CN103874505A - 防止过表达her2/neu 的肿瘤的治疗过程中发生逃逸突变的组合物和方法 - Google Patents
防止过表达her2/neu 的肿瘤的治疗过程中发生逃逸突变的组合物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供用于治疗非人动物中表达Her2/neu抗原的肿瘤和给非人动物接种疫苗并诱导对该肿瘤的免疫应答的组合物和方法。提供治疗非人动物中表达Her-2/neu的肿瘤生长或癌症的示例性方法，该方法包括施用包含编码融合多肽的核酸分子的重组李斯特菌的步骤，其中所述融合多肽包含与另外的佐剂多肽融合的Her2/neu嵌合抗原。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年8月16日提交的美国专利申请系列号13/210,696的优先权，其是2010年11月12日提交的共同未决美国专利申请系列号12/945,386(其要求2009年11月11日美国临时申请系列号61/260,277的权益)的部分继续申请。这些申请以其整体通过引用并入本申请。
技术领域
本发明提供在非人动物中治疗和接种疫苗并诱导抗表达Her2/neu抗原肿瘤的免疫应答的组合物和方法。
背景技术
Her-2/neu(此后称为“Her-2”)是185kDa糖蛋白，其是酪氨酸激酶表皮生长因子受体(EGFR)家族的成员，由胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域组成，已知所述胞内结构域参与细胞信号传导(Bargmann CI等，Nature319:226,1986;King CR等，Science229：974，1985)。在人中，HER2抗原在所有乳腺癌的25%至40%中过表达，并且也在卵巢、肺、胰腺、脑和胃肠道的许多癌症中过表达。Her-2的过表达与不受控的细胞生长和信号传导相关，这二者都促进肿瘤的发展。即使存在针对Her-2的可检测的体液、CD8+T细胞和CD4+T细胞应答，患有过表达Her-2的癌症的患者展示耐受性。
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenens)是胞内病原体，其主要感染抗原呈递细胞并且适于在这些细胞的细胞质中存活。宿主细胞，比如巨噬细胞，积极吞噬单核细胞增生李斯特氏菌并且大部分细菌在吞噬溶酶体中降解。一些细菌经溶血素、李斯特氏菌溶胞素O(LLO)作用通过使吞噬体膜穿孔逃逸入宿主胞质溶胶。一旦在胞质溶胶中，单核细胞增生李斯特氏菌可聚合宿主肌动蛋白并且直接从细胞至细胞传递，进一步逃避宿主免疫系统并且导致对单核细胞增生李斯特氏菌的抗体应答可以忽略。
已经报道了从蛋白质的胞外和胞内结构域独立表达人Her2/neu蛋白小片段的许多单核细胞增生李斯特氏菌(Lm)基疫苗的构造和开发。Her2/neu太大而不能装入Lm，这使得必须产生Her2/neu片段。所有这些疫苗显示为有免疫原性而且对使FVB/N小鼠中预先建立的肿瘤退化有效并且延迟表达Her2/neu的转基因动物中自发性乳房肿瘤的发病。来自这些初步实验的令人振奋的结果提示可产生重组李斯特氏菌(Listeria)-Her2/neu疫苗，其可打破对Her2/neu自身抗原的耐受性。但是，迄今开发的李斯特氏菌-Her2/neu疫苗基于使用抗生素标记(cat)的减毒李斯特氏菌平台，所述抗生素标记用于在存在氯霉素的情况下体外选择重组细菌。对于临床使用，不但高减毒是重要的，而且没有对抗生素的抗性也是重要的。
犬科动物骨肉瘤是长(腿)骨的癌症，其是超过10岁大狗的主要杀手。标准治疗是诊断后立即截肢，随后化疗。但是，癌症总是转移至肺。利用化疗，狗生存大约12个月，与之相比，没有治疗，狗生存6个月。HER2抗原在多达50%的骨肉瘤中存在。
已经报道了肿瘤经逃逸突变(escape mutation)逃避宿主免疫应答，这仍然是肿瘤治疗的主要障碍。因此，需要开发具有高治疗功效并且不产生逃逸突变的疫苗。在发现上述每个片段疫苗的活性之后，本发明整合了来自每个独立片段的所有活性位点，从而获得了新的免疫原性组合物，用于疫苗产生。此外，在动物市场上对安全和有效癌症治疗的需要远远未获得满足。本发明通过提供重组李斯特氏菌-Her2/neu疫苗(ADXS31-164)，满足了该需要，该疫苗使用具有良好定义的减毒机制并且没有抗生素选择标记的LmddA疫苗载体产生。该嵌合抗原的使用不产生逃逸突变，这表明肿瘤不会突变而丧失对用该新抗原治疗的治疗性有效应答。
发明内容
在一种实施方式中，本发明涉及包含融合多肽的免疫原性组合物，其中所述融合多肽包含与另外的多肽融合的Her2/neu嵌合抗原，并且其中给具有表达Her2/neu的肿瘤的对象施用融合蛋白引起突变回避(mutationavoidance)。在另一实施方式中，突变回避是由于表位扩展(epitopespreading)。在再一个实施方式中，突变回避是由于抗原的嵌合性质。
在另一实施方式中，本发明涉及包含核酸分子的重组李斯特氏菌疫苗株，其中以及在另一实施方式中，核酸分子包含编码多肽的第一开放阅读框，其中多肽包含Her2/neu嵌合抗原，其中核酸分子进一步包含编码代谢酶的第二开放阅读框，并且其中代谢酶补偿重组李斯特氏菌株的染色体中缺乏的内源基因。
在一种实施方式中，本发明涉及治疗非人动物中表达Her-2/neu的肿瘤生长或癌症的方法，该方法包括施用包含编码融合多肽的核酸的重组李斯特氏菌的步骤，其中融合多肽包含与另外的佐剂多肽融合的Her2/neu嵌合抗原。
在另一实施方式中，本发明涉及预防非人动物中表达Her-2/neu的肿瘤生长或癌症的方法，该方法包括施用包含编码融合多肽的核酸的重组李斯特氏菌的步骤，其中融合多肽包含与另外的佐剂多肽融合的Her2/neu嵌合抗原。
在一种实施方式中，本发明涉及引起非人动物中针对表达Her-2/neu的肿瘤生长或癌症的增强的免疫应答的方法，该方法包括施用包含编码融合多肽的核酸的重组李斯特氏菌的步骤，其中融合多肽包含与另外的佐剂多肽融合的Her2/neu嵌合抗原。
附图说明
图1显示ADXS31-164的构造。(A)pAdv164的质粒图谱，其具有枯草芽孢杆菌dal基因，受组成型李斯特氏菌p60启动子的控制，用于补充LmddA菌株中的染色体dal-dat删除。其也含有截短的LLO(1-441)与嵌合人Her2/neu基因融合，这是通过直接融合3个片段Her2/neu:EC1(aa40-170)、EC2(aa359-518)和ICI(aa679-808)构建的。(B)通过用抗LLO抗体印迹的TCA沉淀的细胞培养物上清液的蛋白质印迹分析，在Lm-LLO-ChHer2(Lm-LLO-138)和LmddA-LLO-ChHer2(ADXS31-164)中检测tLLO-ChHer2的表达和分泌。大约104KD的差异条带对应tLLO-ChHer2。检测到内源LLO为58KD带。李斯特氏菌对照没有ChHer2表达。
图2显示ADXS31-164的免疫原性性质。(A)使用NT-2细胞作为刺激物以及3T3/neu细胞作为靶检测Her2/neu李斯特氏菌基疫苗在来自免疫的小鼠的脾细胞中引起的细胞毒性T细胞应答。Lm-对照基于LmddA背景，所述LmddA背景除了表达不相关抗原(HPV16-E7)外，所有方面都与所述疫苗相同。(B)在体外用丝裂霉素C处理的NT-2细胞刺激来自免疫的FVB/N小鼠的脾细胞24小时后，通过ELISA测量所述脾细胞分泌进入细胞培养基的IFN-γ。(C)来自用嵌合疫苗免疫的HLA-A2转基因小鼠的脾细胞分泌IFN-γ，这是对与来自该蛋白质不同区域的肽一起体外温育的应答。如图例中列举，重组ChHer2蛋白用作阳性对照，不相关肽或没有肽组构成阴性对照。使用72小时共同温育之后收获的细胞培养物上清液通过ELISA试验检测IFN-γ分泌。每个数据点是三个数据的平均值+/-标准差。*P值<0.001。
图3显示李斯特氏菌-ChHer2/neu疫苗的肿瘤预防研究。用每个重组李斯特氏菌-ChHer2或对照李斯特氏菌疫苗注射Her2/neu转基因小鼠六次。在6周龄开始免疫并且继续每三周一次直到第21周。每周监测肿瘤的出现并且将其表达为无肿瘤小鼠的百分数。*p<0.05，N=9每组。
图4显示用LmddA-LLO-ChHer2(ADXS31-164)免疫对脾中Treg百分比的作用。用1x106NT-2细胞皮下接种FVB/N小鼠，并且用每个疫苗以一周的间隔免疫三次。在第二次免疫之后7天收获脾。在分离免疫细胞之后，将其染色用于通过抗CD3、CD4、CD25和FoxP3抗体检测Treg。来自代表性实验的Treg的点图显示CD25+/FoxP3+T细胞频率，该点图表达为横跨不同治疗组的总CD3+或CD3+CD4+T细胞的百分数。
图5显示用LmddA-LLO-ChHer2(ADXS31-164)免疫对NT-2肿瘤中浸润肿瘤的Treg百分比的效果。用1x106NT-2细胞皮下接种FVB/N小鼠，并且用每个疫苗以一周的间隔免疫三次。第二次免疫7天后收获肿瘤。分离免疫细胞之后，将其染色用于通过抗CD3、CD4、CD25和FoxP3抗体检测Treg。(A).来自代表性实验的Treg的点图。(B).CD25+/FoxP3+T细胞的频率，表达为横跨不同治疗组的总CD3+或CD3+CD4+T细胞的百分数(左图)和肿瘤内CD8/Treg比(右图)。数据显示为从2个独立实验获得的平均值±SEM。
图6显示用LmddA-LLO-ChHer2(ADXS31-164)接种疫苗可延迟乳腺癌细胞系在脑中的生长。用ADXS31-164或对照李斯特氏菌疫苗免疫Balb/c小鼠三次。在麻醉的小鼠中颅内注射EMT6-Luc细胞(5,000)。(A)使用Xenogen X-100CCD照相机在指定日进行小鼠的离体成像。(B)以每秒每cm2表面积的光子数对像素亮度作图；这显示为平均辐射强度。(C)通过蛋白质印迹，使用抗Her2/neu抗体，检测EMT6-Luc细胞、4T1-Luc和NT-2细胞系的Her2/neu的表达。用J774.A2细胞(鼠巨噬细胞样细胞系)作为阴性对照。
发明详述
在一种实施方式中，本文提供组合物和方法，其用于预防、治疗和接种针对表达Her2-neu抗原的肿瘤的疫苗并且诱导针对Her2-neu抗原的次优势表位的免疫应答，同时引起突变回避。在另一实施方式中，突变回避是因为表位扩展。在再一个实施方式中，突变回避是因为抗原的嵌合性质。
在另一实施方式中，本文提供了包含融合多肽的免疫原性组合物，其中融合多肽包含与另外多肽融合的Her2/neu嵌合抗原，其中给具有表达Her2/neu肿瘤的对象施用融合蛋白防止肿瘤中的逃逸突变。在另一实施方式中，本文提供了包含免疫原性组合物的重组李斯特氏菌疫苗株。
在一种实施方式中，本文提供了引起非人动物中针对表达Her-2/neu的肿瘤生长或癌症的增强的免疫应答的方法，该方法包括施用包含编码融合多肽的核酸分子的重组李斯特氏菌的步骤，其中融合多肽包含与另外佐剂多肽融合的Her2/neu嵌合抗原。
在另一实施方式中，本文提供了预防非人动物中表达Her-2/neu的肿瘤生长或癌症的方法，该方法包括施用包含编码融合多肽的核酸的重组李斯特氏菌的步骤，其中融合多肽包含与另外佐剂多肽融合的Her2/neu嵌合抗原。
在一种实施方式中，本文提供了治疗非人动物中表达Her-2/neu的肿瘤生长或癌症的方法，该方法包括施用包含编码融合多肽的核酸分子的重组李斯特氏菌的步骤，其中融合多肽包含与另外佐剂多肽融合的Her2/neu嵌合抗原。在另一实施方式中，非人动物是犬科动物。在在一个实施方式中，犬科动物是狗。
在一种实施方式中，本文提供了包含核酸分子的重组李斯特氏菌疫苗株，其中核酸分子包含编码多肽的第一开放阅读框，其中多肽包含Her2/neu嵌合抗原，其中核酸分子进一步包含编码代谢酶的第二开放阅读框，其中代谢酶补充重组李斯特氏菌株的染色体中没有的内源基因。在另一实施方式中，重组李斯特氏菌疫苗株进一步包含含有编码代谢酶的第三开放阅读框的核酸分子，其中代谢酶补充重组李斯特氏菌株的染色体中没有的内源基因。
在另一实施方式中，本文提供了包含核酸分子的重组李斯特氏菌疫苗株，其中核酸分子包含编码多肽的第一开放阅读框，其中多肽包含Her2/neu嵌合抗原，其中核酸分子进一步包含各自编码代谢酶的第二和第三开放阅读框，其中代谢酶补充所述重组李斯特氏菌株的染色体中没有的内源基因。在一种实施方式中，核酸分子整合至李斯特氏菌基因组。在另一实施方式中，核酸分子在重组李斯特氏菌疫苗株中的质粒中。在在一个实施方式中，在没有抗生素选择的情况下，质粒稳定保持在重组李斯特氏菌疫苗株中。在另一实施方式中，质粒不赋予重组李斯特氏菌抗生素抗性。在另一实施方式中，重组李斯特氏菌株是减毒的。在另一实施方式中，重组李斯特氏菌是减毒的营养缺陷型菌株。在另一实施方式中，外源抗原的表达对细菌比如本发明之一施加的高代谢负担也是减毒的重要机制。
在一种实施方式中，减毒株是LmddA。在另一实施方式中，该菌株发挥强的佐剂效果，所述佐剂效果是李斯特氏菌基疫苗的固有性质。该佐剂效果的一种表现是不相关李斯特氏菌或ADXS-31-164疫苗造成的肿瘤内Treg数量下降5倍(见本文图5)。在另一实施方式中，表达不相关抗原(HPV16E7)的LmddA载体也与肿瘤中Treg频率的显著下降相关，这可能是先天免疫应答的结果。
在一种实施方式中，本发明提供用于克隆her-2-嵌合体的核酸序列(见本文实施例的表1)。
通过SOEing PCR方法并且以每个分开的hHer-2/neu区段作为模板的直接融合产生Her-2/neu嵌合构建体。引物显示在表2中(见本文实施例)。
在一种实施方式中，根据本文提供的实施例产生LmddA-LLO-ChHer2(ADXS31-164)。在一种实施方式中，嵌合Her2基因(ChHer2)基因使用XhoI和SpeI限制酶从pAdv138切下，并且克隆在具有Lmdd穿梭载体pAdv134中具有截短的、非溶血性LLO片段的框架中。在另一实施方式中，通过DNA测序分析确认插入物、LLO和hly启动子的序列。在另一实施方式中，该质粒然后电穿孔进入电感受态actA、dal、dat突变的单核细胞增生李斯特氏菌株，在含有链霉素(250μg/ml)的脑心浸液(BHI)琼脂平板上选择LmddA和阳性克隆。在另一实施方式中，表达hHer2/neu(Lm-hHer2)片段的类似的李斯特氏菌株用于比较目的。在另一实施方式中，包含不相关李斯特氏菌构建体(Lm-对照)以解释李斯特氏菌对免疫系统的抗原独立作用。在另一实施方式中，Lm-对照基于与LmddA-LLO-ChHer2(ADXS31-164)相同的李斯特氏菌平台，但是表达不同的抗原，比如HPV16-E7或NY-ESO-1。在另一实施方式中，使用本领域已知的方法，包括但不限于，免疫印迹、RNA印迹、免疫荧光等，检测和确认来自李斯特氏菌的融合蛋白的表达和分泌。在另一实施方式中，每个构建体在体内传代两次(见本文实施例)。
在一种实施方式中，减毒的营养缺陷型李斯特氏菌疫苗株LmddA-LLO-ChHer2(ADXS31-164)菌株基于李斯特氏菌疫苗载体，所述疫苗载体由于删除致病基因actA而减毒并且保持用于通过补充dal基因体内和体外表达Her2/neu的质粒。在一种实施方式中，ADXS31-164表达和分泌与李斯特氏菌溶胞素O(LLO)的前441个氨基酸融合的嵌合Her2/neu蛋白。在另一实施方式中，构建体利用本领域已知的适当的启动子和信号序列或信号肽，以使融合蛋白可以表达和分泌。这些启动子和信号序列中的一些包括但不限于李斯特氏菌actA启动子和信号序列、hly启动子和信号序列、p60启动子和其他本领域已知的启动子和信号序列，其中一些描述在美国专利号5,830,702中，其通过参考以其整体并入本文。
在一种实施方式中，ADXS31-164在转基因动物中施加强的且抗原特异性的抗肿瘤应答，该应答具有打破转基因动物中对HER2/neu耐受性的能力(见实施例2)。在另一实施方式中，ADXS31-164能够引起对位于靶抗原不同结构域的人表位的抗Her2/neu特异性免疫应答(见实施例2)。在另一实施方式中，ADXS31-164菌株高度减毒并且比之前代的李斯特氏菌疫苗具有更好的安全性谱，因为其更快速地从免疫的小鼠的脾中清除。在另一实施方式中，尽管ADXS31-164是更减毒的，但是其在预防Her2/neu转基因动物中自发性乳房肿瘤的出现方面比Lm-LLO-ChHer2更有效(见实施例3)。
在另一实施方式中，ADXS31-164比Lm-LLO-ChHer2更长延迟在转基因动物中的肿瘤发病，Lm-LLO-ChHer2是该疫苗的抗生素抗性和更具致病性的变体(见图3)。在另一实施方式中，ADXS31-164菌株是具有高度免疫原性的，能够在Her2/neu转基因动物中打破对HER2/neu自身抗原的耐受性并且预防转基因动物中的肿瘤形成。在另一实施方式中，ADXS31-164使得肿瘤内T调节细胞(Treg)显著下降(见本文实施例5)。在另一实施方式中，用LmddA疫苗治疗的肿瘤中更低频率的Treg导致肿瘤内CD8/Treg比增加，这提示在用LmddA疫苗免疫之后，可获得更有利的肿瘤微环境(见本文实施例5)。在另一实施方式中，该嵌合抗原的使用不产生逃逸突变，表明肿瘤没有突变而丧失对用该新抗原治疗的治疗性有效应答(见本文实施例6)。在另一实施方式中，用ADXS31-164外周免疫延迟脑中转移性乳腺癌细胞系的生长(见本文实施例7)。在另一实施方式中，外周施用ADXS31-164到达中枢神经系统，证明LmddA基疫苗提供CNS肿瘤的潜在治疗(见本文实施例7)。
犬科动物骨肉瘤是长(腿)骨的癌症，其是超过10岁大狗的主要杀手。标准治疗是诊断后立即截肢，随后化疗。但是，癌症总是转移至肺。利用化疗，狗生存大约18个月，与之相比，没有治疗，狗生存6-12个月。认为HER2抗原在多达50%的骨肉瘤中存在。在一种实施方式中，本文提供的疫苗ADXS31-164对表达该抗原的细胞产生免疫攻击并且治疗人乳腺癌。
组织学诊断为骨肉瘤的狗显示通过恶性细胞表达HER2/neu的证据。因此，在一种实施方式中，本文提供了治疗犬科动物骨肉瘤的方法，方法包括下述步骤：给具有骨肉瘤的犬科动物施用包含ADXS31-164和佐剂的疫苗组合物，从而治疗犬科动物骨肉瘤(见本文实施例8)。在另一实施方式中，本文提供了治疗犬科动物骨肉瘤的方法，方法包括下述步骤：给具有骨肉瘤的犬科动物施用由ADXS31-164和佐剂组成的疫苗组合物，从而治疗犬科动物骨肉瘤(见本文实施例8)。在另一实施方式中，本文提供了治疗犬科动物骨肉瘤的方法，方法包括下述步骤：给具有骨肉瘤的犬科动物施用由ADXS31-164组成的疫苗组合物，从而治疗犬科动物骨肉瘤(见实施例8)。
在另一实施方式中，如本领域技术人员理解的，使用本领域已知的各种方法，包括静脉内、腹膜内、肌内、口服、鼻内等，给犬科动物施用本发明的疫苗。在另一实施方式中，以在犬科动物对象舌的基细胞处或附近输送疫苗的方式施用疫苗。
在另一实施方式中，施用可以是单个事件，或可以以不同的时间间隔施用多个加强剂量以增加免疫应答。在给幼犬施用的情况下，典型的施用方案是在例如2-3周龄初始施用，随后在4和6周加强剂量。在另一实施方式中，施用是预防性的，即在肿瘤生长出现或怀疑出现之前，但是也可在该事实之后，即治疗性地，例如在出现与肿瘤或癌症生长相关的疾病症状之后。
在一种实施方式中，Lm-LLO-ChHer2菌株是Lm-LLO-138。
在一种实施方式中，表达嵌合抗原的重组减毒的、无抗生素李斯特氏菌可用于预防和治疗癌症或实体瘤，如本文举例。在另一实施方式中，肿瘤是Her2/neu阳性肿瘤。在另一实施方式中，癌症是表达Her2/neu的癌症。在另一实施方式中，癌症是乳腺癌、中枢神经系统(CNS)癌、头颈癌、骨肉瘤、犬科动物骨肉瘤或本领域已知的任何癌症。在另一实施方式中，肿瘤是骨瘤、乳腺肿瘤、头颈瘤或本领域已知的任何其他抗原表达肿瘤。在另一实施方式中，表达嵌合Her2/neu的重组李斯特氏菌可用作治疗性疫苗，用于治疗过表达Her2/neu的实体瘤。在另一实施方式中，本文提供的Her2/neu嵌合抗原可用于治疗表达Her2/neu的肿瘤和防止其逃逸突变。在另一实施方式中，术语“逃逸突变”指肿瘤突变而丧失对治疗的治疗性有效应答。
在一种实施方式中，本文提供了包含编码免疫原性组合物的第一开放阅读框的核酸分子，其中核酸分子位于重组李斯特氏菌疫苗株中。在另一实施方式中，本文提供的核酸分子用于转化李斯特氏菌，以获得重组李斯特氏菌。在另一实施方式中，本文提供的核酸没有致病基因。在另一实施方式中，整合至李斯特氏菌基因组的核酸分子携带非功能性致病基因。在另一实施方式中，致病基因在重组李斯特氏菌中突变。在再一个实施方式中，核酸分子用于使李斯特氏菌基因组中存在的内源基因失活。在再一个实施方式中，致病基因是ActA基因。在另一实施方式中，致病基因是PrfA基因。如本领域技术人员理解的，致病基因可以是与重组李斯特氏菌的致病性相关的本领域已知的任何基因。
在一种实施方式中，李斯特氏菌株的染色体中没有代谢基因、致病基因等。在另一实施方式中，李斯特氏菌株的染色体和任何游离的遗传元件中没有代谢基因、致病基因等。在另一实施方式中，致病菌株的基因组中没有代谢基因、致病基因等。在一种实施方式中，致病基因在染色体中突变。在另一实施方式中，致病基因从染色体中删除。每个可能性代表本发明的单独的实施方式。
在一种实施方式中，李斯特氏菌株的染色体中没有代谢基因、致病基因等。在另一实施方式中，李斯特氏菌株的染色体和任何游离的遗传元件中没有代谢基因、致病基因等。在另一实施方式中，致病菌株的基因组中没有代谢基因、致病基因等。在一种实施方式中，致病基因在染色体中突变。在另一实施方式中，致病基因从染色体删除。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。
在另一实施方式中，本文提供的核酸和质粒不赋予重组李斯特氏菌抗生素抗性。
在另一实施方式中，“核酸分子”指质粒。在另一实施方式中，该术语指整合载体。在另一实施方式中，该术语指包含整合载体的质粒。在另一实施方式中，整合载体是位点特异性整合载体。在另一实施方式中，本发明方法和组合物的核酸分子由本领域已知的任何类型的核苷酸组成。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。
在另一实施方式中，“代谢酶”指参与宿主细菌需要的营养物的合成的酶。在另一实施方式中，该术语指宿主细菌需要的营养物的合成所需要的酶。在另一实施方式中，该术语指参与宿主细菌利用的营养物的合成的酶。在另一实施方式中，该术语指参与宿主细菌的持续生长需要的营养物的合成的酶。在另一实施方式中，酶是营养物合成所需要的。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。
在另一实施方式中，“稳定保持”指核酸分子或质粒在没有选择(例如抗生素选择)的情况下保持10代，而没有可检测的丢失。在另一实施方式中，周期是15代。在另一实施方式中，周期是20代。在另一实施方式中，周期是25代。在另一实施方式中，周期是30代。在另一实施方式中，周期是40代。在另一实施方式中，周期是50代。在另一实施方式中，周期是60代。在另一实施方式中，周期是80代。在另一实施方式中，周期是100代。在另一实施方式中，周期是150代。在另一实施方式中，周期是200代。在另一实施方式中，周期是300代。在另一实施方式中，周期是500代。在另一实施方式中，周期是大于代。在另一实施方式中，核酸分子或质粒在体外(例如在培养物中)稳定保持。在另一实施方式中，核酸分子或质粒在体内稳定保持。在另一实施方式中，核酸分子或质粒在体外和体外都稳定保持。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。
在一种实施方式中，本发明提供表达抗原的重组李斯特氏菌株。本发明也提供包含与Her-2嵌合蛋白或其片段融合的李斯特氏菌溶胞素(LLO)蛋白片段或PEST肽或ActA N末端片段的重组肽、包含该重组肽的疫苗和免疫原性组合物，以及包含该重组肽的诱导针对Her-2的免疫应答和治疗表达Her-2的肿瘤和接种针对其的疫苗的方法。
在另一实施方式中，本发明的重组李斯特氏菌株已经通过动物宿主传代。在另一实施方式中，传代使得作为疫苗载体的菌株功效最大化。在另一实施方式中，传代稳定李斯特氏菌株的免疫原性。在另一实施方式中，传代稳定李斯特氏菌株的致病性。在另一实施方式中，传代增加李斯特氏菌株的免疫原性。在另一实施方式中，传代增加李斯特氏菌株的致病性。在另一实施方式中，传代移除李斯特氏菌株的不稳定的亚株。在另一实施方式中，传代减少李斯特氏菌株的不稳定亚株的流行。在另一实施方式中，李斯特氏菌株含有编码含抗原的重组肽的基因的基因组插入。在另一实施方式中，李斯特氏菌株携带包含编码含抗原的重组肽的基因的质粒。在另一实施方式中，通过本领域已知的任何其他方法进行传代。
在一种实施方式中，本文提供的多肽是包含选自下述的另外多肽的融合蛋白：a)非溶血性LLO蛋白或N末端片段，b)PEST序列，或c)ActA N末端片段，以及进一步其中另外的多肽与Her2/neu嵌合抗原融合。在另一实施方式中，另外的多肽是有功能的。在另一实施方式中，另外的多肽的片段具有免疫原性。在另一实施方式中，另外的多肽具有免疫原性。
在另一实施方式中，本文提供的多肽是包含与Her2/neu嵌合抗原融合的非溶血性LLO蛋白或N末端片段的融合蛋白。在另一实施方式中，本发明的方法和组合物的融合蛋白包含来自李斯特氏菌生物体的ActA序列。ActA蛋白和其片段以与LLO类似的方式增加抗原呈递和免疫。
在本发明的方法和组合物的另一实施方式中，融合蛋白包含Her2/neu抗原和另外的佐剂多肽。在一种实施方式中，另外的多肽是非溶血性LLO蛋白或其片段(见本文实施例)。在另一实施方式中，另外的多肽是PEST序列。在另一实施方式中，另外的多肽是ActA蛋白或其片段。ActA蛋白和其片段以与LLO类似的方式增加抗原呈递和免疫力。
在另一实施方式中，本发明的方法和组合物的另外的多肽是李斯特氏菌溶胞素(LLO)肽。在另一实施方式中，另外的多肽是ActA肽。在另一实施方式中，另外的多肽是PEST样序列的肽。在另一实施方式中，另外的多肽是能够提高抗原肽的免疫原性的任何其他肽。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
可通过任何合适的方法制备包含Her2/neu嵌合抗原的融合蛋白，所述合适的方法包括，例如，克隆和限制性酶切(restriction)适当的序列或通过下述方法的直接化学合成。或者，可克隆子序列并且使用适当的限制酶切开适当的子序列。然后可连接片段，以产生期望的DNA序列。在一种实施方式中，使用DNA扩增方法，例如聚合酶链反应(PCR)产生编码抗原的DNA。首先，分别扩增在新末端任一侧上的天然DNA的区段。一条扩增序列的5'端编码肽接头，同时另一扩增序列的3'端也编码肽接头。因为第一片段的5'端与第二片段的3'端互补，所以两个片段(在部分纯化之后，例如在LMP琼脂糖上)可用作第三PCR反应中的重叠模板。扩增序列含有密码子、开放位点的羧基侧的区段(现在形成氨基序列)、接头和开放位点的氨基侧的序列(现在形成羧基序列)。将抗原连接至质粒。每种方法代表本发明的独立的实施方式。
