DE19949594A1 - Rekombinante attenuierte Listerien zur Immuntherapie - Google Patents
Rekombinante attenuierte Listerien zur ImmuntherapieInfo
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Abstract
Beschrieben werden Listeria-Expressionsvektoren, die die Expression der humanen Tumorantigene Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-1 und Trp-2 oder davon abgeleiteter antigener Epitope erlauben, sowie diese Expressionsvektoren enthaltende, attenuierte Listeria-Bakterien, wobei es sich vorzugsweise um Bakterien des Stamms Listeria monocytogenes handelt. Diese Bakterien können zur prophylaktischen, adjuvanten oder therapeutischen Immuntherapie, beispielsweise zur Behandlung des malignen Melanoms verwendet werden.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Listeria-
Expressionsvektoren, die die Expression der humanen
tumorassoziierten Antigene Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-1
und Trp-2 erlauben, sowie diese Expressionsvektoren
enthaltende, attenuierte Listeria-Bakterien, wobei es sich
vorzugsweise um Bakterien des Stamms Listeria monocytogenes
handelt. Diese Bakterien können zur prophylaktischen,
adjuvanten oder therapeutischen Immuntherapie, beispielsweise
zur Behandlung des malignen Melanoms, verwendet werden.
Gegenwärtig stützt sich die Tumortherapie im wesentlichen
immer noch auf die drei Hauptsäulen: Chirurgie, Chemo-,
adjuvante Chemo- und Radiotherapie. Allerdings haben diese
Therapien die folgenden gravierenden Nachteile: (a) Sie sind
im metastasierenden Krankheitsstadium bzw. als vorbeugende
Therapie nach Entfernung des Primärtumors kaum wirksam, d. h.
eine Heilung im Metastasierungsstadium ist nicht mehr möglich,
(b) sie sind im Bezug auf das klinische Ansprechen, auf die
Dauer des rezidivfreien Intervalls, die Gesamtüberlebenszeit
sowie die Lebensqualität des Patienten sehr unzureichend und
(c) sie weisen eine Reihe von teilweise schwerwiegenden
Nebenwirkungen auf, beispielsweise eine beträchtliche
Schädigung von normalem Gewebe. Darüberhinaus gibt es bisher
keine präventiven Möglichkeiten, die beispielsweise auf einer
"Schutzimpfung" beruhen könnten. Dies wäre aber gerade
hinsichtlich des malignen Melanoms sehr wünschenswert.
Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische
Problem zugrunde, Mittel zur Tumortherapie, insbesondere zur
Therapie des malignen Melanoms, bereitzustellen, die nicht die
vorstehend beschriebenen Nachteile der gegenwärtigen
Therapieverfahren ausweisen, insbesondere eine präventive
Anwendung erlauben, als Adjuvanz nach Entfernung eines
Primärtumors wirksam sind bzw. im Stadium der
Fernmetastasierung von therapeutischem Nutzen sind.
Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die
Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten
Ausführungsformen erreicht.
Bei den erfindungsgemäßen Listeria-Expressionsvektoren bzw.
den rekombinanten attenuierten Listeria-Bakterien handelt es
sich um gentherapeutisch wirksame Konstrukte, die zur
prophylaktischen oder im Rahmen einer adjuvanten oder
therapeutischen Tumorbekämpfung, beispielsweise beim malignen
Melanom, eingesetzt werden können. Dabei kann durch eine
vorzugsweise orale Immunisierung eine tumorspezifische
Immunantwort erzeugt, d. h. durch das körpereigene zelluläre
Immunsystem kann eine gezielte Bekämpfung der Tumorzellen
erreicht werden. Diese Behandlung kann außerdem bei Bedarf mit
Behandlungsverfahren wie Chemotherapie oder Radiotherapie
kombiniert werden, vorzugsweise ersetzt sie jedoch die
letzteren Therapieformen.
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Befund, daß mittels
einer Immunisierung, vorzugsweise oralen Immunisierung, unter
Verwendung der erfindungsgemäßen rekombinanten attenuierten
Listerien als Synthese- und Transportvehikel für
tumorassoziierte Antigene eine prophylaktische bzw.
therapeutische Behandlung von Tumoren möglich ist. Die
Expression der einzelnen tumorassoziierten Antigene erfolgt
dabei bevorzugt als Fusionsproteine, bei denen beispielsweise
eine Listerien-spezifische Signalsequenz an den N-Terminus
des Antigens fusioniert ist. Nach Expression werden diese
Fusionsproteine aus den Bakterienzellen in die Umgebung
exportiert. Nach oraler Applikation passieren die Bakterien
das mukosale Epithel des Intestinaltrakts im Bereich der
Peyerschen Plaques und werden durch die dort lokalisierten
Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) des Immunsystems durch
Phagocytose aufgenommen. Die Listerien liegen daher zunächst
im Phagosom der infizierten Zelle vor, in das sie die
Fusionsproteine sekretieren, die damit einer Prozessierung zur
Generierung von HLA Klasse I und HLA Klasse II Peptiden zur
Verfügung stehen. Aufgrund des natürlichen Infektionszyklus
können sowohl das Wildtyp-Listerien-Bakterium als auch
definierte attentuierte Mutamen (sofern sie keine Deletion
des hly-Gens aufweisen) in das Cytosol der Zelle übertreten.
