CN102076843A

CN102076843A - 包含prfa*突变体李斯特菌的组合物及其使用方法

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Publication number: CN102076843A
Application number: CN200980123864XA
Authority: CN
Inventors: P·M·劳尔; T·W·小杜本斯盖; J·斯库伯; D·G·布洛克斯泰德; W·S·小卢科特; W·汉森
Original assignee: Aduro Biotech Inc
Current assignee: Chinook Therapeutics Inc
Priority date: 2008-05-19
Filing date: 2009-05-18
Publication date: 2011-05-25
Also published as: US20110287055A1; WO2009143085A1; KR20110027695A; EP2283112B1; JP2011523553A; EP2283112A1; EP2283112A4; AU2009249273A1; CA2724649A1

Abstract

本发明提供了重组李斯特菌，所述重组李斯特菌组成型表达PrfA并且包含编码例如肿瘤或传染剂抗原的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸可操纵地连接于PrfA应答调节剂。本发明提供了用于诱导或加强免疫应答和/或疾病治疗的利用李斯特菌的方法和其组合物。本发明还提供了所述细菌的制备方法。

Description

包含PRFA*突变体李斯特菌的组合物及其使用方法

关于联邦资助的研究或开发的声明

本发明部分在国立卫生研究院授予的基金5U01AI070834-02和SBIR基金5R44CA101421-03的资助下通过美国政府支持得以完成。政府可能拥有本发明的某些权利。

技术领域

本发明的领域总体涉及用于表达包括异源多肽在内的多肽的新型重组李斯特菌(Listeria)。尤其是，本发明涉及可用于疫苗组合物的在PrfA中含有突变的重组细菌。

背景技术

对基于重组单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)疫苗与其它重组疫苗平台相比的优点的认识，有助于它们当前的开发和在早期临床试验中的通行评价。这些优点包括实用性考虑因素诸如用于生产的直接发酵法，以及诸如即使在保护性Lm特异性免疫的存在下反复施用的能力等其它理想特征(Bouwer，H.G.等(1999)Infection and Immunity 67：253-258；Starks，H.等(2004)J Immunol 173：420-427，Stevens，R.等人(2005)Vaccine 23：1479-1490)。该疫苗平台的一个主要原理是基于小鼠李斯特菌病模型中保护的公知关联：响应于以单核细胞增生性李斯特菌进行的单免疫而诱导的长寿的功能性CD4+和CD8+记忆T细胞(Harty，J.T.等人(2000)Ann Rev Immunol 18：275-308；Pamer，E.G.(2004)Nat.Rev.Immunol.4：812-823)。现在有大量公开文件可证实重组单核细胞增生性李斯特菌疫苗由于强健的先天和适应性细胞免疫而在数种动物模型中的显著功效(Brockstedt，D.G.等人(2004)Proc Natl Acad Sci U S A 101：13832-13837；Bruhn，K.W.等人(2007)Microbes Infect 9：1226-1235；Paterson，Y.和Maciag，P.C.(2005)Curr Opin Mol Ther 7：454-460)。已报道了将重组单核细胞增生性李斯特菌疫苗用于治疗癌症和肿瘤(例如见Brockstedt等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；Brockstedt等人(2005)Nature Med.11：853-860)；Starks等人(2004)J.Immunol.173：420-427；Shen等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：3987-3991)。例如，美国专利公开号2005/0281783、2005/0249748、2004/0228877和2004/0197343中也报道了基于李斯特菌的疫苗，将各篇上述文件通过引用整体并入本文。因此，基于重组Lm的疫苗代表了解决对可引发功能性细胞免疫从而预防或治疗感染如HIV、HCV、结核和疟疾以及癌症的有效疫苗的急迫全球性需求的新兴方法。未来几年的结果将表明在临床前研究中观察到的强力活性是否能转变为对人体的有效性。

