CN106794234A - 用于治疗her‑2阳性癌症的联合免疫疗法和放疗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供使用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株疫苗的组合来诱导人和犬科动物受试者中对Her‑2/neu抗原表达性肿瘤的免疫应答以及治疗所述肿瘤和接种所述肿瘤的疫苗的方法。
Description
技术领域
本发明提供使用放射疗法和重组减毒李斯特菌(Listeria)菌株疫苗的组合来诱导人和犬科动物受试者中对Her-2/neu抗原表达性肿瘤的免疫应答以及治疗该肿瘤和接种该肿瘤的疫苗的方法。
背景技术
Her-2/neu(下文称为“Her-2”)是185kDa的糖蛋白，它是酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(EGFR)家族的成员，并在所有乳腺癌的25至40％中过表达，并且也在很多骨(骨肉瘤–OSA)、卵巢、肺、胰腺、脑和胃肠道癌中过表达。过表达Her-2的癌症患者表现出耐受性，即使存在可检测的直接对Her-2的体液、CD8+T细胞和CD4+T细胞应答。
大型养殖狗自发发展成OSA，再现了人类小儿OSA的多个方面，包括组织学异质性、侵袭性局部疾病和早期转移。在诊断中，95％的狗患有微转移性疾病，并且尽管进行了截肢和化疗，但中值存活时间也只有10个月，大部分狗由于进行性转移性疾病而被实施安乐死。患有转移性骨肉瘤的人类患者的总体存活率在10-50％的范围内，具体取决于转移灶的位置和数量。
用于破坏肿瘤细胞或改变肿瘤/间质结构的放射疗法(RT)是许多癌症类型的治疗方法的组成部分。然而，由于OSA对标准剂量的放疗而言是耐放射的，因此其不用于治疗OSA。
近来，已有证据表明RT可与靶向免疫疗法发挥协同作用。例如，RT引起免疫原性细胞死亡，其中肿瘤细胞随着时间的推移因细胞凋亡、坏死和/或有丝分裂障碍而缓慢死亡，从而导致濒死细胞被免疫系统清除。这继而充当肿瘤抗原的潜在来源以用于免疫疗法。RT还调节细胞死亡受体、肿瘤相关抗原和粘附分子的肿瘤细胞表面表达，这使得肿瘤细胞更易受到免疫介导的杀伤的影响。
本发明通过以下令人惊讶的发现满足了患有OSA的受试者的需求：放射疗法在与使用LmddA疫苗载体生成的重组李斯特菌-Her-2/neu疫苗(ADXS31-164)联合时对骨肉瘤和肺转移尤其有效，所述载体具有明确的减毒机制且不含抗生素选择标记。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供治疗受试者中Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因，并且其中施用所述放射疗法包括施用所述放射疗法至少两次。
在另一个实施例中，本发明提供引起对受试者中Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症增强的免疫应答的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因，并且其中施用所述放射疗法包括施用所述放射疗法至少两次。
在另一个实施例中，本发明提供延长患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的受试者的存活期的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因，并且其中施用所述放射疗法包括施用所述放射疗法至少两次。
在另一个实施例中，本发明提供延迟患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的受试者的转移性疾病的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因，并且其中施用所述放射疗法包括施用所述放射疗法至少两次。
在另一个实施例中，本发明提供破坏患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的受试者对Her-2/neu的耐受性的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的佐剂的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因，并且其中施用所述放射疗法包括施用所述放射疗法至少两次。
在一个实施例中，受试者是人。在一个实施例中，人受试者是儿童。在另一个实施例中，人受试者是成人。在另一个实施例中，受试者是犬科动物。
在另一个实施例中，将所述融合多肽施用于所述受试者防止所述肿瘤内的逃逸突变。
在另一个实施例中，所述Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17个标绘的人MHC I类表位。在另一个实施例中，所述Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17个犬科动物MHC I类表位。
在一个实施例中，核酸分子整合进李斯特菌基因组。在另一个实施例中，核酸分子在所述重组李斯特菌疫苗株的质粒中，并且质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定维持在重组李斯特菌疫苗株中。
在一个实施例中，重组李斯特菌缺乏actA毒力基因。在一个实施例中，另外的多肽选自：a)非溶血LLO蛋白或N-末端片段、b)PEST序列或c)ActA片段。在一个实施例中，由所述第二开放阅读框编码的代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。在本发明的一些实施例中，重组减毒李斯特菌菌株为ADXS31-164。
在一个实施例中，重组减毒李斯特菌菌株与独立的佐剂一起施用，该佐剂在一个实施例中包括粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂草苷QS21、单磷酰脂质A或未经甲基化的含CpG寡核苷酸。
在一个实施例中，癌症是骨肉瘤(OSA)。在另一个实施例中，癌症或肿瘤是肺转移性疾病。在一个实施例中，施用包括施用所述重组减毒李斯特菌菌株至少两次。在一个实施例中，施用所述放射疗法包括施用所述放射疗法至少两次。在一个实施例中，本文提供包括放射疗法和施用本文所提供的ADXS31-164的联合疗法。在一个实施例中，放射疗法在施用重组减毒李斯特菌菌株之前施用。
在另一个实施例中，受试者在施用所述放射疗法和所述重组减毒李斯特菌菌株前未进行截肢。在另一个实施例中，该方法还包括在所述受试者中出现复发或转移后施用所述放射疗法和所述重组减毒李斯特菌菌株，所述转移在一个实施例中为肺转移性疾病。
在一个实施例中，该方法导致所述受试者的总体存活期延长。在另一个实施例中，该方法导致受试者中转移性疾病延迟。在另一个实施例中，该方法导致Her-2/neu特异性T细胞应答增强。在另一个实施例中，所述引起增强的免疫应答导致所述受试者的总体存活期延长。在另一个实施例中，所述引起增强的免疫应答导致受试者中转移性疾病延迟。在一个实施例中，转移性疾病为肺转移性疾病。在另一个实施例中，所述引起增强的免疫应答导致Her-2/neu特异性T细胞应答增强。
附图说明
被视为本发明的主题在说明书的结论部分特别指出并明确要求进行保护。然而，在结合附图阅读时，通过参考以下具体实施方式，可以最好地理解本发明(对组织和操作方法来说皆是如此)及其目的、特征和优点，在附图中：
图1.ADXS31-164的构建。(A)pAdv164的质粒图谱，其具有在组成型李斯特菌p60启动子控制下的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dal基因，用于互补LmddA菌株的染色体dal-dat缺失。它还包含截短的LLO(1-441)与嵌合人HER2/neu基因的融合体，该融合体通过3个HER2/neu片段：EC1(aa 40-170)、EC2(aa 359-518)和ICI(aa 679-808)的直接融合而构建。右侧的载体示意图详细示出，pAdv164表达由融合至截短的LLO的人HER2/neu的2个胞外域和一个胞内域组成的嵌合HER2/neu融合蛋白。质粒借助于dal基因的营养缺陷型互补而维持在重组dal/dat/actA-李斯特菌菌株(LmddA)内(参见实例)。(B)通过对用抗LLO抗体印迹的TCA沉淀细胞培养上清液进行的Western印迹分析检测了Lm-LLO-ChHer2(Lm-LLO-138)和LmddA-LLO-ChHer2(ADXS31-164)中tLLO-ChHer2的表达和分泌。～104KD的差异条带对应于tLLO-ChHer2。检测到内源性LLO为58KD条带。李斯特菌对照缺乏ChHer2表达。
图2.ADXS31-164的免疫原性(A)基于HER2/neu李斯特菌的疫苗在免疫小鼠的脾细胞中引起的细胞毒性T细胞应答使用NT-2细胞作为刺激因子、3T3/neu细胞作为靶标进行测试。Lm-对照基于在各个方面相同但表达不相关抗原(HPV16-E7)的LmddA背景。(B)免疫FVB/N小鼠的脾细胞分泌进细胞培养基中的IFN-在使用丝裂霉素C处理的NT-2细胞体外刺激24小时后通过ELISA测定。(C)嵌合疫苗免疫的HLA-A2转基因小鼠的脾细胞响应于来自蛋白不同区域的肽的体外温育而分泌IFN-。重组ChHer2蛋白用作阳性对照，不相关肽或无肽组构成阴性对照，如图例中所列出。使用72小时共温育后收集的细胞培养上清液进行ELISA分析，以测定IFN-γ分泌。每个数据点为一式三份数据的平均值+/-标准误差。*P值<0.001。
图3.李斯特菌-ChHER2/neu疫苗的肿瘤预防研究使用每种重组李斯特菌-ChHer2或对照李斯特菌疫苗注射HER2/neu转基因小鼠六次。免疫在6周龄开始，每三周一次延续直到第21周。每周监测肿瘤的外观并以无肿瘤小鼠的百分比表示。*p<0.05，N＝9只每组。
图4.ADXS31-164免疫对脾脏中％Treg的作用。给FVB/N小鼠皮下接种1×106个NT-2细胞，并且使用每种疫苗以一周为间隔免疫三次。在第二次免疫后7天收集脾脏。在分离免疫细胞后，对其进行染色，以通过抗CD3、CD4、CD25和FoxP3抗体检测Treg。来自代表性实验的Treg的点图示出CD25+/FoxP3+T细胞的频率，以不同治疗组之间总CD3+或CD3+CD4+T细胞的百分比表示。
图5.ADXS31-164免疫对NT-2肿瘤中％肿瘤浸润Treg的作用。给FVB/N小鼠皮下接种1×106个NT-2细胞，并且使用每种疫苗以一周为间隔免疫三次。在第二次免疫后7天收集肿瘤。在分离免疫细胞后，对其进行染色，以通过抗CD3、CD4、CD25和FoxP3抗体检测Treg。(A).来自代表性实验的Treg的点图。(B).CD25+/FoxP3+T细胞的频率，以不同治疗组之间总CD3+或CD3+CD4+T细胞的百分比(左插图)和肿瘤内CD8/Treg比率(右插图)表示。数据以2个独立实验获得的平均值±SEM表示。
图6.ADXS31-164疫苗接种可延缓脑中乳腺癌细胞系的生长。Balb/c小鼠使用ADXS31-164或对照李斯特菌疫苗免疫三次。给麻醉小鼠颅内注射EMT6-Luc细胞(5,000个)。(A)小鼠的离体成像使用Xenogen X-100CCD照相机在指定的天数进行。(B)像素强度以光子数/秒/cm2表面积绘图；这以平均发光度表示。(C)EMT6-Luc细胞、4T1-Luc和NT-2细胞系的HER2/neu表达通过使用抗HER2/neu抗体的Western印迹检测。鼠科动物巨噬细胞样细胞系J774.A2细胞用作阴性对照。
图7.示出在截肢和化疗后ADXS31-164接种的前18个犬科动物骨肉瘤患者。
图8.示出ADXS31-164施用不会导致A)扩张型心肌病的早期迹象。B)在研究过程中评估的连续心脏肌钙蛋白I水平表明该水平对于大部分狗而言在整个研究期间保持在正常范围内。应当注意的是，心脏肌钙蛋白I水平暂时性升高的一只狗在这些值轻度升高时具有不明显的超声心动图(另见图26D)。
图9.示出A)体温和B)收缩压的ADXS31-164相关变化。在基线和ADXS31-164施用后每2小时记录体温和收缩压。示出每只狗每次疫苗接种时的参数。水平条表示每个剂量组、每个时间点所有狗的中值。★p<0.05，★★p<0.005
图10.示出联合ADXS31-164和姑息性放射疗法(RT)在未接受截肢和化疗的原发性肢体骨肉瘤的背景下的治疗计划表。
图11.上部插图：放射显影照片显示出存在与骨肉瘤相关的肱骨近端骨折，并且那些照片在使用两块骨板和一颗髓内钉进行骨折固定术后获取。下部插图：胸部的CT扫描未显示出入选时转移性疾病的迹象。也在基线时和8次ADXS31-164施用后获取放射显影照片。这些放射显影照片显示无肺转移性疾病的迹象，且存在围绕骨折部位的骨痂，表明尽管存在骨肉瘤但骨折已愈合。
图12.前期I期临床试验的时间线，其评估重组表达ADXS31-164的单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)引起患有肢体骨肉瘤的进行了截肢和后续化疗的狗的治疗有效性抗肿瘤免疫的安全性和功效。
图13A-B.ADXS-31-164施用后的治疗相关不良事件和存活期曲线。图13A示出治疗相关不良事件。图13B示出在试验入选时所有狗均无转移性疾病。对照组的狗接受了截肢，然后单独施用卡铂或卡铂加上阿霉素。审查疫苗组的2只狗，因为它们死于不相关的原因(1只狗死于吸入性肺炎，另一只死于肾胚细胞瘤)。疫苗接种组：红线；对照组：黑线。
图14.人(A)和犬科动物(B)患者的原发性和转移性骨肉瘤(OSA)的放射图像。在两个物种中，原发性病灶的特征在于骨干骺端(A中箭头)的增生和溶解区域。
图15.I期3+3临床试验的示意图，其在患有HER2+骨肉瘤(OSA)的狗中评估ADXS31-164的安全性和功效。患有自发性HER2+肢体OSA的私有狗接受了护理标准截肢和随访卡铂化疗。在最终卡铂剂量三周后，给狗静脉内接种2×108、5×108、1×109或3.3×109个CFU的ADXS31-164(相隔三周进行三次疫苗接种)。每2个月给狗进行再分期直到死亡，以确定疫苗预防转移性疾病的功效。
图16.犬科动物原发性骨肉瘤中的HER2/neu表达。(A)狗原发性OSA的H&E染色示出恶性成骨细胞的巢和类骨质沉积。(B)犬科动物原发性OSA的免疫组织化学评估示出HER2/neu在恶性成骨细胞中的表达。(C)5只私有狗的原发性OSA样品的Western印迹示出HER2/neu表达是可变的。阳性对照为：MCF-7人乳腺癌细胞系和CAMAC2犬科动物乳腺癌细胞系。
图17.基线(前)和ADXS31-164施用后24小时(后)的血液指标值。对每个剂量组内所有狗每次疫苗接种时的前值和后值取平均值。★p<0.05，★★p<0.005。示出在ADXS31-164施用后24小时，白细胞和中性粒细胞计数(A-B)的瞬时、但统计学上显著的增加，并且伴有血小板和淋巴细胞(C-D)瞬时减少。
图18.ADXS31-164诱导的白细胞(WBC)、中性粒细胞和单核细胞计数增加与存活期相关。WBC、中性粒细胞和单核细胞计数在基线和疫苗接种后24小时测定。在每次疫苗接种后计算增加的百分比，并且对每只狗取平均值。(A)结果根据存活(死亡或活着)显示。(B)结果根据所接受的ADXS31-164剂量显示。水平条表示该组的中值。
图19.示出ADXS31-164诱导的Her-2特异性T细胞应答的IFN-γ ELISpot评估结果。
图20.示出重复“加强”疫苗接种刺激了Her-2特异性免疫。(A)示出患者289-003的结果。(B)示出患者289-004的结果。EC1、EC2和IC1表示HER2/neu多肽的肽片段。
图21.(A)转移时间(TTM)和(B)OSA特异性存活期的Kaplan Meier估计。
图22.示出ADXS31-164预防转移性疾病的发展。(A和B)在卡铂治疗后3周(A)和第三次ADXS31-164疫苗接种后3周(B)采集的胸部放射显影照片示出右颅侧肺叶预先存在的转移性结节大小增加，但在其余的肺叶中转移性疾病不会进一步发展。(C和D)在ICG施用后，肺结节的胸腔镜检查发现在近红外光下发荧光(C)。在转移灶切除时移除的外观总体正常的肺组织示出在近红外光下的荧光(插图)(D)。(E和F)(E)肺结节和(F)发荧光正常肺组织的H&E染色组织病理学示出包裹性肺结节(E)和外观总体正常的肺组织炎症的局灶性区域(F)的显著出血和坏死。(G和H)在低倍(G)和高倍(H)放大率下肺结节的免疫组织化学示出围绕肺结节的CD3+T细胞以及肿瘤组织内的微量CD3+T细胞。(I和J)在低倍(I)和高倍(J)放大率下外观正常的肺组织的免疫组织化学显示CD3+T细胞的局灶性积聚。(K)局灶性肺炎的高倍放大率H&E染色示出大异常细胞，其中有丝分裂象被淋巴细胞围绕。(L)肺炎区域的波形蛋白染色示出大波形蛋白阳性细胞，其中突出的有丝分裂象被单核细胞围绕。
图23.ADXS31‐164延缓/预防转移性疾病并且延长患有自发性HER2+骨肉瘤的狗的总体存活期。示出疫苗接种狗与历史对照组相比的Kaplan‐Meier存活期曲线。对照组由患有HER2+肢体OSA的狗、截肢处理的狗和随访化疗但未接受ADXS31-164的狗组成。P<0.0001。疫苗接种组：红线；对照组：黑线。
图24.示出ADXS31‐164破坏了对HER2/neu的耐受性。在基线、第3次疫苗接种后3周(9周)和2个月后(17周)收集PBMC，并通过IFN-γ ELISpot分析对HER2/neu的高度保守IC1域的应答。所示的结果将狗分为早期应答者、晚期应答者和表观无应答者。NA表示这些狗的17周样品未经评估。
图25A-D.示出ADXS31-164未对心脏功能造成不利影响。评估每只狗的基线、疫苗接种时和其后每2个月的心脏参数LVID(舒张期)(图25A)、LVID(收缩期)(图25B)和缩短分数(图25C)。在相同的时间点评估心脏肌钙蛋白I水平(图25D)。
图26.示出ADXS31-164破坏了对HER2/neu的高度保守胞内域的免疫耐受性。
图27A-D.示出与ADXS31-164疗法结合的放射疗法在受试者386-002(图27A)、受试者385-005(图27B)、受试者386-003(图27C)和受试者386-007(图27D)中延迟原发性骨肉瘤(OSA)的进展。
图28A-C.示出在具有干扰一般活动的疼痛的受试者中(图28A)、在具有干扰行走能力的疼痛的受试者中(图28B)以及在具有干扰生活幸福的疼痛的受试者中(图28C)的疼痛问卷结果。
图29A-D.示出与ADXS31-164疗法结合的姑息性放射疗法减少溶解、促进肿瘤合并并延长受试者存活期(图29A-D)。在16Gy的放射(从2014年9月13日开始连续2天给予8Gy)和3剂ADXS31-164(2014年11月25日)后，远端胫骨骨肉瘤病变的横向(图29A)和AP(图29C)放射线视图展示出明显的皮质骨重建和溶解减少。用16Gy的放射(从2014年7月16日开始连续2天给予8Gy)和3剂ADXS31-164(2014年10月13日)治疗的远端桡骨骨肉瘤病变的横向(图29B)和AP(图29D)放射线视图。注意，在桡骨的远端部分中的肿胀和骨溶解明显减少(在图29B中将2014年10月13日的放射显影照片与2014年7月16日的放射显影照片进行比较)。在远端胫骨的内侧面上骨密度增加(在图29D中将2014年10月13日的放射显影照片与2014年7月16日的放射显影照片进行比较)。在图29D中2014年10月13日的放射显影照片上见到远端挠骨的内侧面的骨折有微小的移置。
图30A-B.示出与ADXS31-164结合的放射疗法延长了患有骨肉瘤(OSA)的狗的存活期。
应当理解，为了阐述的简洁和清楚，显示在图中的要素未必是按比率绘制的。例如，为了清楚，一些要素的尺寸可以是相对其他要素而放大的。另外，在认为适合时，附图标记可以在附图之间重复，以指出对应的或类似的要素。
具体实施方式
在以下具体实施方式中，陈述了多个具体细节，以提供对本发明的透彻理解。然而，本领域的技术人员将理解可在不具有这些具体细节的情况下实施本发明。在其他情况中，为避免使本发明复杂化，未对熟知的方法、工序和组分进行详细描述。
在一个实施例中，本发明提供治疗受试者中的肿瘤生长或癌症的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的肿瘤特异性抗原。
在一个实施例中，本发明提供预防受试者中的肿瘤生长或癌症的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的肿瘤特异性抗原。
在一个实施例中，本发明提供引起受试者中针对肿瘤生长或癌症增强的免疫应答的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的肿瘤特异性抗原。
在一个实施例中，本发明提供延长患有肿瘤生长或癌症的受试者的存活期的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的肿瘤特异性抗原。
在一个实施例中，本发明提供延迟患有肿瘤生长或癌症的受试者的转移性疾病的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的肿瘤特异性抗原。
在一个实施例中，本发明提供破坏患有肿瘤生长或癌症的受试者对肿瘤特异性抗原的耐受性的方法，该肿瘤生长或癌症表达所述肿瘤特异性抗原，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的肿瘤特异性抗原。
在一个实施例中，肿瘤特异性抗原为Her-2/neu。
在一个实施例中，本发明提供治疗受试者中的Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原。
在一个实施例中，本发明提供预防受试者中的Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原。
在另一个实施例中，本发明提供引起受试者中针对Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症增强的免疫应答的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原。
在另一个实施例中，本发明提供延长患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的受试者的存活期的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原。
在另一个实施例中，本发明提供延迟患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的受试者中的转移性疾病的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原。
在另一个实施例中，本发明提供破坏患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的受试者对Her-2/neu的耐受性的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的佐剂的Her-2/neu嵌合抗原。
在一个实施例中，重组减毒李斯特菌菌株还包含编码代谢酶的第二开放阅读框，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在一个实施例中，本发明提供治疗受试者中Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在一个实施例中，本发明提供预防受试者中Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在另一个实施例中，本发明提供引起受试者中针对Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症增强的免疫应答的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在另一个实施例中，本发明提供延长患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的受试者的存活期的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在另一个实施例中，本发明提供延迟患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的受试者中的转移性疾病的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在另一个实施例中，本发明提供破坏患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的受试者对Her-2/neu的耐受性的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的佐剂的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在一个实施例中，施用所述放射疗法包括施用所述放射疗法至少两次。
在一个实施例中，本发明提供治疗受试者中Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因，并且其中施用所述放射疗法包括施用所述放射疗法至少两次。
在另一个实施例中，本发明提供引起对受试者中Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症增强的免疫应答的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因，并且其中施用所述放射疗法包括施用所述放射疗法至少两次。
在另一个实施例中，本发明提供延长患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的受试者的存活期的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因，并且其中施用所述放射疗法包括施用所述放射疗法至少两次。
在另一个实施例中，本发明提供延迟患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的受试者的转移性疾病的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因，并且其中施用所述放射疗法包括施用所述放射疗法至少两次。
在另一个实施例中，本发明提供破坏患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的受试者对Her-2/neu的耐受性的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的佐剂的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因，并且其中施用所述放射疗法包括施用所述放射疗法至少两次。
在一个实施例中，受试者是人。在一个实施例中，人受试者是儿童。在另一个实施例中，人受试者是成人。
在一个实施例中，本发明提供治疗人类受试者中Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在一个实施例中，本发明提供预防人类受试者中Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在另一个实施例中，本发明提供引起人类受试者中针对Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症增强的免疫应答的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在另一个实施例中，本发明提供延长患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的人类受试者的存活期的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在另一个实施例中，本发明提供延迟患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的人类受试者中的转移性疾病的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在另一个实施例中，本发明提供破坏患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的人类受试者对Her-2/neu的耐受性的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的佐剂的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在另一个实施例中，受试者是犬科动物。在一个实施例中，犬科动物是狗。
在一个实施例中，本发明提供治疗犬科动物受试者中Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在一个实施例中，本发明提供预防犬科动物受试者中Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在另一个实施例中，本发明提供引起犬科动物受试者中针对Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症增强的免疫应答的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在另一个实施例中，本发明提供延长患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的犬科动物受试者的存活期的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在另一个实施例中，本发明提供延迟患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的犬科动物受试者中的转移性疾病的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在另一个实施例中，本发明提供破坏患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的犬科动物受试者对Her-2/neu的耐受性的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的佐剂的Her-2/neu嵌合抗原，该第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在一个实施例中，本发明提供延迟受试者中的转移性疾病或治疗受试者中的转移性疾病的方法。在一个实施例中，转移性疾病为肺转移性疾病。
因此，在一个实施例中，本发明提供延迟患有肿瘤生长或癌症的受试者中的肺转移性疾病的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的肿瘤特异性抗原。
在另一个实施例中，本发明提供治疗患有肿瘤生长或癌症的受试者中的肺转移性疾病的方法，该方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，该重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框的核酸，该第一开放阅读框编码融合多肽，该融合多肽包含融合至另外的多肽的肿瘤特异性抗原。
在一个实施例中，本文提供用于预防、治疗、延长存活期、延迟转移性疾病、破坏对Her-2/neu的耐受性、针对Her2-neu抗原表达性肿瘤进行疫苗接种、诱导免疫应答、引起针对Her2-neu抗原的次优势表位增强的免疫应答，同时绕开突变回避的方法。在另一个实施例中，将本发明的融合多肽施用于受试者防止所述肿瘤内的逃逸突变。在另一个实施例中，绕开突变回避是由于表位扩展。在又一个实施例中，突变回避是由于抗原的嵌合性质所致。
在另一个实施例中，本文提供用于受权利要求书保护的方法的免疫原性组合物，该组合物包含融合多肽，其中所述融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，并且其中将融合蛋白施用于患有Her-2/neu表达性肿瘤的受试者防止所述肿瘤内的逃逸突变。在另一个实施例中，本文提供用于受权利要求书保护的方法的重组李斯特菌疫苗株，该疫苗株包含免疫原性组合物。
在一个实施例中，重组减毒李斯特菌菌株是疫苗株。在一个实施例中，本文提及的核酸是核酸分子。
在一个实施例中，用于本发明方法的重组减毒李斯特菌菌株还包含含有编码代谢酶的第三开放阅读框的核酸分子，并且其中该代谢酶互补在重组李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在另一个实施例中，本文提供包含核酸分子的重组减毒李斯特菌菌株，其中该核酸分子包含编码多肽的第一开放阅读框，其中该多肽包含Her-2/neu嵌合抗原，其中该核酸分子还包含第二和第三开放阅读框，第二和第三开放阅读框各编码代谢酶，并且其中该代谢酶互补在所述重组李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。
在一个实施例中，核酸分子整合进李斯特菌基因组。在另一个实施例中，核酸分子在重组李斯特菌疫苗株的质粒中。在又一个实施例中，质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定维持在重组李斯特菌疫苗株中。在另一个实施例中，该质粒不赋予重组李斯特菌抗生素抗性。在另一个实施例中，重组李斯特菌菌株是减毒的。在另一个实施例中，重组李斯特菌是减毒营养缺陷型菌株。在另一个实施例中，外源抗原表达对细菌诸如本发明的一种细菌施加的高代谢负担也是减毒的重要机制。
在一个实施例中，减毒菌株是LmddA。在另一个实施例中，该菌株发挥强烈的佐剂效应，这是基于李斯特菌的疫苗的固有特性。该佐剂效应的一个表现是表达除人嵌合Her-2/neu之外的抗原的李斯特菌或ADXS-31-164(表达人嵌合Her-2/neu)疫苗导致的肿瘤内Treg数量下降5倍(参见本文的图5)。在另一个实施例中，表达不同抗原(HPV16 E7)的LmddA载体还与肿瘤中Treg的频率显著下降相关，很可能是由于先天免疫应答的结果。在另一个实施例中，LmddA载体表达前列腺特异性抗原(PSA)、人乳头瘤病毒(HPV)抗原(E6、E7)。在另一个实施例中，HPV菌株为HPV16、HPV18或本领域已知的任何菌株。
在一个实施例中，减毒营养缺陷型李斯特菌疫苗株是ADXS-31-164菌株。ADXADXS-31-164基于李斯特菌疫苗载体，该载体由于毒力基因actA的缺失而减毒，并且由于dal基因的互补而维持用于Her-2/neu的体内和体外表达的质粒。在一个实施例中，ADXS31-164表达和分泌融合至李斯特菌溶血素O(LLO)的前441个氨基酸的嵌合Her-2/neu蛋白。在另一个实施例中，ADXS31-164发挥强烈的和抗原特异性的抗肿瘤应答，在转基因动物中能够破坏对Her-2/neu的耐受性(参见实例)。在另一个实施例中，ADXS31-164菌株是高度减毒的，并且具有比前代李斯特菌疫苗更高的安全谱，因为它能更迅速地从免疫小鼠的脾脏清除。在另一个实施例中，ADXS31-164使转基因动物中的肿瘤发病延缓期比Lm-LLO-ChHer2(该疫苗的抗生素抗性和毒性更强的形式)更长(参见图3)。在一个实施例中，Lm-LLO-ChHer2菌株为Lm-LLO-138。
在另一个实施例中，ADXS31-164菌株具有高度免疫原性，能够破坏对Her-2/neu自体抗原的耐受性，并且防止Her-2/neu转基因动物中的肿瘤形成。在另一个实施例中，ADXS31-164使肿瘤内调节性T细胞(Treg)显著减少。在另一个实施例中，LmddA疫苗处理的肿瘤中Treg频率的下降使肿瘤内CD8/Treg比率升高，暗示在LmddA疫苗免疫后可获得更有利的肿瘤微环境。在另一个实施例中，该嵌合抗原的使用不产生逃逸突变，表明肿瘤的突变不会远离对使用该新型抗原进行治疗的治疗有效应答(参见实例6)。在另一个实施例中，ADXS31-164的外周免疫延缓了脑中转移性乳腺癌细胞系的生长(参见实例7)。
在另一个实施例中，与未接受ADXS31-164疫苗接种的对照受试者相比，将包括截肢、化疗和ADXS31-164疫苗接种的治疗提供给患有骨肉瘤犬科动物受试者延长了存活期(参见实例9和10)。在另一个实施例中，与未接受ADXS31-164疫苗接种的对照受试者相比，将包括截肢、化疗和ADXS31-164疫苗接种的治疗提供给患有骨肉瘤的犬科动物受试者显示出转移减少(参见实例10)。在另一个实施例中，与未接受ADXS31-164疫苗接种的对照受试者相比，将包括截肢、化疗和ADXS31-164疫苗接种的治疗提供给患有骨肉瘤的犬科动物受试者显示出所诱导的特异性T细胞应答增强(参见实例10)。在另一个实施例中，与仅接受放射疗法或仅接受ADXS31-164疫苗接种的对照受试者相比，患有骨肉瘤并接受放射疗法然后用ADXS31-164进行疫苗接种的犬科动物受试者延长了存活期(参见实例11)。在另一个实施例中，与仅接受放射疗法或仅接受ADXS31-164疫苗接种的对照受试者相比，患有骨肉瘤并接受放射疗法然后用ADXS31-164进行疫苗接种的犬科动物受试者显示出转移减少(参见实例11)。
在另一个实施例中，术语“ADXS31-164”、“Lm-人嵌合Her-2/neu”、“Lm-huHer2-neu”和“Lm-hucHer-2/neu”在本文可互换使用。
在一个实施例中，骨肉瘤细胞不易被放射杀死，因此放射疗法很少用于治疗骨肉瘤。在一个实施例中，将重组减毒的表达嵌合抗原的无抗生素李斯特菌用于预防和治疗癌症或实体肿瘤，如本文所举例说明。在另一个实施例中，肿瘤是Her-2/neu阳性肿瘤。在另一个实施例中，癌症是Her-2/neu表达性癌症。在另一个实施例中，癌症是乳腺癌、中枢神经系统(CNS)癌症、头颈癌、骨肉瘤(OSA)、犬科动物OSA、尤因氏肉瘤(ES)或本领域已知的任何Her-2/neu表达性癌症。在另一个实施例中，犬科动物骨肉瘤是肢体骨肉瘤。在另一个实施例中，肿瘤是骨肉瘤、乳腺肿瘤、头颈部肿瘤或本领域已知的任何其他抗原表达性肿瘤。在另一个实施例中，所述癌症或实体肿瘤是复发或转移性疾病的结果。在一个实施例中，转移性疾病为肺转移性疾病。
在一个实施例中，本发明提供治疗、预防或延迟转移的方法。在一个实施例中，本发明提供治疗、预防或延迟OSA转移的方法。在一个实施例中，转移在肺中。在另一个实施例中，转移在另一组织中。在另一个实施例中，转移在骨中，在一个实施例中该转移在初始OSA部位的近侧，在另一个实施例中该转移在初始OSA部位的远侧。在另一个实施例中，转移在肾中。在另一个实施例中，转移在心脏中。在另一个实施例中，转移为孤立的。在另一个实施例中，转移为孤立的局部复发。在另一个实施例中，转移为多部位转移。
在另一个实施例中，表达嵌合Her-2/neu的重组李斯特菌可用作治疗Her-2/neu过表达实体肿瘤的治疗性疫苗。在另一个实施例中，本文提供的Her-2/neu嵌合抗原可用于治疗Her-2/neu表达性肿瘤和防止该肿瘤的逃逸突变。在另一个实施例中，术语“逃逸突变”是指远离对治疗的治疗有效应答的肿瘤突变。
在一个实施例中，本文提供了包含编码本文提供的重组多肽的第一开放阅读框的核酸分子，其中核酸分子驻留在重组李斯特菌疫苗株内。在另一个实施例中，将本文提供的核酸分子用于转化李斯特菌，以获得重组李斯特菌。在另一个实施例中，本文提供的核酸缺乏毒力基因。在另一个实施例中，整合进李斯特菌基因组的核酸分子携带无功能的毒力基因。在另一个实施例中，毒力基因在重组李斯特菌的基因组中是突变的。在又一个实施例中，该核酸分子用于使李斯特菌基因组中存在的内源性基因失活。在又一个实施例中，毒力基因是actA基因。在另一个实施例中，毒力基因是prfA基因。在另一个实施例中，毒力基因是inlB基因。技术人员将会理解，毒力基因可以是本领域已知的与重组李斯特菌中的毒性相关的任何基因。
在一个实施例中，代谢基因、毒力基因或两者在李斯特菌菌株的染色体中缺乏。在另一个实施例中，代谢基因、毒力基因或两者在李斯特菌菌株的染色体以及任何游离型遗传元件中缺乏。技术人员将会理解，术语“游离体”、“游离体的”等是指不整合进本文提供的李斯特菌的染色体中的质粒载体或其用途。在另一个实施例中，该术语是指整合进本文提供的李斯特菌的染色体中的质粒载体。在另一个实施例中，代谢基因、毒力基因或两者在李斯特菌菌株的基因组中缺乏。在一个实施例中，代谢基因、毒力基因或两者在染色体中突变。在一个实施例中，代谢基因、毒力基因或两者从染色体中缺失。在一个实施例中，代谢基因、毒力基因或两者在染色体中失活。
在另一个实施例中，本文提供的核酸和质粒不赋予重组李斯特菌抗生素抗性。
“核酸分子”在一个实施例中是指质粒。在另一个实施例中，该术语是指整合载体。在另一个实施例中，该术语是指非整合载体。在另一个实施例中，该术语是指包含整合载体的质粒。在另一个实施例中，整合载体是位点特异性整合载体。在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的核酸分子由本领域已知的任何类型的核苷酸构成。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
