CN103687611A - 基于李斯特菌属的佐剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了使用单核细胞增生李斯特菌作为增强受试者中的免疫应答的佐剂的方法和组合物。

Description

基于李斯特菌属的佐剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年3月11日提交的美国临时专利申请号61/451,651的优先权。本申请另外要求2011年11月7日提交的美国专利申请号13/290,783的优先权，后者是2011年2月7日提交的美国申请号12/993,380的部分继续申请，后者要求2009年5月19日提交的国际申请号PCT/US09/44538的优先权，后者要求2008年5月19日提交的美国临时申请号61/071,792的权益。本申请还要求2011年2月15日提交的美国专利申请号13/027,828的优先权，后者要求2010年2月15日提交的美国临时申请号61/304,701的权益。本申请还要求2011年8月16日提交的美国专利申请号13/210,696的优先权，后者是2010年11月12日提交的美国申请号12/945,386的部分继续申请，后者要求2009年11月11日提交的美国临时申请号61/260,277的权益。这些申请特此通过引用整体并入本文中。

技术领域

本发明提供了使用单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）作为佐剂用于增强受试者中的免疫应答的方法和组合物。

背景技术

佐剂在免疫疗法中具有广泛应用。大多数基于细胞的免疫疗法在提供抗原特异性的治疗之前施用佐剂。通常，这些抗原包括GM-CSF、IL-1、QP-100、钥孔虫戚血蓝蛋白和其它。这些佐剂通常通过静脉内（IV）、肌肉内（IM）、真皮内（ID）或类似的途径全身性地施用。

单核细胞增生李斯特菌(Lm)是细胞内病原体，其主要感染抗原呈递细胞，且已经适应生活在这些细胞的细胞质中。单核细胞增生李斯特菌和它产生的被称作李斯特菌溶血素O(LLO)的蛋白具有强佐剂性能，其与用于基于细胞的免疫疗法的大多数佐剂不同，可以在提供抗原特异性的治疗以后施用。

为了降低受试者的患病频率和由其引起的死亡率，需要快速地升高受试者对任意抗原的免疫应答的方法。本发明提供了通过利用由分泌非溶血性LLO或截短的ActA的活Lm疫苗提供的佐剂性能来升高受试者（诸如成年人和儿童）的免疫应答的方法。

此外，提供了相同的方法，以在受试者中重建免疫应答或促进免疫应答恢复至正常或大约正常水平，所述受试者由于癌症已经经历细胞毒性治疗。

发明内容

在一个实施方案中，本发明涉及在受试者中重建免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用活的减毒的李斯特菌属疫苗株。

在一个实施方案中，本发明涉及在受试者中重建免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用活的减毒的李斯特菌属疫苗株，所述李斯特菌属菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含编码含PEST多肽的第一开放读码框。

在一个实施方案中，本发明涉及在受试者中促进细胞毒性治疗后的免疫应答恢复的方法，所述方法包括给所述受试者施用活的减毒的李斯特菌属疫苗株。

在一个实施方案中，本发明涉及在受试者中促进细胞毒性治疗后的免疫应答恢复的方法，所述方法包括给所述受试者施用活的减毒的李斯特菌属疫苗株。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含编码含PEST多肽的第一开放读码框。

在一个实施方案中，本发明涉及提高疫苗的免疫原性的方法，所述方法包括下述步骤：给受试者共同施用所述疫苗和基于李斯特菌属的佐剂，其中所述基于李斯特菌属的佐剂增强所述疫苗的免疫原性，由此提高所述疫苗的免疫原性。

在一个实施方案中，本发明涉及在受试者中以不依赖于抗原的方式增强对疾病的免疫应答的方法，所述方法包括给所述受试者施用基于李斯特菌属的佐剂。

从下述详细描述实施例和附图将明白本发明的其它特征和优点。但是，应当理解，所述详细描述和具体实施例尽管指出了本发明的优选实施方案，但是仅仅通过例证给出，因为本领域技术人员从该详细描述会明白在本发明的精神和范围内的各种变化和修改。

附图说明

图1是大肠杆菌-李斯特菌属穿梭质粒pGG55(上面)和pTV3(下面)的示意图。CAT(-)：大肠杆菌氯霉素转移酶；CAT(+)：李斯特菌属氯霉素转移酶；Ori Lm：李斯特菌属的复制起点；Ori Ec：大肠杆菌的p15复制起点；prfA：李斯特菌属致病性调节因子A；LLO：C-端截短的李斯特菌溶血素O，包括它的启动子；E7：HPV E7；p60-dal；p60启动子和李斯特菌属dal基因的表达盒。还描绘了选择的限制位点。

图2显示了存在于李斯特菌属菌株EGD的基因组的inlC区域的上游和下游的DNA序列。DNA-up(红色)、inlC基因(蓝色)和DNA-down(黑色)。

图3显示了被克隆进温度敏感的质粒pKSV7中以建立inl C缺失突变体的DNA的序列。用于克隆这些区域的限制性酶位点用大写字母表示且标有下划线。GAATTC-EcoRI、GGATCC-BamHI和CTGCAg-PstI。将EcoRI-PstI插入序列克隆进载体pKSV7中。

图4显示了Lm-dd和Lm-ddD actA菌株的示意图。凝胶显示了使用寡核苷酸1/2和寡核苷酸3/4的PCR产物的大小，所述寡核苷酸使用菌株Lm-dd和Lm-ddΔactA的e染色体DNA作为模板得到。

图5显示了存在于李斯特菌属染色体的actA基因的上游和下游的DNA序列。以斜体字显示的区域含有存在于LmddΔactA菌株中的残余actA序列元件。标有下划线的序列gtcgac代表XhoI的限制位点，其为actA的N-T和C-T区域之间的连接部。

图6描绘了由Lm疫苗株(A)的施用引起的肿瘤消退。圆圈代表原初小鼠，倒三角形代表施用Lmdd-TV3的小鼠，十字叉代表施用Lm-LLOE7的小鼠。

图7显示了肿瘤中MDSC和Treg的减少。在Lm疫苗接种(LmddAPSA和LmddAE7)以后的MDSC(右侧图)和Treg(左侧图)的数目。

图8显示的抑制测定数据证实，在李斯特菌属疫苗接种后，得自TPSA23肿瘤的单核细胞MDSC更少地受到抑制。MDSC的抑制能力的这种变化不是抗原特异性的，因为用PSA-抗原特异性的T细胞以及用非特异性地刺激的T细胞观察到相同的抑制减少。No MDSC组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入MDSC来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。

图9显示的抑制基因测定数据证实，李斯特菌属对脾单核细胞MDSC没有影响，且它们仅以抗原特异性的方式产生抑制。No MDSC组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入MDSC来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。

图10显示的抑制基因测定数据证实，在李斯特菌属疫苗接种后，得自肿瘤的粒细胞MDSC具有降低的抑制T细胞的能力。MDSC的抑制能力的这种变化不是抗原特异性的，因为用PSA-抗原特异性的T细胞以及用非特异性地刺激的T细胞观察到相同的抑制减少。No MDSC组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入MDSC来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。

图11显示的抑制基因测定数据证实，李斯特菌属对脾粒细胞MDSC没有影响，且它们仅以抗原特异性的方式产生抑制。No MDSC组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入MDSC来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。

图12显示的抑制基因测定数据证实，得自肿瘤的Treg仍然是抑制性的。在该肿瘤模型中存在Treg的抑制能力的非抗原特异性的方式的轻微下降。No Treg组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入Treg来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。

图13显示的抑制基因测定数据证实，脾Treg仍然是抑制性的。NoTreg组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入Treg来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。

图14显示的抑制基因测定数据证实，常规CD4+T细胞对细胞分裂没有影响，不论它们存在于小鼠的肿瘤还是脾中。左侧图和右侧图显示了合并的分裂周期。

图15显示的抑制基因测定数据证实，在李斯特菌属疫苗接种后，得自4T1肿瘤的单核细胞MDSC具有降低的抑制能力。MDSC的抑制能力的这种变化不是抗原特异性的，因为用Her2/neu-抗原特异性的T细胞以及用非特异性地刺激的T细胞观察到相同的抑制减少。No MDSC组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入MDSC来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。

图16显示的抑制基因测定数据证实，对脾单核细胞MDSC不存在李斯特菌属特异性的作用。No MDSC组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入MDSC来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。

图17显示的抑制基因测定数据证实，在李斯特菌属疫苗接种后，得自4T1肿瘤的粒细胞MDSC具有降低的抑制能力。MDSC的抑制能力的这种变化不是抗原特异性的，因为用Her2/neu-抗原特异性的T细胞以及用非特异性地刺激的T细胞观察到相同的抑制减少。No MDSC组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入MDSC来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。

图18显示的抑制基因测定数据证实，对脾粒细胞MDSC不存在李斯特菌属特异性的作用。No MDSC组显示了应答者T细胞当不受刺激时分裂的缺乏，且最后一组显示了在没有加入MDSC来抑制分裂时受刺激的细胞的分裂。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。

图19显示的抑制基因测定数据证实，在李斯特菌属疫苗接种后，得自4T1肿瘤的Treg的抑制能力下降。该下降不是抗原特异性的，因为用Her2/neu-特异性的和非特异性的应答者T细胞观察到所述Treg抑制能力变化。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。

图20显示的抑制基因测定数据证实，对脾Treg不存在李斯特菌属特异性的作用。应答者T细胞都能够分裂，不论它们是否是抗原特异性的。左侧图显示了每组的单个细胞分裂周期。右侧图显示了合并的分裂周期。

图21表明，曼森血吸虫（S.mansoni）感染的小鼠中的IFN-γ产生减少。

图22表明，具有慢性血吸虫病的小鼠中的IL-4水平增加。

图23表明，被曼森血吸虫感染的小鼠中的IL-10产生增加。

图24表明，血吸虫感染不会改变针对免疫显性CTL和辅助表位的抗原特异性的疫苗应答。

具体实施方式

新颖的且迄今未开发的用途是，建立没有外源性抗原的、活的减毒的李斯特菌属疫苗株。

新颖的且迄今未开发的用途是，建立没有抗原的、活的减毒的李斯特菌属疫苗株，这使得所述李斯特菌属能够仅分泌非溶血形式的LLO(Lm-LLO)或截短的ActA(Lm-ActA)作为佐剂。本文中提供的发明实现了第一种活佐剂。

在一个实施方案中，本文提供了在受试者中重建免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用活的减毒的李斯特菌属疫苗株。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含编码含PEST多肽的第一开放读码框。

在一个实施方案中，所述李斯特菌属过表达所述含PEST多肽。在另一个实施方案中，所述含PEST多肽是非溶血性LLO蛋白或其免疫原性片段、ActA蛋白或其截短片段、或PEST氨基酸序列。

在一个实施方案中，本文提供了在受试者中促进细胞毒性治疗后的免疫应答恢复的方法，所述方法包括给所述受试者施用活的减毒的李斯特菌属疫苗株。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含编码含PEST多肽的第一开放读码框。

在一个实施方案中，本文提供了提高疫苗的免疫原性的方法，所述方法包括下述步骤：给受试者共同施用所述疫苗和基于李斯特菌属的佐剂，其中所述基于李斯特菌属的佐剂增强所述疫苗的免疫原性，由此提高所述疫苗的免疫原性。

在一个实施方案中，本文提供了在受试者中以不依赖于抗原的方式增强对疾病的免疫应答的方法，所述方法包括给所述受试者施用基于李斯特菌属的佐剂。

在一个实施方案中，本文提供了用于生物工程改造活Lm细菌的组合物和方法，所述活Lm细菌感染特定细胞（包括抗原呈递细胞(APC)、肝巨噬细胞、血管内皮、骨髓和其它）以及诸如实体瘤和脾等结构。在另一个实施方案中，在需要并使用佐剂来刺激免疫应答的情况下，所述活Lm佐剂随后在原位合成和分泌经修饰的LLO片段。在另一个实施方案中，所述活Lm合成ActA。在另一个实施方案中，不同于以前的佐剂，本发明实现了在原位制备佐剂的能力，且不涉及免疫佐剂的全身性施用。

在一个实施方案中，本文提供了在新生儿受试者中引起成年人水平的增强免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用重组李斯特菌属疫苗株。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含编码非溶血性李斯特菌溶血素O(LLO)或ActA的第一开放读码框，其中所述核酸分子还包含编码代谢酶的第二开放读码框，其中所述代谢酶补充在所述重组李斯特菌属菌株的染色体中缺少的内源基因。

在一个实施方案中，本文提供了在受试者中促进细胞毒性治疗后的免疫应答恢复的方法，所述方法包括给所述受试者施用重组李斯特菌属疫苗株。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含编码非溶血性李斯特菌溶血素O或ActA的第一开放读码框，其中所述核酸分子还包含编码代谢酶的第二开放读码框，其中所述代谢酶补充在所述重组李斯特菌属菌株的染色体中缺少的内源基因。在另一个实施方案中，所述受试者是成年人受试者。

佐剂的增加对抗原的免疫应答的能力通常表现为免疫介导的保护的显著增加。例如，体液免疫的增加通常表现为针对抗原产生的抗体的滴度的显著增加，且T-细胞活性的增加通常表现为增加的细胞增殖、增加的细胞因子产生和/或抗原特异性的细胞裂解活性。佐剂也可以改变免疫应答，例如，通过实现针对持久的Th2表型背景的Th1应答。

在一个实施方案中，本发明提供了用于预防疾病、治疗疾病和给人受试者接种疫苗的方法和组合物。

在另一个实施方案中，本发明涉及增强人、新生儿或由于癌症而已经经历细胞毒性治疗的人的免疫应答。

在一个实施方案中，基于李斯特菌属的佐剂表示活的减毒的李斯特菌属疫苗株。在另一个实施方案中，所述基于李斯特菌属的佐剂是Lm-LLO或Lm-ActA。在另一个实施方案中，Lm-LLO表达非溶血性LLO。在另一个实施方案中，Lm-ActA表达截短的ActA蛋白。在另一个实施方案中，Lm-LLO或Lm-ActA可以单独使用，或者与其中佐剂为适当的任意疗法联合使用，且可以用于通常不使用佐剂的场合，诸如化学疗法或放射疗法。

在另一个实施方案中，本文提供的李斯特菌属菌株还包含编码代谢酶的第三开放读码框。

在一个实施方案中，所述代谢酶是氨基酸代谢酶。在另一个实施方案中，所述由第二开放读码框编码的代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。在另一个实施方案中，所述由第三开放读码框编码的代谢酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸转移酶。在另一个实施方案中，所述代谢酶由dal基因编码，而在另一个实施方案中，所述dal基因得自枯草芽孢杆菌。在另一个实施方案中，所述代谢酶由dat基因编码。

在另一个实施方案中，所述重组李斯特菌属是减毒的营养缺陷型菌株。

在一个实施方案中，所述减毒的菌株是Lmdd。在另一个实施方案中，所述减毒的菌株是Lmdda。在另一个实施方案中，所述减毒的菌株是LmΔPrfA。在另一个实施方案中，所述减毒的菌株是LmΔPlcB。在另一个实施方案中，所述减毒的菌株是LmΔPlcA。在另一个实施方案中，所述减毒的菌株是LmddAΔinlC。在另一个实施方案中，所述LmddAΔinlC突变株使用Lm的EGD菌株产生，后者不同于背景菌株10403S，即Lm dal datactA(LmddA)的亲本菌株。在另一个实施方案中，该菌株发挥强佐剂作用，后者是基于李斯特菌属的疫苗的固有性质。在另一个实施方案中，该菌株从EGD李斯特菌属骨架构建得到。

在另一个实施方案中，在本发明中使用的菌株是表达非溶血性LLO的李斯特菌属菌株。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属菌株是prfA突变体、ActA突变体、plcB缺失突变体、或缺少plcA和plcB的双重突变体。所有这些李斯特菌属菌株被涵盖用于本文提供的方法中。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在一个实施方案中，所述LmddAΔinlC突变株可安全地用于人类，并诱导高水平的先天性免疫应答。在一个实施方案中，所述inlC缺失突变体产生非抗原特异性的增强水平的先天性免疫应答。

在一个实施方案中，李斯特菌属向邻近细胞的易位通过2个单独的机制受到抑制：actA和inlC基因（它们二者都涉入该过程）的缺失，由此导致意外高水平的减毒、增加的免疫原性和作为疫苗骨架的实用性。在另一个实施方案中，李斯特菌属向邻近细胞的易位通过2个单独的机制受到抑制：actA或inlC基因（它们二者都涉入该过程）的缺失，由此导致意外高水平的减毒、增加的免疫原性和作为疫苗骨架的实用性。

内化蛋白与增加的毒力有关，且它们的存在与李斯特菌属的增加的免疫原性有关，但是，在本发明中，切除inlC基因会增加本文中提供的李斯特菌属疫苗载体的免疫原性。在另一个实施方案中，本发明提供了下述新颖性：从缺失actA的载体切离inlC基因，由此除去下述两种能力，形成肌动蛋白鞭毛（其为穿过宿主细胞膜移动和进入邻近细胞所必需）的能力，和形成跨膜通道的能力。因此，这2种缺失的组合会产生李斯特菌属疫苗载体与野生型李斯特菌属菌株或单个突变株相比降低的毒力和增加的免疫原性的惊人结果。

在另一个实施方案中，本文提供的核酸分子会整合进李斯特菌属基因组中。在另一个实施方案中，所述核酸分子是在本文也提供的重组李斯特菌属疫苗株的质粒中。在另一个实施方案中，在不存在抗生素选择的情况下，本文提供的质粒会稳定地维持在重组李斯特菌属疫苗株中。在另一个实施方案中，所述质粒不会给所述重组李斯特菌属赋予抗生素抗性。

在一个实施方案中，本文提供的重组李斯特菌属菌株是减毒菌株。在另一个实施方案中，所述重组李斯特菌属缺少ActA毒力基因。在另一个实施方案中，所述重组李斯特菌属缺少PrfA毒力基因。

在另一个实施方案中，所述重组李斯特菌属疫苗株包含佐剂，其中所述佐剂是李斯特菌溶血素O。在另一个实施方案中，所述重组李斯特菌属疫苗株包含佐剂，其中所述佐剂是ActA。

在一个实施方案中，所述李斯特菌属疫苗株是LmddAinlC142菌株。LmddAinlC142是基于这样的李斯特菌属疫苗载体：其由于inlC基因的缺失而减毒，且通过dal基因的互补而保留用于PSA体内和体外表达的质粒。在另一个实施方案中，LmddAinlC142引起强烈的且抗原特异性的抗肿瘤应答，具有破坏受试者中对异种抗原的耐受性的能力。在另一个实施方案中，所述LmddAinlC142菌株是高度减毒的，且具有比以前的李斯特菌属疫苗代更好的安全性谱，因为它更迅速地从被免疫的小鼠的脾清除。在另一个实施方案中，LmddAinlC142菌株是高度免疫原性的，能够破坏对异种抗原的耐受性，并在受试者中防止肿瘤形成。

