JP4839209B2 - 改変された自由生活微生物、ワクチン組成物、およびそれらの使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、その各々の内容を、ここに引用して本開示に一体化させる、2003年2月6日に出願された米国仮出願第60/446,051号、2003年2月21日に出願された米国仮出願第60/449,153号、2003年7月24日に出願された米国仮出願第60/490,089号、2003年10月15日に出願された米国仮出願第60/511,869号、2004年2月2日に出願された「Listeria Attenuated for Entry into Non−Phagocytic Cells,Vaccines comprising the Listeria,and Methods of Use Thereof」なる発明の名称の米国仮出願に対する優先権の利益を主張する。
本発明は、一般に、ワクチン組成物および免疫療法に関する。特に、本発明は、個体に特定の抗原を送達するのに用いることができる改変された自由生活微生物の集団を含むワクチン組成物に関する。そのような組成物において、ワクチンは、微生物それ自体、または微生物に取り込まれた異種抗原に対して向けられる。また、本発明は、樹状細胞のような抗原提示細胞の活性化および成熟を負荷し、誘導するための改変された微生物の使用に関する。
主に、ウイルス、細菌、および寄生虫によって引き起こされる感染症の予防を標的とする、臨床的使用のために種々のワクチンが開発されてきた。ワクチンは、生きた弱毒化された微生物、不活化された(死滅した)微生物、または微生物それ自体の成分から調製することができる。生きた弱毒化された微生物は、よりビルレントではない微生物に由来する、ビルレンス因子の欠失のような遺伝的改変を含む。不活化ワクチンでは、微生物は化学的にまたは物理的に不活化することができる。理想的には、そのようなワクチンは感染を引き起こすことはできないが、依然として、所望の免疫応答を刺激することができる。不活化されたワクチンの例はポリオおよびインフルエンザウイルス、およびコレラおよび破傷風に対する細菌ワクチンを含むが、生きた弱毒化ワクチンはポリオ、インフルエンザおよびコレラでは同様に任意である。所望の免疫応答を惹起するためには、不活化微生物は不活化に先立って適当な抗原を含むことが重要である。ある場合には、感染性微生物によるデ・ノボ遺伝子発現が最適な免疫応答を刺激するのに必要な故に、微生物の不活化は有意に低下した免疫応答をもたらすことが観察されている。これは、細胞内細菌で特に重要である。細菌を不活化するのに用いられてきた方法は、アセトン、アルコール、ホルマリン、グルタルアルデヒド、パラホルムアルデヒド、またはフェノール、加熱、または紫外線照射の使用を含む[Paceら、Vaccine 16(16):1563(1998)]。
本発明は自由生活微生物を含み、ここで、該微生物の増殖は、十分な微生物の遺伝子発現を維持しつつ減弱され、ここで、該減弱は用量依存的に制御することができる。本発明は、自由生活微生物のこの減弱のための方法を含む。本発明は、これらの減弱化された微生物を含むワクチン組成物を含む。また、本発明は、特に、インビトロまたはエキソビボにおいて、樹状細胞のような、抗原提示細胞の活性化および成熟を負荷し、誘導するための、改変された微生物および減弱化されたListeriaの新規な使用を提供する。得られた抗原提示細胞はワクチンおよび免疫療法で有用である。特別な具体例において、提供されたワクチンおよび免疫療法は癌に対して向けられる。
pestisである。好ましい具体例において、細菌はListeria、好ましくはListeria monocytogenesである。1つの具体例において、Listeriaは、貪食細胞によるListeriaの摂取に有意に影響すること無く非−貪食細胞に侵入するListeriaの能力の減弱をもたらす突然変異を含む。1つの具体例において、Listeria突然変異はインターナリン遺伝子におけるものである。1つの具体例においてListeria突然変異はinlA、inlB、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子である。1つの具体例において、Listeria monocytogenesはinlAおよびinlB遺伝子双方における遺伝子突然子を含む。1つの具体例において、Listeriaは、感染細胞のファゴリソソームを逃げ出すListeriaの能力も減弱をもたらす突然変異を含む。1つの具体例においてListeria突然変異はhly遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeriaは、Listeriaによるアクチンの重合の減弱化をもたらす突然変異を含む。1つの具体例において、Listeria突然変異はactA遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeria monocytogenesは1を超える突然変異を含む。好ましい具体例において、Listeria突然変異はactAおよびinlB遺伝子双方におけるもの、好ましくは、actAおよびinlB遺伝子双方における欠失突然変異である。
本発明は改変された自由生活微生物、およびワクチン組成物における改変された自由生活微生物の使用を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が減弱されるように改変される。いくつかの具体例において、微生物遺伝子発現は改変によって実質的に影響されない。また、本発明は、抗原負荷のための改変された微生物の使用およびインビトロまたはエキソビボでの抗原提示細胞(APC)の活性化/成熟化の誘導を含む。抗原は改変された微生物によって天然に生産される抗原であってもよく、あるいは組換え微生物によって発現された異種抗原であってもよい。得られた抗原提示細胞はワクチン組成物における使用、および免疫療法で適当である。得られたワクチン組成物の投与によって刺激された免疫応答はCD4+またはCD8+免疫応答であり得る。
本発明は、改変された自由生活微生物、および改変された自由生活微生物のワクチン組成物における使用を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が減弱されるように改変される。いくつかの具体例において、微生物遺伝子発現は改変によって実質的に影響されない。
本発明は自由生活微生物、抗原提示細胞に基づくワクチン組成物の調製における改変された自由生活微生物の使用を含み、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が減弱化されるように改変されるいくつかの具体例において、改変された微生物の微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。
本発明は、微生物の複製を減弱化するための微生物核酸の改変を含む。複製におけるこの減弱化を用いて、微生物の個体への投与に際して安全性のレベルを増加させることができる。微生物の増殖する能力は、正常な増殖を供する条件下で微生物の集団を培養することによって測定することができる。微生物の集団の正常な増殖は、微生物の核酸に対する改変を有しない微生物の増殖であると考えられる。微生物ゲノムの改変の結果、微生物が正常な増殖を受けないようなある程度の減弱化がもたらされるであろう。幾つかの微生物は、固化された増殖培地上でカウントすることができるコロニーを形成する。かくして、微生物の複製の減弱化は、コロニー形成単位(CFU)の数の低下として測定することができる。微生物コロニーのストック溶液は、コロニー形成単位の数が容易に測定できるまで(例えば、50ないし500CFU)系列的に希釈される。典型的には、希釈は10倍であり、1以上の希釈されたサンプルでカウントされたコロニーの数を用いて、サンプルのlog力価を見積もる。例えば、希釈された微生物ストックのアリコットを増殖培地で平板培養し、得られたコロニーをカウントする。希釈のmL当たりのコロニー形成単位(CFU/mL)を計算し、(力価として知られた)元のストックのmL当たりのコロニー形成単位を希釈から計算する。log数はlog力価として知られている。例として、1×105希釈の0.2mLアリコットを平板培養する24コロニー形成単位は1.2×107力価、または7.08log力価ストックを与える。減弱化は、微生物核酸の改変後におけるそれに対する微生物核酸の改変に先立っての微生物力価の比較として測定することができる。改変後における微生物の力価に対する未改変微生物の力価の比率のlogは、log減弱化を表す(または単に2つのlog力価の差を表す)。例えば、もし未改変微生物力価が1,2×107と測定され、改変された微生物力価が4.3×102と測定されれば減弱化の得られたレベルは4.45logである。この方法を用いて、病原体または非−病原体であるかを問わず、いずれかの微生物の減弱化を評価することができる。いくつかの微生物では、直接的に微生物の増殖を測定するよりはむしろ、感染された細胞を殺すその能力によって微生物を測定するプラークアッセイを用いることができる。例えば、ある細胞内細菌は、それが感染できる哺乳動物細胞の群上で増殖させることができる。適当なインキュベーション条件後に該群をプラーク(死滅した細胞を表す細胞層における明瞭な領域)につき観察することができる。前記計算は、プラーク形成単位の数が、微生物の核酸の改変によりプラーク形成単位数の減弱化を評価するためにコロニー形成単位につき置き換えられている場合に同様である。本発明の具体例では、減弱化の所望の量は、安全性の所望のレベルおよび微生物の意図した適用に依存して、実質的に増殖が観察されないレベルを含めた、2倍低下からかなり大きなレベルの減弱化までの範囲とすることができる。複製における2倍減弱化は、もし与えられた希釈につき、微生物の未改変集団にある(約0.3log減弱化)ものとして核酸が改変される場合に、微生物の集団に半分のコロニー(またはプラーク)があれば観察されるであろう。幾つかの具体例において、減弱化は少なくとも約0.3log、約1log、約2log、約3log、約4log、約5log、約6log、または少なくとも約8logである。いくつかの具体例において、減弱化は約0.3ないし>10log、約2ないし>10log、約4ないし>10log、約6ないし>10log、約0.3ないし8log、また約0.3ないし7log、また約0.3ないし6log、また約0.3ないし5log、また約0.3ないし4log、また約0.3ないし3log、また約0.3ないし2log、また約0.3ないし1logの範囲にある。いくつかの具体例においては、減弱化は約1ないし>10log、1ないし8log、1ないし6log、また約2ないし6log、また約2ないし5log、また約3ないし5logの範囲にある。本発明の1つの具体例において、減弱化の結果、実質的に完全な不活化がもたらされる(例えば、コロニーまたはプラークが検出限界まで観察されない場合)、ここで、微生物遺伝子発現は十分に活性である。そのような微生物の集団は、微生物核酸を改変して、コロニーまたはプラークが検出の限界で観察されない最低濃度を見出すのに用いられる剤の濃度を滴定することによって達成することができる。
微生物の増殖の減弱化に加えて、微生物の核酸の改変は、微生物遺伝子発現が実質的に影響されないように制御される。実質的に影響されないためには、微生物遺伝子発現は、核酸の改変に際して完全に活性である必要はない。複製を減弱化するように核酸が改変される微生物の集団において、微生物遺伝子発現は、微生物による所望のタンパク質の適切なレベルの発現を供するのに十分に活性であることのみが必要である。適切なレベルの発現は、ある程度、微生物の意図した使用に依存する。例えば、もし微生物がワクチンとして使用されるべき特定の抗原を含むならば、適切な発現は、ワクチンに対する効果的な保護または治療免疫応答を供する発現の最小レベルとして決定されるであろう。微生物遺伝子発現は、そのようなワクチンが効果的な免疫応答を供するか否かを評価するためにインビトロおよびインビボの双方において評価することができる。一般に、核酸が改変されている微生物の集団は、特定の抗原に関して微生物の未改変集団と比較することができる。
微生物の集団の核酸は、種々の方法によって改変することができる。微生物の核酸は物理的手段、例えば、紫外線または電離放射線の放射によって改変することができる。X−線またはγ−線のような電離放射線を用いて、核酸中で一本鎖または二本鎖の破壊を引き起こすことができる、紫外線放射を用いて、核酸中にピリミジンダイマーを生じさせることができる。適切な量の放射線は、前記にて詳細に説明した複製およびタンパク質発現に対する放射線の効果を評価することによって決定される。
微生物は、微生物によって発現され得る異種核酸配列を含む様に改変することができる。異種配列は少なくとも1つの特異的タンパク質抗原をコードことができる。微生物は、当業者に知られた方法によって改変することができる[SambrookおよびRussell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Eddition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(2000)]。微生物は、1以上の抗原をコードする1以上の配列を含むように改変することができる。特異的抗原をコードする異種核酸配列は、正確な核酸配列に限定されるものではなく、個体に投与されると、所望の免疫応答を誘導するであろう抗原の発現を供するのに十分な配列である。異種配列は、特定の疾患に関連する抗原として発現され得る。そのような抗原を発現する微生物はワクチンとしてもちいることができ、ここで、該ワクチンは予防的処置または治療的処置として用いることができる。そのようなワクチンによって処理することができる疾患は感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌および他の過剰増殖性病を含む。
1つの具体例において、本発明は微生物を含むワクチンを含み、ここで、微生物の核酸は、微生物の増殖が減弱されるように改変されており、微生物集団は、依然として、免疫応答を誘導するのに十分な程度まで所望の抗原を発現することができ、かつ微生物は、さらに、少なくとも1つの遺伝子突然変異によって減弱される。微生物における突然変異は、微生物の種々の特徴に影響し得る。いくつかの場合において、突然変異は、ある種の細胞に侵入する微生物の能力に影響する。例えば、ある種の細胞内細菌は、細菌に存在する受容体に応じて種々の細胞型を侵入することができる。突然変異は、細菌がある細胞型によって取り込まれるが、他の細胞型によっては取り込まれないように、ある受容体の発現を改変することができる。これの例として、Listeriaは、典型的には、貪食細胞によって取り込まれ、非−貪食細胞(例えば、肝臓細胞)に活動的に侵入する。非−貪食細胞の侵入が、貪食細胞による摂取が十分に活性でありつつ有意に低下または排除されるListeriaの突然変異を用いることができる。そのような突然変異は良好な免疫応答を提供することができる。というのは、ワクチンは貪食細胞によって優先的に取り込まれ、これは、免疫系に対して細菌抗原を提示するにおいて重要だからである。突然変異は、ある細胞型に侵入する微生物の能力の減弱をもたらすいずれの遺伝子に対するものでもあり得、これはListeriaにおけるインターナリン遺伝子(例えば、inlA、inlB)に対する突然変異が例示される。同様な遺伝子が他の細菌に存在でき(例えば、Salmonella、Bacillus anthracisおよびYersiniaのインベーシン遺伝子)、これらの遺伝子における突然変異は本発明に含まれる。突然変異は、ビルレンス因子、または増殖および拡大を可能とする遺伝子のような微生物の他の特徴にインパクトを与え、それにより、微生物のビルレンスを低下させる。例えば、ListeriaのactA遺伝子における突然変異は宿主細胞アクチンの重合において欠損を引き起こし、これは、他の細胞まで拡大するListeriaの能力を阻害する。Listeriaのhly遺伝子における突然変異(リステリオリシン(LLO)タンパク質)は、感染細胞のファゴリソソームから逃げるListeriaの能力にインパクトを与える。ListeriaのplcAまたはplcB遺伝子いずれかにおける突然変異は、細胞間を拡大するListeriaの能力にインパクトを与える。Yersiniaのyop遺伝子における突然変異は、マクロファージによる貪食を妨げるYersiniaの能力に影響する。もう1つの具体例において、遺伝子突然変異はある種の抗原、例えば、通常、微生物それ自体に対する免疫応答をもたらすであろう抗原の発現を減弱させる。もし微生物を、異種抗原を含むワクチンとして用いて、非−突然変異微生物と比較して、送達微生物に対して免疫応答が低下することを除き、異種抗原に対する強力な免疫応答を刺激すれば、そのような突然変異は有用であろう。1つの具体例において、微生物は、1を超える遺伝子における突然変異によって減弱される。1つの具体例において、突然変異の1つは、Listeriaのインターナリン遺伝子、または他の細菌における同様な遺伝子におけるものである。1つの具体例において、突然変異は、Listeriaのインターナリン遺伝子または他の細菌における同様な遺伝子の1以上におけるものである。1つの具体例において、突然変異の1つはactA遺伝子におけるものである。1つの具体例において、微生物は、actA遺伝子および1以上のインターナリン遺伝子において突然変異を持つListeria monocytogenesを含む。好ましい具体例において、Listeria monocytogenesは、actA遺伝子およびinlB遺伝子における突然変異を含み、好ましくはListeria monocytogenesは、(別法として、本明細書中では、ΔactAΔinlBまたはactA−inlB−という)actA/inlB欠失突然変異体を含む。本明細書中に記載されたものを含めた種々のListeria遺伝子の配列はGenbank受託番号NC 003210に見出すことができる。
