ES2657168T3 - Composiciones que comprenden HMW-MAA y fragmentos de este para el tratamiento del cáncer - Google Patents

Composiciones que comprenden HMW-MAA y fragmentos de este para el tratamiento del cáncer Download PDF

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Abstract

Uso de un polipéptido recombinante que comprende (i) un fragmento de una proteína del Antígeno Asociado a Melanoma de Alto Peso Molecular (HMW-MAA) codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 21, 22, o 23, y (ii) una secuencia PEST de Listeria, o una Listeria recombinante que comprende dicho polipéptido recombinante, para la preparación de una composición para inducir una respuesta inmunitaria contra un cáncer o tumor que no expresa HMW-MAA o para retrasar la progresión de un cáncer o tumor que no expresa HMW-MAA.

Description

Composiciones que comprenden HMW-MAA y fragmentos de este para el tratamiento del cáncer
Campo de la invención
Esta invención proporciona polipéptidos recombinantes que comprenden un fragmento de un Antígeno Asociado a Melanoma de Alto Peso Molecular (HMW-MAA) y cepas de Listeria recombinante para usar en los métodos para inducir una respuesta inmunitaria y tratar e impedir el crecimiento de tumores.
Antecedentes de la invención
HMW-MAA, conocido además como el proteoglicano sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), es una proteína de transmembrana de 2322 residuos. HMW-MAA se expresa en más del 90 % de los nevos benignos y las lesiones de melanoma extirpados quirúrgicamente, y se expresa, además, en carcinoma de células basales, tumores originados en la cresta neural (por ejemplo astrocitomas, gliomas, neuroblastomas y sarcomas), leucemias en la infancia, y lesiones de carcinoma lobular de mama. El documento WO 2005/037233 describe vacunas contra diversos tipos de cáncer (que incluyen melanoma), que comprenden Listeria modificada genéticamente para expresar un antígeno de melanoma fusionado a LLO.
Los tratamientos y las curas para muchos tumores, por ejemplo, tumores que expresan HMW-MAA, así como métodos para la prevención especialmente en poblaciones de alto riesgo, se necesitan con urgencia en la técnica.
Resumen de la invención
Esta invención proporciona el uso de un polipéptido recombinante que comprende (i) un fragmento de una proteína del Antígeno Asociado a Melanoma de Alto Peso Molecular (HMW-MAA) codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 21, 22, o 23, y (ii) una secuencia PEST de Listeria, o una Listeria recombinante que comprende dicho polipéptido recombinante, para la preparación de una composición para inducir una respuesta inmunitaria contra un cáncer o tumor que no expresa HMW-MAA o para retrasar la progresión de un cáncer o tumor que no expresa HMW-MAA. La invención proporciona, además, el uso mencionado anteriormente, en donde el cáncer o tumor es un cáncer o tumor renal o de la piel.
La invención proporciona, además, el uso de un polipéptido recombinante que comprende (i) un fragmento de una proteína del Antígeno Asociado a Melanoma de Alto Peso Molecular (HMW-MAA) codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 21, 22, o 23, y (ii) una secuencia PEST de Listeria, o una Listeria recombinante que comprende dicho polipéptido recombinante, para la preparación de una composición para inducir una respuesta inmunitaria contra un cáncer o tumor renal o de la piel o para retrasar la progresión de un cáncer o tumor renal o de la piel.
La invención proporciona, además, el uso mencionado anteriormente, en donde el cáncer o tumor renal o de la piel no expresan HMW-MAA.
La invención proporciona, además, cualquiera de los usos mencionados anteriormente, en donde el cáncer o tumor es un cáncer o tumor sólido, y la composición induce una respuesta inmunitaria contra un pericito de la vasculatura de dicho cáncer o tumor.
La invención proporciona, además, cualquiera de los usos mencionados anteriormente, en donde el cáncer o tumor de la piel es un melanoma.
La invención proporciona, además, cualquiera de los usos mencionados anteriormente, en donde la secuencia PEST está comprendida en un oligopéptido de Listeriolisina (LLO) o un fragmento de este, o en un oligopéptido de ActA o un fragmento de este.
La invención proporciona, además, cualquiera de los usos mencionados anteriormente, en donde HMW-MAA es una proteína HMW-MAA humana.
La invención proporciona, además, una composición que comprende un polipéptido recombinante que comprende (i) un fragmento de una proteína del Antígeno Asociado a Melanoma de Alto Peso Molecular (HMW-MAA) codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 21, 22, o 23, y (ii) una secuencia PEST de Listeria, o una Listeria recombinante que comprende dicho polipéptido recombinante, para usar en la inducción de una respuesta inmunitaria contra un cáncer o tumor que no expresa HMW-MAA o para usar en el retraso de la progresión de un cáncer o tumor que no expresa HMW-MAA.
La invención proporciona, además, una composición para el uso mencionado anteriormente, en donde el cáncer o tumor es un cáncer o tumor renal o de la piel.
La invención comprende, además, una composición que comprende un polipéptido recombinante que comprende (i) un fragmento de una proteína del Antígeno Asociado a Melanoma de Alto Peso Molecular (HMW-MAA) codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 21, 22, o 23, y (ii) una secuencia PEST de Listeria, o una Listeria recombinante que comprende dicho polipéptido recombinante, para usar en la
5 inducción de una respuesta inmunitaria contra un cáncer o tumor renal o de la piel o para usar en el retraso de la progresión de un cáncer o tumor renal o de la piel. La invención proporciona, además, cualquiera de las composiciones para el uso mencionado anteriormente, en donde la composición es una vacuna que comprende, además, un adyuvante, una citocina, una quimiocina, o una combinación de estos.
10 Breve descripción de las figuras
Figura 1: Clonación de HMW-MAA en un plásmido basado en pGG55. Lm-LLO-HMW-MAA se generó mediante la transformación de la cepa prfA-XFL-7 con el plásmido pGG-55. pGG-55 tiene el promotor de hly que dirige la expresión de una fusión no hemolítica de LLO-E7 y el gen prfA para seleccionar respecto a la retención del
15 plásmido. XFL-7 debe retener el plásmido para que sea viable.
Figura 2. Se expresaron construcciones de LLO-HMW-MAA. Se cosechó el sobrenadante de las cepas de LM transformadas con los plásmidos A, B y C de LLO-HMW-MAA. A. Las sondas anti-PEST revelaron que las tres cepas produjeron proteínas de fusión de los tamaños esperados (48 Kda para LLO, 75 Kda para HMW-MAA-A, 98
20 Kda para HMW-MAA-B, y 62 Kda para HMW-MAA-C). B. Las sondas anti-LLO revelaron bandas de LLO para HMW-MAA-A, HMW-MAA-B, HMW-MAA-C, y en controles de 10403S.
Figura 3. Las cepas de Listeria que expresan construcciones de LLO-HMW-MAA muestran crecimiento en los medios (A), virulencia, y crecimiento intracelular (B) similar a Lm de tipo silvestre.
25 Figura 4. La Lm que expresa HMW-MAA impide el crecimiento de tumores, incluso en células tumorales que no expresan HMW-MAA. 108 ufc de Lm-HMW-MAA-C impiden el crecimiento tumoral de B16F0-Ova según se midió por el tamaño (A) y el volumen (B) del tumor comparados significativamente con el grupo virgen. Se observaron efectos similares sobre el diámetro y el volumen del tumor con las tres cepas de Lm-LLO-HMW-MAA después de la
30 inoculación de ratones C57BL/6 con células tumorales B16F0-Ova (C) y RENCA (D y E).
Figura 5. Selección de clones de células tumorales murinas B16F10 que expresan HMW-MAA.
Figura 6. Las construcciones de Lm-HMW-MAA indujeron respuestas inmunitarias con especificidad antigénica que 35 impidieron el crecimiento tumoral.
Figura 7. El agotamiento in vivo de células CD4+ o CD8+ anuló la eficacia de la vacuna de Lm-HMW-MAA-C.
Figura 8. Las células T CD8+ de ratones vacunados con Lm-HMW-MAA-C inhibieron el crecimiento de tumores de 40 B16F10 HMW-MAA in vivo.
Figura 9. Los ratones vacunados con Lm-HMW-MAA-C que eliminaron el tumor de B16F10-HMW-MAA estuvieron protegidos contra un segundo reto con el mismo tumor.
45 Figura 10. La inmunización de ratones transgénicos para HLA-A2/Kb con Lm-HMW-MAA-B y Lm-HMW-MAA-C indujo respuestas inmunitarias detectables contra dos epítopos de HMW-MAA HLA-A2 caracterizados en los fragmentos B y C.
Figura 11. Secreción de IFN-γ por las células T estimuladas con un péptido restringido a HLA-A2 del fragmento C de 50 HMW-MAA después de una inmunización con Lm-HMW-MAA-C en ratones C57B1/6 HLA-A2/Kb y de tipo silvestre.
Figura 12. Representación de construcciones del virus de vaccinia que expresan diferentes formas de la proteína E7 de HPV16.
55 Figura 13. Inducción y penetración de células T CD8+ específicas para E7 en los bazos y tumores de ratones administrados con células TC-1 y posteriormente administrados con una vacuna de Listeria recombinante (virgen, Lm-LLO-E7, Lm-E7, Lm-ActA-E7).
Figura 14. A. Construcciones de Listeria que contienen regiones PEST conducen a mayor regresión tumoral. B. 60 tamaño tumoral promedio en ratones tratados con vacunas de Listeria.
Figura 15. Las construcciones de Listeria que contienen regiones PEST inducen un mayor porcentaje de linfocitos específicos para E7 en el bazo. A. datos de 1 experimento representativo. B. promedio y SE de los datos de 3 experimentos.
Figura 16. Las construcciones de Listeria que contienen regiones PEST inducen un mayor porcentaje de linfocitos específicos para E7 dentro del tumor. A. datos de 1 experimento representativo. B. promedio y SE de los datos de 3 experimentos.
Figura 17. Representación de construcciones del virus de vaccinia que expresan diferentes formas de la proteína E7 de HPV16.
Figura 18. VacLLOE7 induce una regresión a largo plazo de los tumores establecidos a partir de 2 × 105 células TC1 en ratones C57BL/6. Los ratones se inyectaron 11 y 18 días después del reto tumoral con 107 PFU de VacLLOE7, VacSigE7LAMP-1, o VacE7/ratón i.p. o se dejaron sin tratamiento (virgen). Se usaron 8 ratones por grupo de tratamiento, y se muestra la sección transversal para cada tumor (promedio de 2 mediciones) para los días indicados después de la inoculación del tumor.
Descripción detallada de la invención
Esta invención proporciona polipéptidos recombinantes que comprenden un fragmento de un Antígeno Asociado a Melanoma de Alto Peso Molecular (HMW-MAA), cepas de Listeria recombinante que comprenden el mismo, y métodos para inducir una respuesta inmunitaria y tratar e impedir el crecimiento de tumores, que comprende administrar los mismos.
En una modalidad, la presente invención proporciona una cepa de Listeria recombinante que comprende un polipéptido recombinante, el polipéptido recombinante comprende un fragmento de una proteína HMW-MAA ("fragmento de HMW-MAA"). En otra modalidad, una cepa de Listeria recombinante de la presente invención expresa un polipéptido recombinante de la presente invención. En otra modalidad, una cepa de Listeria recombinante de la presente invención comprende un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido recombinante de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido recombinante que comprende un fragmento de una proteína HMW-MAA unido operativamente a un oligopéptido que no es de HMW-MAA, seleccionado de un oligopéptido de listeriolisina (LLO), un oligopéptido de ActA, o un oligopéptido similar a PEST o un fragmento de estos. En una modalidad, el fragmento tiene las mismas o similares propiedades o función que el péptido o proteína de longitud completa, como puede demostrarse mediante el uso de ensayos y herramientas conocidos en la técnica. Las propiedades y funciones de los péptidos y proteínas de longitud completa de la presente invención se describen en detalle a continuación.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido recombinante que comprende un fragmento de una proteína HMW-MAA, en donde el fragmento consiste en aproximadamente los aminoácidos (AA) 360-554 de la proteína HMW-MAA a partir de la cual se deriva el fragmento. En otra modalidad, el fragmento consiste en aproximadamente los AA 701-1130. En otra modalidad, el fragmento tiene una secuencia seleccionada de la sec. con núm. de ident.: 21-23. En otra modalidad, el fragmento consiste en aproximadamente los AA 2160-2258.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido recombinante que comprende un fragmento de una proteína HMW-MAA con una secuencia de aminoácidos como se expone en la sec. con núm. de ident.: 21.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido recombinante que comprende un fragmento de una proteína HMW-MAA con una secuencia de aminoácidos como se expone en la sec. con núm. de ident.: 22.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido recombinante que comprende un fragmento de una proteína HMW-MAA con una secuencia de aminoácidos como se expone en la sec. con núm. de ident.: 23.
En otra modalidad, un polipéptido recombinante de la presente invención comprende además un péptido que no es de HMW-MAA. En otra modalidad, el péptido que no es de HMW-MAA aumenta la inmunogenicidad del fragmento.
El péptido que no es de HMW-MAA es, en otra modalidad, un oligopéptido de listeriolisina (LLO). En otra modalidad, el péptido que no es de HMW-MAA es un oligopéptido de ActA. En otra modalidad, el péptido que no es de HMW-MAA es un oligopéptido similar a PEST. Como se proporciona en la presente descripción, la fusión a LLO, ActA, secuencias similares a PEST y fragmentos de estas aumenta la inmunogenicidad mediada por células, de los antígenos. En una modalidad, la fusión a LLO, ActA, secuencias similares a PEST y fragmentos de estas aumenta la inmunogenicidad, mediada por células, de los antígenos en una variedad de sistemas de expresión. En una modalidad, el sistema de expresión es viral, mientras que en otra modalidad, el sistema de expresión es bacteriano. En otra modalidad, el péptido que no es de HMW-MAA es cualquier otro péptido inmunogénico que no es de HMW-MAA conocido en la técnica.
Un oligopéptido de LLO de los métodos y las composiciones de la presente invención es, en otra modalidad, un oligopéptido no hemolítico de LLO. En otra modalidad, el oligopéptido es un fragmento de LLO. En otra modalidad, el
oligopéptido es una proteína LLO completa. En otra modalidad, el oligopéptido es cualquier proteína LLO o fragmento de esta, conocida en la técnica.
En otra modalidad, el fragmento de LLO se vuelve no hemolítico mediante tratamiento químico. En otra modalidad, el tratamiento químico comprende glutaraldehído. En otra modalidad, el tratamiento químico comprende un compuesto que actúa de manera similar. En otra modalidad, el tratamiento químico comprende cualquier otro compuesto adecuado conocido en la técnica.
En otra modalidad, la proteína LLO utilizada para construir las vacunas de la presente invención tiene la siguiente secuencia: MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQ GLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPG ALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWN EKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQ IYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVK AAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETP GVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGN EIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNR NISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE (núm. de acceso del GenBank P13128; sec. con núm. de ident.: 1; la secuencia de ácido nucleico se expone en el Núm. de acceso del GenBank X15127). En una modalidad, los primeros 25 AA de la proproteína que corresponde a esta secuencia son la secuencia señal y se escinden de LLO cuando es secretada por la bacteria. Por lo tanto, de acuerdo con esta modalidad, la proteína LLO activa de longitud completa es de 504 residuos de longitud. En otra modalidad, la secuencia anterior se usa como la fuente del fragmento de LLO incorporado en una vacuna de la presente invención. En otra modalidad, una secuencia de AA de LLO de los métodos y las composiciones de la presente invención es un homólogo de la sec. con núm. de ident.: 1. En otra modalidad, la secuencia de AA de LLO es una variante de la sec. con núm. de ident.: 1. En otra modalidad, la secuencia de AA de LLO es un fragmento de la sec. con núm. de ident.: 1. En otra modalidad, la secuencia de AA de LLO es una isoforma de la sec. con núm. de ident.: 1.
En una modalidad, una isoforma es un péptido o proteína que tiene la misma función y una secuencia similar o idéntica a otro péptido o proteína, pero es el producto de un gen diferente. En una modalidad, una variante es un péptido o proteína que difiere de otro péptido o proteína en menor grado.
En otra modalidad, un fragmento de la proteína LLO se utiliza en las composiciones y los métodos de la presente invención. En otra modalidad, el fragmento de LLO es un fragmento N-terminal. En otra modalidad, el fragmento de LLO N-terminal tiene la secuencia: MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQ GLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYP GALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVER WNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVIS FKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHST KVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFN RETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYD (sec. con núm. de ident.: 2). En otra modalidad, una secuencia de AA de LLO de los métodos y las composiciones de la presente invención comprende la secuencia que se expone en la sec. con núm. de ident.: 2. En otra modalidad, la secuencia de AA de LLO es un homólogo de la sec. con núm. de ident.: 2. En otra modalidad, la secuencia de AA de LLO es una variante de la sec. con núm. de ident.: 2. En otra modalidad, la secuencia de AA de LLO es un fragmento de la sec. con núm. de ident.: 2. En otra modalidad, la secuencia de AA de LLO es una isoforma de la sec. con núm. de ident.: 2.
En otra modalidad, el fragmento de LLO tiene la secuencia: MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQ GLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYP GALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVER WNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVI SFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSH STKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGA TFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTD (sec. con núm. de ident.: 3). En otra modalidad, una secuencia de AA de LLO de los métodos y las composiciones de la presente invención comprende la secuencia que se expone en la sec. con núm. de ident.: 3. En otra modalidad, la secuencia de AA de LLO es un homólogo de la sec. con núm. de ident.: 3. En otra modalidad, la secuencia de AA de LLO es una variante de la sec. con núm. de ident.: 3. En otra modalidad, la secuencia de AA de LLO es un fragmento de la sec. con núm. de ident.: 3. En otra modalidad, la secuencia de AA de LLO es una isoforma de la sec. con núm. de ident.: 3.
En otra modalidad, el fragmento de LLO de los métodos y las composiciones de la presente invención comprende un dominio similar a PEST. En otra modalidad, un fragmento de LLO que comprende una secuencia PEST se utiliza como parte de una composición o en los métodos de la presente invención.
En otra modalidad, el fragmento de LLO no contiene el dominio de activación en el terminal carboxilo. En otra modalidad, el fragmento de LLO no incluye la cisteína 484. En otra modalidad, el fragmento de LLO es un fragmento no hemolítico. En otra modalidad, el fragmento de LLO se vuelve no hemolítico por deleción o mutación del dominio de activación. En otra modalidad, el fragmento de LLO se vuelve no hemolítico por deleción o mutación de la cisteína 484. En otra modalidad, una secuencia de LLO se vuelve no hemolítica por deleción o mutación en otra ubicación.
En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los primeros 441 AA de la proteína LLO. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los primeros 400-441 AA de la proteína LLO de longitud completa de 529 AA. En otra modalidad, el fragmento de LLO corresponde a los AA 1-441 de una proteína LLO descrita en la presente descripción. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los primeros 420 AA de LLO. En otra modalidad, el fragmento de LLO corresponde a los AA 1-420 de una proteína LLO descrita en la presente descripción. En otra modalidad, el fragmento de LLO consiste en aproximadamente los AA 20-442 de LLO. En otra modalidad, el fragmento de LLO corresponde a los AA 20-442 de una proteína LLO descrita en la presente descripción. En otra modalidad, cualquier ΔLLO sin el dominio de activación que comprende la cisteína 484, y en particular sin la cisteína 484, es adecuada para los métodos y las composiciones de la presente invención.