“代谢酶”在另一个实施例中是指参与宿主细菌所需的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，该术语是指宿主细菌所需的营养物的合成所需的酶。在另一个实施例中，该术语是指参与宿主细菌所利用的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，该术语是指参与宿主细菌持续生长所需的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，该酶为营养物的合成所需。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，“稳定保持”指核酸分子或质粒在没有选择(例如抗生素选择)的情况下保持10代，而没有可检测的损失。在另一个实施例中，该周期为15代。在另一个实施例中，该周期为20代。在另一个实施例中，该周期为25代。在另一个实施例中，该周期为30代。在另一个实施例中，该周期为40代。在另一个实施例中，该周期为50代。在另一个实施例中，该周期为60代。在另一个实施例中，该周期为80代。在另一个实施例中，该周期为100代。在另一个实施例中，该周期为150代。在另一个实施例中，该周期为200代。在另一个实施例中，该周期为300代。在另一个实施例中，该周期为500代。在另一个实施例中，该周期为500代以上。在另一个实施例中，该核酸分子或质粒在体外(例如培养物中)稳定保持。在另一个实施例中，该核酸分子或质粒在体内稳定保持。在另一个实施例中，该核酸分子或质粒在体外和体内都稳定保持。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，本发明提供表达该抗原的重组李斯特菌菌株。本发明还提供包含融合至Her-2嵌合蛋白或其片段的李斯特菌溶血素(LLO)蛋白片段的重组多肽，包含该重组多肽的疫苗和免疫原性组合物，以及诱导抗Her-2免疫应答和治疗Her-2表达性肿瘤及接种包含该重组多肽的疫苗的方法。
在另一个实施例中，本发明的重组李斯特菌菌株已在动物宿主中传代。在另一个实施例中，该传代让该菌株作为疫苗载体的效能最佳化。在另一个实施例中，该传代稳定李斯特菌菌株的免疫原性。在另一个实施例中，该传代稳定李斯特菌菌株的毒力。在另一个实施例中，该传代增强李斯特菌菌株的免疫原性。在另一个实施例中，该传代增强李斯特菌菌株的毒力。在另一个实施例中，该传代除去李斯特菌菌株的不稳定亚株。在另一个实施例中，该传代降低李斯特菌菌株的不稳定亚株的普遍性。在另一个实施例中，李斯特菌菌株包含编码含抗原重组肽的基因的基因组插入。在另一个实施例中，李斯特菌菌株携带包含编码含抗原重组肽的基因的质粒。在另一个实施例中，该传代通过本领域已知的任何其他方法进行。
在一个实施例中，本文提供的多肽为融合蛋白，该融合蛋白包含另外的多肽，该另外的多肽选自：a)非溶血LLO蛋白或N-末端片段、b)PEST序列或c)ActA片段，另外其中所述另外的多肽融合至Her-2/neu嵌合抗原。在另一个实施例中，另外的多肽是有功能的。在另一个实施例中，另外的多肽的片段具有免疫原性。在另一个实施例中，另外的多肽具有免疫原性。
在另一个实施例中，本文提供的多肽为融合蛋白，该融合蛋白包含融合至Her-2/neu嵌合抗原的非溶血LLO蛋白或N-末端片段。在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的融合蛋白包含来自李斯特菌生物体的ActA序列。在一个实施例中，ActA蛋白及其片段以类似于LLO的方式增强抗原呈递和免疫。
在本发明的方法和组合物的一个实施例中，融合蛋白包含Her-2/neu抗原和另外的多肽。在另一个实施例中，融合至Her-2/neu抗原的该另外的多肽称为另外的佐剂多肽。在一个实施例中，另外的多肽是非溶血LLO蛋白或其片段(本文的实例)。在另一个实施例中，另外的多肽是PEST序列。在另一个实施例中，另外的多肽是ActA蛋白或其片段。
在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的另外的多肽是李斯特菌溶血素(LLO)肽。在另一个实施例中，另外的多肽是ActA肽。在另一个实施例中，另外的多肽是PEST序列肽。在另一个实施例中，另外的多肽是能够增强抗原肽的免疫原性的任何其他肽。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
包含Her-2/neu嵌合抗原的融合蛋白可通过任何合适的方法制备，包括例如克隆和适当序列的限制或通过下文讨论的方法直接化学合成。或者，可克隆子序列并使用适当的限制性酶切割适当的子序列。然后可连接片段以制备所需的DNA序列。在一个实施例中，编码所述抗原的DNA可使用DNA扩增法例如聚合酶链式反应(PCR)制备。首先，在天然DNA片段的新末端的任一侧单独扩增。一个扩增的序列的5'末端编码肽接头，而另一个扩增的序列的3'末端也编码肽接头。由于第一片段的5'末端与第二片段的3'末端互补，两个片段(在部分纯化后，如在LMP琼脂糖上)可在第三PCR反应中用作重叠模板。扩增的序列将包含密码子、开口位点羧基侧上的片段(现在形成氨基序列)、接头和开口位点氨基侧上的序列(现在形成羧基序列)。将抗原连接至质粒。每种方法代表了本发明的独立实施例。
本发明的结果表明，本发明的组合物的施用可用于诱导识别和杀死肿瘤细胞的抗原特异性T细胞(如，细胞毒性T细胞)的形成(本文的实例)。
在一个实施例中，本发明提供包含融合至Her-2嵌合蛋白或融合至其片段的LLO蛋白的N-末端片段的重组多肽。在一个实施例中，本发明提供由融合至Her-2嵌合蛋白或融合至其片段的LLO蛋白的N-末端片段组成的重组多肽。
在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的Her-2嵌合蛋白是人Her-2嵌合蛋白。在另一个实施例中，Her-2嵌合蛋白是小鼠Her-2嵌合蛋白。在另一个实施例中，Her-2嵌合蛋白是大鼠Her-2嵌合蛋白。在另一个实施例中，Her-2嵌合蛋白是灵长类Her-2嵌合蛋白。在另一个实施例中，Her-2嵌合蛋白是犬科动物Her-2嵌合蛋白。在另一个实施例中，Her-2蛋白是本领域已知的人或任何其他动物物种的Her-2嵌合蛋白或它们的组合。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，Her-2蛋白是称为“Her-2/neu”、“Erbb2”、“v-erb-b2”、“c-erb-b2”、“neu”或“cNeu”的蛋白。在另一个实施例中，术语Her2/neu或其语法等同形式在本文也称为“Her-2”、“Her-2蛋白”、“HER2蛋白”或“HER2”。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，Her2-neu嵌合蛋白具有Her-2/neu抗原的两个胞外片段和一个胞内片段，该抗原示出癌基因的MHC I类表位簇，而在另一个实施例中，嵌合蛋白具有3个H2Dq和至少17个Her-2/neu抗原的标绘的人MHC I类表位(片段EC1、EC2和IC1)(参见图1A)。在另一个实施例中，嵌合蛋白具有至少13个标绘的人MHC I类表位(片段EC2和IC1)。在另一个实施例中，嵌合蛋白具有至少14个标绘的人MHC I类表位(片段EC1和IC1)。在另一个实施例中，嵌合蛋白具有至少9个标绘的人MHC I类表位(片段EC1和IC2)。在另一个实施例中，Her2-neu嵌合蛋白融合至非溶血李斯特菌溶血素O(LLO)。在另一个实施例中，Her2-neu嵌合蛋白融合至截短的李斯特菌溶血素O(tLLO)。在另一个实施例中，Her2-neu嵌合蛋白融合至单核细胞增多性李斯特菌李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白的前441个氨基酸，并且由单核细胞增多性李斯特菌减毒营养缺陷型菌株LmddA表达和分泌。在另一个实施例中，来自本文提供的减毒营养缺陷型菌株(表达嵌合Her-2/neu抗原/LLO融合蛋白)的融合蛋白tLLO-ChHer2的表达和分泌与体外生长8小时后TCA沉淀细胞培养上清液中Lm-LLO-ChHer2的表达和分泌相当(参见图1B)。
在一个实施例中，在未暴露的动物(animal)或不相关李斯特菌疫苗注射的小鼠中未检测到CTL活性(参见图2A)。而在另一个实施例中，本文提供的减毒营养缺陷型菌株(ADXS31-164)能够通过野生型FVB/N小鼠的脾细胞刺激IFN-γ的分泌(图2B)。
在另一个实施例中，本文提供的方法和组合物的代谢酶是氨基酸代谢酶，而在另一个实施例中，代谢酶是丙氨酸消旋酶。在另一个实施例中，代谢酶是D-氨基酸转移酶。在另一个实施例中，代谢酶催化用于重组李斯特菌菌株中的细胞壁合成的氨基酸的形成，而在另一个实施例中，代谢酶是丙氨酸消旋酶。
在另一个实施例中，编码该代谢酶的基因在李斯特菌p60启动子的控制下表达。在另一个实施例中，使用inlA(编码内化素)启动子。在另一个实施例中，使用hly启动子。在另一个实施例中，使用ActA启动子。在另一个实施例中，整合酶基因在任何其他革兰氏阳性启动子的控制下表达。在另一个实施例中，编码代谢酶的基因在李斯特菌中发挥功能的任何其他启动子的控制下表达。技术人员将会知道，其他启动子或多顺反子表达盒可用于驱动基因的表达。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，Her-2嵌合蛋白由以下SEQ ID NO:1示出的核酸序列编码gagacccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaacctggaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggaggtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctgcggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaatggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggagctgcagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccccagctctgctaccaggacacgattttgtggaagaatatccaggagtttgctggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttctgccggagagctttgatggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagcagctccaagtgtttgagactctggaagagatcacaggttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcctgacctcagcgtcttccagaacctgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcctactcgctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaactgggcagtggactggccctcatccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtgccctgggaccagctctttcggaacccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggccagaggacgagtgtgtgggcgagggcctggcctgccaccagctgtgcgcccgagggcagcagaagatccggaagtacacgatgcggagactgctgcaggaaacggagctggtggagccgctgacacctagcggagcgatgcccaaccaggcgcagatgcggatcctgaaagagacggagctgaggaaggtgaaggtgcttggatctggcgcttttggcacagtctacaagggcatctggatccctgatggggagaatgtgaaaattccagtggccatcaaagtgttgagggaaaacacatcccccaaagccaacaaagaaatcttagacgaagcatacgtgatggctggtgtgggctccccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacagcttatgccctatggctgcctcttagactaa(SEQ ID NO:1)。
在另一个实施例中，Her-2嵌合蛋白具有以下序列：
E T H L D M L R H L Y Q G C Q V V Q G N L E L T Y L P T N A S L S F LQ D I Q E V Q G Y V L I A H N Q V R Q V P L Q R L R I V R G T Q L F E D N Y AL A V L D N G D P L N N T T P V T G A S P G G L R E L Q L R S L T E I L K G GV L I Q R N P Q L C Y Q D T I L W K N I Q E F A G C KK I F G S L A F L P E SF D G D P A S N T A P L Q P E Q L Q V F E T L E E I T G Y L Y I S A W P D S LP D L S V F Q N L Q V I R G R I L H N G A Y S L T L Q G L G I S W L G L R S LR E L G S G L A L I H H N T H L C F V H T V P W D Q L F R N P H Q A L L H T AN R P E D E C V G E G L A C H Q L C A R G Q Q K I R K Y T M R R L L Q E T E LV E P L T P S G A M P N Q A Q M R I L K E T E L R K V K V L G S G A F G T V YK G I W I P D G E N V K I P V A I K V L R E N T S P K A N K E I L D E A Y V MA G V G S P Y V S R L L G I C L T S T V Q L V T Q L M P Y G C L L D(SEQ IDNO:2)。
下表1分别示出人和犬科动物Her-2 EC和IC片段的氨基酸序列之间的百分比(％)同一性。
表1
在另一个实施例中，编码人Her-2/neu EC1片段的氨基酸序列在(SEQ ID NO:69)：
SLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCK(SEQ ID NO:69)中示出。
在另一个实施例中，编码犬科动物Her-2/neu EC1片段的氨基酸序列在(SEQ IDNO:70)：
SLSFLQDIQEVQGYVLIAHSQVRQIPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLEGGIPAPGAAPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRSPQLCHQDTILWKDVFHKNNQLALTLIDTNRSRACPPCSPACK(SEQ ID NO:70)中示出。
在另一个实施例中，编码人Her-2/neu EC2片段的氨基酸序列在(SEQ ID NO:71)：
TAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGS(SEQ ID NO:71)中示出。
在另一个实施例中，编码犬科动物Her-2/neu EC2片段的氨基酸序列在(SEQ IDNO:72)：
TAPLQPEQLRVFEALEEITGYLYISAWPDSLPNLSVFQNLRVIRGRVLHDGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGS(SEQ ID NO:72)中示出。
在另一个实施例中，编码人Her-2/neu IC1片段的氨基酸序列在(SEQ ID NO:73)：
NQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLED(SEQ ID NO:73)中示出。
在另一个实施例中，编码犬科动物Her-2/neu IC1片段的氨基酸序列在(SEQ IDNO:74)：
NQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLED(SEQ ID NO:74)中示出。
在一个实施例中，Her-2 EC1片段(SEQ ID NO:69)的人氨基酸序列具有与犬科动物Her-2 EC1片段(SEQ ID NO:70)89％的同一性。在另一个实施例中，Her-2 EC2片段(SEQID NO:71)的人氨基酸序列具有与犬科动物Her-2 EC2片段(SEQ ID NO:72)93％的同一性。在另一个实施例中，Her-2 IC1片段(SEQ ID NO:73)的人氨基酸序列具有与犬科动物Her-2IC1片段(SEQ ID NO:74)98％的同一性。
在一个实施例中，本文提供的方法和组合物的Her2嵌合蛋白或其片段不包括其信号序列。在另一个实施例中，由于信号序列的高疏水性，信号序列的省去使Her2片段能够在李斯特菌中成功表达。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的Her2嵌合蛋白的片段不包括其跨膜域(TM)。在一个实施例中，由于TM的高疏水性，TM的省去使Her2片段能够在李斯特菌中成功表达。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，大鼠Her-2/neu基因的核酸序列为CCGGAATCGCGGGCACCCAAGTGTGTACCGGCACAGACATGAAGTTGCGGCTCCCTGCCAGTCCTGAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTGTACCAGGGCTGTCAGGTAGTGCAGGGCAACTTGGAGCTTACCTACGTGCCTGCCAATGCCAGCCTCTCATTCCTGCAGGACATCCAGGAAGTTCAGGGTTACATGCTCATCGCTCACAACCAGGTGAAGCGCGTCCCACTGCAAAGGCTGCGCATCGTGAGAGGGACCCAGCTCTTTGAGGACAAGTATGCCCTGGCTGTGCTAGACAACCGAGATCCTCAGGACAATGTCGCCGCCTCCACCCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCTGAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTGGAAGGACGTCTTCCGCAAGAATAACCAACTGGCTCCTGTCGATATAGACACCAATCGTTCCCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCCGGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGGCCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGCATTCTGACTGCCTGGCCTGCCTCCACTTCAATCATAGTGGTATCTGTGAGCTGCACTGCCCAGCCCTCGTCACCTACAACACAGACACCTTTGAGTCCATGCACAACCCTGAGGGTCGCTACACCTTTGGTGCCAGCTGCGTGACCACCTGCCCCTACAACTACCTGTCTACGGAAGTGGGATCCTGCACTCTGGTGTGTCCCCCGAATAACCAAGAGGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCTCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGACAATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTGTTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTCCGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGCGCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGGGAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACTGTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGGCCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCACTGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGTCATTTCCTTCGGGGCCAGGAGTGTGTGGAGGAGTGCCGAGTATGGAAGGGGCTCCCCCGGGAGTATGTGAGTGACAAGCGCTGTCTGCCGTGTCACCCCGAGTGTCAGCCTCAAAACAGCTCAGAGACCTGCTTTGGATCGGAGGCTGATCAGTGTGCAGCCTGCGCCCACTACAAGGACTCGTCCTCCTGTGTGGCTCGCTGCCCCAGTGGTGTGAAACCGGACCTCTCCTACATGCCCATCTGGAAGTACCCGGATGAGGAGGGCATATGCCAGCCGTGCCCCATCAACTGCACCCACTCCTGTGTGGATCTGGATGAACGAGGCTGCCCAGCAGAGCAGAGAGCCAGCCCGGTGACATTCATCATTGCAACTGTAGTGGGCGTCCTGCTGTTCCTGATCTTAGTGGTGGTCGTTGGAATCCTAATCAAACGAAGGAGACAGAAGATCCGGAAGTATACGATGCGTAGGCTGCTGCAGGAAACTGAGTTAGTGGAGCCGCTGACGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGCTAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACATCTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTCCGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCCAGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGCGGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCAAGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAGATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCACCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGGCCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAACGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTTCACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTTGGGCCCATCCAGCCCCATGGACAGTACCTTCTACCGTTCACTGCTGGAAGATGATGACATGGGTGACCTGGTAGACGCTGAAGAGTATCTGGTGCCCCAGCAGGGATTCTTCTCCCCGGACCCTACCCCAGGCACTGGGAGCACAGCCCATAGAAGGCACCGCAGCTCGTCCACCAGGAGTGGAGGTGGTGAGCTGACACTGGGCCTGGAGCCCTCGGAAGAAGGGCCCCCCAGATCTCCACTGGCTCCCTCGGAAGGGGCTGGCTCCGATGTGTTTGATGGTGACCTGGCAATGGGGGTAACCAAAGGGCTGCAGAGCCTCTCTCCACATGACCTCAGCCCTCTACAGCGGTACAGCGAGGACCCCACATTACCTCTGCCCCCCGAGACTGATGGCTATGTTGCTCCCCTGGCCTGCAGCCCCCAGCCCGAGTATGTGAACCAATCAGAGGTTCAGCCTCAGCCTCCTTTAACCCCAGAGGGTCCTCTGCCTCCTGTCCGGCCTGCTGGTGCTACTCTAGAAAGACCCAAGACTCTCTCTCCTGGGAAGAATGGGGTTGTCAAAGACGTTTTTGCCTTCGGGGGTGCTGTGGAGAACCCTGAATACTTAGTACCGAGAGAAGGCACTGCCTCTCCGCCCCACCCTTCTCCTGCCTTCAGCCCAGCCTTTGACAACCTCTATTACTGGGACCAGAACTCATCGGAGCAGGGGCCTCCACCAAGTAACTTTGAAGGGACCCCCACTGCAGAGAACCCTGAGTACCTAGGCCTGGATGTACCTGTA(SEQID NO:45)。
在一个实施例中，编码大鼠Her-2/neu EC1片段的核酸序列为
CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCTGAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTGGAAGGACGTCTTCCGCAAGAATAACCAACTGGCTCCTGTCGATATAGACACCAATCGTTCCCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCCGGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGGCCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGCA(SEQ ID NO:46)。
在另一个实施例中，编码大鼠Her-2/neu EC2片段的核酸序列为：
GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCTCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGACAATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTGTTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTCCGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGCGCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGGGAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACTGTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGGCCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCACTGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCA(SEQ ID NO:47)。
在另一个实施例中，编码大鼠Her-2/neu IC1片段的核酸序列为：
CGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGCTAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACATCTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTCCGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCCAGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGCGGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCAAGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAGATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCACCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGGCCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAACGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTTCACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTTGGGCCCATCCAGCCCCATGGACAGTACCTTCTACCGTTCACTGCTGGAA(SEQ ID NO:48)。
在一个实施例中，人Her-2/neu基因的核酸序列为：
ATGGAGCTGGCGGCCTTGTGCCGCTGGGGGCTCCTCCTCGCCCTCTTGCCCCCCGGAGCCGCGAGCACCCAAGTGTGCACCGGCACAGACATGAAGCTGCGGCTCCCTGCCAGTCCCGAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTCTACCAGGGCTGCCAGGTGGTGCAGGGAAACCTGGAACTCACCTACCTGCCCACCAATGCCAGCCTGTCCTTCCTGCAGGATATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTGCTCATCGCTCACAACCAAGTGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTGTGCGAGGCACCCAGCTCTTTGAGGACAACTATGCCCTGGCCGTGCTAGACAATGGAGACCCGCTGAACAATACCACCCCTGTCACAGGGGCCTCCCCAGGAGGCCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGCCTCACAGAGATCTTGAAAGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGAACCCCCAGCTCTGCTACCAGGACACGATTTTGTGGAAGGACATCTTCCACAAGAACAACCAGCTGGCTCTCACACTGATAGACACCAACCGCTCTCGGGCCTGCCACCCCTGTTCTCCGATGTGTAAGGGCTCCCGCTGCTGGGGAGAGAGTTCTGAGGATTGTCAGAGCCTGACGCGCACTGTCTGTGCCGGTGGCTGTGCCCGCTGCAAGGGGCCACTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCTGCCGGCTGCACGGGCCCCAAGCACTCTGACTGCCTGGCCTGCCTCCACTTCAACCACAGTGGCATCTGTGAGCTGCACTGCCCAGCCCTGGTCACCTACAACACAGACACGTTTGAGTCCATGCCCAATCCCGAGGGCCGGTATACATTCGGCGCCAGCTGTGTGACTGCCTGTCCCTACAACTACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGATGGAACACAGCGGTGTGAGAAGTGCAGCAAGCCCTGTGCCCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACTTGCGAGAGGTGAGGGCAGTTACCAGTGCCAATATCCAGGAGTTTGCTGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTCTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCAGCCTCCAACACTGCCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCCAAGTGTTTGAGACTCTGGAAGAGATCACAGGTTACCTATACATCTCAGCATGGCCGGACAGCCTGCCTGACCTCAGCGTCTTCCAGAACCTGCAAGTAATCCGGGGACGAATTCTGCACAATGGCGCCTACTCGCTGACCCTGCAAGGGCTGGGCATCAGCTGGCTGGGGCTGCGCTCACTGAGGGAACTGGGCAGTGGACTGGCCCTCATCCACCATAACACCCACCTCTGCTTCGTGCACACGGTGCCCTGGGACCAGCTCTTTCGGAACCCGCACCAAGCTCTGCTCCACACTGCCAACCGGCCAGAGGACGAGTGTGTGGGCGAGGGCCTGGCCTGCCACCAGCTGTGCGCCCGAGGGCACTGCTGGGGTCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGCCAGTTCCTTCGGGGCCAGGAGTGCGTGGAGGAATGCCGAGTACTGCAGGGGCTCCCCAGGGAGTATGTGAATGCCAGGCACTGTTTGCCGTGCCACCCTGAGTGTCAGCCCCAGAATGGCTCAGTGACCTGTTTTGGACCGGAGGCTGACCAGTGTGTGGCCTGTGCCCACTATAAGGACCCTCCCTTCTGCGTGGCCCGCTGCCCCAGCGGTGTGAAACCTGACCTCTCCTACATGCCCATCTGGAAGTTTCCAGATGAGGAGGGCGCATGCCAGCCTTGCCCCATCAACTGCACCCACTCCTGTGTGGACCTGGATGACAAGGGCTGCCCCGCCGAGCAGAGAGCCAGCCCTCTGACGTCCATCGTCTCTGCGGTGGTTGGCATTCTGCTGGTCGTGGTCTTGGGGGTGGTCTTTGGGATCCTCATCAAGCGACGGCAGCAGAAGATCCGGAAGTACACGATGCGGAGACTGCTGCAGGAAACGGAGCTGGTGGAGCCGCTGACACCTAGCGGAGCGATGCCCAACCAGGCGCAGATGCGGATCCTGAAAGAGACGGAGCTGAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCTGGCGCTTTTGGCACAGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCTGATGGGGAGAATGTGAAAATTCCAGTGGCCATCAAAGTGTTGAGGGAAAACACATCCCCCAAAGCCAACAAAGAAATCTTAGACGAAGCATACGTGATGGCTGGTGTGGGCTCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCTGACATCCACGGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTCTTAGACCATGTCCGGGAAAACCGCGGACGCCTGGGCTCCCAGGACCTGCTGAACTGGTGTATGCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGATGTGCGGCTCGTACACAGGGACTTGGCCGCTCGGAACGTGCTGGTCAAGAGTCCCAACCATGTCAAAATTACAGACTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGACGAGACAGAGTACCATGCAGATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAGTGGATGGCGCTGGAGTCCATTCTCCGCCGGCGGTTCACCCACCAGAGTGATGTGTGGAGTTATGGTGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGGCCAAACCTTACGATGGGATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGACCTGCTGGAAAAGGGGGAGCGGCTGCCCCAGCCCCCCATCTGCACCATTGATGTCTACATGATCATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTCTGAATGTCGGCCAAGATTCCGGGAGTTGGTGTCTGAATTCTCCCGCATGGCCAGGGACCCCCAGCGCTTTGTGGTCATCCAGAATGAGGACTTGGGCCCAGCCAGTCCCTTGGACAGCACCTTCTACCGCTCACTGCTGGAGGACGATGACATGGGGGACCTGGTGGATGCTGAGGAGTATCTGGTACCCCAGCAGGGCTTCTTCTGTCCAGACCCTGCCCCGGGCGCTGGGGGCATGGTCCACCACAGGCACCGCAGCTCATCTACCAGGAGTGGCGGTGGGGACCTGACACTAGGGCTGGAGCCCTCTGAAGAGGAGGCCCCCAGGTCTCCACTGGCACCCTCCGAAGGGGCTGGCTCCGATGTATTTGATGGTGACCTGGGAATGGGGGCAGCCAAGGGGCTGCAAAGCCTCCCCACACATGACCCCAGCCCTCTACAGCGGTACAGTGAGGACCCCACAGTACCCCTGCCCTCTGAGACTGATGGCTACGTTGCCCCCCTGACCTGCAGCCCCCAGCCTGAATATGTGAACCAGCCAGATGTTCGGCCCCAGCCCCCTTCGCCCCGAGAGGGCCCTCTGCCTGCTGCCCGACCTGCTGGTGCCACTCTGGAAAGGGCCAAGACTCTCTCCCCAGGGAAGAATGGGGTCGTCAAAGACGTTTTTGCCTTTGGGGGTGCCGTGGAGAACCCCGAGTACTTGACACCCCAGGGAGGAGCTGCCCCTCAGCCCCACCCTCCTCCTGCCTTCAGCCCAGCCTTCGACAACCTCTATTACTGGGACCAGGACCCACCAGAGCGGGGGGCTCCACCCAGCACCTTCAAAGGGACACCTACGGCAGAGAACCCAGAGTACCTGGGTCTGGACGTGCCAGTGTGAACCAGAAGGCCAAGTCCGCAGAAGCCCTGA(SEQ ID NO:49)。
在另一个实施例中，以嵌合体实施的编码人Her-2/neu EC1片段的核酸序列跨越人EC1区域的120-510bp，并在(SEQ ID NO:50)中示出。
GAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTCTACCAGGGCTGCCAGGTGGTGCAGGGAAACCTGGAACTCACCTACCTGCCCACCAATGCCAGCCTGTCCTTCCTGCAGGATATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTGCTCATCGCTCACAACCAAGTGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTGTGCGAGGCACCCAGCTCTTTGAGGACAACTATGCCCTGGCCGTGCTAGACAATGGAGACCCGCTGAACAATACCACCCCTGTCACAGGGGCCTCCCCAGGAGGCCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGCCTCACAGAGATCTTGAAAGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGAACCCCCAGCTCTGCTACCAGGACACGATTTTGTGGAAG(SEQ ID NO:50)。
在一个实施例中，完整的EC1人Her-2/neu片段跨越人Her-2/neu基因的58-979bp，并在(SEQ ID NO:54)中示出。
GCCGCGAGCACCCAAGTGTGCACCGGCACAGACATGAAGCTGCGGCTCCCTGCCAGTCCCGAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTCTACCAGGGCTGCCAGGTGGTGCAGGGAAACCTGGAACTCACCTACCTGCCCACCAATGCCAGCCTGTCCTTCCTGCAGGATATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTGCTCATCGCTCACAACCAAGTGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTGTGCGAGGCACCCAGCTCTTTGAGGACAACTATGCCCTGGCCGTGCTAGACAATGGAGACCCGCTGAACAATACCACCCCTGTCACAGGGGCCTCCCCAGGAGGCCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGCCTCACAGAGATCTTGAAAGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGAACCCCCAGCTCTGCTACCAGGACACGATTTTGTGGAAGGACATCTTCCACAAGAACAACCAGCTGGCTCTCACACTGATAGACACCAACCGCTCTCGGGCCTGCCACCCCTGTTCTCCGATGTGTAAGGGCTCCCGCTGCTGGGGAGAGAGTTCTGAGGATTGTCAGAGCCTGACGCGCACTGTCTGTGCCGGTGGCTGTGCCCGCTGCAAGGGGCCACTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCTGCCGGCTGCACGGGCCCCAAGCACTCTGACTGCCTGGCCTGCCTCCACTTCAACCACAGTGGCATCTGTGAGCTGCACTGCCCAGCCCTGGTCACCTACAACACAGACACGTTTGAGTCCATGCCCAATCCCGAGGGCCGGTATACATTCGGCGCCAGCTGTGTGACTGCCTGTCCCTACAACTACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGAT(SEQ ID NO:54)。