本発明のワクチン組成物は、微生物核酸が改変されている微生物を含み、および/または抗原−負荷されており、および/または微生物の増殖が減弱されるように微生物核酸が改変された微生物での感染によって活性化された/成熟化された抗原提示細胞を含み、ここで、前記したように、微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。本発明のワクチン組成物を用いて、個体において免疫応答を刺激することができる。処方は、種々の投与経路によって個体に投与することができる。そのようなワクチン組成物の投与方法は当該分野で知られており、経口、鼻孔、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、リンパ内および皮下投与経路を含む。ワクチン組成物は、さらに、アジュバントまたはT細胞共刺激分子のようなワクチンに対する免疫応答を改良することが当該分野で知られたさらなる成分を含むことができる。また、本発明は、本発明の医薬組成物を含む医薬を含む。そのようなワクチンで処置すべき個体はいずれかの脊椎動物、好ましくは家畜動物、スポーツ用動物を含めた哺乳動物、およびヒトを含めた霊長類である。ワクチンは予防剤として投与することができ、そこでは、個体をワクチン接種して、特定の疾患に対して個体を免疫化する。ワクチンは、いくらかの状況では、癌ワクチンと一緒のようにいずれかの個体に与えることができるが、処置された個体は、癌を発生する高い危険性がある個体に限定される。また、ワクチンは治療剤として投与することができ、そこでは、特定の疾患を有する個体をワクチン接種して、疾患、または疾患関連タンパク質に対する免疫応答を改良する。この具体例において、ワクチンは、疾患に関連する物理的症状の軽減をもたらすことができる。例えば、癌ワクチンでは、ワクチン接種の結果、腫瘍の増殖が停止され、好ましくは平均腫瘍容量が減少され、より好ましくはいずれかの腫瘍が排除される。1つの具体例において、平均腫瘍容量は少なくとも約5%、また約10%、また約25%、また約50%、また約75%、また約90%または約100%だけ減少する。同様に、ワクチン接種の結果、腫瘍の転移が停止され、好ましくは腫瘍転移の数の低下がもたらされる。癌ワクチンのさらなる効果は、個体メジアンの生存の延長であろう。ヒトにおいては、メジアン生存は少なくとも約3ヶ月、また少なくとも約6ヶ月、または少なくとも約12ヶ月だけ延長される。
本明細書中に記載された改変された微生物、抗原提示細胞、ワクチン、および医薬組成物を用いる種々の方法が本発明によって提供される。例えば、免疫応答を誘導し、および/または疾患を処置しまたは予防するための、本明細書中に記載された改変された微生物、抗原提示細胞、ワクチン、および医薬組成物を用いる方法が提供される。ワクチンおよび他の組成物を調製するための、改変された微生物および/または突然変異体株の使用方法も提供される。
また、本発明は、Listeria monocytogenesの突然変異体株を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供し、ここで、突然変異体株は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、Listeriaの核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている(例えば、S−59/UVA処置による)。いくつかの具体例において、疾患は感染症である。他の具体例において、疾患は癌である。
また、本発明は、Bacillus anthracisの突然変異体株を含む有効量の組成物を宿主に投与することを含む、宿主において疾患を予防または処置する方法を提供し、ここで、突然変異体株は、その核酸を修復するその能力を減弱化する遺伝子突然変異を含む。いくつかの具体例において、Bacillusの核酸は、微生物が増殖について減弱化されるように改変されている(例えば、S−59/UVA処置による)。
また、本発明は医療用途のための自由生活微生物を提供し、ここで、微生物の核酸は、微生物が増殖について減弱化される、および/または微生物がDNA修復酵素に関して欠損があるように改変されている。医療用途は(例えば、ワクチンとして使用するための)治療的および予防的医療適用双方を含むと理解される。いくつかの具体例において、微生物は、微生物が増殖について減弱化されるように、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されている。いくつかの具体例において、微生物はListeria monocytogenesまたはBacillus anthracisである。
本発明は、さらに、本発明の改変された微生物および突然変異体株を含むキット(または製品)を提供する。
1つの具体例において、本発明は、微生物核酸が、微生物の増殖が減弱化されるように改変されている自由生活微生物を含む、および/または抗原−負荷されており、および/または微生物核酸が、微生物の増殖が減弱化されるように改変されている自由生活微生物での感染を通じて活性化されたまたは成熟化された抗原提示細胞を含むワクチン組成物を含み、ここで、微生物遺伝子発現は実質的に影響されない。1つの具体例において、微生物遺伝子発現は、抗原が、個体への微生物の投与に際して免疫応答を刺激するのに十分なレベルにて抗原が発現されるように実質的に影響されない。1つの具体例において、微生物の増殖は少なくとも約0.3log、また少なくとも約1log、約2log、約3log、約4log、約6log、または少なくとも約8logによって減弱化される。もう1つの具体例において、微生物の増殖は約0.3ないし>10log、約2ないし>10log、約4ないし>10log、約6ないし>10log、約0.3ないし8log、約0.3ないし6log、約0.3ないし5log、約1ないし5log、または約2ないし5logだけ減弱化される。1つの具体例において、微生物による抗原の発現は、微生物核酸が改変されていない微生物による抗原の発現の少なくとも約10%、約25%、約50%、約75%、または少なくとも約90%である。1つの具体例において、発現された抗原は微生物それ自体からの抗原である。1つの具体例において、微生物は抗原をコードする異種核酸配列を含む。1つの具体例において、抗原は疾患関連抗原である。1つの具体例において、抗原は感染症、自己免疫疾患、アレルギー、癌、および他の過剰増殖性病よりなる群から選択される疾患に関連する。1つの具体例において、抗原は腫瘍関連抗原である。1つの具体例において、腫瘍抗原は分化抗原、組織−特異的抗原、発生抗原、腫瘍−関連ウイルス抗原、癌−精巣抗原、胚抗原、癌タンパク質抗原、過剰に発現されたタンパク質抗原および突然変異したタンパク質抗原よりなる群から選択される。1つの具体例において、腫瘍抗原はメソテリン、Sp17、gp100、PR3、PAGE−4、TARP、WT−1、NY−ESO−1およびSPAS−1よりなる群から選択される。1つの具体例において、微生物核酸は、微生物の放射線への暴露、および微生物核酸の改変を引き起こす核酸標的化化合物と微生物との反応よりなる群から選択される方法によって改変される。好ましい具体例において、微生物核酸は、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物と微生物とを反応させることによって改変される。1つの具体例において、核酸標的化化合物は、インターカレーション、小溝結合、大溝結合、静電結合、および配列−特異的結合よりなる群から選択される態様によって核酸に標的かされる。1つの具体例において、核酸標的化化合物は、核酸アルキル化剤を含む。好ましい具体例において、核酸標的化化合物はβ−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルである。1つの具体例において、核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物は、照射によって、好ましくはUVA照射によって化合物の活性化に際して反応する。1つの具体例において、UVA照射によって活性化された核酸標的化化合物はソラレンである。好ましい具体例において、ソラレンは4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンである。1つの具体例において、核酸標的化化合物は核酸の改変を間接的に引き起こす。1つの具体例において、核酸標的化化合物は、照射によって、好ましくはUVA照射による活性化に際して改変を間接的に引き起こす。1つの具体例において、微生物は遺伝子突然変異を含む。1つの具体例において、遺伝子突然変異の結果、改変されている微生物核酸を修復する微生物の能力の減弱化がもたらされる。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、微生物の属および種に依存して、phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecA、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子にある。1つの具体例において、突然変異はphrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrDおよびrecA、またはその機能的に同等な遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の1以上である。1つの具体例において、遺伝子突然変異は、PhrB、UvrA、UvrB、UvrC、UvrDおよびRecAよりなる群から選択されるDNA修復酵素の活性の減弱をもたらす。さらなる具体例において、これらの突然変異を含む微生物は、UVA照射によって活性化されたソラレンとの反応によって改変される。好ましい具体例において、ソラレンは4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンである。1つの具体例において、微生物は細菌、原生動物および真菌よりなる群から選択される。1つの具体例において、微生物は細菌である。1つの具体例において、細菌は細胞内細菌である。好ましい具体例において、細菌はListeria、好ましくはListeria monocytogenesである。1つの具体例において、Listeriaは、貪食細胞によるListeriaの摂取に有意に影響すること無く、非−貪食細胞に侵入するListeriaの能力の減弱をもたらす突然変異を含む。1つの具体例において、Listeriaの突然変異はインターナリン遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeria突然変異はinlA、inlB、およびインターナリンをコードするいずれかの遺伝子よりなる群から選択される遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeria monocytogenesはinlAおよびinlB遺伝子双方に遺伝子突然変異を含む。1つの具体例において、Listeriaは、感染した細胞のファゴリソソームから逃げ出すListeriaの能力の減弱をもたらす突然変異を含む。1つの具体例において、Listeria突然変異はhly遺伝子におけるものである。1つの具体例において、Listeriaは、Listeriaによるアクチンの重合の減弱をもたらす突然変異を含む。好ましい具体例において、Listeria突然変異はactA遺伝子におけるものである。1つの具体例において、ListeriaはactA遺伝子および1以上のインターナリン遺伝子に突然変異を含む。好ましい具体例において、ListeriaはactA遺伝子およびinlB遺伝子に突然変異を含み、好ましくは、ListeriaはactA/inlB欠失突然変異体を含む。好ましい具体例において、Listeria monocytogenes actA/inlB欠失突然変異体は、さらに、uvrAB遺伝子に欠失突然変異を含む。
(OVA抗原の発現を維持しつつ増殖の減弱を供するListeria株のソラレン処理)
オボアルブミン、異種ニワトリOVA抗原を発現するように改変されているListeria monocytogenesのいくつかの株を(4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレン(Ben Venue,Cleveland,OHによって3mM溶液として固体から調製されたS−59(Ash−Stevens,Riverview,MI)(米国特許第5,399,719号参照))およびUVA光(320ないし400nm)と反応させた。得られたListeriaをアッセイして、生きたListeriaのlog力価の低下、ならびにListeriaによるOVA抗原の発現を評価した。Listeria株はUniversity of California,BerkeleyのDan Portnoy博士によって供され、実施例8に記載したようにOVA抗原を含むように改変した。これらはDP−L4056(野生型)、DP−L4029(10403S ΔactA、ActA遺伝子におけるファージ治癒欠失突然変異、Skobleら、Journal of Cell Biology,150:527−537(2000)およびLauerら、Journal of Bacteriology 184(15):4177−4186(2002)参照)、DP−L4364(10403S ΔlplA、ホスホリパーゼA遺伝子における欠失突然変異)およびDP−L4017(10403S hlyL461T、ヘモリシン遺伝子における点突然変異、Glomskiら、Journal of Cell Biology 156(6):1029−1038,(2002)参照)であった。株を37℃にて300rpmにおいてBHI培地(ブレイン・ハート・インフュージョン、Fisher Scientific)中で約1×109CFU/mLの濃度まで(600nmにおける0.5の吸光度まで)増殖させた。各株の1.0mLアリコットを二連15mL試験管に移した。各試験管を4℃にて2300×gにおいて20分間遠心し、上清を除去し、S−59の有りおよび無しにて、1%BSAを含む5mLのPBS(リン酸緩衝化生理食塩水、Hyclone)を二連試験管に添加した(1×108CFU/mL)。S−59は100nMの濃度で添加した。サンプルを6ウェル培養プレート中に入れ、ほぼ2J/cm2の量でUVAを照射した(FX1019照射デバイス、Baxter Fenwal,Round Lake,IL)。次いで、各サンプルを15mL試験管に移し、前記したように遠心し、上清を除去した。これらを5mLのPBSで洗浄し、遠心し、上清を除去し、最終細菌ペレットを0.5mLのPBS中に懸濁させた。各々の100μLサンプルを用いて、系列希釈によって細菌の力価を決定した。各希釈をLB(Luria−Bertani,Q−Biogene,Carlsbad,CA)プレート上に平板培養し、37℃で一晩インキュベートし、コロニーをカウントして、細菌の力価を測定した。
T細胞ハイブリッドを、10%FBS(胎児ウシ血清、HyClone)を含むRPMI1640培養基(RPMI,Invitrogen)中に維持した。DC2.4細胞を200μLアリコットにて、96ウェル培養プレートのウェルに移した(ウェル当たり1×105DC2.4)。細菌サンプルを50μLストックにて系列的に、1×105CFU/mLまで低下した450μL PBSまで希釈した(S−59処理サンプルはCFU等価物であり、すなわち、それはS−59処理に先立ってのコロニー形成単位の数である)。各希釈の20μLを、DC2.4細胞を含有するウェルに移して、ほぼ1×104、1×105、1×106、1×107、または1×108CFU/mLを得る。加えて、PBSのみの20μLアリコットを陰性コントロールとして添加した。サンプルを5%CO2中で37℃にて1時間インキュベートした。プレートをPBSで3回洗浄して、細胞外細菌を除去した。B3Z T細胞(1×105細胞)の200μLアリコットおよび100μg/mLゲンタマイシン(Sigma)を各ウェルに添加した。陽性コントロールとして、100nM SL8 OVA257−264ペプチド(SL8 OVA抗原、SIINFEKL、配列番号:1、Invitrogen、San Diego、CA)を、DC2.4およびB3Z細胞の各々1×105を含有するウェルに添加した。サンプルを5%CO2中で37℃にて一晩インキュベートした。プレートを400×gにて3分間遠心し、各ウェルを250μLのPBSで洗浄した。100μMの2−メルカプトエタノール、9mMのMgCl2、0.125%Igepal CA−630((オクタフェノキシ)ポリエトキシエタノール、Sigma)、および0.15mMのCPRGを含有するPBSの100μLアリコットを各ウェルに添加した。サンプルを37℃にて少なくとも4時間インキュベートした。プレートリーダーを用い、吸光度を655nmにおける参照測定にて595nmにて測定した。細菌力価、および未処理に対するS−59処理の抗原提示についての結果を(DC2.4当たり100細菌)を表1に掲げる。結果は、DC2.4当たり添加された100細菌細胞のレベルでは、抗原提示は未処理サンプルのほぼ55ないし85%であることを示す。細菌力価はほぼ104だけ低下したので、これは、十分な抗原提示がListeriaの増殖のかなりの減弱を伴って維持されることを示す。
