TW201437370A - 李氏菌疫苗治療之後的抑制性細胞功能抑制 - Google Patents

Abstract

本發明提供使用活減毒李氏菌(Listeria)抑制患有疾病之個體中抗疾病浸潤性T淋巴細胞之細胞介導之抑制的方法及組合物。

Description

李氏菌疫苗治療之後的抑制性細胞功能抑制

本發明提供使用活減毒李氏菌(Listeria)抑制患有疾病之個體中抗疾病浸潤性T淋巴細胞之細胞介導之抑制的方法及組合物。

單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes，Lm)為一種細胞內病原體，其主要感染抗原呈現細胞且適宜在此等細胞之細胞質中生存。單核球增多性李氏菌及其產生的名為李氏溶血素O(listeriolysin O，LLO)之蛋白質具有與大部分用於基於細胞之免疫療法之佐劑不同的強力佐劑性質，可在提供抗原特異性治療之後投與。

Treg在維持周邊自身耐受性方面起到關鍵作用。天然產生之CD4⁺CD25^高Treg產生於胸腺中且表現FoxP3(一種為建立及維持Treg譜系一致性及抑制因子功能所需之轉錄因子)。Treg可積聚於疾病部位處，在疾病部位中其抑制疾病特異性T細胞之效應功能。在此情況發生時，儘管存在適當抗原或經活化以攻擊該等抗原之T細胞，其亦可引起疾病加重。腫瘤浸潤性FoxP3⁺ Treg密度增大已與各種實體腫瘤(包括胰臟癌、卵巢癌及肝細胞癌)之不良預後相關。Treg耗 盡會引起鼠類模型中抗腫瘤免疫性增強以及腫瘤排斥反應，但亦可引起自體免疫疾病之發展。

骨髓來源抑制性細胞(MDSC)為處於不同分化階段之早期骨髓祖細胞、不成熟顆粒球、巨噬細胞及樹突狀細胞之異源群體。此等細胞因其能夠抑制自然殺手(NK)及NKT細胞之細胞毒活性以及由CD8⁺ T細胞所介導之應變性免疫反應兩者而備受關注。雖然當前並不充分瞭解NK細胞抑制之機制，但多種路徑會引起MDSC介導之T細胞抑制，包括：1)產生精胺酸酶1/ARG1及2)上調氧化氮合成酶2(NOS2)。ARG1及NOS2代謝L-精胺酸，且共同地或分別地阻斷T細胞CD3ζ鏈之轉譯、抑制T細胞增殖及促進T細胞凋亡。另外，MDSC分泌免疫抑制性細胞激素且誘導調節性T細胞發育。在小鼠中，MDSC被廣泛定義為CD11b⁺Gr-1/Ly-6G⁺細胞，但Ly-6G及Ly-6C之相對表現水準鑑別兩個特異性子集。人類MDSC通常表現Siglec-3/CD33且缺乏譜系標誌物及HLA-DR，但CD14及CD15之異源表現表明存在多種子集。

MDSC由促炎性細胞激素誘生且發現在感染性及發炎性病理學病況中數目增加。其積聚在腫瘤負載小鼠之血液、骨髓及二級淋巴器官中，且其存在於腫瘤微環境中已提示在促進腫瘤相關免疫抑制方面具有主因作用。儘管現在顯然MDSC可充當預防腫瘤進展之靶標，但有必要進行進一步表徵以確定可抑制其之有效機制。

本發明提供一種藉由提供李氏菌疫苗來抑制抑制性細胞(諸如Treg及MDSC)之有效機制，該等李氏菌疫苗一旦投與腫瘤負載個體，即著手抑制Treg及MDSC功能， 由此允許抗腫瘤T細胞複製並抑制腫瘤生長。

在一個實施例中，本發明係關於一種在患有疾病之個體中或在該個體內之疾病部位中增加T浸潤性淋巴細胞/抑制性細胞比率的方法，該方法包含向該個體投與包含活減毒李氏菌疫苗株之組合物的步驟。

在另一實施例中，本發明係關於一種減小個體中疾病之抑制性細胞之百分比的方法，該方法包含向該個體投與活減毒李氏菌疫苗株之步驟。

本發明之其他特徵及優點將自以下詳細描述實例及圖式而變得顯而易見。然而，應瞭解在指示本發明之較佳實施例時，詳細描述及特定實例僅以說明的方式給出，此係因為熟習此項技術者根據此詳細描述將易於清楚在本發明之精神及範疇內的各種改變及修改。

以下圖式形成本說明書之一部分且被包括在內以進一步論證本發明之特定態樣，其中本發明可以藉由與本文呈現之特定實施例之詳細描述結合參考此等圖式中之一或多者而更好地理解。本專利或申請案文件含有至少一張彩色繪製之圖式。在請求並且支付必要費用後，本局將提供具有彩色圖式之本專利或專利申請公開案之複本。

圖1展示Lm-E7及Lm-LLO-E7使用不同表現系統來表現並分泌E7。Lm-E7藉由將基因卡匣引入單核球增多性李氏菌基因組之orfZ域中而產生(A)。hly啟動子驅動hly信號序列及LLO之前五個胺基酸(AA)繼而HPV-16 E7之表 現。B)，Lm-LLO-E7藉由用質體pGG-55轉型prfA-菌株XFL-7而產生。pGG-55具有驅動LLO-E7之非溶血性融合體之表現的hly啟動子。pGG-55亦含有prfA基因以在活體內選擇由XFL-7保留的質體。

圖2展示Lm-E7及Lm-LLO-E7分泌E7。Lm-Gag(泳道1)、Lm-E7(泳道2)、Lm-LLO-NP(泳道3)、Lm-LLO-E7(泳道4)、XFL-7(泳道5)及10403S(泳道6)在盧里亞-貝托尼培養液中在37℃下生長隔夜。使相等數目之細菌(如由OD在600nm下吸光度測定)沈澱，且使18ml各上清液經TCA沈澱。E7表現利用西方墨點法分析。墨點依序用抗E7單抗及HRP接合之抗小鼠(Amersham)進行探針探查，且接著使用ECL偵測試劑顯影。

圖3展示LLO-E7融合體之腫瘤免疫治療功效。展示在腫瘤接種後7、14、21、28及56天時小鼠中之腫瘤大小(以毫米為單位)。未處理小鼠：空心圓形；Lm-LLO-E7：填充之圓形；Lm-E7：正方形；Lm-Gag：空心菱形；及Lm-LLO-NP：填充之三角形。

圖4展示來自經Lm-LLO-E7免疫接種之小鼠之脾細胞在暴露於TC-1細胞時增殖。C57BL/6小鼠用Lm-LLO-E7、Lm-E7或對照rLm菌株免疫接種並加強。脾細胞在加強後6天收集且以所示比率與經輻射TC-1細胞一起塗。細胞用³H胸苷脈衝且收集。Cpm定義為(實驗性cpm)-(無TC-1對照)。

圖5展示(A)西方墨點，其展示Lm-ActA-E7分泌E7。泳道1：Lm-LLO-E7；泳道2：Lm-ActA-F7.001； 泳道3；Lm-ActA-E7-2.5.3；泳道4：Lm-ActA-E7-2.5.4。(B)投與Lm-ActA-E7(長方形)、Lm-E7(橢圓形)、Lm-LLO-E7(X)之小鼠及未處理小鼠(未經疫苗接種；實心三角形)中之腫瘤大小。

圖6展示(A)用於建立4種LM疫苗之質體插入物之示意性表示。Lm-LLO-E7插入物含有所有所用的李氏菌基因。其含有hly啟動子、hly基因之前1.3kb(其編碼蛋白質LLO)及HPV-16 E7基因。hly之前1.3kb包括信號序列(ss)及PEST區。Lm-PEST-E7包括hly啟動子、信號序列及PEST及E7序列但不包括截短型LLO基因之剩餘部分。Lm-△PEST-E7不包括PEST區，但含有hly啟動子、信號序列、E7及截短型LLO之剩餘部分。Lm-E7epi僅具有hly啟動子、信號序列及E7。(B)上圖：含有PEST區之李氏菌構築體誘導腫瘤消退。下圖：在2次獨立實驗中在腫瘤攻擊後第28天的平均腫瘤大小。(C)含有PEST區之李氏菌構築體誘導脾臟中較高百分比之E7特異性淋巴細胞。描繪來自3次實驗之資料之平均值及SE。

圖7展示(A)在投與TC-1腫瘤細胞且隨後投與Lm-E7、Lm-LLO-E7、Lm-ActA-E7或無疫苗(未處理)之小鼠中，脾臟中E7特異性分泌IFN-γ之CD8⁺ T細胞之誘導及滲入腫瘤的數目。(B)針對(A)所述之小鼠之脾臟及腫瘤中E7特異性CD8⁺細胞之誘導及滲入。

圖8展示含有PEST區之李氏菌構築體誘導腫瘤內較高百分比之E7特異性淋巴細胞。(A)來自1次實驗之代表性資料。(B)來自所有3次實驗之資料之平均值及SF。

圖9展示大腸桿菌-李氏菌穿梭質體pGG55(上方)及pTV3(下方)之示意圖。CAT(-)：大腸桿菌氯黴素轉移酶；CAT(+)：李氏菌氯黴素轉移酶；Ori Lm：李氏菌之複製起點；Ori Ec：大腸桿菌之p15複製起點；prfA：李氏菌病原性調節因子A；LLO：C端截短型李氏溶血素O，包括其啟動子；E7：HPV E7；p60-dal；p60啟動子及李氏菌dal基因之表現卡匣。亦描繪所選擇之限制性位點。

圖10展示呈現李氏菌株EGD之基因組上inlC區之上游及下游的DNA序列(SEQ ID NO：81)。DNA-上(紅色)、inlC基因(藍色)及DNA-下(黑色)。

圖11展示選殖於溫度敏感性質體pKSV7中以建立inl C缺失突變體之DNA序列(SEQ ID NO：82)。用於選殖此等區域之限制酶位點以caps指示且加下劃線。GAATTC-EcoRI，GGATCC-BamHI及CTGCAg-PstI。將EcoRI-PstI插入物選殖於載體pKSV7中。

圖12展示Lm-dd及Lm-ddD actA菌株之示意性表示。凝膠展示使用利用菌株Lm-dd及Lm-dd△actA之染色體DNA作為模板獲得之寡聚物之1/2及寡聚物之3/4的PCR產物大小。

圖13展示呈現李氏菌染色體中actA基因之上游及下游之DNA序列(SEQ ID NO：83)。呈斜體形式之區域含有Lmdd△actA菌株中存在之剩餘actA序列元件。加下劃線序列gtcgac代表XhoI之限制性位點，其為actA之N-T與C-T區之間的接合點。

圖14描繪回應於投與LM疫苗株之腫瘤消退 (A)。圓形代表未處理小鼠，倒轉三角形代表投與Lmdd-TV3之小鼠，且十字代表投與Lm-LLOE7之小鼠。

圖15展示(A)pAdv164之質體圖，其具有在組成性李氏菌p60啟動子之控制下的枯草桿菌dal基因以用於補充LmddA菌株中染色體dal-dat缺失。其亦含有截短型LLO_(1-441)與嵌合人類Her2/neu基因之融合體，其藉由3個片段Her2/neu：EC1(aa 40-170)、EC2(aa 359-518)及ICI(aa 679-808)之直接融合而構築。(B)藉由用抗LLO抗體墨點處理之經TCA沈澱細胞培養上清液之西方墨點分析在Lm-LLO-ChHer2(Lm-LLO-138)及LmddA-LLO-ChHer2(ADXS31-164)中偵測tLLO-ChHer2之表現及分泌。約104KD之差異條帶對應於tLLO-ChHer2。內源性LLO偵測為58KD條帶。李氏菌對照缺乏ChHer2表現。

圖16(A)使用NT-2細胞作為刺激劑及3T3/neu細胞作為目標，測試來自經免疫接種之小鼠之脾細胞中由基於Her2/neu李氏菌之疫苗誘發的細胞毒性T細胞反應。Lm-對照係基於在各方面相同但表現不相關抗原(HPV16-E7)之LmddA背景。(B)活體外在經絲裂黴素C處理之NT-2細胞情況下刺激24小時後，由來自經免疫接種之FVB/N小鼠之脾細胞分泌至細胞培養基中的IFN-γ，由ELISA量測。(C)回應於在活體外與來自蛋白質之不同區域之肽一起培育，由來自經嵌合疫苗免疫接種之HLA-A2轉殖基因小鼠之脾細胞分泌的IFN-γ。重組ChHer2蛋白質用作陽性對照，且不相關肽或無肽組構成陰性對照，如圖例中所列。IFN-γ分泌使用在共培育72小時後收集之細胞培養上清液藉由ELISA分析進行偵 測。各資料點為一式三份資料之平均值+/-標準誤差。*P值<0.001。

圖17表示來自用各重組李氏菌-ChHer2或對照李氏菌疫苗注射六次之Her2/neu轉殖基因小鼠的結果。免疫接種在6週齡開始，且每三週繼續，直至第21週為止。每週監測腫瘤之出現且表示為無腫瘤小鼠之百分比。*p<0.05，N=每組9個。

圖18展示FVB/N小鼠用1×10⁶個NT-2細胞皮下接種且以一週間隔用各疫苗免疫接種三次。第二次免疫接種後7天收集脾臟。分離免疫細胞後，將其染色以利用抗CD3、CD4、CD25及FoxP3抗體偵測Treg。來自代表性實驗之Treg之點圖展示CD25⁺/FoxP3⁺ T細胞之頻率，表示為在不同處理組中總CD3⁺或CD3⁺CD4⁺ T細胞之百分比。

圖19展示FVB/N小鼠用1×10⁶個NT-2細胞皮下接種且以一週間隔用各疫苗免疫接種三次。第二次免疫接種後7天收集腫瘤。分離免疫細胞後，將其染色以利用抗CD3、CD4、CD25及FoxP3抗體偵測Treg。(A).來自代表性實驗之Treg之點圖。(B).CD25⁺/FoxP3⁺ T細胞之頻率，表示為在不同處理組中總CD3⁺或CD3⁺CD4⁺ T細胞之百分比(左圖)及腫瘤內CD8/Treg比率(右圖)。資料顯示為自2次獨立實驗獲得之平均值±SEM。

圖20展示pAdv134質體及雙質體之示意性表示。指示將用於選殖抗原1(Xho I及SpeI)及抗原2(XbaI及SacI或BglII)基因之限制性位點。黑色箭頭表示轉錄方向。p15 ori及RepR係指李氏菌及大腸桿菌複製起點。tLLO 為截短型李氏溶血素O蛋白質(1-441 aa)，且tActA為截短型ActA(1-233 aa)蛋白質。桿菌-dal基因編碼D-丙胺酸消旋酶，其補充Lm△dal dat菌株中D-丙胺酸之合成。

圖21展示腫瘤中MDSC及Treg減少。Lm疫苗接種(LmddAPSA及LmddAE7)之後MDSC(右手圖)及Treg(左手圖)之數目。

圖22展示抑制因子分析資料，其展示在李氏菌疫苗接種之後來自TPSA23腫瘤之單核細胞性MDSC具較小抑制性。MDSC抑制能力之此變化並非抗原特異性的，因為在PSA抗原特異性T細胞情況下以及在非特異性刺激之T細胞情況下看到同樣的抑制減小。無MDSC組展示反應者T細胞在其保持未受刺激時缺乏分裂，且最後一組展示在未添加MDSC抑制分裂之情況下經刺激之細胞的分裂。左手圖展示各組之個別細胞分裂週期。右手圖展示彙集之分裂週期。

圖23展示抑制因子分析資料，其展示李氏菌對脾臟單核細胞性MDSC無影響且其僅以抗原特異性方式具抑制性。無MDSC組展示反應者T細胞在其保持未受刺激時缺乏分裂，且最後一組展示在未添加MDSC抑制分裂之情況下經刺激之細胞的分裂。左手圖展示各組之個別細胞分裂週期。右手圖展示彙集之分裂週期。

圖24展示抑制因子分析資料，其展示來自腫瘤之顆粒球性MDSC在李氏菌疫苗接種之後抑制T細胞之能力減小。MDSC抑制能力之此變化並非抗原特異性的，因為在PSA抗原特異性T細胞情況下以及在非特異性刺激之T細胞情況下看到同樣的抑制減小。無MDSC組展示反應者T細胞 在其保持未受刺激時缺乏分裂，且最後一組展示在未添加MDSC抑制分裂之情況下經刺激之細胞的分裂。左手圖展示各組之個別細胞分裂週期。右手圖展示彙集之分裂週期。

圖25展示抑制因子分析資料，其展示李氏菌對脾臟顆粒球性MDSC無影響且其僅以抗原特異性方式具抑制性。無MDSC組展示反應者T細胞在其保持未受刺激時缺乏分裂，且最後一組展示在未添加MDSC抑制分裂之情況下經刺激之細胞的分裂。左手圖展示各組之個別細胞分裂週期。右手圖展示彙集之分裂週期。

圖26展示抑制因子分析資料，其展示來自腫瘤之Treg仍具抑制性。在此腫瘤模型中，Treg之抑制能力以非抗原特異性方式略微減小。無Treg組展示反應者T細胞在其保持未受刺激時缺乏分裂，且最後一組展示在未添加Treg抑制分裂之情況下經刺激之細胞的分裂。左手圖展示各組之個別細胞分裂週期。右手圖展示彙集之分裂週期。

圖27展示抑制因子分析資料，其展示脾臟Treg仍具抑制性。無Treg組展示反應者T細胞在其保持未受刺激時缺乏分裂，且最後一組展示在未添加Treg抑制分裂之情況下經刺激之細胞的分裂。左手圖展示各組之個別細胞分裂週期。右手圖展示彙集之分裂週期。

圖28展示抑制因子分析資料，其展示習知CD4+ T細胞對細胞分裂無影響，與其是否見於小鼠之腫瘤或脾臟中無關。左手及右手圖展示彙集之分裂週期。

圖29展示抑制因子分析資料，其展示來自4T1腫瘤之單核細胞性MDSC在李氏菌疫苗接種之後抑制能力減 小。MDSC抑制能力之此變化並非抗原特異性的，因為在Her2/neu-抗原特異性T細胞情況下以及在非特異性刺激之T細胞情況下看到同樣的抑制減小。無MDSC組展示反應者T細胞在其保持未受刺激時缺乏分裂，且最後一組展示在未添加MDSC抑制分裂之情況下經刺激之細胞的分裂。左手圖展示各組之個別細胞分裂週期。右手圖展示彙集之分裂週期。

圖30展示抑制因子分析資料，其展示對脾臟單核細胞性MDSC不存在李氏菌特異性作用。無MDSC組展示反應者T細胞在其保持未受刺激時缺乏分裂，且最後一組展示在未添加MDSC抑制分裂之情況下經刺激之細胞的分裂。左手圖展示各組之個別細胞分裂週期。右手圖展示彙集之分裂週期。

圖31展示抑制因子分析資料，其展示來自4T1腫瘤之顆粒球性MDSC在李氏菌疫苗接種之後抑制能力減小。MDSC抑制能力之此變化並非抗原特異性的，因為在Her2/neu-抗原特異性T細胞情況下以及在非特異性刺激之T細胞情況下看到同樣的抑制減小。無MDSC組展示反應者T細胞在其保持未受刺激時缺乏分裂，且最後一組展示在未添加MDSC抑制分裂之情況下經刺激之細胞的分裂。左手圖展示各組之個別細胞分裂週期。右手圖展示彙集之分裂週期。

圖32展示抑制因子分析資料，其展示對脾臟顆粒球性MDSC不存在李氏菌特異性作用。無MDSC組展示反應者T細胞在其保持未受刺激時缺乏分裂，且最後一組展示在未添加MDSC抑制分裂之情況下經刺激之細胞的分裂。左手圖展示各組之個別細胞分裂週期。右手圖展示彙集之分裂 週期。

圖33展示抑制因子分析資料，其展示來自4T1腫瘤之Treg在李氏菌疫苗接種之後抑制能力減小。此減小並非抗原特異性的，因為在Her2/neu-特異性及非特異性反應者T細胞兩種情況下看到Treg抑制能力之變化。左手圖展示各組之個別細胞分裂週期。右手圖展示彙集之分裂週期。

圖34展示抑制因子分析資料，其展示對脾臟Treg不存在李氏菌特異性作用。反應者T細胞均能夠分裂，與其是否為抗原特異性的無關。左手圖展示各組之個別細胞分裂週期。右手圖展示彙集之分裂週期。

圖35展示抑制因子分析資料，其展示顆粒球性MDSC之抑制能力係由於tLLO之過度表現且與搭配的融合體抗原無關(A-D)。左手圖展示各組之個別細胞分裂週期。右手圖展示彙集之分裂週期。

圖36展示抑制因子分析資料，其亦展示單核細胞性MDSC之抑制能力係由於tLLO之過度表現且與搭配的融合體抗原無關(A-D)。左手圖展示各組之個別細胞分裂週期。右手圖展示彙集之分裂週期。

圖37展示抑制因子分析資料，其展示自脾臟純化之顆粒球性MDSC保持其在Lm疫苗接種之後抑制抗原特異性反應者T細胞之分裂的能力(A、B)。然而，在非特異性刺激之後，活化T細胞(在PMA/離子黴素情況下)仍然能夠分裂(C、D)。左手圖展示各組之個別細胞分裂週期。右手圖展示彙集之分裂週期。

圖38展示抑制因子分析資料，其展示自脾臟純 化之單核細胞性MDSC保持其在Lm疫苗接種之後抑制抗原特異性反應者T細胞之分裂的能力(A、B)。然而，在非特異性活化(利用PMA/離子黴素刺激)之後，T細胞仍然能夠分裂(C、D)。左手圖展示各組之個別細胞分裂週期。右手圖展示彙集之分裂週期。

圖39展示抑制因子分析資料，其展示自經Lm處理之組中之任一者的腫瘤純化之Treg抑制反應者T細胞分裂之能力略微減小，與反應者細胞是否經抗原特異性(A、B)或非特異性(C、D)活化無關。左手圖展示各組之個別細胞分裂週期。右手圖展示彙集之分裂週期。

圖40展示抑制因子分析資料，其展示自脾臟純化之Treg仍然能夠抑制經抗原特異性(A、B)及非特異性(C、D)活化之反應者T細胞兩者的分裂。

圖41展示抑制因子分析資料，其展示腫瘤Tcon細胞不能抑制T細胞分裂，與反應者細胞是否經抗原特異性(A、B)或非特異性活化(C、D)無關。

圖42展示抑制因子分析資料，其展示脾臟Tcon細胞不能抑制T細胞分裂，與反應者細胞是否經抗原特異性(A、B)或非特異性活化(C、D)無關。

在一個實施例中，本文提供一種在患有疾病之個體中或在該個體內之疾病部位中增加浸潤性T淋巴細胞/抑制性細胞比率的方法。在另一實施例中，本文提供一種在患有疾病之個體中或在該個體內之疾病部位中增加CD8+ T細胞/抑制性細胞之比率的方法。在另一實施例中，增加浸潤性T 淋巴細胞/抑制性細胞或CD8+ T細胞/抑制性細胞比率之方法包含向個體投與包含本發明之活減毒李氏菌或重組李氏菌株之組合物的步驟。

在一個實施例中，本文提供一種在患有疾病之個體中或在該個體內之疾病部位中增加浸潤性T淋巴細胞/T調節性細胞比率的方法。在另一實施例中，本文提供一種在患有疾病之個體中或在該個體內之疾病部位中增加CD8+ T細胞/T調節性細胞之比率的方法。在另一實施例中，增加浸潤性T淋巴細胞/T調節性細胞或CD8+ T細胞/T調節性細胞比率之方法包含向個體投與包含本發明之活減毒李氏菌或重組李氏菌株之組合物的步驟。

在一個實施例中，本文提供一種在患有疾病之個體中或在該個體內之疾病部位中增加浸潤性T淋巴細胞/骨髓來源抑制性細胞(MDSC)比率的方法。在另一實施例中，本文提供一種在患有疾病之個體中或在該個體內之疾病部位中增加CD8+ T細胞/骨髓來源抑制性細胞(MDSC)之比率的方法。在另一實施例中，增加浸潤性T淋巴細胞/骨髓來源抑制性細胞(MDSC)或CD8+ T細胞/骨髓來源抑制性細胞(MDSC)比率之方法包含向個體投與包含本發明之活減毒李氏菌或重組李氏菌株之組合物的步驟。