在另一个实施例中，以嵌合体实施的编码人Her-2 EC2片段的核酸序列跨越人Her-2/neu EC2片段的1077-1554bp，并且包括50bp延伸，且在(SEQ ID NO:51)中示出。
AATATCCAGGAGTTTGCTGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTCTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCAGCCTCCAACACTGCCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCCAAGTGTTTGAGACTCTGGAAGAGATCACAGGTTACCTATACATCTCAGCATGGCCGGACAGCCTGCCTGACCTCAGCGTCTTCCAGAACCTGCAAGTAATCCGGGGACGAATTCTGCACAATGGCGCCTACTCGCTGACCCTGCAAGGGCTGGGCATCAGCTGGCTGGGGCTGCGCTCACTGAGGGAACTGGGCAGTGGACTGGCCCTCATCCACCATAACACCCACCTCTGCTTCGTGCACACGGTGCCCTGGGACCAGCTCTTTCGGAACCCGCACCAAGCTCTGCTCCACACTGCCAACCGGCCAGAGGACGAGTGTGTGGGCGAGGGCCTGGCCTGCCACCAGCTGTGCGCCCGAGGG(SEQ ID NO:51)。
在一个实施例中，完整的EC2人Her-2/neu片段跨越人Her-2/neu基因的907-1504bp，并在(SEQ ID NO:55)中示出。
TACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGATGGAACACAGCGGTGTGAGAAGTGCAGCAAGCCCTGTGCCCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACTTGCGAGAGGTGAGGGCAGTTACCAGTGCCAATATCCAGGAGTTTGCTGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTCTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCAGCCTCCAACACTGCCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCCAAGTGTTTGAGACTCTGGAAGAGATCACAGGTTACCTATACATCTCAGCATGGCCGGACAGCCTGCCTGACCTCAGCGTCTTCCAGAACCTGCAAGTAATCCGGGGACGAATTCTGCACAATGGCGCCTACTCGCTGACCCTGCAAGGGCTGGGCATCAGCTGGCTGGGGCTGCGCTCACTGAGGGAACTGGGCAGTGGACTGGCCCTCATCCACCATAACACCCACCTCTGCTTCGTGCACACGGTGCCCTGGGACCAGCTCTTTCGGAACCCGCACCAAGCTCTGCTCCACACTGCCAACCGGCCAGAG(SEQ ID NO:55)。
在另一个实施例中，以嵌合体实施的编码人Her-2/neu IC1片段的核酸序列以(SEQ ID NO:52)示出。
CAGCAGAAGATCCGGAAGTACACGATGCGGAGACTGCTGCAGGAAACGGAGCTGGTGGAGCCGCTGACACCTAGCGGAGCGATGCCCAACCAGGCGCAGATGCGGATCCTGAAAGAGACGGAGCTGAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCTGGCGCTTTTGGCACAGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCTGATGGGGAGAATGTGAAAATTCCAGTGGCCATCAAAGTGTTGAGGGAAAACACATCCCCCAAAGCCAACAAAGAAATCTTAGACGAAGCATACGTGATGGCTGGTGTGGGCTCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCTGACATCCACGGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTCTTAGACT(SEQ ID NO:52)。
在另一个实施例中，编码完整的人Her-2/neu IC1片段的核酸序列跨越人Her-2/neu基因的2034-3243，并在(SEQ ID NO:56)中示出。
CAGCAGAAGATCCGGAAGTACACGATGCGGAGACTGCTGCAGGAAACGGAGCTGGTGGAGCCGCTGACACCTAGCGGAGCGATGCCCAACCAGGCGCAGATGCGGATCCTGAAAGAGACGGAGCTGAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCTGGCGCTTTTGGCACAGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCTGATGGGGAGAATGTGAAAATTCCAGTGGCCATCAAAGTGTTGAGGGAAAACACATCCCCCAAAGCCAACAAAGAAATCTTAGACGAAGCATACGTGATGGCTGGTGTGGGCTCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCTGACATCCACGGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTCTTAGACCATGTCCGGGAAAACCGCGGACGCCTGGGCTCCCAGGACCTGCTGAACTGGTGTATGCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGATGTGCGGCTCGTACACAGGGACTTGGCCGCTCGGAACGTGCTGGTCAAGAGTCCCAACCATGTCAAAATTACAGACTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGACGAGACAGAGTACCATGCAGATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAGTGGATGGCGCTGGAGTCCATTCTCCGCCGGCGGTTCACCCACCAGAGTGATGTGTGGAGTTATGGTGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGGCCAAACCTTACGATGGGATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGACCTGCTGGAAAAGGGGGAGCGGCTGCCCCAGCCCCCCATCTGCACCATTGATGTCTACATGATCATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTCTGAATGTCGGCCAAGATTCCGGGAGTTGGTGTCTGAATTCTCCCGCATGGCCAGGGACCCCCAGCGCTTTGTGGTCATCCAGAATGAGGACTTGGGCCCAGCCAGTCCCTTGGACAGCACCTTCTACCGCTCACTGCTGGAGGACGATGACATGGGGGACCTGGTGGATGCTGAGGAGTATCTGGTACCCCAGCAGGGCTTCTTCTGTCCAGACCCTGCCCCGGGCGCTGGGGGCATGGTCCACCACAGGCACCGCAGCTCATCTACCAGGAGTGGCGGTGGGGACCTGACACTAGGGCTGGAGCCCTCTGAAGAGGAGGCCCCCAGGTCTCCACTGGCACCCTCCGAAGGGGCT(SEQ ID NO:56)。
在一个实施例中，用于本文提供的方法和组合物的LLO是李斯特菌LLO。在一个实施例中，LLO来自的李斯特菌是单核细胞增多性李斯特菌(LM)。在另一个实施例中，李斯特菌是伊万诺夫李斯特菌(Listeria ivanovii)。在另一个实施例中，李斯特菌是威耳逊李斯特菌。在另一个实施例中，李斯特菌是西尔李斯特菌。在另一个实施例中，LLO蛋白是非李斯特菌LLO蛋白。在另一个实施例中，LLO蛋白是合成LLO蛋白。在另一个实施例中，它是重组LLO蛋白。
在一个实施例中，LLO蛋白由以下(SEQ ID NO:3)示出的核酸序列编码
atgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgat(SEQ ID NO:3)。
在另一个实施例中，LLO蛋白包含序列SEQ ID NO:4
M K K I M L V F I T L I L V S L P I A Q Q T E A K D A S A F N K E N SI S S M A P P A S P P A S P K T P I E K K H A D E I D K Y I Q G L D Y N K N NV L V Y H G D A V T N V P P R K G Y K D G N E Y I V V E K K K K S I N Q N N AD I Q V V N A I S S L T Y P G A L V K A N S E L V E N Q P D V L P V K R D S LT L S I D L P G M T N Q D N K I V V K N A T K S N V N N A V N T L V E R W N EK Y A Q A Y P N V S A K I D Y D D E M A Y S E S Q L I A K F G T A F K A V N NS L N V N F G A I S E G K M Q E E V I S F K Q I Y Y N V N V N E P T R P S R FF G K A V T K E Q L Q A L G V N A E N P P A Y I S S V A Y G R Q V Y L K L S TN S H S T K V K A A F D A A V S G K S V S G D V E L T N I I K N S S F K A V IY G G S A K D E V Q I I D G N L G D L R D I L K K G A T F N R E T P G V P I AY T T N F L K D N E L A V I K N N S E Y I E T T S K A Y T D G K I N I D H S GG Y V A Q F N I S W D E V N Y D(SEQ ID NO:4)
对应于该序列的前蛋白的前25个氨基酸为信号序列，并且在细菌分泌时从LLO切割。因此，在本实施例中，全长的活性LLO蛋白为504个残基长。在另一个实施例中，LLO蛋白具有GenBank登录号DQ054588、DQ054589、AY878649、U25452或U25452示出的序列。在另一个实施例中，LLO蛋白是LLO蛋白的变体。在另一个实施例中，LLO蛋白是LLO蛋白的同源物。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，“截短的LLO”或“tLLO”是指包含PEST域的LLO片段。在另一个实施例中，该术语是指不包含氨基末端的活化域并且不包含胱氨酸484的LLO片段。在另一个实施例中，LLO片段由PEST序列组成。在另一个实施例中，LLO片段包含PEST序列。在另一个实施例中，LLO片段由529个氨基酸全长LLO蛋白的约前400至441个氨基酸组成。在另一个实施例中，该LLO片段为LLO蛋白的非溶血形式。
在本发明的方法和组合物的另一个实施例中，由本发明的方法和组合物的核酸序列编码的多肽是包含嵌合Her-2/neu抗原和另外的多肽的融合蛋白，其中在另一个实施例中，该融合蛋白尤其包含单核细胞增多性李斯特菌非溶血LLO蛋白(本文的实例)。
在一个实施例中，LLO片段由大约残基1-25组成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-50构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-75构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-100构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-125构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-150构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-175构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-200构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-225构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-250构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-275构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-300构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-325构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-350构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-375构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-400构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-425构成。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的融合蛋白包含来自LLO蛋白或来自另一种生物体如原核生物体的PEST序列。
PEST氨基酸序列在另一个实施例中具有选自SEQ ID NO:5-9的序列。在另一个实施例中，PEST序列是单核细胞增多性李斯特菌ActA蛋白的PEST序列。在另一个实施例中，PEST序列为KTEEQPSEVNTGPR(SEQ ID NO:5)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(SEQ ID NO:6)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQ ID NO:7)或RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(SEQID NO:8)。在另一个实施例中，PEST序列来自链球菌属(Streptococcus sp)的链球菌溶血素O蛋白。在另一个实施例中，PEST序列来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的链球菌溶血素O，例如氨基酸35-51处的KQNTASTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:9).在另一个实施例中，PEST序列来自类马链球菌(Streptococcus equisimilis)的链球菌溶血素O，例如氨基酸38-54处的KQNTANTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:10)。在另一个实施例中，PEST序列为源自原核生物体的另一PEST氨基酸序列。在另一个实施例中，PEST序列是本领域已知的任何其他PEST序列。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，抗原融合至单核细胞增多性李斯特菌的PEST序列增强了抗原的细胞介导免疫和抗肿瘤免疫。因此，抗原融合至来源于其他原核生物体的其他PEST序列也将增强抗原的免疫原性。可根据诸如由例如Rechsteiner和Rogers(1996,TrendsBiochem.Sci.21:267-271)针对单核细胞增多性李斯特菌所述的方法来鉴定其他原核生物体的PEST序列。或者，来自其他原核生物体的PEST氨基酸序列也可基于这种方法来鉴定。可预期其中PEST氨基酸序列的其他原核生物体包括但不限于其他的李斯特菌菌种。在另一个实施例中，PEST序列嵌入抗原蛋白内。因此，在另一个实施例中，“融合”是指既包含抗原也包含连接至抗原的一端或嵌入抗原内的PEST氨基酸序列的抗原蛋白。
在另一个实施例中，本文提供了包含本发明的重组多肽的疫苗。在另一个实施例中，本文提供了由本发明的重组多肽组成的疫苗。
在另一个实施例中，本文提供了编码本发明的重组多肽的核苷酸分子。在另一个实施例中，本文提供了包含核苷酸分子的疫苗。
在另一个实施例中，本文提供了编码本发明的重组多肽的核苷酸分子。
在另一个实施例中，本文提供了本发明的核苷酸分子编码的重组多肽。
在另一个实施例中，本文提供了包含本发明的核苷酸分子或重组多肽的疫苗。
在另一个实施例中，本文提供了包含本发明的核苷酸分子或重组多肽的免疫原性组合物。
在另一个实施例中，本文提供了包含本发明的核苷酸分子或重组多肽的载体。
在另一个实施例中，本文提供了包含本发明的核苷酸分子的李斯特菌的重组形式。
在另一个实施例中，本文提供了包含本发明的李斯特菌的重组形式的疫苗。
在另一个实施例中，本文提供了本发明的李斯特菌的重组形式的培养物。
在一个实施例中，用于本发明的方法的疫苗或组合物包含本文所述的任何形式或实施例的重组单核细胞增多性李斯特菌。在一个实施例中，用于本发明的疫苗或组合物由本文所述的任何形式或实施例的本发明的重组单核细胞增多性李斯特菌组成。在另一个实施例中，用于本发明的方法的疫苗或组合物基本上由本文所述的任何形式或实施例的本发明的重组单核细胞增多性李斯特菌组成。在一个实施例中，术语“包含”是指疫苗或组合物中包含重组单核细胞增多性李斯特菌，以及包括可为本领域已知的其他疫苗、组合物或处理。在另一个实施例中，术语“基本上由...组成”是指功能组分为重组单核细胞增多性李斯特菌的疫苗，然而可包括不直接涉及疫苗的治疗效果的其他疫苗组分，并且可以例如指有利于重组单核细胞增多性李斯特菌的效果(如，稳定、维持等)的组分。在另一个实施例中，术语“组成”是指包含重组单核细胞增多性李斯特菌的疫苗。
在另一个实施例中，本文提供了阻碍或延缓来源于受试者的HER2表达性肿瘤的转移性疾病的方法，其中并且在另一个实施例中，该方法包括将包含本文所述的重组李斯特菌疫苗株的组合物施用于受试者的步骤。
在另一个实施例中，本发明的方法包括施用本文所述的任何形式或实施例的重组单核细胞增多性李斯特菌的步骤。在一个实施例中，本发明的方法由施用本文所述的任何形式或实施例的本发明的重组单核细胞增多性李斯特菌的步骤组成。在另一个实施例中，本发明的方法基本上由施用本文所述的任何形式或实施例的本发明的重组单核细胞增多性李斯特菌的步骤组成。在一个实施例中，术语“包括”是指方法包括施用重组单核细胞增多性李斯特菌的步骤，以及包括可为本领域已知的其他方法或处理。在另一个实施例中，术语“基本上由...组成”是指功能组成部分为施用重组单核细胞增多性李斯特菌的方法，然而可包括不直接涉及方法的治疗效果的其他方法步骤，并且可以例如指有利于重组单核细胞增多性李斯特菌的施用效果的步骤。在一个实施例中，术语“组成”是指无另外的步骤的施用重组单核细胞增多性李斯特菌的方法。
在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的李斯特菌是单核细胞增多性李斯特菌。在另一个实施例中，李斯特菌是伊万诺夫李斯特菌(Listeria ivanovii)。在另一个实施例中，李斯特菌是威耳逊李斯特菌。在另一个实施例中，李斯特菌是西尔李斯特菌。每种类型的李斯特菌表示本发明的单独实施例。
在一个实施例中，本发明的方法和组合物的李斯特菌菌株是ADXS31-164菌株。在另一个实施例中，ADXS31-164刺激野生型FVB/N小鼠的脾细胞分泌IFN-γ。另外，本文提供的数据显示，ADXS31-164能够引起对位于靶抗原的不同域的人表位的抗Her-2/neu特异性免疫应答。
在另一个实施例中，本发明提供包含编码Her-2嵌合蛋白或其片段的核苷酸分子的李斯特菌的重组形式。
在一个实施例中，融合蛋白的两个分子(LLO、ActA片段或PEST序列和抗原)直接连接。在另一个实施例中，两个分子通过由一个或多个氨基酸组成的短间隔肽连接。在一个实施例中，间隔肽除连接蛋白或维持一定的最小距离或它们之间的其他空间关系之外无特定生物学活性。在另一个实施例中，选择间隔肽的组成氨基酸以影响分子的一些性质，诸如折叠、净电荷或疏水性。在另一个实施例中，两个蛋白分子(LLO片段和抗原)是单独合成的或不融合的。在另一个实施例中，两个蛋白分子从相同的核酸单独合成。在又一个实施例中，两个分子从单独的核酸各自合成。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，编码本文提供的重组多肽的核酸还编码信号肽或序列。在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的融合蛋白包含来自LLO的LLO信号序列。在一个实施例中，异源抗原可通过使用信号序列诸如李斯特菌信号序列例如溶血素信号序列或actA信号序列表达。或者，例如，外源基因可在单核细胞增多性李斯特菌启动子下游表达，而不形成融合蛋白。在另一个实施例中，信号肽是细菌的(李斯特菌的或非李斯特菌的)。在一个实施例中，信号肽是细菌天然的。在另一个实施例中，信号肽是细菌外源的。在另一个实施例中，信号肽是单核细胞增多性李斯特菌的信号肽，诸如secA1信号肽。在另一个实施例中，信号肽是乳乳球菌(Lactococcus lactis)的Usp45信号肽或炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)的保护抗原信号肽。在另一个实施例中，信号肽是secA2信号肽，例如单核细胞增多性李斯特菌的p60信号肽。此外，重组核酸分子任选地包含编码p60或其片段的第三多核苷酸序列。在另一个实施例中，信号肽是Tat信号肽，诸如枯草芽孢杆菌Tat信号肽(如，PhoD)。在一个实施例中，信号肽在编码重组多肽的相同翻译阅读框中。
在另一个实施例中，本文提供了诱导受试者的抗Her-2免疫应答的方法，该方法包括将编码包含融合至Her-2嵌合蛋白或融合至其片段的LLO蛋白的N-末端片段的重组多肽的重组核苷酸施用于受试者，从而诱导受试者的抗Her-2免疫应答。
在一个实施例中，本文提供了引起受试者的对Her-2/neu表达性肿瘤的增强免疫应答的方法，而在另一个实施例中，该方法包括将包含本文提供的重组李斯特菌疫苗株的组合物施用于受试者。在另一个实施例中，对Her-2表达性肿瘤的免疫应答包括对Her-2蛋白的次优势表位的免疫应答。在另一个实施例中，对Her-2表达性肿瘤的免疫应答包括对Her-2蛋白的多个次优势表位的免疫应答。在另一个实施例中，对Her-2表达性肿瘤的免疫应答包括对Her-2蛋白的至少1-5个次优势表位的免疫应答。在另一个实施例中，对Her-2表达性肿瘤的免疫应答包括对Her-2蛋白的至少1-10个次优势表位的免疫应答。在另一个实施例中，对Her-2表达性肿瘤的免疫应答包括对Her-2蛋白的至少1-17个次优势表位的免疫应答。在另一个实施例中，对Her-2表达性肿瘤的免疫应答包括对Her-2蛋白的至少17个次优势表位的免疫应答。
据报告，当基于小片段李斯特菌的疫苗或曲妥单抗(针对位于Her-2/neu抗原的胞外域的表位的单克隆抗体)靶向这些肿瘤时，致癌蛋白Her-2/neu的点突变或氨基酸缺失介导了耐药肿瘤细胞的治疗。本文描述了基于嵌合Her-2/neu的组合物，该组合物具有Her-2/neu抗原的两个胞外片段和一个胞内片段，该抗原示出癌基因的MHC I类表位簇。该嵌合蛋白具有3个H2Dq和至少17个Her-2/neu抗原的标绘的人MHC I类表位，并且融合至单核细胞增多性李斯特菌李斯特菌溶血素O蛋白的前441个氨基酸，由单核细胞增多性李斯特菌减毒菌株LmddA表达和分泌。
前述报告示出，当使用分别表达和分泌Her-2/neu抗原的小片段的基于李斯特菌的疫苗(每种疫苗仅具有Her-2/neu癌基因的一个H2Dq表位)免疫Her-2/neu转基因小鼠时，由于每种疫苗靶向的Her-2/neu抗原的那些表位的突变，Her-2/neu过表达性肿瘤可逃逸(参见Singh R,Paterson Y.Immunoediting sculpts tumor epitopes duringimmunotherapy.Cancer Res 2007；67:1887-92)。本文示出了出乎意料的结果，当Her-2/neu蛋白的三个或更多个表位并入嵌合疫苗时，可通过逃逸突变消除这些肿瘤的选择和逃逸。使用新型Her-2/neu嵌合李斯特菌疫苗免疫不会导致可能与Her-2/neu抗原的点突变或氨基酸缺失相关的任何逃逸突变(参见本文的实例4)。
在一个实施例中，本文提供了将李斯特菌疫苗株工程化为表达Her-2嵌合蛋白或表达嵌合蛋白的重组多肽的方法，该方法包括用核酸分子转化李斯特菌菌株。在另一个实施例中，核酸分子包含编码多肽的第一开放阅读框，其中该多肽包含Her-2/neu嵌合抗原。在另一个实施例中，核酸分子还包含编码代谢酶的第二开放阅读框，并且其中所述代谢酶互补在重组李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因，从而将李斯特菌疫苗株工程化为表达Her-2嵌合蛋白。
在一个实施例中，本文提供的方法和组合物还包含佐剂，佐剂在一个实施例中为独立的佐剂，其中在另一个实施例中，佐剂或独立的佐剂包括粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂草苷QS21、单磷酰脂质A或未经甲基化的含CpG寡核苷酸。在另一个实施例中，佐剂是铝佐剂、弗氏佐剂、MPL、乳液、SBAS2、编码免疫刺激细胞因子的核苷酸分子、细菌有丝分裂原或细菌毒素。
在一个实施例中，“佐剂”是加强对抗原的免疫应答和/或调节其倾向所需的免疫应答的组分。在一个实施例中，佐剂是免疫原性佐剂，其在一个实施例中是在与特定的疫苗抗原结合使用时起到加速、延长或增强抗原特异性免疫应答的作用的物质。
在一个实施例中，“独立的”佐剂是独立的，在一个实施例中与存在于融合多肽中的本发明的“另外的佐剂多肽”不同的佐剂，所述融合多肽具有肿瘤特异性抗原，其在一个实施例中为Her-2/neu。
在一个实施例中，将减毒李斯特菌菌株诸如单核细胞增多性李斯特菌δ-actA突变体(Brundage et al,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90:11890-11894)、单核细胞增多性李斯特菌δ-plcA(Camilli et al,1991,J.Exp.Med.,173:751-754)或δ-ActA、δINL-b(Brockstedt et 5 al,2004,PNAS,101:13832–13837)用于本发明。在另一个实施例中，减毒李斯特菌菌株通过引入一个或多个减毒突变构建，如本领域的普通技术人员了解本文的公开内容时所理解。此类菌株的例子包括但不限于芳族氨基酸营养缺陷型李斯特菌菌株(Alexander et al,1993,Infection and Immunity 10 61:2245-2248)和形成脂磷壁酸的突变体(Abachin et al,2002,Mol.Microbiol.43:1-14)以及因缺乏毒力基因而减毒的那些(参见本文的实例)。
在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的核酸分子可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的第一开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的第二开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的第三开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施例中，每个开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
技术人员在了解本文提供的本公开内容和方法时，将易于理解不同的转录启动子、终止子、载体或特定基因序列(如，市售的克隆载体中的那些)可成功地用于本发明的方法和组合物。如本发明所设想，这些功能在例如称为pUC系列的市售载体中提供。在另一个实施例中，移除非必需DNA序列(如，抗生素抗性基因)。每种可能性代表了本发明的独立实施例。在另一个实施例中，本发明使用市售的质粒。此类质粒可从多个来源获得，例如Invitrogen(La Jolla,CA)、Stratagene(La Jolla,CA)、Clontech(Palo Alto,CA)，或可使用本领域熟知的方法构建。
在另一个实施例中，将诸如pCR2.1(Invitrogen,La Jolla,CA)的质粒用于有利于在原核生物体中表达本发明的多肽，pCR2.1是具有原核复制起点和启动子/调控元件的原核表达载体。在另一个实施例中，移除外源性核苷酸序列以减小质粒的大小并增加可置于其中的盒的大小。
此类方法是本领域熟知的，并且在例如Sambrook et al.(1989,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)andAusubei et al.(1997,Current Protocols in Molecular Biology,Green&Wiley,NewYork)中有所描述。
将抗生素抗性基因用于分子生物学和疫苗制备通常使用的常规选择和克隆工艺。本发明设想的抗生素抗性基因包括但不限于赋予氨苄青霉素、青霉素、甲氧西林、链霉素、红霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素(CAT)、新霉素、潮霉素、庆大霉素以及本领域熟知的其他抗生素抗性的基因产物。每个基因表示本发明的单独实施例。
用于转化细菌的方法是本领域熟知的，并包括基于氯化钙感受态细胞的方法、电穿孔方法、噬菌体介导的转导、化学和物理转化技术(de Boer et al,1989,Cell 56:641-649；Miller et al,1995,FASEB J.,9:190-199；Sambrook et al.1989,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York；Ausubel etal.,1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York；Gerhardt et al.,eds.,1994,Methods for General and Molecular Bacteriology,American Society for Microbiology,Washington,DC；Miller,1992,A Short Course inBacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。在另一个实施例中，本发明的李斯特菌疫苗株通过电穿孔转化。每种方法代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，将接合用于将遗传物质和/或质粒引入细菌。接合的方法是本领域熟知的，并且例如在Nikodinovic J et al.(A second generation snp-derivedEscherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that is generallytransferable by conjugation.Plasmid.2006Nov；56(3):223-7)和Auchtung JM et al(Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellularsignaling and the global DNA damage response.Proc Natl Acad Sci U S A.2005Aug 30；102(35):12554-9)中有所描述。每种方法代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，“转化”与术语“转染”等同使用，是指将细菌细胞工程化为吸收质粒或其他异源性DNA分子。在另一个实施例中，“转化”是指将细菌细胞工程化为表达质粒的基因或其他异源性DNA分子。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
本发明可用的质粒和其他表达载体在本文别处有所描述，并且可包括例如启动子/调控序列、革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的复制起点、编码融合蛋白的分离的核酸以及编码氨基酸代谢基因的分离的核酸等特征。另外，编码融合蛋白和氨基酸代谢基因的分离的核酸将具有适用于驱动此类分离的核酸的表达的启动子。用于驱动在细菌系统中表达的启动子是本领域熟知的，并且包括噬菌体λ、pBR322的β-内酰胺酶基因的bla启动子和pBR325的氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。原核启动子的另外例子包括：噬菌体λ的主要右和左启动子(PL和PR)，大肠杆菌的trp、recA、lacZ、lad和gal启动子，枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶(Ulmanen et al,1985.J.Bacteriol.162:176-182)和S28特异性启动子(Gilmanet al,1984Gene 32:11-20)，芽孢杆菌属的噬菌体的启动子(Gryczan,1982,In:TheMolecular Biology of the Bacilli,Academic Press,Inc.,New York)以及链霉菌属启动子(Ward et al,1986,Mol.Gen.Genet.203:468-478)。在本发明中考虑的另外的原核启动子例如在Glick(1987,J.Ind.Microbiol.1:277-282)、Cenatiempo(1986,Biochimie,68:505-516)和Gottesman(1984,Ann.Rev.Genet.18:415-442)中进行了综述。在本发明中考虑的启动子/调控元件的另外例子包括但不限于：李斯特菌prfA启动子、李斯特菌hly启动子、李斯特菌p60启动子和李斯特菌ActA启动子(GenBank登录号NC_003210)或其片段。
在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的质粒包含编码融合蛋白的基因。在另一个实施例中，克隆子序列，并使用适当的限制性酶切割适当的子序列。在另一个实施例中，然后连接片段生成所需的DNA序列。在另一个实施例中，编码抗原的DNA使用DNA扩增法例如聚合酶链式反应(PCR)制备。首先，在天然DNA片段的新末端的任一侧单独扩增。一个扩增的序列的5'末端编码肽接头，而另一个扩增的序列的3'末端也编码肽接头。由于第一片段的5'末端与第二片段的3'末端互补，两个片段(在部分纯化后，如在LMP琼脂糖上)可在第三PCR反应中用作重叠模板。扩增的序列将包含密码子、开口位点羧基侧上的片段(现在形成氨基序列)、接头和开口位点氨基侧上的序列(现在形成羧基序列)。将抗原连接至质粒。每种方法代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，本发明还包括用于临床应用的基于噬菌体的染色体整合系统。使用必需酶(包括但不限于D-丙氨酸消旋酶)营养缺陷型宿主菌株，例如Lmdal(-)dat(-)。在另一个实施例中，为避免“噬菌体治愈步骤”(phage curing step)，使用基于PSA的噬菌体整合系统(Lauer,et al.,2002 J Bacteriol,184:4177-4186)。这在另一个实施例中需要通过抗生素持续选择以维持整合基因。因此，在另一个实施例中，本发明使得能建立基于噬菌体的染色体整合系统，该系统不需要以抗生素选择。相反，营养缺陷型宿主菌株将是互补的。
在另一个实施例中，使用重组DNA方法合成本发明的重组蛋白。在一个实施例中，这涉及形成编码融合蛋白的DNA序列，将DNA置于具体启动子/调控元件的控制下的表达盒(诸如本发明的质粒)中，以及表达蛋白。在另一个实施例中，通过任何合适的方法，包括例如适当序列的克隆和限制或通过诸如Narang et al.(1979,Meth.Enzymol.68:90-99)的磷酸三酯法、Brown et al.(1979,Meth.Enzymol 68:109-151)的磷酸二酯法、Beaucage etal.(1981,Tetra.Lett.,22:15 1859-1862)的二乙基亚磷酰胺法和美国专利No.4,458,066的固相载体法的方法直接化学合成来制备编码本发明的融合蛋白(如，非溶血LLO/抗原)的DNA。
在另一个实施例中，使用化学合成制备单链寡核苷酸。在各种实施例中，该单链寡核苷酸通过与互补序列杂交或使用单链作为模板通过DNA聚合酶聚合转换为双链DNA。本领域的技术人员将认识到，虽然DNA的化学合成仅限于约100个碱基的序列，但较长的序列可通过较短的序列的连接获得。在另一个实施例中，克隆子序列，并使用适当的限制性酶切割适当的子序列。然后连接片段以制备所需的DNA序列。
在另一个实施例中，使用DNA扩增法诸如聚合酶链式反应(PCR)克隆编码本发明的融合蛋白或重组蛋白的DNA。因此，使用包含合适的限制性位点的正义引物和包含另一个限制性位点(如，不相同的限制性位点以有利于克隆)的反义引物PCR扩增非溶血LLO的基因。重复相同的步骤扩增编码抗原的分离的核酸。连接非溶血LLO和抗原序列并插入质粒或载体，以生成编码连接至抗原末端的非溶血LLO的载体。两个分子直接或通过限制性位点引入的短间隔肽连接。
在另一个实施例中，分子通过由一个或多个氨基酸组成的间隔肽隔离，通常间隔肽除连接蛋白或维持一定的最小距离或它们之间的其他空间关系之外无特定生物学活性。在另一个实施例中，选择间隔肽的组成氨基酸以影响分子的一些性质，诸如折叠、净电荷或疏水性。在另一个实施例中，将编码融合或重组蛋白的核酸序列转化至多种宿主细胞，包括大肠杆菌、其他细菌宿主诸如李斯特菌、酵母和各种高等真核细胞诸如COS、CHO和HeLa细胞系以及骨髓瘤细胞系。重组融合蛋白基因将可操作地连接至每个宿主的适当表达控制序列。启动子/调控序列在本文别处详细描述。在另一个实施例中，质粒还包含另外的启动子调控元件，以及核糖体结合位点和转录终止信号。对于真核细胞，调控序列将包括启动子和来源于如免疫球蛋白基因、SV40、细胞巨化病毒等的增强子，以及聚腺苷酸化序列。在另一个实施例中，序列包括剪接供体和受体序列。
在一个实施例中，术语“可操作地连接”是指其中这样描述的组成部分处于允许其以预期方式发挥功能的关系的并置。“可操作地连接”至编码序列的控制序列的连接方式使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现。
在另一个实施例中，为了选择包含质粒的营养缺陷型细菌，使转化的营养缺陷型细菌在将选择氨基酸代谢基因表达的培养基上生长。在另一个实施例中，用包含用于D-谷氨酸合成的基因的质粒转化D-谷氨酸合成缺陷型细菌，并且该营养缺陷型细菌将在不存在D-谷氨酸的情况下生长，而未被该质粒转化或者不表达编码用于D-谷氨酸合成的蛋白的质粒的营养缺陷型细菌将不会生长。在另一个实施例中，如果本发明的质粒包含编码用于D-丙氨酸合成的氨基酸代谢酶的分离的核酸，D-丙氨酸合成营养缺陷型的细菌当被转化且表达所述质粒时，将在不存在D-丙氨酸的情况下生长。这样的用于制备适当的培养基(其包含或缺少必需生长因子、补充剂、氨基酸、维生素、抗生素等)的方法是本领域熟知的，且可商购获得(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)。每种方法代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，一旦在适当培养基上选择了包含本发明的质粒的营养缺陷型细菌，细菌即可在存在选择压力的情况下繁殖。这样的繁殖包括使细菌在无营养缺陷因子的培养基中生长。表达氨基酸代谢酶的质粒在营养缺陷型细菌中的存在将确保，该质粒将与该细菌一起复制，从而连续地选择携带该质粒的细菌。技术人员在获知本文的公开内容和方法后将能够容易地通过调整培养基(包含质粒的营养缺陷型细菌在其中生长)的体积来放大李斯特菌疫苗载体的生产。
