PT1592441E

PT1592441E - Listeria atenuada relativamente à entrada em células não patogénicas, vacinas compreendendo a listeria e métodos para sua utilização

Info

Publication number: PT1592441E
Application number: PT04749316T
Authority: PT
Inventors: Thomas W Dubensky; Dirk G Brockstedt; David Cook
Original assignee: Aduro Biotech
Priority date: 2003-02-06
Filing date: 2004-02-06
Publication date: 2012-05-21
Also published as: AU2004246999A1; JP4545151B2; US20110201092A1; JP2007503846A; WO2004110481A3; ES2382332T3; JP2007125040A; CA2515369A1; KR20050105460A; MXPA05008342A; US8287883B2; US20040228877A1; CA2515369C; HK1082187A1; US7691393B2; KR101192652B1; AU2004246999B2; EP1592441A2; WO2004110481A2; EP1592441B1

Description

ΡΕ1592441 1

DESCRIÇÃO

"LISTERIA ATENUADA RELATIVAMENTE À ENTRADA EM CÉLULAS NÃO PATOGÉNICAS, VACINAS COMPREENDENDO A LISTERIA E MÉTODOS PARA SUA UTILIZAÇÃO"

CAMPO DA INVENÇÃO 0 campo desta invenção refere-se geralmente a bactérias atenuadas para utilização em vacinas. Em particular, esta invenção refere-se a Listeria monocytogenes útil em composições de vacina e métodos para utilização daquelas vacinas em tratamentos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Foram desenvolvidos micróbios para utilização como vacinas que administram antigénios heterólogos. A administração de antigénios heterólogos é proporcionada por micróbios que foram modificados para conterem sequências de ácidos nucleicos que codificam para uma proteína ou um antigénio originário de uma espécie diferente. A administração de antigénios heterólogos é especialmente vantajosa para o tratamento ou a prevenção de doenças ou condições que resultam de fontes especialmente virulentas ou letais, tais com cancro e agentes patogénicos (por exemplo, VIH ou Hepatite B) . A injecção de um agente infeccioso nativo ou 2 ΡΕ1592441 virulento é potencialmente prejudicial ao organismo recep-tor. Do mesmo modo, uma célula cancerosa que surge esporadicamente num indivíduo afectado pode subsequentemente propagar-se e do mesmo modo ser potencialmente prejudicial a um organismo receptor. Verificou-se que a administração do antigénio heterólogo é também especialmente vantajosa quando a administração de um agente ou uma célula morto ou atenuado não provoca uma resposta imunitária eficaz ou não pode ser assegurada com uma certeza aceitável uma atenuação suficiente do agente infeccioso ou da célula cancerosa. Recentemente, certas estirpes bacterianas foram desenvolvidas como vacinas recombinantes. Por exemplo, verificou-se que uma vacina oral de Salmonella atenuada modificada para expressar um antigénio circum-esporozoita de Plasmodium berghei protege ratinhos contra malária (Aggarwal et al. 1990. J. Exp. Med. 172: 1083).

Uma classe de bactérias que pode ser potencialmente utilizada como vacinas heterólogas é a das bactérias intracelulares facultativas. A resposta imunitária a estas bactérias pode ser uma resposta humoral, uma célula mediata por células, ou ambas. No entanto, bactérias intracelulares mortas ou componentes de bactérias intracelulares podem não provocar uma resposta imunitária mediada por células completa (Lauvau et al. 2001. Science 294: 1735-9). Estas bactérias podem passar uma porção do seu ciclo de vida livres nos sistemas circulatório ou linfático do seu hospedeiro, na qual estão sujeitas às respostas inatas e de anticorpos (isto é, humoral) do sistema imunitário do hospedeiro. 3 ΡΕ1592441

As bactérias intracelulares facultativas podem também passar uma porção do seu ciclo de vida sequestradas no interior das células do hospedeiro, nas quais podem ser protegidas dos aspectos inato e humoral do sistema imunitário do hospedeiro e podem ser susceptiveis às respostas mediadas por células do sistema imunitário do hospedeiro. Uma resposta imunitária mediada por células resulta da apresentação de antigénios à superfície de células hospedeiras. As células fagociticas do sistema imunitário do hospedeiro podem engolfar bactérias vivas, bactérias mortas ou componentes da bactéria para o interior de lisossomas, que amadurecem em fagolisossomas e degradam proteínas antigénicas em péptidos. Os péptidos dos antigénios contidos no interior de fagolisossomas de células fagociticas podem ser apresentadas à superfície destas células fagociticas por moléculas MHC de classe II para reconhecimento por células T CD4+ e a activação de uma resposta T "helper". Os péptidos de antigénios expressos no citossol de qualquer célula no corpo de um mamifero podem ser apresentados à superfície daquela célula por moléculas MHC de classe I para reconhecimento por células T CD8+ e a activação de uma resposta T citotóxica (CTL). No entanto, bactérias intracelulares mortas ou componentes de bactérias intracelulares podem não invadir células não fagociticas ou podem não escapar do fagolisossoma de uma célula fagocitica no citossol, resultando na activação e maturação de células fagociticas, por exemplo, macrófagos e células dendriticas. Deste modo, os antigénios de bactérias intracelulares 4 ΡΕ1592441 mortas ou componentes de bactérias intracelulares podem não estar disponíveis para a apresentação MHC I directa e podem não activar uma resposta CTL. A capacidade de bactérias intracelulares para produzir proteínas no interior de fagolisossomas e/ou do citossol do hospedeiro pode ser necessária de modo a provocar uma resposta imunitária mediada por células completamente eficaz.

Foram recentemente desenvolvidas estirpes de Listeria monocytogenes como veículos de administração intracelular de proteínas heterólogas que proporcionam a administração de antigénios ao sistema imunitário para induzir uma resposta imunitária a condições clínicas que não permitem a injecção do agente causador de doença, tal como cancro (Patente U.S. No. 6,051,237 Paterson; WO 99/29884; Patente U.S. No. 6,565,852) e VIH (Patente U.S. No. 5,830,702, Portnoy & Paterson). Na qualidade de uma bactéria intracelular facultativa, L. monocytogenes desencadeia ambas as respostas humoral e mediada por células específica de um antigénio bacteriano. Após a entrada de Listeria numa célula do organismo hospedeiro, a Listeria produz proteínas específicas de Listeria que permitem que escapem do fagolisossoma da célula hospedeira que engolfa no citossol daquela célula. Na célula, L. monocytogenes prolifera, expressando proteínas necessárias para sobrevivência, mas também expressando genes heteró-logos ligados de forma operativa a promotores Listeria. A apresentação de péptidos destas proteínas heterólogas à superfície da célula que engolfa por proteínas MHC permite 5 ΡΕ1592441 o desenvolvimento de uma resposta de célula T. Uma vez que L. monocytogenes é um patogénio humano e animal transmitido por alimentos responsável por várias infecções sérias em indivíduos imunocomprometidos e mulheres grávidas, estirpes destas bactéria têm de ser atenuadas de um modo que reduz a toxicidade para o hospedeiro, enquanto mantêm a imunoge-nicidade da vacina. Esta toxicidade é o resultado da invasão bacteriana de vários órgãos e tecidos do hospedeiro, tais como aqueles do fígado, do baço e do sistema nervoso central. Seria benéfico reduzir os riscos associados com a utilização de Listeria monocytogenes como uma vacina sem afectar a sua potência para induzir imunidade adaptativa mediada por células específica para antigénios codificados heterólogos relacionados com doenças infecciosas e malignas seleccionadas.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção definida pelas reivindicações proporciona geralmente Listeria monocytogenes atenuada, em particular, assim como métodos para utilização daquelas Listeria em vacinas. As vacinas são úteis na indução de respostas imunitárias e no tratamento e/ou prevenção de uma larga gama de doenças incluindo cancro.

Num aspecto, a divulgação proporciona uma bactéria Listeria isolada que é atenuada relativamente à entrada em células não fagocíticas (por exemplo, é deficiente relativamente a uma internalina, tais como internalina B) e 6 ΡΕ1592441 que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio que não é de Listeria. Nalgumas realizações, a bactéria é ainda atenuada relativamente à disseminação célula-para-célula (por exemplo, é deficiente em relação a ActA). A bactéria Listeria atenuada pertence à espécie Listeria monocytogenes. A bactéria Listeria atenuada é uma estirpe de Listeria mutante. É também proporcionada uma composição imunogénica compreendendo a bactéria Listeria, uma vez que é uma vacina compreendendo tanto a bactéria como um veiculo e/ou um adjuvante farmaceutica-mente aceitável. Além disso, são também proporcionados métodos para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro num antigénio que não é de Listeria compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo a bactéria Listeria atenuada e métodos para a prevenção ou o tratamento de uma doença num hospedeiro (tal como cancro ou uma doença infecciosa), compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo a bactéria Listeria atenuada. Proporciona-se também uma célula apresentadora de antigénio profissional isolada compreendendo a bactéria Listeria atenuada.

Noutro aspecto, a divulgação proporciona uma bactéria Listeria isolada que é atenuada tanto para a entrada em células não fagociticas (por exemplo, é deficiente em relação a uma internalina, tal como internalina B) e para a disseminação célula a célula (por exemplo, é deficiente relativamente a ActA). A bactéria Listeria 7 ΡΕ1592441 atenuada é uma estirpe mutante de Listeria. Nalgumas realizações, o ácido nucleico da bactéria Listeria foi modificada com um composto direccionado para um ácido nucleico de tal modo que a bactéria é atenuada relativamente a disseminação célula a célula. A bactéria Listeria atenuada compreende pelo menos uma mutação de deleção em ambos os genes inlB e actA. A Listeria atenuada é a estirpe de Listeria monocytogenes LactAAinlB (alternativamente referida como a estirpe Listeria monocytogenes actA~inlB~) depositada na American Type Culture Collection (ATCC) e identificada pelo número de acesso PTA-5562, ou um mutante da estirpe depositada que é deficiente tanto relativamente à internalina B e ActA. A bactéria Listeria atenuada compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio que não é de Listeria. A bactéria Listeria atenuada pertence à espécie Listeria monocytogenes. Uma composição imunogénica compreendendo à Listeria atenuada é também proporcionada, como uma vacina compreendendo tanto a Listeria atenuada e um veiculo e/ou um adjuvante farma-ceuticamente aceitável. Além disso, proporcionam-se os métodos para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio que não é de Listeria compreendendo a administração a um hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo a bactéria Listeria atenuada. São também proporcionados métodos para a prevenção ou o tratamento de uma doença num hospedeiro (tal como cancro, Listeriose, ou uma doença causada por um patogénio que não é Listeria), compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma ΡΕ1592441 composição compreendendo a bactéria de Listeria atenuada. É também proporcionada uma célula apresentadora de antigénio profissional compreendendo uma bactéria Listeria atenuada.

Num aspecto adicional, a divulgação proporciona uma vacina compreendendo (a) uma bactéria Listeria, em que a bactéria Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagocíticas, e (b) um veículo e/ou um adjuvante farmaceuticamente aceitável. A bactéria Listeria atenuada é deficiente relativamente à internalina B. A bactéria atenuada Listeria na vacina pertence à espécie Listeria monocytogenes. A bactéria Listeria atenuada é uma estirpe Listeria mutante. Proporcionam-se os métodos para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio que não é de Listeria compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz da vacina. Proporcionam-se também métodos para a prevenção ou o tratamento de uma doença num hospedeiro, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma vacina.

Ainda noutro aspecto, a divulgação proporciona uma célula apresentadora de antigénio profissional isolada compreendendo uma bactéria Listeria, em que a bactéria Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagocíticas (por exemplo, é deficiente em relação à internalina, tais como a internalina B). Nalgumas realizações, a bactéria é ainda atenuada relativamente à disseminação célula a célula (por exemplo, é deficiente relativamente ao ActA) . Nalgumas realizações, a bactéria atenuada Listeria 9 ΡΕ1592441 na célula apresentadora de antigénio profissional é uma estirpe Listeria mutante. Nalgumas realizações, a bactéria Listeria pertence à espécie Listeria monocytogenes. A invenção também proporciona um método para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma célula apresentadora de antigénio, em que a bactéria Listeria atenuada compreende um ácido nucleico que codifica para um antigénio. Ainda noutro aspecto, a divulgação proporciona um método para a prevenção ou para o tratamento de uma doença num hospedeiro, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz da célula apresentadora de antigénio profissional.

Noutro aspecto, a divulgação proporciona um método para a indução da apresentação de um antigénio MHC de classe I ou para a apresentação de um antigénio MHC de classe II numa célula apresentadora de antigénio (in vivo ou in vitro) , compreendendo o contacto de uma bactéria Listeria atenuada com uma célula apresentadora de antigénio, em que a bactéria de Listeria atenuada é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio que não é de Listeria compreendendo um epitopo MHC de classe I ou um epitopo MHC de classe II.

Divulga-se um método para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio, compreendendo os seguintes passos: (a) contacta-se uma bactéria 10 ΡΕ1592441

Listeria atenuada com uma célula apresentadora de antigénio (por exemplo, uma célula apresentadora de antigénio do hospedeiro), em que a bactéria Listeria atenuada é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para o antigénio; e (b) administra-se a célula apresentadora de antigénio ao hospedeiro.

Noutro aspecto, a presente divulgação proporciona um método para a prevenção ou o tratamento de uma doença (tal como cancro) num hospedeiro, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma vacina compreendendo uma estirpe mutante de Listeria, em que a estirpe mutante de Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas em relação a uma estipe de Listeria não mutante, mas retém uma capacidade de entrar em células fagociticas.

Noutro aspecto, a divulgação proporciona um método para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo uma estirpe mutante de Listeria, em que a estirpe mutante de Listeria é atenuada relativamente à entrada nas células não fagociticas em relação a uma estirpe não mutante de Listeria, mas retém a capacidade de entrar em células fagociticas, e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para o antigénio.

Ainda noutro aspecto, a divulgação proporciona um 11 ΡΕ1592441 método para a indução da apresentação de um antigénio MHC de classe I ou da apresentação de um antigénio MCH de classe II numa célula apresentadora de antigénio compreendendo o contacto de uma estirpe de Listeria mutante com uma célula apresentadora de antigénio, em que a estirpe mutante de Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas em relação a uma estirpe não mutante de Listeria, mas retém uma capacidade de entrar em células fagociticas, e compreende uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica para um antigénio compreendendo, respectivamente, um epitopo MHC de classe I ou um epitopo MHC de classe II.

Noutro aspecto, a divulgação proporciona um método para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio compreendendo, os seguintes passos: (a) contactar a estirpe mutante de Listeria com uma célula apresentadora de antigénio do hospedeiro, sob condições adequadas e durante um tempo suficiente para carregar as células apresentadoras de antigénio, em que estirpe mutante de Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas em relação a uma estirpe não mutante de Listeria, mas retém uma capacidade para entrar em células fagociticas, e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio; e (b) administração da célula apresentadora de antigénio ao hospedeiro. Numa realização, o antigénio é um antigénio associado a um tumor ou é derivado de um antigénio associado a um tumor. 12 ΡΕ1592441

Ainda noutro aspecto, a divulgação proporciona métodos para diminuir a patogenicidade de uma estirpe de Listeria utilizada numa vacina, compreendendo a modificação da estirpe de modo a diminuir a capacidade da estirpe em entrar em células não fagociticas, mas retendo substancialmente a capacidade da estirpe em entrar em células fagociticas. Estes métodos podem incluir mutações de deleção em genes que codificam para proteínas que direccionam tropismo bacteriano directo (invasinas) para células não fagociticas particulares, ou alternativamente, podem incluir o tratamento de bactérias com anticorpos monoclonais ou policlonais que mascaram as referidas invasinas, e como resultado inibem a infecção de células não fagociticas.

Ainda noutro aspecto, a divulgação proporciona um método para administração selectiva de uma proteína em células fagociticas (em contraste com não fagociticas) num hospedeiro, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma composição compreendendo uma estirpe Listeria mutante que é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas em relação a estirpes Listeria não mutantes, mas retém substancialmente uma capacidade de entrar em células fagociticas, em que o genoma da estirpe mutante de Listeria que expressa a proteína que compreende pelo menos uma mutação em pelo menos um gene que codifica para uma invasina (alternativamente denominada uma "proteína de invasão"), tal como uma internalina. 13 ΡΕ1592441

Noutros aspectos, a divulgação proporciona métodos para a produção de vacinas. Por exemplo, a invenção proporciona um método para produzir uma vacina compreendendo o contacto de uma estirpe mutante de Listeria com uma célula apresentadora de antigénio in vitro ou ex vivo, sob condições adequadas e durante um tempo suficiente para carregar as células apresentadoras de antigénio em que a estirpe mutante de Listeria é atenuada relativamente à entrada de células não fagociticas em relação a uma estirpe não mutante de Listeria, mas retém a capacidade de entrar em células fagociticas, e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio.

Nalgumas realizações em cada um dos aspectos acima mencionados, a estirpe mutante de Listeria é uma estirpe mutante de Listeria monocytogenes que é deficiente em relação à internalina B e/ou compreende pelo menos uma mutação no gene que codifica para a internalina B (inlB) , e/ou num elemento que regula a sua expressão. Ainda noutras realizações de cada um dos aspectos acima mencionados, a estirpe mutante é deficiente em relação tanto à internalina B e actA e/o compreende pelo menos uma mutação em ambos os genes inlB e actA, e/ou num elemento que regula a sua expressão.

Além disso, a presente divulgação proporciona uma variedade de composições e estirpes úteis nos métodos acima mencionados, assim como para outras utilizações. Por 14 ΡΕ1592441 exemplo, ainda noutro aspecto, a divulgação proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma estirpe mutante de Listeria e um veiculo farmaceuticamente aceitável, em que a estirpe mutante de Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas em relação a uma estirpe não mutante de Listeria, mas retém uma capacidade de entrar em células fagociticas. Numa realização, o genoma da estirpe mutante compreende pelo menos uma mutação em pelo menos um gene que codifica para uma invasina (isto é, uma proteína de invasão), tal como uma internalina, e/ou num elemento que regula a sua expressão.

Noutro aspecto, a divulgação proporciona uma composição imunogénica compreendendo uma estirpe mutante de Listeria, em que a estirpe mutante e Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas em relação a uma estirpe não mutante de Listeria, mas retém uma capacidade para entrar células fagociticas, e compreende uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica para um antigénio.

Noutro aspecto, a divulgação proporciona uma vacina compreendendo uma estirpe mutante de Listeria, em que a estirpe mutante de Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas em relação a uma estirpe não mutante de Listeria, mas retém uma capacidade de entrar em células fagociticas.

Ainda noutro aspecto, a divulgação proporciona 15 ΡΕ1592441 uma célula apresentadora de antigénio profissional, tal como uma célula dendritica, compreendendo uma estirpe mutante de Listeria, em que a estirpe mutante de Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagocíticas em relação à estirpe não mutante de Listeria, mas retém uma capacidade de entrar em células fagociticas.

Nalgumas realizações de cada um dos aspectos acima mencionados, a estirpe mutante de Listeria é uma estirpe mutante de Listeria monocytogenes.

Nalgumas realizações de cada um dos aspectos acima mencionados, a estirpe mutante de Listeria é deficiente relativamente a internalina B. Nalgumas realizações de cada um dos aspectos acima mencionados, o genoma da estirpe mutante de Listeria que é deficiente em relação à internalina B compreende pelo menos uma mutação no gene que codifica para a internalina B (inlB), e/ou num elemento que regula a sua expressão. Noutras realizações, deleta-se inlB do genoma da estirpe mutante de Listeria.

Ainda noutras realizações de cada um dos aspectos acima mencionados, a estirpe mutante é deficiente em relação tanto à internalina B e a ActA. Nalgumas realizações, a estirpe mutante compreende pelo menos uma mutação tanto no gene inlB (e/ou um elemento que regula a expressão do gene inlB) e no gene actA (e/ou num elemento que regula a expressão do gene actA). 16 ΡΕ1592441

Num aspecto adicional, a presente divulgação proporciona um método para a prevenção ou para o tratamento de uma doença (tal como o cancro) num hospedeiro, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma vacina compreendendo uma estirpe mutante de Listeria, em que a estirpe mutante de Listeria é deficiente em relação à internali-na B.

Noutro aspecto, a divulgação proporciona um método para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo uma estirpe mutante de Listeria, em que a estirpe mutante de Listeria é deficiente relativamente à internalina B e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para o antigénio.

Noutro aspecto, a divulgação proporciona um método para a indução da apresentação de um antigénio MHC de classe I ou da apresentação de um antigénio MHC de classe II numa célula apresentadora de antigénio (in vitro ou in vivo) , compreendendo o contacto de uma estirpe mutante de Listeria com uma célula apresentadora de antigénio, em que a estirpe mutante de Listeria é deficiente em relação à internalina B e compreende uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica para um antigénio que compreende, respectivamente, um epitopo MHC de classe I ou um epitopo MHC de classe II. 17 ΡΕ1592441

Ainda noutro aspecto, a divulgação proporciona um método para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio compreendendo os seguintes passos: (a) contactar uma estirpe mutante de Listeria com uma célula apresentadora de antigénio do hospedeiro, sob condições adequadas e durante um tempo suficiente para carregar as células apresentadoras de antigénio, em que a estirpe mutante de Listeria é deficiente em relação à internalina B, e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio; e (b) administrar a célula apresentadora de antigénio ao hospedeiro. Numa realização, o antigénio é um antigénio associado a tumor ou é derivado de um antigénio associado a um tumor.

Ainda noutro aspecto, a divulgação proporciona um método para a diminuição da patogenicidade de uma estirpe de Listeria utilizada numa vacina, compreendendo a modificação da estirpe de Listeria de modo que seja deficiente em relação à internalina B.

Noutros aspectos, a divulgação proporciona métodos para a preparação de vacinas. Por exemplo, a invenção proporciona um método para a produção de uma vacina compreendendo o contacto de uma estirpe mutante de Listeria com uma célula apresentadora de antigénio sob condições adequadas e durante um tempo suficiente para carregar as células apresentadoras de antigénio, em que a estirpe mutante de Listeria é deficiente em relação à internalina B. 18 ΡΕ1592441

Além disso, a presente divulgação proporciona uma variedade de composições e estirpes úteis nos métodos acima mencionados, assim como para outras utilizações. Por exemplo, ainda noutro aspecto, a divulgação proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma estirpe mutante de Listeria e um veiculo farmaceuticamente aceitável, em que a estirpe mutante de Listeria é deficiente em relação à internalina B. Numa realização, o genoma da estirpe mutante compreende pelo menos uma mutação em inlB, ou num elemento que regula a sua expressão.

Noutro aspecto, a divulgação proporciona uma composição imunogénica compreendendo uma estirpe mutante de Listeria, em que a estirpe mutante de Listeria é deficiente em relação à internalina B, e compreende uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica para um antigénio.

Noutro aspecto, a divulgação proporciona uma vacina que compreende uma estirpe mutante de Listeria, em que a estirpe mutante de Listeria é deficiente relativamente à internalina B.

Ainda noutro aspecto, a divulgação proporciona uma célula apresentadora de antigénio profissional, tal como uma célula dendritica, compreendendo uma estirpe mutante de Listeria, em que a estirpe mutante de Listeria é deficiente em relação à internalina B. 19 ΡΕ1592441

Nalgumas realizações de cada um dos aspectos acima mencionados, o genoma da estirpe mutante de Listeria que é deficiente em relação à internalina B compreende pelo menos uma mutação no gene que codifica para a internalina B (inlB), e/ou num elemento que regula a sua expressão. Noutras realizações, inlB é deletada do genoma da estirpe mutante de Listeria.

Ainda noutras realizações de cada um dos aspectos acima mencionados, a estirpe mutante é deficiente em relação tanto à internalina B como a ActA. Nalgumas realizações, as estirpes mutantes compreendem pelo menos uma mutação tanto no gene inlB (e/ou um elemento que regula a expressão do gene inlB) como no gene actA (e/ou num elemento que regula a expressão do gene actA).

Num aspecto adicional, a divulgação proporciona uma estirpe de Listeria monocytogenes que é deficiente em relação tanto a uma internalina, tal como a internalina B, e ActA. Num aspecto, a invenção proporciona uma estirpe de Listeria monocytogenes que é deficiente tanto relativamente a internalina B como a ActA. Tanto o gene inlB como o gene actA foram deletados. A estirpe é o duplo mutante Listeria monocytogenes hactAAinlB (alternativamente denominado o duplo mutante Listeria monocytogenes actA~inlB~) depositado 20 ΡΕ1592441 na American Type Culture Collection (ATCC) a 3 de Outubro de 2003, e designado com o número de acesso PTA-5562. Noutra realização, a estirpe é um mutante da estirpe designada como PTA-5562, em que o mutante é atenuado para a entrada em células não fagociticas em relação à Listeria monocytogenes nativa. São também proporcionadas culturas, composições imunogénicas, e composições farmacêuticas, incluindo vacinas que compreendem qualquer uma das estirpes acima mencionadas. É também proporcionada a utilização destas estirpes particulares em qualquer um e em todos os métodos acima mencionados.

DESENHOS A Figura 1 apresenta populações celulares alvo após a injecção num ratinho vacinado com as estirpes de Listeria indicadas ou controlo com o veiculo. Niveis reduzidos de células alvo especificas para o antigénio em relação a células alvo não especificas indica citotoxicidade in vivo de células T em resposta à vacinação. A Figura IA apresenta citotoxicidade in vivo em ratinhos vacinados IV ou IM com o mutante AactA ou o duplo mutante AactAAinlB. A Figura 1B apresenta citotoxicidade in vivo em ratinhos vacinados IV com o mutante AactA ou o duplo mutante AactAAinlB. A Figura IC mostra a citotoxicidade in vivo em ratinhos vacinados por IV com o duplo mutante AactAAinlB. 21 ΡΕ1592441 A Figura 2 mostra os pulmões de ratinhos com tumores CT26 estabelecido administrados com uma vacinação com estirpes mutantes Listeria ou um controlo (Figura 2A). São visíveis metástases como pontos no pulmão. A sobrevivência dos ratinhos de dois estudos adicionais são representados nas Figuras 2B-C. A Figura 3 mostra os resultados de ensaios de Marcação intracelular de citocinas (ICS) com IFN-γ e TNF-a para células esplénicas T CD8+ de ratinhos vacinados com Listeria mutante, estimuladas com o péptido SL8 OVA257-264 (Figuras 3A-B) , o péptido LLO190 (Figuras 3C-D) , ou o péptido LLO296 (Figuras 3E-F). ("PCT" indica os dados para as células inactivadas S-59/UVA).