在一個實施例中，浸潤性T淋巴細胞為腫瘤浸潤性T淋巴細胞(TIL)。

在一個實施例中，本文提供一種減少會抑制對抗疾病之免疫反應之細胞之量的方法。在另一實施例中，抑制免疫反應之細胞為抑制性細胞。在另一實施例中，抑制性細 胞為骨髓來源抑制性細胞(MDSC)。在另一實施例中，抑制性細胞為T調節性細胞(Treg)。

人類MDSC中之常見血漿標誌物包括CD33、CD11b、CD15、CD14陰性、MHC II類陰性、HLA DR^低或-。常見細胞內標誌物包括精胺酸酶及iNOS。另外，人類MDSC之抑制性活性或機制包括使用氧化氮(NO)、精胺酸酶或硝基酪胺酸。在小鼠中，骨髓來源抑制性細胞(MDSC)為CD11b及Gr-1雙陽性，且亦已描述為F4/80^中、CD11c^低、MHCII-/^低、Ly6C+。具有免疫抑制能力之CD11b+/Gr-1+細胞已描述為產生IFN-g。MDSC亦可為單核細胞性及顆粒球性。

在一個實施例中，腫瘤MDSC可出乎意料地抑制抗原特異性及非特異性T細胞功能之功能兩者，而脾臟MDSC僅可抑制抗原特異性T細胞之功能。如以下實例中所展示(參見實例17-20)，本文提供之活減毒李氏菌減小疾病中抑制性細胞與疾病部位(例如腫瘤部位)處腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之群體相比的百分比。

Lm或人類上皮Caco-2細胞中LLO之亞溶解劑量誘導IL-6之表現，IL-6減少細菌細胞內生長且引起誘導型氧化氮合成酶(NOS)之過度表現。氧化氮似乎為對Lm之先天性免疫反應之必需組分，在嗜中性白血球及巨噬細胞之殺李氏菌活性方面具有重要作用，且缺乏誘導型NO合成酶(iNOS)會引起對Lm感染之易感性。

Lm感染亦引起穩固MHC 2類限制性CD4⁺ T細胞反應產生，且使CD4⁺ T細胞之表型漂移成Th-1。另外，產生及維持對抗Lm之功能性CD8⁺ T細胞記憶需要CD4⁺ T細 胞幫助。此外，已報導使小鼠腹膜內感染Lm引起腹膜腔中與IL-17分泌相關之CD4⁺ T_γδ細胞之局部誘生，然而在此等注射之後未在脾臟或淋巴結T細胞群體中觀察到變化。另外，李氏菌感染亦涉及其他系統，該等其他系統本質上並非免疫系統之一部分，但支持免疫功能從而影響治療結果，諸如骨髓形成及血管內皮細胞功能。

經Lm感染之巨噬細胞產生TNF-α、IL-18及IL-12，所有該等因子在誘導IFN-γ產生及Lm在吞噬體中之後續殺死及降解方面均很重要。IL-12不足引起對李氏菌症之易感性增加，此可經由投與IFN-γ來逆轉。NK細胞在早期感染時為IFN-γ之主要來源。在再感染時，記憶CD8⁺ T細胞能夠在不存在同源抗原下響應於IL-12及IL-18產生IFN-γ。CD8⁺ T細胞與巨噬細胞及Lm共定位於脾臟之T細胞區域中，在該區域中其不依賴於抗原產生IFN-γ。CD8⁺ T細胞產生IFN-γ部分依賴於LLO之表現。

IFN-γ在利用基於Lm之疫苗獲得之抗腫瘤反應中起重要作用。儘管起初由NK細胞產生，但IFN-γ含量隨後由CD4⁺ T輔助細胞維持較長時間。Lm疫苗需要IFN-γ以達成有效腫瘤消退，且IFN-γ特別為淋巴細胞之腫瘤浸潤所需。IFN-γ亦在疫苗接種後之早期效應期抑制腫瘤部位處之血管生成。

在一個實施例中，LLO能夠誘導後生修飾影響DNA表現之控制。細胞外LLO在李氏菌感染之早期誘導組織蛋白H3之脫磷酸作用及組織蛋白H4之類似脫乙醯作用。此後生效應引起涉及免疫功能之某些基因之轉錄減少，由此提 供LLO可根據其調節為免疫反應所需之基因產物之表現的機制。在另一實施例中，LLO之另一基因組效應為其能夠增加與ICAM及E-選擇蛋白之表現以及IL-8及MCP-1之分泌相關之NF-κβ易位。在另一實施例中，受LLO影響之另一信號傳導級聯為有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)路徑，引起跨越細胞膜之Ca²⁺流入增加，此促進李氏菌進入內皮細胞及其後續感染。

在一個實施例中，LLO為對先天性及應變性免疫反應重要之發炎性細胞激素(諸如IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、TNF-α及IFN-γ、GM-CSF以及NO)、趨化因子及共刺激分子的強力誘導物。在一個實施例中，巨噬細胞在LLO存在下釋放IL-1α、TNF-α、IL-12及IL-18，IL-1α、TNF-α、IL-12及IL-18又活化NK細胞從而釋放IFN-γ，引起巨噬細胞活化增強。

在一個實施例中，由細胞溶質Lm分泌之LLO使巨噬細胞中特定基因上調，引起顯著的IFN-γ轉錄及分泌。在另一實施例中，細胞溶質LLO在無NF-KB及MAPK之可偵測活化情況下不依賴於Toll樣受體(TLR)活化對侵入性Lm之強力I型干擾素反應。

在一個實施例中，本文提供之李氏菌(Lm)疫苗株減小疾病部位處Treg及MDSC之百分比，且疾病部位處效應細胞與抑制性細胞之比率相應偏移。在另一實施例中，本文提供之Lm疫苗適用於藉由減小個體中特定疾病部位處Treg及MDSC之百分比及MDSC之絕對數目來改進免疫反應。該部位可為因過敏、創傷、感染、疾病所致之發炎部位， 或該部位可為腫瘤部位。

在另一實施例中，自經李氏菌處理之小鼠之腫瘤中純化的單核細胞及顆粒球MDSC與自未經處理之小鼠之腫瘤純化的MDSC相比均較不能抑制CD8+ T細胞的分裂，而自此等相同腫瘤負載小鼠之脾臟純化的單核細胞及顆粒球MDSC在經李氏菌疫苗接種之後在其功能方面未展示變化(參見本文中實例17-20)。在一個實施例中，看到此作用係因為脾臟MDSC僅以抗原特異性方式呈抑制性。因此，用李氏菌治療具有其允許腫瘤抑制性細胞(諸如Treg及MDSC)之腫瘤特異性抑制的獨特優點。由本文提供之方法及組合物之活減毒李氏菌提供的另一出乎意外的優點在於，腫瘤中存在較低量之Treg及持續損失抑制T細胞複製之能力的Treg。

在另一實施例中，自經表現截短型LLO之李氏菌處理之小鼠之腫瘤中純化的單核細胞及顆粒球MDSC與自未經處理小鼠之腫瘤純化的MDSC相比均較不能抑制CD8+ T細胞的分裂，而自此等相同腫瘤負載小鼠之脾臟純化的單核細胞及顆粒球MDSC在經表現截短型LLO之李氏菌疫苗接種之後在其功能方面未展示變化(參見本文中實例21)。在一個實施例中，看到此作用係因為脾臟MDSC僅以抗原特異性方式呈抑制性。因此，用表現截短型LLO之李氏菌治療具有其允許腫瘤抑制性細胞(諸如Treg及MDSC)之腫瘤特異性抑制的獨特優點。由本文提供之方法及組合物之表現截短型LLO之活減毒李氏菌提供的另一出乎意外的優點在於，腫瘤中存在較低量之Treg及MDSC以及持續損失抑制T細胞複製之能力的Treg及MDSC，且甚至在不存在LLO融合搭配物(諸 如異源抗原)下亦觀察到此作用。

在另一實施例中，投與表現截短型LLO之活減毒李氏菌疫苗藉由抑制Treg介導及MDSC介導之T細胞抑制來增強抗腫瘤T細胞反應(參見本文中實例21)。

在一個實施例中，本文提供一種減小個體之疾病部位中抑制性細胞之百分比的方法，該方法包含向該個體投與活減毒李氏菌疫苗株之步驟。

在另一實施例中，本文提供一種降低抑制性細胞在個體之疾病部位中抑制T細胞複製之能力的方法，該方法包含向該個體投與活減毒李氏菌疫苗株之步驟。

在一個實施例中，減少疾病部位處抑制性細胞之數目有效地治療疾病。在另一實施例中，減少疾病部位處抑制性細胞之數目使在疾病部位處患有疾病之個體之抗疾病免疫反應增強。在另一實施例中，免疫反應為細胞介導之免疫反應。在另一實施例中，免疫反應為腫瘤浸潤性T淋巴細胞(TIL)免疫反應。

在一個實施例中，本文提供一種減小個體中疾病之抑制性細胞之百分比以及增強個體中對抗疾病之治療反應的方法，該方法包含向個體投與活減毒李氏菌疫苗株之步驟，由此減小疾病中抑制性細胞之百分比且增強個體中對抗疾病之治療反應。

在另一實施例中，本文提供一種降低抑制性細胞在個體中疾病之抑制T細胞複製之能力以及增強個體中對抗疾病之治療反應的方法，該方法包含向個體投與活減毒李氏菌疫苗株之步驟。

在一個實施例中，本文提供一種減少個體中疾病之骨髓來源抑制性細胞之數目的方法，該方法包含向該個體投與活減毒李氏菌疫苗株之步驟。

在一個實施例中，術語「減小百分比」表示如在分析中或在免疫反應中存在於疾病部位處之抑制性細胞(Treg或MDSC)之量相對於T浸潤性細胞之存在減少或減小。

在另一實施例中，術語「減少數目」係指抑制性細胞(Treg或MDSC)之絕對數目已因投與本文提供之活減毒李氏菌或實現類似作用之其他試劑(亦描述於本文中其他地方)而減少或減小。

在一個實施例中，本文提供之抑制性細胞為T調節性細胞(Treg)。在另一實施例中，抑制性細胞為骨髓來源抑制性細胞(MDSC)。

在另一實施例中，本文提供之活減毒李氏菌包含重組核酸序列，該重組核酸序列包含各自編碼第一及至少第二多肽之第一及至少第二開放閱讀框架，其中該第一及該第二多肽各自包含融合至內源性含PEST之多肽之異源抗原或其功能片段。

在一個實施例中，本文提供之異源抗原或其功能片段以及內源性含PEST之多肽在單一開放閱讀框架中轉譯。在另一實施例中，本文提供之各異源抗原多肽及內源性含PEST之多肽在分別轉譯之後融合。

在另一實施例中，本文提供之重組核酸進一步包含編碼第三多肽之第三開放閱讀框架，其中該第三多肽包含融合至內源性含PEST之多肽之異源抗原或其功能片段。

在另一實施例中，含PEST之多肽為N端截短型LLO多肽、N端ActA多肽、或PEST肽或其功能片段。

在另一實施例中，第一、第二或第三異源抗原或其功能片段係由感染性病原體或腫瘤細胞表現或自感染性病原體或腫瘤細胞獲得。

在一個實施例中，第一、第二或第三抗原與和癌症之發展或轉移進一步相關之局部組織環境相關，或與腫瘤脫逃或對癌症之抗性相關，或為血管生成抗原。

在另一實施例中，異源抗原為在宿主中引起過敏性、發炎性反應之過敏原。

在另一實施例中，本文提供之疾病為局部化疾病(亦即侷限於特定疾病部位)或為全身性疾病。

在另一實施例中，疾病為感染性疾病、呼吸性或發炎性疾病、或癌症或腫瘤。

在另一實施例中，感染性疾病為由(但不限於)以下病原體中之任一者引起的感染性疾病：BCG/結核病、瘧疾、惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、三日瘧原蟲(plasmodium malariae)、間日瘧原蟲(plasmodium vivax)、輪狀病毒、霍亂、白喉-破傷風、百日咳、流感嗜血桿菌、B型肝炎、人類乳頭狀瘤病毒、季節性流感、大流行性A型流感(H1N1)、麻疹及風疹、流行性腮腺炎、腦膜炎雙球菌A+C、單價、二價及三價口服脊髓灰質炎疫苗、肺炎球菌、狂犬病、破傷風類毒素、黃熱病、炭疽桿菌(Bacillus anthracis；炭疽)、肉毒桿菌毒素(Clostridium botulinum toxin；肉毒中毒)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis；鼠疫)、重型天花(Variola major；天花)及其他相關痘瘡病毒、野兔熱弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis；野免熱)、病毒性出血熱、沙粒病毒(LCM、胡寧病毒(Junin virus)、馬秋波病毒(Machupo virus)、瓜納里托病毒(Guanarito virus)、賴薩熱(Lassa Fever)、布尼亞病毒(Bunyaviruses)(漢坦病毒(Hantaviruses)、裂谷熱(Rift Valley Fever))、黃病毒(登革熱)、絲狀病毒(埃博拉病毒(Ebola)、馬爾堡病毒(Marburg))、類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderia pseudomallei)、貝納特氏立克次體(Coxiella burnetii；Q熱)、布氏桿菌種(Brucella species/brucellosis)、鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia mallei；鼻疽)、鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci；鸚鵡熱)、蓖麻毒素(來自蓖麻(Ricinus communis))、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)之ε毒素、葡萄球菌腸毒素B(Staphylococcus enterotoxin B)、斑疹傷寒(Typhus fever；普氏立克次氏體(Rickettsia prowazekii))、其他立克次氏體(Rickettsias)、食物及水媒病原體、細菌(致瀉性大腸桿菌(Diarrheagenic E.coli)、病原性弧菌(Pathogenic Vibrios)、志賀菌種(Shigella species)、沙門氏菌BCG/、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica))、病毒(杯狀病毒(Caliciviruses)、A型肝炎、西尼羅河病毒(West Nile Virus)、拉克羅斯病毒(LaCrosse)、加利福尼亞腦炎(California encephalitis)、VEE、EEE、WEE、日本腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)、科薩努爾森林病毒(Kyasanur Forest Virus)、尼帕病毒(Nipah virus)、漢坦病毒(hantaviruses)、蜱傳出血熱病毒、切昆貢亞熱病毒 (Chikungunya virus)、克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo Hemorrhagic fever virus)、蜱傳腦炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、疱疹單純型病毒(HSV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)、人類乳突狀瘤病毒(HPV))、原蟲(小球隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)、卡晏環孢子球蟲(Cyclospora cayatanensis)、腸蘭伯式鞭毛蟲(Giardia lamblia)、痢疾內阿米巴(Entamoeba histolytica)、弓形蟲(Toxoplasma))、真菌(小孢子蟲目(Microsporidia))、黃熱病、結核病(包括耐藥TB)、狂犬病、朊病毒、重度急性呼吸性症候群相關之冠狀病毒(SARS-CoV)、Coccidioides posadasii、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、細菌性陰道病、沙眼衣原體、細胞巨大病毒、性病性肉芽腫、杜氏嗜血桿菌(Hemophilus ducreyi)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhea)、蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)、陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)或本文中未列出之此項技術中已知之任何其他感染性疾病。

在另一實施例中，感染性疾病為家畜感染性疾病。在另一實施例中，家畜疾病可傳染給人且稱作「人畜共通疾病(zoonotic disease)」。在另一實施例中，此等疾病包括(但不限於)口蹄疫(Foot and mouth disease)、西尼羅河病毒、狂犬病、犬小病毒(canine parvovirus)、貓白血病毒(feline leukemia virus)、馬流感病毒(equine influenza virus)、牛傳染性鼻氣管炎(infectious bovine rhinotracheitis；IBR)、假性狂犬病(pseudorabies)、經典豬瘟(classical swine fever；CSF)、由牛之牛疱疹病毒1型(BHV-1)感染引起之IBR， 及豬之假性狂犬病(奧耶斯基氏病(Aujeszky's disease))、弓蟲病、炭疽、水泡性口炎病毒、馬紅球菌(rhodococcus equi)、野免熱、鼠疫(鼠疫耶爾森氏菌)、毛滴蟲。

在另一實施例中，呼吸性或發炎性疾病為哮喘。.

活減毒李氏菌株能夠在不共同投與其他治療劑(諸如抗發炎劑或支氣管擴張劑)之情況下減輕哮喘症狀。在另一實施例中，本文提供之方法另外包含向個體共同投與活減毒李氏菌株及一或多種治療劑之步驟。在另一實施例中，治療劑為抗哮喘劑。在另一實施例中，藥劑為抗發炎劑、非類固醇抗發炎劑、抗生素、抗膽鹼激導性劑、支氣管擴張劑、皮質類固醇、短效β促效劑、長效β促效劑、組合吸入劑、抗組織胺劑或其組合。

在另一實施例中，本發明醫藥組合物可含有活減毒李氏菌株及共同投與之治療劑兩者。活減毒李氏菌株及共同投與之治療劑亦可在不同醫藥組合物中。

在另一實施例中，藥劑包括吸入式皮質類固醇，其包括氟替卡松(fluticasone；Flovent Diskus、Flovent HFA)、布地奈德(budesonide；Pulmicort Flexhaler)、莫美他松(mometasone；Asmanex)、氟尼縮松(flunisolide；Aerobid)、倍氯米松(beclomethasone；Qvar)及其他藥劑。其為最常見的處方型長期哮喘藥物。不同於口服皮質類固醇，此等皮質類固醇藥物具有相對較低之副作用風險且對於長期使用而言通常為安全的。

藥劑可為白三烯調節劑。此等口服藥物包括孟魯司特(montelukast；Singulair)、紮魯司特(zafirlukast； Accolate)及齊留通(zileuton；Zyflo,Zyflo CR)。其有助於預防哮喘症狀持續至多24小時。

此外，藥劑可為長效β促效劑(LABA)。此等吸入式藥物包括沙美特羅(salmeterol；Serevent Diskus)及福莫特羅(formoterol；Foradil Aerolizer)。LABA使氣管開放且減少發炎。然而，其已與重度哮喘攻擊有聯繫。LABA應僅與吸入式皮質類固醇組合服用。

在一個實施例中，利用本發明方法治療之癌症為乳癌。在另一實施例中，癌症為宮頸癌。在另一實施例中，癌症為含Her2之癌症。在另一實施例中，癌症為黑色素瘤。在另一實施例中，癌症為胰臟癌。在另一實施例中，癌症為卵巢癌。在另一實施例中，癌症為胃癌。在另一實施例中，癌症為胰臟之癌性病變。在另一實施例中，癌症為肺腺癌。在另一實施例中，其為多形性膠質母細胞瘤。在另一實施例中，其為缺氧性實性腫瘤。在另一實施例中，癌症為結腸直腸腺癌。在另一實施例中，癌症為肺鱗腺癌。在另一實施例中，癌症為胃腺癌。在另一實施例中，癌症為卵巢表面上皮贅生物(例如其良性、增生性或惡性變種)。在另一實施例中，癌症為口腔鱗狀細胞癌。在另一實施例中，癌症為非小細胞肺癌。在另一實施例中，癌症為子宮內膜癌。在另一實施例中，癌症為膀胱癌。在另一實施例中，癌症為頭部及頸部癌症。在另一實施例中，癌症為前列腺癌。各可能性代表本發明之各別實施例。

在一個實施例中，本文提供之異源抗原為HPV-E7。在另一實施例中，抗原為HPV-E6。在另一實施例中， 抗原為Her-2/neu。在另一實施例中，抗原為NY-ESO-1。在另一實施例中，抗原為端粒酶(TERT)。在另一實施例中，抗原為SCCE。在另一實施例中，抗原為CEA。在另一實施例中，抗原為LMP-1。在另一實施例中，抗原為p53。在另一實施例中，抗原為碳酸酐酶IX(CAIX)。在另一實施例中，抗原為PSMA。在另一實施例中，抗原為前列腺幹細胞抗原(PSCA)。在另一實施例中，抗原為HMW-MAA。在另一實施例中，抗原為WT-1。在另一實施例中，抗原為HIV-1 Gag。在另一實施例中，抗原為蛋白酶3。在另一實施例中，抗原為酪胺酸酶相關蛋白2。在另一實施例中，抗原為PSA(前列腺特異性抗原)。在另一實施例中，抗原係選自HPV-E7、HPV-E6、Her-2、NY-ESO-1、端粒酶(TERT)、SCCE、HMW-MAA、WT-1、HIV-1Gag、CEA、LMP-1、p53、PSMA、PSCA、蛋白酶3、酪胺酸酶相關蛋白2、Muc1、PSA(前列腺特異性抗原)或其組合。

在另一實施例中，本文提供之異源抗原為腫瘤相關抗原，其在一個實施例中為以下腫瘤抗原中之一者：MAGE(黑色素瘤相關抗原E)蛋白質，例如MAGE 1、MAGE 2、MAGE 3、MAGE 4、酪胺酸酶；突變體ras蛋白質；突變體p53蛋白質；p97黑色素瘤抗原、與晚期癌症相關之ras肽或p53肽；與頸癌相關之HPV 16/18抗原、與乳癌相關之KLH抗原、與結腸直腸癌相關之CEA(癌胚抗原)、gp100、與黑色素瘤相關之MART1抗原或與前列腺癌相關之PSA抗原。在另一實施例中，用於本文提供之組合物及方法之抗原為黑色素瘤相關抗原，其在一個實施例中為TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、gp-100、酪胺酸酶、HSP-70、β-HCG或其組合。應 瞭解熟練技工將能使用本文中未提及但在此項技術中已知之任何異源抗原以用於本文提供之方法及組合物。

在一個實施例中，本文提供之核酸分子進一步包含編碼新陳代謝酶之第二開放閱讀框架。在另一實施例中，新陳代謝酶補充缺乏重組李氏菌株之染色體之內源性基因。在另一實施例中，由第二開放閱讀框架編碼之新陳代謝酶為丙胺酸消旋酶。在一個實施例中，李氏菌進一步包含編碼另一新陳代謝酶之第三開放閱讀框架。在另一實施例中，由第三開放閱讀框架編碼之新陳代謝酶為D-胺基酸轉移酶。在另一實施例中，核酸分子包含編碼異源抗原或其片段之第四閱讀框架。

在一個實施例中，核酸分子整合至李氏菌基因組中。在另一實施例中，核酸分子位於重組李氏菌疫苗株中之質體中。在另一實施例中，質體在不存在抗生素選擇下穩定維持於重組李氏菌疫苗株中。在另一實施例中，質體不賦予重組李氏菌以抗生素抗性。

在一個實施例中，本文提供一種核酸分子，其用於將李氏菌轉型以便得到重組李氏菌。在另一實施例中，本文提供之用於轉型李氏菌之核酸缺乏毒性基因。在另一實施例中，核酸分子整合至李氏菌基因組中且攜帶無功能的毒性基因。在另一實施例中，毒性基因在重組李氏菌中突變。在另一實施例中，核酸分子用於使李氏菌基因組中存在之內源性基因不活化。在另一實施例中，毒性基因為ActA基因、inlA基因、inlB基因、inlC基因、inlJ基因、PlbC基因或PrfA基因。熟練技工應瞭解，毒性基因可為此項技術中已知與重組 李氏菌中毒性相關之任何基因。

在一個實施例中，新陳代謝基因、毒性基因等缺乏李氏菌株之染色體。在另一實施例中，新陳代謝基因、毒性基因等缺乏李氏菌株之染色體及任何游離型基因元件。在另一實施例中，新陳代謝基因、毒性基因等缺乏毒性株之基因組。在一個實施例中，毒性基因之染色體突變。在另一實施例中，毒性基因自染色體缺失。各可能性代表本發明之各別實施例。