En otra modalidad, el fragmento de LLO corresponde a los primeros 400 AA de una proteína LLO. En otra modalidad, el fragmento de LLO corresponde a los primeros 300 AA de una proteína LLO. En otra modalidad, el fragmento de LLO corresponde a los primeros 200 AA de una proteína LLO. En otra modalidad, el fragmento de LLO corresponde a los primeros 100 AA de una proteína LLO. En otra modalidad, el fragmento de LLO corresponde a los primeros 50 AA de una proteína LLO, que en una modalidad, comprende una o más secuencias similares a PEST.
En otra modalidad, el fragmento de LLO contiene residuos de una proteína LLO homóloga que corresponde a uno de los intervalos de AA anteriores. Los números de los residuos no necesitan, en otra modalidad, corresponder exactamente con los números de los residuos enumerados anteriormente; por ejemplo, si la proteína LLO homóloga tiene una inserción o deleción, con relación a una proteína LLO utilizada en la presente descripción.
Cada proteína LLO y fragmento de LLO representa una modalidad separada de la presente invención.
En otra modalidad, los homólogos de LLO de otras especies, que incluyen lisinas conocidas, o fragmentos de estas pueden usarse como el péptido que no es de HMW-MAA.
En otra modalidad de los métodos y las composiciones de la presente invención, un fragmento de una proteína ActA se fusiona al fragmento de HMW-MAA. En otra modalidad, el fragmento de una proteína ActA tiene la secuencia: MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAR EVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKGPNINNNNSEQTENAAINEEASGADRPAI QVERRHPGLPSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKVNKKKVAKESVADASESDLDS SMQSADESSPQPLKANQQPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTK KKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPML LGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIIRETASSLDSSFTRGDLASLRNAINRHSQNFSDFPPIPTEE ELNGRGGRP (sec. con núm. de ident.: 4). En otra modalidad, una secuencia de AA de ActA de los métodos y las composiciones de la presente invención comprende la secuencia que se expone en la sec. con núm. de ident.: 4. En otra modalidad, la secuencia de AA de ActA es un homólogo de la sec. con núm. de ident.: 4. En otra modalidad, la secuencia de AA de ActA es una variante de la sec. con núm. de ident.: 4. En otra modalidad, la secuencia de AA de ActA es un fragmento de la sec. con núm. de ident.: 4. En otra modalidad, la secuencia de AA de ActA es una isoforma de la sec. con núm. de ident.: 4.
En otra modalidad, el fragmento de ActA está codificado por un nucleótido recombinante que comprende la secuencia: ATGCGTGCGATGATGGTGGTTTTCATTACTGCCAATTGCATTACGATTAACCCCGACATAA TATTTGCAGCGACAGATAGCGAAGATTCTAGTCTAAACACAGATGAATGGGAAGAAGAAA AAACAGAAGAGCAACCAAGCGAGGTAAATACGGGACCAAGATACGAAACTGCACGTGAA GTAAGTTCACGTGATATTAAAGAACTAGAAAAATCGAATAAAGTGAGAAATACGAACAAA GCAGACCTAATAGCAATGTTGAAAGAAAAAGCAGAAAAAGGTCCAAATATCAATAATAAC AACAGTGAACAAACTGAGAATGCGGCTATAAATGAAGAGGCTTCAGGAGCCGACCGACCA GCTATACAAGTGGAGCGTCGTCATCCAGGATTGCCATCGGATAGCGCAGCGGAAATTAAAA AAAGAAGGAAAGCCATAGCATCATCGGATAGTGAGCTTGAAAGCCTTACTTATCCGGATAA ACCAACAAAAGTAAATAAGAAAAAAGTGGCGAAAGAGTCAGTTGCGGATGCTTCTGAAA GTGACTTAGATTCTAGCATGCAGTCAGCAGATGAGTCTTCACCACAACCTTTAAAAGCAAA CCAACAACCATTTTTCCCTAAAGTATTTAAAAAAATAAAAGATGCGGGGAAATGGGTACG
TGATAAAATCGACGAAAATCCTGAAGTAAAGAAAGCGATTGTTGATAAAAGTGCAGGGTT AATTGACCAATTATTAACCAAAAAGAAAAGTGAAGAGGTAAATGCTTCGGACTTCCCGCC ACCACCTACGGATGAAGAGTTAAGACTTGCTTTGCCAGAGACACCAATGCTTCTTGGTTTT AATGCTCCTGCTACATCAGAACCGAGCTCATTCGAATTTCCACCACCACCTACGGATGAAG AGTTAAGACTTGCTTTGCCAGAGACGCCAATGCTTCTTGGTTTTAATGCTCCTGCTACATC GGAACCGAGCTCGTTCGAATTTCCACCGCCTCCAACAGAAGATGAACTAGAAATCATCCG GGAAACAGCATCCTCGCTAGATTCTAGTTTTACAAGAGGGGATTTAGCTAGTTTGAGAAAT GCTATTAATCGCCATAGTCAAAATTTCTCTGATTTCCCACCAATCCCAACAGAAGAAGAGT TGAACGGGAGAGGCGGTAGACCA (sec. con núm. de ident.: 5). En otra modalidad, el nucleótido recombinante tiene la secuencia que se expone en la sec. con núm. de ident.: 5. En otra modalidad, un nucleótido que codifica ActA, de los métodos y las composiciones de la presente invención, comprende la secuencia que se expone en la sec. con núm. de ident.: 5. En otra modalidad, el nucleótido que codifica ActA es un homólogo de la sec. con núm. de ident.: 5. En otra modalidad, el nucleótido que codifica ActA es una variante de la sec. con núm. de ident.: 5. En otra modalidad, el nucleótido que codifica ActA es un fragmento de la sec. con núm. de ident.: 5. En otra modalidad, el nucleótido que codifica ActA es una isoforma de la sec. con núm. de ident.: 5.
En otra modalidad, el fragmento de ActA es cualquier otro fragmento de ActA conocido en la técnica. En otra modalidad, un nucleótido recombinante de la presente invención comprende cualquier otra secuencia que codifique un fragmento de una proteína ActA. En otra modalidad, el nucleótido recombinante comprende cualquier otra secuencia que codifique una proteína ActA completa.
En otra modalidad de los métodos y las composiciones de la presente invención, una secuencia de AA similar a PEST se fusiona al fragmento de HMW-MAA. En otra modalidad, la secuencia de AA SIMILAR A PEST es KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK (sec. con núm. de ident.: 6). En otra modalidad, la secuencia similar a PEST es KENSISSMAPPASPPASPK (sec. con núm. de ident.: 7). En otra modalidad, la fusión de un antígeno a cualquier secuencia de LLO que incluye la 1 de las secuencias de AA similares a PEST enumeradas en la presente descripción puede mejorar la inmunidad mediada por células contra HMW-MAA.
En otra modalidad, la secuencia de AA similar a PEST es una secuencia similar a PEST de una proteína ActA de Listeria. En otra modalidad, la secuencia similar a PEST es KTEEQPSEVNTGPR (sec. con núm. de ident.: 8), KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK (sec. con núm. de ident.: 9), KNEEVNASDFPPPPTDEELR (sec. con núm. de ident.: 10), o RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR (sec. con núm. de ident.: 11). En otra modalidad, la secuencia similar a PEST es de la citolisina de Listeria seeligeri, codificada por el gen lso. En otra modalidad, la secuencia similar a PEST es RSEVTISPAETPESPPATP (sec. con núm. de ident.: 12). En otra modalidad, la secuencia similar a PEST es de la proteína estreptolisina O de Streptococcus sp. En otra modalidad, la secuencia similar a PEST es de estreptolisina O de Streptococcus pyogenes, por ejemplo KQNTASTETTTTNEQPK (sec. con núm. de ident.: 13) en los AA 35-51. En otra modalidad, la secuencia similar a PEST es de la Estreptolisina O de Streptococcus equisimilis, por ejemplo, KQNTANTETTTTNEQPK (sec. con núm. de ident.: 14) en los AA 38
54. En otra modalidad, la secuencia similar a PEST tiene una secuencia seleccionada de la sec. con núm. de ident.: 8-14. En otra modalidad, la secuencia similar a PEST tiene una secuencia seleccionada de la sec. con núm. de ident.: 6-14. En otra modalidad, la secuencia similar a PEST es otra secuencia de AA similar a PEST derivada de un organismo procariota.
La identificación de secuencias similares a PEST se conoce bien en la técnica, y se describe, por ejemplo en Rogers S y otros (Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science 1986; 234(4774):364-8) y Rechsteiner M y otros (PEST sequences and regulation by proteolysis. Trends Biochem Sci 1996; 21(7):267-71)). Una “secuencia similar a PEST” se refiere, en otra modalidad, a una región rica en residuos de prolina (P), ácido glutámico (E), serina (S), y treonina (T). En otra modalidad, la secuencia similar a PEST está flanqueada por uno o más grupos que contienen varios aminoácidos cargados positivamente. En otra modalidad, la secuencia similar a PEST media la degradación intracelular rápida de las proteínas que la contienen. En otra modalidad, la secuencia similar a PEST se adapta a un algoritmo descrito en Rogers y otros. En otra modalidad, la secuencia similar a PEST se adapta a un algoritmo descrito en Rechsteiner y otros. En otra modalidad, la secuencia similar a PEST contiene uno o más sitios de fosforilación internos, y la fosforilación en estos sitios precede a la degradación de proteínas.
En una modalidad, las secuencias similares a PEST de organismos procariotas se identifican de acuerdo con métodos tales como los descritos en, por ejemplo, Rechsteiner y Rogers (1996, Trends Biochem. Sci. 21:267-271) para LM y en Rogers S y otros (Science 1986; 234(4774):364-8). Alternativamente, pueden identificarse además secuencias de AA similares a PEST a partir de otros organismos procariotas sobre la base de este método. Otros organismos procariotas en donde se esperarían secuencias de AA similares a PEST incluyen, pero sin limitarse a, otras especies de Listeria. En una modalidad, la secuencia similar a PEST se adapta a un algoritmo descrito en Rogers y otros. En otra modalidad, la secuencia similar a PEST se adapta a un algoritmo descrito en Rechsteiner y otros. En otra modalidad, la secuencia similar a PEST se identifica mediante el uso del programa de búsqueda de PEST.
En otra modalidad, la identificación de motivos PEST se logra mediante una exploración inicial de los AA cargados positivamente R, H, y K dentro de la secuencia especificada de la proteína. Se cuentan todos los AA entre los flancos cargados positivamente y sólo se consideran además, los motivos que contienen un número de AA igual o mayor que el parámetro de tamaño de la ventana. En otra modalidad, una secuencia similar a PEST debe contener al menos 1 P,1 D o E, yalmenos1 S o T.
En otra modalidad, la calidad de un motivo PEST se refina por medio de un parámetro de puntuación basado en el enriquecimiento local de AA críticos, así como en la hidrofobicidad del motivo. El enriquecimiento de D, E, P, S y T se expresa en porcentaje de masa (p/p) y se corrige para 1 equivalente de D o E, 1 de P y 1 de S o T. En otra modalidad, el cálculo de hidrofobicidad sigue en principio, el método de J. Kyte y R.F. Doolittle (Kyte, J y Dootlittle, RF. J. Mol. Biol. 157, 105 (1982)). Para la simplificación de los cálculos, los índices de hidropatía de Kyte-Doolittle, que originalmente se encontraban en el intervalo de -4,5 para arginina a +4,5 para isoleucina, se convierten a números enteros positivos, mediante el uso de la siguiente transformación lineal, que produjo valores de 0 para arginina a 90 para isoleucina.
Índice de hidropatía = 10 * índice de hidropatía de Kyte-Doolittle + 45
En otra modalidad, la hidrofobicidad de un motivo PEST potencial se calcula como la suma sobre los productos del por ciento en moles y el índice de hidrofobicidad para cada especie de AA. La puntuación de PEST deseada se obtiene como la combinación del término de enriquecimiento local y el término de hidrofobicidad como se expresa por la siguiente ecuación:
Puntuación de PEST = 0,55 * DEPST -0,5 * índice de hidrofobicidad.
En otra modalidad, los términos "secuencia similar a PEST", "péptido con secuencia similar a PEST" se refieren a un péptido que tiene una puntuación de al menos +5, con el uso del algoritmo anterior. En otra modalidad, el término se refiere a un péptido que tiene una puntuación de al menos 6. En otra modalidad, el péptido tiene una puntuación de al menos 7. En otra modalidad, la puntuación es al menos 8. En otra modalidad, la puntuación es al menos 9. En otra modalidad, la puntuación es al menos 10. En otra modalidad, la puntuación es al menos 11. En otra modalidad, la puntuación es al menos 12. En otra modalidad, la puntuación es al menos 13. En otra modalidad, la puntuación es al menos 14. En otra modalidad, la puntuación es al menos 15. En otra modalidad, la puntuación es al menos 16. En otra modalidad, la puntuación es al menos 17. En otra modalidad, la puntuación es al menos 18. En otra modalidad, la puntuación es al menos 19. En otra modalidad, la puntuación es al menos 20. En otra modalidad, la puntuación es al menos 21. En otra modalidad, la puntuación es al menos 22. En otra modalidad, la puntuación es al menos 22. En otra modalidad, la puntuación es al menos 24. En otra modalidad, la puntuación es al menos 24. En otra modalidad, la puntuación es al menos 25. En otra modalidad, la puntuación es al menos 26. En otra modalidad, la puntuación es al menos 27. En otra modalidad, la puntuación es al menos 28. En otra modalidad, la puntuación es al menos 29. En otra modalidad, la puntuación es al menos 30. En otra modalidad, la puntuación es al menos 32. En otra modalidad, la puntuación es al menos 35. En otra modalidad, la puntuación es al menos 38. En otra modalidad, la puntuación es al menos 40. En otra modalidad, la puntuación es al menos 45.
En otra modalidad, la secuencia similar a PEST se identifica mediante el uso de cualquier otro método o algoritmo conocido en la técnica, por ejemplo, el CaSPredictor (Garay-Malpartida HM, Occhiucci JM, Alves J, Belizario JE. Bioinformatics. Junio de 2005;21 Suplemento 1:i169-76). En otra modalidad, se usa el siguiente método:
Un índice de PEST se calcula para cada tramo de longitud adecuada (por ejemplo, un tramo de 30-35 AA) mediante la asignación de un valor de 1 a los AA Ser, Thr, Pro, Glu, Asp, Asn, o Gln. El valor del coeficiente (CV) para cada uno de los residuos PEST es 1 y para cada uno de los otros AA (no PEST) es 0.
"Fusión a una secuencia similar a PEST" se refiere, en otra modalidad, a la fusión a un fragmento proteico que comprende una secuencia similar a PEST. En otra modalidad, el término incluye casos en donde el fragmento proteico comprende una secuencia circundante distinta de la secuencia similar a PEST. En otra modalidad, el fragmento proteico consiste en la secuencia similar a PEST. Por lo tanto, en otra modalidad, “fusión” se refiere a dos péptidos o fragmentos proteicos unidos entre sí en sus extremos respectivos o embebidos uno dentro del otro.
En otra modalidad, el fragmento de HMW-MAA de los métodos y las composiciones de la presente invención se fusiona a la secuencia de AA que no es de HMW-MAA. En otra modalidad, el fragmento de HMW-MAA está embebido dentro de una secuencia de AA que no es de HMW-MAA. En otra modalidad, un péptido derivado de HMW-MAA se incorpora en un fragmento de LLO, proteína o fragmento de ActA, o secuencia similar a PEST.
En otra modalidad, las proteínas de fusión de la presente invención se preparan mediante un proceso que comprende subclonar secuencias adecuadas, seguido de la expresión del nucleótido resultante. En otra modalidad, las subsecuencias se clonan y las subsecuencias adecuadas se escinden mediante el uso de enzimas de restricción adecuadas. Los fragmentos se ligan después, en otra modalidad, para producir la secuencia de ADN deseada. En otra modalidad, el ADN que codifica la proteína de fusión se produce mediante el uso de métodos de amplificación del ADN, por ejemplo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En primer lugar, los segmentos del ADN nativo
en cada lado del nuevo extremo se amplifican por separado. El extremo 5' de la secuencia amplificada codifica al enlazador peptídico, mientras que el extremo 3' de la otra secuencia amplificada también codifica al enlazador peptídico. Dado que el extremo 5' del primer fragmento es complementario al extremo 3' del segundo fragmento, los dos fragmentos (después de una purificación parcial, por ejemplo en LMP agarosa) pueden usarse como una plantilla de superposición en una tercera reacción de PCR. La secuencia amplificada contendrá codones, el segmento en el lado carboxilo del sitio de apertura (que ahora forma la secuencia del amino), el enlazador, y la secuencia en el lado amino del sitio de apertura (que ahora forma la secuencia del carboxilo). El inserto se liga después en un plásmido. En otra modalidad, se usa una estrategia similar para producir una proteína en donde un fragmento de HMW-MAA está embebido dentro de un péptido heterólogo.
En una modalidad, las secuencias de LLO fusionadas a un fragmento de HMW-MAA tal como A, B, o C o una Listeria que expresa un fragmento de HMW-MAA aumentaron la respuesta inmunitaria contra dicho péptido (Ejemplo 5), confirieron inmunidad antitumoral (Ejemplos 4 y 5), y generaron células CD8+ secretoras de IFN-gamma específicas para el péptido (Ejemplo 5). En una modalidad, ActA, LLO y/o secuencias similares a PEST fusionadas a un péptido tal como E7 de HPV aumentaron la respuesta inmunitaria contra dicho péptido, confirieron inmunidad antitumoral, y generaron células CD8+ secretoras de IFN-gamma específicas para el péptido (Ejemplos 6 y 7), incluso cuando el péptido de fusión se expresó en un vector diferente de Listeria (Ejemplo 8).
En otra modalidad, un polipéptido recombinante de la presente invención se produce mediante un proceso que comprende la etapa de conjugar químicamente un primer polipéptido que comprende un fragmento de HMW-MAA a un segundo polipéptido que comprende un péptido que no es de HMW-MAA. En otra modalidad, un fragmento de HMW-MAA se conjuga a un segundo polipéptido que comprende el péptido que no es de HMW-MAA. En otra modalidad, un péptido que comprende un fragmento de HMW-MAA se conjuga a un péptido que no es de HMW-MAA. En otra modalidad, un fragmento de HMW-MAA se conjuga a un péptido que no es de HMW-MAA.
La proteína HMW-MAA a partir de la cual se derivan los fragmentos de HMW-MAA de la presente invención es, en otra modalidad, una proteína HMW-MAA humana. En otra modalidad, la proteína HMW-MAA es una proteína de ratón. En otra modalidad, la proteína HMW-MAA es una proteína de rata. En otra modalidad, la proteína HMW-MAA es una proteína de primate. En otra modalidad, la proteína HMW-MAA es de cualquier otra especie conocida en la técnica. En otra modalidad, la proteína HMW-MAA es el proteoglicano sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP). En otra modalidad, una proteína AN2 se usa en los métodos y las composiciones de la presente invención. En otra modalidad, una proteína NG2 se usa en los métodos y las composiciones de la presente invención.