A Figura 4 mostra os resultados de testes ICS IFN-γ para células do baço de ratinhos vacinados (intravenosamente) com Listeria mutante, estimuladas com o péptido SL8 OVA257-264r células EL-4 vivas ou inactivadas com S-59/UVA, ou células EG7 que expressam OVA vivas ou inactivadas com S-59/UVA.

A Figura 5 mostra os resultados de testes ICS IFN-γ para células do baço de ratinhos vacinados (intravenosamente) com diferentes doses de Listeria mutante, estimuladas com o péptido SL8 OVA257-264.

A Figura 6 mostra os resultados de testes ICS 22 ΡΕ1592441 IFN-γ para células do baço de ratinhos vacinados por vias diferentes com Listeria mutante, estimuladas com o péptido SL8 OVA257-264·

As Figuras 7A e 7B mostram a eliminação acelerada da estirpe Listeria monocytogenes AactAAinlB in vivo. Apresentam-se na figura os teores de bactéria no figado ao longo do tempo.

As Figuras 8A e 8B mostram a eliminação acelerada da estirpe Listeria monocytogenes AactAAinlB in vivo. Apresentam-se na figura os teores de bactéria no baço ao longo do tempo. A Figura 9 mostra que a estirpe Listeria monocytogenes AinlB e a estirpe Listeria monocytogenes AactAAinlB são atenuadas relativamente à entrada em células não fagociticas, mas não células fagocíticas in vitro. A Figura 10 mostra que elevados teores de soro anti-Listeria inibe a absorção por células não fagociticas, mas não por células fagocíticas. A Figura 11A mostra a atenuação da estirpe Listeria (AactA) DP-L4029 contendo o antigénio OVA como função da concentração de psoraleno S-59 em conjunto com a medição da apresentação do antigénio OVA a uma linha celular dendrítica. Representa-se o logaritmo do teor de bactérias e a % de apresentação de antigénio em relação à 23 ΡΕ1592441 ausência de tratamento (escala linear, 1 Listeria por célula DC 2.4) em relação a nM de S-59 (doseado com 0,5 J/cm2 de UVA, Listeria lavada uma vez, dosado outra vez com 5.5 J/cm2 de UVA). A Figura 11B mostra a atenuação da estirpe de Listeria AuvzAB DP-L4029 contendo o antigénio OVA como função da concentração de psoraleno S-59 em conjunto com a medição da apresentação do antigénio OVA a uma linha celular dendritica. Representa-se o logaritmo do teor de bactérias e a % de apresentação de antigénio em relação à ausência de tratamento (escala linear, 1 Listeria por célula DC 2.4) em relação a nM de S-59 (doseado com 0,5 J/cm2 de UVA, Listeria lavada uma vez, dosado outra vez com 5.5 J/cm2 de UVA). A Figura 11C mostra a atenuação da estirpe de Listeria (AactA) DP-L4029 contendo o antigénio OVA como função da concentração de psoraleno S-59 em conjunto com a medição da apresentação do antigénio OVA a uma linha celular dendritica. A Figura 11D mostra a atenuação da estirpe de Listeria AuvrAB (AactAAuvrAB) DP-L4029 contendo o antigénio OVA como função da concentração de psoraleno S-59 em conjunto com a medição da apresentação do antigénio OVA a uma linha celular dendritica. A Figura 12A mostra a indução de uma resposta de ΡΕ1592441 - 24 - células T específica para OVA na presença de imunidade anti-Lis teria. A Figura 12B mostra que a resposta imunitária antitumoral eficaz é estimulada na presença de imunidade específica para Listeria. A Figura 12C mostra que a transferência do soro imunitário de Listeria não evita o desenvolvimento de células CD8+ específicas para OVA.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Introdução A presente divulgação proporciona Listeria atenuadas para a entrada em células não fagocíticas (por exemplo, estirpes mutantes de Listeria que são deficientes em relação a internalinas, tais como internalina B). Nalgumas realizações, as Listeria atenuadas são ainda atenuadas para disseminação celular. Nalgumas realizações, a toxicidade das Listeria recombinantes foram grandemente diminuídas pelas modificações realizadas na estirpe e, no entanto, a imunogenicidade da estirpe foi suficientemente retida. Assim, pela primeira vez, a imunogenicidade da Listeria atenuada foi suficientemente segregada da toxicidade de Listeria. A presente divulgação proporciona composições farmacêuticas, composições imunogénicas, e vacinas compreendendo as Listeria atenuadas, e a utilização 25 ΡΕ1592441 destas Listeria atenuadas e composições contendo Listeria para induzir respostas imunitárias, incluindo respostas imunitárias terapeuticamente eficazes num hospedeiro. As vacinas e métodos podem ser usados ou pela prevenção de doenças infecciosas causadas por Listeria ou para administrar um antigénio heterólogo, tal como um antigénio associado a tumor ou um antigénio derivado de um patogénio não Listeria.

Divulgam-se estirpes atenuadas de Listeria monocytogenes nas quais o gene inlB foi deletado (isto é, uma estirpe atenuada para entrada nas células não fagociticas, por exemplo, hepatócitos através do receptor c-met) ou tanto o gene actA e os genes inlB foram deletados (isto é, uma estirpe atenuada tanto para a entrada em células não fagociticas como para disseminação célula a célula. Também se determinou que a estirpe AactAAinlB era aproximadamente 1000 vezes menos virulenta do que a estirpe Listeria monocytogenes nativa (ver Exemplo 2 e Tabela 1, abaixo). A atenuação da estirpe de Listeria AactAAinlB e da estirpe Listeria AinlB para entrada em células humanas não fagociticas foi confirmada (Exemplo 9, abaixo, e Figura 9). A vacinação com estirpes Listeria AactAAinlB e AinlB que expressam antigénios heterólogos mostrou resultar na produção de células-T especificas para um antigénio (ver Exemplos 5-7, abaixo, e Figuras 3A, 3B, e 4-6). Além disso, verificou-se agora também que a vacinação com a estirpe Listeria AactAAinlB que expressa um antigénio heterólogo induz uma resposta citotóxica robusta eficaz a células alvo 26 ΡΕ1592441 específicas para o antigénio in vivo (ver Exemplo 3, abaixo, e Figura 1). Além disso, mostrou-se que a vacinação terapêutica com a estirpe Listeria AactAAinlB que expressa um antigénio heterólogo era eficaz na redução do número de metástases no pulmão e na aumenta das taxas de sobrevivência num modelo de cancro colorrectal de rato (ver Exemplo 4, abaixo, e Figuras 2A-C). Adicionalmente, mostrou-se que a eliminação de uma estirpe Listeria AactAAinlB do fígado e do baço era muito mais rápida do que aquela de Listeria nativa, da estirpe de Listeria AactA, ou da estirpe de Listeria AinlB (ver Exemplo 8, abaixo, e Figuras 7-8). Ou seja, a combinação das mutações por deleção actA e inlB em conjunto tem um efeito sinérgico, resultando numa rápida eliminação no fígado de animais aos quais se administraram elevadas doses IV de bactérias.

Deste modo, a presente divulgação proporciona uma bactéria Listeria atenuada para a entrada em células não fagocíticas (por exemplo, deficiente em relação a uma internalina, tal como a internalina B) e que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um antigénio que não é de Listeria. Nalgumas realizações, a bactéria é ainda atenuada para disseminação celular (por exemplo, é deficiente relativamente a ActA). Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada pertence à espécie Listeria monocytogenes. Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada é uma estirpe Listeria mutante. É também proporcionada uma composição imunogénica compreendendo a bactéria Listeria, uma vez que é uma vacina compreendendo 27 ΡΕ1592441 tanto a bactéria e um veiculo e/ou um adjuvante farmaceuticamente aceitável. Além disso, são também proporcionados os métodos para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio que não é de Listeria compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo a bactéria Listeria atenuada e métodos de prevenção ou tratamento de uma doença num hospedeiro (tal como cancro ou uma doença infecciosa) , compreendendo a administração a um hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo a bactéria Listeria atenuada. Proporciona-se também uma célula apresentadora de antigénio profissional compreendendo a bactéria Listeria atenuada.

Proporciona-se uma bactéria Listeria que é atenuada tanto para a entrada em células não fagociticas (por exemplo, é deficiente em relação a uma internalina, tal como internalina B) e para a disseminação célula a célula (por exemplo, é deficiente relativamente a ActA). Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada é uma estirpe mutante de Listeria. Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada compreende pelo menos uma mutação (tal como uma mutação de deleção) em ambos os genes inlB e actA. Nalgumas realizações, a Listeria atenuada é a estirpe de Listeria monocytogenes AactAAinlB depositada na American Type Culture Collection (ATCC) e identificada pelo número de acesso PTA-5562, ou um mutante da estirpe depositada que é deficiente tanto relativamente à internalina B e ActA. Nalgumas realizações a bactéria 28 ΡΕ1592441

Listeria atenuada compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio que não é de Listeria. Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada pertence à espécie Listeria monocytogenes. Uma composição imunogé-nica compreendendo à Listeria atenuada é também proporcionada, como uma vacina compreendendo tanto a Listeria atenuada e um veiculo e/ou um adjuvante farmaceuticamente aceitável. Além disso, proporcionam-se os métodos para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio que não é de Listeria compreendendo a administração a um hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo a bactéria Listeria atenuada. São também proporcionados métodos para a prevenção ou o tratamento de uma doença num hospedeiro (tal como cancro, Listeriose, ou uma doença causada por um patogénio que não é Listeria), compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo a bactéria de Listeria atenuada. É também proporcionada uma célula apresentadora de antigénio profissional compreendendo uma bactéria Listeria atenuada. A divulgação proporciona ainda uma vacina compreendendo (a) uma bactéria Listeria, em que a bactéria Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas, e (b) um veiculo e/ou um adjuvante farmaceuti-camente aceitável. Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada é deficiente relativamente à internalina B. Nalgumas realizações, a bactéria atenuada Listeria na vacina pertence à espécie Listeria monocytogenes. Nalgumas 29 ΡΕ1592441 realizações, a bactéria Listeria atenuada é uma estirpe Listeria mutante. Proporcionam-se os métodos para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio que não é de Listeria compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz da vacina. Proporcionam-se também métodos para a prevenção ou o tratamento de uma doença num hospedeiro, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma vacina.

Além disso, a divulgação proporciona uma célula apresentadora de antigénio profissional compreendendo uma bactéria Listeria, em que a bactéria Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas (por exemplo, é deficiente em relação à internalina, tais como a internalina B) . Nalgumas realizações, a bactéria é ainda atenuada relativamente à disseminação célula a célula (por exemplo, é deficiente relativamente ao ActA). Nalgumas realizações, a bactéria atenuada Listeria na célula apresentadora de antigénio profissional é uma estirpe Listeria mutante. Nalgumas realizações, a bactéria Listeria pertence à espécie Listeria monocytogenes. A divulgação também proporciona um método para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma célula apresentadora de antigénio, em que a bactéria Listeria atenuada compreende um ácido nucleico que codifica para um antigénio. Ainda noutro aspecto, a divulgação proporciona um método para a prevenção ou para o tratamento de uma doença num hospedeiro, compreendendo a administração 30 ΡΕ1592441 ao hospedeiro de uma quantidade eficaz da célula apresentadora de antigénio profissional. A divulgação proporciona também um método para a indução da apresentação de um antigénio MHC de classe I ou para a apresentação de um antigénio MHC de classe II numa célula apresentadora de antigénio (seja in vivo ou in vitro), compreendendo o contacto de uma bactéria Listeria atenuada com uma célula apresentadora de antigénio, em que a bactéria de Listeria atenuada é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio que não é de Listeria compreendendo um epitopo MHC de classe I ou um epitopo MHC de classe II.

Adicionalmente, a divulgação proporciona um método para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio, compreendendo os seguintes passos: (a) contacta-se uma bactéria Listeria atenuada com uma célula apresentadora de antigénio do hospedeiro, em que a bactéria Listeria atenuada é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para o antigénio; e (b) administra-se a célula apresentadora de antigénio ao hospedeiro. A divulgação também proporciona um método para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio compreendendo a administração ao hospedeiro de 31 ΡΕ1592441 uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo uma estirpe mutante de Listeria, em que a estirpe mutante de Listeria é atenuada relativamente à entrada nas células não fagociticas em relação a uma estirpe não mutante de Listeria, mas retém a capacidade de entrar em células fagociticas, e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para o antigénio. No interior do hospedeiro, o antigénio é expresso pela Listeria mutante num modo que induz uma resposta imunitária. A presente divulgação proporciona um método para a prevenção ou o tratamento de uma doença (tal como cancro) num hospedeiro, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma vacina compreendendo uma estirpe mutante de Listeria, em que a estirpe mutante de Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas em relação a uma estipe de Listeria não mutante, mas retém uma capacidade de entrar em células fagociticas. A divulgação proporciona também um método para a indução da apresentação de um antigénio MHC de classe I ou da apresentação de um antigénio MCH de classe II ou uma célula apresentadora de antigénio compreendendo o contacto de uma estirpe de Listeria mutante com uma célula apresentadora de antigénio, em que a estirpe mutante de Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas em relação a uma estirpe não mutante de Listeria, mas retém uma capacidade de entrar em células fagociticas, e compreende uma molécula de ácido nucleico 32 ΡΕ1592441 heteróloga que codifica para um antigénio compreendendo, respectivamente, um epitopo MHC de classe I ou um epitopo MHC de classe II.

Além disso, a divulgação proporciona um método para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio compreendendo, os seguintes passos: (a) contactar a estirpe mutante de Listeria com uma célula apresentadora de antigénio do hospedeiro, sob condições adequadas e durante um tempo suficiente para carregar as células apresentadoras de antigénio, em que estirpe mutante de Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas em relação a uma estirpe não mutante de Listeria, mas retém uma capacidade para entrar em células fagociticas, e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio; e (b) administração da célula apresentadora de antigénio ao hospedeiro. Numa realização, o antigénio é um antigénio associado a um tumor ou é derivado de um antigénio associado a um tumor. A divulgação também proporciona um método para a indução de uma resposta imunitária a um antigénio num hospedeiro compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo uma estirpe mutante de Listeria, em que a estirpe mutante de Listeria é deficiente em relação à internalina B, e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para o antigénio. No hospedeiro, o antigénio é expresso pela Listeria mutante de um modo que induz uma resposta imunitária. 33 ΡΕ1592441 A presente divulgação também proporciona um método para a prevenção ou o tratamento de doença (tal como cancro) num hospedeiro, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma vacina compreendendo uma estirpe mutante de Listeria, em que a estirpe mutante de Listeria é deficiente em relação à internalina B. A divulgação proporciona ainda um método para a indução da apresentação do antigénio MHC de classe I ou da apresentação do antigénio MHC de classe II compreendendo o contacto de uma estirpe mutante de Listeria com uma célula apresentadora de antigénio, em que a estirpe mutante de Listeria é deficiente relativamente a internalina B e compreende uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica para um antigénio compreendendo, respectivamente, um epitopo MHC de classe I ou um epitopo MHC de classe II.

Além disso, a divulgação proporciona um método para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio compreendendo os seguintes passos: (a) contacta-se uma bactéria Listeria com uma célula apresentadora de antigénio do hospedeiro, sob condições e durante um tempo suficiente para carregar as células apresentadoras de antigénio, em que a bactéria Listeria mutante é deficiente relativamente a internalina B, e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para o antigénio; e (b) administra-se a célula apresentadora de antigénio ao hospedeiro. 34 ΡΕ1592441 A presente divulgação também proporciona composições farmacêuticas, composições imunogénicas, e vacinas compreendendo uma estirpe mutante de Listeria que é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas em relação a uma estirpe não mutante, mas retém uma capacidade de entrar células fagociticas. Nalgumas realizações, as estirpes mutantes de Listeria são deficientes em relação a uma ou mais invasinas, tais como internalina B. Por exemplo, nalgumas realizações, a estirpe mutante de Listeria é uma estirpe mutante de Listeria monocytogenes que compreende uma mutação num ou mais genes que codificam para uma proteína (tal como a internalina B) , e/ou num elemento que regula a expressão de uma proteína internalina (tal como o gene inlB) . Nalgumas realizações, as estirpes deficientes relativamente a uma proteína internalina, tal como a internalina B, são também deficientes em relação a uma segunda proteína de Listeria, tal como ActA. A divulgação proporciona ainda novas estirpes de Listeria monocytogenes que são deficientes em relação tanto à internalina B e ActA. Por exemplo, nalgumas realizações o gene inlB e o gene actA foram deletados. Numa realização, a estirpe é o mutante duplo Listeria monocytogenes LactALinlB depositado na American Type Culture Collection (ATCC) a 3 de Outubro, 2003, e designada com o número de acesso PTA-5562. 35 ΡΕ1592441 II. Listeria Atenuada A Listeria atenuada da presente invenção foi desenvolvida para permitir a expressão e a administração de um ou mais antigénios para os fagolisossomas e/ou citossol de células apresentadoras de antigénio profissionais (APCs), tais como macrófagos, neutrófilos e células dendriticas, reduzindo em simultâneo a entrada das bactérias em não APCs, tais como as células de órgãos e sistemas não imunitários. Deste modo, a bactéria Listeria utilizada nas composições, vacinas e métodos da divulgação é atenuada para entrada em células não fagociticas, em relação a Listeria sem as modificações atenuantes relevantes, tais como Listeria nativa.

Tal como aqui utilizados, os termos "bactéria Listeria atenuada" e "bactéria Listeria modificada" (ou "Listeria atenuada" e "Listeria modificada") são aqui utilizados de forma equivalente para referir uma bactéria Listeria (ou Listeria) que é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas em relação a Listeria nativa. Deve entender-se que a Listeria atenuada (isto é, Listeria modificada) aqui descrita são ou Listeria que não ocorrem naturalmente ou Listeria que ocorrem naturalmente, mas que foram agora isoladas e/ou que se descobriram agora numa forma na qual não existem na natureza. Tal como aqui utilizados, os termos "bactéria Listeria não atenuada" e "bactéria Listeria não modificada" (ou "Listeria não atenuada" ou "Listeria não modificada") são termos 36 ΡΕ1592441 aparentados aqui utilizados de forma equivalente para se referirem à bactéria Listeria (ou Listeria) que não compreende uma modificação particular que atenua outra bactéria Listeria ou Listeria para a entrada em células não fagociticas em relação a Listeria nativa. Deste modo, um exemplo de uma Listeria não modificada é Listeria nativa.

Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada é um membro de uma estirpe mutante de Listeria, em que mutações no genoma da estirpe mutante de Listeria tornam a Listeria atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas. Nalgumas realizações, a bactéria Listeria foi modificada através de outros meios para além de, ou adicionalmente a mutação, de modo que a bactéria Listeria seja atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas (por exemplo, através de ligação de anticorpos a Listeria).

Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada é não só atenuada para entrada em células não fagociticas, em relação a Listeria não modificada, tal como Listeria nativa, mas a bactéria Listeria atenuada é também atenuada relativamente a disseminação célula a célula, relativamente à Listeria não modificada. Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada pertence a uma estirpe de Listeria mutante que compreende uma ou mais mutações genómicas que tornam a Listeria atenuada para disseminação célula a célula. Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada foi modificada por outros meios para além de, ou adicionalmente a mutação, de modo que a 37 ΡΕ1592441 bactéria Listeria seja atenuada relativamente à disseminação célula a célula (por exemplo, através de tratamento S-59/UVA). A bactéria atenuada pertence ao género Listeria. Nalgumas realizações, a Listeria atenuada pertence a uma espécie seleccionada do grupo que consiste em Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Listeria seeligeri, ou Listeria innocua. Além disso, a invenção contempla a mutação de estirpes de uma variedade de espécies Listeria (por exemplo, uma estirpe que normalmente expressa internalina B, ou o seu equivalente) , especialmente em que aquelas bactérias são normalmente patogénicas e/ou utilizam invasinas para invadir células eucarióticas não fagociticas. Numa realização, a estirpe de Listeria que é mutada é uma estirpe patogénica de Listeria. Noutra realização, a estirpe de Listeria que é mutada produz pelo menos uma invasina. Noutra realização, a estirpe é Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Listeria seeligeri, ou Listeria innocua. Noutra realização, a estirpe mutante de Listeria é uma estirpe mutante de Listeria monocytogenes. A presente divulgação proporciona ainda culturas da Listeria atenuada aqui descrita, tais como culturas de estirpes mutantes. A. Atenuação relativamente à entrada em células não fagociticas

Geralmente, a bactéria Listeria atenuada da 38 ΡΕ1592441 presente divulgação é uma bactéria Listeria compreendendo uma ou mais modificações de tal modo que é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas ("bactéria Listeria modificada" ou "bactéria Listeria atenuada") relativamente à mesma bactéria Listeria sem a ou as modificações que tornam a bactéria atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas ("bactéria Listeria não modificada" ou "bactéria Listeria não atenuada") . A bactéria Listeria que é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas é menos capaz de infectar pelo menos um tipo de célula não fagocitica do ambiente extracelular da célula não fagocitica do que a Listeria nativa da mesma espécie. Nalgumas realizações, a capacidade da bactéria Listeria em entrar em células não fagociticas é reduzida em pelo menos 10%, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, ou pelo menos 90%, em relação a Listeria nativa. Nalgumas realizações, a capacidade da bactéria Listeria atenuada em entrar células não fagociticas é reduzida em pelo menos 50% em relação a Listeria nativa da mesma espécie. Noutras realizações, a capacidade da bactéria Listeria atenuada em entrar em células não fagociticas é reduzida em pelo menos 75%.

Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada pertence a uma estirpe mutante de Listeria que compreende uma ou mais mutações no seu genoma que causam a atenuação da estirpe relativamente à entrada em células não fagociticas (estirpe de Listeria "mutante") em relação à mesma estirpe Listeria sem a uma ou mais mutações (estirpe 39 ΡΕ1592441 de Listeria "não mutante"). A capacidade da estirpe Liste-ria atenuada em entrar em células não fagociticas pode ser reduzida em pelo menos 10%, em pelo menos 25%, em pelo menos 50%, em pelo menos 75%, ou em pelo menos 90%, relativamente à estirpe Listeria não modificada (não mutante).

Entende-se que a Listeria atenuada, tal como uma estirpe Listeria mutante, não necessita necessariamente de ser atenuada relativamente à entrada de mais do que um tipo de célula não fagocitica. Por exemplo, a estirpe atenuada pode ser atenuada relativamente à entrada em hepatócitos, mas não atenuada relativamente à entrada em células epiteliais. Como outro exemplo, a estirpe atenuada pode ser atenuada relativamente à entrada em células epiteliais, mas não atenuada relativamente à entrada em hepatócitos. Também se entende que a atenuação para entrada numa célula não fagocitica de uma Listeria modificada particular é um resultado da mutação de um gene designado, por exemplo uma mutação de deleção, que codifica para uma proteína invasina que interagem com um receptor celular particular, e como resultado facilita a infecção de uma célula não fagocitica. Por exemplo, as estirpes mutantes Listeria hinlB são atenuadas relativamente à entrada em células não fagocí-ticas que expressam o receptor do factor de crescimento de hepatócitos (c-met), incluindo linhas celulares de hepatócitos (por exemplo, HepG2), e hepatócitos humanos primários .

Nalgumas realizações, apesar da bactéria Listeria 40 ΡΕ1592441 (por exemplo, a Listeria mutante) ser atenuada relativamente à entrada em células não fagocíticas, as Listeria são ainda capazes de ser absorvidas pelas células fagociticas, tais como pelo menos células dendriticas e/ou macrófagos. Numa realização a capacidade da estirpe Listeria atenuada em entrar em células fagociticas não é reduzida pela modificação realizada na estirpe, tal como uma mutação de uma invasina (isto é, aproximadamente 90% ou mais da capacidade medida da estirpe de ser absorvida por células fagociticas é mantida após a modificação) . Noutras realizações, a capacidade da Listeria atenuada em entrar nas células fagociticas é diminuída em não mais de 10%, em não mais de 25%, em não mais de 50%, ou em não mais de 75%.

Ensaios in vitro para a determinação se uma bactéria Listeria (por exemplo uma estirpe mutante de Listeria) é ou não atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas são conhecidos pelos competentes na técnica. Por exemplo, tanto Dramsi et al., Molecular Microbiology 16:251-261 (1995) como Gaillard et al. , Cell 65:1127-1141 (1991) descrevem ensaios para o rastreio da capacidade de estirpes mutantes de L. monocytogenes entrarem em certas linhas celulares. Por exemplo, para determinar se uma bactéria Listeria com uma modificação particular é atenuada relativamente à entrada num tipo particular de células não fagociticas, a capacidade da bactéria Listeria atenuada entrar num tipo particular de células não fagocitica é determinada e comparada com a capacidade da bactéria de Listeria idêntica sem a 41 ΡΕ1592441 modificação em entrar em células não fagociticas. Igualmente, para determinar se uma estirpe Listeria com uma mutação particular é atenuada relativamente à entrada num tipo particular de células não fagociticas, a capacidade da bactéria Listeria mutante entrar num tipo particular de células não fagocitica é determinada e comparada com a capacidade da bactéria de Listeria idêntica sem a mutação em entrar em células não fagociticas.

Nalgumas realizações da divulgação, a quantidade de atenuação na capacidade da bactéria Listeria entrar em células não fagociticas situa-se na gama de uma redução para metade até niveis muito mais elevados de atenuação. Nalgumas realizações, a atenuação na capacidade de Listeria para entrar em células não fagociticas é pelo menos de 0,3 log, cerca de 1 log, cerca de 2 log, cerca de 3 log, cerca de 4 log, cerca de 5 log, ou pelo menos cerca de 6 log. Nalgumas realizações a atenuação situa-se na gama de cerca de 0,3 a >8 log, cerca de 2 a >8 log, cerca de 4 a >8 log, cerca de 6 a >8 log, cerca de 0,3-8 log, também cerca de 0,3-7 log, também cerca de 0,3-6 log, também cerca de 0,3-5 log, também cerca de 0,3-4 log, também cerca de 0,3-3 log, também cerca de 0,3-2 log, também cerca de 0,3-1 log. Nalgumas realizações, a atenuação situa-se na gama de cerca de 1 to >8 log, 1-7 log, 1-6 log, também cerca de 2-6 log, também cerca de 2-5 log, também cerca de 3-5 log.

Nalgumas realizações, a atenuação da Listeria da presente invenção pode ser medida em termos dos efeitos 42 ΡΕ1592441 biológicos da Listeria num hospedeiro. A patogenicidade da uma estirpe de Listeria pode ser avaliada pela medição da DL5o em ratinhos ou noutros vertebrados (Exemplo 2, Tabela 1) . A DL5o é a quantidade, ou dose, de Listeria injectada nos vertebrados necessária para causar a morte em 50% dos vertebrados. Os valores de DL5o podem ser comparados para Listeria com uma modificação particular (por exemplo, mutação) em comparação com Listeria sem a modificação particular como medição do nível de atenuação. Por exemplo, se a estirpe de Listeria sem uma mutação particular tem uma DL50 de 103 bactérias e a estirpe de Listeria com a mutação particular tem uma DL50 de 105 bactérias, a estirpe foi atenuada de modo que a sua DO50 é aumentada 100 vezes ou por 2 log.