在另一个实施方案中，本文提供的方法还提供了克服或“破坏”对作为自体抗原的异种抗原的耐受性的方法。这样的抗原可以由多种肿瘤异常地表达，使用本文提供的方法和组合物对所述肿瘤进行在本发明的范围内的治疗或预防。

在一个实施方案中，与其它治疗模式相组合的、表达李斯特菌溶血素O的重组的减毒的不含抗生素的李斯特菌属可用于增强免疫应答，以及用于预防和治疗癌症或实体瘤。在另一个实施方案中，单独的或与其它治疗剂相组合的、表达李斯特菌溶血素O的重组的减毒的不含抗生素的李斯特菌属可用于预防和治疗受试者的感染性疾病。在另一个实施方案中，所述受试者是新生儿、儿童或成年人。

在一个实施方案中，与其它治疗模式相组合的、表达ActA的重组的减毒的不含抗生素的李斯特菌属可用于增强免疫应答，以及用于预防和治疗癌症或实体瘤。在另一个实施方案中，单独的或与其它治疗剂组合的、表达ActA的重组的减毒的不含抗生素的李斯特菌属可用于预防和治疗受试者的感染性疾病。在另一个实施方案中，所述受试者是新生儿、儿童或成年人。

在一个实施方案中，由本文提供的方法和组合物诱导的免疫应答是治疗性免疫应答。在另一个实施方案中，它是预防性免疫应答。在另一个实施方案中，与本领域可用于在罹患本文提供的病症的受试者中诱导免疫应答的方法相比，它是增强的免疫应答。在另一个实施方案中，所述免疫应答会导致折磨受试者的本文提供的疾病的清除。

应当理解，本发明的方法可以用于治疗任何传染性疾病，在一个实施方案中，所述传染性疾病是细菌感染、病毒感染、微生物感染、微小生物感染、致病性感染或它们的组合。在另一个实施方案中，本发明的方法被用于抑制或遏制受试者的细菌感染、病毒感染、微生物感染、微小生物感染、致病性感染或它们的组合。在另一个实施方案中，本发明提供了在受试者中引起针对细菌感染、病毒感染、微生物感染、微小生物感染、致病性感染或它们的组合的细胞毒性的T-细胞应答的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了在Th1无应答的受试者中诱导针对细菌感染、病毒感染、微生物感染、微小生物感染、致病性感染或它们的组合的Th1免疫应答的方法。在一个实施方案中，所述感染是病毒感染，在一个实施方案中，所述病毒是HIV。在一个实施方案中，所述感染是细菌感染，在一个实施方案中，所述细菌是分枝杆菌属，在一个实施方案中，所述细菌感染是结核病。在一个实施方案中，所述感染是真核生物感染，在一个实施方案中，所述真核生物是疟原虫属，在一个实施方案中，所述真核生物感染是疟疾。

在一个实施方案中，本文提供了在具有伴随性蠕虫感染的Th1无应答的受试者中诱导Th1免疫应答的方法，在另一个实施方案中，所述方法包括使用李斯特菌属疫苗载体。

在另一个实施方案中，本文提供了提高疫苗的免疫原性的方法，所述方法包括给受试者共同施用所述疫苗和基于李斯特菌属的佐剂，其中所述基于李斯特菌属的佐剂增强所述疫苗的免疫原性，由此提高所述疫苗的免疫原性。在一个实施方案中，所述方法能够治疗所述疫苗对其具有特异性的疾病。

在一个实施方案中，本文提供了以不依赖于抗原的方式增强对疾病的免疫应答的方法，所述方法包括给受试者施用基于李斯特菌属的佐剂。

在另一个实施方案中，所述基于李斯特菌属的佐剂是表达LLO的李斯特菌属菌株或LLO蛋白或其非溶血片段。在另一个实施方案中，所述基于李斯特菌属的佐剂是表达ActA的李斯特菌属菌株或ActA蛋白或其截短片段。在另一个实施方案中，基于李斯特菌属的佐剂单独使用，或者与其它佐剂相组合。在另一个实施方案中，所述其它佐剂是非核酸佐剂，包括铝佐剂、弗氏佐剂、MPL、乳剂、GM-CSF、QS21、SBAS2，含有CpG的寡核苷酸，编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子，所述佐剂是或包含细菌促分裂原或细菌毒素。在另一个实施方案中，所述LLO蛋白或其溶血片段与所述疫苗混合或者化学偶联。

在一个实施方案中，所述疫苗选自：乙型肝炎病毒血液-衍生的疫苗、乙型肝炎病毒基因工程蛋白疫苗、HBV病毒载体疫苗、乙型肝炎病毒细菌载体疫苗、乙型肝炎病毒转基因植物疫苗、狂犬病病毒血液-衍生的疫苗、狂犬病病毒基因工程蛋白疫苗、狂犬病病毒载体疫苗、狂犬病病毒细菌载体疫苗和狂犬病病毒转基因植物疫苗，且所述DNA疫苗选自：乙型肝炎病毒DNA疫苗和狂犬病DNA疫苗。

在另一个实施方案中，所述基于李斯特菌属的佐剂单独使用，或者与其它佐剂相组合。

在另一个实施方案中，本发明的佐剂与其它佐剂共同施用。在另一个实施方案中，在本发明的方法和组合物中使用的其它佐剂是，在另一个实施方案中，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白。在另一个实施方案中，所述佐剂包含GM-CSF蛋白。在另一个实施方案中，所述佐剂是编码GM-CSF的核苷酸分子。在另一个实施方案中，所述佐剂包含编码GM-CSF的核苷酸分子。在另一个实施方案中，所述佐剂是皂苷QS21。在另一个实施方案中，所述佐剂包含皂苷QS21。在另一个实施方案中，所述佐剂是单磷酰脂质A。在另一个实施方案中，所述佐剂包含单磷酰脂质A。在另一个实施方案中，所述佐剂是SBAS2。在另一个实施方案中，所述佐剂包含SBAS2。在另一个实施方案中，所述佐剂是未甲基化的含有CpG的寡核苷酸。在另一个实施方案中，所述佐剂包含未甲基化的含有CpG的寡核苷酸。在另一个实施方案中，所述佐剂是免疫刺激性细胞因子。在另一个实施方案中，所述佐剂包含免疫刺激性细胞因子。在另一个实施方案中，所述佐剂是编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子。在另一个实施方案中，所述佐剂包含编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子。在另一个实施方案中，所述佐剂是或包含羽管糖苷（quill glycoside）。在另一个实施方案中，所述佐剂是或包含细菌促分裂原。在另一个实施方案中，所述佐剂是或包含细菌毒素。在另一个实施方案中，所述佐剂是或包含本领域已知的任意其它佐剂。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在一个实施方案中，本文提供了核酸分子，其编码本发明的佐剂。在另一个实施方案中，所述核酸分子被用于转化李斯特菌属，以便获得重组李斯特菌属。在另一个实施方案中，本文提供的用于转化李斯特菌属的核酸缺少毒力基因。在另一个实施方案中，整合进李斯特菌属基因组中的核酸分子携带无功能的毒力基因。在另一个实施方案中，所述毒力基因在重组李斯特菌属中发生突变。在另一个实施方案中，使用所述核酸分子将存在于李斯特菌属基因组中的内源基因灭活。在另一个实施方案中，所述毒力基因是ActA基因、inlC基因或PrfA基因。技术人员会理解，所述毒力基因可以是本领域已知的与重组李斯特菌属的毒力有关的任何基因。

在一个实施方案中，在所述李斯特菌属菌株的染色体中缺少所述代谢基因、所述毒力基因等。在另一个实施方案中，在所述李斯特菌属菌株的染色体中和任意附加型遗传元件中缺少所述代谢基因、所述毒力基因等。在另一个实施方案中，在所述毒力菌株的基因组中缺少所述代谢基因、所述毒力基因等。在一个实施方案中，所述毒力基因在染色体中发生突变。在另一个实施方案中，所述毒力基因从染色体缺失。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，本文提供的核酸和质粒不会给重组李斯特菌属赋予抗生素抗性。

在另一个实施方案中，“核酸分子”表示质粒。在另一个实施方案中，该术语表示整合载体。在另一个实施方案中，该术语表示包含整合载体的质粒。在另一个实施方案中，所述整合载体是位点特异性的整合载体。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的核酸分子由本领域已知的任意类型的核苷酸组成。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，“代谢酶”表示，在宿主细菌需要的营养物的合成中涉及的酶。在另一个实施方案中，该术语表示宿主细菌需要的营养物的合成所需的酶。在另一个实施方案中，该术语表示在宿主细菌所利用的营养物的合成中涉及的酶。在另一个实施方案中，该术语表示在宿主细菌的持续生长所需的营养物的合成中涉及的酶。在另一个实施方案中，所述酶是营养物的合成所必需的。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，“稳定地维持”表示，在不存在选择(例如抗生素选择)的情况下，核酸分子或质粒维持10代，而没有可检测的丢失。在另一个实施方案中，所述时段是15代。在另一个实施方案中，所述时段是20代。在另一个实施方案中，所述时段是25代。在另一个实施方案中，所述时段是30代。在另一个实施方案中，所述时段是40代。在另一个实施方案中，所述时段是50代。在另一个实施方案中，所述时段是60代。在另一个实施方案中，所述时段是80代。在另一个实施方案中，所述时段是100代。在另一个实施方案中，所述时段是150代。在另一个实施方案中，所述时段是200代。在另一个实施方案中，所述时段是300代。在另一个实施方案中，所述时段是500代。在另一个实施方案中，所述时段是很多代。在另一个实施方案中，所述核酸分子或质粒在体外(例如在培养物中)稳定地维持。在另一个实施方案中，所述核酸分子或质粒在体内稳定地维持。在另一个实施方案中，所述核酸分子或质粒在体外和在体内稳定地维持。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，本文提供的方法和组合物的代谢酶是氨基酸代谢酶，在另一个实施方案中，所述代谢酶是丙氨酸消旋酶。在另一个实施方案中，所述代谢酶是D-氨基酸转移酶。在另一个实施方案中，所述代谢酶会催化在重组李斯特菌属菌株中用于细胞壁合成的氨基酸的形成，在另一个实施方案中，所述代谢酶是丙氨酸消旋酶。

在另一个实施方案中，在李斯特菌属p60启动子控制下，表达编码所述代谢酶的基因。在另一个实施方案中，使用inlA(编码内化蛋白)启动子。在另一个实施方案中，使用hly启动子。在另一个实施方案中，使用ActA启动子。在另一个实施方案中，在任意其它革兰氏阳性的启动子控制下，表达所述整合酶基因。在另一个实施方案中，在任意其它在李斯特菌属中起作用的启动子的控制下，表达编码所述代谢酶的基因。技术人员会明白，可以使用其它启动子或多顺反子表达盒来驱动所述基因的表达。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在一个实施方案中，在本文提供的方法和组合物中使用的LLO是李斯特菌的LO。在一个实施方案中，用于衍生出LLO的李斯特菌属是单核细胞增生李斯特菌(Lm)。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属是伊氏李斯特菌（Listeria ivanovii）。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属是威氏李斯特菌（Listeria welshimeri）。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属是斯氏李斯特菌（Listeria seeligeri）。

在一个实施方案中，所述LLO蛋白由在(SEQ ID NO:1)中阐述的下述核酸序列编码。

atgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatctcgag(SEQ ID NO:1)。

在另一个实施方案中，所述LLO蛋白具有序列SEQ ID NO:2

M K K I M L V F I T L I L V S L P I A QQ T E A K D A S A F N K E N S I S S MA P P A S P P A S P K T P I E K K H A DE I D K Y I Q G L D Y N K N N V L V YH G D A V T N V P P R K G Y K D G N EY I V V E K K K K S I N Q N N A D I QV V N A I S S L T Y P G A L V K A N S EL V E N Q P D V L P V K R D S L T L S ID L P G M T N Q D N K I V V K N A T KS N V N N A V N T L V E R W N E K Y AQ A Y P N V S A K I D Y D D E M A Y SE S Q L I A K F G T A F K A V N N S LN V N F G A I S E G K M Q E E V I S FK Q I Y Y N V N V N E P T R P S R F FG K A V T K E Q L Q A L G V N A E N PP A Y I S S V A Y G R Q V Y L K L S T NS H S T K V K A A F D A A V S G K S VS G D V E L T N I I K N S S F K A V I YG G S A K D E V Q I I D G N L G D L RD I L K K G A T F N R E T P G V P I A YT T N F L K D N E L A V I K N N S E Y IE T T S K A Y T D G K I N I D H S G GY V A Q F N I S W D E V N Y D L(SEQ ID NO:2)

与该序列对应的前蛋白的前25个氨基酸是信号序列，其在LLO被细菌分泌时从LLO切掉。因而，在该实施方案中，全长有活性的LLO蛋白的长度是504个残基。在另一个实施方案中，所述LLO蛋白具有在GenBank登记号DQ054588、DQ054589、AY878649、U25452或U25452中阐述的序列。在另一个实施方案中，所述LLO蛋白是LLO蛋白的变体。在另一个实施方案中，所述LLO蛋白是LLO蛋白的同系物。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，“截短的LLO”或“tLLO”表示包含PEST-样结构域的LLO片段。在另一个实施方案中，该术语表示，在氨基端不含有活化结构域且不包括胱氨酸484的LLO片段。在另一个实施方案中，所述LLO片段由PEST序列组成。在另一个实施方案中，所述LLO片段包含PEST序列。在另一个实施方案中，所述LLO片段由529个氨基酸的全长LLO蛋白的约前400-441个氨基酸组成。在另一个实施方案中，所述LLO片段是非溶血形式的LLO蛋白。

在一个实施方案中，所述LLO片段由约残基1-25组成。在另一个实施方案中，所述LLO片段由约残基1-50组成。在另一个实施方案中，所述LLO片段由约残基1-75组成。在另一个实施方案中，所述LLO片段由约残基1-100组成。在另一个实施方案中，所述LLO片段由约残基1-125组成。在另一个实施方案中，所述LLO片段由约残基1-150组成。在另一个实施方案中，所述LLO片段由约残基1-175组成。在另一个实施方案中，所述LLO片段由约残基1-200组成。在另一个实施方案中，所述LLO片段由约残基1-225组成。在另一个实施方案中，所述LLO片段由约残基1-250组成。在另一个实施方案中，所述LLO片段由约残基1-275组成。在另一个实施方案中，所述LLO片段由约残基1-300组成。在另一个实施方案中，所述LLO片段由约残基1-325组成。在另一个实施方案中，所述LLO片段由约残基1-350组成。在另一个实施方案中，所述LLO片段由约残基1-375组成。在另一个实施方案中，所述LLO片段由约残基1-400组成。在另一个实施方案中，所述LLO片段由约残基1-425组成。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，本文提供了包含本发明的重组形式的李斯特菌属的疫苗。

在另一个实施方案中，本文提供了本发明的重组形式的李斯特菌属的培养物。

在一个实施方案中，本文提供的活的减毒的李斯特菌属或重组李斯特菌属表达ActA蛋白或其片段。在本发明的方法和组合物的另一个实施方案中，将ActA蛋白的片段与本文也提供的异种抗原或其片段融合。在另一个实施方案中，所述ActA蛋白的片段具有序列：

MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKGPNINNNNSEQTENAAINEEASGADRPAIQVERRHPGLPSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKVNKKKVAKESVADASESDLDSSMQSADESSPQPLKANQQPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIIRETASSLDSSFTRGDLASLRNAINRHSQNFSDFPPIPTEEELNGRGGRP(SEQ ID No:3)。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的ActA氨基酸序列包含在SEQ ID No:3中阐述的序列。在另一个实施方案中，所述ActA氨基酸序列是SEQ ID No:3的同系物。在另一个实施方案中，所述ActA氨基酸序列是SEQ ID No:3的变体。在另一个实施方案中，所述ActA氨基酸序列是SEQ ID No:3的片段。在另一个实施方案中，所述ActA氨基酸序列是SEQ ID No:3的异形体。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，所述ActA片段由包含下述序列的重组核苷酸编码：

ATGCGTGCGATGATGGTGGTTTTCATTACTGCCAATTGCATTACGATTAACCCCGACATAATATTTGCAGCGACAGATAGCGAAGATTCTAGTCTAAACACAGATGAATGGGAAGAAGAAAAAACAGAAGAGCAACCAAGCGAGGTAAATACGGGACCAAGATACGAAACTGCACGTGAAGTAAGTTCACGTGATATTAAAGAACTAGAAAAATCGAATAAAGTGAGAAATACGAACAAAGCAGACCTAATAGCAATGTTGAAAGAAAAAGCAGAAAAAGGTCCAAATATCAATAATAACAACAGTGAACAAACTGAGAATGCGGCTATAAATGAAGAGGCTTCAGGAGCCGACCGACCAGCTATACAAGTGGAGCGTCGTCATCCAGGATTGCCATCGGATAGCGCAGCGGAAATTAAAAAAAGAAGGAAAGCCATAGCATCATCGGATAGTGAGCTTGAAAGCCTTACTTATCCGGATAAACCAACAAAAGTAAATAAGAAAAAAGTGGCGAAAGAGTCAGTTGCGGATGCTTCTGAAAGTGACTTAGATTCTAGCATGCAGTCAGCAGATGAGTCTTCACCACAACCTTTAAAAGCAAACCAACAACCATTTTTCCCTAAAGTATTTAAAAAAATAAAAGATGCGGGGAAATGGGTACGTGATAAAATCGACGAAAATCCTGAAGTAAAGAAAGCGATTGTTGATAAAAGTGCAGGGTTAATTGACCAATTATTAACCAAAAAGAAAAGTGAAGAGGTAAATGCTTCGGACTTCCCGCCACCACCTACGGATGAAGAGTTAAGACTTGCTTTGCCAGAGACACCAATGCTTCTTGGTTTTAATGCTCCTGCTACATCAGAACCGAGCTCATTCGAATTTCCACCACCACCTACGGATGAAGAGTTAAGACTTGCTTTGCCAGAGACGCCAATGCTTCTTGGTTTTAATGCTCCTGCTACATCGGAACCGAGCTCGTTCGAATTTCCACCGCCTCCAACAGAAGATGAACTAGAAATCATCCGGGAAACAGCATCCTCGCTAGATTCTAGTTTTACAAGAGGGGATTTAGCTAGTTTGAGAAATGCTATTAATCGCCATAGTCAAAATTTCTCTGATTTCCCACCAATCCCAACAGAAGAAGAGTTGAA CGGGAGAGGCGGTAGACCA(SEQ ID NO:4)。在另一个实施方案中，所述重组核苷酸具有在SEQ ID NO:4中阐述的序列。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的编码ActA的核苷酸包含在SEQ ID No:4中阐述的序列。在另一个实施方案中，所述编码ActA的核苷酸是SEQ ID No:4的同系物。在另一个实施方案中，所述编码ActA的核苷酸是SEQ ID No:4的变体。在另一个实施方案中，所述编码ActA的核苷酸是SEQ ID No:4的片段。在另一个实施方案中，所述编码ActA的核苷酸是SEQ ID No:4的异形体。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，所述ActA片段由包含下述序列的重组核苷酸编码：