本发明的结果表明施用本发明的组合物对诱导形成识别和杀死肿瘤细胞的抗原特异性T细胞(例如细胞毒性T细胞)有效(见本文实施例)。
在一种实施方式中，本发明提供包含与Her-2嵌合蛋白融合或与其片段融合的LLO蛋白的N末端片段的重组多肽。在一种实施方式中，本发明提供由与Her-2嵌合蛋白融合或与其片段融合的LLO蛋白的N末端片段组成的重组多肽。
在另一实施方式中，本发明的方法和组合物的Her-2嵌合蛋白是人Her-2嵌合蛋白。在另一实施方式中，Her-2蛋白是小鼠Her-2嵌合蛋白。在另一实施方式中，Her-2蛋白是大鼠Her-2嵌合蛋白。在另一实施方式中，Her-2蛋白是灵长类Her-2嵌合蛋白。在另一实施方式中，Her-2蛋白是人或任何其他动物种的Her-2嵌合蛋白或本领域已知的其组合。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在另一实施方式中，Her-2蛋白是称为“HER-2/neu”、“Erbb2”、“v-erb-b2”、“c-erb-b2”、“neu”或“cNeu”的蛋白质。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在一种实施方式中，Her2-neu嵌合蛋白具有Her2/neu抗原的两个胞外和一个胞内片段，其显示致癌基因的MHC-I型表位簇，而在另一实施方式中，嵌合蛋白具有Her2/neu抗原的3个H2Dq和至少17个定位的人MHC-I型表位(片段EC1、EC2和IC1)(见图1和实施例1)。在另一实施方式中，嵌合蛋白具有至少13个定位的人MHC-I型表位(片段EC2和IC1)。在另一实施方式中，嵌合蛋白具有至少14个定位的人MHC-I型表位(片段EC1和IC1)。在另一实施方式中，嵌合蛋白具有至少9个定位的人MHC-I型表位(片段EC1和IC2)。在另一实施方式中，Her2-neu嵌合蛋白与非溶血性李斯特氏菌溶胞素O(LLO)融合。在另一实施方式中，Her2-neu嵌合蛋白与单核细胞增生李斯特氏菌的李斯特氏菌溶胞素O(LLO)蛋白的前441氨基酸融合并且由单核细胞增生李斯特氏菌减毒的营养缺陷型菌株LmddA表达和分泌。在另一实施方式中，来自本文提供的表达嵌合Her2/neu抗原/LLO融合蛋白的减毒的营养缺陷型菌株的融合蛋白tLLO-ChHer2的表达和分泌可以与体外生长8小时后TCA沉淀的细胞培养物上清液中的Lm-LLO-ChHer2的表达和分泌相媲美(见图1B)。
在一种实施方式中，在注射不相关的李斯特氏菌疫苗的未免疫的动物
或小鼠中没有检测到CTL活性(见图2A)。而在另一实施方式中，本文提供的减毒的营养缺陷型菌株(ADXS31-164)能够刺激来自野生型FVB/N小鼠的脾细胞分泌IFN-γ(图2B)。
在另一实施方式中，本文提供的方法和组合物的代谢酶是氨基酸代谢酶，而在另一实施方式中，代谢酶是丙氨酸消旋酶。在另一实施方式中，代谢酶是D-氨基酸转移酶。在另一实施方式中，代谢酶催化形成重组李斯特氏菌株中用于细胞壁合成的氨基酸，而在另一实施方式中，代谢酶是丙氨酸消旋酶。
在另一实施方式中，在李斯特氏菌p60启动子的控制下表达编码代谢酶的基因。在另一实施方式中，使用inlA(编码内化蛋白)启动子。在另一实施方式中，使用hly启动子。在另一实施方式中，使用ActA启动子。在另一实施方式中，在任何其他革兰氏阳性启动子控制下表达整合酶基因。在另一实施方式中，在李斯特氏菌中起作用的任何其他启动子的控制下表达编码代谢酶的基因。本领域技术人员会理解其他启动子或多顺反子表达盒可用于驱动基因的表达。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在另一实施方式中，Her-2嵌合蛋白由SEQ ID NO:1中所示的下列核酸序列编码
gagacccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaacctggaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggaggtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctgcggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaatggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggagctgcagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccccagctctgctaccaggacacgattttgtggaagaatatccaggagtttgctggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttctgccggagagctttgatggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagcagctccaagtgtttgagactctggaagagatcacaggttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcctgacctcagcgtcttccagaacctgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcctactcgctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaactgggcagtggactggccctcatccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtgccctgggaccagctctttcggaacccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggccagaggacgagtgtgtgggcgagggcctggcctgccaccagctgtgcgcccgagggcagcagaagatccggaagtacacgatgcggagactgctgcaggaaacggagctggtggagccgctgacacctagcggagcgatgcccaaccaggcgcagatgcggatcctgaaagagacggagctgaggaaggtgaaggtgcttggatctggcgcttttggcacagtctacaagggcatctggatccctgatggggagaatgtgaaaattccagtggccatcaaagtgttgagggaaaacacatcccccaaagccaacaaagaaatcttagacgaagcatacgtgatggctggtgtgggctccccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacagcttatgccctatggctgcctcttagactaa(SEQ ID NO:1)。
在另一实施方式中，Her-2嵌合蛋白具有下列序列：
ETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKNIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLD(SEQ ID NO:2)。
在一种实施方式中，本文提供的方法和组合物的Her2嵌合蛋白或其片段不包括其信号序列。在另一实施方式中，由于信号序列的高疏水性，省略信号序列使得Her2片段能够在李斯特氏菌中成功表达。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在另一实施方式中，本发明的方法和组合物的Her2嵌合蛋白的片段不包括其跨膜结构域(TM)。在一种实施方式中，由于TM的高疏水性，省略TM使得Her-2片段能够在李斯特氏菌中成功表达。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在一种实施方式中，大鼠-Her2/neu基因的核酸序列是CCGGAATCGCGGGCACCCAAGTGTGTACCGGCACAGACATGAAGTTGCGGCTCCCTGCCAGTCCTGAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTGTACCAGGGCTGTCAGGTAGTGCAGGGCAACTTGGAGCTTACCTACGTGCCTGCCAATGCCAGCCTCTCATTCCTGCAGGACATCCAGGAAGTTCAGGGTTACATGCTCATCGCTCACAACCAGGTGAAGCGCGTCCCACTGCAAAGGCTGCGCATCGTGAGAGGGACCCAGCTCTTTGAGGACAAGTATGCCCTGGCTGTGCTAGACAACCGAGATCCTCAGGACAATGTCGCCGCCTCCACCCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCTGAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTGGAAGGACGTCTTCCGCAAGAATAACCAACTGGCTCCTGTCGATATAGACACCAATCGTTCCCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCCGGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGGCCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGCATTCTGACTGCCTGGCCTGCCTCCACTTCAATCATAGTGGTATCTGTGAGCTGCACTGCCCAGCCCTCGTCACCTACAACACAGACACCTTTGAGTCCATGCACAACCCTGAGGGTCGCTACACCTTTGGTGCCAGCTGCGTGACCACCTGCCCCTACAACTACCTGTCTACGGAAGTGGGATCCTGCACTCTGGTGTGTCCCCCGAATAACCAAGAGGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCTCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGACAATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTGTTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTCCGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGCGCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGGGAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACTGTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGGCCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCACTGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGTCATTTCCTTCGGGGCCAGGAGTGTGTGGAGGAGTGCCGAGTATGGAAGGGGCTCCCCCGGGAGTATGTGAGTGACAAGCGCTGTCTGCCGTGTCACCCCGAGTGTCAGCCTCAAAACAGCTCAGAGACCTGCTTTGGATCGGAGGCTGATCAGTGTGCAGCCTGCGCCCACTACAAGGACTCGTCCTCCTGTGTGGCTCGCTGCCCCAGTGGTGTGAAACCGGACCTCTCCTACATGCCCATCTGGAAGTACCCGGATGAGGAGGGCATATGCCAGCCGTGCCCCATCAACTGCACCCACTCCTGTGTGGATCTGGATGAACGAGGCTGCCCAGCAGAGCAGAGAGCCAGCCCGGTGACATTCATCATTGCAACTGTAGTGGGCGTCCTGCTGTTCCTGATCTTAGTGGTGGTCGTTGGAATCCTAATCAAACGAAGGAGACAGAAGATCCGGAAGTATACGATGCGTAGGCTGCTGCAGGAAACTGAGTTAGTGGAGCCGCTGACGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGCTAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACATCTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTCCGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCCAGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGCGGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCAAGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAGATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCACCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGGCCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAACGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTTCACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTTGGGCCCATCCAGCCCCATGGACAGTACCTTCTACCGTTCACTGCTGGAAGATGATGACATGGGTGACCTGGTAGACGCTGAAGAGTATCTGGTGCCCCAGCAGGGATTCTTCTCCCCGGACCCTACCCCAGGCACTGGGAGCACAGCCCATAGAAGGCACCGCAGCTCGTCCACCAGGAGTGGAGGTGGTGAGCTGACACTGGGCCTGGAGCCCTCGGAAGAAGGGCCCCCCAGATCTCCACTGGCTCCCTCGGAAGGGGCTGGCTCCGATGTGTTTGATGGTGACCTGGCAATGGGGGTAACCAAAGGGCTGCAGAGCCTCTCTCCACATGACCTCAGCCCTCTACAGCGGTACAGCGAGGACCCCACATTACCTCTGCCCCCCGAGACTGATGGCTATGTTGCTCCCCTGGCCTGCAGCCCCCAGCCCGAGTATGTGAACCAATCAGAGGTTCAGCCTCAGCCTCCTTTAACCCCAGAGGGTCCTCTGCCTCCTGTCCGGCCTGCTGGTGCTACTCTAGAAAGACCCAAGACTCTCTCTCCTGGGAAGAATGGGGTTGTCAAAGACGTTTTTGCCTTCGGGGGTGCTGTGGAGAACCCTGAATACTTAGTACCGAGAGAAGGCACTGCCTCTCCGCCCCACCCTTCTCCTGCCTTCAGCCCAGCCTTTGACAACCTCTATTACTGGGACCAGAACTCATCGGAGCAGGGGCCTCCACCAAGTAACTTTGAAGGGACCCCCACTGCAGAGAACCCTGAGTACCTAGGCCTGGATGTACCTGTA(SEQID NO:45)。
在一种实施方式中，编码大鼠/her2/neu EC1片段的核酸序列是：CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCTGAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTGGAAGGACGTCTTCCGCAAGAATAACCAACTGGCTCCTGTCGATATAGACACCAATCGTTCCCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCCGGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGGCCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGCA(SEQ ID NO:46)。
在另一实施方式中，编码大鼠her2/neu EC2片段的核酸序列是：GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCTCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGACAATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTGTTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTCCGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGCGCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGGGAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACTGTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGGCCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCACTGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCA(SEQ ID NO:47)。
在另一实施方式中，编码大鼠her2/neu IC1片段的核酸序列是：
CGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGCTAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACATCTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTCCGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCCAGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGCGGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCAAGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAGATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCACCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGGCCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAACGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTTCACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTTGGGCCCATCCAGCCCCATGGACAGTACCTTCTACCGTTCACTGCTGGAA(SEQ ID NO:48)。
在一种实施方式中，人-Her2/neu基因的核酸序列是：
ATGGAGCTGGCGGCCTTGTGCCGCTGGGGGCTCCTCCTCGCCCTCTTGCCCCCCGGAGCCGCGAGCACCCAAGTGTGCACCGGCACAGACATGAAGCTGCGGCTCCCTGCCAGTCCCGAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTCTACCAGGGCTGCCAGGTGGTGCAGGGAAACCTGGAACTCACCTACCTGCCCACCAATGCCAGCCTGTCCTTCCTGCAGGATATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTGCTCATCGCTCACAACCAAGTGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTGTGCGAGGCACCCAGCTCTTTGAGGACAACTATGCCCTGGCCGTGCTAGACAATGGAGACCCGCTGAACAATACCACCCCTGTCACAGGGGCCTCCCCAGGAGGCCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGCCTCACAGAGATCTTGAAAGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGAACCCCCAGCTCTGCTACCAGGACACGATTTTGTGGAAGGACATCTTCCACAAGAACAACCAGCTGGCTCTCACACTGATAGACACCAACCGCTCTCGGGCCTGCCACCCCTGTTCTCCGATGTGTAAGGGCTCCCGCTGCTGGGGAGAGAGTTCTGAGGATTGTCAGAGCCTGACGCGCACTGTCTGTGCCGGTGGCTGTGCCCGCTGCAAGGGGCCACTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCTGCCGGCTGCACGGGCCCCAAGCACTCTGACTGCCTGGCCTGCCTCCACTTCAACCACAGTGGCATCTGTGAGCTGCACTGCCCAGCCCTGGTCACCTACAACACAGACACGTTTGAGTCCATGCCCAATCCCGAGGGCCGGTATACATTCGGCGCCAGCTGTGTGACTGCCTGTCCCTACAACTACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGATGGAACACAGCGGTGTGAGAAGTGCAGCAAGCCCTGTGCCCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACTTGCGAGAGGTGAGGGCAGTTACCAGTGCCAATATCCAGGAGTTTGCTGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTCTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCAGCCTCCAACACTGCCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCCAAGTGTTTGAGACTCTGGAAGAGATCACAGGTTACCTATACATCTCAGCATGGCCGGACAGCCTGCCTGACCTCAGCGTCTTCCAGAACCTGCAAGTAATCCGGGGACGAATTCTGCACAATGGCGCCTACTCGCTGACCCTGCAAGGGCTGGGCATCAGCTGGCTGGGGCTGCGCTCACTGAGGGAACTGGGCAGTGGACTGGCCCTCATCCACCATAACACCCACCTCTGCTTCGTGCACACGGTGCCCTGGGACCAGCTCTTTCGGAACCCGCACCAAGCTCTGCTCCACACTGCCAACCGGCCAGAGGACGAGTGTGTGGGCGAGGGCCTGGCCTGCCACCAGCTGTGCGCCCGAGGGCACTGCTGGGGTCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGCCAGTTCCTTCGGGGCCAGGAGTGCGTGGAGGAATGCCGAGTACTGCAGGGGCTCCCCAGGGAGTATGTGAATGCCAGGCACTGTTTGCCGTGCCACCCTGAGTGTCAGCCCCAGAATGGCTCAGTGACCTGTTTTGGACCGGAGGCTGACCAGTGTGTGGCCTGTGCCCACTATAAGGACCCTCCCTTCTGCGTGGCCCGCTGCCCCAGCGGTGTGAAACCTGACCTCTCCTACATGCCCATCTGGAAGTTTCCAGATGAGGAGGGCGCATGCCAGCCTTGCCCCATCAACTGCACCCACTCCTGTGTGGACCTGGATGACAAGGGCTGCCCCGCCGAGCAGAGAGCCAGCCCTCTGACGTCCATCGTCTCTGCGGTGGTTGGCATTCTGCTGGTCGTGGTCTTGGGGGTGGTCTTTGGGATCCTCATCAAGCGACGGCAGCAGAAGATCCGGAAGTACACGATGCGGAGACTGCTGCAGGAAACGGAGCTGGTGGAGCCGCTGACACCTAGCGGAGCGATGCCCAACCAGGCGCAGATGCGGATCCTGAAAGAGACGGAGCTGAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCTGGCGCTTTTGGCACAGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCTGATGGGGAGAATGTGAAAATTCCAGTGGCCATCAAAGTGTTGAGGGAAAACACATCCCCCAAAGCCAACAAAGAAATCTTAGACGAAGCATACGTGATGGCTGGTGTGGGCTCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCTGACATCCACGGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTCTTAGACCATGTCCGGGAAAACCGCGGACGCCTGGGCTCCCAGGACCTGCTGAACTGGTGTATGCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGATGTGCGGCTCGTACACAGGGACTTGGCCGCTCGGAACGTGCTGGTCAAGAGTCCCAACCATGTCAAAATTACAGACTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGACGAGACAGAGTACCATGCAGATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAGTGGATGGCGCTGGAGTCCATTCTCCGCCGGCGGTTCACCCACCAGAGTGATGTGTGGAGTTATGGTGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGGCCAAACCTTACGATGGGATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGACCTGCTGGAAAAGGGGGAGCGGCTGCCCCAGCCCCCCATCTGCACCATTGATGTCTACATGATCATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTCTGAATGTCGGCCAAGATTCCGGGAGTTGGTGTCTGAATTCTCCCGCATGGCCAGGGACCCCCAGCGCTTTGTGGTCATCCAGAATGAGGACTTGGGCCCAGCCAGTCCCTTGGACAGCACCTTCTACCGCTCACTGCTGGAGGACGATGACATGGGGGACCTGGTGGATGCTGAGGAGTATCTGGTACCCCAGCAGGGCTTCTTCTGTCCAGACCCTGCCCCGGGCGCTGGGGGCATGGTCCACCACAGGCACCGCAGCTCATCTACCAGGAGTGGCGGTGGGGACCTGACACTAGGGCTGGAGCCCTCTGAAGAGGAGGCCCCCAGGTCTCCACTGGCACCCTCCGAAGGGGCTGGCTCCGATGTATTTGATGGTGACCTGGGAATGGGGGCAGCCAAGGGGCTGCAAAGCCTCCCCACACATGACCCCAGCCCTCTACAGCGGTACAGTGAGGACCCCACAGTACCCCTGCCCTCTGAGACTGATGGCTACGTTGCCCCCCTGACCTGCAGCCCCCAGCCTGAATATGTGAACCAGCCAGATGTTCGGCCCCAGCCCCCTTCGCCCCGAGAGGGCCCTCTGCCTGCTGCCCGACCTGCTGGTGCCACTCTGGAAAGGGCCAAGACTCTCTCCCCAGGGAAGAATGGGGTCGTCAAAGACGTTTTTGCCTTTGGGGGTGCCGTGGAGAACCCCGAGTACTTGACACCCCAGGGAGGAGCTGCCCCTCAGCCCCACCCTCCTCCTGCCTTCAGCCCAGCCTTCGACAACCTCTATTACTGGGACCAGGACCCACCAGAGCGGGGGGCTCCACCCAGCACCTTCAAAGGGACACCTACGGCAGAGAACCCAGAGTACCTGGGTCTGGACGTGCCAGTGTGAACCAGAAGGCCAAGTCCGCAGAAGCCCTGA(SEQ ID NO:49)。
在另一实施方式中，编码用于嵌合体中的人her2/neu EC1片段的核酸序列跨越人EC1区域的120-510bp并且如(SEQ ID NO:50)所示。
GAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTCTACCAGGGCTGCCAGGTGGTGCAGGGAAACCTGGAACTCACCTACCTGCCCACCAATGCCAGCCTGTCCTTCCTGCAGGATATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTGCTCATCGCTCACAACCAAGTGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTGTGCGAGGCACCCAGCTCTTTGAGGACAACTATGCCCTGGCCGTGCTAGACAATGGAGACCCGCTGAACAATACCACCCCTGTCACAGGGGCCTCCCCAGGAGGCCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGCCTCACAGAGATCTTGAAAGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGAACCCCCAGCTCTGCTACCAGGACACGATTTTGTGGAAG(SEQ ID NO:50)。
在一种实施方式中，完整的EC1人her2/neu片段跨越人her2/neu基因的58-979bp并且如(SEQ ID NO:54)所示。
GCCGCGAGCACCCAAGTGTGCACCGGCACAGACATGAAGCTGCGGCTCCCTGCCAGTCCCGAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTCTACCAGGGCTGCCAGGTGGTGCAGGGAAACCTGGAACTCACCTACCTGCCCACCAATGCCAGCCTGTCCTTCCTGCAGGATATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTGCTCATCGCTCACAACCAAGTGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTGTGCGAGGCACCCAGCTCTTTGAGGACAACTATGCCCTGGCCGTGCTAGACAATGGAGACCCGCTGAACAATACCACCCCTGTCACAGGGGCCTCCCCAGGAGGCCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGCCTCACAGAGATCTTGAAAGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGAACCCCCAGCTCTGCTACCAGGACACGATTTTGTGGAAGGACATCTTCCACAAGAACAACCAGCTGGCTCTCACACTGATAGACACCAACCGCTCTCGGGCCTGCCACCCCTGTTCTCCGATGTGTAAGGGCTCCCGCTGCTGGGGAGAGAGTTCTGAGGATTGTCAGAGCCTGACGCGCACTGTCTGTGCCGGTGGCTGTGCCCGCTGCAAGGGGCCACTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCTGCCGGCTGCACGGGCCCCAAGCACTCTGACTGCCTGGCCTGCCTCCACTTCAACCACAGTGGCATCTGTGAGCTGCACTGCCCAGCCCTGGTCACCTACAACACAGACACGTTTGAGTCCATGCCCAATCCCGAGGGCCGGTATACATTCGGCGCCAGCTGTGTGACTGCCTGTCCCTACAACTACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGAT(SEQ ID NO:54)。
在另一实施方式中，编码用于嵌合体中的人her2/neu EC2片段的核酸序列跨越人her2/neu EC2片段的1077-1554bp并且包括50bp延伸，并且如(SEQ ID NO:51)所示。
AATATCCAGGAGTTTGCTGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTCTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCAGCCTCCAACACTGCCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCCAAGTGTTTGAGACTCTGGAAGAGATCACAGGTTACCTATACATCTCAGCATGGCCGGACAGCCTGCCTGACCTCAGCGTCTTCCAGAACCTGCAAGTAATCCGGGGACGAATTCTGCACAATGGCGCCTACTCGCTGACCCTGCAAGGGCTGGGCATCAGCTGGCTGGGGCTGCGCTCACTGAGGGAACTGGGCAGTGGACTGGCCCTCATCCACCATAACACCCACCTCTGCTTCGTGCACACGGTGCCCTGGGACCAGCTCTTTCGGAACCCGCACCAAGCTCTGCTCCACACTGCCAACCGGCCAGAGGACGAGTGTGTGGGCGAGGGCCTGGCCTGCCACCAGCTGTGCGCCCGAGGG(SEQ ID NO:51)。
在一种实施方式中，完整的EC2人her2/neu片段跨越人her2/neu基因的907-1504bp并且如(SEQ ID NO:55)所示。
TACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGATGGAACACAGCGGTGTGAGAAGTGCAGCAAGCCCTGTGCCCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACTTGCGAGAGGTGAGGGCAGTTACCAGTGCCAATATCCAGGAGTTTGCTGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTCTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCAGCCTCCAACACTGCCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCCAAGTGTTTGAGACTCTGGAAGAGATCACAGGTTACCTATACATCTCAGCATGGCCGGACAGCCTGCCTGACCTCAGCGTCTTCCAGAACCTGCAAGTAATCCGGGGACGAATTCTGCACAATGGCGCCTACTCGCTGACCCTGCAAGGGCTGGGCATCAGCTGGCTGGGGCTGCGCTCACTGAGGGAACTGGGCAGTGGACTGGCCCTCATCCACCATAACACCCACCTCTGCTTCGTGCACACGGTGCCCTGGGACCAGCTCTTTCGGAACCCGCACCAAGCTCTGCTCCACACTGCCAACCGGCCAGAG(SEQ ID NO:55)。
在另一实施方式中，编码用于嵌合体中的人her2/neu IC1片段的核酸序列如(SEQ ID NO:52)所示。
CAGCAGAAGATCCGGAAGTACACGATGCGGAGACTGCTGCAGGAAACGGAGCTGGTGGAGCCGCTGACACCTAGCGGAGCGATGCCCAACCAGGCGCAGATGCGGATCCTGAAAGAGACGGAGCTGAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCTGGCGCTTTTGGCACAGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCTGATGGGGAGAATGTGAAAATTCCAGTGGCCATCAAAGTGTTGAGGGAAAACACATCCCCCAAAGCCAACAAAGAAATCTTAGACGAAGCATACGTGATGGCTGGTGTGGGCTCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCTGACATCCACGGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTCTTAGACT(SEQ ID NO:52)。
在另一实施方式中，编码完整的人her2/neu IC1片段的核酸序列跨越人her2/neu基因的2034-3243，并且如(SEQ ID NO:56)所示。
CAGCAGAAGATCCGGAAGTACACGATGCGGAGACTGCTGCAGGAAACGGAGCTGGTGGAGCCGCTGACACCTAGCGGAGCGATGCCCAACCAGGCGCAGATGCGGATCCTGAAAGAGACGGAGCTGAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCTGGCGCTTTTGGCACAGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCTGATGGGGAGAATGTGAAAATTCCAGTGGCCATCAAAGTGTTGAGGGAAAACACATCCCCCAAAGCCAACAAAGAAATCTTAGACGAAGCATACGTGATGGCTGGTGTGGGCTCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCTGACATCCACGGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTCTTAGACCATGTCCGGGAAAACCGCGGACGCCTGGGCTCCCAGGACCTGCTGAACTGGTGTATGCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGATGTGCGGCTCGTACACAGGGACTTGGCCGCTCGGAACGTGCTGGTCAAGAGTCCCAACCATGTCAAAATTACAGACTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGACGAGACAGAGTACCATGCAGATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAGTGGATGGCGCTGGAGTCCATTCTCCGCCGGCGGTTCACCCACCAGAGTGATGTGTGGAGTTATGGTGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGGCCAAACCTTACGATGGGATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGACCTGCTGGAAAAGGGGGAGCGGCTGCCCCAGCCCCCCATCTGCACCATTGATGTCTACATGATCATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTCTGAATGTCGGCCAAGATTCCGGGAGTTGGTGTCTGAATTCTCCCGCATGGCCAGGGACCCCCAGCGCTTTGTGGTCATCCAGAATGAGGACTTGGGCCCAGCCAGTCCCTTGGACAGCACCTTCTACCGCTCACTGCTGGAGGACGATGACATGGGGGACCTGGTGGATGCTGAGGAGTATCTGGTACCCCAGCAGGGCTTCTTCTGTCCAGACCCTGCCCCGGGCGCTGGGGGCATGGTCCACCACAGGCACCGCAGCTCATCTACCAGGAGTGGCGGTGGGGACCTGACACTAGGGCTGGAGCCCTCTGAAGAGGAGGCCCCCAGGTCTCCACTGGCACCCTCCGAAGGGGCT(SEQ ID NO:56)。
在一种实施方式中，本文提供的方法和组合物中使用的LLO是李斯特氏菌LLO。在一种实施方式中，LLO所源自的李斯特氏菌是单核细胞增生李斯特氏菌(LM)。在另一实施方式中，李斯特氏菌是伊氏李斯特氏菌(Listeria ivanovii)。在另一实施方式中，李斯特氏菌是威氏李斯特氏菌(Listeria welshimeri)。在另一实施方式中，李斯特氏菌是斯氏李斯特氏杆菌(Listeria seeligeri)。在另一实施方式中，LLO蛋白是非李斯特氏菌LLO蛋白。在另一实施方式中，LLO蛋白是合成的LLO蛋白。在另一实施方式中，其是重组LLO蛋白。
在一种实施方式中，LLO蛋白由(SEQ ID NO:3)所示的下列核酸序列编码
atgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgat(SEQ ID NO:3)。
在另一实施方式中，LLO蛋白具有序列SEQ ID NO:4
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYD(SEQ ID NO:4)
对应该序列的前蛋白的前25个氨基酸是信号序列并且当其被细菌分泌时从LLO切下。因此，在该实施方式中，全长活性LLO蛋白长504个残基。在另一实施方式中，LLO蛋白具有在GenBank编号DQ054588、DQ054589、AY878649、U25452或U25452中所示的序列。在另一实施方式中，LLO蛋白是LLO蛋白的变体。在另一实施方式中，LLO蛋白是LLO蛋白的同系物。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在另一实施方式中，“截短的LLO”或“tLLO”指包含PEST样结构域的LLO的片段。在另一实施方式中，该术语指不含有氨基端活化结构域并且不包括484位胱氨酸的LLO片段。在另一实施方式中，LLO片段由PEST序列组成。在另一实施方式中，LLO片段包含PEST序列。在另一实施方式中，LLO片段由529个氨基酸全长LLO蛋白的大约前400至441个氨基酸组成。在另一实施方式中，LLO片段是LLO蛋白的非溶血性形式。
在本发明的方法和组合物的另一实施方式中，由本发明的方法和组合物的核酸序列编码的多肽是包含嵌合Her-2/neu抗原和另外的多肽的融合蛋白，而在另一实施方式中，融合蛋白尤其包含LM非溶血性LLO蛋白等(本文实施例)。
在一种实施方式中，LLO片段大约由残基1-25组成。在另一实施方式中，LLO片段大约由残基1-50组成。在另一实施方式中，LLO片段大约由残基1-75组成。在另一实施方式中，LLO片段大约残基由1-100组成。在另一实施方式中，LLO片段大约由残基1-125组成。在另一实施方式中，LLO片段大约由残基1-150组成。在另一实施方式中，LLO片段大约由残基1175组成。在另一实施方式中，LLO片段大约由残基1-200组成。在另一实施方式中，LLO片段大约由残基1-225组成。在另一实施方式中，LLO片段大约由残基1-250组成。在另一实施方式中，LLO片段大约由残基1-275组成。在另一实施方式中，LLO片段大约由残基1-300组成。在另一实施方式中，LLO片段大约由残基1-325组成。在另一实施方式中，LLO片段大约由残基1-350组成。在另一实施方式中，LLO片段大约由残基1-375组成。在另一实施方式中，LLO片段大约由残基1-400组成。在另一实施方式中，LLO片段大约由残基1-425组成。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在另一实施方式中，本发明的方法和组合物的融合蛋白包含PEST序列，其来自LLO蛋白或来自其它生物体，例如原核生物。
在另一实施方式中，PEST样AA序列具有选自SEQ ID NO:5-9的序列。在另一实施方式中，PEST样序列是来自LM ActA蛋白的PEST样序列。在另一实施方式中，PEST样序列是KTEEQPSEVNTGPR(SEQ ID NO:5)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(SEQ ID NO:6)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQ ID NO:7)或RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(SEQ ID NO:8)。在另一实施方式中，PEST样序列是来自链球菌(Streptococcus sp.)的链球菌溶血素O蛋白。在另一实施方式中，PEST样序列是来自酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的链球菌溶血素O，例如在AA35-51的KQNTASTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:9)。在另一实施方式中，PEST样序列来自似马链球菌(Streptococcus equisimilis)的链球菌溶血素O，例如在AA38-54的KQNTANTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:10)。在另一实施方式中，PEST样序列是源自原核生物的另一PEST样AA序列。在另一实施方式中，PEST样序列是本领域已知的任何其他PEST样序列。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在一种实施方式中，抗原与LM的PEST样序列融合增强抗原的细胞介导的和抗肿瘤的免疫。因此，抗原与源自其他原核生物的其他PEST样序列融合也增强抗原的免疫原性。例如，根据如Rechsteiner和Rogers(1996,Trends Biochem.Sci.21:267-271)描述的用于LM的方法鉴定其他原核生物的PEST样序列。或者，也可基于该方法鉴定来自其他原核生物的PEST样AA序列。其他原核生物(其中期望具有PEST样AA序列)包括，但不限于其他李斯特氏菌种。在另一实施方式中，PEST样序列嵌入抗原性蛋白中。因此，在另一实施方式中，“融合体”涉及包含抗原和连接在抗原的一端或嵌入抗原的PEST样氨基酸序列的抗原性蛋白。
在另一实施方式中，本文提供了包含本发明的重组多肽的疫苗。在另一实施方式中，本文提供了由本发明的重组多肽组成的疫苗。
在另一实施方式中，本文提供了编码本发明的重组多肽的核苷酸分子。在另一实施方式中，本文提供了包含核苷酸分子的疫苗。
在另一实施方式中，本文提供了编码本发明的重组多肽的核苷酸分子。
在另一实施方式中，本文提供了由本发明的核苷酸分子编码的重组多肽。
在另一实施方式中，本文提供了包含本发明的核苷酸分子或重组多肽的疫苗。
在另一实施方式中，本文提供了包含本发明的核苷酸分子或重组多肽的免疫原性组合物。
在另一实施方式中，本文提供了包含本发明的核苷酸分子或重组多肽的载体。
在另一实施方式中，本文提供了包含本发明的核苷酸分子的李斯特氏菌的重组体形式。
在另一实施方式中，本文提供了包含本发明李斯特氏菌的重组体形式的疫苗。
在另一实施方式中，本文提供了本发明李斯特氏菌的重组体形式的培养物。
在一种实施方式中，用于本发明方法的疫苗包含如本文所述任何形式或实施方式的重组单核细胞增生李斯特氏菌。在一种实施方式中，本发明使用的疫苗由如本文所述任何形式或实施方式的本发明的重组单核细胞增生李斯特氏菌组成。在另一实施方式中，用于本发明方法的疫苗基本上由如本文所述任何形式或实施方式的本发明的重组单核细胞增生李斯特氏菌组成。在一种实施方式中，术语“包含”指疫苗中包括重组单核细胞增生李斯特氏菌，以及包括本领域可已知的其他疫苗或治疗。在另一实施方式中，术语“基本上由……组成”涉及其功能组分是重组单核细胞增生李斯特氏菌的疫苗，但是，其可包括不直接参与疫苗的治疗效果的疫苗的其他组分，并且可涉及例如有利于重组单核细胞增生李斯特氏菌的作用(例如稳定、保存等)的组分。在另一实施方式中，术语“由……组成”涉及含有重组单核细胞增生李斯特氏菌的疫苗。
在另一实施方式中，本发明的方法包括施用以如本文所述任何形式或实施方式的重组单核细胞增生李斯特氏菌的步骤。在一种实施方式中，本发明的方法由施用以如本文所述任何形式或实施方式的本发明的重组单核细胞增生李斯特氏菌的步骤组成。在另一实施方式中，本发明的方法基本上由施用以如本文所述任何形式或实施方式的本发明的重组单核细胞增生李斯特氏菌的步骤组成。在一种实施方式中，术语“包括”指在方法中包括施用重组体单核细胞增生李斯特氏菌的步骤，以及包括本领域已知的其他方法或治疗。在另一实施方式中，术语“基本上由……组成”涉及其功能步骤是施用重组单核细胞增生李斯特氏菌的方法，但是，其可包括不直接参与方法的治疗效果的方法的其他步骤，并且可例如涉及有利于施用重组单核细胞增生李斯特氏菌的效果的步骤。在一种实施方式中，术语“由……组成”涉及施用重组单核细胞增生李斯特氏菌的方法，没有另外的步骤。
在另一实施方式中，本发明的方法和组合物的李斯特氏菌是单核细胞增生李斯特氏菌。在另一实施方式中，李斯特氏菌是伊氏李斯特氏菌。在另一实施方式中，李斯特氏菌是威氏李斯特氏菌。在另一实施方式中，李斯特氏菌是斯氏李斯特氏菌。每个类型的李斯特氏菌代表本发明的独立的实施方式。
在一种实施方式中，本发明的方法和组合物的李斯特氏菌株是ADXS31-164菌株。在另一实施方式中，ADXS31-164刺激来自野生型FVB/N小鼠的脾细胞分泌IFN-γ。进一步，本文提供的数据显示ADXS31-164能够引起对位于靶抗原不同结构域的人表位的抗Her2/neu特异性免疫应答。
在另一实施方式中，本发明提供包含编码Her-2嵌合蛋白或其片段的核苷酸分子的李斯特氏菌的重组体形式。
在一种实施方式中，本发明提供在对象中诱导抗Her-2免疫应答的方法，包括给对象施用包含与Her-2嵌合蛋白融合或与其片段融合的LLO蛋白的N末端片段的重组多肽，从而在对象中诱导抗Her-2免疫应答。