Die ins Cytosol sekretierten Fusionsproteine sind wiederum
einer Prozessierung zur Generierung von HLA-Klasse I Peptiden
zugänglich. Die in beiden Zellkompartimenten (Phagosom und
Cytosol) generierten Peptide stehen somit zur Beladung von HLA
I bzw. HLA-Klasse II Molekülen zur Verfügung. Der Peptid-HLA-
Komplex wird an der Zelloberfläche der APCs präsentiert und es
wird eine spezifische T-Zellantwort (CD4+ und CD8+ T-Zellen)
gegen die exprimierten tumorassoziierten Antigene induziert,
d. h. eine zelluläre cytotoxische Immunantwort des
körpereigenen Immunsystems gegen einen Tumor. Dadurch werden
die Tumorzellen gezielt als entartet erkannt und abgetötet.
Die Vorteile dieses Vorgehens liegen u. a. darin, daß das
körpereigene Immunsystem gezielt in Richtung einer Zerstörung
des Tumors mobilisiert wird. Es stellt ein einfaches
Immunisierungsverfahren dar, da die APCs die tumorassoziierten
Antigene mittels einer bakteriellen Infektion erhalten, d. h.
bei dem erfindungsgemäßen Vorgehen ist keine arbeitsintensive
ex-vivo-Modifikation autologer APCs erforderlich, da ein
natürlich vorkommender Infektionsprozess zur Modifizierung der
Zellen des Immunsystems ausgenutzt wird.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung einen Listeria-
Expressionsvektor zur Immuntherapie, wobei der Listeria-
Expressionsvektor folgende DNA-Sequenzen funktionell verknüpft
umfaßt: (a) einen in Listeria aktiven Promotor; und (b) eine
für humane Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-1 oder Trp-2
codierende DNA-Sequenz oder davon abgeleitete antigene
Epitope.
Der hier verwendete Ausdruck "in Listeria aktiver Promotor"
bezieht sich auf alle Promotoren, die in Listeria die
Expression der tumorassoziierten Antigene erlauben.
Vorzugsweise handelt es sich dabei um Promotoren von Listeria-
monocytogenes-Genen, beispielsweise konstitutive oder unter
den Bedingungen der Infektion aktivierte Promotoren. Besonders
bevorzugt sind Promotoren, die zu einer starken Expression des
gewünschten Antigens führen. Dieser Begriff bezieht sich auch
auf Promotor-Fragmente oder Promotoren mit modifizierten
Sequenzen, die noch biologisch aktiv sind. In einer
bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Promotor
für die Listeria-Expressionsvektoren um einen Promotor des
hly-, actA-, plcA-, plcB- oder mpl-Gens, die jeweils unter den
Bedingungen der Infektion aktiv sind und die die Listeria-
Proteine Haemolysin, ActA, Phosphotidylinositol-spezifische
Phospholipase C, Phosphatidylcholin-spezifische Phospholipase
C bzw. Metalloprotease codieren. Diese Promotoren sind bereits
in der Literatur ausführlich beschrieben:
- - actA/plcB-Promotor: Domann et al., (1992), EMBO J. 11: 1981-1990 (Die Transkription des actA- und des plcB-Gens wird durch einen gemeinsamen Promotor gesteuert)
- - hly Promotor: Domann et al., (1989), Nucleic Acids Res. 17: 6406
- - plcA-Promotor: Domann et al., (1991), Mol. Microbiol. 5: 361-366
- - mpl-Promotor: Domann et al., (1991), Infect. Immun. 59: 65-72.
Der hier verwendete Ausdruck "für humane Tyrosinase, Trp-1,
MelanA/MART-1 oder Trp-2 codierende DNA-Sequenz" betrifft jede
DNA-Sequenz, die das native Protein ganz oder teilweise
codiert. Diese DNA-Sequenzen sowie die abgeleiteten
Aminosäuresequenzen sind beispielsweise beschrieben in:
humanes Tyrosinase-Gen: Genbank Accession Nr. M27160
humanes trp-1-Gen: Genbank Accession Nr.: AF001295
humanes trp-2-Gen: Genbank Accession Nr.: D17547
humanes MelanA/MART-1-Gen: Genbank Accession Nr.: U06452.
