JP6329211B2 - 脳腫瘍または乳腺腫瘍の発症を遅延させるための医薬の製造における組換えリステリア株の使用 - Google Patents
脳腫瘍または乳腺腫瘍の発症を遅延させるための医薬の製造における組換えリステリア株の使用 Download PDFInfo
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Landscapes
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Description
一実施形態では、キメラ抗原を発現する、弱毒化された抗生物質フリーの組換えリステリアは、本明細書で例示されているように、癌または固形腫瘍を予防し、かつ治療するのに有用である。別の実施形態では、キメラHer2/neuを発現する組換えリステリアは、Her2/neuを過剰発現する固形腫瘍を治療するための治療ワクチンとして有用である。別の実施形態では、本明細書で提供されるHer2/neuキメラ抗原は、Her2/neu発現腫瘍を治療し、かつそのエスケープ変異を予防するのに有用である。別の実施形態では、「エスケープ変異」という用語は、突然変異して、治療に対する有効な治療応答から逃れる腫瘍を指す。
「核酸分子」は、別の実施形態では、プラスミドを指す。別の実施形態では、この用語は、組込みベクターを指す。別の実施形態では、この用語は、組込みベクターを含むプラスミドを指す。別の実施形態では、組込みベクターは部位特異的組込みベクターである。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の核酸分子は、当技術分野で公知の任意のタイプのヌクレオチドから構成されている。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本発明のヌクレオチド分子によってコードされる組換えポリペプチドである。
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本発明のヌクレオチド分子または組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物である。
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本発明のヌクレオチド分子を含む組換え形態のリステリアである。
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本発明の組換え形態のリステリアの培養物である。
一実施形態では、本発明は、対象の抗Her−2免疫応答を誘導する方法であって、対象にHer−2キメラタンパク質に融合したまたはその断片に融合したLLOタンパク質のN末端断片を含む組換えポリペプチドを投与し、それにより、対象の抗Her−2免疫応答を誘導する方法を提供する。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象におけるHer−2発現腫瘍の増殖を妨げる方法であり、この場合および別の実施形態では、本方法は、対象に本明細書で記載される組換えリステリアワクチン株を含む組成物を投与する工程を含む。
本発明の方法および組成物における抗原は、一実施形態では、対象の非腫瘍細胞表面に検出可能なレベルで発現される。別の実施形態では、抗原は、対象の非腫瘍細胞の少なくとも一定のパーセンテージ(例えば、0.01%、0.03%、0.1%、0.3%、1%、2%、3%、または5%)で、検出可能なレベルで発現される。一実施形態では、「非腫瘍細胞」は、腫瘍本体の外側にある細胞を指す。別の実施形態では、「非腫瘍細胞」は、非悪性細胞を指す。別の実施形態では、「非腫瘍細胞」は、非形質転換細胞を指す。別の実施形態では、非腫瘍細胞は体細胞である。別の実施形態では、非腫瘍細胞は生殖細胞である。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。
別の実施形態では、本発明は、癌を治療するための免疫原性組成物であって、切断LLOとHer−2キメラタンパク質との融合体を含む免疫原性組成物を提供する。別の実施形態では、免疫原性組成物は、この融合体を発現するリステリア株をさらに含む。各々の候補は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態では、本発明は、癌を治療するための免疫原性組成物であって、Her−2キメラタンパク質を発現するリステリア株を含む免疫原性組成物を提供する。