Alternativamente, o grau de atenuação da capacidade de uma bactéria Listeria em infectar células não fagocíticas pode ser avaliado muito mais directamente in vitro. A capacidade de uma bactéria Listeria modificada em infectar células não fagocíticas, tais como hepatócitos, pode ser comparada com a capacidade de uma Listeria não modificada ou Listeria nativa em infectar células fagocíticas. Num ensaio deste tipo, as Listeria modificada e não modificada são tipicamente adicionadas às células não fagocíticas in vitro durante um período de tempo limitado (por exemplo, uma hora), as células são então lavadas com uma solução contendo gentamicina, para matar quaisquer bactérias extracelulares, as células são lisadas e depois plaqueadas para avaliar o seu título. Exemplos de tal 43 ΡΕ1592441 ensaio são proporcionados no Exemplo 9 e no Exemplo 10, abaixo. 0 grau de atenuação pode também ser medido quantitativamente por outros efeitos biológicos, tais como o grau de uma patologia num tecido ou niveis de enzimas do figado no soro. Determinam-se os niveis de alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), albumina e bilirrubina no soro num laboratório clinico em ratos injectados com Listeria da presente invenção. As comparações destes efeitos em ratinhos ou outros vertebrados podem ser realizadas para Listeria com e sem modificações/mutações particulares para avaliar a atenuação da Listeria. A atenuação da Listeria relativamente à presente invenção pode ser também medida por patologia dos tecidos. A quantidade de Listeria que pode ser recuperada de vários tecidos num vertebrado infectado, tal como o figado, o baço e o sistema nervoso, pode também ser usada como medida do nivel de atenuação por intermédio da comparação destes valores em vertebrados injectados com uma Listeria mutante versus não-mutante. Por exemplo, a quantidade de Listeria que pode ser recuperada de tecidos infectados tais como o figado ou o baço como função do tempo pode ser usada como uma medida da atenuação através da comparação destes valores em ratinhos injectados com Listeria mutante vs. não-mutante.

Deste modo, a atenuação da Listeria da presente invenção pode ser medida em termos de carga bacteriana em 44 ΡΕ1592441 órgãos seleccionados particulares em ratinhos que se sabe serem alvos da Listeria nativa. Por exemplo, a atenuação da Listeria da presente invenção pode ser medida através da contagem das colónias (Unidades Formadoras de Colónia; UFC) que se formam após o plaqueamento de diluições de homogenatos de fígado ou baço (homogeneizado em H20 + 0,2% NP40) em meio de agar BHI. As ufc de fígado ou baço podem ser medidas, por exemplo, ao longo de um período de tempo após a administração da Listeria modificada da presente invenção através de qualquer número de vias, incluindo intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, e subcutânea (ver, por exemplo, Exemplo 8, abaixo). Adicionalmente, a Listeria da presente invenção pode ser medida e comparada com uma Listeria nativa, resistente a fármacos (ou qualquer outra estirpe de Listeria seleccionada) no fígado ou no baço (ou qualquer outro órgão seleccionado) ao longo de um período de tempo após a administração através do ensaio do índice competitivo, tal como descrito. O grau de atenuação na absorção das bactérias envolvidas nas vacinas por células não fagocíticas não necessita de ser uma atenuação absoluta de modo a proporcionar uma vacina segura e eficaz. Nalgumas realizações, o grau de atenuação é um que proporcione uma redução na toxicidade suficiente para prevenir ou reduzir os sintomas de toxicidade a níveis que não são perigosos para a vida. 1. Mutações compreendendo Listeria que atenuam a Listeria relativamente à entrada em células não fagocíticas 45 ΡΕ1592441

Nalgumas realizações, a Listeria atenuada compreende uma ou mais mutações para tornar a Listeria deficiente relativamente a uma ou mais invasina (alternativamente denominada uma proteina de invasão) normalmente produzida pela Listeria, tal como uma internalina. Nalgumas realizações da invenção, a atenuação na capacidade da Listeria atenuada para entrar em células não fagociticas é conseguida através da utilização de mutações que afectam uma ou mais invasinas expressas pela bactéria. Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada é um membro de uma estirpe mutante de Listeria que é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas.

Numa realização, as Listeria atenuadas são deficientes na produção de uma ou mais invasinas. Uma bactéria Listeria atenuada é deficiente em relação à produção de uma invasina se a bactéria ou produz quantidades inferiores de uma versão funcional da invasina ou expressa uma versão da invasina que é parcialmente ou totalmente não funcional, ou ambos. Do mesmo modo, uma bactéria Listeria é deficiente em relação à produção de uma invasina se a bactéria da estirpe ou produz quantidades inferiores de uma versão funcional da invasina ou expressa uma versão da invasina que é parcialmente ou totalmente não funcional, ou ambos.

Nalgumas realizações, o genoma da Listeria atenuada compreende uma ou mais mutações num gene que 46 ΡΕ1592441 codifica para uma invasina, tal como uma internalina. A mutação é opcionalmente um ponto de mutação, uma mutação de inserção, uma terminação, uma mutação por deslocação da grelha de leitura, ou uma deleção de parte ou da totalidade do gene que codifica para a invasina. Nalgumas realizações, o gene que codifica para a invasina (por exemplo, inlB) é deletado.

Nalgumas realizações, a mutação do gene que codifica para a invasina situa-se na sequência codificante. Nestas realizações, a mutação do gene que codifica para a invasina torna a proteina menos funcional como uma invasina do que a sequência não mutada. Nalgumas realizações, a mutação do gene que codifica para a invasina torna a proteina totalmente não funcional.

Em realizações alternativas, a expressão de pelo menos um gene que codifica para uma invasina na estirpe mutante é inibida em relação a uma estirpe não mutante. Por exemplo, o genoma da Listeria mutante pode compreender pelo menos uma mutação um gene que codifica para uma invasina, em que a mutação limita a expressão. Por exemplo, a mutação pode estar numa ou mais sequências de controlo (tais como o promotor ou a região de ligação do ribossoma) dos genes, de tal modo que a expressão do gene da invasina é diminuída ou eliminada. Alternativamente, a Listeria mutante pode compreender pelo menos uma mutação num gene diferente de um que codifique para a invasina, mas que no entanto resulta numa diminuição dos níveis de expressão de uma ou mais invasinas. 47 ΡΕ1592441

As invasinas são proteínas expressas por Listeria que interagem com receptores expressos por células hospedeiras seleccionadas, e como resultado ajudam a facilitar a penetração de Listeria para o interior das células hospedeiras. Algumas invasinas encontram-se na parede celular de Listeria. Outras invasinas são secretadas por Listeria. As invasinas de Listeria incluem, mas não se limitam a, membros da família de proteínas relacionada com internalina ("internalinas") . As proteínas internalina dirigem directamente a absorção de Listeria por células não fagocíticas, tais como células do fígado, do baço ou do cérebro. (www.sciencemag.org/cgi/

Foram identificadas diversas internalinas em L. monocytogenes (Boland, et al., Clinicai Microbiology Reviews, 2001, 14: 584-640). Estas internalinas incluem, mas não se limitam a, InlA, InlB, InlC, InlC2, InlD, InlE, InlF, InlG, e InlH (Dramsi, et al., Infection and Immunity, 65: 1615-1625 (1997); Raffelsbauer et al., Mol. Gen. Genet. 260: 144-158 (1988)). As sequências de genes que codificam para estas proteínas foram anteriormente reportados. Por exemplo, as sequências de tanto inlA como inlB foram reportadas em Gaillard et al., Cell, 65:1127-1141 (1991) e no número de acesso M67471 do GenBank. Os genes que codificam para membros adicionais da família de proteínas relacionada com internalinas são identificados na Web Table 2 do material suplementar na internet de Glaser et al., Science, 294:849-852 (2001), 48 ΡΕ1592441 content/full/294/5543/849/DCl), incluindo lmo0327, lmo0331, lmo0514, ImoO 610, lmo0732, lmoll36, lmol289, lmo2396, lmo0171, lmo0333, lmo0801, lmol290, lmo2026, e lmo2821. (As sequências de cada membro da família de proteínas relacionada com a internalina podem ser encontradas no genoma da estirpe EGD de L. monocytogenes, número de Acesso do GenBank AL591824, e/ou no genoma da estirpe EGD-e de L. monocytogenes, número de Acesso do GenBank NC_003210. São indicadas localizações dos vários genes relacionados com a internalina em Glaser et al.)

Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada é deficiente relativamente a uma internalina tal como uma ou mais proteínas internalina listadas acima ou codificadas por um gene de internalina listado acima. Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada é deficiente em relação à internalina B, ou o seu equivalente (dependendo da espécie de Listeria utilizada). Noutras realizações, a bactéria de Listeria atenuada é deficiente em relação à internalina A, ou ao seu equivalente (dependendo da espécie de Listeria utilizada). Noutras realizações, a bactéria de Listeria é deficiente em relação a uma ou mais internalinas para além da internalina A, ou o seu equivalente (dependendo da espécie de Listeria utilizada).

Por exemplo, a estripe de Listeria mutante é opcionalmente uma estirpe de L. monocytogenes que foi modificada para ser deficiente na produção de internalina B funcional. Ainda noutra realização, a L. monocytogenes foi 49 ΡΕ1592441 modificada para ser deficiente na produção de uma internalina diferente da internalina A (InlA). (Entende-se que as proteínas que são equivalentes funcionais das internalinas acima listadas, incluindo a internalina B, podem estar presentes em espécies de Listeria diferentes da Listeria monocytogenes. Deste modo, nalgumas realizações, a estirpe mutante de Listeria foi modificada para ser deficiente relativamente à produção de uma proteína que é funcionalmente equivalente à internalina B).

As estirpes mutantes de Listeria podem expressar menos da sequência de internalina nativa que as estirpes de Listeria não mutantes. Alternativamente, a Listeria mutante pode expressar uma forma mutada de internalina que não é funcional ou que é menos funcional do que aquela expressa por Listeria não mutada. Ainda noutra realização, a Listeria mutante não expressa de todo uma internalina particular, tal como internalina B, uma vez que a maioria ou a totalidade do gene ou da sequência que codifica para a internalina foi deletada.

Numa realização o genoma da Listeria mutante compreende uma mutação de atenuação num ou mais genes de internalina(incluindo, mas não necessariamente limitados aos listados acima). Numa realização, o genoma da Listeria mutante que é atenuada relativamente à entrada em células não fagocíticas compreende pelo menos uma mutação num gene seleccionado do grupo que consiste no gene inlA, no gene inlB, no gene inlC, no gene inlC2, no gene inlD, no gene 50 ΡΕ1592441 inlE, no gene inlF, no gene inlG, e no gene inlH. Noutra realização, o genoma da mutante Listeria compreende pelo menos uma mutação num gene seleccionado do grupo que consiste no gene inlB, no gene inlC, no gene inlC2, no gene inlD, no gene inlE, no gene inlF, no gene inlG, e no gene inlH. Numa realização a Listeria mutante é uma Listeria monocytogenes mutante que é deficiente relativamente à internalina B. Ainda noutra realização, a Listeria mutante é uma Listeria monocytogenes mutante e o seu genoma compreende pelo menos uma mutação no gene inlB. Noutra realização a Listeria mutante compreende pelo menos uma mutação num gene da internalina diferente do gene inlA. Noutra realização, a Listeria mutante compreende pelo menos uma mutação no gene inlA.

Ao longo desta divulgação (incluindo as figuras), utiliza-se terminologia alternativa para referir as mutações genéticas, quer sejam mutações que atenuam a Listeria para entrada em células não fagociticas ou outras mutações (tais como mutações de disseminação célula a célula). Os termos "xyz", "Axyz" e "mutante de deleção xyz" são aqui utilizados intermutavelmente para referir mutantes de deleção nos quais pelo menos a maior parte ou a totalidade da sequência codificante do gene xyz. (Em muitos casos, a totalidade do gene xyz foi deletada daqueles mutantes). Por exemplo, os termos "inlB" e "AinlB" e "mutante de deleção inlB" são aqui geralmente utilizados intermutavelmente. 51 ΡΕ1592441

InlA (internalina A) (Gaillard et al., Cell, 65:1127-1141 (1991); número de acesso Genbank NC_003210) dirige a absorção de Listeria por células epiteliais tais como aquelas dos intestinos. A atenuação de Listeria tornando a estirpe deficiente relativamente à internalina A pode melhorar a segurança da utilização das vacinas em composições farmacêuticas e de vacina. A invasão das células epiteliais intestinais por Listeria pode resultar numa infecção gastrointestinal de Listeria caracterizada pro febre, dor de cabeça, diarreia ou náusea.

InlB (internalina B) (Gaillard et al., Cell, 65:1127-1141 (1991); número de acesso Genbank AL591975 (Listeria monocytogenes estirpe EGD, genoma completo, segmento 3/12, região do gene inlB: nts. 97008-98963); e número de acesso NC_003210 (Listeria monocytogenes estirpe EGD, genoma completo, região do gene inlB: nts. 457008-458963), cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade) dirige a absorção de Listeria por hepatócitos ou por células endoteliais tais como células endoteliais vasculares da microvasculatura do cérebro que compreende a barreira cerebral do sangue (Para mais descrições da internalina B, ver Ireton, et al., J. of Biological Chemistry, 274: 17025-17032 (1999); Dramsi, et al., Molecular Microbiology 16:251-261 (1995); Mansell et al., J. of Biological Chemistry, 276: 43597-43603 (2001); e Bierne et al., j. of Cell Science 115:3357-3367 (2002), todos os quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade). A atenuação de Listeria tornando a estirpe 52 ΡΕ1592441 deficiente relativamente à internalina B pode melhorar a segurança de utilização de estirpes em composições farmacêuticas e de vacina. A infecção de células endoteliais microvasculares do cérebro pode resultar em meningoence-falite, que se caracteriza por dores de cabeça, um pescoço rigido, perda de equilíbrio, confusão, obnubilação, convulsões, ou morte. A meningite é a causa principal de morte por Listeria entre adultos.

Nalgumas realizações, a estirpe mutante de Listeria é uma estirpe de Listeria que compreende uma ou mais mutações no seu genoma que causam uma deficiência da estirpe relativamente à internalina B em relação à estirpe Listeria sem a uma ou mais mutações. A estirpe de Listeria é deficiente em relação à produção de internalina B se a bactéria da estirpe ou produz quantidades inferiores e uma versão funcional da internalina B ou expressa uma versão da internalina B que é parcialmente ou totalmente não funcional, ou ambos. (Entende-se que o termo "internalina B" tal como aqui utilizado refere-se não apenas à internalina B de Listeria monocytogenes, mas também a seus equivalentes em Listeria de outras espécies).

Nalgumas realizações, o genoma de Listeria compreende uma ou mais mutações num gene que codifica para a internalina B (inlB) . A mutação é opcionalmente uma mutação pontual, uma mutação de inserção, uma mutação de terminação, uma mutação de deslocamento da grelha de leitura, ou uma deleção de parte ou da totalidade do gene 53 ΡΕ1592441 que codifica para a internalina B. Nalgumas realizações, a totalidade ou pelo menos a maioria da sequência que codifica para a internalina B é deletada do genoma da Listeria. Nalgumas realizações, a maioria ou a totalidade do gene inlB é deletado. Nalgumas realizações, não é produzida qualquer internalina B funcional pela Listeria atenuada.

Nalgumas realizações, a mutação de inlB situa-se na sequência codificante. Nestas realizações, a mutação de inlB torna a internalina B menos funcional do que a proteina produzida a partir da sequência inlB não mutada. Nalgumas realizações, a mutação de inlB torna a internalina B inteiramente não funcional (cerca de 100% menos funcional do que a Listeria não mutante). Nalgumas realizações, a internalina B expressa pela Listeria mutante é pelo menos 90% menos funcional, pelo menos cerca de 75% menos funcional, pelo menos cerca de 50% menos funcional, ou pelo menos cerca de 25% menos funcional do que a internalina B da Listeria não mutante.

Em realizações alternativas, a expressão de inlB na estirpe mutante é inibida em relação a uma estirpe não mutante. Por exemplo, o genoma da Listeria mutante pode compreender pelo menos uma mutação em inlB, em que a mutação limita a expressão. Por exemplo, a mutação pode estar em ou uma ou mais das sequências de controlo (tais como o promotor ou a região de ligação ribossomal) de inlB, de modo que a expressão de inlB seja diminuída ou 54 ΡΕ1592441 eliminada. Alternativamente, a Listeria mutante pode compreender pelo menos uma mutação num gene diferente de inlB, mas que no entanto resulta numa diminuição dos níveis de expressão da internalina B. Nalgumas realizações, a expressão da internalina B pode ser reduzida em pelo menos 100%, em pelo menos 90%, em pelo menos 75%, em pelo menos 50%, ou em pelo menos 25%.

Deve entender-se que invasões são proteínas bacterianas que facilitam a infecção de células não fago-cíticas, como tal podem ser seleccionadas de genes internalina ou quaisquer outros genes bacterianos cujos produtos codificados facilitam a ligação e assimilação por células não fagocíticas.

As mutações bacterianas podem ser conseguidas através de métodos mutagénicos tradicionais, tais como químicos mutagénicos ou radiação seguindo-se a selecção de mutantes. As mutações bacterianas podem também ser conseguidas por um perito na técnica através de tecnologia de ADN recombinante. Por exemplo, um método de permuta de alelos é descrita em Camilli et al., Molecular Micro. 8:143-147 (1993) que é adequado para utilização na geração de mutantes tais como mutantes de deleção. (Camilli et al., é aqui incorporada por referência na sua totalidade). (Ver também o Exemplo 1, abaixo, para uma descrição de um exemplo de aplicação de permuta de alelos). Alternativamente, pode ser usado o protocolo de substituição de genes descrito em Biswas et al. J. Bacteriol. 175:3528-3635 55 ΡΕ1592441 (1993). Outros métodos similares são conhecidos pelos competentes na técnica. A confirmação que uma mutação particular, tal como uma mutação inlB particular, está presente numa estirpe de Listeria e/ou que a estirpe é deficiente relativamente à sua produção de uma internalina particular, tal como a internalina B, pode ser obtida através de diversos métodos conhecidos pelos competentes na técnica. Por exemplo, a porção relevante do genoma da estirpe pode ser clonada e sequenciada. Alternativamente, mutações especificas podem ser identificadas através de PCR utilizando iniciadores emparelhados que codificam para regiões adjacentes a uma deleção ou outra mutação. Podem também ser utilizados "Southern blots" para detectar alterações no genoma bacteriano. Além disso, pode-se analisar se uma proteína particular é expressa pela estirpe utilizando técnicas convencionais na técnica tal como "Western blotting". A confirmação que a estirpe contém uma mutação no gene desejado pode também ser obtida através da comparação do fenótipo da estirpe com um fenótipo previamente registado. Por exemplo, a confirmação de que a estirpe é deficiente em relação à internalina B pode também ser obtida através da comparação do fenótipo da estirpe com os fenótipos previamente registados para mutantes da internalina B.

Uma estirpe mutante pode opcionalmente ser avaliada relativamente à utilidade na presente invenção 56 ΡΕ1592441 através da avaliação de se a estirpe é atenuada ou não relativamente à entrada em pelo menos um tipo de célula não fagocitica (ver secção II.A, acima). Para determinar a adequação para utilização nos métodos e composições da presente invenção, a estirpe mutante pode também ser avaliada relativamente à sua capacidade de ser absorvida por células fagociticas. A adequação de um mutante de Listeria particular, tal como Listeria compreendendo uma deleção num gene de internalina particular (por exemplo, inlB), para utilização numa vacina pode ser aferida pela medição da DL5o da estirpe, a protecção proporcionada pela estirpe relativamente a um teste com uma Listeria nativa, a capacidade da estirpe em induzir uma resposta de células T especifica a um antigénio, a capacidade da estirpe em induzir uma resposta citotóxica in vivo contra células que expressam um antigénio, e/ou a eficiência terapêutica da estirpe in vivo contra uma patologia alvo (por exemplo, num modelo de ratinho), assim como outros tipos de testes conhecidos pelos competentes na técnica. Exemplos específicos de alguns destes testes são ilustrados nos Exemplos 2-7, abaixo. A medição da DL5o de uma mutante Listeria é exemplificada no Exemplo 2, abaixo. A imunogenicidade de várias estirpes mutantes de Listeria é testada por testes ICS nos Exemplos 5-7, abaixo. 0 Exemplo 3, abaixo, apresenta um exemplo de um possível ensaio para aferir a citotoxicidade in vivo de estirpes mutantes de Listeria. 0 Exemplo 4, abaixo, proporciona um exemplo de um 57 ΡΕ1592441 ensaio que testa a eficácia terapêutica de uma estirpe de Listeria mutante.

Tal como descrito acima, proporciona-se um método para a diminuição da capacidade de uma estirpe de Listeria em entrar em células não fagociticas, enquanto conserva substancialmente a capacidade de entrar em células fagociticas, compreendendo a introdução de pelo menos uma mutação em pelo menos um gene da estirpe que codifica para uma invasina de modo a diminuir os niveis da invasina produzida pela estirpe. Numa realização, a invasina é uma internalina diferente de InlA. 2. Listeria compreendendo outras modificações que afectam a entrada em células não fagociticas

Nalgumas realizações, a Listeria reage com anticorpos policlonais ou monoclonais (ou seus fragmentos) que são específicos para proteínas invasinas particulares (por exemplo, internalina B), ou alternativamente são específicos para múltiplos antigénios de padrões moleculares repetidos expressos à superfície da bactéria. Anticorpos (Ab) específicos para uma proteína invasina particular ou múltiplas proteínas e/ou macromoléculas causam a atenuação de Listeria relativamente à entrada em células não fagociticas (estirpe Listeria "opsonizada por Ab") em relação à mesma estirpe Listeria sem tratamento com Ab (estirpe Listeria "não opsonizada). (Ver, por exemplo, o 58 ΡΕ1592441

Exemplo 10, abaixo). A capacidade da estirpe de Listeria ligada a anticorpo em entrar para células não fagociticas pode ser reduzida em cerca de 10%, em cerca de 25%, em cerca de 50%, em cerca de 75%, em cerca de 90%, em relação à estirpe de Listeria não ligada a anticorpo.

Nalgumas realizações alternativas da invenção, a capacidade da Listeria em entrar para células não fagociticas é atenuada pelo bloqueio de uma ou mais porções chave à superfície da Listeria. Por exemplo, uma proteína envolvida na entrada de Listeria em células fagociticas pode ser bloqueada por uma entidade que se liga à proteína da superfície celular e bloqueia a sua incapacidade de se ligar aos seus receptores numa célula não fagocítica. Nalgumas realizações, uma internalina na superfície da Listeria está bloqueada. Nalgumas realizações, a proteína de superfície é internalina B. Nalgumas realizações, a porção chave na superfície de Listeria é bloqueada com um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fab. Nalgumas realizações, a superfície da Listeria é revestida com anticorpos anti-Listeria ou fragmentos de anticorpos.

Nalgumas realizações, a capacidade da Listeria em entrar em células não fagociticas é conseguida por opsonização da Listeria. Nalgumas realizações, a Listeria atenuada foi opsonizada pelo elevado teor de soro anti-Listeria. Nalgumas realizações, a Listeria atenuada foi 59 ΡΕ1592441 opsonizada com anticorpos policlonais. Noutras realizações, a Listeria atenuada foi opsonizada com anticorpos monoclonais. Nalgumas realizações, os anticorpos utilizados para modificar a Listeria através de opsonização são anticorpos policlonais anti-Listeria. Nalgumas realizações, os anticorpos utilizados para opsonizar a Listeria são anticorpos anti-internalina, tais como anticorpos monoclonais ou policlonais específicos para a internalina B, ou seus fragmentos.

Os anticorpos específicos para Listeria podem ser produzidos por técnicas bem conhecidas para os peritos na técnica, tais como por infecção i.v. de ratinhos com Listeria para produzir elevados teores de soro de ratinho específicos para Listeria. As Listeria opsonizadas podem então ser geradas pela incubação da Listeria a ser atenuada pelo soro de ratinho anti-Listeria. Os inventores mostraram que tal Listeria opsonizada resultante é atenuada para entrada em células não-fagocíticas, mas não para células fagocíticas (ver, por exemplo, Exemplo 10, abaixo).

Deste modo, nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada é opsonizada. Nalgumas realizações, a Listeria opsonizada é também atenuada para disseminação célula a célula. Por exemplo, a bactéria Listeria atenuada pode ser uma bactéria Listeria opsonizada que é deficiente relativamente a ActA (por exemplo, um mutante de deleção actA). 60 ΡΕ1592441 B. Atenuação de Listeria relativamente a disseminação célula a célula

Nalgumas realizações, a Listeria atenuada utilizada nas composições, vacinas, e métodos aqui descritos não são apenas atenuadas relativamente à entrada em células não fagociticas, mas são também atenuadas relativamente a disseminação célula a célula. A bactéria Listeria é atenuada relativamente a disseminação célula a célula se a bactéria Listeria é menos capaz de se disseminar intracelularmente de uma célula infectada (uma célula compreendendo a Listeria no interior do seu citoplasma) para uma célula vizinha. Noutras palavras, a capacidade da bactéria Listeria atenuada em crescer e se disseminar é diminuída em relação a Listeria nativa da mesma espécie. Nalgumas realizações, a atenuação da Listeria relativamente a disseminação célula a célula é directamente afectada. Por exemplo, nalgumas realizações, a Listeria é atenuada relativamente a disseminação célula a célula devido à capacidade da Listeria em formar protrusões da célula infectada que entram numa célula vizinha ser limitada em relação à nativa. Noutras realizações, a atenuação da Listeria relativamente a disseminação célula a célula é devida a uma menor limitação directa que no entanto atenua a Listeria relativamente à disseminação célula a célula. Por exemplo, nalgumas realizações alternativas, a capacidade da Listeria em sair do vacúolo de uma célula fago-cítica é limitada. 61 ΡΕ1592441

Nalgumas realizações, a capacidade da Listeria atenuada em se disseminar célula a célula é reduzida em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 90%, em relação à Listeria nativa. Nalgumas realizações, a capacidade da Listeria atenuada em se disseminar célula a célula é reduzida em pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 90%, em relação à Listeria nativa. Nalgumas realizações, a capacidade da Listeria atenuada em se disseminar célula a célula é reduzida em pelo menos cerca de 50% em relação à Listeria nativa.