技术人员应当理解，在另一个实施例中，其他营养缺陷型菌株和互补系统适合与本发明一起使用。
在一个实施例中，本文提供了阻碍受试者的Her-2表达性肿瘤生长的方法，其中并且在另一个实施例中，该方法包括将包含本文所述的重组李斯特菌疫苗株的组合物施用于受试者的步骤。
在另一个实施例中，本文提供了引起受试者的对Her-2/neu表达性肿瘤的增强免疫应答的方法，其中并且在另一个实施例中，该方法包括将包含本文所述的重组李斯特菌疫苗株的组合物施用于受试者的步骤。在又一个实施例中，对Her-2/neu表达性肿瘤的免疫应答包括对Her-2/neu蛋白的至少一个次优势表位的免疫应答。
在一个实施例中，本文提供了防止Her-2/neu表达性肿瘤治疗中的逃逸突变的方法，其中并且在另一个实施例中，该方法包括将包含本文提供的重组李斯特菌疫苗株的组合物施用于所述受试者的步骤。
在另一个实施例中，本文提供了预防受试者的Her-2/neu抗原表达性肿瘤发病的方法，其中并且在另一个实施例中，该方法包括将包含本文提供的重组李斯特菌疫苗株的组合物施用于受试者的步骤。
在一个实施例中，本文提供了降低肿瘤内调节性T细胞的频率的方法，其中并且在另一个实施例中，该方法包括将包含本文提供的重组李斯特菌疫苗株的组合物施用于受试者的步骤。
在一个实施例中，本文提供了降低肿瘤内骨髓来源的抑制性细胞的频率的方法，其中并且在另一个实施例中，该方法包括将包含本文提供的重组李斯特菌疫苗株的组合物施用于受试者的步骤。
在另一个实施例中，本文提供了降低骨髓来源的抑制性细胞的频率的方法，其中并且在另一个实施例中，该方法包括将包含本文提供的重组李斯特菌疫苗株的组合物施用于受试者的步骤。
在一个实施例中，本文提供了防止受试者中Her-2/neu表达性肿瘤的发展的方法，其中并且在另一个实施例中，该方法包括将包含本文提供的重组李斯特菌疫苗株的组合物施用于受试者的步骤。
在另一个实施例中，本文提供了防止受试者中形成来自于Her-2/neu表达性肿瘤的转移性疾病的方法，其中并且在另一个实施例中，该方法包括将包含本文提供的重组李斯特菌疫苗株的组合物施用于受试者的步骤。
在另一个实施例中，本文提供了治疗受试者的来自于Her-2/neu表达性肿瘤的转移性疾病的方法，其中并且在另一个实施例中，该方法包括将包含本文提供的重组李斯特菌疫苗株的组合物施用于受试者的步骤。
在一个实施例中，本文提供了施用本发明的组合物的方法。在另一个实施例中，本文提供了施用本发明的疫苗的方法。在另一个实施例中，本文提供了施用本发明的重组多肽或重组核苷酸的方法。在另一个实施例中，施用本发明的组合物、疫苗、重组多肽或重组核苷酸的步骤通过各自本身为分立的实施例的李斯特菌的减毒重组形式进行，该李斯特菌包括组合物、疫苗、重组核苷酸或表达重组多肽。在另一个实施例中，施用通过不同的减毒细菌载体进行。在另一个实施例中，施用通过DNA疫苗(如，裸DNA疫苗)进行。在另一个实施例中，本发明的重组多肽的施用通过重组生成蛋白，然后将重组蛋白施用于受试者来进行。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，本发明的方法和组合物引起的免疫应答包括CD8+T细胞介导的应答。在另一个实施例中，免疫应答主要由CD8+T细胞介导的应答组成。在另一个实施例中，免疫应答的仅有可检测组成部分是CD8+T细胞介导的应答。
在另一个实施例中，本文提供的方法和组合物引起的免疫应答包括CD4+T细胞介导的应答。在另一个实施例中，免疫应答主要由CD4+T细胞介导的应答组成。在另一个实施例中，免疫应答的仅有可检测组成部分是CD4+T细胞介导的应答。在另一个实施例中，CD4+T细胞介导的应答伴有对抗原的可测定抗体应答。在另一个实施例中，CD4+T细胞介导的应答不伴有对抗原的可测定抗体应答。
在另一个实施例中，本发明提供诱导受试者的对抗原的次优势CD8+T细胞表位的CD8+T细胞介导的免疫应答的方法，该方法包括以下步骤：(a)使编码Her2-neu嵌合抗原或其片段的核苷酸分子融合至编码LLO蛋白的N-末端片段的核苷酸分子，从而形成编码LLO-抗原融合蛋白的重组核苷酸；以及(b)将重组核苷酸或LLO-抗原融合体施用于受试者；从而诱导对抗原的次优势CD8+T细胞表位的CD8+T细胞介导的免疫应答。
在一个实施例中，本文提供了提高肿瘤内CD8+/调节性T细胞比率的方法，其中并且在另一个实施例中，该方法包括将包含本发明的重组多肽、重组李斯特菌或重组载体的组合物施用于受试者的步骤。
在另一个实施例中，本文提供了降低肿瘤内调节性T细胞的频率的方法，其中并且在另一个实施例中，该方法包括将包含本文提供的重组李斯特菌疫苗株的组合物施用于受试者的步骤。
在另一个实施例中，本文提供的方法和组合物引起的免疫应答包括对抗原的至少一个次优势表位的免疫应答。在另一个实施例中，免疫应答不包括对次优势表位的免疫应答。在另一个实施例中，免疫应答主要由对至少一个次优势表位的免疫应答组成。在另一个实施例中，免疫应答的仅有可测定组成部分是对至少一个次优势表位的免疫应答。每种类型的免疫应答表示本发明的单独实施例。
在一个实施例中，本发明的方法破坏了受试者对Her-2/neu表达性肿瘤或所述受试者的癌症的耐受性，其中并且在另一个实施例中，该方法包括将包含本文提供的重组李斯特菌疫苗株的组合物施用于受试者的步骤。
测定免疫应答的方法是本领域熟知的，并且包括如测定肿瘤生长的抑制、流式细胞术、靶细胞裂解分析(如，铬释放分析)、四聚物的使用等等。每种方法代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，本发明提供阻碍受试者中Her-2表达性肿瘤的生长的方法，其中并且在另一个实施例中，该方法包括向受试者施用以下组合：放射疗法，和包含融合至Her-2嵌合蛋白或其片段的LLO蛋白的N-末端片段的重组多肽或编码该重组多肽的重组核苷酸，其中该受试者产生对Her-2表达性肿瘤的免疫应答，从而阻碍Her-2表达性肿瘤在受试者中生长。
在另一个实施例中，本发明提供延缓或抑制受试者的来源于Her-2表达性肿瘤的转移性疾病的方法，其中并且在另一个实施例中，该方法包括向受试者施用以下组合：放射疗法，和包含融合至Her-2嵌合蛋白或其片段的LLO蛋白的N-末端片段的重组多肽或编码该重组多肽的重组核苷酸，其中该受试者产生对Her-2表达性肿瘤的免疫应答，从而延缓或抑制受试者的来源于Her-2表达性肿瘤的转移性疾病。
在另一个实施例中，本发明提供改善Her-2嵌合蛋白的抗原性的方法，其中并且在另一个实施例中，该方法包括使编码LLO蛋白的N-末端片段的核苷酸融合至编码Her-2蛋白或其片段的核苷酸，以形成重组核苷酸的步骤，从而改善Her-2嵌合蛋白的抗原性。
在另一个实施例中，本文提供了改善Her-2嵌合蛋白的抗原性的方法，其中并且在另一个实施例中，该方法包括将李斯特菌菌株工程化为表达重组核苷酸。在另一个实施例中，使用不同的细菌载体表达重组核苷酸。在另一个实施例中，细菌载体是减毒的。在另一个实施例中，使用DNA疫苗(如，裸DNA疫苗)表达重组核苷酸。在另一个实施例中，核苷酸编码的LLO-Her-2嵌合体融合肽的施用通过重组生成蛋白，然后将重组蛋白施用于受试者来进行。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，本发明提供诱导肿瘤的“表位扩展”的方法。在另一个实施例中，使用本文提供的组合物和方法的免疫诱导具有除本发明的疫苗携带的抗原之外的抗原的其他肿瘤上的表位扩展。
在另一个实施例中，优势表位或次优势表位在进行治疗的受试者中分别是优势的或次优势的。在另一个实施例中，优势表位或次优势表位在进行治疗的群体中是优势的或次优势的。
在一个实施例中，本文提供了通过表位扩展来预防、治疗、阻遏、抑制受试者中的癌症或肿瘤生长、诱导对受试者中癌症或肿瘤生长的免疫应答、或引起对次优势表位增强的免疫应答的方法，其中并且在另一个实施例中，所述癌症与本发明的组合物中包含的抗原或其片段的表达相关。在另一个实施例中，方法包括将包含本发明的重组多肽、重组李斯特菌或重组载体的组合物施用于所述受试者。在又一个实施例中，受试者产生对抗原表达性癌症或抗原表达性肿瘤的免疫应答，从而治疗、阻遏或抑制受试者的癌症或肿瘤生长。
在一个实施例中，“优势CD8+T细胞表位”是指蛋白或包含蛋白的病原体或癌细胞的疫苗接种、感染或恶性生长引起的超过30％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指由此引起的超过35％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过40％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过45％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过50％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过55％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过60％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过65％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过70％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过75％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过80％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过85％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过90％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过95％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过96％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过97％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过98％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。
在一个实施例中，“次优势CD8+T细胞表位”是指蛋白或包含蛋白的病原体或癌细胞的疫苗接种、感染或恶性生长引起的少于30％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于28％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过26％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于24％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过22％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于20％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过18％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于16％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过14％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过12％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于10％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过8％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于6％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于5％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指超过4％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于3％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于2％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于1％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。在另一个实施例中，该术语是指少于0.5％的抗原特异性CD8+T细胞识别的表位。
每种类型的优势表位和次优势表位表示本发明的单独实施例。
在一个实施例中，本发明的方法和组合物中的抗原以可检测水平在受试者非肿瘤细胞上表达。在另一个实施例中，抗原以可检测水平在至少某一百分比(如，0.01％、0.03％、0.1％、0.3％、1％、2％、3％或5％)的受试者非肿瘤细胞上表达。在一个实施例中，“非肿瘤细胞”是指肿瘤体外的细胞。在另一个实施例中，“非肿瘤细胞”是指非恶性细胞。在另一个实施例中，“非肿瘤细胞”是指未转化的细胞。在另一个实施例中，非肿瘤细胞是体细胞。在另一个实施例中，非肿瘤细胞是生殖细胞。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，“可检测水平”是指可使用标准分析检测的水平。在一个实施例中，分析是免疫分析。在一个实施例中，分析是酶联免疫分析(ELISA)。在另一个实施例中，分析是Western印迹。在另一个实施例中，分析是FACS。技术人员将会知道，本文提供的方法可使用本领域可用的任何其他分析。在另一个实施例中，可检测水平相对于具体分析的背景水平确定。用于执行每种这些技术的方法是本领域技术人员熟知的，并且每种技术表示本发明的单独实施例。
在一个实施例中，使用重组抗原表达性单核细胞增多性李斯特菌进行疫苗接种诱导了表位扩展。在另一个实施例中，即使在Her2的范围外，使用LLO-抗原融合体的疫苗接种也诱导了表位扩展。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，本发明提供阻碍受试者中Her-2表达性肿瘤的生长的方法，该方法包括将包含融合至Her-2嵌合抗原的LLO蛋白的N-末端片段的重组多肽施用于受试者，其中抗原具有一个或多个次优势CD8+T细胞表位，其中受试者产生对抗原表达性肿瘤的免疫应答，从而阻碍受试者中Her-2表达性肿瘤的生长。在另一个实施例中，抗原不包含任何优势CD8+T细胞表位。在另一个实施例中，本文提供了阻碍受试者中Her-2表达性肿瘤生长的方法，该方法包括将包含编码本文提供的重组多肽的重组核苷酸的李斯特菌的重组形式施用于受试者。
在另一个实施例中，本发明提供诱导在患有癌症的宿主中形成细胞毒性T细胞的方法，该方法包括将本发明的组合物施用于宿主，从而诱导在患有癌症的宿主中形成细胞毒性T细胞。
在另一个实施例中，本发明提供减少癌症发生的方法，该方法包括施用本发明的组合物。在另一个实施例中，本发明提供改善癌症的方法，该方法包括施用本发明的组合物。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，将组合物离体施用于受试者的细胞；在另一个实施例中，将组合物离体施用于供体的细胞；在另一个实施例中，将组合物体内施用于供体的细胞，然后转移到受试者。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，本发明的方法治疗的癌症为乳腺癌。在另一个实施例中，癌症为含Her2癌症。在另一个实施例中，癌症为黑素瘤。在另一个实施例中，癌症为胰腺癌。在另一个实施例中，癌症为卵巢癌。在另一个实施例中，癌症为胃癌。在另一个实施例中，癌症为胰腺的癌性病变。在另一个实施例中，癌症为肺腺癌。在另一个实施例中，癌症为结直肠腺癌。在另一个实施例中，癌症为肺鳞癌。在另一个实施例中，癌症为胃腺癌。在另一个实施例中，癌症为卵巢表面上皮肿瘤(例如其良性的、增生性的或恶性的种类)。在另一个实施例中，癌症为口腔鳞状细胞癌。在另一个实施例中，癌症为非小细胞肺癌。在另一个实施例中，癌症为CNS癌症。在另一个实施例中，癌症为子宫内膜癌。在另一个实施例中，癌症为膀胱癌。在另一个实施例中，癌症为间皮瘤。在另一个实施例中，癌症为恶性间皮瘤(MM)。在另一个实施例中，癌症为头颈癌。在另一个实施例中，癌症为前列腺癌。
在一个实施例中，癌症为骨肉瘤，其在一个实施例中为恶性骨肿瘤。在一个实施例中，骨肉瘤是以下亚型中的任一种：成骨细胞、成软骨细胞、成纤维细胞OSA、毛细血管扩张型OSA、小细胞OSA、低级中央OSA、骨膜OSA、骨旁OSA、继发性OSA、高级骨膜OSA或骨外OSA。
在另一个实施例中，癌症为Her-2/neu表达性骨肉瘤。在另一个实施例中，骨肉瘤为犬科动物骨肉瘤。在另一个实施例中，骨肉瘤为局部骨肉瘤。在另一个实施例中，骨肉瘤为转移性骨肉瘤。在另一个实施例中，骨肉瘤为高度骨肉瘤。在另一个实施例中，骨肉瘤为犬科动物肢体骨肉瘤。在另一个实施例中，癌症为肺转移性疾病。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在本发明的方法的另一个实施例中，受试者产生对抗原表达性肿瘤或靶抗原的免疫应答，从而介导抗肿瘤效应。
在另一个实施例中，本发明提供用于治疗癌症的免疫原性组合物，该组合物包含截短的LLO与Her-2嵌合蛋白的融合体。在另一个实施例中，免疫原性组合物还包含表达该融合体的李斯特菌菌株。每种可能性代表了本发明的独立实施例。在另一个实施例中，本发明提供用于治疗癌症的免疫原性组合物，该组合物包含表达Her-2嵌合蛋白的李斯特菌菌株。
在另一个实施例中，本文提供了包含本发明的李斯特菌的重组形式的免疫原性组合物。
在一个实施例中，本发明的处理方案为治疗性的。在另一个实施例中，该方案为预防性的。在另一个实施例中，将本发明的疫苗用于保护人们免于诸如乳腺癌的癌症或其他类型的含Her-2肿瘤的风险，因为家族性遗传或其他情况使得它们易于患有这些类型的疾病，如技术人员将理解的那样。在另一个实施例中，疫苗在通过手术、常规化疗或放疗摧毁肿瘤生长后用作癌症免疫疗法。在另一个实施例中，疫苗与放射治疗和手术、常规化疗或两者联合。在此类治疗后，本发明的疫苗的施用使得对疫苗的肿瘤抗原的CTL应答破坏了其余的转移并且延长了癌症的缓解。在另一个实施例中，疫苗与手术、常规化疗、放射治疗或它们的任何组合联合用作放疗癌症免疫疗法。在另一个实施例中，此类联合治疗用于不能经受截肢的受试者。在另一个实施例中，此类联合治疗用于患有原发性骨肉瘤的不能经受截肢的受试者。在另一个实施例中，将本发明的疫苗用于影响之前建立的肿瘤的生长并杀死现有的肿瘤细胞。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，上述任何方法所用的疫苗和免疫原性组合物具有本发明的疫苗和免疫原性组合物的任何特性。每种特性表示本发明的单独实施例。应当理解的是，在本发明的组合物和用途的背景下描述的组合物可被称为免疫原性组合物，反之亦然。
本发明设想了剂量范围的各种实施例。在一个实施例中，就疫苗载体而言，剂量在0.4LD50/剂的范围内。在另一个实施例中，剂量为约0.4-4.9LD50/剂。在另一个实施例中，剂量为约0.5-0.59LD50/剂。在另一个实施例中，剂量为约0.6-0.69LD50/剂。在另一个实施例中，剂量为约0.7-0.79LD50/剂。在另一个实施例中，剂量为约0.8LD50/剂。在另一个实施例中，剂量为0.4LD50/剂至0.8LD50/剂。
在另一个实施例中，剂量为107个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为1.5×107个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为2×107个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为3×107个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为4×107个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为6×107个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为8×107个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为1×108个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为1.5×108个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为2×108个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为3×108个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为4×108个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为6×108个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为8×108个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为1×109个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为1.5×109个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为2×109个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为3×109个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为5×109个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为6×109个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为8×109个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为1×1010个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为1.5×1010个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为2×1010个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为3×1010个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为5×1010个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为6×1010个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为8×1010个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为8×109个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为1×1011个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为1.5×1011个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为2×1011个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为3×1011个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为5×1011个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为6×1011个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为8×1011个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为5.0×108个细菌/剂。在另一个实施例中，剂量为3.3×109个细菌/剂。在另一个实施例中，用于本文提供的方法的组合物包含3.3×109个李斯特菌/剂。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，将本发明的疫苗或免疫原性组合物单独施用于受试者。在另一个实施例中，疫苗或免疫原性组合物与另一种癌症疗法(其在一个实施例中为放射疗法)一起施用。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，本发明的方法和组合物的重组李斯特菌与编码Her-2嵌合抗原或LLO-Her-2嵌合抗原融合体的构建体一起稳定转化。在一个实施例中，构建体包含多接头以有利于另外的亚克隆。制备重组李斯特菌的多种技术是已知的。
在一个实施例中，使用同源重组将构建体或核酸分子整合进李斯特菌染色体。用于同源重组的技术是本领域熟知的，并且例如在Baloglu S,Boyle SM,et al.(Immuneresponses of mice to vaccinia virus recombinants expressing eitherListeriamonocytogenes partial listeriolysin or Brucella abortus ribosomal L7/L12 protein.Vet Microbiol 2005,109(1-2):11-7)和Jiang LL,Song HH,et al.,(Characterization of a mutant Listeriamonocytogenes strain expressing greenfluorescent protein.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)2005,37(1):19-24)中有所描述。在另一个实施例中，如美国专利No.6,855,320所述进行同源重组。在这种情况下，通过hly启动子控制下的E7基因的染色体整合，制备表达E7的重组单核细胞增多性李斯特菌菌株，并且包含hly信号序列以确保基因产物的分泌，从而产生称作Lm-AZ/E7的重组体。在另一个实施例中，将温敏质粒用于选择重组体。每种技术代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，该构建体或核酸分子采用转座子插入整合进李斯特菌染色体。用于转座子插入的技术在本领域是熟知的，尤其是Sun et al.(Infection andImmunity 1990,58:3770-3778)在DP-L967的构建中所描述的。在另一个实施例中，转座子诱变具有可形成稳定的基因组插入突变体的优点，但缺点是外源基因在基因组中的插入位置是未知的。
在另一个实施例中，使用噬菌体整合位点将该构建体或核酸分子整合进李斯特菌染色体(Lauer P,Chow MY et al,Construction,characterization,and use of twoListeriamonocytogenes site-specific phage integration vectors.J Bacteriol2002；184(15):4177-86)。在该方法的某些实施例中，使用噬菌体(例如U153或PSA李斯特噬菌体)的整合酶基因和连接位点将异源基因插入对应的连接位点，该连接位点可以是基因组中的任何适当的位点(例如comK，或arg tRNA基因的3’末端)。在另一个实施例中，内源性原噬菌体在构建体或异源基因整合之前从所利用的连接位点解离。在另一个实施例中，该方法产生单拷贝整合体。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，使用各种启动子中的一者表达抗原或包含该抗原的融合蛋白。在一个实施例中，使用单核细胞增多性李斯特菌启动子，如基因hly、actA、plca、plcB和mpl的启动子，这些基因分别编码李斯特菌蛋白溶血素、actA、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶、磷脂酶C和金属蛋白酶。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，本发明的方法和组合物采用Her-2嵌合蛋白的同源物或本发明的LLO序列。在另一个实施例中，本发明的方法和组合物采用非人类哺乳动物的Her-2嵌合蛋白。在一个实施例中，当术语“同源性”、“同源的”等涉及任何蛋白或肽时，是指在对齐序列和引入空位(如有必要)，以实现最大同源性百分比，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守置换之后，候选序列中与对应天然多肽的残基相同的氨基酸残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域熟知的。
在另一个实施例中，当提及任何核酸序列时，术语“同源性”类似地指候选序列中与相应天然核酸序列的核苷酸相同的核苷酸的百分比。
在另一个实施例中，本发明提供编码信号肽或本发明的重组多肽或融合蛋白的分离的核酸。在一个实施例中，分离的核酸包含与编码信号肽或本发明的重组多肽或融合蛋白的核酸共有至少65％同源性的序列。在另一个实施例中，分离的核酸包含与编码信号肽或本发明的重组多肽或融合蛋白的核酸共有至少75％同源性的序列。在另一个实施例中，分离的核酸包含与编码信号肽或本发明的重组多肽或融合蛋白的核酸共有至少85％同源性的序列。在另一个实施例中，分离的核酸包含与编码信号肽或本发明的重组多肽或融合蛋白的核酸共有至少90％同源性的序列。在另一个实施例中，分离的核酸包含与编码信号肽或本发明的重组多肽或融合蛋白的核酸共有至少95％同源性的序列。在另一个实施例中，分离的核酸包含与编码信号肽或本发明的重组多肽或融合蛋白的核酸共有至少97％同源性的序列。在另一个实施例中，分离的核酸包含与编码信号肽或本发明的重组多肽或融合蛋白的核酸共有至少99％同源性的序列。
在一个实施例中，通过序列比对的计算机算法、通过本领域中充分描述的方法来确定同源性。例如，核酸序列同源性的计算机算法分析可以包括使用多种可用软件包，比如BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLAST Enhanced Alignment Utility)、GENPEPT和TREMBL软件包。
在另一个实施例中，“同源性”是指与选自本文提供的序列(核酸或氨基酸序列)的序列的同一性大于65％。在另一个实施例中，“同源性”是指与选自本文提供的序列的序列的同一性大于70％。在另一个实施例中，该同一性大于75％。在另一个实施例中，该同一性大于78％。在另一个实施例中，该同一性大于80％。在另一个实施例中，该同一性大于82％。在另一个实施例中，该同一性大于83％。在另一个实施例中，该同一性大于85％。在另一个实施例中，该同一性大于87％。在另一个实施例中，该同一性大于88％。在另一个实施例中，该同一性大于90％。在另一个实施例中，该同一性大于92％。在另一个实施例中，该同一性大于93％。在另一个实施例中，该同一性大于95％。在另一个实施例中，该同一性大于96％。在另一个实施例中，该同一性大于97％。在另一个实施例中，该同一性大于98％。在另一个实施例中，该同一性大于99％。在另一个实施例中，该同一性为100％。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，通过确定候选序列杂交来确定同源性，其方法在现有技术中有充分描述(参见，例如“Nucleic Acid Hybridization″Hames,B.D.,and Higgins S.J.,Eds.(1985)；Sambrook et al.,2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Press,N.Y.；和Ausubel et al.,1989,Current Protocols in MolecularBiology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y)。例如，可在中等至严格条件下进行与编码天然半胱天冬酶肽的DNA的互补序列杂交的方法。杂交条件为例如在包含以下物质的溶液中42℃下温育过夜：10-20％甲酰胺、5X SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5X登哈特溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的经剪切的鲑鱼精DNA。
在本发明的一个实施例中，“核酸”是指一串至少两个碱基-糖-磷酸组合。在一个实施例中，该术语包括DNA和RNA。在一个实施例中，“核苷酸”是指核酸聚合物的单体单元。在一个实施例中，RNA可为tRNA(转运RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和核糖酶的形式。siRNA和miRNA的使用已有所描述(Caudy AA et al,Genes&Devel 16:2491-96及其中引用的参考文献)。DNA可以是质粒DNA、病毒DNA、线性DNA或染色体DNA或这些分组的衍生物的形式。此外，这些形式的DNA和RNA可以是单链、双链、三链或四链的。在另一个实施例中，该术语还包括可包含其他类型的主链但具有相同碱基的人工核酸。在一个实施例中，人工核酸是PNA(肽核酸)。PNA包含肽主链和核苷酸碱基，并且在一个实施例中能够结合DNA和RNA两种分子。在另一个实施例中，核苷酸是氧杂环丁烷修饰的。在另一个实施例中，核苷酸通过用硫代磷酸键代替一个或多个磷酸二酯键来修饰。在另一个实施例中，人工核酸包含本领域已知的天然核酸的磷酸主链的任何其他变体。硫代磷酸核酸和PNA的使用是本领域的技术人员已知的，并且在例如Neilsen PE,Curr Opin Struct Biol 9:353-57和Raz NK et al Biochem Biophys ResCommun.297:1075-84中有所描述。核酸的制备和使用是本领域的技术人员已知的，并且在例如Molecular Cloning,(2001),Sambrook and Russell,eds.和Methods inEnzymology:Methods for molecular cloning in eukaryotic cells(2003)Purchio andG.C.Fareed中有所描述。每种核酸衍生物表示本发明的单独实施例。
在一个实施例中，通过本领域充分描述的方法确定蛋白和/或肽对本文列出的任何氨基酸序列的同源性，包括免疫印迹分析，或通过建立的方法采用多种可用软件包中的任一种通过氨基酸序列的计算机算法分析进行。例如，这些软件包中的一些可包括FASTA、BLAST、MPsrch或Scanps软件包，并且可利用Smith和Waterman算法，和/或整体/局部或BLOCKS比对用于分析。每种确定同源性的方法代表了本发明的独立实施例。
在另一个实施例中，本发明提供了包括用于进行本发明的方法的试剂的试剂盒。在另一个实施例中，本发明提供包括本发明的组合物、工具或仪器的试剂盒。
在一个实施例中，术语“接触”或“施用”是指使本发明的组合物直接接触癌细胞或肿瘤。在另一个实施例中，该术语是指使本发明的组合物间接接触癌细胞或肿瘤。在另一个实施例中，本发明的方法包括其中受试者接触本发明的组合物，然后组合物通过扩散或本领域已知的任何其他主动运输或被动运输过程(化合物通过该过程在体内循环)接触癌细胞或肿瘤的方法。
在另一个实施例中，本发明的方法可包括至少单次施用本发明的组合物，其中在另一个实施例中，本发明的方法可包括多次施用本发明的组合物。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，本发明提供其中仅施用一次重组李斯特菌的方法。在另一个实施例中，施用两次李斯特菌。在另一个实施例中，施用三次李斯特菌。在另一个实施例中，施用四次李斯特菌。在另一个实施例中，施用四次以上李斯特菌。在另一个实施例中，施用多次李斯特菌。在另一个实施例中，李斯特菌以定期间隔施用，该间隔在一个实施例中可以为每天、每周、每两周、每三周或每个月。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，本发明提供其中仅施用一次放射疗法的方法。在另一个实施例中，施用两次放射疗法。在另一个实施例中，施用三次放射疗法。在另一个实施例中，施用四次放射疗法。在另一个实施例中，施用四次以上放射疗法。在另一个实施例中，施用多次放射疗法。在另一个实施例中，放射疗法以定期间隔施用，该间隔在一个实施例中可以为每天、每周、每两周、每三周或每个月。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
在一个实施例中，放射疗法在施用重组减毒李斯特菌之前施用。在另一个实施例中，放射疗法在首次施用重组减毒李斯特菌之前已施用两次。在另一个实施例中，放射疗法在首次施用重组减毒李斯特菌之前已施用三次。
在另一个实施例中，重组减毒李斯特菌在施用放射疗法之前施用。在另一个实施例中，重组减毒李斯特菌在首次施用放射疗法之前已施用两次。在另一个实施例中，重组减毒李斯特菌在首次施用放射疗法之前已施用三次。
在另一个实施例中，术语“基因”和“重组基因”是指包含编码本发明的多肽的开放阅读框的核酸分子。此类天然等位基因变异通常可导致给定基因的核苷酸序列的1-5％变化。可通过多个不同个体或生物体中所关注的基因的测序鉴定替代等位基因。这易于通过使用杂交探针鉴定多个个体或生物体中相同的遗传基因座来进行。作为天然等位基因变异的结果并且不改变功能活性的任何和所有此类核苷酸变异和所得的氨基酸多态性或变异均旨在在本发明的范围之内。
药物组合物
技术人员将会知道，术语“免疫原性组合物”、“组合物”和“药物组合物”可互换使用。还应理解的是，此类组合物的施用增强免疫应答或增加T效应细胞与调节性T细胞比率或者引起抗肿瘤免疫应答，如本文进一步提供的。
在一个实施例中，本文提供的免疫原性组合物包含本文提供的重组李斯特菌。
在一个实施例中，“联合疗法”是指与本文提供的包含重组李斯特菌的组合物相结合或在其之前联合施用本文所述的放射疗法。
在另一个实施例中，通过本领域的技术人员已知的任何方法，诸如肠胃外、癌旁侧、经粘膜、鼻内、肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内、阴道内或肿瘤内将包含本发明的疫苗和组合物的药物组合物施用于受试者。
在本文提供的方法和组合物的另一个实施例中，该疫苗或组合物经口施用，并因此将其被配制为适合经口施用的形式，即，作为固体或液体制备物。适合的固体口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、药丸等。适合的液体口服制剂包括溶液、混悬液、分散剂、乳剂、油剂等。在本发明的另一个实施例中，将活性成分配制在胶囊中。根据该实施例，除活性化合物和惰性载体或稀释剂之外，本发明的组合物还包括硬明胶胶囊。
在另一个实施例中，通过静脉内、动脉内或肌肉内注射液体制备物来以疫苗或组合物施用。适合的液体制剂包括溶液、混悬剂、分散剂、乳剂、油剂等。
在一个实施例中，将药物组合物静脉内施用，因此将其配制为适合静脉内施用的形式。在另一个实施例中，将药物组合物动脉内施用，因此将其配制为适合动脉内施用的形式。在另一个实施例中，将药物组合物肌肉内施用，因此将其配制为适合肌肉内施用的形式。
在一个实施例中，本发明的组合物的重复施用(加强剂量)可在治疗的第一疗程后立即进行或在几天、几周或几个月的间隔后进行，以实现肿瘤消退。在另一个实施例中，重复剂量可在治疗的第一疗程后立即进行或在几天、几周或几个月的间隔后进行，以实现肿瘤生长的抑制。评估可通过本领域已知的任何技术确定，包括诊断方法诸如成像技术、血清肿瘤标志物分析、活组织检查、肿瘤相关症状的存在、不存在或改善。
在一个实施例中，受试者每1-2周、每2-3周、每3-4周、每4-5周、每6-7周、每7-8周或每9-10周施用一次加强剂量以实现预期的抗肿瘤应答。在一个实施例中，受试者每1-2个月、每2-3个月、每3-4个月、每4-5个月、每6-7个月、每7-8个月或每9-10个月施用一次加强剂量以实现预期的抗肿瘤应答。
在一个实施例中，术语“治疗”是指治愈疾病。在另一个实施例中，“治疗”是指防止疾病。在另一个实施例中，“治疗”是指减少疾病的发生。在另一个实施例中，“治疗”是指改善疾病的症状。在另一个实施例中，“治疗”是指提高患者的无进展存活期或总体存活期。在另一个实施例中，“治疗”是指稳定疾病的进展。在另一个实施例中，“治疗”是指诱导缓解。在另一个实施例中，“治疗”是指减缓疾病的进展。在另一个实施例中，术语“减少”、“阻遏”和“抑制”是指减轻或降低。每种可能性代表了本发明的独立实施例。
如本文所用，术语“约”是数量术语，意指加或减5％，或在另一个实施例中，加或减10％，或在另一个实施例中，加或减15％，或在另一个实施例中，加或减20％。