医薬組成物
本発明のワクチンおよび組成物を含む医薬組成物は、別の実施形態では、当業者に公知の任意の方法によって、対象に、例えば、非経口、癌近傍(paracancerally)、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、心室内、頭蓋内、膣内、または腫瘍内に投与される。
材料および方法
オリゴヌクレオチドは、インビトロジェン(カリフォルニア州カールスバッド)により合成され、DNAシークエンシングは、ジーンウィズ社(Genewiz Inc)、ニュージャージー州サウス・プレインフィールドにより行なわれた。フローサイトメトリー試薬は、ベクトン・ディッキンソン・バイオサイエンシズ(BD、カリフォルニア州サンディエゴ)から購入した。細胞培養培地、補助因子および他の全ての試薬は、指示しない限り、シグマ(Sigma)(ミズーリ州セントルイス)製であった。Her2/neu HLA−A2ペプチドは、EZバイオラブス(EZbiolabs)(インディアナ州ウェストフィールド)により合成された。完全RPMI 1640(C−RPMI)培地は、2mMのグルタミン、0.1mMの非必須アミノ酸、および1mMのピルビン酸ナトリウム、10%の胎仔ウシ血清、ペニシリン/ストレプトマイシン、Hepes(25mM)を含んでいた。ポリクローナル抗LLO抗体は以前に記載されており、抗Her2/neu抗体はシグマから購入した。
マウスおよび細胞株
動物実験は全て、ペンシルバニア大学またはラトガーズ大学のIACUCによって承認されたプロトコルに従って実施された。FVB/Nマウスは、ジャクソン・ラボラトリーズ(Jackson laboratories)(メイン州バーハーバー)から購入した。ラットHer2/neu発癌タンパク質を過剰発現するFVB/N Her2/neuトランスジェニックマウスは、ペンシルバニア大学の動物コア施設で飼育し、繁殖させた。高レベルのラットHer2/neuタンパク質を発現するNT−2腫瘍細胞株は、これらのマウスの自然発生乳腺腫瘍に由来するものであり、これを以前に記載されている通りに増殖させた。DHFR−G8(3T3/neu)細胞をATCCから入手し、ATCCの推奨に従って増殖させた。EMT6−Luc細胞株は、John Ohlfest博士(ミネソタ大学、ミネソタ州)から惜しみなく提供されたものであり、これを完全C−RPMI培地中で増殖させた。生物発光に関する作業は、ペンシルバニア大学(ペンシルバニア州フィラデルフィア)の小動物イメージング施設(SAIF)による指導の下で行なわれた。
Her2/neu−pGEM7Zは、ペンシルバニア大学のMark Greene博士から親切に提供されたものであり、これは、pGEM7Zプラスミド(プロメガ(Promega)、ウィスコンシン州マディソン)にクローニングされた全長ヒトHer2/neu(hHer2)遺伝子を含んでいた。このプラスミドを鋳型として用いて、pfx DNAポリメラーゼ(インビトロジェン)および表1に示したオリゴを用いるPCRによって、hHer−2/neuの3つの部分、すなわち、EC1、EC2、およびIC1を増幅した。
3〜5匹のFVB/Nマウスの群に1×108コロニー形成単位(CFU)のLm−LLO−ChHer2、ADXS31−164、Lm−hHer2IC1もしくは(無関係な抗原を発現する)Lm−対照を1週間間隔で3回免疫したか、または感作しないでおいた。NT−2細胞をインビトロで増殖させ、トリプシンで剥離し、37℃で45分間、マイトマイシンC(無血清C−RPMI培地中250μg/ml)で処理した。5回の洗浄の後、それらを、免疫動物または未感作動物から回収した脾細胞とともに1:5(刺激体:応答体)の比率で、37℃および5%CO2で5日間、共インキュベートした。標準的な細胞傷害性アッセイを、ユーロピウム標識した3T3/neu(DHFR−G8)細胞を標的として用いて、先に記載した方法に従って実施した。4時間のインキュベーションの後、590nmで分光光度計(パーキン・エルマー(Perkin Elmer)、Victor2)を用いて、死滅した標的細胞からの放出されたユーロピウムを測定した。パーセント比溶解を(実験群における溶解−自然発生的溶解)/(最大溶解−自然発生的溶解)と定義した。
