JP6039669B2 - Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍に対する薬剤の調製における弱毒化組換えリステリアの使用 - Google Patents

Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍に対する薬剤の調製における弱毒化組換えリステリアの使用 Download PDF

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Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年１１月１１日に出願された、米国仮特許出願第６１／２６０，２７７号による優先権を主張する、２０１０年１１月１２日に出願され、同時係属の米国特許出願第１２／９４，５３８６号の部分継続出願である、２０１１年８月１６日に出願された米国特許出願第１３／２１０，６９６号による優先権を主張する。これらの出願は、参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。
（技術分野）
本発明は、ヒト以外の動物での、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原発現腫瘍に対する、治療及びワクチン接種、並びに免疫応答を誘発する組成物及び方法を提供する。
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（以下、“Ｈｅｒ−２”という）は、細胞内シグナル伝達に関与することが知られている、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのチロシンキナーゼの一員である１８５ｋＤａの糖タンパク質であり、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインからなる（非特許文献１及び２）。ヒトではこのＨＥＲ２抗原は、すべての乳癌の２５〜４０％で過剰発現されるとともに、卵巣、肺、膵臓、脳、及び消化管の多くの癌でも過剰発現される。Ｈｅｒ−２の過剰発現は、制御されない細胞増殖及びシグナル伝達に関係し、その両方が腫瘍の発達に寄与する。Ｈｅｒ−２を過剰発現する癌患者は、Ｈｅｒ−２に対する検出可能な液性応答、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答に対しても寛容を示す。
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、主に抗原提示細胞に感染し、これらの細胞の細胞質内での生活に適応している細胞内病原体である。マクロファージなどの宿主細胞は、Ｌ．モノサイトゲネスを活発に貪食し、これらの細菌の大部分は、ファゴリソソームで分解される。細菌の一部は、溶血素のリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の作用を通じてファゴソーム膜に穴を開けることによって宿主細胞質中に逃げ込む。一旦細胞質に入ると、Ｌ．モノサイトゲネスは宿主のアクチンを重合させ、細胞から細胞へと直接移行し、宿主免疫系からさらに逃れることができ、結果として、Ｌ．モノサイトゲネスに対する抗体応答はほとんど生じない。
ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の細胞外ドメインおよび細胞内ドメインに由来する、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の小断片を別々に発現するいくつかのリステリア・モノサイトゲネスリステリア（Ｌｍ）ベースのワクチンの構築及び開発が報告されている。Ｈｅｒ２／ｎｅｕは、Ｌｍに入り込むには大きすぎるために、Ｈｅｒ２／ｎｅｕのフラグメントを作製することが必要となる。これらのワクチンは全て、免疫原性でかつＦＶＢ／Ｎマウスで予め樹立された腫瘍を退行させるのに有効であること、およびＨｅｒ２／ｎｅｕ発現トランスジェニック動物で自然発生乳腺腫瘍の発症を遅延させることが示されている。これらの予備実験から得られた有望な結果から、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ自己抗原に対する寛容を破り得る組換えリステリア−Ｈｅｒ２／ｎｅｕワクチンを作製することができることが示唆された。しかしながら、これまでに開発された、リステリア−Ｈｅｒ２／ｎｅｕワクチンは、クロラムフェニコールの存在下での組換え細菌のインビトロ選択に抗生物質マーカー（ｃａｔ）を用いる、弱毒化されたリステリアプラットフォームに基づくものであった。臨床的使用のためには、高度の弱毒化だけでなく、抗生物質に対する耐性がないことも重要である。
イヌ骨肉腫は、１０歳を超える大型犬の主要な死因となる長（脚）骨の癌である。標準的治療は、診断後の速やかな切断、その後の化学療法である。しかしながら、常にこの癌は肺に転移する。化学療法により、イヌは、それをしない場合の６か月に対して１２か月生存する。ＨＥＲ２抗原は、骨肉腫の場合には５０％を超える割合で存在する。
エスケープ変異を介する腫瘍の宿主免疫応答の回避は、十分に立証されており、今なお腫瘍治療における大きな障害である。したがって、高い治療効力を持ち、かつエスケープ変異を生じさせないワクチンを開発する必要がある。上述のワクチンのそれぞれのフラグメントに活性を見出すことで、本発明は、それぞれの非依存性フラグメントの各々に由来する活性部位の全てを包含し、それにより、ワクチンの産生に用いられる、新規の免疫原性組成物に到達する。その上に、動物の分野では、安全で、有効な癌治療法の必要性は、いまだにほとんど満たされていない。本発明は、明確に定義された弱毒化機構を有し、かつ抗生物質選択マーカーを持たないＬｍｄｄＡワクチンベクターを用いて作製された組換えＨｅｒ２／ｎｅｕワクチン（ＡＤＸＳ３１−１６４）を提供することによって、この必要に応えている。このキメラ抗原の使用は、エスケープ変異を生じさせないが、これは、腫瘍が突然変異して、この新規抗原による処置に対する有効な治療応答を逃れることがないことを示している。
Ｂａｒｇｍａｎｎ ＣＩら，Ｎａｔｕｒｅ ３１９：２２６，１９８６ Ｋｉｎｇ ＣＲら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：９７４，１９８５
一実施形態においては、本明細書中に示される本発明は、融合ポリペプチドを含む免疫原性組成物に関し、この融合ポリペプチドは追加的なポリペプチドに融合されたＨｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、及びこの融合タンパク質の、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍を持つ被験体への投与は、変異の回避を誘導する。別の実施形態においては、変異の回避は、エピトープ拡散に起因する。さらに別の実施形態では、変異の回避は、抗原のキメラ性に起因する。
別の実施形態においては、本明細書中に示される本発明は、核酸分子を含む組換えリステリアワクチン株に関し、及び別の実施形態においては、核酸分子は、ポリペプチドをコードする第一オープンリーディングフレームを含み、このポリペプチドはＨｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、この核酸分子は、さらに代謝酵素をコードする第二のオープンリーディングフレームを含み、及びこの代謝酵素は、組換えリステリア株の染色体に欠失する内在性遺伝子を補完する。
一実施形態においては、本明細書中に示される本発明は、ヒト以外の動物でのＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現腫瘍の増殖又は癌を治療する方法に関し、本方法は、融合ポリペプチドをコードする組換えリステリアを投与するステップを含み、この融合ポリペプチドは、追加的なアジュバントポリペプチドに融合されたＨｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む。
別の実施形態においては、本明細書中に示される本発明は、ヒト以外の動物での、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発現腫瘍の増殖又は癌を防止する方法に関し、この方法は融合ポリペプチドをコードする核酸を含む組換えリステリアを投与することを含み、この融合ポリペプチドは、追加のアジュバントポリペプチドに融合されたＨｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む。
一実施形態においては、本明細書中に示される本発明は、ヒト以外の動物での、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発現腫瘍の増殖又は癌に対する増強された免疫応答を誘発する方法に関し、この方法は、融合ポリペプチドをコードする核酸を含む組換えリステリアを投与するステップを含み、この融合ポリペプチドは、追加のアジュバントポリペプチドに融合されたＨｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む。
図１は、ＡＤＸＳ３１−１６４の構成を示す。（Ａ）ＬｍｄｄＡ菌株の染色体ｄａｌ−ｄａｔ欠失を補完するために、構成的リステリアｐ６０プロモーターの制御を受ける、枯草菌のｄａｌ遺伝子を内包するｐＡｄｖ１６４のプラスミド地図である。これは、さらにトランケートされたＬＬＯ（１−４４１）のキメラ・ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子への融合物も含み、これは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ：ＥＣ１（ａａ４０−１７０）、ＥＣ２（ａａ３５９−５１８）及びＩＣＩ（ａａ６７９−８０８）の３つのフラグメントの直接融合により構築された。（Ｂ）ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現及び分泌は、ＴＣＡにより沈殿させた細胞培養物の上澄み液を、抗ＬＬＯ抗体によりウエスタンブロッティングすることにより、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８）及びＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）中でのウエスタンブロット法により検出された。約１０４ＫＤの区別されるバンドは、ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に対応する。内因性ＬＬＯは５８ＫＤのバンドとして検出される。リステリア対照はＣｈＨｅｒ２の発現を欠いていた。 図２は、ＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性特性を示す。（Ａ）免疫されたマウスからの脾細胞中でのＨｅｒ２／ｎｅｕリステリアに基づくワクチンにより引き起こされた細胞傷害性Ｔ細胞応答が、促進剤としてＮＴ−２細胞を、及び３Ｔ３／ｎｅｕ細胞を標的として使用して試験された。Ｌｍ対照は、無関係な抗原（ＨＰＶ１６−Ｅ７）を発現すること以外はすべて同一であるＬｍｄｄＡのバックグラウンドに基づいていた。（Ｂ）免疫性を付与されたＦＶＢ／Ｎマウス脾細胞より細胞培養物培地に分泌されたＩＦＮ−γであり、インビトロでのマイトマイシンＣ処理ＮＴ−２細胞により２４時間促進したのちにＥＬＩＳＡにより測定された。（Ｃ）インビトロでの、タンパク質の異なる領域からのペプチドとのインキュベーションに反応して、キメラワクチンにより免疫されたＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス脾細胞から分泌されたＩＦＮ−γ。組換えＣｈＨｅｒ２タンパク質が、陽性対照として用いられ、図中の凡例にリストされている無関係なぺプチド群又はペプチドなしが、陰性対照を構成した。ＩＦＮ−γの分泌は、７２時間の共インキュベーション後の細胞培養物上澄み液を用いてＥＬＩＳＡ検定により検出された。各データ点は、３回の平均＋／−標準誤差である。＊Ｐ値＜０．００１。 図３は、リステリア−ＣｈＨｅｒ２／ｎｅｕワクチンの腫瘍防止研究を示す。Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスに組換えリステリア−ＣＨｅｒ２又は対照リステリアワクチンをそれぞれ６回注射した。免疫付与は、６週齢目に開始され、及び３週間ごとに２１週まで継続された。腫瘍の外観が１週間ごとに監視され、及び腫瘍のないマウスのパーセンテージで表された。＊ｐ＜０．０５、群あたりのＮ＝９である。 図４は、脾臓中の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の％に対するＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）による免疫付与の効果を示す。ＦＶＢ／Ｎマウスに１ｘ１０６ＮＴ−２細胞を皮下注射により移植し、１週間の間隔を置いて、各ワクチンにより３回免疫性を付与した。２回目の免疫付与の７日後に脾臓を摘出した。免疫細胞を単離したのちに、Ｔｒｅｇの検出のために、抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５及びＦｏｘＰ３抗体により染色した。代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロットは、異なる治療群すべてからのＣＤ３＋又はＣＤ３＋ＣＤ４＋のパーセンテージとして表される、Ｔ細胞ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度を示す。 図５は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）による免疫付与の、ＮＴ−２腫瘍における腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの％に対する効果を示す。ＦＶＢ／Ｎマウスに１ｘ１０６ＮＴ−２細胞を皮下注射により接種し、１週間の間隔をおいて、各ワクチンにより３回免疫性を与えた。２回目の免疫付与の７日後に腫瘍を摘出した。免疫細胞を単離したのちに、Ｔｒｅｇの検出のために抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５及びＦｏｘＰ３抗体により染色した。（Ａ）代表的実験からのドットプロット。（Ｂ）すべての異なる治療群を通じたＣＤ３＋又はＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の合計（左のパネル）及び腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（右のパネル）のパーセンテージとして表された、ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の頻度。データは２回の非依存性実験から得られた平均値±標準誤差平均として示されている。 図６は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）によるワクチン接種が、脳における乳癌細胞株の増殖を遅らせ得ることを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＡＤＸＳ３１−１６４又は対照リステリアワクチンで３回免疫性を与えた。麻酔マウスにＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞（５，０００）を注射により頭蓋内投与した。（Ａ）エクスビボでのマウスの画像化が、ＸｅｎｏｇｅｎＸ−１００ＣＣＤカメラにより示されている日に行われた。（Ｂ）ピクセル強度は、表面領域での１秒当たり１ｃｍ２当たりの光子数としてグラフ化された；これは平均の放射輝度として示されている。（Ｃ）ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞、４Ｔ１−Ｌｕｃ及びＮＴ−２細胞株によるＨｅｒ２／ｎｅｕの発現は、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体を使用するウエスタンブロットにより検出された。マウスマクロファージに類似した細胞株である、Ｊ７７４．Ａ２細胞を陰性対照として用いた。
本明細書において提供される一実施形態は、変異を回避しながら、Ｈｅｒ２−ｎｅｕ抗原発現腫瘍の、予防、治療、及びワクチン接種のための、並びにＨｅｒ２−ｎｅｕ抗原のサブドミナントエピトープに対する免疫応答を誘導するための、組成物及び方法である。別の実施形態においては、変異の回避はエピトープ拡散に起因する。さらに別の実施形態では、変異の回避は、抗原のキメラ性に起因する。
本明細書において提供される別の実施形態は、融合ポリペプチドを含む免疫原性組成物であり、この融合ポリペプチドは、追加のポリペプチドに融合したＨｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、及びこの融合タンパク質をＨｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍を有する被験体に投与することは、腫瘍内のエスケープ変異を防止する。本願の別の実施形態においては、免疫原性組成物を含む組換えリステリアワクチン菌株が提供される。
本明細書において提供される一実施形態は、ヒト以外の動物での、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発現腫瘍の増殖、又は癌に対する増強された免疫応答を引き起こす方法であり、この方法は、融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換えリステリアを投与するステップを含み、この融合ポリペプチドは、追加のアジュバントポリペプチドに融合したＨｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む。
本明細書において提供される別の実施形態は、ヒト以外の動物での、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発現腫瘍の増殖又は癌に対する防止方法であり、この方法は、融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換えリステリアを投与するステップを含み、この融合ポリペプチドは、追加のアジュバントポリペプチドに融合したＨｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む。
本明細書において提供される一実施形態は、ヒト以外の動物での、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発現腫瘍の増殖又は癌に対する治療方法であり、この方法は、融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換えリステリアを投与するステップを含み、この融合ポリペプチドは、追加のアジュバントポリペプチドに融合したＨｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む。別の実施形態においてヒト以外の動物はイヌ科動物である。さらに別の実施形態では、イヌ科動物はイヌである。
本明細書中に示される一実施形態は、核酸分子を含む組換えリステリアワクチン菌株であり、この核酸分子はポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、このポリペプチドは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、核酸分子は代謝酵素をコードする第二のオープンリーディングフレームを更に含み、及びこの代謝酵素は、組換えリステリア株の染色体内に欠失している内在性遺伝子を補完する。別の実施形態においては、組換えリステリアワクチン菌株では、核酸分子は代謝酵素をコードする第三のオープンリーディングフレームを更に含み、及びこの代謝酵素は、組換えリステリア株の染色体内に欠失している内在性遺伝子を補完する。
本明細書において提供される別の実施形態は、核酸分子を含む組換えリステリアワクチン菌株であり、この核酸分子はポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、このポリペプチドは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、核酸分子は代謝酵素をコードする第二および第三のオープンリーディングフレームを更に含み、及びこの代謝酵素は、組換えリステリア株の染色体内に欠失している内在性遺伝子を補完する。一実施形態においては、核酸分子はリステリアゲノムに組み込まれている。別の実施形態においては、核酸分子は、組換えリステリアワクチン菌株のプラスミド中に存在する。更に別の実施形態では、プラスミドは、抗生物質による選別がない場合には、組換えリステリアワクチン菌株中に安定に維持される。別の実施形態においては、プラスミドは、組換えリステリアに抗生物質耐性を与えない。別の実施形態においては、組換えリステリア株は弱毒化されている。別の実施形態においては、組換えリステリアは、弱毒化された栄養要求性菌株である。別の実施形態においては、外来抗原の発現が本発明の一つなどの細菌に及ぼす高い代謝負担も弱毒化の重要な機構である。
一実施形態においては、弱毒化された菌株はＬｍｄｄＡである。別の実施形態においては、この菌株は、リステリアに基づくワクチンに固有の特性である強いアジュバント効果を発揮する。このアジュバント効果の一つの発現は、無関係なリステリア、又はＡＤＸＳ−３１−１６４ワクチンのいずれかにより引き起こされた腫瘍内Ｔｒｅｇ数の１／５への減少である（本願の図５を参照されたい）。別の実施形態においては、無関係な抗原（ＨＰＶ１６Ｅ７）を発現するＬｍｄｄＡベクターは、腫瘍内のＴｒｅｇの頻度の大幅な減少とも関係しており、そのことは本来の免疫応答の結果である可能性がある。
一実施形態においては、本発明はｈｅｒ−２−キメラのクローニングのための核酸配列を提供する（本願中の実施例の表１を参照されたい）。
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕキメラ構築物は、それぞれの分離したｈＨｅｒ−２／ｎｅｕセグメントをテンプレートとして、ＳＯＥｉｎｇＰＣＲ法による直接融合により作製された。プライマーが表２に示されている（本願の実施例を参照されたい）。
一実施形態においては、Ｌｍｄｄａ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）は、本明細書において提供される実施例に従って作製される。一実施形態においては、キメラＨｅｒ２遺伝子（ＣｈＨｅｒ２）遺伝子は、Ｘｈｏｌ及びＳｐｅｌ制限酵素を用いて、ｐＡｄｖ１３８から切り出され、ＬｍｄｄシャトルベクターのＬＬＯのトランケートされた非溶血性フラグメントのフレームでクローン化される。別の実施形態においては、挿入物の配列、ＬＬＯ及びｈｌｙプロモーターは、ＤＮＡ配列解析により確認される。別の実施形態においては、このプラスミドは、次いでエレクトロコンピテントな、ａｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ変異リステリア株、ＬｍｄｄＡに電子穿孔され、陽性クローンはストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍｌ）を含む、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天プレートで選別される。別の実施形態においては、ｈＨｅｒ２／ｎｅｕ（Ｌｍ−ｈＨｅｒ２）フラグメントを発現する同様のリステリア株が、比較の目的で用いられた。別の実施形態においては、免疫系にリステリアが与える抗原非依存性効果の割り出しのために、無関係なリステリア構築物（Ｌｍ−参照）が含められた。別の実施形態においては、Ｌｍ−参照は、ＨＰＶ１６−Ｅ７又はＮＹ−ＥＳＯ−１などの異なる抗原を発現する以外は、Ｌｍｄｄａ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）と同一のリステリアプラットフォームに基づいた。別の実施形態においては、リステリアからの融合タンパク質の発現及び分泌が試験され、及び限定はされないが、免疫ブロット法、ＲＮＡブロット法、免疫蛍光法などの当技術分野で周知の方法を使用して確認された。別の実施形態においては、各構築物はインビボで２回継代された（本願中の実施例を参照されたい）。
一実施形態においては、弱毒化された栄養要求性リステリアワクチン菌株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）菌株は、病原性遺伝子ａｃｔＡの欠失に起因して弱毒化され、ｄａｌ遺伝子の補完により、インビボ及びインビトロでのＨｅｒ２／ｎｅｕ発現のためのプラスミドは維持しているリステリアワクチンベクターに基づいている。一実施形態においては、ＡＤＸＳ３１−１６４は、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の最初の４４１個のアミノ酸と融合したキメラＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を発現、分泌する。別の実施形態においては、構築物は、融合タンパク質の発現及び分泌を可能にするために、当技術分野で周知の、適切なプロモーター及びシグナル配列、又はシグナルペプチドを利用する。これらのプロモーター及びシグナル配列のいくつかとしては、限定はされないがリステリアａｃｔＡプロモーター、及びシグナル配列、ｈｌｙプロモーター及びシグナル配列、当技術分野で周知のｐ６０プロモーター、及び他のプロモーター及びシグナル配列が挙げられ、これらのうちのいくつかは、米国特許第５，８３０，７０２号に記載されており、この特許は参照により本明細書に組み込まれる。
一実施形態においては、ＡＤＸＳ３１−１６４は、トランスジェニック動物中のＨＥＲ２／ｎｅｕに対する耐性を打壊す能力とともに、強力な抗原特異的な抗腫瘍反応を発揮する（実施例２を参照されたい）。別の実施形態においては、ＡＤＸＳ３１−１６４は、目的の抗原の異なるドメインに位置するヒトエピトープに対して、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的免疫応答を引き起こし得る（実施例２を参照されたい）。別の実施形態においては、ＡＤＸＳ３１−１６４菌株は高度に弱毒化され、及びより迅速に免疫されたマウスの脾臓から排出されるために、以前のリステリアワクチン世代よりもより良い安全性プロファイルを有している。別の実施形態においては、ＡＤＸＳ３１−１６４がより弱毒化されているにも関わらず、Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物中での、自然発生的乳房腫瘍の侵襲の防止において、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２よりも、より有効である（実施例３を参照されたい）。
別の実施形態においては、ＡＤＸＳ３１−１６４は、このワクチンの抗生物質耐性、及びより毒性であるバージョンである、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２よりも、トランスジェニック動物での腫瘍侵襲に対し、より長い遅延をもたらす（図３を参照されたい）。別の実施形態においては、ＡＤＸＳ３１−１６４菌株は高度に免疫原性であり、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ自己抗原に対する耐性を打ち破り、及びＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物における腫瘍形成を防止する能力がある。別の実施形態においては、ＡＤＸＳ３１−１６４は、腫瘍内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の大幅な減少を引き起こす（本願の実施例５を参照されたい）。別の実施形態においては、ＬｍｄｄＡワクチンで治療された腫瘍中のより頻度の低いＴｒｅｇは、増加した腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比をもたらし、より好ましい腫瘍のミクロ環境が、ＬｍｄｄＡワクチンによる免疫付与後に得られることを示唆している（本願の実施例５を参照されたい）。別の実施形態においては、このキメラ抗原の使用はエスケープ変異をもたらさず、変異により腫瘍が、この新規抗原による治療に対する有効な応答から逃避することがないことを示している（本願の実施例６を参照されたい）。別の実施形態においては、ＡＤＸＳ３１−１６４による末梢免疫付与は、脳内の転移性乳癌細胞株の増殖を遅延させる（本願の実施例７を参照されたい）。別の実施形態においては、ＡＤＸＳ３１−１６４の末梢投与は、中枢神経系に到達し、ＬｍｄｄＡに基づくワクチンが、ＣＮＳ腫瘍の治療可能性を提供することを実証している（本願の実施例７を参照されたい）。
イヌ骨肉腫は、１０歳を超える大型犬の一番の死因となる長（脚）骨の癌である。標準的治療は、診断後の速やかな切断、それに続く化学療法である。しかしながら、常にこの癌は肺に転移する。化学療法により、イヌは、それをしない場合の６〜１２か月と比較して、約１８か月生存する。ＨＥＲ２抗原は、骨肉腫の場合には５０％を超える割合で存在すると信じられている。一実施形態においては、本明細書において提供されるワクチンであるＡＤＸＳ３１−１６４は、この抗原発現細胞への免疫攻撃を発生し、及びヒト乳癌を治療する。
組織学的な骨肉腫の診断を有するイヌは、悪性細胞によるＨｅｒ２／ｎｅｕ発現の証拠を示した。したがって、本明細書において提供される一実施形態は、イヌ科動物骨肉腫を治療する方法であり、この方法は、ＡＤＸＳ３１−１６４及びアジュバントを含むワクチン組成物を、骨肉腫を有するイヌ科動物に投与するステップを含み、それによりイヌ骨肉腫を治療する（本願の実施例８を参照されたい）。本明細書において提供される別の実施形態は、ＡＤＸＳ３１−１６４及びアジュバントから成るワクチン組成物を、骨肉腫を有するイヌ科動物に投与するステップを含み、それによりイヌ骨肉腫を治療する（本願の実施例８を参照されたい）。本明細書において提供される別の実施形態は、ＡＤＸＳ３１−１６４から成るワクチン組成物を、骨肉腫を有するイヌ科動物に投与するステップを含み、それによりイヌ骨肉腫を治療する（本願の実施例８を参照されたい）。