Hierzu wird außerdem auf die Fig. 1-4 verwiesen.
humanes Tyrosinase-Gen: Genbank Accession Nr. M27160
humanes trp-1-Gen: Genbank Accession Nr.: AF001295
humanes trp-2-Gen: Genbank Accession Nr.: D17547
humanes MelanA/MART-1-Gen: Genbank Accession Nr.: U06452.
Hierzu wird außerdem auf die Fig. 1-4 verwiesen.
Bei den Antigenen Tyrosinase, Trp-1, Trp-2 und MelanA/MART-1
handelt es sich um Differenzierungsantigene melanocytären
Ursprungs. Da diese Antigene ausschließlich in melanocytären
Zellen (Melanocyten) im Rahmen der Melanogenese exprimiert
werden, sind sie außerordentlich gut geeignet, um eine
spezifische Immunantwort gegen Melanomzellen zu generieren.
Diese Differenzierungsantigene haben zudem den Vorteil, daß
sie von bis zu 100% der Zellen eines pigmentierten Tumors
(Melanom) exprimiert werden, wohingegen nur ca. 50% der
Melanome Cancer-Testis Antigene, wie z. B. MAGE-1, exprimieren.
Die Enzyme Tyrosinase, Trp-1, Trp-2 katalysieren den Prozeß
der Pigmentbildung (Malaninbiosynthese). Die Biosynthese
findet in den spezifischen Organellen, den Melanosomen statt,
in deren Matrix auch das MelanA/MART-1-Protein lokalisiert
ist.
Der Ausdruck "für humane . . . codierende DNA-Sequenz"
betrifft darüber hinaus auch DNA-Sequenzen, die solche Formen
von humaner Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-1 bzw. Trp-2
codieren, die Veränderungen gegenüber der nativen Form, d. h.
beispielsweise Deletionen, Additionen oder Austausche von
einer oder mehreren Aminosäuren und/oder (eine) modifizierte
Aminosäure(n) oder die Anheftung eines Ubiquitin-Restes
aufweisen oder veränderte Oligosaccharidseitenketten, wobei
ihre antigenen Eigenschaften ganz oder teilweise bzw. in der
gewünschten Weise bleiben, d. h. sie weisen beispielsweise die
in den nachstehenden Beispielen hinsichtlich der Behandlung
eines Tumors beschriebenen Eigenschaften auf. Zu den
Austauschen zählen vorzugsweise "konservative" Austausche von
Aminosäureresten, d. h. Austausche gegen biologisch ähnliche
Reste, z. B. die Substitution eines hydrophoben Rests (z. B.
Isoleucin, Valin, Leucin, Methionin) gegen einen anderen
hydrophoben Rest, oder die Substitution eines polaren Rests
gegen einen anderen polaren Rest (z. B. Arginin gegen Lysin,
Glutaminsäure gegen Asparaginsäure etc.). Zu den Austauschen
zählen auch "nicht-konservative" Austausche, die die antigenen
Eigenschaften der Proteine bzw. einzelner abgeleiteter
Proteinfragmente (Peptide) erhalten oder sogar verstärken
können. Dies kann durchaus die biologische bzw. enzymatische
Aktivität des nativen Proteins verändern. Deletionen können
zur Erzeugung von Molekülen führen, die eine deutlich
geringere Größe aufweisen, d. h., denen beispielsweise
Aminosäuren am N- oder C-Terminus fehlen. Die vorstehenden
Varianten betreffen auch Varianten, die im Vergleich zu der
ursprünglichen Form eine bessere Wirksamkeit hinsichtlich der
Tumorbekämpfung aufweisen. Verfahren zur Erzeugung der
vorstehenden Änderungen in der Aminosäuresequenz bzw.
entsprechenden Nucleinsäuresequenz sind dem Fachmann bekannt
und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben,
beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor NY (1989). Der Fachmann ist auch in
der Lage zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten
Nucleinsäuresequenz codiertes Protein bzw. Peptid noch über
die erwünschten antigenen Eigenschaften der Tyrosinase, Trp-1,
MelanA/MART-1 bzw. Trp-2 (ganz oder teilweise) verfügt. Diese
antigenen Eigenschaften lassen sich für die Proteine/Peptide
anhand der Stimulierung Antigen-spezifischer cytotoxischer T-
Zellinien feststellen. Im Falle der Peptide bietet sich
außerdem eine Überprüfung ihrer HLA-Bindungseigenschaften im
Rahmen von FACS-Analysen an. Vorzugsweise sollten die
Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-1, Trp-2 bzw. die vorstehenden
Varianten codierenden DNA-Sequenzen eine
Transkriptionsterminationssequenz und eine
Translationsterminationssequenz zur Gewährleistung einer
stabilen und korrekten Transkription bzw. Translation
aufweisen.
Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur
Konstruktion der erfindungsgemäßen Listeria-
Expressionsvektoren, u. a. zur Ligation der Fragmente für den
Promotor und die tumorassoziierten Antigene und Insertion in
den Vektor, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen
beispielsweise in-vitro-Rekombinationstechniken, synthetische
Verfahren, sowie in-vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie
beispielsweise in Ausubel und Frederick (1991), Current
Protocols in Molecular Biology (J. Wiley & Sons, New York)
beschrieben sind.
Am meisten bevorzugt sind Listeria-Expressionsvektoren, bei
denen die für humane Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-1 bzw.
Trp-2 codierende DNA-Sequenz mit einer ein Listeria-
Protein(fragment) codierenden DNA-Sequenz so verknüpft ist,
daß ein Fusionsprotein codiert wird. Vorzugsweise stellt der
von dem Listeria-Protein stammende Anteil den N-terminalen
Anteil des Fusionsproteins dar. Verschiedene Listeria-Proteine
bzw. Fragmente davon sind zur Herstellung dieses
Fusionsprotein geeignet, beispielsweise die vorstehend
hinsichtlich der Listeria-Promotoren offenbarten Gene. Noch
mehr bevorzugt sind Listeria-Expressionsvektoren, bei denen
der Listeria-Protein-Anteil des Fusionsproteins von einem an
der Lyse der Wirtsvakuolen oder an Bewegungen der Bakterien in
der Wirtszelle beteiligten Protein stammt, vorzugsweise
Listeriolysin O (Lyse), ActA (intrazelluläre Bewegung) oder
PI-PLC (Lyse). Der Vorteil von Listeriolysin O, eine Listeria-
Phospholipase oder das ActA-Protein zur Konstruktion von
Fusionsproteinen einzusetzen, liegt darin, daß diese Proteine
sekretiert werden. Im Falle einer Infektion gelangen diese
Fusionsproteine daher bevorzugt ins Phagolysosom bzw. ins
Cytosol der infizierten Zelle, d. h. in die Zellkompartimente,
in denen die Generierung von HLA-Klasse I und HLA-Klasse II
präsentierten Peptiden stattfindet. Die Fusionsproteine können
vorzugsweise wie folgt aussehen:
- a) lediglich die sekretorische Signalsequenz eines Listerien-spezifischen Proteins wird mit dem Antigen fusioniert
- b) die sekretorische Signalsequenz inklusive eines Ausschnitts der sich daran anschließenden nativen Proteinsequenz wird mit dem Antigen fusioniert,
- c) ein kurzes Fragment des Antigens wird unter Aufrechterhaltung des Leserahmens in die Sequenz des genannten Listerien-Proteins eingebaut.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Listeria-
Expressionsvektoren, bei denen der Listeria-Protein-Anteil des
Fusionsproteins eine Signalsequenz eines sezernierten
Listeria-Proteins umfaßt. Vorzugsweise stammt die
Signalsequenz vom Listeria-Haemolysin, einer Listeria-
Phospholipase oder dem ActA-Protein.
Ausgangsvektor für die Herstellung des erfindungsgemäßen
Listeria-Expressionsvektors ist jeder Vektor, der in Listeria
zur Expression der gewünschten Antigene führt. Dabei kann es
sich um einen autosomalen oder stabil in das Listeria-Genom
inserierenden Vektor handeln. Vorzugsweise ist der
Ausgangsvektor ein "Shuttle"-Vektor, der sich in einem
weiteren Wirt, beispielsweise E. coli, vermehren läßt.
Derartige Vektoren sind beispielsweise pKSV7 (Frankel et al.,
1995, J. Immunol. 155: 4775-4782), pCGU34 (Paglia et al.,
1997, Eur. J. Immunol. 27: 1570-1575), pAUL-A (Niebuhr et al.,
1997, EMBO J. 16: 5444-5445) und pLIGA160.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die erfindungsgemäßen
Listeria-Expressionsvektoren (autosomal oder stabil in das
Genom integriert, beispielsweise über homologe Rekombination)
enthaltende rekombinante, attenuierte Listeria-Bakterien,
vorzugsweise Listeria monocytogenes oder Listeria innocua,
wobei letzterer sich insbesondere zur Verstärkung einer
Immunantwort eignet. Die Auswahl geeigneter Listerien kann für
den Fachmann nach üblichen Kriterien hinsichtlich des
Einsatzes von Bakterien für die Vakzinierung erfolgen, d. h.
die für die erfindungsgemäßen Zwecke verwendbaren Listerien
sollten über Immunogenizität verfügen, jedoch ausreichend
attenuiert sein, um die sichere Anwendung beim Menschen zu
erlauben. Dazu ist es nötig, daß der Mutantenphänotyp der
Listerien absolut stabil ist, was üblicherweise nur durch die
Erzeugung chromosomaler Deletionen möglich ist. Zu den
Beispielen für attenuierte Mutanten zählen Mutanten, die
hinsichtlich der Ausbreitung von Zelle zu Zelle defizient
sind, actA-negative Mutanten, die hinsichtlich des
intrazellulären Wachstums defizient sind, hly2-
(Listeriolysin)-negative Mutanten, sowie Mutanten, die
zumindest hinsichtlich eines Phospholipase-Gens defizient sind
(Guzmán et al., Infect. Immun. 63 (1995), 3665-3673). Zu den
Beispielen für geeignete Listeria-Stämme zählen die Δmp12-
Mutante (Paglia et al., Eur. J. Immunol. 27: 1570-1575).