技术人员理解，术语“受试者”可涵盖哺乳动物，包括需要治疗病症或其后遗症或易受其影响的人类成人或儿童、少年或青少年，并且还可包括非人类哺乳动物，诸如狗、猫、猪、乳牛、绵羊、山羊、马、大鼠和小鼠。应当理解，该术语可以涵盖家畜。术语”受试者”不排除在所有方面都正常的个体。
在一个实施例中，术语“受试者”还涵盖不能经受截肢的人。在另一个实施例中，术语“受试者”还涵盖不能经受手术的人。在另一个实施例中，术语“受试者”还涵盖不能经受截肢的人。
技术人员将会知道，出于治疗目的，术语“哺乳动物”是指被归为哺乳动物的任何动物，包括但不限于人、家畜和农畜以及动物园、比赛动物或宠物，诸如包括狗的犬科动物和马、猫、黄牛、猪、绵羊等。
涉及肿瘤治疗的“治疗有效量”是指能够产生一种或多种以下效应的量：(1)在一定程度上抑制肿瘤生长，包括减缓和完全生长停滞；(2)减少肿瘤细胞的数量；(3)减小肿瘤的大小；(4)抑制(即，减少、缓解或完全阻止)肿瘤细胞浸润外周器官；(5)抑制(即，减少、缓解或完全阻止)转移；(6)增强抗肿瘤免疫应答，这可以(但不一定)导致肿瘤消退或排斥；和/或(7)在一定程度上减轻与失调相关的一个或多个症状。出于肿瘤治疗的目的，本文提供的疫苗的“治疗有效量”可凭经验以及以惯例方式确定。
在一个实施例中，用于本发明的方法的组合物包含编码代谢酶的第二开放阅读框，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。在另一个实施例中，该代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中缺乏的内源性基因。
在一个实施例中，“突变的”或“突变体”描述缺失。在另一个实施例中，“突变的”或“突变体”描述失活。在另一个实施例中，“突变的”或“突变体”描述截短。在另一个实施例中，“突变的”或“突变体”描述添加。在另一个实施例中，“突变的”或“突变体”描述置换。在另一个实施例中，“突变的”或“突变体”描述提前终止密码子的插入。在另一个实施例中，“突变的”或“突变体”描述对基因内一个或多个核酸的改变，该改变破坏基因的表达。
在一个实施例中，“放射疗法”或“放疗”是指电离辐射作为癌症治疗的一部分以控制或根治恶性细胞的医学用途。放疗可用于治愈性、辅助性或姑息性治疗。放疗的合适类型包括常规外照射放疗、立体定向放射疗法(例如亚瑟刀(Axesse)、射波刀(Cyberknife)、伽马刀(Gamma Knife)、诺力刀(Novalis)、Primatom、Synergy、X线刀(X-Knife)、螺旋刀(TomoTherapy)或Trilogy)、调强放射疗法、粒子疗法(例如质子疗法)、短程疗法、递送放射性同位素、术中放疗、Auger疗法、容积旋转调强疗法(VMAT)、虚拟仿真、三维适形放射疗法和调强放射疗法等。应当理解，该列表无意为限制性的。
在一个实施例中，放射疗法使用高能放射使肿瘤缩小并杀死癌细胞。在一个实施例中，X射线、伽马射线和带电粒子是可用于治疗癌症的放射类型。在一个实施例中，放射疗法通过直接损坏癌细胞的DNA或通过在细胞内形成自由基继而可损坏DNA来杀死癌细胞。
在一个实施例中，放射疗法可通过身体之外的机器递送(外照射放射疗法)，或在另一个实施例中其可来自置于体内的癌细胞附近的放射性物质(内放射疗法，也称为短程疗法)。
在一个实施例中，全身放射疗法使用在血液中流动以杀死癌细胞的放射性物质，诸如放射性碘。
在一个实施例中，本发明提供使用与免疫疗法相结合的标准放射来同时治疗对放射不敏感的癌症诸如骨肉瘤的方法，诸如在需要较短放射治疗时间的方案中施用重组李斯特菌，从而缓和通常与放射治疗相关的副作用。
在一个实施例中，放射根据本发明通过采用标准巨电压设备(诸如AECLTheratron 80、Varian Clinac 4或Varian Clinac)的标准技术来施用。在一个实施例中，放射门(radiation portal)的最大尺寸不应超过300cm2。在一个实施例中，合适的剂量介于约15Gy与35Gy之间，具体的剂量取决于进行治疗的身体面积。因此，针对脊髓的剂量将为约35Gy，而针对双侧肾的剂量将为约15Gy，针对整个肝脏的剂量将为20Gy。治疗的中断由临床医生考虑到患者对放射疗法的耐受性而决定。
在另一个实施例中，在联合疗法中的放射剂量按顺序施用。在另一个实施例中，在联合疗法中的放射剂量如本文示例性示出的那样连续数天施用(参见实例11)。在另一个实施例中，在联合疗法中连续数天给予8Gy的放射剂量，总剂量为16Gy，然后每3周一次给予多个剂量(最多8个)的ADXS31-164，如在本文的实例中所示(参见实例11)。在另一个实施例中，在联合疗法中连续数天给予8Gy的放射剂量，总剂量为16Gy，然后每3周一次给予多个剂量(最多8个)的最多3.3×109个CFU的ADXS31-164，如在本文的实例中所示(参见实例11)。在另一个实施例中，在联合疗法中连续数天给予8Gy的放射剂量，总剂量为16Gy，然后每3周一次给予多个剂量(最多8个)的3.3×109个CFU的ADXS31-164，如在本文的实例中所示(参见实例11)。在一个实施例中，本文提供的ADXS31-164的多剂量范围为1-8、8-15、15-25个，或根据实现预期治疗目标的需要而定。
在一个实施例中，为本文提供的联合疗法而施用的总放射剂量在70-80Gy的范围内。在另一个实施例中，为本文提供的联合疗法而施用的总放射剂量在10-26GY的范围内在另一个实施例中，按顺序施用10-26GY范围内的放射剂量。在一个实施例中，该顺序可以为每小时、每天、每周或每两周。在一个实施例中，按顺序施用70-80GY范围内的放射剂量。在另一个实施例中，施用10-26GY范围内的放射剂量。在另一个实施例中，对于成年男性而言，放射剂量为约α/β＝5.4Gy和μ＝1.73Gy-1。
在一个实施例中，本发明中作为联合疗法的一部分所述的放射疗法为姑息性放射疗法。在一个实施例中，放射疗法可出于姑息性目的而给予。在一个实施例中，姑息性治疗旨在缓解症状并减轻癌症或肿瘤导致的痛苦。在另一个实施例中，本文作为联合疗法的一部分所述的放射疗法旨在治愈癌症或肿瘤。
为了更充分地举例说明本发明的优选实施例，提供了以下实例。然而，它们绝不应解释为限制本发明的广泛范围。
实例
材料和方法
寡核苷酸由Invitrogen(Carlsbad,CA)合成，DNA测序由Genewiz Inc,SouthPlainfield,NJ进行。流式细胞术试剂购自Becton Dickinson Biosciences(BD,SanDiego,CA)。除非另外指明，否则细胞培养基、补充剂和所有其他试剂均购自Sigma(St.Louise,MO)。Her-2/neu HLA-A2肽由EZbiolabs(Westfield,IN)合成。完全RPMI1640(C-RPMI)培养基包含2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠、10％胎牛血清、青霉素/链霉素、Hepes(25mM)。多克隆抗LLO抗体如上文所述，并且抗Her-2/neu抗体购自Sigma。
小鼠和细胞系
所有动物实验均根据University of Pennsylvania或Rutgers University的IACUC批准的方案进行。FVB/N小鼠购自Jackson laboratories(Bar Harbor,ME)。过表达大鼠Her-2/neu癌蛋白的FVB/N Her-2/neu转基因小鼠关在University of Pennsylvania的动物饲养中心(animal core facility)并繁殖。表达高水平的大鼠Her-2/neu蛋白的NT-2肿瘤细胞系来源于这些小鼠的自发性乳腺肿瘤，并且如上文所述生长。DHFR-G8(3T3/neu)细胞得自ATCC并且根据ATCC推荐方案生长。EMT6-Luc细胞系由John Ohlfest博士(University of Minnesota,MN)慷慨赠送，并在完全C-RPMI培养基中生长。生物荧光工作在University of Pennsylvania(Philadelphia,PA)的Small Animal Imaging Facility(SAIF)的指导下进行。
李斯特菌构建体和抗原表达
Her-2/neu-pGEM7Z由University of Pennsylvania的Mark Greene博士友情提供，并且包含克隆至pGEM7Z质粒(Promega,Madison WI)的全长人Her-2/neu(hHer2)基因。将该质粒用作模板，以使用表1所示的pfx DNA聚合酶(Invitrogen)和寡聚物，通过PCR扩增hHer-2/neu的三个区段，即EC1、EC2和IC1。
表2：用于克隆人her-2嵌合体的引物
表2
通过SOEing PCR方法，并将每个单独的hHer-2/neu区段作为模板，通过直接融合产生Her-2/neu嵌合构建体。引物显示在表3中。
用于扩增不同区段人Her2区域的引物的序列。
表3
使用XhoI和SpeI限制性酶从pAdv138切下ChHer2基因，并与Lmdd穿梭载体pAdv134中截短的LLO非溶血片段在同一阅读框内克隆。插入序列LLO和hly启动子通过DNA测序分析确认。将该质粒电穿孔转化至电感受态actA、dal、dat突变单核细胞增多性李斯特菌菌株，在包含链霉素(250μg/ml)的脑心浸液(BHI)琼脂平板上选择LmddA和阳性克隆。在一些实验中，将表达hHer-2/neu(Lm-hHer2)片段的类似李斯特菌菌株用于对比目的。这些内容在上文有所描述。在所有研究中，包括不相关李斯特菌构建体(Lm-对照)，以考虑到李斯特菌对免疫系统的抗原非依赖性效应。Lm-对照基于与ADXS31-164相同的李斯特菌平台，但表达不同的抗原，诸如HPV16-E7或NY-ESO-1。测试李斯特菌的融合蛋白的表达和分泌。每个构建体体内传代两次。
细胞毒性分析
以3-5只FVB/N小鼠为一组，使用1×108个集落形成单位(CFU)的Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164、Lm-hHer2 ICI或Lm-对照(表达不相关抗原)以一周为间隔免疫三次或保持未暴露的。使NT-2细胞体外生长，通过胰蛋白酶脱壁，并用丝裂霉素C(250μg/ml，溶于无血清C-RPMI培养基)在37℃下处理45分钟。在洗涤5次后，将其与从免疫或未暴露的动物收集的脾细胞以1:5(刺激因子:应答细胞)的比率在37℃和5％CO2下一起温育5天。标准细胞毒性分析使用铕标记的3T3/neu(DHFR-G8)细胞作为靶标根据前述方法进行。在4小时温育后使用分光光度计(Perkin Elmer，Victor2)在590nm下测定从杀死的靶细胞释放的铕。特异性裂解的百分比定义为(实验组的裂解-自发性裂解)/(最大裂解-自发性裂解)。
免疫小鼠的脾细胞分泌的干扰素-γ
以3-5只FVB/N或HLA-A2转基因小鼠为一组，使用1×108个CFU的阴性李斯特菌对照ADXS31-164(表达不相关抗原)以一周为间隔免疫三次或保持未暴露的。在最后免疫后一周分离FVB/N小鼠的脾细胞，并以5×106个细胞/孔在24孔板中的C-RPMI培养基中在存在丝裂霉素C处理的NT-2细胞的情况下共培养。在1μM HLA-A2特异性肽或1μg/ml重组His-标记的ChHer2蛋白(大肠杆菌中产生并且通过基于镍的亲和色谱系统纯化)存在下，温育来自HLA-A2转基因小鼠的脾细胞。在24或72小时后从上清液获得样品，使用小鼠IFN-γ酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒根据制造商的推荐方案测试干扰素-γ(IFN-γ)的存在。
INF-γ ELISpot分析
在每个指定的时间点解冻冷藏的PBMC，在37℃下放置过夜，然后计数。细胞用2.5μM重叠人Her-2/neu肽库(11个单位重叠5个氨基酸)(表示嵌合疫苗中存在的Her-2/neu的EC1、EC2和IC1域)和重组人IL-2(Invitrogen,Fredrick,MD)刺激5天。收集细胞，在1×PBS中洗涤两次并计数。IFN-γ ELISpot分析使用商业化犬科动物IFN-γ ELISpot分析试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN)根据制造商的方案进行。简而言之，将0.8-2×105个经刺激的细胞与2.5μM EC1、EC2或IC1肽库加上IL-2或单独的IL-2(以测定背景计数)一起温育。所有分析一式两份地进行。根据制造商的说明对平板显色。使用CTL-Immunospot分析仪(C.T.L,Shaker Heights,OH)对斑点进行计数。斑点的数量通过减去未刺激孔中的斑点数量的两倍进行归一化。
Her2转基因动物中的肿瘤研究
六周龄FVB/N大鼠Her-2/neu转基因小鼠(9-14只/组)使用5×108个CFU的Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164或Lm-对照免疫6次。每周观察自发性乳腺肿瘤的出现两次，使用电子卡尺测量肿瘤，最多52周。当平均直径大小达到1cm2时切下逃逸的肿瘤，在-20℃下保存于RNAlater中°。为确定Her-2/neu蛋白中的突变对这些肿瘤逃逸的影响，使用基因组DNA分离试剂盒提取基因组DNA，并测序。
ADXS31-164对脾脏和肿瘤中调节性T细胞的作用
将小鼠皮下(s.c.)植入1×106个NT-2细胞。在第7、14和21天，使用1×108个CFU的ADXS31-164、LmddA-对照对它们进行免疫或保持未暴露的。在第28天提取肿瘤和脾脏并通过FACS分析测试CD3+/CD4+/FoxP3+Treg的存在。简而言之，通过在C-RPMI培养基中匀化两个载玻片之间的脾脏而分离脾细胞。使用无菌刀片切碎肿瘤，并用包含DNA酶(12U/ml)和溶于PBS的胶原酶(2mg/ml)的缓冲液消化。在室温下搅拌温育60min后，通过猛烈吹打而分离细胞。用RBC裂解缓冲液裂解红细胞，然后用包含10％FBS的完全RPMI-1640培养基洗涤多次。在通过尼龙网过滤后，将肿瘤细胞和脾细胞重悬于FACS缓冲液(2％FBS/PBS)中，用抗CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC、CD25-APC抗体染色，然后进行透化和抗Foxp3-PE染色。使用4色FACS calibur(BD)进行流式细胞分析，使用cell quest软件(BD)分析数据。
统计学分析
将对数秩卡方检验用于存活期数据，并将学生t-检验用于CTL和ELISA分析，所述分析一式三份地进行。在这些分析中，小于0.05的p-值(以*标记)被视为具有统计学上的显著性。所有统计学分析均使用Prism软件V.4.0a(2006)或SPSS软件V.15.0(2006)进行。对于所有FVB/N大鼠Her-2/neu转基因研究，我们使用了8-14只小鼠/组，对于所有野生型FVB/N研究，我们使用了至少8只小鼠/组，除非另外指明。除Her-2/neu转基因小鼠模型中的长期肿瘤研究外，所有研究重复至少一次。
实例1：
产生分泌融合至Her-2片段的LLO片段的单核细胞增多性李斯特菌菌株：ADXS31-164的构建。
嵌合Her-2/neu基因(ChHer2)的构建如上文所述。简而言之，ChHer2基因通过SOEing PCR法直接融合Her-2/neu蛋白的两个胞外片段(aa 40-170和aa 359-433)和一个胞内片段(aa 678-808)来制备。嵌合蛋白具有蛋白的大部分已知的人MHC I类表位。从质粒pAdv138(其用于构建Lm-LLO-ChHer2)切下ChHer2基因并克隆至LmddA穿梭质粒中，得到质粒pAdv164(图1A)。这两个质粒骨架之间有两个主要差异。1)pAdv138使用氯霉素抗性标记(cat)进行重组细菌的体外选择，而pAdv164具有枯草芽孢杆菌的D-丙氨酸消旋酶基因(dal)，它使用缺乏dal-dat基因的LmddA菌株中的体外选择和体内质粒保持的代谢互补途径。此疫苗平台被设计和开发成解决FDA对工程化李斯特菌疫苗株的抗生素抗性的关注。2)与pAdv138不同，pAdv164不具有质粒中的prfA基因拷贝(参见以下序列和图1A)，因为这不是Lmdd菌株的体内互补必需的。LmddA疫苗株还缺乏actA基因(负责李斯特菌的胞内移动和细胞间播散)，因此来源于此骨架的重组疫苗株的毒性比来源于其亲代菌株Lmdd的那些小100倍。基于LmddA的疫苗从免疫小鼠脾脏的清除也比基于Lmdd的疫苗快(在不到48小时内)。来自此菌株的融合蛋白tLLO-ChHer2的表达和分泌与在体外生长8小时后TCA沉淀细胞培养上清液中的Lm-LLO-ChHer2相当(图1B)，因为使用Western印迹分析通过抗LLO抗体检测到～104KD的条带。仅表达tLLO的李斯特菌骨架菌株用作阴性对照。
pAdv164序列(7075个碱基对)(参见图1)：
cggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttctagccctcctttgattagtatattcctatcttaaagttacttttatgtggaggcattaacatttgttaatgacgtcaaaaggatagcaagactagaataaagctataaagcaagcatataatattgcgtttcatctttagaagcgaatttcgccaatattataattatcaaaagagaggggtggcaaacggtatttggcattattaggttaaaaaatgtagaaggagagtgaaacccatgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatctcgagacccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaacctggaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggaggtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctgcggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaatggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggagctgcagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccccagctctgctaccaggacacgattttgtggaagaatatccaggagtttgctggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttctgccggagagctttgatggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagcagctccaagtgtttgagactctggaagagatcacaggttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcctgacctcagcgtcttccagaacctgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcctactcgctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaactgggcagtggactggccctcatccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtgccctgggaccagctctttcggaacccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggccagaggacgagtgtgtgggcgagggcctggcctgccaccagctgtgcgcccgagggcagcagaagatccggaagtacacgatgcggagactgctgcaggaaacggagctggtggagccgctgacacctagcggagcgatgcccaaccaggcgcagatgcggatcctgaaagagacggagctgaggaaggtgaaggtgcttggatctggcgcttttggcacagtctacaagggcatctggatccctgatggggagaatgtgaaaattccagtggccatcaaagtgttgagggaaaacacatcccccaaagccaacaaagaaatcttagacgaagcatacgtgatggctggtgtgggctccccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacagcttatgccctatggctgcctcttagactaatctagacccgggccactaactcaacgctagtagtggatttaatcccaaatgagccaacagaaccagaaccagaaacagaacaagtaacattggagttagaaatggaagaagaaaaaagcaatgatttcgtgtgaataatgcacgaaatcattgcttatttttttaaaaagcgatatactagatataacgaaacaacgaactgaataaagaatacaaaaaaagagccacgaccagttaaagcctgagaaactttaactgcgagccttaattgattaccaccaatcaattaaagaagtcgagacccaaaatttggtaaagtatttaattactttattaatcagatacttaaatatctgtaaacccattatatcgggtttttgaggggatttcaagtctttaagaagataccaggcaatcaattaagaaaaacttagttgattgccttttttgttgtgattcaactttgatcgtagcttctaactaattaattttcgtaagaaaggagaacagctgaatgaatatcccttttgttgtagaaactgtgcttcatgacggcttgttaaagtacaaatttaaaaatagtaaaattcgctcaatcactaccaagccaggtaaaagtaaaggggctatttttgcgtatcgctcaaaaaaaagcatgattggcggacgtggcgttgttctgacttccgaagaagcgattcacgaaaatcaagatacatttacgcattggacaccaaacgtttatcgttatggtacgtatgcagacgaaaaccgttcatacactaaaggacattctgaaaacaatttaagacaaatcaataccttctttattgattttgatattcacacggaaaaagaaactatttcagcaagcgatattttaacaacagctattgatttaggttttatgcctacgttaattatcaaatctgataaaggttatcaagcatattttgttttagaaacgccagtctatgtgacttcaaaatcagaatttaaatctgtcaaagcagccaaaataatctcgcaaaatatccgagaatattttggaaagtctttgccagttgatctaacgtgcaatcattttgggattgctcgtataccaagaacggacaatgtagaattttttgatcccaattaccgttattctttcaaagaatggcaagattggtctttcaaacaaacagataataagggctttactcgttcaagtctaacggttttaagcggtacagaaggcaaaaaacaagtagatgaaccctggtttaatctcttattgcacgaaacgaaattttcaggagaaaagggtttagtagggcgcaatagcgttatgtttaccctctctttagcctactttagttcaggctattcaatcgaaacgtgcgaatataatatgtttgagtttaataatcgattagatcaacccttagaagaaaaagaagtaatcaaaattgttagaagtgcctattcagaaaactatcaaggggctaatagggaatacattaccattctttgcaaagcttgggtatcaagtgatttaaccagtaaagatttatttgtccgtcaagggtggtttaaattcaagaaaaaaagaagcgaacgtcaacgtgttcatttgtcagaatggaaagaagatttaatggcttatattagcgaaaaaagcgatgtatacaagccttatttagcgacgaccaaaaaagagattagagaagtgctaggcattcctgaacggacattagataaattgctgaaggtactgaaggcgaatcaggaaattttctttaagattaaaccaggaagaaatggtggcattcaacttgctagtgttaaatcattgttgctatcgatcattaaattaaaaaaagaagaacgagaaagctatataaaggcgctgacagcttcgtttaatttagaacgtacatttattcaagaaactctaaacaaattggcagaacgccccaaaacggacccacaactcgatttgtttagctacgatacaggctgaaaataaaacccgcactatgccattacatttatatctatgatacgtgtttgtttttctttgctggctagcttaattgcttatatttacctgcaataaaggatttcttacttccattatactcccattttccaaaaacatacggggaacacgggaacttattgtacaggccacctcatagttaatggtttcgagccttcctgcaatctcatccatggaaatatattcatccccctgccggcctattaatgtgacttttgtgcccggcggatattcctgatccagctccaccataaattggtccatgcaaattcggccggcaattttcaggcgttttcccttcacaaggatgtcggtccctttcaattttcggagccagccgtccgcatagcctacaggcaccgtcccgatccatgtgtctttttccgctgtgtactcggctccgtagctgacgctctcgccttttctgatcagtttgacatgtgacagtgtcgaatgcagggtaaatgccggacgcagctgaaacggtatctcgtccgacatgtcagcagacgggcgaaggccatacatgccgatgccgaatctgactgcattaaaaaagccttttttcagccggagtccagcggcgctgttcgcgcagtggaccattagattctttaacggcagcggagcaatcagctctttaaagcgctcaaactgcattaagaaatagcctctttctttttcatccgctgtcgcaaaatgggtaaatacccctttgcactttaaacgagggttgcggtcaagaattgccatcacgttctgaacttcttcctctgtttttacaccaagtctgttcatccccgtatcgaccttcagatgaaaatgaagagaaccttttttcgtgtggcgggctgcctcctgaagccattcaacagaataacctgttaaggtcacgtcatactcagcagcgattgccacatactccgggggaaccgcgccaagcaccaatataggcgccttcaatccctttttgcgcagtgaaatcgcttcatccaaaatggccacggccaagcatgaagcacctgcgtcaagagcagcctttgctgtttctgcatcaccatgcccgtaggcgtttgctttcacaactgccatcaagtggacatgttcaccgatatgttttttcatattgctgacattttcctttatcgcggacaagtcaatttccgcccacgtatctctgtaaaaaggttttgtgctcatggaaaactcctctcttttttcagaaaatcccagtacgtaattaagtatttgagaattaattttatattgattaatactaagtttacccagttttcacctaaaaaacaaatgatgagataatagctccaaaggctaaagaggactataccaactatttgttaattaa(SED IDNO:53)
实例2：
ADXS31-164的免疫原性与LM-LLO-ChHER2一样。
在标准CTL分析中将ADXS31-164产生抗Her-2/neu特异性细胞毒性T细胞的免疫原性与Lm-LLO-ChHer2疫苗进行比较。两种疫苗均引起对3T3/neu靶细胞表达的Her-2/neu抗原的强烈但类似的细胞毒性T细胞应答。因此，使用仅表达融合至LLO的Her2胞内片段的李斯特菌免疫的小鼠显示出比包含多个MHC I类表位的嵌合体更低的裂解活性。在未暴露的动物或不相关李斯特菌疫苗注射的小鼠中未检测到CTL活性(图2A)。ADXS31-164也能够刺激野生型FVB/N小鼠的脾细胞分泌IFN-γ(图2B)。这在与丝裂霉素C处理的NT-2细胞(表达高水平的Her-2/neu抗原)共培养的这些细胞的培养上清液中检测到(图5C)。
在HLA-A2小鼠中测试了ADXS31-164免疫后人MHC I类表位的适当处理和呈递。将来自经免疫的HLA-A2转基因动物的脾细胞与对应于标绘的HLA-A2限制性表位的肽一起温育72小时，所述HLA-A2限制性表位位于Her-2/neu分子的胞外(HLYQGCQVV SEQ ID NO:11或KIFGSLAFL SEQ ID NO:12)或胞内(RLLQETELV SEQ ID NO:13)域。重组ChHer2蛋白用作阳性对照，不相关肽或无肽作为阴性对照。该实验的数据显示，ADXS31-164能够引起对位于靶抗原的不同域的人表位的抗Her-2/neu特异性免疫应答。
实例3：
ADXS31-164抑制自发性乳腺肿瘤的发病比LM-LLO-ChHER2更有效。
将ADXS31-164的抗肿瘤效应与Her-2/neu转基因动物中的Lm-LLO-ChHer2比较，该Her-2/neu转基因动物在20-25周龄患上缓慢生长的自发性乳腺肿瘤。所有使用不相关李斯特菌对照疫苗免疫的动物在21-25周内患上乳腺肿瘤并且在第33周前处死。相比之下，李斯特菌-Her-2/neu重组疫苗使乳腺肿瘤的形成显著延缓。在第45周，超过50％的ADXS31-164疫苗接种的小鼠(9只中的5只)仍无肿瘤，相比之下，使用Lm-LLO-ChHer2免疫的小鼠只有25％。在第52周，使用ADXS31-164免疫的8只小鼠中的2只仍无肿瘤，而其他实验组的所有小鼠已死于疾病(图3)。这些结果表明，尽管是减毒程度更高的，但ADXS31-164防止Her-2/neu转基因动物的自发性乳腺肿瘤的发病比Lm-LLO-ChHer2更有效。
实例4：
ADXS31-164免疫时HER-2/NEU基因的突变。
Her-2/neu的MHC I类表位的突变已被视为在小片段疫苗或曲妥单抗(Herceptin)(一种靶向Her-2/neu的胞外域中的表位的单克隆抗体)免疫时负责肿瘤逃逸。为评估该作用，从转基因动物中的逃逸肿瘤提取基因组物质，并对嵌合或对照疫苗免疫的肿瘤中neu基因的对应片段进行测序。在任何接种疫苗的肿瘤样品的Her-2/neu基因中均未观察到突变，这提示替代性逃逸机制(数据未显示)。
实例5：
ADXS31-164使肿瘤内调节性T细胞显著减少。
为阐明ADXS31-164对脾脏和肿瘤中调节性T细胞频率的影响，将NT-2肿瘤细胞植入小鼠。在三次免疫后分离脾细胞和肿瘤内淋巴细胞并对Treg染色，Treg定义为CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+细胞，但是当单独分析时，FoxP3或CD25标记获得了类似的结果。结果表明，与不相关李斯特菌疫苗或未暴露的动物相比，ADXS31-164免疫对脾脏中Treg的频率无影响(参见图4)。相比之下，李斯特菌疫苗免疫对肿瘤中Treg的存在产生很大的影响(图5A)。而未治疗的肿瘤中平均而言所有CD3+T细胞的19.0％为Treg，对于不相关疫苗该频率降低至4.2％，对于ADXS31-164降低至3.4％，肿瘤内Treg的频率降低5倍(图5B)。任一LmddA疫苗治疗的小鼠中肿瘤内Treg的频率降低不能归因于肿瘤大小的差异。在代表性实验中，ADXS31-164免疫的小鼠的肿瘤显著小于[平均直径(mm)±SD，6.71±0.43，n＝5]未治疗的小鼠(8.69±0.98,n＝5,p<0.01)或不相关疫苗治疗的小鼠(8.41±1.47,n＝5,p＝0.04)的肿瘤，而最后两组的比较未显示出肿瘤大小的统计学上的显著差异(p＝0.73)。LmddA疫苗处理的肿瘤中Treg频率的下降使肿瘤内CD8/Treg比率升高，暗示在LmddA疫苗免疫后可获得更有利的肿瘤微环境。然而，只有表达靶抗原Her-2/neu的疫苗(ADXS31-164)能够减缓肿瘤生长，表明Treg的减少仅在肿瘤中存在抗原特异性应答的情况下具有作用。
实例6：
表达HER-2嵌合体的李斯特菌疫苗未引入逃逸突变。
收集不同疫苗诸如Lm-LLO-138、LmddA164和不相关疫苗Lm-LLO-NY免疫的小鼠的肿瘤样品。从这些样品纯化DNA，扩增Her-2/neu区域IC1、EC1和EC2对应的DNA片段，并测序以确定是否存在任何免疫逃逸突变。使用CLUSTALW进行每个DNA的序列比对。分析结果表明，从肿瘤收集的DNA序列中无突变。参考序列在下面列出：
EC2的比对(Her-2-neu的975-1029bp)
GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT(SEQ ID NO:14)
CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC(SEQ IDNO:15)
AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG(SEQ IDNo:16)
AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG(SEQ IDNo:17)
TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTC(SEQ IDNO:18)
CGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC(SEQ IDNO:19)
GCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGG(SEQ IDNO:20)
GAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACT(SEQ IDNO:21)
GTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGG(SEQ IDNO:22)
CCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCAC(SEQ IDNO:23)
TGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGTCATTTCCTTCGGGGCCAGGAG(SEQ IDNO:24)
IC1的比对(Her-2-neu的2114-3042 bp)
CGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGC(SEQ ID NO:25)
TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA(SEQ IDNO:26)
TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT(SEQ IDNO:27)
CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC(SEQ IDNO:28)
CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC(SEQ IDNO:29)
TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC(SEQ IDNO:30)
AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC(SEQ IDNO:31)
GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA(SEQ IDNO:32)
AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG(SEQ IDNO:33)
ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA(SEQ IDNO:34)
CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG(SEQ IDNO:35)
CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA(SEQ IDNO:36)
CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT(SEQ ID NO:37)
GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT(SEQ ID NO:38)
CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT(SEQ ID NO:39)
EC1的比对(Her-2-neu的399-758 bp)
CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCT(SEQ IDNO:40)
GAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTG(SEQ IDNO:41)
CCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCC(SEQ IDNO:42)
GGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGG(SEQ IDNO:43)
CCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGCA(SEQ IDNO:44)
实例7：
ADXS31-164的外周免疫可延缓脑中转移性乳腺癌细胞系的生长。
使用ADXS31-164或不相关Lm-对照疫苗IP免疫小鼠，然后颅内植入5,000个表达荧光素酶和低水平Her-2/neu的EMT6-Luc肿瘤细胞(图6C)。在接种后的不同时间通过麻醉小鼠的离体成像监测肿瘤。在肿瘤接种后第8天，检测所有对照动物中的肿瘤，但ADXS31-164中的小鼠均未显示出任何可检测的肿瘤(图6A和B)。ADXS31-164可明显延缓这些肿瘤的发病，因为在肿瘤接种后第11天阴性对照组中的所有小鼠已死于肿瘤，但ADXS31-164组中的所有小鼠仍然存活，并且仅显示出少量肿瘤生长的迹象。这些结果强烈暗示，ADXS31-164的外周施用得到的免疫应答可能到达中枢神经系统，并且基于LmddA的疫苗可具有治疗CNS肿瘤的潜在用途。
实例8：
通过ADXS31-164免疫治疗犬科动物骨肉瘤。
犬科动物骨肉瘤是长(腿)骨的癌症，是年龄超过10岁的大狗的主要杀手。标准治疗是在诊断后立即截肢，然后化疗。然而，不变的是癌症转移到肺。与未治疗的6-12个月存活期相比，通过化疗可使狗存活约18个月。据信，HER2抗原存在于多达50％的骨肉瘤中。ADXS31-164对表达此抗原的细胞形成免疫攻击，并且已开发用于治疗人乳腺癌。
组织学诊断为骨肉瘤并且具有恶性细胞表达HER2/neu的证据的狗符合入选资格。
犬科动物骨肉瘤试验
在第一队中，进行截肢，然后接受几轮化疗治疗。随后施用3剂Her-2疫苗，6个月间隔期后加强或不加强。
所有狗接受4周的卡铂治疗。在最后卡铂给药后四周，狗每三周接受一次ADXS-HER2，总共给药3次。第1组(3只狗)接受1×108个CFU/剂，第2组(3只狗)每只接受5×108个CFU/剂，第3组(3只狗)接受1×109个CFU/剂。如果观察到潜在的剂量限制毒性，则向组中加入另外的狗以收集更多的数据。因此，在初步研究中可治疗9-18只狗。
在第二队中，与第一队相同重复治疗，不同的是在化疗前(1个月前)仅施用单剂疫苗，总共给药4次。
另外，在化疗后一个月给两队施用单剂。
实例9：
评估ADXS-cHER2在患有HER-2/NEU过表达的犬科动物骨肉瘤的伴侣狗中的安全性的1期剂量递增研究
进行前期I期剂量递增研究以确定可安全和有效地刺激患有骨肉瘤的狗的肿瘤特异性免疫的表达人Her-2/neu重组疫苗的单核细胞增多性李斯特菌的剂量。例行收集由于怀疑或确认患有OSA而提供给PennVet进行截肢的所有狗的肿瘤，并进行组织病理学评估以确认OSA的诊断。此外，通过IHC和Western印迹分析来评估所有狗的肿瘤切片，以确定肿瘤是否表达Her-2/neu。只有组织学诊断为OSA并且具有恶性细胞表达Her-2/neu的证据的狗才符合入选资格。冷藏在手术时采集的肿瘤组织的单细胞悬液，并在铬释放分析中用作自体肿瘤靶标，以确定抗肿瘤免疫。
入选了最多18只患有肢体OSA并确认表达Her2-neu的私有狗(图7)。在入选时(最后卡铂治疗后3周)，所有狗接受了基本临床实验室测试，包括全血细胞计数(CBC)、化学筛选(CS)和尿分析(UA)以及通过超声心动描记法进行心脏功能的基线评估和测定心脏特异性肌钙蛋白I(cTnI)水平。通过胸部放射显影确定是否存在肺转移。只有无肺转移证据的狗才符合研究入选资格。在入选时，收集外周血单核细胞(PBMC)以评估抗肿瘤免疫的基线水平(参见抗肿瘤免疫的评估)。此外，采血评估基线免疫功能，以确保它们不再受卡铂免疫抑制。只有具有功能完整的免疫系统的狗才符合接受李斯特菌疫苗的资格。