別の実施形態においては、本発明のワクチンは、当業者には明らかなように、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、経口投与、経鼻投与などを含む当技術分野において周知の様々な方法を用いてイヌ科動物に投与される。別の実施形態においては、このワクチンは、イヌ科動物被験体の舌の基底細胞の近くに送達されるように投与される。
別の実施形態においては、投与は単回のイベントであるか、又は免疫応答を増大させるために、複数の追加抗原投与が、さまざまな間隔で行われ得る。イヌ科動物の幼若固体への投与の場合、典型的な投与計画は、例えば２〜３週齢の年齢で最初の投与を行い、続いて４〜６週齢で追加抗原投与を行う。別の実施形態においては、投与は予防的であり、すなわち、腫瘍の増殖が起きる前、又は起きていると疑われるときに行われるが、事後、すなわち、治療的には、例えば腫瘍又は癌の増殖に付随する症状の出現後に行うこともできる。
一実施形態においては、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２菌株はＬｍ−ＬＬＯ−１３８である。
一実施形態においては、組換えの弱毒化された、抗生物質を含まないリステリア発現キメラ抗原は、本明細書において例示されるように、癌又は固形腫瘍の予防及び治療に有用である。別の実施形態においては、腫瘍はＨｅｒ２／ｎｅｕ陽性腫瘍である。別の実施形態においては、癌はＨｅｒ２／ｎｅｕ発現癌である。別の実施形態においては、癌は、乳癌、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、頭頸部癌、骨肉腫、イヌ骨肉腫、又は当技術分野において周知の任意の癌である。別の実施形態においては、腫瘍は、骨腫瘍、乳房腫瘍、頭頸部腫瘍、又は当技術分野において周知の任意の他の抗原発現腫瘍である。別の実施形態においては、キメラＨｅｒ２／ｎｅｕを発現する組換えリステリアは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ過剰発現固形腫瘍の治療のための治療的ワクチンとして有用である。別の実施形態においては、本明細書において提供されるこのＨｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍の治療、及びそのエスケープ変異を防止するために有用である。別の実施形態においては、用語「エスケープ変異」は、治療に対する有効な反応から、変異により逃れようとする腫瘍を意味する。
本明細書において提供される一実施形態は、免疫原性組成物をコードする核酸分子を含む第一のオープンリーディングフレームを含む核酸分子であり、この核酸分子は、組換えリステリアワクチン菌株内に存在する。別の実施形態においては、本明細書において提供されるこの核酸分子は、組換えリステリアに到達するために、リステリアの形質転換のために用いられる。別の実施形態においては、本明細書において提供されるこの核酸は病原性遺伝子を欠いている。別の実施形態においては、この核酸分子は非機能性病原性遺伝子を担持するリステリアゲノムに組み込まれている。別の実施形態においては、この病原性遺伝子は、組換えリステリア中で変異される。更に別の実施形態では、この核酸分子は、リステリアゲノム中に存在する内在性遺伝子の不活性化のために用いられる。更に別の実施形態では、この病原性遺伝子はＡｃｔＡ遺伝子である。別の実施形態においては、この病原性遺伝子はＰｒｆＡ遺伝子である。当業者には明らかなように、この病原性遺伝子は、組換えリステリア中の病原性に関係する、当技術分野において周知の任意の遺伝子であってよい。
一実施形態においては、代謝関連遺伝子、病原性遺伝子などは、リステリア株の染色体中に欠失している。別の実施形態においては、代謝関連遺伝子、病原性遺伝子などは、染色体、及びリステリア株の任意のエピソーム性の遺伝的要素の中で欠失している。別の実施形態においては、代謝関連遺伝子、病原性遺伝子などは、病原性菌株のゲノム中で欠失している。一実施形態においては、病原性遺伝子は染色体で変異させられる。別の実施形態においては、病原性遺伝子は染色体から削除されている。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
一実施形態においては、代謝関連遺伝子、病原性遺伝子などは、リステリア株の染色体中に欠失している。別の実施形態においては、代謝関連遺伝子、病原性遺伝子などは、染色体、及びリステリア株の任意のエピソーム性の遺伝的要素の中で欠失している。別の実施形態においては、代謝関連遺伝子、病原性遺伝子などは、病原性菌株のゲノム中で欠失している。一実施形態においては、病原性遺伝子は染色体で変異させられる。別の実施形態においては、病原性遺伝子は染色体から削除されている。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
別の実施形態においては、本明細書において提供される核酸及びプラスミドは、組換えリステリアには抗生物質耐性を与えない。
「核酸分子」は、別の実施形態においてはプラスミドを指す。別の実施形態においては、この用語は組込み型ベクターを指す。別の実施形態においては、この用語は、組込み型ベクターを含むプラスミドを指す。別の実施形態においては、この組込み型ベクターは、部位特異的組込み型ベクターである。別の実施形態においては、本発明の方法及び組成物の核酸分子は、当技術分野において周知の任意のタイプのヌクレオチドにより構成される。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
「代謝酵素」は、別の実施形態においては、宿主の細菌により要求される栄養の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態においては、この用語は、宿主の細菌により要求される栄養の合成に要求される酵素を指す。別の実施形態においては、この用語は、宿主の細菌により要求される栄養の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態においては、この用語は、宿主の細菌の持続的な増殖に要求される栄養の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態においては、この酵素は、栄養の合成に必要とされる。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
「安定に維持される」は、別の実施形態においては、選別（例えば、抗生物質による選別）がない場合には、１０世代にわたる核酸分子又はプラスミドの、検出可能な損失のない維持を指す。別の実施形態においては、この期間は１５世代である。別の実施形態においては、この期間は２０世代である。別の実施形態においては、この期間は２５世代である。別の実施形態においては、この期間は３０世代である。別の実施形態においては、この期間は４０世代である。別の実施形態においては、この期間は５０世代である。別の実施形態においては、この期間は６０世代である。別の実施形態においては、この期間は８０世代である。別の実施形態においては、この期間は１００世代である。別の実施形態においては、この期間は１５０世代である。別の実施形態においては、この期間は２００世代である。別の実施形態においては、この期間は３００世代である。別の実施形態においては、この期間は５００世代である。別の実施形態においては、この期間は数百世代より多い。別の実施形態においては、この核酸分子又はプラスミドはインビトロで（例えば、培養物中で）安定に維持される。別の実施形態においては、この核酸分子又はプラスミドは、インビボで安定に維持される。別の実施形態においては、この核酸分子又はプラスミドは、インビトロ及びインビトロの両方で安定に維持される。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
一実施形態においては、本発明は、抗原を発現する組換えリステリア株である。本発明は、リステリオリシン（ＬＬＯ）タンパク質のフラグメント、ＰＥＳＴペプチド、又はＨｅｒ−２キメラタンパク質、若しくはそのフラグメントと融合したＮ末端ＡｃｔＡフラグメントを含む組換えペプチド、それを含むワクチン及び免疫原性組成物、及び抗Ｈｅｒ−２免疫応答を誘導する方法、それを含むＨｅｒ−２発現腫瘍に対する治療、並びにワクチン接種を提供する。
別の実施形態においては、本発明の組換えリステリア株は、動物宿主を介して継代される。別の実施形態においては、継代は、ワクチンベクターとしての有効性を最大化する。別の実施形態においては、この継代は、リステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態においては、この継代は、リステリア株の病原性を安定化する。別の実施形態においては、この継代は、リステリア株の免疫原性を増加させる。別の実施形態においては、この継代は、リステリア株の病原性を増加させる。別の実施形態においては、この継代は、リステリア株の不安定な亜株を除去する。別の実施形態においては、この継代は、リステリア株の不安定な亜株の出現率を低下させる。別の実施形態においては、このリステリア株は、抗原含有組換えペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入を含む。別の実施形態においては、このリステリア株は、抗原含有組換えペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを担持する。別の実施形態においては、この継代は当技術分野において周知の任意の他の方法により行われる。
一実施形態においては、本明細書において提供されるポリペプチドは、ａ）非溶血性ＬＬＯタンパク質、若しくはＮ末端フラグメント、ｂ）ＰＥＳＴ配列、又はｃ）Ｎ末端ＡｃｔＡフラグメントから成る群から選ばれる、追加のポリペプチドとの融合タンパク質であり、及び更に追加のポリペプチドはＨｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原と融合している。別の実施形態においては、この追加のポリペプチドは機能性である。別の実施形態においては、この追加のポリペプチドのフラグメントは免疫原性である。別の実施形態においては、この追加のポリペプチドは免疫原性である。
別の実施形態においては、本明細書において提供されるポリペプチドは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原に融合した非溶血性ＬＬＯタンパク質又はＮ末端フラグメントを含む融合タンパク質である。別の実施形態においては、本発明の方法及び組成物の融合タンパク質はリステリアからのＡｃｔＡ配列を含む。ＡｃｔＡタンパク質及びそのフラグメントは、ＬＬＯと同様に、抗原を提示して免疫力を増強する。
本発明の方法及び組成物の別の実施形態においては、融合タンパク質は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原及び追加のアジュバントポリペプチドを含む。一実施形態においては、追加のポリペプチドは非溶血性ＬＬＯタンパク質又はそのフラグメントである（本願中の実施例を参照されたい）。別の実施形態においては、追加のポリペプチドはＰＥＳＴ配列である。別の実施形態においては、追加のポリペプチドは、ＡｃｔＡタンパク質又はそのフラグメントである。ＡｃｔＡタンパク質及びそのフラグメントは、ＬＬＯと同様の様式で抗原を提示して、免疫力を増強する。
本発明の方法及び組成物の追加のポリペプチドは、別の実施形態においては、リステリオリシン（ＬＬＯ）ペプチドである。別の実施形態においては、この追加のポリペプチドは、ＡｃｔＡペプチドである。別の実施形態においては、この追加のポリペプチドは、ＰＥＳＴ様の配列のペプチドである。別の実施形態においては、この追加のポリペプチドは、抗原ペプチドの免疫原性を増強する能力のある任意の他のペプチドである。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
Ｈｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む融合タンパク質は、例えば、以下に議論されるクローニング及び適切な配列の制限、又は直接化学合成などを含む任意の適切な方法により調製され得る。代替的に、部分配列はクローニングされることができ、及びその適切な部分配列を適切な制限酵素により切り出すことができる。そのフラグメントは、所望のＤＮＡ配列を生成するために連結することができる。一実施形態においては、この抗原をコードするＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅方法を用いて作製することができる。まず、新しい末端の両側の天然ＤＮＡのセグメントが、別々に増幅される。一方の増幅された配列の５’末端が、ペプチドリンカーをコードし、その一方で、他方の増幅された配列の３’末端もペプチドリンカーをコードする。第一のフラグメントの５’末端は、第二のフラグメントの３’末端に相補的であるために、これらの２つのフラグメント（例えば、ＬＭＰアガロースによる部分的な精製の後）は、３番目のＰＣＲ反応において、オーバーラップするテンプレートとして使用できる。この増幅された配列は、コドン、オープニング部位のカルボキシル末端側のセグメント（今や、アミノ配列を形成する）、リンカー、及びオープニング部位のアミノ側の配列（今や、カルボキシル配列を形成する）を含む。この抗原はプラスミド中に連結される。それぞれの方法は、本発明の別々の実施形態を表している。
本発明の結果は、本発明の組成物の投与が、腫瘍細胞を認識して殺す抗原特異的Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）の形成を誘導するための有用性を有することを実証した（本願中の実施例を参照されたい）。
一実施形態においては、本発明は、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質又はそのフラグメントに融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントを含む組換えポリペプチドを提供する。一実施形態においては、本発明は、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質又はそのフラグメントに融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントから成る組換えポリペプチドを提供する。
別の実施形態においては、本発明の方法及び組成物のＨｅｒ−２キメラタンパク質は、ヒトＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態においては、このＨｅｒ−２タンパク質はマウスＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態においては、このＨｅｒ−２タンパク質は、ラットＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態においては、このＨｅｒ−２タンパク質は、霊長類Ｈｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態においては、このＨｅｒ−２タンパク質はヒト、他の動物種、又は当技術分野において周知のそれらの組合せのＨｅｒ−２キメラタンパク質である。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
別の実施形態においては、Ｈｅｒ−２タンパク質は、“ＨＥＲ−２／ｎｅｕ”、“Ｅｒｂｂ２”、“ｖ−ｅｒｂ−ｂ２”、“ｃ−ｅｒｂ−ｂ２”、“ｎｅｕ”、又は“ｃＮｅｕ”と称されるタンパク質である。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
一実施形態においては、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は、癌遺伝子のＭＨＣクラスＩエピトープのクラスターを示す、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の２つの細胞外、及び１つの細胞内フラグメントを含む。別の実施形態においては、キメラタンパク質は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原（フラグメントＥＣ１、ＥＣ２、及びＩＣ１）の３つのＨ２Ｄｑ、及び少なくとも１７個のマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープを含む（図１及び実施例１を参照されたい）。別の実施形態においては、キメラタンパク質は、少なくとも１３個のマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（フラグメントＥＣ２及びＩＣ１）を含む。別の実施形態においては、キメラタンパク質は、少なくとも１４個のマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（フラグメントＥＣ１及びＩＣ１）を含む。別の実施形態においては、キメラタンパク質は、少なくとも９個のマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープ（フラグメントＥＣ１及びＩＣ２）を含む。別の実施形態においては、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は、非溶血性リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）に融合している。別の実施形態においては、Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は、リステリア・モノサイトゲネスリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質の初めの４４１アミノ酸と融合しており、リステリア・モノサイトゲネスの弱毒化栄養要求性菌株ＬｍｄｄＡにより発現され分泌される。別の実施形態においては、本明細書において提供される、キメラＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原／ＬＬＯ融合を発現する、弱毒化された栄養要求性菌株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現及び分泌は、インビトロで８時間増殖させたのちに、ＴＣＡにより沈殿させた細胞培養物の上澄み液中のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現及び分泌に匹敵する（図１Ｂを参照されたい）。
一実施形態においては、無関係なリステリアワクチンを注射された、抗原感作を受けたことのない（ナイーブな）動物又はマウスではＣＴＬ活性は検出されない（図２Ａを参照されたい）。一方、別の実施形態においては、本明細書において提供される弱毒化された栄養要求性菌株（ＡＤＸＳ３１−１６４）は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスにおいて、脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌を促進することができる（図２Ｂ）。
別の実施形態においては、本明細書において提供される方法及び組成物の代謝酵素は、アミノ酸代謝酵素であり、別の実施形態においては、代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素である。別の実施形態においては、代謝酵素はＤ−アミノ酸転移酵素である。別の実施形態においては、代謝酵素は、組換えリステリア株において細胞壁合成に使用されるアミノ酸生成を触媒し、別の実施形態においては、代謝酵素は、アラニンラセマーゼ酵素である。
別の実施形態においては、代謝酵素をコードする遺伝子は、リステリアｐ６０プロモーターの制御下に発現される。別の実施形態においては、ｉｎｌＡ（インターナリンをコードする）プロモーターが用いられる。別の実施形態においては、ｈｌｙプロモーターが用いられる。別の実施形態においては、ＡｃｔＡプロモーターが用いられる。別の実施形態においては、インテグラーゼ遺伝子は、他の任意のグラム陽性プロモーターの制御下に発現される。別の実施形態においては、代謝酵素をコードする遺伝子は、リステリア内で機能する、任意の他のプロモーターの制御下に発現される。当業者は、他のプロモーター、又は多シストロン性発現カセットが遺伝子の発現を促進することを理解するであろう。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
別の実施形態においては、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質は、配列番号１に示される以下の核酸配列によりコードされる
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別の実施形態においては、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質は以下の配列を有する：
Ｅ Ｔ Ｈ Ｌ Ｄ Ｍ Ｌ Ｒ Ｈ Ｌ Ｙ Ｑ Ｇ Ｃ Ｑ Ｖ Ｖ Ｑ Ｇ Ｎ Ｌ Ｅ Ｌ Ｔ Ｙ Ｌ Ｐ Ｔ Ｎ Ａ Ｓ Ｌ Ｓ Ｆ Ｌ Ｑ Ｄ Ｉ Ｑ Ｅ Ｖ Ｑ Ｇ Ｙ Ｖ Ｌ Ｉ Ａ Ｈ Ｎ Ｑ Ｖ Ｒ Ｑ Ｖ Ｐ Ｌ Ｑ Ｒ Ｌ Ｒ Ｉ Ｖ Ｒ Ｇ Ｔ Ｑ Ｌ Ｆ Ｅ Ｄ Ｎ Ｙ Ａ Ｌ Ａ Ｖ Ｌ Ｄ Ｎ Ｇ Ｄ Ｐ Ｌ Ｎ Ｎ Ｔ Ｔ Ｐ Ｖ Ｔ Ｇ Ａ Ｓ Ｐ Ｇ Ｇ Ｌ Ｒ Ｅ Ｌ Ｑ Ｌ Ｒ Ｓ Ｌ Ｔ Ｅ Ｉ Ｌ Ｋ Ｇ Ｇ Ｖ Ｌ Ｉ Ｑ Ｒ Ｎ Ｐ Ｑ Ｌ Ｃ Ｙ Ｑ Ｄ Ｔ Ｉ Ｌ Ｗ Ｋ Ｎ Ｉ Ｑ Ｅ Ｆ Ａ Ｇ Ｃ Ｋ Ｋ Ｉ Ｆ Ｇ Ｓ Ｌ Ａ Ｆ Ｌ Ｐ Ｅ Ｓ Ｆ Ｄ Ｇ Ｄ Ｐ Ａ Ｓ Ｎ Ｔ Ａ Ｐ Ｌ Ｑ Ｐ Ｅ Ｑ Ｌ Ｑ Ｖ Ｆ Ｅ Ｔ Ｌ Ｅ Ｅ Ｉ Ｔ Ｇ Ｙ Ｌ Ｙ Ｉ Ｓ Ａ Ｗ Ｐ Ｄ Ｓ Ｌ Ｐ Ｄ Ｌ Ｓ Ｖ Ｆ Ｑ Ｎ Ｌ Ｑ Ｖ Ｉ Ｒ Ｇ Ｒ Ｉ Ｌ Ｈ Ｎ Ｇ Ａ Ｙ Ｓ Ｌ Ｔ Ｌ Ｑ Ｇ Ｌ Ｇ Ｉ Ｓ Ｗ Ｌ Ｇ Ｌ Ｒ Ｓ Ｌ Ｒ Ｅ Ｌ Ｇ Ｓ Ｇ Ｌ Ａ Ｌ Ｉ Ｈ Ｈ Ｎ Ｔ Ｈ Ｌ Ｃ Ｆ Ｖ Ｈ Ｔ Ｖ Ｐ Ｗ Ｄ Ｑ Ｌ Ｆ Ｒ Ｎ Ｐ Ｈ Ｑ Ａ Ｌ Ｌ Ｈ Ｔ Ａ Ｎ Ｒ Ｐ Ｅ Ｄ Ｅ Ｃ Ｖ Ｇ Ｅ Ｇ Ｌ Ａ Ｃ Ｈ Ｑ Ｌ Ｃ Ａ Ｒ Ｇ Ｑ Ｑ Ｋ Ｉ Ｒ Ｋ Ｙ Ｔ Ｍ Ｒ Ｒ Ｌ Ｌ Ｑ Ｅ Ｔ Ｅ Ｌ Ｖ Ｅ Ｐ Ｌ Ｔ Ｐ Ｓ Ｇ Ａ Ｍ Ｐ Ｎ Ｑ Ａ Ｑ Ｍ Ｒ Ｉ Ｌ Ｋ Ｅ Ｔ Ｅ Ｌ Ｒ Ｋ Ｖ Ｋ Ｖ Ｌ Ｇ Ｓ Ｇ Ａ Ｆ Ｇ Ｔ Ｖ Ｙ Ｋ Ｇ Ｉ Ｗ Ｉ Ｐ Ｄ Ｇ Ｅ Ｎ Ｖ Ｋ Ｉ Ｐ Ｖ Ａ Ｉ Ｋ Ｖ Ｌ Ｒ Ｅ Ｎ Ｔ Ｓ Ｐ Ｋ Ａ Ｎ Ｋ Ｅ Ｉ Ｌ Ｄ Ｅ Ａ Ｙ Ｖ Ｍ Ａ Ｇ Ｖ Ｇ Ｓ Ｐ Ｙ Ｖ Ｓ Ｒ Ｌ Ｌ Ｇ Ｉ Ｃ Ｌ Ｔ Ｓ Ｔ Ｖ Ｑ Ｌ Ｖ Ｔ Ｑ Ｌ Ｍ Ｐ Ｙ Ｇ Ｃ Ｌ Ｌ Ｄ （配列番号２）。
一実施形態においては、本明細書において提供される方法及び組成物のＨｅｒ２キメラタンパク質又はそのフラグメントは、そのシグナル配列を含まない。別の実施形態においては、シグナル配列の高度の疎水性のために、シグナル配列の削除は、リステリア内でＨｅｒ２フラグメントがうまく発現されることを可能にする。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
別の実施形態においては、本発明の方法及び組成物のＨｅｒ２キメラタンパク質のフラグメントは、その膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含まない。一実施形態においては、ＴＭの高度の疎水性のために、ＴＭの削除は、リステリア内でＨｅｒ２フラグメントがうまく発現されることを可能にする。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
一実施形態においては、ラット−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子の核酸配列は以下の通りである：
ＣＣＧＧＡＡＴＣＧＣＧＧＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴＧＴＧＴＡＣＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＴＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＴＣＡＧＧＴＡＧＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＴＴＧＧＡＧＣＴＴＡＣＣＴＡＣＧＴＧＣＣＴＧＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＴＣＡＧＧＧＴＴＡＣＡＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＣＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡＴＣＧＴＧＡＧＡＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＧＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＡＣＣＧＡＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＧＴＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＴＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＡＴＡＴＡＧＡＣＡＣＣＡＡＴＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＡＴＣＡＴＡＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＴＣＧＴＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＣＴＴＴＧＡＧＴＣＣＡＴＧＣＡＣＡＡＣＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＴＧＧＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＴＣＴＡＣＧＧＡＡＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＣＴＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＣＣＣＣＧＡＡＴＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＡＧＴＧＣＣＧＡＧＴＡＴＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＣＣＣＣＣＧＧＧＡＧＴＡＴＧＴＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＧＴＧＴＣＡＣＣＣＣＧＡＧＴＧＴＣＡＧＣＣＴＣＡＡＡＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＧＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＧＡＴＣＧＧＡＧＧＣＴＧＡＴＣＡＧＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＴＣＧＴＣＣＴＣＣＴＧＴＧＴＧＧＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴＧＧＴＧＴＧＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣＴＣＴＣＣＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡＧＴＡＣＣＣＧＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣＧＴＧＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＴＣＣＴＧＴＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＧＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＴＧＡＣＡＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＡＣＴＧＴＡＧＴＧＧＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＡＴＣＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＣＧＴＴＧＧＡＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡＡＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＴＡＣＧＡＴＧＣＧＴＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＧＴＴＡＧＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＡＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＴＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＴＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＴＡＧＡＣＧＣＴＧＡＡＧＡＧＴＡＴＣＴＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＣＣＧＧＡＣＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＣＡＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＡＣＡＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＣＧＧＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣＣＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣＣＴＣＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＣＧＡＴＧＴＧＴＴＴＧＡＴＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＣＡＡＴＧＧＧＧＧＴＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＴＧＡＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＧＧＴＡＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＡＣＡＴＴＡＣＣＴＣＴＧＣＣＣＣＣＣＧＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＴＡＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＴＴＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＴＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＡＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧＡＣＣＣＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＧＴＴＧＴＣＡＡＡＧＡＣＧＴＴＴＴＴＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＡＴＡＣＴＴＡＧＴＡＣＣＧＡＧＡＧＡＡＧＧＣＡＣＴＧＣＣＴＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＴＣＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＧＡＣＡＡＣＣＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＡＡＣＴＣＡＴＣＧＧＡＧＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＴＡＡＣＴＴＴＧＡＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＧＴＡＣＣＴＡＧＧＣＣＴＧＧＡＴＧＴＡＣＣＴＧＴＡ（配列番号４５）。