Nalgumas realizações, as Listeria atenuadas compreendem mutações nos seus genomas que atenuam a Listeria para disseminação célula a célula. Por exemplo, nalgumas realizações, a bactéria de Listeria pertence a uma estirpe mutante de Listeria. Nalgumas realizações da presente invenção, o genoma da estirpe mutante de Listeria compreende uma ou mais mutações num gene diferente de um gene de invasina. Por exemplo, nalgumas realizações, o genoma da estirpe mutante de Listeria compreende uma ou mais mutações num gene diferente de inlB. Por exemplo, a estirpe mutante pode também ser deficiente num ou mais factores de virulência que afectam a disseminação célula a célula. Noutras realizações, as Listeria são atenuadas relativamente a disseminação célula a célula através de métodos alternativos. 62 ΡΕ1592441

Mesmo naquelas realizações em que as Listeria atenuadas são atenuadas relativamente à disseminação célula a célula, as Listeria atenuadas são preferentemente ainda capazes de entrar para o interior de células fagociticas, tais como células dendriticas e/ou macrófagos. Numa realização, a capacidade da estirpe Listeria atenuada em entrar para células fagociticas não é diminuída pela modificação realizada às Listeria (isto é, aproximadamente 95% ou mais da capacidade medida da estirpe em entrar para células fagociticas é mantida após a modificação) . Noutras realizações, a capacidade da Listeria atenuada em entrar para células fagociticas é diminuída em não mais de cerca de 10%, não mais de cerca de 25%, não mais de cerca de 50%, não mais de cerca de 75%, em relação à nativa.

Os testes in vitro para a determinação se uma bactéria Listeria é ou não atenuada relativamente à disseminação célula a célula são conhecidos pelos competentes na técnica. Por exemplo, pode ser medido o diâmetro das placas formadas ao longo do tempo após a infecção de monocamadas de células em cultura seleccio-nadas. Os testes de placa no interior de monocamadas de células L2 podem ser levados a cabo como descrito anteriormente (Sun, A., A. Camilli, e D. A. Portnoy. 1990, Isolation of Listeria monocytogenes small-plaque mutants defective for intracellular growth and cell-to-cell spread. Infect. Immun. 58:3770-3778), com modificações aos métodos de medição, tal como descrito por (Skoble, J., D. A. Portnoy, e M. D. Welch. 2000, Three regions within ActA 63 ΡΕ1592441 promote Arp2/3 complex-mediated actin nucleation and Listeria monocytogenes motility. J. Cell Biol. 150:527-538). Resumidamente, as células L2 são crescidas até confluência em placas de cultura de tecidos com seis poços e são então infectadas com bactérias durante 1 h. Após a infecção, coloca-se uma camada de meio aquecido a 40°C que compreende DME contendo 0,8% de agarose, Soro Fetal Bovino (por exemplo, 2%), e uma concentração desejada de Gentami-cina. A concentração de Gentamicina no meio afecta bastante a dimensão da placa, e é uma medição da capacidade da disseminação célula a célula (Glomski, I. J., Μ. M. Gedde, A. W. Tsang, J. A. Swanson, e D. A. Portnoy. 2002. J. Cell Biol. 156:1029-1038). Por exemplo, 3 dias após a infecção da monocamada, o tamanho da placa das estirpes Listeria com um fenótipo deficiente relativamente à disseminação célula a célula é reduzida em pelo menos 50% em comparação com a Listeria nativa, quando se recobre com meio contendo Gentamicina numa concentração de 50 yg/mL. Por outro lado, o tamanho da placa entre estirpes de Listeria com um fenótipo deficiente relativamente à disseminação célula a célula e Listeria nativas é similar, quando se recobrem monocamadas infectadas com meio + agarose contendo apenas 5 yg/mL de gentamicina. Assim, a capacidade relativa de uma estirpe seleccionada em se disseminar célula a célula numa monocamada de células infectadas em relação a Listeria nativa pode ser determinada através da variação da concentração da gentamicina no meio contendo agarose. Opcionalmente, a visualização e a medição do diâmetro da placa pode ser facilitada pela adição de meio contendo 64 ΡΕ1592441

Neutral Red (GIBCO BRL; diluição 1:250 em DME + meio de agarose) ao recobrimento às 48 h após a infecção. Adicionalmente, o teste da placa pode ser levado a cabo em monocamadas derivadas de outras células primárias ou células continuas. Por exemplo, células HepG2, uma linha celular derivada de hepatócitos, ou hepatócitos primários humanos podem ser usados para avaliar a capacidade de mutantes seleccionados em conseguir a disseminação célula a célula, em comparação com Listeria nativa. Nalgumas realizações, Listeria compreendendo mutações ou outras modificações que atenuam a Listeria para disseminação célula a célula produzem placas "pinpoint" com elevadas concentrações de gentamicina (cerca de 50 pg/mL). A atenuação da Listeria atenuada da presente invenção pode também ser medida de forma menos directa, em termos de efeitos biológicos da Listeria num hospedeiro. A patogenicidade da Listeria atenuada pode ser avaliada pela medição da DL5o em ratinhos ou outros vertebrados (ver Exemplo 2, Tabela 1) . A LD50 é a quantidade, ou dosagem, de Listeria, injectada em vertebrados necessária para causar a morte em 50% dos vertebrados. Os valores DL50 podem ser comparados relativamente a Listeria com uma mutação particular ou modificação relativamente a Listeria sem a mutação ou modificação particular como uma medida do nivel de atenuação. Por exemplo, se a estirpe de Listeria sem uma mutação ou modificação particular tem uma DL5o de 103 bactérias e a estirpe de Listeria com a mutação ou modificação particular tem uma DL5o de 105 bactérias, a 65 ΡΕ1592441 estirpe foi atenuada de modo que a sua DL50 é aumentada 100 vezes ou em 2 log. 0 grau de atenuação pode também ser medido qualitativamente por outros efeitos biológicos, tais como a extensão da patologia em tecidos ou niveis de enzimas do figado no soro. Determinam-se os niveis de alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), albumina e bilirrubina no soro num laboratório clinico para ratinhos injectados com Listeria da presente invenção. As comparações destes efeitos em ratinhos ou outros vertebrados podem ser realizadas para Listeria com e sem mutações particulares para avaliar a atenuação da Listeria. A atenuação da Listeria relativamente à presente invenção pode ser também medida por patologia dos tecidos. A quantidade de Listeria que pode ser recuperada de vários tecidos num vertebrado infectado, tal como o figado, o baço e o sistema nervoso, pode também ser usada como medida do nivel de atenuação por intermédio da comparação destes valores em vertebrados injectados com uma Listeria mutante versus não-mutante. Por exemplo, a quantidade de Listeria que pode ser recuperada de tecidos infectados tais como o figado ou o baço como função do tempo pode ser usada como uma medida da atenuação através da comparação destes valores em ratinhos injectados com Listeria mutante vs. não-mutante. O grau de atenuação para disseminação de célula para célula envolvido nas vacinas da presente invenção não 66 ΡΕ1592441 necessita de ser uma atenuação absoluta de modo a proporcionar uma vacina segura e eficaz. Nalgumas realizações, o grau de atenuação é um que proporciona uma redução em toxicidade suficiente para prevenir ou reduzir os sintomas de toxicidade para niveis que não são potencialmente fatais. 1. Listeria que compreendem mutações que afectam a disseminação célula a célula

Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada compreende uma ou mais mutações que atenua ainda mais a bactéria para disseminação de célula a célula. Por exemplo, nalgumas realizações, a Listeria atenuada é uma estirpe de Listeria mutante que é deficiente relativamente a uma ou mais proteína de Listeria envolvida na disseminação de célula a célula, tais como aquelas seleccionadas do grupo que consiste em ActA, ligase lipoato proteína, PI-PLC, PC PLC, metaloprotease dependente do zinco e LLO (ou equivalentes destas proteínas, dependendo da espécie de Listeria utilizada). Nalgumas realizações, a Listeria atenuada é uma estirpe Listeria mutante que compreende uma ou mais mutações num gene seleccionado do grupo que consiste em actA, lplA, plcA, plcB, mpl, e hly (ou equivalentes destes genes, dependendo da espécie de Listeria utilizada), em que a mutação no gene atenua a bactéria relativamente à disseminação de célula a célula.

Nalgumas realizações, a bactéria Listeria é 67 ΡΕ1592441 atenuada relativamente à entrada em células não fagocíticas (por exemplo, deficiente numa ou mais internalinas tais como internalina B) e é também deficiente em relação a uma ou mais proteínas de polimerização de actina. Uma tal proteína de polimerização de actina é a actina polimerase codificada pelo gene actA (Kocks, et al., Cell, 68:521-531 (1992); no. de acesso Genbank AL591974, nts 9456-11389). A proteína actina polimerase está envolvida no recrutamento e na polimerização da F-actina do hospedeiro num polo da bactéria Listeria. A polimerização e dissolução subsequente da actina resulta na propulsão da Listeria através do citossol e para o interior de células vizinhas. Esta mobilidade permite às bactérias disseminarem-se directamente de célula para célula sem qualquer exposição suplementar ao ambiente extracelular, escapando assim às defesas do hospedeiro tais como desenvolvimento de anticorpos. Nalgumas realizações, a Listeria atenuada compreende opcionalmente tanto uma mutação num gene da internalina, tal como inlB, como em actA. A estirpe de Listeria desta realização da presente invenção é atenuada relativamente à entrada em células não fagocíticas assim como atenuada relativamente à disseminação célula a célula. Os termos "actA-", "ΔactA", e "mutante de deleção actA" são todos aqui utilizados indistintamente.

Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada é uma estirpe mutante de Listeria monocytogenes que é deficiente tanto relativamente à internalina B como à actina polimerase codificada por actA. Noutra realização, o 68 ΡΕ1592441 genoma da estirpe mutante de Listeria é um genoma de uma estirpe mutante de Listeria monocytogenes que compreende uma mutação em ambos inlB e actA (por exemplo, deleção da maioria ou da totalidade das sequências que codificam para a internalina B e ActA). Numa realização, a estirpe é o duplo mutante Listeria monocytogenes AactAAinlB depositado na American Type Culture Collection (ATCC) a 3 de Outubro de 2003, e designado pelo número de acesso PTA-5562. Noutra realização, a estirpe é um mutante da estirpe designada como PTA-5562, em que o mutante é deficiente tanto relativamente à internalina B como a ActA em relação à Listeria monocytogenes nativa. De novo, como anteriormente indicado os termos "actA-", "AactAAinlB" são aqui usados indistintamente para referir o mutante de deleção dupla.

Nalgumas realizações, o genoma da Listeria atenuada é deficiente para uma ligase lipoato proteína codificada pelo gene lplA (0'Riordan, et al., Science, 302:462-4 (2003); no. de acesso Genbank NC_003210).

Nalgumas realizações, a Listeria atenuada é deficiente tanto relativamente à internalina B e à ligase lipoato proteína. Nalgumas realizações, a Listeria atenuada é um mutante que compreende uma mutação no gene lplA. Nalgumas realizações, a Listeria atenuada compreende uma mutação tanto em inlB e lplA. Alguns exemplos de mutantes lplA são descritos no pedido de patente U.S. 2004/0013690, aqui incorporada por referência na sua totalidade.

Nalgumas realizações a bactéria Listeria que é 69 ΡΕ1592441 atenuada relativamente à entrada em células não fagocíticas é também deficiente relativamente a uma ou mais fosfolipases. Nalgumas realizações, a Listeria atenuada é uma estirpe de Listeria mutante deficiente em relação a uma ou mais internalinas (tais como internalina B) mas também deficiente em relação a e/ou mutada numa ou mais fosfolipases. Fosfolipases são uma classe de enzimas que catalisam a hidrólise de fosfoglicéridos. A fosfolipase C é uma fosfodiaesterase que liberta diacil glicerol, um segundo mensageiro em outras vias bacterianas. Em Listeria contribuem para a formação de poros na membrana fagoli-sossomal. Nalgumas realizações, os genes fosfolipase que são mutados na Listeria envolvida na presente invenção são seleccionados do grupo que consiste em plcA, plc e smcL. Nalgumas realizações, a Listeria atenuada compreende uma ou mais mutações nos genes plcA e/ou plcB (acesso Genbank no. NC 00321; Angelakopolous H. et al., 2002, Infect Immun. 70: 3592-3601). Nalgumas realizações, a Listeria atenuada compreende uma mutação no gene smcL. Nalgumas realizações, a Listeria atenuada compreende a mutações de atenuação em inlB e em plcA e/ou plcB. A estirpe Listeria destas realizações da presente invenção é atenuada relativamente à entrada em células não fagocíticas assim como escapam do fagolisossoma para o citossol da célula hospedeira, e, como resultado, relativamente à disseminação célula a célula.

Nalgumas realizações, o genoma da Listeria atenuada é deficiente relativamente à metaloprotease dependente do zinco codificada pelo gene mpl (Marquis, et al., 70 ΡΕ1592441 J. Cell. Biol. 137:1381-92 (1997); no. acesso Genbank NC_003210). Nalgumas realizações, a Listeria atenuada é deficiente tanto relativamente à internalina B como à meta-loprotease dependente do zinco. Nalgumas realizações, a Listeria atenuada é um mutante que compreende uma mutação no gene mpl. Nalgumas realizações, a Listeria atenuada compreende uma mutação de atenuação tanto em inlB como em mpl.

Nalgumas realizações, a bactéria Listeria que é atenuada para a entrada em células não fagociticas é também deficiente em relação a LLO. Nalgumas realizações, as estirpes mutantes de Listeria que são deficientes em relação a uma ou mais invasinas (por exemplo, internalina B) são também deficientes em relação a e/ou mutados para uma ou mais proteinas de Listeria eficazes na mediação do escape e da disseminação de Listeria do local inicial de invasão. Tais proteinas de escape podem compreender a listeriolisina O nativa (LLO; no. de acesso Genbank M24199, aqui incorporada por referência na sua totalidade) assim como formas mutantes de LLO. Nalgumas realizações, o genoma da bactéria Listeria atenuada compreende uma mutação no gene hly que codifica para LLO. LLO é uma proteina citolisina responsável para a formação de poros na membrana de fagolisossomas que encapsulam a Listeria invasora. Estes poros permitem à Listeria escapar o ambiente letal do fagolisossoma para o citossol da célula hospedeira, em que a Listeria pode crescer e se disseminar para células vizinhas. Uma proteina LLO mutante possivel compreende substituições de aminoácidos. Tais substituições de 71 ΡΕ1592441 aminoácidos podem envolver um ou mais aminoácidos da proteína LLO e pode afectar a citotoxicidade da LLO através da alteração do óptimo de pH ou a estabilidade da proteína resultante. Outra proteína LLO mutante da Listeria envolvida na presente invenção compreende a deleção de um ou mais aminoácidos da LLO. Tais deleções de aminoácidos podem também afectar a citotoxicidade através da alteração da estabilidade da proteína LLO resultante. As estirpes de Listeria envolvidas na presente invenção que são deficientes numa ou mais internalinas e são também deficientes ou mutadas para a proteína LLO são atenuadas para entrada em células não fagocíticas assim como atenuadas relativamente ao escape para o fagolisossoma e resultantes crescimento e disseminação directamente de célula para célula. Alguns mutantes hly exemplares são descritos no pedido de patente U.S. 2004/0013690, aqui incorporados por referência na sua totalidade.

Deste modo, nalgumas realizações, o genoma da bactéria Listeria atenuada relativamente à entrada em células não fagocíticas é ainda mais atenuada para disseminação de célula para célula e compreende pelo menos uma mutação num ou mais genes seleccionados do grupo que consiste em actA, hly, lplA, plcA, mpl e plcB. Numa realização alternativa, o genoma da estirpe mutante compreende ainda uma mutação em actA. Por exemplo, o genoma da bactéria Listeria modificada pode compreender uma mutação tanto em inlB como num gene seleccionado do grupo consistindo em actA, hly, lplA, plcA, mpl e plcB. Alter- 72 ΡΕ1592441 nativamente, o genoma da Listeria atenuada compreende pelo menos uma mutação tanto em inlB como em actA.

As mutações adicionais nas estirpes Listeria podem ser introduzidas e rastreadas do mesmo modo que descrito na Secção II.A, acima, ou nos Exemplos, abaixo. Múltiplas mutações serão tipicamente introduzidas sequencialmente. Por exemplo, iniciando com Listeria nativa, o gene actA pode ser deletado utilizando permuta de alelos. Finalmente, o gene inlB pode ser deletado do mutante actA ou o mutante actA/uvrAB através da permuta de alelos para gerar o mutante actA/inlB.

Em realizações alternativas, as estirpes de Listeria mutantes conhecidas pelos peritos na técnica são ainda modificadas para introduzir mutações que irão atenuar a sua capacidade em entrar em células não fagocíticas e/ou para tornar as células deficientes em relação à internalina B. Por exemplo, foram descritas anteriormente algumas estirpes de Listeria mutantes. A estirpe mutante LLO L461T (DP-L4017) foi descrita em Glomski, et al, J. Cell. Biol. 156: 1029 (2002), aqui incorporados por referência. O mutante ΔactA (DP-L4029) é a estirpe DP-L3078 descrita em Skoble et al., J. of Cell Biology, 150: 527-537 (2000), aqui incorporada por referência na sua totalidade, que contém um profago temperado. (A introdução de profagos temperados é descrita em (Lauer et al., J. Bacteriol 184:4177 (2002); Publicação de Patente U.S. No. 2003/0203472)). O mutante LLO (DP-L4027) (Lauer et al., J. 73 ΡΕ1592441 of Bacteriology, 184:4177-4186 (2002)), e LLO Δ26 (DP-L4042) (Decatur et al, Science 290:992 (2000)) foram também descritos anteriormente. Quaisquer destas estirpes poderiam compreender um ponto de partida para produzir uma estirpe mutante de Listeria da presente invenção. Alternativamente, qualquer uma de uma grande variedade das estirpes Listeria mutantes podem ser primeiro geradas a partir de Listeria nativa utilizando os métodos de permuta de alelos descritos acima ou outros métodos conhecidos pelos competentes na técnica e depois a mutação para a atenuação da bactéria relativamente à entrada em células não fagociticas (tais como inlB) pode ser mais tarde introduzida na estirpe. A adequação de uma estirpe Listeria atenuada particular relativamente à entrada em células não fagociticas (por exemplo, uma estirpe deficiente em relação à internalina B) que é também atenuada relativamente à disseminação célula a célula para utilização numa vacina pode ser avaliada utilizando os mesmos tipos de testes tais como descritos para avaliar mutações adequadas que afectam invasinas na Secção II.A., acima.

Entende-se que os genomas das Listeria atenuadas da presente invenção podem também compreender mutações atenuadas que não atenuam a Listeria relativamente à entrada em células não fagociticas nem para disseminação célula a célula. 74 ΡΕ1592441 2. Listeria compreendendo outras modificações que afectam a disseminação célula a célula

Nalgumas realizações, a bactéria Listeria que é atenuada tanto para a entrada em células não fagocíticas e para a disseminação célula para célula foi modificada por métodos alternativos (ou por um meio adicional a) aquelas mutações apresentadas acima. Por exemplo, nalgumas realizações, o ácido nucleico da bactéria Listeria foi modificado e tal modo que a proliferação da bactéria é atenuada, atenuando deste modo a bactéria relativamente à disseminação célula a célula.

Nalgumas realizações, a atenuação da proliferação de Listeria é controlável de um modo dependente da dose. Nalgumas realizações, a expressão de genes de Listeria na bactéria de Listeria não é substancialmente afectada pela atenuação da proliferação do micróbio. Nalgumas realizações, a Listeria expressa um antigénio a um nivel suficiente para induzir uma resposta imunitária ao antigénio num indivíduo através da administração da vacina ao indivíduo .

Nalgumas realizações, o ácido nucleico da bactéria foi modificado por reacção com um composto direccionado para o ácido nucleico de modo que a proliferação da bactéria é atenuada. Nalgumas realizações, o ácido nucleico da Listeria foi modificado por reacção com um composto que tem como alvo o ácido nucleico e que reage directamente com 75 ΡΕ1592441 o ácido nucleico. Nalgumas realizações, o composto que tem como alvo o ácido nucleico é um agente de alquilação do ácido nucleico. Por exemplo, nalgumas realizações, o agente de alquilação do ácido nucleico é β-alanina, N-(acridin-9-il) , éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino)etilo. Nalgumas realizações, o composto que tem como alvo o ácido nucleico é um composto psoraleno activado por radiação UVA e o ácido nucleico da bactéria Listeria atenuada foi modificada por contacto com o composto psoraleno activado por irradiação UVA. Por exemplo, nalgumas realizações, o composto que tem como alvo o ácido nucleico é 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno (também aqui referido como "S-59"). São proporcionados exemplos de protocolos para a inactivação de Listeria por S-59/UVA no Exemplo 11, abaixo. Mais descrições da utilização dos compostos que têm como alvo o ácido nucleico tais como compostos reticulantes são proporcionadas nos pedidos relacionados Nos. Série U.S. 60/446,051, 60/449,153 e 60/511,869, aqui incorporados por referência na sua totalidade. Igualmente, o pedido de patente U.S. relacionado intitulado "Modified Free-Living Microbes, Vaccine Compositions, and Methods of Use Thereof", presentado a 6 de Fevereiro de 2004, é também aqui incorporado pro referência na sua totalidade.

Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada não foi apenas atenuada em relação à entrada em células não fagociticas e o seu ácido nucleico modificado de tal modo que é atenuado relativamente à proliferação (tal como descrito acima), mas é também deficiente em 76 ΡΕ1592441 relação a uma proteína que funciona para reparar modificações ao ácido nucleico de Listeria. Nalgumas realizações, a Listeria atenuada é deficiente em relação a uma enzima de reparação de ADN. Nalgumas realizações, a estirpe de Listeria mutante é deficiente em relação tanto à internalina B como a uma proteína que funciona para reparar modificações no seu ácido nucleico. Por exemplo, uma estirpe mutante de Listeria que compreende uma mutação em inlB poderia também compreender uma mutação em qualquer de uma variedade de genes que estão envolvidos nos mecanismos de reparação de ADN de micróbios (Aravind et al., Nucleic Acids Research 27(5):1223-1242 (1999)). Numa realização, o mutante deficiente para a reparação não tem a capacidade de produzir PhrB (uma fotoliase), que repara dímeros de pirimidina. Por exemplo, a mutação adicional pode ser no gene phrB, ou um gene funcionalmente equivalente, dependendo da espécie da Listeria. Tal mutante poderia ser usado em conjunto com radiação ultravioleta (por exemplo, UVB, UVC) do micróbio para produzir dímeros de pirimidina no ácido nucleico do micróbio. Noutra realização, o mutante de internalina B é também incapaz de reparar ligações cruzadas entre cadeias. Tais mutantes incluem, mas não se limitam a, mutações num ou em todos os genes uvr, isto é, genes uvrA, uvrB, uvrC, e uvrD assim como genes recA, ou genes funcionalmente equivalentes, dependendo do género e da espécie do micróbio. Estas mutações resultam numa atenuação na actividade dos enzimas correspondentes UvrA (uma ATPase) , UvrB (uma helicase) , UvrC (uma nuclease) , UvrD (uma helicase II) e RecA (uma recombinase) . Estes mutantes 77 ΡΕ1592441 seriam tipicamente usados em conjunto com um composto reticulante, tal como psoraleno. Numa realização, existem mutações atenuantes tanto em uvrA como em uvrB (uvrAB).

Deste modo, numa realização, o genoma da estirpe mutante atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas, compreende ainda pelo menos uma mutação em pelo menos um gene seleccionado do grupo que consiste em phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD e recA. Por exemplo, o genoma da Listeria mutante pode compreender pelo menos uma mutação em tanto inlB e num gene seleccionado do grupo que consiste em phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD e recA. Alternativamente, a Listeria atenuada é um mutante de Listeria monocytogenes que compreende pelo menos uma mutação em inlB, actA, e uvrAB.

As mutações adicionais nas estirpes Listeria podem ser introduzidas e rastreadas do mesmo modo que descrito na Secção II. A acima, ou nos Exemplos, abaixo. Múltiplas mutações serão tipicamente introduzidas sequencialmente. Por exemplo, iniciando com Listeria nativa, o gene actA pode ser deletado utilizando permuta de alelos. De seguida, os genes uvrA e uvrB podem ser opcionalmente deletados do mutante LactA utilizando permuta de alelos. (Um mutante Listeria monocytogenes LactAhuvrAB foi depositado na ATCC a 3 de Outubro de 2003, e designado PTA-5563) . Finalmente, o gene inlB pode ser deletado do mutante AactA ou o mutante LactALuvrAB (também conhecido como actA~/uvrAB~) através da permuta de alelos para gerar o mutante LactAAinlBAuvrAB (actA~/inlB~/uvrAB~) . 78 ΡΕ1592441

Em realizações alternativas, as estirpes de Listeria mutantes conhecidas pelos peritos na técnica são ainda modificadas para introduzir mutações que irão atenuar a sua capacidade em entrar em células não fagociticas e/ou para tornar as células deficientes em relação à internalina B. Por exemplo, a construção da estirpe LactAAuvrAB é descrita na patente provisória 60/446,051 submetida a 6 de Fevereiro de 2003, como L4 02 9/uvrAB~ (ver, por exemplo, o Exemplo 7 daquele pedido). Esta estirpe poderia compreender o ponto de partida para produzir uma estirpe mutante de Listeria da presente invenção. Alternativamente, qualquer uma de uma grande variedade das estirpes Listeria mutantes podem ser primeiro geradas a partir de Listeria nativa utilizando os métodos de permuta de alelos descritos acima ou outros métodos conhecidos pelos competentes na técnica e depois a mutação para a atenuação da bactéria relativamente à entrada em células não fagociticas (tais como inlB) pode ser mais tarde introduzida na estirpe. A adequação de uma estirpe Listeria atenuada particular (por exemplo, uma estirpe deficiente em relação à internalina B) que é também atenuada relativamente à disseminação célula a célula para utilização numa vacina pode ser avaliada utilizando os mesmos tipos de testes tais como descritos para avaliar mutações adequadas que afectam invasinas na Secção II.A., acima. 79 ΡΕ1592441 C. Antigénios e expressão de proteína heteróloga

Nalgumas realizações, a Listeria atenuada (por exemplo as estirpes mutantes de Listeria) compreendem uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio. Nalgumas realizações, o antigénio é um antigénio de Listeria. Alternativamente, o antigénio é um antigénio que não é de Listeria. Nalgumas, apesar de não todas, realizações da invenção, o ácido nucleico que codifica para o antigénio é heterólogo em relação à Listeria mutante. A molécula de ácido nucleico que codifica para o antigénio pode ser integrada no genoma da Listeria mutante. Alternativamente, a molécula de ácido nucleico que codifica para o antigénio pode estar num plasmideo ou semelhante no interior da Listeria. 0 antigénio que é expresso pelo ácido nucleico heterólogo na estirpe mutante de Listeria pode ser ou autólogo ou heterólogo relativamente a um animal hospedeiro ao qual a estirpe Listeria mutante é administrada como parte de uma vacina ou outra composição.