在一個實施例中，術語「核酸分子」在另一實施例中係指質體。在另一實施例中，該術語係指整合載體。在另一實施例中，該術語係指包含整合載體之質體。在另一實施例中，整合載體為位點特異性整合載體。在另一實施例中，本發明之方法及組合物之核酸分子係由此項技術中已知之任何類型核苷酸組成。各可能性代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，構築體或核酸分子使用同源重組整合至李氏菌染色體中。用於同源重組之技術為此項技術中所熟知且描述於例如Baloglu S,Boyle SM等人(Immune responses of mice to vaccinia virus recombinants expressing either Listeria monocytogenes partial listeriolysin or Brucella abortus ribosomal L7/L12 protein.Vet Microbiol 2005,109(1-2)：11-7)；及Jiang LL,Song HH等人(Characterization of a mutant Listeria monocytogenes strain expressing green fluorescent protein.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)2005,37(1)：19-24)中。在另一實施例中，同源重組係如美國專利第6,855,320號中所述進行。在此情況下，表現E7之重組Lm 菌株藉由以下方式製得：在hly啟動子控制下染色體整合E7基因且包含hly信號序列以確保基因產物之分泌，產生稱為Lm-AZ/E7之重組體。在另一實施例中，溫度敏感性質體用於選擇重組體。各技術代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，構築體或核酸分子使用轉座子插入整合至李氏菌染色體中。用於轉座子插入之技術為此項技術中所熟知且尤其由Sun等人(Infection and Immunity 1990,58：3770-3778)描述於DP-L967之解釋中。轉座子突變誘發在另一實施例中具有可形成穩定基因組插入突變體之優點，但具有基因組中已插入外來基因之位置未知的缺點。

在另一實施例中，構築體或核酸分子使用噬菌體整合位點整合至李氏菌染色體中(Lauer P,Chow MY等人，Construction,characterization,and use of two Listeria monocytogenes site-specific phage integration vectors.J Bacteriol 2002；184(15)：4177-86)。在此方法之某些實施例中，噬菌體(例如U153或PSA李氏菌噬菌體)之整合酶基因及連接位點用於將異源基因插入相應連接位點中，該相應連接位點可為基因組中之任何適當位點(例如comK或arg tRNA基因之3'端)。在另一實施例中，內源性原噬菌體由在整合構築體或異源基因之前所用之連接位點治癒。在另一實施例中，此方法產生單一複本整合體。在另一實施例中，本發明進一步包含基於噬菌體之染色體整合系統以用於臨床應用，其中可使用對於必要酶(包括(但不限於)d-丙胺酸消旋酶)營養缺陷之宿主株，例如Lmdal(-)dat(-)。在另一實施例中，為了避免「噬菌體治癒步驟」，使用基於PSA之噬菌體整 合系統。在另一實施例中，此需要利用抗生素連續選擇以維持完整的基因。由此，在另一實施例中，本發明能夠建立不需要用抗生素選擇之基於噬菌體之染色體整合系統。代之，可補充營養缺陷宿主株。各可能性代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，構築體或核酸分子由具有編碼LLO、PEST或ActA序列或其功能片段之內源性核酸序列的游離型載體表現。在另一實施例中，構築體或核酸分子包含各自編碼第一及至少第二多肽之第一及至少第二開放閱讀框架，其中該第一及該至少第二多肽各自包含融合至內源性含PEST之多肽之異源抗原或其功能片段。

在另一實施例中，本文提供一種重組李氏菌株，其包含游離型重組核酸分子，該核酸分子包含各自編碼第一及至少第二多肽之第一及至少第二開放閱讀框架，其中該第一及該至少第二多肽各自包含融合至內源性含PEST之多肽之異源抗原或其功能片段，其中該核酸進一步包含編碼質體複製控制區之開放閱讀框架。

在一個實施例中，本發明提供一種製造包含游離型表現質體之重組李氏菌株的方法，該游離型表現質體包含編碼第一及至少第二多肽之第一及至少第二核酸，其中該第一及該第二多肽各自包含融合至內源性含PEST之多肽之異源抗原，該方法包含以下步驟：a)將編碼各自包含融合至內源性含PEST之多肽之第一及第二異源抗原之第一及第二多肽的第一及第二核酸以重組方式融合於質體中；b)將重組李氏菌用游離型表現質體轉型；及c)在有助於重組李氏菌株中抗原表現之情況下表現第一及至少第二抗原。

在一個實施例中，本文提供一種製造包含游離型表現質體之重組李氏菌株的方法，該游離型表現質體包含編碼第一、第二及第三多肽之第一、第二及第三核酸，其中該第一、該第二及該第三多肽各自包含融合至內源性含PEST之多肽之異源抗原，該方法包含以下步驟：a)將編碼各自包含融合至內源性含PEST之多肽之第一、第二及第三異源抗原之第一、第二及第三多肽的第一、第二及第三核酸以重組方式融合於質體中；b)將重組李氏菌用游離型表現質體轉型；及c)在有助於重組李氏菌株中抗原表現之情況下表現第一、第二及第三抗原。

在另一實施例中，本發明提供一種重組李氏菌株，其包含至少一個游離型重組核酸分子，該核酸分子包含各自編碼第一及至少第二多肽之第一及至少第二開放閱讀框架，其中該第一及該至少第二多肽各自包含融合至內源性含PEST之多肽之異源抗原或其功能片段，其中該核酸進一步包含編碼質體複製控制區之開放閱讀框架。在另一實施例中，質體控制區調節游離型重組核酸分子之複製。

在另一實施例中，質體控制區包含編碼轉錄抑制子之開放閱讀框架，該轉錄抑制子抑制來自第一或至少第二核酸分子之異源抗原表現。在另一實施例中，質體控制區包含編碼轉錄誘導子之開放閱讀框架，該轉錄誘導子誘導來自第一或至少第二核酸分子之異源抗原表現。在另一實施例中，質體控制區包含編碼轉錄抑制子之開放閱讀框架，該轉錄抑制子抑制來自第一，第二或第三核酸分子之異源抗原表現。在另一實施例中，質體控制區包含編碼轉錄誘導子之開 放閱讀框架，該轉錄誘導子誘導來自第一，第二或第三核酸分子之異源抗原表現。

在一個實施例中，存在不同類型之轉錄調節，此等類型包括「負控制」及「正控制」。在負控制中，調節蛋白或抑制蛋白結合至操作子且防止RNA聚合酶適當地結合至啟動子序列。或者，抑制蛋白可以不活化形式合成，因為其無法阻斷RNA聚合酶結合至啟動子，抑制子接著經活化以藉由結合共抑制子而防止RNA聚合酶結合至啟動子。此類控制最常見於合成代謝路徑(例如精胺酸生物合成)，其中共抑制子常為合成代謝路徑之最終產物。或者，抑制蛋白以活化形式合成，結合至操作子且防止RNA聚合酶結合至啟動子。當誘導子結合至抑制子時，抑制子變得不活化，因此RNA聚合酶現能自由地起始轉錄。此類控制最常見於分解代謝路徑(例如乳糖分解代謝)。誘導子常為將降解之受質之形式。在正控制中，調節蛋白(稱為活化蛋白)結合至操作子且活化分子使RNA聚合酶穩定結合至啟動子區域。此一實例包括阿拉伯糖分解代謝。調節蛋白(對於正調節及負調節兩者而言)由調節基因編碼且可在較低含量下連續地合成。其可製成經自身調節，藉此較高濃度之調節蛋白(與較高質體產生相關)結合至其自身操作子且抑制RNA聚合酶結合至啟動子序列。此舉終止轉錄直至其含量下降。此等類型調節之數種實例包括乳糖操縱子、精胺酸操縱子、白喉毒素基因調節系統等。轉錄抑制子及其使用方法在此項技術中容易獲知且預期用於本發明。

在另一實施例中，質體複製調節區能夠調節來自 第一或至少第二核酸分子中之各者之外源性異源抗原之表現。在另一實施例中，質體複製調節區能夠調節來自第一、第二或第三核酸分子中之各者之外源性異源抗原之表現。

在一個實施例中，量測代謝負荷係藉由在本發明時此項技術中已知之任何手段實現，該等手段包括(但不限於)量測疫苗株之生長速率、光密度讀數、群落形成單位(CFU)接種及其類似手段。在另一實施例中，細菌細胞上之代謝負荷係藉由量測細菌細胞之生存率來測定的。量測細菌生存率之方法為此項技術中容易獲知且可利用的，該等方法中之一些包括(但不限於)供生存率計數用之細菌接種、量測ATP及流動式細胞測量術。在ATP染色中，偵測係基於使用螢光素酶反應以量測來自活細胞之ATP之量，其中細胞中ATP之量與細胞生存率相關。關於流動式細胞測量術，此方法可例如在採用生存率染料之用法之後以亦為此項技術中已知之各種方式使用，該等生存率染料被活細菌細胞排斥且被死亡的細菌細胞吸收或吸附。熟練技工將易於瞭解用於量測細菌生存率之此項技術中已知之此等及任何其他方法可用於本發明。應瞭解，熟練技工將能實施在本發明時在此項技術中可利用之知識以用於量測疫苗株之生長速率或疫苗株之標誌物基因表現，該等參數能夠測定表現多種異源抗原或其功能片段之疫苗株之代謝負荷。

在另一實施例中，「功能片段」為免疫原性片段且在單獨或在本文提供之疫苗組合物中投與個體時誘發免疫反應。在另一實施例中，功能性片段具有如熟練技工將瞭解且如本文進一步提供之生物活性。

在一個實施例中，術語「至少第二核酸分子」係指兩種或兩種以上核酸分子，或者其係指三、四、五種等核酸分子。

在另一實施例中，重組核酸分子進一步包含編碼第三多肽之第三開放閱讀框架，其中該第三多肽包含融合至內源性含PEST之多肽之異源抗原或其功能片段。

在一個實施例中，本文提供一種多價質體，其傳遞至少兩種抗原。在另一實施例中，質體為雙質體。在另一實施例中，本文提供一種編碼多價質體之游離型重組核酸。在另一實施例中，游離型重組核酸主鏈係由包含SEQ ID NO：1之序列編碼，在另一實施例中，本文提供之游離型重組核酸係利用由SEQ ID NO：1組成之序列編碼。在另一實施例中，本文提供之游離型重組核酸係由SEQ ID NO：1中所述之序列編碼。

(SEQ ID NO：1)。

在一個實施例中，多價質體主鏈包含編碼至少兩 種抗原之至少兩種核酸序列。在另一實施例中，重組游離型核酸編碼質體主鏈序列及至少兩種抗原。在另一實施例中，抗原對攜帶質體之細菌宿主為異源抗原。在另一實施例中，抗原對攜帶質體之李氏菌宿主為異源抗原。在另一實施例中，編碼質體主鏈及至少兩種異源抗原之重組游離型核酸序列包含SEQ ID NO：2。在另一實施例中，編碼質體主鏈及至少兩種異源抗原之重組游離型核酸序列由SEQ ID NO：2組成。

(SEQ ID NO：2)。

在另一實施例中，由SEQ ID NO：2中序列編碼之抗原之一為E7(在SEQ ID NO：2中加粗)。在另一實施例中，E7序列係陳述於SEQ ID NO：3中。

(SEQ ID NO：3)。

在一個實施例中，由SEQ ID NO：2中序列編碼之抗原之一為嵌合Her2-neu抗原(在SEQ ID NO：2用斜體排字)。在另一實施例中，嵌合Her2-neu序列係陳述於SEQ ID NO：4中。

(SEQ ID NO：4)。

在另一實施例中，「新陳代謝酶」係指在合成宿主細菌所需之養分中所涉及之酶。在另一實施例中，該術語係指合成宿主細菌所需之養分所需的酶。在另一實施例中，該術語係指在合成為宿主細菌所利用之養分中所涉及之酶。在另一實施例中，該術語係指在合成為宿主細菌持續生長所需之養分中所涉及之酶。在另一實施例中，該酶為合成養分所需。各可能性代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，「穩定維持」係指在不存在選擇(例如抗生素選擇)下維持核酸分子或質體持續10代且無可偵測損失。在另一實施例中，期間為15代。在另一實施例中，期間為20代。在另一實施例中，期間為25代。在另一實施例中，期間為30代。在另一實施例中，期間為40代。在另一實施例中，期間為50代。在另一實施例中，期間為60代。在另一實施例中，期間為80代。在另一實施例中，期間為100代。在另一實施例中，期間為150代。在另一實施例中，期間為200代。在另一實施例中，期間為300代。在另一實施例中，期間為500代。在另一實施例中，期間超過數代。在另一實施例中，核酸分子或質體在活體外(例如在培養物中)穩定維持。在另一實施例中，核酸分子或質體在活 體內穩定維持。在另一實施例中，核酸分子或質體在活體外及在活體外均穩定維持。各可能性代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，本文提供之方法及組合物之新陳代謝酶為胺基酸代謝酶，其中，在另一實施例中，新陳代謝酶為丙胺酸消旋酶。在另一實施例中，新陳代謝酶為D-胺基酸轉移酶。在另一實施例中，新陳代謝酶催化供重組李氏菌株中細胞壁合成使用之胺基酸之形成，其中在另一實施例中新陳代謝酶為丙胺酸消旋酶。

在另一實施例中，編碼新陳代謝酶之基因在李氏菌p60啟動子之控制下表現。在另一實施例中，使用inlA(編碼內化素(internalin))啟動子。在另一實施例中，使用hly啟動子。在另一實施例中，使用ActA啟動子。在另一實施例中，整合酶基因在任何其他革蘭氏陽性(gram positive)啟動子之控制下表現。在另一實施例中，編碼新陳代謝酶之基因在於李氏菌中起作用之任何其他啟動子之控制下表現。熟練技工應瞭解其他啟動子或多順反子表現卡匣可用於驅動基因之表現。各可能性代表本發明之各別實施例。

在一個實施例中，活減毒李氏菌為重組李氏菌。在另一實施例中，重組李氏菌包含基因組內化素C(inlC)基因、ActA基因、PlcA基因、PrfA基因或PlcB基因之突變或缺失。在另一實施例中，重組李氏菌包含基因組actA基因及基因組內化素C基因之突變或缺失。

在一個實施例中，重組李氏菌株已經由動物宿主繼代。在另一實施例中，動物宿主為非人類動物宿主。在另一實施例中，繼代使菌株作為疫苗載體之功效最大化。在另 一實施例中，繼代使李氏菌株之免疫原性穩定。在另一實施例中，繼代使李氏菌株之毒性穩定。在另一實施例中，繼代增加李氏菌株之免疫原性。在另一實施例中，繼代增加李氏菌株之毒性。在另一實施例中，繼代移除李氏菌株之不穩定子菌株。在另一實施例中，繼代減少李氏菌株之不穩定子菌株之流行率。在另一實施例中，繼代使菌株減毒，或在另一實施例中使菌株毒性較小。用於經由動物宿主繼代重組李氏菌株之方法為此項技術中所熟知且描述於例如美國專利申請案第10/541,614號中。各可能性代表本文提供之方法及組合物之各別實施例。

在一個實施例中，本發明提供用於預防疾病、治療疾病及疫苗接種人類個體之方法及組合物。

在另一實施例中，本發明係有關增強人類之抗腫瘤免疫反應。在另一實施例中，藉由投與本文提供之組合物來增強個體之抗腫瘤反應的方法可與其他已知抗腫瘤或抗癌療法組合。在另一實施例中，Lm-LLO可單獨或與其中佐劑適當之任何療法組合使用，且可在通常不使用佐劑之設置(諸如化學療法或放射療法)中具有效用。

在另一實施例中，本文提供之李氏菌株進一步包含編碼新陳代謝酶之第三開放閱讀框架。

在一個實施例中，新陳代謝酶為胺基酸代謝酶。在另一實施例中，由第二開放閱讀框架編碼之新陳代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。在另一實施例中，由第三開放閱讀框架編碼之新陳代謝酶為丙胺酸消旋酶或D-胺基酸轉移酶。在另一實施例中，新陳代謝酶係由dal基因編碼，其 中在另一實施例中dal基因係來自枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。在另一實施例中，新陳代謝酶係由dat基因編碼。

在另一實施例中，重組李氏菌為減毒營養缺陷型菌株。

在一個實施例中，減毒株為Lm dal(-)dat(-)(Lmdd).在另一實施例中，減毒株為Lm dal(-)dat(-)△actA(LmddA)。LmddA係基於因缺失毒性基因actA而減毒之李氏菌疫苗載體，且藉由補充dal基因而保留供所需異源抗原或截短型LLO活體內及活體外表現用之質體。

在另一實施例中，減毒株為Lmdda。在另一實施例中，減毒株為Lm△actA。在另一實施例中，減毒株為Lm△PrfA。在另一實施例中，減毒株為Lm△PlcB。在另一實施例中，減毒株為Lm△PlcA。在另一實施例中，菌株為上述菌株中之任一者之雙突變體或三突變體。在另一實施例中，此菌株產生作為基於李氏菌之疫苗之固有性質的強大佐劑效應。在另一實施例中，此菌株係由EGD李氏菌主鏈構築。在另一實施例中，本發明中所用菌株為表現非溶血性LLO之李氏菌株。在另一實施例中，李氏菌株為prfA突變體、ActA突變體、plcB缺失突變體、或缺乏plcA及plcB兩者之雙突變體。所有此等李氏菌株均預期用於本文提供之方法。各可能性代表本發明之各別實施例。

在一個實施例中，李氏菌向鄰近細胞之易位藉由與該過程有關之actA基因及/或inlC基因之缺失而得以抑制，由此引起出人意料地較高程度減毒作用且作為疫苗主鏈之免疫原性及效用增加。

在一個實施例中，本文提供之重組李氏菌株經減毒。在另一實施例中，重組李氏菌缺乏ActA毒性基因。在另一實施例中，重組李氏菌缺乏PrfA毒性基因。

在另一實施例中，重組李氏菌疫苗株包含佐劑，其中該佐劑為李氏溶血素O。在另一實施例中，重組李氏菌疫苗株包含佐劑，其中該佐劑為ActA。在另一實施例中，重組李氏菌疫苗株包含佐劑，其中該佐劑為PEST胺基酸序列。

在另一實施例中，本文提供之方法進一步提供克服或「打斷」對作為自身抗原之異源抗原之耐受性的方法。該等抗原可由各種腫瘤異常地表現，該等腫瘤藉由使用本文提供之方法及組合物在本發明之範疇下經受治療或防治。

在一個實施例中，由本文提供之方法及組合物誘發之免疫反應為治療性免疫反應。在另一實施例中，其為防治性免疫反應。在另一實施例中，其為相對於在此項技術中對於誘導罹患本文所提供病況之個體之免疫反應可利用之方法增強的免疫反應。在另一實施例中，免疫反應引起使個體痛苦之本文提供之腫瘤的清除。

在一個實施例中，表現截短型李氏溶血素O之重組減毒李氏菌與其他治療模態之組合適用於增強免疫反應以及預防及治療包括癌症或實體腫瘤之疾病。在一個實施例中，表現截短型ActA之重組減毒李氏菌與其他治療模態之組合適用於增強免疫反應以及預防及治療包括癌症或實體腫瘤之疾病。在一個實施例中，表現PEST胺基酸序列之重組減毒李氏菌與其他治療模態之組合適用於增強免疫反應以及預防及治療包括癌症或實體腫瘤之疾病。

在另一實施例中，本文提供一種改進治療性疫苗之免疫原性的方法，該方法包含向個體共同投與疫苗及活減毒李氏菌，其中活減毒李氏菌增強疫苗之免疫原性，由此改進疫苗之免疫原性。在另一實施例中，活減毒李氏菌為重組李氏菌。在一個實施例中，該方法能夠治療為疫苗所特異性對抗之腫瘤。

在一個實施例中，本文提供一種以非抗原依賴性方式增強對抗疾病之免疫反應的方法，該方法包含向個體投與活減毒李氏菌或重組李氏菌。

在另一實施例中，本文提供之活減毒或重組李氏菌表現LLO蛋白質或其非溶血性片段。在另一實施例中，本文提供之李氏菌單獨或與另一佐劑組合使用。在另一實施例中，本發明之方法及組合物中所用之另一佐劑在另一實施例中為顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白質。在另一實施例中，佐劑包含GM-CSF蛋白質。在另一實施例中，佐劑為編碼GM-CSF之核苷酸分子。在另一實施例中，佐劑包含編碼GM-CSF之核苷酸分子。在另一實施例中，佐劑為皂素QS21。在另一實施例中，佐劑包含皂素QS21。在另一實施例中，佐劑為單磷醯基脂質A。在另一實施例中，佐劑包含單磷醯基脂質A。在另一實施例中，佐劑為SBAS2。在另一實施例中，佐劑包含SBAS2。在另一實施例中，佐劑為含未甲基化CpG之寡核苷酸。在另一實施例中，佐劑包含含未甲基化CpG之寡核苷酸。在另一實施例中，佐劑為免疫刺激性細胞激素。在另一實施例中，佐劑包含免疫刺激性細胞激素。在另一實施例中，佐劑為編碼免疫刺激性細胞激素之 核苷酸分子。在另一實施例中，佐劑包含編碼免疫刺激性細胞激素之核苷酸分子。在另一實施例中，佐劑為或包含羽莖糖苷。在另一實施例中，佐劑為或包含細菌有絲分裂原。在另一實施例中，佐劑為或包含細菌毒素。在另一實施例中，佐劑為或包含此項技術中已知之任何其他佐劑。各可能性代表本發明之各別實施例。

在一個實施例中，本文提供之方法及組合物中所用之LLO為李氏菌LLO。在一個實施例中，LLO所來源之李氏菌為單核球增多性李氏菌(Lm)。在另一實施例中，李氏菌為伊氏李氏菌(Listeria ivanovii)。在另一實施例中，李氏菌為魏氏李氏菌(Listeria welshimeri)。在另一實施例中，李氏菌為斯氏李氏菌(Listeria seeligeri)。

在一個實施例中，LLO蛋白質係由以下(SEQ ID NO：5)中陳述之核酸序列編碼。

(SEQ ID NO：5)。

在另一實施例中，LLO蛋白質具有序列SEQ ID NO：6 (SEQ ID NO：6)

對應於此序列之原蛋白之前25個胺基酸為信號序列且在其由細菌分泌時自LLO裂解。因此，在此實施例中，全長活性LLO蛋白質長度為504個殘基。在另一實施例中，LLO蛋白質具有GenBank寄存編號DQ054588、DQ054589、AY878649、U25452或U25452中陳述之序列。在另一實施例中，LLO蛋白質為LLO蛋白質之變異體。在另一實施例中，LLO蛋白質為LLO蛋白質之同系物。各可能性代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，「截短型LLO」或「tLLO」係指包含PEST樣域之LLO之片段。在另一實施例中，該等術語係指在胺基端不含活化域且並不包括胱胺酸484之LLO片段。在另一實施例中，LLO片段由PEST序列組成。在另一實施例中，LLO片段包含PEST序列。在另一實施例中，LLO片段由529個胺基酸全長LLO蛋白質之大約前400至441個胺基酸組成。在另一實施例中，LLO片段為LLO蛋白質之非溶血性形式。

在一個實施例中，LLO片段由大約殘基1-25組成。在另一實施例中，LLO片段由大約殘基1-50組成。在另一實施例中，LLO片段由大約殘基1-75組成。在另一實施例中，LLO片段由大約殘基1-100組成。在另一實施例中，LLO 片段由大約殘基1-125組成。在另一實施例中，LLO片段由大約殘基1-150組成。在另一實施例中，LLO片段由大約殘基1175組成。在另一實施例中，LLO片段由大約殘基1-200組成。在另一實施例中，LLO片段由大約殘基1-225組成。在另一實施例中，LLO片段由大約殘基1-250組成。在另一實施例中，LLO片段由大約殘基1-275組成。在另一實施例中，LLO片段由大約殘基1-300組成。在另一實施例中，LLO片段由大約殘基1-325組成。在另一實施例中，LLO片段由大約殘基1-350組成。在另一實施例中，LLO片段由大約殘基1-375組成。在另一實施例中，LLO片段由大約殘基1-400組成。在另一實施例中，LLO片段由大約殘基1-425組成。各可能性代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，來自其他物種之LLO之同系物(包括已知溶素，諸如鏈球菌溶血素O、產氣夾膜羧菌溶素O(perfringolysin O)、肺炎球菌溶血素等)或其片段可用於本發明。