3〜5匹のFVB/NまたはHLA−A2トランスジェニックマウスの群に1×108CFUのADXS31−164、(無関係な抗原を発現する)陰性リステリア対照を1週間間隔で3回免疫したか、または感作しないでおいた。FVB/Nマウス由来の脾細胞を最後の免疫の1週間後に単離し、C−RPMI培地中で、マイトマイシンC処理したNT−2細胞の存在下、5×106細胞/ウェルで24ウェルプレートにて共培養した。HLA−A2トランスジェニックマウス由来の脾細胞を、1μMのHLA−A2特異的ペプチドまたは大腸菌で産生し、ニッケルに基づく親和性クロマトグラフィーシステムで精製した1μg/mlの組換えHisタグ化ChHer2タンパク質の存在下でインキュベートした。24または72時間後に上清由来の試料を得て、製造元の推奨に従ってマウスIFN−γ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キットを用いて、インターフェロン−γ(IFN−γ)の存在について試験した。
6週齢のFVB/NラットHer2/neuトランスジェニックマウス(9〜14匹/群)に5×108CFUのLm−LLO−ChHer2、ADXS31−164またはLm−対照を6回免疫した。それらを自然発生乳腺腫瘍の出現について週に2回観察した。自然発生乳腺腫瘍は、電子キャリパーを用いて、最長52週まで測定した。エスケープした腫瘍を平均直径1cm2のサイズに達したときに摘出し、RNAlater中−20℃で保存した。これらの腫瘍のエスケープに対するHer2/neuタンパク質における突然変異の効果を明らかにするために、ゲノムDNA単離キットを用いてゲノムDNAを抽出し、シークエンシングした。
マウスに1×106個のNT−2細胞を皮下(s.c.)移植した。7、14および21日目に、それらに1×108CFUのADXS31−164、LmddA−対照を免疫したかまたはまたは感作しないでおいた。28日目に腫瘍および脾臓を抽出し、CD3+/CD4+/FoxP3+Tregの存在についてFACS解析で検討した。簡潔に述べると、脾臓を、C−RPMI培地中、2枚のスライドガラスの間でホモジナイズすることによって、脾細胞を単離した。滅菌したカミソリの刃を用いて腫瘍を細かく切り、PBS中にDNアーゼ(12U/ml)、およびコラゲナーゼ(2mg/ml)を含む緩衝液を用いて消化した。撹拌しながら室温で60分間インキュベートした後、激しいピペッティングにより細胞を分離した。赤血球をRBC溶解緩衝液で溶解し、その後、10%FBSを含む完全RPMI−1640培地で数回洗浄した。ナイロンメッシュに通して濾過した後、腫瘍細胞および脾細胞をFACS緩衝液(2%FBS/PBS)に再懸濁し、抗CD3−PerCP−Cy5.5抗体、抗CD4−FITC抗体、抗CD25−APC抗体で染色し、次いで、透過処理し、抗Foxp3−PEで染色した。4色FACSキャリバー(BD)を用いてフローサイトメトリー解析を実施し、セルクエストソフトウェア(BD)を用いてデータを解析した。
ログランクカイ二乗検定を生存率データに用い、スチューデントのt検定をCTLおよびELISAアッセイに用いた。これらの検定は3つの複製を作って行なった。0.05未満のp値(*と印を付けた)は、これらの解析において統計的に有意であると考えられた。統計解析は全て、Prismソフトウェア、V.4.0a(2006)またはSPSSソフトウェア、V.15.0(2006)のいずれかを用いて行なわれた。別途記載しない限り、全てのFVB/NラットHer2/neuトランスジェニック研究のために、本発明者らは、1群当たり8〜14匹のマウスを用い、全ての野生型FVB/N研究のために、本発明者らは、1群当たり少なくとも8匹のマウスを用いた。Her2/neuトランスジェニックマウスモデルでの長期の腫瘍研究を除き、全ての研究を少なくとも1回繰り返した。
Her−2断片に融合したLLO断片を分泌するリステリア・モノサイトゲネス株の作製:ADXS31−164の構築