Geeignete attentuierte Listeria-Stämme sind auch in der
internationalen Patentanmeldung PCT/EP98/08096 beschrieben.
Verfahren zur Transformation der vorstehenden Listerien mit
den erfindungsgemäßen Listeria-Expressionsvektoren,
beispielsweise Elektroporation, zur phänotypischen Selektion
von Transformanten und zur Expression der die
tumorassoziierten Antigene (gegebenenfalls als
Fusionsproteine) codierenden DNA-Sequenzen unter Verwendung
der vorstehend beschriebenen Listeria-Expressionsvektoren sind
auf dem Fachgebiet bekannt.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ferner ein die
erfindungsgemäßen rekombinanten attenuierten Listeria-
Bakterien enthaltendes Arzneimittel (Impfstoff) bzw. deren
Verwendung zur Immuntherapie. Diese Immuntherapie eignet sich
zur Behandlung pigmentierter Tumorarten, vorzugsweise zur
Therapie des malignen Melanoms oder des malignen Schwannoms
(Untergruppe der Neuroblastome). Diese Arzneimittel enthalten
gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen
Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger
Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern
zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen,
Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen,
Netzmittel, sterile Lösungen etc. Das erfindungsgemäße
Arzneimittel kann beispielsweise zur oralen Verabreichung in
Form eines Elixiers, einer Kapsel oder Suspension verabreicht
werden. Die geeignete Dosierung und die Art der Verabreichung,
vorzugsweise orale, intravenöse oder intraperitoneale
Verabreichung werden von dem behandelnden Arzt bestimmt und
hängen von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem
Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium
und Schweregrad des Tumors, der Art der Verabreichung etc.
Jedenfalls muß die Verabreichung in einer wirksamen Menge
erfolgen, d. h. einer Menge, daß das tumorassoziierte Antigen
in einer Menge exprimiert wird, daß eine Immunantwort in T-
Zellen gegenüber dem tumorassoziierten Antigen induziert wird,
so daß dieses Antigen enthaltende Zellen zerstört werden. Das
erfindungsgemäße Arzneimittel kann entweder allein verabreicht
werden oder in Kombination mit weiteren Tumortherapien.
Erfindungsgemäße Expressionsvektoren wurden bei der DSMZ
(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH),
Mascheroder Weg 1b, Braunschweig jeweils am 5. Oktober 1999
nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt. Die
hinterlegten Proben haben folgende Hinterlegungsnummern
erhalten:
Escherichia coli XL2-Blue pLIGA-trp2 DSM 13072
Escherichia coli XL2-Blue pLIGA-tyro DSM 13073
Escherichia coli XL2-Blue pLIGA-trp1 DSM 13074.
Escherichia coli XL2-Blue pLIGA-trp2 DSM 13072
Escherichia coli XL2-Blue pLIGA-tyro DSM 13073
Escherichia coli XL2-Blue pLIGA-trp1 DSM 13074.
Die Figuren erläutern weiter die Erfindung.
Fig. 1 Darstellung der cDNA-Kodierregion von menschl.
Tyrosinase und der daraus abgeleiteten
Proteinsequenz,
Fig. 2 Darstellung der cDNA-Kodierregion von menschl.
Trp-1 und der daraus abgeleiteten Proteinsequenz,
Fig. 3 Darstellung der cDNA-Kodierregion von menschl.
Trp-2 und der daraus abgeleiteten Proteinsequenz,
Fig. 4 Darstellung der cDNA-Kodierregion von menschl.