En otra modalidad, la proteína HMW-MAA de los métodos y las composiciones de la presente invención tiene la secuencia: MQSGRGPPLPAPGLALALTLTMLARLASAASFFGENHLEVPVATALTDIDLQLQFSTSQ PEALLLLAAGPADHLLLQLYSGRLQVRLVLGQEELRLQTPAETLLSDSIPHTVVLTVVEGWATL SVDGFLNASSAVPGAPLEVPYGLFVGGTGTLGLPYLRGTSRPLRGCLHAATLNGRSLLRPLTPD VHEGCAEEFSASDDVALGFSGPHSLAAFPAWGTQDEGTLEFTLTTQSRQAPLAFQAGGRRGDF IYVDIFEGHLRAVVEKGQGTVLLHNSVPVADGQPHEVSVHINAHRLEISVDQYPTHTSNRGVLS YLEPRGSLLLGGLDAEASRHLQEHRLGLTPEATNASLLGCMEDLSVNGQRRGLREALLTRNMA AGCRLEEEEYEDDAYGHYEAFSTLAPEAWPAMELPEPCVPEPGLPPVFANFTQLLTISPLVVAE GGTAWLEWRHVQPTLDLMEAELRKSQVLFSVTRGARHGELELDIPGAQARKMFTLLDVVNRK ARFIHDGSEDTSDQLVLEVSVTARVPMPSCLRRGQTYLLPIQVNPVNDPPHIIFPHGSLMVILEH TQKPLGPEVFQAYDPDSACEGLTFQVLGTSSGLPVERRDQPGEPATEFSCRELEAGSLVYVHRG GPAQDLTFRVSDGLQASPPATLKVVAIRPAIQIHRSTGLRLAQGSAMPILPANLSVETNAVGQD VSVLFRVTGALQFGELQKQGAGGVEGAEWWATQAFHQRDVEQGRVRYLSTDPQHHAYDTV ENLALEVQVGQEILSNLSFPVTIQRATVWMLRLEPLHTQNTQQETLTTAHLEATLEEAGPSPPT FHYEVVQAPRKGNLQLQGTRLSDGQGFTQDDIQAGRVTYGATARASEAVEDTFRFRVTAPPY FSPLYTFPIHIGGDPDAPVLTNVLLVVPEGGEGVLSADHLFVKSLNSASYLYEVMERPRHGRLA WRGTQDKTTMVTSFTNEDLLRGRLVYQHDDSETTEDDIPFVATRQGESSGDMAWEEVRGVF RVAIQPVNDHAPVQTISRIFHVARGGRRLLTTDDVAFSDADSGFADAQLVLTRKDLLFGSIVAV DEPTRPIYRFTQEDLRKRRVLFVHSGADRGWIQLQVSDGQHQATALLEVQASEPYLRVANGSS LVVPQGGQGTIDTAVLHLDTNLDIRSGDEVHYHVTAGPRWGQLVRAGQPATAFSQQDLLDGA VLYSHNGSLSPRDTMAFSVEAGPVHTDATLQVTIALEGPLAPLKLVRHKKIYVFQGEAAEIRRD QLEAAQEAVPPADIVFSVKSPPSAGYLVMVSRGALADEPPSLDPVQSFSQEAVDTGRVLYLHSR PEAWSDAFSLDVASGLGAPLEGVLVELEVLPAAIPLEAQNFSVPEGGSLTLAPPLLRVSGPYFPT LLGLSLQVLEPPQHGALQKEDGPQARTLSAFSWRMVEEQLIRYVHDGSETLTDSFVLMANASE MDRQSHPVAFTVTVLPVNDQPPILTTNTGLQMWEGATAPIPAEALRSTDGDSGSEDLVYTIEQP SNGRVVLRGAPGTEVRSFTQAQLDGGLVLFSHRGTLDGGFRFRLSDGEHTSPGHFFRVTAQKQ VLLSLKGSQTLTVCPGSVQPLSSQTLRASSSAGTDPQLLLYRVVRGPQLGRLFHAQQDSTGEAL VNFTQAEVYAGNILYEHEMPPEPFWEAHDTLELQLSSPPARDVAATLAVAVSFEAACPQRPSH LWKNKGLWVPEGQRARITVAALDASNLLASVPSPQRSEHDVLFQVTQFPSRGQLLVSEEPLHA GQPHFLQSQLAAGQLVYAHGGGGTQQDGFHFRAHLQGPAGASVAGPQTSEAFAITVRDVNER PPQPQASVPLRLTRGSRAPISRAQLSVVDPDSAPGEIEYEVQRAPHNGFLSLVGGGLGPVTRFTQ ADVDSGRLAFVANGSSVAGIFQLSMSDGASPPLPMSLAVDILPSAIEVQLRAPLEVPQALGRSSL
SQQQLRVVSDREEPEAAYRLIQGPQYGHLLVGGRPTSAFSQFQIDQGEVVFAFTNFSSSHDHFR VLALARGVNASAVVNVTVRALLHVWAGGPWPQGATLRLDPTVLDAGELANRTGSVPRFRLL EGPRHGRVVRVPRARTEPGGSQLVEQFTQQDLEDGRLGLEVGRPEGRAPGPAGDSLTLELWA QGVPPAVASLDFATEPYNAARPYSVALLSVPEAARTEAGKPESSTPTGEPGPMASSPEPAVAK GGFLSFLEANMFSVIIPMCLVLLLLALILPLLFYLRKRNKTGKHDVQVLTAKPRNGLAGDTETFR KVEPGQAIPLTAVPGQGPPPGGQPDPELLQFCRTPNPALKNGQYWV (sec. con núm. de ident.: 15). En otra modalidad, una secuencia de AA de HMW-MAA de los métodos y las composiciones de la presente invención comprende la secuencia que se expone en la sec. con núm. de ident.: 15. En otra modalidad, la secuencia de AA de HMW-MAA es un homólogo de la sec. con núm. de ident.: 15. En otra modalidad, la secuencia de AA de HMW-MAA es una variante de la sec. con núm. de ident.: 15. En otra modalidad, la secuencia de AA de HMW-MAA es un fragmento de la sec. con núm. de ident.: 15. En otra modalidad, la secuencia de AA de HMW-MAA es una isoforma de la sec. con núm. de ident.:15.
En otra modalidad, la proteína HMW-MAA de los métodos y las composiciones de la presente invención está codificada por la secuencia: atgcagtccggccgcggccccccacttccagcccccggcctggccttggctttgaccctgactatgttggccagacttgcatccgcggcttccttcttcg gtgagaaccacctggaggtgcctgtggccacggctctgaccgacatagacctgcagctgcagttctccacgtcccagcccgaagccctccttctcctg gcagcaggcccagctgaccacctcctgctgcagctctactctggacgcctgcaggtcagacttgttctgggccaggaggagctgaggctgcagactc cagcagagacgctgctgagtgactccatcccccacactgtggtgctgactgtcgtagagggctgggccacgttgtcagtcgatgggtttctgaacgcct cctcagcagtcccaggagcccccctagaggtcccctatgggctctttgttgggggcactgggacccttggcctgccctacctgaggggaaccagccga cccctgaggggttgcctccatgcagccaccctcaatggccgcagcctcctccggcctctgacccccgatgtgcatgagggctgtgctgaagagttttctg ccagtgatgatgtggccctgggcttctctgggccccactctctggctgccttccctgcctggggcactcaggacgaaggaaccctagagtttacactca ccacacagagccggcaggcacccttggccttccaggcagggggccggcgtggggacttcatctatgtggacatatttgagggccacctgcgggccgt ggtggagaagggccagggtaccgtattgctccacaacagtgtgcctgtggccgatgggcagccccatgaggtcagtgtccacatcaatgctcaccgg ctggaaatctccgtggaccagtaccctacgcatacttcgaaccgaggagtcctcagctacctggagccacggggcagtctccttctcggggggctgga tgcagaggcctctcgtcacctccaggaacaccgcctgggcctgacaccagaggccaccaatgcctccctgctgggctgcatggaagacctcagtgtc aatggccagaggcgggggctgcgggaagctttgctgacgcgcaacatggcagccggctgcaggctggaggaggaggagtatgaggacgatgcct atggacattatgaagctttctccaccctggcccctgaggcttggccagccatggagctgcctgagccatgcgtgcctgagccagggctgcctcctgtctt tgccaatttcacccagctgctgactatcagcccactggtggtggccgaggggggcacagcctggcttgagtggaggcatgtgcagcccacgctggac ctgatggaggctgagctgcgcaaatcccaggtgctgttcagcgtgacccgaggggcacgccatggcgagctcgagctggacatcccgggagccca ggcacgaaaaatgttcaccctcctggacgtggtgaaccgcaaggcccgcttcatccacgatggctctgaggacacctccgaccagctggtgctggag gtgtcggtgacggctcgggtgcccatgccctcatgccttcggaggggccaaacatacctcctgcccatccaggtcaaccctgtcaatgacccacccca catcatcttcccacatggcagcctcatggtgatcctggaacacacgcagaagccgctggggcctgaggttttccaggcctatgacccggactctgcctg tgagggcctcaccttccaggtccttggcacctcctctggcctccccgtggagcgccgagaccagcctggggagccggcgaccgagttctcctgccgg gagttggaggccggcagcctagtctatgtccaccgcggtggtcctgcacaggacttgacgttccgggtcagcgatggactgcaggccagccccccg gccacgctgaaggtggtggccatccggccggccatacagatccaccgcagcacagggttgcgactggcccaaggctctgccatgcccatcttgccc gccaacctgtcggtggagaccaatgccgtggggcaggatgtgagcgtgctgttccgcgtcactggggccctgcagtttggggagctgcagaagcagg gggcaggtggggtggagggtgctgagtggtgggccacacaggcgttccaccagcgggatgtggagcagggccgcgtgaggtacctgagcactgac ccacagcaccacgcttacgacaccgtggagaacctggccctggaggtgcaggtgggccaggagatcctgagcaatctgtccttcccagtgaccatcc agagagccactgtgtggatgctgcggctggagccactgcacactcagaacacccagcaggagaccctcaccacagcccacctggaggccaccctg gaggaggcaggcccaagccccccaaccttccattatgaggtggttcaggctcccaggaaaggcaaccttcaactacagggcacaaggctgtcagat ggccagggcttcacccaggatgacatacaggctggccgggtgacctatggggccacagcacgtgcctcagaggcagtcgaggacaccttccgtttc cgtgtcacagctccaccatatttctccccactctataccttccccatccacattggtggtgacccagatgcgcctgtcctcaccaatgtcctcctcgtggtg cctgagggtggtgagggtgtcctctctgctgaccacctctttgtcaagagtctcaacagtgccagctacctctatgaggtcatggagcggccccgccat gggaggttggcttggcgtgggacacaggacaagaccactatggtgacatccttcaccaatgaagacctgttgcgtggccggctggtctaccagcatg atgactccgagaccacagaagatgatatcccatttgttgctacccgccagggcgagagcagtggtgacatggcctgggaggaggtacggggtgtctt ccgagtggccatccagcccgtgaatgaccacgcccctgtgcagaccatcagccggatcttccatgtggcccggggtgggcggcggctgctgactac agacgacgtggccttcagcgatgctgactcgggctttgctgacgcccagctggtgcttacccgcaaggacctcctctttggcagtatcgtggccgtag atgagcccacgcggcccatctaccgcttcacccaggaggacctcaggaagaggcgagtactgttcgtgcactcaggggctgaccgtggctggatcc agctgcaggtgtccgacgggcaacaccaggccactgcgctgctggaggtgcaggcctcggaaccctacctccgtgtggccaacggctccagcctt gtggtccctcaagggggccagggcaccatcgacacggccgtgctccacctggacaccaacctcgacatccgcagtggggatgaggtccactacca cgtcacagctggccctcgctggggacagctagtccgggctggtcagccagccacagccttctcccagcaggacctgctggatggggccgttctctat agccacaatggcagcctcagcccccgcgacaccatggccttctccgtggaagcagggccagtgcacacggatgccaccctacaagtgaccattgcc ctagagggcccactggccccactgaagctggtccggcacaagaagatctacgtcttccagggagaggcagctgagatcagaagggaccagctgga ggcagcccaggaggcagtgccacctgcagacatcgtattctcagtgaagagcccaccgagtgccggctacctggtgatggtgtcgcgtggcgccttg gcagatgagccacccagcctggaccctgtgcagagcttctcccaggaggcagtggacacaggcagggtcctgtacctgcactcccgccctgaggcc tggagcgatgccttctcgctggatgtggcctcaggcctgggtgctcccctcgagggcgtccttgtggagctggaggtgctgcccgctgccatcccact agaggcgcaaaacttcagcgtccctgagggtggcagcctcaccctggcccctccactgctccgtgtctccgggccctacttccccactctcctgggcc tcagcctgcaggtgctggagccaccccagcatggagccctgcagaaggaggacggacctcaagccaggaccctcagcgccttctcctggagaatg gtggaagagcagctgatccgctacgtgcatgacgggagcgagacactgacagacagttttgtcctgatggctaatgcctccgagatggatcgccaga gccatcctgtggccttcactgtcactgtcctgcctgtcaatgaccaaccccccatcctcactacaaacacaggcctgcagatgtgggagggggccact gcgcccatccctgcggaggctctgaggagcacggacggcgactctgggtctgaggatctggtctacaccatcgagcagcccagcaacgggcgggt agtgctgcggggggcgccgggcactgaggtgcgcagcttcacgcaggcccagctggacggcgggctcgtgctgttctcacacagaggaaccctgg atggaggcttccgcttccgcctctctgacggcgagcacacttcccccggacacttcttccgagtgacggcccagaagcaagtgctcctctcgctgaag ggcagccagacactgactgtctgcccagggtccgtccagccactcagcagtcagaccctcagggccagctccagcgcaggcactgacccccagctc ctgctctaccgtgtggtgcggggcccccagctaggccggctgttccacgcccagcaggacagcacaggggaggccctggtgaacttcactcaggca
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16.
En otra modalidad, la proteína HMW-MAA de los métodos y las composiciones de la presente invención tiene una secuencia de AA que se expone en una entrada del GenBank que tiene uno de los números de acceso seleccionado de NM_001897 y X96753. En otra modalidad, la proteína HMW-MAA está codificada por una secuencia de nucleótidos que se expone en una de las entradas del GenBank anteriores. En otra modalidad, la proteína HMW-MAA comprende una secuencia que se expone en una de las entradas del GenBank anteriores. En otra modalidad, la proteína HMW-MAA es un homólogo de una secuencia que se expone en una de las entradas del GenBank anteriores. En otra modalidad, la proteína HMW-MAA es una variante de una secuencia que se expone en una de las entradas del GenBank anteriores. En otra modalidad, la proteína HMW-MAA es un fragmento de una secuencia que se expone en una de las entradas del GenBank anteriores. En otra modalidad, la proteína HMW-MAA es una isoforma de una secuencia que se expone en una de las entradas del GenBank anteriores.
El fragmento de HMW-MAA utilizado en la presente invención comprende, en otra modalidad, los AA 360-554. En otra modalidad, el fragmento consiste esencialmente en los AA 360-554. En otra modalidad, el fragmento consiste en los AA 360-554. En otra modalidad, el fragmento comprende los AA 701-1130. En otra modalidad, el fragmento consiste esencialmente en los AA 701-1130. En otra modalidad, el fragmento consiste en los AA 701-1130. En otra modalidad, el fragmento comprende los AA 2160-2258. En otra modalidad, el fragmento consiste esencialmente en 2160-2258. En otra modalidad, el fragmento consiste en 2160-2258.
En algunas modalidades, un polipéptido de la presente invención comprenderá un fragmento de una proteína HMW-MAA, en cualquier forma o modalidad como se describe en la presente. En algunas modalidades, cualquiera de los polipéptidos de la presente invención consistirá de un fragmento de una proteína HMW-MAA, en cualquier forma o modalidad como se describe en la presente. En algunas modalidades, de las composiciones de esta invención consistirá esencialmente de un fragmento de una proteína HMW-MAA, en cualquier forma o modalidad como se describe en la presente. En algunas modalidades, el término "comprender" se refiere a la inclusión del agente activo indicado, tal como el fragmento de una proteína HMW-MAA, o el fragmento de una proteína HMW-MAA y un polipéptido que no es de HMW-MAA, así como la inclusión de otros agentes activos, y vehículos, excipientes, emolientes, estabilizadores farmacéuticamente aceptables, etcétera, como se conocen en la industria farmacéutica. En algunas modalidades, el término "que consiste esencialmente en" se refiere a una composición, cuyo único ingrediente activo es el ingrediente activo indicado, sin embargo, pueden incluirse otros compuestos que son para estabilizar, preservar, etcétera, la formulación, pero no están implicados directamente en el efecto terapéutico del ingrediente activo indicado. En algunas modalidades, el término "que consiste esencialmente en" puede referirse a componentes que facilitan la liberación del ingrediente activo. En algunas modalidades, el término "que consiste" se refiere a una composición, que contiene el ingrediente activo y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptables.
En otra modalidad, el fragmento de HMW-MAA es de aproximadamente 98 AA de longitud. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 194 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 430 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 98-194 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 194-430 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 98-430 AA.
En otra modalidad la longitud del fragmento de HMW-MAA de la presente invención es de al menos 8 aminoácidos (AA). En otra modalidad, la longitud es de más de 8 AA. En otra modalidad, la longitud es de al menos 9 AA. En otra modalidad, la longitud es de más de 9 AA. En otra modalidad, la longitud es de al menos 10 AA. En otra modalidad, la longitud es de más de 10 AA. En otra modalidad, la longitud es de al menos 11 AA. En otra modalidad, la longitud es de más de 11 AA. En otra modalidad, la longitud es de al menos 12 AA. En otra modalidad, la longitud es de más de 12 AA. En otra modalidad, la longitud es de al menos aproximadamente 14 AA. En otra modalidad, la longitud es de más de 14 AA. En otra modalidad, la longitud es de al menos aproximadamente 16 AA. En otra modalidad, la longitud es de más de 16 AA. En otra modalidad, la longitud es de al menos aproximadamente 18 AA. En otra modalidad, la longitud es de más de 18 AA. En otra modalidad, la longitud es de al menos aproximadamente 20 AA. En otra modalidad, la longitud es de más de 20 AA. En otra modalidad, la longitud es de al menos aproximadamente 25 AA. En otra modalidad, la longitud es de más de 25 AA. En otra modalidad, la longitud es de al menos aproximadamente 30 AA. En otra modalidad, la longitud es de más de 30 AA. En otra modalidad, la longitud es de al menos aproximadamente 40 AA. En otra modalidad, la longitud es de más de 40 AA. En otra modalidad, la longitud es de al menos aproximadamente 50 AA. En otra modalidad, la longitud es de más de 50 AA. En otra modalidad, la longitud es de al menos aproximadamente 70 AA. En otra modalidad, la longitud es de más de 70 AA. En otra modalidad, la longitud es de al menos aproximadamente 100 AA. En otra modalidad, la longitud es de más de 100 AA. En otra modalidad, la longitud es de al menos aproximadamente 150 AA. En otra modalidad, la longitud es de más de 150 AA. En otra modalidad, la longitud es de al menos aproximadamente 200 AA. En otra modalidad, la longitud es de más de 200 AA.