Os métodos para preparar Listeria contendo ácidos nucleicos heterólogos que expressam antigénios são conhecidos pelos competentes na técnica. A Listeria pode ser alterada por métodos de ADN recombinante conhecidos pelos competentes na técnica (ver, por exemplo, Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2000)). A 80 ΡΕ1592441 sequência codificante para o antigénio, ou um eu fragmento e/ou variante, está ligado de forma operacional a sequências reguladoras apropriadas para realizar a expressão da sequência do antigénio na Listeria. Sequências promotoras adequadas são conhecidas pelos competentes na técnica. Por exemplo, o promotor hly é adequado para utilização nas construções de expressão. Nalgumas realizações, as construções de expressão contendo as sequências que codificam para o antigénio compreendem ainda sequências de péptido sinal ligadas de forma operacional. Nalgumas realizações, a sequência de antigénio é fundida, directa ou indirecta-mente, a sequências que codificam para pelo menos porções de proteínas de Listeria tais como LLO. Exemplos específicos de vectores de integração adequados para a expressão de antigénios em Listeria incluem pPL2 e pPLl, descritos em Lauer et al., J. Bacteriol. 184:41777-4186 (2002) e Patente U.S. Pub. No. 2003/0203472 Al. A sequência de ácidos nucleicos heteróloga pode codificar para pelo menos uma proteína antigénio ou outra proteína específica, tal como uma proteína que proporcione um tratamento paliativo para uma doença. A Listeria pode ser alterada para conter uma ou mais sequências que codificam para um ou mais antigénios ou outras proteínas desejadas. A sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica para um antigénio específico não é limitada a uma sequência de ácido nucleico exacta, mas é de uma sequência que é suficiente para proporcionar a expressão de um antigénio que irá provocar a resposta imunitária desejada 81 ΡΕ1592441 quando administrada a um indivíduo. Do mesmo modo para sequências heterólogas que codificam para outras proteínas, as sequências que codificam para uma dada proteína podem variar desde que a proteína desejada seja expressa de modo a proporcionar o efeito desejado (por exemplo, um efeito paliativo) quando administrada a um indivíduo. A sequência heteróloga pode ser expressa como um antigénio relacionado com uma doença particular. A Listeria que expressa tais antigénios pode ser usada como uma vacina, em que a vacina pode ser usada como um tratamento preventivo ou um tratamento terapêutico. As doenças que podem ser tratadas por tais vacinas incluem, mas não se limitam a, doenças infecciosas, doenças auto-imunes, alergias, cancros e outras doenças hiperproliferativas. A Listeria envolvida na invenção pode ser alterada para conter uma sequência de ácido nucleico heterólogo que codifica para um antigénio que é um antigénio associado a um tumor ou que é derivada de um antigénio associado a um tumor. Foram identificados diversos antigénios associados a tumores que são reconhecidos por células T (Renkvist et al., Câncer Immunol Immunother 50:3-15 (2001)). Estes antigénios associados a um tumor podem ser antigénios de diferenciação (por exemplo, PSMA, Tirosinase, gplOO), antigénios específicos de um tecido (por exemplo, PAP, PSA), antigénios do desenvolvimento, antigénios virais associados a tumor (por exemplo, HPV 16 E7), antigénios do cancro dos testículos (por exemplo, MAGE, BAGE, NY-ESO-1), antigénios embrionários (por 82 ΡΕ1592441 exemplo, CEA, alfa-fetoproteína), antigénios oncoproteína (por exemplo, Ras, p53), antigénios proteína sobre-expressos (por exemplo, ErbB2 (Her2/Neu), MUC1), ou antigénios proteína mutados. Os antigénios associados a tumor que podem ser codificados pela sequência de ácido nucleico incluem, mas não se limitam a, 707-AP, Anexina II, AFP, ART-4, BAGE, β-catenina/m, BCL-2, bcr-abl, bcr-abl pl 90, bcr-abl p210, BRCA-1, BRCA-2, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK-4/m, CEA (Huang et al., Exper Rev. Vaccines (2002)1:49-63), CT9, CT10, Cyp-B, Dek-cain, DAM-6 (MAGE-B2), DAM-10 (MAGE-B1), EphA2 (Zantek et al., Cell Growth Differ. (1999) 10:629-38; Carles-Kinch et al., Câncer Res. (2002) 62:2840-7), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, GnT-V, gplOO, HAGE, HER2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, hTRT, iCE, inibidores da apoptose (por exemplo, survivina), KIAA0205, K-ras, LAGE, LAGE-1, LDLR/FUT, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-6, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D, MART-1, MART-l/Melan-A, MC1R, MDM-2, mesotelina, Miosina/m, MUC1, MUC2, MUM-1, MUM-2, MUM-3, polimerase neo-polyA, NA88-A, NY-ESO-1, NY-ESO-la (CAG-3), PAGE-4, PAP, Proteinase 3 (Molldrem et al., Blood (1996) 88:2450-7; Molldrem et al., Blood (1997) 90:2529-34), P15, pl90, Pml/RARa, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RAS, RCAS1, RUI, RU2, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SP 17, SPAS-1, TEL/AML 1, TPI/m, Tirosinase, TARP, TRP-1 (gp75), TRP-2, TRP-2/INT2, WT-1, e proteínas alternativamente traduzidas NY-ESO-ORF2 e CAMEL, derivadas dos genes NY-ESO-1 e LAGE-1. 83 ΡΕ1592441 A Listeria atenuada da presente invenção pode incluir qualquer antiqénio associado a tumor que possa provocar uma resposta imunitária especifica para um tumor, incluindo antigénios ainda por identificar. A Listeria pode ser alterada para conter mais do que uma sequência heteróloga que codifica para mais do que antigénio associado a tumor. Numa realização, o antigénio é a mesotelina (Argani et al., Clin Câncer Res. 7(12):3862-8 (2001)), Spl7 (Lim et al.,

Blood 97(5):1508-10 (2001)), gplOO (Kawakami et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:6458 (1994)), PAGE-4 (Brinkmann et al., Câncer Res. 59(7):1445-8 (1999)), TARP (Wolfgang et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97(17):9437-42 (2000)), ou SPAS-1 (Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2002/0150588).

Nalgumas realizações, o ácido nucleico heterólogo codifica para um antigénio que não é idêntico a um antigénio associado a tumor, mas sim derivado de um antigénio associado a um tumor. Por exemplo, o antigénio expresso pela Listeria mutante pode compreender um fragmento de um antigénio associado a um tumor, uma variante de um antigénio associado a um tumor, ou um fragmento de uma variante de um antigénio associado a um tumor. Nalguns casos, um antigénio, tal como um antigénio tumoral, é capaz de induzir uma resposta imunitária mais significativa numa vacina em que a sequência difere daquela que é endógena ao hospedeiro. Nalgumas realizações, a variante de um antigénio associado a um tumor, ou um fragmento de uma variante de um antigénio associado a um 84 ΡΕ1592441 tumor, difere daquela do antigénio associado a um tumor, ou do seu fragmento correspondente, por um ou mais aminoácidos. 0 antigénio derivado de um antigénio associado a um tumor irá compreender pelo menos uma sequência de epitopo capaz de induzir a resposta imunitária desejada aquando da administração da Listeria mutante a um hospedeiro.

Deste modo, nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio tal como mesotelina, SPAS-1, proteinase-3, EphA2, SP-17, gplOO, PAGE-4, TARP, Her-2/neu, WT-1, NY-ESO-1, PSMA, K-ras, ou CEA, ou um antigénio derivado de uma daquelas proteínas. Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio tal como mesotelina, SPAS-1, proteinase-3, SP-17, gplOO, PAGE-4, TARP, Her-2/neu, WT-1, NY-ESO-1, PSMA, K-ras, ou CEA, ou um antigénio derivado de uma daquelas proteinas. Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio tal como mesotelina, SPAS-1, proteinase-3, EphA2, SP-17, gplOO, PAGE-4, TARP, WT-1, NY-ESO-1, ou CEA, ou um antigénio derivado de uma daquelas proteinas. Noutras realizações, a bactéria Listeria atenuada compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio tal como mesotelina, SPAS-1, proteinase-3, SP-17, gplOO, PAGE-4, TARP, WT-1, NY-ESO-1, ou CEA, ou um antigénio derivado de uma daquelas proteinas. Nalgumas realizações, a 85 ΡΕ1592441 bactéria Listeria atenuada compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para a mesotelina humana, ou um antigénio derivado da mesotelina humana. Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para a EphA2 humana, ou um antigénio derivado da EphA2 humana. Nalgumas realizações, a bactéria Listeria atenuada compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para a NY-ESO-1 humana, ou um antigénio derivado da NY-ESO-1 humana.

Nalgumas outras realizações, o antigénio hete-rólogo expresso pela Listeria atenuada é proteinase-3 ou é derivado da proteinase-3. Por exemplo, numa realização, o antigénio compreende o péptido PR1 restrito a HLA-A2.1 (aa 169-177; VLQELNVTV (SEQ ID NO:1)). A informação sobre a proteinase-3 e/ou o epitopo PR1 está disponível publicamente nas seguintes referências: Pat. U.S. No. 5,180,819, Molldrem, et al., Blood, 90:2529-2534 (1997); Molldrem et al., Câncer Research, 59:2675-2681 (1999); Molldrem, et al., Nature Medicine, 6:1018-1023 (2000); e Molldrem et al., Oncogene, 21: 8668-8673 (2002).

Alternativamente, a Listeria atenuada da invenção pode ser alterada para conter uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica para um antigénio especifico de uma doença auto-imune. Numa doença auto-imune mediada por células T, uma resposta das células T aos antigénios próprios resulta na doença auto-imune. O tipo de antigénio para utilização no tratamento de uma doença auto- 86 ΡΕ1592441 imune com as vacinas da presente invenção poderá ter como alvo células T especificas responsáveis pela resposta auto-imune. Por exemplo, o antigénio pode ser parte de um receptor de células T, o idiotipo, especifico àquelas células T que causam uma resposta auto-imune, em que o antigénio incorporado numa vacina da invenção provocaria uma resposta imunitária especifica àquelas células T que causam a resposta auto-imune. A eliminação daquelas células T seria um mecanismo terapêutico para aliviar a doença auto-imune. Outra possibilidade seria incorporar um antigénio que resultaria numa resposta imunitária que tem como alvo os anticorpos que são gerados a antigénios próprios numa doença auto-imune ou ter como alvo os clones de células B específicos que secretam os anticorpos. Por exemplo, um antigénio idiotipo pode ser incorporado na Listeria que resultará numa resposta imunitária anti-idiotipo a tais células B e/ou os a reacção dos anticorpos com antigénios próprios numa doença auto-imune.

Noutras realizações da invenção, o antigénio é derivado de um patogénio humano ou animal. 0 patogénio é opcionalmente um vírus, uma bactéria, um fungo, ou um protozoário. Numa realização, o antigénio é uma proteína produzida pelo patogénio, ou um fragmento e/ou uma variante de uma proteína produzida pelo patogénio.

Por exemplo, o antigénio pode ser derivado de um vírus de Imunodeficiência Humana (tais como gp 120, gp 160, gp41, antigénios gag tais como p24 gag e p55 gag, assim 87 ΡΕ1592441 como proteínas derivadas das regiões pol, env, tat, vif, rev, nef, vpr, vpu e LTR do HIV), vírus de Imunodeficiência Felina, ou vírus do herpes humano ou animal. Numa realização, o antigénio é derivado dos tipos 1 e 2 do vírus herpes simplex (HSV) (tais como gD, gB, gH, proteína Precoce Imediata tal como ICP27), de citomegalovírus (tais como gB e gH) , do vírus de Epstein-Barr ou do vírus Varicella Zoster (tais como gpl, II ou III) . (Ver, por exemplo, Chee et al. (1990) Cytomegaloviruses (J. K.

McDougall, ed., Springer Verlag, pp. 125-169; McGeoch et al. (1988) J. Gen. Virol . 69: 1531-1574; Pat. U.S. No. 5, 171,568; Baer et al. (1984) Nature 310: 207-211; e

Davison et al. (1986) J. Gen. Virol. 67: 1759-1816).

Noutra realização, o antigénio é derivado de um vírus da hepatite tal como um vírus da hepatite B (por exemplo, o antigénio de Superfície da Hepatite B), vírus da hepatite A, vírus da hepatite C, vírus da hepatite delta, vírus da hepatite E, ou vírus da hepatite G. Ver, por exemplo WO 89/04669; WO 90/11089; e WO 90/14436. O antigénio da hepatite pode ser um antigénio de superfície, do núcleo ou outro antigénio associado. O genoma de HCV codifica para várias proteínas virais, incluindo El e E2. Ver, por exemplo, Houghton et al., Hepatology 14: 381-388 (1991).

Um antigénio que é um antigénio virai é opcionalmente derivado de um vírus de qualquer uma das famílias Picornaviridae (por exemplo, poliovírus, rinovírus, etc.); Caliciviridae; Togaviridae (por exemplo, vírus da rubéola, ΡΕ1592441 vírus do dengue, etc.); Flaviviridae; Coronaviridae; Reoviridae (por exemplo, rotavírus, etc.); Birnaviridae; Rhabodoviridae (por exemplo, vírus da raiva, etc.); Orthomyxoviridae (por exemplo, vírus influenza dos tipos A, B e C, etc.); Filoviridae; Paramyxoviridae (por exemplo, vírus da papeira, vírus do sarampo, vírus sincicial respiratório, vírus parainfluenza, etc.); Bunyaviridae; Arenaviridae; Retroviradae (por exemplo, HTLV-I; HTLV-11; HIV-1; HlVIllb; HIVSF2; HTVLAV; HIVLAI; HIVMN; HIV-1CM235; HIV-2; vírus da imunodeficiência símia (SIV)); Papillomavirus, vírus da encefalite provocada por picada de carraça; e semelhantes. Ver, por exemplo Virology, 3a Edição (W. K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 3a Edição (B. N. Fields, D. M. Knipe, e P. M. Howley, Eds. 1996), para uma descrição destes e doutros vírus. Numa realização, o antigénio é Flu-HA (Morgan et al., J. Immunol. 160:643 (1998)).

Nalgumas realizações alternativas, o antigénio é derivado de patogénios bacterianos tais como Microbactéria, Bacillus, Yersinia, Salmonella, Neisseria, Borrelia (por exemplo, OspA ou OspB ou os seus derivados) , Chlamydia, ou Bordetella (por exemplo, P.69, PT e FHA), ou derivados de parasitas tais como plasmódio ou Toxoplasma. Numa realização, o antigénio é derivado de Mycobacterium tuberculosis (por exemplo ESAT-6, 85A, 85B, 72F), Bacillus anthracis (por exemplo PA), ou Yersinia pestis (por exemplo Fl, V). Além disso, antigénios adequados para utilização na presente invenção podem ser obtidos ou derivados de agentes causadores conhecidos responsáveis pro doenças, incluindo 89 ΡΕ1592441 mas não limitadas a Difteria, Tosse Convulsa, Tétano, Tuberculose, Pneumonia Bacteriana ou Fúngica, Otite Média, Gonorreia, Cólera, Febre Tifoide, Meningite, Mononucleose, Peste, Sigelose ou Salmonelose, Doença do Legionário, Doença de Lyme, Lepra, Malária, Ancilostomíase, Oncocer-cose, Esquistossomose, Tripanossomiase, Leishmaniose, Giar-diose, Amibiose, Filariase, Doença de Lyme, e Triquinose. Podem ser obtidos ou derivados ainda mais antigénios de patogénios não convencionais tais como os agentes causadores de Kuru, da doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), paraplexia enzoótica dos ovinos, encefalopatia transmissível do vison, e doenças emaciantes crónicas, ou de partículas infecciosas proteicas tais como priões que estão associados à doença das vacas loucas.

Ainda noutras realizações, o antigénio é obtido ou derivado de um agente biológico envolvido no inicio ou na progressão de doenças neurodegenerativas (tais como a doença de Alzheimer), doenças metabólicas (tais como a diabetes do Tipo I), e dependência de drogas (tais com dependência de nicotina). Alternativamente, as composições que compreendem a estirpe Listeria mutante que expressa o antigénio são usadas para a gestão da dor e o antigénio é um receptor da dor ou outro agente envolvido na transmissão de sinais de dor.

Nalgumas realizações, os codões na sequência do antigénio podem ser optimizados para corresponder à preferência de codões do hospedeiro Listeria. 90 ΡΕ1592441 D. Imunogenicidade da Listeria atenuada

Nalgumas realizações, a Listeria atenuada (por exemplo, estirpes de Listeria mutantes) são capazes de induzir uma resposta imunitária num hospedeiro animal. Numa realização, a resposta imunitária é uma resposta imunitária mediada por células. Numa realização, a resposta imunitária eficaz induzida pela bactéria Listeria atenuada compreende uma resposta das células T, tal como uma resposta das células T CD4+ ou uma resposta das células T CD8 + , ou ambas.

Estas respostas imunitárias celulares podem ser medidas tanto por métodos in vitro como por métodos in vivo para determinar se a resposta imunitária da Listeria envolvida na presente invenção é eficaz. A eficácia pode ser determinada através da comparação destas medições para Listeria atenuada com aquelas para Listeria não atenuada para qualquer antigénio ou proteína heteróloga particular. Uma possibilidade é medir a apresentação a proteína ou do antigénio de interesse por uma célula apresentadora de antigénio que foi misturada com uma população da Listeria. A Listeria pode ser misturada com uma célula ou linha celular apresentadora de antigénio, por exemplo, uma célula dendrítica, e pode-se medir a apresentação do antigénio pela célula dendrítica a uma célula T que reconhece a proteína ou o antigénio. Se as Listeria estão a expressar a proteína ou o antigénio a um nível suficiente, será processada em fragmentos peptídicos pelas células dendríticas e 91 ΡΕ1592441 apresentada no contexto de MHC de classe I ou de classe II às células T. Para o objectivo de se detectar a proteína ou antigénio apresentado, pode-se usar um clone de células T ou de linha celular T que responda ao antigénio ou proteina particular. A célula T pode também ser um hibridoma de célula T, em que a célula T é imortalizada por fusão com uma linha celular de cancro. Tais hibridomas de células T, clones de células T, ou linhas celulares T podem compreender células T CD8+ ou CD4+. A célula dendritica pode apresentar a células CD8+ ou CD4+, dependendo da via através da qual os antigénios são processados. As células T CD8+ reconhecem antigénios no contexto de MHC de classe I, enquanto que CD4+ reconhecem antigénios no contexto de MHC de classe II. A célula I será estimulada pelo antigénio apresentado através de reconhecimento especifico pelo seu receptor de célula T, resultando na produção de certas proteinas, tais como IL-2, factor de necrose tumoral α (TNF-cx) , ou interferão γ (IFN-γ) , que podem ser medidas quantitativamente (por exemplo, usando um teste de ELISA, um teste de ELISPOT, ou Marcação intracelular de citocinas (ICS)). Para exemplos específicos de testes para a medição de imunogenicidade, ver Exemplos 5-7 abaixo.

Alternativamente, um hibridoma pode ser desenhado de modo a incluir um gene repórter, tal como β-galac-tosidase, que é activado aquando da estimulação do hibridoma de célula T pelos antigénios apresentados. 0 aumento na produção de β-galactosidase pode ser facilmente medido pela sua actividade num substrato, tal como β-galactósido 92 ΡΕ1592441 vermelho de clorofenol, que resulta numa alteração de cor. A alteração de cor pode ser directamente medida como um indicador da apresentação de um antigénio específico. Métodos adicionais para a avaliação in vitro e in vivo da expressão do antigénio das vacinas de Listeria da presente invenção são conhecidos pelos competentes na técnica. É também possível medir directamente a expressão de um antigénio heterólogo particular por Listeria. Por exemplo, um aminoácido marcado radioactivamente pode ser adicionado a uma população celular e a quantidade de radioactividade incorporada numa proteína particular pode ser determinada. As proteínas sintetizadas pela população celular podem ser isoladas, por exemplo por electroforese em gel ou electroforese capilar, e a quantidade de radioactividade pode ser medida quantitativamente para avaliar o nível de expressão da proteína particular. Alternativamente, as proteínas podem ser expressas sem radioactividade e visualizadas por vários métodos, tais como um teste ELISA ou por electroforese em gel ou "Western blot" com detecção utilizando um anticorpo associado a uma enzima ou um anticorpo marcado radioactivamente.

Adicionalmente, nalgumas realizações, a Listeria atenuada (por exemplo, estirpes de Listeria mutantes) que expressam antigénios heterólogos ou autólogos induzem citotoxicidade in vivo contra células que expressam e/ou têm os antigénios (ver, por exemplo, o Exemplo 3, abaixo). Nalgumas realizações, a Listeria atenuada que expressa os 93 ΡΕ1592441 antigénios heterólogos ou autólogos são terapeuticamente eficazes (ver, por exemplo, o Exemplo 4, abaixo).

Apesar de ser possível que a modificação da Listeria possa reduzir o nível de expressão proteica em comparação com a Listeria não atenuada, entende-se que nalgumas realizações a Listeria atenuada é ainda eficaz numa composição ou vacina imunogénica. É a combinação de atenuação com a invasão não fagocitica com expressão proteica adequada que é importante nalgumas realizações da invenção. A eficácia de uma vacina é geralmente relacionada com a dose de antigénio que pode ser administrada pelo micróbio. A atenuação de uma invasão não fagocitica da Listeria pode ser de vários log enquanto que a expressão genética de Listeria ainda é adequadamente mantida. Se a mesma dose de uma Listeria atenuada for comparada com aquela de uma Listeria sem a modificação de atenuação, a expressão do antigénio resultante (tal como avaliada pelos métodos discutidos acima) na população de Listeria atenuada é pelo menos 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ou pelo menos 90% da expressão do antigénio na população de Listeria sem a modificação de atenuação. Uma vez que podem existir vários log de atenuação na invasão não fagocitica, a dose da Listeria atenuada pode ser aumentada de forma segura até vários log, resultando numa quantidade superior de antigénio apresentada pela Listeria atenuada em relação à Listeria sem a modificação de atenuação aquando da vacinação. 94 ΡΕ1592441 III. Vacinas e outras composições compreendendo a Listeria atenuada.

Além da Listeria atenuada aqui descrita, a presente divulgação proporciona uma variedade de composições que compreendem a Listeria atenuada, incluindo composições imunogénicas, composições farmacêuticas, células e vacinas. (Exemplos de Listeria úteis nas composições da presente invenção são descritos na Secção II.A-C, acima, e nos Exemplos, abaixo).

Por exemplo, a divulgação proporciona uma composição farmacêutica compreendendo (a) uma bactéria Listeria que é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio que não é de Listeria, e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável. A divulgação proporciona ainda uma composição farmacêutica compreendendo (a) uma bactéria Listeria que é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas e para a disseminação célula a célula, e (b) um veiculo farmaceuticamente aceitável. A divulgação também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma estirpe Listeria mutante e um veiculo farmaceuticamente aceitável, em que a estirpe Listeria mutante é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas em relação a uma estirpe Listeria não mutante, mas retém uma capacidade de entrar em células 95 ΡΕ1592441 fagocíticas. Numa realização, a estirpe Listeria mutante é deficiente em relação à internalina B. Noutra realização, o genoma da estirpe mutante compreende pelo menos uma mutação em pelo menos um gene que codifica para uma invasina, tal como uma internalina como a internalina B. Noutra realização, a sequência codificante (ou gene) de inlB foi deletada do genoma da estirpe. Ainda noutra realização, as sequências codificantes (ou genes) de ambas inlB e actA foram deletadas. Os competentes na técnica conhecem diversos veiculos adequados para utilização com estirpes bacterianas. A divulgação proporciona ainda um método para a diminuição da toxicidade de uma composição farmacêutica compreendendo uma primeira estirpe de Listeria para administração ao hospedeiro, compreendendo a substituição da primeira estirpe com uma estirpe Listeria mutante, em que a estirpe Listeria mutante é atenuada relativamente á entrada em células não fagociticas relativamente à primeira estirpe Listeria, mas retém uma capacidade de entrar em células fagociticas. Nalgumas realizações, a estirpe mutante é deficiente relativamente à internalina B. Noutras realizações, a estirpe mutante é deficiente em relação a ambas a internalina B e ActA. A divulgação também proporciona composições imunogénicas compreendendo a Listeria atenuada aqui descrita. Por exemplo, a divulgação proporciona uma composição imunogénica compreendendo uma bactéria Listeria atenuada 96 ΡΕ1592441 que é atenuada relativamente à entrada em células não fagocíticas e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio que não é de Listeria. A divulgação proporciona ainda uma composição imunogénica que compreende uma bactéria Listeria atenuada que é atenuada relativamente à entrada em células não fagocíticas e relativamente à disseminação célula a célula.