由于单核细胞增生性李斯特菌是在免疫受损的个体中具有增加毒力的食物传播病原体，因此减毒疫苗平台是在人中进一步评估的先决条件(Lorber，B.(1997)Clin Infect Dis 24：1-9)。衍生于野生型株10403S的活减毒疫苗平台和光化学失活疫苗平台都已有描述(Brockstedt，D.G.等人(2005)Nat Med 11：853-860；Brockstedt，D.G.等人(2004)Proc Natl Acad Sci U S A 101：13832-13837)。活减毒疫苗株缺失actA和inlB毒力基因(单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB)，所述毒力基因缺失联合限制了在肝脏中的生长，肝脏正是野生型生物体感染的主要靶器官。这种联合缺失阻断了经由InlB肝细胞生长因子受体相互作用的直接肝细胞感染(Dramsi，S.等人(1995)Mol Microbiol 16：251-261)以及从被感染的肝存留Kupffer细胞经由ActA介导的细胞至细胞的传播而在肝细胞中的间接传播。与静脉内注射(IV)野生型Lm的小鼠相比，静脉内注射(IV)单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB的小鼠中的肝毒性显著降低，所述肝毒性通过血清肝功检测(LFTs)谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)测定。此外，在给予逐增剂量的基于单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB株的食蟹猴中进行的2种GLP毒性研究中，肝毒性最小并且无剂量限制(数据未公开)。单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB疫苗株构成了2项正在对患晚期癌症的成年对象进行的FDA批准的1期临床试验的基础。第二种疫苗平台称为杀死但具有代谢活性(Killed But Metabolically Active，KBMA)，源于单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB，并且还同时携带了uvrA和uvrB的缺失，uvrA和uvrB是编码核苷酸切除修复(NER)途径的DNA修复酶的基因。KBMA疫苗(单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB/ΔuvrAB)对通过合成补骨脂素、S-59和长波UV光的联合处理进行光化学失活非常敏感。在被杀死时，KBMA单核细胞增生性李斯特菌疫苗能够瞬时表达其基因产物，从而使其逃避吞噬溶酶体并诱导功能性细胞免疫和针对野生型单核细胞增生性李斯特菌与疫苗病毒侵袭的保护(Brockstedt，D.G.等人(2005)Nat Med 11：853-860)。

PrfA是充当中心毒力调节物的细胞内激活转录因子，其作用是能够使单核细胞增生性李斯特菌在哺乳动物内或作为腐生生物的生长生活方式如“化身博士”(Dr.Jekyll and Mr.Hyde)所述那样二元化(Gray，M.J.等人(2006)Infect Immun 74：2505-2512)。PrfA敲除株不具毒力(Vazquez-Boland，J.A.等人(2001)Clin Microbiol Rev 14：584-640)。在野生型Lm中，PrfA在感染宿主细胞时表达，并进而诱导包括分别编码李斯特溶素O(LLO)和磷脂酶C的hly和plcA基因的prfA调节子的表达。组合时，这些基因产物介导该细菌由吞噬溶酶体的严酷微环境中逃逸。PfrA还调节内化素基因(例如，inlA和inlB)的转录，所述内化素基因编码有助于受体介导的非吞噬细胞的感染的配体(Scortti，M.等人(2007)Microbes Infect)。通过将异源基因与hly或actA启动子连接，所述PrfA依赖启动子能够用于驱动重组单核细胞增生性李斯特菌疫苗中的Ag表达(Gunn，G.R.等人(2001)J Immunology 167：6471-6479；Shen，H.等人(1995)Proc Natl Acad Sci 92：3987-3991)。可导致PrfA依赖基因的组成型激活的PrfA中的氨基酸取代物统称为PrfA^*突变体(Ripio，M.T.等人(1997)J Bacteriol 179：1533-1540；Scortti，M.等人(2007)Microbes Infect)。多种具有超溶血表型的野生型单核细胞增生性李斯特菌株具有prfA中的突变，最常见为G145S，与实验室获得株如10403S相比，G145S可产生增加的毒力(Ripio，M.T.等人(1997)J Bacteriol 179：1533-1540)。类似地，通过化学诱变法选择的PrfA依赖基因表达增加的其它prfA突变体也具有对小鼠增加的毒力(Shetron-Rama，L.M.等人(2003)Mol Microbiol 48：1537-1551)。免疫之前对PrfA依赖基因的诱导可通过多种机制增强疫苗的功效，所述机制包括在宿主细胞胞质溶胶中增加吞噬溶酶体逃逸和PrfA依赖编码抗原的表达，产生更强力的CD4+和CD8+T细胞应答。