一実施形態においては、ラット／Ｈｅｒ２／ｎｅｕＥＣ１フラグメントをコードする核酸配列は、以下の通りである：
ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＧＴＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＴＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＡＴＡＴＡＧＡＣＡＣＣＡＡＴＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡ（配列番号４６）。
別の実施形態においては、ラットｈｅｒ２／ｎｅｕＥＣ２フラグメントをコードする核酸配列は以下の通りである：
ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡ（配列番号４７）。
別の実施形態においては、ラットｈｅｒ２／ｎｅｕ ＩＣ１フラグメントをコードする核酸配列は以下の通りである：
ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＴＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＴＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡ（配列番号４８）。
一実施形態においては、ヒト−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子の核酸配列は以下の通りである：
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別の実施形態においては、キメラに組み入れられるヒトＨｅｒ２／ｎｅｕＥＣ１フラグメントをコードする核酸配列はヒトＥＣ１領域の１２０〜５１０ｂｐにわたっており、（配列番号５０）に示される。
ＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＧＧＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧ（配列番号５０）。
一実施形態においては、完全なＥＣ１ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕフラグメントはヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子の５８〜９７９ｂｐにわたっており、（配列番号５４）に示される。
ＧＣＣＧＣＧＡＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＧＧＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＣＡＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＣＡＣＴＧＡＴＡＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＧＣＴＣＴＣＧＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＧＡＴＧＴＧＴＡＡＧＧＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＧＡＧＴＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＧＣＡＣＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＧＧＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＡＡＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧＴＧＧＣＡＴＣＴＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＣＧＴＴＴＧＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＣＣＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＴＧＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＣＧＧＡＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＴ（配列番号５４）。
別の実施形態においては、キメラに組み込まれるヒトＨｅｒ２／ｎｅｕＥＣ２フラグメントをコードする核酸配列はヒトＨｅｒ２／ｎｅｕＥＣ２フラグメントの１０７７〜１５５４ｂｐにわたっており、（配列番号５１）に示され、５０ｂｐの延長を含む。
ＡＡＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＡＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＴＡＡＴＣＣＧＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＣＧＣＣＴＡＣＴＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＧＧＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＡＴＡＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＴＣＧＧＡＡＣＣＣＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＧＡＧＴＧＴＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＧＣＣＣＧＡＧＧＧ（配列番号５１）。
一実施形態においては、完全なＥＣ２ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕフラグメントはヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子の９０７〜１５０４ｂｐにわたっており、（配列番号５５）において示される。
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別の実施形態においては、キメラに組み込まれるヒトＨｅｒ２／ｎｅｕＩＣ１フラグメントをコードする核酸配列は（配列番号５２）に示される。
ＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＴＡＧＣＧＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＡＣＧＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＡＣＴ（配列番号５２）。
別の実施形態においては、完全なヒトＨｅｒ２／ｎｅｕＩＣ１フラグメントをコードする核酸配列はヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子の２０３４〜３２４３ｂｐにわたっており、（配列番号５６）に示される。
ＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＴＡＧＣＧＧＡＧＣＧＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＡＣＧＡＡＧＣＡＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＡＡＣＣＧＣＧＧＡＣＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＴＴＧＧＣＣＧＣＴＣＧＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＡＣＡＧＡＣＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＣＴＧＧＡＧＴＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＴＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＣＣＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＴＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＣＴＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＧＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＴＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＧＣＡＴＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＴＡＣＣＡＧＧＡＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＡＣＡＣＴＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＧＡＡＧＧＧＧＣＴ（配列番号５６）。
本明細書において提供される方法及び組成物において利用されるＬＬＯは、一実施形態においては、リステリアＬＬＯである。一実施形態においては、ＬＬＯが誘導されるリステリアは、リステリア・モノサイトゲネス（ＬＭ）である。別の実施形態においては、リステリアは、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）である。別の実施形態においては、リステリアは、リステリア・ウェルシメリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）である。別の実施形態においては、リステリアは、リステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）である。別の実施形態においては、ＬＬＯタンパク質は、非リステリアのＬＬＯタンパク質である。別の実施形態においては、ＬＬＯタンパク質は、合成ＬＬＯタンパク質である。別の実施形態においては、それは組換えＬＬＯタンパク質である。
一実施形態においては、ＬＬＯタンパク質は、（配列番号３）に示される核酸配列によりコードされる。
ａｔｇａａａａａａａｔａａｔｇｃｔａｇｔｔｔｔｔａｔｔａｃａｃｔｔａｔａｔｔａｇｔｔａｇｔｃｔａｃｃａａｔｔｇｃｇｃａａｃａａａｃｔｇａａｇｃａａａｇｇａｔｇｃａｔｃｔｇｃａｔｔｃａａｔａａａｇａａａａｔｔｃａａｔｔｔｃａｔｃｃａｔｇｇｃａｃｃａｃｃａｇｃａｔｃｔｃｃｇｃｃｔｇｃａａｇｔｃｃｔａａｇａｃｇｃｃａａｔｃｇａａａａｇａａａｃａｃｇｃｇｇａｔｇａａａｔｃｇａｔａａｇｔａｔａｔａｃａａｇｇａｔｔｇｇａｔｔａｃａａｔａａａａａｃａａｔｇｔａｔｔａｇｔａｔａｃｃａｃｇｇａｇａｔｇｃａｇｔｇａｃａａａｔｇｔｇｃｃｇｃｃａａｇａａａａｇｇｔｔａｃａａａｇａｔｇｇａａａｔｇａａｔａｔａｔｔｇｔｔｇｔｇｇａｇａａａａａｇａａｇａａａｔｃｃａｔｃａａｔｃａａａａｔａａｔｇｃａｇａｃａｔｔｃａａｇｔｔｇｔｇａａｔｇｃａａｔｔｔｃｇａｇｃｃｔａａｃｃｔａｔｃｃａｇｇｔｇｃｔｃｔｃｇｔａａａａｇｃｇａａｔｔｃｇｇａａｔｔａｇｔａｇａａａａｔｃａａｃｃａｇａｔｇｔｔｃｔｃｃｃｔｇｔａａａａｃｇｔｇａｔｔｃａｔｔａａｃａｃｔｃａｇｃａｔｔｇａｔｔｔｇｃｃａｇｇｔａｔｇａｃｔａａｔｃａａｇａｃａａｔａａａａｔａｇｔｔｇｔａａａａａａｔｇｃｃａｃｔａａａｔｃａａａｃｇｔｔａａｃａａｃｇｃａｇｔａａａｔａｃａｔｔａｇｔｇｇａａａｇａｔｇｇａａｔｇａａａａａｔａｔｇｃｔｃａａｇｃｔｔａｔｃｃａａａｔｇｔａａｇｔｇｃａａａａａｔｔｇａｔｔａｔｇａｔｇａｃｇａａａｔｇｇｃｔｔａｃａｇｔｇａａｔｃａｃａａｔｔａａｔｔｇｃｇａａａｔｔｔｇｇｔａｃａｇｃａｔｔｔａａａｇｃｔｇｔａａａｔａａｔａｇｃｔｔｇａａｔｇｔａａａｃｔｔｃｇｇｃｇｃａａｔｃａｇｔｇａａｇｇｇａａａａｔｇｃａａｇａａｇａａｇｔｃａｔｔａｇｔｔｔｔａａａｃａａａｔｔｔａｃｔａｔａａｃｇｔｇａａｔｇｔｔａａｔｇａａｃｃｔａｃａａｇａｃｃｔｔｃｃａｇａｔｔｔｔｔｃｇｇｃａａａｇｃｔｇｔｔａｃｔａａａｇａｇｃａｇｔｔｇｃａａｇｃｇｃｔｔｇｇａｇｔｇａａｔｇｃａｇａａａａｔｃｃｔｃｃｔｇｃａｔａｔａｔｃｔｃａａｇｔｇｔｇｇｃｇｔａｔｇｇｃｃｇｔｃａａｇｔｔｔａｔｔｔｇａａａｔｔａｔｃａａｃｔａａｔｔｃｃｃａｔａｇｔａｃｔａａａｇｔａａａａｇｃｔｇｃｔｔｔｔｇａｔｇｃｔｇｃｃｇｔａａｇｃｇｇａａａａｔｃｔｇｔｃｔｃａｇｇｔｇａｔｇｔａｇａａｃｔａａｃａａａｔａｔｃａｔｃａａａａａｔｔｃｔｔｃｃｔｔｃａａａｇｃｃｇｔａａｔｔｔａｃｇｇａｇｇｔｔｃｃｇｃａａａａｇａｔｇａａｇｔｔｃａａａｔｃａｔｃｇａｃｇｇｃａａｃｃｔｃｇｇａｇａｃｔｔａｃｇｃｇａｔａｔｔｔｔｇａａａａａａｇｇｃｇｃｔａｃｔｔｔｔａａｔｃｇａｇａａａｃａｃｃａｇｇａｇｔｔｃｃｃａｔｔｇｃｔｔａｔａｃａａｃａａａｃｔｔｃｃｔａａａａｇａｃａａｔｇａａｔｔａｇｃｔｇｔｔａｔｔａａａａａｃａａｃｔｃａｇａａｔａｔａｔｔｇａａａｃａａｃｔｔｃａａａａｇｃｔｔａｔａｃａｇａｔｇｇａａａａａｔｔａａｃａｔｃｇａｔｃａｃｔｃｔｇｇａｇｇａｔａｃｇｔｔｇｃｔｃａａｔｔｃａａｃａｔｔｔｃｔｔｇｇｇａｔｇａａｇｔａａａｔｔａｔｇａｔ（配列番号３）。
別の実施形態においては、ＬＬＯタンパク質は配列配列番号４を有する。
Ｍ Ｋ Ｋ Ｉ Ｍ Ｌ Ｖ Ｆ Ｉ Ｔ Ｌ Ｉ Ｌ Ｖ Ｓ Ｌ Ｐ Ｉ Ａ Ｑ Ｑ Ｔ Ｅ Ａ Ｋ Ｄ Ａ Ｓ Ａ Ｆ Ｎ Ｋ Ｅ Ｎ Ｓ Ｉ Ｓ Ｓ Ｍ Ａ Ｐ Ｐ Ａ Ｓ Ｐ Ｐ Ａ Ｓ Ｐ Ｋ Ｔ Ｐ Ｉ Ｅ Ｋ Ｋ Ｈ Ａ Ｄ Ｅ Ｉ Ｄ Ｋ Ｙ Ｉ Ｑ Ｇ Ｌ Ｄ Ｙ Ｎ Ｋ Ｎ Ｎ Ｖ Ｌ Ｖ Ｙ Ｈ Ｇ Ｄ Ａ Ｖ Ｔ Ｎ Ｖ Ｐ Ｐ Ｒ Ｋ Ｇ Ｙ Ｋ Ｄ Ｇ Ｎ Ｅ Ｙ Ｉ Ｖ Ｖ Ｅ Ｋ Ｋ Ｋ Ｋ Ｓ Ｉ Ｎ Ｑ Ｎ Ｎ Ａ Ｄ Ｉ Ｑ Ｖ Ｖ Ｎ Ａ Ｉ Ｓ Ｓ Ｌ Ｔ Ｙ Ｐ Ｇ Ａ Ｌ Ｖ Ｋ Ａ Ｎ Ｓ Ｅ Ｌ Ｖ Ｅ Ｎ Ｑ Ｐ Ｄ Ｖ Ｌ Ｐ Ｖ Ｋ Ｒ Ｄ Ｓ Ｌ Ｔ Ｌ Ｓ Ｉ Ｄ Ｌ Ｐ Ｇ Ｍ Ｔ Ｎ Ｑ Ｄ Ｎ Ｋ Ｉ Ｖ Ｖ Ｋ Ｎ Ａ Ｔ Ｋ Ｓ Ｎ Ｖ Ｎ Ｎ Ａ Ｖ Ｎ Ｔ Ｌ Ｖ Ｅ Ｒ Ｗ Ｎ Ｅ Ｋ Ｙ Ａ Ｑ Ａ Ｙ Ｐ Ｎ Ｖ Ｓ Ａ Ｋ Ｉ Ｄ Ｙ Ｄ Ｄ Ｅ Ｍ Ａ Ｙ Ｓ Ｅ Ｓ Ｑ Ｌ Ｉ Ａ Ｋ Ｆ Ｇ Ｔ Ａ Ｆ Ｋ Ａ Ｖ Ｎ Ｎ Ｓ Ｌ Ｎ Ｖ Ｎ Ｆ Ｇ Ａ Ｉ Ｓ Ｅ Ｇ Ｋ Ｍ Ｑ Ｅ Ｅ Ｖ Ｉ Ｓ Ｆ Ｋ Ｑ Ｉ Ｙ Ｙ Ｎ Ｖ Ｎ Ｖ Ｎ Ｅ Ｐ Ｔ Ｒ Ｐ Ｓ Ｒ Ｆ Ｆ Ｇ Ｋ Ａ Ｖ Ｔ Ｋ Ｅ Ｑ Ｌ Ｑ Ａ Ｌ Ｇ Ｖ Ｎ Ａ Ｅ Ｎ Ｐ Ｐ Ａ Ｙ Ｉ Ｓ Ｓ Ｖ Ａ Ｙ Ｇ Ｒ Ｑ Ｖ Ｙ Ｌ Ｋ Ｌ Ｓ Ｔ Ｎ Ｓ Ｈ Ｓ Ｔ Ｋ Ｖ Ｋ Ａ Ａ Ｆ Ｄ Ａ Ａ Ｖ Ｓ Ｇ Ｋ Ｓ Ｖ Ｓ Ｇ Ｄ Ｖ Ｅ Ｌ Ｔ Ｎ Ｉ Ｉ Ｋ Ｎ Ｓ Ｓ Ｆ Ｋ Ａ Ｖ Ｉ Ｙ Ｇ Ｇ Ｓ Ａ Ｋ Ｄ Ｅ Ｖ Ｑ Ｉ Ｉ Ｄ Ｇ Ｎ Ｌ Ｇ Ｄ Ｌ Ｒ Ｄ Ｉ Ｌ Ｋ Ｋ Ｇ Ａ Ｔ Ｆ Ｎ Ｒ Ｅ Ｔ Ｐ Ｇ Ｖ Ｐ Ｉ Ａ Ｙ Ｔ Ｔ Ｎ Ｆ Ｌ Ｋ Ｄ Ｎ Ｅ Ｌ Ａ Ｖ Ｉ Ｋ Ｎ Ｎ Ｓ Ｅ Ｙ Ｉ Ｅ Ｔ Ｔ Ｓ Ｋ Ａ Ｙ Ｔ Ｄ Ｇ Ｋ Ｉ Ｎ Ｉ Ｄ Ｈ Ｓ Ｇ Ｇ Ｙ Ｖ Ａ Ｑ Ｆ Ｎ Ｉ Ｓ Ｗ Ｄ Ｅ Ｖ Ｎ Ｙ Ｄ （配列番号４）
この配列に対応する、前駆タンパク質の最初の２５アミノ酸は、シグナル配列であり、細菌から分泌される際にＬＬＯから切り離される。したがって、この実施形態では、完全長の活性ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。別の実施形態においては、ＬＬＯタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＤＱ０５４５８８、ＤＱ０５４５８９、ＡＹ８７８６４９、Ｕ２５４５２、又はＵ２５４５２において示される配列である。別の実施形態においては、ＬＬＯタンパク質は、ＬＬＯタンパク質の変異型である。別の実施形態においては、ＬＬＯタンパク質は、ＬＬＯタンパク質の相同体である。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
別の実施形態においては、「トランケートされたＬＬＯ」又は「ｔＬＬＯ」とは、ＰＥＳＴ様ドメインを含むＬＬＯのフラグメントを指す。別の実施形態においては、この用語は、そのアミノ端末に活性化ドメインを含まず、シスチン４８４を含まないＬＬＯフラグメントを指す。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントはＰＥＳＴ配列から成る。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントはＰＥＳＴ配列を含む。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントは、５２９アミノ酸の完全長のＬＬＯタンパク質の、大体最初の４００〜４４１アミノ酸から成る。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントはＬＬＯタンパク質の非溶血性型である。
本発明の方法及び組成物の別の実施形態においては、本発明の方法及び組成物の核酸配列によりコードされるポリペプチドは、キメラＨｅｒ−２／ｎｅｕ抗原及び追加のポリペプチドを含む、融合タンパク質であり、別の実施形態においては、この融合タンパク質は、とりわけＬＭ非溶血性ＬＬＯタンパク質である（本願の実施例）。
一実施形態においては、ＬＬＯフラグメントは残基１〜２５から成る。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントは残基１〜５０から成る。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントは残基１〜７５から成る。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントは残基１〜１００から成る。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントは残基１〜１２５から成る。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントは残基１〜１５０から成る。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントは残基１１７５から成る。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントは残基１〜２００から成る。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントは残基１〜２２５から成る。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントは残基１〜２５０から成る。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントは残基１〜２７５から成る。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントは残基１〜３００から成る。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントは残基１〜３２５から成る。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントは残基１〜３５０から成る。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントは残基１〜３７５から成る。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントは残基１〜４００から成る。別の実施形態においては、ＬＬＯフラグメントは残基１〜４２５から成る。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
別の実施形態においては、本発明の方法及び組成物の融合タンパク質は、ＬＬＯタンパク質又は他の生物、例えば、原核生物のいずれかからのＰＥＳＴ配列を含む。
別の実施形態においては、ＰＥＳＴ様ＡＡ配列は、配列番号５〜９から選ばれる配列を含む。別の実施形態においては、ＰＥＳＴ様配列は、ＬＭ ＡｃｔＡタンパク質からのＰＥＳＴ様配列である。別の実施形態においては、ＰＥＳＴ様配列は、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号５）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号６）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号７）、又はＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号８）である。別の実施形態においては、ＰＥＳＴ様配列は、ストレプトコッカス属のストレプトリジンＯタンパク質からのものである。別の実施形態においては、ＰＥＳＴ様配列は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅ）ストレプトリジンＯからのものであり、例えば、ＡＡ３５〜５１におけるＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号９）の配列である。別の実施形態においては、ＰＥＳＴ様配列は、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）ストレプトリジンＯからのものであり、例えば、ＡＡ３８〜５４におけるＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号１０）の配列である。別の実施形態においては、ＰＥＳＴ様配列は、原核生物から導出された、別のＰＥＳＴ様ＡＡ配列である。別の実施形態においては、ＰＥＳＴ様配列は当技術分野において周知の任意の他のＰＥＳＴ様配列である。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
一実施形態においては、ＬＭのＰＥＳＴ様配列への抗原の融合は、その抗原の細胞媒介性かつ抗腫瘍免疫を増強した。したがって、抗原の他の原核生物から導出されたＰＥＳＴ様配列への融合も、抗原の免疫原性を増強する。他の原核生物のＰＥＳＴ様配列の特定は、ＬＭについては、例えば、Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ及びＲｏｇｅｒｓ（１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．２１：２６７〜２７１）に記載された方法にしたがって行うことができる。代替的に、他の原核生物からのＰＥＳＴ様ＡＡ配列も、本方法に基づいて特定できる。ＰＥＳＴ様ＡＡ配列が含まれると予期される他の原核生物は、限定はされないが、他のリステリア属である。別の実施形態においては、ＰＥＳＴ様配列は抗原性タンパク質の中に埋め込まれている。したがって、別の実施形態においては、「融合」は、抗原性タンパク質抗原、及び抗原に連結するか、又は抗原中に埋め込まれているかのいずれかであるＰＥＳＴ様アミノ酸配列の両方を指す。
本明細書において提供される別の実施形態は、本発明の組換えポリペプチドを含むワクチンである。本明細書において提供される別の実施形態は、本発明の組換えポリペプチドから成るワクチンである。
本明細書において提供される別の実施形態は、本発明の組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子である。本明細書において提供される別の実施形態はそのヌクレオチド分子を含むワクチンである。
本明細書において提供される別の実施形態は、本発明の組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子である。
本明細書において提供される別の実施形態は、本発明のヌクレオチド分子によりコードされる組換えポリペプチドである。
本明細書において提供される別の実施形態は、本発明のヌクレオチド分子又は組換えポリペプチドを含むワクチンである。
本明細書において提供される別の実施形態は、本発明のヌクレオチド分子又は組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物である。
本明細書において提供される別の実施形態は、本発明のヌクレオチド分子又は組換えポリペプチドを含むベクターである。
本明細書において提供される別の実施形態は、本発明のヌクレオチド分子を含む組換えリステリアである。
本明細書において提供される別の実施形態は、本発明の組換えリステリアを含むワクチンである。
本明細書において提供される別の実施形態は、本発明の組換えリステリアを含む培養物である。
一実施形態においては、本発明の方法に使用されるワクチンは、本明細書に記載される任意の形態の組換えリステリア・モノサイトゲネスを含む。一実施形態においては、本発明の方法に使用されるワクチンは、本明細書に記載される任意の形態の本発明の組換えリステリアから成る。別の実施形態においては、本発明の方法に使用されるワクチンは、本質的に本明細書に記載される任意の形態の本発明の組換えリステリアから成る。一実施形態においては、用語「含む」は、ワクチンへの組換えリステリアの包含と同様に、当技術分野において周知の他のワクチン又は治療薬への包含も指す。別の実施形態においては、用語「本質的に〜から成る」は、その機能性構成要素が組換えリステリア・モノサイトゲネスであるワクチンを指すが、しかしながら、ワクチンの治療効果に直接的には関与しない、ワクチンの他の構成要素が含まれることができ、例えば、組換えリステリアの効果を促進する（例えば、安定化、保持などのための）構成要素を指すことができる。別の実施形態においては、用語「〜から成る」は、リステリア・モノサイトゲネスを含むワクチンを指す。
別の実施形態においては、本発明の方法は、本明細書に記載される任意の形態の、組換えリステリア・モノサイトゲネスを投与するステップを含む。一実施形態においては、本発明の方法は、本明細書に記載される任意の形態の、本発明の組換えリステリアを投与することから成る。別の実施形態においては、本発明の方法は、本明細書に記載される任意の形態の、本発明の組換えリステリアを投与するステップから本質的に成る。一実施形態においては、用語「含む」は、組換えリステリアの投与のステップの方法への包含を指すと同時に、当技術分野において周知の他の方法又は治療への包含も指す。別の実施形態においては用語「本質的に〜から成る」は、その機能的構成要素が組換えリステリア・モノサイトゲネスの投与である方法を指すが、しかしながら、その方法の治療効果には、直接的には関与しない、方法の他のステップが包含することができ、及び、例えば、組換えリステリア・モノサイトゲネスの投与の効果を促進するステップを指すことができる。一実施形態においては、用語「〜から成る」は、追加のステップなしで組換えリステリアを投与する方法を指す。
別の実施形態においては、本発明の方法及び組成物のリステリアは、リステリア・モノサイトゲネスである。別の実施形態においては、リステリアは、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）である。別の実施形態においては、リステリアは、リステリア・ウェルシメリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）である。別の実施形態においては、リステリアは、リステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）である。リステリアのそれぞれの種類は、本発明の別々の実施形態を代表する。
一実施形態においては、本発明の方法及び組成物のリステリア株は、ＡＤＸＳ３１−１６４菌株である。別の実施形態においては、ＡＤＸＳ３１−１６４は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスにおいて、脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌を促進することができる。更に、本明細書により提示されるデータは、ＡＤＸＳ３１−１６４が、標的抗原の異なるドメインに所在するヒト・エピトープに、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的免疫応答を引き起こす能力があることを示した。
別の実施形態においては、本発明は、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質又はそのフラグメントをコードするヌクレオチド分子を含む、組換えリステリアを提供する。
一実施形態においては、本発明は、被験体に、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質又はそのフラグメントに融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントを含む、組換えポリペプチドを投与し、それにより被験体において抗Ｈｅｒ−２免疫応答を誘導することを含む、被験体において抗Ｈｅｒ−２免疫応答を誘導する方法を提供する。
一実施形態においては、本発明の方法及び組成物の融合タンパク質は、ＬＬＯからのＬＬＯシグナル配列を含む。別の実施形態においては、タンパク質の２つの分子（ＬＬＯフラグメント及び抗原）は直接結合している。別の実施形態においては、２つの分子は、１つ又は２つのアミノ酸から成る短いスペーサーペプチドにより結合されている。一実施形態においては、このスペーサーは、タンパク質を結合するか、又は特定の最小距離、若しくはそれらの間の空間的関係を維持する以外には、特異的な生物活性を持たない。別の実施形態においてはスペーサーの構成アミノ酸は、折り畳み、正味の電荷、又は疎水性などの分子の特定の性質に影響を与えるために選択される。別の実施形態においては、タンパク質の２つの分子（ＬＬＯフラグメント及び抗原）は、別々に合成されるか又は融合されない。別の実施形態においては、タンパク質の２つの分子は、同一の核酸から別々に合成される。更に別の実施形態では、これらの２つの分子は、別の核酸から個々に合成される。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
本明細書において提供される別の実施形態は、被験体に、Ｈｅｒ−２キメラタンパク又質はそのフラグメントに融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントを含む、組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与し、それにより被験体において抗Ｈｅｒ−２免疫応答を誘導することを含む、被験体において抗Ｈｅｒ−２免疫応答を誘導する方法である。
本明細書において提供される一実施形態は、被験体中のＨｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍に対する増強された免疫応答を引き起こす方法であり、別の実施形態においてはこの方法は、本願で提供される、組換えリステリアワクチン菌株を含む組成物を被験体に投与することを含む。別の実施形態においては、Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対する免疫応答は、Ｈｅｒ−２タンパク質のサブドミナントエピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態においては、Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対する免疫応答は、Ｈｅｒ−２タンパク質のいくつかのサブドミナントエピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態においては、Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対する免疫応答は、Ｈｅｒ−２タンパク質の少なくとも１〜５個のサブドミナントエピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態においては、Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対する免疫応答は、Ｈｅｒ−２タンパク質の少なくとも１〜１０個のサブドミナントエピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態においては、Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対する免疫応答は、Ｈｅｒ−２タンパク質の少なくとも１〜１７個のサブドミナントエピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態においては、Ｈｅｒ−２発現腫瘍に対する免疫応答は、Ｈｅｒ−２タンパク質の少なくとも１７個のサブドミナントエピトープに対する免疫応答を含む。
これらの腫瘍が、小フラグメントのリステリアに基づくワクチン、又はトラスツズマブ（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の細胞外ドメインに所在するエピトープに対するモノクローナル抗体）により標的とされたときに、発癌遺伝子性タンパク質Ｈｅｒ２／ｎｅｕにおける点突然変異又はアミノ酸欠失が、抵抗性腫瘍細胞の治療を媒介することが報告されている。本明細書に記載されるものは、癌遺伝子のＭＨＣクラスＩエピトープのクラスターを示す、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の２つの細胞外及び１つの細胞内フラグメントを含むキメラＨｅｒ２／ｎｅｕに基づく組成物である。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の３つのＨ２Ｄｑ、及び少なくとも１７個のマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープを内包するこのキメラタンパク質は、最初のリステリア・モノサイトゲネスリステリオリシンＯタンパク質の最初の４４１個のアミノ酸と融合され、及びリステリアの弱毒化された菌株ＬｍｄｄＡにより発現され、分泌される。
Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスが、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の小フラグメントを別々に発現し、分泌するリステリアに基づくワクチン（そのそれぞれが、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ癌遺伝子のただ１つのＨ２Ｄｑエピトープを内包した）により免疫された場合、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ過剰発現腫瘍は、免疫療法中に、それぞれのワクチンにより標的となる、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原のエピトープにおける変異により逃避することが可能であることが、以前の報告により示されている（Ｓｉｎｇｈ Ｒ，Ｐａｔｅｒｓｏｎ Ｙ．Ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ ｓｃｕｌｐｔｓ ｔｕｍｏｒ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００７；６７：１８８７〜９２を参照されたい）。本願で実証されるものは、予期されなかった結果であり、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の３つ以上のエピトープが、キメラワクチンに組み込まれたときに、これらの腫瘍のエスケープ変異による選択及び逃避を除去できることである。新規Ｈｅｒ２／ｎｅｕキメラリステリアワクチンによる免疫付与は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原中での点突然変異又はアミノ酸欠失に関連するエスケープ変異を全くもたらさなかった（本願の実施例４を参照されたい）。
本明細書において提供される一実施形態は、リステリアワクチン菌株がＨｅｒ−２キメラタンパク質、又はキメラタンパク質を発現する組換えポリペプチドを発現するように操作する方法であり、この方法は、核酸分子によりリステリア株を形質転換することを含む。別の実施形態においては、この核酸分子は、ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを含み、このポリペプチドは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含む。別の実施形態においては、この核酸分子は、代謝酵素をコードする第二のオープンリーディングフレームを更に含み、及び代謝酵素は、組換えリステリア株染色体に欠失する内在性遺伝子を補完し、それによりリステリアワクチン菌株がＨｅｒ−２キメラタンパク質を発現するように操作する。
一実施形態においては、本明細書において提供される方法及び組成物はアジュバントを更に含み、別の実施形態においては、このアジュバントは、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、又はメチル化されていないＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドを含む。
一実施形態においては、ＬＭ ｄｅｌｔａ−ａｃｔＡ変異体（Ｂｒｕｎｄａｇｅら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：１１８９０〜１１８９４）、リステリア・モノサイトゲネスｄｅｌｔａ−ｐｌｃＡ（Ｃａｍｉｌｌｉら，１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３：７５１〜７５４）、又はｄｅｌｔａ−ＡｃｔＡ、ｄｅｌｔａＩＮＬ−ｂ（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔら，２００４，ＰＮＡＳ，１０１：１３８３２〜１３８３７）などの弱毒化されたリステリア株が本発明において用いられた。別の実施形態においては、本願の開示に接した場合に当業者に明らかなように、弱毒化されたリステリア株は、１つ以上の弱毒化変異を誘導することにより構築された。そのような菌株の例としては、限定はされないが、芳香族アミノ酸に対する栄養要求性があるリステリア株（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９９３，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０６１：２２４５〜２２４８）、リポテイコ酸産生型変異体（Ａｂａｃｈｉｎら，２００２，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１〜１４）及び病原性遺伝子の欠失により弱毒化されたそれらのものが挙げられる（本願中の実施例を参照されたい）。
別の実施形態においては、本発明の方法及び組成物の核酸分子は、操作可能にプロモーター／調節配列に連結される。別の実施形態においては、本発明の方法及び組成物の第一のオープンリーディングフレームは、操作可能にプロモーター／調節配列に連結される。別の実施形態においては、本発明の方法及び組成物の第二のオープンリーディングフレームは、操作可能にプロモーター／調節配列に連結される。別の実施形態においては、オープンリーディングフレームのそれぞれは、操作可能にプロモーター／調節配列に連結される。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
本開示及び本明細書に提供される方法に接した場合に、当業者は直ちに、異なる転写プロモーター、ターミネーター、キャリアーベクター、又は特異的遺伝子配列（例えば、市販品として入手可能なクローニングベクター中にあるもの）が、本発明の方法及び組成物において成功裏に使用可能であることを理解するであろう。本発明において熟考されるように、これらの機能性は、例えば、ｐＵＣシリーズとして知られる市販品として入手可能なベクターにおいて提供される。別の実施形態においては、非必須ＤＮＡ配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）が除去される。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。別の実施形態においては、本発明では、市販品として入手可能なプラスミドが用いられる。そのようなプラスミドは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州ラホヤ），Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラホヤ），Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州パロアルト）などの様々な入手源から入手できるか、又は当技術分野において周知の方法を用いて構築することができる。
別の実施形態は、ｐＣＲ２．１などのプラスミドであり（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州ラホヤ）、これは原核生物起源の複製、及び原核生物における発現を促進するためのプロモーター／調節要素を持つ原核生物の発現ベクターである。別の実施形態においては、外来ヌクレオチド配列が、プラスミドのサイズを減少させるために除去され、及びそこに配置され得るカセットのサイズが増大される。
そのような方法は、当技術分野において周知であり、及び、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、及びＡｕｓｕｂｅｉら，（１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されている。
抗生物質耐性遺伝子は、通常、分子生物学及びワクチンの調製に用いられる、従来の選別及びクローニングのプロセスにおいて用いられている。本発明において考慮される抗生物質耐性遺伝子としては、限定はされないが、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ゲンタマイシン及び当技術分野において周知の他のものに対する抵抗性を与える遺伝子生成物が挙げられる。それぞれの遺伝子は、本発明の個別の実施形態を代表する。
細菌の形質転換のための方法は、当技術分野において周知であり、及び塩化カルシウムコンピテント細胞に基づく方法、電子穿孔法、バクテリオファージ媒介形質導入法、化学的、及び物理的形質転換技法（ｄｅ Ｂｏｅｒら，１９８９，Ｃｅｌｌ ５６：６４１〜６４９；Ｍｉｌｌｅｒら，１９９５，ＦＡＳＥＢＪ．，９：１９０〜１９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｉら．，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｇｅｒｈａｒｄｔらにより編集，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２，Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ.Ｙ．）などが挙げられる。別の実施形態においては、本発明リステリアワクチン菌株は、エレクトロポレーションにより形質転換される。それぞれの方法は本発明の別個の実施形態を代表する。
別の実施形態においては、接合が、遺伝子性物質及び／又はプラスミドを細菌に導入するために用いられる。接合のための方法は、当技術分野において周知であり、及び、例えば、Ｎｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃ Ｊら，（Ａ ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｎｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｈｕｔｔｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｉｓ ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ ｂｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．（一般的に接合により移動可能な、第二世代のｓｎｐ−導出大腸菌−ストレプトミセスシャトル発現ベクター）Ｐｌａｓｍｉｄ．２００６ Ｎｏｖ；５６（３）：２２３〜７）、及びＡｕｃｈｔｕｎｇ ＪＭら，（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｍｏｂｉｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｙ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｌｏｂａｌ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．（細胞内シグナリング及びグローバルＤＮＡ損傷応答による枯草菌の可動遺伝的要素の調整）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００５ Ａｕｇ ３０；１０２（３５）：１２５５４〜９）に記載されている。それぞれの方法は本発明の別個の実施形態を代表する。
一実施形態においては、「形質転換する」は、一実施形態においては、用語「核酸を導入する」と同義に用いられ、細菌細胞がプラスミド又は他の異種ＤＮＡ分子を取り込むために操作することを指す。別の実施形態においては、「形質転換する」は、細菌細胞がプラスミド又は他の異種ＤＮＡ分子の遺伝子を発現するために操作することを指す。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
本発明において有用であるプラスミド及び他の発現ベクターは、本願の他の部分において記載され、及びプロモーター／調節配列、グラム陰性及びグラム陽性細菌の複製起点、融合タンパク質をコードする単離された核酸、及びアミノ酸代謝遺伝子をコードする単離された核酸などの特性を包含できる。更に、融合タンパク質及びアミノ酸代謝遺伝子をコードする単離された核酸は、そのような単離された核酸の発現を駆動するために適するプロモーターを有する。細菌のシステムにおいて発現を駆動するために有用であるプロモーターは、当技術分野において周知であり、バクテリオファージλ、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、及びｐＢＲ３２５のクロラムフェニコールアセチル転移酵素遺伝子のＣＡＴプロモーターが含まれる。原核生物のプロモーターの更なる例としては、５バクテリオファージλの主要な左右のプロモーター（ＰＬ及びＰＲ）、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｄ、及び大腸菌のｇａｌプロモーター、α−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎら，１９８５．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｄ．１６２：１７６〜１８２）及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＳ２８−特異的プロモーター（Ｏｉｌｍａｎら，１９８４ Ｇｅｎｅ ３２：１１〜２０）、枯草菌ファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のプロモーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，１９８２，Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、及びストレプトミセス・プロモーター（Ｗａｒｄら，１９８６，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８〜４７８）が挙げられる。本発明において考慮される、追加の原核生物のプロモーターは、例えば、Ｇｌｉｃｋ（１９８７，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７〜２８２）；Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ，（１９８６、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，６８：５０５〜５１６）；及びＧｏｔｔｅｓｍａｎ，（１９８４，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５〜４４２）において総説されている。本発明において考慮されるプロモーター／調節要素の更なる例としては、限定はされないが、リステリアｐｒｆＡプロモーター、リステリアｈｌｙプロモーター、リステリアｐ６０プロモーター及びリステリアＡｃｔＡプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＣ＿００３２１０）又はそれらのフラグメントが挙げられる。
別の実施形態においては、本発明の方法及び組成物のプラスミドは、融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。別の実施形態においては、部分配列がクローニングされ及びこの適切な部分配列が、適切な制限酵素を用いて開裂される。このフラグメントは、次いで、別の実施形態においては、所望のＤＮＡ配列を生成するために結合される。別の実施形態においては、抗原をコードするＤＮＡは、ＤＮＡ増幅方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて産生される。まず、天然ＤＮＡのセグメントの新しい末端の両側が、別々に増幅される。一方の増幅された配列の５’末端は、ペプチドリンカーをコードし、他方の増幅された配列の３’末端もペプチドリンカーをコードする。第一のフラグメントの５’末端は、第二のフラグメントの３’末端に相補的であるため、これら２つのフラグメントは（例えば、ＬＭＰアガロースでの部分的な精製後に）第三のＰＣＲ反応において、重なり合うテンプレートとして使用できる。これらの増幅された配列はコドン、オープニング部位のカルボキシ側のセグメント（ここで、アミノ配列が形成される）、リンカー、及びオープニング部位のアミノ側の配列（ここで、カルボキシル配列が形成される）を含む。抗原は、プラスミドに連結される。それぞれの方法は本発明の別個の実施形態を代表する。
別の実施形態においては、本発明は、臨床的適用のための、ファージに基づく染色体組込みシステムを更に含む。限定はされないが、Ｄ−アラニンラセマーゼを含む必須酵素に対して、栄養要求性である宿主の菌株、例えばＬｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）が用いられる。別の実施形態においては、“ファージのキュアリング・ステップ”を回避するために、ＰＳＡに基づくファージ組込みシステムが用いられる（Ｌａｕｅｒら．，２００２ Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８４：４１７７〜４１８６）。これは、別の実施形態においては、組み込まれた遺伝子を維持するために抗生物質による継続的な選別を必要とする。したがって、別の実施形態においては、本発明は、抗生物質による選別を必要としない、ファージに基づく染色体の組込みシステムを可能にする。その代わり、栄養要求性宿主の菌株が補完される。
別の実施形態においては、本発明の組換えタンパク質は、組換えＤＮＡの手法を用いて合成される。これは、一実施形態においては、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を作製すること、特定のプロモーター／調節要素の制御下に、本発明のプラスミドなどの発現カセット中にこのＤＮＡを配置すること、及びタンパク質を発現することを含む。別の実施形態においては、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、非溶血性ＬＬＯ／抗原）が、例えば、クローニング及び適切な配列の制限、又はＮａｒａｎｇら（１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０〜９９）のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら（１９７９．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９〜１５１）のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１５１８５９〜１８６２）のジエチルホスホロアミダイト法；及び米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法などの直接的な化学合成法を含む、任意の適切な方法により調製される。
別の実施形態においては、一本鎖オリゴヌクレオチドの作製に化学合成が用いられる。一本鎖オリゴヌクレオチドは、様々な実施形態において、相補的配列とのハイブリダイゼーションによるか、又は一本鎖をテンプレートとして用いる、ＤＮＡポリメラーゼによる重合により二本鎖ＤＮＡに変換される。ＤＮＡの化学合成は約１００塩基の配列に制限される一方、より長い配列は、より短い配列の連結により得られることを当業者は理解するであろう。別の実施形態においては、部分配列がクローニングされ、及び適切な部分配列が適切な制限酵素を用いて切り出される。次に、このフラグメントは、所望のＤＮＡ配列を作製するために連結される。
別の実施形態においては、融合タンパク質、又は本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅方法を用いてクローニングされる。したがって、非溶血性ＬＬＯに対する遺伝子が、適切な制限部位を含むセンス・プライマー及び別の制限部位、例えば、クローニングを促進するための非同一制限部位を含むアンチセンス・プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅される。抗原をコードする単離された核酸に対しても同じことが繰り返される。非溶血性ＬＬＯと抗原配列の連結、及びプラスミド又はベクターへの挿入は、抗原末端に結合した非溶血性ＬＬＯをコードするベクターを生成する。２つの分子は、直接か、又は制限部位から導入される短いスペーサーを介するかの、いずれかにより結合される。
別の実施形態においては、分子は、１つ以上のアミノ酸から成るペプチドスペーサーにより分離され、一般的には、このスペーサーは、タンパク質を結合するか、又は特定の最小距離若しくはそれらの間の空間的関係を維持する以外には、特異的な生物活性を持たない。別の実施形態においては、スペーサーの構成アミノ酸は、折り畳み、正味の電荷、又は疎水性などの分子の特定の性質に影響を与えるために選択される。別の実施形態においては、融合又は組換えタンパク質をコードする核酸配列は、大腸菌、リステリア、酵母などの他の細菌性宿主、及びＣＯＳ、ＣＨＯ及びＨｅＬａ細胞株及び骨髄腫細胞株などの、より高度な真核細胞を含む、さまざまな宿主細胞に形質転換される。組換え融合タンパク質遺伝子は、操作可能に各宿主に対する適切な発現制御配列と連結される。プロモーター／調節配列は本願の他の部分で詳細に記載される。別の実施形態においては、プラスミドは、追加のプロモーター調節要素と同時に、リボソーム結合部位、及び転写終結シグナルを更に含む。真核細胞については、制御配列は、プロモーター、及び、例えば、イムノグロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスなどから導出されたエンハンサー、並びにポリアデニル化配列を含む。別の実施形態においては、この配列は、スプライスドナー配列及びアクセプター配列を含む。
一実施形態においては、用語「操作可能に連結される」は、そのように記述された構成要素が、それらの意図された様式で機能することを許容する関係にある、並置を指す。コーディング配列に「操作可能に連結された」制御配列は、コーディング配列の発現が、制御配列と対応する条件下に達成されるような方式で連結されることである。
別の実施形態においては、プラスミドを含む栄養要求性細菌を選別するために、形質転換された栄養要求性細菌が、アミノ酸代謝遺伝子の発現を選択する培地で生育される。別の実施形態においては、Ｄ−グルタミン酸合成に対して栄養要求性である細菌が、Ｄ−グルタミン酸合成遺伝子を含むプラスミドにより形質転換され、及びこの栄養要求性細菌が、Ｄ−グルタミン酸を欠いた培地で培養され、プラスミドにより形質転換されていない栄養要求性細菌、又はＤ−グルタミン酸合成のタンパク質をコードするプラスミドを発現しない細菌は生育しない。別の実施形態においては、本発明のプラスミドにより形質転換され、発現しているＤ−アラニン合成に対して栄養要求性である細菌は、プラスミドがＤ−アラニンに対するアミノ酸代謝酵素をコードする単離された核酸を含む場合には、Ｄ−アラニンの欠乏下でも生育する。必要な増殖因子、補助栄養、アミノ酸、ビタミン、抗生物質などを、含むか、又は欠失する適切な培地を作製する方法は、当技術分野において周知であり、及び市販品として入手可能である（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリン・レイクス）。それぞれの方法は本発明の別個の実施形態を代表する。