在一個實施例中，本文提供之活減毒李氏菌或重組李氏菌表現ActA蛋白質或其片段。在本發明之方法及組合物之另一實施例中，ActA蛋白質之片段融合至本文亦提供之異源抗原或其片段。在另一實施例中，ActA蛋白質之片段具有序列： (SEQ ID No：7)。在另一實施例中，本發明之方法及組合物之ActA AA序列包含SEQ ID No：7中陳述之序列。在另一實施例中，ActA AA序列為SEQ ID No：7之同系物。在另一實施例中，ActA AA序列為SEQ ID No：7之變異體。在另一實施例中，ActA AA序列為SEQ ID No：7之片段。在另一實施例中，ActA AA序列為SEQ ID No：5之同功異型物。各可能性代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，ActA片段係由包含以下序列之重組核苷酸編碼： (SEQ ID NO：8)。在另一實施例中，重組核苷酸具有SEQ ID NO：8中陳述之序列。在另一實施例中，本發明之方法及組合物之編碼ActA之核苷酸包含SEQ ID No：8中陳述的序列。在另一實施例中，編碼ActA之核苷酸為SEQ ID No：8之同系物。在另一實施例中，編碼ActA之核苷酸為SEQ ID No：8之變異體。在另一實施例中，編碼ActA之核苷酸為SEQ ID No：8之片段。在另一實施例中，編碼ActA之核苷酸為SEQ ID No： 8之同功異型物。各可能性代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，ActA片段係由包含以下序列之重組核苷酸編碼： (SEQ ID NO：9)。在另一實施例中，重組核苷酸具有SEQ ID NO：9中陳述之序列。在另一實施例中，本發明之方法及組合物之編碼ActA之核苷酸包含SEQ ID No：9中陳述的序列。在另一實施例中，編碼ActA之核苷酸為SEQ ID No：9之同系物。在另一實施例中，編碼ActA之核苷酸為SEQ ID No：9之變異體。在另一實施例中，編碼ActA之核苷酸為SEQ ID No：9之片段。在另一實施例中，編碼ActA之核苷酸為SEQ ID No：9之同功異型物。在另一實施例中，SEQ ID NO：9用於得到本文亦提供之SEQ ID NO：2之構築體。各可能性代表本發明之各別實施例。

在本發明之方法及組合物之另一實施例中，ActA 蛋白質之片段融合至異源抗原或其片段。在另一實施例中，ActA蛋白質之片段具有如GenBank寄存編號AAF04762中陳述之序列。在另一實施例中，本發明之方法及組合物之ActA AA序列包含GenBank寄存編號AAF04762中陳述之序列。在另一實施例中，ActA AA序列為GenBank寄存編號AAF04762之同系物。在另一實施例中，ActA AA序列為GenBank寄存編號AAF04762之變異體。在另一實施例中，ActA AA序列為GenBank寄存編號AAF04762之片段。在另一實施例中，ActA AA序列為GenBank寄存編號AAF04762之同功異型物。各可能性代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，本發明之方法及組合物中所用之ActA蛋白質之N端片段具有SEQ ID NO：10中陳述的序列： 。在另一實施例中，ActA片段包含SEQ ID NO：10中陳述之序列。在另一實施例中，ActA片段為此項技術中已知之任何其他ActA片段。各可能性代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，編碼ActA蛋白質之片段之重組核苷酸包含SEQ ID NO：11中陳述之序列： 。在另一實施例中，重組核苷酸具有SEQ ID NO：11中陳述之序列。在另一實施例中，重組核苷酸包含編碼ActA蛋白質之片段之任何其他序列。各可能性代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，ActA片段係由包含如GenBank寄存編號AF103807中陳述之序列之重組核苷酸編碼。在另一實施例中，重組核苷酸具有GenBank寄存編號AF103807中陳述之序列。在另一實施例中，本發明之方法及組合物之編碼ActA之核苷酸包含GenBank寄存編號AF103807中陳述的序列。在另一實施例中，編碼ActA之核苷酸為GenBank寄存編號AF103807之同系物。在另一實施例中，編碼ActA之核苷酸為GenBank寄存編號AF103807之變異體。在另一實施例中，編碼ActA之核苷酸為GenBank寄存編號AF103807之片段。在另一實施例中，編碼ActA之核苷酸為GenBank寄存編號AF103807之同功異型物。各可能性代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，ActA片段為此項技術中已知之任何其他ActA片段。在另一實施例中，本發明之重組核苷酸包含編碼ActA蛋白質之片段之任何其他序列。在另一實施例中，重組核苷酸包含編碼整個ActA蛋白質之任何其他序列。各可能性代表本發明之各別實施例。

在一個實施例中，本文提供之活減毒李氏菌或重組李氏菌表現PEST序列肽。在本發明之方法及組合物之另一實施例中，PEST AA序列融合至異源抗原或片段。在另一實施例中，PEST AA序列為KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK(SEQ ID NO：12)。在另一實施例中，PEST序列為KENSISSMAPPASPPASPK(SEQ ID NO：13)。在另一實施例中，抗原融合至任何LLO序列(其包括本文中列舉之PEST AA序列中之一者)可增強對抗HMW-MAA之細胞介導之免疫性。

在另一實施例中，PEST AA序列為來自李氏菌ActA蛋白質之PEST序列。在另一實施例中，PEST序列為KTEEQPSEVNTGPR(SEQ ID NO：14)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(SEQ ID NO：15)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQ ID NO：16)或RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(SEQ ID NO：17)。在另一實施例中，PEST樣序列為上文所述之PEST序列之變異體，如熟練技工將瞭解，其在一個實施例中為KESVVDASESDLDSSMQSADESTPQPLK(SEQ ID NO：18)、KSEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQ ID NO：19)或RGGRPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(SEQ ID NO：20)。在另一實施例中，PEST樣序列係來自斯氏李氏菌細胞溶素，由lso基因編碼。在另一實施例中，PEST序列為RSEVTISPAETPESPPATP(SEQ ID NO：21)。在另一實施例中，PEST序列係來自鏈球菌屬(Streptococcus sp.)之鏈球菌溶血素O蛋白質。在另一實施例中，PEST序列係來自化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)鏈球菌溶血素O，例如在AA 35-51處之KQNTASTETTTTNEQPK(SEQ ID NO：22)。在另一實施例中，PEST樣序列係來自類馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)鏈球菌溶血素O，例如在AA 38-54處之KQNTANTETTTTNEQPK(SEQ ID NO：23)。在另一實施例中，PEST樣序列具有選自SEQ ID NO：14-20之序列。在另一實施例中，PEST樣序列具有選自SEQ ID NO：14-23之序列。在另一實施例中，PEST序列為自原核生物體獲得之PEST AA序列。

PEST序列之鑑別為此項技術中所熟知，且描述於例如Rogers S等人(Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins：the PEST hypothesis.Science 1986；234(4774)：364-8)及Rechsteiner M等人(PEST sequences and regulation by proteolysis.Trends Biochem Sci 1996；21(7)：267-71)中。在另一實施例中，「PEST序列」係指富含脯胺酸(P)、麩胺酸(E)、絲胺酸(S)及蘇胺酸(T)殘基之區域。在另一實施例中，PEST序列側接一或多個含有數個帶正電荷胺基酸之叢集。在另一實施例中，PEST序列介導含有其之蛋白質之快速細胞內降解。在另一實施例中，PEST序列適合Rogers等人中揭示之演算法。在另一實施例中，PEST序列適合Rechsteiner等人中揭示之演算法。在另一實施例中，PEST序列含有一或多個內部磷酸化位點，且此等位點處之磷酸化在蛋白質降解之前發生。

在一個實施例中，原核生物體之PEST序列根據諸如由例如Rechsteiner及Rogers(1996,Trends Biochem.Sci.21：267-271)針對LM及Rogers S等人(Science 1986；234(4774)：364-8)中描述之方法鑑別。或者，來自其他原核生物體之PEST AA序列亦可基於此方法鑑別。預期將有PEST AA序列之其他原核生物體包括(但不限於)其他李氏菌種。在一個實施例中，PEST序列適合Rogers等人中揭示之演算法。在另一實施例中，PEST序列適合Rechsteiner等人中揭示之演算法。在另一實施例中，PEST序列使用PEST發現程式鑑別。

在另一實施例中，PEST基元之鑑別藉由對指定 蛋白質序列內帶正電荷的AA R、H及K之初始掃描來達成。計數帶正電荷的側接序列之間的所有AA，且僅進一步考慮含有等於或高於窗口大小參數之AA數目之該等基元。在另一實施例中，PEST樣序列必須含有至少1個P、1個D或E及至少1個S或T。

在另一實施例中，PEST基元之品質基於關鍵AA之局部增濃以及基元之疏水性藉助於評分參數來改進。D、E、P、S及T之增濃係以質量百分比(w/w)表示且針對1個當量D或E、1個當量P及1個當量S或T進行校正。在另一實施例中，疏水性之計算原則上遵循J.Kyte及R.F.Doolittle(Kyte,J及Dootlittle,RF.J.Mol.Biol.157,105(1982))之方法。

在另一實施例中，潛在PEST基元之疏水性計算為相對於各AA種類之莫耳百分比與疏水性指數之乘積的總和。所需PEST評分如由以下方程式所表示以局部增濃項與疏水性項之組合形式獲得：PEST評分=0.55×DEPST-0.5×疏水性指數。

應瞭解，術語「PEST序列」、「PEST樣序列」或「PEST樣序列肽」可涵蓋使用以上演算法評分為至少+5之肽。在另一實施例中，該術語係指評分為至少6之肽。在另一實施例中，該肽之評分為至少7。在另一實施例中，評分為至少8。在另一實施例中，評分為至少9。在另一實施例中，評分為至少10。在另一實施例中，評分為至少11。在另一實施例中，評分為至少12。在另一實施例中，評分為至少13。在另一實施例中，評分為至少14。在另一實施例中，評分為 至少15。在另一實施例中，評分為至少16。在另一實施例中，評分為至少17。在另一實施例中，評分為至少18。在另一實施例中，評分為至少19。在另一實施例中，評分為至少20。在另一實施例中，評分為至少21。在另一實施例中，評分為至少22。在另一實施例中，評分為至少22。在另一實施例中，評分為至少24。在另一實施例中，評分為至少24。在另一實施例中，評分為至少25。在另一實施例中，評分為至少26。在另一實施例中，評分為至少27。在另一實施例中，評分為至少28。在另一實施例中，評分為至少29。在另一實施例中，評分為至少30。在另一實施例中，評分為至少32。在另一實施例中，評分為至少35。在另一實施例中，評分為至少38。在另一實施例中，評分為至少40。在另一實施例中，評分為至少45。各可能性代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，PEST序列使用此項技術中已知之任何其他方法或演算法鑑別，例如CaSPredictor(Garay-Malpartida HM,Occhiucci JM,Alves J,Belizario JE.Bioinformatics.2005年6月；21增刊1：i169-76)。在另一實施例中，使用以下方法：PEST指數藉由將值1分配給AA Ser、Thr、Pro、Glu、Asp、Asn或Gln來針對各適當長度之序列段(stretch)(例如30-35個AA的序列段)計算。PEST殘基中之各者之係數值(CV)為1且其他AA(非PEST)中之各者的係數值為0。

用於鑑別PEST樣序列之各方法代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，PEST序列為此項技術中已知之任何其他PEST序列。各PEST序列及其類型代表本發明之各別實施例。

應瞭解，術語「融合至PEST序列」涵蓋融合至包含PEST序列之蛋白質片段。在另一實施例中，該術語包括蛋白質片段包含除PEST序列以外之周圍序列的情況。在另一實施例中，蛋白質片段由PEST序列組成。亦應瞭解，術語「融合」涵蓋對兩個肽或蛋白質片段之融合，該兩個肽或蛋白質片段在其相應末端連接在一起或一者包埋在另一者內。

在另一實施例中，本文提供一種疫苗，其包含本發明之李氏菌之重組形式。

在另一實施例中，本文提供一種本發明之李氏菌之重組形式之培養物。

在另一實施例中，本發明之方法及組合物之李氏菌為單核球增多性李氏菌。在另一實施例中，李氏菌為伊氏李氏菌。在另一實施例中，李氏菌為魏氏李氏菌。在另一實施例中，李氏菌為斯氏李氏菌。各類型李氏菌代表本發明之各別實施例。

在一個實施例中，減毒李氏菌株，諸如LM△actA突變體、單核球增多性李氏菌△plcA、或△ActA、△INL-b、△INL-c用於本發明。在另一實施例中，如一般技術者在配備有本文中之本發明時將瞭解，減毒李氏菌株係藉由引入一或多個減毒突變而構築的。該等菌株之實例包括(但不限於)針對芳族胺基酸營養缺陷的李氏菌株及針對脂磷壁酸形成之突變體以及藉由缺乏毒性基因而減毒之李氏菌株(參見本文 中實例)。

在另一實施例中，本發明之方法及組合物之核酸分子可操作地連接於啟動子/調節序列。在另一實施例中，本發明之方法及組合物之第一開放閱讀框架可操作地連接於啟動子/調節序列。在另一實施例中，本發明之方法及組合物之第二開放閱讀框架可操作地連接於啟動子/調節序列。在另一實施例中，開放閱讀框架中之各者可操作地連接於啟動子/調節序列。各可能性代表本發明之各別實施例。

熟練技工在配備有本文提供之本發明及方法時將易於瞭解不同轉錄啟動子、終止子、攜帶載體(carrier vector)或特定基因序列(例如市售選殖載體中之基因序列)可成功地用於本發明之方法及組合物。如本發明中所涵蓋，此等功能性提供於例如稱為pUC系列之市售載體中。在另一實施例中，移除非必需DNA序列(例如抗生素抗性基因)。各可能性代表本發明之各別實施例。在另一實施例中，市售質體用於本發明。該等質體可自多種來源(例如Invitrogen(La Jolla,CA)、Stratagene(La Jolla,CA)、Clontech(Palo Alto,CA))獲得或可使用此項技術中熟知之方法構築。

另一實施例為諸如pCR2.1(Invitrogen,La Jolla,CA)之質體，其為具有原核複製起點及啟動子/調節元件以促進原核生物體中表現之原核表現載體。在另一實施例中，移除外來核苷酸序列以減小質體大小且增加可置放於其中之卡匣之大小。

該等方法為此項技術中所熟知，且描述於例如Sambrook等人(1989,Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)及Ausubei等人(1997,Current Protocols in Molecular Biology,Green & Wiley,New York)中。

抗生素抗性基因用於分子生物學及疫苗製備中通常採用之習知選擇及選殖過程。本發明中涵蓋之抗生素抗性基因包括(但不限於)賦予對以下各者之抗性的基因產物：胺苄青黴素(ampicillin)、青黴素(penicillin)、甲氧西林(methicillin)、鏈黴素(streptomycin)、紅黴素(erythromycin)、康黴素(kanamycin)、四環素(tetracycline)、氯黴素(cloramphenicol；CAT)、新黴素(neomycin)、潮黴素(hygromycin)、慶大黴素(gentamicin)及此項技術中熟知之其他抗生素。各基因代表本發明之各別實施例。

用於轉型細菌之方法為此項技術中所熟知，且包括基於鈣-氯化物勝任細胞之方法、電穿孔法、噬菌體介導之轉導、化學及物理轉型技術(de Boer等人，1989,Cell 56：641-649；Miller等人，1995,FASEB J.,9：190-199；Sambrook等人1989,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York；Ausubel等人，1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York；Gerhardt等人編，1994,Methods for General and Molecular Bacteriology,American Society for Microbiology,Washington,DC；Miller,1992,A Short Course in Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。在另一實施例中，本發明之李氏菌疫苗株利用電穿孔轉型。各方法代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，接合用於將遺傳物質及/或質體引入細菌。用於接合之方法為此項技術中所熟知，且描述於例如Nikodinovic J等人(A second generation snp-derived Escherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that is generally transferable by conjugation.Plasmid.2006年11月；56(3)：223-7)及Auchtung JM等人(Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellular signaling and the global DNA damage response.Proc Natl Acad Sci U S A.2005年8月30日；102(35)：12554-9)中。各方法代表本發明之各別實施例。

應瞭解，術語「轉型」可與術語「轉染」同樣地使用且係指將細菌細胞工程化以吸收質體或其他異源DNA分子。亦應瞭解，術語「轉型」可指將細菌細胞工程化以表現質體或其他異源DNA分子之基因。

適用於本發明之質體及其他表現載體描述於本文中其他地方，且可包括諸如以下之特徵：啟動子/調節序列、用於革蘭氏陰性(gram negative)及革蘭氏陽性細菌之複製起點、編碼融合蛋白質之經分離之核酸及編碼胺基酸代謝基因的經分離之核酸。另外，編碼融合蛋白質及胺基酸代謝基因之經分離之核酸將具有適於驅動該經分離之核酸表現的啟動子。適用於驅動細菌系統中表現之啟動子為此項技術中所熟知，且包括噬菌體λ、pBR322之β-內醯胺酶之bla啟動子以及pBR325之氯黴素乙醯基轉移酶基因之CAT啟動子。原核啟動子之其他實例包括：5噬菌體λ之主要左側及右側啟動子(PL及PR)、大腸桿菌之trp、recA、lacZ、lad及gal啟動子、 α-澱粉酶(Ulmanen等人，1985.J.Bacteriol.162：176-182)及枯草芽孢桿菌之S28特異性啟動子(Gilman等人，1984 Gene 32：11-20)、桿菌之噬菌體之啟動子(Gryczan,1982,The Molecular Biology of the Bacilli,Academic Press,Inc.,New York)及鏈黴菌啟動子(Ward等人，1986,Mol.Gen.Genet.203：468-478)。本發明中涵蓋之其他原核啟動子評述於例如Glick(1987,J.Ind.Microbiol.1：277-282)、Cenatiempo(1986,Biochimie,68：505-516)及Gottesman(1984,Ann.Rev.Genet.18：415-442)中。本發明中涵蓋之啟動子/調節元件之其他實例包括(但不限於)李氏菌prfA啟動子、李氏菌hly啟動子、李氏菌p60啟動子及李氏菌ActA啟動子(GenBank寄存編號NC_003210)或其片段。

在一個實施例中，編碼重組非溶血性LLO之DNA使用DNA擴增法(例如聚合酶鏈反應(PCR))產生。首先，分別擴增天然DNA任一側新末端上之區段。一個經擴增序列之5'端編碼肽連接子，而另一經擴增序列之3'端亦編碼肽連接子。由於第一片段之5'端與第二片段之3'端互補，故可將該兩個片段(例如在LMP瓊脂糖上部分純化後)用作第三PCR反應中之重疊模板。經擴增序列將含有密碼子、開放位點之羧基側上之區段(現形成胺基序列)、連接子及開放位點之胺基側上之序列(現形成羧基序列)。將抗原接合至質體。各方法代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，本發明之重組蛋白質使用重組DNA方法學合成。在一個實施例中，此舉涉及形成DNA序列，將DNA置放於表現卡匣(諸如本發明之質體)中處於特 定啟動子/調節元件之控制下，以及表現蛋白質。在另一實施例中，本發明之編碼蛋白質(例如非溶血性LLO)之DNA藉由任何適合方法製備，包括例如選殖及限制適當序列或利用諸如以下之方法直接化學合成：Narang等人之磷酸三酯法(1979,Meth.Enzymol.68：90-99)；Brown等人之磷酸二酯法(1979,Meth.Enzymol 68：109-151)；Beaucage等人之二乙基胺基磷酸酯法(1981,Tetra.Lett.,22：15 1859-1862)；及美國專利第4,458,066號之固體支撐法。

在另一實施例中，化學合成用於產生單股寡核苷酸。在各種實施例中，此單股寡核苷酸藉由與互補序列雜交或藉由使用該單股作為模板用DNA聚合酶聚合來轉化成雙股DNA。熟習此項技術者將認識到，雖然DNA之化學合成限於約100個鹼基之序列，但較長序列可藉由較短序列之接合來獲得。在另一實施例中，選殖子序列，且使用適當限制酶裂解適當子序列。接著將片段接合以產生所需DNA序列。

在另一實施例中，編碼本發明之重組蛋白質之DNA使用DNA擴增法(諸如聚合酶鏈反應(PCR))選殖。因此，使用包含適合限制性位點之有義引子及包含另一限制性位點之反義引子，例如不相同的限制性位點以促進選殖，將針對非溶血性LLO之基因進行PCR擴增。

在另一實施例中，重組融合蛋白質基因可操作地連接於各宿主之適當表現控制序列。啟動子/調節序列詳細地描述於本文中其他地方。在另一實施例中，質體進一步包含其他啟動子調節元件以及核糖體結合位點及轉錄終止信號。對於真核細胞，控制序列將包括來源於例如免疫球蛋白基 因、SV40、細胞巨大病毒等之啟動子及強化子以及聚腺苷酸化序列。在另一實施例中，序列包括剪接供體及受體序列。

在一個實施例中，術語「可操作地連接」係指其中如此描述之組分呈允許其以其預定方式起作用之關係的並置。控制序列「可操作地連接」於編碼序列係以使得編碼序列之表現在與控制序列相容之條件下達成的方式接合。

在另一實施例中，為了選擇包含質體之營養缺陷型細菌，使經轉型營養缺陷型細菌生長於將針對胺基酸代謝基因之表現選擇的培養基上。在另一實施例中，對於D-麩胺酸合成營養缺陷的細菌用包含用於D-麩胺酸合成之基因的質體轉型，且營養缺陷型細菌將在不存在D-麩胺酸下生長，而尚未用質體轉型或並不表現編碼用於D-麩胺酸合成之蛋白質之質體的營養缺陷型細菌不會生長。在另一實施例中，對於D-丙胺酸合成營養缺陷的細菌將在不存在D-丙胺酸下在轉型及表現本發明質體(若該質體包含編碼用於D-丙胺酸合成之胺基酸代謝酶的經分離之核酸)時生長。用於製造包含或缺乏必需生長因子、補充劑、胺基酸、維生素、抗生素及其類似物之適當培養基之該等方法為此項技術中所熟知且為可購得的(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)。各方法代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，一旦包含本發明質體之營養缺陷型細菌已在適當培養基上選擇，該等細菌即在選擇壓力存在下增殖。該增殖包含細菌在無營養缺陷因子之情況下在培養基中生長。營養缺陷型細菌中存在表現胺基酸代謝酶之質體會確保質體將與細菌一起複製，由此針對具有質體之細菌 不斷地選擇。熟練技工在配備有本文中本發明及方法時將易於能夠藉由調整包含質體之營養缺陷型細菌所生長之培養基之體積來使李氏菌疫苗載體的製造規模放大。

在另一實施例中，熟練技工應瞭解，採用其他營養缺陷型菌株及補充系統以用在本發明上。

在一個實施例中，本文提供一種投與本發明之組合物之方法。在另一實施例中，本文提供一種投與本發明之疫苗之方法。在另一實施例中，本文提供一種投與本發明之李氏菌之減毒重組形式的方法。

在另一實施例中，本發明之方法在如本文所述之任何形式或實施例中包含投與重組單核球增多性李氏菌之步驟。在一個實施例中，本發明之方法在如本文所述之任何形式或實施例中由投與本發明之重組單核球增多性李氏菌的步驟組成。在另一實施例中，本發明之方法在如本文所述之任何形式或實施例中基本上由投與本發明之重組單核球增多性李氏菌的步驟組成。在一個實施例中，術語「包含」係指包含該等方法中投與重組單核球增多性李氏菌之步驟以及包含可為此項技術中已知之其他方法或處理。在另一實施例中，術語「基本上由......組成」係指一種方法，其功能性組成部分為投與重組單核球增多性李氏菌，然而，該等方法之其他步驟可包括在內，該等其他步驟並不直接涉及該等方法之治療性作用且可例如指有助於投與重組單核球增多性李氏菌之作用的步驟。在一個實施例中，術語「由......組成」係指投與重組單核球增多性李氏菌且無其他步驟之方法。

在另一實施例中，由本發明之方法及組合物誘發 之免疫反應包含CD8⁺ T細胞介導之反應。在另一實施例中，免疫反應主要由CD8⁺ T細胞介導之反應組成。在另一實施例中，免疫反應之唯一可偵測組成部分為CD8⁺ T細胞介導之反應。

在另一實施例中，由本發明之方法及組合物誘發之免疫反應包含CD4⁺ T細胞介導之反應。在另一實施例中，免疫反應主要由CD4⁺ T細胞介導之反應組成。在另一實施例中，免疫反應之唯一可偵測組成部分為CD4⁺ T細胞介導之反應。

在另一實施例中，由本發明之方法及組合物誘發之免疫反應包含先天性免疫反應。在另一實施例中，免疫反應主要由先天性免疫反應組成。在另一實施例中，免疫反應之唯一可偵測組成部分為先天性免疫反應。應瞭解，先天性免疫反應之活化涉及巨噬細胞(諸如M1巨噬細胞)以及樹突狀細胞(DC)之活化。