(OVA抗原の発現を維持しつつ増殖の減弱を供するListeria株のDNA標的化アルキル化剤処理)
化合物β−アラニン,((N−アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステル(化合物1、ChemSyn,Harrisonville,MO,米国特許第6,093,725号)のみを用い、手法は実施例1と同様に行った。用いたListeria株はDP−L4056およびDP−L4017であった。化合物1(酸性BBS(血液バンク生理食塩水)中1mM、100mL BBS当たり1.48M H3PO4の135μl)を、0、0.5、1、2、5および10μMの濃度まで、1×108CFU/mLにおける5mLの細菌に添加し、サンプルを室温にて2時間インキュベートした。インキュベーションの後、細菌力価および抗原提示を実施例1におけるように評価した。抗原提示では、Listeria株を1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、または1×107CFU/mLまで希釈した。log力価、log減弱、および化合物1の濃度の関数としての未処理(DC2.4当たり1のListeria)のパーセントとしての抗原提示を表3および図2A、Bに掲げる。結果は、化合物1が、Listeriaの増殖のかなりの減弱でもって、十分な抗原提示を供するにおいて、例えば1μMでやはり効果的である。
(uvrAB突然変異体−対−野生型Escherichia coliのソラレン処理による増殖の減弱の比較)
核酸損傷を修復する能力に欠損がある突然変異体Escherichia coli(E.coli)株のソラレン処理を野生型株と比較した。E.coli株AB1157(野生型)およびCSR603(Aziz Sancar博士,University of North carolinaから得られたuvrA、recA、phr突然変異体、Harm,Mutation Research 60:263−270(1979)参照)。この実施例は、250rpmのオービタルシェーカーにて37℃で一晩、ストレプトマイシンを含む3mLのLB培地で増殖させたAB1157−対−突然変異体CSR603の減弱を比較する。この2mLアリコットを30℃の100mLのLB培地に添加し、600nmにおける吸光度が0.9OD、ほぼ1×109CFU/mLとなるまでほぼ5時間シェーカー上に置いた。各株では、ほぼ0.5mLの細菌ストックを15mL試験管に加え、2300×gにおいて4℃にて20分間遠心した。上清を除去し、各ペレットを、0、1、10、100および1000nMのソラレンS−59を含有する5mLのPBSに懸濁させた。各サンプルを6ウェル培養プレートに移し、実施例1におけるように照射した。実施例1におけるように、サンプルを系列希釈し、力価を測定した。結果を表4および図3に示す。結果は、uvrABC突然変異体のソラレン処理が、与えられたソラレン濃度では細菌の増殖のより大きな減弱がもたらされる(より低い力価が残存)ことを示す。
(S−59処理の有りおよび無しでの、Listeria株を用いるマウスの治療的ワクチン接種)
ワクチンとしてのS−59処理Listeriaの有用性を評価するために、C57B1/6マウスメラノーマ腫瘍モデルを用いた。C57B1/6マウス(Charles River,Hollister,CA)の毛を剃り、100μLのHBSS中の2×105B16.F10.Mo520.10細胞(Kenneth Rock博士、University of Massuchesettsから得られたB16−OVA発現メラノーマ細胞、Mandlら、Proc Natl Acad Sci USA 95:8216(1998)参照)で皮下移植した。OVA抗原を含有するListeria monocytogenes株DP−L4056およびDP−L4017をS−59処理(実施例1のような量の20nM S−59UVA)の有りまたは無しにて調製した。加えて、OVA抗原無しの野生型DP−L4056をコントロールとして用いた。S−59処理サンプルのlog力価を測定して、ソラレン処理によるlog減弱を評価した(表6)。ListeriaをHBSS(ハンクスの平衡塩培地、Gibco)に懸濁させ、10ないし12匹のマウスの群を、各株の100μL腹腔内注射で3回ワクチン接種し、ならびにある群をHBSSビヒクルで注射した。種々の株に対するワクチン接種量(ワクチン接種当たりの合計CFU)を表6に示す。量は非S−59処理Listeriaに対する0.1 LD50、およびS−59処理Listeriaに対する最大可能量に対応した。ワクチン接種は腫瘍移植から3、10および17日に行った。マウスを触知可能腫瘍につき観察した。一旦観察されれば、腫瘍の対向直径を一週間に2回測定した。もし腫瘍がいずれかの方向で20mmに測定されれば、マウスを犠牲にした。B16−OVA移植後の日数の関数としての平均腫瘍容量を図4および表5に示す。群当たりのマウスのパーセント生存を図5にプロットし、メジアン生存を表6に掲げる。本実施例は、高い量のS−59処理Listeria株がマウスに安全に投与することができ、良好な抗腫瘍応答をもたらすことを示す。
(ワクチン接種後における抗原特異的免疫応答の評価)
種々のインビトロおよびインビボ方法を用い、本発明のワクチンを評価することができる。これらの方法をListeriaベースのワクチンを用いて例示するが、これを用いて、本発明のいずれかの微生物ベースのワクチンの優れた効率を見積もることができる。
OVA抗原を有するListeria株を、ELISPOTアッセイを用い、マウスモデルにおいて免疫化に際して生じた抗原特異的T細胞の定量的頻度につき評価する。評価した抗原特異的T細胞はOVA特異的CD8+またはLLO特異的CD8+またはCD4+T細胞である。このOVA抗原モデルはワクチンに挿入された異種腫瘍抗原に対する免疫応答を評価し、注目するいずれかの抗原で置き換えることができよう。LLO抗原はListeriaに対して特異的であり、ワクチンビヒクルとして用いられるいずれかの微生物ベクターのための適当な抗原に代えて置き換えることができよう。特異的T細胞は、特異的抗原の認識に際してサイトカイン放出(例えば、IFN−γ)の検出によって評価される。PVDFベースの96ウェルプレート(BD Biosciences,San
Jose,CA)を抗−ネズミIFN−γモノクローナル抗体(mAb R4;5μg/mL)で4℃にて一晩被覆する。プレートを洗浄し、200μLの完全なRPMIで室温にて2時間ブロックする。ワクチン接種したマウス(または非ワクチン接種コントロールマウスからの脾臓細胞をウェル当たり2×105細胞にて添加し、約0.01ないし10μMの範囲の種々の濃度のペプチドの存在下にて37℃にて20ないし22時間インキュベートする。用いたペプチドはSL8、OVA、LLO190(NEKYAQAYPNVS、配列番号:2、Invitrogen)についてのMHCクラスIエピトープ、リステリオリシンO(Listeria抗原)、またはLLO296(VAYGRQVYL、配列番号:3)についてのMHCクラスIIエピトープ、リステリオリシンOについてのMHCクラスIエピトープいずれかであった。洗浄の後、プレートを、PBS中に0.5μg/mL中に希釈したIFN−γに対して特異的な二次ビオチニル化抗体(XMG1.2)とともにインキュベートする。室温での2時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、1%BSAを含有するPBS中で希釈した1nm金ヤギ抗−ビオチンコンジュゲート(GAB−1; 1:200希釈;Ted Pella,Redding,CA)とともに37℃にて1時間インキュベートする。徹底的な洗浄の後、プレートを、スポット発生のための基質(Silver Enhancing Kit; 30μL/ウェル; Ted Pella)とともに室温にて2ないし10分間インキュベートする。次いで、プレートを蒸留水で濯いで、基質反応を停止させる。プレートを風乾した後、各ウェル中のスポットを、自動ELISPOTプレートリーダー(CTL、Cleveland、OH)を用いてカウントする。サイトカイン応答は、OVA特異的T細胞またはListeria特異的T細胞いずれかにつき、106脾臓細胞当たりのIFN−γスポット−形成細胞(SFC)の数として表す。
抗原特異的CD8+またはCD4+T細胞の数をさらに評価し、結果をELISPOTアッセイから得られたのと相関付けるために、ICSを行い、フローサイトメトリー分析によって細胞を評価する。マウスのワクチン接種した、およびコントロール群からの脾臓細胞を、ブレフェルジンA(Pharmingen)の存在下で、SL8(OVA特異的CD8+細胞を刺激)またはLLO190(LLO特異的CD4+細胞を刺激)とともに5時間インキュベートする。ブレフェルジンAは、T細胞の刺激に際して生じたサイトカインの分泌を阻害する。無関係なMHCクラスIペプチドとともにインキュベートした脾臓細胞をコントロールとして用いる。PMA(フォルボール−12−ミリステート−13−アセテート,Sigma)20ng/mLおよびイオノマイシン(Sigma)2μg/mL刺激脾臓細胞を、IFN−γおよびTNF−α細胞内サイトカイン染色についての陽性コントロールとして用いる。細胞質サイトカイン発現の検出では、細胞をFITC−抗−CD4 mAb(RM4−5)およびPerCP−抗−CD8 mAb(53−6.7)で染色し、固定し、Cytofix/CytoPerm溶液(Pharmingen)で浸透性化し、氷上で、PE−コンジュゲーテッド抗−TNF−α mAb(MP6−XT22)およびATC−コンジュゲーテッド抗−IFN−γ mAb(XMG1.2)で30分間染色する。細胞内IFN−γおよび/またはTNF−αを発現する細胞のパーセンテージはフローサイトメトリー(FACScalibur,Becton Dickinson,Mountain View,CA)によって決定し、データは、CELLQuestソフトウェア(Becton Dickinson Immunocytometry System)を用いて分析する。種々の抗体上の蛍光ラベルは全てFACScaliburによって区別できるので、適当な細胞は、抗−IFN−γまたは抗−TNF−αのいずれかまたは双方で染色されるCD8+およびCD4+につきゲーティングすることによって同定される。また、このモデルを用いて微生物ワクチンの免疫原性を決定することもでき、ここで、樹状細胞集団、またはマクロファージ集団のようなもう1つの抗原提示細胞は微生物ベクターとともにインキュベートされる。得られた抗原提示細胞はマウスの足に注入され、リンパ節からの細胞集団を前記したようにT細胞につき評価される。
マウスの脾臓細胞によるサイトカイン分泌のレベルもまた、コントロールおよびワクチン接種C57B1/6マウスにつき評価することができる。脾臓細胞はSL8またはLLO190で24時間刺激する。無関係なペプチドHSV−gB2(Invitrogen,SSIEF ARL、配列番号:4)での刺激をコントロールとして用いる。刺激された細胞の上清を収集し、Tヘルパー−1およびTヘルパー−2サイトカインのレベルを、ELISAアッセイ(eBiosciences,CO)またはCytometric Bead Arrayキット(Pharmingen)を用いて決定する。
インビトロにて、またはインビボでC57B1/6マウスにて直接的に、その細胞傷害性活性を評価することによって、OVA特異的CD8+T細胞をさらに評価することができる。CD8+T細胞は、その各標的細胞を抗原特異的に認識し、溶解させる。インビトロ細胞傷害性は、クロム放出アッセイを用いて決定される。ナイーブおよびListeria−OVA(内部)ワクチン接種マウスの脾臓細胞を、照射されたEG7.OVA細胞(OVAを発現するようにトランスフェクトされたEL−4腫瘍細胞系、ATCC、Manassas,VA)で、または100nM SL8いずれかで10:1比率にて刺激して、脾臓細胞集団中のOVA特異的T細胞を拡大させる。培養から7日後に、エフェクター細胞の細胞傷害性活性を、標的細胞としてのEG7.OVAまたはSL8パルスドEL−4細胞(ATCC,Manassas,VA)および陰性コントロールとしてのEL−4細胞単独を用い、標準的な4時間51Cr−放出アッセイで決定する。YAC−1細胞系(ATCC,Manassas,VA)を標的として用いて、NK細胞活性を測定して、T細胞による活性をNK細胞による活性から区別する。特異的細胞傷害性のパーセンテージは100×(実験的放出−自然発生的放出)/(最大放出−自然発生的放出)として計算される。自然発生的放出は、エフェクター細胞無くして標的細胞のインキュベーションによって決定される。最大放出は、0.1%トリトンX−100で細胞を溶解することによって決定される。実験は、もし自然発生的放出が最大放出の>20%であれば分析につき有効であると考えられる。
(S−59処理の有りおよび無しでの、Listeria DP−L4056でワクチン接種したマウスからの脾臓細胞のELISPOTおよびICS分析)
OVA抗原の有りまたは無しでListeria株DP−L4056をS−59処理の有りまたは無しで調製し、それを用いて、投与が静脈内であったことを除いて実施例4と同様にC57B1/6マウスをワクチン接種した(同様にHBSSコントロール)。ワクチン接種は、表7および8に示した用量にてナイーブなマウスに対して行った。ワクチン接種から12日後に脾臓を収集した。脾臓を、実施例5におけるようにICSおよびESISPOTアッセイによって評価した。加えて、LD50をこれらのListeriaにつき評価した。TNF−αおよびIFN−γ双方につき陽性の細胞のパーセントの項目にて、LLO190特異的CD4+T細胞およびOVA特異的CD8+T細胞双方についてのICSアッセイ結果を表7および図6A、Bに掲げる。2×105脾臓細胞当たりのIFN−γSFCの項目にて、ELISPOTアッセイを表8および図7に掲げる。これらの結果は、OVAを持つS−59処理サンプルは、非S−59処理サンプルの100倍過剰で投与した場合にOVA特異的応答を刺激することを示す。陽性OVA特異的応答はより低い用量では観察されないが、これは、依然として、S−59処理サンプルが4logだけ減弱されるにつれて増大した安全性の余地を提供する。加えて、LD50は未処理サンプルに対してS−59処理につき103倍高く、これは、100倍高いレベルにおける投与でさえ、未処理Listeriaに対して安全性の10倍レベルがあることを示す。
(対立遺伝子交換によるListeriaからのuvrABの欠失についてのpKSV7−dlBsrFI uvrABの構築)
ソラレンおよびUVA光での処理によって誘導されたDNAに対する損傷を修復することができないListeriaの突然変異体株を、Listeriaにおける紫外線抵抗性(uvr)AB遺伝子(UVRAB)を実質的に欠失することによって作り出した。これらの突然変異体はDNA修復突然変異体、あるいはヌクレオチド切出修復(NER)突然変異体として知られている。ListeriaからのuvrABの欠失は対立遺伝子交換によって達成された[Camilliら、Molecular Microbiology 8:143−147(1993)]。uvrABはいずれかのListeria株から欠失することができる例として、表9に示すListeria monocytogenes株からuvrABを欠失させた。
(対立遺伝子交換による、または部位−特異的組み込みベクターによる選択されたListeria株のゲノムへの抗原発現カセットの挿入)
実施例7に記載された株、いずれかの選択されたListeria株、またはいずれかの細菌株をさらに改変して、悪性病または感染症に関連する異種タンパク質または抗原を発現させることができる。異種タンパク質の発現は、プラスミドが安定に維持されるように、選択された宿主細菌に適合するレプリコンを含むプラスミドを介することができる。別法として、原核生物発現カセットは、実施例7に記載された対立遺伝子交換を含めた種々の方法を用い、あるいは選択されたトランスポゾンまたはバクテリオファージに由来するランダムまたは部位−特異的に組み込まれるベクターにて、宿主細菌のゲノムに安定に組み込むことができる。
(ヌクレオチド−切出修復(NER)突然変異体に由来する細菌ワクチン)
本特許に記載された実施例は、感染症および悪性病に関連する抗原をコードする組換え送達プラットホームの光化学処理を介するゲノム不活化を利用するワクチン組成物の効率を説明する。本組成物に従い、ゲノムは不活化され、複製の間に分離することはできないが、転写プロフィールはほとんど無傷のままであり、かくして、ワクチン接種された個体におけるデ・ノボ抗原発現、およびCD8+細胞傷害性T細胞(CTL)を含めた病原体特異的免疫応答の最適な誘導をもたらす。さらに、実施例7に記載されたように、DNAヌクレオチド切出修復(NER)マシーナリーが、作成された遺伝子欠失を含めたいずれかの数の手段によって不活化されているこの組成物におけるワクチンプラットフォームを利用することによって、これらの突然変異体における光化学不活化に対する感度は劇的に増大する。