別の実施形態においては、本発明のプラスミドを含む栄養要求性細菌が適切な培地でいったん選別されると、この細菌は、選択圧の存在下で繁殖させられる。そのような繁殖は、栄養要求性因子なしで、細菌を培地で生育させることを含む。栄養要求性細菌中のアミノ酸代謝酵素を発現するプラスミドの存在は、細菌とともにプラスミドが複製することを保証し、したがってプラスミドを内包する細菌を継続的に選別する。本願の開示及び方法に接したときに、当業者はプラスミドを含む栄養要求性細菌が生育している培地の量を調整することにより、容易にリステリアワクチンベクターの生産を拡大することができる。
当業者は、別の実施形態においては、他の栄養要求性菌株、及び相補システムが本発明での使用に対して採用されることを理解するであろう。
本明細書において提供される一実施形態は、被験体中のＨｅｒ−２発現腫瘍の増殖を遅らせる方法であり、この場合及び別の実施形態においても、この方法は、被験体に、本明細書に記載される組換えリステリアワクチン菌株を含む組成物を投与するステップを含む。
本明細書において提供される別の実施形態は、被験体中のＨｅｒ−２発現腫瘍の増殖を遅らせる方法であり、この場合及び別の実施形態においても、この方法は、被験体に、本明細書に記載される組換えリステリアワクチン菌株を含む組成物を投与するステップを含む。
本明細書において提供される別の実施形態は、被験体中のＨｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍に対して増強された免疫応答を引き起こす方法であり、この場合及び別の実施形態においても、この方法は、被験体に、本明細書に記載される組換えリステリアワクチン菌株を含む組成物を投与するステップを含む。更に別の実施形態では、このＨｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍に対する免疫応答は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の少なくとも１つのサブドミナントエピトープに対する免疫応答を含む。
本明細書において提供される一実施形態は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ過剰発現腫瘍の治療におけるエスケープ変異を防止する方法であり、この場合及び別の実施形態においても、この方法は、被験体に、本明細書に記載される組換えリステリアワクチン菌株を含む組成物を投与するステップを含む。
本明細書において提供される別の実施形態は、被験体中のＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原発現腫瘍の侵襲を防止する方法であり、この場合及び別の実施形態においても、この方法は、被験体に、本明細書に記載される組換えリステリアワクチン菌株を含む組成物を投与するステップを含む。
本明細書において提供される一実施形態は、腫瘍内の制御性Ｔ細胞の頻度を減少させる方法であり、この場合及び別の実施形態においても、この方法は、被験体に、本明細書に記載される組換えリステリアワクチン菌株を含む組成物を投与するステップを含む。
本明細書において提供される別の実施形態は、腫瘍内の制御性Ｔ細胞の頻度を減少させる方法であり、この場合及び別の実施形態においても、この方法は、被験体に、本明細書に記載される組換えリステリアワクチン菌株を含む組成物を投与するステップを含む。
本明細書において提供される一実施形態は、腫瘍内の骨髄性抑制細胞を減少させる方法であり、この場合及び別の実施形態においても、この方法は、被験体に、本明細書に記載される組換えリステリアワクチン菌株を含む組成物を投与するステップを含む。
本明細書において提供される別の実施形態は、骨髄性抑制細胞を減少させる方法であり、この場合及び別の実施形態においても、この方法は、被験体に、本明細書に記載される組換えリステリアワクチン菌株を含む組成物を投与するステップを含む。
本明細書において提供される一実施形態は、被験体中のＨｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍の形成を防止する方法であり、この場合及び別の実施形態においても、この方法は、被験体に、本明細書に記載される組換えリステリアワクチン菌株を含む組成物を投与するステップを含む。
本明細書において提供される別の実施形態は、被験体中のＨｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍の形成を防止する方法であり、この場合及び別の実施形態においても、この方法は、被験体に、本明細書に記載される組換えリステリアワクチン菌株を含む組成物を投与するステップを含む。
本明細書において提供される一実施形態は、被験体中のＨｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍を治療する方法であり、この場合及び別の実施形態においても、この方法は、被験体に、本明細書に記載される組換えリステリアワクチン菌株を含む組成物を投与するステップを含む。
本明細書において提供される一実施形態は、本発明の組成物を投与する方法である。本明細書において提供される別の実施形態は、本発明のワクチンを投与する方法である。本明細書において提供される別の実施形態は、本発明の組換えポリペプチド又は組換えヌクレオチドを投与する方法である。別の実施形態においては、本発明の組成物、ワクチン、組換えポリペプチド又は組換えヌクレオチドを投与するステップは、組成物、ワクチン、組換えヌクレオチド、又は発現している組換えポリペプチドを含む、弱毒化された組換えリステリアにより遂行される。別の実施形態においては、投与は、異なる弱毒化された細菌性ベクターにより遂行される。別の実施形態においては、投与は、ＤＮＡワクチン（例えば、ネイキッドＤＮＡワクチン）により遂行される。別の実施形態においては、本発明の組換えポリペプチドの投与は、組換え的にタンパク質を生産し、次いでこの組換えタンパク質を被験体に投与することにより遂行される。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
別の実施形態においては、本発明の方法及び組成物により引き起こされる免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に媒介される応答を含む。別の実施形態においては、この免疫応答は、主としてＣＤ８＋Ｔ細胞に媒介される応答から成る。別の実施形態では、唯一検出される免疫応答の構成要素は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に媒介される応答である。
別の実施形態においては、本発明の方法及び組成物により引き起こされる免疫応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に媒介される応答を含む。別の実施形態においては、この免疫応答は、主としてＣＤ４＋Ｔ細胞に媒介される応答から成る。別の実施形態では、唯一検出される免疫応答の構成要素は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に媒介される応答である。別の実施形態においては、ＣＤ４＋Ｔ細胞に媒介される応答は、抗原に対する測定可能な抗体応答に付随する。別の実施形態においては、ＣＤ４＋Ｔ細胞に媒介される応答は、抗原に対する測定可能な抗体応答に付随しない。
別の実施形態においては、本発明は、被験体において、ＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介される、抗原のサブドミナントなＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対する応答を誘導する方法を提供し、この方法は、（ａ）Ｈｅｒ２−ｎｅｕキメラ抗原又はそのフラグメントをコードするヌクレオチド分子を、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントをコードするヌクレオチド分子に融合し、それによりＬＬＯ−抗原融合タンパク質をコードする組換えヌクレオチドを生成するステップ；及び（ｂ）この組換えヌクレオチド又はＬＬＯ−抗原融合物を被験体に投与し、それにより抗原のサブドミナントなＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介される免疫応答を誘導するステップを含む。
本明細書において提供される一実施形態は、腫瘍内のＣＤ８＋／制御性Ｔ細胞の比率を増加させる方法であり、この場合及び別の実施形態においては、この方法は、本発明の組換えポリペプチド、組換えリステリア、又は組換えベクター組成物を被験体に投与するステップを含む。
本明細書において提供される別の実施形態は、腫瘍内のＣＤ８＋／制御性Ｔ細胞の比率を増加させる方法であり、この場合及び別の実施形態においては、この方法は、本発明の組換えポリペプチド、組換えリステリア、又は組換えベクター組成物を被験体に投与するステップを含む。
別の実施形態においては、本明細書において提供される方法及び組成物により引き起こされる免疫応答は、抗原の少なくとも１つのサブドミナントエピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態においては、この免疫応答は、少なくとも１つのドミナントエピトープに対する免疫応答を含む。別の実施形態においては、この免疫応答は、主に少なくとも１つのサブドミナントエピトープに対する免疫応答から成る。別の実施形態においては、免疫応答の唯一の検出可能な構成要素は、少なくとも１つのサブドミナントエピトープに対する免疫応答である。免疫応答のそれぞれの種類が別個の本発明の実施形態を代表する。
免疫応答を測定する方法は、当技術分野において周知であり、例えば、腫瘍増殖の抑制の測定、フローサイトメトリー、標的細胞溶解測定法（例えば、クロム放出測定法）、テトラマーの使用などを含む。それぞれの方法は本発明の別個の実施形態を代表する。
別の実施形態においては、本発明は被験体中のＨｅｒ−２発現腫瘍の増殖を遅らせる方法を提供し、この場合及び別の実施形態においても、この方法は、被験体に、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質に融合したＩＬＯタンパク質のＮ末端フラグメント又はそのフラグメント、あるいはその組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを投与するステップを含み、被験体はＨｅｒ−２発現腫瘍に対する免疫応答を上昇させ、それにより被験体中のＨｅｒ−２発現腫瘍増殖を遅らせる。
別の実施形態においては、本発明は、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質の抗原性を改善する方法を提供し、この場合及び別の実施形態においても、この方法は、組換えヌクレオチドを作製するために、ＬＬＯタンパク質Ｎ末端フラグメントをコードするヌクレオチドを、Ｈｅｒ−２タンパク質又はそのフラグメントをコードするヌクレオチドに融合し、それによりＨｅｒ−２キメラタンパク質の抗原性を改良することを含む。
本明細書において提供される別の実施形態はＨｅｒ−２キメラタンパク質の抗原性を改善する方法であり、この場合及び別の実施形態においても、この方法は、組換えヌクレオチドを発現させるために、リステリア株を操作することを含む。別の実施形態においては、異なる細菌性ベクターが、組換えヌクレオチドを発現させるために用いられる。別の実施形態においては、細菌性ベクターは弱毒化される。別の実施形態においては、ＤＮＡワクチン（例えば、ネイキッドＤＮＡワクチン）が組換えヌクレオチドを発現するために用いられる。別の実施形態においては、ヌクレオチドによりコードされるＬＬＯ−Ｈｅｒ−２キメラ融合ペプチドの投与は、組換え的にタンパク質を生産し、次いでこの組換えタンパク質を被験体に投与することにより遂行される。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
一実施形態においては、本発明は、腫瘍の「エピトープ拡散」のための方法を提供する。別の実施形態においては、本明細書において提供される組成物及び方法を用いる免疫付与は、本発明のワクチン中に担持される抗原以外に、抗原を有する他の腫瘍へのエピトープ拡散を誘導する。
別の実施形態においては、ドミナントエピトープ又はサブドミナントエピトープは、治療される被験体において、それぞれドミナントであるか、又はサブドミナントである。別の実施形態においては、ドミナントエピトープ又はサブドミナントエピトープは、治療される集団において、それぞれドミナントであるか、又はサブドミナントである。
本明細書において提供される一実施形態は、被験体中の癌又は腫瘍の増殖を、エピトープ拡散により、治療、抑制、又は阻害する方法であり、この場合及び別の実施形態でも、この癌は、本発明の組成物に含まれる抗原又はそのフラグメントの発現に関連する。別の実施形態においては、この方法は、本発明の組換えポリペプチド、組換えリステリア、又は組換えベクターを含む組成物を、被験体に投与することを含む。更に別の実施形態では、被験体は、抗原発現癌又は抗原発現腫瘍に対する免疫応答を上昇させ、それにより被験体中の癌又は腫瘍の増殖を、治療、抑制、又は阻害する。
「ドミナントなＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ」は、一実施形態においては、ワクチン接種、感染、又はタンパク質又はタンパク質を含む病原体若しくは癌細胞による悪性増殖により引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち３０％を超えるものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、それによって引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち３５％を超えるものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち４０％を超えるものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち４５％を超えるものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち５０％を超えるものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち５５％を超えるものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち６０％を超えるものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち６５％を超えるものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち７０％を超えるものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち７５％を超えるものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち８０％を超えるものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち８５％を超えるものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち９０％を超えるものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち９５％を超えるものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち９６％を超えるものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち９７％を超えるものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち９８％を超えるものにより認識されるエピトープを指す。
「サブドミナントなＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ」は、一実施形態においては、ワクチン接種、感染、又はタンパク質又はタンパク質を含む病原体若しくは癌細胞による悪性増殖により引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち３０％未満のものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、それによって引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち２８％未満のものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、それによって引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち２６％を上回るものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、それによって引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち２４％未満のものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、それによって引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち２２％を上回るものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、それによって引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち２０％未満のものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、それによって引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち１８％を上回るものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、それによって引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち１６％未満のものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、それによって引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち１４％を上回るものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、それによって引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち１２％を上回るものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、それによって引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち１０％未満のものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、それによって引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち８％を上回るものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、それによって引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち６％未満のものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、それによって引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち５％未満のものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、それによって引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち４％を上回るものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、それによって引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち３％未満のものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、それによって引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち２％未満のものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、それによって引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち１％未満のものにより認識されるエピトープを指す。別の実施形態においては、この用語は、それによって引き起こされる抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち０．５％未満のものにより認識されるエピトープを指す。
ドミナントエピトープ及びサブドミナントエピトープのそれぞれの種類が、別個の本発明の実施形態を代表する。
本発明の方法及び組成物中の抗原は、一実施形態においては、被験体の非腫瘍細胞中でも、検出可能なレベルで発現される。別の実施形態においては、この抗原は、被験体の非腫瘍細胞の少なくとも特定のパーセンテージ（例えば、０．０１％、０．０３％、０．１％、０．３％、１％、２％、３％、又は５％）において、検出可能なレベルで発現される。一実施形態においては、「非腫瘍細胞」は、腫瘍本体の外部にある細胞を指す。別の実施形態においては、「非腫瘍細胞」は、悪性ではない細胞を指す。別の実施形態においては、「非腫瘍細胞」は、形質転換されていない細胞を指す。別の実施形態においては、「非腫瘍細胞」は、体細胞である。別の実施形態においては、非腫瘍細胞は、生殖細胞である。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
「検出可能なレベル」は、一実施形態においては、標準アッセイにより検出可能なレベルを指す。一実施形態においては、このアッセイは免疫アッセイである。一実施形態においては、このアッセイは酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）である。別の実施形態においては、このアッセイはウエスタンブロット法である。別の実施形態においては、このアッセイはＦＡＣＳである。本明細書において提供される方法に、当技術分野で利用可能な他の方法が使用できることは当業者には理解される。別の実施形態においては、検出可能なレベルは、実用的なアッセイのバックグラウンドに対して決定される。これらの技法を遂行する方法は、当業者には周知であり、及びそれぞれの技法が別個の本発明の実施形態を代表する。
一実施形態においては、組換え抗原発現ＬＭのワクチン接種は、エピトープ拡散を誘導する。別の実施形態においては、ＬＬＯ−抗原融合物によるワクチン接種は、Ｈｅｒ２のコンテクスト外であっても、同様にエピトープ拡散を誘導する。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
別の実施形態においては、本発明は、Ｈｅｒ−２キメラ抗原に融合したＬＬＯタンパク質Ｎ末端フラグメントを含む組換えポリペプチドを被験体に投与することを含む、被験体中のＨｅｒ−２発現腫瘍の増殖を遅らせる方法を提供し、この抗原は、１つ以上のサブドミナントなＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有し、この被験体は抗原発現腫瘍に対する免疫応答を上昇させ、それにより被験体中のＨｅｒ−２発現腫瘍の増殖を遅らせる。別の実施形態においては、この抗原は、ドミナントなＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを全く含まない。本明細書において提供される別の実施形態は、本明細書において提供される組換えポリペプチドをコードする、組換えヌクレオチドを含む組換えリステリアを被験体に投与することを含む、被験体中のＨｅｒ−２発現腫瘍の増殖を遅らせる方法である。
別の実施形態においては、本発明は、宿主に本発明の組成物を投与し、それにより癌を持つ宿主の中で細胞傷害性Ｔ細胞の形成を誘導することを含む、癌を持つ宿主の中で細胞傷害性Ｔ細胞の形成を誘導する方法を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、本発明の組成物を投与することを含む、癌の発生率を低減させる方法を提供する。別の実施形態においては、本発明は、本発明の組成物を投与することを含む、癌を改善する方法を提供する。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
一実施形態においては、組成物は被験体の細胞にエクスビボで投与される。別の実施形態においては、組成物は、ドナーの細胞にエクスビボで投与される。別の実施形態においては、組成物はドナーの細胞にインビボで投与され、次いで被験体に移転される。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
一実施形態においては、本発明の方法により治療される癌は乳癌である。別の実施形態においては、この癌は、Ｈｅｒ２を含む癌である。別の実施形態においては、この癌は黒色腫である。別の実施形態においては、この癌は膵臓癌である。別の実施形態においては、この癌は卵巣癌である。別の実施形態においては、この癌は胃癌である。別の実施形態においては、この癌は膵臓の癌病巣である。別の実施形態においては、この癌は、肺腺癌である。別の実施形態においては、この癌は、結腸直腸腺癌である。別の実施形態においては、この癌は肺扁平上皮腺癌である。別の実施形態においては、この癌は、胃腺癌である。別の実施形態においては、この癌は、卵巣表面上皮腫瘍（例えば、良性、増殖性、又はその悪性型）である。別の実施形態においては、この癌は、口腔扁平細胞癌である。別の実施形態においては、この癌は、非小細胞肺癌である。別の実施形態においては、この癌は、ＣＮＳ癌である。別の実施形態においては、この癌は、子宮内膜癌である。別の実施形態においては、この癌は、膀胱癌である。別の実施形態においては、この癌は、頭頸部癌である。別の実施形態においては、この癌は、前立腺癌である。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
本発明の方法の別の実施形態においては、被験体が抗原発現腫瘍又は抗原への免疫応答を上昇させ、それにより抗腫瘍効果を媒介する。
別の実施形態においては、本発明は、癌治療のための免疫原性組成物を提供し、この組成物はトランケートされたＬＬＯのＨｅｒ−２キメラタンパク質への融合物を含む。別の実施形態においては、この免疫原性組成物は、融合物を発現するリステリア株を更に含む。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。別の実施形態は、本発明は、癌を治療するための免疫原性組成物を提供するもので、該組成物は、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質を発現するリステリア株を含む。
一実施形態においては、本発明の治療プロトコールは治療的である。別の実施形態においては、このプロトコールは予防的である。別の実施形態においては、本発明のワクチンは、当業者には明らかなように、病気に罹患させやすくする家族性遺伝又は他の状況のために、乳癌又は他の種類のＨｅｒ２を含む腫瘍などの癌のリスクに晒される人々を守るために用いられる。別の実施形態においては、このワクチンは腫瘍の増殖を外科手術、従来の化学療法、又は放射線治療により減量した後の、癌の免疫療法として用いられる。そのような治療に続いて、本発明のワクチンは、ワクチンの腫瘍抗原に対するＣＴＬの応答が、残存する転移を破壊し、及び癌からの寛解がより長くなるように投与される。別の実施形態においては、本発明のワクチンは、既に確立した腫瘍の増殖に影響を与え、及び存在する腫瘍細胞を殺すために用いられる。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
別の実施形態においては、上述の任意の方法において用いられる、ワクチン及び免疫原性組成物は、本発明のワクチン及び免疫原性組成物の任意の特性を有する。それぞれの特性は、本発明の個別の実施形態を表している。
用量域のさまざまな実施形態が、本発明により予期される。一実施形態においては、ワクチンベクターの場合には、この用量は０．４ＬＤ５０／投与である。別の実施形態においては、この用量は約０．４〜４．９ＬＤ５０／投与である。別の実施形態においては、この用量は約０．５〜０．５９ＬＤ５０／投与である。別の実施形態においては、この用量は約０．６〜０．６９ＬＤ５０／投与である。別の実施形態においては、この用量は約０．７〜０．７９ＬＤ５０／投与である。別の実施形態においては、この用量は約０．８ＬＤ５０／投与である。別の実施形態においては、この用量は０．４ＬＤ５０／投与〜０．８ＬＤ５０／投与である。