在一种实施方式中，本发明的方法和组合物的融合蛋白包含来自LLO的LLO信号序列。在另一实施方式中，两个分子的蛋白质(LLO片段和抗原)直接连接。在另一实施方式中，两个分子通过由一个或更多个氨基酸组成的短间隔肽连接。在一种实施方式中，间隔没有特定生物活性，而是连接蛋白质或在它们之间保持一些最小的距离或其他空间关系。在另一实施方式中，选择组成间隔的氨基酸以影响分子的一些性质，比如折叠、净电荷或疏水性。在另一实施方式中，两个分子的蛋白质(LLO片段和抗原)分别合成或未融合。在另一实施方式中，两个分子的蛋白质分别由相同的核酸合成。在再一个实施方式中，两个分子单独地由单独的核酸合成。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在另一实施方式中，本文提供了在对象中诱导抗Her-2免疫应答的方法，包括给对象施用编码包含与Her-2嵌合蛋白融合或与其片段融合的LLO蛋白的N末端片段的重组多肽的重组核苷酸，从而在对象中诱导抗Her-2免疫应答。
在一种实施方式中，本文提供了在对象中引起对表达Her2/neu的肿瘤的增强的免疫应答的方法，而在另一实施方式中，该方法包括给对象施用包含本文提供的重组李斯特氏菌疫苗株的组合物。在另一实施方式中，针对表达Her-2的肿瘤的免疫应答包括对Her-2蛋白的次优势表位的免疫应答。在另一实施方式中，针对表达Her-2的肿瘤的免疫应答包括对Her-2蛋白的数个次优势表位的免疫应答。在另一实施方式中，针对表达Her-2的肿瘤的免疫应答包括对Her-2蛋白的至少1-5个次优势表位的免疫应答。在另一实施方式中，针对表达Her-2的肿瘤的免疫应答包括对Her-2蛋白的至少1-10个次优势表位的免疫应答。在另一实施方式中，针对表达Her-2的肿瘤的免疫应答包括对Her-2蛋白的至少1-17个次优势表位的免疫应答。在另一实施方式中，针对表达Her-2的肿瘤的免疫应答包括对Her-2蛋白的至少17个次优势表位的免疫应答。
已经报道，当小片段李斯特氏菌基疫苗或曲妥珠单抗(trastuzumab)(针对位于Her2/neu抗原的胞外结构域的表位的单克隆抗体)靶向抗性肿瘤时，致癌蛋白Her2/neu中的点突变或氨基酸删除介导对抗性肿瘤细胞的治疗。本文描述了嵌合Her2/neu基组合物，其具有Her2/neu抗原的两个胞外和一个胞内片段，显示致癌基因的MHC-I型表位簇。具有Her2/neu抗原的3个H2Dq和至少17个定位的人MHC-I型表位的该嵌合蛋白与单核细胞增生李斯特氏菌的李斯特氏菌溶胞素O蛋白的前441个氨基酸融合，并且通过单核细胞增生李斯特氏菌减毒株LmddA表达和分泌。
之前的报道已经显示，当用分别表达和分泌Her2/neu抗原的小片段(其每个仅仅具有Her2/neu致癌基因的一个H2Dq表位)的李斯特氏菌基疫苗免疫Her2/neu转基因小鼠时，过表达Her2/neu的肿瘤可由于被每个疫苗靶向的Her2/neu抗原的那些表位中的突变而逃逸(见Singh R,Paterson Y.Immunoediting sculpts tumor epitopes during immunotherapy.Cancer Res2007;67:1887-92)。本文表明了下述预料不到的结果：当三个或更多个Her2/neu蛋白的表位并入嵌合疫苗时，其可消除这些肿瘤由于逃逸突变的选择和逃逸。用新的Her2/neu嵌合李斯特氏菌疫苗的免疫不产生任何逃逸突变——其可能与Her2/neu抗原中的点突变或氨基酸删除相关(见本文实施例4)。
在一种实施方式中，本文提供了改造李斯特氏菌疫苗株以表达Her-2嵌合蛋白或表达嵌合蛋白的重组多肽的方法，该方法包括用核酸分子转化李斯特氏菌株。在另一实施方式中，核酸分子包含编码多肽的第一开放阅读框，其中多肽包含Her2/neu嵌合抗原。在另一实施方式中，核酸分子进一步包含编码代谢酶的第二开放阅读框，其中所述代谢酶补充重组李斯特氏菌株的染色体中没有的内源基因，从而改造李斯特氏菌疫苗株，以表达Her-2嵌合蛋白。
在一种实施方式中，本文提供的方法和组合物进一步包含佐剂，而在另一实施方式中，佐剂包括粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂苷QS21、单磷酰脂质A或含有未甲基化CpG的寡核苷酸。
在一种实施方式中，减毒的李斯特氏菌株，比如LM delta-actA突变体(Brundage等,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90:11890-11894)、单核细胞增生李斯特氏菌delta-plcA(Camilli等，1991，J.Exp.Med.，173:751-754)或delta-ActA、delta INL-b(Brockstedt等，2004,PNAS,101:13832–13837)用于本发明。在另一实施方式中，如本领域技术人员在具备本文公开内容时所理解的，通过引入一个或更多个减毒的突变来构建减毒的李斯特氏菌株。这种菌株的例子包括，但不限于对芳香氨基酸营养缺陷型的李斯特氏菌株(Alexander等,1993,Infection and Immunity1061:2245-2248)和脂磷壁酸形成的突变体(Abachin等,2002,Mol.Microbiol.43:1-14)以及通过缺少致病基因减毒的那些(见本文实施例)。
在另一实施方式中，本发明的方法和组合物的核酸分子与启动子/调节序列可操作地连接。在另一实施方式中，本发明的方法和组合物的第一开放阅读框与启动子/调节序列可操作地连接。在另一实施方式中，本发明的方法和组合物的第二开放阅读框与启动子/调节序列可操作地连接。在另一实施方式中，每个开放阅读框与启动子/调节序列可操作地连接。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
当具备本公开内容和本文提供的方法时，本领域技术人员容易理解不同的转录启动子、终止子、运载载体或具体的基因序列(例如商业上可获得的克隆载体中的那些)可成功用于本发明的方法和组合物。如本发明中所考虑，这些功能在，例如，商业上可获得的称为pUC系列的载体中提供。在另一实施方式中，去除非必需DNA序列(例如抗生素抗性基因)。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。在另一实施方式中，在本发明中使用商业上可获得的质粒。这些质粒可从各种来源获得，例如，Invitrogen(La Jolla,CA)、Stratagene(La Jolla,CA)、Clontech(Palo Alto,CA)，或可使用本领域熟知的方法构建。
另一实施方式是质粒比如pCR2.1(Invitrogen，La Jolla，CA)，其是原核表达载体，具有有利于在原核生物中表达的原核复制起点和启动子/调节元件。在另一实施方式中，去除外源核苷酸序列，以减小质粒的尺寸并且增加可放置在其中的盒的尺寸。
这种方法是本领域熟知的，并且在，例如，Sambrook等(1989，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork)和Ausubei等(1997，Current Protocols in Molecular Biology，Green&Wiley，New York)中描述。
抗生素抗性基因用于在分子生物学和疫苗制备中通常采用的常规选择和克隆方法中。本发明考虑的抗生素抗性基因包括，但不限于，赋予对氨苄青霉素、青霉素、甲氧西林、链霉素、红霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素(CAT)、新霉素、潮霉素、庆大霉素和本领域熟知的其他抗生素的抗性的基因产物。每个基因代表本发明的独立的实施方式。
转化细菌的方法是本领域熟知的，包括基于感受态细胞的氯化钙法、电穿孔法、噬菌体-介导的转导、化学和物理转化技术(de Boer等,1989,Cell56:641-649;Miller等,1995,FASEB J.,9:190-199;Sambrook等.1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork;Ausubel等.,1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley &Sons,New York;Gerhardt等.,eds.,1994,Methods for General and MolecularBacteriology,American Society for Microbiology,Washington,DC;Miller,1992,A Short Course in Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.)。在另一实施方式中，通过电穿孔转化本发明的李斯特氏菌疫苗株。每种方法代表本发明的独立的实施方式。
在另一实施方式中，接合(conjugation)用于引导遗传物质和/或质粒进入细菌。接合的方法是本领域熟知的，并且在，例如，Nikodinovic J等(A secondgeneration snp-derived Escherichia coli-Streptomyces shuttle expression vectorthat is generally transferable by conjugation.Plasmid.2006Nov;56(3):223-7)和Auchtung JM等(Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element byintercellular signaling and the global DNA damage response.Proc Natl Acad SciU S A.2005Aug30;102(35):12554-9)中描述。每种方法代表本发明的独立的实施方式。
在一种实施方式中，“转化”与术语“转染”同等地使用，指改造细菌细胞以摄取质粒或其他异源DNA分子。在另一实施方式中，“转化”指改造细菌细胞，以表达质粒或其他异源DNA分子的基因。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在本文其他地方描述了本发明中可用的质粒和其他表达载体，并且可包括这些特征如：启动子/调节序列、革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的复制起点、编码融合蛋白的分离的核酸和编码氨基酸代谢基因的分离的核酸。进一步，编码融合蛋白和氨基酸代谢基因的分离的核酸具有适于驱动这种分离的核酸表达的启动子。可用于在细菌系统中驱动表达的启动子是本领域熟知的，包括噬菌体λ、pBR322的β-内酰胺酶基因的bla启动子和pBR325的氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。原核启动子进一步的例子包括5噬菌体λ的主要右和左启动子(PL和PR)，大肠杆菌(E.coli)的trp、recA、lacZ、lad和gal启动子，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的α-淀粉酶(Ulmanen等,1985.J.Bacteriol.162:176-182)和S28-特异性启动子(Gilman等，1984Gene32:11-20)，芽孢杆菌属的噬菌体的启动子(Gryczan，1982，In：The MolecularBiology of the Bacilli，Academic Press，Inc.，New York)，和链霉菌属启动子(Ward等，1986，Mol.Gen.Genet.203:468-478)。本发明考虑的另外的原核启动子综述于，例如，Glick(1987，J.Ind.Microbiol.1:277-282)；Cenatiempo，(1986，Biochimie,68:505-516)；和Gottesman，(1984，Ann.Rev.Genet.18:415-442)中。本发明考虑的启动子/调节元件的进一步例子包括，但不限于李斯特氏菌prfA启动子、李斯特氏菌hly启动子、李斯特氏菌p60启动子和李斯特氏菌ActA启动子(GenBank Acc.No.NC_003210)或其片段。
在另一实施方式中，本发明的方法和组合物的质粒包括编码融合蛋白的基因。在另一实施方式中，克隆子序列并且使用适当的限制酶切割适当的子序列。在另一实施方式中，然后连接片段，以产生期望的DNA序列。在另一实施方式中，使用DNA扩增方法，例如聚合酶链反应(PCR)产生编码抗原的DNA。首先，分别扩增在新末端任一侧上的天然DNA的区段。一个扩增序列的5'端编码肽接头，同时另一扩增序列的3'端也编码肽接头。因为第一片段的5'端与第二片段的3'端互补，两个片段(在部分纯化之后，例如在LMP琼脂糖上)可用作第三PCR反应中的重叠模板。扩增的序列将含有密码子、开放位点的羧基侧的区段(现在形成氨基序列)、接头和开放位点的氨基侧的序列(现在形成羧基序列)。抗原连接入质粒。每种方法代表本发明的独立的实施方式。
在另一实施方式中，本发明进一步包括用于临床应用的基于噬菌体的染色体整合系统。使用包括但不限于，d-丙氨酸消旋酶的必需酶的营养缺陷型的宿主菌株，例如Lmdal(-)dat(-)。在另一实施方式中，为了避免“噬菌体自愈步骤(phage curing step)”，使用基于PSA的噬菌体整合系统(Lauer等，2002J Bacteriol，184:4177-4186)。在另一实施方式中，这需要通过抗生素持续选择，以保持整合的基因。因此，在另一实施方式中，本发明使得基于噬菌体的染色体整合系统能够建立，其不需要用抗生素选择。而是互补营养缺陷型宿主菌株。
在另一实施方式中，使用重组DNA方法合成本发明的重组蛋白。在一种实施方式中，这包括产生编码融合蛋白的DNA序列，将该DNA在具体启动子/调节元件的控制下放置在表达盒，比如本发明的质粒中，并且表达蛋白。在另一实施方式中，通过任何合适的方法制备编码本发明融合蛋白(例如非溶血性LLO/抗原)的DNA，所述方法包括例如克隆和限制性酶切适当的序列或通过下述方法直接化学合成，比如Narang等的磷酸三酯方法(1979，Meth.Enzymol.68:90-99)；Brown等的磷酸二酯方法(1979，Meth.Enzymol68:109-151)；Beaucage等的二乙基磷酰胺酸法(1981，Tetra.Lett.，22：151859-1862)；和美国专利号4,458,066的固体支持方法。
在另一实施方式中，化学合成用于产生单链寡核苷酸。在各种实施方式中，通过与互补序列杂交，或通过使用单链作为模板用DNA聚合酶聚合，该单链寡核苷酸转化成双链DNA。本领域技术人员会认识到尽管DNA的化学合成限于大约100碱基的序列，但可通过连接较短的序列来获得更长的序列。在另一实施方式中，克隆子序列并且使用适当的限制酶切割适当的子序列。然后连接片段，以产生期望的DNA序列。
在另一实施方式中，使用DNA扩增方法比如聚合酶链反应(PCR)，克隆编码本发明的融合蛋白或重组蛋白的DNA。因此，其使用包含合适的限制性酶切位点的有义引物和包含另一限制性酶切位点例如有利于克隆的不同限制性酶切位点的反义引物，PCR扩增非溶血性LLO的基因。对于编码抗原的分离的核酸，重复同样操作。连接非溶血性LLO和抗原序列并且插入质粒或载体，产生编码连接抗原末端的非溶血性LLO的载体。直接或通过限制性酶切位点引入的短间隔连接两个分子。
在另一实施方式中，通过由一个或更多个氨基酸组成的肽间隔物分开分子，通常间隔没有特定的生物活性，而是连接蛋白或在它们之间保持一些最小的距离或其他空间关系。在另一实施方式中，选择间隔的组成AA，以影响分子的一些性质，比如折叠、净电荷或疏水性。在另一实施方式中，将编码融合或重组蛋白的核酸序列转化入各种宿主细胞，包括大肠杆菌，其他细菌宿主，比如李斯特氏菌、酵母菌，和各种高级真核细胞比如COS、CHO和HeLa细胞系和骨髓瘤细胞系。重组融合蛋白基因与每个宿主的适当表达控制序列可操作地连接。本文其他地方详细描述了启动子/调节序列。在另一实施方式中，质粒进一步包含另外的启动子调节元件，以及核糖体结合位点和转录终止信号。对于真核细胞，控制序列将包括源自例如免疫球蛋白基因，SV40，巨细胞病毒等的启动子和增强子，和多聚腺苷酸序列。在另一实施方式中，序列包括剪接供体和受体序列。
在一种实施方式中，术语“可操作地连接”指其中如此描述的组分以允许它们以它们打算的方式起作用的关系毗邻。控制序列与编码序列“可操作地连接”是以这样的方式连接，其使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现。
在另一实施方式中，为了选择包含质粒的营养缺陷型细菌，转化的营养缺陷型细菌在选择表达氨基酸代谢基因的培养基上生长。在另一实施方式中，用包含D-谷氨酸合成基因的质粒转化对D-谷氨酸合成营养缺陷型的细菌，并且营养缺陷型细菌将在没有D-谷氨酸的情况下生长，而没有用质粒转化，或不表达编码用于D-谷氨酸合成的蛋白质的质粒的营养缺陷型细菌将不生长。在另一实施方式中，当D-丙氨酸合成营养缺陷型的细菌被转化和表达本发明的质粒(如果质粒包含编码用于D-丙氨酸合成的氨基酸代谢酶的分离核酸)时，其将在没有D-丙氨酸的情况下生长。这种制造包含或缺乏必须生长因子、添加物、氨基酸、维生素、抗生素等的适当培养基的方法是本领域熟知的，并且商业上可获得的(Becton-Dickinson，FranklinLakes，NJ)。每种方法代表本发明的独立的实施方式。
在另一实施方式中，包含本发明质粒的营养缺陷型细菌在适当的培养基上选择后，细菌在存在选择压力的情况下增殖。这种增殖包括细菌在没有营养缺陷型因子的培养基中生长。营养缺陷型细菌中表达氨基酸代谢酶的质粒的存在使得质粒连同细菌一起复制，从而连续地选择具有该质粒的细菌。当具备本公开内容和本文方法时，本领域技术人员能够容易地通过调整其中包含质粒的营养缺陷型细菌生长的培养基的体积，来扩大生产李斯特氏菌疫苗载体的规模。
在另一实施方式中，本领域技术人员会理解，采用其他其他营养缺陷型菌株和补充系统与本发明一起使用。
在一种实施方式中，本文提供了在对象中阻碍表达Her-2的肿瘤生长的方法，其中以及在另一实施方式中，该方法包括给对象施用包含本文所述的重组李斯特氏菌疫苗株的组合物的步骤。
在另一实施方式中，本文提供了在对象中阻碍表达Her-2的肿瘤生长的方法，其中以及在另一实施方式中，该方法包括给对象施用包含本文所述的重组李斯特氏菌疫苗株的组合物的步骤。
在另一实施方式中，本文提供了在对象中引起对表达Her2/neu的肿瘤的增强的免疫应答的方法，其中以及在另一实施方式中，该方法包括给对象施用包含本文所述的重组李斯特氏菌疫苗株的组合物的步骤。在再一个实施方式中，针对表达Her2/neu的肿瘤的免疫应答包括对Her2/neu蛋白的至少一个次优势表位的免疫应答。
在一种实施方式中，本文提供了防止在治疗过表达Her2/neu的肿瘤中逃逸突变的方法，其中以及在另一实施方式中，该方法包括给所述对象施用包含本文提供的重组李斯特氏菌疫苗株的组合物的步骤。
在另一实施方式中，本文提供了在对象中预防表达Her2/neu抗原的肿瘤发作的方法，其中以及在另一实施方式中，该方法包括给对象施用包含本文提供的重组李斯特氏菌疫苗株的组合物的步骤。
在一种实施方式中，本文提供了降低肿瘤内T调节细胞频率的方法，其中以及在另一实施方式中，该方法包括给对象施用包含本文提供的重组李斯特氏菌疫苗株的组合物的步骤。
在另一实施方式中，本文提供了降低肿瘤内T调节细胞频率的方法，其中以及在另一实施方式中，该方法包括给对象施用包含本文提供的重组李斯特氏菌疫苗株的组合物的步骤。
在一种实施方式中，本文提供了降低肿瘤内骨髓源的抑制细胞频率的方法，其中以及在另一实施方式中，该方法包括给对象施用包含本文提供的重组李斯特氏菌疫苗株的组合物的步骤。
在另一实施方式中，本文提供了降低骨髓源的抑制细胞频率的方法，其中以及在另一实施方式中，该方法包括给对象施用包含本文提供的重组李斯特氏菌疫苗株的组合物的步骤。
在一种实施方式中，本文提供了在对象中预防形成表达Her2/neu的肿瘤的方法，其中以及在另一实施方式中，该方法包括给对象施用包含本文提供的重组李斯特氏菌疫苗株的组合物的步骤。
在另一实施方式中，本文提供了在对象中预防形成表达Her2/neu的肿瘤的方法，其中以及在另一实施方式中，该方法包括给对象施用包含本文提供的重组李斯特氏菌疫苗株的组合物的步骤。
在一种实施方式中，本文提供了在对象中治疗表达Her2/neu的肿瘤的方法，其中以及在另一实施方式中，该方法包括给对象施用包含本文提供的重组李斯特氏菌疫苗株的组合物的步骤。
在一种实施方式中，本文提供了施用本发明的组合物的方法。在另一实施方式中，本文提供了施用本发明的疫苗的方法。在另一实施方式中，本文提供了施用本发明的重组多肽或重组核苷酸的方法。在另一实施方式中，施用本发明的组合物、疫苗、重组多肽或重组核苷酸的步骤利用包含该组合物、疫苗、重组核苷酸或表达重组多肽的减毒重组体形式的李斯特氏菌进行，每个在其自身分立的实施方式中。在另一实施方式中，施用利用不同的减毒细菌载体进行。在另一实施方式中，施用利用DNA疫苗(例如裸DNA疫苗)进行。在另一实施方式中，通过重组地产生蛋白，然后给对象施用重组蛋白，进行本发明的重组多肽的施用。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在另一实施方式中，通过本发明的方法和组合物引起的免疫应答包括CD8+T细胞介导的应答。在另一实施方式中，免疫应答主要由CD8+T细胞介导的应答组成。在另一实施方式中，唯一可检测的免疫应答的组分是CD8+T细胞介导的应答。
在另一实施方式中，本文提供的方法和组合物引起的免疫应答包括CD4+T细胞介导的应答。在另一实施方式中，免疫应答主要由CD4+T细胞介导的应答组成。在另一实施方式中，唯一可检测的免疫应答的组分是CD4+T细胞介导的应答。在另一实施方式中，CD4+T细胞介导的应答伴随着针对抗原的可检测的抗体应答。在另一实施方式中，CD4+T细胞介导的应答不伴随对抗原的可检测的抗体应答。
在另一实施方式中，本发明提供在对象中诱导针对抗原的次优势CD8+T细胞表位的CD8+T细胞介导的免疫应答的方法，其包括下述步骤：(a)将编码Her2-neu嵌合抗原或其片段的核苷酸分子与编码LLO蛋白N末端片段的核苷酸分子融合，从而产生编码LLO-抗原融合蛋白的重组核苷酸；和(b)给对象施用重组核苷酸或LLO-抗原融合体；从而诱导针对抗原的次优势CD8+T细胞表位的CD8+T细胞介导的免疫应答。
在一种实施方式中，本文提供了增加CD8+/T调节细胞的肿瘤内比例的方法，其中以及在另一实施方式中，该方法包括给对象施用包含本发明重组多肽、重组李斯特氏菌或重组体载体的组合物的步骤。
在另一实施方式中，本文提供了增加CD8+/T调节细胞的肿瘤内比例的方法，其中以及在另一实施方式中，该方法包括给对象施用包含本发明重组多肽、重组李斯特氏菌或重组体载体的组合物的步骤。
在另一实施方式中，本文提供的方法和组合物引起的免疫应答包括对抗原的至少一个次优势表位的免疫应答。在另一实施方式中，免疫应答包括对至少一个优势表位的免疫应答。在另一实施方式中，免疫应答基本上由对至少一个次优势表位的免疫应答组成。在另一实施方式中，唯一可检测的免疫应答的组分是对至少一个次优势表位的免疫应答。每个类型的免疫应答代表本发明的独立的实施方式。
测量免疫应答的方法是本领域熟知的，其包括，例如测量肿瘤生长的抑制、流式细胞术、靶细胞溶解试验(例如铬释放试验)、四聚体的使用等。每种方法代表本发明的独立的实施方式。
在另一实施方式中，本发明提供在对象中阻碍表达Her-2的肿瘤生长的方法，其中以及在另一实施方式中，该方法包括给对象施用包含与Her-2嵌合蛋白或其片段融合的LLO蛋白的N末端片段的重组多肽或编码该重组多肽的重组核苷酸，其中对象增加针对表达Her-2的肿瘤的免疫应答，从而在对象中阻碍表达Her-2的肿瘤的生长。
在另一实施方式中，本发明提供改善Her-2嵌合蛋白的抗原性的方法，其中以及在另一实施方式中，该方法包括下述步骤：将编码LLO蛋白的N末端片段的核苷酸与编码Her-2蛋白或其片段的核苷酸融合，以产生重组核苷酸，从而改善Her-2嵌合蛋白的抗原性。
在另一实施方式中，本文提供了改善Her-2嵌合蛋白抗原性的方法，其中以及在另一实施方式中，该方法包括改造李斯特氏菌株，以表达重组核苷酸。在另一实施方式中，使用不同的细菌载体来表达重组核苷酸。在另一实施方式中，细菌载体是减毒的。在另一实施方式中，使用DNA疫苗(例如裸DNA疫苗)来表达重组核苷酸。在另一实施方式中，通过重组地产生蛋白质，然后给对象施用重组蛋白进行由核苷酸编码的LLO-Her-2嵌合融合肽的施用。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在一种实施方式中，本发明提供肿瘤的“表位扩展”的方法。在另一实施方式中，使用本文提供的组合物和方法的免疫诱导在其他肿瘤上表位扩展，所述其他肿瘤具有本发明疫苗中携带的抗原以外的抗原。
在另一实施方式中，优势表位或次优势表位在被治疗的对象中分别是优势的或次优势的。在另一实施方式中，优势表位或次优势表位在被治疗的群体中是优势的或次优势的。
在一种实施方式中，本文提供了在对象中通过表位扩展治疗、阻碍或抑制癌症或肿瘤生长的方法，其中以及在另一实施方式中，癌症与本发明的组合物中包含的抗原或其片段的表达相关。在另一实施方式中，方法包括给对象施用包含本发明的重组多肽、重组李斯特氏菌或重组体载体的组合物。在再一个实施方式中，对象增加针对表达抗原的癌症或表达抗原的肿瘤的免疫应答，从而在对象中治疗、阻碍或抑制癌症或肿瘤生长。