Tttatcacgtacccatttccccgcatcttttatttttttaaatactttagggaaaaatggtttttgatttgcttttaaaggttgtggtgtagactcgtctgctgactgcatgctagaatctaagtcactttcagaagcatccacaactgactctttcgccacttttctcttatttgcttttgttggtttatctggataagtaaggctttcaagctcactatccgacgacgctatggcttttcttctttttttaatttccgctgcgctatccgatgacagacctggatgacgacgctccacttgcagagttggtcggtcgactcctgaagcctcttcatttatagccacatttcctgtttgctcaccgttgttattattgttattcggacctttctctgcttttgctttcaacattgctattaggtctgctttgttcgtatttttcactttattcgatttttctagttcctcaatatcacgtgaacttacttcacgtgcagtttcgtatcttggtcccgtatttacctcgcttggctgctcttctgttttttcttcttcccattcatctgtgtttagactggaatcttcgctatctgtcgctgcaaatattatgtcggggttaatcgtaatgcagttggcagtaatgaaaactaccatcatcgcacgcat(SEQID NO:5)。在另一个实施方案中，所述重组核苷酸具有在SEQ ID NO:5中阐述的序列。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的编码ActA的核苷酸包含在SEQ ID No:5中阐述的序列。在另一个实施方案中，所述编码ActA的核苷酸是SEQ ID No:5的同系物。在另一个实施方案中，所述编码ActA的核苷酸是SEQ ID No:5的变体。在另一个实施方案中，所述编码ActA的核苷酸是SEQ ID No:5的片段。在另一个实施方案中，所述编码ActA的核苷酸是SEQ ID No:5的异形体。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在本发明的方法和组合物的另一个实施方案中，将ActA蛋白片段与异种抗原或其片段融合。在另一个实施方案中，所述ActA蛋白片段具有在Genbank登记号AAF04762中阐述的序列。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的ActA氨基酸序列包含在Genbank登记号AAF04762中阐述的序列。在另一个实施方案中，所述ActA氨基酸序列是Genbank登记号AAF04762的同系物。在另一个实施方案中，所述ActA氨基酸序列是Genbank登记号AAF04762的变体。在另一个实施方案中，所述ActA氨基酸序列是Genbank登记号AAF04762的片段。在另一个实施方案中，所述ActA氨基酸序列是Genbank登记号AAF04762的异形体。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，在本发明的方法和组合物中利用的N-端ActA蛋白片段具有在SEQ ID NO:6中阐述的序列：

MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKGPNINNNNSEQTENAAINEEASGADRPAIQVERRHPGLPSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKVNKKKVAKESVADASESDLDSSMQSADESSPQPLKANQQPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIIRETASSLDSSFTRGDLASLRNAINRHSQNFSDFPPIPTEEELNGRGGRP。在另一个实施方案中，所述ActA片段包含在SEQ IDNO:6中阐述的序列。在另一个实施方案中，所述ActA片段是本领域已知的任意其它ActA片段。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，所述编码ActA蛋白片段的重组核苷酸包含在SEQ ID NO:7中阐述的序列：

Atgcgtgcgatgatggtggttttcattactgccaattgcattacgattaaccccgacataatatttgcagcgacagatagcgaagattctagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcaaccaagcgaggtaaatacgggaccaagatacgaaactgcacgtgaagtaagttcacgtgatattaaagaactagaaaaatcgaataaagtgagaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagaaaaagcagaaaaaggtccaaatatcaataataacaacagtgaacaaactgagaatgcggctataaatgaagaggcttcaggagccgaccgaccagctatacaagtggagcgtcgtcatccaggattgccatcggatagcgcagcggaaattaaaaaaagaaggaaagccatagcatcatcggatagtgagcttgaaagccttacttatccggataaaccaacaaaagtaaataagaaaaaagtggcgaaagagtcagttgcggatgcttctgaaagtgacttagattctagcatgcagtcagcagatgagtcttcaccacaacctttaaaagcaaaccaacaaccatttttccctaaagtatttaaaaaaataaaagatgcggggaaatgggtacgtgataaaatcgacgaaaatcctgaagtaaagaaagcgattgttgataaaagtgcagggttaattgaccaattattaaccaaaaagaaaagtgaagaggtaaatgcttcggacttcccgccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacaccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcagaaccgagctcattcgaatttccaccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacgccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcggaaccgagctcgttcgaatttccaccgcctccaacagaagatgaactagaaatcatccgggaaacagcatcctcgctagattctagttttacaagaggggatttagctagtttgagaaatgctattaatcgccatagtcaaaatttctctgatttcccaccaatcccaacagaagaagagttgaacgggagaggcggtagacca。在另一个实施方案中，所述重组核苷酸具有在SEQ ID NO:7中阐述的序列。在另一个实施方案中，所述重组核苷酸包含编码ActA蛋白片段的任意其它序列。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，所述ActA片段由包含在Genbank登记号AF103807中阐述的序列的重组核苷酸编码。在另一个实施方案中，所述重组核苷酸具有在Genbank登记号AF103807中阐述的序列。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的编码ActA的核苷酸包含在Genbank登记号AF103807中阐述的序列。在另一个实施方案中，所述编码ActA的核苷酸是Genbank登记号AF103807的同系物。在另一个实施方案中，所述编码ActA的核苷酸是Genbank登记号AF103807的变体。在另一个实施方案中，所述编码ActA的核苷酸是Genbank登记号AF103807的片段。在另一个实施方案中，所述编码ActA的核苷酸是Genbank登记号AF103807的异形体。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，所述ActA片段是本领域已知的任意其它ActA片段。在另一个实施方案中，本发明的重组核苷酸包含编码ActA蛋白片段的任意其它序列。在另一个实施方案中，所述重组核苷酸包含编码整个ActA蛋白的任意其它序列。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在一个实施方案中，本文提供的活的减毒的李斯特菌属或重组李斯特菌属表达PEST序列肽。在本发明的方法和组合物的另一个实施方案中，将PEST氨基酸序列与异种抗原或片段融合。在另一个实施方案中，所述PEST氨基酸序列是KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK(SEQ ID NO:8)。在另一个实施方案中，所述PEST序列是KENSISSMAPPASPPASPK(SEQ ID No:9)。

在另一个实施方案中，所述PEST氨基酸序列是得自李斯特菌属ActA蛋白的PEST序列。在另一个实施方案中，所述PEST序列是KTEEQPSEVNTGPR(SEQ ID NO:10)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(SEQ ID NO:11)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQ ID NO:12)或RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(SEQ ID NO:13)。在另一个实施方案中，所述PEST-样序列是在上文中描述的PEST序列的变体，在一个实施方案中，其为KESVVDASESDLDSSMQSADESTPQPLK(SEQ ID NO:14)、KSEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQ ID NO:15)或RGGRPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(SEQ ID NO:16)，这是技术人员会理解的。在另一个实施方案中，所述PEST-样序列得自斯氏李斯特菌溶细胞素，后者由lso基因编码。在另一个实施方案中，所述PEST序列是RSEVTISPAETPESPPATP(SEQ ID NO:17)。在另一个实施方案中，所述PEST序列得自链球菌属的链球菌溶血素O蛋白。在另一个实施方案中，所述PEST序列得自酿脓链球菌链球菌溶血素O，例如在氨基酸35-51处的KQNTASTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:18)。在另一个实施方案中，所述PEST-样序列得自似马链球菌链球菌溶血素O，例如在氨基酸38-54处的KQNTANTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:19)。在另一个实施方案中，所述PEST-样序列具有选自SEQ ID NO:8-16的序列。在另一个实施方案中，所述PEST-样序列具有选自SEQ ID NO:8-19的序列。在另一个实施方案中，所述PEST序列是源自原核生物的另一个PEST氨基酸序列。

PEST序列的鉴别是本领域众所周知的，且被描述在，例如，Rogers S等人(Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins:thePEST hypothesis.Science1986;234(4774):364-8)和Rechsteiner M等人(PEST sequences and regulation by proteolysis.Trends Biochem Sci1996;21(7):267-71)。在另一个实施方案中，“PEST序列”表示富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)残基的区域。在另一个实施方案中，所述PEST序列侧接一个或多个含有若干带正电荷的氨基酸的簇。在另一个实施方案中，所述PEST序列介导含有它的蛋白的快速细胞内降解。在另一个实施方案中，所述PEST序列拟合在Rogers等人中公开的算法。在另一个实施方案中，所述PEST序列拟合在Rechsteiner等人中公开的算法。在另一个实施方案中，所述PEST序列含有一个或多个内部磷酸化位点，且在这些位点处的磷酸化先于蛋白降解。

在一个实施方案中，根据诸如在下述文献中描述的方法，鉴别原核生物的PEST序列：例如关于Lm的Rechsteiner和Rogers(1996,TrendsBiochem.Sci.21:267-271)，和Rogers S等人(Science1986;234(4774):364-8)。可替换地，基于该方法，还可以鉴别得自其它原核生物的PEST氨基酸序列。在其中预见到PEST氨基酸序列的其它原核生物包括、但不限于其它李斯特菌属种。在一个实施方案中，所述PEST序列拟合在Rogers等人中公开的算法。在另一个实施方案中，所述PEST序列拟合在Rechsteiner等人中公开的算法。在另一个实施方案中，使用PEST-find程序鉴别PEST序列。

在另一个实施方案中，通过在指定的蛋白序列内初步扫描带正电荷的AA R、H和K，实现PEST基序的鉴别。计数在带正电荷的侧翼之间的所有氨基酸，并且仅进一步考虑含有等于或高于窗口大小参数的氨基酸数目的那些基序。在另一个实施方案中，PEST-样序列必须含有至少1个P、1个D或E、和至少1个S或T。

在另一个实施方案中，借助于基于关键氨基酸的局部富集以及基序的疏水性的评分参数，精化PEST基序的质量。以质量百分比(w/w)的方式表达D、E、P、S和T的富集，并针对1当量的D或E、1当量的P、和1当量的S或T进行校正。在另一个实施方案中，疏水性的计算基本上遵循J.Kyte和R.F.Doolittle的方法(Kyte,J和Dootlittle,RF.J.Mol.Biol.157,105(1982)。

在另一个实施方案中，将潜在PEST基序的疏水性计算为，每个氨基酸物质的摩尔百分比和疏水性指数的乘积的总和。得到期望的PEST评分，其为由下述方程式表示的局部富集项和疏水性项的组合：

PEST评分=0.55*DEPST-0.5*疏水性指数。

在另一个实施方案中，“PEST序列”、“PEST-样序列”或“PEST-样序列肽”表示，使用上述算法，具有至少+5的评分的肽。在另一个实施方案中，该术语表示具有至少6的评分的肽。在另一个实施方案中，所述肽具有至少7的评分。在另一个实施方案中，所述评分是至少8。在另一个实施方案中，所述评分是至少9。在另一个实施方案中，所述评分是至少10。在另一个实施方案中，所述评分是至少11。在另一个实施方案中，所述评分是至少12。在另一个实施方案中，所述评分是至少13。在另一个实施方案中，所述评分是至少14。在另一个实施方案中，所述评分是至少15。在另一个实施方案中，所述评分是至少16。在另一个实施方案中，所述评分是至少17。在另一个实施方案中，所述评分是至少18。在另一个实施方案中，所述评分是至少19。在另一个实施方案中，所述评分是至少20。在另一个实施方案中，所述评分是至少21。在另一个实施方案中，所述评分是至少22。在另一个实施方案中，所述评分是至少22。在另一个实施方案中，所述评分是至少24。在另一个实施方案中，所述评分是至少24。在另一个实施方案中，所述评分是至少25。在另一个实施方案中，所述评分是至少26。在另一个实施方案中，所述评分是至少27。在另一个实施方案中，所述评分是至少28。在另一个实施方案中，所述评分是至少29。在另一个实施方案中，所述评分是至少30。在另一个实施方案中，所述评分是至少32。在另一个实施方案中，所述评分是至少35。在另一个实施方案中，所述评分是至少38。在另一个实施方案中，所述评分是至少40。在另一个实施方案中，所述评分是至少45。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，使用本领域已知的任意其它方法或算法，例如CaSPredictor(Garay-Malpartida HM,Occhiucci JM,Alves J,Belizario JE.Bioinformatics.2005年6月21日增刊1:i169-76)，鉴别PEST序列。在另一个实施方案中，使用下述方法：

通过将1的值分配给氨基酸Ser、Thr、Pro、Glu、Asp、Asn或Gln，计算每个适当长度段(例如30-35个氨基酸的段)的PEST指数。每个PEST残基的系数值(CV)为1，且每个其它氨基酸(非-PEST)的系数值为0。

每种用于鉴别PEST-样序列的方法代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，所述PEST序列是本领域已知的任意其它PEST序列。每个PEST序列及其类型代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，“与PEST序列融合”表示与包含PEST序列的蛋白片段融合。在另一个实施方案中，该术语包括这样的情况：其中所述蛋白片段包含除了PEST序列以外的周围序列。在另一个实施方案中，所述蛋白片段由PEST序列组成。因而，在另一个实施方案中，“融合体”表示这样的2个肽或蛋白片段：它们在各自的末端处连接在一起，或者一个嵌入在另一个内。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，本文提供了包含本发明的重组形式的李斯特菌属的疫苗。

在另一个实施方案中，本文提供了本发明的重组形式的李斯特菌属的培养物。

在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的李斯特菌属是单核细胞增生李斯特菌。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属是伊氏李斯特菌。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属是威氏李斯特菌。在另一个实施方案中，所述李斯特菌属是斯氏李斯特菌。每种类型的李斯特菌属代表本发明的一个单独实施方案。

在一个实施方案中，在本发明中使用减毒的李斯特菌属菌株，诸如Lmδ-actA突变体(Brundage等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90:11890-11894)、产单核细胞李斯特菌δ-plcA(Camilli等人,1991,J.Exp.Med.,173:751-754)或δ-ActA、δINL-b(Brockstedt等人,2004,PNAS,101:13832-13837)。在另一个实施方案中，如本领域普通技术人员在获得本文的公开内容以后会理解的，通过引入一个或多个减毒突变，构建减毒的李斯特菌属菌株。这样的菌株的例子包括、但不限于：芳族氨基酸营养缺陷型的李斯特菌属菌株(Alexander等人,1993,Infection and Immunity1061:2245-2248)和脂磷壁酸形成的突变体(Abachin等人,2002,Mol.Microbiol.43:1-14)和通过缺失毒力基因而减毒的那些(参见本文中的实施例)。

在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的核酸分子可操作地连接至启动子/调节序列。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的第一开放读码框可操作地连接至启动子/调节序列。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的第二开放读码框可操作地连接至启动子/调节序列。在另一个实施方案中，每个开放读码框可操作地连接至启动子/调节序列。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

技术人员在获得本文提供的公开内容和方法后会容易地理解，不同的转录启动子、终止子、运输载体或特定基因序列(例如在商购可得的克隆载体中的那些)可以成功地用于本发明的方法和组合物中。如在本发明中所涵盖的，这些功能性提供在例如被称作pUC系列的商购可得的载体中。在另一个实施方案中，除去非必需DNA序列(例如抗生素抗性基因)。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。在另一个实施方案中，在本发明中使用商购可得的质粒。这样的质粒可从多种来源得到，例如，Invitrogen(LaJolla,CA),Stratagene(La Jolla,CA),Clontech(Palo Alto,CA)，或者可以使用本领域众所周知的方法构建。

另一个实施方案是质粒诸如pCR2.1(Invitrogen,La Jolla,CA)，其是原核表达载体，具有用于促进在原核生物中的表达的原核复制起点和启动子/调节元件。在另一个实施方案中，除去外来核苷酸序列以减小质粒的大小和增加可以放入其中的盒的大小。

这样的方法是本领域众所周知的，且被描述在，例如，Sambrook等人(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York)和Ausubei等人(1997,Current Protocols inMolecular Biology,Green&Wiley,New York)。

抗生素抗性基因被用于在分子生物学和疫苗制备中常用的常规选择和克隆过程中。在本发明中涵盖的抗生素抗性基因包括、但不限于这样的基因产物：其赋予对氨苄西林、青霉素、甲氧西林、链霉素、红霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素(CAT)、新霉素、潮霉素、庆大霉素和本领域众所周知的其它抗生素的抗性。每种基因代表本发明的一个单独实施方案。

用于转化细菌的方法是本领域众所周知的，且包括基于氯化钙感受态细胞的方法、电穿孔方法、噬菌体介导的转导、化学和物理转化技术(deBoer等人,1989,Cell56:641-649;Miller等人,1995,FASEB J.,9:190-199;Sambrook等人.1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York;Ausubel等人,1997,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York;Gerhardt等人,编,1994,Methods for General and Molecular Bacteriology,American Society for Microbiology,Washington,DC;Miller,1992,A ShortCourse in Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.)。在另一个实施方案中，通过电穿孔来转化本发明的李斯特菌属疫苗株。每种方法代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，使用接合将遗传物质和/或质粒引入细菌中。接合方法是本领域众所周知的，且被描述在，例如，Nikodinovic J等人(Asecond generation snp-derived Escherichia coli-Streptomyces shuttleexpression vector that is generally transferable by conjugation.Plasmid.2006年11月;56(3):223-7)和Auchtung JM等人(Regulation of a Bacillussubtilis mobile genetic element by intercellular signaling and the globalDNA damage response.Proc Natl Acad Sci U S A.2005年8月30日;102(35):12554-9)。每种方法代表本发明的一个单独实施方案。