对于开发具有增加功效的疫苗，理想的是改善用于异源抗原向受感染细胞(特别是抗原递呈细胞)的胞质溶胶中的李斯特菌介导的输送方法。还继续需要可增强基于Lm的疫苗的效能或降低基于Lm的疫苗的毒性的进一步改进，从而有助于其最终临床开发。

发明内容

本发明提供了包含可用作异源抗原输送载体的毒力基因的组成型突变体激活剂的李斯特菌。在一些实施方式中，通过prfA调节子的组成型激活，可增强李斯特菌的异源多肽和/或多核苷酸向受感染细胞的胞质溶胶中的输送。提供了含有李斯特菌的组合物如药物组合物和疫苗。还提供了利用李斯特菌诱导免疫应答，或者治疗或预防治疗哺乳动物疾病的方法。

在一方面，本发明提供了包含编码PrfA^*突变体多肽的多核苷酸的重组李斯特菌属细菌；和包含prfA应答调控元件和编码异源多肽的多核苷酸的重组多核苷酸。编码异源多肽的多核苷酸可操纵地连接于prfA应答调控元件。在一些方面，异源多肽是非细菌的。在本发明的一些方面，PrfA^*突变体多肽包含选自Y63C、E77K、L149F、G145S、G155S和S183A的突变。在一些方面，PrfA^*突变体多肽是G155S突变。在本发明的一些方面，所述重组多核苷酸编码包含信号肽和异源多肽的融合蛋白。在本发明的一些方面，prfA应答调控元件选自hly启动子、plcA启动子、plcB启动子、mpl启动子、hpt启动子、inlC启动子、inlA启动子、inlB启动子、prfA启动子和actA启动子。在一些方面，prfA应答调控元件是actA启动子。在本发明的一些方面，所述信号肽是选自单核细胞增生性李斯特菌的ActA信号肽、单核细胞增生性李斯特菌的LLO信号肽、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的Usp45信号肽、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)的保护抗原信号肽、单核细胞增生性李斯特菌的p60信号肽、枯草杆菌(Bacillus subtilis)的PhoD信号肽、secA2信号肽和Tat信号肽的信号肽。在一些方面，所述信号肽是单核细胞增生性李斯特菌的ActA信号肽。在一些方面，所述融合蛋白包含ActA的前100个氨基酸。

在本发明的一些方面，重组李斯特菌属细菌包含含有抗原的异源多肽，所述抗原选自肿瘤相关抗原、肿瘤相关抗原衍生的多肽、传染病抗原和传染病抗原衍生的多肽。在一些方面，所述传染病抗原来自病毒或异源传染病病原体，该病毒或异源传染病病原体选自肝炎病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒、乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、巨细胞病毒、结核分枝杆菌、恶性疟原虫或沙眼衣原体。肝炎病毒的实例包括，但不限于甲肝病毒、乙肝病毒或丙肝病毒。