En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 8-50 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 8-70 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 8-100 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 8-150 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 8-200 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 8-250 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 8-300 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 8-400 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 8-500 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 9-50 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 9-70 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 9100 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 9-150 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 9-200 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 9-250 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 9-300 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 10-50 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 10-70 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 10-100 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 10-150 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 10-200 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 10-250 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 10-300 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 10-400 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 10-500 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 11-50 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 11-70 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 11-100 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 11-150 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 11-200 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 11-250 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 11-300 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 11-400 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 11-500 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 12-50 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 12-70 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 12-100 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 12-150 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 12-200 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 12-250 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 12-300 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 12-400 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 12-500 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 15-50 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 15-70 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 15-100 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 15-150 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 15-200 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 15-250 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 15-300 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 15-400 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 15-500 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 8-400 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 8-500 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 20-50 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 20-70 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 20-100 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 20-150 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 20-200 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 20-250 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 20-300 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 20-400 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 20-500 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 30-50 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 30-70 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 30-100 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 30-150 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 30-200 AA. En otra modalidad, la longitud es de
aproximadamente 30-250 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 30-300 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 30-400 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 30-500 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 40-50 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 40-70 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 40-100 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 40-150 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 40-200 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 40-250 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 40-300 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 40-400 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 40-500 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 50-70 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 50-100 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 50-150 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 50-200 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 50-250 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 50-300 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 50-400 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 50-500 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 70-100 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 70-150 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 70-200 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 70-250 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 70-300 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 70-400 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 70-500 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 100-150 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 100-200 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 100-250 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 100-300 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 100-400 AA. En otra modalidad, la longitud es de aproximadamente 100-500 AA.
En otra modalidad, un polipéptido recombinante de los métodos y las composiciones de la presente invención comprende una secuencia señal. En otra modalidad, la secuencia señal es del organismo usado para la construcción del vector vacunal. En otra modalidad, la secuencia señal es una secuencia señal de LLO. En otra modalidad, la secuencia señal es una secuencia señal de ActA. En otra modalidad, la secuencia señal es una secuencia señal de Listeria. En otra modalidad, la secuencia señal es cualquier otra secuencia señal conocida en la técnica.
Los términos “péptido” y “péptido recombinante” se refieren, en otra modalidad, a un péptido o polipéptido de cualquier longitud. En otra modalidad, un péptido o péptido recombinante de la presente invención tiene una de las longitudes enumeradas anteriormente para un fragmento de HMW-MAA. Cada posibilidad representa una modalidad separada de la presente invención. En una modalidad, el término “péptido” se refiere a péptidos nativos (ya sean productos de degradación, péptidos sintetizados sintéticamente o péptidos recombinantes) y/o peptidomiméticos (típicamente, péptidos sintetizados sintéticamente), tales como peptoides y semipeptoides que son análogos de péptidos, que pueden tener, por ejemplo, modificaciones que le dan más estabilidad a los péptidos mientras están en un cuerpo, o más capacidad de penetrar en las células. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a modificación del N terminal, modificación del C terminal, modificación de los enlaces peptídicos, que incluyen, pero no se limitan a, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH o CF=CH, modificaciones de la cadena principal, y modificación de residuos. Los métodos para preparar compuestos peptidomiméticos se conocen bien en la técnica y se especifican, por ejemplo, en Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Capítulo 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992), que se incorpora como referencia como si se expusiera totalmente en la presente descripción. A continuación se proporcionan más detalles al respecto.
Los enlaces peptídicos (-CO-NH-) dentro del péptido pueden sustituirse, por ejemplo, por enlaces N-metilados (-N(CH3)-CO-), enlaces tipo éster (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-), enlaces cetometileno (-CO-CH2-), enlaces *-aza (-NH-N(R)-CO-), en donde R es cualquier grupo alquilo, por ejemplo, metilo, enlaces carba (-CH2-NH-), enlaces hidroxietileno (-CH(OH)-CH2-), enlaces tioamida (-CS-NH-), doble enlaces olefínicos (-CH=CH-), enlaces retroamida (-NH-CO-), derivados de péptidos (-N(R)-CH2-CO-), en donde R es la cadena lateral "normal", que se presenta naturalmente en el átomo de carbono.
Estas modificaciones pueden producirse en cualquiera de los enlaces a lo largo de la cadena peptídica e incluso en varios (2-3) al mismo tiempo. Los aminoácidos aromáticos naturales, Trp, Tyr y Phe, pueden sustituirse por ácidos sintéticos no naturales tales como TIC, naftilelanina (Nol), derivados de Phe metilados en el anillo, derivados halogenados de Phe u o-metil-Tyr.
Además de lo anterior, los péptidos de la presente invención pueden incluir, además, uno o más aminoácidos modificados o uno o más monómeros que no son aminoácidos (por ejemplo ácidos grasos, carbohidratos complejos, etcétera).
En una modalidad, se comprende que el término "aminoácido(s)" incluye los 20 aminoácidos de origen natural; los aminoácidos frecuentemente modificados postraduccionalmente in vivo, que incluyen, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoácidos inusuales que incluyen, pero no se limitan a, ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, norvalina, norleucina y ornitina. Además, el término "aminoácido" puede incluir D-y Laminoácidos.
Los péptidos o proteínas de esta invención pueden prepararse mediante diversas técnicas conocidas en la materia, que incluyen genotecas de presentación por fagos (Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks y otros, J. Mol. Biol. 222:581 (1991)).
En una modalidad, el término "oligonucleótido" es intercambiable con el término "ácido nucleico", y puede referirse a una molécula, que puede incluir, pero no se limita a, secuencias procariotas, ARNm eucariótico, ADNc a partir de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (por ejemplo, de mamíferos), e incluso secuencias de ADN sintético. El término se refiere, además, a secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de las bases, conocidos para ADN y ARN.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna que comprende una cepa de Listeria recombinante de la presente invención. En una modalidad, la vacuna comprende adicionalmente un adyuvante. En una modalidad, la vacuna comprende adicionalmente una citocina, quimiocina, o combinación de estas. En una modalidad, una vacuna es una composición que induce una respuesta inmunitaria contra un antígeno o polipéptido en la composición como resultado de la exposición a la composición. En otra modalidad, la vacuna o composición comprende adicionalmente APC, que en una modalidad son autólogas, mientras que en otra modalidad, son alogénicas respecto al sujeto.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna que comprende un polipéptido recombinante de la presente invención y un adyuvante.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un polipéptido recombinante de la presente invención. En otra modalidad, la composición inmunogénica de los métodos y las composiciones de la presente invención comprende un vector vacunal recombinante que codifica un péptido recombinante de la presente invención. En otra modalidad, la composición inmunogénica comprende un plásmido que codifica un péptido recombinante de la presente invención. En otra modalidad, la composición inmunogénica comprende un adyuvante. En una modalidad, un vector de la presente invención puede administrarse como parte de una composición vacunal.
La composición inmunogénica utilizada en los métodos y las composiciones de la presente invención comprende, en otra modalidad, un vector vacunal recombinante. En otra modalidad, el vector vacunal recombinante comprende un péptido recombinante de la presente invención. En otra modalidad, el vector vacunal recombinante comprende un ácido nucleico aislado de la presente invención. En otra modalidad, el vector vacunal recombinante comprende un ácido nucleico aislado que codifica un péptido recombinante de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un vector vacunal recombinante que codifica un polipéptido recombinante de la presente invención. En otra modalidad, la presente invención proporciona un vector vacunal recombinante que comprende un polipéptido recombinante de la presente invención. En otra modalidad el vector de expresión es un plásmido. Los métodos para construir y utilizar vectores recombinantes se conocen bien en la materia y se describen, por ejemplo, en Sambrook y otros (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York), y en Brent y otros (2003, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York).
En otra modalidad, el vector es un patógeno intracelular. En otra modalidad, el vector se deriva de un patógeno citosólico. En otra modalidad, el vector se deriva de un patógeno intracelular. En otra modalidad, un patógeno intracelular induce una respuesta inmunitaria mediada por células predominantemente. En otra modalidad, el vector es una cepa de Salmonella. En otra modalidad, el vector es una cepa de BCG. En otra modalidad, el vector es un vector bacteriano. En otra modalidad, las células dendríticas transducidas con un vector de la presente invención pueden administrarse al sujeto para regular positivamente la respuesta inmunitaria del sujeto, que en una modalidad se lleva a cabo mediante la regulación positiva de la actividad de CTL.
En otra modalidad, un vector vacunal recombinante induce una respuesta inmunitaria de tipo Th1 predominantemente.
Una composición inmunogénica de los métodos y las composiciones de la presente invención comprende, en otra modalidad, un adyuvante que favorece una respuesta inmunitaria de tipo Th1 predominantemente. En otra modalidad, el adyuvante favorece una respuesta inmunitaria mediada por Th1 predominantemente. En otra modalidad, el adyuvante favorece una respuesta inmunitaria de tipo Th1. En otra modalidad, el adyuvante favorece una respuesta inmunitaria mediada por Th1. En otra modalidad, el adyuvante favorece una respuesta inmunitaria mediada por células sobre una respuesta mediada por anticuerpos. En otra modalidad, el adyuvante es cualquier otro tipo de adyuvante conocido en la técnica. En otra modalidad, la composición inmunogénica induce la formación de una respuesta inmunitaria de células T contra la proteína objetivo.
En otra modalidad, el adyuvante es MPL. En otra modalidad, el adyuvante es QS21. En otra modalidad, el adyuvante es un agonista de TLR. En otra modalidad, el adyuvante es un agonista de TLR4. En otra modalidad, el adyuvante es un agonista de TLR9. En otra modalidad, el adyuvante es Resiquimod®. En otra modalidad, el
adyuvante es imiquimod. En otra modalidad, el adyuvante es un oligonucleótido con CpG. En otra modalidad, el adyuvante es una citocina o un ácido nucleico que codifica la misma. En otra modalidad, el adyuvante es una quimiocina o un ácido nucleico que codifica la misma. En otra modalidad, el adyuvante es IL-12 o un ácido nucleico que codifica la misma. En otra modalidad, el adyuvante es IL-6 o un ácido nucleico que codifica la misma. En otra modalidad, el adyuvante es un lipopolisacárido. En otra modalidad, el adyuvante es como se describe en Fundamental Immunology, 5ta ed (Agosto de 2003): William E. Paul (Editor); Lippincott Williams & Wilkins Publishers; Capítulo 43: Vaccines, GJV Nossal, que se incorpora de esta manera como referencia. En otra modalidad, el adyuvante es cualquier otro adyuvante conocido en la técnica.
En una modalidad, una "respuesta inmunitaria de tipo Th1 predominantemente" se refiere a una respuesta inmunitaria en la que se secreta IFN-gamma. En otra modalidad, se refiere a una respuesta inmunitaria en la que se secreta el factor de necrosis tumoral-β. En otra modalidad, se refiere a una respuesta inmunitaria en la que se secreta IL-2.
En otra modalidad, el vector se selecciona de Salmonella sp., Shigella sp., BCG, L. monocytogenes (dicha modalidad se ejemplifica en el Ejemplo 2), E. coli, y S. gordonii. En otra modalidad, las proteínas de fusión se suministran mediante vectores bacterianos recombinantes modificados para escapar de la fusión fagolisosómica y vivir en el citoplasma de la célula. En otra modalidad, el vector es un vector viral. En otras modalidades, el vector se selecciona de Vaccinia (dicha modalidad se ejemplifica en el Ejemplo 8), Avipox, Adenovirus, AAV, virus Vaccinia NYVAC, cepa de vaccinia modificada Ankara (MVA), virus del bosque de Semliki, virus de la encefalitis equina venezolana, virus del herpes y retrovirus. En otra modalidad, el vector es un vector de ADN desnudo. En otra modalidad, el vector es cualquier otro vector conocido en la técnica.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido recombinante de la presente invención. En una modalidad, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia que comparte al menos 85 % de homología con un ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante de la presente invención. En otra modalidad, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia que comparte al menos 90 % de homología con un ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante de la presente invención. En otra modalidad, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia que comparte al menos 95 % de homología con un ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante de la presente invención. En otra modalidad, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia que comparte al menos 97 % de homología con un ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante de la presente invención. En otra modalidad, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia que comparte al menos 99 % de homología con un ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna que comprende una molécula de nucleótidos recombinante de la presente invención y un adyuvante. En otra modalidad, la presente invención proporciona un vector vacunal recombinante que comprende una molécula de nucleótidos recombinante de la presente invención. En otra modalidad, la presente invención proporciona un vector vacunal recombinante que codifica un polipéptido recombinante de la presente invención. En otra modalidad, la presente invención proporciona un vector vacunal recombinante que comprende un polipéptido recombinante de la presente invención. En otra modalidad el vector de expresión es un plásmido. Los métodos para construir y utilizar vectores recombinantes se conocen bien en la materia y se describen, por ejemplo, en Sambrook y otros (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York), y en Brent y otros (2003, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York).
Los métodos para preparar vacunas peptídicas se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento núm. EP1408048, la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 20070154953, y OGASAWARA y otros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 89, pp. 8995-8999, Octubre de 1992). En una modalidad, las técnicas de evolución de péptidos se usan para crear un antígeno con mayor inmunogenicidad. Las técnicas para la evolución de péptidos se conocen bien en la materia y se describen, por ejemplo en la patente de Estados Unidos núm. 6773900.
En una modalidad, una vacuna es una composición que induce una respuesta inmunitaria contra un antígeno o polipéptido en la composición como resultado de la exposición a la composición.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una cepa de Listeria recombinante que comprende una molécula de nucleótidos recombinante de la presente invención.
La cepa de Listeria recombinante de los métodos y las composiciones de la presente invención es, en otra modalidad, una cepa de Listeria monocytogenes recombinante. En otra modalidad, la cepa de Listeria es una cepa de Listeria seeligeri recombinante. En otra modalidad, la cepa de Listeria es una cepa de Listeria grayi recombinante. En otra modalidad, la cepa de Listeria es una cepa de Listeria ivanovii recombinante. En otra modalidad, la cepa de Listeria es una cepa de Listeria murrayi recombinante. En otra modalidad, la cepa de Listeria es una cepa de Listeria welshimeri recombinante. En otra modalidad, la cepa de Listeria es una cepa recombinante de cualquier otra especie de Listeria conocida en la técnica. En una modalidad, la cepa de Listeria es una cepa de Listeria que comprende LLO, mientras que en otra modalidad, la cepa de Listeria es una cepa de Listeria que
comprende ActA, mientras en otra modalidad, la cepa de Listeria es una cepa de Listeria que comprende secuencias similares a PEST.
En otra modalidad la cepa de Listeria está atenuada por deleción de un gen. En otra modalidad la cepa de Listeria está atenuada por deleción de más de 1 gen. En otra modalidad la cepa de Listeria está atenuada por deleción o inactivación de un gen. En otra modalidad la cepa de Listeria está atenuada por deleción o inactivación de más de 1 gen.
En otra modalidad, el gen que está mutado es hly. En otra modalidad, el gen que está mutado es actA. En otra modalidad, el gen que está mutado es plc A. En otra modalidad, el gen que está mutado es plcB. En otra modalidad, el gen que está mutado es mpl. En otra modalidad, el gen que está mutado es inl A. En otra modalidad, el gen que está mutado es inlB. En otra modalidad, el gen que está mutado es bsh.
En otra modalidad, la cepa de Listeria es un mutante auxotrófico. En otra modalidad, la cepa de Listeria es deficiente de un gen que codifica un gen para la síntesis de vitaminas. En otra modalidad, la cepa de Listeria es deficiente de un gen que codifica una sintasa de ácido pantoténico.
En otra modalidad, la cepa de Listeria es deficiente de una enzima del metabolismo de AA. En otra modalidad, la cepa de Listeria es deficiente de un gen de la sintasa de ácido D-glutámico. En otra modalidad, la cepa de Listeria es deficiente del gen dat. En otra modalidad, la cepa de Listeria es deficiente del gen dal. En otra modalidad, la cepa de Listeria es deficiente del gen dga. En otra modalidad la cepa de Listeria es deficiente en un gen implicado en la síntesis del ácido diaminopimélico. CysK. En otra modalidad, el gen es de la metionina sintasa independiente de la vitamina B12. En otra modalidad, el gen es trpA. En otra modalidad, el gen es trpB. En otra modalidad, el gen es trpE. En otra modalidad, el gen es asnB. En otra modalidad, el gen es gltD. En otra modalidad, el gen es gltB. En otra modalidad, el gen es leuA. En otra modalidad, el gen es argG. En otra modalidad, el gen es thrC. En otra modalidad, la cepa de Listeria es deficiente en uno o más de los genes descritos anteriormente.
En otra modalidad, la cepa de Listeria es deficiente de un gen de sintasa. En otra modalidad, el gen es un gen para la síntesis de AA. En otra modalidad, el gen es folP. En otra modalidad, el gen es de una proteína de la familia de dihidrouridina sintasa. En otra modalidad, el gen es ispD. En otra modalidad, el gen es ispF. En otra modalidad, el gen es de la fosfoenolpiruvato sintasa. En otra modalidad, el gen es hisF. En otra modalidad, el gen es hisH. En otra modalidad, el gen es fliI. En otra modalidad, el gen es de la pseudouridina sintasa de la subunidad ribosomal grande. En otra modalidad, el gen es ispD. En otra modalidad, el gen es de la proteína bifuncional GMP sintasa/glutamina amidotransferasa. En otra modalidad, el gen es cobS. En otra modalidad, el gen es cobB. En otra modalidad, el gen es cbiD. En otra modalidad, el gen es de C-metiltransferasa de uroporfirina III/sintasa de uroporfirinógeno III. En otra modalidad, el gen es cobQ. En otra modalidad, el gen es uppS. En otra modalidad, el gen es truB. En otra modalidad, el gen es dxs. En otra modalidad, el gen es mvaS. En otra modalidad, el gen es dapA. En otra modalidad, el gen es ispG. En otra modalidad, el gen es folC. En otra modalidad, el gen es de la citrato sintasa. En otra modalidad, el gen es argJ. En otra modalidad, el gen es de la 3-desoxi-7-fosfoheptulonato sintasa. En otra modalidad, el gen es de la indol-3-glicerol-fosfato sintasa. En otra modalidad, el gen es un componente de antranilato sintasa/glutamina amidotransferasa. En otra modalidad, el gen es menB. En otra modalidad, el gen es de la isocorismato sintasa específica de menaquinona. En otra modalidad, el gen es de fosforibosilformilglicinamidina sintasa I o II. En otra modalidad, el gen es de fosforibosilaminoimidazol-succinocarboxamida sintasa. En otra modalidad, el gen es carB. En otra modalidad, el gen es carA. En otra modalidad, el gen es thyA. En otra modalidad, el gen es mgsA. En otra modalidad, el gen es aroB. En otra modalidad, el gen es hepB. En otra modalidad, el gen es rluB. En otra modalidad, el gen es ilvB. En otra modalidad, el gen es ilvN. En otra modalidad, el gen es alsS. En otra modalidad, el gen es fabF. En otra modalidad, el gen es fabH. En otra modalidad, el gen es de pseudouridina sintasa. En otra modalidad, el gen es pyrG. En otra modalidad, el gen es truA. En otra modalidad, el gen es pabB. En otra modalidad, el gen es un gen de la ATP sintasa (por ejemplo, atpC, atpD-2, aptG, atpA-2, etcétera).
En otra modalidad, el gen es phoP. En otra modalidad, el gen es aroA aroC. En otra modalidad, el gen es aroD. En otra modalidad, el gen es plcB.