キメラHer2/neu遺伝子(ChHer2)の構築は以前に記載されている。簡潔に述べると、ChHer2遺伝子を、SOEing PCR法による、Her2/neuタンパク質の2つの細胞外断片(aa40〜170およびaa359〜433)と1つの細胞内断片(aa678〜808)の直接的な融合によって作製した。キメラタンパク質は、このタンパク質の既知のヒトMHCクラスIエピトープの大半を有する。ChHer2遺伝子をプラスミドpAdv138(これは、Lm−LLO−ChHer2を構築するために用いられた)から切り出して、LmddAシャトルプラスミドにクローニングし、プラスミドpAdv164が得られた(図1A)。これら2つのプラスミド骨格には2つの大きな違いがある。1)pAdv138が、組換え細菌のインビトロ選択のためにクロラムフェニコール耐性マーカー(cat)を用いるのに対し、pAdv164は、枯草菌由来のD−アラニンラセマーゼ遺伝子(dal)を有する。枯草菌は、dal−dat遺伝子を欠くLmddA株でのインビトロ選択およびインビボプラスミド保持のために代謝相補経路を用いる。このワクチンプラットフォームは、人工リステリアワクチン株の抗生物質耐性についてのFDAの懸念に対処するようにデザインされ、開発された。2)pAdv138とは異なり、pAdv164は、プラスミド中にprfA遺伝子のコピーを有さない(下記の配列および図1Aを参照されたい)。というのは、これは、Lmdd株のインビボ相補に必要ないからである。LmddAワクチン株は、(リステリアの細胞内移動および細胞間拡散に関与する)actA遺伝子も欠くので、この骨格に由来する組換えワクチン株は、その親株のLmddから派生したものよりも毒性が100倍低い。LmddAベースのワクチンはまた、Lmddベースのワクチンよりもはるかに速く(48時間足らずで)免疫マウスの脾臓から除去される。ウェスタンブロット解析を用いて抗LLO抗体で約104KDのバンドを検出したとき、この株からの融合タンパク質tLLO−ChHer2の発現および分泌は、インビトロ増殖の8時間後のTCA沈殿した細胞培養上清におけるLm−LLO−ChHer2の発現および分泌と同程度であった(図1B)。tLLOだけを発現するリステリア骨格株を陰性対照として用いた。
pAdv164配列(7075塩基対)(図1参照):
ADXS31−164はLM−LLO−ChHER2と同程度の免疫原性である
抗Her2/neu特異的細胞傷害性T細胞を生成させる際のADXS31−164の免疫原性特性を、標準的なCTLアッセイでLm−LLO−ChHer2ワクチンの免疫原性特性と比較した。両ワクチンとも、3T3/neu標的細胞によって発現されたHer2/neu抗原に対する、強力ではあるが、同程度の細胞傷害性T細胞応答を誘発した。したがって、LLOに融合したHer2の細胞内断片だけを発現するリステリアで免疫したマウスは、より多くのMHCクラスIエピトープを含むキメラよりも低い溶解活性を示した。CTL活性は、未感作動物または無関係なリステリアワクチンを注射したマウスでは検出されなかった(図2A)。ADXS31−164は、野生型FVB/Nマウス由来の脾細胞によるIFN−γの分泌を刺激することもできた(図2B)。これは、高レベルのHer2/neu抗原を発現する、マイトマイシンC処理したNT−2細胞と共培養したこれらの細胞の培養上清で検出された(図5C)。
ADXS31−164は、自然発生乳腺腫瘍の発症の予防においてLM−LLO−ChHER2よりも有効であった
ゆっくりと増殖する自然発生乳腺腫瘍を発症する、20〜25週齢のHer2/neuトランスジェニック動物で、ADXS31−164の抗腫瘍効果をLm−LLO−ChHer2の抗腫瘍効果と比較した。無関係なリステリア−対照ワクチンで免疫した動物は全て、21〜25週以内に乳房腫瘍を発症し、33週の前に屠殺された。対照的に、リステリア−Her2/neu組換えワクチンは、乳腺腫瘍の形成を顕著に遅延させた。45週目で、Lm−LLO−ChHer2で免疫したマウスの25%と比較して、ADXS31−164ワクチンを接種したマウスの50%強(9匹中5匹)に依然として腫瘍がなかった。52週で、ADXS31−164で免疫したマウスの8匹中2匹には依然として腫瘍がない状態であったのに対し、他の実験群のマウスは全て、その疾患で死んでいた(図3)。これらの結果は、より弱毒化されているにもかかわらず、ADXS31−164は、Her2/neuトランスジェニック動物での自然発生乳腺腫瘍の発症の予防においてLm−LLO−ChHer2よりも有効であることを示している。