MART-1/MelanA und der daraus abgeleiteten
Proteinsequenz.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Am 5'- und am 3'-Ende der für die menschliche tumorassoziierte
Tyrosinase-Antigen codierenden cDNA (Genbank-Zugangsnummer:
M27160) wurden mittels PCR (s. Tabelle 1) unter Verwendung der
in Tabelle 1 und 2 angegebenen spezifischen Primer (tyr-5/2-
LIGA+tyr/3-LIGA; tyr/5-LIGA+tyr/3-LIGA) eine NdeI- bzw. eine
SalI-Erkennungssequenz eingeführt. Die Primerkombination
tyr-5/2-LIGA und tyr/3-LIGA (Tab. 1) wurde zur Amplifizierung der
vollständigen Tyrosinase cDNA-Sequenz eingesetzt. Die
Primerkombination tyr/5-LIGA und tyr/3-LIGA (Tab. 2) wurde zur
Amplifizierung einer 5'-deletierten Tyrosinase cDNA-Sequenz
eingesetzt. Beide PCR-Amplifikate wurden dann wie folgt
behandelt: Unter Ausnutzung der genannten
Restriktionsschnittstellen wurde das Fragment in den Vektor
pLIGA160 in frame stromabwärts der plasmidkodierten actA-
Signalsequenz kloniert. Die Expression des resultierenden
Fusionsgens wird durch den plasmidkodierten actA-Promotor
gesteuert (Domann et al., 1992, EMBO J. 11: 1981-1990; Genbank
Accession: X59723). Die inserierte DNA-Sequenz sowie deren
Übergangsstellen zum Vektor wurden zur Kontrolle sequenziert.
Der resultierende Expressionsvektor erhielt die Bezeichnung
pLIGA-tyrof (codiert gesamte Tyrosinase cDNA) bzw. pLIGA-tyro
(codiert 5'-deletierte Tyrosinase cDNA). Letzterer wurde bei
der DSMZ am 5. Oktober unter der Nummer DSM 13073 hinterlegt.
Am 5'- und am 3'-Ende der für das menschliche tumorassoziierte
Trp-1-Antigen codierenden cDNA (Genbank-Zugangsnummer:
AF001295) wurden mittels PCR (s. Tabelle 1) unter Verwendung
der in Tabelle 1 und 2 angegebenen spezifischen Primer (trp1-5/2-
LIGA+trp1/3-LIGA; trp1/5-LIGA+trp1/3-LIGA) eine NdeI- bzw.
eine Bgl-II-Erkennungssequenz eingeführt. Die
Primerkombination trp1-5/2-LIGA und trp1/3-LIGA (Tab. 1) wurde
zur Amplifikation der vollständigen trp-1-cDNA-Sequenz
eingesetzt. Die Primerkombination trp1/5-LIGA und trp1/3-LIGA
(Tab. 2) wurde zur Amplifikation einer 5'-deletierten trp-1-
cDNA-Sequenz eingesetzt. Beide PCR-Amplifikate wurden dann
wie folgt behandelt: Unter Ausnutzung der genannten
Restriktionsschnittstellen wurde das Fragment in den Vektor
pLIGA160 in frame stromabwärts der plasmidkodierten actA-
Signalsequenz kloniert. Die Expression des resultierenden
Fusionsgens wird durch den plasmidkodierten actA-Promotor
gesteuert (Domann et al., 1992, EMBO J. 11: 1981-1990; Genbank
Accession: X59723) Die inserierte DNA-Sequenz sowie deren
Übergangsstellen zum Vektor wurden zur Kontrolle sequenziert.
Der resultierende Expressionsvektor erhielt die Bezeichnung
pLTGA-trp1f (codiert die gesamte trp-1-cDNA) bzw. pLIGA-trp1
(codiert 5'-deletierte trp-1 cDNA). Letzterer wurde am 5.
Oktober 1999 bei der DSMZ Braunschweig unter DSM 13074
hinterlegt.
Am 5'- und am 3'-Ende der für das menschliche tumorassoziierte
Trp-2 Antigen codierenden cDNA (Genbank-Zugangsnummer: D17547)
wurden mittels PCR (s. Tabelle 1) unter Verwendung der in
Tabelle 1 und 2 angegebenen spezifischen Primer (trp2-5/2-
LIGA+trp-2/3-LIGA; trp2/5-LIGA+trp2/3-LIGA) eine NdeI- bzw.
eine Sal-I-Erkennungssequenz eingeführt. Die Primerkombination
trp2-5/2-LIGA und trp2/3-LIGA (Tab. 1) wurde zur Amplifikation
der vollständigen trp-2-cDNA-Sequenz eingesetzt. Die
Primerkombination trp2/5-LIGA und trp2/3-LIGA (Tab. 2) wurde
zur Amplifizierung einer 5'-deletierten trp-2-cDNA-Sequenz
eingesetzt. Beide PCR-Amplifikate wurde dann wie folgt
behandelt: Unter Ausnutzung der genannten
Restriktionsschnittstellen wurde das Fragment in den Vektor
pLIGA160 in frame stromabwärts der plasmidkodierten actA-
Signalsequenz kloniert. Die Expression des resultierenden
Fusionsgens wird durch den plasmidkodierten actA-Promotor
gesteuert (Domann et al., 1992, EMBO J. 11: 1981-1990; Genbank
Accession: X59723) Die inserierte DNA-Sequenz sowie deren
Übergangsstellen zum Vektor wurden zur Kontrolle sequenziert.