En otra modalidad, la cepa de Listeria es deficiente de un transportador de péptidos. En otra modalidad, el gen es una proteína transportadora ABC/de unión al ATP/permeasa. En otra modalidad, el gen es una proteína transportadora ABC de oligopéptidos/de unión a oligopéptidos. En otra modalidad, el gen es una proteína transportadora ABC de oligopéptidos/permeasa. En otra modalidad, el gen es de una proteína transportadora ABC de zinc/de unión al zinc. En otra modalidad, el gen es de un transportador ABC de azúcar. En otra modalidad, el gen es de un transportador de fosfato. En otra modalidad, el gen es de un ZIP transportador de zinc. En otra modalidad, el gen es de un transportador de resistencia a fármacos de la familia EmrB/QacA. En otra modalidad, el gen es de un transportador de sulfato. En otra modalidad, el gen es de un transportador de oligopéptidos dependiente de protones. En otra modalidad, el gen es de un transportador de magnesio. En otra modalidad, el gen es de un transportador de formiato/nitrito. En otra modalidad, el gen es de un transportador ABC de espermidina/putrescina. En otra modalidad, el gen es de un cotransportador de Na/Pi. En otra modalidad, el gen es de un transportador de azúcar fosfato. En otra modalidad, el gen es de un transportador ABC de glutamina. En otra modalidad, el gen es de un transportador de la familia de facilitadores principales. En otra modalidad, el gen es de un transportador ABC de
glicina betaína/L-prolina. En otra modalidad, el gen es de un transportador ABC de molibdeno. En otra modalidad, el gen es de un transportador ABC de ácido tecoico. En otra modalidad, el gen es de un transportador ABC de cobalto. En otra modalidad, el gen es de un transportador de amonio. En otra modalidad, el gen es de un transportador ABC de aminoácidos. En otra modalidad, el gen es de un transportador ABC en la división celular. En otra modalidad, el gen es de un transportador ABC de manganeso. En otra modalidad, el gen es de un transportador ABC de compuestos de hierro. En otra modalidad, el gen es de un transportador ABC de maltosa/maltodextrina. En otra modalidad, el gen es de un transportador de resistencia a fármacos de la familia Bcr/CflA.
En otra modalidad, el gen es de una subunidad de una de las proteínas anteriores.
En otra modalidad, una cepa de Listeria recombinante de la presente invención se ha sometido a pases a través de un huésped animal. En otra modalidad, los pases maximizan la eficacia de la cepa como un vector vacunal. En otra modalidad, los pases estabilizan la inmunogenicidad de la cepa de Listeria. En otra modalidad, los pases estabilizan la virulencia de la cepa de Listeria. En otra modalidad, los pases aumentan la inmunogenicidad de la cepa de Listeria. En otra modalidad, los pases aumentan la virulencia de la cepa de Listeria. En otra modalidad, los pases eliminan subcepas inestables de la cepa de Listeria. En otra modalidad, los pases reducen la prevalencia de subcepas inestables de la cepa de Listeria. En otra modalidad, el proceso de pases atenúa la cepa, o en otra modalidad, hace a la cepa menos virulenta. Los métodos para los pases de una cepa de Listeria recombinante a través de un huésped animal se conocen bien en la técnica, y se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente de Estados Unidos núm. de serie 10/541,614.
Cada cepa de Listeria y el tipo de esta representa una modalidad separada de la presente invención.
En otra modalidad, la Listeria recombinante de los métodos y las composiciones de la presente invención se transforma establemente con una construcción que codifica un antígeno o una fusión LLO-antígeno. En una modalidad, la construcción contiene un polienlazador para facilitar otros subclonajes. Se conocen varias técnicas para producir Listeria recombinante.
En otra modalidad, la construcción o gen heterólogo se integra en el cromosoma de Listeria mediante recombinación homóloga. Las técnicas para la recombinación homóloga se conocen bien en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Frankel, FR, Hegde, S, Lieberman, J, y Y Paterson. Induction of a cell-mediated immune response to HIV gag using Listeria monocytogenes as a live vaccine vector. J. Immunol. 155: 4766 -4774. 1995; Mata, M, Yao, Z, Zubair, A, Syres, K y Y Paterson, Evaluation of a recombinant Listeria monocytogenes expressing an HIV protein that protects mice against viral challenge. Vaccine 19:1435-45, 2001; Boyer, JD, Robinson, TM, Maciag, PC, Peng, X, Johnson, RS, Pavlakis, G, Lewis, MG, Shen, A, Siliciano, R, Brown, CR, Weiner, D, y Y Paterson. DNA prime Listeria boost induces a cellular immune response to SIV antigens in the Rhesus Macaque model that is capable of limited suppression of SIV239 viral replication. Virology. 333: 88-101, 2005. En otra modalidad, la recombinación homóloga se lleva a cabo como se describe en la patente de Estados Unidos núm. 6,855,320. En otra modalidad, un plásmido sensible a la temperatura se usa para seleccionar los recombinantes.
En otra modalidad, la construcción o gen heterólogo se integra en el cromosoma de Listeria mediante inserción de transposones. Las técnicas para la inserción de transposones se conocen bien en la técnica, y se describen, entre otros, por Sun y otros (Infection and Immunity 1990, 58: 3770-3778) en la construcción de DP-L967. La mutagénesis por transposones tiene la ventaja, en otra modalidad, que puede formarse un mutante estable por inserción genómica. En otra modalidad, se conoce la posición en el genoma donde el gen extraño se ha insertado mediante mutagénesis por transposones.
En otra modalidad, la construcción o gen heterólogo se integra en el cromosoma de Listeria mediante el uso de sitios de integración de fagos (Lauer P, Chow MY y otros, Construction, characterization, and use of two LM site-specific phage integration vectors. J Bacteriol 2002;184(15): 4177-86). En otra modalidad, se usa un gen de integrasa y un sitio de unión de un bacteriófago (por ejemplo, listeriófago U153 o PSA) para insertar el gen heterólogo en el sitio de unión correspondiente, que puede ser cualquier sitio adecuado en el genoma (por ejemplo, comK o el extremo 3’ del gen del ARNt de Arg). En otra modalidad, los profagos endógenos se curan del sitio de unión utilizado antes de la integración del constructo o gen heterólogo. En otra modalidad, este método resulta en integrantes de una sola copia.
En otra modalidad, la cepa de Listeria porta la construcción en un plásmido. Los vectores de LM que expresan proteínas de fusión con antígenos se han construido por medio de esta técnica. Lm-GG/E7 se obtuvo mediante complementación de un mutante por deleción de prfA con un plásmido que contiene una copia del gen de prfA y una copia del gen de E7 fusionado a una forma del gen de LLO (hly) truncado para eliminar la actividad hemolítica de la enzima, como se describe en la presente. El organismo mantuvo una LLO funcional por medio de la copia cromosómica endógena de hly. En otra modalidad, el plásmido contiene un gen para la resistencia a antibióticos. En otra modalidad, el plásmido contiene un gen que codifica un factor de virulencia que está ausente en el genoma de la cepa de Listeria transformada. En otra modalidad, el factor de virulencia es prfA. En otra modalidad, el factor de virulencia es LLO. En otra modalidad, el factor de virulencia es ActA. En otra modalidad, el factor de virulencia es
cualquiera de los genes enumerados anteriormente como objetivos para la atenuación. En otra modalidad, el factor de virulencia es cualquier otro factor de virulencia conocido en la técnica.
En otra modalidad, un péptido recombinante de la presente invención se fusiona a una proteína de Listeria, tal como PI-PLC, o una construcción que codifica la misma. En otra modalidad, una secuencia señal de una proteína de Listeria secretada tal como hemolisina, ActA, o fosfolipasas se fusiona al gen que codifica al antígeno. En otra modalidad, se usa una secuencia señal del vector vacunal recombinante. En otra modalidad, se usa una secuencia señal funcional en el vector vacunal recombinante.
En otra modalidad, la construcción está contenida en la cepa de Listeria de una manera episomal. En otra modalidad, el antígeno extraño se expresa a partir de un vector albergado en la cepa de Listeria recombinante.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una cepa de Listeria recombinante de la presente invención para usar en un método para inducir una respuesta inmunitaria anti-HMW-MAA en un sujeto.
En otra modalidad, un sujeto es administrado con sus propias células alogénicas, que en una modalidad, provocan una respuesta inmunitaria contra un antígeno. En otra modalidad, las composiciones y los métodos de la presente invención dan como resultado la expresión de citocinas estimuladoras, que en una modalidad, son citocinas de Th1, que en una modalidad, es IFN-gamma. En una modalidad, la expresión de citocinas estimuladoras contribuye al efecto antitumoral de las composiciones y los métodos. En otra modalidad, las composiciones y los métodos de la presente invención dan como resultado la expresión de células T gamma delta.
En otra modalidad, la presente invención proporciona composiciones para inducir respuestas antitumorales no específicas. En una modalidad, la inmunización con un antígeno de melanoma, tal como un péptido de HMW-MAA, protege contra un tipo de melanoma que no expresa el antígeno (Ejemplo 4).
En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende una cepa de Listeria recombinante de la presente invención, para usar en un método para inducir una respuesta inmunitaria contra un tumor que expresa HMW-MAA. Como se proporciona en la presente, las vacunas de la presente invención inducen una respuesta inmunitaria con especificidad antigénica, como se muestra por múltiples líneas de evidencia -por ejemplo inhibición del crecimiento tumoral, tinción de tetrámeros, medición de las cantidades de células T CD8+ infiltrantes del tumor, FACS, y ensayo de liberación de cromio.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende una cepa de Listeria recombinante de la presente invención, para usar en un método para inducir una respuesta inmunitaria contra un pericito.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende una cepa de Listeria recombinante de la presente invención, para usar en un método para impedir un crecimiento y/o retrasar la progresión de un tumor sólido en un sujeto. En otra modalidad, el sujeto produce una respuesta inmunitaria contra un pericito del tumor sólido. En otra modalidad, el pericito está en una vasculatura del tumor sólido.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende una cepa de Listeria recombinante de la presente invención, para tratar un tumor sólido en un sujeto. En otra modalidad, el sujeto produce una respuesta inmunitaria contra un pericito del tumor sólido. En otra modalidad, el pericito está en una vasculatura del tumor sólido.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para lisar una o más células tumorales en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cepa de Listeria recombinante de la presente invención, para lisar así una o más células tumorales en un sujeto. En una modalidad, la lisis del tumor se debe a linfocitos T citotóxicos, linfocitos infiltrantes del tumor, o una combinación de estos, que en una modalidad son específicos del tumor.
En una modalidad, los métodos de la presente descripción se usan para tratar, impedir, suprimir, inhibir, o prevenir cualquiera de las enfermedades, trastornos, síntomas, o efectos secundarios descritos anteriormente asociados con alergia o asma. En una modalidad, el término “tratar” se refiere tanto a un tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o disminuir la afección patológica o los síntomas objetivo asociados con la enfermedad, trastorno o afección o una combinación de estos. Por lo tanto, “tratar” se refiere, entre otros, a retrasar la progresión, acelerar la remisión, inducir la remisión, aumentar la remisión, acelerar la recuperación, aumentar la eficacia de, o disminuir la resistencia a agentes terapéuticos alternativos, o una combinación de estos. En una modalidad, “prevenir” o “impedir” se refiere, entre otros, a retrasar la aparición de síntomas, prevenir la recaída de una enfermedad, disminuir la cantidad o frecuencia de los episodios de recaída, aumentar la latencia entre los episodios sintomáticos, o una combinación de estos. En una modalidad, “suprimir” o “inhibir”, se refiere, entre otros, a reducir la gravedad de los síntomas, reducir la gravedad de un episodio agudo, reducir la cantidad de síntomas, reducir la incidencia de los síntomas relacionados con la enfermedad, reducir la
latencia de los síntomas, mejorar los síntomas, reducir los síntomas secundarios, reducir las infecciones secundarias, prolongar la supervivencia del paciente, o una combinación de estos.
En una modalidad, los síntomas son primarios, mientras que en otra modalidad, los síntomas son secundarios. En una modalidad, “primario” se refiere a un síntoma que es un resultado directo de una enfermedad o trastorno particular, mientras que en una modalidad, “secundario” se refiere a un síntoma que se deriva o es consecuencia de una causa primaria. En una modalidad, los compuestos para usar en la presente invención tratan los síntomas primarios o secundarios o las complicaciones secundarias relacionados con alergia o asma. En otra modalidad, los “síntomas” pueden ser cualquier manifestación de una enfermedad o afección patológica.
Como se proporciona en la presente, las cepas de Listeria que expresan HMW-MAA inhibieron el crecimiento de tumores que no expresaban HMW-MAA. Estos hallazgos muestran que las respuestas inmunitarias anti-HMW-MAA inhiben y revierten la vascularización de tumores sólidos, y por lo tanto inhiben el crecimiento de estos. Las vacunas anti-HMW-MAA de la presente invención fueron capaces de ejercer estos efectos a pesar de la identidad incompleta (80 %) entre HMW-MAA y su homólogo de ratón, específicamente el proteoglicano sulfato de condroitina de ratón ("AN2"). En esta modalidad, las vacunas anti-HMW-MAA de la presente invención son eficaces para la vacunación contra cualquier tumor sólido, independientemente de su expresión de HMW-MAA.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende una cepa de Listeria recombinante de la presente invención, para usar en un método para impedir una vascularización de un tumor sólido en un sujeto. En otra modalidad, el sujeto produce una respuesta inmunitaria contra un pericito del tumor sólido. En otra modalidad, el pericito está en una vasculatura del tumor sólido
El tumor sólido que es el objetivo de las composiciones de la presente invención es, en otra modalidad, un melanoma. En otra modalidad, el tumor es un sarcoma. En otra modalidad, el tumor es un carcinoma. En otra modalidad, el tumor es un mesotelioma (por ejemplo mesotelioma maligno). En otra modalidad, el tumor es un glioma. En otra modalidad, el tumor es un tumor de células germinales. En otra modalidad, el tumor es un coriocarcinoma.
En otra modalidad, el tumor es cáncer pancreático. En otra modalidad, el tumor es cáncer de ovario. En otra modalidad, el tumor es cáncer gástrico. En otra modalidad, el tumor es una lesión carcinomatosa del páncreas. En otra modalidad, el tumor es adenocarcinoma pulmonar. En otra modalidad, el tumor es adenocarcinoma colorrectal. En otra modalidad, el tumor es adenocarcinoma escamoso pulmonar. En otra modalidad, el tumor es adenocarcinoma gástrico. En otra modalidad, el tumor es una neoplasia epitelial de la superficie del ovario (por ejemplo, una variedad benigna, proliferativa o maligna de esta). En otra modalidad, el tumor es un carcinoma de células escamosas orales. En otra modalidad, el tumor es carcinoma pulmonar no microcítico. En otra modalidad, el tumor es un carcinoma endometrial. En otra modalidad, el tumor es un cáncer de vejiga. En otra modalidad, el tumor es un cáncer de cabeza y cuello. En otra modalidad, el tumor es un carcinoma de próstata.
En otra modalidad, el tumor es un cáncer pulmonar no microcítico (NSCLC). En otra modalidad, el tumor es un tumor de Wilms. En otra modalidad, el tumor es un tumor desmoplástico de células redondas pequeñas. En otra modalidad, el tumor es un cáncer de colon. En otra modalidad, el tumor es un cáncer de pulmón. En otra modalidad, el tumor es un cáncer de ovario. En otra modalidad, el tumor es un cáncer uterino. En otra modalidad, el tumor es un cáncer de tiroides. En otra modalidad, el tumor es un carcinoma hepatocelular. En otra modalidad, el tumor es un cáncer de tiroides. En otra modalidad, el tumor es un cáncer de hígado. En otra modalidad, el tumor es un cáncer renal. En otra modalidad, el tumor es un tumor de Kaposi. En otra modalidad, el tumor es un sarcoma. En otra modalidad, el tumor es otro carcinoma o sarcoma.
En una modalidad, esta invención proporciona composiciones para prevenir el cáncer en poblaciones que están predispuestas al cáncer o en poblaciones que tienen alto riesgo de cáncer, que en una modalidad, puede ser una población de mujeres con mutaciones de brca1 o 2, dicha población en una modalidad es susceptible a cáncer de mama.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende una cepa de Listeria recombinante de la presente invención para usar en un método para inducir una respuesta inmunitaria contra un tumor que expresa HMW-MAA. Como se proporciona en la presente, las cepas de Listeria que expresan HMW-MAA indujeron respuestas inmunitarias anti-HMW-MAA e inhibieron el crecimiento de tumores que expresan HMW-MAA.
El tumor que expresa HMW-MAA que es el objetivo de las composiciones de la presente invención es, en otra modalidad, un carcinoma de células basales. En otra modalidad, el tumor que expresa HMW-MAA es un tumor derivado de la cresta neural. En otra modalidad, el tumor que expresa HMW-MAA es un astrocitoma. En otra modalidad, el tumor que expresa HMW-MAA es un glioma. En otra modalidad, el tumor que expresa HMW-MAA es un neuroblastoma. En otra modalidad, el tumor que expresa HMW-MAA es un sarcoma. En otra modalidad, el tumor que expresa HMW-MAA es una leucemia de la infancia. En otra modalidad, el tumor que expresa HMW-MAA es una
lesión de carcinoma lobular de mama. En otra modalidad, el tumor que expresa HMW-MAA es un melanoma. En otra modalidad, el tumor que expresa HMW-MAA es cualquier otro tumor que exprese HMW-MAA.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende una cepa de Listeria
5 recombinante de la presente invención para un método para inducir una respuesta inmunitaria contra un pericito. Como se proporciona en la presente, las cepas de Listeria que expresan HMW-MAA inhibieron el crecimiento de tumores sólidos, incluso aquellos que no expresaban HMW-MAA. Estos hallazgos demuestran la inhibición de la vascularización por medio de la inducción de respuestas inmunitarias contra pericitos asociados a la vasculatura del tumor.
10 En otra modalidad, la presente invención proporciona una cepa de Listeria recombinante de la presente invención para usar en un método para impedir un crecimiento y/o retrasar la progresión de un tumor que expresa HMW-MAA en un sujeto. En otra modalidad, el sujeto produce una respuesta inmunitaria contra el tumor que expresa HMW-MAA.
15 En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende una cepa de Listeria recombinante de la presente invención para usar en un método para el tratamiento de un tumor que expresa HMW-MAA en un sujeto. En otra modalidad, el sujeto produce una respuesta inmunitaria contra el tumor que expresa HMW-MAA.
20 La cepa de Listeria recombinante de la presente invención utilizada en los métodos de la presente invención comprende, en otra modalidad, un polipéptido recombinante de la presente invención. En otra modalidad, la cepa de Listeria recombinante comprende una molécula nucleotídica recombinante de la presente invención. En otra modalidad, la cepa de Listeria recombinante es cualquier cepa de Listeria recombinante descrita o mencionada
25 anteriormente.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un polipéptido recombinante de la presente invención para usar en un método para inducir una respuesta inmunitaria anti-HMW-MAA en un sujeto.
30 En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un polipéptido recombinante de la presente invención para usar en un método para inducir una respuesta inmunitaria contra un tumor que expresa HMW-MAA.
35 En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un polipéptido recombinante de la presente invención para usar en un método para inducir una respuesta inmunitaria contra un pericito.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un polipéptido recombinante de la presente invención para usar en un método para impedir un crecimiento y/o retrasar la progresión de un tumor 40 sólido en un sujeto. En otra modalidad, el sujeto produce una respuesta inmunitaria contra un pericito del tumor sólido. En otra modalidad, el pericito está en una vasculatura del tumor sólido.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un polipéptido recombinante de la presente invención para usar en un método para el tratamiento de un tumor sólido en un sujeto. En otra 45 modalidad, el sujeto produce una respuesta inmunitaria contra un pericito del tumor sólido. En otra modalidad, el pericito está en una vasculatura del tumor sólido.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un polipéptido recombinante de la presente invención para usar en un método para impedir una vascularización de un tumor sólido en un sujeto. 50 En otra modalidad, el sujeto produce una respuesta inmunitaria contra un pericito del sólido
En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido recombinante de la presente invención para usar en un método para impedir un crecimiento y/o retrasar la progresión de un tumor que expresa HMW-MAA en un sujeto. En otra modalidad, el sujeto produce una respuesta inmunitaria contra el tumor que expresa HMW-MAA.