在另一實施例中，本發明提供一種降低癌症或感染性疾病或過敏症之發病率之方法，該方法包含投與本發明之組合物。在另一實施例中，本發明提供一種改善癌症或感染性疾病或過敏症之方法，該方法包含投與本發明之組合物。各可能性代表本發明之各別實施例。

在一個實施例中，用於本發明之重組單核球增多性李氏菌分泌異源肽。在另一實施例中，用於本發明之重組單核球增多性李氏菌表現異源肽。在另一實施例中，用於本發明之重組單核球增多性李氏菌表現並分泌非溶血性LLO，如本文所述。

在一個實施例中，本發明之治療方案為治療性的。在另一實施例中，方案為防治性的。在另一實施例中，本發明之疫苗用於保護由於如熟練技工將瞭解使人易罹患癌症(諸如乳癌)或其他類型腫瘤之家族遺傳或其他境況而處於此等類型疾病風險中的人。在另一實施例中，本發明之疫苗用於治療由於如熟練技工將瞭解使人易罹患癌症(諸如乳癌)或其他類型腫瘤之家族遺傳或其他境況而患有此等類型疾病的人。在另一實施例中，本發明之疫苗在替代性治療之前用於由於如熟練技工將瞭解使人易罹患癌症(諸如乳癌)或其他類型腫瘤之家族遺傳或其他境況而患有此等類型疾病的人。在另一實施例中，該等治療包括化學療法、手術、輻射及其類似治療。在該等治療之前，投與本發明之疫苗以使疫苗對腫瘤抗原之CTL反應破壞剩餘癌轉移且延長由癌症緩解。在另一實施例中，本發明之疫苗用於影響先前建立之腫瘤之生長以及殺死現有腫瘤細胞。各可能性代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，如上所述之任何方法中所用之疫苗及免疫原性組合物具有本發明疫苗及免疫原性組合物之特徵中的任一者。各特徵代表本發明之各別實施例。

本發明涵蓋劑量範圍之各種實施例。在一個實施例中，在疫苗載體情況下，劑量在0.4LD₅₀/劑範圍內。在另一實施例中，劑量為約0.4-4.9LD₅₀/劑。在另一實施例中，劑量為約0.5-0.59LD₅₀/劑。在另一實施例中，劑量為約0.6-0.69LD₅₀/劑。在另一實施例中，劑量為約0.7-0.79LD₅₀/劑。在另一實施例中，劑量為約0.8LD₅₀/劑。在另一實施例中，劑量 為0.4LD₅₀/劑至0.8LD₅₀/劑。

在另一實施例中，劑量為10⁷個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為1.5×10⁷個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為2×10⁷個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為3×10⁷個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為4×10⁷個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為6×10⁷個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為8×10⁷個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為1×10⁸個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為1.5×10⁸個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為2×10⁸個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為3×10⁸個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為4×10⁸個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為6×10⁸個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為8×10⁸個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為1×10⁹個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為1.5×10⁹個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為2×10⁹個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為3×10⁹個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為5×10⁹個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為6×10⁹個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為8×10⁹個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為1×10¹⁰個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為1.5×10¹⁰個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為2×10¹⁰個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為3×10¹⁰個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為5×10¹⁰個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為6×10¹⁰個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為8×10¹⁰個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為8×10⁹個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為1×10¹¹個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為1.5×10¹¹個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為2×10¹¹個細菌/劑。在另一實施例中，劑量 為3×10¹¹個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為5×10¹¹個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為6×10¹¹個細菌/劑。在另一實施例中，劑量為8×10¹¹個細菌/劑。各可能性代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，本發明方法進一步包含向個體投與加強疫苗接種之步驟。在一個實施例中，加強疫苗接種在單次激活疫苗接種之後。在另一實施例中，在激活疫苗接種之後投與單次加強疫苗接種。在另一實施例中，在激活疫苗接種之後投與兩次加強疫苗接種。在另一實施例中，在激活疫苗接種之後投與三次加強疫苗接種。在一個實施例中，激活與加強疫苗之間的時間由熟練技工以實驗方式測定。在另一實施例中，激活與加強疫苗之間的時間為1週，在另一實施例中，其為2週，在另一實施例中，其為3週，在另一實施例中，其為4週，在另一實施例中，其為5週，在另一實施例中，其為6-8週，在另一實施例中，加強疫苗在激活疫苗之後8-10週投與。

在一個實施例中，本發明之疫苗或免疫原性組合物係單獨投與個體。在另一實施例中，疫苗或免疫原性組合物與其他療法一起投與。另一療法可為針對感染性疾病之抗生素介導之療法、或化學療法、免疫療法、輻射、或針對癌症之手術、或如熟練技工將瞭解此項技術中可利用之任何其他類型疾病療法。各可能性代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，各種啟動子中之一者用於表現含有其之蛋白質。在一個實施例中，使用LM啟動子，例如用於基因hly、actA、plcA、plcB及mpl之啟動子，該等基因 分別編碼李氏菌蛋白質溶血素、actA、磷脂醯肌醇特異性磷脂酶、磷脂酶C及金屬蛋白酶。各可能性代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，本發明之方法及組合物利用本發明之異源抗原或LLO序列之同系物。在一個實施例中，術語「同源性」、「同源」等在關於任何蛋白質或肽時係指在比對序列且必要時引入空隙以獲得最大同源性百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分之後，候選序列中與相應天然多肽之殘基相同的胺基酸殘基之百分比。用於比對之方法及電腦程式為此項技術中所熟知。

在另一實施例中，術語「同源性」在關於任何核酸序列時類似地指示候選序列中與相應天然核酸序列之核苷酸相同的核苷酸之百分比。

在一個實施例中，同源性係利用此項技術中充分描述之方法藉由用於序列比對之電腦演算法測定的。舉例而言，核酸序列同源性之電腦演算法分析可包括利用許多可獲得的套裝軟體，諸如BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLAST Enhanced Alignment Utility)、GENPEPT及TREMBL套裝。

在另一實施例中，「同源性」係指與選自SEQ ID NO：1-76之序列之一致性大於60%。在另一實施例中，「同源性」係指與選自SEQ ID NO：1-76之序列之一致性大於70%。在另一實施例中，一致性大於75%。在另一實施例中，一致性大於78%。在另一實施例中，一致性大於80%。在另一實施例中，一致性大於82%。在另一實施例中，一致性大於83%。在另一實施例中，一致性大於85%。在另一實施例中，一致 性大於87%。在另一實施例中，一致性大於88%。在另一實施例中，一致性大於90%。在另一實施例中，一致性大於92%。在另一實施例中，一致性大於93%。在另一實施例中，一致性大於95%。在另一實施例中，一致性大於96%。在另一實施例中，一致性大於97%。在另一實施例中，一致性大於98%。在另一實施例中，一致性大於99%。在另一實施例中，一致性為100%。各可能性代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，同源性經由測定候選序列雜交而測定，其方法充分描述在此項技術中(參見，例如「Nucleic Acid Hybridization」Hames,B.D.及Higgins S.J.編.(1985)；Sambrook等人，2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.；及Ausubel等人，1989,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y)。舉例而言，雜交方法可在對編碼天然卡斯蛋白酶肽之DNA之互補溫和至嚴格的條件下進行。雜交條件例如為在42℃下在包含以下各者之溶液中培育隔夜：10-20%甲醯胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5×唐納氏溶液(Denhardt's solution)、10%硫酸葡聚糖及20μg/ml變性剪切的鮭魚精DNA。

在一個實施例中，利用此項技術中充分描述之方法，包括免疫墨點分析(immunoblot analysis)，或利用許多可獲得的套裝軟體中之任一者經由所建立之方法經由電腦演算法分析胺基酸序列，對本文中所列之任何胺基酸序列之蛋白質及/或肽同源性進行測定。舉例而言，此等套裝中之一些 可包括FASTA、BLAST、MPsrch或Scanps套裝，且可採用Smith及Waterman演算法之用法及/或供分析用之整體/局部或BLOCKS比對。測定同源性之各方法代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，本發明提供一種套組，其包含執行本發明方法中所用之試劑。在另一實施例中，本發明提供一種套組，其包含本發明之組合物、工具或儀器。

應充分瞭解，術語「接觸」或「投與」可涵蓋使癌細胞、腫瘤或疾病部位與本發明之組合物直接接觸。在另一實施例中，該等術語係指使癌細胞、腫瘤或疾病部位與本發明之組合物間接接觸。在另一實施例中，本發明方法包括如此方法：個體與本發明組合物接觸，此後該組合物藉由擴散或此項技術中已知使化合物在體內循環之任何其他主動輸送或被動輸送過程而與癌細胞、腫瘤或疾病部位接觸。各可能性代表本發明之各別實施例。

在另一實施例中，術語「基因」及「重組基因」係指包含編碼本發明多肽之開放閱讀框架之核酸分子。該等自然對偶基因變異通常可引起給定基因之核苷酸序列之1-5%變異。替代性對偶基因可藉由將許多不同個體或生物體中相關基因定序來鑑別。此舉可易於藉由使用雜交探針以鑑別各種個體或生物體中相同基因座來進行。作為自然對偶基因變異之結果且並不改變功能活性之任何及所有該等核苷酸變異及所得胺基酸多形現象或變異意欲處於本發明之範疇內。

在另一實施例中，含有本發明之疫苗及組合物之醫藥組合物藉由熟習此項技術者已知之任何方法(諸如非經 腸、癌旁、經黏膜、經皮、肌肉內、靜脈內、皮內、皮下、腹膜內、心室內、顱內、陰道內或腫瘤內)投與個體。

在本文提供之方法及組合物之另一實施例中，疫苗或組合物經口投與且由此以適於經口投與之形式(亦即以固體或液體製劑形式)調配。適合之固體經口調配物包括錠劑、膠囊、丸劑、顆粒、片粒及其類似調配物。適合之液體經口調配物包括溶液、懸浮液、分散液、乳液、油劑及其類似調配物。在本發明之另一實施例中，活性成分調配於膠囊中。根據此實施例，本發明之組合物除活性化合物及惰性載劑或稀釋劑以外亦包含明膠膠囊。

在另一實施例中，疫苗或組合物藉由靜脈內、動脈內或肌肉內注射液體製劑來投與。適合之液體調配物包括溶液、懸浮液、分散液、乳液、油劑及其類似調配物。在一個實施例中，醫藥組合物經靜脈內投與且由此以適於靜脈內投與之形式調配。在另一實施例中，醫藥組合物經動脈內投與且由此以適於動脈內投與之形式調配。在另一實施例中，醫藥組合物經肌肉內投與且由此以適於肌肉內投與之形式調配。

應瞭解，術語「治療」可涵蓋治癒疾病、預防疾病、降低疾病之發病率、改善疾病之症狀、誘導疾病之緩解、減緩疾病之進展。在另一實施例中，術語「降低」、「抑制(suppressing)」及「抑制(inhibiting)」係指減輕或減少。

應充分瞭解，術語「治療有效劑量」或「治療有效量」可涵蓋針對其投與產生所需作用之劑量。確切劑量應由熟習此項技術者使用已知技術確定。

應充分瞭解，術語「約」可涵蓋在數量上加上或減去5%，或在另一實施例中加上或減去10%，或在另一實施例中加上或減去15%，或在另一實施例中加上或減去20%。

應充分瞭解，術語「個體」可涵蓋需要針對病況或其後遺症之療法或易罹患該病況或其後遺症之哺乳動物(包括人類)，且亦可包括大、貓、豬、牛、綿羊、山羊、馬、大鼠及小鼠及人類。術語「個體」並不排除在各方面正常之個體。

呈現以下實例以便更充分地說明本發明之較佳實施例。然而，其不應以任何方式解釋為限制本發明之廣泛範疇。

實例 實例1：LLO-抗原融合體誘導抗腫瘤免疫性 材料及實驗方法(實例1-2) 細胞株

C57BL/6同基因TC-1腫瘤經HPV-16 E6及E7永生化且經c-Ha-ras致癌基因轉型。TC-1(由T.C.Wu(Johns Hopkins University School of Medicine,Baltimore,MD)提供)為一種表現較低含量HPV-16 E6及E7且經c-Ha-ras致癌基因轉型之高度致瘤性肺上皮細胞。TC-1在37℃下在10% CO₂下生長於RPMI 1640、10% FCS、2mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、100μM非必需胺基酸、1mM丙酮酸鈉、50微莫耳(mcM)2-ME、400微克(mcg)/毫升G418及10%國家標準菌種保存中心-109培養基(National Collection Type Culture-109 medium)中。C3為來自經HPV 16 之完整基因組永生化且經pEJ-ras轉型之C57BL/6小鼠的小鼠胚胎細胞。EL-4/E7為經E7以反轉錄病毒方式轉導之胸腺瘤EL-4。

單核球增多性李氏菌株及增殖

所用李氏菌株為Lm-LLO-E7(游離型表現系統中之hly-E7融合基因；圖1A)、Lm-E7(整合於李氏菌基因組中之單複本E7基因卡匣)、Lm-LLO-NP(「DP-L2028」；游離型表現系統中之hly-NP融合基因)及Lm-Gag(「ZY-18」；整合於染色體中之單複本HIV-1 Gag基因卡匣)。E7藉由PCR使用引子5'-GGCTCGAGCATGGAGATACACC-3'(SEQ ID No：24；XhoI位點加下劃線)及5'-GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA-3'(SEQ ID No：25；SpeI位點加下劃線)擴增且接合至pCR2.1(Invitrogen,San Diego,CA)。E7藉由XhoI/SpeI消化自pCR2.1切除且接合至pGG-55。將hly-E7融合基因及多潛能轉錄因子prfA選殖至pAM401(一種多複本穿梭質體(Wirth R等人，J Bacteriol,165：831,1986))中，產生pGG-55。hly啟動子驅動hly基因產物之前441個AA之表現，(缺乏溶血性C端，下文稱為「△LLO」)，其利用XhoI位點連接至E7基因，產生以LLO-E7形式轉錄及分泌之hly-E7融合基因。李氏菌之prfA陰性株XFL-7(由Dr.Hao Shen,University of Pennsylvania)經pGG-55轉型，針對在活體內質體之保留進行選擇(圖1A-B)。hly啟動子及基因片段使用引子5'-GGGGGCTAGCCCTCCTTTGATTAGTATATTC-3'(SEQ ID No：26；NheI位點加下劃線)及5'-CTCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATC-3'(SEQ ID No： 27；XhoI位點加下劃線)產生。prfA基因使用引子5'-GACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3'(SEQ ID No：28；XbaI位點加下劃線)及5'-CCCGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3'(SEQ ID No：29；SalI位點加下劃線)進行PCR擴增。Lm-E7藉由將含有驅動E7表現及分泌之hly啟動子及信號序列之表現卡匣引入LM基因組之orfZ域中而產生。E7藉由PCR使用引子5'-GCGGATCCCATGGAGATACACCTAC-3'(SEQ ID No：30；BamHI位點加下劃線)及5'-GCTCTAGATTATGGTTTCTGAG-3'(SEQ ID No：31；XbaI位點加下劃線)進行擴增。E7接著接合至pZY-21穿梭載體中。LM菌株10403S經所得質體pZY-21-E7轉型，該質體包括插入對應於LM基因組之orfX、Y、Z域之1.6kb序列中間的表現卡匣。同源性域允許E7基因卡匣藉由同源重組插入orfZ域。篩選E7基因卡匣整合至orfZ域中之純系。細菌生長於具有(Lm-LLO-E7及Lm-LLO-NP)或不具有(Lm-E7及ZY-18)氯黴素(20μg/ml)之腦心浸液培養基中。細菌以等分試樣形式冷凍在-80℃下。表現利用西方墨點法(Western blotting)驗證(圖2)。

西方墨點法

李氏菌株在37℃下生長於盧里亞-貝托尼培養基(Luria-Bertoni medium)中，且在相同的在600nm處量測之光密度下收集。上清液經TCA沈澱且再懸浮於補充有0.1N NaOH之1×樣品緩衝液中。將相同量之各細胞沈澱或各TCA沈澱之上清液加載於4-20% Tris-甘胺酸SDS-PAGE凝膠(NOVEX,San Diego,CA)上。將凝膠轉移至聚偏二氟乙烯 上，且用抗E7單株抗體(mAb)(Zymed Laboratories,South San Francisco,CA)進行探針探查，接著與HRP接合之抗小鼠二級Ab(Amersham Pharmacia Biotech,Little Chalfont,U.K.)一起培育，用Amersham ECL偵測試劑顯影，且曝光於Hyperfilm(Amersham Pharmacia Biotech)上。

量測腫瘤生長

腫瘤每隔一天用測徑規跨越最短及最長表面直徑量測。此等兩個量測值之平均值以平均腫瘤直徑(以毫米為單位)對各時間點之形式作圖。小鼠在腫瘤直徑達至20mm時處死。僅展示存活小鼠之各時間點之腫瘤量測值。

李氏菌重組體對所確立之腫瘤生長的作用

6至8週大的C57BL/6小鼠(Charles River)在左側腹皮下接受2×10⁵個TC-1細胞。腫瘤接種後一週，腫瘤直徑已達至4-5mm之可觸知的大小。八隻小鼠之組接著在第7天及第14天用0.1LD₅₀ Lm-LLO-E7(10⁷個CFU)、Lm-E7(10⁶個CFU)、Lm-LLO-NP(10⁷個CFU)或Lm-Gag(5×10⁵個CFU)腹膜內處理。

⁵¹ Cr釋放分析

C57BL/6小鼠(6-8週大)用0.1LD₅₀ Lm-LLO-E7、Lm-E7、Lm-LLO-NP或Lm-Gag腹膜內免疫接種。免疫接種後十天，收集脾臟。脾細胞與作為餵養細胞之經輻射TC-1細胞(100：1，脾細胞：TC-1)一起建立於培養物中；活體外刺激5天，接著用於標準⁵¹Cr釋放分析，使用以下靶標：與E7 H-2b肽(RAHYNIVTF)(SEQ ID NO：32)一起脈衝之EL-4、EL-4/E7或EL-4。E：T細胞比率(一式三份 地進行)為80：1、40：1、20：1、10：1、5：1及2.5：1。在37℃下培育4小時後，細胞沈澱，且自各孔移除50μl上清液。樣品用Wallac 1450閃爍計數器(Gaithersburg,MD)分析。特異性溶解百分比以[(實驗性每分鐘計數(cpm)-自發性cpm)/(總cpm-自發性cpm)]×100形式測定。

TC-1特異性增殖

C57BL/6小鼠經0.1LD₅₀ Lm-LLO-E7、Lm-E7、Lm-LLO-NP或Lm-Gag免疫接種且藉由20天後用1LD₅₀ Lm-LLO-E7、Lm-E7、Lm-LLO-NP或Lm-Gag腹膜內注射來加強。加強後六天，自經免疫接種小鼠及未處理小鼠收集脾臟。在具有2.5×10⁴、1.25×10⁴、6×10³或3×10³個經輻射TC-1細胞/孔作為E7 Ag來源之情況下，或在無TC-1細胞情況下或在10μg/ml Con A情況下，脾細胞在平底96孔盤中以5×10⁵個/孔建立於培養物中。45小時後，細胞用0.5μCi[³H]胸苷/孔脈衝處理。18小時後，盤使用Tomtec收集器96(Orange,CT)收集，且用Wallac 1450閃爍計數器評估增殖。cpm之變化計算為實驗性cpm-無Ag cpm。

流動式細胞測量分析

C57BL/6小鼠用0.1LD₅₀ Lm-LLO-E7或Lm-E7靜脈內(i.v)免疫接種且30天後加強。針對CD8(53-6.7，經PE接合)、CD62配位體(CD62L；MEL-14，經APC接合)及E7 H-2Db四聚體之三色流動式細胞測量使用具有CellQuest®軟體之FACSCalibur®流式細胞儀(Becton Dickinson,Mountain View,CA)進行。加強5天後收集之脾細胞在室溫(rt)下用負載有E7肽(RAHYNIVTF)(SEQ ID NO：32)或對照(HIV-Gag)肽之H-2Db四聚體染色。四聚體以1/200稀釋液使用且由Dr.Larry R.Pease(Mayo Clinic,Rochester,MN)及由NIAID Tetramer Core Facility及NIH AIDS研究及參考試劑計劃(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)提供。分析四聚體⁺、CD8⁺、CD62L^低細胞。

B16F0-Ova實驗

24隻C57BL/6小鼠用5×10⁵個B16F0-Ova細胞接種。在第3天、第10天及第17天，8小鼠之組用0.1LD₅₀ Lm-OVA(10⁶個cfu)、Lm-LLO-OVA(10⁸個cfu)免疫接種，且八隻動物保持未經處理。

統計

針對腫瘤直徑之比較，測定各組之腫瘤大小之平均值及SD，且利用史都登氏t試驗法(Student's t test)確定統計顯著性。p0.05視為顯著。

結果

比較Lm-E7及Lm-LLO-E7影響TC-1生長之能力。皮下腫瘤建立在C57BL/6小鼠之左側腹。七天後，腫瘤已達至可觸知的大小(4-5mm)。小鼠在第7天及第14天用0.1LD₅₀ Lm-E7、Lm-LLO-E7或作為對照的Lm-Gag及Lm-LLO-NP進行疫苗接種。Lm-LLO-E7誘導75%所建立之TC-1腫瘤之完全消退，同時該組中之另2隻小鼠中之腫瘤生長得到控制(圖3)。相形之下，用Lm-E7及Lm-Gag免疫接種並不誘導腫瘤消退。此實驗多次重複，結果總是極其相似。另外，在不同免疫接種方案下針對Lm-LLO-E7獲得相似結果。在另一實驗中，單次免疫接種能夠治癒小鼠之所建立之5 mm TC-1腫瘤。

在其他實驗中，在其他2種表現E7之腫瘤細胞株：C3及EL-4/E7情況下，獲得相似結果。為了證實用Lm-LLO-E7疫苗接種之功效，分別在第60天或第40天用TC-1或EL-4/E7腫瘤細胞再攻擊腫瘤已消除之動物。用Lm-LLO-E7免疫接種之動物保持無腫瘤直至實驗結束(在TC-1情況下第124天且對於EL-4/E7第54天)。

因此，抗原以與△LLO之融合蛋白質形式表現增強抗原之免疫原性。

實例2：LM-LLO-E7處理誘發TC-1特異性脾細胞增殖

為了量測Lm-E7與Lm-LLO-E7對T細胞之誘導，在經免疫接種之小鼠中量測E7特異性增殖反應(抗原特異性免疫活性之一種量度)。來自經Lm-LLO-E7免疫接種之小鼠之脾細胞在暴露於作為E7來源之經輻射TC-1細胞時在20：1、40：1、80：1及160：1之脾細胞：TC-1比率下增殖(圖4)。相反地，來自經Lm-E7及rLm對照免疫接種之小鼠之脾細胞僅展示出背景水準之增殖。