在一个实施方案中，“转化”与术语“转染”等同地使用，并表示工程化细菌细胞以吸收质粒或其它异源DNA分子。在另一个实施方案中，“转化”表示示工程化细菌细胞以表达质粒或其它异源DNA分子的基因。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在本文别处描述了在本发明中可用的质粒和其它表达载体，且可以包括诸如启动子/调节序列、革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的复制起点、编码融合蛋白的分离的核酸、和编码氨基酸代谢基因的分离的核酸等特征。此外，编码融合蛋白和氨基酸代谢基因的分离核酸将具有适合驱动这样的分离核酸的表达的启动子。可用于驱动在细菌系统中的表达的启动子是本领域众所周知的，且包括噬菌体λ、pBR322的β-内酰胺酶基因的bla启动子、和pBR325的氯霉素乙酰基转移酶基因的CAT启动子。原核启动子的其它例子包括：噬菌体λ的主要右和左启动子(PL和PR)，大肠杆菌的trp、recA、lacZ、lad和gal启动子，枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶(Ulmanen等人,1985.J.Bacteriol.162:176-182)和S28-特异性的启动子(Gilman等人,1984Gene32:11-20)，芽孢杆菌属的噬菌体的启动子(Gryczan,1982，见：TheMolecular Biology of the Bacilli,Academic Press,Inc.,New York)，和链霉菌属启动子(Ward等人,1986,Mol.Gen.Genet.203:468-478)。在本发明中涵盖的其它原核启动子综述在，例如，Glick(1987,J.Ind.Microbiol.1:277-282);Cenatiempo,(1986,Biochimie,68:505-516)；和Gottesman,(1984,Ann.Rev.Genet.18:415-442)。在本发明中涵盖的启动子/调节元件的其它例子包括、但不限于：李斯特菌的prfA启动子、李斯特菌的hly启动子、李斯特菌的p60启动子和李斯特菌的ActA启动子(GenBank Acc.No.NC_003210)或其片段。

在一个实施方案中，使用DNA扩增方法，例如聚合酶链式反应(PCR)，生产编码重组非溶血性LLO的DNA。首先，单独地扩增在新末端的任一侧上的天然DNA区段。一个扩增的序列的5'末端编码肽接头，而另一个扩增的序列的3'末端也编码肽接头。由于第一片段的5'末端与第二片段的3'末端互补，可以在第三PCR反应中使用所述2个片段(例如在LMP琼脂糖上部分纯化后)作为重叠模板。所述扩增的序列将含有：密码子、在开放位点的羧基侧上的区段(现在形成氨基序列)、接头和在开放位点的氨基侧上的序列(现在形成羧基序列)。将所述抗原连接进质粒中。每种方法代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，本发明另外包含用于临床应用的基于噬菌体的染色体整合系统。将使用必需酶（包括、但不限于，d-丙氨酸消旋酶）营养缺陷型的宿主菌株，例如Lmdal(-)dat(-)。在另一个实施方案中，为了避免“噬菌体自愈步骤”，使用基于PSA的噬菌体整合系统(Lauer,等人,2002J Bacteriol,184:4177-4186)。在另一个实施方案中，这需要通过抗生素进行连续选择以维持整合的基因。因而，在另一个实施方案中，本发明会实现基于噬菌体的染色体整合系统的建立，该系统不需要抗生素选择。相反，营养缺陷型的宿主菌株将被补足。

在另一个实施方案中，使用重组DNA方法学，合成本发明的重组蛋白。在一个实施方案中，这包括：制备DNA序列，将所述DNA放入表达盒（诸如本发明的质粒）中，置于特定启动子/调节元件的控制下，和表达所述蛋白。在另一个实施方案中，通过任意合适的方法制备编码本发明的蛋白(例如非溶血性LLO)的DNA，所述方法包括、例如，适当序列的克隆和限制酶切，或通过诸如下述方法的直接化学合成：Narang等人(1979,Meth.Enzymol.68:90-99)的磷酸三酯方法；Brown等人(1979,Meth.Enzymol68:109-151)的磷酸二酯方法；Beaucage等人(1981,Tetra.Lett.,22:151859-1862)的二乙基氨基亚磷酸酯方法；和美国专利号4,458,066的固体支持物方法。

在另一个实施方案中，使用化学合成来生产单链的寡核苷酸。在不同的实施方案中，如下将该单链的寡核苷酸转化成双链的DNA：通过与互补序列的杂交，或通过使用该单链作为模板用DNA聚合酶进行聚合。本领域技术人员会认识到，尽管DNA的化学合成限于约100个碱基的序列，但是通过连接较短的序列可以得到较长的序列。在另一个实施方案中，克隆子序列，并使用适当的限制性酶切割适当的子序列。然后连接片段以产生期望的DNA序列。

在另一个实施方案中，使用DNA扩增方法诸如聚合酶链式反应(PCR)，克隆编码本发明的重组蛋白的DNA。因而，使用包含合适的限制位点的同义引物和包含另一个限制位点（例如用于促进克隆的不同限制位点）的反义引物，PCR扩增非溶血性LLO的基因。

在另一个实施方案中，将重组融合蛋白基因可操作地连接至每种宿主的适当的表达控制序列。在本文别处详细描述了启动子/调节序列。在另一个实施方案中，所述质粒还包含其它启动子调节元件、以及核糖体结合位点和转录终止信号。对于真核细胞，所述控制序列将包括：源自例如免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒等的启动子和增强子，以及聚腺苷酸化序列。在另一个实施方案中，所述序列包括剪接供体和受体序列。

在一个实施方案中，术语“可操作地连接”表示并列连接，其中如此描述的组件发生关联，从而允许它们以它们的预期方式起作用。与编码序列“可操作地连接”的控制序列是以这样的方式连接：在与所述控制序列相容的条件下，实现所述编码序列的表达。

在另一个实施方案中，为了选择包含质粒的营养缺陷型细菌，在将会选择氨基酸代谢基因的表达的培养基上培养转化的营养缺陷型细菌。在另一个实施方案中，用包含D-谷氨酸合成基因的质粒转化D-谷氨酸合成营养缺陷型的细菌，并且所述营养缺陷型细菌将在不存在D-谷氨酸的情况下生长，而尚未被所述质粒转化或者不表达编码D-谷氨酸合成蛋白的质粒的营养缺陷型细菌将不会生长。在另一个实施方案中，如果本发明的质粒包含编码负责D-丙氨酸合成的氨基酸代谢酶的分离核酸，D-丙氨酸合成营养缺陷型的细菌当被转化且表达所述质粒时，将在不存在D-丙氨酸的情况下生长。这样的用于制备适当的培养基（其包含或缺少必需的生长因子、补充物、氨基酸、维生素、抗生素等）的方法是本领域众所周知的，且可商业得到(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)。每种方法代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，已经在适当的培养基上选择包含本发明的质粒的营养缺陷型细菌以后，在有选择压力存在下繁殖所述细菌。这样的繁殖包括：在没有营养缺陷因子存在下，在培养基中培养所述细菌。表达氨基酸代谢酶的质粒在营养缺陷型细菌中的存在会确保，所述质粒将与所述细菌一起复制，从而连续地选择携带所述质粒的细菌。技术人员在获知本文的公开内容和方法后将能够容易地通过调节培养基（在其中培养包含质粒的营养缺陷型细菌）的体积来放大李斯特菌属疫苗载体的生产。

技术人员会明白，在另一个实施方案中，其它营养缺陷型菌株和互补系统适合与本发明一起使用。

在一个实施方案中，本文提供了施用本发明的组合物的方法。在另一个实施方案中，本文提供了施用本发明的疫苗的方法。在另一个实施方案中，本文提供了施用本发明的重组多肽或重组核苷酸的方法。在另一个实施方案中，施用本发明的组合物、疫苗、重组多肽或重组核苷酸的步骤，用包含所述组合物、疫苗、重组多肽或表达重组多肽的重组核苷酸（每种在它自己的单独实施方案中）的减毒重组形式的李斯特菌属来执行。在另一个实施方案中，所述施用用不同的减毒的细菌载体来执行。在另一个实施方案中，所述施用用DNA疫苗(例如裸露DNA疫苗)来执行。在另一个实施方案中，本发明的重组多肽的施用如下执行：生产所述重组蛋白，然后给受试者施用所述重组蛋白。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在一个实施方案中，用于本发明的方法中的疫苗包含重组单核细胞增生李斯特菌，其呈如本文中所述的任意形式或实施方案。在一个实施方案中，用于本发明中的疫苗由本发明的重组单核细胞增生李斯特菌组成，其呈如本文中所述的任意形式或实施方案。在另一个实施方案中，用于本发明的方法中的疫苗基本上由本发明的重组单核细胞增生李斯特菌组成，其呈如本文中所述的任意形式或实施方案。在一个实施方案中，术语“包含”表示在疫苗中包括重组单核细胞增生李斯特菌，以及包括本领域可能已知的其它疫苗或治疗。在另一个实施方案中，术语”基本上由……组成”表示这样的疫苗：其功能组分是重组单核细胞增生李斯特菌，但是，可能包括与所述疫苗的治疗效果没有直接关联的其它疫苗组分，且可以例如表示促进重组单核细胞增生李斯特菌的作用的组分(例如稳定、保存等)。在另一个实施方案中，术语“由……组成”表示含有重组单核细胞增生李斯特菌的疫苗。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括下述步骤：施用重组单核细胞增生李斯特菌，其呈如本文中所述的任意形式或实施方案。在一个实施方案中，本发明的方法由下述步骤组成：施用本发明的重组单核细胞增生李斯特菌，其呈如本文中所述的任意形式或实施方案。在另一个实施方案中，本发明的方法基本上由下述步骤组成：施用本发明的重组单核细胞增生李斯特菌，其呈如本文中所述的任意形式或实施方案。在一个实施方案中，术语“包括”表示，在所述方法中包括施用重组单核细胞增生李斯特菌的步骤，以及包括本领域可能已知的其它方法或治疗。在另一个实施方案中，术语”基本上由……组成”表示这样的方法：其功能组分是重组单核细胞增生李斯特菌的施用，但是，可能包括与所述方法的治疗效果没有直接关联的其它方法步骤，且可以例如表示促进重组单核细胞增生李斯特菌的施用效果的步骤。在另一个实施方案中，术语“由……组成”表示，施用重组单核细胞增生李斯特菌，没有其它步骤。

在另一个实施方案中，由本发明的方法和组合物引起的免疫应答包括CD8⁺T细胞介导的应答。在另一个实施方案中，所述免疫应答主要由CD8⁺T细胞介导的应答组成。在另一个实施方案中，所述免疫应答的唯一可检测的组分是CD8⁺T细胞介导的应答(参见实施例7-11)。

在另一个实施方案中，由本文提供的方法和组合物引起的免疫应答包括CD4⁺T细胞介导的应答。在另一个实施方案中，所述免疫应答主要由CD4⁺T细胞介导的应答组成。在另一个实施方案中，所述免疫应答的唯一可检测的组分是CD4⁺T细胞介导的应答。在另一个实施方案中，所述CD4⁺T细胞介导的应答伴有可测量的针对抗原的抗体应答。在另一个实施方案中，所述CD4⁺T细胞介导的应答不伴有可测量的针对抗原的抗体应答(参见实施例7-11)。

在另一个实施方案中，由本文提供的方法和组合物引起的免疫应答包括先天性免疫应答，其中M1巨噬细胞和树突细胞(DCs)被活化。

在一个实施方案中，本文提供了增加CD8⁺/T调节细胞的瘤内比例的方法，由此且在另一个实施方案中，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用包含本发明的重组多肽、重组李斯特菌属或重组载体的组合物(参见实施例7-11)。

在另一个实施方案中，本文提供了增加CD8⁺/T调节细胞的瘤内比例的方法，由此且在另一个实施方案中，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用包含本发明的重组多肽、重组李斯特菌属或重组载体的组合物(参见实施例7-11)。

在一个实施方案中，本文提供了增加CD8⁺/骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)的瘤内比例的方法，由此且在另一个实施方案中，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用包含本发明的重组李斯特菌属或重组载体的组合物。

在另一个实施方案中，本文提供了增加CD8⁺/骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)在疾病部位处的比例的方法，由此且在另一个实施方案中，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用包含本发明的重组李斯特菌属或重组载体的组合物。

人MDSC中的常见血浆标志物包括CD33、CD11b、CD15、CD14阴性、II类MHC阴性、HLA DR^低或-。常见的细胞内标志物包括精氨酸酶和iNOS。此外，人MDSC的抑制活性或机制包括一氧化氮(NO)、精氨酸酶或硝基酪氨酸的利用。在小鼠中，骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)是CD11b和Gr-1双重阳性的，且已经被描述为F4/80^int、CD11c^低、MHCII^-/低、Ly6C+。具有免疫抑制能力的CD11b+/Gr-1+细胞已经被描述为生产IFN-g。MDSC也可以是单核细胞和/或粒细胞。

在一个实施方案中，在疾病部位处的MDSC可以意外地抑制抗原特异性的和非特异性的T细胞功能，而脾MDSC仅可以抑制抗原特异性的T细胞的功能。如在下面的实施例中所证实的(参见实施例21-24)，本文提供的活的减毒的李斯特菌属会减少疾病中抑制细胞的量或数量，由此允许在疾病部位（例如，肿瘤部位）处的CD8T细胞复制和渗入。

Lm或亚裂解剂量的LLO在人上皮Caco-2细胞中会诱导IL-6的表达，所述IL-6会减少细菌的细胞内生长和造成可诱导的一氧化氮合酶(NOS)的过表达。一氧化氮似乎为针对Lm的先天性免疫应答的必需组分，在嗜中性粒细胞和巨噬细胞的杀李斯特菌活性中具有重要作用，可诱导的NO合酶(iNOS)的缺乏会造成Lm感染的易感性。

Lm感染也会导致稳健的2类MHC限制的CD4⁺T细胞应答的产生，并使CD4⁺T细胞的表型转换为Th-1。此外，针对Lm的功能性的CD8⁺T细胞记忆的产生和维持需要CD4⁺T细胞帮助。此外，已经报道，Lm对小鼠的腹膜内感染会造成CD4⁺T_γδ细胞的局部诱导（与腹腔中的IL-17分泌有关），但是在这些注射以后在脾或淋巴结T细胞群体中没有观察到变化。另外，李斯特菌属感染也涉及基本上不是免疫系统的一部分的其它系统，但是其支持免疫功能以影响治疗结果，诸如髓细胞生成和血管内皮细胞功能。

Lm感染的巨噬细胞会产生TNF-α、IL-18和IL-12，它们都在诱导IFN-γ产生和随后在吞噬体中杀死和降解Lm方面是重要的。IL-12缺乏会导致增加的李斯特菌病易感性，该病可以通过施用IFN-γ来逆转。NK细胞是早期感染中的IFN-γ的主要来源。在再感染后，记忆CD8⁺T细胞具有在不存在同源抗原的情况下响应于IL-12和IL-18而产生IFN-γ的能力。CD8⁺T细胞与巨噬细胞和Lm一起共同局部化在脾的T细胞区域，在此处，它们独立于抗原而产生IFN-γ。CD8⁺T细胞的IFN-γ产生部分地依赖于LLO的表达。

IFN-γ在用基于Lm的疫苗所得到的抗肿瘤应答中起重要作用。尽管最初由NK细胞产生，IFN-γ水平随后由CD4⁺T-辅助细胞维持较长时段。Lm疫苗需要IFN-γ才能实现有效的肿瘤消退，并且淋巴细胞的肿瘤渗入特别需要IFN-γ。在疫苗接种后的早期效应阶段，IFN-γ也会抑制肿瘤部位处的血管生成。

LLO的未得到充分描述的性质是，它的诱导后天修饰的能力，所述后天修饰影响DNA表达的控制。在李斯特菌属感染的早期阶段，细胞外的LLO会诱导组蛋白蛋白H3的去磷酸化和组蛋白H4的类似脱乙酰化。该表现遗传效应会导致在免疫功能中涉及的某些基因的转录减少，从而提供这样的机制：LLO通过该机制可以调节免疫应答所需的基因产物的表达。LLO的另一种基因组效应是，它的增加NF-κβ易位的能力，所述NF-κβ易位与ICAM和E-选择素的表达以及IL-8和MCP-1的分泌有关。受LLO影响的另一种信号传递级联是促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)途径，其导致跨细胞膜的Ca²⁺流入增加，这会促进李斯特菌属向内皮细胞中的进入和它们的后续感染。

LLO也是炎症性细胞因子（诸如IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、TNF-α和IFN-γ）、GM-CSF以及NO、趋化因子和共刺激分子（其对于先天性和适应性免疫应答而言是重要的）的有效诱导物。LLO的诱导促炎性细胞因子的性质被视作TLR4信号途径活化的后果。LLO的高Th1细胞因子诱导活性的一个证据是，杀死的或无毒性的Lm当与LLO一起施用时可以诱导针对Lm的保护性免疫，而在不存在LLO的情况下不会产生所述保护。在有LLO存在下，巨噬细胞会释放IL-1α、TNF-α、IL-12和IL-18，它们又会活化NK细胞以释放IFN-γ，从而导致增强的巨噬细胞活化。

即使在不存在IFN-γ的情况下，IL-18对于针对Lm的抗性而言也是关键的，并且是受感染的巨噬细胞的TNF-α和NO产生所必需的。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1的缺乏会赋予巨噬细胞清除Lm的能力，并造成IFN-γ产生和杀李斯特菌的活性的显著下降，该下降可以被IL-18逆转。重组IFN-γ注射会在天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1^-/-小鼠中恢复对李斯特菌病的先天性抗性。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1活化先于被Lm感染的巨噬细胞的细胞死亡，并且不能逃过吞噬溶酶体的LLO缺陷型突变体具有受损的活化天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1的能力。

由细胞溶质的Lm分泌的LLO会在巨噬细胞中造成特异性基因增量调节，从而导致显著的IFN-γ转录和分泌。细胞溶质的LLO会独立于Toll-样受体(TLR)而活化针对侵袭性Lm的有效I型干扰素应答，没有可检测的NF-KB和MAPK活化。IFN I-特异性的细胞凋亡基因之一，TNF-α有关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)，在Lm感染过程中在脾中被增量调节。缺乏TRAIL的小鼠也更耐受与脾中的淋巴样和髓系细胞死亡同时发生的原发性李斯特菌病。

Lm也会分泌P60，所述P60直接地作用于原初DC，从而以允许活化NK细胞的方式刺激它们的成熟。活化的DC和由NK细胞产生的IFN-y可以增强细胞的(Th1-型)免疫应答。ActA会刺激toll受体，例如在病原体识别和先天性免疫应答活化中起重要作用的TLR-5。

在一个实施方案中，本文提供的Lm疫苗会减少本文另外提供的疾病中的Treg和MDSC的数目。在另一个实施方案中，本文提供的Lm疫苗可用于通过减少受试者的特定部位处的Treg和MDSC的数目而改善免疫应答。这样的部位可以是由变态反应、创伤、感染、疾病引起的炎症部位，或者所述部位可以是肿瘤部位。