55 En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un polipéptido recombinante de la presente invención para usar en un método para el tratamiento de un tumor que expresa HMW-MAA en un sujeto. En otra modalidad, el sujeto produce una respuesta inmunitaria contra el tumor que expresa HMW-MAA.
60 En otra modalidad se administra una vacuna que comprende una cepa de Listeria recombinante de la presente invención. En otra modalidad, se administra una composición inmunogénica que comprende una cepa de Listeria recombinante de la presente invención. En otra modalidad, se administra una vacuna que comprende un polipéptido recombinante de la presente invención. En otra modalidad, se administra una composición inmunogénica que comprende un polipéptido recombinante de la presente invención.
En otra modalidad, el pericito objetivo de las composiciones de la presente invención es un pericito activado. En otra modalidad, el pericito objetivo es cualquier otro tipo de pericito conocido en la técnica.
En otra modalidad, una composición inmunogénica de la presente invención induce una respuesta inmunitaria mediada por células. En otra modalidad, una composición inmunogénica induce una respuesta inmunitaria mediada por células predominantemente. En otra modalidad, la composición inmunogénica induce una respuesta inmunitaria de tipo Th1 predominantemente.
En otra modalidad, la respuesta inmunitaria inducida por los métodos de la presente invención es una respuesta inmunitaria mediada por células. En otra modalidad, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria mediada por células T.
La respuesta inmunitaria mediada por células T inducida por las composiciones de la presente invención comprende, en otra modalidad, un CTL. En otra modalidad, la célula T implicada en la respuesta inmunitaria mediada por células T es un CTL.
En otra modalidad, la respuesta inmunitaria mediada por células T comprende una célula cooperadora T. En otra modalidad, la célula T implicada en la respuesta inmunitaria mediada por células T es una célula cooperadora T.
En otra modalidad el sujeto se inmuniza con una composición inmunogénica, vector, o péptido recombinante de la presente invención. En otra modalidad, el sujeto se pone en contacto con la composición inmunogénica, vector, o péptido recombinante.
En otra modalidad, la presente descripción describe un método para inhibir la adhesión de una célula cancerosa a la matriz extracelular, que comprende inducir una respuesta inmunitaria anti-HMW-MAA mediante un método descrito en la presente que inhibe así la adhesión de una célula cancerosa a la matriz extracelular. En otra modalidad, la célula cancerosa es una célula de melanoma.
En otra modalidad, la presente descripción describe un método para inhibir la metástasis de un tumor, que comprende inducir una respuesta inmunitaria anti-HMW-MAA mediante un método descrito en la presente, que inhibe así la metástasis de un tumor. En otra modalidad, el tumor es un tumor de melanoma.
En otra modalidad, la presente descripción describe un método para inhibir la migración de una célula cancerosa, que comprende inducir una respuesta inmunitaria anti-HMW-MAA mediante un método descrito en la presente, para inhibir así la migración de una célula cancerosa. En otra modalidad, la célula cancerosa es una célula de melanoma.
En otra modalidad, la presente descripción describe un método para inhibir la proliferación de células en un tumor, que comprende inducir una respuesta inmunitaria anti-HMW-MAA mediante un método descrito en la presente, para inhibir así la proliferación de células en un tumor. En otra modalidad, el tumor es un tumor de melanoma.
En otra modalidad, la presente descripción describe un método para reducir la invasividad de un tumor, que comprende inducir una respuesta inmunitaria anti-HMW-MAA mediante un método descrito en la presente, para reducir así la invasividad de un tumor. En otra modalidad, el tumor es un tumor de melanoma. En otra modalidad, las respuestas inmunitarias anti-HMW-MAA inhiben la formación de complejos HMW-MAA-MT3-MMP (metaloproteinasas del tipo de membrana). En otra modalidad, la inhibición de la formación de estos complejos inhibe la degradación de colágeno tipo I por las células de melanoma.
En otra modalidad, la presente descripción describe un método para inhibir la conversión de plasminógeno en plasmina en la vecindad de un tumor, que comprende inducir una respuesta inmunitaria anti-HMW-MAA mediante un método descrito en la presente, para inhibir así la conversión de plasminógeno en plasmina en la vecindad de un tumor. En otra modalidad, el tumor es un tumor de melanoma. En otra modalidad, la inhibición de la liberación de plasmina inhibe, a su vez, la degradación de la matriz extracelular (ECM).
En otra modalidad, la presente descripción describe un método para inhibir el secuestro de angiostatina en la vecindad de un tumor, que comprende inducir una respuesta inmunitaria anti-HMW-MAA mediante un método descrito en la presente para inhibir así el secuestro de angiostatina en la vecindad de un tumor. En otra modalidad, el tumor es un tumor de melanoma.
En otra modalidad, un péptido de la presente invención es homólogo a un péptido mencionado en la presente. Los términos “homología”, “homólogo”, etcétera, cuando hacen referencia a cualquier proteína o péptido, se refieren, en una modalidad, a un porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos de un polipéptido nativo correspondiente, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso de ser necesario, para lograr el porcentaje máximo de homología, y sin considerar cualquier sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. Los métodos y programas informáticos para la alineación se conocen bien en la técnica.
La homología, en otra modalidad, se determina por un algoritmo informático para el alineamiento de secuencias, por métodos bien descritos en la técnica. Por ejemplo, el análisis de la homología de secuencias de ácidos nucleicos mediante algoritmos informáticos puede incluir la utilización de cualquier cantidad de paquetes de programas informáticos disponibles, tales como, por ejemplo, los paquetes BLAST, DOMAIN, BEAUTY (utilidad de alineación mejorada de BLAST), GENPEPT y TREMBL.
En otra modalidad, “homología” u “homólogo” se refiere a una identidad con una secuencia que no es de HMW-MAA seleccionada de las sec. con núm. de ident.: 1-14 mayor que 70 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una secuencia seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 1-14 mayor que 72 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 1-14 mayor que 75 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una secuencia seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 1-14 mayor que 78 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 1-14 mayor que 80 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 1-14 mayor que 82 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una secuencia seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 1-14 mayor que 83 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 1-14 mayor que 85 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 1-14 mayor que 87 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una secuencia seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 1-14 mayor que 88 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 1-14 mayor que 90 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 1-14 mayor que 92 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una secuencia seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 1-14 mayor que 93 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 1-14 mayor que 95 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una secuencia seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 1-14 mayor que 96 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 1-14 mayor que 97 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 1-14 mayor que 98 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 1-14 mayor que 99 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 1-14 de 100 %.
En otra modalidad, “homología” u “homólogo” se refiere a una identidad con una secuencia de HMW-MAA seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 15-16 mayor que 70 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una secuencia seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 15-16 mayor que 72 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 15-16 mayor que 75 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una secuencia seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 15-16 mayor que 78 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 15-16 mayor que 80 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 15-16 mayor que 82 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una secuencia seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 15-16 mayor que 83 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 15-16 mayor que 85 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 15-16 mayor que 87 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una secuencia seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 15-16 mayor que 88 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 15-16 mayor que 90 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 15-16 mayor que 92 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una secuencia seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 15-16 mayor que 93 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 15-16 mayor que 95 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una secuencia seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 15-16 mayor que 96 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 15-16 mayor que 97 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 15-16 mayor que 98 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 15-16 mayor que 99 %. En otra modalidad, “homología” se refiere a una identidad con una de las secs. con núms. de ident.: 15-16 de 100 %.
En otra modalidad, la homología se determina por medio de la determinación de la hibridación de las secuencias candidatas, cuyos métodos se describen bien en la técnica (Ver, por ejemplo, "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., e Higgins S. J., Eds. (1985); Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel y otros, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y). En otras modalidades, los métodos de hibridación se llevan a cabo en condiciones de moderadas a rigurosas, con el complemento de un ADN que codifica un péptido nativo de caspasa. Las condiciones de hibridación son, por ejemplo, incubación durante la noche a 42 ºC en una solución que comprende: formamida al 1020 %, SSC 5 X (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5 X, sulfato de dextrano al 10 %, y ADN de esperma de salmón desnaturalizado, fragmentado a 20 μg/ml.
La homología de proteínas y/o péptidos para cualquier secuencia de AA mencionada en la presente descripción se determina, en otra modalidad, por métodos bien descritos en la técnica, que incluyen análisis de
inmunotransferencia, o por medio de análisis basados en algoritmos informáticos de las secuencias de AA, mediante la utilización de cualquiera de una serie de paquetes de programas informáticos disponibles, a través de métodos establecidos. Algunos de estos paquetes incluyen los paquetes FASTA, BLAST, MPsrch o Scanps, y, en otra modalidad, emplean el uso de los algoritmos de Smith y Waterman, y/o alineaciones globales/locales o de bloques para el análisis.
En otra modalidad de la presente invención, los términos “ácidos nucleicos” o “nucleótido” se refieren a una cadena de al menos dos combinaciones de base-azúcar-fosfato. El término incluye, en una modalidad, ADN y ARN. El término “nucleótidos” se refiere, en una modalidad, a las unidades monoméricas de polímeros de ácidos nucleicos. En una modalidad, el ARN está en la forma de un ARNt (ARN de transferencia), ARNnp (ARN nuclear pequeño), ARNr (ARN ribosomal), ARNm (ARN mensajero), ARN antisentido, ARN inhibidor pequeño (ARNip), micro ARN (miARN) y ribozimas. Se ha descrito el uso de ARNip y miARN (Caudy AA y otros, Genes & Devel 16: 2491-96 y las referencias citadas allí). El ADN puede estar, en otras modalidades, en forma de ADN plasmídico, ADN viral, ADN lineal, o ADN cromosómico o derivados de estos grupos. Adicionalmente, estas formas de ADN y ARN pueden tener cadenas simples, dobles, triples, o cuádruples. El término incluye, además, en otra modalidad, ácidos nucleicos artificiales que contienen otros tipos de cadenas principales, pero las mismas bases. En una modalidad, el ácido nucleico artificial es un PNA (ácido nucleico peptídico). Los PNA contienen cadenas principales peptídicas y bases de nucleótidos y son capaces de unirse, en una modalidad, tanto a moléculas de ADN como de ARN. En otra modalidad, el nucleótido se modifica con un grupo oxetano. En otra modalidad, el nucleótido se modifica por sustitución de uno o más enlaces fosfodiéster con un enlace fosforotioato. En otra modalidad, el ácido nucleico artificial contiene cualquier otra variante de la cadena principal de fosfato de los ácidos nucleicos nativos conocidos en la técnica. El uso de ácidos nucleicos con fosfotiorato y PNA se conoce por los expertos en la técnica, y se describen en, por ejemplo, Neilsen PE, Curr Opin Struct Biol 9:353-57; y Raz NK y otros, Biochem Biophys Res Commun. 297:1075-84. La producción y el uso de ácidos nucleicos se conocen por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning, (2001), Sambrook y Russell, eds. y Methods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cells (2003) Purchio y G. C. Fareed.
Composiciones farmacéuticas y métodos de administración
Una “composición farmacéutica" se refiere, en otra modalidad, a una cantidad con eficacia terapéutica del ingrediente activo, es decir el péptido recombinante o el vector que comprende o que codifica el mismo, junto con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptables. Una "cantidad con eficacia terapéutica" se refiere, en otra modalidad, a esa cantidad que proporciona un efecto terapéutico para una afección determinada y al régimen de administración.
Las composiciones farmacéuticas que contienen el ingrediente activo, en otra modalidad, pueden administrarse a un sujeto mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica, tal como por vía parenteral, transmucosal, transdérmica, intramuscular, intravenosa, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intraventricular, intracraneal, intravaginal o intratumoral.
En otra modalidad de los métodos y las composiciones de la presente invención, las composiciones farmacéuticas se administran por vía oral, y por lo tanto se formulan en una forma adecuada para la administración oral, es decir como una preparación sólida o líquida. Las formulaciones orales sólidas adecuadas incluyen tabletas, cápsulas, píldoras, gránulos, comprimidos y similares. Las formulaciones orales líquidas adecuadas incluyen soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones, aceites y similares. En otra modalidad de la presente invención, el ingrediente activo se formula en una cápsula. De acuerdo con esta modalidad, las composiciones de la presente invención comprenden, en adición al compuesto activo y el portador o diluyente inertes, una cápsula de gelatina dura.
En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por inyección intravenosa, intraarterial, o intramuscular de una preparación líquida. Las formulaciones líquidas adecuadas incluyen soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones, aceites y similares. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intravenosa y por lo tanto se formulan en una forma adecuada para la administración intravenosa. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intraarterial y por lo tanto se formulan en una forma adecuada para la administración intraarterial. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intramuscular y por lo tanto se formulan en una forma adecuada para la administración intramuscular.
En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por vía tópica a las superficies corporales y por lo tanto se formulan en una forma adecuada para la administración tópica. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen geles, ungüentos, cremas, lociones, gotas y similares. Para la administración tópica, el péptido recombinante o vector se prepara y aplica como una solución, suspensión, o emulsión en un diluyente fisiológicamente aceptable con o sin un portador farmacéutico.
En otra modalidad, el ingrediente activo se suministra en una vesícula, por ejemplo un liposoma.
En otras modalidades, los portadores o diluyentes usados en los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, una goma, un almidón (por ejemplo, almidón de maíz, almidón pregelatinizado), un azúcar (por ejemplo, lactosa, manitol, sacarosa, dextrosa), un material celulósico (por ejemplo, celulosa microcristalina), un acrilato (por ejemplo, polimetilacrilato), carbonato de calcio, óxido de magnesio, talco, o mezclas de estos.
En otra modalidad, los portadores farmacéuticamente aceptables para las formulaciones líquidas son soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones, emulsiones o aceites. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, que incluyen solución salina y medios tamponados. Los ejemplos de aceites son los de origen animal, vegetal, o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soya, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de hígado de pescado, otro aceite marino, o un lípido de la leche o de huevos.
En otra modalidad, los vehículos parenterales (para la inyección subcutánea, intravenosa, intraarterial, o intramuscular) incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución láctica de Ringer y aceites fijos. Los vehículos para administración intravenosa incluyen reabastecedores de fluido y nutrientes, reabastecedores de electrolitos tales como los basados en dextrosa de Ringer, y similares. Los ejemplos son líquidos estériles tales como agua y aceites, con o sin la adición de un tensoactivo y otros adyuvantes farmacéuticamente aceptables. En general, agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones de azúcar relacionadas, y glicoles tales como propilenglicoles o polietilenglicol son portadores líquidos preferidos, particularmente para soluciones inyectables. Los ejemplos de aceites son los de origen animal, vegetal, o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soya, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de hígado de pescado, otro aceite marino, o un lípido de la leche o de huevos.
En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente son composiciones de liberación controlada, es decir composiciones en las cuales el ingrediente activo se libera durante un periodo de tiempo después de la administración. Las composiciones de liberación controlada o sostenida incluyen formulación en depósitos lipofílicos (por ejemplo ácidos grasos, ceras, aceites). En otra modalidad, la composición es una composición de liberación inmediata, es decir una composición en la que todo el ingrediente activo se libera inmediatamente después de la administración.
Sección de detalles experimentales
Ejemplo 1: Construcción de constructos de LLO-HMW-MAA y cepas de Listeria que expresan los mismos
Las construcciones de LLO-HMW-MAA se crearon de la siguiente manera: pGG-55, el precursor de las construcciones de LLO-HMW-MAA, se creó a partir de pAM401, un vector lanzadera capaz de replicarse en bacterias Gram-negativas y Gram-positivas (Wirth R y otros, J Bacteriol, 165: 831, 1986). pAM401 contiene un gen de resistencia al cloramfenicol para las Gram-positivas y un determinante de resistencia a la tetraciclina para Gram-negativas. En pGG-55, el promotor de hly conduce la expresión de los primeros 441 AA del producto génico hly, (que carece del extremo C terminal hemolítico, que tiene la secuencia que se expone en la sec. con núm. de ident.: 3), que se une por el sitio de Xho al gen de E7, lo que produce un gen de la fusión hly-E7 que se transcribe y secreta como LLO-E7.
Generación de pGG-55: Una fusión de un fragmento de listeriolisina con E7 ("LLO-E7") y el factor de transcripción pluripotencial prfA se clonaron en pAM401 de la siguiente manera: El fragmento de ADN que codifica los primeros 420 AA de LLO y su promotor y las secuencias reguladoras hacia el extremo 5' se amplificó por PCR con ADN genómico de LM usado como molde y se ligó a pUC19. Los cebadores de PCR usados fueron 5'- GGCCCGGGCCCCCTCCTTTGAT-3' (sec. con núm. de ident.: 17) y 5'-GGTCTAGATCATAATTTACTTCATCC-3' (sec. con núm. de ident.: 18). E7 se amplificó por PCR mediante el uso de los cebadores 5'- GGCTCGAGCATGGAGATACACC-3' (sec. con núm. de ident.: 19; el sitio de XhoI está subrayado) y 5'- GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA-3' (sec. con núm. de ident.: 20; el sitio de SpeI está subrayado) y se ligó en pCR2.1 (Invitrogen, San Diego, CA). E7 se escindió de pCR2.1 mediante digestión con XhoI/SpeI y posteriormente se ligó como una fusión de traducción en marco a pUC19-hly hacia el extremo 3' del fragmento del gen de hemolisina. La fusión se subclonó después en el multienlazador de pAM401. El gen de prfA se subclonó después en el sitio de SalI del plásmido resultante, produciendo pGG-55 (Figura 1).
pGG34A, B y C se crearon a partir de pGG-55 de la siguiente manera: Los fragmentos de HMW-MAA A, B, y C (que codifican los AA 360-554, 701-1130, y 2160-2258, respectivamente, Figura 1) tienen las siguientes secuencias:
HMW-MAA-A:
HMW-MAA-B:
HMW-MAA-C:
Los fragmentos se amplificaron mediante el uso de los siguientes cebadores. Los sitios de XhoI en los cebadores
15 directos y los sitios de XmaI (A y C) o sitio de SpeI (B) en los cebadores inversos están subrayados: Fragmento A: -cebador directo TCCTCGAGGTCAATGGCCAGAGGCGGGGG (sec. con núm. de ident.: 24). Inverso: CCCGGGTTACTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGTGGGGTGGGTCATTGAC (sec. con núm. de ident.: 25). Fragmento B: directo: GCCTCGAGTTCCGCGTCACTGGGGCCCTG (sec. con núm. de ident.: 26).
20 Inverso: ACTAGTTTACTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGGCCACACGGAGGTAGGGTTC (sec. con núm. de ident.: 27). Fragmento C: Directo: TGCTCGAGGCCACTGAGCCTTACAATGCTGCC (sec. con núm. de ident.: 28). Inverso: CCCGGGTTACTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTGGACGTCATGCTTGCCCG (sec. con núm. de ident.: 29).
25 Los fragmentos A-C se subclonaron después en pGG-55, mediante el uso del sitio de XhoI al final de la secuencia de hly y el sitio de XmaI o SpeI después del gen.