Lm重组给药和数据采集
使用单个Lm-huHer-2/neu重组疫苗给所有狗接种。在最后卡铂给药后三周给予第一次Lm-huHer2-neu疫苗，此后每三周给予一次，总共给药3次(图7)。
第1组(3只狗)接受1×108个CFU/剂的ADXS31-164(Lm-hucHer-2/neu)疫苗，第2组(3只狗)每只接受5×108个CFU/剂，第3组(3只狗)接受1×109个CFU/剂和3.3×109个CFU/剂(1只狗)。重组Lm经30分钟以缓慢静脉内输注而施用。第1组所选的剂量为小鼠中嵌合huHer-2/neu重组体的确定安全剂量。在人中，Lm-LLO-E7的无毒剂量仅比小鼠中确定的剂量高一个数量级，并且该剂量为该前期试验中第3组评估的剂量。
在Lm施用时，监测狗的全身性不利影响的证据。在输注期间，通过ECG监测心搏率和心律并记录呼吸率。另外，使用超声波并通过测定肌钙蛋白I水平来监测心脏损伤(图8)。在输注后，密切监测狗48小时。在输注后使用MiniMitter Respironics制造的Vital Sense连续体温监控系统(兽医临床试验中心(VCIC)常用仪器)连续监控核心体温<12小时。在前6小时的每小时和其后的每4小时监测并记录脉搏率、脉搏节律和脉象、呼吸率和呼吸努力，以及血压和体温(图9)。记录所有符合免疫刺激的症状，根据需要使用流体、止痛剂、止吐剂和抗组胺剂控制严重反应。所有狗每天观察六次，记录重组体的任何毒性效应的迹象，包括不适、嗜睡、恶心、呕吐和腹泻。在第一次ADXS31-164疫苗接种后24、48和72小时采集血样进行培养，以评估全身施用后Lm的清除。
抗肿瘤免疫的评估
在最后卡铂给药后三周，狗接受常规临床检查和基线血液工作，包括CBC、CS、UA和cTnI水平。在该时间采集PBMC进行抗肿瘤免疫的基线评估。在每次疫苗接种时和最后疫苗接种后三周进行重复的免疫评估。通过CFSE增殖、细胞因子生成(ELISpot和qRT-PCR)和CTL分析法来分析PBMC对自体肿瘤靶标的Her-2/neu特异性T细胞应答，如下文所概述(图12)。
结果
迄今为止，我们在16只狗中进行了总共41次ADXS31-164输注。
ADXS31-164剂量的范围为1×108、5×108、1×109和3.3×109个CFU。
| 接受的剂量 | 施用的总剂量数 | 狗的数量 | 报告的副作用 |
| 1×108 | 9 | 3 | 发热、恶心、呕吐、肝脏酶升高 |
| 5×108 | 9 | 3 | 发热、恶心、呕吐、肝脏酶升高 |
| 1×109 | 17 | 10 | 发热、恶心、呕吐、肝脏酶升高、血小板减少 |
| 3.3×109 | 1 | 1 | 恶心、呕吐 |
疫苗施用的标准操作规程
开发ADXS31-164施用的标准操作规程。在疫苗接种前一小时，患者通过肌内注射接受2mg/kg苯海拉明，以及缓慢静脉推注0.2mg/kg昂丹司琼。疫苗保持在-80℃下，在给患者施用时解冻。它溶于200ml 0.9％NaCl中经30分钟施用。然后用30ml Plasmalyte冲洗输注管线。将狗送回笼舍，三天一个疗程施用阿莫西林(疫苗接种后72小时开始)，7天一个疗程施用肝脏补充剂(S-腺苷-甲硫氨酸)，以帮助细胞生长和修复。
研究的主要终点是确定ADXS31-164的最大耐受剂量。
体重在25kg至67kg范围内的狗能很好地耐受高达3.3×109的剂量。所有报告的副作用均为I级毒性，最大耐受剂量尚未达到。通常在疫苗施用的2-4小时内出现副作用。高热通常以维持速率(4ml/kg/小时)静脉内递送等渗流体2-4小时而消退。在其中发热达到104.7和更高的两种情况下，单次皮下注射卡洛芬在1-2小时内使体温恢复正常。恶心和呕吐通常是自限性的，但在其中记录到多次发作的情况下，施用1mg/kg Cerenia，这对预防进一步的恶心和呕吐非常有效。在疫苗施用的48小时内，总共5只狗的肝脏酶出现轻度、I级升高，这在疫苗接种一周后消退。
李斯特菌的清除
在对迄今为止接种疫苗的所有16只狗进行血液培养后，疫苗接种后24小时任何一只狗的外周循环中均未检测到李斯特菌。未评估疫苗接种狗的尿液和粪便中李斯特菌的流出。
研究的次要终点是无进展存活期和总体存活期。在截肢和4剂卡铂后施用ADXS31-164时已观察到患有骨肉瘤的狗具有统计学上的显著性的总体存活期优势。前两剂组(6只狗)的早期结果显示，与其主人选择不参与试验但跟踪存活期的6只狗相比，接受ADXS31-164的狗具有显著的存活期优势(p＝0.003)(图13)。未接种疫苗的狗的平均存活时间为239.5天。未到达接种疫苗的狗的平均存活时间。当分析包括意向治疗组中的所有狗时，这也成立。
因此，没有证据显示对心血管、造血、肝脏或肾脏系统造成显著的短期或长期副作用。此外，在存在微小残留病的情况下，ADXS31-164的施用可延缓/预防转移性疾病，并延长患有Her-2/neu阳性骨肉瘤的狗的总体存活期。
实例10：
在骨肉瘤(OSA)的自发性犬科动物模型中评估ADXS31-164的1期临床试验。
疫苗制造
ADXS31-164的设计和产生。简而言之，用携带嵌合人HER2/neu构建体的pADV质粒转染单核细胞增多性李斯特菌(Lm)的dal dat actA突变体菌株。该构建体包含人HER2/neu分子的2个胞外域(EC1和EC2)和一个胞内域(IC1)，人HER2/neu分子包含大部分融合至截短的李斯特菌溶血素O构建体的HLA-A2限制免疫优势表位。转移质粒还包含芽孢杆菌p60dal基因，并且通过营养缺陷型互补而维持在突变体Lm内。不存在细菌抗性盒。疫苗由Vibalogics GmbH(Cuxhaven,Germany)制造，在使用之前保存在-80℃。
组织病理学、分期和免疫组织化学
所有原发性肢体骨肉瘤肿瘤的组织病理学评估由委员会认证的兽医病理学家(J.E.)进行。根据组织学特征将肿瘤描述为成骨细胞肿瘤、软骨母细胞肿瘤、纤维母细胞肿瘤和血管扩张性肿瘤。根据有丝分裂指数、核多形性以及基质和坏死的存在量对原发性肿瘤进行评分。将组织学评分转换为级别(I、II或III)。
对于HER2/neu染色，将福尔马林固定、脱钙、石蜡包埋组织的5微米厚连续切片安装到带负电的载玻片上。切片在80℃下加热20分钟，浸入Pro Par(clearant)中，在乙醇中再水化。通过在柠檬酸钠缓冲液(pH～9.0)中煮沸切片进行抗原修复。使用3％过氧化氢封闭内源性过氧化物酶。使用兔抗人HER2/neu抗体(Neu(c-18):sc-284,Santa CruzBiotecnology)或兔IgG同种型(通用阴性对照血清(Universal Negative Controlserum)，NC498，Biocare Medical)进行染色。使用通用链亲和素-生物素2系统(UniversalStreptavadin-Biotin2System)(DAKO/LSAB2,HRP)检测结合的抗体。组织用3,3'-二氨基联苯胺溶液(DAKO)染色，并用苏木精复染色。使用Nikon E600infinity经校正的正立显微镜观察玻片。使用Nikon Digital Sight DS-Fi1彩色照相机获取亮视野图像，并使用NIS-Element BR3.0进行图像分析。由委员会认证的病理学家(J.E.)根据赘生性细胞的HER2/neu染色百分比(<10％＝1、10％-50％＝2、>50％＝3)和HER2/neu染色强度(弱＝1、中＝2、强＝3)对组织切片的HER2/neu阳性进行评估和评分。每个组织切片的得分基于10hpf内分析的细胞。合并的HER2/neu得分通过HER2/neu染色阳性的肿瘤细胞百分比和HER2/neu染色强度给出的两个单独的得分相乘得到。只有HER2/neu染色阳性的肿瘤细胞大于10％的狗才符合试验入选资格。
合格标准和临床试验设计
组织病理学和免疫组织化学诊断为HER2/neu阳性OSA的狗接受了通过截肢或保肢手术进行的原发性肿瘤摘除，并接受了4剂300mg/m2的卡铂作为辅助性化疗，卡铂每3周给予一次(或如果出现骨髓抑制，则每4周一次)，此类狗符合筛选资格。在最后卡铂治疗后三周对狗进行筛选。进行全面体检、全血细胞计数(CBC)、化学筛选(CS)和尿分析(UA)以确定一般健康状态。分别使用流式细胞中性粒细胞氧化爆发分析和有丝分裂原诱导的淋巴细胞增殖分析来测试基本先天性和适应性免疫功能。通过心电描记法、超声心动描记法和血清心脏肌钙蛋白I水平评估基线心脏状态。进行胸部放射显影以确定肺转移性疾病的存在(参见图14B)。只有经发现全身健康、先天性和适应性免疫功能完整、无潜在心脏疾病证据并且无肺转移性疾病证据的那些狗才符合入选资格。在研究的过程中死亡的狗接受尸检。记录转移性疾病的存在和位置，进行组织病理学和免疫组织化学分析，以评估转移性病灶中的HER2/neu表达。
免疫分析
中性粒细胞氧化爆发分析。使用0.83％NH4Cl裂解肝素钠抗凝血中的红细胞，其余的白细胞在1×PBS中洗涤两次。用15μg/ml二氢若丹明123(DHR-123；Molecular Probes,Grand Island,NY)标记细胞，并用3nM佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯(PMA,Sigma,St.Louis,MO)在37℃下活化30分钟。将细胞置于冰上15分钟，然后进行流式细胞分析。在FACS Canto细胞计数器(BD Biosciences,San Jose,CA)上获取细胞，并使用FloJo软件(Treestar,San Carlos,CA)进行分析。
淋巴细胞增殖分析。通过密度离心从肝素钠抗凝全血分离外周血单核细胞(PBMC)。PBMC在1×PBS中洗涤两次并计数。用5μM CFSE标记细胞，并用1.25μM伴刀豆球蛋白A在37℃下刺激5天。收集细胞，在FACS缓冲液中洗涤两次，用APC缀合的大鼠抗犬科动物CD4和PE缀合的大鼠抗犬科动物CD8抗体Serotec,Raleigh,NC)标记，并通过流式细胞术分析。对于免疫功能分析，使用从健康集落狗(IACUC#804197)采集的外周血作为阳性对照。
T细胞亚群分析。在基线、每次疫苗接种之前、再分期时以及其后每2个月采集PBMC，进行CD4和CD8T细胞亚群分析。简而言之，解冻冷藏的细胞，在FACS缓冲液(1×PBS、0.2％BSA组分V和4mM叠氮化钠)中洗涤两次，然后用小鼠抗犬科动物CD3、PE标记的大鼠抗狗CD8或Alexa标记的大鼠抗狗CD4(Serotec,Raleigh,NC)进行表面染色。在流式细胞采集之前立即用活体染料7-ADD温育细胞。由使用Cell Dyn 3700CS血液分析仪测定的流式细胞百分比和总淋巴细胞计数来计算CD4+和CD8+T细胞总数。
疫苗施用
在疫苗接种之前，狗接受静脉内施用5HT3拮抗剂昂丹司琼(0.2mg/kg)和肌内施用H1受体阻断剂苯海拉明(2mg/kg)，分别用于预防恶心和过敏。利用标准3+3临床试验设计。ADXS31-164按以下剂量施用；第1组(2×108个CFU)、第2组(5×108个CFU)、第3组(1×109个CFU)以及第4组(3.3×109个CFU)。在100ml 0.9％NaCl(第1和2组)和200ml 0.9％NaCl(第3和4组)中稀释ADXS31-164，并经30分钟静脉内施用。在输注后每小时监测体温、脉搏、呼吸率、心率和心律(通过EKG)以及血压。在其中体温超过103℉的情况下，给狗静脉内施用4ml/kg/h Plasmalyte，直到体温降至103℉之下。每小时监测狗的嗜睡、恶心或呕吐迹象。在24小时和疫苗接种后一周采集血样，以评估血液学或生物化学参数的任何变化，并且在疫苗接种后24小时进行血液培养，以确定血流中活细菌的持续存在性。在疫苗接种后72小时，所有狗接受短疗程的阿莫西林和S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)，以杀死任何残留的李斯特菌，以及为肝脏提供抗氧化剂支持。
在接受初始系列中的最后疫苗后至少5个月无转移性疾病的狗的主人可选择接受1×109个CFU的标准剂量的加强疫苗。如上文所述施用加强疫苗，并且如上文所述在输注后对狗进行监测。
毒性
根据Veterinary Co-operative Oncology Group-Common TerminologyCriteria for Adverse Events(VCOG-CTCAE)(兽医合作肿瘤学组-不良事件的常用术语标准)对毒性进行分级。在基线、每次疫苗接种时、最后疫苗接种后3周以及其后每2个月通过连续心电图、超声心动图和血清心脏肌钙蛋白I水平进行心脏毒性的评估，直到死亡。所评估的参数包括左室缩短分数(LVFS)和左室舒张末期内径(LVIDd)以及左室收缩末期内径(LVIDs)。将LVIDd和LVIDs归一化为体重，以考虑狗中宽范围的体格大小。
ELISpot分析
在每个指定的时间点解冻冷藏的PBMC，在37℃下放置过夜，然后计数。细胞用2.5μM重叠人HER2/Neu肽库(11个单位重叠5个氨基酸)(表示嵌合疫苗中存在的HER2/Neu的EC1、EC2和IC1域)和重组人IL-2(Invitrogen,Fredrick,MD)刺激5天。收集细胞，在1×PBS中洗涤两次并计数。IFN-γ ELISpot分析使用商业化犬科动物IFN-γ ELISpot分析试剂盒(R&DSystems,Minneapolis,MN)根据制造商的方案进行。简而言之，将0.8-2×105个经刺激的细胞与2.5μM EC1、EC2或IC1肽库加上IL-2或单独的IL-2(以测定背景计数)一起温育。所有分析一式两份地进行。根据制造商的说明对平板显色。使用CTL-Immunospot分析仪(C.T.L,Shaker Heights,OH)对斑点进行计数。
主要和次要结局测定
转移时间(TTM)以截肢和发生转移性疾病之间的时间计算。OSA特异性存活期以截肢和死亡之间的时间计算。对死于不相关原因的患者在死亡时进行审查。
结果
达到合格标准的十八只狗入选该I期临床试验。记录年龄、品种、性别、肿瘤位置、亚类、等级和HER2/neu状态(表4)。利用标准3+3临床试验设计。ADXS31-164按以下剂量施用；第1组：2×108个CFU(n＝3)、第2组：5×108个CFU(n＝3)、第3组：1×109个CFU(n＝9)以及第4组：3×109个CFU(n＝3)。出于关怀护理，五只另外的在筛选时鉴定为患有预先存在的肺转移性疾病的狗也接受ADXS31-164(表4)。这些狗中的四只在>50％的来自原发性肿瘤的赘生性细胞中具有强HER2/neu染色。在筛选时，这些狗中的三只具有多个肺转移性结节，两只狗具有单个转移性结节。具有多个肺结节的狗每只在疾病进展前接受一剂疫苗，并退出研究进行替代治疗。具有单个结节的两只狗每只接受全程三剂疫苗。患有预先存在的转移性疾病的狗接受1×109个CFU(n＝3)或3×109个CFU(n＝2)ADXS31-164(表5)。
图15示出了1期临床试验的时间线示意图，其中三次疫苗接种在截肢和随访化疗后施用。
表4：入选的狗的特征描述和肿瘤特征
表5：出于关怀护理而治疗的患有预先存在的转移性疾病的狗的特征描述和肿瘤特征。
结果
安全性和毒性＝评估所有23只疫苗接种狗的安全性。所有狗能很好地耐受ADXS31-164施用，仅在疫苗接种日观察到瞬时低级别毒性(表6)。在所有组中，ADXS31-164施用后4小时出现具有统计学上的显著性的体温升高，与剂量无关(图9A)。在任何时间点或任何剂量下均未观察到低血压(图9B)。8/18只狗(未患预先存在的转移性疾病)和3/5只狗(患有预先存在的转移性疾病)在疫苗接种的4小时内出现>103℉的发热，此时给予静脉补液。三只狗接受单剂量的非甾体抗炎药，以降低体温。在所有情况下，发热的消退无需另外干预。在疫苗接种的4小时内出现不需要治疗干预的瞬时嗜睡、恶心和呕吐，与剂量无关。在疫苗接种后不久，在两只狗中鉴定到瞬时单或二联室性早搏。在疫苗接种的2小时内，一只患有预先存在的转移性疾病的狗出现室性心动过速。然而，利多卡因、普鲁卡因胺、索他洛尔和皮质类固醇的治疗没有效果，心律失常在72小时内消退。在ADXS31-164施用24小时后出现瞬时、但具有统计学上的显著性的白细胞和中性粒细胞计数增加，并且伴有血小板和淋巴细胞瞬时减少(图17)。虽然ADXS31-164剂量和血液学变化幅度之间无相关性，但存活的狗和死亡的狗之间的白细胞、中性粒细胞和单核细胞应答幅度存在显著的差异(图18A-F)。大约一半的狗的肝脏酶血清浓度出现轻度、瞬时升高，与亲肝李斯特菌引起的轻度炎症一致(表6)。外周血中鉴定的所有变化均为无症状的，并且在ADXS31-164施用的一周内消退。在任何狗中均未记录到肾功能的显著变化。19/23只狗在ADXS31-164施用后24小时进行了血液培养，并且均为阴性的，与高度减毒LmddA菌株的快速清除一致。
鉴于HER2/neu靶向单克隆抗体会引起心脏毒性，我们在基线、每次疫苗接种之前以及其后每2个月评估了心脏损伤的生物标志物和机能障碍的超声心动描记计测量，包括心脏肌钙蛋白I、缩短分数(％)、LVIDd和LVIDs。在任何疫苗接种狗中均未鉴定到心脏肌钙蛋白I、缩短分数、LVIDd或LVIDs的显著、持续变化(图26A-D)。然而，第3组的一只狗在每次疫苗接种时显示出血清心脏肌钙蛋白I的阶跃升高，不伴有超声心动描记的机能障碍迹象。值在最后疫苗接种后返回基线，并且在重复评估时未升高。
在整个临床试验中，测定心脏肌钙蛋白I水平，以及缩短分数、左室收缩末期内径(LVIDs)和左室舒张末期内径(LVIDd)，如图25(A-D)所示，在ADXS31-164的施用后，不存在长期或短期心脏毒性的证据。
下表6提供的数据示出，在临床试验期间报告了极少的治疗相关不良事件。
表6：在ADXS31-164疫苗接种时或48小时内出现的治疗相关不良事件。
结论：ADSX31-164毒性是低级别的并且是瞬时的
对ADXS31-164的免疫应答
图18提供的结果证实，在接受疫苗的狗中，对ADXS31-164的早期免疫应答预测了狗的存活期。图18显示，ADXS31-164诱导了与存活期相关的WBC、中性粒细胞和单核细胞计数增加，并且伴有血小板和淋巴细胞的瞬时减少(图17)。
在临床试验期间评估了ADXS31-164诱导和维持免疫应答，具体地讲诱导HER2/neu特异性T细胞免疫的能力。为了评估免疫应答以及确定ADXS31-164是否诱导了HER2/neu特异性T细胞应答，通过IFN-γ ELISpot评估了HER2/neu特异性T细胞数量。在基线(卡铂施用后3周)、每次疫苗接种时以及其后每2个月采集样品。图19示出了ELISpot分析的结果。
HER2/neu特异性免疫应答。在基线分别对4/18、6/18和1/18只狗检测对人HER2/neu的EC1、EC2和IC1域(分别与犬科动物HER2/neu共有89％、93％和98％同一性)的免疫应答。在第三次ADXS31-164疫苗接种后3周对7只狗检测对一个或多个HER2/neu域的诱导的IFN-γ应答(表7)。这些狗中的五只出现对高度保守的IC1域的免疫应答。在2个月后五只另外的狗出现对IC1域的IFN-γ应答。在复发时，三只另外的狗出现对单独的EC2、EC2和IC1或EC1、EC2和EC3的IFN-γ应答(狗001、002和017)。通过IFN-γ ELISpot评估在初始疫苗接种系列期间出现对HER2/neu的免疫应答的3只狗15至17个月。然而，并未维持HER2/neu特异性IFN-γ应答，在此期间狗仍无转移性疾病。10只狗接受另外的加强疫苗接种，其中6只可评估，在加强疫苗接种后2个月，2只狗检测到HER2/neu特异性IFN-γ应答增加。在ADXS31-164施用后3周，复发的8只狗中，5只的HER2/neu特异性IFN-γ应答不增加。
表7
加强疫苗接种。在18只入选时无转移性疾病的狗中，十只在初始疫苗系列后5和10个月之间施用单剂加强疫苗。这些狗中的四只接受在首次加强疫苗后4和15个月之间给予的另外加强疫苗。在加强疫苗接种时，与初始疫苗接种系列一样，记录到了类似的低级别、瞬时副作用。
图20(A和B)示出，重复加强疫苗接种还刺激了HER2特异性免疫。在6和10个月对动物289-003施用重复加强疫苗接种，在8个月对动物289-004施用。
临床结局。疫苗接种组中8/18只狗复发，4只患有肺转移性疾病，4只出现骨转移。两只骨转移的狗进展到肺转移。一只骶骨具有骨病灶的狗死于吸入性肺炎，一只具有单个肺结节的狗死于肾胚细胞瘤，然而，分别来自骨和肺病灶的尸检样本不适于转移性骨肉瘤的组织病理学确认。通过OSA特异性存活期分析，对这两只狗进行审查。复发的狗在初诊判断时接受不同的挽救化疗和放疗。4只骨转移的狗仅用止痛剂治疗(1只狗)、单独的姑息性放疗(1只狗)或与化疗联合(2只狗)。两只狗接受阿霉素，1只狗接受Palladia，以治疗肺转移性疾病。未达到疫苗接种狗的中值OSA特异性存活期。TTM的Kaplan-Meier存活期曲线和OSA特异性存活期如图21所示。疫苗接种狗的1年和2年总体存活率分别为71.4％和57％。在疫苗接种的2个月内出现HER2/neu特异性IFN-γ应答的12只狗中，9只仍然存活(3只狗>900天，1只狗>700天，3只狗>400天，2只狗>300天，并且7只目前仍无肿瘤(表7))。图24提供的结果显示，ADXS31-164破坏了对HER2/Neu的耐受性。这对OSA以及其他HER2/neu肿瘤和/或癌症的治疗是重要的。
尸检结果。6/18只狗在研究期间死亡，对这些狗中的4只进行尸检。三只狗被发现患有多灶性II和III级转移性骨肉瘤，涉及肺(3只狗)、骨(2只狗)、纵隔(1只狗)和肾(1只狗)。一只狗由于大型进行性肾脏肿块而被实施安乐死，被发现患有肾胚细胞瘤。这只狗还具有单个肺结节，但遗憾的是未通过组织病理学评估。
ADXS31-164施用后的存活期、长存活期、肿瘤进展
在筛选时三只具有多个转移性肺结节的狗，出于关怀护理，在疾病进行前每只接受一剂疫苗治疗，并从研究中移除。在筛选时两只存在孤立性转移性肺结节的狗接受全部三剂疫苗(参见表5的特征描述和肿瘤特征)。尽管进行了疫苗接种，这些狗中的一只仍出现进行性肺转移性疾病。在第二只狗中，尽管预先存在的肺结节每3周大小加倍，但未出现另外的肺病灶(图22A和B)。在最后疫苗接种后一周，CT扫描确认不存在另外的转移性病灶，并且狗接受转移灶切除。在手术前，静脉内施用用于检测肿瘤边缘和炎症区域的染料吲哚菁绿(ICG)，在手术时，在近红外光下观察到肺结节中以及孤立性结节附近的多个其他外观健康的肺实质区域中的荧光(图22C和D)。肺结节的组织病理学揭示，转移性OSA具有被厚纤维囊围绕的很大的出血和坏死区域(图22E)。IHC显示CD3+T细胞在纤维囊周围积聚，结节本身内的T细胞很少(图22G和H)。近红外荧光识别的其他区域示出了T细胞浸润的局灶性区域(图22F、22I和22J)。在具有显著的有丝分裂象的异常大的波形蛋白阳性细胞周围观察到T细胞(图22K和22L)。这些发现暗示，单个转移性肉瘤细胞可被肺内的肿瘤特异性T细胞有效地靶向，并且提供ADXS31-164防止转移性肺疾病的可能机制。狗能很好地从手术恢复，并且保持无肺转移性疾病5个月，随后在皮下组织(成骨细胞肿瘤，II级；和软骨母细胞肿瘤，III级)、纵隔(成骨细胞肿瘤，II级)和隔膜(成骨细胞肿瘤，III级)中出现广泛的侵袭性HER2/neu+转移性疾病。结果显示，尽管诱导了HER2/neu特异性T细胞应答，但未鉴定到脱肿瘤副作用，因此HER2/neu特异性T细胞的诱导负责消除HER2/neu阳性转移性细胞，以及长期防止疾病复发。这可由以下方面支持：HER2/Neu-特异性T细胞扩增的时间(在5只狗中出现在诊断后大约8个月，当时很多狗将出现转移性疾病)，以及疫苗接种和转移灶切除后一只狗的肺实质内局灶性T细胞应答的组织病理学发现。
图22和图23提供的结果证实，ADXS31-164的施用延缓了和/或防止了转移性疾病，并且延长了患有自发性HER2+骨肉瘤的狗的总体存活期。从两张图中可以看出，接受疫苗的狗的存活时间显著延长，而其他的则未达到那些接受疫苗的狗的中值存活期。
虽然我们的研究证实了此方法防止转移性疾病的有效性，但在出于关怀护理治疗的5只狗中，ADXS31-164疫苗接种不能诱导预先存在的严重肺转移性疾病的消退。在一只狗中，这似乎与T细胞不能穿透围绕转移性病灶的纤维囊或那些细胞不能在已建立的肿瘤微环境中存活相关(图22C)。然而，在相同的狗中，总体正常的肺实质中观察到大型、活跃分裂的旨在成为转移性OSA细胞的间充质细胞周围的T细胞浸润的局灶性区域，出乎意料的是，在转移灶切除后，该狗未发生进一步的肺转移性疾病。这些数据共同暗示，ADXS31-164通过其诱导强大先天性免疫应答和适应性免疫应答的能力防止了肺转移性疾病，该先天性免疫应答可敏化转移性OSA细胞发生FAS/FASL介导的细胞凋亡，该适应性免疫应答为消除微转移性肺疾病的HER2/neu特异性T细胞的形式。
结论：
在提交本申请时，12/18只狗未发生肺转移性疾病，证实了在微小残留病的背景中施用时，ADXS31-164防止了患有自发性HER2+骨肉瘤的受试者的转移性疾病。与历史HER2/Neu+对照组相比，疫苗接种狗显示出具有统计学上的显著性的总体存活期延长。HER2/Neu+对照狗(n＝11)的中值存活期为316天(p＝0.032)，其中未达到ADSX31-164治疗狗的中值存活期。另外，结果表明，ADXS31-164破坏了对HER2/neu的高度保守IC1域的外周耐受性(图26)。在ADXS31-164施用24小时内白细胞增加的幅度(图18)与存活期相关，暗示结局部分取决于狗的免疫系统对疫苗作出应答的能力。重要的是，本研究显示将高达3×109个CFU的ADXS31-164施用于患有自发性OSA的狗是安全的，并且在施用时仅引起瞬时、低级别的副作用。此外，防止肺转移性疾病可能部分地与肺中CD3+T细胞介导的微观转移性疾病消除相关。本研究对于表达HER2/Neu的小儿OSA和其他人类癌症具有重要意义。
此外，我们在这里示出，在狗中剂量高达3.3×10^9个CFU的ADXS31-164的施用是安全的，尽管诱导了HER2/neu特异性免疫但不会导致短期或长期心脏毒性。包括心脏毒性的在靶、脱肿瘤副作用与大量HER2/neu特异性T细胞的施用相关，或当曲妥单抗与蒽环类同时使用时出现。我们利用无多柔比星的标准化疗方案减小心脏毒性的任何潜在风险。
我们的研究证实，ADXS31-164可防止患有OSA的狗的肺转移性疾病。这些结果证实了患有OSA的狗的安全性和史无前例的存活时间，并且为研究ADXS31-164防止患有HER2/neu表达性肿瘤(包括小儿骨肉瘤和乳腺癌)的患者的转移性疾病的能力铺平了道路。
实例11：
联合ADXS31-164和放射疗法治疗犬科动物和人类骨肉瘤(OSA)以及肺转移性疾病。
描述了与姑息性放疗结合使用表达人嵌合Her-2/neu构建体(ADXS31-164)的重组单核细胞增多性李斯特菌来预防具有自发性肢体骨肉瘤的狗中的肺转移性疾病并延长总体存活期。鉴于犬科动物与人骨肉瘤之间的相似性，我们相信，该联合将是对人类疾病有效的疗法。
材料和方法
疫苗制备
ADXS31-164疫苗的构建细节在上文已进行了描述。制备了ADXS31-164库存疫苗，并作为1ml等分试样储存在-70℃的冷冻机中。注射前，将库存疫苗在37℃下解冻2-3分钟，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次并以5×108个集落形成单位(CFU)/ml的浓度重悬在PBS中。将每只狗用200μl该悬浮液经腹膜内免疫。
RT和免疫疗法
入选了十只全身健康的狗，它们具有经组织病理学确认的、未经治疗的HER2+肢体OSA，无心脏病或转移性疾病的迹象。所有狗连续两天接受分成两个部分的16Gy的RT，然后首次接受8个ADXS31-164静脉内剂量(3.3×10^9个CFU/剂)，每3周给予一次。每3周进行基于李斯特菌的疫苗的免疫(例如，在第7、28、49、70、91、112、133和154)天(图10)。在免疫当天还进行了免疫分析。
在第4和5天，使用Siemens 6MV线性加速器递送8Gy的外照射RT。RT在全身麻醉下给予。每三周在临床上对肿瘤进行评估，并在基线时、在第四次疫苗施用(第70天)时以及在第八次疫苗施用(第154天)时通过放射照相对肿瘤进行评估。在这些时间点，进行胸部放射显影以确定肺转移性疾病的存在。
在入选时进行了骨活检以确认骨肉瘤的诊断。在第0、70和133天以及在之后的每2个月直到实施安乐死，进行了全血细胞计数(CBC)、化学筛选(CS)、尿分析(UA)、心电图(EKG)/超声心动图/心脏肌钙蛋白I(cTnl)血清浓度以及受影响肢体和胸部的放射显影照片采集。在安乐死当天，进行了全血细胞计数(CBC)、化学筛选(CS)、尿分析(UA)、免疫分析、心电图(EKG)/超声心动图/心脏肌钙蛋白I(cTnl)血清浓度采集和尸检。
ELISpot分析在每个指定的时间点解冻冷藏的PBMC，在37℃下放置过夜，然后计数。细胞用2.0μM重叠人HER2/Neu肽库(11个单位重叠5个氨基酸)(表示嵌合疫苗中存在的HER2/Neu的EC1、EC2和IC1域)和重组人IL-2(Invitrogen,Fredrick,MD)刺激5天。收集细胞，在1×PBS中洗涤两次并计数。IFN-γ ELISpot分析使用商业化犬科动物IFN-γELISpot分析试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN)根据制造商的方案进行。简而言之，将0.1-3×105个经刺激的细胞与2.5μM EC1、EC2或IC1肽库或不与肽(以测定背景计数)一起温育。所有分析一式两份地进行。根据制造商的说明对平板显色。使用CTL-Immunospot分析仪(C.T.L,Shaker Heights,OH)对斑点进行计数。
结果
我们评估了ADXS31-164作为辅助疗法在如上文所述的患有自发性骨肉瘤的狗中的使用。ADXS31-164在连续两天施用16Gy RT后施用给患有自发性肢体OSA的狗。施用了最多8个剂量的ADXS31-164。这项研究显示反复施用3.3×109个CFU的ADXS31-164是安全的。
然后探索了放射疗法与ADXS31-164之间促进抗肿瘤免疫(具体地讲，产生Her-2/neu特异性T细胞)、阻碍原发性肿瘤进展并预防/延迟肺转移性疾病的潜在协同作用。
图10描述了治疗方案。在入选进试验的第0天对狗进行了筛选。筛选包括评价基线血检、尿液分析、心脏评估、胸部和受影响的肢体的放射显影以及骨活检以确认骨肉瘤的诊断。在入选后连续2天给予姑息性放射。在姑息性放疗后，给予多剂量(最多8个)的ADXS31-164，每3周一次，仅有暂时性的、低等级的副作用(数据未示出)。在第70和154天重复进行胸部和肢体放射显影。在每个时间点由两名经委员会认证的兽医整形外科医生基于他/她们对每个时间点每只狗获取的视频的评估而为每只狗给出跛行评分。主人还填写了经验证的疼痛问卷，该问卷记录主人对生活质量的感知(图28)。10只狗中有5只仍然活着，三只无肿瘤进展或肺转移性疾病的迹象。在撰写时，中值存活期为285天，其有利地与仅使用RT实现的136天的历史中值存活期形成对比。在一个患者中，在试验入选时呈现出近端肱骨的病理性骨折(通过2块骨板和一颗髓内钉稳定化)，在放射疗法和ADXS31-164施用后三个月，放射显影显示出骨折愈合的迹象，而无肺转移性疾病的迹象(图11)。
此外，结果表明与ADXS31-164疗法结合的姑息性放射疗法减少溶解、促进肿瘤合并并延长受试者存活期(图29A-D和图30-A-B)。在16Gy的放射(从2014年9月13日开始连续2天给予8Gy)和3剂ADXS31-164(2014年11月25日)后，远端胫骨骨肉瘤病变的横向(图29A)和AP(图29C)放射线视图展示出明显的皮质骨重建和溶解减少。用16Gy的放射(从2014年7月16日开始连续2天给予8Gy)和3剂ADXS31-164(2014年10月13日)治疗的远端桡骨骨肉瘤病变的横向(图29B)和AP(图29D)放射线视图。注意，在桡骨的远端部分中的肿胀和骨溶解明显减少(在图29B中将2014年10月13日的放射显影照片与2014年7月16日的放射显影照片进行比较)。在远端胫骨的内侧面上骨密度增加(在图29D中将2014年10月13日的放射显影照片与2014年7月16日的放射显影照片进行比较)。在图29D中2014年10月13日的放射显影照片上见到远端挠骨的内侧面的骨折有微小的移置。因此，ADXS31-164可在不进行化疗的情况下使用；与放疗结合并可能在新辅助治疗情况下在截肢和化疗前使用以预防转移性疾病。
虽然本文已示出和描述了本发明的某些特征，但现在本领域的普通技术人员将想到许多修改、置换、变化和等同形式。因此，应当理解，所附权利要求书旨在涵盖落在本发明的真实精神范围内的所有此类修改和变化。
序列表
<110> 宾夕法尼亚大学理事会
<120> 用于治疗HER-2阳性癌症的联合免疫疗法和放疗
<130> P-73423-PC3
<140> PCT/US15/999999
<141> 2015-04-02
<150> 14/669,629
<151> 2015-03-26
<150> 14/268,436
<151> 2014-05-02
<150> PCT/US15/17559
<151> 2015-02-25
<150> 62/076,411
<151> 2014-11-06
<160> 74
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1263
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2嵌合蛋白
<400> 1
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caccataaca cccacctctg cttcgtgcac acggtgccct gggaccagct ctttcggaac 780
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<220>
<223> Her-2嵌合蛋白
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His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg
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Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Val Leu Arg
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<213> 单核细胞增多性李斯特菌
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<223> 位于HER2的胞外域上的标绘HLA-A2表位
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<213> 人工序列
<220>
<223> EC2的比对（Her-2-neu的975 -1029 bp）
<400> 14
ggtcacagct gaggacggaa cacagcgttg tgagaaatgc agcaagccct gtgct 55
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC2的比对（Her-2-neu的975 -1029 bp）
<400> 15
cgagtgtgct atggtctggg catggagcac cttcgagggg cgagggccat caccagtgac 60
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC2的比对（Her-2-neu的975 -1029 bp）
<400> 16
aatgtccagg agtttgatgg ctgcaagaag atctttggga gcctggcatt tttgccggag 60
<210> 17
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC2的比对（Her-2-neu的975 -1029 bp）
<400> 17
agctttgatg gggacccctc ctccggcatt gctccgctga ggcctgagca gctccaagtg 60
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC2的比对（Her-2-neu的975 -1029 bp）
<400> 18
ttcgaaaccc tggaggagat cacaggttac ctgtacatct cagcatggcc agacagtctc 60
<210> 19
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC2的比对（Her-2-neu的975 -1029 bp）
<400> 19
cgtgacctca gtgtcttcca gaaccttcga atcattcggg gacggattct ccacgatggc 60
<210> 20
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC2的比对（Her-2-neu的975 -1029 bp）
<400> 20
gcgtactcat tgacactgca aggcctgggg atccactcgc tggggctgcg ctcactgcgg 60
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC2的比对（Her-2-neu的975 -1029 bp）
<400> 21
gagctgggca gtggattggc tctgattcac cgcaacgccc atctctgctt tgtacacact 60
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC2的比对（Her-2-neu的975 -1029 bp）
<400> 22
gtaccttggg accagctctt ccggaaccca catcaggccc tgctccacag tgggaaccgg 60
<210> 23
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC2的比对（Her-2-neu的975 -1029 bp）
<400> 23
ccggaagagg attgtggtct cgagggcttg gtctgtaact cactgtgtgc ccacgggcac 60
<210> 24
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC2的比对（Her-2-neu的975 -1029 bp）
<400> 24
tgctgggggc cagggcccac ccagtgtgtc aactgcagtc atttccttcg gggccaggag 60
<210> 25
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1的比对（Her-2-neu的2114-3042 bp）
<400> 25
cgcccagcgg agcaatgccc aaccaggctc agatgcggat cctaaaagag acggagc 57
<210> 26
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1的比对（Her-2-neu的2114-3042 bp）
<400> 26
taaggaaggt gaaggtgctt ggatcaggag cttttggcac tgtctacaag ggcatctgga 60
<210> 27
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1的比对（Her-2-neu的2114-3042 bp）
<400> 27
tcccagatgg ggagaatgtg aaaatccccg tggctatcaa ggtgttgaga gaaaacacat 60
<210> 28
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1的比对（Her-2-neu的2114-3042 bp）
<400> 28
ctcctaaagc caacaaagaa attctagatg aagcgtatgt gatggctggt gtgggttctc 60
<210> 29
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1的比对（Her-2-neu的2114-3042 bp）
<400> 29
cgtatgtgtc ccgcctcctg ggcatctgcc tgacatccac agtacagctg gtgacacagc 60
<210> 30
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1的比对（Her-2-neu的2114-3042 bp）
<400> 30
ttatgcccta cggctgcctt ctggaccatg tccgagaaca ccgaggtcgc ctaggctccc 60
<210> 31
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1的比对（Her-2-neu的2114-3042 bp）
<400> 31
aggacctgct caactggtgt gttcagattg ccaaggggat gagctacctg gaggacgtgc 60
<210> 32
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1的比对（Her-2-neu的2114-3042 bp）
<400> 32
ggcttgtaca cagggacctg gctgcccgga atgtgctagt caagagtccc aaccacgtca 60
<210> 33
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1的比对（Her-2-neu的2114-3042 bp）
<400> 33
agattacaga tttcgggctg gctcggctgc tggacattga tgagacagag taccatgcag 60
<210> 34
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1的比对（Her-2-neu的2114-3042 bp）