在另一个实施方案中，从李斯特菌属处理过的小鼠的肿瘤纯化出的单核细胞和粒细胞MDSC的抑制CD8⁺T细胞分裂的能力低于从未经处理的小鼠的肿瘤纯化出的MDSC，而在用李斯特菌属接种疫苗后，从这些相同荷瘤小鼠的脾纯化出的单核细胞和粒细胞MDSC没有表现出它们的功能的变化(参见本文中的实施例7-11)。在一个实施方案中，观察到该效应，因为脾MDSC仅是抗原特异性的方式产生抑制。因此，使用李斯特菌属的治疗具有下述独特优点：它允许肿瘤抑制细胞诸如Treg和MDSC的肿瘤特异性的抑制(参见本文中的实施例7-11)。由本文提供的方法和组合物的活的减毒的李斯特菌属提供的另一个意外优点是，在肿瘤中存在较低量的Treg，并且持续的那些丧失抑制T细胞复制的能力(参见本文中的实施例7-11)。

在一个实施方案中，本文提供了降低受试者的疾病部位中的抑制细胞的百分比的方法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用活的减毒的李斯特菌属疫苗株。

在另一个实施方案中，本文提供了减小受试者的疾病部位中的抑制细胞的抑制T细胞复制的能力的方法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用活的减毒的李斯特菌属疫苗株。

在一个实施方案中，减少在疾病部位处的抑制细胞的数目会有效地治疗所述疾病。在另一个实施方案中，减少在疾病部位处的抑制细胞的数目会增强在疾病部位处具有所述疾病的受试者的抗疾病免疫应答。在另一个实施方案中，所述免疫应答是细胞介导的免疫应答。在另一个实施方案中，所述免疫应答是肿瘤浸润性的T-淋巴细胞(TIL)免疫应答。

在一个实施方案中，本文提供了降低受试者疾病中的抑制细胞百分比和增强针对受试者疾病的治疗应答的方法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用活的减毒的李斯特菌属疫苗株，由此降低所述疾病中的抑制细胞百分比和增强针对受试者疾病的治疗应答。

在另一个实施方案中，本文提供了减小抑制细胞的抑制受试者疾病中的T细胞复制的能力和增强针对受试者疾病的治疗应答的方法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用活的减毒的李斯特菌属疫苗株。

在一个实施方案中，术语“百分比”是在测定中或在免疫应答中的Treg、MDSC或CD8/CD4T细胞量度的量、数量或数目等的表示。在另一个实施方案中，它表示本文提供的任意组合物、细胞、蛋白、细菌或李斯特菌属细胞的量、数量、百分比等。

在一个实施方案中，本文提供了将重组李斯特菌属疫苗株减毒的方法，其中所述方法包括删除基因组prfA、inlC和actA基因，而在另一个实施方案中，所述减毒是相对于野生型菌株或具有突变体prfA、inlC或actA或其任何毒力基因的突变株而言。在另一个实施方案中，本文提供了还增强本文也提供的重组李斯特菌属疫苗株的免疫原性的方法，其中所述方法包括删除基因组prfA、inlC和actA基因。在一个实施方案中，本文提供了将重组李斯特菌属疫苗株减毒的方法，其中所述方法包括删除基因组prfA、inlC或actA基因，而在另一个实施方案中，所述减毒是相对于野生型菌株或具有突变体prfA、inlC或actA或其任何毒力基因的突变株而言。在另一个实施方案中，本文提供了还增强本文也提供的重组李斯特菌属疫苗株的免疫原性的方法，其中所述方法包括删除基因组prfA、inlC或actA基因。

在另一个实施方案中，本文提供了在从针对肿瘤或癌症的细胞毒性治疗中恢复的受试者中引起增强的免疫应答的方法，所述方法包括给所述受试者施用组合物，所述组合物包含本文提供的重组李斯特菌属菌株。在另一个实施方案中，所述重组李斯特菌属菌株包含inlC基因、actA基因、prfA基因、PlcA基因、PLcB基因、dal基因或dal/dat基因的突变或缺失。在另一个实施方案中，所述重组李斯特菌属菌株包含inlC和actA突变或缺失。在另一个实施方案中，所述重组李斯特菌属菌株包含inlC或actA突变或缺失。在另一个实施方案中，所述重组李斯特菌属菌株由inlC或actA突变或缺失组成。

在一个实施方案中，由本文提供的组合物和方法引起的免疫应答不是抗原特异性的。

在另一个实施方案中，本发明提供了降低癌症或传染性疾病的发病率的方法，所述方法包括施用本发明的组合物。在另一个实施方案中，本发明提供了改善癌症或传染性疾病的方法，所述方法包括施用本发明的组合物。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在一个实施方案中，通过本发明的方法治疗的癌症是乳腺癌。在另一个实施方案中，所述癌症是子宫颈癌。在另一个实施方案中，所述癌症是含有Her2的癌症。在另一个实施方案中，所述癌症是黑素瘤。在另一个实施方案中，所述癌症是胰腺癌。在另一个实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在另一个实施方案中，所述癌症是胃癌。在另一个实施方案中，所述癌症是胰腺的癌性病变。在另一个实施方案中，所述癌症是肺腺癌。在另一个实施方案中，它是多形性胶质母细胞瘤。在另一个实施方案中，它是低氧的实体瘤。在另一个实施方案中，所述癌症是结肠直肠腺癌。在另一个实施方案中，所述癌症是肺鳞状腺癌。在另一个实施方案中，所述癌症是胃腺癌。在另一个实施方案中，所述癌症是卵巢表面上皮肿瘤(例如其良性的、增生性的或恶性的种类)。在另一个实施方案中，所述癌症是口腔鳞状细胞癌。在另一个实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，所述癌症是子宫内膜癌。在另一个实施方案中，所述癌症是膀胱癌。在另一个实施方案中，所述癌症是头颈癌。在另一个实施方案中，所述癌症是前列腺癌。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

应当理解，本发明的方法可以用于治疗任意传染性疾病，在一个实施方案中，所述传染性疾病是细菌感染、病毒感染、微生物感染、微小生物感染、致病性感染或它们的组合。在另一个实施方案中，本发明的方法被用于抑制或遏制受试者的细菌感染、病毒感染、微生物感染、微小生物感染、致病性感染或它们的组合。在另一个实施方案中，本发明提供了引起针对受试者的细菌感染、病毒感染、微生物感染、微小生物感染、致病性感染或它们的组合的细胞毒性T-细胞应答的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了诱导针对受试者的细菌感染、病毒感染、微生物感染、微小生物感染、致病性感染或它们的组合的免疫应答的方法。在一个实施方案中，所述感染是病毒感染，在一个实施方案中，所述病毒是HIV。在一个实施方案中，所述感染是细菌感染，在一个实施方案中，所述细菌是分枝杆菌属，在一个实施方案中，所述细菌感染是结核病。在一个实施方案中，所述感染是真核生物感染，在一个实施方案中，所述真核生物是疟原虫属，在一个实施方案中，所述真核生物感染是疟疾。

在一个实施方案中，本发明提供了在具有伴随性蠕虫感染的受试者中诱导免疫应答的方法，而在另一个实施方案中，所述方法包括使用李斯特菌属疫苗载体。

在另一个实施方案中，本发明提供了在具有伴随的传染性疾病和蠕虫感染的受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括给所述受试者施用治疗有效剂量的李斯特菌属疫苗载体，其中所述李斯特菌属疫苗载体表达和分泌传染性疾病的抗原。

在另一个实施方案中，本发明提供了在具有伴随的传染性疾病和蠕虫感染的受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括给所述受试者施用治疗有效剂量的李斯特菌属疫苗载体，其中所述李斯特菌属疫苗载体表达和分泌传染性疾病的抗原，所述抗原与额外的免疫原性多肽融合。

在另一个实施方案中，本发明提供了在受试者中增强针对传染性疾病的先天性免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用治疗有效剂量的组合物，所述组合物包含本文提供的李斯特菌属疫苗载体。

在一个实施方案中，本发明提供了在受试者中引起增强的对传染性疾病的免疫应答的方法，所述方法包括给所述受试者施用治疗有效剂量的组合物，所述组合物包含本文提供的李斯特菌属疫苗载体。在另一个实施方案中，所述免疫应答不是抗原特异性的。

在另一个实施方案中，本发明提供了预防传染性疾病在受试者中发作的方法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用治疗有效剂量的组合物，所述组合物包含本文提供的李斯特菌属疫苗载体。在另一个实施方案中，所述免疫应答不是抗原特异性的。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗受试者的传染性疾病的方法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用治疗有效剂量的组合物，所述组合物包含本文提供的李斯特菌属疫苗载体。在另一个实施方案中，所述免疫应答不是抗原特异性的。

在一个实施方案中，所述传染性疾病是由下述病原体（但不限于此）中的任一种造成的疾病：卡介苗/结核病、疟疾、恶性疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫、轮状病毒、霍乱、白喉-破伤风、百日咳、流感嗜血杆菌、乙型肝炎、人乳头瘤病毒、季节性流感)、A型流感(H1N1)大范围流行、麻疹和风疹、腮腺炎、脑膜炎球菌A+C、口服脊髓灰质炎疫苗（单价、二价和三价）、肺炎球菌、狂犬病、破伤风类毒素、黄热病、炭疽芽孢杆菌(炭疽)、肉毒棱状芽孢杆菌毒素(肉毒中毒)、鼠疫耶尔森菌(瘟疫)、重型天花(天花)和其它有关的痘病毒、土拉热弗朗西丝菌(土拉菌病)、病毒性出血热、沙粒病毒(LCM、胡宁病毒、马丘波病毒、瓜纳瑞托病毒、拉沙热)、布尼亚病毒(汉坦病毒属、裂谷热)、黄病毒属(登革热)、线状病毒(埃博拉病毒、马尔堡病毒)、假鼻疽伯克霍尔德菌、伯内特考克斯体(Q热)、布鲁杆菌属种(布鲁杆菌病)、鼻疽伯克霍尔德菌(鼻疽)、鹦鹉衣原体(鹦鹉热)、蓖麻蛋白毒素(来自蓖麻)、产气荚膜梭菌的ε毒素、葡萄球菌属肠毒素B、斑疹伤寒热(普氏立克次体)、其它立克次体属、食品和水传播的病原体、细菌(致腹泻性的大肠杆菌、致病性的弧菌属、志贺氏菌属种、沙门氏菌属/卡介苗、空肠弯曲杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌)、病毒(杯状病毒、甲型肝炎、西尼罗病毒、LaCrosse、加利福尼亚脑炎、VEE、EEE、WEE、日本脑炎病毒、科萨努尔森林病毒、尼帕病毒、汉坦病毒属、蜱传出血热病毒、切昆贡亚病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、蜱传脑炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头状瘤病毒(HPV))、原生动物(小隐孢子虫、卡晏环孢子虫、兰伯贾第虫、溶组织内阿米巴、弓形虫属)、真菌(微孢子目)、黄热病、结核病（包括药物抗性的TB）、狂犬病、朊病毒、严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)、Coccidioides posadasii、粗球孢子菌、细菌性阴道病、沙眼衣原体、巨细胞病毒、腹股沟肉芽肿、杜克雷嗜血杆菌、淋病奈瑟球菌、苍白密螺旋体、阴道毛滴虫或本领域已知的在本文中没有列出的任意其它传染性疾病。

在另一个实施方案中，所述传染性疾病是家畜传染性疾病。在另一个实施方案中，家畜疾病可以传播给人类，且被称作“人畜共患病”。在另一个实施方案中，这些疾病包括、但不限于：口蹄疫、西尼罗病毒、狂犬病、犬细小病毒、猫白血病病毒、马流感病毒、传染性牛鼻气管炎(IBR)、伪狂犬病、古典猪瘟(CSF)、由牛的1型牛疱疹病毒(BHV-1)感染造成的IBR和猪的伪狂犬病(奥尔斯基病)、弓形虫病、炭疽、水疱性口炎病毒、马红球菌、土拉菌病、瘟疫(鼠疫耶尔森菌)、毛滴虫属。

在本发明的方法的另一个实施方案中，所述受试者产生针对表达抗原的肿瘤或靶抗原的免疫应答，由此介导抗肿瘤作用。

在一个实施方案中，用于本发明中的重组单核细胞增生李斯特菌会分泌异源肽。在另一个实施方案中，用于本发明中的重组单核细胞增生李斯特菌会表达异源肽。在另一个实施方案中，用于本发明中的重组单核细胞增生李斯特菌会表达和分泌如本文中所述的非溶血性LLO。

在一个实施方案中，本发明的治疗方案是治疗性的。在另一个实施方案中，所述方案是预防性的。在另一个实施方案中，使用本发明的疫苗来保护处于癌症（诸如乳腺癌或其它类型的肿瘤）风险中的人，所述风险归因于家族性遗传学或技术人员会理解的使他们易患这些类型的疾病的其它情况。类似地，在另一个实施方案中，使用本发明的疫苗来保护处于传染性疾病（诸如结核病、疟疾、流感和利什曼病）风险中的人。在另一个实施方案中，在疾病早期，或在通过外科手术切除肿瘤生长物、常规化学疗法或辐射治疗以后，使用所述疫苗作为癌症免疫疗法。在这样的治疗以后，施用本发明的疫苗，使得针对疫苗的肿瘤抗原的CTL应答会破坏剩余的转移灶和延长癌症缓解。在另一个实施方案中，使用本发明的疫苗来影响以前建立的肿瘤的生长和杀死现存的肿瘤细胞。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，在上述的任意方法中使用的疫苗和免疫原性组合物具有本发明的疫苗和免疫原性组合物的任意特征。每种特征代表本发明的一个单独实施方案。

本发明涵盖剂量范围的不同实施方案。在一个实施方案中，在疫苗载体的情况下，所述剂量是在0.4LD₅₀/剂的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是约0.4-4.9LD₅₀/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是约0.5-0.59LD₅₀/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是约0.6-0.69LD₅₀/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是约0.7-0.79LD₅₀/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是约0.8LD₅₀/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是0.4LD₅₀/剂至0.8LD₅₀/剂。

在另一个实施方案中，所述剂量是10⁷个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是1.5x10⁷个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是2x10⁷个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是3x10⁷个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是4x10⁷个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是6x10⁷个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是8x10⁷个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是1x10⁸个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是1.5x10⁸个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是2x10⁸个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是3x10⁸个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是4x10⁸个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是6x10⁸个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是8x10⁸个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是1x10⁹个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是1.5x10⁹个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是2x10⁹个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是3x10⁹个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是5x10⁹个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是6x10⁹个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是8x10⁹个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是1x10¹⁰个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是1.5x10¹⁰个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是2x10¹⁰个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是3x10¹⁰个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是5x10¹⁰个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是6x10¹⁰个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是8x10¹⁰个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是8x10⁹个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是1x10¹¹个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是1.5x10¹¹个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是2x10¹¹个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是3x10¹¹个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是5x10¹¹个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是6x10¹¹个细菌/剂。在另一个实施方案中，所述剂量是8x10¹¹个细菌/剂。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在一个实施方案中，本发明的佐剂疫苗包含联合施用的疫苗。在另一个实施方案中，按照疫苗方案的施用来施用本发明的佐剂疫苗，其中所述疫苗方案是病毒、细菌、核酸或重组多肽疫苗制剂。

在另一个实施方案中，“佐剂”通常表示这样的化合物：当被施用给个体或在体外试验时，其会在施用抗原的个体或试验系统中增加对所述抗原的免疫应答。在另一个实施方案中，免疫佐剂会增强对抗原的免疫应答，所述抗原在单独施用时是弱免疫原性的，即，不诱导或者诱导较弱的抗体滴度或细胞介导的免疫应答。在另一个实施方案中，所述佐剂会增加针对抗原的抗体滴度。在另一个实施方案中，所述佐剂会降低在个体中有效地实现免疫应答的抗原的剂量。但是，在一个实施方案中，在本发明中，所述佐剂以抗原非特异性的方式增强免疫应答，从而实现免疫应答的增强状态（这适用于新生儿），或者实现在细胞毒性治疗以后的免疫应答恢复（这适用于老年人、儿童和成年人），并且也在本文中还提供。

在另一个实施方案中，本发明的方法另外包括下述步骤：给所述受试者施用强化疫苗接种。在一个实施方案中，所述强化疫苗接种跟随在单次初次疫苗接种之后。在另一个实施方案中，在初次疫苗接种之后施用单次强化疫苗接种。在另一个实施方案中，在初次疫苗接种之后施用2次强化疫苗接种。在另一个实施方案中，在初次疫苗接种之后施用3次强化疫苗接种。在一个实施方案中，初次和强化疫苗之间的时段由技术人员通过实验确定。在另一个实施方案中，初次和强化疫苗之间的时段是1周，在另一个实施方案中，它是2周，在另一个实施方案中，它是3周，在另一个实施方案中，它是4周，在另一个实施方案中，它是5周，在另一个实施方案中，它是6-8周，在另一个实施方案中，在初次疫苗以后8-10周施用强化疫苗。

在一个实施方案中，将本发明的疫苗或免疫原性组合物单独地施用给受试者。在另一个实施方案中，将所述疫苗或免疫原性组合物与另一种癌症治疗一起施用。在另一个实施方案中，所述癌症治疗是化学疗法、免疫疗法、辐射、外科手术或技术人员会理解的本领域可利用的任意其它类型的疗法。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在一个实施方案中，使用同源重组，将所述构建体或核酸分子整合进李斯特菌的染色体中。同源重组技术是本领域众所周知的，且被描述在，例如，Baloglu S,Boyle SM,等人(Immune responses of mice to vacciniavirus recombinants expressing either Listeria monocytogenes partiallisteriolysin or Brucella abortus ribosomal L7/L12protein.Vet Microbiol2005,109(1-2):11-7)；和Jiang LL,Song HH,等人(Characterization of amutant Listeria monocytogenes strain expressing green fluorescent protein.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)2005,37(1):19-24)。在另一个实施方案中，如在美国专利号6,855,320中所述进行同源重组。在该情况下，通过在hly启动子控制下的E7基因的染色体整合，制备表达E7的重组Lm菌株，并且包含hly信号序列以确保基因产物的分泌，从而产生被称作Lm-AZ/E7的重组体。在另一个实施方案中，使用温度敏感的质粒来选择所述重组体。每种技术代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，使用转座子插入，将所述构建体或核酸分子整合进李斯特菌的染色体中。转座子插入技术是本领域众所周知的，且由Sun等人(Infection and Immunity1990,58:3770-3778)在DP-L967的构建中描述，以及描述在其它文献中。在另一个实施方案中，转座子诱变具有可以形成稳定的基因组插入突变体的优点，但是具有下述缺点：外源基因在基因组中已经插入的位置是未知的。