Una cepa de Listeria prfA negativa, XFL-7 (proporcionada por el Dr. Hao Shen, Universidad de Pensilvania), se transformó después con pGG34A, B y C para seleccionar respecto a la retención de los plásmidos in vivo.
Ejemplo 2: Las construcciones de LLO-HMW-MAA se expresan en Listeria 5 Materiales y métodos experimentales
Cultivo de bacterias y cosecha
10 Listeria monocytogenes (LM) recombinante que expresa los fragmentos de HMW-MAA A, B y C fusionados a LLO se cultivaron durante la noche en medio BHI suplementado con estreptomicina (250 ug/ml) y cloramfenicol (25 ug/ml). Para la inducción de LLO endógena, las bacterias se cultivaron en presencia de carbón al 0,2 %. Los sobrenadantes del cultivo se limpiaron mediante centrifugación a 14000 rpm durante 5 minutos, y 1,35 mililitros (ml) de sobrenadante se mezcló con 0,15 ml de TCA al 100 % para la precipitación de proteínas. Después de la incubación
15 en hielo durante 1 hora, la solución se centrifugó durante 10 minutos, 14000 rpm. El sedimento se resuspendió en 45 microlitros (mcL) de tampón de carga de gel de SDS-PAGE 1x, se añadieron 5 mcL de DTT 1 M, y la muestra se calentó a 75 °C durante 5 minutos. Se cargaron 5-10 mcL de proteína en cada pocillo y se corrió durante 50 minutos a 200V mediante el uso de tampón MOPS.
20 Después de transferir a membranas PVDF, las membranas se incubaron con un anticuerpo policlonal de conejo anti-PEST (1:3000), que reconoce la secuencia PEST en la proteína LLO, o con el anticuerpo monoclonal B3-19, que reconoce la LLO endógena solamente, después se incubó con anticuerpo anti-conejo conjugado con HRP. Las señales se detectaron con el sustrato quimioluminiscente SuperSignal® West Pico (Pierce, Rockford, IL).
25 Resultados
Para determinar si las construcciones de LLO-HMW-MAA pueden expresarse en Listeria, el sobrenadante se cosechó a partir de cepas de LM transformadas con los plásmidos A, B y C de LLO-HMW-MAA, y se analizaron para determinar la presencia de las proteínas de fusión. Las tres cepas produjeron proteínas de fusión de los tamaños
30 esperados cuando se analizaron con el anticuerpo anti-PEST (48 Kda para LLO, 75 Kda para HMW-MAA-A, 98 Kda para HMW-MAA-B, y 62 Kda para HMW-MAA-C; Figura 2A). El anticuerpo anti-LLO reveló una banda de 58 Kda para LLO en las tres cepas y los controles (Figura 2B).
Por lo tanto, las construcciones de LLO-HMW-MAA se expresan en Listeria.
35 Ejemplo 3: Cepas de Listeria que expresan construcciones de LLO-HMW-MAA infectan y crecen dentro de las células
Materiales y métodos experimentales 40
Ensayo de infección de células
Las células J774 similares a macrófagos murinas se infectaron a una MOI (multiplicidad de infección) de 1. Después de una incubación de 1 hora, se añadió gentamicina para destruir la Listeria extracelular, la Listeria intracelular se
45 recuperó cada 2 horas mediante lisis de las células J774 con agua y siembra de diluciones en serie del lisado en placas de BHI suplementado con estreptomicina (250 microgramos (mcg)/ml) y cloramfenicol (25 mcg/ml). Las colonias recuperadas se contaron y usaron para determinar la cantidad de Listeria dentro de las células J774.
Resultados
50 Para determinar las características del crecimiento y la virulencia de las cepas de Listeria que expresan las construcciones de LLO-HMW-MAA, se midió la tasa de crecimiento de las cepas de Listeria del Ejemplo anterior en medio BHI. Cada una de las cepas creció con cinéticas muy similares a la Listeria de tipo silvestre (1043 S) (Figura 3A). A continuación, las células J774 se incubaron con las cepas de Listeria, y se midió el crecimiento intracelular. El
55 crecimiento intracelular fue muy similar al tipo silvestre para cada cepa (Figura 3B).
Por lo tanto, las cepas de Listeria que expresan las construcciones de LLO-HMW-MAA mantienen su capacidad de crecer en medios, de infectar células, y de crecer intracelularmente.
60 Ejemplo 4: Vacunación con Lm que expresa HMW-MAA impide el crecimiento tumoral de B16F0-OVA
Materiales y métodos experimentales
Mediciones del crecimiento tumoral
Los tumores se midieron en días alternos con calibres que abarcan los diámetros superficiales más corto y más largo. La media de estas dos mediciones se representó como la media del diámetro del tumor en milímetros frente a varios puntos de tiempo. Los ratones se sacrificaron cuando el diámetro del tumor alcanzó 20 mm. Las mediciones de los tumores para cada punto de tiempo se muestran solo para los ratones supervivientes.
Resultados
Se inocularon 32 ratones C57BL/6 (n=8 por grupo) con 5 x 105B16F0-Ova. En los días 3, 10 y 17 los ratones se inmunizaron con una de las 3 construcciones, Lm-OVA (106 ufc), Lm-LLO-OVA (108 ufc; control positivo), y Lm-LLO-HMW-MAA-C (108 ufc). A pesar de la falta de expresión de HMW-MAA por las células tumorales, la vacunación con Lm-LLO-HMW-MAA-C impidió el crecimiento tumoral, significativamente, pero en menor medida que Lm-LLO-OVA (Figuras 4A-B). En un experimento adicional, se observaron resultados similares con las 3 cepas de Lm-LLO-HMW-MAA (2,5 x 107 ufc de cada una de A y C; 1 x 108 ufc de B; Figura 4C).
Un experimento similar se realizó con células RENCA. Se inocularon 40 ratones BALB/c (n=8 por grupo) con 2 x 105 células tumorales RENCA. En los días 3, 10, y 17, los ratones se inmunizaron con una de las cuatro construcciones, Lm-HMW-MAA-A, B, o C ((2,5 x 107 ufc de cada una de A y C; 1 x 108 ufc de B), o GGE7 (Lm-LLO-E7; 1,0 x 108 ufc), o se dejaron sin vacunar (virgen). Las tres cepas de Lm-LLO-HMW-MAA impidieron el crecimiento tumoral, y Lm-HMW-MAA-C ejerció el efecto más fuerte (Figuras 4D-4E).
Por lo tanto, la vacunación con Lm que expresa HMW-MAA impide el crecimiento de tumores, incluso en la ausencia de expresión de HMW-MAA por las células tumorales.
Ejemplo 5: Vacunación con Lm que expresa HMW-MAA impide el crecimiento tumoral de B16F10-HMW-MAA por medio de células CD4+ y CD8+
Materiales y métodos experimentales
Modificación genética de las líneas celulares tumorales murinas B16 y B16F10 para expresar HOW MAY
Las células B16F10 se transfectaron con el plásmido pcDNA3.1-HMW-MAA, que contiene el ADNc de HMW-MAA de longitud completa expresado bajo el control del promotor de CMV. Las células transfectadas establemente se seleccionaron por la resistencia al antibiótico G418, y posteriormente se cultivaron clones a partir de células individuales mediante dilución limitante. Los clones seleccionados se analizaron mediante citometría de flujo para la expresión de HMW-MAA mediante el uso del anticuerpo monoclonal específico para HMW-MAA VT80.12. Basado en los resultados de la citometría de flujo, se seleccionó el clon 7 de B16F10-HMW-MAA para experimentos futuros (Figura 5).
Agotamiento de CD4+ y CD8+
Se inocularon 32 ratones C57BL/6 con 2 x 105 B16F10-HMW-MAA/CMV7. En los días 3, 10 y 17 los ratones se inmunizaron con Lm-HMW-MAA-C (2,5x107 ufc), excepto el grupo virgen control. Para el agotamiento de CD4 y CD8, 500 µg de GK1.5 y 2.43 se administraron por vía i.p. en los días 1, 2, 6 y 9, así como el anticuerpo control G1. Para el agotamiento de CD25, se administraron 500 µg de CP61 por vía i.p. en los días 0 y 2.
Inmunización de ratones transgénicos para HLA A2/Kb con Lm-HMW-MAA-B o Lm-HMW-MAA-C
Los ratones transgénicos para HLA A2/Kb expresan una molécula clase I quimérica compuesta de los dominios α1 y α2 del alelo A*0201 humano y los dominios α3 de las moléculas clase I de H-2Kb de ratón. Los ratones transgénicos para hLA-A2/Kb se inmunizaron una vez con 1,0x108 ufc de Lm-HMW-MAA-B o 2,5x107 ufc de Lm-HMW-MAA-C. Nueve días más tarde, los esplenocitos se estimularon in vitro con péptido B1 (ILSNLSFPV; sec. con núm. de ident.: 43; corresponde a HMW-MAA769-777), péptido B2 (LLFGSIVAV; sec. con núm. de ident.: 44; corresponde a HMW-MAA1063-1071), o péptido C (LILPLLFYL; sec. con núm. de ident.: 45; corresponde a HMWMAA2238-2246) durante 5 horas en presencia de monensina. Las células se clasificaron como CD8+-CD62Lbajo y se midió la tinción intracelular para IFN-γ.
En un experimento separado, los ratones se inmunizaron dos veces (día 0 y día 7) con Lm-HMW-MAA-B o Lm-HMW-MAA-C y los esplenocitos se cosecharon en el día 14 para la estimulación in vitro con el fragmento B1 o C de Lm-HMW-MAA. Los niveles de IFN-γ se midieron mediante el uso de Elispot para IFN-γ.
Resultados
Los ratones C57BL/6 (n=8 por grupo) se inocularon con 2 x 105B16F10-HMW-MAA/CMV7. En los días 3, 10 y 17, los ratones se inmunizaron con una de tres construcciones, Lm-HMW-MAA-A (2,5x107 ufc), Lm-HMW-MAA-B (1x108 ufc), Lm-HMW-MAA-C (2,5x107 ufc). El grupo control se vacunó con Lm-GGE7 (1x108 ufc). Las tres construcciones de Lm-HMW-MAA ejercieron efectos antitumorales significativos (Figura 6).
Para determinar el papel de las células CD4+ y CD8+ en el efecto antitumoral de Lm-HMW-MAA, las células CD4+ o CD8+ se agotaron en ratones C57BL/6 que se habían inoculado con B16F10-HMW-MAA/CMV7B y se inmunizaron en los días 3, 10, y 17 con Lm-HMW-MAA-C (2,5x107 ufc). El agotamiento de CD4+ o CD8+ anuló la eficacia de la vacuna de LM-HMW-MAA-C (Figura 7).
Las células T CD8+ (2x106 células por ratón) se purificaron a partir de los bazos de ratones de cada grupo de tratamiento, se mezclaron con células tumorales B16F10-HMW-MAA (2x105 por ratón), y después se inyectaron por vía subcutánea en los ratones (8 por grupo). Los ratones se observaron durante 28 días y se examinaron cada 2 días para determinar el crecimiento tumoral. Las células T CD8+ de los ratones vacunados con Lm-HMW-MAA-C inhibieron el crecimiento de tumores B16F10 HMW-MAA in vivo (Figura 8).
Los ratones que se habían inoculado con 2 x 105 B16F10-HMW-MAA/CMV7 y vacunado con Lm-HMW-MAA-C como se describió anteriormente y permanecieron libres de tumor después de 7 semanas se volvieron a retar con 2x105 células B16F10-HMW-MAA 7 semanas después de la primera inyección del tumor. Los ratones vacunados estuvieron protegidos contra un segundo reto con células tumorales B16F10-HMW-MAA/CMV7 (Figura 9).
La inmunización de ratones transgénicos para HLA-A2/Kb con Lm-HMW-MAA-B y Lm-HMW-MAA-C induce respuestas inmunitarias detectables contra dos epítopos caracterizados de HMW-MAA HLA-A2 en los fragmentos B y C ambos después de una (Figura 10A) o dos inmunizaciones (Figura 10B).
Los ratones C57Bl/6 HLA-A2/Kb y de tipo silvestre se inmunizaron una vez con Lm-HMW-MAA-B o Lm-HMW-MAA-C, y la secreción de IFN-γ por células T estimuladas con un péptido restringido a HLA-A2 a partir del fragmento C se midió con Elispot para IFN-γ. La secreción de IFN-γ se incrementó en ratones transgénicos para HLA-A2/Kb inmunizados con Lm-HMW-MAA-C, estimulados con Péptido C en comparación con los ratones transgénicos no estimulados, en comparación con ratones no transgénicos estimulados con Péptido C y en comparación con ratones control y transgénicos no inmunizados (Figuras 11A y 11B).
Por lo tanto, las construcciones de Lm-HMW-MAA inducen respuestas inmunitarias con especificidad antigénica que impiden el crecimiento tumoral. Además, las construcciones de Lm-HMW-MAA muestran actividad antitumoral incluso contra tumores que no expresan HMW-MAA.
Ejemplo 6: La fusión de E7 a LLO o ActA mejora la inmunidad específica para E7 y genera células CD8+ infiltrantes de tumores específicas para E7
Materiales y métodos experimentales
Construcción de Lm-actA-E7
Lm-actA-E7 se generó mediante la introducción de un vector plasmídico pDD-1, construido por modificación de pDP2028, en Listeria. pDD-1 comprende un casete de expresión que expresa una copia del promotor de hly de 310 pb y la secuencia señal (ss) de hly, que conduce la expresión y secreción de ActA-E7; 1170 pb del gen de actA que comprende 4 secuencias PEST (sec. con núm. de ident.: 5) (el polipéptido de ActA truncado consiste en los primeros 390 AA de la molécula, sec. con núm. de ident.: 4); el gen de E7 de HPV de 300 pb; el gen de prfA de 1019 pb (controla la expresión de los genes de virulencia); y el gen de CAT (gen de resistencia al cloranfenicol) para la selección de los clones de bacterias transformadas.
pDD-1 se creó a partir de pDP2028 (que codifica ΔLLO-NP), que a su vez se creó a partir de pDP1659 de la siguiente manera: Construcción de pDP1659: El fragmento de ADN que codifica los primeros 420 AA de LLO y su promotor y las secuencias reguladoras hacia el extremo 5' se amplificó por PCR con ADN genómico de LM usado como molde y se ligó a pUC19. Los cebadores de PCR usados fueron 5'-GGCCCGGGCCCCCTCCTTTGAT-3' (sec. con núm. de ident.: 30) y 5'-GGTCTAGATCATAATTTACTTCATCC-3' (sec. con núm. de ident.: 31). El fragmento de ADN que codifica NP se amplificó de manera similar por PCR a partir del plásmido linealizado pAPR501 (obtenido del Dr. Peter Palese, Mt. Sinai Medical School, Nueva York) y posteriormente se ligó como una fusión de traducción en marco a pUC19 hacia el extremo 3' del fragmento del gen de hemolisina. Los cebadores de PCR usados fueron 5'-GGTCTAGAGAATTCCAGCAAAAGCAG-3' (sec. con núm. de ident.: 32) y 5'-GGGTCGACAAGGGTATTTTTCTTTAAT-3' (sec. con núm. de ident.: 33). La fusión se subclonó después en los sitios de EcoRV y SalI de pAM401. El plásmido pDP2028 se construyó mediante subclonaje del gen de prfA en el sitio de SalI de pDP1659.
pDD-1 se creó a partir de pDP-2028 (Lm-LLO-NP) de la siguiente manera: El promotor de hly (pHly) y el fragmento génico (441 AA) se amplificaron por PCR a partir de pGG55 mediante el uso del cebador 5'-GGGGTCTAGACCTCCTTTGATTAGTATATTC-3' (el sitio de XbaI está subrayado; sec. con núm. de ident.: 34) y el cebador 5'-ATCTTCGCTATCTGTCGCCGCGGCGCGTGCTTCAGTTTGTTGCGC-'3 (el sitio de Not I está subrayado. Los primeros 18 nucleótidos son la superposición del gen ActA; sec. con núm. de ident.: 35). El gen de actA se amplificó por PCR a partir del genoma de tipo silvestre de LM 10403s mediante el uso del cebador 5'
GCGCAACAAACTGAAGCAGCGGCCGCGGCGACAGATAGCGAAGAT-3' (el sitio de NotI está subrayado; sec. con núm. de ident.: 36) y el cebador 5'-TGTAGGTGTATCTCCATGCTCGAGAGCTAGGCGATCAATTTC-3' (el sitio de XhoI está subrayado; sec. con núm. de ident.: 37). El gen E7 se amplificó por PCR a partir de pGG55 mediante el uso del cebador 5'-GGAATTGATCGCCTAGCTCTCGAGCATGGAGATACACCTACA-3' (el sitio de XhoI está subrayado; sec. con núm. de ident.: 38) y el cebador 5'-AAACGGATTTATTTAGATCCCGGGTTATGGTTTCTGAGAACA-3' (el sitio de XmaI está subrayado; sec. con núm. de ident.: 39). El gen prfA se amplificó por PCR a partir del genoma de tipo silvestre de LM 10403s mediante el uso del cebador 5'-TGTTCTCAGAAACCATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3' (el sitio de XmaI está subrayado; sec. con núm. de ident.: 40) y el cebador 5'-GGGGGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3' (el sitio de SalI está subrayado; sec. con núm. de ident.: 41). La fusión del promotor de hly-gen actA (pHly-actA) se generó por PCR y se amplificó a partir del ADN purificado de pHly y actA mediante el uso del cebador de pHly hacia el extremo 5' (sec. con núm. de ident.: 34) y el cebador de actA hacia el extremo 3' (sec. con núm. de ident.: 37).
El gen E7 fusionado al gen prfA (E7-prfA) se generó por PCR y se amplificó a partir del ADN purificado de E7 y prfA mediante el uso del cebador de E7 hacia el extremo 5' (sec. con núm. de ident.: 38) y el cebador del gen prfA hacia el extremo 3' (sec. con núm. de ident.: 41).
El producto de fusión pHly-actA fusionado con el producto de fusión E7-prfA se generó por PCR y se amplificó a partir de los productos de ADN pHly-actA y E7-prfA fusionados y purificados mediante el uso del cebador de pHly hacia el extremo 5' (sec. con núm. de ident.: 34) y el cebador del gen prfA hacia el extremo 3' (sec. con núm. de ident.: 41) y se ligó a pCRII (Invitrogen, La Jolla, Calif.). Se transformaron células competentes de E. coli (TOP10'F, Invitrogen, La Jolla, Calif.) con pCRII-ActAE7. Después de la lisis y el aislamiento, el plásmido se seleccionó mediante análisis de restricción con el uso de BamHI (tamaños esperados de los fragmentos 770 y 6400 pb) y BstXI (tamaños esperados de los fragmentos 2800 y 3900 pb) y además se seleccionó por PCR mediante el uso del cebador de pHly hacia el extremo 5´ y el cebador del gen prfA hacia el extremo 3´.
El inserto de ADN pHly-ActA-E7-PrfA se escindió de pCRII mediante digestión con XbaI/SalI y se ligó a pDP-2028 digerido con Xba I/Sal I. Después de transformar E. coli competente TOP 10'F (Invitrogen, La Jolla, Calif.) con el sistema de expresión pHly-ActA-E7, los clones resistentes al cloramfenicol se tamizaron mediante análisis de PCR con el uso del cebador de pHly hacia el extremo 5' y el cebador del gen de prfA hacia el extremo 3' descritos anteriormente. Un clon que contiene pHly-ActA-E7 se amplificó, y se aisló el ADN midiprep (Promega, Madison, Wis). XFL-7 se transformó con pHly-ActA-E7, y los clones se seleccionaron respecto a la retención del plásmido in vivo. Los clones se cultivaron en medio de infusión de corazón y cerebro (Difco, Detroit, Mich) con cloramfenicol 20 mcg (microgramo)/ml (mililitro) a 37 °C. Las bacterias se congelaron en alícuotas a -80 °C.