在本发明的一些方面，包含毒力基因的组成型突变体激活剂的李斯特菌属于物种单核细胞增生性李斯特菌。在一些方面，重组李斯特菌属细菌是减毒的；例如对于细胞至细胞的传播、进入非吞噬细胞、增殖或DNA修复中的一种或多种方面。在一些情况下通过actA突变、inlB突变、uvrA突变、uvrB突变、uvrC突变、核酸靶向的化合物或uvrAB突变和靶向核酸的化合物中的一种或多种使李斯特菌减毒。在一些情况下，靶向核酸的化合物是补骨脂素。在一些方面，本发明提供了重组PrfA^*李斯特菌属细菌，其中该菌的核酸通过与可直接与核酸反应的靶向核酸的化合物进行反应而得到修饰，从而使该菌在增殖方面被减弱。在一些情况下，该菌包含可使被修饰的菌在增殖方面减弱的核酸交联物。在一些情况下，该菌包含使菌在增殖方面被减弱的补骨脂素-核酸加合物。在一些情况下，该菌还包含可减弱该菌修复其被修饰核酸的能力的遗传突变。在本发明的一些方面，该菌包含actA、inlB、uvrA和uvrB中的失活突变；并且该菌的增殖已通过补骨脂素-核酸交联物被减弱。在本发明的一些方面，PrfA^*李斯特菌被杀死但具有代谢活性(KBMA)。

本发明提供了包含重组PrfA^*李斯特菌属细菌，以及药学上可接受的赋形剂、佐剂和共刺激分子中的一种或多种的药物组合物。在一些方面，所述组合物还包含治疗剂。

本发明提供了诱导宿主的针对非李斯特菌抗原的免疫应答的方法，所述方法包括对宿主施用有效量的组合物，所述组合物包含编码PrfA^*突变体多肽的重组李斯特菌属细菌；和包含prfA应答调控元件以及编码异源多肽的多核苷酸从而编码可操纵地连接于prfA应答调控元件的抗原的重组多核苷酸。在一些方面，本发明提供了增强非李斯特菌抗原在宿主中的免疫原性的方法。在一些方面，本发明提供了预防或治疗宿主中的非李斯特菌的传染病症或癌性病症的方法。在一些方面，所述抗原选自肿瘤相关抗原、肿瘤相关抗原衍生的多肽、传染病抗原和传染病抗原衍生的多肽。在一些方面，所述免疫应答是先天免疫应答；在一些方面所述免疫应答是适应性免疫应答。在本发明的一些方面，所述宿主是人。在本发明的一些方面，本发明的重组李斯特菌增大响应于PrfA^*重组李斯特菌的施用而引起的对所编码抗原特异性的T细胞功能。

本发明提供了诱导或增强宿主中的免疫应答的方法，其中重复施用本发明的重组PrfA^*李斯特菌属细菌。在一些方面，首先施用本发明的重组PrfA^*李斯特菌属细菌，然后一次或多次施用非李斯特菌免疫原性组合物。在一些情况下，首先施用非李斯特菌免疫原性组合物，然后一次或多次施用本发明的重组PrfA^*李斯特菌属细菌。

在本发明的一些方面，与其中编码异源多肽的多核苷酸的表达受野生型PrfA多肽控制的重组李斯特菌属细菌诱导的抗原的免疫原性相比，抗原的免疫原性得到增强。在一些情况下，增强的免疫原性包括MCP-1、IL-6、IFN-γ、TNFα或IL-12p70中的一种或任意组合的表达增加。

本发明提供了重组李斯特菌属细菌的制备方法。例如，将在PrfA-应答调控元件控制下的编码异源多肽的重组多核苷酸稳定地引入到PrfA^*李斯特菌属细菌中。在一些情况下所述异源多肽与信号序列融合。在一些方面，编码异源多肽的重组多核苷酸整合在李斯特菌染色体中。在一些情况下，编码异源多肽的重组多核苷酸整合在李斯特菌染色体的tRNA^arg基因中或actA基因中。在一些方面，将编码PrfA^*突变体多肽的重组多核苷酸稳定地引入到含有非功能性prfA等位基因的李斯特菌属细菌中。

附图说明

图1显示了对单核细胞增生性李斯特菌prfA^*疫苗株的表征。(A)利用pPL2位点特异性整合载体构建表达四个疫苗病毒T细胞表位(A24R、C4L、K3L和B8R)和以连接物序列间隔并与ActA的前100个氨基酸(ActAN100)融合的卵清蛋白SL8表位的单核细胞增生性李斯特菌Quadvac株。(B)异源蛋白在酵母提取肉汤中的表达。(C)受感染J774巨噬细胞中感染后7小时时异源Ag的表达。(D)受感染DC2.4树突细胞中感染后2.5小时时异源Ag的表达。(E)J774巨噬细胞中同基因型单核细胞增生性李斯特菌疫苗株的细胞内生长。