在一种实施方式中，“优势CD8+T细胞表位”指被超过30%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位，所述抗原特异性CD8+T细胞通过用蛋白质进行疫苗接种、或因包含该蛋白质的病原体感染或因包含该蛋白质的癌症细胞的恶性生长而引发。在另一实施方式中，该术语指被超过35%的如此引发的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过40%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过45%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过50%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过55%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过60%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过65%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过70%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过75%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过80%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过85%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过90%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过95%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过96%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过97%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过98%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。
在一种实施方式中，“次优势CD8+T细胞表位”指被小于30%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位，所述抗原特异性CD8+T细胞通过用蛋白质进行疫苗接种、或因包含该蛋白质的病原体感染或因包含该蛋白质的癌症细胞的恶性生长而引发。在另一实施方式中，该术语指被小于28%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过26%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被小于24%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过22%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被小于20%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过18%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被小于16%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过14%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过12%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被小于10%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过8%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被小于6%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被小于5%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被超过4%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被小于3%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被小于2%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被小于1%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一实施方式中，该术语指被小于0.5%的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。
每种类型的优势表位和次优势表位代表本发明的独立的实施方式。
在一种实施方式中，本发明的方法和组合物中的抗原在对象的非肿瘤细胞上以可检测的水平表达。在另一实施方式中，抗原以可检测的水平表达于对象的至少一定百分比(例如0.01%、0.03%、0.1%、0.3%、1%、2%、3%或5%)的非肿瘤细胞上。在一种实施方式中，“非肿瘤细胞”指瘤体之外的细胞。在另一实施方式中，“非肿瘤细胞”指非恶性细胞。在另一实施方式中，“非肿瘤细胞”指非转化的细胞。在另一实施方式中，非肿瘤细胞是体细胞。在另一实施方式中，非肿瘤细胞是生殖细胞。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在一种实施方式中，“可检测的水平”指标准测定法可检测的水平。在一种实施方式中，测定法是免疫学测定。在一种实施方式中，测定法是酶联免疫测定(ELISA)。在另一实施方式中，测定法是蛋白质印迹。在另一实施方式中，测定法是FACS。本领域技术人员理解本领域可用的任何其他测定法可用于本文提供的方法。在另一实施方式中，可检测的水平相对于具体测定法的背景水平确定。本领域技术人员熟知进行这些技术每一个的方法，并且每个技术代表本发明的独立的实施方式。
在一种实施方式中，用表达重组抗原的LM的疫苗接种诱导表位扩展。在另一实施方式中，用LLO-抗原融合体接种疫苗，即使在Her2的环境(context)之外，也诱导表位扩展。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在另一实施方式中，本发明提供阻碍表达Her-2的肿瘤在对象中的生长的方法，包括给对象施用包含与Her-2嵌合抗原融合的LLO蛋白的N末端片段的重组多肽，其中抗原具有一个或多个次优势CD8+T细胞表位，其中对象增加针对表达抗原的肿瘤的免疫应答，从而阻碍表达Her-2的肿瘤在对象中的生长。在另一实施方式中，抗原不含有任何优势CD8+T细胞表位。在另一实施方式中，本文提供了阻碍表达Her-2的肿瘤在对象中生长的方法，包括给对象施用包含编码本文提供的重组多肽的重组核苷酸的重组体形式的李斯特氏菌。
在另一实施方式中，本发明提供了诱导在具有癌症的宿主中形成细胞毒性T细胞的方法，包括给宿主施用本发明的组合物，从而在具有癌症的宿主中诱导形成细胞毒性T细胞。
在另一实施方式中，本发明提供降低癌症发生率的方法，包括施用本发明的组合物。在另一实施方式中，本发明提供使癌症减轻的方法，包括施用本发明的组合物。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在一种实施方式中，给对象的细胞离体施用组合物；在另一实施方式中，给供体的细胞离体施用组合物；在另一实施方式中，给供体的细胞体内施用组合物，然后转移至对象。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在一种实施方式中，本发明的方法治疗的癌症是乳腺癌。在另一实施方式中，癌症是含有Her2的癌症。在另一实施方式中，癌症是黑素瘤。在另一实施方式中，癌症是胰腺癌。在另一实施方式中，癌症是卵巢癌。在另一实施方式中，癌症是胃癌。在另一实施方式中，癌症是胰腺的癌损伤。在另一实施方式中，癌症是肺腺癌。在另一实施方式中，癌症是结肠直肠腺癌。在另一实施方式中，癌症是肺鳞腺癌。在另一实施方式中，癌症是胃腺癌。在另一实施方式中，癌症是卵巢表面上皮瘤(例如其良性、增生性或恶性变种)。在另一实施方式中，癌症是口腔鳞状细胞癌。在另一实施方式中，癌症是非小细胞肺癌。在另一实施方式中，癌症是CNS癌。在另一实施方式中，癌症是子宫内膜癌。在另一实施方式中，癌症是膀胱癌。在另一实施方式中，癌症是头颈癌。在另一实施方式中，癌症是前列腺癌。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在本发明的方法的另一实施方式中，对象增加针对表达抗原的肿瘤或靶抗原的免疫应答，从而介导抗肿瘤作用。
在另一实施方式中，本发明提供治疗癌症的免疫原性组合物，该组合物包含截短的LLO与Her-2嵌合蛋白的融合体。在另一实施方式中，免疫原性组合物进一步包含表达该融合体的李斯特氏菌株。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。在另一实施方式中，本发明提供治疗癌症的免疫原性组合物，该组合物包含表达Her-2嵌合蛋白的李斯特氏菌株。
在一种实施方式中，本发明的治疗方案是治疗性的。在另一实施方式中，该方案是预防性的。在另一实施方式中，本发明的疫苗用于保护处在癌症(比如乳腺癌或其他类型的含有Her2的肿瘤)风险的人们，如本领域技术人员理解的，这种风险是因为家庭遗传或使他们倾向于这些类型疾病的其他环境。在另一实施方式中，疫苗用于通过外科手术切除(debulking)肿瘤生长、常规的化疗或放射治疗之后的癌症免疫疗法。这些治疗之后，施用本发明的疫苗，从而对肿瘤抗原的疫苗的CTL应答破坏剩余的转移灶并且延长癌症的缓解期。在另一实施方式中，本发明的疫苗用于影响之前建立的肿瘤的生长并且杀死现有的肿瘤细胞。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在另一实施方式中，在上述任何方法中使用的疫苗和免疫原性组合物具有本发明的疫苗和免疫原性组合物的任何特征。每个特征代表本发明的独立的实施方式。
本发明考虑剂量范围的各种实施方式。在一种实施方式中，在疫苗载体的情况下，剂量范围为0.4LD50/剂。在另一实施方式中，剂量为从大约0.4-4.9LD50/剂。在另一实施方式中，剂量为从大约0.5-0.59LD50/剂。在另一实施方式中，剂量为从大约0.6-0.69LD50/剂。在另一实施方式中，剂量为从大约0.7-0.79LD50/剂。在另一实施方式中，剂量是大约0.8LD50/剂。在另一实施方式中，剂量是0.4LD50/剂至0.8LD50/剂。
在另一实施方式中，剂量是107个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是1.5x107个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是2x107个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是3x107个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是4x107个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是6x107个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是8x107个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是1x108个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是1.5x108个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是2x108个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是3x108个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是4x108个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是6x108个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是8x108个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是1x109个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是1.5x109个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是2x109个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是3x109个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是5x109个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是6x109个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是8x109个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是1x1010个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是1.5x1010个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是2x1010个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是3x1010个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是5x1010个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是6x1010个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是8x1010个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是8x109个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是1x1011个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是1.5x1011个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是2x1011个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是3x1011个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是5x1011个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是6x1011个细菌/剂。在另一实施方式中，剂量是8x1011个细菌/剂。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在一种实施方式中，给对象单独施用本发明的疫苗或免疫原性组合物。在另一实施方式中，疫苗或免疫原性组合物与另一癌症疗法一起施用。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在一种实施方式中，本发明的方法和组合物的重组李斯特氏菌用编码Her-2嵌合抗原或LLO-Her-2嵌合抗原融合体的构建体稳定地转化。在一种实施方式中，该构建体含有多接头以有利于进一步亚克隆。生产重组李斯特氏菌数个技术是已知的。
在一种实施方式中，构建体或核酸分子使用同源重组整合至李斯特氏菌染色体。同源重组的技术是本领域熟知的，并且在，例如，Baloglu S,BoyleSM，等(Immune responses of mice to vaccinia virus recombinants expressingeither Listeria monocytogenes partial listeriolysin or Brucella abortus ribosomalL7/L12protein.Vet Microbiol2005,109(1-2):11-7)；和Jiang LL,Song HH等,(Characterization of a mutant Listeria monocytogenes strain expressing greenfluorescent protein.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)2005,37(1):19-24)中进行了描述。在另一实施方式中，根据美国专利号6,855,320中提供的描述进行同源重组。在该情况下，通过E7基因的染色体整合制造表达E7的重组LM菌株，产生称为Lm-AZ/E7的重组体，其中所述E7基因在hly启动子控制下并且包含hly信号序列以确保基因产物的分泌。在另一实施方式中，用温度敏感性质粒选择重组体。每个技术代表本发明的独立的实施方式。
在另一实施方式中，使用转座子插入将构建体或核酸分子整合至李斯特氏菌染色体。转座子插入的技术是本领域熟知的，并且尤其被Sun等(Infection and Immunity1990，58：3770-3778)在DP-L967的构建中描述。在另一实施方式中，转座子诱变具有可形成稳定的基因组插入突变体的优势，但是其劣势是外源基因在基因组中插入的位置是未知的。
在另一实施方式中，使用噬菌体整合位点将构建体或核酸分子整合至李斯特氏菌染色体(Lauer P,Chow MY等,Construction,characterization,anduse of two Listeria monocytogenes site-specific phage integration vectors.JBacteriol2002;184(15):4177-86)。在该方法的某些实施方式中，用噬菌体(例如U153或PSA李斯特氏噬菌体)的整合酶基因和附着位点将异源基因插入对应的附着位点，其可以是基因组中任何适当的位点(例如comK或argtRNA基因的3’端)。在另一实施方式中，内源性原噬菌体从使用的附着位点自愈，然后整合构建体或异源基因。在另一实施方式中，该方法产生单拷贝整合体。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在另一实施方式中，各种启动子的一种用于表达抗原或含有该抗原的融合蛋白。在一种实施方式中，使用LM启动子，例如hly、actA、plca、plcB和mpl基因的启动子，上述基因用于编码李斯特氏菌蛋白质，分别是溶血素、actA、磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶、磷脂酶C和金属蛋白酶。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在另一实施方式中，本发明的方法和组合物使用本发明的Her-2嵌合蛋白或LLO序列的同系物。在另一实施方式中，本发明的方法和组合物使用来自非人哺乳动物的Her-2嵌合蛋白。在一种实施方式中，当提及任何蛋白质或肽时，术语“同源性”、“同源的”等指候选序列中与对应天然多肽的残基相同的氨基酸残基的百分数，这在比对序列和引入空隙(如果需要)以实现最大百分数同源性以后，并且不考虑任何保守替换作为部分序列相同性。比对的方法和计算机程序是本领域熟知的。
在另一实施方式中，当提及任何核酸序列时，术语“同源性”类似地指示候选序列中与对应的天然核酸序列的核苷酸相同的核苷酸的百分数。
在一种实施方式中，通过序列比对的计算机算法、通过本领域充分描述的方法确定同源性。例如，核酸序列同源性的计算机算法分析可包括使用任何数量可用的软件包，比如，例如，BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLAST增强的比对效用)、GENPEPT和TREMBL包。
在另一实施方式中，“同源性”指与选自SEQ ID NO:1-4的序列的相同性大于70%。在另一实施方式中，“同源性”指与选自SEQ ID NO:1-4序列的相同性大于72%。在另一实施方式中，相同性大于75%。在另一实施方式中，相同性大于78%。在另一实施方式中，相同性大于80%。在另一实施方式中，相同性大于82%。在另一实施方式中，相同性大于83%。在另一实施方式中，相同性大于85%。在另一实施方式中，相同性大于87%。在另一实施方式中，相同性大于88%。在另一实施方式中，相同性大于90%。在另一实施方式中，相同性大于92%。在另一实施方式中，相同性大于93%。在另一实施方式中，相同性大于95%。在另一实施方式中，相同性大于96%。在另一实施方式中，相同性大于97%。在另一实施方式中，相同性大于98%。在另一实施方式中，相同性大于99%。在另一实施方式中，相同性是100%。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在另一实施方式中，通过确定候选序列杂交确定同源性，其方法在本领域中充分描述(见，例如，“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,andHiggins S.J.,Eds.(1985);Sambrook等,2001,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.;以及Ausubel等,1989,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and WileyInterscience,N.Y)。例如，与编码天然半胱天冬酶肽的DNA互补物杂交的方法可在中等至严格条件下进行。杂交条件是，例如，在42℃下温育过夜，所述温育在包含：10-20%甲酰胺、5X SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5X Denhardt's溶液、10%硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的剪切的鲑鱼精子DNA的溶液中进行。
在本发明的一种实施方式中，“核酸”指一串至少两个碱基-糖-磷酸酯的组合。在一种实施方式中，该术语包括DNA和RNA。在一种实施方式中，“核苷酸”指核酸聚合物的单体单元。在一种实施方式，RNA可为tRNA(转运RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA、小抑制RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和核酶的形式。已经对siRNA和miRNA的使用进行了描述(Caudy AA等，Genes & Devel16：2491-96和其参考文献)。DNA可为质粒DNA、病毒DNA、线性DNA或染色体DNA或这些组的衍生物的形式。另外，这些形式的DNA和RNA可以是单链、双链、三链或四链的。在另一实施方式中，该术语也包括人工核酸，其可含有其他类型的骨架但是碱基相同。在一种实施方式中，人工核酸是PNA(肽核酸)。PNA含有肽骨架和核苷酸碱基，并且在一种实施方式中，能够与DNA和RNA分子结合。在另一实施方式中，核苷酸是氧杂环丁烷(oxetane)修饰的。在另一实施方式中，通过用硫代磷酸酯键替换一个或多个磷酸二酯键修饰核苷酸。在另一实施方式中，人工核酸含有本领域已知的天然核酸的磷酸酯骨架的任何其他变体。本领域技术人员知道硫代磷酸酯核酸和PNA的使用，并且在，例如，Neilsen PE,Curr Opin Struct Biol9:353-57和Raz NK等Biochem Biophys Res Commun.297:1075-84中进行了描述。本领域技术人员知道核酸的生产和使用并且在例如Molecular Cloning,(2001),Sambrook and Russell,eds.and Methods in Enzymology:Methods formolecular cloning in eukaryotic cells(2003)Purchio and G.C.Fareed中进行了描述。每个核酸衍生物代表本发明的独立的实施方式。
在一种实施方式中，通过本领域充分描述的方法确定本文列举的任何氨基酸序列的蛋白质和/或肽的同源性，所述方法包括免疫印迹分析、或通过氨基酸序列的计算机算法分析(使用可用的许多软件包的任意一种)、通过已制定的方法。这些包的一些可包括FASTA、BLAST，MPsrch或Scanps包，并且可采用，例如Smith和Waterman算法的使用，和/或全局/局部或BLOCKS比对进行分析。每种确定同源性的方法代表本发明的独立的实施方式。
在另一实施方式中，本发明提供一种试剂盒，其包含进行本发明的方法使用的试剂。在另一实施方式中，本发明提供一种试剂盒，其包含本发明的组合物、工具或器械。
在一种实施方式中，术语“接触”或“施用”指癌细胞或肿瘤与本发明的组合物直接接触。在另一实施方式中，该术语指癌细胞或肿瘤与本发明的组合物间接接触。在另一实施方式中，本发明的方法包括这样的方法，其中对象接触本发明的组合物，其后通过本领域已知的使化合物在体内循环的扩散或任何其他主动运输或被动运输方法，使组合物接触癌细胞或肿瘤。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
在另一实施方式中，术语“基因”和“重组基因”指包含编码本发明多肽的开放阅读框的核酸分子。典型地，这种天然等位变型可在给定基因的核苷酸序列中产生1-5%变异。可选的等位基因可通过测序许多不同个体或生物体中感兴趣的基因来鉴定。这可通过使用杂交探针容易地实行，以鉴定许多个体或生物体中相同的基因座。任何和所有这种核苷酸变异和所得的氨基酸多态性或变异(其是天然等位变异的结果并且不改变功能活性)在本发明的范围内。
药物组合物
在另一实施方式中，通过本领域技术人员已知的任何方法，比如肠胃外、癌周围(paracancerally)、经粘膜、经皮、肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内、阴道内或肿瘤内，给对象施用含有本发明的疫苗和组合物的药物组合物。
在本文提供的方法和组合物的另一实施方式中，口服施用疫苗或组合物，因此，其配制为适于口服施用的形式，即作为固体或液体制剂。合适的固体口服剂型包括片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂、小球等。合适的液体口服剂型包括溶液、悬浮液、分散剂、乳液、油等。在本发明的另一实施方式中，有效成分配制在胶囊中。按照该实施方式，除了活性化合物和惰性载体或稀释剂，本发明的组合物还包括硬凝胶胶囊。