ADXS31−164で免疫したときのHER2/NEU遺伝子における突然変異
Her2/neuのMHCクラスIエピトープにおける突然変異は、小断片ワクチンまたはHer2/neuの細胞外ドメインのエピトープを標的とするモノクローナル抗体であるトラスツズマブ(ハーセプチン(登録商標))で免疫したときの腫瘍エスケープの原因であると考えられている。これを評価するために、ゲノム物質をトランスジェニック動物のエスケープした腫瘍から抽出し、キメラまたは対照ワクチンで免疫した腫瘍内のneu遺伝子の対応する断片とともにシークエンシングした。突然変異は、ワクチン接種したどの腫瘍試料のHer−2/neu遺伝子にも認められず、別のエスケープ機構が示唆された(データは示さない)。
ADXS31−164は腫瘍内T調節性細胞の顕著な減少を引き起こす
脾臓および腫瘍における調節性T細胞の頻度に対するADXS31−164の効果を解明するために、マウスにNT−2腫瘍細胞を移植した。3回の免疫の後、脾細胞および腫瘍内リンパ球を単離し、Tregについて染色した。Tregは、CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+細胞と定義されたが、個別に解析した場合、FoxP3またはCD25マーカーのどちらかでも同等の結果が得られた。これらの結果は、ADXS31−164による免疫が、無関係なリステリアワクチンまたは未感作動物と比較して、脾臓におけるTregの頻度に対して効果がないことを示した(図4を参照されたい)。対照的に、リステリアワクチンによる免疫は、腫瘍におけるTregの存在にかなりの影響をもたらした(図5A)。Tregは、未処置の腫瘍における全CD3+T細胞で平均19.0%であったが、この頻度は、無関係なワクチンについては4.2%、ADXS31−164については3.4%にまで低下し、腫瘍内Tregの頻度は5倍低下した(図5B)。どちらかのLmddAワクチンで処置したマウスにおける腫瘍内Tregの頻度の減少は、腫瘍のサイズの違いに起因するものではあり得なかった。代表的な実験において、ADXS31−164で免疫したマウス由来の腫瘍は、未処置のマウス由来の腫瘍(8.69±0.98、n=5、p<0.01)または無関係なワクチンで処置したマウス由来の腫瘍(8.41±1.47、n=5、p=0.04)よりも有意に小さかった[平均直径(mm)±SD、6.71±0.43、n=5]が、これらの後者2つの群の比較は、腫瘍サイズの統計的有意差を示さなかった(p=0.73)。LmddAワクチンで処置した腫瘍におけるTregのより低い頻度は、腫瘍内CD8/Treg比の増大をもたらしたが、これは、LmddAワクチンによる免疫の後に、より好都合な腫瘍微小環境が得られる可能性があることを示唆している。しかしながら、標的抗原HER2/neu(ADXS31−164)を発現するワクチンだけが腫瘍増殖を低下させることができ、これは、Tregの減少は、腫瘍における抗原特異的応答が存在するときにのみ効果を有することを示している。
エスケープ変異はHER−2キメラを発現するリステリアワクチンによって誘導されない
Lm−LLO−138、LmddA164および無関係なワクチンLm−LLO−NYなどの様々なワクチンで免疫したマウスの腫瘍試料を回収した。これらの試料からDNAを精製し、Her−2/neu領域IC1、EC1およびEC2に対応するDNA断片を増幅し、シークエンシングして、免疫エスケープ変異があるかどうかを明らかにした。CLUSTALWを用いて各DNAの配列のアラインメントを実施した。解析の結果は、腫瘍から回収したDNA配列中に突然変異がないことを示した。これらの配列の詳細な解析を以下に示す。
ADXS31−164による末梢免疫は脳における転移性乳癌細胞株の増殖を遅延させることができる