<400> 34
atgggggcaa ggtgcccatc aaatggatgg cattggaatc tattctcaga cgccggttca 60
<210> 35
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1的比对（Her-2-neu的2114-3042 bp）
<400> 35
cccatcagag tgatgtgtgg agctatggag tgactgtgtg ggagctgatg acttttgggg 60
<210> 36
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1的比对（Her-2-neu的2114-3042 bp）
<400> 36
ccaaacctta cgatggaatc ccagcccggg agatccctga tttgctggag aagggagaa 59
<210> 37
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1的比对（Her-2-neu的2114-3042 bp）
<400> 37
cgcctacctc agcctccaat ctgcaccatt gatgtctaca tgattatggt caaatgtt 58
<210> 38
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1的比对（Her-2-neu的2114-3042 bp）
<400> 38
ggatgattga ctctgaatgt cgcccgagat tccgggagtt ggtgtcagaa tttt 54
<210> 39
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC1的比对（Her-2-neu的2114-3042 bp）
<400> 39
cacgtatggc gagggacccc cagcgttttg tggtcatcca gaacgaggac tt 52
<210> 40
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC1的比对（Her-2-neu的399-758 bp）
<400> 40
cccaggcaga accccagagg ggctgcggga gctgcagctt cgaagtctca cagagatcct 60
<210> 41
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC1的比对（Her-2-neu的399-758 bp）
<400> 41
gaagggagga gttttgatcc gtgggaaccc tcagctctgc taccaggaca tggttttgtg 60
<210> 42
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC1的比对（Her-2-neu的399-758 bp）
<400> 42
ccgggcctgt ccaccttgtg cccccgcctg caaagacaat cactgttggg gtgagagtcc 60
<210> 43
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC1的比对（Her-2-neu的399-758 bp）
<400> 43
ggaagactgt cagatcttga ctggcaccat ctgtaccagt ggttgtgccc ggtgcaaggg 60
<210> 44
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EC1的比对（Her-2-neu的399-758 bp）
<400> 44
ccggctgccc actgactgct gccatgagca gtgtgccgca ggctgcacgg gccccaagca 60
<210> 45
<211> 3716
<212> DNA
<213> 褐家鼠
<400> 45
ccggaatcgc gggcacccaa gtgtgtaccg gcacagacat gaagttgcgg ctccctgcca 60
gtcctgagac ccacctggac atgctccgcc acctgtacca gggctgtcag gtagtgcagg 120
gcaacttgga gcttacctac gtgcctgcca atgccagcct ctcattcctg caggacatcc 180
aggaagttca gggttacatg ctcatcgctc acaaccaggt gaagcgcgtc ccactgcaaa 240
ggctgcgcat cgtgagaggg acccagctct ttgaggacaa gtatgccctg gctgtgctag 300
acaaccgaga tcctcaggac aatgtcgccg cctccacccc aggcagaacc ccagaggggc 360
tgcgggagct gcagcttcga agtctcacag agatcctgaa gggaggagtt ttgatccgtg 420
ggaaccctca gctctgctac caggacatgg ttttgtggaa ggacgtcttc cgcaagaata 480
accaactggc tcctgtcgat atagacacca atcgttcccg ggcctgtcca ccttgtgccc 540
ccgcctgcaa agacaatcac tgttggggtg agagtccgga agactgtcag atcttgactg 600
gcaccatctg taccagtggt tgtgcccggt gcaagggccg gctgcccact gactgctgcc 660
atgagcagtg tgccgcaggc tgcacgggcc ccaagcattc tgactgcctg gcctgcctcc 720
acttcaatca tagtggtatc tgtgagctgc actgcccagc cctcgtcacc tacaacacag 780
acacctttga gtccatgcac aaccctgagg gtcgctacac ctttggtgcc agctgcgtga 840
ccacctgccc ctacaactac ctgtctacgg aagtgggatc ctgcactctg gtgtgtcccc 900
cgaataacca agaggtcaca gctgaggacg gaacacagcg ttgtgagaaa tgcagcaagc 960
cctgtgctcg agtgtgctat ggtctgggca tggagcacct tcgaggggcg agggccatca 1020
ccagtgacaa tgtccaggag tttgatggct gcaagaagat ctttgggagc ctggcatttt 1080
tgccggagag ctttgatggg gacccctcct ccggcattgc tccgctgagg cctgagcagc 1140
tccaagtgtt cgaaaccctg gaggagatca caggttacct gtacatctca gcatggccag 1200
acagtctccg tgacctcagt gtcttccaga accttcgaat cattcgggga cggattctcc 1260
acgatggcgc gtactcattg acactgcaag gcctggggat ccactcgctg gggctgcgct 1320
cactgcggga gctgggcagt ggattggctc tgattcaccg caacgcccat ctctgctttg 1380
tacacactgt accttgggac cagctcttcc ggaacccaca tcaggccctg ctccacagtg 1440
ggaaccggcc ggaagaggat tgtggtctcg agggcttggt ctgtaactca ctgtgtgccc 1500
acgggcactg ctgggggcca gggcccaccc agtgtgtcaa ctgcagtcat ttccttcggg 1560
gccaggagtg tgtggaggag tgccgagtat ggaaggggct cccccgggag tatgtgagtg 1620
acaagcgctg tctgccgtgt caccccgagt gtcagcctca aaacagctca gagacctgct 1680
ttggatcgga ggctgatcag tgtgcagcct gcgcccacta caaggactcg tcctcctgtg 1740
tggctcgctg ccccagtggt gtgaaaccgg acctctccta catgcccatc tggaagtacc 1800
cggatgagga gggcatatgc cagccgtgcc ccatcaactg cacccactcc tgtgtggatc 1860
tggatgaacg aggctgccca gcagagcaga gagccagccc ggtgacattc atcattgcaa 1920
ctgtagtggg cgtcctgctg ttcctgatct tagtggtggt cgttggaatc ctaatcaaac 1980
gaaggagaca gaagatccgg aagtatacga tgcgtaggct gctgcaggaa actgagttag 2040
tggagccgct gacgcccagc ggagcaatgc ccaaccaggc tcagatgcgg atcctaaaag 2100
agacggagct aaggaaggtg aaggtgcttg gatcaggagc ttttggcact gtctacaagg 2160
gcatctggat cccagatggg gagaatgtga aaatccccgt ggctatcaag gtgttgagag 2220
aaaacacatc tcctaaagcc aacaaagaaa ttctagatga agcgtatgtg atggctggtg 2280
tgggttctcc gtatgtgtcc cgcctcctgg gcatctgcct gacatccaca gtacagctgg 2340
tgacacagct tatgccctac ggctgccttc tggaccatgt ccgagaacac cgaggtcgcc 2400
taggctccca ggacctgctc aactggtgtg ttcagattgc caaggggatg agctacctgg 2460
aggacgtgcg gcttgtacac agggacctgg ctgcccggaa tgtgctagtc aagagtccca 2520
accacgtcaa gattacagat ttcgggctgg ctcggctgct ggacattgat gagacagagt 2580
accatgcaga tgggggcaag gtgcccatca aatggatggc attggaatct attctcagac 2640
gccggttcac ccatcagagt gatgtgtgga gctatggagt gactgtgtgg gagctgatga 2700
cttttggggc caaaccttac gatggaatcc cagcccggga gatccctgat ttgctggaga 2760
agggagaacg cctacctcag cctccaatct gcaccattga tgtctacatg attatggtca 2820
aatgttggat gattgactct gaatgtcgcc cgagattccg ggagttggtg tcagaatttt 2880
cacgtatggc gagggacccc cagcgttttg tggtcatcca gaacgaggac ttgggcccat 2940
ccagccccat ggacagtacc ttctaccgtt cactgctgga agatgatgac atgggtgacc 3000
tggtagacgc tgaagagtat ctggtgcccc agcagggatt cttctccccg gaccctaccc 3060
caggcactgg gagcacagcc catagaaggc accgcagctc gtccaccagg agtggaggtg 3120
gtgagctgac actgggcctg gagccctcgg aagaagggcc ccccagatct ccactggctc 3180
cctcggaagg ggctggctcc gatgtgtttg atggtgacct ggcaatgggg gtaaccaaag 3240
ggctgcagag cctctctcca catgacctca gccctctaca gcggtacagc gaggacccca 3300
cattacctct gccccccgag actgatggct atgttgctcc cctggcctgc agcccccagc 3360
ccgagtatgt gaaccaatca gaggttcagc ctcagcctcc tttaacccca gagggtcctc 3420
tgcctcctgt ccggcctgct ggtgctactc tagaaagacc caagactctc tctcctggga 3480
agaatggggt tgtcaaagac gtttttgcct tcgggggtgc tgtggagaac cctgaatact 3540
tagtaccgag agaaggcact gcctctccgc cccacccttc tcctgccttc agcccagcct 3600
ttgacaacct ctattactgg gaccagaact catcggagca ggggcctcca ccaagtaact 3660
ttgaagggac ccccactgca gagaaccctg agtacctagg cctggatgta cctgta 3716
<210> 46
<211> 360
<212> DNA
<213> 褐家鼠
<400> 46
cccaggcaga accccagagg ggctgcggga gctgcagctt cgaagtctca cagagatcct 60
gaagggagga gttttgatcc gtgggaaccc tcagctctgc taccaggaca tggttttgtg 120
gaaggacgtc ttccgcaaga ataaccaact ggctcctgtc gatatagaca ccaatcgttc 180
ccgggcctgt ccaccttgtg cccccgcctg caaagacaat cactgttggg gtgagagtcc 240
ggaagactgt cagatcttga ctggcaccat ctgtaccagt ggttgtgccc ggtgcaaggg 300
ccggctgccc actgactgct gccatgagca gtgtgccgca ggctgcacgg gccccaagca 360
<210> 47
<211> 618
<212> DNA
<213> 褐家鼠
<400> 47
ggtcacagct gaggacggaa cacagcgttg tgagaaatgc agcaagccct gtgctcgagt 60
gtgctatggt ctgggcatgg agcaccttcg aggggcgagg gccatcacca gtgacaatgt 120
ccaggagttt gatggctgca agaagatctt tgggagcctg gcatttttgc cggagagctt 180
tgatggggac ccctcctccg gcattgctcc gctgaggcct gagcagctcc aagtgttcga 240
aaccctggag gagatcacag gttacctgta catctcagca tggccagaca gtctccgtga 300
cctcagtgtc ttccagaacc ttcgaatcat tcggggacgg attctccacg atggcgcgta 360
ctcattgaca ctgcaaggcc tggggatcca ctcgctgggg ctgcgctcac tgcgggagct 420
gggcagtgga ttggctctga ttcaccgcaa cgcccatctc tgctttgtac acactgtacc 480
ttgggaccag ctcttccgga acccacatca ggccctgctc cacagtggga accggccgga 540
agaggattgt ggtctcgagg gcttggtctg taactcactg tgtgcccacg ggcactgctg 600
ggggccaggg cccaccca 618
<210> 48
<211> 929
<212> DNA
<213> 褐家鼠
<400> 48
cgcccagcgg agcaatgccc aaccaggctc agatgcggat cctaaaagag acggagctaa 60
ggaaggtgaa ggtgcttgga tcaggagctt ttggcactgt ctacaagggc atctggatcc 120
cagatgggga gaatgtgaaa atccccgtgg ctatcaaggt gttgagagaa aacacatctc 180
ctaaagccaa caaagaaatt ctagatgaag cgtatgtgat ggctggtgtg ggttctccgt 240
atgtgtcccg cctcctgggc atctgcctga catccacagt acagctggtg acacagctta 300
tgccctacgg ctgccttctg gaccatgtcc gagaacaccg aggtcgccta ggctcccagg 360
acctgctcaa ctggtgtgtt cagattgcca aggggatgag ctacctggag gacgtgcggc 420
ttgtacacag ggacctggct gcccggaatg tgctagtcaa gagtcccaac cacgtcaaga 480
ttacagattt cgggctggct cggctgctgg acattgatga gacagagtac catgcagatg 540
ggggcaaggt gcccatcaaa tggatggcat tggaatctat tctcagacgc cggttcaccc 600
atcagagtga tgtgtggagc tatggagtga ctgtgtggga gctgatgact tttggggcca 660
aaccttacga tggaatccca gcccgggaga tccctgattt gctggagaag ggagaacgcc 720
tacctcagcc tccaatctgc accattgatg tctacatgat tatggtcaaa tgttggatga 780
ttgactctga atgtcgcccg agattccggg agttggtgtc agaattttca cgtatggcga 840
gggaccccca gcgttttgtg gtcatccaga acgaggactt gggcccatcc agccccatgg 900
acagtacctt ctaccgttca ctgctggaa 929
<210> 49
<211> 3798
<212> DNA
<213> 智人
<400> 49
atggagctgg cggccttgtg ccgctggggg ctcctcctcg ccctcttgcc ccccggagcc 60
gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagac atgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag 120
acccacctgg acatgctccg ccacctctac cagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg 180
gaactcacct acctgcccac caatgccagc ctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg 240
cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaa gtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg 300
attgtgcgag gcacccagct ctttgaggac aactatgccc tggccgtgct agacaatgga 360
gacccgctga acaataccac ccctgtcaca ggggcctccc caggaggcct gcgggagctg 420
cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaa ggaggggtct tgatccagcg gaacccccag 480
ctctgctacc aggacacgat tttgtggaag gacatcttcc acaagaacaa ccagctggct 540
ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgg gcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag 600
ggctcccgct gctggggaga gagttctgag gattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt 660
gccggtggct gtgcccgctg caaggggcca ctgcccactg actgctgcca tgagcagtgt 720
gctgccggct gcacgggccc caagcactct gactgcctgg cctgcctcca cttcaaccac 780
agtggcatct gtgagctgca ctgcccagcc ctggtcacct acaacacaga cacgtttgag 840
tccatgccca atcccgaggg ccggtataca ttcggcgcca gctgtgtgac tgcctgtccc 900
tacaactacc tttctacgga cgtgggatcc tgcaccctcg tctgccccct gcacaaccaa 960
gaggtgacag cagaggatgg aacacagcgg tgtgagaagt gcagcaagcc ctgtgcccga 1020
gtgtgctatg gtctgggcat ggagcacttg cgagaggtga gggcagttac cagtgccaat 1080
atccaggagt ttgctggctg caagaagatc tttgggagcc tggcatttct gccggagagc 1140
tttgatgggg acccagcctc caacactgcc ccgctccagc cagagcagct ccaagtgttt 1200
gagactctgg aagagatcac aggttaccta tacatctcag catggccgga cagcctgcct 1260
gacctcagcg tcttccagaa cctgcaagta atccggggac gaattctgca caatggcgcc 1320
tactcgctga ccctgcaagg gctgggcatc agctggctgg ggctgcgctc actgagggaa 1380
ctgggcagtg gactggccct catccaccat aacacccacc tctgcttcgt gcacacggtg 1440
ccctgggacc agctctttcg gaacccgcac caagctctgc tccacactgc caaccggcca 1500
gaggacgagt gtgtgggcga gggcctggcc tgccaccagc tgtgcgcccg agggcactgc 1560
tggggtccag ggcccaccca gtgtgtcaac tgcagccagt tccttcgggg ccaggagtgc 1620
gtggaggaat gccgagtact gcaggggctc cccagggagt atgtgaatgc caggcactgt 1680
ttgccgtgcc accctgagtg tcagccccag aatggctcag tgacctgttt tggaccggag 1740
gctgaccagt gtgtggcctg tgcccactat aaggaccctc ccttctgcgt ggcccgctgc 1800
cccagcggtg tgaaacctga cctctcctac atgcccatct ggaagtttcc agatgaggag 1860
ggcgcatgcc agccttgccc catcaactgc acccactcct gtgtggacct ggatgacaag 1920
ggctgccccg ccgagcagag agccagccct ctgacgtcca tcgtctctgc ggtggttggc 1980
attctgctgg tcgtggtctt gggggtggtc tttgggatcc tcatcaagcg acggcagcag 2040
aagatccgga agtacacgat gcggagactg ctgcaggaaa cggagctggt ggagccgctg 2100
acacctagcg gagcgatgcc caaccaggcg cagatgcgga tcctgaaaga gacggagctg 2160
aggaaggtga aggtgcttgg atctggcgct tttggcacag tctacaaggg catctggatc 2220
cctgatgggg agaatgtgaa aattccagtg gccatcaaag tgttgaggga aaacacatcc 2280
cccaaagcca acaaagaaat cttagacgaa gcatacgtga tggctggtgt gggctcccca 2340
tatgtctccc gccttctggg catctgcctg acatccacgg tgcagctggt gacacagctt 2400
atgccctatg gctgcctctt agaccatgtc cgggaaaacc gcggacgcct gggctcccag 2460
gacctgctga actggtgtat gcagattgcc aaggggatga gctacctgga ggatgtgcgg 2520
ctcgtacaca gggacttggc cgctcggaac gtgctggtca agagtcccaa ccatgtcaaa 2580
attacagact tcgggctggc tcggctgctg gacattgacg agacagagta ccatgcagat 2640
gggggcaagg tgcccatcaa gtggatggcg ctggagtcca ttctccgccg gcggttcacc 2700
caccagagtg atgtgtggag ttatggtgtg actgtgtggg agctgatgac ttttggggcc 2760
aaaccttacg atgggatccc agcccgggag atccctgacc tgctggaaaa gggggagcgg 2820
ctgccccagc cccccatctg caccattgat gtctacatga tcatggtcaa atgttggatg 2880
attgactctg aatgtcggcc aagattccgg gagttggtgt ctgaattctc ccgcatggcc 2940
agggaccccc agcgctttgt ggtcatccag aatgaggact tgggcccagc cagtcccttg 3000
gacagcacct tctaccgctc actgctggag gacgatgaca tgggggacct ggtggatgct 3060
gaggagtatc tggtacccca gcagggcttc ttctgtccag accctgcccc gggcgctggg 3120
ggcatggtcc accacaggca ccgcagctca tctaccagga gtggcggtgg ggacctgaca 3180
ctagggctgg agccctctga agaggaggcc cccaggtctc cactggcacc ctccgaaggg 3240
gctggctccg atgtatttga tggtgacctg ggaatggggg cagccaaggg gctgcaaagc 3300
ctccccacac atgaccccag ccctctacag cggtacagtg aggaccccac agtacccctg 3360
ccctctgaga ctgatggcta cgttgccccc ctgacctgca gcccccagcc tgaatatgtg 3420
aaccagccag atgttcggcc ccagccccct tcgccccgag agggccctct gcctgctgcc 3480
cgacctgctg gtgccactct ggaaagggcc aagactctct ccccagggaa gaatggggtc 3540
gtcaaagacg tttttgcctt tgggggtgcc gtggagaacc ccgagtactt gacaccccag 3600
ggaggagctg cccctcagcc ccaccctcct cctgccttca gcccagcctt cgacaacctc 3660
tattactggg accaggaccc accagagcgg ggggctccac ccagcacctt caaagggaca 3720
cctacggcag agaacccaga gtacctgggt ctggacgtgc cagtgtgaac cagaaggcca 3780
agtccgcaga agccctga 3798
<210> 50
<211> 393
<212> DNA
<213> 智人
<400> 50
gagacccacc tggacatgct ccgccacctc taccagggct gccaggtggt gcagggaaac 60
ctggaactca cctacctgcc caccaatgcc agcctgtcct tcctgcagga tatccaggag 120
gtgcagggct acgtgctcat cgctcacaac caagtgaggc aggtcccact gcagaggctg 180
cggattgtgc gaggcaccca gctctttgag gacaactatg ccctggccgt gctagacaat 240
ggagacccgc tgaacaatac cacccctgtc acaggggcct ccccaggagg cctgcgggag 300
ctgcagcttc gaagcctcac agagatcttg aaaggagggg tcttgatcca gcggaacccc 360
cagctctgct accaggacac gattttgtgg aag 393
<210> 51
<211> 477
<212> DNA
<213> 智人
<400> 51
aatatccagg agtttgctgg ctgcaagaag atctttggga gcctggcatt tctgccggag 60
agctttgatg gggacccagc ctccaacact gccccgctcc agccagagca gctccaagtg 120
tttgagactc tggaagagat cacaggttac ctatacatct cagcatggcc ggacagcctg 180
cctgacctca gcgtcttcca gaacctgcaa gtaatccggg gacgaattct gcacaatggc 240
gcctactcgc tgaccctgca agggctgggc atcagctggc tggggctgcg ctcactgagg 300
gaactgggca gtggactggc cctcatccac cataacaccc acctctgctt cgtgcacacg 360
gtgccctggg accagctctt tcggaacccg caccaagctc tgctccacac tgccaaccgg 420
ccagaggacg agtgtgtggg cgagggcctg gcctgccacc agctgtgcgc ccgaggg 477
<210> 52
<211> 391
<212> DNA
<213> 智人
<400> 52
cagcagaaga tccggaagta cacgatgcgg agactgctgc aggaaacgga gctggtggag 60
ccgctgacac ctagcggagc gatgcccaac caggcgcaga tgcggatcct gaaagagacg 120
gagctgagga aggtgaaggt gcttggatct ggcgcttttg gcacagtcta caagggcatc 180
tggatccctg atggggagaa tgtgaaaatt ccagtggcca tcaaagtgtt gagggaaaac 240
acatccccca aagccaacaa agaaatctta gacgaagcat acgtgatggc tggtgtgggc 300
tccccatatg tctcccgcct tctgggcatc tgcctgacat ccacggtgca gctggtgaca 360
cagcttatgc cctatggctg cctcttagac t 391
<210> 53
<211> 7075
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAdv164序列（7075个碱基对）
<400> 53
cggagtgtat actggcttac tatgttggca ctgatgaggg tgtcagtgaa gtgcttcatg 60
tggcaggaga aaaaaggctg caccggtgcg tcagcagaat atgtgataca ggatatattc 120
cgcttcctcg ctcactgact cgctacgctc ggtcgttcga ctgcggcgag cggaaatggc 180
ttacgaacgg ggcggagatt tcctggaaga tgccaggaag atacttaaca gggaagtgag 240
agggccgcgg caaagccgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacaagca tcacgaaatc 300
tgacgctcaa atcagtggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 360
cctggcggct ccctcgtgcg ctctcctgtt cctgcctttc ggtttaccgg tgtcattccg 420
ctgttatggc cgcgtttgtc tcattccacg cctgacactc agttccgggt aggcagttcg 480
ctccaagctg gactgtatgc acgaaccccc cgttcagtcc gaccgctgcg ccttatccgg 540
taactatcgt cttgagtcca acccggaaag acatgcaaaa gcaccactgg cagcagccac 600
tggtaattga tttagaggag ttagtcttga agtcatgcgc cggttaaggc taaactgaaa 660
ggacaagttt tggtgactgc gctcctccaa gccagttacc tcggttcaaa gagttggtag 720
ctcagagaac cttcgaaaaa ccgccctgca aggcggtttt ttcgttttca gagcaagaga 780
ttacgcgcag accaaaacga tctcaagaag atcatcttat taatcagata aaatatttct 840
agccctcctt tgattagtat attcctatct taaagttact tttatgtgga ggcattaaca 900
tttgttaatg acgtcaaaag gatagcaaga ctagaataaa gctataaagc aagcatataa 960
tattgcgttt catctttaga agcgaatttc gccaatatta taattatcaa aagagagggg 1020
tggcaaacgg tatttggcat tattaggtta aaaaatgtag aaggagagtg aaacccatga 1080
aaaaaataat gctagttttt attacactta tattagttag tctaccaatt gcgcaacaaa 1140
ctgaagcaaa ggatgcatct gcattcaata aagaaaattc aatttcatcc atggcaccac 1200
cagcatctcc gcctgcaagt cctaagacgc caatcgaaaa gaaacacgcg gatgaaatcg 1260
ataagtatat acaaggattg gattacaata aaaacaatgt attagtatac cacggagatg 1320
cagtgacaaa tgtgccgcca agaaaaggtt acaaagatgg aaatgaatat attgttgtgg 1380
agaaaaagaa gaaatccatc aatcaaaata atgcagacat tcaagttgtg aatgcaattt 1440
cgagcctaac ctatccaggt gctctcgtaa aagcgaattc ggaattagta gaaaatcaac 1500
cagatgttct ccctgtaaaa cgtgattcat taacactcag cattgatttg ccaggtatga 1560
ctaatcaaga caataaaata gttgtaaaaa atgccactaa atcaaacgtt aacaacgcag 1620
taaatacatt agtggaaaga tggaatgaaa aatatgctca agcttatcca aatgtaagtg 1680
caaaaattga ttatgatgac gaaatggctt acagtgaatc acaattaatt gcgaaatttg 1740
gtacagcatt taaagctgta aataatagct tgaatgtaaa cttcggcgca atcagtgaag 1800
ggaaaatgca agaagaagtc attagtttta aacaaattta ctataacgtg aatgttaatg 1860
aacctacaag accttccaga tttttcggca aagctgttac taaagagcag ttgcaagcgc 1920
ttggagtgaa tgcagaaaat cctcctgcat atatctcaag tgtggcgtat ggccgtcaag 1980
tttatttgaa attatcaact aattcccata gtactaaagt aaaagctgct tttgatgctg 2040
ccgtaagcgg aaaatctgtc tcaggtgatg tagaactaac aaatatcatc aaaaattctt 2100
ccttcaaagc cgtaatttac ggaggttccg caaaagatga agttcaaatc atcgacggca 2160
acctcggaga cttacgcgat attttgaaaa aaggcgctac ttttaatcga gaaacaccag 2220
gagttcccat tgcttataca acaaacttcc taaaagacaa tgaattagct gttattaaaa 2280
acaactcaga atatattgaa acaacttcaa aagcttatac agatggaaaa attaacatcg 2340
atcactctgg aggatacgtt gctcaattca acatttcttg ggatgaagta aattatgatc 2400
tcgagaccca cctggacatg ctccgccacc tctaccaggg ctgccaggtg gtgcagggaa 2460
acctggaact cacctacctg cccaccaatg ccagcctgtc cttcctgcag gatatccagg 2520
aggtgcaggg ctacgtgctc atcgctcaca accaagtgag gcaggtccca ctgcagaggc 2580
tgcggattgt gcgaggcacc cagctctttg aggacaacta tgccctggcc gtgctagaca 2640
atggagaccc gctgaacaat accacccctg tcacaggggc ctccccagga ggcctgcggg 2700
agctgcagct tcgaagcctc acagagatct tgaaaggagg ggtcttgatc cagcggaacc 2760
cccagctctg ctaccaggac acgattttgt ggaagaatat ccaggagttt gctggctgca 2820
agaagatctt tgggagcctg gcatttctgc cggagagctt tgatggggac ccagcctcca 2880