別の実施形態においては、この用量は１０７細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は１．５ｘ１０７細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は２ｘ１０７細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は３ｘ１０７細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は４ｘ１０７細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は６ｘ１０７細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は８ｘ１０７細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は１ｘ１０８細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は１．５ｘ１０８細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は２ｘ１０８細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は３ｘ１０８細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は４ｘ１０８細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は６ｘ１０８細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は８ｘ１０８細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は１ｘ１０９細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は１．５ｘ１０９細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は２ｘ１０９細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は３ｘ１０９細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は５ｘ１０９細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は６ｘ１０９細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は８ｘ１０９細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は１ｘ１０１０細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は１．５ｘ１０１０細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は２ｘ１０１０細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は３ｘ１０１０細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は５ｘ１０１０細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は６ｘ１０１０細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は８ｘ１０１０細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は８ｘ１０９細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は１ｘ１０１１細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は１．５ｘ１０１１細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は２ｘ１０１１細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は３ｘ１０１１細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は５ｘ１０１１細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は６ｘ１０１１細菌／投与である。別の実施形態においては、この用量は８ｘ１０１１細菌／投与である。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
一実施形態においては、本発明のワクチン又は免疫原性組成物は、単独で被験体に投与される。別の実施形態においては、このワクチン又は免疫原性組成物は、他の癌の治療剤とともに投与される。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
本発明の方法及び組成物の組換えリステリアは、一実施形態においては、Ｈｅｒ−２キメラ抗原又はＬＬＯ−Ｈｅｒ−２キメラ抗原融合物をコードする構築物により、安定に形質導入される。一実施形態においては、この構築物は、更なるサブクローニングを促進するために、ポリリンカーを含む。組換えリステリアを作製するためのいくつかの技法が周知である。
一実施形態においては、構築物又は核酸分子は、相同的組換えを用いて、リステリアの染色体中に組み込まれる。相同的組換えのための技法は、当技術分野において周知であり、及び、例えば、Ｂａｌｏｇｌｕ Ｓ，Ｂｏｙｌｅ ＳＭら（Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｔｏ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｅｉｔｈｅｒ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｐａｒｔｉａｌ ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ ｏｒ Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｌ７／Ｌ１２ ｐｒｏｔｅｉｎ．（リステリア・モノサイトゲネス部分的リステリオリシン又はウシ流産菌のリボソームＬ７／Ｌ１２タンパク質のいずれかを発現する、ワクシニアウイルス組換え体に対するマウスの免疫応答）Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００５，１０９（１−２）：１１〜７）；及びＪｉａｎｇ ＬＬ，Ｓｏｎｇ ＨＨら（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｓｔｒａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．（緑色蛍光タンパク質を発現する変異リステリア・モノサイトゲネス菌株の特性解析）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）２００５，３７（１）：１９〜２４）に記載されている。別の実施形態においては、相同的組換えは、米国特許第６，８５５，３２０号において提供される記述にしたがって遂行される。この場合には、Ｅ７を発現する組換えＬＭ菌株は、遺伝子生成物の分泌を確実にして、Ｌｍ−ＡＺ／Ｅ７と称される組換えを産生するために、ｈｌｙプロモーターの制御下に、ｈｌｙシグナル配列を包含して、Ｅ７遺伝子の染色体への組込みにより作製された。別の実施形態においては、温度感受性プラスミドが、組換え体の選別のために用いられた。それぞれの技法は別個の本発明の実施形態を代表する。
別の実施形態においては、構築物又は核酸分子は、トランスポゾン挿入を用いて、リステリア染色体中に組み込まれる。トランスポゾン挿入の技法は、当技術分野において周知であり、及び、とりわけ、Ｓｕｎら（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９０，５８：３７７０〜３７７８）による、ＤＰ−Ｌ９６７の構築の中に記載されている。別の実施形態においては、トランスポゾン突然変異生成は、安定なゲノム挿入突然変異体が形成され得るという利点を有するが、そのゲノムにおいて外来遺伝子が挿入された位置が不明であるという不利益がある。
別の実施形態においては、構築物又は核酸分子は、ファージ組込み部位を用いて、リステリア染色体中に組み込まれる（Ｌａｕｅｒ Ｐ，Ｃｈｏｗ ＭＹら，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｔｗｏ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈａｇｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ．（２つのリステリア・モノサイトゲネス部位特異的ファージ組込みベクターの構築、特性評価、及び使用）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ２００２；１８４（１５）：４１７７〜８６）。この方法の特定の実施形態では、インテグラーゼ遺伝子及びバクテリオファージの接着部位（例えば、Ｕ１５３又はＰＳＡリステリオファージ）が、異種遺伝子を対応する接着部位の中に挿入するために用いられ、この部位はゲノム中の任意の適切な部位（例えば、ｃｏｍＫ又はａｒｇｔＲＮＡ遺伝子の３’末端）であってよい。別の実施形態においては、内因性プロファージが、構築物又は異種遺伝子の組込みに先立って、利用された接着部位からキュアリングされる。別の実施形態においては、この方法は、単一コピー成分をもたらす。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
別の実施形態においては、抗原又はその抗原を含む融合タンパク質を発現させるために、さまざまなプロモーターの１つが用いられる。一実施形態においては、ＬＭプロモーターが用いられ、例えば、リステリアタンパク質溶血素、ａｃｔＡ、フォスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼ、ホスホリパーゼＣ、及びメタロプロテアーゼをそれぞれコードする、遺伝子ｈｌｙ、ａｃｔＡ、ｐｌｃａ、ｐｌｃＢ及びｍｐｌに対するプロモーターが用いられる。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
別の実施形態においては、本発明の方法及び組成物は、本発明のＨｅｒ−２キメラタンパク質又はＬＬＯ配列の相同体を用いる。別の実施形態においては、本発明の方法及び組成物は、ヒト以外の哺乳類からのＨｅｒ−２キメラタンパク質を用いる。用語「相同性」、「相同体」などは、タンパク質又はペプチドに関して用いられる場合には、一実施形態においては、最大のパーセンテージの相同性を達成するために、配列のアラインメントを行い、必要であればギャップを導入したのちに、配列の同一性としての同類置換を考慮しない場合に、候補配列中の、対応する天然のポリペプチドの残基と同一のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。アラインメントのための方法及びコンピュータ・プログラムは当技術分野において周知である。
別の実施形態においては、用語「相同性」は、核酸配列の類似性に関して用いられる場合には、候補配列中のヌクレオチドの、対応する天然の核酸配列のヌクレオチドと同一のパーセンテージを示す。
相同性は、一実施形態においては、配列アラインメントについてのコンピュータ・アルゴリズムにより、当技術分野でよく記載される方法により決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピュータ・アルゴリズム解析は、ＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｕｔｉｌｉｔｙ）、ＧＥＮＰＥＰＴ、及びＴＲＥＭＢＬパッケージなどの、任意の数の利用可能なソフトウエア・パッケージの利用を含むことができる。
別の実施形態においては「相同性」は、配列番号１〜４から選ばれた配列に対する７０％を超える同一性を指す。別の実施形態においては「相同性」は、配列番号１〜４から選ばれた配列に対する７２％を超える同一性を指す。別の実施形態においては「相同性」は、７５％を超える。別の実施形態においては「相同性」は、７８％を超える。別の実施形態においては「相同性」は、８０％を超える。別の実施形態においては「相同性」は、８２％を超える。別の実施形態においては「相同性」は、８３％を超える。別の実施形態においては「相同性」は、８５％を超える。別の実施形態においては「相同性」は、８７％を超える。別の実施形態においては「相同性」は、８８％を超える。別の実施形態においては「相同性」は、９０％を超える。別の実施形態においては「相同性」は、９２％を超える。別の実施形態においては「相同性」は、９３％を超える。別の実施形態においては「相同性」は、９５％を超える。別の実施形態においては「相同性」は、９６％を超える。別の実施形態においては「相同性」は、９７％を超える。別の実施形態においては「相同性」は、９８％を超える。別の実施形態においては「相同性」は、９９％を超える。別の実施形態においては「相同性」は、１００％である。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
別の実施形態においては、相同性は候補配列のハイブリダイゼーションの決定を通じて決定され、その方法は、当技術分野でよく記載されている（例えば、“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，編（１９８５）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌら．，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙを参照されたい）。例えばハイブリダイゼーションの方法は、天然のカスパーゼペプチドをコードするＤＮＡの相補体に対しては中程度から厳しい条件の下で遂行されることができる。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、４２°Ｃで、１０〜２０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５Ｘデンハート液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌの変性された断片化済みのサケ精子ＤＮＡを含む溶液中での、終夜のインキュベーションである。
本発明の一実施形態においては、「核酸」は、少なくとも２個の塩基−糖−リン酸エステルの組合せの鎖を指す。この用語は、一実施形態においては、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。「ヌクレオチド」は、一実施形態においては、核酸ポリマーの単量体単位を指す。ＲＮＡは、一実施形態においては、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びリボソームの形態であることができる。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの使用は、（Ｃａｕｄｙ ＡＡら，Ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖｅｌ １６：２４９１〜９６，及びその中に引用される参照文献）に記載されている。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、線状ＤＮＡ、若しくは染色体ＤＮＡ又はこれらの群の誘導体の形態であることができる。加えて、これらのＤＮＡ及びＲＮＡの形態は一本鎖、二本鎖、又は四本鎖であることができる。この用語は、別の実施形態においては、同じ塩基を持つが、骨格が異なる人工的な核酸を含むことができる。一実施形態においては、この人工的な核酸はＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡは、ペプチド骨格及びヌクレオチド塩基を含み、及び一実施形態においては、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の両方に結合する能力がある。別の実施形態においては、ヌクレオチドはオキセタンにより修飾されている。別の実施形態においては、ヌクレオチド１つ以上のホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合により置換することにより修飾される。別の実施形態においては、人工的核酸は、天然の核酸のホスフェート骨格に、当技術分野において周知のその他の任意の変異を含むことができる。ホスホロチオエート核酸及びＰＮＡの使用は当業者に周知であり、例えば、Ｎｅｉｌｓｅｎ ＰＥ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ９：３５３〜５７；及びＲａｚ ＮＫら．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． ２９７： １０７５〜８４。核酸の生産及び使用は、当業者には周知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，（２００１），Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ，編、並びに Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ（２００３） Ｐｕｒｃｈｉｏ及びＧ．Ｃ．Ｆａｒｅｅｄに記載されている。それぞれの核酸誘導体は、別個の本発明の実施形態を代表する。
本明細書に一覧されるタンパク質及び／又はペプチドの任意のアミノ酸配列の相同性は、一実施形態においては、免疫ブロット測定法、又は任意の数の利用可能なソフトウエア・パッケージを利用するコンピュータ・アルゴリズムによるアミノ酸配列の解析、確立された方法を含む、当技術分野では周知の方法により決定される。これらのパッケージのいくつかとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈ又はＳｃａｎｐｓパッケージを挙げることができ、及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、及び／又は例えばｇｌｏｂａｌ／ｌｏｃａｌ若しくは解析のためのＢＬＯＣＫＳアラインメントの使用を採用できる。相同性決定のためのそれぞれの方法は、別個の本発明の実施形態を代表する。
別の実施形態においては、本発明は、本発明の方法を遂行するために用いられる試薬を含むキットを提供する。別の実施形態においては、本発明は、本発明の組成物、ツール、又は器具を含むキットを提供する。
用語「接触する」又は「投与する」は、一実施形態においては、本発明の組成物が直接的に癌細胞又は腫瘍に接触することを指す。別の実施形態においては、これらの用語は、本発明の組成物が間接的に癌細胞又は腫瘍に接触することを指す。別の実施形態においては、本発明の方法は、被験体が本発明の組成物に接触した後に、組成物が、拡散又は当技術分野において周知の任意の能動輸送若しくは受動輸送プロセスにより、癌細胞又は腫瘍に接触し、それにより体内を化合物が循環する方法を含む。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
別の実施形態においては、用語「遺伝子」及び「組換え遺伝子」は、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。そのような、自然な対立遺伝子の変異は、典型的には所定の遺伝子のヌクレオチド配列の１〜５％の変化をもたらし得る。代替的な対立遺伝子は、一連の異なる個体又は生物中の対象とする遺伝子のシークエンシングにより同定される。このことは、さまざまな個体又は生物において同一の遺伝子座を同定するために、ハイブリダイゼーションのプローブを用いることにより容易に遂行できる。自然な対立遺伝子の変異の結果であり、及び機能的活性を変化させない、そのようなヌクレオチド変異及び生成されるアミノ酸多型、又は変異のすべてが、本発明の範囲に包含されることが意図される。
（薬剤組成物）
本発明のワクチン及び組成物を含む薬剤組成物は、別の実施形態においては、非経口投与、癌細胞近傍投与、経粘膜投与、経皮投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、心室内投与、頭蓋内投与、膣内投与、腫瘍内投与などの、当業者に周知の任意の方法によって、被験体に投与される。
本明細書において提供される方法及び組成物の別の実施形態においては、ワクチン又は組成物は、経口投与され、従って、経口投与に適切な形態、すなわち、固体又は液体調製物に製剤される。適切な固体の経口製剤としては、錠剤、カプセル、ピル、顆粒、ペレットなどが挙げられる。適切な液体経口製剤としては、溶液、懸濁液、分散液、乳液、油剤などが挙げられる。本発明の別の実施形態においては、活性成分はカプセル中に製剤される。この実施形態に従うと、本発明の組成物は、活性化合物及び不活性な担体又は希釈剤に加え、硬ゼラチンカプセルを含む。
別の実施形態においては、ワクチン又は組成物は、液体製剤の、静脈内、動脈内、又は筋肉内注射により投与される。適切な液体製剤としては、溶液、懸濁液、分散液、乳液、油剤などが挙げられる。一実施形態においては、薬剤組成物は、静脈内に投与され、及び従って、静脈内投与に適した形態に製剤される。別の実施形態においては、薬剤組成物は、動脈内に投与され、従って、動脈内投与に適した形態に製剤される。別の実施形態においては、薬剤組成物は、筋肉内に投与され、従って、筋肉内投与に適した形態に製剤される。
一実施形態においては、用語「治療する」は、疾患を治癒することを指す。別の実施形態においては、「治療する」は、疾患を予防することを指す。別の実施形態においては、「治療する」は、疾患の発生率を低下させることを指す。別の実施形態においては、「治療する」は、疾患を改善することを指す。別の実施形態においては、「治療する」は、患者の無病生存又は全生存を増加させることを指す。別の実施形態においては、「治療する」は、疾患の進行を安定化させることを指す。別の実施形態においては、「治療する」は、寛解を導くことを指す。別の実施形態においては、「治療する」は、疾患の進行を遅くすることを指す。用語「低下させる」、「抑制する」、及び「阻害する」は、別の実施形態においては、少なくする、又は減少させることを指す。それぞれの可能性は、本発明の別々の実施形態を表している。
本明細書において使用される用語「約」は、量的にプラス、又はマイナス５％を指すか、又は別の実施形態においてはプラス、又はマイナス１０％を、又は別の実施形態においてはプラス、又はマイナス１５％を、又は別の実施形態においてはプラス、又はマイナス２０％を指す。
用語「被験体」は、一実施形態においては、疾患若しくはその後遺症の治療を必要とするか、又はその影響を受けやすい、イヌ科動物を含む哺乳類を指す。被験体としては、様々な種類のイヌ、オオカミを含む動物園の動物、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、マウス、及びヒトを挙げることができる。用語「被験体」は、すべての点で正常である個体を除外しない。
一実施形態においては、治療の目的のための用語「哺乳類」は、ヒト、家畜、動物園の動物、スポーツ用動物、イヌを含むイヌ科動物などのペット用動物、ウマ、ネコ、畜牛、ブタ、ヒツジなどを指す。
一実施形態においては、イヌ科動物は、成熟した、又は幼若のイヌ科動物であってよい。
腫瘍の治療に関して「治療的に有効な用量」は、１つ以上の以下の効果を誘導する能力のある量を指す：（１）遅延化及び完全な増殖停止を含む、腫瘍増殖の一定程度の阻害；（２）腫瘍細胞の数の低減；（３）腫瘍サイズの低減；（４）腫瘍細胞の末梢器官への浸潤の阻害（すなわち、低減、遅延化又は完全な停止）；（５）転移の阻害（すなわち、低減、遅延化又は完全な停止）；（６）限定はされないが、腫瘍の軽減、又は拒絶をもたらし得る、抗腫瘍免疫応答の増強；及び／又は（７）疾患に付随する１つ以上の症状の一定程度の軽減。主要治療の目的における、本明細書において提供されるワクチンの「治療的に有効な用量」は、経験的に、及び一連の決められた様式で決定され得る。
以下の実施例は、本発明の好適な実施形態を、より完全に説明する目的で提示される。しかしながら、それらは、本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
（実施例）
（材料及び方法）
オリゴヌクレオチドはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）により合成され、及びＤＮＡシークエンシングはＧｅｎｅｗｉｚ社（ニュージャージー州サウスプレインフィールド）により行われた。フローサイトメトリーの試薬は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＤ，カリフォルニア州サンディエゴ）より購入した。細胞培養物培地、補助栄養物及び他のすべての試薬は、特に指示されない限り、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）からのものである。Ｈｅｒ２／ｎｅｕＨＬＡ−Ａ２ペプチドは、ＥＺｂｉｏｌａｂｓ（インディアナ州ウェストフィールド）により合成された。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＲＰＭＩ １６４０（Ｃ−ＲＰＭＩ）培地は、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びＨｅｐｅｓ（２５ｍＭ）を含んでいた。ポリクローナル抗ＬＬＯ抗体は、以前にも記載されており、及び抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体はＳｉｇｍａから購入した。
（マウス及び細胞株）
すべての動物実験は、ペンシルベニア大学又はラトガーズ大学のＩＡＣＵＣ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ：施設内の動物ケア及び使用に関する委員会）により承認されたプロトコールに従い行われた。ＦＶＢ／ＮマウスはＪａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（メイン州バー・ハーバー）より購入した。ラットＨｅｒ２／ｎｅｕ癌タンパク質を過剰発現する、ＦＶＢ／ＮＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスを、ペンシルベニア大学の動物ケア施設で飼育及び給餌した。ラットＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を高レベルで発現するＮＴ−２腫瘍細胞株は、これらのマウスでの自然発生乳房腫瘍から導出し、及び上述のように増殖させた。ＤＨＦＲ−Ｇ８（３Ｔ３／ｎｅｕ）細胞は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手し、及びＡＴＣＣ推奨に従い増殖させた。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞株は、Ｊｏｈｎ Ｏｈｌｆｅｓｔ博士（ミネソタ大学，ミネソタ州）により寄贈され、及びｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｃ−ＲＰＭＩ培地中で増殖させた。生物発光の作業は、ペンシルベニア大学のＳｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（小動物イメージング施設：ＳＡＩＦ）（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）の指導の下に遂行された。
（リステリア構築物及び抗原発現）
Ｈｅｒ２／ｎｅｕｐＧＥＭ７Ｚは、ペンシルベニア大学のＭａｒｋ Ｇｒｅｅｎｅ博士より寄贈され、及びｐＧＥＭ７Ｚプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）中にクローニングされた、全長のヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ（ｈＨｅｒ２）遺伝子を含んでいた。このプラスミドは、ｈＨｅｒ−２／ｎｅｕの３つのセグメント、すなわち、ＥＣ１、ＥＣ２、及びＩＣ１を、ｐｆｘＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるＰＣＲにより増幅するためのテンプレートとして用いられ、そのオリゴ（ｏｌｉｇｏ）が表１に示される。
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕキメラ構築物は、ＳＯＥｉｎｇＰＣＲ方法による直接融合によりそれぞれの別個のｈＨｅｒ−２／ｎｅｕセグメントをテンプレートとして作製された。プライマーが表２に示される。
ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ｐＡｄｖ１３８から、ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ制限酵素を用いて切り出し、及びＬｍｄｄシャトルベクター、ｐＡｄｖ１３４中のＬＬＯのトランケートされた非溶血性フラグメントのフレームでクローニングされた。この挿入物の配列、ＬＬＯ及びｈｌｙプロモーターは、ＤＮＡシークエンシング分析により確認された。このプラスミドは、エレクトロコンピテントな、ａｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ変異体、リステリア株、ＬｍｄｄＡに電子穿孔され、及び陽性クローンはストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍｌ）を含むブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天プレート上で選別された。いくつかの実験では、ｈＨｅｒ２／ｎｅｕ（Ｌｍ−ｈＨｅｒ２）フラグメントを発現する同様のリステリア株が、比較の目的で用いられた。これらは、以前に記載されている。すべての試験で、リステリアの免疫系に対する抗原非依存性効果を割り出すために、無関係なリステリア構築物（Ｌｍ−対照）を含有させた。Ｌｍ−対照は、ＡＤＸＳ３１−１６４と同一のリステリアプラットフォームに基づいているが、ＨＰＶ１６−Ｅ７又はＮＹ−ＥＳＯ−１などの異なる抗原を発現する。リステリアからの融合タンパク質の発現及び分泌が試験された。それぞれの構築物は、インビボで２回継代された。
（細胞傷害性の検定）
３〜５匹のＦＶＢ／Ｎマウス群が、１週間の間隔をおいて、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、Ｌｍ−ｈＨｅｒ２ＩＣＩ若しくはＬｍ対照（無関係な抗原を発現）の１ｘ１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）により３回免疫されたか、又は免疫感作を与えられないままにされた。ＮＴ−２細胞はインビトロで増殖させ、トリプシンにより切り離され、及びマイトマイシンＣ（２５０μｇ／ｍｌ血清を含まないＣ−ＲＰＭＩ培地中）により、３７°Ｃで４５分間処理された。５回洗浄後に、これらは、免疫されたか、又は与えられなかった動物から取り出された脾細胞とともに、１：５（刺激体：応答体）の比率で、５日間、３７°Ｃ及び５％ＣＯ２下で共インキュベーションされた。標準細胞傷害性検定は、ユーロピウムにより標識された３Ｔ３／ｎｅｕ（ＤＨＦＲ−Ｇ８）細胞を標的として用いて、以前に記載した方法に従って遂行した。殺された標的細胞から放出されたユーロピウムが、４時間のインキュベーション後に、分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｖｉｃｔｏｒ２）を用いて５９０ｎｍで測定された。特異的な溶解の比率は（実験群における溶解−自然発生的溶解）／（最大溶解−自然発生的溶解）で定義される。