(ヒト癌のインビボ処置のための本発明のワクチンの使用)
ヒト癌の処置または予防の例として、微生物核酸が微生物集団の増殖が減弱されるように改変され、ここで、微生物遺伝子発現が実質的に影響されない微生物集団を含むワクチンが個体に投与される。微生物は実施例7および8のプロトコルに従って調製することができ、ここで、ヒト腫瘍抗原をコードするいずれかの所望の原核生物発現カセットは、例えば、実施例8に記載されたpPL2組込みベクター、またはそのいずれかの改変を利用することによって、あるいは当該分野におけるものに共通したいずれかの方法によって、微生物に取り込まれる。得られた集団は粗製、または好ましくは精製された形態で処方されることができる。それらは、液体懸濁液として調製することができるか、あるいは凍結乾燥し、投与用の適当なキャリアに再懸濁させることができる。加えて、それらは保存剤(例えばチメロサール、フェノキシエタノール)、安定化剤(例えば、ラクトース、グルタミン酸モノナトリウム)、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サイトカイン)、抗生物質(例えば、ネオマイシン、ストレプトマイシン)または他の物質のような添加剤と共に処方することができる。処方は滅菌水、生理食塩水、等張緩衝化生理食塩水(例えば、生理学的pHに緩衝化されたリン酸塩)、または他の適当な希釈剤のような適当な希釈剤に再懸濁または希釈することができる。
(S−59ソラレンUVA処置に続く、uvrAB突然変異を持つおよび持たないListeria株DP−L4029の抗原提示)
実施例7のListeria株DP−L4029uvrAB突然変異体クローンを改変して、実施例8の手法を用いてOVA抗原を発現させた。この株およびOVAを発現するように改変されたDP−L4029を、種々の濃度にてソラレンS−59で処理した。Listeria株は37℃にて一晩増殖させ、2mLアリコットを100mLのBHIに希釈し、37℃にてほぼ4時間、0.5のOD600(ほぼ1×109CFU/mL)まで増殖させた。各Listeria株の5mLアリコットを15mL試験管に加え、2300×gにて20分間遠心し、上清を除去し、細菌を5mLのPBSに再懸濁させ、ほぼ1×109CFU/mLが得られた。uvrAB突然変異体株については、3mM S−59ストックを10mL PBSまで33.3μL希釈して、10μM溶液が得られ、これの適当なアリコットを10、20、30、40、50、60、70、80、90および100nMの最終濃度までListeriaに添加し、他方、DP−L4029では、S−59を5mLの最終容量中の100、200、400、800および1000nMの最終濃度まで添加した。これらを6ウェル培養プレートまで移し、0.5J/cm2の用量で照射した(FX1019UVAデバイス)。サンプルを15mL試験管に移し、5mLのPBSを加え、それらを2300×gにて20分間遠心して、未処理ソラレンを洗浄した。上清を除去し、細菌を5mLのPBSに再懸濁させ、新しい6ウェルプレートに移した。これらを5.5J/cm2のUVA量にて照射して、ソラレンモノアダクトを架橋に変換した。また、各Listeria株のサンプルを、72℃にて3時間処理することによって加熱死滅させた。log力価およびOVA抗原提示は実施例1のように評価した。S−59処理サンプルについての結果は表12Aおよび図9Aおよび9Bに見出される(バックグラウンドレベルを差し引くことなく計算した、DC2.4細胞当たり1のListeriaにおける抗原提示)。双方の加熱死滅させた株についての結果は、検出限界未満の力価を示し(完全な不活化、加熱死滅させた細菌はB3ZアッセイにおいてOVA抗原を提示しなかった。結果は、uvrAB突然変異体は検出限界まで増殖の減弱でさえ非常に強い抗原提示を示すことを示し、ここで、非uvrAB突然変異体株は(実質的に完全な不活化でのほぼバックグラウンドレベルまでの)増殖の減弱の関数として抗原提示の大きな低下を示す。これは、uvrAB突然変異体がソラレン減弱化Listeriaの意味でMHCクラスI提示を保持し、有効な免疫応答および有意に増大したレベルの安全性を伴ってワクチンを提供するはずであることを示す。
もう1つの実験は同一の株を用いて行った。この実験では、Listeriaを37℃にて一晩BHI中で増殖させた。これらをBHIに1:50希釈し、37℃にて300rpmで0.5のOD600まで増殖させ、その時点で、50mLの溶液を清浄なフラスコに移し、S−59を表12Bに示したレベルまで加えた。これらのサンプルは37℃にて300rpmにおいてほぼ1時間インキュベートした(OD600ほぼ1.0、ほぼ1×109/mL)。1mLアリコットを除去して、力価を評価し、残りを150mmペトリ皿に移し、6J/cm2の量にて照射した(FX1019)。力価後照射を各サンプルにつき決定し、OVA抗原提示を前記したように評価した。結果は表12Bおよび図9Cおよび9Dに見出される(バックグラウンドレベルを差し引くことなく計算した、DC2.4細胞当たり10のListeriaにおける抗原提示)。結果は、親株については、抗原提示がバックグラウンドレベルにあり、そこでは、実質的に完全な不活化があり、他方、uvrAB突然変異体では、ほぼ10倍範囲のS−59濃度があり、それを超えて、適切な抗原提示と共に実質的な完全な不活化があることを示す。
(実施例12)
(DP−L4029 uvrABと比較したS−59/UVA処理Listeria monocytogenes DP−L4029におけるタンパク質合成)
Listeria monocytogenes DP−L4029およびDP−L4029uvrABを37℃にて一晩BHI中で増殖させた。これらをBHIへ1:50希釈し、37℃にて300rpmにおいて0.5のOD600まで増殖させ、その時点において、50mLの溶液を清浄なフラスコに移し、S−59を4029については2500nMのレベルまで、4029uvrAB突然変異体株については200nMのレベルまで加えた。これらのサンプルを37℃にて300rpmにおいてほぼ1時間インキュベートした(OD600ほぼ1.0)。1mLアリコットを除去して、力価を評価し、残りを150mmペトリ皿に移し、6J/cm2の量にて照射した(FX1019)。力価後照射を各サンプルについて測定して、不活化のレベルを評価し、その結果、実質的に完全な不活化が得られた。この処置は、双方の株についての検出の限界まで不活化を提供するほぼ最低のS−59量であることが決定された。各株については、OD600−対−力価CFU/mL増殖曲線に基づいて、1×1010細菌を15mL遠心管に移した。サンプルを2300×gにおいて4℃にて20分間遠心し、上清を除去し、ペレットを50mLのPBSで洗浄した。これを合計3回の洗浄のために反復した。最終ペレットをメチオニンまたはシステイン(Gibco)を含まない2mLのDMEMに懸濁させ、30分間振盪しつつ5%CO2インキュベーター中にて37℃でインキュベートした。サンプルを1600rpmにて2分間、2mL遠心管中で遠心し、上清を除去し、メチオニンまたはシステインを含まない2mLのDMEMを加えた。35Sメチオニン−システインの80μCiアリコットを加え(Perkin Elmer Life Sciences)、サンプルを30分間振盪しつつ、5%CO2インキュベーター中で37℃にてインキュベートした。サンプルを前記したように遠心し、上清を除去した。各上清の50μLアリコットをSDS−PAGEゲル(Invitrogen、NuPage4ないし12%ビス−トリスゲル)上へと隣接するレーンに負荷し、100ボルトにてほぼ1.5時間泳動させた。ゲルを10%酢酸および30%エタノールで固定し、次いで、エンハンサー(Enlightning、NEN Life Sciences)に15分間浸漬させた。ゲルを80℃にて3時間乾燥し、X−線フィルムへの暴露によって可視化した。2つの実験についての結果を図10に示し、これは、uvrAB突然変異体株におけるかなりのタンパク質合成を示し、他方、親株は限定されたタンパク質合成を示すことを示す。
(Listeriaの増殖の間における存在するS−59の有りまたは無しにてのS−59/UVA不活化の比較)
2つの不活化方法を、Listeria monocytogenes株の不活化に関して比較した。第一の方法においては、Listeriaを300rpmにおいて37℃にて一晩BHI中で増殖し、次いで、BHIへ1:50希釈し、37℃にて300rpmにおいて0.7ないし1.00のOD600まで増殖させた。これらを遠心し、1%BSAを含むBS中へ1×109/mLのレベルまで懸濁させた。S−59を親株については120nMのレベルまで、およびuvrAB突然変異体株については30nMのレベルまで加えた。サンプルを氷上でほぼ60分間インキュベートし、次いで、150mmペトリ皿に移し、6J/cm2の量にて照射した(FX1019)。第2の方法においては、Listeriaを同様に0.5のOD600まで増殖させ、その時点で、50mLの溶液を清浄なフラスコに移し、S−59を親株については2500nMのレベルまで、およびuvrAB突然変異体株については200nMのレベルまで加えた。これらのサンプルを37℃にて300rpmにおいてほぼ1時間インキュベートした(OD600ほぼ1.0、ほぼ1×109/mL)。1mLアリコットを取り出して、力価を評価し、残りを150mmペトリ皿に移し、第一の方法のように照射した。力価後照射を各サンプルにつき決定し、その結果、全てのサンプルについて増殖の実質的に完全な阻害がもたらされた(>8log不活化)。DP−L4029−対−DP−L4029uvrAB、第二の方法によって処理されたほぼ1×1011細菌を含む全サンプルでなされた実験においては、全サンプルを平板培養し、これは、親株についてはほぼ9log死滅、およびuvrAB突然変異体については>10log死滅を示す。Listeriaの4つの異なる調製物についての結果を表13に掲げる。
もう1つの実験において、DP−L4029およびDP−L4029 uvrAB株を、マウスにおける野生型挑戦に対して保護的免疫性を供するその能力につき評価する。Balb/cマウスをHBSS、DP−L4056野生型(+/−加熱死滅)、BP−L4027(LLO欠失)、DP−L4029 S−59/UVA処理(前記した第一および第二の方法)、DP−L4029uvrAB S−59/UVA処理(前記した第一および第二の方法)にて、表14に記載された群にてワクチン接種した。ワクチン接種から27日後、群当たり3匹のマウスに2×LD50を挑戦させ、群当たり6匹のマウスに、100×LD50の野生型Listeria monocytogenesを挑戦させた。挑戦から3日後に、2×LD50を挑戦させたマウスを犠牲にし、脾臓および肝臓を摘出し、Listeriaの増殖のために培養した。各マウスからの脾臓または肝臓を、0.5%トリトンX−100(Sigma)を含む滅菌蒸留水中でホモゲナイズした。系列10倍希釈をストレプトマイシン(50μg/mL)を含有するBHI寒天プレート上で平板培養し、37℃において一晩インキュベートした。脾臓または肝臓当たりのコロニー形成単位の数を、野生型挑戦に対する免疫性のサンプルとして測定した。図13A、Bは、S−59/UVA処理サンプルがHBSS(非−ワクチン接種)コントロールと比較した器官当たりCFU中ほぼ3log低下を与えることを示し、サンプルは第二の方法によって調製されたのであり、これは、第一の方法で調製されたCFUのより大きな低下を示す。加えて、処理されたuvrAB突然変異体株は、処理された親株よりもわずかに良好なCFU低下を示す。CFU低下は野生型でのワクチン接種と同程度に良好ではないが、S−59/uva処理株はCFUの低下につきいくらか効果を示し、これは、保護的免疫性と大いに相関する。100×LD50で挑戦された6匹のマウスを10日間生存につきモニターし、野生型Listeriaでワクチン接種したマウスのみが生存した。
(マウスモデルにおいてS−59/UVA処理株を用いる免疫寛容の破壊の証明)
実施例13の第二の方法に従い、Gp−70−AH1A5およびOVAを発現するDP−L4029およびDP−L4029 uvrAB株をS−59/uva処理した。Gp−70はCT−26腫瘍細胞によって発現されるオートロガスマウス抗原である。AH1A5は、生きた株において発現されると免疫応答を誘導することが示されている天然配列の単一塩基突然変異である(AH1ペプチドはSPSYVYHQF(配列番号:20)、AH1H5ペプチドはSPSYAYHQF(配列番号:21))である。予防免疫化実験では、表16に従い、Balb/cマウスを8匹のマウスの群にて静脈内ワクチン接種した(100μL)(ワクチン接種の最初の組から7日後に、群当たり3匹のマウスを犠牲にし、脾臓を収集した)。最初のワクチン接種から21日後に、群当たり残りの5匹のマウスを1×105CT−26結腸上皮腫瘍細胞(ATCC)で静脈内注射し、生存につきモニターした。
(uvrAB欠失を持つソラレン減弱化Listeria株を用いるマウスの治療的ワクチン接種)
C57B1/6マウスを用い、B16.F10,MO5.10.H3(OVA+、これはOVA発現に対して増大した均一性を有する実施例4で用いた細胞のサブクローンである)メラノーマ腫瘍細胞をマウスに注射して(100μLのHBSS IV中1×106)、肺転移を確立した。Listeria monocytogenes株DP−L4029−OVA、DP−L4027−OVA、DP−L4038−OVA(actA/461T二重突然変異体)、およびDP−L4029uvrAB−OVAを10匹のマウスのワクチン接種群で用いた。DP−L4029uvrAB−OVA株をS−59処理の有り、無しにて用い(実施例13の最初の方法により>8log死滅)、加熱死滅させたDP−L4029−OVAをHBSSのみと共にコントロールで用いた。マウスを、表16で与えられた用量での腫瘍移植から3日後にワクチン接種した(HBSS中100μLIV)。腫瘍移植から30日後に、群当たり5匹のマウスを犠牲にし、肺を収集した。肺当たりの転移の数をカウントした。群当たり残り5匹のマウスを生存につきモニターした。肺転移の数およびメジアン生存日数を表17に示す。actA−、actA−OVA、およびactA−uvrAB−OVA S−59/UVA処理および加熱死滅についての肺を図19Aに示し、肺転移の数を図19Bにプロットし、生存を図19Cにプロットする。このデータは、S−59/UVA処理uvrAB突然変異体が治療ワクチンとして投与でき、それにより、非−ワクチン接種加熱死滅コントロール、またはOVAなくしてのDP−L4029と比較して有意に低下した肺転移および拡大された生存をもたらすことを示す。
(gp70マウス抗原を発現するS−59不活化Listeria株での治療的ワクチン接種)
Balb/cマウスを用い、ヒト抗原(該ヒト抗原は本実験とは無関係である)を発現するように改変された(AH1を発現する)CT26腫瘍細胞をマウスに注射して(HBSS中100μL IVに2×105)、肺転移を確立した。Listeria monocytogenes株DP−L4029、DP−L4029−AH1A5、DP−L4029uvrAB−AH1A5、およびDP−L4406actA−AH1A5 (actA/inlB二重突然変異体)を、13匹のマウスのワクチン接種群で用いた。AH1A5株もまたOVA抗原を発現する。DP−L4029uvrAB−AH1A5株を処理、加熱死滅またはS−59処理なくして用いた(実施例13の第二の方法による)。マウスをワクチン接種し(100μL HBSS IV)、表18に従って腫瘍移植後4日に始めた。腫瘍移植から19日後に、群当たり3匹のマウスを犠牲にし、肺を収集した。肺当たりの転移の数をカウントした。群当たり残りの10匹のマウスを生存につきモニターした。肺転移についての結果を図20A(肺の絵)および20B(プロットした肺転移の数)に示し、生存を表18および図20C(ΔactAサンプル)および20D(ΔactAΔuvrABサンプル)に示す。AH1A5抗原は、いずれかの免疫化効果がマウスにおいて免疫寛容を破壊するであろうように、マウスに対して内因性である。結果は、S−59処理uvrAB突然変異体株がマウスにおいて寛容を破壊でき、その結果、有意に低下された肺転移および延長された生存をもたらすことを示す。単一ワクチン接種と比較して3日間にわたってワクチンを投与した場合に、治療的効果が改良される(3日間にわたって送達された合計用量は単一日に等しい)。
(蛍光顕微鏡を用いる樹状細胞におけるS−59/uva処理Listeria monocytogenes局所化の評価)