Além disso, a divulgação proporciona uma composição imunogénica que compreende uma estirpe Listeria mutante, em que a estirpe Listeria mutante é atenuada relativamente à entrada em células não fagocíticas em relação a uma estirpe Listeria não mutante, mas retém uma capacidade de entrar em células fagocíticas, e compreende uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica para um antigénio. Nalgumas realizações, a estirpe é deficiente em relação à internalina B e compreende uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica para um antigénio. Noutras realizações, a estirpe mutante é deficiente em relação a ambas a internalina B e ActA. A divulgação proporciona diversas composições de vacina compreendendo a Listeria atenuada aqui descrita. Por exemplo, a divulgação proporciona uma vacina compreendendo (a) uma bactéria Listeria atenuada que é atenuada relativamente à entrada em células não fagocíticas e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio que não é de Listeria, e (b) um veículo e/ou um adjuvante farmaceuticamente aceitável. A divulgação 97 ΡΕ1592441 proporciona ainda uma vacina compreendendo (a) uma bactéria Listeria atenuada que é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas e para a disseminação célula a célula, e (b) um veículo e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. A divulgação também proporciona uma vacina compreendendo (a) uma bactéria Listeria atenuada que á atenuada relativamente à entrada em células não fagocíti-cas, e (b) um veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. Nalgumas realizações, as vacinas aqui descritas compreendem mais do que um tipo de bactérias Listeria atenuadas. Por exemplo, nalgumas realizações, a vacina compreende múltiplos tipos diferentes de Listeria atenuada. Os diferentes tipos de Listeria atenuada podem diferir uns dos outros em relação aos antigénios que expressam e/ou à natureza das suas modificações e mutações. A presente divulgação proporciona ainda uma vacina que compreende uma estirpe Listeria mutante, em que a estirpe Listeria mutante é atenuada relativamente á entrada em células não fagociticas em relação a uma estirpe Listeria não mutante, mas mantém uma capacidade de entrar em células fagociticas. Nalgumas realizações, a estirpe mutante na vacina é deficiente em relação à internalina B. Noutras realizações, a estirpe mutante na vacina é deficiente em relação a ambas a internalina B e ActA. Nalgumas realizações, a vacina compreende mais do que uma estirpe mutante de Listeria, cada uma das quais é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas. 98 ΡΕ1592441 0 termo vacina tal como aqui utilizado pretende abranger uma vacina profilática, tal como uma administrada para induzir uma resposta imunitária antes da exposição a um agente que abrange um antigénio de modo a permitir ao indivíduo de desenvolver uma resposta imunitária mais forte aquando da exposição àquele antigénio, aumentando deste modo a sua capacidade de resistir ao agente ou às células que contêm o agente. 0 termo vacina também pretende abranger uma vacina terapêutica, tal como uma administrada a um indivíduo que já tem a doença associada com o antigénio da vacina, em que a vacina pode reforçar a resposta imunitária do indivíduo ao antigénio para proporcionar uma capacidade acrescida de combater a doença ou as células que transportam o antigénio. Métodos de administração de uma tal composição de vacina são conhecidos na técnica, e incluem as vias de administração in vitro, oral, intravenosa, intradérmica, intraperitoneal, intramuscular, intralinfática, intranasal e subcutânea. As composições de vacina podem ainda compreender componentes adicionais conhecidos na técnica para melhorar a resposta imunitária a uma vacina, tais como adjuvantes ou moléculas co-estimuladoras. Por exemplo, moléculas co-estimuadoras compreendem um ou mais factores seleccionados do grupo que consiste em GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-14, IL-15, B7.1, B7.2, e B7-DC são opcionalmente incluídas nas composições de vacina da presente invenção. Outras moléculas co-estimuladoras são conhecidas pelos competentes na técnica. 99 ΡΕ1592441 São conhecidas na técnica formulações de vacina e podem incluir diversos aditivos, tais como conservantes, estabilizantes, adjuvantes, antibióticos, e outras substâncias. Estabilizantes, tais como lactose ou glutamato monos-sódico (MSG), são adicionados para estabilizar a formulação de vacina contra diversas condições, tais como variações de temperatura ou um processo de liofilização. As formulações de vacina podem também incluir um fluido de suspensão tal como solução salina ou água estéril. Nalgumas realizações, a vacina é uma formulação congelada ou liofilizada compreendendo um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis que são adequados para administração parenteral ou oral. Noutras realizações, a vacina é uma formulação congelada ou liofilizada compreendendo um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis que são adequados para administração em mucosas ou administração na forma de um aerossol. A eficácia das vacinas pode ser avaliada utilizando modelos in vivo, por exemplo um modelo de ratinho. As vacinas podem ser avaliadas relativamente à sua capacidade de proporcionar ou um efeito profilático ou terapêutico contra uma doença particular. Por exemplo, no caso de doenças infecciosas, uma população de ratinhos pode ser vacinada com uma quantidade desejada da vacina apropriada da invenção, em que a bactéria expressa um antigénio associado a uma doença infecciosa. Este antigénio pode ser da própria Listeria ou pode ser um antigénio 100 ΡΕ1592441 heterólogo. O ratinho pode ser subsequentemente infectado com o agente infeccioso relacionado com o antigénio da vacina e avaliado relativamente à protecção contra a infecção. A progressão da doença infecciosa pode ser observada relativamente a uma população controlo (seja não vacinada ou vacinada apenas com um veiculo ou Listeria que não expressa o antigénio apropriado).

No caso de vacinas contra cancro, estão disponíveis modelos de células tumorais, em que uma linha celular que expressa o antigénio tumoral desejado pode ser injectada numa população de ratinhos ou antes (modelo terapêutico) ou depois (modelo profilático) da vacinação com uma Listeria envolvida na invenção contendo o antigénio associado a tumor desejado ou um antigénio derivado de um antigénio associado a um tumor. A vacinação com uma Listeria contendo o antigénio tumoral pode ser comparada com populações controlo que são ou não vacinadas, vacinadas com o veiculo, ou com uma Listeria que não expressa o antigénio desejado. A eficácia da vacina em tais modelos pode ser avaliada em termos de volume do tumor em função do tempo após a injecção do tumor ou em termos de sobrevivência das populações em função do tempo após a injecção do tumor. Geralmente, a vacina resultará num volume tumoral reduzido na maioria ou na totalidade dos tempos em relação a um controlo negativo (tal como uma amostra não vacinada) e resultara numa sobrevivência mediana mais longa.

Nalgumas realizações da divulgação, o volume do 101 ΡΕ1592441 tumor nos ratinhos vacinados com a Listeria mutante é inferior ou igual ao volume do tumor nos ratinhos controlo. Noutra realização, o volume do tumor nos ratinhos vacinados com a Listeria mutante é pelo menos cerca de 10% , pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 50% inferior ao volume do tumor em ratinhos controlo. Noutra realização, esta diferença no volume do tumor é observada a pelo menos 7, 14, 30, ou a pelo menos 60 dias após o implante dos tumores nos ratinhos. Numa realização, o tempo mediano de sobrevivência nos ratinhos vacinados com a Listeria mutante é aproximadamente o mesmo que aquele em ratinhos vacinados com Listeria controlo. Noutra realização, o tempo mediano de sobrevivência nos ratinhos vacinados com a Listeria atenuada é pelo menos cerca de 1, pelo menos cerca de 3, ou pelo menos cerca de 5 dias mais longo que em ratinhos vacinados com Listeria controlo. Noutras realizações, o tempo mediano de sobrevivência nos ratinhos vacinados com a Listeria atenuada é pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 20 dias, pelo menos cerca de 30 dias mais longo que em ratinhos vacinados com Listeria controlo. Numa realização da invenção, a vacinação com a Listeria mutante é realizada com uma dose de Listeria que é aproximadamente a mesma que a dose de Listeria controlo. Noutra realização, a vacinação da Listeria mutante é doseada de forma segura a um nivel que é pelo menos cerca de 2, cerca de 5, cerca de 10, cerca de 102, cerca de 103, ou pelo menos cerca de 104 vezes mais elevado do que a dose de vacinação da Listeria controlo. 102 ΡΕ1592441

Além das medições da eficácia das vacinas, são também realizadas medições da segurança e toxicidade. Tais métodos para a medição da segurança pode incluir a determinação do número de Listeria mutante que entram nos hepatócitos em comparação com Listeria não mutante. Nalgumas realizações, a Listeria mutante é deficiente em relação à internalina B. Noutras realizações, a Listeria mutante é deficiente em relação tanto à internalina B como a ActA.

Noutro aspecto, a divulgação proporciona um método para a diminuição da patogenicidade de uma estirpe de Listeria utilizada numa vacina, compreendendo a modificação da estirpe de modo a diminuir a capacidade da estirpe em entrar em células não fagociticas, mas retendo substancialmente a capacidade da estirpe em entrar em células fagociticas. Nalgumas realizações, a divulgação proporciona um método para a diminuição da patogenicidade de uma estirpe de Listeria usada numa vacina, compreendendo a modificação da estirpe de modo a torná-la deficiente em relação à internalina B. Nalgumas realizações, a estirpe é ainda modificada para ser deficiente em relação a ActA.

Noutros aspectos, a divulgação proporciona métodos para produzir vacinas. Por exemplo, a divulgação proporciona um método para produzir uma vacina compreendendo o contacto de uma Listeria atenuada (tal como uma estirpe mutante de Listeria) com uma célula apresentadora de antigénio profissional, sob condições adequadas e durante um tempo suficiente para carregar as células 103 ΡΕ1592441 apresentadoras de antigénios profissionais, em que a Listeria é atenuada relativamente á entrada em células não fagociticas em relação a uma Listeria não modificada tal como nativa (por exemplo, deficiente em relação à inter-nalina B) , mas retendo a capacidade de entrar em células fagociticas, e compreende uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica para um antigénio. Ainda noutro aspecto, a divulgação proporciona uma célula apresentadora de antigénio profissional compreendendo uma bactéria Listeria, em que a bactéria Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas. A divulgação também proporciona uma célula apresentadora de antigénio profissional compreendendo uma estirpe de Listeria mutante, em que a estirpe de Listeria mutante é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas em relação a uma estirpe de Listeria não mutante, mas retém a capacidade de entrar em células fagociticas. Nalgumas realizações, a Listeria mutante é contactada com uma célula apresentadora de antigénio profissional ex vivo ou in vivo. Nalgumas realizações, a célula apresentadora de antigénio profissional é uma célula dendritica. Noutras realizações, a célula apresentadora de antigénio profissional é um macrófago. Para descrições de alguns exemplos de antigénios, ver a Secção II.C, acima. IV. Métodos para a indução de respostas imunitárias e métodos de tratamento A presente divulgação também proporciona métodos para a indução de respostas imunitárias e o tratamento e/ou 104 ΡΕ1592441 a prevenção de doenças que compreendem a utilização das Listeria atenuadas, células, composições, e vacinas aqui descritas. (Exemplos de Listeria atenuadas úteis nos métodos da presente invenção são descritos na Secção II. A-D, acima, e nos Exemplos, abaixo. Exemplos de composições, vacinas e células são descritos na Secção III, acima).

Por exemplo, a divulgação proporciona um método para a indução de uma resposta imunitária num hospedeira a um antigénio que não é de Listeria compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo uma bactéria de Listeria que é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para o antigénio que não é de Listeria. A divulgação proporciona ainda um método para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo uma bactéria Listeria que é atenuada tanto relativamente á entrada em células não fagociticas como para disseminação célula a célula, em que a estirpe Listeria mutante compreende um ácido nucleico que codifica para o antigénio. A divulgação proporciona ainda um método para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma vacina compreendendo (a) uma bactéria Listeria que é atenuada relativamente á entrada em células não fagociticas, e (b) um veiculo e/ou um adjuvante farmaceuticamente aceitável. 105 ΡΕ1592441 A divulgação proporciona também um método para a indução de uma resposta imunitária a um antigénio num hospedeiro que compreende a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo uma estirpe Listeria mutante, em que a estirpe Listeria mutante é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas em relação a uma estirpe Listeria não mutante, mas retém uma capacidade de entrar em células fagociticas, e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para o antigénio. A resposta imunitária pode ser uma resposta mediada por células. Numa realização, a resposta imunitária é uma resposta de células T CD8+. Noutra realização, a resposta imunitária é uma resposta de células T CD4+. Ainda noutra realização, a resposta imunitária induzida no hospedeiro compreende ambas as respostas de células T CD8+ e CD4+. Para descrições de alguns exemplos de antigénios, ver a Secção II.C, acima. Numa realização, o antigénio é um antigénio associado a um tumor ou derivado de um antigénio associado a um tumor. Nalgumas realizações, a estirpe mutante é deficiente em relação à internalina B. Noutras realizações, a estirpe mutante é deficiente relativamente a ambas a internalina B como ActA.

Noutro aspecto, a divulgação proporciona um método para a indução da apresentação do antigénio MHC de classe I numa célula apresentadora de antigénio profissional (in vitro, in vivo, ou ex vivo) compreendendo o contacto de uma estirpe mutante de Listeria com a célula 106 ΡΕ1592441 apresentadora de antigénio profissional, em que a estirpe Listeria mutante é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas em relação a uma estirpe de Listeria não mutante, mas retém uma capacidade de entrar em células fagociticas, e compreende uma molécula heteróloga de ácido nucleico que codifica para um antigénio que compreende um epitopo MHC de classe I. Nalgumas realizações, a estirpe mutante é deficiente em relação à internalina B. Noutras realizações, a estirpe mutante é deficiente em relação a ambas a internalina B e ActA.

Adicionalmente, a divulgação proporciona um método para a indução da apresentação de um antigénio MHC de classe I ou para a apresentação de um antigénio MHC de classe II numa célula apresentadora de antigénio (in vivo ou in vitro) , compreendendo o contacto de uma bactéria Listeria com uma célula apresentadora de antigénio, em que a bactéria de Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio que não é de Listeria compreendendo um epitopo MHC de classe I ou um epitopo MHC de classe II. A invenção proporciona ainda um método para a indução da apresentação de um antigénio MHC de classe II numa célula apresentadora de antigénio (in vivo ou in vitro) , compreendendo o contacto de uma bactéria Listeria com uma célula apresentadora de antigénio, em que a bactéria de Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas em relação a uma estirpe Listeria não mutante, mas mantém a capacidade de entrar em 107 ΡΕ1592441 células fagocíticas, e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio que não é de Lis-teria compreendendo um epitopo MHC de classe II. Nalgumas realizações, a estirpe mutante é deficiente em relação à internalina B. Noutras realizações, a estirpe mutante é deficiente em relação a ambas a internalina B e ActA. A divulgação também proporciona um método para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma célula apresentadora de antigénio profissional compreendendo uma bactéria Listeria atenuada, em que a bactéria Listeria é atenuada para entrada em células não fagociticas e compreende um ácido nucleico que codifica para o antigénio. A divulgação proporciona ainda um método para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio, compreendendo os seguintes passos: (a) contacta-se uma bactéria Listeria atenuada com uma célula apresentadora de antigénio do hospedeiro, sob condições adequadas e durante um periodo de tempo suficiente para carregar as células apresentadoras de antigénio, em que a bactéria Listeria atenuada é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para o antigénio; e (b) administra-se a célula apresentadora de antigénio ao hospedeiro. A invenção proporciona ainda um método para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um 108 ΡΕ1592441 antigénio compreendendo os seguintes passos: (a) contactar uma estirpe mutante Listeria com uma célula apresentadora de antigénio profissional do hospedeiro, sob condições adequadas e durante um tempo suficiente para carregar as células apresentadoras de antigénio, em que a estirpe mutante de Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas em relação a uma estirpe Listeria não mutante, mas retêm uma capacidade de entrar em células fagociticas, e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio; e (b) administrar a célula apresentadora de antigénio ao hospedeiro. Numa realização, o antigénio é um antigénio associado a um tumor ou é derivado de um antigénio associado a um tumor. Nalgumas realizações, a estirpe mutante é deficiente em relação à internalina B. Noutras realizações, a estirpe mutante é deficiente em relação a ambas a internalina B e ActA.

Ainda noutro aspecto, a divulgação proporciona um método para a administração selectiva de uma proteína heteróloga em células fagociticas num hospedeiro, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma composição compreendendo uma estirpe mutante de Listeria que é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas em relação a uma estirpe de Listeria não mutante, mas retém substancialmente uma capacidade para entrar em células fagociticas, em que o genoma da estirpe mutante de Listeria compreende pelo menos uma mutação em pelo menos um gene que codifica para uma invasina, tal como uma internalina. 109 ΡΕ1592441 A divulgação proporciona ainda métodos para a prevenção ou o tratamento de uma doença num hospedeiro (tal como cancro, uma doença infecciosa, ou Listeriose), utilizando a Listeria atenuada aqui descrita. Por exemplo, a invenção proporciona um método para a prevenção ou o tratamento de uma doença num hospedeiro compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo uma bactéria de Listeria atenuada que é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio que não é de Listeria. A divulgação também proporciona um método para a prevenção ou o tratamento de doença num hospedeiro compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo uma bactéria Listeria atenuada que é atenuada tanto para a entrada em células não fagociticas como para disseminação célula a célula. A divulgação proporciona ainda um método para a prevenção ou o tratamento de uma doença num hospedeiro, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma vacina compreendendo (a) uma bactéria Listeria atenuada que é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas, e (b) um veiculo e/ou um adjuvante farmaceu-ticamente aceitável.

Num aspecto, a presente divulgação proporciona um método para a prevenção ou o tratamento de uma doença num hospedeiro, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma vacina compreendendo uma estirpe Listeria mutante, em 110 ΡΕ1592441 que a estirpe de Listeria mutante é atenuada para entrada em células não fagociticas em relação a uma estirpe de Listeria não mutante, mas mantém a capacidade de entrar em células fagociticas. A doenças é prevenida ou tratada pela indução de uma resposta imunitária terapeuticamente benéfica contra um antigénio relacionado com a doença. Nalgumas realizações, a estirpe mutante é deficiente relativamente à internalina B. Noutras realizações, a estirpe mutante é deficiente em relação a ambas a internalina B e ActA. Numa realização, a doença é cancro. Noutra realização, a doença é uma doença auto-imune. Ainda noutras realizações, a doença é uma doença infecciosa ou outra doença causada por um patogénio tal como um virus, uma bactéria, um fungo, ou um protozoário. A divulgação também proporciona um método para a prevenção ou o tratamento de uma doença num hospedeiro compreendendo a administração ao hospedeiro de uma quantidade eficaz de uma célula apresentadora de antigénio profissional compreendendo uma bactéria de Listeria atenuada, em que a bactéria de Listeria atenuada é atenuada para entrada em células não fagociticas. A divulgação proporciona ainda uma composição compreendendo uma bactéria de Listeria para utilização médica, em que a bactéria de Listeria é atenuada para entrada em células não fagociticas e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio que não é de Listeria. Noutra realização, a divulgação 111 ΡΕ1592441 proporciona uma bactéria de Listeria para utilização médica, em que a bactéria de Listeria é atenuada para entrada em células não fagociticas e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio que não é de Listeria. A divulgação proporciona também uma composição compreendendo uma bactéria de Listeria para utilização médica, em que a bactéria é atenuada tanto para entrada em células não fagociticas. A divulgação proporciona também uma bactéria de Listeria para utilização médica, em que a bactéria de Listeria é atenuada tanto para entrada em células não fagociticas.

Além disso, a divulgação proporciona uma composição compreendendo uma bactéria de Listeria para utilização médica, em que a bactéria é atenuada tanto para entrada em células não fagociticas como para disseminação célula a célula. A divulgação proporciona também uma bactéria de Listeria para utilização médica, em que a bactéria de Listeria é atenuada tanto para entrada em células não fagociticas como para disseminação célula a célula.

Adicionalmente, a divulgação proporciona a utilização de uma bactéria Listeria para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença não relacionada com e/ou não causada por Listeria, em que a bactéria Listeria é atenuada relativamente á entrada em células não fagociticas e compreende uma molécula de ácido nucleico que 112 ΡΕ1592441 codifica para um antigénio que não é de Listeria. Por exemplo, nalgumas realizações, a doença é cancro e o antigénio é um antigénio tumoral ou é um antigénio derivado de um antigénio tumoral. A divulgação também proporciona a utilização de uma bactéria de Listeria para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença não relacionada com e/ou não causada por Listeria, em que a bactéria Listeria é atenuada relativamente á entrada em células não fagocí-ticas. Nalgumas realizações, a bactéria Listeria é ainda atenuada para a disseminação célula a célula. Nalgumas realizações, a doença é cancro e o antigénio é um antigénio tumoral ou é um antigénio derivado de um antigénio tumoral.

Nalgumas realizações, a utilização da Listeria atenuada na profilaxia ou no tratamento de um cancro compreende a administração da Listeria atenuada a células do sistema imunitário de um indivíduo para prevenir ou tratar um cancro presente ou ao qual o individuo tenha factores de risco acrescidos, tais como exposição ambiental e/ou predisposição familiar. Nalgumas realizações, o individuo que é tratado com a vacina teve um tumor removido e/ou teve cancro no passado. intravenoso A administração da Listeria atenuada, ou de uma composição compreendendo a Listeria atenuada, pode ser qualquer método adequado, incluindo, mas sem limitação, intradérmico, subcutâneo, intraperitoneal, 113 ΡΕ1592441 intramuscular, intralinfático, oral ou intranasal. Nalgumas realizações, a administração da Listeria atenuada é pa-renteral. Nalgumas realizações, utiliza-se uma administração através de uma mucosa.

Nalgumas realizações, as composições compreendendo a Listeria atenuada são administradas a um hospedeiro em combinação com um agente de imunoestimulação. A Listeria atenuada e o agente de imunoestimulação podem ser administrados em simultâneo, sequencialmente ou separadamente. Exemplos de agentes de imunoestimulação incluem, mas não se limitam a, IL-2, IL-12, GMCSF, IL-15, B7.1, B7.2, e B7-DC e IL-14. Nalgumas realizações, o agente de imunoestimulação é um anticorpo ou uma pequena molécula que tem como alvo moléculas de regulação das células T. Por exemplo, nalgumas realizações, o agente de imunoestimulação é CTLA-4 ou BTLA-4. Nalgumas realizações, o agente de imunoestimulação é um agente que tem como alvo as células T reguladoras. Por exemplo, o agente de imunoestimulação utilizado em conjunto com a Listeria atenuada pode ser um anticorpo anti-CD25, um anticorpo anti-LAG-3, ou citoxano. 0 hospedeiro nos métodos aqui descritos é qualquer vertebrado, preferentemente um mamifero, incluindo animais domésticos, animais de desporto, e primatas, e incluindo humanos. A dose das composições farmacêuticas ou vacinas que são dadas ao hospedeiro irão variar dependendo da 114 ΡΕ1592441 espécie do hospedeiro, da dimensão do hospedeiro, e da condição ou doença do hospedeiro. A dose das composições irá também depender da frequência de administração das composições e da via de administração. Nalgumas realizações, uma única dose compreende de cerca de 102 a cerca de 1012 dos organismos Listeria atenuados. Noutra realização, uma única dose compreende de cerca de 106 a cerca de 1011 dos organismos Listeria atenuados. Ainda noutra realização, uma única dose da composição farmacêutica ou vacina compreende desde cerca de 107 a cerca de IO10 dos organismos atenuados. V. Kits A divulgação proporciona ainda kits (ou artigos de fabrico) compreendendo a Listeria atenuada da invenção (tal como descrito acima e nos Exemplos abaixo).

Num aspecto, a divulgação proporciona um kit compreendendo (a) uma composição compreendendo uma bactéria Listeria, em que a bactéria Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio que não é de Listeria; e (b) instruções para a utilização da composição na prevenção ou no tratamento de uma doenças num hospedeiro. Nalgumas realizações, as instruções estão numa etiqueta no kit ou no seu interior. Noutras realizações, as instruções estão numa bula contida no interior do kit. 115 ΡΕ1592441

Noutro aspecto, a divulgação proporciona um kit compreendendo (a) uma composição compreendendo uma bactéria Listeria, em que a bactéria Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas e compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio que não é de Listeria; e (b) instruções para a administração da composição a um hospedeiro. Nalgumas realizações, as instruções estão numa etiqueta no kit ou no seu interior. Noutras realizações, as instruções estão numa bula contida no interior do kit. Nalgumas realizações, as instruções estão numa etiqueta no kit ou no seu interior. Noutras realizações, as instruções estão numa bula contida no interior do kit.

Ainda noutro aspecto, a divulgação proporciona um kit compreendendo (a) uma composição compreendendo a bactéria Listeria, em que a bactéria Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagociticas; e (b) instruções para a utilização da composição na prevenção ou no tratamento de uma doença num hospedeiro. Nalgumas realizações, a bactéria Listeria é ainda atenuada para disseminação célula a célula. Nalgumas realizações, as instruções estão numa etiqueta no kit ou no seu interior. Noutras realizações, as instruções estão numa bula contida no interior do kit. A divulgação proporciona ainda um kit compreendendo (a) uma composição compreendendo a bactéria Listeria, 116 ΡΕ1592441 em que a bactéria Listeria é atenuada relativamente à entrada em células não fagocíticas; e (b) instruções para a administração da composição a um hospedeiro. Nalgumas realizações, a bactéria Listeria é ainda atenuada para disseminação célula a célula. Nalgumas realizações, as instruções estão numa etiqueta no kit ou no seu interior. Noutras realizações, as instruções estão numa bula contida no interior do kit.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são proporcionados para ilustrar, mas não para limitar, a invenção.

Exemplo 1. Construção das estirpes Listeria mutantes. A. Preparaçao de estirpes Listeria mutantes.

As estirpes de Listeria foram derivadas de 10403S (Bishop et al., J. Immunol. 139:2005 (1987)). As estirpes de Listeria com deleções na grelha de leitura dos genes indicados foram geradas por SOE-PCR e permuta de alelos com métodos estabelecidos (Camilli, et al, Mol. Microbiol. 8:143 (1993)). A estirpe mutante LLO L461T (DP-L4017) foi descrita em Glomski, et al, J. Cell. Biol. 156: 1029 (2002). O mutante AactA (DP-L4029) é a estirpe DP-L3078 descrita em Skoble et al., J. of Cell Biology, 150: 527-537 (2000), com um profago temperado. (A introdução de profagos temperados é descrita em (Lauer et al., J. Bacteriol. 117 ΡΕ1592441 184:4177 (2002); Publicação de Patente U.S. No. 2003/ 0203472).) O mutante LLO“ (DP-L4027) (Lauer et al., J. of Bacteriology, 184:4177-4186 (2002)), e LLO Δ26 (DP-L4042) (Decatur et al, Science 290:992 (2000)) foram também descritos anteriormente. A construção de uma estirpe LactALuvrAB é descrita como L4029/uvrAB. DP-L4029uvrAB (também conhecida como AactAAuvrAB ou actA~ / uvrAB~) foi depositada na ATCC a 3 de Outubro de 2003, atribuindo-se PTA-5563. B. Construção de pKSV7dl inlB para deleção de inlB de Listeria por uma permuta de alelos. A deleção de inlB de Listeria DP-L4029 (ou de outras estirpes mutantes seleccionadas ou de Listeria nativa) pode ser efectuada por permuta de alelos, tal como descrito por Camilli et al., Mol. Microbiol. 8:143-147 (1993). Pode-se usar a técnica de Splice Overlap Extension (SOE) PCR para preparar a construção usada no procedimento de permuta de alelos. A fonte do gene da internalina B é a sequência listada com o número de acesso no Genbank AL591975 (Listeria monocytogenes estirpe EGD, genoma completo, segmento 3/12; região do gene inlB: nts. 97008-98963), aqui incorporada por referência na sua totalidade, e/ou a sequência listada com o número de acesso no Genbank NC_003210 (Listeria monocytogenes estirpe EGD, genoma completo, região do gene inlB: nts. 457008-458963), aqui incorporada por referência na sua totalidade. 118 ΡΕ1592441

Nas reacções de PCR primárias, aproximadamente 1000 pbs da sequência a montante e a jusante das extremidades 5' e 3' do gene inlB de Listeria, respectivamente, são amplificadas usando os seguintes moldes e iniciadores: Molde: ADN genómico DP-L4056 ou DP-L4039

Par iniciador 1 (para amplificação da região a montante da extremidade 5' de inlB):

Lm-96031F: 5'-GTTAAGTTTCATGTGGACGGCAAAG (SEQ ID NO:2) (Tm: 72 °C)

Lm-(3' inlB-R +) 97020R: 5'-AGGTCTTTTTCAGTTAACTATCC- TCTCCTTGATTCTAGTTAT (SEQ ID NO:3) (Tm: 114° C) (A sequência sublinhada complementar à região a jusante da extremidade carboxilo InlB).