Der resultierende Expressionsvektor erhielt die Bezeichnung
pLIGA-trp2f (codiert die gesamte trp-2-cDNA) bzw. pLIGA-trp2
(codiert 5'-deletierte trp-2 cDNA). Letzterer wurden am 5.
Oktober 1999 bei der DSMZ Braunschweig unter DSM 13072
hinterlegt.
Am 5'- und am 3'-Ende der für das menschliche tumorassoziierte
MelanA-Antigen codierenden cDNA (Genbank-Zugangsnummer:
U06452) wurden mittels PCR (s. Tabelle 1) unter Verwendung der
in Tabelle 1 angegebenen Primer (melanA-5/2-LIGA, melanA/3-
LIGA) eine NdeI- bzw. eine Bgl-II-Erkennungssequenz
eingeführt. Unter Ausnutzung der Restriktionsschnittstellen
wurde das Fragment in den Vektor pLIGA160 in frame
stromabwärts der plasmidkodierten actA-Signalsequenz kloniert.
Die Expression des resultierenden Fusionsgens wird durch den
plasmidkodierten actA-Promotor gesteuert (Domann et al., 1992,
EMBO J. 11: 1981-1990; Genbank Accession: X59723) Die
inserierte DNA-Sequenz sowie deren Übergangsstellen zum Vektor
wurden zur Kontrolle sequenziert.
Die in den vorstehenden Beispielen 1 bis 4 beschriebenen
Listeria-Expressionsvektoren wurde nach Amplifikation in dem
E.-coli-Stamm XL2-Blue jeweils in den L. monocytogenes Stamm
EGD sowie in die attentuierten Mutanten Δhly2 und ΔactA
(Guzmann et al., 1995, Infect. Immun. 63: 3665-3573) mittels
Elektroporation eingeführt. Die dazu angewandte Technik ist
dem Fachmann hinreichend bekannt. Plasmidtragende Listerien
wurden anhand der plasmidvermittelten Erythromycin-Resistenz
identifiziert. Die Expression der tumorassoziierten Antigene
wird dann unter Anwendung immunologischer Nachweisverfahren
(z. B. immunologische Färbung, Western Blot) mittels
spezifischer Antikörper (MelanA-AK erhältlich von Fa.
Novocastra; Tyrosinase-AK erhältlich von Fa. BioTrend, Köln;
Trp-1 AK beschrieben in Thomsen et al. 1985, J. Invest.
Dermatol. 85: 169-174) bestimmt. Jedes der tumorassoziierten
Antigene konnte nachgewiesen werden, d. h. der gewählte
Expressionsweg war erfolgreich.
Der im vorstehenden Beispiel 4 beschriebene Listeria-
Expressionsvektor pLIGA-MelanA wurde nach Amplifikation im
E.-coli-Stamm XL2-Blue in den L. monocytogenes Stamm EGD
(Guzmán et al., 1995, Infect. Immun. 63: 3665-3573) mittels
Elektroporation eingeführt. Diese Bakterien wurden über Nacht
bei 37°C in BHI(Brain-Heart-Infusion)-Medium (Hersteller: Fa.
Difco) angezüchtet. Es wurde eine 1: 50-Verdünnungskultur
angelegt und das Wachstum der Bakterien bis zur mittleren 10 g-
Phase fortgesetzt. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation
bei 3000 × g geerntet. Die Zellen wurden dreimal mit PBS
gewaschen und in PBS resuspendiert. Zur Kontrolle wurden die
das nicht-veränderte Plasmid pLIGA160 tragenden EGD-Bakterien
ebenso behandelt und kultiviert.
Mäuse vom transgenen Stamm HLA-A2kb (Vitiello et al., 1991, J.
Exp. Med. 173: 1007-1015) wurden mit den in PBS
resuspendierten Bakterien (EGD-pLIGA-MelanA und EGD-pLIGA160)
im 7-tägigen Intervall immunisiert. Die Mäuse erhielten
jeweils eine orale Applikation von 1 × 106 Bakterien an Tag 0 und
1 × 107 Bakterien an Tag 7, 14, 21, usw.
Primäres Ziel der Immunisierungsexperimente ist die Erzeugung
einer zellulären cytotoxischen T-Zellantwort. Die Antigen
spezifische Aktivität cytotoxischer T-Zellen gilt als
Grundlage einer effizienten antitumorösen Immunantwort.
Die Milzgin von je 3 immunisierten Mäusen werden 7 Tage nach
der letzten Immunisierung entnommen, gepoolt und mechanisch
bearbeitet, daß eine Einzelzellsuspension vorliegt. Die
Milzzellen werden mit einer zur HLA-A2kb transgenen Zellinie
(C1R-A2kb) restimuliert. Diese Zellinie ist mit dem MelanA-
Antigen kodierenden Gen stabil transfiziert und kann daher zur
Stimulierung der cytotoxischen Aktivität Antigen-spezifischer
T-Zellen eingesetzt werden. Nach 5-7 Tagen werden die lebenden
Zellen geerntet und im dem Fachmann hinreichend bekannten 51Cr-
Freisetzungsexperiment auf ihre Fähigkeit hin überprüft, die
genannten Antigen-exprimierenden Zielzellen zu lysieren.