在另一个实施方案中，使用噬菌体整合位点(Lauer P,Chow MY等人,Construction,characterization,and use of two Listeria monocytogenessite-specific phage integration vectors.J Bacteriol2002;184(15):4177-86)，将所述构建体或核酸分子整合进李斯特菌的染色体中。在该方法的某些实施方案中，使用噬菌体(例如U153或PSA李斯特噬菌体)的整合酶基因和附着位点将异源基因插入对应的附着位点中，后者可以是基因组中的任何适当的位点(例如comK或arg tRNA基因的3’末端)。在另一个实施方案中，内源原噬菌体从构建体或异源基因整合之前利用的附着位点自愈。在另一个实施方案中，该方法产生单拷贝整合体。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，使用多种启动子之一来表达含有它们的蛋白。在一个实施方案中，使用Lm启动子，例如分别编码李斯特菌蛋白溶血素、ActA、磷脂酰肌醇-特异性的磷脂酶、磷脂酶C和金属蛋白酶的基因hly、actA、plcA、plcB和mpl的启动子。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，从附加型载体表达所述构建体或核酸分子，所述附加型载体含有编码LLO、PEST或ActA序列或其功能片段的内源核酸序列。在另一个实施方案中，所述构建体或核酸分子包含各自编码第一多肽和至少第二多肽的第一开放读码框和至少第二开放读码框，其中所述第一多肽和所述至少第二多肽各自包含与含有PEST的内源多肽融合的异种抗原或其功能片段。这样的组合物描述于美国专利申请系列号13/290,783中，其通过引用整体并入本文。

在另一个实施方案中，所述含PEST多肽是截短的非溶血性LLO、N-端ActA或PEST序列。

在另一个实施方案中，本文提供了包含附加型重组核酸分子的重组李斯特菌属菌株，所述核酸分子包含各自编码第一多肽和至少第二多肽的第一开放读码框和至少第二开放读码框，其中所述第一多肽和所述至少第二多肽各自包含与含有PEST的内源多肽融合的异种抗原或其功能片段，其中所述核酸还包含编码质粒复制控制区的开放读码框。这样的组合物描述于美国专利申请系列号13/290,783中，通过引用整体并入本文。

在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物利用本发明的异种抗原或LLO序列的同系物。当提及任何蛋白或肽时，术语“同源性”、“同源的”等在一个实施方案中表示，在将序列对齐并在必要时引入缺口以达到最大同源性百分比后，且在不将任何保守置换视为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中与相应天然多肽的残基相同的氨基酸残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域众所周知的。

在另一个实施方案中，当提及任何核酸序列时，术语“同源性”类似地指示候选序列中与相应天然核酸序列的核苷酸相同的核苷酸的百分比。

在一个实施方案中，通过本领域熟知的方法，通过用于序列比对的计算机算法确定同源性。例如，核酸序列同源性的计算机算法分析可以包括使用任何数目的可利用的软件包，例如，BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLAST Enhanced Alignment Utility),GENPEPT和TREMBL包。

在另一个实施方案中，“同源性”表示与选自SEQ ID No:1-41的序列大于约70%的同一性。在另一个实施方案中，“同源性”表示与选自SEQ IDNo:1-41的序列大于约70%的同一性。在另一个实施方案中，所述同一性大于约75%。在另一个实施方案中，所述同一性大于约78%。在另一个实施方案中，所述同一性大于约80%。在另一个实施方案中，所述同一性大于约82%。在另一个实施方案中，所述同一性大于约83%。在另一个实施方案中，所述同一性大于约85%。在另一个实施方案中，所述同一性大于约87%。在另一个实施方案中，所述同一性大于约88%。在另一个实施方案中，所述同一性大于约90%。在另一个实施方案中，所述同一性大于约92%。在另一个实施方案中，所述同一性大于约93%。在另一个实施方案中，所述同一性大于约95%。在另一个实施方案中，所述同一性大于约96%。在另一个实施方案中，所述同一性大于约97%。在另一个实施方案中，所述同一性大于98%。在另一个实施方案中，所述同一性大于约99%。在另一个实施方案中，所述同一性是100%。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，通过确定候选序列杂交而确定同源性，其方法在现有技术中有充分描述(参见，例如，“Nucleic Acid Hybridization”Hames,B.D.,和Higgins S.J.,编(1985);Sambrook等人,2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.；和Ausubel等人,1989,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associatesand Wiley Interscience,N.Y)。例如，可以在对于编码天然天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶肽的DNA的补体而言是中等至严谨条件下进行杂交方法。杂交条件为，例如，在包含下述物质的溶液中在42℃温育过夜：10-20%甲酰胺、5X SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5X登哈特溶液、10%硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的剪切的鲑鱼精DNA。

在本发明的一个实施方案中，“核酸”表示一串至少两个碱基-糖-磷酸的组合。在一个实施方案中，该术语包括，DNA和RNA。在一个实施方案中，“核苷酸”表示核酸聚合物的单体单元。在一个实施方案中，RNA可以呈tRNA(转移RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA、小抑制性RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和核酶的形式。siRNA和miRNA的应用已经有描述(Caudy AA等人,Genes&Devel16:2491-96和其中引用的参考文献)。DNA可以呈质粒DNA、病毒DNA、线性DNA或染色体DNA或这些组的衍生物的形式。此外，这些形式的DNA和RNA可以是单链、双链、三链或四链的。在另一个实施方案中，该术语还包括人工核酸，其可以含有其它类型的主链，但含有相同的碱基。在一个实施方案中，所述人工核酸是PNA(肽核酸)。PNA含有肽主链和核苷酸碱基，且在一个实施方案中，其能够结合DNA和RNA分子。在另一个实施方案中，所述核苷酸被氧杂环丁烷修饰。在另一个实施方案中，所述核苷酸通过用硫代磷酸酯键置换一个或多个磷酸二酯键而被修饰。在另一个实施方案中，所述人工核酸含有本领域已知的天然核酸的磷酸酯主链的任意其它变体。硫代磷酸酯核酸和PNA的应用是本领域技术人员已知的，且被描述在，例如，Neilsen PE,Curr Opin Struct Biol9:353-57；和Raz NK等人Biochem Biophys Res Commun.297:1075-84。核酸的制备和应用是本领域技术人员已知的，且被描述在，Molecular Cloning,(2001),Sambrook和Russell,编，以及Methods in Enzymology:Methods formolecular cloning in eukaryotic cells(2003)Purchio和G.C.Fareed。每种核酸衍生物代表本发明的一个单独实施方案。

在一个实施方案中，如下确定本文中列出的任意氨基酸序列的蛋白和/或肽同源性：通过本领域熟知的方法（包括免疫印迹分析），或通过利用许多可得到的软件包中的任一种进行氨基酸序列的计算机算法分析，通过确立的方法。这些包中的一些可以包括FASTA、BLAST、MPsrch或Scanps包，且可以采用例如Smith和Waterman算法、和/或总体/局部或BLOCKS比对进行分析算法。每种确定同源性的方法代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包含用于实施本发明的方法的试剂。在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包含本发明的组合物、工具或仪器。

在一个实施方案中，术语“接触”或“施用”表示，使癌细胞或肿瘤与本发明的组合物直接接触。在另一个实施方案中，该术语表示，使癌细胞或肿瘤与本发明的组合物间接接触。在另一个实施方案中，本发明的方法包括这样的方法：其中使受试者与本发明的组合物接触，然后使所述组合物通过扩散或本领域已知的任意其它主动转运或被动转运过程（由此使化合物在体内循环）与癌细胞或肿瘤接触。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

在另一个实施方案中，术语“基因”和“重组基因”表示，包含编码本发明多肽的开放读码框的核酸分子。这样的天然等位基因变异通常可以导致给定基因的核苷酸序列的1-5%差异。通过对许多不同个体或生物体中的目标基因测序，可以鉴别替代性的等位基因。这可以如下容易地实现：使用杂交探针来鉴别多种个体或生物体中的相同遗传基因座。任意和所有这样的核苷酸变异和产生的氨基酸多态性或变异（其归因于天然的等位基因变异，且其不会改变功能活性）意图在本发明的范围内。

药物组合物

在另一个实施方案中，通过本领域技术人员已知的任意方法，诸如胃肠外地、癌旁地、透粘膜地、透皮地、肌肉内地、静脉内地、真皮内地、皮下地、腹膜内地、心室内地、颅内地、阴道内地或肿瘤内地，将本发明的含有疫苗和组合物的药物组合物施用给受试者。

在本文提供的方法和组合物的另一个实施方案中，口服施用所述疫苗或组合物，且因此将其被配制为适合口服施用的形式，即，作为固体或液体制剂。合适的固体口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、药丸等。合适的液体口服制剂包括溶液、混悬液、分散剂、乳剂、油剂等。在本发明的另一个实施方案中，所述活性成分被配制为胶囊剂。根据该实施方案，本发明的组合物除了包含活性化合物和惰性载体或稀释剂以外，还包含明胶胶囊。

在另一个实施方案中，通过静脉内、动脉内、或肌肉内注射液体制剂来施用所述疫苗或组合物。合适的液体制剂包括溶液、混悬液、分散剂、乳剂、油剂等。在一个实施方案中，静脉内地施用所述药物组合物，且因此将其配制为适合静脉内施用的形式。在另一个实施方案中，动脉内地施用所述药物组合物，且因此将其配制为适合动脉内施用的形式。在另一个实施方案中，肌肉内地施用所述药物组合物，且因此将其配制为适合肌肉内施用的形式。

在一个实施方案中，术语“治疗”表示治愈疾病。在另一个实施方案中，“治疗”表示预防疾病。在另一个实施方案中，“治疗”表示降低疾病的发病率。在另一个实施方案中，“治疗”表示改善疾病的征状。在另一个实施方案中，“治疗”表示诱导缓解。在另一个实施方案中，“治疗”表示减慢疾病的进展。在另一个实施方案中，术语“减轻”、“遏制”和“抑制”表示减轻或减少。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。

术语“治疗有效剂量”或“治疗有效量”是指产生期望的作用的剂量，所述作用是施用的目的。确切剂量可由本领域技术人员使用已知的技术确定。

本文中使用的术语”约”以定量方式表示加或减5%，或在另一个实施方案中表示加或减10%，或在另一个实施方案中表示加或减15%，或在另一个实施方案中表示加或减20%。

在一个实施方案中，术语”受试者”表示，需要治疗病症或它的后遗症或者易感病症或它的后遗症的哺乳动物，包括人。受试者可以包括狗、猫、猪、牛、绵羊、山羊、马、大鼠和小鼠和人类。术语”受试者”不排除在所有方面正常的个体。

为了更充分地举例说明本发明的优选实施方案，提供了下述实施例。但是，所述实施例绝不应当解释为限制本发明的宽范围。

实施例

材料和实验方法

细菌菌株、转化和选择

使用标准方案，将大肠杆菌菌株MB2159用于转化。通过用H₂O洗涤，将细菌细胞准备用于电穿孔。

大肠杆菌菌株MB2159(Strych U等人,FEMS Microbiol Lett.2001Mar15;196(2):93-8)是不能合成D-丙氨酸消旋酶的alr(-)/dadX(-)缺陷型突变体。李斯特菌属菌株Lm dal(-)/dat(-)(Lmdd)由于dal和dat基因的部分缺失同样不能合成D-丙氨酸消旋酶。

质粒构建

使用公开的plcA基因的序列(Mengaud等人,Infect.Immun.198957,3695-3701)，使用PCR扩增来自染色体DNA的基因。然后使用SalI-和XbaI产生的DNA末端将扩增产物连接进pAM401中，以产生pDP1462。

如下构建含有单独prfA的质粒pDP1500：在用XbaI和PstI限制酶切以后，从pDP1462删除plcA基因，即碱基429-1349(Mengaud等人,出处同上)，用T4DNA聚合酶处理DNA末端以使它们成为钝端，并进行分子内连接。

如下构建含有plcA启动子和plcA的3'末端的一部分的质粒pDP1499：在用PstI和NsiI限制酶切以后，从pDP1339删除plcA内部片段，即碱基428-882(Mengaud等人,Infect.Immun.198957,3695-3701)，并进行分子内连接。

通过单次连接下述3部分，构建pDP1526(pKSV7：ΔplcA)：用BAMHI和XbaI限制酶切的pKSV7；得自pAM401的XbaI和NsiI产生的468碱基对片段：含有plcA的5'末端的plcA(碱基882-1351;Mengaud等人,出处同上)；和，得自pAM401的PstI-和BamHI-产生的501碱基对片段：含有plcA的3'末端的plcA prfA(碱基77-429;Mengaud等人,出处同上)。

通过EcoRI和PstI双重消化pDP1462，分离出prfA启动子，即碱基1-429(Mengaud等人,出处同上)，随后将该片段连接进EcoRI-和PstI-限制酶切的pKSV7中，以产生pDP1498。将2个随机的HindIII-产生的10403S染色体DNA片段（长度为大约3kb）连接进HindIII-限制酶切的pKSV7中，以产生随机的整合控制质粒pDP1519和pDP1521。

产单核细胞李斯特菌突变株的构建

从如以前所述构建的SLCC5764的Tn917-LTV3库(Camilli等人,J.Bacteriol.1990,172,3738-3744)，分离出产单核细胞李斯特菌菌株DP-L1387作为具有减少的卵磷脂酶的突变体(PC-PLC)。通过如以前所述对一个转座子-染色体DNA连接部测序(Sun等人,Infect.Immun.199058,3770-3778)，确定Tn917-LTV3插入位点。如以前所述(Camilli等人,出处同上)，用质粒DNA转化产单核细胞李斯特菌。在有10μg氯霉素/ml培养基存在下，施加用于维持pAM401、pKSV7和它们在产单核细胞李斯特菌中的衍生物的选择压力。另外，pKSV7衍生物的维持需要在30℃（革兰氏阳性细菌中的质粒复制的许可温度）生长。

pKSV7衍生物向产单核细胞李斯特菌染色体中的整合，通过质粒上的产单核细胞李斯特菌DNA序列和它们的对应染色体等位基因之间的同源重组而发生。通过在含有10μg氯霉素/ml培养基的脑心浸液(BHI)液体培养基中在40℃（pKSV7复制的非许可温度）培养大约30代，富集整合突变体。随后在含有10μg氯霉素/ml培养基的BHI琼脂上菌落纯化每个整合菌株，并在40℃温育。从每个整合菌株分离出的染色体DNA的DNA印迹分析证实了整合的质粒的存在。

如上所述，通过pKSV7衍生物pDP1526的整合，实现DP-L1552的构建，以产生部分二倍体中间体。整合的质粒通过分子内同源重组实现的自发切除以低频率发生。通过在BHI液体培养基中在30℃培养大约50代，富集这样的细菌：其中质粒已经从染色体切离。在该步骤中的选择压力的性质是未知的，但是可能是由于含有整合的温度敏感质粒的菌株的轻微生长缺陷。大约50%的切除事件，即，由缺失的3'侧的序列之间的同源重组产生的那些，导致ΔplcA对染色体上的野生型等位基因的等位基因交换。

通过将所述细菌在BHI中在40℃培养大约30代，使切离的质粒自愈。如下鉴别在染色体上保留ΔplcA等位基因的自愈质粒的细菌：在含有5mlBHI琼脂/2.5%蛋黄/2.5%磷酸盐缓冲盐水(PBS)(BHI/蛋黄琼脂)的覆盖层的BHI琼脂平板上培养以后，它们不能在菌落周围产生浑浊地带。浑浊地带源自蛋黄中的PI的PI-PLC水解，从而产生不溶性的二酰甘油沉淀物。通过使用PCR扩增缺失的等位基因和对缺失测序，证实在产单核细胞李斯特菌染色体上的正确plcA缺失。

因而，根据本发明，可以使用PI-PLC阴性突变体(plcA缺失突变体)来产生减毒的产单核细胞李斯特菌疫苗。使用相同方法制备其它突变体，即，actA缺失突变体、plcB缺失突变体和缺失plcA和plcB二者的双重突变体，它们也都可以根据本公开内容用于产生减毒的产单核细胞李斯特菌疫苗。鉴于本公开内容，本领域技术人员将能够制备除了上述的那些以外的其它减毒的突变体。

Lmdd的构建

首先借助于染色体基因和温度敏感的穿梭质粒pKSV7之间的双等位基因交换(Smith K等人,Biochimie.1992Jul-Aug;74(7-8):705-11)，将dal基因灭活，所述穿梭质粒pKSV7携带在得自原始850-bp dal基因PCR产物的5′末端的450-bp片段和得自dal基因PCR产物的3′末端的450-bp片段之间的红霉素抗性基因。随后，通过使用pKSV7的类似交换反应，构建覆盖82%的基因的dal缺失突变体，所述pKSV7携带得自期望的缺失周围的完整基因(包括所述基因的上游和下游序列)的5′和3′末端的同源性区域。使用PCR分析确认该染色体缺失的结构。

通过类似的等位基因交换反应，将染色体dat基因灭活。将pKSV7修饰成携带450-bp片段，该片段通过PCR衍生自完整dat基因(包括所述基因的上游和下游序列)的5′和3′末端。通过适当的PCR，连接这2个片段。该构建体向染色体中的交换，会导致dat基因的30%的中央碱基的缺失，这通过PCR分析进行证实。

李斯特菌属的细菌培养物和体内传代

按照标准方法，培养大肠杆菌。在含有50μg/ml链霉素的LB培养基(Difco,Detroit,MI)中在37℃、250rpm摇动下培养李斯特菌属，并在指数生长期中收获。对于Lm-LLOE7，将37μg/ml氯霉素加入培养基中。对于生长动力学确定，在10ml LB+抗生素中培养细菌16小时。测量OD_600nm，并将培养物密度在菌株之间标准化。将培养物1:50稀释进LB+合适的抗生素和D-丙氨酸（如果适用的话）中。

Lm在小鼠中的传代

将1x10⁸个CFU腹膜内地(ip.)注射进C57BL/6小鼠。在第3天，分离脾，并在PBS中均质化。将脾混悬液的等分试样铺板在含有抗生素（如果适用的话）的LB平板上。繁殖几个菌落，并混合，以建立注射储备液。

不含抗生素抗性因子的质粒pTV3的构建

p60-dal盒的构建。构建不含抗生素抗性基因的载体的第一步是，构建截短的p60启动子与dal基因的融合体。通过从Lm菌株10403S的基因组PCR扩增，分离出Lm丙氨酸消旋酶(dal)基因(正向引物:5'-CCA TGGTGA CAG GCT GGC ATC-3';SEQ ID NO:20)(反向引物:5'-GCT AGCCTA ATG GAT GTA TTT TCT AGG-3';SEQ ID NO:21)和最小p60启动子序列(正向引物:5'-TTA ATT AAC AAA TAG TTG GTA TAG TCC-3';SEQ ID No:22)(反向引物:5'-GAC GAT GCC AGC CTG TCA CCATGG AAA ACT CCT CTC-3';SEQ ID No:23)。所述引物会引入p60序列的上游PacI位点、dal序列的下游NheI位点(限制位点以粗体显示)和p60启动子的下游重叠dal序列(前18个碱基对)，用于随后通过剪接重叠延伸(SOE)-PCR融合p60和dal。截短的p60启动子的序列为：CAAATAGTTGGTATAGTCCTCTTTAGCCTTTGGAGTATTATCTCATCATTTGTTTTTTAGGTGAAAACTGGGTAAACTTAGTATTATCAATATAAAATTAATTCTCAAATACTTAATTACGTACTGGGATTTTCTGAAAAAAGAGAGGAGTTTTCC(SEQ ID NO:24Kohler等人,JBacteriol173:4668-74,1991)。使用SOE-PCR，融合p60和dal PCR产物，并克隆进克隆载体pCR2.1(Invitrogen,La Jolla,CA)中。