抗原提示細胞内のListeria monocytogenesの接種および分布は、蛍光顕微鏡によって評価した。樹状細胞系DC2.4は、10%FBS(Hyclone)、1×非−必須アミノ酸(Cellgro)、5×104I.U.ペニシリン/5×104μgストレプトマイシン(Irvine Scientific)、2mM L−グルタミン(Irvine Scientific)および1nMピルビン酸ナトリウム(Sigma)を補足した完全なRPMI培地、RPMI−1640(Gibco)中にて、皿当たり5×105細胞にてペトリ皿中でカバーグラス上で培養し、37℃にて一晩インキュベートした(これは他の細胞系、例えば、マクロファージJ774で同様に行うことができた)。Listeria 株(DP−L4056、DP−L4027(LLO−)およびDP−L4056uvrAB)の静止相培養物は、3mLのBHI培地に細菌コロニーを接種し、30℃にて一晩増殖させることによって調製した。
(グラム染色を用いるS−59UVA処理Listeria monocytogenes uviAB−株の可視化)
Listeria monocytogenesの野生型およびuvrAB−株を0.5のOD600まで増殖させ、その時点で、50mLの溶液を清浄なフラスコに移し、S−59を野生型株については2500nMのレベルまで添加し、uvrAB−突然変異体株については200nMのレベルまで添加した。これらのサンプルを300rpmにおいて37℃にてほぼ1時間インキュベートした(OD600ほぼ1.0、ほぼ1×109/mL)。1mLアリコットを取り出して力価を評価し、残りを150mmペトリ皿に移し、6J/cm2(FX−1019)のUVA量にて照射し、その結果、双方の株について>8log不活化が得られた。処理した株を実施例13に記載したように貯蔵凍結した。これらを解凍し、mL当たりほぼ1ないし2×109の濃度にて15mLの試験管中のBHI培地に1:10希釈した。これらを37℃にて300rpmでインキュベートし、0、2、4、6、8時間および一晩(ほぼ18時間)にてアリコットを取り出した。該アリコットをスライドグラス上に広げ(ほぼ50μL)、風乾した。火炎を3回通すことによってスミヤを加熱固定し、次いで、Fisher Gram Stainキット(カタログ番号282−407)を用いてグラム染色前に冷却した。スライドを顕微鏡で観察し、写真を撮り、ネガイメージを図22に示す。これは、処理された修復欠損株のユニークな性質を示し、これは、遺伝子発現を示す鎖を示すが、細菌が増殖しないように分裂できない。
(さらなる突然変異体Listeria株の構築)
突然変異体Listeria株の調製。Listeria株は10403S(Bishopら、J.Immunol.139:2005(1987))に由来した。示された遺伝子のイン−フレーム欠失を持つListeria株はSOE−PCRおよび確立された方法での対立遺伝子交換によって生じさせた(Camilliら,Mol.Microbiol.8:143(1993))。突然変異体株LLO L461T(DP−L4017)は、引用してここに一体化させるGlomskiら、J.Cell.Biol.156:1029(2002)に記載されている。actA−突然変異体(DP−L4029)は、そのプロファージで治癒されている、ここに引用してその全体を援用する、Shobleら、J.of Cell Biology,150:527−537(2000)に記載されているDB−L3078株である(プロファージ治癒は(Lauerら、J.Bacteriol.184:4177(2002);米国特許公開番号2003/0203472)に記載されている)。LLO−突然変異体(DB−L4027)(Lauerら、J.of Bacteriology,184:4177−4186(2002))、およびLLO Δ26(DP−L4042)(Decaturら,Science 290:992(2000))もまた従前に記載されている。actA−uvrAB−株の構築は、L4029/uvrAB(例えば、その出願の実施例7参照)として、2003年2月6日に出願された同時係属米国仮出願60/446,051に記載されている。DP−L4029uvrAB(actA−/uvrAB−)は2003年10月3日にATCCに寄託され、PTA−5563の受託番号が与えられた。
monocytogenes株EGD,完全なゲノム、inlB遺伝子領域; nts.457008−458963)としてリストされた配列である。
鋳型:DP−L4056またはDP−L4029ゲノムDNA
プライマー対1(inlBの5’末端から上流の領域の増幅用):
Lm−9603 1F:
Lm−(3‘inlB−R+)97020R:
(InlBカルボキシ末端の下流の領域に相補的な下線を施した配列)
(アンプリコンサイズ(bps):1007)
プライマー対2(inlBの3‘末端から下流の領域の増幅用):
Lm(5‘inlB−F+)98911F:
Lm−99970R:
(アンプリコンサイズ(bps):1074)
二次PCR反応において、一次PCRアンプリコンは、対1からの逆方向プライマーおよび対2の順方向プライマーの間の相補性を利用し、重複PCRを介して融合させる。この結果、配列:nts.97021−98910=1889bpsをコードするinlBの正確な欠失がもたらされる。以下の鋳型およびプライマーは二次PCR反応で利用した:
鋳型:清浄された一次PCR反応
プライマー対:
Lm−96043F:
Lm−99964R:
(アムプリコンサイズ(bps):2033)
構築プロセスを完成するためのプロトコルは以下の通りである:
一次PCR反応(3温度サイクル)を、Vent DNAポリメラーゼ(NEB)および10μlの洗浄された30℃ Listeria DP−L4056またはDP−L4029一晩培養物を用いて行う。1%アガロースゲルによるListeriaアンプリコンの予測されるサイズ(1007bpsおよび1074bps)。一次PCR反応をゲル精製し、DNAはGeneClean(BIO101)で溶出する。
源:DP−L4056ゲノムDNA
プライマー:
順方向(KpnI−LLO nts.1257ないし1276):
(Tm: LLO−spec:52℃、総じて:80℃)
逆方向(BamHI−XhoI−LLO nts.2811−2792):
(Tm: LLO−spec:52℃、総じて:102℃)
また、PCRを用いて、以下の鋳型およびプライマーを用いて切形OVAを増幅する:
源:DP−E3616 E.ColiからのpDP3616プラスミドDNA(Higginsら、Mol.Molbiol.31:1631−1641(1999))。
順方向(XhoI−NcoI OVA cDNA nts.174−186):
(Tm:OVA−spec:60℃、総じて:88℃)
逆方向(XhoI−NotI−HindIII):
(Tm:総じて:82℃)
構築プロセスを完了させるための1つのプロトコルは、まず、LLOアンプリコンをKpnIおよびBamHIで切断し、次いで、KpnI/BamHIベクターをpPL2ベクター(pPL−LLO)に挿入することを含む。次いで、OVAアンプリコンをXhoIおよびNcoIで切断し、XhoI/NotIで切断されているpPL2−LLOに挿入する(注:pPL2ベクターはいずれのXhoI部位も含まず;pDP−3616は、OVA逆方向プライマー設計で開発される1つのXhoI部位を含む)。構築体pPL2/LLO−OVAは、制限分析(KpnI−LLO−XhoI−OVA−NotI)および配列決定によって確認される。正確にLauerらによって記載されているように、プラスミドpPL2/LLO−OVAを形質転換によってE.coliに導入し、続いて、コンジュゲーションによってListeria(DP−L4056)にまたはinlB−突然変異体またはinlB−actA−二重突然変異体のようなListeriaのもう1つの所望の株に)導入し、それに組み込む。
AH1エピトープインサート(ClaI−PstI適合性末端):
頂部ストランドオリゴ(AH1頂部):
底部ストランドオリゴ(AH1底部):
AH1−A5エピトープインサート(ClaI−AVAII適合性末端):
AH1−A5エピトープの配列はSPSYAYHQF(配列番号:21)である。
頂部:
底部:
与えられたエピトープのためのオリゴヌクレオチド対を等モル比で一緒に混合し、95℃にて5分間加熱する。次いで、オリゴヌクレオチド混合物をゆっくりと冷却する。次いで、アニールしたオリゴヌクレオチド対を、関連制限酵素での消化によって調製したpPL2−LLO/OVAプラスミドと200対1モル比で連結する。新しい構築体の同一性は、制限分析および/または配列決定によって確認することができる。
(Listeria monocytogenesでワクチン接種したマウスにおけるインビボ細胞傷害性活性の評価)
一連の実験を行って、インビボで抗原特異的標的細胞を溶解させるワクチン接種マウスの能力を評価した。最初の実験において、Balb/cマウスにListeria monocytogenes株DP−L4029(actA−)、AH1/A5を発現するDP−L4029、およびAH1/A5を発現するDP−L4029uvrAB−いずれかで静脈内(IV)でワクチン接種した。また、AH1/A5発現株を、実施例13の第二の方法に従ってSS−59UVAで処理した。また、AH1−A5を発現するListeria構築対もLLOおよびOVAを発現する。ワクチン接種は、表20に示された用量(0.1LD50)にて、全ての群について0日に、加えて、S−59処理株については1日および2日に行った。各株およびコントロールでは、3匹のマウスの2つの群をワクチン接種した。標的細胞集団は、RPMI1640培地中の20のナイーブなBalb/cマウスの脾臓を収集することによって調製した。細胞を解離し、赤血球細胞を溶解させた。白血球細胞をカウントし、4つの等しい集団に分けた。各群に、37℃において90分間、0.5μg/mLにて、特異的ペプチド、標的AHI(SynPep、Dublin、CAからのSPSYVYHQF(配列番号:20))、標的AH1−A5(SPSYAYHQF(配列番号:21)、SynPep)、またはコントロールの2つの集団(β―gal、TPHPARIGL(配列番号:37))いずれかでパルスした。次いで、細胞を培地中で3回、PBS+0.1%BSA中で2回洗浄した。カルボキシフルオロセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE、Molecular Probes、Eugene、OR)で標識するために、細胞をmL当たり1×107にて、温かいPBS+0.1%BSA(10mL以下)に再懸濁した。細胞懸濁液を標的化するために、1.25μLのCFSEの5mMストックを加え、渦巻かせることによってサンプルを混合した。コントロール細胞懸濁液に、CFSEストックの10倍希釈を加え、渦巻かせることによってサンプルを混合した。細胞を37℃にて10分間インキュベートした。大容量の(>40mL)の氷冷PBSの添加によって染色を停止した。細胞を室温にてPBSで2回洗浄し、次いで、再懸濁し、カウントした。各細胞懸濁液をmL当たり50×106に希釈し、100μLの各集団を混合し、第6日に、ナイーブなまたはワクチン接種したマウスいずれかの尾静脈を解して注射した。各株またはコントロールにつき、3匹のマウスの群にβ−galおよびAH−1またはβ−galおよびAH1−A5を注射した。12ないし24時間後、脾臓を収集し、合計5×106細胞をフローサイトメトリーによって分析した。高い(標的)および低い(コントロール)で蛍光ピークを数え、2つの比率を用いて、HBSSコントロール集団に対する標的細胞溶解のパーセンテージを確立した。結果を表20および図23Aに示す(本実施例における表は3匹のマウスについての平均を示し、他方図面は示されたサンプルについての個々のマウスからの代表的なヒストグラムである(必ずしも同一のマウスではない))。S−59処理株を用いるワクチン接種は、uvrA−突然変異体についてのAH1に対するわずかに良好な応答、およびS−59処理actA−株に対するuvrAB−突然変異体についてのAH1−A5に対する有意により高い応答を示す。
(uvrAB欠失の有りおよび無しにての、Bacillus anthracisのS−59/UVA処理)
実施例7ないし9、およびCamilliら、Molecular Micro.,8.143−147(1993)に詳細に記載された対立遺伝子交換方法を用いて、Bacillus anthracis Sterne株を改変した。この株のビルレンスを減弱化する(pXO1+、pXO2−)。
一次PCR反応:各々、B.anthracis uvrAB遺伝子5’および3’末端から上流および下流のほぼ1000bpsを増幅した。
プライマー対1: uvrB.の5’末端から1000bp上流の領域の増幅
(アンプリコンサイズ(bps):1029)
Ba−225099F:
Ba−(3’uvrA−R+)226109R:
プライマー対2:uvrAの3’末端から下流の領域の増幅
(アンプリコンサイズ(bps):990)
Ba−(3‘uvrA−R+)230779F:
Ba−231769R:
二次PCR反応:対1の逆方向プライマーおよび対2の順方向プライマーの間の相補性を利用する、SOE PCRを介する一次PCRアンプリコンの融合。配列:nts.226110−230779=4670bpsをコードするuvrABの正確な欠失における結果。
プライマー対:(アンプリコンサイズ(bps:1973)
Ba−225118F:
Ba−231761R:
構築:一次PCR反応(3温度サイクル)を、Vent DNAポリメラーゼ(NEB)およびSterne株ゲノムDNAを用いて行う。4つの一次PCR反応は、スプライス重複延長(SOE)で用いるプライマーの有りおよび無し双方にて行う(もしBa−(3’uvrA―R+)226109RまたはBa−(3’uvrA−R+)226109Rプライマーを含む反応が有意なアンプリコン産物を生じなかったならば、Ba−225099F/Ba−226109RまたはBa−230779F/Ba−231769Rプライマー対との反応からのアンプリコンに対するこれらのプライマーを用いた)。1%アガロースゲルによるanthracis一次アンプリコンの予測されるサイズ(1029bpsおよび990bps)が確認された。反応物はS6カラム(BioRad)またはGeneClean(BIO 101)で洗浄した。
(ヒト癌のインビボ処置のための本発明のワクチンの使用)
ヒト癌の処置または予防の例として、負荷され、かつ微生物の増殖が減弱化されるように改変された微生物による感染によって活性化された抗原提示細胞を含むワクチンであって、ここで、微生物遺伝子発現が実質的に影響されないワクチンを個体に投与する。微生物は実施例4および5のプロトコルに従って調製することができ、ここで、ヒト腫瘍抗原をコードするいずれかの所望の原核生物発現カセットを、例えば、実施例8に記載されたpPL2組込みベクター、またはそのいずれかの改変を利用することによって、あるいは当業者に常識であるいずれかの方法によって微生物に取り込ませる。次いで、抗原提示細胞(APC)を負荷し、本明細書中に概説したもののような方法を用いて改変された微生物で活性化させる。
(Listeriaの減弱化株に基づく組換え腫瘍Ag分泌ワクチンの生成)
抗原分泌およびMHCクラスIプロセッシングを容易とするためにリステリオシリン(Listeriolysin)O(LLO)の切形された形態と融合させたニワトリオボアルブミン(OVA)を、選択された減弱化Listeria株の免疫原性を評価するための実験においてモデル抗原として用いた。腫瘍抗原発現カセットを、独占的pPL2組込みベクターで減弱化されたListeria株のパネルの染色体上の無毒部位に部位−特異的に組み込んだ。組換えLisetria株は、ウェスタンブロット分析によって測定されるように予測された改変LLO−OVA融合タンパク質を発現し、分泌した(データは示さず)。液体ブロス培養ならびに細胞内増殖動態学におけるこれらの組換え体の各々の増殖もその親から区別することができた。さらに、組換えOVA発現株は、未改変親株の2のファクター内にあるIV LD50を有することが示された(表24)。
(生きていないが、代謝的には活性なListeriaを生産するためのソラレン−誘導DNA架橋)
Listeriaベースのエキソビボ抗原送達プラットホームに対する安全性を確認するために、遺伝子的に減弱されたListeriaを用いることに加えて、本発明者らは、ソラレンでの処理を通じて十分に不活化することができるが、代謝的には活性であり、細胞に感染し、ファゴリソソームから逃避し、かつクラスI経路を介してコードされた抗原の提示を促進するその能力をかくして保有するListeria株を作成した。作成されたListeria株は、ソラレン、それらが増殖できないように、UVA光照射後に細菌のゲノムにおいて不可逆的な架橋を形成する化合物の群での不活化に対して非常に感受性である。ソラレンー媒介DNA損傷を修復することができないListeriaの突然変異体株は、Listeriaおよび他の細菌におけるヌクレオチド−切出修復に必要な、紫外線光抵抗性(uvr)AB遺伝子(uvrAB)を欠失することによって創製された(Sancarら、Ann.Rev.Biochem.,57:29−67(1988))。ソラレンS−59はHelinxとして知られたDNA架橋技術で用いられるCerus化合物のメンバーの1つである(Lin,N.,Psoralen photochemical treatment of plateletes,Science and Medicine (1998); Hei,ら、Transfusion,39:239−48(1999))。検出の限界までListeria uvrAB欠失突然変異体を不活化するソラレン濃度において、無傷DNA修復メカニズムを有する親非−突然変異体株はUVA光不活化に対して4log以上感受性が低い(図25B)。S−59/UVA不活化Listeria uvrABは、MTTアッセイにおいて測定されたようにそのミトコンドリア活性を維持し、35S−メチオニン−標識パルス−チェイス実験によって測定されたように、そのゲノムレパートリーを発現するその能力を保持した(図26および図10)。不活化親株はそうではなかったが、S−59/UVA不活化Listeria uvrABは、その遺伝子レパートリーの継続した発現を示した。不活化親株の発現レベルは有意に減少し、これは、十分な不活化に必要なS−59濃度におけるS−59/UVA処理が、同様にコードされた腫瘍抗原の発現を含めた、Listeria遺伝子産物の発現を有意に減少させることを示す。