图2显示了由PrfA^*疫苗株诱导的改善的先天免疫和适应性免疫。(A)单静脉内施用5×10⁶cfu的单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB/WT prfA、PrfA^*G155S、PrfA^*G145S和PrfA^*Y63C株后8小时确定的血清细胞因子/趋化因子水平。细胞因子/趋化因子通过流式微球阵列(CBA)确定。各符号表示单个动物。数据为至少2次实验中具有代表性的一次实验的数据。(B，C)活减毒PrfA^*疫苗株诱导更高量级的抗原特异性免疫。以5×10⁶cfu的单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB/WTprfA、PrfA^*G155S、PrfA^*G145S和PrfA^*Y63C株对C57BL/6小鼠进行静脉内免疫。抗原特异性T细胞应答通过接种后7天的应答峰的细胞内细胞因子染色来确定。(B)显示了各组代表性动物的点印迹。(C)显示了各组5只动物的平均值±标准差。

图3显示PrfA^*增强的KBMA单核细胞增生性李斯特菌疫苗的免疫原性。(A)单静脉内施用1×10⁸颗粒的KBMA单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB/WT prfA、PrfA^*G155S、PrfA^*G145S和PrfA^*Y63C株后8小时确定的血清细胞因子/趋化因子水平。细胞因子/趋化因子通过流式微球分析(CBA)确定。各符号表示单个动物。(B，C)KBMA单核细胞增生性李斯特菌PrfA^*株诱导更高量级的抗原特异性免疫。以1×10⁸颗粒的KBMA单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB/WT prfA、PrfA^*G155S、PrfA^*G145S和PrfA^*Y63C株对C57BL/6小鼠进行静脉内免疫。通过接种后7天的应答峰的细胞内细胞因子染色确定抗原特异性T细胞应答。(B)显示了各组代表性动物的点印迹。(C)显示了各组5只动物的平均值±标准差。

图4显示了通过KBMA单核细胞增生性李斯特菌PrfA^*株引起的T细胞应答的改善的效能。(A，B)以HBSS(左图)或1×10⁸颗粒的KBMA单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB/WT prfA、PrfA^*G155S、PrfA^*G145S和PrfA^*Y63C株对C57BL/6小鼠进行静脉内或肌肉内(如图指明)免疫两次(相隔2周)。7天后，通过以gB2(对照；中间峰)、A24R负载的靶(右峰)或B8R负载的靶(左锋)侵袭小鼠而确定体内细胞溶解活性。(A)显示了各组代表性动物的直方图。(B)显示了静脉内或肌肉内接种的小鼠对A42R和B8R特异性的体内细胞溶解活性。各符号表示个体动物。(C)显示了以各种剂量的KBMA单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB/WT prfA或PrfA^*G155S相隔2周接种2次后对B8R特异性的体内细胞溶解活性。显示了各具有5只动物的组的平均值±标准差。(D)显示了对通过野生型单核细胞增生性李斯特菌进行的2×LD₅₀侵袭的保护性免疫。以1×10⁸颗粒的KBMA单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB/WT prfA或PrfA^*G155S对Balb/c小鼠进行静脉内免疫一次。HBSS用作对照。侵袭后3天收集脾脏并铺板用于CFU。通过学生T检验确定，WT prfA和prfA^*G155S之间的log-保护具有统计学显著性差异。(E)以1×10⁷pfu的疫苗病毒进行腹膜内侵袭后卵巢内的病毒滴度。以1×10⁸颗粒的KBMA单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB/WT prfA或prfA^*G155S对C57BL/6小鼠进行2次静脉内接种。疫苗病毒侵袭后5天确定病毒滴度。各符号表示个体动物。通过学生T检验确定，WT PrfA和PrfA^*G155S之间的log-保护具有统计学显著性差异。