マウスにADXS31−164または無関係なLm−対照ワクチンをIP免疫し、その後、ルシフェラーゼおよび低レベルのHer2/neuを発現する5,000個のEMT6−Luc腫瘍細胞を頭蓋内に移植した(図6C)。麻酔したマウスのエクスビボイメージングにより、腫瘍を接種後の様々な時点でモニタリングした。腫瘍接種後8日目、腫瘍は全ての対照動物で検出されたが、ADXS31−164群のマウスはどれも、検出可能な腫瘍を示さなかった(図6AおよびB)。ADXS31−164は、これらの腫瘍の発症を明らかに遅延させることができた。なぜなら、腫瘍接種後11日目に、陰性対照群のマウスは全て、その腫瘍で既に死んでいたが、ADXS31−164群のマウスは全てまだ生きており、腫瘍増殖のわずかな兆候しか示さなかったからである。これらの結果は、ADXS31−164の末梢投与で得られた免疫応答が中枢神経系に達する可能性があること、およびLmddAベースのワクチンがCNS腫瘍の治療に使用可能であることを強く示唆する。
Claims (18)
- 対象におけるHer2/neu発現脳腫瘍またはHer2/neu発現乳腺腫瘍の発症を遅延させるための医薬の製造における有効量の組換えリステリア株の使用であって、前記組換えリステリア株は、染色体のD−アラニンラセマーゼ(Dal)遺伝子およびD−アミノ酸トランスフェラーゼ(Dat)遺伝子の欠失、ならびにactA毒性遺伝子の突然変異または欠失を有し、前記組換えリステリア株は、第1のオープンリーディングフレームおよび第2のオープンリーディングフレームを含む核酸分子を有し、第1のオープンリーディングフレームは、a)非溶血性LLOタンパク質またはそのN末端断片、b)PEST配列、およびc)ActA断片のうちから選択されるさらなるポリペプチドに融合した配列番号2のHer2/neuキメラ抗原を含む組換えポリペプチドをコードしており、第2のオープンリーディングフレームは、Dal遺伝子およびDat遺伝子の前記欠失を相補するアラニンラセマーゼ酵素をコードしている、使用。
- Her2/neuキメラ抗原が配列番号1を含む配列によってコードされている、請求項1に記載の使用。
- Her2/neuキメラ抗原が、マッピングされたヒトMHCクラスIエピトープのうちの少なくとも5個を含む、請求項1または2に記載の使用。
- 前記核酸分子がリステリアゲノムに組み込まれている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用。
- 前記核酸分子が組換えリステリア株内のプラスミド中にある、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用。
- 前記プラスミドが配列番号53に記載の核酸を含む、請求項5に記載の使用。
- 前記プラスミドが、抗生物質選択の非存在下、組換えリステリア株の中で安定に維持される、請求項5に記載の使用。
- 前記プラスミドが、抗生物質に対する耐性を組換えリステリア株に付与しない、請求項5に記載の使用。
- 前記組換えリステリア株が弱毒化されている、請求項1〜8のいずれか一項に記載の使用。
- 前記組換えリステリア株が組換えリステリア・モノサイトゲネス株である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の使用。
- actA毒性遺伝子が欠失または不活化している、請求項1〜10のいずれか一項に記載の使用。
- 前記使用は、前記脳腫瘍または前記乳腺腫瘍におけるエスケープ変異を予防する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の使用。
- 前記使用は、対象における前記脳腫瘍または前記乳腺腫瘍に対する増強された免疫応答を誘発する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の使用。
- 腫瘍に対する免疫応答が、Her2/neuタンパク質のサブドミナントエピトープに対する免疫応答を含む、請求項13に記載の使用。
- 前記使用は、対象における前記脳腫瘍または前記乳腺腫瘍の形成を予防するための、請求項1〜14のいずれか一項に記載の使用。
- 前記使用は、前記脳腫瘍または前記乳腺腫瘍を有する対象の腫瘍内T調節性細胞の頻度を減少させる、請求項1〜15のいずれか一項に記載の使用。
- 前記使用は、前記脳腫瘍または前記乳腺腫瘍を有する対象の骨髄由来サプレッサ細胞の頻度を減少させる、請求項1〜16のいずれか一項に記載の使用。
- 前記使用は、前記脳腫瘍または前記乳腺腫瘍を有する対象のCD8+/T調節性細胞の腫瘍内比率を増大させる、請求項1〜17のいずれか一項に記載の使用。
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