Tamanho do amplicão (pbs): 1007

Par iniciador 2 (para amplificação da região a jusante da extremidade 3' de inlB):

Lm-(5' inlB-F +) 98911F: 5'- CAAG GAGAGGATAGTT AAC T GAAAAAGAC C T AAAAAAGAAG G C (SEQ ID NO:4) (Tm: 118 °C) (A sequência sublinhada complementar à região a montante da extremidade amino InlB)

Lm-99970R: 5'-TCCCCTGTTCCTATAATTGTTAGCTC (SEQ ID NO:5) (Tm: 74°C)

Tamanho do amplicão (pbs): 1074 119 ΡΕ1592441

Na reacção de PCR secundária, os amplicões primários de PCR são fundidos através de SOE PCR, tirando vantagem da complementaridade entre o iniciador inverso do par 1 e o iniciador directo do par 2. Isto resulta na deleção precisa da sequência codificante inlB: nts. 97021-98910=1889 pbs. Os seguintes molde e iniciadores foram utilizados na reacção de PCR secundária:

Molde: Reacções de PCR primárias limpas Par de iniciador:

Lm-96043F: 5'-GTGGACGGCAAAGAAACAACCAAAG (SEQ ID NO: 6) (Tm: 74 °C)

Lm-99964R: 5'-GTTCCTATAATTGTTAGCTCATTTTTTTC (SEQ ID NO:7) (Tm: 7 4 °C) (Tamanho do amplicão (pbs): 2033)

Um protocolo para completar o processo de construção é como se segue:

As reacções de PCR primárias (3 ciclos de temperatura) são realizadas utilizando a ADN polimerase Vent (NEB) e 10 yL de uma cultura durante a noite a 30°C de Listeria DP-L4056 ou DP-L4029 lavada. A dimensão esperada dos amplicões de Listeria por gel de agarose a 1% (1007 pbs e 1074 pbs). As reacções de PCR primárias são purificadas em gel e o ADN eluido com GeneClean (BIO 101). É realizada uma reacção de PCR secundária, utilizando quantidades aproximadamente iguais de cada 120 ΡΕ1592441 reacção primária como molde (cerca de 5 yL) . O tamanho esperado do amplicão de Listeria da reacção secundária de PCR é verificada por gel de agarose a 1% (2033 pbs) . Adicionam-se resíduos de adenosina nas extremidades 3' do amplicão de Listeria dl inlB com polimerase Taq. O amplicão de Listeria dl inlB é então inserido num vector pCR2.1-TOPO. O ADN plasmídico pCR2.1-TOPO-dl inlB é digerido com Xhol e Kpnl e o fragmento de 2123 pb é purificado em gel. O fragmento Kpnl/Xhol de 2123 pb é inserido num vector pKSV7 que foi preparado por digestão com Kpnl e Xhol e tratamento com CIAP (pKSV7-dl inlB) . A fidelidade da sequência dl inlB em pKSV7-dl inlB é então verificada. O gene inlB é deletado das estirpes de Listeria desejadas por permuta de alelos com o plasmídeo pKSV7-dl inlB. C. Construção de estirpes que expressam o antigénio.

Foram preparadas estirpes de Listeria mutantes que expressam uma forma truncada de um antigénio modelo ovalbumina (OVA), o epitopo imunodominante do cancro colorrectal de ratinho (CT26) conhecido como AH1 (SPSYVYHQF (SEQ ID NO:8)), e o epitopo alterado AH1-A5 (SPSYAYHQF (SEQ ID NO:9); Slansky et al., Immunity, 13:529-538 (2000)). O vector integracional pPL2 (Lauer et al., J. Bacteriol. 184:4177 (2002); Publicação de Patente U.S. No. 2003/ 0203472) foi usado para produzir estirpes de Listeria 121 ΡΕ1592441 recombinantes OVA e AH1-A5/OVA contendo uma única cópia integrada num local inócuo do genoma de Listeria. i. Construção de Listeria que expressa OVA (DP-L4056).

Prepara-se primeiro uma cassete de expressão de antigénio que consiste na LLO deletada da hemolisina fundida com OVA truncada e contida no vector de integração pPL2 (pPL2/LL00VA). A estirpe de vacina Listeria-OVA é obtida através da introdução de pPL2/LL0-0VA na estirpe L. monocytogenes DP-L4056 com fago temperado no local de ligação PSA (Phage from ScottA) tARNArg-attBB' .

Utiliza-se PCR para amplificar a LLO deletada de hemolisina utilizando o seguinte molde e iniciadores:

Fonte: ADN genómico DP-L4056 Iniciadores:

Directo (Kpnl-LLO nts. 1257-1276): 5'-CTCTGGTACCTCCTTTGATTAGTATATTC (SEQ ID NO:10) (Tm: LLO-esp: 52°C. Total: 80°C).

Inverso (BamHI-XhoI-LLO nts. 2811-2792): 5'-CAATGGATCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATCCC (SEQ ID NO:11) (Tm: LLO-esp: 52°C. Total: 102°C).

Também se utiliza PCR para amplificar a OVA amplificada utilizando o seguinte molde e iniciadores: Fonte: ADN plasmidico pDP3616 de E. coli DP-E3616 (Higgins et al., Mol. Molbiol. 31:1631-1641 (1999)). 122 ΡΕ1592441

Iniciadores :

Directo (Xhol-Ncol cADN OVA nts. 174-186) : 5'-ATTTCTCGAGTCCATGGGGGGTTCTCATCATC (SEQ ID NO:12) (Tm: OVA-esp: 60°C. Global: 88°C).

Inverso (Xhol-NotI-HindIII) : 5'-GGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTT (SEQ ID NO:13) (Tm: Global: 82°C).

Um protocolo para completar o processo de construção envolve primeiro cortar o amplicão LLO com Kpnl e BamHI e inserir o vector Kpnl/BamHI no vector pPL2 (pPL2-LLO) . 0 amplicão OVA é então cortado com Xhol e Notl e inserido em pPL2-LL0 que foi cortado com Xhol/Notl. (Nota: o vector pPL2 não contém quaisquer locais Xhol; pDP-3616 contém um local Xhol, que é explorado no desenho do iniciador inverso OVA). A construção pPL2/LL0-0VA é verificada por análise de restrição (Kpnl-LLO-Xhol-OVA-Notl) e sequenciação. 0 plasmideo pPL2/LL0-0VA é introduzido em E. coli por transformação, seguindo-se a introdução e integração em Listeria (DP-L4056) por conjugação, exacta-mente tal como descrito por Lauer et al. (ou em qualquer outra estirpe desejada de Listeria, tal como um mutante AinlB ou um mutante duplo AactAAinlB).

Uma descrição da inserção de uma cassete de expressão de antigénio que expressa OVA pode também ser encontrada no Exemplo 8 do pedido provisório de patente U.S com o titulo "Free-Living Microbe Based Vaccine Compositions", U.S. Ser. No. 60/511,869, submetido a 15 de Outubro de 2003. 123 ΡΕ1592441 ii. Construção de estirpes Listeria que expressam AHl/OVA ou AH1-A5/0VA.

Para preparar Listeria que expressam ou a sequência de antigénio AHl/OVA ou AH1-A5/0VA, são primeiramente preparados insertos com o antigénio a partir de oligonucleótidos e depois ligadas no vector pPL2-LL0-0VA (preparado como descrito acima).

Os seguintes oligonucleótidos são usados na preparação do inserto AH1 ou AH1-A5:

Inserto do epitopo AHl (extremidades compatíveis Clal-Pstl) :

Oligo da cadeia superior (AHl Top): 5'-CGATTCCCCTAGTTATGTTTACCACCAATTTGCTGCA (SEQ IDN0:14) Oligo da cadeia inferior (AHl Bottom): 5'-GCAAATTGGTGGTAAACATAACTAGGGGAAT (SEQ ID NO:15)

Inserto do epitopo AH1-A5 (extremidades compatíveis Ciai-Avall) : A sequência do epitopo AH1-A5 é SPSYAYHQF (SEQ ID NO: 9)

(5'-AGT CCA AGT TAT GCA TAT CAT CAA TTT-3') (SEQ ID N0:16). Superior: 5'-CGATAGTCCAAGTTATGCATATCATCAATTTGC (SEQ ID NO:17)

Inferior: 5'-GTCGCAAATTGATGATATGCATAACTTGGACTAT (SEQ ID NO:18) 0 par de oligonucleótidos para um dado epitopo é misturado numa razão equimolar, aquecido a 95°C durante 5 124 ΡΕ1592441 min. Deixa-se então a mistura de oligonucleótidos arrefecer lentamente. Os pares de oligonucleótidos emparelhados são então ligados a uma razão molar de 200 para 1 com o plasmideo pPL2-LLO/OVA preparado por digestão com as enzimas de restrição relevantes. A identidade da nova construção pode ser verificada por análise de restrição e/ou sequenciação. O plasmideo pode então ser introduzido em E. coli por transformação, seguindo-se a introdução e integração em Listeria (DP-L4056) por conjugação, exactamente tal como descrito por Lauer et al. (ou em qualquer outra estirpe desejada de Listeria, tal como um mutante Δ inlB ou um mutante duplo AactAAinlB).

Exemplo 2. Estudos de patogenicidade de Listeria A dose letal mediana (DL50) de algumas das estirpes Listeria mutantes foi determinada por infecção IV em ratinhos. Infectaram-se três a cinco ratinhos fêmea C57BL/6 IV com três diluições de 5 vezes da estirpe indicada. Os ratinhos foram monitorizados diariamente durante 10 dias e sacrificados quando apresentam sinais de sofrimento. A dose letal mediana foi calculada. Os dados são apresentados na Tabela 1, abaixo. Os resultados mostram que as estirpes Listeria mutantes que são deficientes em relação à internalina B (ΔinlB AactAAinlB e AactAAínlAB) são menos tóxicas quando combinadas com uma deleção actA. A estripe apenas ΔinlB apresenta uma toxicidade similar à Listeria nativa. 125 ΡΕ1592441

Tabela 1. Estirpes de Listeria monocytogenes atenuadas

Estirpe Genótipo Fenótipo Patogenicidade DL50 (ufc em ratinhos C57BL/6) Parental DP-L4056 AinlB Nativo 1 x 105 DP-L4406 Nativo; 10403S, sem fago Infecção limitada mediada por inlB 1 x 105 DP-L4029 AactA Disseminação célula a célula deficiente 1 x 108 AactAAinlB Não ocorre nucleação da actina; disseminação célula a célula deficiente; infecção limitada mediada por inlB CO O \—1 X «—1 AactAAinlB O \—1 X «—1

Exemplo 3. Avaliação da actividade citotóxica in vivo em ratinhos vacinados com Listeria monocytogenes.

Realizou-se uma série de estudos para avaliar a capacidade dos ratinhos vacinados em lisar células alvo especificas para um antigénio in vivo. No primeiro estudo, vacinaram-se ratinhos Balb/c ou por via intravenosa (IV) ou por via intramuscular (IM) com estirpes Listeria monocytogenes DP-L4029 (AactA), DP-L4029 AinlB (AactAAinlB) e as mesmas estirpes foram modificadas para expressar AH1-A5 de acordo com a Tabela 2. As construções de Listeria que expressam AH1-A5 também expressam LLO deletada da hemolisina e OVA truncada (ver Exemplo l.C, acima) A dose de vacinação foi de 0,1 DO50. Uma população alvo foi 126 ΡΕ1592441 preparada através da colheira de baços de 10 ratinhos Balb/c "narve" em meio RPMI 1640. As células foram dissociadas e os glóbulos vermelhos foram lisados. Os glóbulos brancos foram contados e divididos em duas populações iguais. Cada grupo foi pulsado com um péptido específico, seja o péptido alvo (AH1, SPSYVYHQF (SEQ ID NO: 8), da SynPep, Dublin, CA) ou controlo (β-gal, TPHPARIGL (SEQ ID NO:19)), a 0,5 pg/mL durante 90 minutos a 37°C. As células foram então lavadas 3 vezes em meio e duas vezes em PBS + 0,1% BSA. As células foram ressuspendidas a 1 x 107 por mL em PBS + 0,1% BSA morno (10 mL ou menos) para marcação com éster succinimidílico do diacetato de carboxifluoresceina (CFSE, Molecular Probes, Eugene, OR) . Adiciona-se à suspensão celular alvo, 1,25 pL de uma solução stock a 5 mM de CFSE e a amostra foi misturada por agitação em vórtex. As células foram incubadas a 37°C durante 10 minutos. A coloração foi parada através da adição de um grande volume (>40 mL) de PBS gelado. As células foram lavadas duas vezes à temperatura ambiente com PBS, depois ressuspendidas e contadas. Cada suspensão celular foi diluída a 50 x 106 por mL, e misturou-se 100 pL de cada população e injectou-se através da veia caudal ou de ratinhos "naive" ou vacinados 6 dias após a vacinação. Após 12-24 horas, os baços foram recolhidos e analisou-se um total de 5 x 106 células por citometria de fluxo. As alturas dos picos de fluorescência elevado (alvo) e baixo (controlo) foram quantificadas e a razão de ambas foi usada para estabelecer a percentagem da lise celular alvo em relação á população controlo HBSS. Os resultados são apresentados na Tabela 2 e na Figura IA. (As 127 ΡΕ1592441 tabelas neste Exemplo indicam as médias dos três ratinhos, enquanto que as fiquras mostram histoqramas representativos de ratinhos individuais). A vacinação utilizando AactAAinlB vs. utilizando ΔactA mostra uma melhoria na citotoxicidade in vivo especifica do antigénio quando administrada por via IV mas não IM.

Tabela 2. Citotoxicidade in vivo (% morte das células alvo em relação a uma amostra controlo não vacinada) de ratinhos Balb/c vacinados como indicado.

Imunização # de ratinhos Dose de vacinação % morte das células alvo HBSS 3 100 μΐ, IV 0 AactA 3 5 x 106 em 100 μΔ IV -0,1 AactA AH1-A5 3 5 x 106 em 100 μΔ IV 11,5 AactAAinlB 3 1 x 107 em 100 μΔ IV 1,7 AactAAinlB AH1-A5 3 1 x 107 em 100 μΔ IV 23,5 AactA 3 5 x 106 em 100 μΔ IV 1,5 AactA AH1-A5 3 5 x 106 em 100 μΐ, IV 8,5 AactAAinlB 3 1 x 107 em 100 μΐ, IV 2,8 AactAAinlB AH1-A5 3 1 x 107 em 100 μΐ, IV 8,7

Outro estudo foi realizado utilizando AactA assim como o mutante duplo AactAAinlB, ambas as estirpes expressando AH1-A5, vacinando por IV de acordo com a Tabela 3. Neste estudo, as células de baço "naive" foram pulsadas com β-gal, AH1, ou P60-217 (KYGVSVQDI (SEQ ID NO:20), um controlo especifico de Listeria) . As células pulsadas com β-gal foram marcadas com CFSE baixo, a AH1 e P60-217 com CFSE elevado. Dois ratinhos de cada conjunto foram 128 ΡΕ1592441 injectados no dia 5 com células pulsadas com β-gal e AH-1 tal como acima. Os restantes dois de cada conjunto foram injectados no dia 5 com células pulsadas com β-gal e P60-217. Os resultados são apresentados na Tabela 3 e na Figura 1B.

Tabela 3. Citotoxicidade in vivo (% morte das células alvo relativamente a uma amostra controlo não vacinada) de ratinhos Balb/c vacinados como indicado.

Imunização # de ratinhos Dose de vacinação Alvo % morte das células alvo HBSS 2 100 uL P60-217 0 AactA AH1-A5 2 5 x 106 em 100 ]iL P60-217 62,4 AactAAinlB AH1-A5 2 1 x 107 em 100 μΐ. P60-217 42,0 HBSS 2 100 uL AH1 0 ΔactA AH1-A5 2 5 x 106 em 100 pL AH1 19,7 AactAAinlB AH1-A5 2 1 x 107 em 100 çL AH1 O 00 C\1

Realizou-se outro estudo utilizando o mutante duplo /AactA/AinlB com ou sem AH1-A5, vacinando por via IV de acordo com a Tabela 4. Neste estudo, células de baço "naive" foram pulsadas com β-gal, AH1, ou AH1-A5 (SPSYAYHQF (SEQ ID NO:9)). As células pulsadas com β-gal foram marcadas com CFSE baixo, a AH1 e AH1-A5 com CFSE elevado. Três ratinhos de cada conjunto foram injectados no dia 6 com células pulsadas com β-gal e AH-1 tal como acima. Os restantes três de cada conjunto foram injectados no dia 6 com células pulsadas com β-gal e AH1-A5. Os resultados são apresentados na Tabela 4 e na Figura 1C. 129 ΡΕ1592441

Tabela 4. Citotoxicidade in vivo (% morte das células alvo relativamente a uma amostra controlo não vacinada) de ratinhos Balb/c vacinados como indicado.

Imunização # de ratinhos Dose de vacinação Alvo % morte das células alvo HBSS 3 100 μΐι AH1 0 AactAAinlB 3 1 x 107 em 100 pL AH1 0,7 AactAAinlB AH1-A5 3 1 x 107 em 100 pL AH1 31,8 HBSS 3 100 pL AH1-A5 0 AactAAinlB 3 1 x 107 em 100 pL AH1-A5 5,7 AactAAinlB AH1-A5 3 1 x 107 em 100 pL AH1-A5 94,9

Exemplo 4. Vacinação terapêutica com o mutante duplo de Listeria monocytogenes hactAhinlB

Utilizando ratinhos Balb/c, injectaram-se células tumorais CT26 (ATCC CRL-2639) nos ratinhos (2 x 105 em 100 pL IV em HBSS) para estabelecer metástases nos pulmões. As células CT26 são um adenocarcinoma do cólon murino que expressa o epitopo MMTV gp70 AH1. (As células foram ainda modificadas para expressar um antigénio tumoral humano, apesar da sua caracteristica não ser relevante para os dados aqui apresentados). Foram realizados vários estudos para avaliar a utilização de Listeria monocytogenes AactAAinlB na qualidade de uma estirpe eficaz para vacina terapêutica. Num estudo, as estirpes Listeria monocytogenes AactA, AactA modificada para expressar AH1-A5, e AactAAinlB modificada para expressar AH1-A5, foram usadas para vacinar 130 ΡΕ1592441 grupos de treze ratinhos. Todas as estirpes foram crescidas em meio BHI (Brain Heart Infusion, Fisher Scientific) a 37°C a 300 rpm e congelou-se antes da utilização. O stock congelado da cada estirpe foi diluído em HBSS e os ratinhos foram vacinados intravenosamente com 1 x 107 UFC em 100 yL para cada estirpe quatro dias após o implante tumoral, assim como com 100 yL de HBSS controlo. Vinte dias após o implante tumoral, três ratinhos por grupo foram sacrificados e os pulmões foram recolhidos (apresentado na Figura 2A) .

Os restantes dez ratinhos por grupo foram monitorizados relativamente à sobrevivência (dados não apresentados). Realizaram-se estudos em grupos de dez ratinhos (apenas sobrevivência, os pulmões não foram recolhidos de qualquer dos ratinhos) usando AactA AH1-A5, e AactAAinlB AH1-A5 assim como L461T expressando OVA como um antigénio irrelevante controlo num estudo e AactA expressando FluHA como um antigénio irrelevante noutro estudo. Os resultados de sobrevivência para estes estudos são apresentados nas Figuras 2B e 2C, respectivamente, O antigénio AH1 é endógeno aos ratinhos, de tal modo que qualquer efeito de imunização seria quebrar a tolerância imunitária nos ratinhos. Os resultados indicam que o mutante AactAAinlB é uma vacina eficaz que quebra a tolerância neste modelo e melhora significativamente a sobrevivência em ratinhos com tumor. 131 ΡΕ1592441

Exemplo 5. Imunogenicidade de várias estirpes de Listeria monocytogenes após administração intramuscular.

Injectaram-se ratinhos C57BL/6 (3 por grupo) por via IM com 100 yL de HBSS contendo 0,1 DL50 de estirpes Listeria monocytogenes indicadas na Tabela 5. Todas as estirpes foram crescidas em meio BHI (Brain Heart Infusion, Fisher Scientific) a 37°C a 300 rpm e armazenaram-se congeladas antes da utilização. Os ratinhos foram sacrificados 7 dias após vacinação e os baços foram recolhidos e testados para Marcação intracelular de citocinas (ICS).

Para ICS, as células de baço de grupos vacinados e controlo de ratinhos foram incubados com o péptido SL8 OVA25 7-2 64 (antigénio SL8 OVA, SIINFEKL (SEQ ID NO:21), Invitrogen, San Diego, CA) gue estimula células CD8+ específicas para OVA, LLOigo (NEKYAQAYPNVS (SEQ ID NO:22), Invitrogen) um epitopo MHC de classe II para a listeriolisina O (antigénio Listeria) , ou LL0296 (VAYGRQVYL (SEQ ID N0:23), Invitrogen), um epitopo MHC de classe I para a listeriolisina O, durante 5 horas na presença de Brefeldina A (Pharmingen). A Brefeldina A inibe a secreção das citocinas produzidas pela estimulação das células T. Utilizaram-se como controlo células de baço com um péptido MHC de classe I irrelevante. Utilizaram-se como controlo positivo células de baço estimuladas com PMA (forbol-12-miristato-13-acetato, Sigma) 20 ng/mL e ionomicina (Sigma) 2 yg/mL para marcação de citocinas intracelular IFN-γ e TNF-cx. Para a detecção da expressão citoplasmática de citocinas, as células foram marcadas com mAb FITC-anti-CD4 132 ΡΕ1592441 (RM 4-5) e mAb PerCP-anti-CD8 (53-6.7), fixadas e permeabilizadas com solução Cytofix/CytoPerm (Pharmingen), e marcadas com mAb anti-TNF-α conjugado com PE (MP6-XT22) e mAb anti-IFN-γ conjugado com APC (XMG1.2) durante 30 minutos em gelo. A percentagem de células que expressam IFN-γ e/ou TNF-α intracelular foi determinada por citometria de fluxo (FACScalibur, Becton Dickinson, Moun-tain View, CA) e os dados foram analisados com o programa informático CELLQuest (Becton Dickinson Immunocytometry System). Uma vez que as marcas fluorescentes nos vários anticorpos podem ser todas distinguidas pelo FACScalibur, as células apropriadas foram identificadas delimitando aquelas CD8+ e CD4+ que foram marcadas com um ou ambos os anti-IFN-γ ou anti-TNF-α. Os resultados são indicados nas Figuras 3A-F. A estirpe AactAAinlB é uma das estirpes mais eficazes em provocar uma resposta imunitária especifica a OVA.

Tabela 5. Vacinação de ratinhos C57BL/6 com várias estirpes de Listeria monocytogenes.

Estirpe de vacinação Descrição Dose de vacinação DP-L4029 AactA 1 x 107 DP-L4017 OVA Mutante L461T LLO, expressa OVA 7,5 x 106 DP-L4027 OVA Mutante Δή_Γ (LLO”), expressa OVA 1 x 108 DP-L4029 OVA Mutante AactA, expressa OVA 1 x 107 DP-L4038 OVA Mutante duplo àactA L461T, expressa OVA 2 x 107 DP-L4042 OVA Mutante LLO Δ26 (PEST”), expressa OVA 5 x 107 DP-L4056 OVA Nativa, expressa OVA 5 x 104 DP-L4097 OVA Mutante S44A LLO, expressa OVA 1 x 107 DP-L4364 OVA Mutante ΔΙρΙ, expressa OVA 2 x 107 DP-L4384 OVA Mutante duplo IIP S44A/L461T, expressa OVA 5 x 107 133 ΡΕ1592441 (continuação)

Estirpe de vacinação Descrição Dose de vacinação DP-L4404 OVA Mutante duplo ΔinlAhinlB, expressa OVA 5 x 104 DP-L4405 OVA Mutante hinlA, expressa OVA 5 x 104 DP-L4406 OVA Mutante ΔίηΙΒ, expressa OVA 1 x 105 P60-LLO OVA Mutante ΔΡ60, egressa OVA 1 x 106 DP-L4029 lplA~ OVA Mutante duplo AactAAlplA, expressa OVA co O \—1 X CM DP-L4029 ΔinlB OVA Mutante duplo AactAAinlB, expressa OVA co O i—1 X i—1 MACKuvr” LLO OVA/AH1 Mutante àuvr, expressa OVA/AH1 2 x 105

Exemplo 6. Avaliação da imunidade específica para OVA induzida por estirpes Listeria monocytogenes em ratinhos C57BL/6.

In j ectaram-se por via IV C57BL/6 (3 por grupo) com 200 yL de HBSS contendo 0,1 DL5o das estirpes indicadas na Tabela 6. A estirpe Δ inlB foi injectada a uma dose demasiado elevada e aqueles ratinhos não sobrevivem 7 dias. Os ratinhos foram sacrificados 7 dias após a vacinação e os baços foram recolhidos e avaliaram-se respostas das células T específicas para antigénios ao antigénio ovalbumina heterólogo (OVA) e ao antigénio de Listeria, LLO, por ICS tal como no Exemplo 5. Além de se estimular células de baço de ratinhos vacinados e controlo com os epitopos de células T para OVA, SL8 (OVA257-264) , e para LLO (LL0190-201, LLO296-304), as células foram estimuladas durante 5 horas com um timoma murino derivado de ratinhos C57BL/6 (EL-4) e

EL-4 transfectadas de forma estável com um plasmídeo que codifica para a ovalbumina (EG-7). As células estimuladoras foram usadas ou vivas ou após inactivação com 150 μΜ de psoraleno S-59 e luz 3 J/cm2 (dispositivo de irradiação FX 134 ΡΕ1592441 1019, Baxter Fenwall, Round Lake, IL). A inactivação com S-59 é referida como um tratamento fotoquímico (PCT) e resulta na inactivação completa das células. Os resultados, excluindo as amostras estimuladas com LLO, para IFN-γ são apresentadas na Figura 4. A estimulação comparável de células de baço de ratinhos vacinados foi observada quando se utilizaram ou as células óptimas SL8 de epitopo de célula T ou células tumorais inteiras, vivas ou inacti-vadas, durante as 5 horas de estimulação. A estimulação com células inteiras implica que as células T especificas para OVA reconhecem niveis endógenos de OVA no contexto de células tumorais. A estirpe AactAàinlB resulta numa resposta especifica para OVA relativamente forte relativamente à estimulação com péptido assim como com células inteiras.