图5显示PrfA^*增强了编码HPV E7的KBMA单核细胞增生性李斯特菌疫苗的免疫原性。在最后接种后7天，在应答峰处通过细胞内细胞因子染色确定HPV E7特异性T细胞应答。(A)以活李斯特菌进行的单接种的数据。(B)以KBMA进行的初免-加强接种的数据。

图6显示PrfA^*增强了编码HPV E7的KBMA单核细胞增生性李斯特菌疫苗的免疫原性。在最后接种后7天，在应答峰处通过细胞内细胞因子染色确定LLO特异性T细胞应答。(A)以活李斯特菌进行的单接种的数据。(B)以KBMA进行的初免-增强接种的数据。

图7显示PrfA、PrfA^*G155S、PrfA^*G145S和PrfA^*Y63C的氨基酸序列。

具体实施方式

I导言

本发明部分基于以下发现：当抗原在李斯特菌的毒力基因的组成型突变体激活剂的控制下表达时，可增强对该抗原的免疫应答。单核细胞增生性李斯特菌的二元生活方式被比作“化身博士”(Dr.Jekyll and Mr.Hyde)。作为腐生生物，李斯特菌在环境中以无害的生命形式存活。然而，在感染哺乳动物宿主时，李斯特菌通过表达多种可使李斯特菌在哺乳动物生理条件下生长和繁衍的毒力基因而变得有害。在从无害的腐生生物生活方式到有害的毒力生活方式的转变中，PrfA蛋白发挥了关键作用。PrfA响应于包括温度、pH、铁浓度、糖浓度和活性氧簇在内的多种刺激而激活。通过PrfA依赖基因的组成型表达，已经部分鉴定了PrfA的突变体。所述组成型PrfA突变体被称为PrfA^*突变体。在一些情况下，已表明组成型PrfA^*突变体多肽表现出李斯特菌的超毒力表型，例如G155S PrfA^*突变体。

本发明提供了用于刺激针对抗原的免疫应答的重组李斯特菌属细菌。在本发明的一些方面，所述重组李斯特菌属细菌包含prfA等位基因突变从而PrfA蛋白组成型表达。重组李斯特菌还包含多肽；例如在PrfA应答调控元件控制下的抗原。在一些情况下，所述多肽可以是融合蛋白，其中信号序列与该多肽连接。PrfA应答调控元件的实例包括，但不限于act A启动子、hly启动子、plcA启动子、inlA启动子、inlB启动子和prfA启动子。

在本发明的一些方面，异源多肽是肿瘤抗原；在本发明的一些方面，多肽是与传染病相关的抗原。在本发明的一些方面，异源多肽是非李斯特菌的多肽；在本发明的一些方面，异源多肽是非细菌多肽。

在本发明的一些方面，所述李斯特菌是单核细胞增生性李斯特菌。在一些情况下，李斯特菌被减毒以用于细胞至细胞的传播和/或进入非吞噬细胞。在一些情况下，李斯特菌包含actA和/或inlB的失活突变。在一些情况下，李斯特菌是actA inlB双缺失突变体。在一些情况下，李斯特菌包含至少一个核酸修复基因如uvrA、uvrB、uvrC或重组修复基因的失活突变。例如，所述李斯特菌可以是uvrAB缺失突变体。在一些情况下，所述细菌还包含核酸交联剂(例如补骨脂素)。在本发明的一些方面，李斯特菌被灭活，但具有代谢活性(KBMA)。

还提供了包含上述方面的李斯特菌的药物组合物、免疫原性组合物和/或疫苗。在一些方面，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。在本发明的一些方面，所述李斯特菌还包含佐剂。

在本发明的一些方面，本发明的李斯特菌与治疗剂联合使用。在一些情况下，将李斯特菌与治疗剂一起施用；在一些情况下，将李斯特菌在治疗剂之前施用。在一些情况下，李斯特菌在治疗剂之后施用。