从pGG55除去抗生素抗性基因。从pGG55除去氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因和引入p60-dal盒的后续克隆策略也会间断地导致革兰氏阳性复制区域(oriRep;Brantl等人,Nucleic Acid Res18:4783-4790,1990)的除去。为了重新引入革兰氏阳性oriRep，使用在该序列上游添加NarI/EheI位点的5'-引物(GGCGCCACTAACTCAACGCTAGTAG,SEQ ID NO:25)和在该序列下游添加NheI位点的3'-引物(GCTAGCCAGCAAAGAAAAACAAACACG,SEQ ID NO:26)，从pGG55PCR扩增oriRep。将PCR产物克隆进克隆载体pCR2.1中，并验证序列。

为了将p60-dal序列整合进pGG55载体中，通过PacI/NheI双消化，从pCR-p60dal切离p60-dal表达盒。通过PCR(引物1,5'-GTC GAC GGTCAC CGG CGC CAC TAA CTC AAC GCT AGT AG-3';SEQ ID No:27)、(引物2,5'-TTA ATT AAG CTA GCC AGC AAA GAA AAA CAAACA CG-3';SEQ ID No:28)，从pCR-oriRep扩增革兰氏阳性细菌在pGG55中的复制区域，以引入额外的EheI和NheI限制位点。将PCR产物连接进pCR2.1-TOPO(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中，并验证序列。通过EheI/NheI消化，切离复制区域，并用EheI和NheI双重消化载体pGG55，从而从质粒同时除去2个CAT基因。将2个插入片段（p60-dal和oriRep）和pGG55片段连接到一起，产生pTV3(图1)。pTV3也含有prfA(致病性调节因子A)基因。该基因不是pTV3的功能所必需的，但是可以用于这样的情形：其中需要或期望额外的选择的标志物。

用于实时PCR的DNA的制备

使用

Total DNA试剂盒(Epicentre,Madison,WI)，制备全李斯特菌属DNA。将李斯特菌属在25ml Luria-Bertoni液体培养基(LB)中在37℃和250rpm摇动下培养24小时。通过离心使细菌细胞沉淀，再悬浮于补充了5mg/ml溶菌酶的PBS中，并在37℃温育20分钟，此后分离DNA。

为了得到用于实时PCR的标准靶DNA，从pGG55PCR扩增LLO-E7基因((5'-ATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTAC-3'(SEQ ID NO:29)；5'-GCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGTGGTTTCTGAGAACAGATG-3'(SEQ ID NO:30))，并克隆进载体pETblue1(Novagen,San Diego,CA)。类似地，将plcA扩增子克隆进pCR2.1。分别用pET-LLOE7和pCR-plcA转化大肠杆菌，并制备纯化的质粒DNA用于实时PCR。

实时PCR

使用下述引物：5'-GCAAGTGTGACTCTACGCTTCG-3'(SEQ IDNO:31)；5'-TGCCCATTAACAGGTCTTCCA-3'(SEQ ID NO:32)；5'-FAM-TGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTAC-TAMRA-3'(SEQ ID NO:33)和单拷贝基因plcA(TGACATCGTTTGTGTTTGAGCTAG-3'(SEQ ID NO:34,5'-GCAGCGCTCTCTATACCAGGTAC-3'(SEQ ID NO:35)；5'-TET-TTAATGTCCATGTTATGTCTCCGTTATAGCTCATCGTA-TAMRA-3';SEQ ID NO:36)作为李斯特菌属基因组靶标，使用ABIPrimerExpress软件(Applied Biosystems)，用E7作为质粒靶标，设计Taqman引物-探针集合(Applied Biosystems,Foster City,CA)。

按照生产商的推荐，将0.4μM引物和0.05mM探针与PuRE Taq RTGPCR珠子(Amersham,Piscataway,NJ)混合。使用纯化的质粒DNA、pET-LLOE7和pCR-plcA(内部标准品)，制备每种靶标的标准曲线，并用于计算未知样品中的基因拷贝数。基于标准曲线，计算E7拷贝/plcA拷贝的平均比率，并通过将Lmdd-TV3和Lm-LLOE7的结果除以得自Lm-E7的结果来进行校准，所述Lm-E7是含有整合进基因组中的E7基因的单个拷贝的李斯特菌属菌株。在每个重复3次的qPCR测定中，一式三份地运行所有样品。使用KyPlot软件，通过双因素方差分析（Two-Way ANOVA），分析样品之间的变异。如果p<0.05，将结果视作统计上显著的。

生长测量

在Luria Bertani(LB)培养基±100微克(μg)/ml D-丙氨酸和/或37μg/ml氯霉素中，在37℃、250rpm摇动下培养细菌。基于OD₆₀₀nm测量结果，调节起始接种物至所有菌株为相同值。

溶血裂解测定

融化4x10⁹CFU的李斯特菌属，通过离心(1分钟,14000rpm)进行沉淀，并再悬浮于100μl含有1M半胱氨酸的PBS（pH5.5）中。将细菌进行系列1:2稀释，并在37℃温育45分钟，以便活化分泌的LLO。将去纤维蛋白的全绵羊血液(Cedarlane,Hornby,Ontario,加拿大)用5体积的PBS洗涤2次，并用6体积的PBS-半胱氨酸洗涤3-4次，直到上清液保持澄清，在洗涤步骤之间将细胞在3000x g沉淀8分钟，然后在PBS-半胱氨酸中再悬浮至10%(v/v)的终浓度。将100μl10%经洗涤的血细胞与100μl李斯特菌属混悬液混合，并在37℃温育另外45分钟。然后通过离心(10分钟,1000x g)，沉淀未裂解的血细胞。将100μl上清液转移进新平板，并确定OD_530nm，相对于样品稀释度绘图。

Lmdd-Tv3的治疗效果

将10⁵TC-1(ATCC,马纳萨斯,VA)皮下地植入C57BL/6小鼠(n=8)中，并允许其生长约7天，此后，肿瘤是可触知的。TC-1是用HPV E6和E7永生化并用活化的ras转化的C57BL/6上皮细胞系，其在皮下植入后形成肿瘤。在肿瘤细胞植入后第7和14天，用0.1LD₅₀的适当的李斯特菌属菌株免疫小鼠。还包括未免疫的对照组(原初)。用电子测径器测量肿瘤生长。

LmddAinlC的构建

通过存在于质粒（其就DNA复制而言是温度敏感的）上的靶基因和同源序列之间的同源重组，在李斯特菌属染色体中引入缺失。在将质粒转化进宿主以后，在非许可温度(42℃)培养过程中，在维持选择压力的同时，选择质粒通过单个交换事件向染色体中的整合。随后在许可温度(30℃)培养共合体会导致第二重组事件，从而导致它们的分辨。

为了建立缺失突变体，通过PCR扩增存在于inl C区域（在图中指示）的上游和下游的DNA片段(在图2和3和各个SEQ ID NO:37和SEQ IDNO:38中指示)。

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GAATTCatggcgcgggatggtatactatacaagcgtatggttcaaaaagatactttgaattaagaagtacaataaagttaacttcattagacaaaaagaaaaaacaaggaagaatagtacatagttataaatacttggagagtgaggtgtaatatgggggcagctgatttttggggtttcatatatgtagtttcaagattagccattgttgcggcagtagtttacttcttatacttattgagaaaaattgcaaataaatagaaaaaaagccttgtcaaacgaggctttttttatgcaaaaaatacgacgaatgaagccatgtgagacaatttggaatagcagacaacaaggaaggtagaacatgttttgaaaaatttactgattttcgattattattaacgcttgttaatttaaacatctcttatttttgctaacatataagtatacaaagggacataaaaaggttaacagcgtttgttaaataggaagtatatgaaaatcctcttttgtgtttctaaatttatttttaaggagtggagaGGATCCggacttgtgcacacctgtatactttgagctctcgtataatcacgagagctttttaaatatgtaagtcttaattatctcttgacaaaaagaacgtttattcgtataaggttaccaagagatgaagaaactattttatttacaattcaccttgacaccaaaaactccatatgatatagtaaataaggttattaaacaagaaagaagaagcaacccgcttctcgcctcgttaacacgaacgttttcaggcaaaaaattcaaactttcgtcgcgtagcttacgcgattttgaatgtgcgggattgctgaaaagcagcccgtttttttatggcctccgaacgaatgagttagcaggccgcagatttgaacagctattttctatcttgttgtaacaaaattaagtggaggtggctcaccattagcaaagacatgttggtaaacgatgggattcgtgcacgtgaagtaagattgatcgaccaagacggtgaacaattaggcgtgaagagtaaaatcgatgcgcttcaaattgctgaaaaggctaatcttgatctagtgcttgttgctccaacagcgaaaccgccagtagctcgtaCTGCAG(SEQ ID NO:38)。

inl C基因编码296氨基酸蛋白，且该蛋白的整个基因被删除。通过PCR，扩增DNA片段DNA-up和DNA-down，并分别使用图3所示的限制性酶位点EcoRI/BamHI和BamH1/Pst1，将所述片段顺序地克隆进质粒pNEB193中。切离DNA盒up-down(EcoR1和Pst1片段)，并还克隆进温度敏感的穿梭载体pKSV7中。克隆以后，将质粒pKSV7/up-down转化进菌株Lm dal dat actA中，并使用菌落PCR针对质粒的存在来试验得到的菌落。

对于同源重组，在氯霉素(Cm)选择下在30℃（允许质粒复制的条件）重复培养细菌5天，且在此期间，发生随机DNA交换事件。该温育步骤允许穿梭质粒向基因组中整合，由此初步转移Cm抗性。通过在Cm选择压力下在向42℃的温度转换过程中的生长（不允许质粒复制的条件），选择含有染色体整合的质粒拷贝的细菌。使用PCR针对第一重组验证菌落，并再次将生长温度转换至30℃，以允许在同源部位发生第二DNA交换，由此切离不希望的质粒序列，且仅在Lm染色体后面剩下重组基因拷贝。通过采用向42℃的额外温度转换，抑制切离的质粒的复制，使得它在细菌培养物的繁殖过程中被稀释。此外，使用随后的影印平板培养来选择Cm敏感的细菌。使用菌落PCR针对inl C基因的缺失分析Cm敏感菌落。

ActA缺失突变体的制备

通过致病因子ActA的不可逆缺失，使菌株Lm dal dat(Lmdd)减毒。构建actA在Lmdaldat(Lmdd)背景下的框架内缺失，以避免对下游基因的表达的任何极化效应。Lm dal datΔactA含有在N-端处的前19个氨基酸和C-端的28个氨基酸残基，缺失了ActA的591个氨基酸。使用与actA缺失区域的外部对合的引物，验证所述基因在染色体斑点中的缺失。这些是如图4所示的引物3(Adv305-tgggatggccaagaaattc)(SEQ ID NO:39)和引物4(Adv304-ctaccatgtcttccgttgcttg)(SEQ ID NO:40)。对分离自Lmdd和Lm-ddΔactA的染色体DNA进行PCR分析。预期在Lm-dd染色体DNA中用2组不同的引物对1、2和3、4扩增以后的DNA片段的大小为3.0Kb和3.4Kb。但是，对于Lm-ddΔactA，使用引物对1、2和3、4的PCR的预期大小为1.2Kb和1.6Kb。因而，在图3中的PCR分析证实，actA的1.8kb区域在菌株Lm-ddΔactA中缺失。还对PCR产物进行了DNA测序，以证实含有actA的区域在菌株Lm-ddΔactA中的缺失(图5)。

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炎症性细胞因子的产生：

用不同的李斯特菌属骨架诸如Lm dal dat、Lm dal dat actA、Lm dal datactAΔinlC和Lm dal datΔinlC感染巨噬细胞诸如RAW264.7，并在不同的时间点收获上清液，以使用不同的基于ELISA的试剂盒定量不同细胞因子的水平。定量的细胞因子包括IFN-γ、TNF-α和IL-6。

体内细胞因子产生：

为了测量体内细胞因子产生和嗜中性粒细胞募集，给C57BL/6小鼠腹膜内地注射不同的10⁸CFU的inlC突变体、李斯特菌属对照或等体积的盐水。12h后，杀死小鼠，并用2mL PBS洗涤腹膜腔。在生长培养基上铺板以后，检查腹膜洗液的细菌载荷，并使用流式细胞计量术分析促炎性细胞因子诸如MIP-1α、KC、MCP等。在用标志物诸如Gr-1、CD11b和F4/80染色以后，确定嗜中性粒细胞和巨噬细胞的数目，并还使用CellQuest软件定量这些群体。

Transwell迁移测定：

进行该测定，以确定在用inlC缺失菌株感染骨髓衍生的巨噬细胞或树突细胞以后，是否存在嗜中性粒细胞迁移的增加。从小鼠诸如C57BL/6分离骨髓衍生的巨噬细胞或树突细胞，并用inlC缺失突变体或对照李斯特菌属感染。使用感染的细胞，使用corning costar Transwell平板，建立transwell测定。最初使用3、5或8微米孔transwell平板，将测定标准化。为了试验嗜中性粒细胞迁移，将受感染的APC铺板在平板的底部，并将嗜中性粒细胞铺板在室的孔的顶部。在不同的时间点，计数细胞，以确定已经迁移至底部的嗜中性粒细胞的数目。

Lm dal dat actAΔinlC突变体的治疗效果：

为了确定inlC突变体的治疗效果，使用人前列腺特异性抗原(PSA)作为肿瘤抗原，作为概念的证据。用质粒pAdv142（其含有人PSA的表达盒）转化骨架Lm dal dat actA inlC，从而产生LmddAinlC142。针对融合蛋白tLLO-PSA的表达和分泌，表征菌株LmddAinlC142。此外，将菌株LmddAinlC142在小鼠体内传代2次，并针对融合蛋白tLLO-PSA的表达和分泌，检查在2次体内传代以后得到的菌落。从第二次体内传代以后得到的菌落制备疫苗工作储备液，并将其用于评估治疗效果和免疫原性。

对肿瘤微环境的影响:

确定了LmddAinlC142、LmddA142和其它对照菌株的造成免疫细胞在肿瘤微环境中的渗入的能力。在该研究中，在第0天给小鼠接种1x10⁶个TPSA23肿瘤细胞，并在第7、14和21天接种10⁸CFU的LmddAinlC142、LmddA142和其它对照菌株。在第28天收获肿瘤，并处理，用于使用不同的细胞表面标志物诸如Gr-1、CD11b、CD3、CD4、CD8、CD25、Foxp3、NK1.1和CD62L进一步染色。使用这些标志物检查的不同细胞群体包括巨噬细胞(CD11b⁺)、NK细胞(NK1.1⁺)、嗜中性粒细胞(Gr-1⁺CD11b⁺)、骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)(Gr-1⁺CD11b⁺)、调节性T细胞(CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺)和效应T细胞(CD8⁺CD3⁺CD62L^低)。此外，表征了效应T细胞的产生效应细胞因子诸如IFN-γ、TNF-α和IL-2的功能能力。试验了瘤内调节性T细胞和MDSC的造成T细胞增殖抑制的能力。

李斯特菌属免疫接种和曼森血吸虫感染

将雌性(6-8周龄)BALB/c小鼠维持为原初(未被感染)或被曼森血吸虫感染。对于感染，给小鼠腹膜内注射50个尾蚴。8周后，如下免疫被感染的和未被感染的小鼠：腹膜内施用(100μg/注射)0.1LD50Lm-gag、0.2LD50Lm-gag或1LD50Lm-gag，或经口施用10LD50Lm-gag或100LD50Lm-gag。2周后，如下强化一些组的小鼠：以类似的方式，腹膜内施用0.1LD50Lm-gag或0.2LD50Lm-gag，或经口施用10LD50Lm-gag或100LD50Lm-gag。使用Lm-E7作为阴性对照。在最后一次免疫接种后2周，如下所述分析T-细胞免疫应答。在处死时，通过检查蠕虫、活卵和肝脾肿大在小鼠中的存在，证实感染。

MDSC和Treg功能

取决于肿瘤模型，将肿瘤植入小鼠的胁腹或生理学部位。7天后，给小鼠接种疫苗，疫苗接种首日取决于使用的肿瘤模型。然后在疫苗施用后1周，给小鼠施用强化疫苗。

然后处死小鼠，并在强化后1周收获肿瘤和脾，或者在侵袭性的肿瘤模型的情况下，在强化后3-4天收获肿瘤和脾。在收获肿瘤之前5天，给非荷瘤小鼠接种疫苗，以用于产生应答者T细胞。使用标准方法学，制备脾细胞。

简而言之，制备肿瘤和脾的单细胞混悬液。手工地破碎脾，并裂解红血细胞。切碎肿瘤，并与胶原酶/DNA酶一起温育。可替换地，与肿瘤解离试剂盒一起使用GENTLEMACS^TM解离器。

使用Miltenyi试剂盒和柱或autoMACs分离器，从肿瘤和脾纯化MDSC。然后计数细胞。

制备单细胞混悬液，并裂解红血细胞。然后用CFSE标记应答者T细胞。

以1x10⁵个T细胞/孔的密度，以应答者T细胞(来自所有分裂周期阶段)与MDSC的2:1比率，将所述细胞一起铺板在96孔板中。然后用适当的肽(PSA OR CA9)刺激应答者T细胞，或者用PMA/离子霉素非特异性地刺激。将细胞在5%CO₂下在37℃在暗处温育2天。2天后，将细胞染色进行FACS，并在FACS机器上分析。

T-细胞应答分析

对于通过ELISA进行的细胞因子分析，收获脾细胞，并在有培养基、SEA或conA(作为阳性对照)存在下，以1500万个细胞/孔铺板在48-孔平板中。温育72小时后，收获上清液，并通过ELISA(BD)分析细胞因子水平。对于抗原特异性的IFN-γELISpot，收获脾细胞，并在有培养基、特定CTL肽、无关肽、特定辅助肽或conA(作为阳性对照)存在下，以30万和15万个细胞/孔铺板在IFN-γELISpot平板中。温育20小时后，进行ELISpots(BD)，并通过Immunospot分析仪(C.T.L.)计数斑点。将每100万脾细胞的斑点数绘图。

使用Coulter Counter,Z1，计数脾细胞。使用标准的基于IFN-γ的ELISPOT测定，确定在用gag-CTL、gag-辅助、培养基、无关抗原和conA(阳性对照)再刺激以后，产生IFN-γ的CD8⁺T细胞的频率。