在另一实施方式中，通过静脉内、动脉内或肌内注射液体制剂施用疫苗或组合物。合适的液体剂型包括溶液、悬浮液、分散剂、乳液、油等。在一种实施方式中，静脉内施用药物组合物，因此其配制为适于静脉内施用的形式。在另一实施方式中，动脉内施用药物组合物，因此其配制为适于动脉内施用的形式。在另一实施方式中，肌内施用药物组合物，因此其配制为适于肌内施用的形式。
在一种实施方式中，术语“治疗”指治愈疾病。在另一实施方式中，“治疗”指预防疾病。在另一实施方式中，“治疗”指降低疾病的发生率。在另一实施方式中，“治疗”指改善疾病的症状。在另一实施方式中，“治疗”指增加患者的无表现存活或总体存活。在另一实施方式中，“治疗”指稳定疾病的进展。在另一实施方式中，“治疗”指诱导缓解。在另一实施方式中，“治疗”指使疾病的进展减慢。在另一实施方式中，术语“降低”、“遏制(suppressing)”和“抑制(inhibiting)”指减轻或降低。每种可能性代表本发明的独立的实施方式。
如本文所使用，术语“大约”在数量术语中指加或减5%，或在另一实施方式中加或减10%，或在另一实施方式中加或减15%，或在另一实施方式中加或减20%。
在一种实施方式中，术语“对象”指哺乳动物，包括需要治疗或易感于病症或其后遗症的犬科动物。对象可包括各种品种的狗、动物园动物和人，所述动物园动物包括狼、猫、猪、母牛、绵羊、山羊、马、大鼠和小鼠。术语“对象”不排除在所有方面正常的个体。
在一种实施方式中，出于治疗目的，术语“哺乳动物”指归类为哺乳动物的任何动物，包括人，家养和农场动物，和动物园、运动或宠物动物，比如犬科动物(包括狗)和马、猫、牛、猪、绵羊等。
在一种实施方式中，犬科动物可以是成年或幼年犬科动物。
提及肿瘤的治疗时，“治疗有效量”指能够引起一种或多种下列作用的量：(1)在一定程度上抑制肿瘤生长，包括，使生长变慢和完全抑制生长；(2)减少肿瘤细胞的数量；(3)减少肿瘤尺寸；(4)抑制(即，减少、减慢或完全停止)肿瘤细胞浸润入外周器官；(5)抑制(即，减少、减慢或完全停止)转移；(6)增强抗肿瘤免疫应答，其可以，但是不必须导致肿瘤的退行或排斥；和/或(7)在一定程度上缓解一个或多个与疾病相关的症状。出于治疗肿瘤目的，可凭经验或以常规途径确定本文提供的疫苗的“治疗有效量”。
展示下列实施例，以便更充分阐明本发明优选的实施方式。但是，绝不应认为它们限制本发明的范围。
实施例
材料和方法
寡核苷酸由Invitrogen(Carlsbad，CA)合成，并且由Genewiz Inc，SouthPlainfield，NJ进行DNA测序。流式细胞术试剂购买自Becton DickinsonBiosciences(BD，San Diego，CA)。细胞培养基、添加物和所有其他试剂，除非指出，来自Sigma(St.Louise,MO)。由EZbiolabs(Westfield，IN)合成Her2/neu HLA-A2肽。完全RPMI1640(C-RPMI)培养基含有2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠、10%胎牛血清、青霉素/链霉素、Hepes(25mM)。之前描述了多克隆抗LLO抗体，而抗Her2/neu抗体购买自Sigma。
小鼠和细胞系
根据IACUC核准的方案在宾夕法尼亚大学或罗格斯大学进行所有动物实验。FVB/N小鼠购买自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)。在宾夕法尼亚大学的动物中心机构圈养和饲养过表达大鼠Her2/neu肿瘤蛋白的FVB/NHer2/neu转基因小鼠。NT-2肿瘤细胞系表达高水平的大鼠Her2/neu蛋白，其源自这些小鼠的自发性乳房肿瘤，其培养如之前描述。DHFR-G8(3T3/neu)细胞获得自ATCC，并且根据ATCC建议培养。EMT6-Luc细胞系是来自Dr.John Ohlfest(University of Minnesota，MN)的慷慨礼物并且在完全C-RPMI培养基中培养。在宾夕法尼亚大学(Philadelphia，PA)小动物成像机构(SAIF)的指导下进行生物荧光工作。
李斯特氏菌构建体和抗原表达
宾夕法尼亚大学的Dr.Mark Greene友好地提供了Her2/neu-pGEM7Z，其含有克隆入pGEM7Z质粒(Promega，Madison WI)的全长人Her2/neu(hHer2)基因。该质粒用作模板，使用表1所示的pfx DNA聚合酶(Invitrogen)和寡核苷酸，通过PCR扩增hHer-2/neu的三个区段，即，EC1、EC2和IC1。
表1：克隆人her-2-嵌合体的引物
通过SOEing PCR方法和每个单独的hHer-2/neu区段作为模板直接融合产生Her-2/neu嵌合构建体。引物显示在表2中。
用于扩增不同区段人Her2区域的引物的序列
使用XhoI和SpeI限制酶从pAdv138切除ChHer2基因，并且将其克隆在Lmdd穿梭载体(pAdv134)中具有LLO的截短的、非溶血性片段的框架中。通过DNA测序分析确认插入体、LLO和hly启动子的序列。将该质粒电穿孔入电感受态actA、dal、dat突变体单核细胞增生李斯特氏菌株，在含有链霉素(250μg/ml)的脑心浸液(BHI)琼脂平板上选择LmddA和阳性克隆。在一些实验中，表达hHer2/neu(Lm-hHer2)片段的类似李斯特氏菌株用于比较目的。这些之前已经描述了。在所有研究中，包括不相关李斯特氏菌构建体(Lm-对照)，以考虑李斯特氏菌对免疫系统的抗原独立作用。Lm-对照基于与ADXS31-164相同的李斯特氏菌平台，但是表达不同的抗原比如HPV16-E7或NY-ESO-1。测试来自李斯特氏菌的融合蛋白的表达和分泌。每个构建体在体内传代两次。
细胞毒性试验
每组3-5只FVB/N小鼠，各组以一周间隔用1x108菌落形成单位(CFU)的Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164、Lm-hHer2ICI或Lm-对照(表达不相关抗原)免疫三次或不免疫。NT-2细胞在体外生长，通过胰蛋白酶分离并且用丝裂霉素C(无血清C-RPMI培养基中250μg/ml)在37℃下处理45分钟。冲洗5次之后，它们与从免疫或未免疫动物收获的脾细胞以1:5的(刺激物:效应器)比一起在37℃和5%CO2下温育5天。使用铕标记的3T3/neu(DHFR-G8)细胞作为靶，根据之前描述的方法，进行标准细胞毒性试验。在4小时温育之后，使用分光光度计(Perkin Elmer，Victor2)在590nm下测量从杀死的靶细胞释放的铕。特异性溶胞百分数定义为(实验组的溶胞-自发的溶胞)/(最大值溶胞-自发的溶胞)。
来自免疫小鼠的脾细胞的干扰素-γ分泌
每组3-5只FVB/N或HLA-A2转基因小鼠，各组以一周间隔用1x108CFU的ADXS31-164、阴性李斯特氏菌对照(表达不相关抗原)免疫三次或不免疫。最后一次免疫之后一周，自FVB/N小鼠分离脾细胞，并且以5x106个细胞/孔在24孔板中的C-RPMI培养基内与丝裂霉素C处理的NT-2细胞共同培养。在存在1μM的HLA-A2特异性肽或1μg/ml的重组His-加标签的ChHer2蛋白(大肠杆菌中产生并且由镍基亲和层析系统纯化)的情况下，温育来自HLA-A2转基因小鼠的脾细胞。24或72小时之后获得来自上清液的样品，并且使用小鼠干扰素-γ(IFN-γ)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒根据制造商的建议测试IFN-γ的存在。
Her2转基因动物中的肿瘤研究
用5x108CFU的Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164或Lm-对照免疫六周龄FVB/N大鼠Her2/neu转基因小鼠(9-14只/组)6次。一周两次观察它们的自发性乳房肿瘤的出现，使用电子卡尺测量，持续上至52周。当逃逸的(escaped)肿瘤平均直径达到1cm2的尺寸时将其切除并且在-20℃保存于RNAlater中。为了确定Her2/neu蛋白中的突变对这些肿瘤逃逸的效果，使用基因组DNA分离试剂盒提取基因组DNA并且测序。
ADXS31-164对脾和肿瘤中调节性T细胞的作用
小鼠皮下(s.c.)植入1x106个NT-2细胞。在第7、14和21天，它们用1x108CFU的ADXS31-164、LmddA-对照免疫或不免疫。在28天提取肿瘤和脾，并且通过FACS分析测试CD3+/CD4+/FoxP3+Treg的存在。简言之，通过在C-RPMI培养基中、两个载玻片之间均质化脾分离脾细胞。使用无菌剃刀刀片切碎肿瘤，并且用PBS中含有DNase(12U/ml)和胶原酶(2mg/ml)的缓冲液消化。在RT下搅拌温育60min之后，通过强力抽吸分离细胞。用RBC溶胞缓冲液裂解红细胞，随后用含有10%FBS的完全RPMI-1640培养基冲洗数次。通过尼龙网筛过滤之后，肿瘤细胞和脾细胞重悬在FACS缓冲液(2%FBS/PBS)中并且用抗CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC、CD25-APC抗体染色，随后进行透化，并且用抗Foxp3-PE染色。使用4-色FACS calibur(BD)进行流式细胞术分析，并且使用细胞寻找软件(BD)分析数据。
统计分析
log-rank Chi-Squared测试用于存活数据而学生t-检验用于CTL和ELISA试验，其进行三次。在这些分析中小于0.05的p值(标记为*)认为是统计学上显著的。所有统计分析用Prism软件，V.4.0a(2006)或SPSS软件，V.15.0(2006)进行。对于所有的FVB/N大鼠Her2/neu转基因研究，除非另外说明，每组我们使用8-14只小鼠，对于所有野生型FVB/N研究，每组我们使用至少8只小鼠。所有研究重复至少一次，除了Her2/neu转基因小鼠模型中的长期肿瘤研究。
实施例1：产生分泌与Her-2片段融合的LLO片段的单核细胞增生李斯特氏菌株：ADXS31-164的构建。
之前描述了嵌合Her2/neu基因(ChHer2)的构建。简言之，通过SOEingPCR方法，直接融合Her2/neu蛋白的两个胞外(aa40-170和aa359-433)和一个胞内片段(aa678-808)产生ChHer2基因。嵌合蛋白具有大部分已知的人MHC I型蛋白表位。从质粒pAdv138(其用于构建Lm-LLO-ChHer2)切除ChHer2基因并且克隆至LmddA穿梭质粒，产生质粒pAdv164(图1A)。在这两个质粒骨架之间有两个主要不同。1)尽管pAdv138使用氯霉素抗性标记(cat)用于体外选择重组细菌，但是pAdv164具有来自枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的D-丙氨酸消旋酶基因(dal)，其使用代谢补充路径进行体外选择和在没有dal-dat基因的LmddA菌株中的体内质粒保持。设计和开发该疫苗平台，以解决FDA对改造的李斯特氏菌疫苗株的抗生素抗性的担心。2)不同于pAdv138，pAdv164在质粒中没有prfA基因拷贝(见下面的序列和图1A)，因为这对于体内补充Lmdd菌株不是必需的。LmddA疫苗株也没有actA基因(负责李斯特氏菌的胞内运动和细胞至细胞的扩散)，所以源自该骨架的重组疫苗株的致病性比源自其母菌株Lmdd的致病性少100倍。LmddA基疫苗也比来自免疫小鼠脾的Lmdd基疫苗更快地清除(小于48小时)。来自该菌株的的融合蛋白tLLO-ChHer2的表达和分泌与体外生长8小时之后TCA沉淀的细胞培养物上清液中的Lm-LLO-ChHer2的表达和分泌相当(图1B)，因为通过抗LLO抗体，使用蛋白质印迹分析检测到～104KD的条带。用仅表达tLLO的李斯特氏菌骨架菌株作为阴性对照。
pAdv164序列(7075碱基对)(见图1)：
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ID NO：53)
实施例2：ADXS31-164具有如LM-LLO-ChHER2一样的免疫原性。
在标准CTL试验中，比较ADXS31-164的产生抗Her2/neu特异性细胞毒性T细胞的免疫原性性质与Lm-LLO-ChHer2疫苗的免疫原性性质。两个疫苗引起对由3T3/neu靶细胞表达的Her2/neu抗原强的但是相当的细胞毒性T细胞应答。因此，用仅表达与LLO融合的Her2胞内片段的李斯特氏菌免疫的小鼠显示比含有更多MHC I型表位的嵌合体更低的溶胞活性。在未免疫动物或注射不相关李斯特氏菌疫苗的小鼠中没有检测到CTL活性(图2A)。ADXS31-164也能够刺激来自野生型FVB/N小鼠的脾细胞分泌IFN-γ(图2B)。这是在这些细胞培养上清液中检测到的，这些细胞是与丝裂霉素C处理的表达高水平的Her2/neu抗原的NT-2细胞共同培养的(图5C)。
用ADXS31-164免疫之后，在HLA-A2小鼠中检测人MHC I型表位的适当的加工和呈递。来自免疫的HLA-A2转基因的脾细胞与对应SEQ ID NO:SEQ ID NO:SEQ ID NO:定位的HLA-A2限制表位的肽共同温育72小时，所述HLA-A2限制表位位于Her2/neu分子的胞外(HLYQGCQVV SEQ IDNO:11或KIFGSLAFL SEQ ID NO:12)或胞内(RLLQETELV SEQ ID NO:13)结构域(图2C)。用重组ChHer2蛋白作为阳性对照，不相关肽或没有肽作为阴性对照。来自该实验的数据显示ADXS31-164能够引起对位于靶抗原不同结构域的人表位的抗Her2/neu特异性免疫应答。
实施例3：ADXS31-164比LM-LLO-ChHER2在预防自发性乳房肿瘤的发作中更有效。
比较ADXS31-164与Lm-LLO-ChHer2在Her2/neu转基因动物中的抗肿瘤效果，所述转基因动物在20-25周龄产生缓慢生长、自发性乳房肿瘤。所有用不相关李斯特氏菌-对照疫苗免疫的动物在21-25周内产生乳腺肿瘤，并且在33周之前杀死。与此相反，李斯特氏-Her2/neu重组疫苗引起乳房肿瘤形成的明显延迟。在第45周，大于50%的ADXS31-164接种的小鼠(9只中的5只)仍然无肿瘤，与之相比，25%的用Lm-LLO-ChHer2免疫的小鼠仍然无肿瘤。在第52周，用ADXS31-164免疫的8只小鼠中的2只仍保持无肿瘤，而来自其他实验组的所有小鼠已经死于疾病(图3)。这些结果表明，尽管ADXS31-164更加减毒，但是其在Her2/neu转基因动物中预防自发性乳房肿瘤的发作中比Lm-LLO-ChHer2更有效。
实施例4：当用ADXS31-164免疫时，HER2/NEU基因的突变。
Her2/neu的MHC I型表位中的突变被认为是当用小片段疫苗或曲妥珠单抗(Herceptin，靶向Her2/neu胞外结构域中表位的单克隆抗体)免疫时，肿瘤逃逸的原因。为了评估这一点，从转基因动物的逃逸的肿瘤中提取基因组材料，并且对用嵌合或对照疫苗免疫的肿瘤中neu基因的对应片段进行测序。在任何接种疫苗的肿瘤样品的Her-2/neu基因中没有观察到突变，这提示另外的逃逸机制(数据未显示)。
实施例5：ADXS31-164引起肿瘤内T调节细胞的明显下降。
为了说明ADXS31-164对脾和肿瘤中调节性T细胞频率的作用，小鼠植入NT-2肿瘤细胞。三次免疫之后分离脾细胞和肿瘤内淋巴细胞并且进行Treg染色Treg，其定义为CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+细胞，尽管当单独分析时，用FoxP3或CD25标记获得相当的结果。结果表明与不相关李斯特氏菌疫苗或未免疫的动物相比，用ADXS31-164的免疫对脾中Treg的频率没有影响(见图4)。相反地，用李斯特氏菌疫苗免疫对肿瘤中Treg的存在造成明显的影响(图5A)。在未处理的肿瘤中所有CD3+T细胞中平均19.0%是Treg，该频率对于不相关疫苗下降至4.2%并且对于ADXS31-164下降至3.4%，肿瘤内Treg的频率下降5倍(图5B)。用LmddA疫苗处理的小鼠中肿瘤内Treg的频率的下降不可归因于肿瘤尺寸的差异。在代表性实验中，来自用ADXS31-164免疫的小鼠的肿瘤[平均直径(mm)±SD，6.71±0.43，n=5]明显小于来自未处理小鼠(8.69±0.98，n=5，p<0.01)或用不相关疫苗处理的小鼠(8.41±1.47，n=5，p=0.04)的肿瘤，而这后两组的比较显示肿瘤尺寸没有统计学上的显著差异(p=0.73)。用LmddA疫苗处理的肿瘤中更低频率的Treg产生增加的肿瘤内CD8/Treg比，这提示在用LmddA疫苗免疫之后可获得更有利的肿瘤微环境。但是，仅有表达靶抗原HER2/neu的疫苗(ADXS31-164)能够减少肿瘤生长，这表明Treg的下降仅仅在该存在对肿瘤中抗原特异性应答的情况下有作用。
实施例6：表达HER-2嵌合体的李斯特氏菌疫苗没有引入逃逸突变
收获用不同疫苗比如Lm-LLO-138、LmddA164和不相关疫苗Lm-LLO-NY免疫的小鼠的肿瘤样品。从这些样品纯化DNA，扩增对应Her-2/neu区域IC1、EC1和EC2的DNA片段，并测序来确定是否有免疫逃逸突变。来自每个DNA的序列的比对使用CLUSTALW进行。分析的结果表明从肿瘤收获的DNA序列中没有突变。这些序列的详细分析如下所示。
比对EC2(Her-2-neu的975-1029bp)
参照
GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT
(SEQ ID NO:14)
Lm-LLO-138-2 GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT
Lm-LLO-138-3 GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT
Lm-ddA-164-1 GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT
LmddA164-2 GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT
Lm-ddA-164-3 GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT
LmddA164-4 GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT
Lm-ddA-164-5 GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT
LmddA-164-6 GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTCTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT
参照
CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC
(SEQ ID NO:15)
Lm-LLO-138-2
CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC
Lm-LLO-138-3
CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC
Lm-ddA-164-1
CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC
LmddA164-2
CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC
Lm-ddA-164-3
CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC
LmddA164-4
CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC
Lm-ddA-164-5
CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC
LmddA-164-6
CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC
参照
AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG
(SEQ ID No:16)
Lm-LLO-138-2
AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG
Lm-LLO-138-3
AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG
Lm-ddA-164-1
AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG
LmddA164-2
AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG
Lm-ddA-164-3
AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG
LmddA164-4
AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG
Lm-ddA-164-5
AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG
LmddA-164-6
AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG
参照
AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG
(SEQ ID No:17)
Lm-LLO-138-2
AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG
Lm-LLO-138-3
AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG
Lm-ddA-164-1
AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG
LmddA164-2
AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG
Lm-ddA-164-3
AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG
LmddA164-4
AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG
Lm-ddA-164-5
AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG
LmddA-164-6
AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG参照
TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTC
(SEQ ID NO:18)
Lm-LLO-138-2
TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTC
Lm-LLO-138-3
TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTC
Lm-ddA-164-1
TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTC
LmddA164-2
TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTC
Lm-ddA-164-3
TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTC
LmddA164-4
TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTC
Lm-ddA-164-5
TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCANACAGTCTC
LmddA-164-6
TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCT
参照
CGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC
(SEQ ID NO:19)
Lm-LLO-138-2
CGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC
Lm-LLO-138-3
CGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC
Lm-ddA-164-1
CGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC
LmddA164-2
CGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC
Lm-ddA-164-3
CGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC
LmddA164-4
CGTGACCTCAGTGTCTTCCAAAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC
Lm-ddA-164-5
CGTGACCTCAGTGTCTTCCAAAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC
LmddA-164-6
CGTGACCTCAGTGTCTTCCAAAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC
参照
GCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGG
(SEQ ID NO:20)