acactgcccc gctccagcca gagcagctcc aagtgtttga gactctggaa gagatcacag 2940
gttacctata catctcagca tggccggaca gcctgcctga cctcagcgtc ttccagaacc 3000
tgcaagtaat ccggggacga attctgcaca atggcgccta ctcgctgacc ctgcaagggc 3060
tgggcatcag ctggctgggg ctgcgctcac tgagggaact gggcagtgga ctggccctca 3120
tccaccataa cacccacctc tgcttcgtgc acacggtgcc ctgggaccag ctctttcgga 3180
acccgcacca agctctgctc cacactgcca accggccaga ggacgagtgt gtgggcgagg 3240
gcctggcctg ccaccagctg tgcgcccgag ggcagcagaa gatccggaag tacacgatgc 3300
ggagactgct gcaggaaacg gagctggtgg agccgctgac acctagcgga gcgatgccca 3360
accaggcgca gatgcggatc ctgaaagaga cggagctgag gaaggtgaag gtgcttggat 3420
ctggcgcttt tggcacagtc tacaagggca tctggatccc tgatggggag aatgtgaaaa 3480
ttccagtggc catcaaagtg ttgagggaaa acacatcccc caaagccaac aaagaaatct 3540
tagacgaagc atacgtgatg gctggtgtgg gctccccata tgtctcccgc cttctgggca 3600
tctgcctgac atccacggtg cagctggtga cacagcttat gccctatggc tgcctcttag 3660
actaatctag acccgggcca ctaactcaac gctagtagtg gatttaatcc caaatgagcc 3720
aacagaacca gaaccagaaa cagaacaagt aacattggag ttagaaatgg aagaagaaaa 3780
aagcaatgat ttcgtgtgaa taatgcacga aatcattgct tattttttta aaaagcgata 3840
tactagatat aacgaaacaa cgaactgaat aaagaataca aaaaaagagc cacgaccagt 3900
taaagcctga gaaactttaa ctgcgagcct taattgatta ccaccaatca attaaagaag 3960
tcgagaccca aaatttggta aagtatttaa ttactttatt aatcagatac ttaaatatct 4020
gtaaacccat tatatcgggt ttttgagggg atttcaagtc tttaagaaga taccaggcaa 4080
tcaattaaga aaaacttagt tgattgcctt ttttgttgtg attcaacttt gatcgtagct 4140
tctaactaat taattttcgt aagaaaggag aacagctgaa tgaatatccc ttttgttgta 4200
gaaactgtgc ttcatgacgg cttgttaaag tacaaattta aaaatagtaa aattcgctca 4260
atcactacca agccaggtaa aagtaaaggg gctatttttg cgtatcgctc aaaaaaaagc 4320
atgattggcg gacgtggcgt tgttctgact tccgaagaag cgattcacga aaatcaagat 4380
acatttacgc attggacacc aaacgtttat cgttatggta cgtatgcaga cgaaaaccgt 4440
tcatacacta aaggacattc tgaaaacaat ttaagacaaa tcaatacctt ctttattgat 4500
tttgatattc acacggaaaa agaaactatt tcagcaagcg atattttaac aacagctatt 4560
gatttaggtt ttatgcctac gttaattatc aaatctgata aaggttatca agcatatttt 4620
gttttagaaa cgccagtcta tgtgacttca aaatcagaat ttaaatctgt caaagcagcc 4680
aaaataatct cgcaaaatat ccgagaatat tttggaaagt ctttgccagt tgatctaacg 4740
tgcaatcatt ttgggattgc tcgtatacca agaacggaca atgtagaatt ttttgatccc 4800
aattaccgtt attctttcaa agaatggcaa gattggtctt tcaaacaaac agataataag 4860
ggctttactc gttcaagtct aacggtttta agcggtacag aaggcaaaaa acaagtagat 4920
gaaccctggt ttaatctctt attgcacgaa acgaaatttt caggagaaaa gggtttagta 4980
gggcgcaata gcgttatgtt taccctctct ttagcctact ttagttcagg ctattcaatc 5040
gaaacgtgcg aatataatat gtttgagttt aataatcgat tagatcaacc cttagaagaa 5100
aaagaagtaa tcaaaattgt tagaagtgcc tattcagaaa actatcaagg ggctaatagg 5160
gaatacatta ccattctttg caaagcttgg gtatcaagtg atttaaccag taaagattta 5220
tttgtccgtc aagggtggtt taaattcaag aaaaaaagaa gcgaacgtca acgtgttcat 5280
ttgtcagaat ggaaagaaga tttaatggct tatattagcg aaaaaagcga tgtatacaag 5340
ccttatttag cgacgaccaa aaaagagatt agagaagtgc taggcattcc tgaacggaca 5400
ttagataaat tgctgaaggt actgaaggcg aatcaggaaa ttttctttaa gattaaacca 5460
ggaagaaatg gtggcattca acttgctagt gttaaatcat tgttgctatc gatcattaaa 5520
ttaaaaaaag aagaacgaga aagctatata aaggcgctga cagcttcgtt taatttagaa 5580
cgtacattta ttcaagaaac tctaaacaaa ttggcagaac gccccaaaac ggacccacaa 5640
ctcgatttgt ttagctacga tacaggctga aaataaaacc cgcactatgc cattacattt 5700
atatctatga tacgtgtttg tttttctttg ctggctagct taattgctta tatttacctg 5760
caataaagga tttcttactt ccattatact cccattttcc aaaaacatac ggggaacacg 5820
ggaacttatt gtacaggcca cctcatagtt aatggtttcg agccttcctg caatctcatc 5880
catggaaata tattcatccc cctgccggcc tattaatgtg acttttgtgc ccggcggata 5940
ttcctgatcc agctccacca taaattggtc catgcaaatt cggccggcaa ttttcaggcg 6000
ttttcccttc acaaggatgt cggtcccttt caattttcgg agccagccgt ccgcatagcc 6060
tacaggcacc gtcccgatcc atgtgtcttt ttccgctgtg tactcggctc cgtagctgac 6120
gctctcgcct tttctgatca gtttgacatg tgacagtgtc gaatgcaggg taaatgccgg 6180
acgcagctga aacggtatct cgtccgacat gtcagcagac gggcgaaggc catacatgcc 6240
gatgccgaat ctgactgcat taaaaaagcc ttttttcagc cggagtccag cggcgctgtt 6300
cgcgcagtgg accattagat tctttaacgg cagcggagca atcagctctt taaagcgctc 6360
aaactgcatt aagaaatagc ctctttcttt ttcatccgct gtcgcaaaat gggtaaatac 6420
ccctttgcac tttaaacgag ggttgcggtc aagaattgcc atcacgttct gaacttcttc 6480
ctctgttttt acaccaagtc tgttcatccc cgtatcgacc ttcagatgaa aatgaagaga 6540
accttttttc gtgtggcggg ctgcctcctg aagccattca acagaataac ctgttaaggt 6600
cacgtcatac tcagcagcga ttgccacata ctccggggga accgcgccaa gcaccaatat 6660
aggcgccttc aatccctttt tgcgcagtga aatcgcttca tccaaaatgg ccacggccaa 6720
gcatgaagca cctgcgtcaa gagcagcctt tgctgtttct gcatcaccat gcccgtaggc 6780
gtttgctttc acaactgcca tcaagtggac atgttcaccg atatgttttt tcatattgct 6840
gacattttcc tttatcgcgg acaagtcaat ttccgcccac gtatctctgt aaaaaggttt 6900
tgtgctcatg gaaaactcct ctcttttttc agaaaatccc agtacgtaat taagtatttg 6960
agaattaatt ttatattgat taatactaag tttacccagt tttcacctaa aaaacaaatg 7020
atgagataat agctccaaag gctaaagagg actataccaa ctatttgtta attaa 7075
<210> 54
<211> 921
<212> DNA
<213> 智人
<400> 54
gccgcgagca cccaagtgtg caccggcaca gacatgaagc tgcggctccc tgccagtccc 60
gagacccacc tggacatgct ccgccacctc taccagggct gccaggtggt gcagggaaac 120
ctggaactca cctacctgcc caccaatgcc agcctgtcct tcctgcagga tatccaggag 180
gtgcagggct acgtgctcat cgctcacaac caagtgaggc aggtcccact gcagaggctg 240
cggattgtgc gaggcaccca gctctttgag gacaactatg ccctggccgt gctagacaat 300
ggagacccgc tgaacaatac cacccctgtc acaggggcct ccccaggagg cctgcgggag 360
ctgcagcttc gaagcctcac agagatcttg aaaggagggg tcttgatcca gcggaacccc 420
cagctctgct accaggacac gattttgtgg aaggacatct tccacaagaa caaccagctg 480
gctctcacac tgatagacac caaccgctct cgggcctgcc acccctgttc tccgatgtgt 540
aagggctccc gctgctgggg agagagttct gaggattgtc agagcctgac gcgcactgtc 600
tgtgccggtg gctgtgcccg ctgcaagggg ccactgccca ctgactgctg ccatgagcag 660
tgtgctgccg gctgcacggg ccccaagcac tctgactgcc tggcctgcct ccacttcaac 720
cacagtggca tctgtgagct gcactgccca gccctggtca cctacaacac agacacgttt 780
gagtccatgc ccaatcccga gggccggtat acattcggcg ccagctgtgt gactgcctgt 840
ccctacaact acctttctac ggacgtggga tcctgcaccc tcgtctgccc cctgcacaac 900
caagaggtga cagcagagga t 921
<210> 55
<211> 597
<212> DNA
<213> 智人
<400> 55
tacctttcta cggacgtggg atcctgcacc ctcgtctgcc ccctgcacaa ccaagaggtg 60
acagcagagg atggaacaca gcggtgtgag aagtgcagca agccctgtgc ccgagtgtgc 120
tatggtctgg gcatggagca cttgcgagag gtgagggcag ttaccagtgc caatatccag 180
gagtttgctg gctgcaagaa gatctttggg agcctggcat ttctgccgga gagctttgat 240
ggggacccag cctccaacac tgccccgctc cagccagagc agctccaagt gtttgagact 300
ctggaagaga tcacaggtta cctatacatc tcagcatggc cggacagcct gcctgacctc 360
agcgtcttcc agaacctgca agtaatccgg ggacgaattc tgcacaatgg cgcctactcg 420
ctgaccctgc aagggctggg catcagctgg ctggggctgc gctcactgag ggaactgggc 480
agtggactgg ccctcatcca ccataacacc cacctctgct tcgtgcacac ggtgccctgg 540
gaccagctct ttcggaaccc gcaccaagct ctgctccaca ctgccaaccg gccagag 597
<210> 56
<211> 1209
<212> DNA
<213> 智人
<400> 56
cagcagaaga tccggaagta cacgatgcgg agactgctgc aggaaacgga gctggtggag 60
ccgctgacac ctagcggagc gatgcccaac caggcgcaga tgcggatcct gaaagagacg 120
gagctgagga aggtgaaggt gcttggatct ggcgcttttg gcacagtcta caagggcatc 180
tggatccctg atggggagaa tgtgaaaatt ccagtggcca tcaaagtgtt gagggaaaac 240
acatccccca aagccaacaa agaaatctta gacgaagcat acgtgatggc tggtgtgggc 300
tccccatatg tctcccgcct tctgggcatc tgcctgacat ccacggtgca gctggtgaca 360
cagcttatgc cctatggctg cctcttagac catgtccggg aaaaccgcgg acgcctgggc 420
tcccaggacc tgctgaactg gtgtatgcag attgccaagg ggatgagcta cctggaggat 480
gtgcggctcg tacacaggga cttggccgct cggaacgtgc tggtcaagag tcccaaccat 540
gtcaaaatta cagacttcgg gctggctcgg ctgctggaca ttgacgagac agagtaccat 600
gcagatgggg gcaaggtgcc catcaagtgg atggcgctgg agtccattct ccgccggcgg 660
ttcacccacc agagtgatgt gtggagttat ggtgtgactg tgtgggagct gatgactttt 720
ggggccaaac cttacgatgg gatcccagcc cgggagatcc ctgacctgct ggaaaagggg 780
gagcggctgc cccagccccc catctgcacc attgatgtct acatgatcat ggtcaaatgt 840
tggatgattg actctgaatg tcggccaaga ttccgggagt tggtgtctga attctcccgc 900
atggccaggg acccccagcg ctttgtggtc atccagaatg aggacttggg cccagccagt 960
cccttggaca gcaccttcta ccgctcactg ctggaggacg atgacatggg ggacctggtg 1020
gatgctgagg agtatctggt accccagcag ggcttcttct gtccagaccc tgccccgggc 1080
gctgggggca tggtccacca caggcaccgc agctcatcta ccaggagtgg cggtggggac 1140
ctgacactag ggctggagcc ctctgaagag gaggccccca ggtctccact ggcaccctcc 1200
gaaggggct 1209
<210> 57
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2-嵌合体(F)
<400> 57
tgatctcgag acccacctgg acatgctc 28
<210> 58
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HerEC1-EC2F（连接）
<400> 58
ctaccaggac acgattttgt ggaagaatat ccaggagttt gctggctgc 49
<210> 59
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HerEC1-EC2R（连接）
<400> 59
gcagccagca aactcctgga tattcttcca caaaatcgtg tcctggtag 49
<210> 60
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HerEC2-ICIF（连接）
<400> 60
ctgccaccag ctgtgcgccc gagggcagca gaagatccgg aagtacacga 50
<210> 61
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HerEC2-ICIR（连接）
<400> 61
tcgtgtactt ccggatcttc tgctgccctc gggcgcacag ctggtggcag 50
<210> 62
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Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu
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Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser
50 55 60
Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu
65 70 75 80
Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp
85 90 95
Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu
100 105 110
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115 120 125
Met Cys Lys
130
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<212> PRT
<213> 家犬
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Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu
1 5 10 15
Ile Ala His Ser Gln Val Arg Gln Ile Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile
20 25 30
Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu
35 40 45
Asp Asn Gly Asp Pro Leu Glu Gly Gly Ile Pro Ala Pro Gly Ala Ala
50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
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130
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 71
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<212> PRT
<213> 家犬
<400> 72
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<213> 智人
<400> 73
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Leu Glu Asp
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<212> PRT
<213> 家犬
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Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu Arg Lys Val
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Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Trp
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65 70 75 80
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Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg Leu Gly Ser
100 105 110
Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly Met Ser Tyr
115 120 125
Leu Glu Asp
130
Claims (89)
1.一种治疗受试者中Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的方法，所述方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，所述重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框的核酸，所述第一开放阅读框编码融合多肽，所述融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，所述核酸还包含第二开放阅读框，所述第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因，并且其中施用所述放射疗法包括施用所述放射疗法至少两次。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Her-2/neu嵌合抗原由SEQ ID NO:2所示的序列编码。
3.根据权利要求1至2所述的方法，其中所述受试者是成人或儿童。
4.根据权利要求1至2所述的方法，其中所述受试者是犬科动物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17个标绘的人MHC I类表位。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17个犬科动物MHC I类表位。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述核酸分子整合进所述李斯特菌基因组。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述核酸分子在所述重组减毒李斯特菌菌株的质粒中，并且其中所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定维持在所述重组减毒李斯特菌菌株中。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌包含actA毒力基因中的缺失。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述另外的多肽选自：a)非溶血LLO蛋白或N-末端片段、b)PEST序列或c)ActA片段。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第二开放阅读框编码的所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中在施用所述重组减毒李斯特菌菌株之前施用所述放射疗法。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述放射疗法以每次8Gy总共16Gy的剂量连续施用2天。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述重组减毒李斯特菌菌株为ADXS31-164。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述重组减毒李斯特菌以3.3×109个CFU每次施用的剂量施用多次。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述重组减毒李斯特菌每3周施用一次至最多8次。
17.根据权利要求15至16所述的方法，还包括施用加强治疗。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述加强治疗每两个月施用一次。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述重组减毒李斯特菌菌株与独立的佐剂一起施用，其中所述佐剂包括粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂草苷QS21、单磷酰脂质A或未经甲基化的含CpG寡核苷酸。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述肿瘤生长或癌症为复发或转移。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述癌症为骨肉瘤。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述转移为肺转移性疾病。
23.一种引起受试者中针对Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症增强的免疫应答的方法，所述方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，所述重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框的核酸，所述第一开放阅读框编码融合多肽，所述融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，所述核酸还包含第二开放阅读框，所述第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因，并且其中施用所述放射疗法包括施用所述放射疗法至少两次。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述Her-2/neu嵌合抗原由SEQ ID NO:2所示的序列编码。
25.根据权利要求23至24所述的方法，其中所述受试者是成人或儿童。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述受试者是犬科动物。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的方法，其中所述Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17个标绘的人MHC I类表位。
28.根据权利要求23或26所述的方法，其中所述Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17个犬科动物MHC I类表位。
29.根据权利要求23至28中任一项所述的方法，其中所述核酸分子整合进所述李斯特菌基因组。
30.根据权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述核酸分子在所述重组减毒李斯特菌菌株的质粒中，并且其中所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定维持在所述重组减毒李斯特菌菌株中。
31.根据权利要求23至30中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌包含actA毒力基因中的缺失。
32.根据权利要求23至31中任一项所述的方法，其中所述另外的多肽选自：a)非溶血LLO蛋白或N-末端片段、b)PEST序列或c)ActA片段。
33.根据权利要求23至32中任一项所述的方法，其中所述第二开放阅读框编码的所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。
34.根据权利要求23至33中任一项所述的方法，其中在施用所述重组减毒李斯特菌菌株之前施用所述放射疗法。
35.根据权利要求23至34中任一项所述的方法，其中所述放射疗法以每次8Gy总共16Gy的剂量连续施用2天。
36.根据权利要求23至35中任一项所述的方法，其中所述重组减毒李斯特菌菌株为ADXS31-164。
37.根据权利要求23至36中任一项所述的方法，其中所述重组减毒李斯特菌以3.3×109个CFU每次施用的剂量施用多次。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述重组减毒李斯特菌每3周施用一次至最多8次。
39.根据权利要求37至38所述的方法，还包括施用加强治疗。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述加强治疗每两个月施用一次。
41.根据权利要求23至40中任一项所述的方法，其中所述重组减毒李斯特菌菌株与独立的佐剂一起施用，其中所述佐剂包括粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂草苷QS21、单磷酰脂质A或未经甲基化的含CpG寡核苷酸。
42.根据权利要求23至41中任一项所述的方法，其中所述肿瘤生长或癌症为复发或转移。
43.根据权利要求23至42中任一项所述的方法，其中所述癌症为骨肉瘤。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述转移为肺转移性疾病。
45.根据权利要求23至44所述的方法，其中所述引起增强的免疫应答导致Her-2/neu特异性T细胞应答增强。
46.一种延长患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的受试者的存活期的方法，所述方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，所述重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，所述第一开放阅读框编码融合多肽，所述融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，所述第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因，并且其中施用所述放射疗法包括施用所述放射疗法至少两次。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述Her-2/neu嵌合抗原由SEQ ID NO:2所示的序列编码。
48.根据权利要求46至47所述的方法，其中所述受试者是成人或儿童。
49.根据权利要求46至47所述的方法，其中所述受试者是犬科动物。
50.根据权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17个标绘的人MHC I类表位。
51.根据权利要求46所述的方法，其中所述Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17个犬科动物MHC I类表位。
52.根据权利要求46至51中任一项所述的方法，其中所述核酸分子整合进所述李斯特菌基因组。
53.根据权利要求46至51中任一项所述的方法，其中所述核酸分子在所述重组减毒李斯特菌菌株的质粒中，并且其中所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定维持在所述重组减毒李斯特菌菌株中。
54.根据权利要求46至53中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌包含actA毒力基因中的缺失。
55.根据权利要求46至54中任一项所述的方法，其中所述另外的多肽选自：a)非溶血LLO蛋白或N-末端片段、b)PEST序列或c)ActA片段。
56.根据权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述第二开放阅读框编码的所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。
57.根据权利要求46至56中任一项所述的方法，其中在施用所述重组减毒李斯特菌菌株之前施用所述放射疗法。
58.根据权利要求46至57中任一项所述的方法，其中所述放射疗法以每次8Gy总共16Gy的剂量连续施用2天。
59.根据权利要求46至58中任一项所述的方法，其中所述重组减毒李斯特菌菌株为ADXS31-164。
60.根据权利要求46至59中任一项所述的方法，其中所述重组减毒李斯特菌以3.3×109个CFU每次施用的剂量施用多次。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述重组减毒李斯特菌每3周施用一次至最多8次。
62.根据权利要求60至61所述的方法，还包括施用加强治疗。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述加强治疗每两个月施用一次。
64.根据权利要求46至63中任一项所述的方法，其中所述重组减毒李斯特菌菌株与独立的佐剂一起施用，其中所述佐剂包括粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂草苷QS21、单磷酰脂质A或未经甲基化的含CpG寡核苷酸。
65.根据权利要求46至64中任一项所述的方法，其中所述肿瘤生长或癌症为复发或转移。
66.根据权利要求46至65中任一项所述的方法，其中所述癌症为骨肉瘤。
67.根据权利要求65所述的方法，其中所述转移为肺转移性疾病。
68.一种延迟患有Her-2/neu表达性肿瘤生长或癌症的受试者中的转移性疾病的方法，所述方法包括施用放射疗法和重组减毒李斯特菌菌株的组合的步骤，所述重组减毒李斯特菌菌株包含含有第一开放阅读框和第二开放阅读框的核酸，所述第一开放阅读框编码融合多肽，所述融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，所述第二开放阅读框编码代谢酶，其中所述代谢酶互补在所述重组减毒李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因，并且其中施用所述放射疗法包括施用所述放射疗法至少两次。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述Her-2/neu嵌合抗原由SEQ ID NO:2所示的序列编码。
70.根据权利要求68至69所述的方法，其中所述受试者是成人或儿童。
71.根据权利要求68至69所述的方法，其中所述受试者是犬科动物。
72.根据权利要求68至71中任一项所述的方法，其中所述Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17个标绘的人MHC I类表位。
73.根据权利要求68所述的方法，其中所述Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17个犬科动物MHC I类表位。
74.根据权利要求68至73中任一项所述的方法，其中所述核酸分子整合进所述李斯特菌基因组。
75.根据权利要求68至73中任一项所述的方法，其中所述核酸分子在所述重组减毒李斯特菌菌株的质粒中，并且其中所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定维持在所述重组减毒李斯特菌菌株中。
76.根据权利要求68至75中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌包含actA毒力基因中的缺失。
77.根据权利要求68至76中任一项所述的方法，其中所述另外的多肽选自：a)非溶血LLO蛋白或N-末端片段、b)PEST序列或c)ActA片段。
78.根据权利要求68至77中任一项所述的方法，其中所述第二开放阅读框编码的所述代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。
79.根据权利要求68至78中任一项所述的方法，其中在施用所述重组减毒李斯特菌菌株之前施用所述放射疗法。
80.根据权利要求68至79中任一项所述的方法，其中所述放射疗法以每次8Gy总共16Gy的剂量连续施用2天。
81.根据权利要求68至80中任一项所述的方法，其中所述重组减毒李斯特菌菌株为ADXS31-164。
82.根据权利要求68至81中任一项所述的方法，其中所述重组减毒李斯特菌以3.3×109个CFU每次施用的剂量施用多次。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述重组减毒李斯特菌每3周施用一次至最多8次。
84.根据权利要求82至83所述的方法，还包括施用加强治疗。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述加强治疗每两个月施用一次。
86.根据权利要求68至85中任一项所述的方法，其中所述重组减毒李斯特菌菌株与独立的佐剂一起施用，其中所述佐剂包括粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、编码GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂草苷QS21、单磷酰脂质A或未经甲基化的含CpG寡核苷酸。
87.根据权利要求68至86中任一项所述的方法，其中所述肿瘤生长或癌症为复发或转移。
88.根据权利要求68至87中任一项所述的方法，其中所述癌症为骨肉瘤。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述转移为肺转移性疾病。
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