實例3：ActA-E7及PEST-E7融合體賦予抗腫瘤免疫性材料及實驗方法 構築Lm-ActA-E7

Lm-ActA-E7為LM之重組株，其包含表現融合至截短型式actA蛋白質之E7蛋白質之質體。Lm-actA-E7藉由將質體載體pDD-1(其藉由修飾pDP-2028而構築)引入李氏菌中而產生。pDD-1包含表現以下各者之複本的表現卡匣：310bp hly啟動子及hly信號序列(ss)，其驅動ActA-E7之 表現及分泌；1170bp actA基因，其包含四個PEST序列(SEQ ID NO：11)(截短型ActA多肽由該分子之前390個AA組成，SEQ ID NO：10)；300bp HPV E7基因；1019bp prfA基因(控制毒性基因之表現)；及用於選擇經轉型之細菌純系之CAT基因(氯黴素抗性基因)(Sewell等人(2004),Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg.,130：92-97)。

hly啟動子(pHly)及基因片段使用引子5'-GGGGTCTAGACCTCCTTTGATTAGTATATTC-3'(Xba I位點加下劃線；SEQ ID NO：33)及引子5'-ATCTTCGCTATCTGTCGCCGCGGCGCGTGCTTCAGTTTGTTGCGC-'3(Not I位點加下劃線。前18個核苷酸為ActA基因重疊；SEQ ID NO：34)自pGG55(實例1)進行PCR擴增。actA基因使用引子5'-GCGCAACAAACTGAAGCAGCGGCCGCGGCGACAGATAGCGAAGAT-3'(NotI位點加下劃線；SEQ ID NO：35)及引子5'-TGTAGGTGTATCTCCATGCTCGAGAGCTAGGCGATCAATTTC-3'(XhoI位點加下劃線；SEQ ID NO：36)自LM 10403s野生型基因組進行PCR擴增。E7基因使用引子5'-GGAATTGATCGCCTAGCTCTCGAGCATGGAGATACACCTACA-3'(XhoI位點加下劃線；SEQ ID NO：37)及引子5'-AAACGGATTTATTTAGATCCCGGGTTATGGTTTCTGAGAACA-3'(XmaI位點加下劃線；SEQ ID NO：38)自pGG55(pLLO-E7)進行PCR擴增。prfA基因使用引子5'-TGTTCTCAGAAACCATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3'(XmaI位點加下劃線；SEQ ID NO：39)及引子 5'-GGGGGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3'(SalI位點加下劃線；SEQ ID NO：40)自LM 10403s野生型基因組進行PCR擴增。hly啟動子-actA基因融合體(pHly-actA)使用上游pHly引子(SEQ ID NO：33)及下游actA引子(SEQ ID NO：36)自純化之pHly DNA及純化之actA DNA進行PCR生成及擴增。

融合至prfA基因之E7基因(E7-prfA)使用上游E7引子(SEQ ID NO：37)及下游prfA基因引子(SEQ ID NO：40)自純化之E7 DNA及純化之prfA DNA進行PCR生成及擴增。

融合至E7-prfA融合產物之pHly-actA融合產物使用上游pHly引子(SEQ ID NO：33)及下游prfA基因引子(SEQ ID NO：40)自純化之經融合pHly-actA DNA產物及純化之經融合E7-prfA DNA產物進行PCR生成及擴增，且接合至pCRII(Invitrogen,La Jolla,Calif.)。勝任大腸桿菌(TOP10'F,Invitrogen,La Jolla,Calif.)經pCRII-ActAE7轉型。在溶解及分離之後，質體使用BamHI(預期片段大小770bp及6400bp(或在插入物反轉至載體中時：2500bp及4100bp))及BstXI(預期片段大小2800bp及3900bp)藉由限制性分析篩選，且亦使用上游pHly引子(SEQ ID NO：33)及下游prfA基因引子(SEQ ID NO：40)用PCR分析篩選。

pHly-actA-E7-prfA DNA插入物藉由用Xba I及Sal I雙重消化而自pCRII切除，且接合至亦經Xba I及Sal I消化之pDP-2028。在TOP10'F勝任大腸桿菌(Invitrogen,La Jolla,Calif.)經表現系統pActAE7轉型之後，氯黴素抗性純 系使用上游pHly引子(SEQ ID NO：33)及下游PrfA基因引子(SEQ ID NO：40)藉由PCR分析進行篩選。包含pActAE7之純系生長於腦心浸液培養基(具有氯黴素(20mcg(微克)/ml(毫升)，Difco,Detroit,Mich.)中，且pActAE7使用midiprep DNA純化系統套組(Promega,Madison,Wis.)自細菌細胞中分離。經青黴素處理之李氏菌之prfA陰性株(菌株XFL-7)如Ikonomidis等人(1994,J.Exp.Med.180：2209-2218)中所述經表現系統pActAE7轉型，且針對在活體內質體之保留選擇純系。純系在37℃下生長於具有氯黴素(20mcg/ml)之腦心浸液中。細菌以等分試樣形式冷凍在-80℃下。

抗原表現之免疫墨點法驗證

為了驗證Lm-ActA-E7分泌ActA-E7(約64kD)，使李氏菌株在37℃下生長於盧里亞-貝托尼(LB)培養基中。蛋白質用三氯乙酸(TCA)自培養物上清液沈澱且再懸浮於具有0.1N氫氧化鈉之1×樣品緩衝液中。將相同量之各經TCA沈澱之上清液加載於4%至20% Tris-甘胺酸十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠(NOVEX,San Diego,Calif)上。將凝膠轉移至聚偏二氟乙烯膜上，且依序用1：2500抗E7單株抗體(Zymed Laboratories,South San Francisco,Calif)及1：5000辣根過氧化酶接合之抗小鼠IgG(Amersham Pharmacia Biotech,Little Chalfont,England)進行探針探查。墨點用Amersham增強型化學發光偵測試劑顯影且曝光於自動放射顯影膜(Amersham)上(圖5A)。

構築Lm-PEST-E7、Lm-△PEST-E7及Lm-E7epi(圖6A)

Lm-PEST-E7與Lm-LLO-E7相同，除了其僅含有 hly基因之啟動子及PEST序列，特定言之LLO的前50個AA。為了構築Lm-PEST-E7，hly啟動子及PEST區使用SOE(藉由重疊延伸之基因剪接)PCR技術融合至全長E7基因。E7基因及hly-PEST基因片段自質體pGG-55(其含有LLO之前441個AA)擴增且利用習知PCR技術剪接在一起。為了形成最終質體pVS16.5，將hly-PEST-E7片段及prfA基因次選殖至質體pAM401(其包括用於活體外選擇之氯黴素抗性基因)中，且所得質體用於轉型XFL-7。

Lm-△PEST-E7為與Lm-LLO-E7相同的重組李氏菌株，除了其缺乏PEST序列。其基本上如針對Lm-PEST-E7所述製造，除了游離型表現系統使用經設計以自hly-E7融合基因中移除含PEST區(bp 333-387)之引子構築。Lm-E7epi為不具有PEST區或LLO之分泌E7之重組株。用於轉型此菌株之質體含有融合至E7基因之hly啟動子及信號序列之基因片段。此構築體與整合於染色體中表現單一複本E7基因之原始Lm-E7不同。Lm-E7epi與Lm-LLO-E7、Lm-PEST-E7及Lm-△PEST-E7為完全同基因的，除了所表現之E7抗原形式。

結果

為了比較由Lm-ActA-E7對Lm-LLO-E7誘導之抗腫瘤免疫性，將2×10⁵個TC-1腫瘤細胞皮下植入小鼠，且允許生長至可觸知大小(約5毫米[mm])。小鼠在第7天及第14天用一個LD₅₀之Lm-ActA-E7(5×10⁸個CFU)(十字)、Lm-LLO-E7(10⁸個CFU)(正方形)或Lm-E7(10⁶個CFU)(圓形)腹膜內免疫接種。到第26天，Lm-LLO-E7及Lm-ActA-E7中的所有動物都無腫瘤且保持如此，而所有的未 處理動物(三角形)及用Lm-E7免疫接種的動物生長較大腫瘤(圖5B)。因此，用ActA-E7融合體疫苗接種引起腫瘤消退。

另外，針對Lm-LLO-E7、Lm-PEST-E7、Lm-△PEST-E7及Lm-E7epi引起表現E7之腫瘤消退之能力對其進行比較。皮下TC-1腫瘤建立在40隻C57BL/6小鼠之左側腹。在腫瘤已達至4-5mm之後，將小鼠分成由8小鼠組成之5組。各組用4種重組LM疫苗中之1種處理，且1組保持未經處理。Lm-LLO-E7及Lm-PEST-E7分別誘導5/8及3/8例中所建立之腫瘤的消退。在任何時間點下用Lm-PEST-E7或Lm-LLO-E7處理之小鼠之平均腫瘤大小之間不存在統計學差異。然而，在無PEST序列、Lm-△PEST-E7及Lm-E7epi之情況下表現E7之疫苗在所有小鼠(除一隻以外)中未能引起腫瘤消退(圖6B，上圖)。此代表2次實驗，其中在第28天在用Lm-LLO-E7或Lm-PEST-E7處理之腫瘤與用Lm-E7epi或Lm-△PEST-E7處理之腫瘤之間觀察到平均腫瘤大小的統計學上顯著差異；P<0.001，史都登氏t試驗法；圖6B，下圖)。另外，在小鼠脾臟用含PEST疫苗進行疫苗接種之3次實驗中可再現地看到四聚體陽性脾細胞之百分比增加(圖6C)。因此，用PEST-E7融合體疫苗接種引起腫瘤消退。

實例4：E7與LLO、ActA或PEST樣序列之融合體增強E7特異性免疫且產生腫瘤浸潤性E7特異性CD8 ⁺ 細胞 材料及實驗方法

將包含100mcl含2×10⁵個TC-1腫瘤細胞之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)加400mcl MATRIGEL®之500mcl(微升) MATRIGEL®(BD Biosciences,Franklin Lakes,N.J)皮下植入12隻C57BL/6小鼠之左側腹(n=3)。小鼠在第7天、第14天及第21天腹膜內免疫接種，且在第28天收集脾臟及腫瘤。腫瘤MATRIGEL自小鼠中移除且在4℃下在含有2毫升(ml)RP 10培養基之試管中在冰上培育隔夜。腫瘤用鑷子切碎，切成2mm塊狀物，且在37℃下與3ml酶混合物(0.2mg/ml膠原酶-P、1mg/ml DNAse-1於PBS中)一起培育1小時。組織懸浮液經由耐綸篩(nylon mesh)過濾且用含5%胎牛血清+0.05% NaN₃之PBS洗滌以用於四聚體及IFN-γ染色。

將脾細胞及腫瘤細胞以10⁷個細胞/毫升在布雷菲德菌素A(brefeldin A)存在下與1微莫耳(mcm)E7肽一起培育5小時。細胞經洗滌兩次且在4℃下在50mcl抗小鼠Fc受體上清液(2.4 G2)中培育1小時或隔夜。細胞針對表面分子CD8及CD62L染色，透化，使用透化套組Golgi-stop®或Golgi-Plug®(Pharmingen,San Diego,Calif.)固定，且針對IFN-γ染色。500,000個事件使用雙雷射流式細胞儀FACSCalibur獲得且使用Cellquest軟體(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)分析。計算經活化(CD62L^低)CD8⁺ T細胞內分泌IFN-γ之細胞之百分比。

針對四聚體染色，H-2D^b四聚體裝載有藻紅素(PE)接合之E7肽(RAHYNIVTF，SEQ ID NO：32)，在室溫下染色1小時，且在4℃下用抗別藻藍蛋白(APC)接合之MEL-14(CD62L)及FITC接合之CD8b染色30分鐘。分析細胞，比較脾臟及腫瘤中四聚體⁺CD8⁺ CD62L^低細胞。

結果

為了分析Lm-ActA-E7增強抗原特異性免疫之能力，小鼠用TC-1腫瘤細胞植入且用Lm-LLO-E7(1×10⁷個CFU)、Lm-E7(1×10⁶個CFU)或Lm-ActA-E7(2×10⁸個CFU)免疫接種，或未經處理的(未處理)。來自Lm-LLO-E7及Lm-ActA-E7組之小鼠的腫瘤與Lm-E7或未處理小鼠中相比含有較高百分比之分泌IFN-γ之CD8⁺ T細胞(圖7A)及四聚體特異性CD8⁺細胞(圖7B)。

在另一實驗中，腫瘤負載小鼠經投與Lm-LLO-E7、Lm-PEST-E7、Lm-△PEST-E7或Lm-E7epi，且量測腫瘤內E7特異性淋巴細胞之含量。小鼠在第7天及第14天用0.1LD₅₀之4種疫苗處理。腫瘤在第21天收集且用CD62L、CD8之抗體及用E7/Db四聚體染色。在用Lm-LLO-E7及Lm-PEST-E7疫苗接種之小鼠中看到腫瘤內四聚體陽性淋巴細胞之百分比增加(圖8A)。此結果在三次實驗中為可再現的(圖8B)。

因此，Lm-LLO-E7、Lm-ActA-E7及Lm-PEST-E7各自有效誘導腫瘤浸潤性CD8⁺ T細胞及腫瘤消退。

材料及實驗方法(參見實例5-10) 細菌菌株、轉型及選擇

使用標準方案，將大腸桿菌菌株MB2159用於轉型。細菌細胞藉由用H₂O洗滌而製備用於電穿孔。

大腸桿菌菌株MB2159(Strych U等人，FEMS Microbiol Lett.2001年3月15日；196(2)：93-8)為不能合成D-丙胺酸消旋酶之alr(-)/dadX(-)缺乏突變體。李氏菌株Lm dal(-)/dat(-)(Lmdd)由於dal及dat基因之部分缺失而類似 地不能合成D-丙胺酸消旋酶。

質體構築

使用plcA基因之公開序列(Mengaud等人，Infect.Immun.1989 57,3695-3701)，PCR用於自染色體DNA擴增基因。擴增產物接著使用SalI-及XbaI-產生之DNA末端接合至pAM401以產生pDP1462。

僅含有prfA之質體pDP1500藉由以下方式構築：在用XbaI及PstI限制、用T4 DNA聚合酶處理DNA末端以使其鈍化且進行分子內接合之後自pDP1462缺失plcA基因、鹼基429至1349(Mengaud等人，上文)。

含有plcA啟動子及plcA之3'端之一部分的質體pDP1499藉由以下方式構築：在用PstI及NsiI限制且進行分子內接合之後自pDP1339缺失plcA內部片段、鹼基428至882(Mengaud等人，Infect.Immun.1989 57,3695-3701)。

pDP1526(pKSV7：：△plcA)藉由以下各者之單一三部分接合來構築：用BAMHI及XbaI限制之pKSV7；來自含有plcA之5'端之pAM401：：plcA之468bp XbaI及NsiI產生的片段(鹼基882至1351；Mengaud等人，上文)；及來自含有plcA之3'端之pAM401：：plcA prfA之501bp PstI及BamHI產生的片段(鹼基77至429；Mengaud等人，上文)。

prfA啟動子(鹼基1-429(Mengaud等人，上文))藉由pDP1462之EcoRI及PstI雙重消化來分離，且隨後將該片段接合至EcoRI及PstI限制之pKSV7以產生pDP1498。將兩個隨機的HindIII產生之10403S染色體DNA片段(長度約3kb)接合至HindIII限制之pKSV7，從而產生隨機整合對照 質體pDP1519及pDP1521。

構築單核球增多性李氏菌突變株

單核球增多性李氏菌株DP-L1387自如先前所述構築之SLCC 5764之Tn917-LTV3庫用還原之卵磷脂酶(PC-PLC)以突變體形式分離(Camilli等人，J.Bacteriol.1990,172,3738-3744)。Tn917-LTV3插入之位點藉由如先前所述對一個轉座子-染色體DNA接合點進行定序來確定(Sun等人，Infect.Immun.1990 58,3770-3778)。單核球增多性李氏菌如先前所述用質體DNA轉型(Camilli等人，上文)。在10微克氯黴素/毫升培養基存在下施加用於在單核球增多性李氏菌中維持pAM401、pKSV7及其衍生物之選擇壓力。另外，pKSV7衍生物之維持需要在30℃(用於革蘭氏陽性菌中質體複製之許可溫度)下生長。

pKSV7衍生物整合至單核球增多性李氏菌染色體中藉由質體上單核球增多性李氏菌DNA序列及其相應染色體對偶基因之間的同源重組來進行。整合突變體藉由在40℃(pKSV7複製之非許可溫度)下在含有10微克氯黴素/毫升培養基之腦心浸液(BHI)培養液中生長約30代來增濃。各整合菌株為在含有10微克氯黴素/毫升培養基之BHI瓊脂上純化且在40℃下培育之後續群落。自各整合菌株分離之染色體DNA之南方墨點分析(Southern blot analyse)證實經整合質體之存在。

DP-L1552之構築藉由整合pKSV7衍生物pDP1526以產生如上所述部分二倍體中間物來達成。經由分子內同源重組，經整合質體之自發切除以低頻率發生。質體 已自染色體中切除之細菌藉由在30℃下在BHI培養液中生長約50代來增濃。在此步驟期間選擇壓力之性質並非已知，但可歸因於含有整合之溫度敏感性質體之菌株的略微生長缺陷。約50%切除事件(亦即由缺失之序列3'之間的同源重組產生之切除事件)引起針對染色體上野生型對偶基因之△plcA之對偶基因交換。

切除之質體藉由使細菌在40℃下在BHI中生長約30代而治癒。在染色體上保留△plcA對偶基因之質體之細菌治癒藉由其在生長在含有5ml覆蓋BHI瓊脂/2.5%蛋黃/2.5%磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(BHI/蛋黃瓊脂)之BHI瓊脂盤上之後不能產生圍繞群落之混濁區域來鑑別。混濁區域由蛋黃中PI之PI-PLC水解產生，得到不溶性二醯基甘油沈澱。單核球增多性李氏菌染色體上正確plcA缺失藉由使用PCR擴增缺失之對偶基因且在缺失中定序來證實。

因此，PI-PLC陰性突變體(plcA缺失突變體)可以根據本發明用於產生減毒單核球增多性李氏菌疫苗。其他突變體使用相同方法製造，亦即，actA缺失突變體、plcB缺失突變體及缺乏plcA及plcB兩者之雙突變體，其所有亦可根據本發明用於產生減毒單核球增多性李氏菌疫苗。鑒於本發明，熟習此項技術者將能建立除上述減毒突變體以外之其他減毒突變體。

構築Lmdd

dal基因最初藉助於染色體基因與溫度敏感性穿梭質體pKSV7(Smith K等人，Biochimie.1992年7月-8月；74(7-8)：705-11)之間的雙重對偶基因交換而失活，該溫度 敏感性穿梭質體pKSV7攜帶在來自原始850-bp dal基因PCR產物之5'端的450-bp片段與來自dal基因PCR產物之3'端的450-bp片段之間的紅黴素抗性基因。隨後，覆蓋82%基因之dal缺失突變體藉由與pKSV7之類似交換反應來構築，該pKSV7攜帶圍繞所需缺失之完整基因(包括基因之序列上游及下游)之5'及3'端之同源區。PCR分析用於證實此染色體缺失之結構。

染色體dat基因藉由類似對偶基因交換反應而失活。pKSV7經修飾以攜帶由PCR自完整dat基因(包括基因之序列上游及下游)之5'及3'兩個末端獲得之450-bp片段。此等兩個片段藉由適當PCR接合。此構築體交換至染色體中引起dat基因之中心鹼基30%缺失，此由PCR分析證實。

李氏菌之細菌培養及活體內繼代

大腸桿菌根據標準方法培養。李氏菌在LB培養基(Difco,Detroit,MI)+50μg/ml鏈黴素中在37℃下、250rpm振盪下生長，且在指數生長期期間收集。針對Lm-LLOE7，向培養基中添加37μg/ml氯黴素。針對生長動力學測定，使細菌在10ml LB+抗生素中生長16小時。量測OD_600nm，且在菌株之間歸一化培養密度。培養物1：50稀釋至LB+適合抗生素及D-丙胺酸(若適用)中。

LM在小鼠中之繼代

將1×10⁸個CFU腹膜內(i.p.)注射至C57BL/6小鼠中。在第三天，分離脾臟且在PBS中均質化。將脾臟懸浮液之等分試樣塗在具有抗生素(如適用)之LB盤上。數個群落擴大且混合以建立注射儲備液。

構築無抗生素抗性因子之質體pTV3

構築p60-dal卡匣.構築無抗生素抗性基因之載體之第一步驟為構築截短型p60啟動子與dal基因之融合體。Lm丙胺酸消旋酶(dal)基因(正向引子：5'-CCA TGG TGA CAG GCT GGC ATC-3'；SEQ ID NO：41)(反向引子：5'-GCT AGC CTA ATG GAT GTA TTT TCT AGG-3'；SEQ ID NO：42)及最小p60啟動子序列(正向引子：5'-TTA ATT AAC AAA TAG TTG GTA TAG TCC-3'；SEQ ID No：43)(反向引子：5'-GAC GAT GCC AGC CTG TCA CCA TGG AAA ACT CCT CTC-3'；SEQ ID No：44)藉由PCR擴增自LM菌株10403S之基因組分離。該等引子引入p60序列上游PacI位點、dal序列下游NheI位點(呈粗體之限制性位點)及p60啟動子下游重疊dal序列(前18個bp)以用於隨後藉由剪接重疊延伸(SOE)-PCR來融合p60及dal。截短型p60啟動子之序列為： (SEQ ID NO：45)(Kohler等人，J Bacteriol 173：4668-74，1991)。使用SOE-PCR，將p60及dal PCR產物融合且選殖至選殖載體pCR2.1(Invitrogen,La Jolla,CA)中。

自pGG55移除抗生素抗性基因.用於自pGG55移除氯黴素乙醯轉移酶(CAT)基因且引入p60-dal卡匣之後續選殖策略亦間歇地引起革蘭氏陽性複製區域(oriRep)之移除(Brantl等人，Nucleic Acid Res 18：4783-4790,1990)。為 了再引入革蘭氏陽性oriRep，使用添加序列上游NarI/EheI位點之5'引子(GGCGCCACTAACTCAACGCTAGTAG，SEQ ID NO：46)及添加序列下游NheI位點之3'引子(GCTAGCCAGCAAAGAAAAACAAACACG，SEQ ID NO：47)，自pGG55對oriRep進行PCR擴增。將PCR產物選殖至選殖載體pCR2.1中且驗證序列。

為了將p60-dal序列併入pGG55載體，藉由PacI/NheI雙重消化自pCR-p60dal切除p60-dal表現卡匣。pGG55中革蘭氏陽性菌之複製區域藉由PCR(引子1，5'-GTC GAC GGT CAC CGG CGC CAC TAA CTC AAC GCT AGT AG-3'；SEQ ID No：48)(引子2，5'-TTA ATT AAG CTA GCC AGC AAA GAA AAA CAA ACA CG-3'；SEQ ID No：49)自pCR-oriRep擴增以引入EheI及NheI之其他限制性位點。將PCR產物接合至pCR2.1-TOPO(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)，且驗證序列。複製區域藉由EheI/NheI消化來切除，且載體pGG55用EheI及NheI雙重消化，同時自質體移除兩個CAT基因。將兩個插入物p60-dal與oriRep及pGG55片段接合在一起，產生pTV3(圖9)。pTV3亦含有prfA(病原性調節因子A)基因。此基因不為pTV3功能所必需，但可用於要求或需要其他所選標誌物之情形。

製備DNA用於即時PCR

總李氏菌DNA使用Masterpure®總DNA套組(Epicentre,Madison,WI)製備。將李氏菌在37℃下培養24小時且以250rpm在25ml盧里亞-貝托尼培養液(LB)中振盪。細菌細胞藉由離心沈澱，再懸浮於補充有5mg/ml溶菌 酶之PBS中且在37℃下培育20分鐘，此後分離DNA。

為了獲得標準目標DNA用於即時PCR，LLO-E7基因自pGG55(5'-ATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTAC-3'(SEQ ID NO：50)；5'-GCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGTGGTTTCTGAGAACAGATG-3'(SEQ ID NO：51))PCR擴增且選殖至載體pETblue1(Novagen,San Diego,CA)中。類似地，將plcA擴增子選殖至pCR2.1中。大腸桿菌分別用pET-LLOE7及pCR-plcA轉型，且純化之質體DNA經製備以用於即時PCR。

即時PCR

使用ABI PrimerExpress軟體(Applied Biosystems)以E7作為質體目標，使用以下引子：5'-GCAAGTGTGACTCTACGCTTCG-3'(SEQ ID NO：52)；5'-TGCCCATTAACAGGTCTTCCA-3'(SEQ ID NO：53)；5'-FAM-TGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTAC-TAMRA-3'(SEQ ID NO：54)及一個複本基因plcA(TGACATCGTTTGTGTTTGAGCTAG-3'(SEQ ID NO：55)、5'-GCAGCGCTCTCTATACCAGGTAC-3'(SEQ ID NO：56)；5'-TET-TTAATGTCCATGTTA TGTCTCCGTTATAGCTCATCGTA-TAMRA-3'；SEQ ID NO：57)作為李氏菌基因組目標，設計Taqman引子-探針組(Applied Biosystems,Foster City,CA)。