（免疫されたマウスからの脾細胞によるインターフェロン−γ分泌）
３〜５匹のＦＶＢ／Ｎ又はＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス群が、１週間の間隔をおいて、ＡＤＸＳ３１−１６４、陰性リステリア対照（無関係な抗原を発現）の１ｘ１０８ＣＦＵにより３回免疫されたか、又は免疫されないままにされた。最後の免疫付与の１週間後に、ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞が単離され、及び２４ウェル・プレート中で、５ｘ１０６細胞／ウェルで、Ｃ−ＲＰＭＩ培地中のマイトマイシンＣで処理されたＮＴ−２細胞の存在下に、共インキュベーションされた。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスからの脾細胞は、１μΜのＨＬＡ−Ａ２特異的ペプチド、又は大腸菌中で生産された１μｇ／ｍｌの組換えＨｉｓ−タグＣｈＨｅｒ２タンパク質の存在下にインキュベートされ、及びニッケルに基づく親和性クロマトグラフィー系で精製された。上澄み液からのサンプルが２４〜７２時間後に取得され、及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の存在が、マウスＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）キットにより、製造者の推奨に従って試験された。
（Ｈｅｒ２トランスジェニック動物での腫瘍研究）
６週齢のＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウス（９〜１４匹／群）が、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４又はＬｍ−対照の５ｘ１０８ＣＦＵにより６回免疫された。それらは、自然発生的な乳房腫瘍に関して週に２回観察され、腫瘍は５２週まで電子キャリパーを用いて測定された。エスケープした腫瘍は、１ｃｍ２の平均直径に達したときに切除され、及びＲＮＡｌａｔｅｒ中に−２０°Ｃで保存された。Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質における変異の、これらの腫瘍のエスケープに与える影響を決定するために、ゲノムＤＮＡがゲノムＤＮＡ単離キットを用いて抽出され、及び配列が決定された。
（脾臓及び腫瘍中の制御性Ｔ細胞に対するＡＤＸＳ３１−１６４の効果）
マウスに、皮下的に１ｘ１０６ＮＴ−２細胞が移植された。７、１４及び２１日目に、それらは、ＡＤＸＳ３１−１６４、ＬｍｄｄＡ対照の１ｘ１０８ＣＦＵにより免疫されたか、又は免疫されないままにされた。腫瘍及び脾臓が２８日目に摘出され、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの存在に関して、ＦＡＣＳ検定により試験された。簡潔には、２枚のスライドガラスの間のＣ−ＲＰＭＩ培地中での脾臓のホモジナイズにより脾細胞が単離された。腫瘍は、殺菌した剃刀刃により切り刻まれ、及びＰＢＳ中にＤＮａｓｅ（１２Ｕ／ｍｌ）、及びコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍｌ）を含む緩衝液により消化された。抗原とともに、室温で６０分インキュベートしたのち、細胞を激しいピペッティングにより分離した。赤血球細胞が、ＲＢＣ溶解緩衝液により溶解され、続いて１０％ＦＢＳを含む完全ＲＰＭＩ−１６４０培地により、数回洗浄された。ナイロン・メッシュによるろ過の後、腫瘍細胞及び脾細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ）中に再懸濁され、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ２５−ＡＰＣ抗体により染色され、続いて抗Ｆｏｘｐ３−ＰＥによる透過性上昇及び染色を受けた。フローサイトメトリー分析が、４色ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）により行われ、及びデータがＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ）を用いて解析された。
（統計解析）
ログランクχ二乗検定が生存率データに使用され、及びステューデントのｔ−検定が、それぞれ３回繰り返されたＣＴＬ及びＥＬＩＳＡ検定に用いられた。これらの解析において、０．０５未満のｐ−値（＊でマークされる）が、統計的に有意であるとみなされた。すべての統計解析は、Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｖ．４．０ａ（２００６）又はＳＰＳＳ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｖ．１５．０（２００６）のいずれかにより行われた。すべてのＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック試験において、本発明者は、群当たり８〜１４マウスを用い、すべての野生型のＦＶＢ／Ｎ試験には、特に指定のない限り、群当たり少なくとも８匹のマウスを使用した。すべての試験は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスのモデルにおける長期の腫瘍試験を除き、少なくとも１回繰り返された。
（実施例１）
Ｈｅｒ−２フラグメントに融合したＬＬＯフラグメントを分泌するリステリア株の作製：ＡＤＸＳ３１−１６４の構築。
キメラＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子（ＣｈＨｅｒ２）の構築は、以前に記載されている。簡潔には、ＣｈＨｅｒ２遺伝子が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の２つの細胞外（ａａ４０−１７０及びａａ３５９−４３３）、並びに１つの細胞内フラグメント（ａａ６７８−８０８）を、ＳＯＥｉｎｇＰＣＲ法によって、直接融合することにより構築された。このキメラタンパク質は、このタンパク質の周知のヒトＭＨＣクラスＩエピトープのほとんどを内包する。ＣｈＨｅｒ２遺伝子が、プラスミド、ｐＡｄｖ１３８（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の構築に用いられた）から切り出され、及びＬｍｄｄＡシャトルプラスミド中でクローニングされ、プラスミドｐＡｄｖ１６４をもたらした（図１Ａ）。これらの２つのプラスミド骨格には２つの主要な相違がある。１）ｐＡｄｖ１３８がインビトロでの組換え細菌の選別にクロラムフェニコール耐性マーカー（ｃａｔ）を使う一方で、ｐＡｄｖ１６４は、インビトロでの選別、及びインビボでのｄａｌ−ｄａｔ遺伝子を欠失するＬｍｄｄＡ菌株中でのプラスミド維持に、代謝相補性経路を用いる枯草菌からのＤ−アラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）を内包する。このワクチンプラットフォームは、操作されたリステリアワクチン菌株の、抗生物質耐性に関するＦＤＡの懸念に対処するために、設計、開発された。２）ｐＡｄｖ１３８とは異なり、ｐＡｄｖ１６４は、インビボでのＬｍｄｄ菌株の補完のためには必要がないために、プラスミド中にｐｒｆＡ遺伝子コピーを内包しない（以下の配列及び図１Ａを参照されたい）。ＬｍｄｄＡワクチン菌株は、ａｃｔＡ遺伝子（細胞内運動及びリステリアの細胞間拡散の原因となる）をも欠失しており、そのため、この骨格から誘導された組換えワクチン菌株は、その親株であるＬｍｄｄから誘導されたものよりも毒性が１００倍低い。ＬｍｄｄＡに基づくワクチンは、免疫されたマウス脾臓からのＬｍｄｄに基づくワクチンに比べてはるかに速やかに除去される（４８時間未満）。この菌株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現及び分泌は、ウエスタンブロッティング分析を用いて抗ＬＬＯ抗体により約１０４ＫＤのバンドが検出されるために、インビトロでの生育の８時間後にＴＣＡにより沈殿された細胞培養物上澄み液中のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に匹敵する（図１Ｂ）。ｔＬＬＯのみを発現する、リステリアの骨格菌株が陰性対照として用いられた。
ｐＡｄｖ１６４の配列（７０７５塩基対）（図１を参照されたい）：
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（実施例２：ＡＤＸＳ３１−１６４ＩＳはＡＳＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２と同等に免疫原性である。）
抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的細胞傷害性Ｔ細胞の産生におけるＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性特性が、標準ＣＴＬ検定において、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２ワクチンと比較された。両方のワクチンとも、３Ｔ３／ｎｅｕ標的細胞により発現されるＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原に対する、強い、同程度の細胞傷害性Ｔ細胞応答を引き起こした。従って、ＬＬＯに融合したＨｅｒ２の細胞内フラグメントのみを発現する、リステリアにより免疫されたマウスは、より多くのＭＨＣクラスＩエピトープを含むキメラよりも、低い溶解活性を示した。免疫性を与えられなかった動物又は無関係なリステリアワクチンを注射されたマウスでは、ＣＴＬ活性は検出されなかった（図２Ａ）。ＡＤＸＳ３１−１６４は、更に野生型ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞にＩＦＮ−γを分泌させることもできた（図２Ｂ）。これは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原を発現する、マイトマイシンＣで処理したＮＴ−２細胞とともに、共培養されたこれらの細胞培養物上澄み液中で検出された（図５Ｃ）。
ＡＤＸＳ３１−１６４による免疫付与後の、ヒトＭＨＣクラスＩエピトープの適正なプロセシング及び提示がＨＬＡ−Ａ２マウス中で試験された。免疫されたＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの脾細胞が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ分子の細胞外（ＨＬＹＱＧＣＱＶＶ 配列番号１１又はＫＩＦＧＳＬＡＦＬ 配列番号１２）、又は細胞内（ＲＬＬＱＥＴＥＬＶ 配列番号１３）ドメインに所在する、マッピングされたＨＬＡ−Ａ２に制限されたエピトープに対応するペプチドとともに、７２時間共インキュベートされた（図２Ｃ）。組換えＣｈＨｅｒ２タンパク質が、陽性対照として用いられ、及び無関係なペプチド、又はペプチドなしが陰性対照として用いられた。この実験からのデータは、ＡＤＸＳ３１−１６４が、標的とされた抗原の異なるドメインに所在するヒトエピトープに対する、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的免疫応答を引き起こすことができることを示した。
（実施例３：ＡＤＸＳ３１−１６４は、自然発生的な乳房腫瘍侵襲の予防においてＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２よりも有効であった。）
ゆっくりと増殖する自然発生的乳房腫瘍を有する２０〜２５週齢のＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物において、ＡＤＸＳ３１−１６４の抗腫瘍効果が、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の効果と比較された。無関係なリステリア対照ワクチンで免疫されたすべての動物が、２１〜２５週の間に乳房腫瘍を発現し、及び３３週の前に屠殺された。その一方で、リステリア−Ｈｅｒ２／ｎｅ組換えワクチンは、乳房腫瘍の形成の有意な遅延を引き起こした。４５週目に、ＡＤＸＳ３１−１６４で免疫された５０％を超えるマウス（９匹中５匹）には腫瘍がなかったのに対し、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２で免疫されたマウスでは２５％であった。５２週目では、ＡＤＸＳ３１−１６４で免疫されたマウスの８匹中の２匹には腫瘍がないままであり、他の実験群のすべてのマウスは、疾患により既に死亡していた（図３）。これらの結果は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物における自然発生的乳房腫瘍の侵襲において、ＡＤＸＳ３１−１６４はより弱毒化されているにも関わらず、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２よりも有効であることを示した。
（実施例４：ＡＤＸＳ３１−１６４での免疫付与時のＨＥＲ２／ＮＥＵ遺伝子の変異。）
小フラグメントワクチン又はＨｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメイン中のエピトープを標的とするモノクローナル抗体である、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）による免疫付与では、Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＭＨＣクラスＩエピトープにおける変異が、腫瘍エスケープの原因だと考えられる。このことを評価するために、ゲノム物質がトランスジェニック動物のエスケープした腫瘍から抽出され、及びキメラ又は対照ワクチンで免疫されたトランスジェニック動物の腫瘍中のｎｅｕ遺伝子のフラグメントに対して、配列決定された。全ての免疫された腫瘍サンプル中では、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子の変異は観察されず、このことは別のエスケープ機構の存在を示唆した（データは示されていない）。
（実施例５：ＡＤＸＳ３１−１６４は腫瘍内制御性Ｔ細胞の有意な減少を引き起こす。）
脾臓及び腫瘍におけるＡＤＸＳ３１−１６４の制御性Ｔ細胞の頻度に対する影響を解明するために、マウスにＮＴ−２腫瘍細胞を移植した。３回の免疫付与後に脾細胞及び腫瘍内リンパ球が単離され、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋細胞として定義されるＴｒｅｇが染色されたが、個別に分析した場合に、ＦｏｘＰ３又はＣＤ２５マーカーで、同等の結果が得られた。この結果は、無関係なリステリアワクチン又は抗原感作されていない動物と比較して、ＡＤＸＳ３１−１６４による免疫付与が、脾臓におけるＴｒｅｇの頻度には影響しないことを示した（図４を参照されたい）。一方で、リステリアワクチンによる免疫付与は、腫瘍中のＴｒｅｇの存在には同等の影響を引き起こした（図５Ａ）。未治療の腫瘍のすべてのＣＤ３＋Ｔ細胞の平均１９．０％がＴｒｅｇである一方で、この頻度は、無関係なワクチンでは４．２％、及びＡＤＸＳ３１−１６４では３．４％に低下され、腫瘍内のＴｒｅｇの頻度は１／５まで減少した（図５Ｂ）。いずれかのＬｍｄｄＡワクチンで処理されたマウスの、腫瘍内のＴｒｅｇの頻度の減少は、腫瘍のサイズの差異には起因しない可能性がある。代表的な実験においては、ＡＤＸＳ３１−１６４により免疫されたマウスの腫瘍は、未処理のマウスの腫瘍（８．６９±０．９８、ｎ＝５、ｐ＜０．０１）又は無関係なワクチンで処理された場合（８．４１±１．４７、ｎ＝５、ｐ＝０．０４）と比較して、有意により小さく［平均直径（ｍｍ）＋標準偏差、６．７１＋０．４３、ｎ＝５］、一方ではこれらの未処理と無関係なワクチンで処理した２つの群は、腫瘍サイズにおいて統計的に有意差を示さなかった（ｐ＝０．７３）。ＬｍｄｄＡワクチンで処理された腫瘍中のＴｒｅｇの低い頻度は、増大した腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比をもたらし、ＬｍｄｄＡワクチンによる免疫付与後に、より好ましい腫瘍のミクロ環境が得られることを示唆した。しかしながら、標的抗原Ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現するワクチン（ＡＤＸＳ３１−１６４）だけが、腫瘍増殖を低下させることができ、このことは、Ｔｒｅｇの減少は、腫瘍中に抗原特異的応答が存在する場合にのみ効果を有することを示している。
（実施例６：ＨＥＲ−２キメラ発現リステリアワクチンによりエスケープ変異は導入されない。）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８、ＬｍｄｄＡ１６４及び無関係なワクチンＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹなどの異なるワクチンにより免疫されたマウスの腫瘍サンプルが摘出された。免疫エスケープ変異の有無を決定するために、これらのサンプルからのＤＮＡが精製され、及びＨｅｒ−２／ｎｅｕ領域ＩＣ１、ＥＣ１及びＥＣ２に対応するＤＮＡフラグメントが増幅され、及び配列が決定された。各ＤＮＡからの配列のアラインメントは、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて遂行された。解析の結果は、腫瘍から摘出されたＤＮＡ配列には変異がないことを示した。これらの配列の詳細な解析が以下に示される。
ＥＣ２のアラインメント（Ｈｅｒ−２−ｎｅｕの９７５−１０２９ｂｐ）
参照
ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ（配列番号１４）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２ ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３ ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１ ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
ＬｍｄｄＡ１６４−２ ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３ ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
ＬｍｄｄＡ１６４−４ ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
ＬｍｄｄＡ−１６４−５ ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
ＬｍｄｄＡ−１６４−６ ＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴ
参照
ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
（配列番号１５）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
ＬｍｄｄＡ１６４−２
ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３
ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
ＬｍｄｄＡ１６４−４
ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５
ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
ＬｍｄｄＡ−１６４−６
ＣＧＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣ
参照
ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
（配列番号１６）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
ＬｍｄｄＡ１６４−２
ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３
ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
ＬｍｄｄＡ１６４−４
ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５
ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
ＬｍｄｄＡ−１６４−６
ＡＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ
参照
ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
（配列番号１７）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
ＬｍｄｄＡ１６４−２
ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３
ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
ＬｍｄｄＡ１６４−４
ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５
ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
ＬｍｄｄＡ−１６４−６
ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧ
参照
ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ
（配列番号１８）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ
ＬｍｄｄＡ１６４−２
ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３
ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ
ＬｍｄｄＡ１６４−４
ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５
ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＮＡＣＡＧＴＣＴＣ
ＬｍｄｄＡ−１６４−６
ＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＣＴ
参照
ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
（配列番号１９）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
ＬｍｄｄＡ１６４−２
ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３
ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
ＬｍｄｄＡ１６４−４
ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５
ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
ＬｍｄｄＡ−１６４−６
ＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＧＧＣ
参照
ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ
（配列番号２０）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ
ＬｍｄｄＡ１６４−３
ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５
ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６
ＧＣＧＴＡＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧ
参照
ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ
（配列番号２１）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ
ＬｍｄｄＡ１６４−３
ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５
ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６
ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴ
参照
ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ
（配列番号２２）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ
ＬｍｄｄＡ１６４−３
ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５
ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＮＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６
ＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧ
参照
ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣ
（配列番号２３）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣ
ＬｍｄｄＡ１６４−３
ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６
ＣＣＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＧＧＧＣＡＣ
参照
ＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧ
（配列番号２４）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧ
ＬｍｄｄＡ１６４−３
ＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６ＴＧＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡ---------------
ＩＣ１のアラインメント（Ｈｅｒ−２−ｎｅｕの２１１４−３０４２ｂｐ）
参照
ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣ（配列番号２５）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２
ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４
ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２
ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３
ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６
ＣＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＣ
参照
ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
（配列番号２６）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１
ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２
ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１
ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４
ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２
ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３
ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４
ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５
ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６
ＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡ
参照
ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
（配列番号２７）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１
ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２
ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１
ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４
ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２
ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３
ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４
ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５
ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６
ＴＣＣＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＴ
参照
ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
（配列番号２８）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１
ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２
ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１
ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４
ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２
ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３
ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４
ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５
ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６
ＣＴＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＧＴＡＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＣ
参照
ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
（配列番号２９）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１
ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２
ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１
ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４
ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２
ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３
ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４
ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５
ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６
ＣＧＴＡＴＧＴＧＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣ
参照
ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
（配列番号３０）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１
ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２
ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１
ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４
ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２
ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３
ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４
ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５
ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６
ＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＧＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣ
参照
ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ（配列番号３１）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１
ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２
ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１
ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４
ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２
ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３
ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４
ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５
ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６
ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣ
参照
ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ（配列番号３２）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１
ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２
ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１
ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４
ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２
ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４
ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３
ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５
ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６
ＧＧＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＡ
参照
ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
（配列番号３３）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１
ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２
ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１
ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４
ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２
ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３
ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４
ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５
ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６
ＡＧＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧ
参照
ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ（配列番号３４）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１
ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２
ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１
ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４
ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２
ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３
ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４
ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５
ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６
ＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡ
参照
ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
（配列番号３５）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１
ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２
ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１
ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４
ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２
ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３
ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４
ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５
ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６
ＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
参照
ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
（配列番号３６）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１
ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２
ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１
ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４
ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＮＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６
ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２
ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３
ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５
ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４
ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡ
参照
ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ（配列番号３７）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１
ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２
ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１
ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３
ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４
ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１ ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２ ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３ ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４ ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５ ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６ ＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＴ
参照
ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ（配列番号３８）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１ ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２ ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２ ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＣＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３ ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４ ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１ ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２ ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３ ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５ ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−４ ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ１６４−６ ＧＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＴＴＴＴ
参照
ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ（配列番号３９）
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−１ ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−２ ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２ ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−３ ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−４ ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１ ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−２ ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−３ ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−５ ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−６ ＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴ
ＥＣ１のアラインメント（Ｈｅｒ−２−ｎｅｕの３９９−７５８ｂｐ）
参照
ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ
（配列番号４０）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１
ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ
ＬｍｄｄＡ−１６４−２
ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ
ＬｍｄｄＡ−１６４−３
ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ
ＬｍｄｄＡ１６４−４
ＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴ
参照
ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ
（配列番号４１）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１
ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ
ＬｍｄｄＡ−１６４−２
ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ
ＬｍｄｄＡ−１６４−３
ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ
ＬｍｄｄＡ１６４−４
ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧ
参照
ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ
（配列番号４２）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１
ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ
ＬｍｄｄＡ−１６４−２
ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ
ＬｍｄｄＡ−１６４−３
ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ
ＬｍｄｄＡ１６４−４
ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣ
参照
ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ
（配列番号４３）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１
ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ
ＬｍｄｄＡ−１６４−２
ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ
ＬｍｄｄＡ−１６４−３
ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ
ＬｍｄｄＡ１６４−４
ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧ
参照
ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡ（配列番号４４）
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−１
ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡ
Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８−２
ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡ
Ｌｍ−ｄｄＡ−１６４−１
ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＡ
ＬｍｄｄＡ−１６４−２
ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＴＡ
ＬｍｄｄＡ−１６４−３
ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＴＡ
ＬｍｄｄＡ１６４−４
ＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＧＴＡ
（実施例７：ＡＤＸＳ３１−１６４による末梢免疫付与は、脳内の転移性乳癌細胞株の増殖を遅延させる。）
マウスが、ＡＤＸＳ３１−１６４又は無関係なＬｍ対照ワクチンの腹腔内投与により免疫され、次いで、頭蓋内にルシフェラーゼ及び低レベルのＨｅｒ２／ｎｅｕを発現するＥＭＴ６−Ｌｕｃ腫瘍細胞５，０００個が移植された（図６Ｃ）。頭蓋内投与後に、各時点で麻酔マウスのエクスビボイメージングにより腫瘍が監視された。腫瘍接種後８日目に、対照動物のすべてで腫瘍が検出されたが、ＡＤＸＳ３１−１６４群のマウスのうちの１匹も検出可能な腫瘍を示さなかった（図６Ａ及びＢ）。ＡＤＸＳ３１−１６４は、明白にこれらの腫瘍侵襲を遅延させ、腫瘍接種後１１日目には、陰性対照の全ての動物がそれらの腫瘍により既に死亡していたが、ＡＤＸＳ３１−１６４群のすべてのマウスは生存しており、及び腫瘍増殖の小さな兆候を示していただけであった。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４の末梢投与により得られた免疫応答が、恐らく中枢神経系に到達し、及びＬｍｄｄＡに基づくワクチンがＣＮＳ腫瘍の治療に用いられる可能性があることを、強く示唆した。
（実施例８：ＡＤＸＳ３１−１６４による免疫付与によるイヌ科動物骨肉腫の治療。）
イヌ骨肉腫は、１０歳を超える大型犬の主要な死因となる長（脚）骨の癌である。標準的治療は、診断後の速やかな切断、その後の化学療法である。しかしながら、常にこの癌は肺に転移する。化学療法により、イヌは、それをしない場合の６か月に対して１２か月生存する。ＨＥＲ２抗原は、骨肉腫の場合には５０％を超える割合で存在する。ＨＥＲ２抗原は骨肉腫の最大５０％に存在すると考えられている。ＡＤＸＳ３１−１６４は、この抗原発現細胞への免疫攻撃を引き起こし、及びヒト乳癌を治療するために開発されている。
イヌの骨肉腫の組織学的診断及び悪性細胞による、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現の証拠は（本発明に）組み込まれる資格がある。
（イヌ骨肉腫での試行）
第一の治療計画では、脚が切断され、続いて化学療法治療のラウンドが行われる。その後に、Ｈｅｒ−２ワクチンの３回投与が、６か月の間隔の追加免疫とともに、又は追加免疫なしで行われる。
すべてのイヌが４週間のカルボプラチンによる治療を受ける。最後のカルボプラチン投与の４週後に、イヌは３週ごとに１回、合計３回のＡＤＸＳ−ＨＥＲ２投与を受ける。群１（３匹のイヌ）は投与ごとに１ｘ１０８ＣＦＵを受け、群２（３匹のイヌ）は、それぞれ投与ごとに５ｘｌ０８ＣＦＵを受け、及び群３（３匹のイヌ）は、投与ごとに１Ｘ１０９ＣＦＵを受ける。万一潜在的に用量制限的な毒性が観察された場合には、より多くのデータを収集するために追加のイヌを加えることができる。そのために、９〜１８匹のイヌが最初の試験で治療される。
第二の治療計画では、化学療法の前（１月前）に、１回のワクチン投与が行われる、合計４回の投与が行われる以外は、第一の治療計画が繰り返される。
更に、両方の治療計画では、化学療法の１月後に単回投与が行われる。
本明細書において、本発明の特定の特徴が、説明され、及び記載される一方で、多くの修正、置換、変更、及び等価物が、今や当業者には思い浮かぶであろう。従って、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨に該当するそのような、すべての修正及び変更を包含することが意図される。

Claims (16)

  1. ヒト以外の動物における、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍の増殖又は癌に対する、予防、治療、又は免疫応答誘発のための薬剤の調製における、融合ポリペプチドをコードする第一のオープンリーディングフレームを有する核酸分子を含む、有効量の弱毒化組換えリステリアの使用であって、前記融合ポリペプチドは、追加のアジュバントのポリペプチドと融合されたＨｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を含み、前記核酸分子は代謝酵素をコードする第二のオープンリーディングフレームをさらに含み、前記代謝酵素は、前記弱毒化組換えリステリア株の染色体に欠失している内在性遺伝子を補完しており、前記Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍又は癌が骨肉腫である、使用。
  2. 前記ヒト以外の動物がイヌ科動物である、請求項１に記載の使用。
  3. 前記薬剤は、前記Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍又は癌におけるＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質のエスケープ変異を防止する、請求項１に記載の使用。
  4. 前記Ｈｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原が、少なくとも５個、９個、１３個、１４個、又は１７個のマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープを含む、請求項１に記載の使用。
  5. 前記核酸分子が、リステリアゲノム、又は前記弱毒化組換えリステリア株のプラスミドに組み込まれている、請求項１に記載の使用。
  6. 抗生物質による選別がない場合に、前記プラスミドが前記弱毒化組換えリステリア株内に安定に維持される、請求項５に記載の使用。
  7. 前記プラスミドが、前記組換えリステリアに抗生物質耐性を与えない、請求項５に記載の使用。
  8. 前記組換えリステリアが、ＡｃｔＡ病原性遺伝子を欠失している、請求項１に記載の使用。
  9. 前記追加のアジュバントのポリペプチドが、非溶血性ＬＬＯタンパク質又はそのＮ末端フラグメント、ＰＥＳＴ配列、又はＡｃｔＡのＮ端末フラグメントである、請求項１に記載の使用。
  10. 前記第二のオープンリーディングフレームによりコードされる前記代謝酵素が、アミノ酸代謝酵素である、請求項１に記載の使用。
  11. 前記第二のオープンリーディングフレームによりコードされる前記代謝酵素が、アラニンラセマーゼ酵素、又はＤ−アミノ酸転移酵素である、請求項１に記載の使用。
  12. 前記組換えリステリア株は、動物宿主を介して継代されたものである、請求項１に記載の使用。
  13. 前記薬剤は非依存性アジュバントを更に含む、請求項１に記載の使用。
  14. 前記非依存性アジュバントが、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードする核酸分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、又はメチル化されていないＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドである、請求項１３に記載の使用。
  15. 前記骨肉腫がイヌ科の骨肉腫である、請求項１に記載の使用。
  16. 前記Ｈｅｒ２／ｎｅｕ発現腫瘍に対する免疫応答が、前記Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質のサブドミナントなエピトープに対する免疫応答である、請求項１に記載の使用。
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