(生きていないListeria uvrAB株はDCに感染し、ファゴリソソームから逃避する能力を保有する)
代謝活性を維持するに加え、樹状細胞(DC)の感染に際して、S−59/UVA不活化Listeria uvrAB株によるMHCクラスI経路への効果的な抗原負荷を示すのは重要である。本発明者らは、今回、LLOをコードするhly遺伝子の欠失によりファゴリソソームから逃避することができないListeria突然変異体(DP−L4027)でのDCの感染は、MHCクラスIの意味において、抗原の提示を排除することを示した。
(生きていないListeria uvrABは、感染された樹状細胞(DC)のMHCクラスI経路に抗原を効果的に負荷する)
感染した細胞内のファゴリソソームを逃避するS−59ソラレン不活化Listeria uvrABのユニークな能力のため、サイトゾルListeriaによって分泌された遺伝子産物はプロセッシングされ、MHCクラスI経路を介して提示される。DCのMHCクラスI経路へ抗原を負荷するS−59/UVA不活化Listeria uvrABの能力をテストするため、DC2.4細胞を、異なる濃度のS−59で不活化された、OVA−発現Listeria株、L4029 uvrAB OVAで1の感染多重度(MOI)にて感染させた。親ListeriaOVAおよび加熱−死滅Listeria uvrAB OVAはコントロールとして供した。Listeriaの貪食作用に続くクラスI分子へのDC2.4によるOVAペプチドの提示は、B3Z細胞とのインキュベーションの後に測定した。B3Zは、ネズミKbクラスI分子上に提示されたOVA257−264(SL8)エピトープに特異的なLacZ−誘導性CD8+T−細胞ハイブリドーマである(Sanderson,Int.Immunol.,6:369−76(1994))。B3Z細胞へのSL8のクラスI−制限提示の結果、B3Zによるβーgal合成の誘導がもたらされる。生じたβ−galの量は発色性基質GPRGの加水分解によって測定することができ、APCの表面に提示されたSL8/Kb複合体の量の指標である。図9Aおよび9Bに示されたように、同族親株はそうでなかったが、S−59/UVA不活化Listeria uvrAB OVA株は、増殖するその能力とは独立してMHCクラスI経路へ抗原を負荷するその能力を維持した(これは、実施例11に記載されたのと同一のデータである)。70ないし100nMのS−59濃度を用いる十分な不活化においてさえ、90%を超えるB3Z活性化が維持された。対照的に、無傷DNA修復を持つ親Listeria OVA株は、より高い濃度のS−59を不活化で用いる場合、B3Z T−細胞ハイブリドーマを活性化するその能力を喪失した。Listeria uvrAB OVA株とは対照的に、B3Z活性化、およびBHI寒天プレート上でコロニーを形成する親Listeria OVA株の能力は密接に関連し、これは、生きたListeria OVAのみがDC2.4細胞を感染でき、かつMHCクラスI経路へ抗原を負荷できることを示唆する。さらに、加熱−死滅化Listeria uvrAB OVAはB3Z活性化をもたらさなかった。この結果は、MHCクラスI経路へ抗原を負荷するListeriaの能力は、ソラレン−媒介DNA損傷を修復するその能力を妨げるように改変された、S−59/UVA不活化Listeriaを用いる増殖ようの要件とはリンクできないことを示す。
(ListeriaはヒトDCを直接的に感染し、活性化させる)
優れた抗原送達プラットホームの開発のためには、MHCクラスI経路へ抗原を効果的に送達することに加え、DCの活性化/成熟化が必要であると広く考えられる。イン・サイチュでは、未成熟DCは末梢組織に存在し、そこで、それは継続的に抗原を取り込み、それを加工するが、それは、活性化/成熟化プロセスを開始するいずれの細菌が提供するかのような活性化刺激の遭遇であり、ケモカイン受容体の変調、およびリンパ節を排出するT細胞領域へのDCのT細胞領域への移動に至る。我々は、ヒト単球−由来BCの表現型成熟化およびサイトカイン生産を誘導する野生型Listeria(L−4056)の能力を評価した。図29に示すように、ヒト未成熟DCとListeriaとの遭遇は、活性化マーカー、CD86およびHLA−DR(図29A)、ならびに成熟化マーカー、CD83(図29B)のアップーレギュレーションに導いた。さらに、Listeriaへのヒト未成熟DCの暴露は、IL−12p70およびTNF−αのような高レベルのプロ−炎症性サイトカインを分泌するその能力によって示されるように、その免疫―刺激能力を増加させた(図29C)。
(S−59/UVA不活化Listeria uvrAB OVAはインビトロにてOVA−特異的免疫性を誘導する)
我々は、インビボにてOVA−特異的免疫性を誘導するS−59/UVA不活化Listeria uvrAB OVAワクチンの能力を評価した。雌C57BL/6マウスを、S−59/UVA不活化Listeria uvrAB OVAの1×108粒子で静脈内ワクチン接種した。OVA−特異的免疫性の誘導はワクチン接種から7日後に評価した。顕著には、S−59/UVA不活化Listeria uvrAB OVAは、図30に示すように、有意なOVA−特異的CD8+T細胞応答を示したが、親Listeria OVA株はそうでなかった。さらに、加熱―死滅化Listeria uvrAB
OVAでのマウスのワクチン接種は、OVA−特異的免疫性の誘導をもたらさなかった。
(天然(CAP1)または増強されたアゴニスト細胞障害性Tリンパ球エピトープ(CAP−1−6D)いずれかを含む全長CEAを発現する2つの組換え減弱化Listeria actA/uvrAB株の構築)
CEAは、皮内で誘導された消化系上皮および胎児結腸の腺癌で見出される180kDaの大きなタンパク質である。CEAはGPI−アンカーによって細胞の膜に付着される。該タンパク質は7つの免疫グロブリン−様ドメインを含み、C−末端は、非特異的交差反応タンパク質、NCA、癌性胚抗原遺伝子ファミリーのメンバーと相同性を示す。我々は、HLA*A0201−制限CEA天然T細胞エピトープCAP1(YLSGANLNL)(配列番号:51)または癌患者においてCEA−特異的免疫性を誘導するのにより優れていることが示されたエンハンサーアゴニスト細胞傷害性Tリンパ球ペプチドCAP1−6D(YLSGADLNL)(配列番号:52)(Zarembaら、Cancer Res.,57:4570−7(1997))いずれかを含む全長CEAを構築することを提案する(表25)(Fongら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,98:8809−14(2001))。
(Listeria株L4029 uvrABに組み込まれたpPL2 CEAwtおよびpPL2 CEA−610Dを含む2つの減弱化組換えListeria株の誘導、およびCEA抗原の発現および分泌の確認)
tRNAArg遺伝子に隣接するpPL2−CEA構築体の、Listeria株L4029 uvrABのゲノムへの組込みは、Lauerら、J.Bacteriol.,184:4177−86(2002)によって従前に記載されたように達成される。簡単に述べれば、まず、形質転換によってプラスミドをE.coli株SM10に導入し、次いで、コンジュゲーションによってListeriaの所望の株に導入する。Listeriaトランス−コンジュガントはクロラムフェニコール(pPL2)およびストレプトマイシン(Listeria株)選択培地によって選択され;このプロセスの効率はほぼ1×10−4である。トランス−コンジュガントの純度を確認し、細菌染色体へのpPL2骨格の組込みを確認するために、限定された数の候補コロニーを、新鮮な選択培地への画線培養によって3回継代する。ListeriaゲノムへのCEA構築体への正確な取込みはコロニー−PCRによって確認される。
(S−59/UVA処理によってListeria actAuvrAB CEA株を十分に不活化するが、最適な代謝活性、腫瘍抗原発現、抗原提示細胞の感染およびファゴリソソーム逃避を保持する条件の確率)
遺伝子発現の結果としての代謝活性は、最小数の架橋で最良に維持される。Listeria actA/uvrAB CEAワクチンを十分に不活化し、抗原発現レベルを無傷のまま残す最小量のS−59/UVA処理のための条件は容易に確立することができる。不活化条件の例は、OD600=0.5のlog−相培養における200nMまでのS−59ソラレンの付加、続いての、培養が1の光学密度に到達した場合の6J/m2のUVA光での不活化である。不活化条件は、S−59の濃度、UVA用量、UVA処理に先立ってのS−59暴露の時間を変化させることによって、ならびにListeria
actA/uvrAB CEA株の細菌増殖の間における処理の時間を変化させることによって最適化される。親Listeria株はコントロールとして用いられる。Listeriaの不活化(log−死滅)は、BHI(ブレイン・ハート・インフージョン)寒天プレート上でコロニーを形成する細菌の無能力によって測定される。加えて、35S−パルス−チェイス実験を用いてS−59/UVA不活化ListeriaのLLOおよびp60のようなCEAの発現およびビルレンス因子を確認して、S−59/UVA不活化後に新しく発現されたタンパク質の合成および分泌を測定することができる。35S−代謝標識を用いるLLOおよびp60の発現はルーチン的に測定することができる。S−59/UVA不活化Listeria actA/uvrAB CEAは35S−メチオニンの存在下で1時間インキュベートされる。抗原発現、およびLLO−CEA融合タンパク質、内因性LLO、およびp60の分泌は全細胞溶解物、および細菌培養流体のTEA沈殿双方で測定されるであろう。LLO−、p60−およびCEA−特異的モノクローナル抗体を免疫沈澱で用いて、不活化後に、組換えListeriaからの継続した発現および分泌を確認する。S−59/UVA不活化Listeria actA/uvrAB CEAの発現レベルは、優れた抗原特異的T細胞応答の誘導をもたらす我々の現在のListeria−OVAワクチン株と比較されるであろう。評価された遺伝子産物の発現レベルに対する限定的影響を持つ再現可能な十分な不活化に導くS−59/UVA条件を選択することができる。
(MHCクラスIの意味でCEAの効果的な提示をもたらす、不活化(S−59/UVA)Listeria actA/UVR AB CEAワクチンでのヒト未成熟樹状細胞(DC)の感染のためのプロトコルおよびワクチン株の確立)
DCのエキソビボ感染のための最適条件は3つの独立したアッセイ:(1)感染に際してのヒト未成熟DCの表現型およびサイトカインプロフィールの変化、(2)同種異系Tリンパ球応答を誘導するListeria−感染DCの能力、および(3)インビトロでCEA−特異的HLA*A0201−制限T細胞系を刺激するListeria actA/uvrAB CEA感染DCの能力の結果に基づいて決定される。
一次ヒトDCを感染し、それを活性化する、S−59/UVA不活化Listeria
actA/UVR AB CEA株の効率を特徴付け、それを最適化することができる。ヒトDCを、従前に記載されているように(Fongら、J.Virol.,76:11033−41(2002))、不動化末梢血液から豊富化する。簡単に述べれば、従前に記載されているように(Mayordomoら、Nat.Med.,1:1297−302(1995))、PBMCをFicoll−Hypaque(Pharmacia,Uppsala,スウェーデン国)上での遠心によって得、次いで、Percoll(Pharmacia)を通す密度遠心によって単球枯渇させる。単球−枯渇PBMCを、外因性サイトカインを添加しない、10%のプールしたヒトAB血清を補足したRPMI 1640(BioWhittaker,Walkersville,MD)中でインキュベートする。37℃における10%CO2を含む湿潤化インキュベーター中での24時間の培養の後、15%(w/v)メトリザミドグラジエント(Sigma,St.Louis,MO)を通す遠心によってDCをさらにリンパ球から豊富化する。豊富化されたDC集団の表現型はフローサイトメトリー(HLA−DA発現、およびCD3、CD14、CD19、およびCD56発現の欠如)およびデキストラン接種によって確認される。DCのListeriaでの感染性を評価するために、DCを、S−59/UVA不活化Listeria actA/uvrAB CEA株と共に異なるMOIにて1時間インキュベートする。生きたListeriaは比較として用いる。いずれの細胞外Listeriaも除去するための広範な洗浄の後、感染したDCを50μg/mLゲンタマイシンの存在下でさらにインキュベートして、細胞外細菌を死滅させる。DCのListeria ΔactAΔuvrAB CEA株での感染に際しての表現型変化を、感染後の異なる時点でフローサイトメトリーを用い、CD80、CD83、CD86、およびMHCクラスIIの細胞表面発現を測定することによって評価する。Tヘルパー−1およびTヘルパー−2タイプサイトカインの発現は、Cytometric Bead Array Kit(Pharmingen)を用いて、感染したDC培養の上澄みから測定する。感染および活性化条件は、LPS、TNF−α、およびα−CD40のような通常に使用される刺激体と比較する。インビトロでヒトDCの優れたかつ一定した刺激および活性化、ならびに親生Listeria株と最も似ているサイトカインの分泌をもたらす感染条件を選択する。もしサイトカインを用いることのない末梢血液から単離されたDCの総じての感染性が低ければ、密度勾配遠心に先立ってのDCの感染を評価する。さらに、単球−由来DCのようなDCのさらなる源は、生きていないおよび生きたListeriaに対するその感染性を評価する。簡単に述べれば、陰性選択を用いてヒト単球を豊富化し、1000U/mLのGM−CSFおよび1000U/mLのIL−4を補足した、1×106細胞/mLの培地(RPMI−1640+10%FCS)に懸濁させる。培養の6ないし7日後に、インビトロ培養したDC集団の表現型を、フローサイトメトリーおよびデキストラン摂取によって確認する。表現型の変化、ならびにListeria感染に際しての単球−由来DCのサイトカイン分泌パターンを従前に記載されているように評価する。
Listeria−感染DC集団の刺激能力に取り組むために、混合白血球反応(MLR)において一次アロー−反応性T細胞を刺激するその能力を測定することができる。その活性化/成熟化状態に依存する、インビボで免疫応答を誘導するAPCの相対的能力は、インビトロで同種異系T細胞応答を刺激するその能力によって反映されると広く信じられている(Jungら、Immunity,17:211(2002))。簡単に述べれば、DCを単離し、十分に不活化されたListeria actA/uvrAB CEAで感染させる。感染された細胞集団の表現型はフローサイトメトリーによって確認される。種々の数の照射された(3000rad)DCを、96−ウェルU−底部プレート中で5×104同種異系レスポンダーと共に培養する(Costar,Cambridge,MA)。ランダムドナーからのPBMCをレスポンダーとして用いる。6日後、培養を1μCiの[3H]チミジンで18時間パルスする。細胞をガラス繊維シート上に収集し、[3H]チミジンの取込を、シンチレーションカウンターで放射能を測定することによって決定する。生きていないListeriaで感染させたDCの刺激能力を、生きたListeriaで感染させたDC、ならびにLPS、TNF−α、およびα−CD40のような刺激体を用いて活性化されたDCと比較する。
表現型の変化、サイトカイン分泌のプロフィール、ならびにDCのアロー−刺激能力は、インビボで抗原特異的T細胞応答を刺激するDCの能力についての間接的尺度を表す。十分に不活化されたListeria actA/uvrAB CEA株によって発現された組換え腫瘍抗原を発現するDCの能力は、L.Fongによって創製されたCEA−特異的HLA*A0201−制限T細胞系の活性化に基づいて評価される(未公表データ)。簡単に述べれば、Milestone 3−1に記載されているように、HLA*A0201陽性ドナーの末梢血液からDCを単離する。最適条件下で感染させた種々の数の照射(3000rad)DCを、5×104CEA−特異的HLA*A0201−制限T細胞と共に96−ウェルU−底プレート(Costar,Cambridge,MA)中で共培養した。24時間後、細胞上清を収集する。T細胞活性化を、IFN−γ、GM−CSF、またはIL−2分泌に基づいて測定する。分泌されたサイトカインを、商業的に入手可能なCytometric Bead Arrayキット(Pharmingen)を用いて測定する。生きていないListeriaで感染させたDCの刺激能力を生きたListeriaで感染させたDC、ならびにLPS、TNF−α、およびα−CD40のような刺激体を用いて活性化したDCと比較する。