简而言之，使用mAb R46-A2（在5mg/ml）和多克隆兔抗-IFN-γ（以最佳稀释度使用）(由University of Pennsylvania,Philadelphia,PA的Phillip Scott博士友情提供)，检测IFN-γ。通过与使用鼠rIFN-γ(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)制备的标准曲线进行对比，计算IFN-γ的水平。使用过氧化物酶-缀合的山羊抗-兔IgG Ab(IFN-γ)，使平板显影。然后在405nm读出平板。测定的检测下限为30pg/ml。

结果

实施例1：含有氨基酸代谢酶而不是抗生素抗性基因的质粒在体外和 在体内都被保留在大肠杆菌和Lm中

使用基于D-丙氨酸消旋酶的营养缺陷型互补系统来介导Lm中的质粒保留，而不使用抗生素抗性基因。大肠杆菌菌株MB2159是不能合成D-丙氨酸消旋酶的alr(-)/dadX(-)缺陷型突变体。李斯特菌属菌株Lmdal(-)/dat(-)(Lmdd)由于dal和dat基因的部分缺失同样不能合成D-丙氨酸消旋酶。如下修饰基于大肠杆菌-李斯特菌属穿梭载体pAM401的质粒pGG55：除去2个CAT基因，并用在李斯特菌属p60启动子控制下的p60-dal表达盒替换它们，以产生pTV3(图1)。从几个菌落纯化DNA。

实施例2：含有代谢酶的质粒不会增加细菌的毒力

由于毒力与LLO功能有关，对比了Lmdd-TV3和Lm-LLOE7之间的溶血裂解活性。该测定通过红血细胞的裂解来试验LLO功能，且可以用培养物上清液、纯化的LLO或细菌细胞进行。Lmdd-TV3显示出比Lm-LLOE7更高的溶血裂解活性。

还通过确定LD₅₀值来测量体内毒力，所述LD₅₀值是测量毒力的更直接的、且因此更准确的方式。Lmdd-TV3的LD₅₀(0.75x10⁹)非常接近于Lm-LLOE7的LD₅₀(1x10⁹)，从而表明含有代谢酶的质粒不会增加细菌的毒力。

实施例3：用含有代谢酶的质粒诱导抗肿瘤免疫

在肿瘤消退模型中确定了含有代谢酶的质粒作为癌症疫苗的效力。使用TC-1细胞系模型，其针对HPV疫苗开发进行了确定表征，且其允许受控地对比在免疫接种Lmdd-TV3或Lm-LLOE7以后建立的类似大小的肿瘤的消退。在2个单独的实验中，Lmdd-TV3和Lm-LLOE7对小鼠的免疫接种导致了类似的肿瘤消退(图6)，在接种疫苗的组之间没有统计上显著的差异(p<0.05)。所有免疫的小鼠在63天后仍然存活，而未免疫的小鼠在它们的肿瘤达到20mm直径时必须处死。治愈的小鼠保持无肿瘤至实验结束。

因而，含有代谢酶的质粒作为治疗性癌症疫苗是有效的。因为治疗性癌症疫苗需要的免疫应答强于预防性癌症疫苗需要的免疫应答，这些结果证实了同样作为预防性癌症疫苗的实用性。

实施例4：inlC-缺失突变体产生显著高水平的趋化因子和细胞因子

inlC缺失突变体产生显著高水平的趋化因子诸如MIP-1α、KC(IL-8的小鼠同系物)、MCP，从而导致嗜中性粒细胞和白细胞向感染部位的渗入。因而，当腹膜内地施用不同的李斯特菌属菌株时，inlC突变体表现出这些细胞因子和趋化因子的产生的增加，它们将嗜中性粒细胞和巨噬细胞吸引到注射后12h得到的腹膜液中。此外，与对照菌株相比，inlC缺失突变体产生显著高水平的炎症性细胞因子。

实施例5:inlC-缺失突变体会诱导嗜中性粒细胞迁移

与其它对照菌株相比，被inlC缺失突变体感染的巨噬细胞在不同的时间点表现出嗜中性粒细胞迁移的显著增加。该实验的结果有力地支持了该菌株在感染过程中吸引免疫细胞（诸如嗜中性粒细胞）的能力。

实施例6:inlC-缺失突变体会实现治疗性抗肿瘤应答

使用LmddA142和LmddAinlC142的抗肿瘤研究的结果彼此非常相当，且观察到肿瘤的治疗消退。此外，2剂LmddAinlC142与3剂菌株LmddA142相当，因为它的产生高水平的先天性应答的能力和增加的促炎性细胞因子分泌。

在第0天，将肿瘤植入小鼠中。在第7天，给小鼠接种Lmdda-E7或LmddA-PSA。在第14天，收获肿瘤，并测量接种疫苗组和原初组的MDSC和Treg百分比和数目。发现在李斯特菌属处理过的小鼠的肿瘤中存在MDSC和Treg百分比下降，而在脾或引流淋巴结(TLDN)中没有观察到该效应(图7)。

将在上述实验中提取自荷瘤小鼠的分离的脾细胞和肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)合并，并针对CD3和CD8染色，以阐明Lm-LLO-E7、Lm-LLO-PSA和Lm-LLO-CA9、Lm-LLO-Her2的免疫接种对MDSC和Treg(脾和肿瘤的MDSC和Treg)在肿瘤中的存在的影响(图8-20)。每个列代表处于特定细胞分裂阶段的T细胞群体的百分比，并且在特定治疗组(原初、肽-CA9或PSA-治疗、无MDSC/Treg、和无MDSC+PMA/离子霉素)下分成小组(参见图8-20)。

荷瘤小鼠血液中的细胞的分析

针对存在的Treg和MDSC的百分比，分析得自荷瘤小鼠的血液。在Lm疫苗接种后，在小鼠血液中存在MDSC和Treg二者的下降。

实施例7：在李斯特菌属疫苗治疗以后的抑制细胞功能

在第0天，将肿瘤植入小鼠中。在第7天，给小鼠接种Lmdda-E7或LmddA-PSA。在第14天，收获肿瘤，并测量接种疫苗组和原初组的MDSC和Treg百分比和数目。发现在李斯特菌属处理过的小鼠的肿瘤中存在MDSC和Treg百分比下降，而在脾或引流淋巴结(TLDN)中没有观察到该效应(图7)。

将在上述实验中提取自荷瘤小鼠的分离的脾细胞和肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)合并，并针对CD3和CD8染色，以阐明Lm-LLO-E7、Lm-LLO-PSA和Lm-LLO-CA9、Lm-LLO-Her2的免疫接种对MDSC和Treg(脾和肿瘤的MDSC和Treg)在肿瘤中的存在的影响(图8-20)。每个列代表处于特定细胞分裂阶段的T细胞群体的百分比，并且在特定治疗组(原初、肽-CA9或PSA-治疗、无MDSC/Treg、和无MDSC+PMA/离子霉素)下分成小组(参见图8-20)。

荷瘤小鼠血液中的细胞的分析

针对存在的Treg和MDSC的百分比，分析得自荷瘤小鼠的血液。在Lm疫苗接种后，在小鼠血液中存在MDSC和Treg二者的下降。

实施例8：在李斯特菌属疫苗接种后，得自TPSA23肿瘤（但是脾却 不然）的MDSC具有更低的抑制性

用非特异性地活化的原初鼠细胞和特异性地活化的细胞(PSA、CA9、PMA/离子霉素)，使用分离自TPSA23肿瘤的单核细胞和粒细胞MDSC，进行抑制测定。结果证实，与得自原初小鼠肿瘤的MDSC相比，分离自Lm接种疫苗组的肿瘤的MDSC具有减小的抑制活化的T细胞分裂的能力(参见图8和10中的Lm-LLO-PSA和Lm-LLO-治疗组，在图右侧的图代表得自左侧图的合并的细胞分裂数据)。另外，得自未治疗的小鼠（其中不存在MDSC，且其中细胞未被刺激/活化）的T应答细胞保持处于它们的亲本(休眠)状态(图8和10)，而观察到用PMA或离子霉素刺激的T细胞发生复制(图8和10)。此外，观察到，在用李斯特菌属疫苗治疗后，Gr+Ly6G+和GrdimLy6G-MDSC都具有更低的抑制性。这适用于它们的降低的抑制活化的PSA-特异性的T细胞和非特异性的(PMA/离子霉素刺激的)T细胞的分裂的能力。

此外，使用分离自非特异性地活化的原初鼠细胞的TPSA23肿瘤的MDSC进行的抑制测定证实，与得自原初小鼠肿瘤的MDSC相比，分离自Lm接种疫苗组的肿瘤的MDSC具有减小的抑制活化的T细胞分裂的能力(参见图8和10)。

另外，当使用脾MDSC时，没有观察到在上面刚刚关于图8和10讨论的观察结果。当使用脾MDSC时，得自原初组、李斯特菌属治疗组(PSA、CA9)和PMA/离子霉素刺激组(阳性对照)的脾细胞/T细胞都表现出相同的复制水平(图9和11)。因此，这些结果表明，李斯特菌属介导的抑制细胞在肿瘤中的抑制以抗原特异性的和非特异性的方式起作用，而李斯特菌属对脾粒细胞MDSC没有影响，因为它们仅以抗原特异性的方式产生抑制。

实施例9：肿瘤T调节细胞的减少的抑制，但是得自脾的那些却不然

使用在李斯特菌属治疗后分离自TPSA23肿瘤的Treg，进行抑制测定。观察到，在李斯特菌属治疗后，存在得自肿瘤的Treg的抑制能力的下降(图12),但是，发现脾Treg仍然是抑制性的(图13)。

作为对照，使用常规CD4+T细胞替代MDSC或Treg，并发现对细胞分裂没有影响(图14)。

实施例10：在李斯特菌属疫苗接种后，得自4T1肿瘤的MDSC和 TREG（但是脾却不然）具有更低的抑制性

如上所述，使用4T1肿瘤进行了相同实验，并且得到了相同的观察结果，即，在李斯特菌属疫苗接种后，MDSC具有更低的抑制性(图15和17)，李斯特菌属对脾单核细胞MDSC没有特异性作用(图16和18)，在李斯特菌属疫苗接种后，存在得自4T1肿瘤的Treg的抑制能力的下降(图19)，并且李斯特菌属对脾Treg的抑制能力没有影响(图20)。

最后，观察到，李斯特菌属对脾Treg的抑制能力没有影响。

为了更充分地举例说明本发明的实施方案，提供了上述实施例。但是，所述实施例绝不应当解释为限制本发明的宽范围。

实施例11：尽管存在蠕虫感染介导的Th1T-细胞免疫应答的抑制，李 斯特菌属载体能够驱动Th1T-细胞免疫应答

尽管如降低的IFN-γ应答(图21)和IL-4和IL-10产生的增加(分别图22和23)所证实地系统性地偏向Th2，IFN-γ的抗原特异性的产生保持不变(图24)，从而指示在有Th2环境存在下该疫苗可以产生功能性的细胞介导的免疫应答。该观察结果提示，李斯特菌属载体疫苗能够在蠕虫感染的群体中驱动疫苗特异性的免疫应答。此外，在要施用给撒哈拉大沙漠以南非洲（在此处蠕虫感染非常流行）的群体的新一代HIV-1、疟疾或TB疫苗的开发中，应当考虑李斯特菌属载体。

为了更充分地举例说明本发明的实施方案，提供了上述实施例.但是，所述实施例绝不应当解释为限制本发明的宽范围。

Claims (58)

1.一种在受试者中重建免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用活的减毒的李斯特菌属疫苗株。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述李斯特菌属菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含编码含PEST多肽的第一开放读码框。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述李斯特菌属过表达所述含PEST多肽。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述含PEST多肽是非溶血性LLO蛋白或其免疫原性片段、ActA蛋白或其截短片段、或PEST氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组李斯特菌属包含基因组内化蛋白C(inlC)基因、ActA基因、PlcA基因、PrfA基因或PlcB基因的突变或缺失。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸分子还包含编码代谢酶的第二开放读码框，其中所述代谢酶补足在所述重组李斯特菌属菌株的染色体中缺少的内源基因。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述李斯特菌属还包含编码代谢酶的第三开放读码框。

8.根据权利要求6所述的方法，其中由所述第二开放读码框编码的所述代谢酶是丙氨酸消旋酶。

9.根据权利要求7所述的方法，其中由所述第三开放读码框编码的所述代谢酶是D-氨基酸转移酶。

10.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸分子整合到李斯特菌属基因组内。

11.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸分子在质粒中，所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定地维持在所述重组李斯特菌属疫苗株中。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组李斯特菌属菌株已经通过动物宿主进行传代。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是成年人或儿童。

14.一种在受试者中促进细胞毒性治疗后的免疫应答恢复的方法，所述方法包括给所述受试者施用活的减毒的李斯特菌属疫苗株。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述李斯特菌属菌株包含核酸分子，其中所述核酸分子包含编码含PEST多肽的第一开放读码框。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述李斯特菌属过表达所述含PEST多肽。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述含PEST多肽是非溶血性LLO蛋白或其免疫原性片段、ActA蛋白或其截短片段、或PEST氨基酸序列。

18.根据权利要求14所述的方法，其中所述重组李斯特菌属包含基因组内化蛋白C(inlC)基因、ActA基因、PlcA基因、PrfA基因或PlcB基因的突变或缺失。

19.根据权利要求15所述的方法，其中所述核酸分子还包含编码代谢酶的第二开放读码框，其中所述代谢酶补足在所述重组李斯特菌属菌株的染色体中缺少的内源基因。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述李斯特菌属还包含编码代谢酶的第三开放读码框。

21.根据权利要求19所述的方法，其中由所述第二开放读码框编码的所述代谢酶是丙氨酸消旋酶。

22.根据权利要求20所述的方法，其中由所述第三开放读码框编码的所述代谢酶是D-氨基酸转移酶。

23.根据权利要求14所述的方法，其中所述核酸分子整合到李斯特菌属基因组内。

24.根据权利要求14所述的方法，其中所述核酸分子在质粒中，所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定地维持在所述重组李斯特菌属疫苗株中。

25.根据权利要求14所述的方法，其中所述重组李斯特菌属菌株已经通过动物宿主进行传代。

26.根据权利要求14所述的方法，其中所述受试者是成年人或儿童。

27.一种提高疫苗的免疫原性的方法，所述方法包括下述步骤：给受试者共同施用所述疫苗和基于李斯特菌属的佐剂，其中所述基于李斯特菌属的佐剂增强所述疫苗的免疫原性，由此提高所述疫苗的免疫原性。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述基于李斯特菌属的佐剂是李斯特菌属菌株，所述菌株包含含有第一开放读码框的核酸分子，所述第一开放读码框表达含PEST多肽或其片段。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述李斯特菌属过表达所述含PEST多肽或其片段。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述含PEST多肽是非溶血性LLO蛋白或其免疫原性片段、ActA蛋白或其截短片段、或PEST氨基酸序列。

31.根据权利要求27所述的方法，其中所述李斯特菌属菌株包含基因组内化蛋白C(inlC)基因、ActA基因、PlcA基因、PrfA基因或PlcB基因的突变或缺失。

32.根据权利要求28所述的方法，其中所述核酸分子包含编码代谢酶的第二开放读码框，其中所述代谢酶补足在所述重组李斯特菌属菌株的染色体中缺少的内源基因。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述李斯特菌属还包含编码代谢酶的第三开放读码框。

34.根据权利要求32所述的方法，其中由所述第二开放读码框编码的所述代谢酶是丙氨酸消旋酶。

35.根据权利要求33所述的方法，其中由所述第三开放读码框编码的所述代谢酶是D-氨基酸转移酶。

36.根据权利要求28所述的方法，其中所述核酸分子整合到李斯特菌属基因组内。

37.根据权利要求28所述的方法，其中所述核酸分子在质粒中，所述质粒在不存在抗生素选择的情况下下稳定地维持在所述重组李斯特菌属疫苗株中。

38.根据权利要求27所述的方法，其中所述重组李斯特菌属菌株已经通过动物宿主进行传代。

39.根据权利要求27所述的方法，其中所述受试者是成年人或儿童。

40.根据权利要求27所述的方法，其中所述基于李斯特菌属的佐剂单独使用，或者与其它佐剂相组合。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述其它佐剂是非核酸佐剂，包括铝佐剂、弗氏佐剂、MPL、乳剂、GM-CSF、QS21、SBAS2，含有CpG的寡核苷酸，编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子，所述佐剂是或包含细菌促分裂原或细菌毒素。

42.根据权利要求27所述的方法，其中所述方法能够治疗所述疾病。

43.一种在受试者中以不依赖于抗原的方式增强对疾病的免疫应答的方法，所述方法包括给所述受试者施用基于李斯特菌属的佐剂。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述基于李斯特菌属的佐剂是李斯特菌属菌株，所述菌株包含含有第一开放读码框的核酸分子，所述第一开放读码框表达含PEST多肽或其片段。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述李斯特菌属过表达所述含PEST多肽或其片段。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述含PEST多肽是非溶血性LLO蛋白或其免疫原性片段、ActA蛋白或其截短片段、或PEST氨基酸序列。

47.根据权利要求44所述的方法，其中所述李斯特菌属菌株包含基因组内化蛋白C(inlC)基因、ActA基因、PlcA基因、PrfA基因或PlcB基因的突变或缺失。

48.根据权利要求44所述的方法，其中所述核酸分子包含编码代谢酶的第二开放读码框，其中所述代谢酶补足在所述重组李斯特菌属菌株的染色体中缺少的内源基因。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述李斯特菌属还包含编码代谢酶的第三开放读码框。

50.根据权利要求48所述的方法，其中由所述第二开放读码框编码的所述代谢酶是丙氨酸消旋酶。

51.根据权利要求49所述的方法，其中由所述第三开放读码框编码的所述代谢酶是D-氨基酸转移酶。

52.根据权利要求44所述的方法，其中所述核酸分子整合到李斯特菌属基因组内。

53.根据权利要求44所述的方法，其中所述核酸分子在质粒中，所述质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定地维持在所述重组李斯特菌属疫苗株中。

54.根据权利要求44所述的方法，其中所述重组李斯特菌属菌株已经通过动物宿主进行传代。

55.根据权利要求43所述的方法，其中所述受试者是成年人或儿童。

56.根据权利要求43所述的方法，其中所述基于李斯特菌属的佐剂单独使用，或者与其它佐剂相组合。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述其它佐剂是非核酸佐剂，包括铝佐剂、弗氏佐剂、MPL、乳剂、GM-CSF、QS21、SBAS2，含有CpG的寡核苷酸，编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子，所述佐剂是或包含细菌促分裂原或细菌毒素。

58.根据权利要求43所述的方法，其中所述方法能够治疗所述疾病。

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