Tabela 6. Vacinação de ratinhos C57BL/6 com várias estirpes de Listeria monocytogenes.

Estirpe de vacinação Descrição Dose de vacinação (UFC) HBSS Controlo 100 pL DP-L4029 AinlB Mutante duplo AactAAinlB CO O \—1 X «—1 DP-L4056 OVA Nativa 5 x 104 DP-L4017 OVA Mutante LIO L461T 7,5 x 106 DP-L4029 OVA AactA γ- Ο \—1 X «—1 DP-L4364 OVA lplX 2 x 107 DP-L4406 OVA AinlB 1 x 106 DP-L4038 OVA Mutante duplo AactA L461T 2 x 107 DP-L4029 lplA~ OVA Mutante duplo AactAAlplA 2 x 108 DP-L4017 lplA~ OVA Mutante duplo IplK L461T 1 x 107 DP-L4029 AinlB OVA Mutante duplo AactAAinlB 1 x 108 135 ΡΕ1592441

Foi realizado outro estudo para observar uma resposta à dosagem usando Listeria monocytogenes nativa, e as estirpes AactA e AactAAinlB modificadas para expressar OVA. Injectaram-se por via IV ratinhos C57BL/6 (3 por grupo) com 200 yL de HBSS como se segue; nativa a 5 x 104, 5 x 103, 5 x 102, 5 x 101, AactA a 1 x 107, 1 x 106, 1 x 105, 5 x 104, 1 x 104, e AactAAinlB a 1 x 108, 1 x 107, 1 x 106, 1 x 105, 5 x 104 . Os ratinhos foram sacrificados 7 dias após vacinação e os baços foram recolhidos e testados para ICS, imunoestimulação com os péptidos SL8, LLO190 e LLO296· Os resultados são apresentados na Figura 5.

Exemplo 7. Imunogenicidade do duplo mutante de Listeria monocytogenes AactAAinlB que expressa LLO-OVA administrado através de diferentes vias em ratinhos.

Injectaram-se ratinhos Balb/c com Listeria monocytogenes AactA (DP-L4029) ou com o mutante duplo Listeria monocytogenes AactAAinlB, em que ambos os mutantes foram modificados para expressar o antigénio OVA. Injectaram-se ratinhos (três por grupo) com 1 x 107 UFC de AactA ou 1 x 108 UFC de AactAAinlB em HBSS seja 200 yL IV (intravenosa), 100 yL SC (subcutânea), 100 yL IM (intramuscular, 50 yL por quadricipite de cada perna) , 50 yL IM (25 yL per tibial de cada perna), 50 yL ID (intradérmica), ou 200 yL IP (intraperitoneal) . Sete dias após a vacinação, os baços foram removidos e avaliados pela Marcação intracelular de citocinas (ICS) tal como no Exemplo 5 (apenas SL8, apenas 136 ΡΕ1592441 IFN-γ) . A Figura 6 mostra a % de células T específicas para OVA CD-8+ no baço, indicando que o mutante actA/inlB proporciona uma resposta maior do que LactA por diversas vias de administração, com as vias IV, IP e IM a mostrar as respostas mais elevadas.

Exemplo 8. Cinética de crescimento in vivo do mutante Listeria monocytogenes AactAAinlB em ratinhos C57BL76 imunocompetentes "nalve".

Apesar das estirpes atenuadas de Listeria poderem ser administradas a doses mais elevadas em comparação com as nativas, é importante para o desenvolvimento de uma vacina segura que a infecção seja eliminada rapidamente, sem danificar os órgãos primários da infecção, ou seja, o fígado ou o baço.

Injectaram-se ratinhos C57BL/6 ou com as estirpes DP-L4056 (nativo) DP-L4029 (LactA), DP-L4406 (AinlB) ou

AactAAinlB de Listeria monocytogenes. As injecções foram 100 pL IV em HBSS nos níveis indicados na Tabela 7, 35 ratinhos por grupo incluindo o grupo controlo HBSS. Todas as estirpes foram crescidas em meio BHI (Brain Heart Infusion, Fisher Scientific) a 37°C a 300 rpm e guardadas congeladas antes da utilização. Sacrificaram-se três ratinhos por grupo nos pontos indicados na Tabela 7, e removeu-se sangue, baço e fígado para análise. O fígado e os baços foram homogeneizados em 5 mL de água duplamente 137 ΡΕ1592441 destilada com 0,05% de Triton X-100 e o número de Listeria viáveis foi determinado através do plaqueamento de diluições em séria em placas BHI/estreptomicina. O figado e os baços foram fixados em 10% de formalina tamponizada para 2 ratinhos por grupo. Os resultados de UFC por figado e baço são indicados nas Figuras 7A e 8A. As experiências foram também repetidas nas concentrações de estirpe mostradas nas Figuras 7B e 8B. A infecção dos ratinhos com Listeria nativa foi resolvida no intervalo de 8 a 11 dias após a administração. O número de Listeria nativas aumentou continuamente significativamente ao longo do período de 4 dias e diminuiu até ao nível mínimo de detecção no baço e no fígado pelo dia 11. De forma interessante, o mutante AinlB apresentou uma cinética semelhante no baço e no fígado, com indução de imunidade estéril ao dia 11. Pelo contrário, o número do mutante AactA apenas aumentou ao longo das primeiras 24 horas 10 vezes no fígado, mas não no baço, e acabou por diminuir depois do dia 4 após infecção. O duplo mutante AactAAinlB, apesar de administrado à dose mais elevada, foi eliminado muito rapidamente no fígado em comparação com as outras três estirpes e a imunidade estéril foi induzida ao dia 4. A eliminação acelerada da bactéria contrasta com a sua capacidade de induzir uma imunidade protectora potente assim como específica para um antigénio num modelo tumoral terapêutico. 138 ΡΕ1592441

Tabela 8. Doseamento e calendário de amostragem para o estudo de cinética de crescimento in vivo de Listeria monocytogenes atenuada.

Estirpe Dose Tempo de recolha após inj ecção HBSS 100 yL 2 horas, dias 1, 2, 3, 4, 7, e 10 Nativa 5 X O \—1 2 horas, dias 1, 2, 3, 4, 7, e 10 Δ actA 1 X 0 \—1 2 horas, dias 1, 2, 3, 4, 7, e 10 AinlB 5 X 0 \—1 2 horas, dias 1, 2, 3, 4, 7, e 10 hactAAinlB 1 X r-O \—1 2 horas, dias i, 2, 3, 4, 7, e 10

Exemplo 9. Infecção in vivo de células não fagocíticas vs células fagocíticas com várias estirpes de Listeria monocytogenes .

Estirpes Listeria monocytogenes nativa, AactA, AinlB e AactAAinlB foram incubadas (37°C com 5% de CO2) com a linha celular de monócito humano THP-1 (ATCC #TIB-202), monócitos humanos primários, a linha celular de hepatócito humano HepG2 (de Drew Pardoll, Universidade Johns Hopkins; também disponível como ATCC #HB8065), ou hepatócitos humanos primários (In vitro Technologies, Baltimore, MD). Prepararam-se monócitos humanos primários a partir de sangue completo utilizando um gradiente de Ficoll para purificar linfócitos, depois isolaram-se monócitos utilizando-se esferas magnéticas conjugadas a um anticorpo específico a monócitos (Miltenyi Biotec). Incubaram-se THP-1 e monócitos em meio RPMI suplementado com soro fetal bovino (FBS) inactivado pelo calor a 10%, bicarbonato de 139 ΡΕ1592441 sódio a 23,8 mM, lx aminoácidos não essenciais, L-glutamina a 2 mM, tampão HEPES a 10 mM, e piruvato de sódio a 1 mM. As estirpes Listeria foram adicionadas a 5 x 105 UFC a células 5 x 105 THP-1 e 3,5 x 107 a 3,5 x 105 monócitos. As células HepG2 foram incubadas em Meio Essencial Minimo de Eagle suplementado com soro fetal bovino inactivado pelo calor a 20%, L-glutamina a 2 mM, e lx aminoácidos não essenciais. As estirpes Listeria foram adicionadas a 1 x 106 UFC a 1 x 105 células HepG2. Incubaram-se hepatócitos humanos primários em Meio de Incubação para Crescimento de Hepatócitos (In vitro Technologies) antes de se adicionar Listeria e incubou-se em DMEM suplementado com 10% de FBS, L-glutamina a 2 mM e lx aminoácidos não essenciais após se adicionar a Listeria. As estirpes de Listeria foram adicionadas a 3,5 x 106 UFC a 3,5 x 105 hepatócitos. Após incubação durante uma hora, as células foram lavadas com meio completo contendo gentamicina (50 pg/mL) de modo a matar qualquer bactéria extracelular. As células foram então lisadas com 225 pL de água estéril, depois adicionou-se 25 mL de lOx PBS. A solução resultante foi plaqueada em BHI com diluições em série para avaliar o titulo de bactérias de cada amostra. O número de Listeria que infectam as células foi dividido pelas Listeria adicionadas às células para determinar a infectividade da estirpe, normalizada com a infectividade da estirpe nativa.

Os resultados são apresentados na Figura 9. Tal como apresentado na Figura 9, todas as estirpes são capazes de infectar células THP-1 e monócitos humanos a uma taxa 140 ΡΕ1592441 similar, demonstrando que a ausência de ActA ou InlB não afecta a infecção de células fagociticas. No entanto, a infecção de hepatócitos foi significativamente diminuida para estirpes de Listeria sem InlB. Existe aproximadamente uma redução de 60% da infecção de hepatócitos humanos e uma redução de 80% em células HepG2 quando se infectam quer com estirpes mutantes desprovidas de InlB, ΔinlB ou AactAAinlB. Estes estudos demonstram que a deleção da proteina InlB selecciona para a absorção por células fagociticas através da prevenção da infecção de hepatócitos cultivados e primários.

Exemplo 10. Infecção in vitro de células não fagociticas vs fagociticas com Listeria monocytogenes opsonizada.

Pré-incubou-se Listeria nativa com um titulo elevado de soro de ratinho especifico para Listeria de ratinhos infectados iv com o mutante Listeria AactA (diluição 1:20) ou HBSS como um controlo durante 1 hora em gelo. A linha celular semelhante a células dendriticas fagociticas (DC 2.4) e a linha celular epitelial de cólon não fagocitica (Caco-2) foram infectadas a MOIs de 1 e 10, respectivamente, durante 1 hora a 37°C. As células foram lavadas três vezes para remover bactérias extracelulares. As células foram cultivadas durante mais 2 horas na presença de 50 mg/mL de gentamicina para matar as bactérias extracelulares remanescentes. Para se determinar a infectividade das linhas celulares, as células foram lisadas com dtbO contendo Triton X-100 a 0,01%. O número de 141 ΡΕ1592441

Listeria viáveis foi determinado através do plaqueamento de diluições em série em placas de agar BHI.

Tal como ilustrado na Figura 10, as Listeria AactA incubada com soro com elevado titulo imune de ratinhos vacinados têm uma capacidade reduzida para infectar a linha celular não fagocitica Caco-2, mas não da linha celular dendritica fagocitica DC2.4. A infecção reduzida de células não fagociticas por Listeria opsonizada é comparável à estirpe atenuada de Listeria que é deletada para actA e inlB (Figura 9) . Sem se desejar qualquer limitação a uma teoria, a utilização de antibióticos específicos a Listeria (anticorpo monoclonal dirigido para internalinas, ou Abs policlonais) pode bloquear os rece-ptores à superfície da bactéria Listeria AactA que permitem a infecção das células não fagociticas in vivo.

Exemplo 11. Exemplo de tratamento com S-59 e UVA de Listeria

Uma estirpe mutante AactAAuvrAB de Listeria (DP-L4029 uvrAB) foi modificada para expressar o antigénio OVA. Esta estirpe e DP-L4029 modificada para expressar OVA foram tratadas com psoraleno S-59 a várias concentrações. As estirpes de Listeria foram crescidas durante a noite a 37°C e diluiu-se uma alíquota de 2mL em 100 mL de BHI e cresceram-se aproximadamente 4 horas a 37°C a uma OD600 de 0,5 (aproximadamente 1 x 109 UFC/mL). Adicionou-se uma alíquota de 5 mL de cada estirpe Listeria a um tubo de 15 142 ΡΕ1592441 mL a centrifugou-se durante 20 minutos a 2300 x g, removeu-se o sobrenadante, e a bactéria foi ressuspendida em 5 mL de PBS resultando em aproximadamente 1 x 109 UFC/mL. Para a estirpe mutante uvrAB, diluiu-se um stock de S-59 a 3 mM de 33,3 yL em 10 mL de PBS para originar uma solução de 10 μΜ, e aliquotas apropriadas desta foram adicionadas à Listeria a concentrações finais de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, e 100 nM, enquanto que para DP-L4029, adicionou-se S-59 até uma concentração final de 100, 200, 400, 800, e 1000 nM num volume final de 5 mL. Estas foram transferidas para uma placa de cultura de 6 poços e irradiadas a uma dose de 0,5 J/cm2 (dispositivo FX1019 UVA). As amostras foram transferidas para tubos de 15 mL e adicionou-se 5 mL de PBS, e foram centrifugadas durante 20 minutos a 2300 x g para lavar psoraleno que não tenha reagido. O sobrenadante foi removido e as bactérias ressuspendidas em 5 mL de PBS e transferidas para novas placas de 6 poços. Estas foram irradiadas a uma dose de UVA de 5,5 J/cm2 de modo a converter monoaductos de psoraleno a ligações cruzadas. Uma amostra de cada estirpe de Listeria foi também morta pelo calor através do tratamento a 72°C durante 3 horas. A apresentação de antigénio das amostras bacterianas foi avaliada utilizando uma linha celular DC 2.4 murina (linha celular dendritica do Dana Farber Câncer Institute, ver Shen et al., J Immunol 158(6):2723-30 (1997)) e uma hibridoma de célula T B3Z T (obtido do Dr. Shastri, Universidade da Califórnia, Berkeley). A B3Z é um hibridoma de célula T CD8+ indutivel por lacZ que expressa 143 ΡΕ1592441 um gene β-galactosidase aquando do reconhecimento do antigénio OVA no contexto de moléculas MHC de classe I. 0 metabolismo de CPRG (β-D-galactopiranósido de vermelho de clorofenol, Calbiochem, La Jolla, CA), um substrato para a β-galactosidase, foi usado para avaliar o nivel de β-galactosidase produzido, que está directamente correlacionado com a quantidade do antigénio OVA apresentado pelas células DC 2.4. As células DC 2.4 e o híbrido célula T B3Z foram mantidos em meio de cultura RPMI 1640 (RPMI, Invitrogen) com FBS a 10% (soro fetal bovino, HyClone). As células DC 2.4 foram transferidas em alíquotas de 200 pL para os poços de uma placa de cultura (1 x 105 DC 2.4 por poço). As amostras de bactéria foram diluídas em série 50 pL de stock a 450 pL PBS até 1 x 105 UFC/mL (amostras tratadas de S-59 são equivalentes em UFC, ou seja, é o número de unidades formadoras de colónias antes do tratamento S-59). Uma alíquota de 20 pL de cada diluição é transferida para um poço contendo as células DC 2.4 para originar aproximadamente 1 χ 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, ou 1 x 108 UFC/mL. Além disso, uma alíquota de 20 pL com apenas PBS foi adicionada como controlo negativo. As amostras foram incubadas durante 1 hora a 37°C em 5% de CO2. A placa foi lavada três vezes com PBS para remover bactéria extracelular. Uma alíquota de 200 pL de células T B3Z (1 χ 105 células) e 100 pg/mL de Gentamicina (Sigma) foi adicionada a cada poço. Como controlo positivo, adicionou-se 100 nM de péptido SL8 OVA257-264 (antigénio SL8 OVA, SIINFEKL (SEQ ID NO:21), Invitrogen, San Diego, CA) a cada poço contendo 1 χ 105 cada das células DC 2.4 e B3Z. 144 ΡΕ1592441

As amostras foram incubadas durante a noite a 37°C em 5% de CO2. A placa foi centrifugada durante 3 minutos a 400 x g e cada poço lavado com 250 yL de PBS. Adicionou-se a cada poço uma alíquota de 100 yL de PBS contendo 100 yM de 2-mercaptoetanol, 9 mM de MgCl2, 0,125% de Igepal CA-630 ( (octafenoxi)polietoxietanol, Sigma), e 0,15 mM de CPRG. As amostras fora incubadas a 37°C durante pelo menos 4 horas. A absorvância foi medida a 595 nm com uma medição de referência a 655 nm utilizando um leitor de placas.

Os resultados das amostras tratadas com S-59 são apresentados na Tabela 8A e nas Figuras 11A e 11B (apresentação de antigénio a 1 Listeria por células DC 2.4, calculada sem subtrair os níveis de base). Os resultados para ambas as estirpes inactivadas pelo calor apresentaram um título inferior ao limite de detecção (inactivação completa) e as bactérias mortas pelo calor não apresentaram o antigénio OVA no teste B3Z. Os resultados iniciam que o mutante uvrAB apresenta uma apresentação de antigénio muito forte mesmo sem atenuação de proliferação até ao limite de detecção em que a estirpe mutante não uvrAB apresenta uma redução na apresentação de antigénio maior como função da atenuação da proliferação (até aproximadamente níveis de base com inactivação essencialmente completa). Isto demonstra que o mutante uvrAB retém apresentação MHC de classe I no contexto de Listeria atenuada por psoraleno e deveria proporcionar uma vacina com uma resposta imunitária e um nível de segurança significativamente acrescido. 145 ΡΕ1592441

Tabela 8A Atenuação log e apresentação do antigénio OVA de estirpes Listeria tratadas com UVA com diferentes concentrações de psoraleno S-59.

Atenuação log % antigénio OVA apresentado* [S-59] nM DP-L4029-OVA DP-L4029 uvrAB-OVA DP-L4029-OVA DP-L4029 uvrAB-OVA 10 2,47 84 20 3,93 84 30 5,28 40 6,44 76 50 6,92 76 60 >7,62 84 70 >7,62 84 80 >7,62 88 90 >7,62 92 100 3,85 >7,62 50 92 200 5,48 47 400 6,78 19 800 >7,78 13 1000 >7,78 13 *Como percentagem de não tratamento, medida a 1 Listeria por célula DC 2.4

Foi realizado outro estudo usando as mesmas estirpes. Neste estudo as Listeria foram crescidas em BHI a 37°C durante a noite. Estas foram diluídas 1:50 em BHI e crescidas a 37°C a 300 rpm a uma DCboo de 0,5, altura em que se transferiu 50 mL de solução para um balão limpo e se adicionou S-59 aos níveis indicados na Tabela 12B. Estas amostras foram incubadas a 37°C a 300 rpm durante aproxima-damente 1 horas (DCtoo aproximadamente 1,0, aproximadamente 1 x 109/mL). Removeu-se uma alíquota de 1 mL para avaliar o título e o remanescente foi transferido para uma placa de 146 ΡΕ1592441

Petri de 150 mm e irradiou-se a uma dose de 6 J/cm2 (FX1019). O titulo após a radiação foi determinado para cada amostra e a apresentação do antigénio OVA foi avaliada tal como acima. Os resultados são apresentados na Tabela 8B e nas Figuras 11C e 11D (apresentação de antigénio a 10 Listeria por célula DC 2.4, calculada sem subtrair os niveis de base). Os resultados indicam que para a estirpe parental, a apresentação de antigénio situa-se a niveis de base quando ocorre uma inactivação essencialmente completa, enquanto que para o mutante uvrAB existe uma gama de aproximadamente 10 vezes de concentração de S-59 na qual existe uma inactivação essencialmente completa em conjunto com uma apresentação de antigénio adequada.

Tabela 8B Atenuação log e apresentação de antigénio OVA de estirpes Listeria UVA tratadas com diferentes concentrações de psoraleno S-59 presente durante o crescimento das bactérias.

Atenuação log % antigénio OVA apresentado* [S-59] ]M DP-L4029-OVA DP-L4029 uvrAB-OVA DP-L4029-OVA DP-L4029 uvrAB-OVA 0,025 3,64 91 0,05 5,70 86 0,1 >8,10 87 0,2 >8,10 86 0,25 50 0,4 >8,10 74 0,5 2,00 31 0,8 >8,10 50 1,0 7,57 14 1,6 >8,10 35 147 ΡΕ1592441 (continuação)

Atenuação log % antigénio OVA apresentado* [S-59] μΜ DP-L4029-OVA DP-L4029 uvrAB-OVA DP-L4029-OVA DP-L4029 uvrAB-OVA 2,0 >8,38 11 3,2 >8,10 16 4,0 >8,38 10 6,4 >8,10 11 8,0 >8,38 10 16,0 >8,38 11 *Como percentagem de não tratamento, medida a 10 Listeria por célula DC 2.4.

Exemplo 12. Eficácia dos mutantes de Listeria na estimulação de respostas específicas ao antigénio na presença de imunidade e/ou anticorpos pré-existentes A imunidade anti-Listeria pré-existente foi induzida através da infecção de ratinhos C57BL/6 por via IP com 0,1 DL50 de Listeria nativa administrada uma vez ou três vezes (com 10 dias de intervalo) . Os ratinhos com imunidade a Listeria (1 ou 3 vx) e ratinhos "naive" foram vacinados pro via ip 32 dias após a última exposição a Listeria com 0,1 DL50 da estirpe de Listeria indicada. Sete dias depois, recolheram-se os baços e a frequência de células T CD8+ específicas para OVA foi determinada por marcação intracelular de citocinas para IFN-g. Os resultados são apresentados na Figura 12A. Observou-se o início de respostas de células T CD8+ específicas para OVA em ratinhos com um nível de imunidade pré-existente que protege contra uma exposição letal a Listeria nativas. A imunidade anti-Listeria pré-existente foi induzida em todos os ratinhos C57BL/6 através da infecção 148 ΡΕ1592441 por via intraperitoneal com 0,1 DL50 da estirpe de Listeria indicada. Após 21 dias, implantaram-se os ratinhos subcu-taneamente com 2e5 células tumorais B16-OVA, e os tumores foram medidos duas vezes por semana. Os resultados são apresentados na Figura 12B. Os estudos tumorais demonstraram que a resposta imunitária especifica para OVA que se desenvolveu na presença de imunidade anti-Listeria pode proteger de forma eficaz contra o teste tumoral B16-OVA.

Gerou-se um soro imune com um titulo elevado através da infecção por via intravenosa de ratinhos C57BL/6 quatro vezes com 0,1 LD50 da estirpe indicada. O soro imune e não-imune foi recolhido e determinou-se o titulo por ELISA especifico para Listeria. Injectaram-se ratinhos C57BL/6 "narve" por via iv com 200 yL de solução salina, soro (imune ou não imune), ou anticorpos policlonal de coelho anti-Listeria no Dia -1 e 1. Os ratinhos foram vacinados por via iv com 0,1 DL50 de Listeria AactA-OVA no dia 0. Recolheram-se os baços e a frequência de células T CD8+ especificas para OVA foi determinada por marcação intracelular de citocinas para IFN-g. Os resultados são apresentados na Figura 12C. Os resultados mostram que a transferência passiva do anticorpo especifico para Listeria para ratinhos naive não reduziu o desenvolvimento de uma resposta imunitária celular primária especifica para OVA em ratinhos tratados.

Lisboa, 8 de Maio de 2012

Claims

ΡΕ1592441 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma bactéria Listeria monocytogenes atenuada que é uma bactéria Listeria monocytogenes LactALinlB, compreendendo ainda a referida bactéria uma molécula de ácido nucleico que codifica para um antigénio que não é de Listeria, estando a referida molécula de ácido nucleico operacionalmente ligada a uma sequência de regulação capaz de expressar o referido antigénio.
2. A bactéria Listeria monocytogenes atenuada da reivindicação 1, caracterizada por compreender ainda pelo menos uma mutação em um ou mais genes seleccionados do grupo que consiste em lplAi, plcA, plcB, e mpl.
3. A bactéria Listeria monocytogenes atenuada das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo antigénio ser um antigénio associado a um tumor ou derivado de um antigénio associado a um tumor.
4. A bactéria Listeria monocytogenes atenuada da reivindicação 3, caracterizada pelo antigénio ser um antigénio associado a um tumor ou derivado de um antigénio associado a um tumor seleccionado do grupo que consiste na mesotelina, spl7, PAGE-4, gp-100, PSMA, K-ras, TARO, pro-teinase 3, WT-1, NY-ESO-1, CEA, Her-2, e SPAS-1.
5. A bactéria Listeria monocytogenes atenuada 2 ΡΕ1592441 de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo antigénio ser um antigénio de uma doença infecciosa ou derivado de um antigénio de uma doença infecciosa.
6. A bactéria Listeria monocytogenes atenuada de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a bactéria é deficiente em relação a um enzima de reparação de ADN e em que o ácido nucleico da bactéria foi modificado por reacção com um ácido nucleico direccionado para um composto que reage directamente com o ácido nucleico de modo que a proliferação da bactéria é atenuada, atenuando deste modo a bactéria relativamente à disseminação célula a célula.
7. A bactéria Listeria monocytogenes atenuada da reivindicação 6, caracterizada pelo ácido nucleico da bactéria ter sido modificado através do contacto com um psoraleno activado por irradiação UVA.
8. Uma composição imunogénica compreendendo a bactéria Listeria monocytogenes atenuada de qualquer uma das reivindicações anteriores.
9. Uma vacina compreendendo (a) a bactéria Listeria monocytogenes atenuada de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e (b) um veiculo ou adjuvante farmaceuti-camente aceitável.
10. Uma célula apresentadora de antigénio 3 ΡΕ1592441 profissional compreendendo a bactéria Listeria monocyto-genes atenuada de qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
11. A bactéria Listeria monocytogenes atenuada de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou a composição imunogénica da reivindicação 8, ou a vacina da reivindicação 9 ou uma célula apresentadora de antigénios profissional da reivindicação 10 para utilização num método para a indução de uma resposta imunitária num hospedeiro a um antigénio que não é de Listeria.
12. A bactéria Listeria monocytogenes atenuada de qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou a composição imunogénica da reivindicação 8, ou a vacina da reivindicação 9 ou uma célula apresentadora de antigénios profissional da reivindicação 10 para utilização num método para a prevenção ou o tratamento de uma doença num hospedeiro. Lisboa, 8 de Maio de 2012