將0.4μM引子及0.05mM探針與如由製造商推薦之PuRE Taq RTG PCR珠粒(Amersham,Piscataway,NJ)混合。標準曲線用純化之質體DNA pET-LLOE7及pCR-plcA(內標)針對各目標製備且用於計算未知樣品中之基因複本數。E7複本/plcA複本之平均比率基於標準曲線計算且藉由將Lmdd-TV3及Lm-LLOE7之結果除以來自Lm-E7(一種單複本 E7基因整合於基因組中之李氏菌株)之結果來校準。所有樣品均在重複三次之各qPCR分析中一式三份地運作。樣品之間的變異使用KyPlot軟體利用雙因子ANOVA分析。若p<0.05，則認為結果在統計學上顯著。

生長量測

細菌在37℃、250rpm振盪下在盧里亞貝托尼(LB)培養基+/-100微克(μg)/毫升D-丙胺酸和/或37μg/ml氯黴素中生長。起始接種物基於欲對所有菌株為相同的OD_600nm量測值調整。

溶血性溶解分析

將4×10⁹個CFU之李氏菌解凍，藉由離心(1分鐘，14000rpm)沈澱且再懸浮於具有1M半胱腔酸之100μl PBS(pH 5.5)中。細菌1：2連續稀釋且在37℃下培育45分鐘以便活化分泌之LLO。脫纖維蛋白之全部綿羊血液(Cedarlane,Hornby,Ontario,Canada)用5倍體積PBS洗滌兩次且用6倍體積PBS-半胱胺酸洗滌三至四次，直至上清液保持清澈為止，在洗滌步驟之間以3000×g沈澱細胞8分鐘，接著在PBS-半胱胺酸中再懸浮至最終濃度10%(v/v)。100μl 10%經洗滌血細胞與100μl李氏菌懸浮液混合且在37℃下再培育45分鐘。未溶解血細胞接著藉由離心(10分鐘，1000×g)沈澱。將100μl上清液轉移至新盤中，且OD_530nm經測定且相對於樣品稀釋度作圖。

Lmdd-Tv3之治療功效

將10⁵個TC-1(ATCC,Manassas,VA)皮下植入C57BL/6小鼠(n=8)且允許生長約7天，此後腫瘤為可觸 知的。TC-1為用HPV E6及E7永生化且用活化ras轉型之C57BL/6上皮細胞株，其在皮下植入後形成腫瘤。小鼠在植入腫瘤細胞之後第7天及第14天用0.1LD₅₀適當李氏菌株免疫接種。亦包括未經免疫接種之對照組(未處理)。用電子測徑規量測腫瘤生長。

生成ActA缺失突變體

菌株Lm dal dat(Lmdd)藉由毒性因子ActA之不可逆缺失而減毒。Lmdaldat(Lmdd)背景中actA之同框缺失經構築以避免對下游基因表現之任何極化效應。Lm dal dat△actA含有N端處前19個胺基酸及C端之28個胺基酸殘基，具有591個胺基酸之ActA之缺失。基因缺失至染色體點中使用外部黏接於actA缺失區域之引子驗證。此等為引子3(Adv305-tgggatggccaagaaattc)(SEQ ID NO：58)及4(Adv304-ctaccatgtcttccgttgcttg)(SEQ ID NO：59)，如圖12中所示。對自Lmdd及Lm-dd△actA分離之染色體DNA進行PCR分析。在用兩組不同的引物對1、2及3、4擴增之後Lm-dd染色體DNA中DNA片段之大小預期為3.0Kb及3.4Kb。然而，對於Lm-dd△actA，使用引物對1、2及3、4之PCR之預期大小為1.2Kb及1.6Kb。因此，圖12中PCR分析證實，actA之1.8KB區域在菌株Lm-dd△actA中缺失。亦對PCR產物進行DNA定序，以證實菌株Lm-dd△actA中含actA區之缺失(圖13)。

(SEQ ID NO：60)。

產生發炎性細胞激素：

巨噬細胞(諸如RAW 264.7)用不同李氏菌主鏈(諸如Lm prfA-(pGG55)、Lm dal dat、Lm dal dat actA、Lm dal dat actA△inlC及Lm dal dat△inlC)感染，且在不同時間點收集上清液以使用不同的基於ELISA之套組定量各種細胞激素之含量。定量之細胞激素包括IFN-γ、TNF-α及IL-6。

活體內細胞激素產生：

為量測活體內細胞激素產生及嗜中性白血球募集，C57BL/6小鼠用不同的10⁸個CFU之Lm prfA-(pGG55)、Lm dal dat、Lm dal dat actA、Lm dal dat actA△inlC及Lm dal dat△inlC、李氏菌對照或相等體積鹽水腹膜內注射。在12小時之後，殺死小鼠且用2mL PBS洗滌腹腔。針對塗於生長培養基上後之細菌負荷及促發炎細胞激素(諸如MIP-1α、KC、MCP等)之分析，檢查腹膜洗滌液。使用流動式細胞測量術，在用標誌物(諸如Gr-1、CD11b及F4/80)染色之後測定嗜中性白血球及巨噬細胞之數目，且另外此等群體使用CellQuest軟體定量。

Transwell遷移分析：

進行此分析以測定在用inlC缺失菌株感染骨髓來源巨噬細胞或樹突狀細胞之後嗜中性白血球遷移是否增加。骨髓來源巨噬細胞或樹突狀細胞自諸如C57BL/6之小鼠中分離且用inlC缺失突變體或對照李氏菌感染。使用經感染細胞，使用corning costar Transwell盤建立transwell分析。該分析最初使用3、5或8微米孔transwell盤標準化。為了測試嗜中性白血球遷移，將經感染APC塗在盤底部，且將嗜中性白血球塗在腔室中孔之頂部。在不同時間點，計數細胞以測定已遷移至底部之嗜中性白血球之數目。

Lm dal dat actA△inlC突變體之治療功效：

為了測定inlC突變體之治療功效，將人類前列腺特異性抗原(PSA)用作腫瘤抗原作為概念驗證。主鏈Lm dal dat actA inlC用含有人類PSA之表現卡匣的質體pAdv142轉 型，產生LmddAinlC142。菌株LmddAinlC142之特徵在於表現並分泌融合蛋白質tLLO-PSA。另外，使菌株LmddAinlC142在活體內在小鼠中繼代兩次，且針對融合蛋白質tLLO-PSA之表現及分泌對兩次活體內繼代後獲得之群落進行檢查。疫苗工作儲備液由在第二次活體內繼代之後獲得之群落製備，且此用於評估治療效果及免疫原性。

對腫瘤微環境之影響：

測定LmddA、LmddA△actA、LmddA△PlcA、LmddA△PlcB、LmddA△prfA、LmddAinlC142、LmddA142及其他對照菌株引起腫瘤微環境中免疫細胞浸潤之能力。在此研究中，小鼠在第0天用1×10⁶個TPSA23腫瘤細胞接種且在第7天、第14天及第21天用10⁸個CFU之LmddAinlC142、LmddA142及其他對照菌株疫苗接種。在第28天收集腫瘤且加以處理以用於用不同細胞表面標誌物(諸如Gr-1、CD11b、CD3、CD4、CD8、CD25、Foxp3、NK1.1及CD62L)進一步染色。使用此等標誌物，所檢查之不同細胞群體包括巨噬細胞(CD11b⁺)、NK細胞(NK1.1⁺)、嗜中性白血球(Gr-1⁺ CD11b⁺)、骨髓來源抑制性細胞(MDSC)(Gr-1⁺ CD11b⁺)、調節性T細胞(CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺)及效應T細胞(CD8⁺ CD3⁺ CD62L^低)。其他效應T細胞之特徵在於其產生效應細胞激素(諸如IFN-γ、TNF-α及IL-2)之功能性能力。測試腫瘤內調節性T細胞及MDSC引起T細胞增殖抑制之能力。

結果 實例5：含有胺基酸代謝酶代替抗生素抗性基因之質體存活體外及活體內均保留在大腸桿菌及LM中

基於D-丙胺酸消旋酶之營養缺陷型補充系統用於在不使用抗生素抗性基因之情況下介導質體保留在LM中。大腸桿菌菌株MB2159為不能合成D-丙胺酸消旋酶之alr(-)/dadX(-)缺乏突變體。李氏菌株Lm dal(-)/dat(-)(Lmdd)由於dal及dat基因之部分缺失而類似地不能合成D-丙胺酸消旋酶。質體pGG55(其基於大腸桿菌-李氏菌穿梭載體pAM401)藉由以下方式修飾：移除兩個CAT基因且其用在李氏菌p60啟動子控制下之p60-dal表現卡匣代替以產生pTV3(圖9)。DNA自數個群落純化。

實例6：含有新陳代謝酶之質體並不增加細菌之毒性

由於毒性與LLO功能相關，故比較Lmdd-TV3與Lm-LLOE7之間的溶血性溶解活性。此分析藉由溶解紅血球來測試LLO功能且可用培養物上清液、純化之LLO或細菌細胞執行。Lmdd-TV3與Lm-LLOE7相比展示較高溶血性溶解活性。

活體內毒性亦藉由測定LD50值(一種量測毒性之更直接且因此精確的方式)來量測。Lmdd-TV3之LD₅₀(0.75×10⁹)與Lm-LLOE7之LD₅₀(1×10⁹)極其接近，展示含有新陳代謝酶之質體並不增加細菌毒性。

實例7：由含有新陳代謝酶之質體誘導抗腫瘤免疫性

在腫瘤消退模型中測定含新陳代謝酶之質體作為癌症疫苗之功效。使用TC-1細胞株模型，其經充分表徵以用於HPV疫苗研發，且其允許在用Lmdd-TV3或Lm-LLOE7免疫接種之後所建立之類似大小腫瘤之消退的經控制比較。在兩個獨立實驗中，用Lmdd-TV3及Lm-LLOE7免疫接種小 鼠引起類似的腫瘤消退(圖14)，且經疫苗接種組之間在統計學上無顯著差異(p<0.05)。所有經免疫接種小鼠在63天之後仍活著，而未經免疫接種之小鼠在其腫瘤直徑達至20mm時必需處死。治癒之小鼠保持無腫瘤直至實驗結束為止。

因此，含新陳代謝酶之質體作為治療性癌症疫苗為有效的。由於治療性癌症疫苗所需之免疫反應與防治性癌症疫苗所需之免疫反應相比較強，故此等結果亦針對防治性癌症疫苗展示效用。

實例8：inlC-缺失突變體產生顯著較高含量之趨化因子及細胞激素.

inlC缺失突變體產生顯著較高含量之趨化因子，諸如MIP-1α、KC(IL-8之小鼠同系物)、MCP，引起嗜中性白血球及白血球對感染部位之浸潤。因此，在腹膜內投與不同李氏菌株時，inlC突變體展示注射後12小時獲得之腹膜液中吸引嗜中性白血球及巨噬細胞之此等細胞激素及趨化因子之產生增加。另外，inlC缺失突變體在與對照菌株相比時產生顯著較高含量之發炎性細胞激素。

實例9：inlC-缺失突變體誘導嗜中性白血球遷移

經inlC缺失突變體感染之巨噬細胞在與其他對照菌株相比時在不同時間點下嗜中性白血球之遷移顯著增加。此實驗結果強有力支持此菌株在感染期間吸引諸如嗜中性白血球之免疫細胞的能力。

實例10：inlC-缺失突變體實現治療性抗腫瘤反應

使用LmddA142及LmddAinlC142兩者之抗腫瘤研究結果彼此極其相當，且觀察到腫瘤之治療性消退。另外， 由於LmddAinlC142能產生較高水準先天反應且促發炎細胞激素分泌增加，故兩劑LmddAinlC142與三劑菌株LmddA142相當。

材料及方法(實例11-16)

寡核苷酸由Invitrogen(Carlsbad,CA)合成，且DNA定序由Genewiz Inc,South Plainfield,NJ進行。流動式細胞測量術試劑由Becton Dickinson Biosciences(BD,San Diego,CA)購買。除非指示，否則細胞培養基、補充劑及所有其他試劑係來自Sigma(St.Louise,MO)。Her2/neu HLA-A2肽由EZbiolabs(Westfield,IN)合成。完全RPMI-1640(C-RPMI)培養基含有2mM麩醯胺酸、0.1mM非必需胺基酸及1mM丙酮酸鈉、10%胎牛血清、青黴素/鏈黴素、Hepes(25mM)。多株抗LLO抗體如先前所述，且抗Her2/neu抗體由Sigma購買。

小鼠及細胞株

所有動物實驗均根據由University of Pennsylvania或Rutgers University之IACUC批准之方案執行。FVB/N小鼠係購自Jackson laboratories(Bar Harbor,ME)。在University of Pennsylvania之動物中心設施容納並飼養會過度表現大鼠Her2/neu onco-蛋白質之FVB/N Her2/neu轉殖基因小鼠。NT-2腫瘤細胞株表現較高含量之大鼠Her2/neu蛋白質，自此等小鼠中之自發性乳房腫瘤獲得並如先前所述生長。DHFR-G8(3T3/neu)細胞係自ATCC獲得並根據ATCC建議生長。EMT6-Luc細胞株由Dr.John Ohlfest(University of Minnesota,MN)慷慨饋贈並生長於完全 C-RPMI培養基中。在University of Pennsylvania(Philadelphia,PA)在小動物成像設施(Small Animal Imaging Facility，SAIF)指導下進行生物發光工作。

李氏菌構築體及抗原表現

Her2/neu-pGEM7Z由University of Pennsylvania之Dr.Mark Greene友情提供且含有選殖至pGEM7Z質體(Promega,Madison WI)中之全長人類Her2/neu(hHer2)基因。將此質體用作模板，從而使用pfx DNA聚合酶(Invitrogen)及表1中指示之寡聚物藉由PCR擴增hHer-2/neu之三個區段(亦即EC1、EC2及IC1)。

Her-2/neu嵌合體構築體利用SOEing PCR方法及各獨立hHer-2/neu區段作為模板藉由直接融合而產生。引子展示於表2中。

用於擴增不同區段人類Her2區之引子序列.

用於擴增不同區段人類Her2區之引子序列.

ChHer2基因使用XhoI及SpeI限制酶自pAdv138切除，且用Lmdd穿梭載體pAdv134中LLO之截短型非溶血性片段同框選殖。插人物LLO及hly啟動子之序列藉由DNA定序分析來證實。將此質體電穿孔至電勝任型actA、dal、dat突變體單核球增多性李氏菌菌株LmddA中，且在含有鏈黴素(250μg/ml)之腦心浸液(BHI)瓊脂盤上選擇陽性純系。在一些實驗中，表現hHer2/neu(Lm-hHer2)片段之類似李氏菌株用於比較性目的。此等先前已經描述。在所有研究中，不相關李氏菌構築體(Lm-對照)被包括在內以考慮李氏菌對免疫系統之抗原非依賴性作用。Lm-對照係基於與ADXS31-164相同的李氏菌平台，但表現不同抗原，諸如HPV16-E7或NY-ESO-1。測試融合蛋白質自李氏菌之表現及分泌。各構築體在活體內繼代兩次。

細胞毒性分析

由3-5隻FVB/N小鼠組成之組以一個週間隔用1×10⁸個集落形成單位(CFU)之Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164、Lm-hHer2 ICI或Lm-對照(表現不相關抗原)免疫接種三次或保持未處理。使NT-2細胞在活體外生長，利用胰蛋白酶分離，且在37℃下用絲裂黴素C(250μg/ml於無血清C-RPMI培養基中)處理45分鐘。在5次洗滌之後，將其與自經免疫接種或未處理動物收集之脾細胞一起在37℃及5% CO₂下以1：5(激勵者：反應者)之比率共培育5天。標準細胞毒性分析使用銪標記之3T3/neu(DHFR-G8)細胞作為目標根據先前描述之方法執行。在4小時培育之後，使用分光光度計(Perkin Elmer,Victor²)在590nm下量測自殺死之目標細胞釋放之銪。特異性溶解百分比被定義為(實驗組中之溶解-自發性溶解)/(最大溶解-自發性溶解)。

由來自經免疫接種之小鼠之脾細胞分泌的干擾素-γ

由3-5隻FVB/N或HLA-A2轉殖基因小鼠組成之組以一週間隔用1×10⁸個CFU之ADXS31-164、陰性李氏菌對照(表現不相關抗原)免疫接種三次或保持未處理。在最後一次免疫接種後一週分離來自FVB/N小鼠之脾細胞，且將其在C-RPMI培養基中在絲裂黴素C處理之NT-2細胞存在下以5×10⁶個細胞/孔共培養於24孔盤中。來自HLA-A2轉殖基因小鼠之脾細胞在1μM HLA-A2特異性肽或1μg/ml重組His-標記之ChHer2蛋白質(其產生於大腸桿菌中且藉由基於鎳之親和層析系統純化)存在下培育。24或72小時後獲得來自上清液之樣品，且根據製造商之建議使用小鼠IFN-γ酶聯結免疫吸附劑分析(ELISA)套組針對干擾素-γ(IFN-γ)之 存在進行測試。

Her2轉殖基因動物中之腫瘤研究

六週大FVB/N大鼠Her2/neu轉殖基因小鼠(9-14隻/組)用5×10⁸個CFU之Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164或Lm-對照免疫接種6次。針對自發性乳房腫瘤(其使用電子測徑規量測)之出現對其每週兩次進行觀察，持續至多52週。逃避之腫瘤在其平均直徑達至大小1cm²時切除且在-20℃下保存於RNAlater中。為了測定Her2/neu蛋白質中突變對此等腫瘤之逃避的作用，使用基因組DNA分離套組提取基因組DNA，且進行定序。

ADXS31-164對脾臟及腫瘤中之調節性T細胞之作用

用1×10⁶個NT-2細胞皮下(s.c.)植入小鼠。在第7天、第14天及第21天，其用1×10⁸個CFU之ADXS31-164、LmddA-對照免疫接種或保持未處理。在第28天提取腫瘤及脾臟，且利用FACS分析針對CD3⁺/CD4⁺/FoxP3⁺ Treg之存在對其進行測試。簡言之，脾細胞藉由在C-RPMI培養基中在兩塊玻璃載片之間均質化脾臟而分離。腫瘤使用無菌刀片切碎且用含有DNase(12U/ml)及膠原酶(2mg/ml)於PBS中之緩衝液消化。在攪拌下在室溫下培育60分鐘後，藉由劇烈移液來分離細胞。紅血球利用RBC溶解緩衝液溶解，隨後用含有10% FBS之完全RPMI-1640培養基洗滌數次。經由耐綸篩過濾後，將腫瘤細胞及脾細胞再懸浮於FACS緩衝液(2% FBS/PBS)中，且用抗CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC、CD25-APC抗體染色，隨後用抗Foxp3-PE透化並染色。流動式細胞測量術分析使用4色FACS calibur(BD) 執行，且使用cell quest軟體(BD)分析資料。

統計分析

將對數等級卡方試驗(log-rank Chi-Squared test)用於存活率資料，且史都登氏t試驗用於CTL及ELISA分析(其一式三份地進行)。在此等分析中，p值小於0.05(標記為*)視為在統計學上顯著。所有統計分析均用Prism軟體V.4.0a(2006)或SPSS軟體V.15.0(2006)進行。除非另作說明，否則針對所有FVB/N大鼠Her2/neu轉殖基因研究，吾人使用每組8-14隻小鼠，針對所有野生型FVB/N研究，吾人使用每組至少8隻小鼠。所有研究均重複至少一次，除了Her2/neu轉殖基因小鼠模型中之長期腫瘤研究。

結果 實例11：分泌融合至Her-2片段之LLO片段之單核球增多性李氏菌株的產生：構築ADXS31-164.

先前已描述嵌合Her2/neu基因(ChHer2)之構築。簡言之，ChHer2基因藉由利用SOEing PCR方法將Her2/neu蛋白質之兩個細胞外片段(aa 40-170及aa 359-433)及一個細胞內片段(aa 678-808)直接融合而產生。嵌合蛋白具有蛋白質之大部分已知人類MHC I類抗原決定基。ChHer2基因自質體pAdv138(其用於構築Lm-LLO-ChHer2)切除且選殖至LmddA穿梭質體中，產生質體pAdv164(圖15A)。此等兩個質體主鏈之間存在兩個主要差異。1)pAdv138使用氯黴素抗性標誌物(cat)以用於重組細菌之活體外選擇，而pAdv164具有來自枯草桿菌(Bacillus subtilis)之D-丙胺酸消旋酶基因(dal)(其使用代謝補充路徑)以用於活體外選擇 及活體內質體保留於缺乏dal-dat基因之LmddA菌株中。此疫苗平台經設計及發展以解決FDA關於工程化李氏菌疫苗株之抗生素抗性的顧慮。2)不同於pAdv138，pAdv164在質體中並不具有prfA基因之複本(參見下文及圖15A之序列)，因為此並非為Lmdd菌株之活體內補充所必需的。LmddA疫苗株亦缺乏actA基因(負責李氏菌之細胞內移動及細胞至細胞擴散)，因此自此主鏈獲得之重組疫苗株與自其親株Lmdd獲得者相比毒性小100倍。基於LmddA之疫苗與基於Lmdd之疫苗相比亦自經免疫接種小鼠之脾臟中遠為較快地清除(在不到48小時內)。融合蛋白質tLLO-ChHer2自此菌株之表現及分泌與活體外生長8小時後TCA沈澱之細胞培養上清液中Lm-LLO-ChHer2之表現及分泌(圖15B)相當，因為使用西方墨點分析利用抗LLO抗體偵測到約104KD之條帶。將僅表現tLLO之李氏菌主鏈菌株用作陰性對照。

pAdv164序列(7075個鹼基對)(參見圖15)： (SEQ ID NO：73)

實例12：ADXS31-164具如LM-LLO-ChHER2般之免疫原性.

在標準CTL分析中將ADXS31-164在產生抗Her2/neu特異性細胞毒性T細胞方面之免疫原性性質與Lm-LLO-ChHer2疫苗之免疫原性性質比較。兩種疫苗對由3T3/neu目標細胞表現之Her2/neu抗原誘發強大但相當的細胞毒性T細胞反應。因此，與含有較多MHC I類抗原決定基之嵌合體相比，用僅表現Her2融合至LLO之細胞內片段之李氏菌免疫接種的小鼠展示較低溶解活性。在未處理動物或用不相關李氏菌疫苗注射之小鼠中未偵測到CTL活性(圖16A)。ADXS31-164亦能夠刺激由來自野生型FVB/N小鼠之脾細胞分泌IFN-γ(圖16B)。在與經絲裂黴素C處理之NT-2細胞(其表現較高含量Her2/neu抗原)一起共培養之此等細胞之培養物上清液中偵測到此現象(圖19C)。

在HLA-A2小鼠中測試在用ADXS31-164免疫接種之後人類MHCI類抗原決定基之適當處理及呈現。將來自經免疫接種之HLA-A2轉殖基因動物之脾細胞與肽一起共培育72小時，該等肽對應於位於Her2/neu分子之細胞外 (HLYQGCQVV SEQ ID NO：74或KIFGSLAFL SEQ ID NO：75)或細胞內(RLLQETELV SEQ ID NO：76)域之定位之HLA-A2限制的抗原決定基(圖16C)。將重組ChHer2蛋白質用作陽性對照且將不相關肽或無肽用作陰性對照。來自此實驗之資料展示ADXS31-164能夠對位於目標抗原之不同域處之人類抗原決定基誘發抗Her2/neu特異性免疫反應。

實例13：ADXS31-164與LM-LLO-ChHER2相比在預防自發性乳房腫瘤發作方面較有效.

在處於20-25週齡發展生長遲緩的自發性乳房腫瘤之Her2/neu轉殖基因動物中，將ADXS31-164之抗腫瘤作用與Lm-LLO-ChHer2之抗腫瘤作用相比。經不相關的李氏菌對照疫苗免疫接種之所有動物均在第21-25週內產生乳房腫瘤且在第33週之前處死。與此對比，李氏菌-Her2/neu重組疫苗在形成乳房腫瘤方面引起顯著延遲。在第45週，與25%經Lm-LLO-ChHer2免疫接種之小鼠相比，超過50% ADXS31-164疫苗接種之小鼠(9隻中之5隻)仍然無腫瘤。在第52週，8隻經ADXS31-164免疫接種之小鼠中之2隻仍然保持無腫瘤，而來自其他實驗組之所有小鼠均已死於其疾病(圖17)。此等結果指示儘管減毒較多，但ADXS31-164與Lm-LLO-ChHer2相比在Her2/neu轉殖基因動物中在預防自發性乳房腫瘤發作方面較有效。

實例14：在用ADXS31-164免疫接種後HER2/NEU基因中之突變.