(インビトロでCEA−特異的免疫性をプライムし、リードListeria株を選択する、Listeria−負荷一次ヒトDCの能力のさらなる開発のための確認)
S−59/UVA不活化Listeria−感染DCが、インビトロでナイーブなCEA−特異的CD8+T細胞応答をプライミングできることを確認するために、Listeria actA/uvrAB CEAで確立された最適条件下で感染させたヒト未成熟DCを用いて、インビトロでナイーブなT細胞を刺激する。天然または改変されたT細胞エピトープいずれかを含むリードListeria actA/uvrAB CEA株は、3つの独立したアッセイ:(1)DC−プライムしたT細胞培養の[3H]チミジン取込;(2)51Cr放出アッセイで測定された、プライムしたCEA−特異的T細胞培養の細胞傷害性活性;および(3)ペプチド:MHCテトラマー染色によって測定されたCEA−特異的T細胞の頻度によって測定して、ナイーブなCEA−特異的T細胞応答を誘導するその能力に基づいて選択される。最適感染をDCの表現型変化によって確認し、フローサイトメトリーを用いてCD80、CD83、CD86、およびMHCクラスIIの細胞表面発現、ならびに感染したDCによって分泌されたサイトカインプロフィールを測定することによって評価する。一次T細胞応答の誘導のために、一定数のCD45RA+Tリンパ球(2×105/ウェル)を種々の数の照射された(3,000R)Listeria−負荷DCとともに、96−ウェルの丸底マイクロタイタープレート中で7日間共インキュベートする。6日後、培養を1μCiの[3H]チミジンで18時間パルスする。細胞をガラス繊維シート上に収集し、[3H]チミジンの取込を、シンチレーションカウンター(Wallac,Turku,フィンランド国)で放射能を測定することによって決定する。さらに、CEA−特異的T細胞の誘導を細胞傷害性T細胞アッセイで評価する。簡単に述べれば、5×106CD45RA+Tリンパ球を平行して、5×106細胞/1.5ml培地にて、24−ウェルプレート(Costar)中で、10:1の比率で、照射された(3,000R)Listeria−負荷DCと共に培養する。T細胞の細胞傷害性活性は、7日後に、標準的な4時間51Cr−放出アッセイで評価する。簡単に述べれば、標的細胞系SW403、SW1417、A375、およびT2を250μCiの[51Cr]中で2時間インキュベートする。この標識工程の間に、T2細胞もまたHLA*0201−制限標的ペプチドCAP1およびCAP1−6D無くして、またはそれと共にインキュベートする。標的細胞系をRPMIで3回洗浄し、96−ウェルU−底プレート(Costar)中で少なくとも5,000標的/ウェルと共に三連で平板培養する。エフェクター細胞を記載されたエフェクター/標的比にて51Cr−標識標的細胞と共にインキュベートする。4時間の培養の後、上清を収集し、Microbetaカウンター(Wallac,Turku,フィンランド国)でカウントする。パーセント特異的溶解は、式:100%×(実験的放出−自然放出)/(最大放出−自然放出)によって計算される。最大放出は、0.5%トリトンX−100(Sigma)を含有するPBS中での標的細胞の溶解によって測定される。最後に、従前に記載されているように(Fongら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,98:8809−14(2001)、CAP1またはCAP1−6Dを提示するMHC/テトラマーを用い、インビトロプライミングの後のCEA−特異的T細胞の頻度を測定することができる。インビトロプライミング前に得られた低温保存CD45RA+T細胞を、平行して、インビトロプライムした培養T細胞培養物で分析する。合計1×106細胞が、室温にて30分間で、対応するHLA*A0201フィコエリスリン−標識MHC/テトラマーで染色されるであろう。(陽性ゲートで用いられる)CD8、およびCD4、CD14、CD19、およびCD56(陰性「ダンプ」ゲート)に対する抗体を推奨される濃度で加え、4℃にて30分間インキュベートする。染色に続き、サンプルを2回洗浄し、4−色フローサイトメトリーで分析する。我々は、テトラマー染色のために以前バックグラウンドを確立した。20人のボランティア血液提供者を同一方法で評価し、彼らは、各々、CEA605−613および610Dテトラマーに対して0.30%±0.18%および0.27%±0.14%を有した(Fongら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,98:8809−14(2001))。
(異種抗原としてのプロテイナーゼ3またはPR1の使用)
前記した具体的な実施例で概説した手法のいくつかは、改変されたListeriaによって発現される抗原としてのCEA抗原の使用を記載するが、当業者であれば、同様な手法を用いて、プロテイナーゼ−3またはプロテイナーゼ−3由来抗原のような異なる抗原を発現する改変されたListeriaを調製して、インビトロまたはエキソビボで樹状細胞を感染させ、負荷および活性化/成熟化を行うことができるのは容易に認識するであろう。当業者であれば、次いで、得られたDCワクチンを動物または患者に投与して、プロテイナーゼ−3および/またはPR1に対する免疫応答を誘導することができるのも認識するであろう。
(ファゴリソソームから逃避し、クラスI抗原提示を促進する突然変異体Listeriaの能力の測定)
抗原提示細胞のファゴリソソームを逃避し、該細胞によるクラスI抗原提示を促進する特定の候補突然変異体Listeriaの能力を評価するための例示的プロトコルは以下の通りである:まず、DC2.4細胞をカバーグラス上で増殖させる。次いで、細胞を所望のListeria株で感染させる(MOI=100)。0.5hpiにおいて、細胞を濯いで遊離Listeriaを洗浄除去する。1hpiにおいて、ゲンタマイシンを50μg/mLで加える。5hpiにおいて、カバーグラスを洗浄し、3.5%ホルムアルデヒド中で固定する。カバーグラスをブロックし、ウサギ−抗−Listeria抗体(Difco)で染色し、ヤギ−抗−ウサギFITC二次(Vector Labs)で検出する。アクチンをファロイジン−ローダミン(Molecular Probes)で検出する。カバーグラスをVectamount+DAPI(Vector Labs)で設置し、調査する。前記した実施例17および実施例25も参照されたし。
(ヒト単球−由来樹状細胞の生成およびListeriaワクチンでの感染)
ヒト単球−由来樹状細胞の生成およびListeriaワクチンでの感染のための例示的プロトコルの概略を以下に掲げる。
第5日樹状細胞(DC)をペレット化し、mL当たり2×106細胞にて、GM−CSFおよびIL−4を含む新鮮な培地に再懸濁させる。500μLの懸濁液を24ウェルプレートの各ウェルに小分けする。成熟化刺激体または細菌を500μL中に加える。1μgのLPSを成熟化制御のために用いる(1000UのIFN−γまたは1μgのsCD40Lを加えて、この応答を高めることができる)。Listeria感染では、DC当たり10ないし100Listeriaの間を用いる。細胞を1時間感染し、次いで、細胞外細菌を洗浄して除去し、細胞を、50μg/mLゲンタマイシンを含有する培地に再懸濁させる。sCD40Lを加えて、DCの生存を増強させ、より大きなIL−12p70の放出を促進する。1000U/mLのIFN−γを加えて、成熟化およびIL−12p70分泌を高める。DCを、HLA−DR、CD1a、CD83、およびCD86を見るサイトメーターで表現型により調べる。
(無胞子B.anthracisワクチン株)
spoIIEイン−フレーム欠失。B.anthracisのspoIIE領域は、B.subtilis中の同一遺伝子に対する相同性によって同定される。B.anthracis Spoiieのイン−フレーム欠失を単離するために、spoIIE遺伝子をまずPCRによって増幅し、それをpcr−Blunt II−TOPO(Invitrogen)にクローン化する。次に、spoIIE遺伝子のほとんどは、重複延長(SOE)による遺伝子スプライシングの技術を用いて欠失される(Hortonら、Biotechniques 8:528−35(1990))。このイン‐フレーム欠失spoIIE遺伝子を、クロラムフェニコール−抵抗性遺伝子を担い、42℃では複製することができないシャトルベクターpKSV7にクローン化する(Smithら、Biochimie,74:705−11(1992)):次いで、欠失されたspoIIE遺伝子を含むpKSV7をB.anthracisにエレクトロポレーションし、細胞をクロラムフェニコールの存在下で42℃で増殖させて、プラスミドが相同組換えによってspoIIE遺伝子に組み込まれた株を選択する。クロラムフェニコール選択無しの30℃におけるさらなる増殖により、プラスミドが切り出され、喪失する。クロラムフェニコール−感受性株は少なくとも1%見出され、その約半分は欠失されたspoIIE対立遺伝子を含むはずである(Camilliら、(1993))。欠失の存在はPCRおよびサザーンブロット分析によって確認される。
(B.anthracisの温度感受性recA突然変異体)
30Cでよく増殖し、42Cでソラレンに対して非常に感受性であるB.anthracisの温度感受性recA突然変異体を作り出すために、E.coliの温度感受性recA突然変異体、recA44(Kawashimaら、193:288−92(1984))のV246M突然変異に類似した突然変異をB.anthracisで行う。B.anthracis突然変異体を作成するために、E.coliおよびB.anthracisの間で保存される配列245KVVKNK250(配列番号:46)を突然変異させる。V246M突然変異を、Stratagene Quick Changeキットを用い、ミスマッチしたオリゴヌクレオチド突然変異誘発によってクローン化B.anthracis recA遺伝子に導入する。突然変異は配列分析によって確認し、それを対立遺伝子交換によってB.anthracis spoIIE uvrABの染色体に導入することができるように、突然変異した遺伝子をpKSV7に導入する。別法として、B.anthracis株からのrecA遺伝子を欠失させ、E.coliのrecA44(ts)対立遺伝子で置き換える(B.anthracis recAはE.coli中で機能することが知られている(Koら、J.Bacteriol 184:3917−22(2002)))。
(B.anthracis抗原の活性部位への突然変異の導入)
致死因子突然変異H686Aはそのプロテアーゼ活性を不活化し、浮腫因子突然変異K346QおよびK353Qが(一緒になって)そのアデニルシクラーゼ活性を不活化する(Brossierら、Infect.Immun.,68:1781−6(2000))。これらの突然変異をB.anthracis株に導入して、spoIIE uvrABおよびspoIIE uvrAB recAts株のような、ワクチンで用いる。lef(致死因子)およびcya(浮腫因子、アデニルシクラーゼ)遺伝子をクローン化し、Quick Changeキット(Stratagene)で突然変異誘発して、突然変異体遺伝子を創製する。次いで、突然変異体遺伝子をpKSV7に移し、最終的に、対立遺伝子交換によって宿主pXO1プラスミドに導入する。
(高レベルで保護抗原を発現するためのSOS調節配列の使用)
Cheoら(Cheoら、J.Bacteriol.,175:5907−15(1993))は、コンセンサス配列GAACN4GTTC(配列番号:47)が、B.subtilisのSOS応答において遺伝子のためのLexAレプレッサー部位を規定することを示している。SOSレギュロンの一部であるB.anthracis recAおよびuvrAB遺伝子のためのプロモーターの上流の同様なコンセンサス配列を位置させる。高レベルで保護抗原を発現するB.anthracis株を作成するために、保護抗原遺伝子をSOS調節配列の制御下に置き、ソラレンでの処置が高レベルの保護抗原を作るように、それをB.anthracis spoIIE uvrAB株に導入する。この人工遺伝子をB.anthracis染色体に挿入するために、pPL2のような組込みベクターを用いる(Lauerら、J.Bacteriol.,184:4177−86(2002))。注目する遺伝子、この場合には、プロモーターの制御下にある保護抗原遺伝子をマルチクローニング部位に挿入する。プラスミドはE.coliからB.anthracis株に接合させる。それはグラム−陽性菌では複製できないので、それは、染色体への組込みによって維持できるに過ぎない。現在のpPL2ベクターはL.monocytogenesからのファージインテグラーゼおよびファージ付着部位を含み、従って、L.monocytogenesファージインテグラーゼ遺伝子およびファージ付着部位を除去し、それらをガンマファージ(Brownら、J.Infect Dis.,96:34−9(1955))のようなB.anthracisのファージからの同様なエレメントで置き換えることによって改変されなければならない。また、pPL2ベクターは、典型的には、選択のためのクロラムフェニコール−抵抗性遺伝子を含む。薬物抵抗性遺伝子は、ワクチンの働きでは望ましくないので、それは除去される。薬物抵抗性遺伝子の1つは、D−アラニンを合成し、D−アラニン栄養要求性突然変異体をD−アラニンの添加無くして豊富な培地で増殖させるD−アラニンラセマーゼについての遺伝子によって置き換えられている。他の薬物抵抗性遺伝子は、グルタミンを合成し、グルタミンを含まない豊富な培地でグルタミンシンテターゼ突然変異体細菌の増殖を可能とするグルタミンシンテターゼについての遺伝子によって置き換えられる。
(例示的突然変異体B.anthracis株)
前記実施例に記載された方法の組合せを用い、種々の異なる突然変異体B.anthracis株を調製する。ワクチン組成物で用いるべき例示的突然変異体B.anthracis株を表26にリストする。
3lacI抑制可能プロモーターの制御下にある条件recA株も誘導される。
4HR、相同組換え
(実施例42)
(ソラレン−不活化B.anthracis株における、保護抗原およびカプセルを含めた、タンパク質発現レベルの特徴付け)
不活化B.anthracis株が依然として代謝することができるのを示すために、細胞を炭酸水素塩を含む最小培地中でインキュベートする(Thorneら、J.Gen.Microbiol.,17:505−16(1957))。そのようなインキュベーションの後、細胞を遠心によって除去し、上清を保存する。上清をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付す。クーマシーブルーでの染色の後、保護抗原が目立ち、その存在はウェスタンブロット分析(Brossierら、Infect.Immun.68:5731−4(2000))によって、および質量分析によって確認される。加えて、質量分析を用いて、Lenzら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,100:12432−12437(2003)に記載された方法を用い、これらの条件下で分泌される他のタンパク質を同定する。ポリグリタメートカプセルがこれらの条件下で作成されるかを評価するために、カプセル合成のための遺伝子をコードするpXO2を形質導入によって株に導入する(Greenら、Infect.Immun.,49:291−7(1985))。カプセルはロケット免疫電気泳動によって測定される(Uchidaら、Mol.Microbiol,23:1229−40(1997))。
(減弱化B.anthracis株で免疫化したSwiss WebsterおよびA/Jマウスにおける液性および粘膜応答の特徴付け)
マウス免疫化。マウスに筋肉内(IM)または皮下(SC)経路によってS−59/UVAワクチンを注射して、いずれの経路の免疫化が最良の細菌−特異的液性および細胞性応答をもたらすかを判断する。また、マウスの鼻孔内(IN)免疫化をテストして、候補ワクチンによって誘導された粘膜応答を評価する。5μlの設計されたワクチン製剤の、軽く麻酔したマウスの各鼻孔へのIN免疫化を従前に記載されているように行う(Boyakaら、J.Immunol.,170:5636−43(2003))。マウスを0.1 LD50用量の候補ワクチンで免疫化する。メジアン致死レベルが観察されない8つのS−59/UVA不活化ワクチン候補のいずれかを108粒子の初期用量で与える。1を超える経路によって免疫化されたマウスを、0.1 LD50用量を超えるか、あるいは108粒子よりも大きな組合せ用量で注射しない。複数免疫化を与えられたマウスは、全ての注射での終始一貫したワクチン用量を受け取る。S−59/UVA不活化Listeria uvrABでの3連続日での免疫化の結果、単一免疫化と比べて増大した液性および細胞性免疫がもたらされるので、同一戦略をB.anthracis株ワクチンで用いる。また、マウスには、一次免疫化後14日および28日にブースター免疫化を与える。
(改変されたB.anthracisでワクチン接種されたA/JマウスにおけるPA−、LF−、およびEF−特異的CD4+T細胞−媒介応答の特徴付け)