Experimentos in vivo
500 mcl de MATRIGEL®, que contenía 100 mcl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 2 x 105 células tumorales TC-1 más 400 mcl de MATRIGEL® (BD Biosciences, Franklin Lakes, N.J.) se implantaron por vía subcutánea en el flanco izquierdo de 12 ratones C57BL/6 (n=3). Los ratones se inmunizaron por vía intraperitoneal en los días 7, 14 y 21, y los bazos y tumores se cosecharon en el día 28. El Matrigel de los tumores se retiró de los ratones y se incubó a 4 °C durante la noche en tubos que contenían 2 ml de medio RP 10 en hielo. Los tumores Los tumores se trituraron con fórceps, se cortaron en bloques de 2 mm, y se incubaron a 37 °C durante 1 hora con 3 ml de una mezcla enzimática (colagenasa-P 0,2 mg/ml, ADNasa-1, a 1 mg/ml en PBS). La suspensión tisular se filtró a través de malla de nylon y se lavó con suero bovino fetal al 5 % + NaN3 al 0,05 % en PBS para la tinción de tetrámeros e IFN-gamma.
Los esplenocitos y las células tumorales se incubaron con péptido de E7 1 micromol (mcm) durante 5 horas en presencia de Brefeldina A a 107 células/ml. Las células se lavaron dos veces y se incubaron en 50 mcL de sobrenadante anti-receptor de Fc de ratón (2.4 G2) durante 1 hora o durante la noche a 4 °C. Las células se tiñeron para las moléculas de la superficie CD8 y CD62L, se permeabilizaron, se fijaron mediante el uso del kit de permeabilización Golgi-stop® o Golgi-Plug® (Pharmingen, San Diego, Calif.), y se tiñeron para IFN-gamma. Se adquirieron 500,000 eventos con el uso del citómetro de flujo de dos láser FACSCalibur y se analizaron mediante el uso del programa informático Cellquest (Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.). Se calcularon los porcentajes de células secretoras de IFN-gamma dentro de las células T (CD62Lbajo) CD8+ activadas.
Para la tinción de tetrámeros, el tetrámero H-2Db se cargó con un péptido de E7 conjugado con ficoeritrina (PE) (RAHYNIVTF, sec. con núm. de ident.: 42), se tiñó a TA durante 1 hora, y se tiñó con MEL-14 conjugado con antialoficocianina (APC) (CD62L) y CD8 β conjugado con FITC a 4 °C durante 30 min. Las células se analizaron mediante la comparación de las células tetrámero+CD8+ CD62Lbajo en el bazo y en el tumor.
Resultados
Para analizar la capacidad de las fusiones de LLO y ActA para mejorar la inmunidad específica para un antígeno, los ratones se implantaron con células tumorales TC-1 y se inmunizaron con Lm-LLO-E7 (1 x 107 UFC), Lm-E7 (1 x 106 UFC), o Lm-ActA-E7 (2 x 108 UFC), o se dejaron sin tratamiento (virgen). Los tumores de los ratones de los grupos
de Lm-LLO-E7 y Lm-ActA-E7 contenían un mayor porcentaje de células T CD8+ secretoras de IFN-gamma (Figura 12) y células CD8+ específicas de tetrámeros (Figura 13) que en los ratones administrados con Lm-E7 o vírgenes.
Por lo tanto, Lm-LLO-E7 y Lm-ActA-E7 son eficaces en la inducción de células T CD8+ infiltrantes del tumor y en la regresión del tumor. En consecuencia, las fusiones de LLO y ActA son eficaces en los métodos y las composiciones de la presente invención.
Ejemplo 7: La fusión a una secuencia similar a PEST aumenta la inmunidad específica a E7
Materiales y métodos experimentales
Construcciones
Lm-PEST-E7, una cepa de Listeria idéntica a Lm-LLO-E7, excepto porque contiene solo el promotor y los primeros 50 AA de LLO, se construyó de la siguiente manera:
El promotor de hly y las regiones PEST se fusionaron con el gen E7 de longitud completa mediante corte y empalme por PCR de extensión del solapamiento (SOE). El gen de E7 y el fragmento de hly-PEST del gen se amplificaron a partir del plásmido pGG-55, que contenía los primeros 441 aminoácidos de LLO, y se realizó el corte y empalme entre sí mediante técnicas de PCR convencionales. pVS16.5, el fragmento hly-PEST-E7 y el factor de transcripción de LM prfA se clonaron en el plásmido pAM401. El plásmido resultante se usó para transformar a XFL
7.
Lm-E7epi es una cepa recombinante que secreta E7 sin la región PEST o un fragmento de LLO. El plásmido usado para transformar esta cepa contiene un fragmento génico del promotor de hly y la secuencia señal fusionados al gen de E7. Este constructo difiere del Lm-E7 original, que expresa una sola copia del gen E7 integrado en el cromosoma. Lm-E7epi es totalmente isogénica para Lm-LLO-E7 y Lm-PEST-E7 excepto por la forma del antígeno E7 expresado.
Las cepas recombinantes se cultivaron en medio de infusión de corazón y cerebro (BHI) con cloramfenicol (20 mcg/ml). Las bacterias se congelaron en alícuotas a -80 °C.
Resultados
Para analizar el efecto sobre la antigenicidad de la fusión a una secuencia similar a PEST, la secuencia similar a PEST de LLO se fusionó a E7. Se realizaron estudios de regresión tumoral, como se describe para el Ejemplo 1, en paralelo con la cepa de Listeria que expresa LLO-E7 y E7 solos. Lm-LLO-E7 y Lm-PEST-E7 provocaron la regresión de 5/8 y 3/8 tumores establecidos, respectivamente (Figura 14). Por el contrario, Lm-E7epi solo provocó regresión tumoral en 1/8 ratones. Una diferencia estadísticamente significativa en los tamaños tumorales se observó entre los tumores tratados con construcciones que contienen PEST (Lm-LLO-E7 o Lm-PEST-E7) y los tratados con Lm-E7epi (prueba t de Student).
Para comparar los niveles de linfocitos específicos para E7 generados por las vacunas en el bazo, los bazos se extrajeron en el día 21 y se tiñeron con anticuerpos para CD62L, CD8, y el tetrámero E7/Db. Lm-E7epi indujo niveles bajos de células T CD8+ activadas positivas para tetrámero E7 en el bazo, mientras que Lm-PEST-E7 y Lm-LLO-E7 indujeron 5 y 15 veces más células, respectivamente (Figura 15A), un resultado que fue reproducible en 3 experimentos separados. Por lo tanto, la fusión a las secuencias similares a PEST incrementó la inducción de esplenocitos positivos para tetrámeros. La media y SE de los datos obtenidos a partir de los 3 experimentos (Figura 15B) demuestran el aumento significativo en células CD8+ positivas para tetrámeros por Lm-LLO-E7 y Lm-PEST-E7 sobre Lm-E7epi (P < 0,05 mediante prueba t de Student). Similarmente, la cantidad de células T CD8+ con especificidad antigénica, infiltrantes del tumor, fue mayor en los ratones vacunados con Lm-LLO-E7 y Lm-PEST-E7, de manera reproducible en 3 experimentos (Figura 16A-B). Los valores promedio de TIL CD8+ positivos para tetrámeros fueron significativamente mayores para Lm-LLO-E7 que para Lm-E7epi (P < 0,05; prueba t de Student).
Por lo tanto, las secuencias similares a PEST confieren aumento de la inmunogenicidad a los antígenos.
Ejemplo 8: El aumento de la inmunogenicidad por fusión de un antígeno a LLO no requiere un vector de Listeria
Materiales y métodos experimentales
Construcción de Vac-SigE7Lamp
La cepa WR de vaccinia se usó como el recipiente, y el gen de fusión se escindió del plásmido de Listeria y se insertó en pSC11 bajo el control del promotor de p75. Se escogió este vector porque es el vector de transferencia usado para las construcciones de vaccinia Vac-SigE7Lamp y Vac-E7 y por lo tanto permite la comparación directa con Vac-LLO-E7. De esta manera los 3 recombinantes de vaccinia se expresaron bajo el control del mismo promotor de compuesto temprano/tardío p7.5. Además, SC11 permite la selección de las placas virales recombinantes para la
selección por TK y tamizaje de beta-galactosidasa. La Figura 17 representa las diversas construcciones de vaccinia usadas en estos experimentos. Vac-SigE7Lamp es un virus de vaccinia recombinante que expresó la proteína E7 fusionada entre la secuencia señal de la proteína de membrana asociada al lisosoma (LAMP-1) y la secuencia de la cola citoplásmica de LAMP-1.
5 Se produjeron las siguientes modificaciones para permitir la expresión del producto génico por vaccinia: (a) la secuencia TEXT que evita la transcripción temprana por vaccinia se eliminó de la porción 5’ de la secuencia de LLO-E7 mediante PCR; y (b) un sitio de restricción Xmal adicional se introdujo mediante PCR para permitir la inserción final de LLO-E7 en SC11. La introducción con éxito de estos cambios (sin pérdida de la secuencia original que
10 codifica LLO-E7) se verificó mediante secuenciación. La construcción pSC11-E7 resultante se usó para transfectar la línea celular TK-vas CV1 que se había infectado con la cepa de vaccinia de tipo silvestre, WR. Los lisados celulares obtenidos a partir de esta etapa de co-infección/transfección contienen recombinantes de vaccinia que se purificaron de las placas 3 veces. La expresión del producto de la fusión LLO-E7 por vaccinia que se purificó de las placas se verificó mediante transferencia Western con el uso de un anticuerpo dirigido contra la secuencia de la proteína LLO.
15 La capacidad de Vac-LLO-E7 para producir células T CD8+ específicas para LLO y E7 se determinó mediante el uso de los epítopos de LLO (91-99) y E7 (49-57) de ratones Balb/c y C57/BL6, respectivamente. Los resultados se confirmaron en un ensayo de liberación de cromio.
Resultados
20 Para determinar si el aumento de la inmunogenicidad por la fusión de un antígeno a LLO requiere un vector de Listeria, se construyó un vector de vaccinia que expresa E7 como una proteína de fusión con una forma truncada no hemolítica de LLO. Los estudios de rechazo de tumores se realizaron con TC-1 como se describió en Ejemplos anteriores, pero con inicio del tratamiento cuando los tumores tuvieron 3 mm de diámetro (Figura 18). Hacia el día
25 76, el 50 % de los ratones tratados con Vac-LLO-E7 estaban libres de tumor, mientras que solo el 25 % de los ratones Vac-SigE7Lamp estaban libres de tumor. En otros experimentos, se demostró que las fusiones LLOantígeno son más inmunogénicas que el péptido E7 mezclado con SBAS2 u oligonucleótidos CpG no metilados en una comparación lado a lado.
30 Estos resultados muestran que (a) las fusiones LLO-antígeno son inmunogénicas no solo en el contexto de Listeria, sino además en otros contextos; y (b) la inmunogenicidad de las fusiones LLO-antígeno se compara favorablemente con otros enfoques de vacunas conocidos por su eficacia.
Listado de secuencias 35
<110> THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA; FERRONE, Soldano
<120> COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN HMW-MAA Y FRAGMENTOS DE ESTE, PARA EL TRATAMIENTO
DEL CÁNCER 40
<130> P-8986-EP1
<150> EP 07872167.7
<151> 2007-08-15 45
<150> PCT/US2007/018091
<151> 2007-08-15
<150> US 60/837,608 50 <151> 2006-08-15
<160> 45
<170> PatentIn versión 3.4 55
<210> 1
<211> 529
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes 60
<400> 1
<210> 2
<211> 441
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 2
<210> 3
<211> 416
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 3
<210> 4
<211> 390
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 4
<210> 5
<211> 1170
<212> ADN
<213> Listeria monocytogenes
<400> 5
<210> 6
<211> 32
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 6
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes 15
<400> 7
<210> 8 20 <211> 14
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 8
<210> 9
<211> 28
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<210> 10
<211> 20
<212> PRT 15 <213> Listeria monocytogenes
<400> 10
20 <210> 11
<211> 33
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
25 <400> 11
30 <210> 12
<211> 19
<212> PRT
<213> Listeria seeligeri
35 <400> 12
<210> 13
<211> 17 40 <212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 13
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> Streptococcus equisimilis
<400> 14
10 <210> 15
<211> 2322
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 16
<211> 7011
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 16
5
<210> 17 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador
10
<400> 17 ggcccgggcc ccctcctttg at 22
15
<210> 18 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador
20
<400> 18 ggtctagatc ataatttact tcatcc 26
25
<210> 19 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador
30
<400> 19 ggctcgagca tggagataca cc 22
35
<210> 20 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador
40
<400> 20 ggggactagt ttatggtttc tgagaaca 28
45
<210> 21 <211> 585 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 21
5 <210> 22
<211> 1290
<212> ADN
<213> Homo sapiens
10 <400> 22
<210> 23
<211> 294
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 23
10
<210> 24 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial
15
<220> <223> Cebador
<400> 24 tcctcgaggt caatggccag aggcggggg
29
20
<210> 25 <211> 54 <212> ADN <213> Artificial
25
<220> <223> Cebador
30 35
<400> 25 cccgggttac tacttatcgt cgtcatcctt gtaatcgtgg ggtgggtcat tgac <210> 26 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador 54
40
<400> 26 gcctcgagtt ccgcgtcact ggggccctg 29
45
<210> 27 <211> 54 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Cebador
50
<400> 27 actagtttac tacttatcgt cgtcatcctt gtaatcggcc acacggaggt aggg 54
55
<210> 28 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Cebador
<400> 28 tgctcgaggc cactgagcct tacaatgctg cc
32
5
<210> 29 <211> 55 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Cebador
15
<400> 29 cccgggttac tacttatcgt cgtcatcctt gtaatcctgg acgtcatgct tgccc <210> 30 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial 55
<220> <223> Cebador
25
<400> 30 ggcccgggcc ccctcctttg at 22
<210> 31 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Cebador
35
<400> 31 ggtctagatc ataatttact tcatcc 26
<210> 32 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial
45
<220> <223> Cebador <400> 32 ggtctagaga attccagcaa aagcag 26
<210> 33 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial
55
<220> <223> Cebador
<400> 33 gggtcgacaa gggtattttt ctttaat
27
<210> 34 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial
65
<220> <223> Cebador
<400> 34 ggggtctaga cctcctttga ttagtatatt c
31
5
<210> 35 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Cebador
15
<400> 35 atcttcgcta tctgtcgccg cggcgcgtgc ttcagtttgt tgcgc <210> 36 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial 45
<220> <223> Cebador
25
<400> 36 gcgcaacaaa ctgaagcagc ggccgcggcg acagatagcg aagat 45
<210> 37 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Cebador
35
<400> 37 tgtaggtgta tctccatgct cgagagctag gcgatcaatt tc 42
<210> 38 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial
45
<220> <223> Cebador <400> 38 ggaattgatc gcctagctct cgagcatgga gatacaccta ca 42
<210> 39 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial
55
<220> <223> Cebador
<400> 39 aaacggattt atttagatcc cgggttatgg tttctgagaa ca
42
<210> 40 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial
65
<220> <223> Cebador
<400> 40 tgttctcaga aaccataacc cgggatctaa ataaatccgt tt
42
5
<210> 41 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial
10
<220> <223> Cebador
15 20
<400> 41 gggggtcgac cagctcttct tggtgaag 28 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptido E7 conjugado con ficoeritrina (PE)
25
<400> 42
<210> 43
<211> 9 30 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
<210> 44
<211> 9
<212> PRT 40 <213> Homo sapiens
<400> 44
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens 50
<400> 45

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Uso de un polipéptido recombinante que comprende (i) un fragmento de una proteína del Antígeno Asociado a Melanoma de Alto Peso Molecular (HMW-MAA) codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 21, 22, o 23, y (ii) una secuencia PEST de Listeria, o una Listeria recombinante que comprende dicho polipéptido recombinante, para la preparación de una composición para inducir una respuesta inmunitaria contra un cáncer o tumor que no expresa HMW-MAA o para retrasar la progresión de un cáncer o tumor que no expresa HMW-MAA.
  2. 2.
    El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el cáncer o tumor es un cáncer o tumor renal o de la piel.
  3. 3.
    Uso de un polipéptido recombinante que comprende (i) un fragmento de una proteína del Antígeno Asociado a Melanoma de Alto Peso Molecular (HMW-MAA) codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 21, 22, o 23, y (ii) una secuencia PEST de Listeria, o una Listeria recombinante que comprende dicho polipéptido recombinante, para la preparación de una composición para inducir una respuesta inmunitaria contra un cáncer o tumor renal o de la piel o para retrasar la progresión de un cáncer o tumor renal o de la piel.
  4. 4.
    El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el cáncer o tumor renal o de la piel no expresan HMW-MAA.
  5. 5.
    El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en donde el cáncer o tumor es un cáncer o tumor sólido, y la composición induce una respuesta inmunitaria contra un pericito de la vasculatura de dicho cáncer o tumor.
  6. 6.
    El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el cáncer o tumor de la piel es un melanoma.
  7. 7.
    El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la secuencia PEST está comprendida en un oligopéptido de Listeriolisina (LLO) o un fragmento de esta, o en un oligopéptido de ActA o un fragmento de esta.
  8. 8.
    El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde HMW-MAA es una proteína HMW-MAA humana.
  9. 9.
    Una composición que comprende un polipéptido recombinante que comprende (i) un fragmento de una proteína del Antígeno Asociado a Melanoma de Alto Peso Molecular (HMW-MAA) codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 21, 22, o 23, y (ii) una secuencia PEST de Listeria, o una Listeria recombinante que comprende dicho polipéptido recombinante, para usar en la inducción de una respuesta inmunitaria contra un cáncer o tumor que no expresa HMW-MAA o para usar en el retraso de la progresión de un cáncer o tumor que no expresa HMW-MAA.
  10. 10.
    La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el cáncer o tumor es un cáncer o tumor renal o de la piel.
  11. 11.
    Una composición que comprende un polipéptido recombinante que comprende (i) un fragmento de una proteína del Antígeno Asociado a Melanoma de Alto Peso Molecular (HMW-MAA) codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secs. con núms. de ident.: 21, 22, o 23, y (ii) una secuencia PEST de Listeria, o una Listeria recombinante que comprende dicho polipéptido recombinante, para usar en la inducción de una respuesta inmunitaria contra un cáncer o tumor renal o de la piel o para usar en el retraso de la progresión de un cáncer o tumor renal o de la piel.
  12. 12.
    La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el cáncer o tumor renal o de la piel no expresan HMW-MAA.
  13. 13.
    La composición para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-12 en donde el cáncer o tumor es un cáncer o tumor sólido, y la composición induce una respuesta inmunitaria contra un pericito de la vasculatura de dicho cáncer o tumor.
  14. 14.
    La composición para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en donde el cáncer o tumor de la piel es un melanoma.
  15. 15.
    El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o la composición para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-14, en donde la composición es una vacuna que comprende, además, un adyuvante, una citocina, una quimiocina, o combinación de estos.
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