Dargestellt ist die MHC-Klasse I Melan A restringierte Lyse von MelanA exprimierenden
C1R-A2kb-Zielzellen durch Lymphocyten die in vivo mit dem rekombinanten L.
monocytogenes EGD pLIGA-MelanA Vakzinstamm primär stimuliert wurden. 7 Tage nach
der letzten Immunisierung mit EGD-pLIGA-MelanA bzw. EGD-pLIGA160
(Negativkontrolle) wurden die Milzzellen an Tag 5 nach Entnahme in vitro restimuliert. Zur
in-vitro-Restimulierung wurde die zum immunisierten HLA-A2kb transgenen Mausstamm
syngene C1R-A2kb-Zellinie, die stabil mit dem humanen MelanA kodierenden Gen
transfiziert wurde, eingesetzt. Zum Ende der Kultur wurden die Lymphocyten im 51Cr-
Freisetzungsexperiment auf ihre Fähigkeit zur Lyse der C1R-A2kb MelanA transfizierten
Zellinie hin getestet.
Fett markiert ist jeweils die Erkennungssequenz spezifischer Restriktionsenzyme, die für die
Klonierung des PCR-Amplifikats in den Vektor pLIGA160 eingesetzt wurden. Unterstrichen ist der
Anteil eines Primers, der an die komplementäre Sequenz der genannten c-DNA bindet.
Initiale Denaturierung: | 3 Min. bei 94°C |
Zyklus (40 X): | 0,5 Min. bei 94°C |
1 Min. bei 55°C | |
1,5 Min. bei 68°C | |
abschließende Polymerisation: | 7 Min. bei 68°C |
Fett markiert ist jeweils die Erkennungssequenz spezifischer Restriktionsenzyme, die für die
Klonierung des PCR-Amplifikats in den Vektor pLIGA160 eingesetzt wurden. Unterstrichen ist der
Anteil eines Primers, der an die komplementäre Sequenz der genannten c-DNA bindet.
Initiale Denaturierung: | 3 Min. bei 94°C |
Zyklus (40 X): | 0,5 Min. bei 94°C |
1 Min. bei 55°C | |
1,5 Min. bei 68°C | |
abschließende Polymerisation: | 7 Min. bei 68°C |
Claims (13)
1. Listeria-Expressionsvektor zur Immuntherapie, wobei der
Listeria-Expressionsvektor folgende DNA-Sequenzen funktionell
verknüpft umfaßt:
- a) einen in Listeria aktiven Promotor und
- b) eine für humane Tyrosinase, Trp-1, MelanA/MART-1 oder Trp-2 codierende DNA-Sequenz.
2. Listeria-Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei der in
Listeria aktive Promotor der Promotor des hly-, actA-, plcA-,
plcB- oder mpl-Gens ist.
3. Listeria-Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2,
zusätzlich eine ein Protein codierende DNA so enthaltend, daß
ein ein Listeria-Protein und humane Tyrosinase, Trp-1,
MelanA/MART-1 oder Trp-2 umfassendes Fusionsprotein codiert
wird.
4. Expressionsvektor nach Anspruch 3, wobei das Listeria-
Protein ein an der Lyse der Wirtsvakuolen oder an der
Wanderung der Wirtszelle beteiligtes Enzym ist.
5. Expressionsvektor nach Anspruch 4, wobei das Listeria-
Protein Listeriolysin 0, PI-PLC oder ActA ist.
6. Expressionsvektor nach Anspruch 3, wobei das Listeria-
Protein eine Signalsequenz eines sezernierten Listeria-
Proteins umfaßt.
7. Expressionsvektor nach Anspruch 6, wobei die Signalsequenz
von Haemolysin (Listeriolysin O), einer Phospholipase (PI-PLC)
oder dem ActA-Protein stammt.
8. Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, der von
pKSV7, pAUL-A oder pLIGA160 stammt.
9. Rekombinantes attenuiertes Listeria-Bakterium, den
Listeria-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 8
enthaltend.
10. Rekombinantes attenuiertes Listeria-Bakterium nach
Anspruch 9, das Listeria monocytogenes ist.
11. Impfstoff, ein rekombinantes attenuiertes Listeria-
Bakterium nach Anspruch 9 oder 10 enthaltend.
12. Verwendung des rekombinanten attenuierten Listeria-
Bakteriums nach Anspruch 9 oder 10 zur Immuntherapie.
13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Immuntherapie die
Therapie des malignen Melanoms ist.
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