Lm-LLO-138-2
GCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGG
Lm-LLO-138-3
GCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGG
Lm-ddA-164-1
GCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGG
LmddA164-3
GCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGG
Lm-ddA-164-5
GCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGG
Lm-ddA-164-6
GCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGG
参照
GAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACT
(SEQ ID NO:21)
Lm-LLO-138-2
GAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACT
Lm-LLO-138-3
GAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACT
Lm-ddA-164-1
GAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACT
LmddA164-3
GAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACT
Lm-ddA-164-5
GAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACT
Lm-ddA-164-6
GAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACT
参照
GTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGG
(SEQ ID NO:22)
Lm-LLO-138-2
GTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGG
Lm-LLO-138-3
GTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGG
Lm-ddA-164-1
GTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGG
LmddA164-3
GTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGG
Lm-ddA-164-5
GTACCTTGGGACCANCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGG
Lm-ddA-164-6
GTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGG
参照
CCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCAC
(SEQ ID NO:23)
Lm-LLO-138-2
CCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCAC
Lm-LLO-138-3
CCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCAC
Lm-ddA-164-1
CCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCAC
LmddA164-3
CCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCAC
Lm-ddA-164-6
CCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCAC
参照
TGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGTCATTTCCTTCGGGGCCAGGAG
(SEQ ID NO:24)
Lm-LLO-138-2
TGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGTCATTTCCTTCGGGGCCAGGAG
Lm-LLO-138-3
TGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGTCATTTCCTTCGGGGCCAGGAG
Lm-ddA-164-1
TGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGTCATTTCCTTCGGGGCCAGGAG
LmddA164-3
TGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGTCATTTCCTTCGGGGCCAGGAG
Lm-ddA-164-6
TGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCA-------------------------------------
比对IC1(Her-2-neu的2114-3042bp)
参照
CGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGC
(SEQ ID NO:25)
Lm-LLO-NY-2 CGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGC
Lm-LLO-138-4 CGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGC
Lm-ddA-164-2 CGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGC
Lm-ddA-164-3 CGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGC
Lm-ddA164-6 CGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGC
参照
TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA
(SEQ ID NO:26)
Lm-LLO-NY-1
TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA
Lm-LLO-NY-2
TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA
Lm-LLO-138-1
TAAGGAAGGTGAACGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA
Lm-LLO-138-2
TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA
Lm-LLO-138-3
TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA
Lm-LLO-138-4
TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA
Lm-ddA-164-1
TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA
Lm-ddA-164-2
TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA
Lm-ddA-164-3
TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA
Lm-ddA-164-4
TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA
Lm-ddA-164-5
TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA
Lm-ddA164-6
TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA
参照
TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT
(SEQ ID NO:27)
Lm-LLO-NY-1
TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT
Lm-LLO-NY-2
TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT
Lm-LLO-138-1
TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT
Lm-LLO-138-2
TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT
Lm-LLO-138-3
TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT
Lm-LLO-138-4
TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT
Lm-ddA-164-1
TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT
Lm-ddA-164-2
TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT
Lm-ddA-164-3
TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT
Lm-ddA-164-4
TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT
Lm-ddA-164-5
TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT
Lm-ddA164-6
TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT
参照
CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC
(SEQ ID NO:28)
Lm-LLO-NY-1
CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC
Lm-LLO-NY-2
CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC
Lm-LLO-138-1
CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC
Lm-LLO-138-2
CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC
Lm-LLO-138-3
CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC
lm-LLO-138-4
CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC
Lm-ddA-164-1
CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC
Lm-ddA-164-2
CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC
Lm-ddA-164-3
CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC
Lm-ddA-164-4
CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC
Lm-ddA-164-5
CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC
Lm-ddA164-6
CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC
参照
CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC
(SEQ ID NO:29)
Lm-LLO-NY-1
CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC
Lm-LLO-NY-2
CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC
Lm-LLO-138-1
CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC
Lm-LLO-138-2
CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC
Lm-LLO-138-3
CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC
Lm-LLO-138-4
CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC
Lm-ddA-164-1
CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC
Lm-ddA-164-2
CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC
Lm-ddA-164-3
CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC
Lm-ddA-164-4
CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC
Lm-ddA-164-5
CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC
Lm-ddA164-6
CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC
参照
TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC
(SEQ ID NO:30)
Lm-LLO-NY-1
TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC
Lm-LLO-NY-2
TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC
Lm-LLO-138-1
TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC
Lm-LLO-138-2
TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC
Lm-LLO-138-3
TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC
Lm-LLO-138-4
TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC
Lm-ddA-164-1
TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC
Lm-ddA-164-2
TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC
Lm-ddA-164-3
TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC
Lm-ddA-164-4
TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC
Lm-ddA-164-5
TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC
Lm-ddA164-6
TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC
参照
AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC
(SEQ ID NO:31)
Lm-LLO-NY-1
AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC
Lm-LLO-NY-2
AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC
Lm-LLO-138-1
AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC
Lm-LLO-138-2
AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC
Lm-LLO-138-3
AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC
Lm-LLO-138-4
AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC
Lm-ddA-164-1
AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC
Lm-ddA-164-2
AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC
Lm-ddA-164-3
AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC
Lm-ddA-164-4
AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC
Lm-ddA-164-5
AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC
Lm-ddA164-6
AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC
参照
GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA
(SEQ ID NO:32)
Lm-LLO-NY-1
GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA
Lm-LLO-NY-2
GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA
Lm-LLO-138-1
GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA
Lm-LLO-138-2
GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA
Lm-LLO-138-3
GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA
Lm-LLO-138-4
GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA
Lm-ddA-164-1
GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA
Lm-ddA-164-2
GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA
Lm-ddA-164-4
GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA
Lm-ddA-164-3
GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA
Lm-ddA-164-5
GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA
Lm-ddA164-6
GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA
参照
AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG
(SEQ ID NO:33)
Lm-LLO-NY-1
AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG
Lm-LLO-NY-2
AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG
Lm-LLO-138-1
AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG
Lm-LLO-138-2
AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG
Lm-LLO-138-3
AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG
Lm-LLO-138-4
AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG
Lm-ddA-164-1
AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG
Lm-ddA-164-2
AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG
Lm-ddA-164-3
AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG
Lm-ddA-164-4
AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG
Lm-ddA-164-5
AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG
Lm-ddA164-6
AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG
参照
ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA
(SEQ ID NO:34)
Lm-LLO-NY-1
ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA
Lm-LLO-NY-2
ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA
Lm-LLO-138-1
ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA
Lm-LLO-138-2
ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA
Lm-LLO-138-3
ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA
Lm-LLO-138-4
ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA
Lm-ddA-164-1
ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA
Lm-ddA-164-2
ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA
Lm-ddA-164-3
ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA
Lm-ddA-164-4
ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA
Lm-ddA-164-5
ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA
Lm-ddA-164-6
ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA
参照
CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG
(SEQ ID NO:35)
Lm-LLO-NY-1
CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG
Lm-LLO-NY-2
CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG
Lm-LLO-138-1
CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG
Lm-LLO-138-2
CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG
Lm-LLO-138-3
CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG
Lm-LLO-138-4
CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG
Lm-ddA-164-1
CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG
Lm-ddA-164-2
CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG
Lm-ddA-164-3
CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG
Lm-ddA-164-4
CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG
Lm-ddA-164-5
CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG
Lm-ddA164-6
CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG
参照
CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA
(SEQ ID NO:36)
Lm-LLO-NY-1CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA
Lm-LLO-NY-2 CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA
Lm-LLO-138-1 CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA
Lm-LLO-138-3 CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA
Lm-LLO-138-4 CCAAACCTTACGATGNAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA
Lm-ddA164-6 CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA
Lm-ddA-164-2 CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA
Lm-LLO-138-2 CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA
Lm-ddA-164-3 CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA
Lm-ddA-164-5 CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA
Lm-ddA-164-1 CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA
Lm-ddA-164-4 CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA
参照
CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT
(SEQ ID NO:37)
Lm-LLO-NY-1 CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT
Lm-LLO-NY-2 CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT
Lm-LLO-138-1 CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT
Lm-LLO-138-2 CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT
Lm-LLO-138-3 CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT
Lm-LLO-138-4 CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT
Lm-ddA-164-1 CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT
Lm-ddA-164-2 CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT
Lm-ddA-164-3 CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT
Lm-ddA-164-4 CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT
Lm-ddA-164-5 CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT
Lm-ddA164-6 CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT
参照
GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT
(SEQ ID NO:38)
Lm-LLO-NY-1
GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT
Lm-LLO-NY-2
GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT
Lm-LLO-138-2
GGATGATTGACTCTGAATGTCCCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAAAATTTT
Lm-LLO-138-3
GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT
Lm-LLO-138-4
GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT
Lm-ddA-164-1
GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT
Lm-ddA-164-2
GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT
Lm-ddA-164-3
GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT
Lm-ddA-164-5
GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT
Lm-ddA-164-4
GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT
Lm-ddA164-6
GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT
参照
CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT
(SEQ ID NO:39)
Lm-LLO-NY-1
CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT
Lm-LLO-NY-2
CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT
Lm-LLO-138-2
CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT
Lm-LLO-138-3
CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT
Lm-LLO-138-4
CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT
Lm-ddA-164-1
CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT
Lm-ddA-164-2
CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT
Lm-ddA-164-3
CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT
Lm-ddA-164-5
CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT
Lm-ddA-164-6
CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT
比对EC1(Her-2-neu的399-758bp)
参照
CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCT
(SEQ ID NO:40)
Lm-LLO-138-1
CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCT
Lm-LLO-138-2
CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCT
Lm-ddA-164-1
CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCT
LmddA-164-2
CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCT
LmddA-164-3
CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCT
LmddA164-4
CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCT
参照
GAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTG
(SEQ ID NO:41)
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GAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTG
Lm-LLO-138-2
GAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTG
Lm-ddA-164-1
GAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTG
LmddA-164-2
GAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTG
LmddA-164-3
GAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTG
LmddA164-4
GAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTG
参照
CCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCC
(SEQ ID NO:42)
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CCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCC
Lm-LLO-138-2
CCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCC
Lm-ddA-164-1
CCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCC
LmddA-164-2
CCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCC
LmddA-164-3
CCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCC
LmddA164-4
CCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCC
参照
GGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGG
(SEQ ID NO:43)
Lm-LLO-138-1
GGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGG
Lm-LLO-138-2
GGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGG
Lm-ddA-164-1
GGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGG
LmddA-164-2
GGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGG
LmddA-164-3
GGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGG
LmddA164-4
GGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGG
参照
CCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGCA
(SEQ ID NO:44)
Lm-LLO-138-1
CCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGCA
Lm-LLO-138-2
CCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGCA
Lm-ddA-164-1
CCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGCA
LmddA-164-2
CCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGTA
LmddA-164-3
CCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGTA
LmddA164-4
CCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGTA
实施例7：用ADXS31-164的外周免疫可延迟脑中转移性乳腺癌细胞系的生长。
用ADXS31-164或不相关Lm-对照疫苗免疫IP小鼠，并且然后颅内植入5,000EMT6-Luc肿瘤细胞，其表达荧光素酶和低水平的Her2/neu(图6C)。在接种后不同时间通过对麻醉的小鼠离体成像监测肿瘤。在肿瘤接种后第8天，在所有对照动物中检测到肿瘤，但是ADXS31-164组中的小鼠没有显示任何可检测到的肿瘤(图6A和B)。ADXS31-164可明显地延迟这些肿瘤的发作，如在肿瘤接种后第11天，阴性对照组中的所有小鼠已经死于肿瘤，但是ADXS31-164组中的所有小鼠仍然存活，并且仅仅显示小的肿瘤生长迹象。这些结果强烈提示外周施用ADXS31-164获得的免疫应答可能到达中枢神经系统，并且LmddA基疫苗可能具有用于CNS肿瘤的治疗潜在用途。
实施例8：通过用ADXS31-164免疫治疗犬科动物骨肉瘤。
犬科动物骨肉瘤是长(腿)骨的癌症，其是超过10岁大狗的主要杀手。标准治疗是诊断后立即截肢，随后化疗。但是，癌症总是转移至肺。利用化疗，狗生存大约18个月，与之相比，没有治疗，狗生存6-12个月。认为在多达50%的骨肉瘤中存在HER2抗原。ADXS31-164对表达该抗原的细胞产生免疫攻击并且已经被开发用于人乳腺癌。
组织学诊断为骨肉瘤的并且通过恶性细胞表达HER2/neu证明的狗符合招募条件。
犬科动物骨肉瘤试验
在第一批中，肢体被切除，随后进行化疗治疗轮。随后施用3剂量的Her-2疫苗，有或没有6个月间隔的加强。
所有的狗接收4周的卡铂治疗。最后卡铂给药之后的四周，狗接收ADXS-HER2，每三周一次总共3个剂量。组1(3只狗)接收1x108CFU每剂，组2(3只狗)每只接收5x108CFU每剂和组3(3只狗)接收1x109CFU每剂。如果观察到限制毒性的潜在剂量，可向组中增加另外的狗，以收集更多数据。所以，在初始研究中治疗9-18只狗。
在第二批中，重复与第一批相同的治疗，不同之处是仅仅施用单剂量的疫苗，然后化疗(1个月之后)，总共4剂。
进一步，在两批中，在化疗之后一个月施用单剂量。
尽管本文已经图解和描述了本发明的某些特征，但是本领域技术人员将想到许多变型、替换、改变和等价物。所以，应理解所附的权利要求期望覆盖所有这些变型和改变，因为其落在本发明的真实精神内。
Claims (82)
1.治疗非人动物中表达Her-2/neu的肿瘤生长或癌症的方法，所述方法包括施用包含编码融合多肽的核酸分子的重组李斯特氏菌的步骤，其中所述融合多肽包含与另外的佐剂多肽融合的Her2/neu嵌合抗原。
2.权利要求1的方法，其中所述非人动物是狗。
3.权利要求1的方法，其中给具有表达Her2/neu的肿瘤的对象施用所述融合多肽，防止所述肿瘤中的逃逸突变。
4.权利要求1的方法，其中所述核酸分子包含编码所述免疫原性组合物的第一开放阅读框，其中所述核酸分子位于所述重组李斯特氏菌疫苗株中。
5.权利要求4的方法，其中所述核酸分子进一步包含编码代谢酶的第二开放阅读框，其中所述代谢酶补偿所述重组李斯特氏菌疫苗株的染色体中缺乏的内源基因。
6.权利要求1的方法，其中所述Her2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17个定位的人MHC-I型表位。
7.权利要求4的方法，其中所述核酸分子整合入所述李斯特氏菌基因组。
8.权利要求4的方法，其中所述核酸分子位于所述重组李斯特氏菌疫苗株内的质粒中。
9.权利要求8的方法，其中所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定地保持在所述重组李斯特氏菌疫苗株中。
10.权利要求8的方法，其中所述质粒不赋予所述重组李斯特氏菌抗生素抗性。
11.权利要求1的方法，其中所述重组李斯特氏菌株是减毒的。
12.权利要求1的方法，其中所述重组李斯特氏菌缺乏ActA致病基因。
13.权利要求1的方法，其中所述另外的多肽是非溶血性LLO蛋白或N末端片段。
14.权利要求1的方法，其中所述另外的多肽是PEST序列。
15.权利要求1的方法，其中所述另外的多肽是ActA N末端片段。
16.权利要求13-15任一项的方法，其中所述另外的多肽与所述Her2/neu嵌合抗原融合。
17.权利要求5的方法，其中由所述第二开放阅读框编码的所述代谢酶是氨基酸代谢酶。
18.权利要求5的方法，其中由所述第二开放阅读框编码的所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。
19.权利要求5的方法，其中所述核酸分子进一步包括第三开放阅读框。
20.权利要求19的方法，其中由所述第三开放阅读框编码的所述代谢酶是D-氨基酸转移酶或丙氨酸消旋酶。
21.权利要求1的方法，其中所述重组李斯特氏菌株已经通过动物宿主传代。
22.权利要求1的方法，进一步包含独立佐剂。
23.权利要求22的方法，其中所述佐剂包括粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂苷QS21、单磷酰脂质A或含有非甲基化CpG的寡核苷酸。
24.权利要求1的方法，其中所述肿瘤是Her2/neu阳性肿瘤。
25.权利要求1的方法，其中所述癌症是表达Her2/neu的癌症。
26.权利要求1的方法，其中所述癌症是骨肉瘤、卵巢癌、胃癌或中枢神经系统(CNS)癌症。
27.权利要求1的方法，其中所述骨肉瘤癌症是犬科动物骨肉瘤。
28.预防非人动物中表达Her-2/neu的肿瘤生长或癌症的方法，所述方法包括施用包含编码融合多肽的核酸的重组李斯特氏菌的步骤，其中所述融合多肽包含与另外的佐剂多肽融合的Her2/neu嵌合抗原。
29.权利要求28的方法，其中所述非人动物是狗。
30.权利要求28的方法，其中给具有表达Her2/neu的肿瘤的对象施用所述融合多肽，防止所述肿瘤中的逃逸突变。
31.权利要求28的方法，其中所述核酸分子包含编码所述免疫原性组合物的第一开放阅读框，其中所述核酸分子位于所述重组李斯特氏菌疫苗株中。
32.权利要求31的方法，其中所述核酸分子进一步包含编码代谢酶的第二开放阅读框，其中所述代谢酶补偿所述重组李斯特氏菌疫苗株的染色体中缺乏的内源基因。
33.权利要求28的方法，其中所述Her2/neu嵌合抗原包括至少5、9、13、14或17个定位的人MHC-I型表位。
34.权利要求32的方法，其中所述核酸分子整合入所述李斯特氏菌的基因组。
35.权利要求32的方法，其中所述核酸分子位于所述重组李斯特氏菌疫苗株内的质粒中。
36.权利要求35的方法，其中所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定地保持在所述重组李斯特氏菌疫苗株中。
37.权利要求35的方法，其中所述质粒不赋予所述重组李斯特氏菌抗生素抗性。
38.权利要求28的方法，其中所述重组李斯特氏菌株是减毒的。
39.权利要求28的方法，其中所述重组李斯特氏菌缺乏ActA致病基因。
40.权利要求28的方法，其中所述另外的多肽是非溶血性LLO蛋白或N末端片段。
41.权利要求28的方法，其中所述另外的多肽是PEST序列。
42.权利要求28的方法，其中所述另外的多肽是ActA N末端片段。
43.权利要求40-42任一项的方法，其中所述另外的多肽与所述Her2/neu嵌合抗原融合。
44.权利要求32的方法，其中由所述第二开放阅读框编码的所述代谢酶是氨基酸代谢酶。
45.权利要求32的方法，其中由所述第二开放阅读框编码的所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。
46.权利要求32的方法，其中所述核酸分子进一步包含第三开放阅读框。
47.权利要求46的方法，其中由所述第三开放阅读框编码的所述代谢酶是D-氨基酸转移酶或丙氨酸消旋酶。
48.权利要求28的方法，其中所述重组李斯特氏菌株已经通过动物宿主传代。
49.权利要求28的方法，进一步包含独立佐剂。
50.权利要求49的方法，其中所述佐剂包括粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂苷QS21、单磷酰脂质A或含有非甲基化CpG的寡核苷酸。
51.权利要求28的方法，其中所述肿瘤是Her2/neu阳性肿瘤。
52.权利要求28的方法，其中所述癌症是表达Her2/neu的癌症。
53.权利要求28的方法，其中所述癌症是骨肉瘤、卵巢癌、胃癌或中枢神经系统(CNS)癌症。
54.权利要求28的方法，其中所述骨肉瘤癌症是犬科动物骨肉瘤。
55.在非人动物中引起针对表达Her-2/neu的肿瘤生长或癌症的增强的免疫应答的方法，所述方法包括施用包含编码融合多肽的核酸的重组李斯特氏菌的步骤，其中所述融合多肽包含与另外佐剂多肽融合的Her2/neu嵌合抗原。
56.权利要求55的方法，其中所述非人动物是狗。
57.权利要求55的方法，其中给具有表达Her2/neu的肿瘤的对象施用所述融合多肽，防止所述肿瘤中的逃逸突变。
58.权利要求55的方法，其中所述核酸分子包含编码所述免疫原性组合物的第一开放阅读框，其中所述核酸分子位于所述重组李斯特氏菌疫苗株中。
59.权利要求58的方法，其中所述核酸分子进一步包含编码代谢酶的第二开放阅读框，其中所述代谢酶补偿所述重组李斯特氏菌疫苗株的染色体中缺乏的内源基因。
60.权利要求55的方法，其中所述Her2/neu嵌合抗原包括至少5、9、13、14或17个定位的人MHC-I型表位。
61.权利要求58的方法，其中所述核酸分子整合入所述李斯特氏菌基因组。
62.权利要求58的方法，其中所述核酸分子位于所述重组李斯特氏菌疫苗株内的质粒中。
63.权利要求62的方法，其中所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定地保持在所述重组李斯特氏菌疫苗株中。
64.权利要求62的方法，其中所述质粒不赋予所述重组李斯特氏菌抗生素抗性。
65.权利要求55的方法，其中所述重组李斯特氏菌株是减毒的。
66.权利要求55的方法，其中所述重组李斯特氏菌缺乏ActA致病基因。
67.权利要求55的方法，其中所述另外的多肽是非溶血性LLO蛋白或N末端片段。
68.权利要求55的方法，其中所述另外的多肽是PEST序列。
69.权利要求55的方法，其中所述另外的多肽是ActA N末端片段。
70.权利要求67-69任一项的方法，其中所述另外的多肽与所述Her2/neu嵌合抗原融合。
71.权利要求59的方法，其中由所述第二开放阅读框编码的所述代谢酶是氨基酸代谢酶。
72.权利要求59的方法，其中由所述第二开放阅读框编码的所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。
73.权利要求59的方法，其中所述核酸分子进一步包含第三开放阅读框。
74.权利要求73的方法，其中由所述第三开放阅读框编码的所述代谢酶是D-氨基酸转移酶或丙氨酸消旋酶。
75.权利要求55的方法，其中所述重组李斯特氏菌株已经通过动物宿主传代。
76.权利要求55的方法，进一步包含独立佐剂。
77.权利要求76的方法，其中所述佐剂包括粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂苷QS21、单磷酰脂质A或含有非甲基化CpG的寡核苷酸。
78.权利要求55的方法，其中所述肿瘤是Her2/neu阳性肿瘤。
79.权利要求55的方法，其中所述癌症是表达Her2/neu的癌症。
80.权利要求55的方法，其中所述癌症是骨肉瘤、卵巢癌、胃癌或中枢神经系统(CNS)癌症。
81.权利要求55的方法，其中所述骨肉瘤癌症是犬科动物骨肉瘤。
82.权利要求1、28或55任一项的方法，其中针对所述表达Her2/neu的肿瘤的所述免疫应答包括对所述Her2/neu蛋白的次优势表位的免疫应答。
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