在用小片段疫苗或曲妥珠單抗(trastuzumab；Herceptin；一種靶向Her2/neu胞外域中抗原決定基之單株抗 體)免疫接種後，Her2/neu之MHC I類抗原決定基突變已視為造成腫瘤脫逃。為了對此進行評估，在轉殖基因動物中自逃避腫瘤中提取基因組材料，且對用嵌合或對照疫苗免疫接種之腫瘤中neu基因之相應片段進行定序。在任何疫苗接種之腫瘤樣品之Her-2/neu基因內並未觀察到突變，提示替代性逃避機制(資料未示出)。

實例15：ADXS31-164引起腫瘤內T調節性細胞顯著減少.

為了闡明ADXS31-164對脾臟及腫瘤中調節性T細胞頻率之作用，小鼠植入有NT-2腫瘤細胞。脾細胞及腫瘤內淋巴細胞在三次免疫接種之後分離且針對Treg(其被定義為CD3⁺/CD4⁺/CD25⁺/FoxP3⁺細胞)染色，不過在獨立分析時用FoxP3或CD25標誌物獲得相當的結果。該等結果指示，與不相關李氏菌疫苗或未處理動物相比，用ADXS31-164免疫接種對脾臟中Treg頻率無影響(參見圖18)。與此對比，用李氏菌疫苗免疫接種對腫瘤中Treg之存在引起相當大的影響(圖19A)。儘管未經處理腫瘤中平均19.0%之所有CD3⁺ T細胞為Treg，但此頻率對於不相關疫苗減小至4.2%且對於ADXS31-164減小至3.4%(腫瘤內Treg頻率之5倍減小)(圖19B)。用LmddA疫苗中之任一者處理之小鼠中腫瘤內Treg之頻率減小不可歸因於腫瘤大小差異。在代表性實驗中，來自用ADXS31-164免疫接種之小鼠之腫瘤與來自未經處理(8.69±0.98，n=5，p<0.01)或用不相關疫苗處理(8.41±1.47，n=5，p=0.04)之小鼠的腫瘤相比顯著較小[平均直徑(mm)±SD，6.71±0.43，n=5]，而此等最後兩組之比較展示腫瘤大小在統計學上無顯著差異(p=0.73)。用LmddA疫苗處理之 腫瘤中Treg之較低頻率引起腫瘤內CD8/Treg比率增加，表明更有利的腫瘤微環境可在用LmddA疫苗免疫接種之後獲得。然而，僅表現目標抗原HER2/neu之疫苗(ADXS31-164)能夠減小腫瘤生長，指示Treg減少僅在腫瘤中存在抗原特異性反應下具有作用。

實例16：構築同時傳遞兩個異源抗原之雙質體

對應於actA啟動子區域及ActA N端之1-233胺基酸之DNA係使用以下引子ActA-F-5'-atcccgggtgaagcttgggaagcagttggg-3'(XmaI)(SEQ ID NO：77)及ActA-R-attctagatttatcacgtacccatttccccgc(XbaI)(SEQ ID NO：78)藉由聚合酶鏈反應(PCR)自李氏菌基因組DNA擴增。將用於選殖之限制性位點加下劃線。將XmaI/XbaI區段選殖於質體pNEB193中以建立pNEB193-ActA。另外，抗原2(其為嵌合體Her2)係使用引子Ch-Her2-F-5'-attctagaacccacctggacatgctccgccac-3'(XbaI)(SEQ ID NO：79)及Ch-Her2-R-5'-gtcgacactagtctagtggtgatggtgatgatggagctcagatctgtctaagaggcagccatagggc-3'(RE位點-SalI-SpeI-SacI-BglII)(SEQ ID NO：80)進行PCR擴增。將Ch-Her2之XbaI及SalI片段選殖於質體pNEB193-ActA中以建立pNEB193-ActA-Ch-Her2質體。His標記DNA序列包括於SacI與SpeI之間的Ch-Her2反向引子序列中。對應於來自質體pNEB193-ActA-Ch-Her2之tActA-Ch-Her2-His之XmaI/SpeI片段經切除以用於在XmaI/SpeI限制之pAdv134中選殖，從而建立雙質體。

接著產生將兩個重組抗原作為融合蛋白質同時傳遞之基於李氏菌之質體。由此質體表現之兩個融合蛋白質 包括tLLO-抗原1及tActA-抗原2。抗原1之表現及分泌係在hly啟動子及LLO信號序列控制下，且其表現為與李氏溶血素O之非溶血性片段(截短型LLO或tLLO)之融合體。抗原2之表現及分泌係在actA啟動子及ActA信號序列控制下，且其表現為與ActA之1-233胺基酸(截短型ActA或tActA)之融合體。無抗生素-標誌物之質體pAdv134之構築已經先前描述，且其含有基因卡匣以用於表現tLLO-抗原1融合蛋白質。pAdv134中tLLO-抗原1下游存在之SpeI及Xma I限制性位點用於選殖actA啟動子-tActA-抗原2 DNA區段(圖20)。將限制性位點XbaI、SacI及BglII添加於卡匣中以有助於在XbaI/SacI或XbaI/BglII處選殖抗原2插入物。針對His標記編碼之DNA序列在SacI位點之後添加以有助於偵測tActA-抗原2-his融合蛋白質。雙質體能夠將兩個不同抗原同時表現並分泌為融合蛋白質。

材料及方法(實例17-21) MDSC及Treg功能

將腫瘤植入小鼠側腹或生理學部位，視腫瘤模型而定。在7天之後，小鼠接著經疫苗接種，初始疫苗接種日視所使用之腫瘤模型而定。小鼠在給予疫苗後一週接著投與加強疫苗。

接著將小鼠處死，且在加強後1週，或者在侵襲性腫瘤模型情況下在加強後3-4天，收集腫瘤及脾臟。收集腫瘤前五天，非腫瘤負載小鼠經疫苗接種以用於反應者T細胞。使用標準方法學製備脾細胞。

簡言之，製備腫瘤及脾臟兩者之單細胞懸浮液。 手動壓碎脾臟，且溶解紅血球。切碎腫瘤且將其與膠原酶/DNase一起培育。或者，將GENTLEMACS^TM解離器與腫瘤解離套組一起使用。

使用Miltenyi套組及管柱或autoMACs分離器自腫瘤及脾臟純化MDSC或Treg。接著計數細胞。

製備單細胞懸浮液，且溶解紅血球。反應者T細胞接著用CFSE標記。

將細胞以反應者T細胞(來自所有分裂週期階段)與MDSC或Treg之2：1比率以1×10⁵個T細胞/孔之密度共同塗在96孔盤中。反應者T細胞接著用適當肽(PSA或CA9)刺激或用PMA/離子黴素非特異性地刺激。將細胞在37℃下在5% CO₂下在黑暗中培育2天。兩天後，將細胞染色以用於FACS，且在FACS機器上分析。

T細胞反應之分析

針對利用ELISA之細胞激素分析，收集脾細胞，且將其在培養基、SEA或conA(作為陽性對照)存在下以150萬個細胞/孔塗於48孔盤中。在培育72小時之後，收集上清液，且利用ELISA(BD)針對細胞激素含量對其進行分析。針對抗原特異性IFN-γ ELISpot，收集脾細胞，且將其在培養基、特異性CTL肽、不相關肽、特異性輔助肽或conA(作為陽性對照)存在下以300K及150K個細胞/孔塗於IFN-γ ELISpot盤中。在培育20小時之後，執行ELISpots(BD)且利用免疫斑點分析儀(C.T.L.)計數斑點。將每百萬個脾細胞之斑點數目繪圖。

脾細胞使用庫爾特計數器Z1(Coulter Counter, Z1)計數。在用gag-CTL、gag-輔助者、培養基、不相關抗原及con A(陽性對照)再刺激之後，產生IFN-γ之CD8+ T細胞之頻率使用標準的基於IFN-γ之ELISPOT分析進行測定。

簡言之，使用5mg/ml單抗R46-A2及以最佳稀釋度使用之多株兔抗IFN-γ(由Dr.Phillip Scott,University of Pennsylvania,Philadelphia,PA友情提供)偵測IFN-γ。藉由與使用鼠類rIFN-γ(Life Technologies,Gaithersburg,MD)之標準曲線比較來計算IFN-γ之含量。盤使用過氧化酶接合之山羊抗兔IgG Ab(IFN-γ)顯影。盤接著在405nm下讀取。分析之探測下限為30pg/ml。

結果 實例17：在李氏菌疫苗治療之後抑制性細胞功能

在第0天，將腫瘤植入小鼠。在第7天，小鼠用Lmdda-E7或LmddA-PSA疫苗接種。在第14天，收集腫瘤，且針對經疫苗接種及未處理組量測浸潤性MDSC及Treg之數目及百分比。已發現，經李氏菌處理小鼠之腫瘤中MDSC及Treg兩者之百分比以及MDSC之絕對數目減少，而在脾臟或引流淋巴結(TLDN)中未觀察到相同作用(圖21)。

將在以上實驗中自腫瘤負載小鼠中提取之分離之脾細胞及腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)彙集且針對CD3及CD8染色，從而闡明用Lm-LLO-E7、Lm-LLO-PSA及Lm-LLO-CA9、Lm-LLO-Her2免疫接種(圖22-34)對腫瘤中MDSC及Treg(脾臟及腫瘤MDSC及Treg)之存在的作用。各欄表示在具體細胞分裂階段下T細胞群體%且根據具體治療組(未處理、經肽-CA9或PSA處理、無MDSC/Treg、及無 MDSC+PMA/離子黴素)再分組(參見圖22-34)。

針對存在之Treg及MDSC之百分比，分析來自腫瘤負載小鼠之血液。在Lm疫苗接種之後小鼠血液中MDSC及Treg均減少。

實例18：來自TPSA23腫瘤而非脾臟之MDSC在李氏菌疫苗接種之後抑制性較小

在非特異性活化未處理鼠類細胞及特異性活化細胞(PSA、CA9、PMA/離子黴素)下使用自TPSA23腫瘤分離之單核細胞性及顆粒球性MDSC進行抑制因子分析。結果展示，與來自未處理小鼠腫瘤之MDSC相比，自來自Lm疫苗接種組之腫瘤分離之MDSC抑制活化T細胞分裂之能力減小。(參見圖22及24中Lm-LLO-PSA及Lm-LLO處理組，圖式中之右手圖表示來自左手圖之彙集的細胞分裂資料)。另外，來自不存在MDSC及細胞未收刺激/活化之未經處理小鼠的T反應者細胞保持處於其親本(靜息)狀態(圖22及24)，而觀察到用PMA或離子黴素刺激之T細胞複製(圖22及24)。另外，觀察到Gr+Ly6G+及GrdimLy6G-MDSC在用李氏菌疫苗處理之後抑制性均較小。此適用於其抑制經活化PSA特異性T細胞及非特異性(經PMA/離子黴素刺激之)T細胞之分裂的能力減小。

此外，在經非特異性活化未處理鼠類細胞下使用自TPSA23腫瘤分離之MDSC進行的抑制因子分析展示與來自未處理小鼠腫瘤的MDSC相比，自來自Lm疫苗接種組之腫瘤分離的MDSC抑制活化T細胞分裂之能力減小(參見圖22及24)。

另外，在使用脾臟MDSC時，並未觀察到緊接上文關於圖22及18論述之觀察結果。在後者中，來自未處理組、李氏菌處理組(PSA，CA9)及PMA/離子黴素刺激組(陽性對照)之脾細胞/T細胞均展示相同複製水準(圖23及25)。因此，此等結果展示，在腫瘤中抑制性細胞之李氏菌介導之抑制以抗原特異性及非特異性方式工作，而李氏菌對脾臟顆粒球性MDSC無影響，因為其僅以抗原特異性方式具抑制性。

實例19：腫瘤T調節性細胞之減小之抑制

在李氏菌處理之後使用自TPSA23腫瘤分離之Treg進行抑制因子分析。觀察到在用李氏菌處理之後，來自腫瘤之Treg之抑制能力減小(圖26)，然而，已發現脾臟Treg仍然具抑制性(圖27)。

作為對照，使用習知CD4+ T細胞代替MDSC或Treg且發現其並不對細胞分裂有影響(圖28)。

實例20：來自4T1腫瘤而非脾臟之MDSC及TREG在李氏菌疫苗接種之後抑制性較小

如在上文中，使用4T1腫瘤進行相同的實驗，且得到相同的觀察結果，亦即MDSC在李氏菌疫苗接種之後抑制性較小(圖29及31)，李氏菌對脾臟單核細胞性MDSC不具有特異性作用(圖30及32)，在李氏菌疫苗接種之後來自4T1腫瘤之Treg抑制能力減小(圖33)，且李氏菌對脾臟Treg之抑制能力無影響(圖34)。

最後，觀察到李氏菌對脾臟Treg之抑制能力無影響。

實例21：顆粒球性及單核細胞性MDSC之抑制能力變化 係由於tLLO之過度表現.

LLO質體展示在TAA或不相關抗原下與李氏菌疫苗類似的結果(圖35)。此意謂顆粒球性MDSC之抑制能力之變化係由於tLLO之過度表現且與搭配的融合體抗原無關。單獨空質體構築體亦引起MDSC抑制能力之變化，不過並未達到與質體上含有截短型LLO之疫苗中之任一者完全相同的水準。3次獨立實驗之平均值展示空質體與其他具有tLLO之質體(具有及不具有腫瘤抗原)之間的抑制差異顯著。MDSC抑制能力之減少相同，與是否使用抗原特異性或非特異性刺激之反應者T細胞之事實無關。

與顆粒球性MDSC類似，3次獨立實驗之平均值展示，在與其他疫苗構築體相比時，在用Lm-空質體疫苗進行疫苗接種之後，在自腫瘤純化之單核細胞性MDSC之抑制能力中觀察到之差異顯著(圖36)。

與以上觀察結果類似，自脾臟純化之顆粒球性MDSC在Lm疫苗接種之後保留其抑制抗原特異性反應者T細胞分裂的能力(圖37)。然而，在非特異性刺激之後，經活化T細胞(在PMA/離子黴素下)仍然能夠分裂。此等結果中沒有一個藉助於僅LLO或空質體疫苗改變，展示基於Lm之疫苗不影響脾臟顆粒球性MDSC(圖37)。

類似地，自脾臟純化之單核細胞性MDSC在Lm疫苗接種之後保留其抑制抗原特異性反應者T細胞分裂的能力。然而，在非特異性活化(由PMA/離子黴素刺激)之後，T細胞仍然能夠分裂。此等結果中沒有一個藉助於僅LLO或空質體疫苗改變，展示Lm疫苗不影響脾臟單核細胞性MDSC (圖38)。

自經Lm處理組中之任一者之腫瘤純化的Treg抑制反應者T細胞分裂之能力稍微減小，與反應者細胞是否經抗原特異性或非特異性活化無關。尤其對於經非特異性活化之反應者T細胞，看起來仿佛具有空質體之疫苗展示與質體上含有LLO之所有疫苗相同的結果。將此實驗與其他實驗平均展示差異為不顯著的(圖39)。

自脾臟純化之Treg仍然能夠抑制經抗原特異性及非特異性活化之反應者T細胞兩者之分裂。Lm處理對脾臟Treg之抑制能力無作用(圖40)。

Tcon細胞不能抑制T細胞分裂，與反應者細胞是否經抗原特異性或非特異性活化無關，此與此等細胞為非抑制性的事實一致。Lm對此等細胞無作用，且當細胞自小鼠之腫瘤或脾臟純化時不存在差異(圖41-42)。

呈現前述實例以便更充分地說明本發明之實施例。然而，其不應以任何方式解釋為限制本發明之廣泛範疇。

<110> 美商艾德凡斯有限公司

<120> 李氏菌疫苗治療之後的抑制性細胞功能抑制

<130> P-75888-PC

<140> PCT/US13/999999

<141> 2013-03-12

<150> 61/609,627

<151> 2012-03-12

<150> PCT/US12/28757

<151> 2012-03-12

<150> PCT/US12/51187

<151> 2012-08-16

<160> 83

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6733

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 游離型重組核酸主鏈

<400> 1

<210> 2

<211> 8317

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 質體主鏈及E7及嵌合Her2異源抗原

<400> 2

<210> 3

<211> 306

<212> DNA

<213> 16型人類乳突狀瘤病毒

<400> 3

<210> 4

<211> 1297

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合Her2-neu

<400> 4

<210> 5

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 李氏溶血素O

<400> 5

<210> 6

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 李氏溶血素O

<400> 6

<210> 7

<211> 390

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> actA

<400> 7

<210> 8

<211> 1170

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> actA

<400> 8

<210> 9

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> actA

<400> 9

<210> 10

<211> 390

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> actA

<400> 10

<210> 11

<211> 1170

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> actA

<400> 11

<210> 12

<211> 32

<212> PRT

<213> 單核球增多性李氏菌

<400> 12

<210> 13

<211> 19

<212> PRT

<213> 單核球增多性李氏菌

<400> 13

<210> 14

<211> 14

<212> PRT

<213> 單核球增多性李氏菌

<400> 14

<210> 15

<211> 28

<212> PRT

<213> 單核球增多性李氏菌

<400> 15

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> 單核球增多性李氏菌

<400> 16

<210> 17

<211> 33

<212> PRT

<213> 單核球增多性李氏菌

<400> 17

<210> 18

<211> 28

<212> PRT

<213> 單核球增多性李氏菌

<400> 18

<210> 19

<211> 20

<212> PRT

<213> 單核球增多性李氏菌

<400> 19

<210> 20

<211> 33

<212> PRT

<213> 單核球增多性李氏菌

<400> 20

<210> 21

<211> 19

<212> PRT

<213> 單核球增多性李氏菌

<400> 21

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> 化膿鏈球菌

<400> 22

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> 類馬鏈球菌

<400> 23

<210> 24

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E7引子序列

<400> 24

<210> 25

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E7引子序列

<400> 25

<210> 26

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hly啟動子及基因片段F引子

<400> 26

<210> 27

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hly啟動子及基因片段R引子

<400> 27

<210> 28

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> prfA基因擴增F引子

<400> 28

<210> 29

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> prfA基因擴增R引子

<400> 29

<210> 30

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E7 F引子序列

<400> 30

<210> 31

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E7 R引子序列

<400> 31

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> (PE)接合之E7肽

<400> 32

<210> 33

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hly啟動子及基因片段F引子

<400> 33

<210> 34

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hly啟動子及基因片段R引子

<400> 34

<210> 35

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ActA基因擴增F引子

<400> 35

<210> 36

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ActA基因擴增R引子

<400> 36

<210> 37

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E7 F引子序列

<400> 37

<210> 38

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E7 R引子序列

<400> 38

<210> 39

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> prfA基因擴增F引子

<400> 39

<210> 40

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> prfA基因擴增R引子

<400> 40

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dal基因正向引子

<400> 41

<210> 42

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dal基因反向引子

<400> 42

<210> 43

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 最小p60啟動子序列正向引子

<400> 43

<210> 44

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 最小p60啟動子序列正向引子

<400> 44

<210> 45

<211> 156

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 截短型p60啟動子

<400> 45

<210> 46

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> oriRep正向引子

<400> 46

<210> 47

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> oriRep反向引子

<400> 47

<210> 48

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> oriRep正向引子

<400> 48

<210> 49

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> oriRep反向引子

<400> 49

<210> 50

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LLO-E7基因正向擴增引子

<400> 50

<210> 51

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LLO-E7基因反向擴增引子

<400> 51

<210> 52

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Taqman引子-探針組

<400> 52

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Taqman引子-探針組

<400> 53

<210> 54

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Taqman引子-探針組

<400> 54

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Taqman引子-探針組

<400> 55

<210> 56

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Taqman引子-探針組

<400> 56

<210> 57

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Taqman引子-探針組

<400> 57

<210> 58

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 驗證ActA缺失之引子

<400> 58

<210> 59

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 驗證ActA缺失之引子

<400> 59

<210> 60

<211> 1256

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Lm-dd actA

<400> 60

<210> 61

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Her-2嵌合體(F)引子

<400> 61

<210> 62

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HerEC1-EC2F引子

<400> 62

<210> 63

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HerEC1-EC2R引子

<400> 63

<210> 64

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HerEC2-ICIF引子

<400> 64

<210> 65

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HerEC2-ICIR引子

<400> 65

<210> 66

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Her-2嵌合體(R)引子

<400> 66

<210> 67

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Her-2-EC1(F)引子

<400> 67

<210> 68

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Her-2-EC1(R)

<400> 68

<210> 69

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Her-2-EC2(F)引子

<400> 69

<210> 70

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Her-2-EC2(R)引子

<400> 70

<210> 71

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Her-2-IC1(F)引子

<400> 71

<210> 72

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Her-2-IC1(R)引子

<400> 72

<210> 73

<211> 7075

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pAdv164序列

<400> 73

<210> 74

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HLA-A2限制的抗原決定基

<400> 74

<210> 75

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HLA-A2限制的抗原決定基

<400> 75

<210> 76

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HLA-A2限制的抗原決定基

<400> 76

<210> 77

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向擴增引子actA啟動子區域

<400> 77

<210> 78

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向擴增引子actA啟動子區域

<400> 78

<210> 79

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合體Her2/neu擴增F引子

<400> 79

<210> 80

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合體Her2/neu擴增R引子

<400> 80

<210> 81

<211> 2015

<212> DNA

<213> 單核球增多性李氏菌

<400> 81

<210> 82

<211> 1140

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 選殖於溫度敏感性質體pKSV7中以建立inl C缺失突變體之DNA序列

<400> 82

<210> 83

<211> 1256

<212> DNA

<213> 單核球增多性李氏菌

<400> 83

Claims (19)

1. 一種包含重組核酸之重組李氏菌株之用途，該核酸包含編碼包含截短型LLO之多肽之第一開放閱讀框架，該重組李氏菌株用於製備供在患有疾病之個體中或在該個體內之疾病部位中提高T浸潤性淋巴細胞/抑制性細胞比率用的藥物。
2. 如請求項1之用途，其中該T浸潤性淋巴細胞為CD8+ T細胞或CD4+ T細胞。
3. 如請求項1之用途，其中該抑制性細胞為T調節性細胞(Treg)或骨髓來源抑制性細胞(MDSC)。
4. 如請求項1之用途，其中該多肽進一步包含異源抗原或其功能片段。
5. 如請求項4之用途，其中該異源抗原或其功能片段由感染性病原體或腫瘤細胞表現或自感染性病原體或腫瘤細胞獲得。
6. 如請求項1之用途，其中該核酸進一步包含編碼新陳代謝酶之另一開放閱讀框架，其中該新陳代謝酶補充該重組李氏菌株之染色體中所缺乏的內源性基因。
7. 如請求項6之用途，其中由該另一開放閱讀框架編碼之該新陳代謝酶為丙胺酸消旋酶。
8. 如請求項6之用途，其中該新陳代謝酶為D-胺基酸轉移酶。
9. 如請求項1之用途，其中該重組李氏菌包含基因組ActA基因、PlcA基因、PrfA基因或PlcB基因之突變或缺失。
10. 如請求項1之用途，其中該核酸整合至該李氏菌基因組中。
11. 如請求項1之用途，其中該核酸位於質體中，該質體在不存在抗生素選擇下穩定維持於該重組李氏菌疫苗株中。
12. 如請求項4之用途，其中該抗原與和癌症之發展或轉移進一步 相關之局部組織環境相關，與腫瘤脫逃或對癌症之抗性相關，其為血管生成抗原或為在宿主中引起過敏性、發炎性反應之過敏原。
13. 如請求項1之用途，其中個體之T浸潤性淋巴細胞/抑制性細胞比率之增加使該疾病或該疾病部位中該等抑制性細胞之百分比降低。
14. 如請求項13之用途，其中該疾病侷限於特定疾病部位或其中該疾病為全身性的。
15. 如請求項13之用途，其中該疾病為感染性疾病、呼吸性或發炎性疾病、或癌症或腫瘤。
16. 如請求項15之用途，其中該呼吸性或發炎性疾病為哮喘。
17. 如請求項15之用途，其中減少腫瘤部位處該等抑制性細胞之數目使患有該腫瘤之該個體之抗腫瘤免疫反應增強。
18. 如請求項1之用途，其中該個體為人類。
19. 如請求項2之用途，其中該等抑制性細胞抑制個體之抗腫瘤T細胞反應。