T細胞増殖。CD4+T細胞増殖は、ワクチン接種したおよびナイーブなA/JマウスのPBMC、脾臓およびリンパ節細胞から測定する。脾臓および頸部リンパ節を分散させて、従前に記載されたように単一細胞懸濁液を得る(Boyakaら、J.Immunol.,162:122−8(1999);Lillardら、J.Immunol.,166:162−169(2001);Littleら、Infect.Immuno.,65:5171−5(1997))。CD4+T細胞は、Miltenyi Biotec(Auburn,CA)からのマウスCD4+T細胞単離キットを用いて陰性選択によって単離する。プールされたリンパ節またはPBMCからの個々のマウス脾臓からの精製されたCD4+T細胞を4×106細胞/mlで培養し、完全RPMI(10%FBS、10mM Hepes、2mM L−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、23.8mM炭酸水素ナトリウム、5×105−5Mのμ−メルカプトエタノール、100U/mlペニシリンおよび100Ug/mlストレプトマイシンを補足したRPMI)中のT−細胞−枯渇非−分裂同系間ナイーブ脾臓フィーダー細胞(8×106細胞/ml)の存在下で種々の濃度のPA、LFまたはEFで刺激する。脾臓フィーダー細胞の複製は、S−59ソラレンでの軽い光化学処理によって阻止される。最終18ないし20時間の0.5μCiのトリチウム化チミジン([3H]TdR)の添加に先立って、培養物を37℃および5%CO2において4日間インキュベートする。細胞をガラス繊維シートに収集し、取り込まれたチミジンの量を、シンチレーションカウンター(Wallac,Turku,フィンランド国)にて放射能を測定することによって決定する。
(改変されたB.anthracisワクチンでの最後の免疫化用量から45日後におけるSwiss WebsterおよびA/Jマウスにおける胞子および致死トキシン挑戦に対する保護の程度の特徴付け)
致死トキシン挑戦に対するマウスの保護。選択された候補ワクチンで免疫化されたマウスを、従前に記載されているごとく(Priceら、Infect.Immun.,69:4509−15(2001);Rhieら(2003))、致死トキシンでの尾静脈注射によって挑戦する。致死トキシンは、記載されているごとく(Rhieら(2003))、組換えPAおよびNF組換えタンパク質(List Biological Laboratories,Campbell,CA)を混合することによって調製される。マウス当たりの致死トキシンIV LD50は6μgのLFと混合したほぼ12μgのPAである。新たに調製された致死トキシンのマウスにおけるメジアン致死性は、公表された値の0.1ないし10のLD50用量範囲にわたる尾静脈注射によって測定される。保護実験は、同様に、LD50用量の5ないし10倍の範囲にわたる致死トキシン挑戦を含む。このモデルにおいては、未保護マウスは24時間以内に死亡する。最初に、anthraxによる死亡は、トリプシンソイ寒天上で血液を平板培養し、37℃にて一晩インキュベートすることによって選択されたマウスで確認される。平板を、2ないし3mmの典型的なanthracis−様「すりガラス」外観を持つコロニーにつき観察する。致死トキシンで処理した全てのマウスは毎日モニターし、2週間後に実験を停止し、全ての保護マウスを犠牲にする。
(マウスにおけるOVAモデル抗原を発現するワクシニアでの挑戦に対するListeriaワクチンの保護免疫)
本発明のワクチンは、Listeria挑戦に対して保護的免疫化を示す。病原体に対して免疫化し、保護する能力をさらに説明するために、OVA抗原を含むまたは含まない、およびS−59UVA処理(前記実施例13の第二の方法)の有りおよび無しにてのListeriaワクチンの方法を用いて、もう1つの微生物、例えば、OVA抗原を発現するワクシニアウイルス(VV−OVA)に対して免疫化する。これは、他の微生物に対する抗原特異的免疫化がListeriaワクチンで達成できることを示す。
Claims (25)
- 自由生活微生物を含むワクチンであって、該微生物がListeria monocytogenesであり、ここで、該微生物の核酸が、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されており;
該微生物が、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱させる遺伝的突然変異を含み;
該微生物が、DNA修復酵素に関して欠損があり;
該遺伝的突然変異が、uvrABにあり;
該改変されている微生物における微生物の遺伝子発現が活性であり、
該核酸標的化化合物が、UVA照射によって活性化されるソラレン化合物である、ワクチン。 - 前記核酸標的化化合物が、4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンである、請求項1に記載のワクチン。
- 前記微生物が、抗原をコードする異種核酸配列を含む、請求項1に記載のワクチン。
- 前記ワクチンが、さらに、薬学的に受容可能なキャリアまたはアジュバントを含む、請求項1に記載のワクチン。
- 宿主において疾患を予防または処置するための組成物であって、有効量の請求項1に記載のワクチンを含む、組成物。
- 宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、有効量の請求項1に記載のワクチンを含み、ここで前記微生物が該抗原を発現する、組成物。
- 単離されたプロフェッショナル抗原提示細胞であって、該細胞は、自由生活微生物と該細胞とを接触させることによって抗原で負荷がかけられたものであり、該微生物は、該抗原をコードする核酸配列を含み、該微生物がListeria monocytogenesであり、ここで、該微生物の核酸が、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されており;
該微生物が、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱させる遺伝的突然変異を含み;
該微生物が、DNA修復酵素に関して欠損があり;
該遺伝的突然変異が、uvrABにあり;
該改変されている微生物における微生物の遺伝子発現が活性であり;
該核酸標的化化合物が、UVA照射によって活性化されるソラレン化合物であり;そして
該プロフェッショナル抗原提示細胞は、B細胞、樹状細胞およびマクロファージからなる群より選択される、細胞。 - 樹状細胞である、請求項7に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 前記核酸標的化化合物が、4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンである、請求項7に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 前記微生物が、前記抗原をコードする異種核酸配列を含む、請求項7に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞。
- 請求項7に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞を含む、ワクチン。
- 宿主において疾患を予防または処置するための組成物であって、有効量の請求項7に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞を含む、組成物。
- 宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、有効量の請求項7に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞を含み、ここで、前記微生物が該抗原をコードする核酸配列を含む、組成物。
- 宿主において疾患を予防または処置するための組成物であって、プロフェッショナル抗原提示細胞と抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とを接触させることによって該抗原を負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞を含み、ここで、該微生物の核酸は、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されており;
該微生物がListeria monocytogenesであり;
該微生物が、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱させる遺伝的突然変異を含み;
該微生物が、DNA修復酵素に関して欠損があり;
該遺伝的突然変異が、uvrABにあり;
該改変されている微生物における微生物の遺伝子発現が活性であり;
該核酸標的化化合物が、UVA照射によって活性化されるソラレン化合物であり;そして
該プロフェッショナル抗原提示細胞は、B細胞、樹状細胞およびマクロファージからなる群より選択される、組成物。 - 宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、プロフェッショナル抗原提示細胞と該抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物と接触させることによって該抗原を負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞を含み、ここで、該微生物の核酸は、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されており;
該微生物がListeria monocytogenesであり;
該微生物が、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱させる遺伝的突然変異を含み;
該微生物が、DNA修復酵素に関して欠損があり;
該遺伝的突然変異が、uvrABにあり;
該改変されている微生物における微生物の遺伝子発現が活性であり;
該核酸標的化化合物が、UVA照射によって活性化されるソラレン化合物であり;そして
該プロフェッショナル抗原提示細胞は、B細胞、樹状細胞およびマクロファージからなる群より選択される、組成物。 - 医療用途のための自由生活微生物であって、該微生物の核酸が、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されており;
該微生物がListeria monocytogenesであり;
該微生物が、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱させる遺伝的突然変異を含み;
該微生物が、DNA修復酵素に関して欠損があり;
該遺伝的突然変異が、uvrABにあり;
該改変されている微生物における微生物の遺伝子発現が活性であり;そして
該核酸標的化化合物が、UVA照射によって活性化されるソラレン化合物である、微生物。 - 医療用途のための抗原提示細胞であって、該抗原提示細胞は、自由生活微生物と該細胞とを接触させることによって抗原で負荷がかけられたものであり、該自由生活微生物は、該抗原をコードする核酸配列を含み、ここで、該微生物の核酸が、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されており;
該微生物がListeria monocytogenesであり;
該微生物が、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱させる遺伝的突然変異を含み;
該微生物が、DNA修復酵素に関して欠損があり;
該遺伝的突然変異が、uvrABにあり;
該改変されている微生物における微生物の遺伝子発現が活性であり;
該核酸標的化化合物が、UVA照射によって活性化されるソラレン化合物であり;そして
該プロフェッショナル抗原提示細胞は、B細胞、樹状細胞およびマクロファージからなる群より選択される、抗原提示細胞。 - 医療用途のための突然変異体自由生活微生物であって、該微生物が、突然変異体Listeria monocytogenes株であり、該突然変異体Listeria monocytogenes株が、その核酸を修復するその能力を減弱させる遺伝子突然変異を含み;
該突然変異体Listeria monocytogenes株が、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱させる遺伝的突然変異を含み;
該突然変異体Listeria monocytogenes株が、DNA修復酵素に関して欠損があり;
該遺伝的突然変異が、uvrABにあり;
該改変されている突然変異体Listeria monocytogenes株における微生物の遺伝子発現が活性であり;そして
該核酸標的化化合物が、UVA照射によって活性化されるソラレン化合物である、突然変異体自由生活微生物。 - キットであって、以下:(a)その核酸を修復する能力を減弱させる遺伝的突然変異を含む突然変異体Listeria monocytogenes株を含む組成物であって、ここで、該突然変異体Listeria monocytogenes株の核酸が、核酸標的化化合物との反応によって改変されている、組成物;ならびに(b)宿主における疾患の予防または処置における該組成物の使用のための指示書、の両方を含み;
該突然変異体Listeria monocytogenes株が、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱させる遺伝的突然変異を含み;
該突然変異体Listeria monocytogenes株が、DNA修復酵素に関して欠損があり;
該遺伝的突然変異が、uvrABにあり;
該改変されている突然変異体Listeria monocytogenes株における微生物の遺伝子発現が活性であり;そして
該核酸標的化化合物が、UVA照射によって活性化されるソラレン化合物である、キット。 - 宿主において疾患を予防または処置するための医薬の製造のための、請求項1に記載のワクチンの有効量の使用。
- 宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、請求項1に記載のワクチンの有効量の使用。
- 宿主において疾患を予防または処置するための医薬の製造のための、請求項7に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞の有効量の使用。
- 宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、請求項7に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞の有効量の使用であって、ここで、微生物が該抗原をコードする核酸配列を含む、使用。
- 宿主において疾患を予防または処置するための医薬の製造のための、プロフェッショナル抗原提示細胞と抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とを接触させることによって該抗原を負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞の使用であって、ここで、該微生物の核酸は、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されており;
該微生物がListeria monocytogenesであり;
該微生物が、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱させる遺伝的突然変異を含み;
該微生物が、DNA修復酵素に関して欠損があり;
該遺伝的突然変異が、uvrABにあり;
該改変されている微生物における微生物の遺伝子発現が活性であり;
該核酸標的化化合物が、UVA照射によって活性化されるソラレン化合物であり;そして
該プロフェッショナル抗原提示細胞は、B細胞、樹状細胞およびマクロファージからなる群より選択される、使用。 - 宿主において抗原に対する免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、プロフェッショナル抗原提示細胞と抗原をコードする核酸配列を含む自由生活微生物とを接触させることによって該抗原を負荷されたプロフェッショナル抗原提示細胞の使用であって、ここで、該微生物の核酸は、該微生物が増殖について減弱されるように、該核酸と直接的に反応する核酸標的化化合物との反応によって改変されており;
該微生物がListeria monocytogenesであり;
該微生物が、改変されているその核酸を修復する微生物の能力を減弱させる遺伝的突然変異を含み;
該微生物が、DNA修復酵素に関して欠損があり;
該遺伝的突然変異が、uvrABにあり;
該改変されている微生物における微生物の遺伝子発現が活性であり;
該核酸標的化化合物が、UVA照射によって活性化されるソラレン化合物であり;そして
該プロフェッショナル抗原提示細胞は、B細胞、樹状細胞およびマクロファージからなる群より選択される、使用。
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