本发明提供了使用本发明的重组李斯特菌的方法。在一些情况下，本发明提供了诱导针对抗原的免疫应答的方法。在一些情况下，本发明提供了增强抗原的免疫原性的方法。在一些情况下，与在野生型PrfA多肽控制下在李斯特菌中表达的抗原的免疫原性相比，抗原的免疫原性得到增强。增强的免疫原性可以通过本领域中已知的方法测定。在一些方面，可以通过测定已知由免疫应答诱导的细胞因子、趋化因子和多肽提高的表达，从而测定增强的免疫原性。例如，MCP-1、IL-6、IFN-γ、TNFα和/或IL-12 p70。在本发明的一些方面，所述已知由免疫应答诱导的细胞因子、趋化因子和多肽提高的表达可以是，与由在野生型PrfA多肽控制下在李斯特菌中表达的抗原诱导的所述细胞因子、趋化因子和多肽的表达相比得到提高。本发明提供了预防或治疗传染病症或癌性病症的方法。

报道称重组单核细胞增生性李斯特菌疫苗已被用于治疗癌症和肿瘤(例如见，Brockstedt等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci USA 101：13832-13837；Brockstedt等人(2005)Nature Med.11：853-860)；Starks等人(2004)J.Immunol.173：420-427；Shen等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci USA 92：3987-3991)。还报道了基于李斯特菌的疫苗，例如见美国专利公开号2007/0207170、2007/0207171、2007/0190063、2005/0281783、2005/0249748、2004/0228877和2004/0197343；将各篇上述文件通过引用整体并入本文。

II.PrfA和prfA调节子

在诱导对李斯特菌毒力而言重要的一套基因中，PrfA(正调控因子A)发挥重要作用(Scortti，M等人(2007)Microbes and Infection 9(10)：1196-207)。PrfA通过结合具有正规序列tTAACanntGTtAa(大写字母表示不变的核苷酸)的回文启动子元件来激活转录。核心PrfA调节子在表1中列出。PrfA可较弱地或不一致地调控许多其它基因(见Scortti，M等人(2007))。在本发明的一些方面，在PrfA调节子的启动子控制下表达异源多肽。

表1核心PrfA调节子

基因	功能
		hly	李斯特菌素O
plcA	磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C
		prfA	正调控因子A
mpl	锌金属蛋白酶前体
		actA	肌动蛋白聚合蛋白
plcB	广泛底物范围的磷脂酶C
		hpt	己糖磷酸转运体
inlC	内化素C
		inlA	内化素A
inlB	内化素B

PrfA是结构上与肠道菌的Crp(cAMP受体蛋白)相关的27kDal蛋白(图7)。该蛋白由具有β-roll的N-末端结构域、α-螺旋、铰链/结构域间区域、DNA结合螺旋-转折-螺旋(HTH)结构域和有助于稳定HTH基序的C-末端αG结构域组成。PrfA存在2种功能状态：自然形式的弱活性状态和构象变化后的高活性状态。包括温度、pH、低铁浓度、低糖源和活性氧族的存在在内的环境刺激似乎可激活从自然低活性态向高活性态的构象变化。PrfA激活似乎主要在受感染细胞的胞质溶胶中发生。PrfA依赖的转录的调控依赖3个主要因素：i)PrfA蛋白活性的变化，ii)PrfA浓度的变化，和iii)基于启动子构型的不同表达。因此，在本发明的一些方面，异源多肽的表达是对PrfA活性的这些变化的应答。

已经鉴定了多种含有PrfA突变体多肽的单核细胞增生性李斯特菌株，所述菌株中PrfA依赖基因被组成型地过表达(Scortti，M.等人(2007)Microbes and Infection 9(10)：1196-207)。这些PrfA多肽突变体称为PrfA^*突变或PrfA^*突变体多肽，并且包括，但不限于I45S、Y63C、E77K、L140F、G145S和G155S突变(图7)。已推测PrfA^*突变体多肽可模拟引起PrfA从低活性态至高活性态转换的构象变化。在携带PrfA^*突变体的李斯特菌株中，超活性PrfA蛋白引起PrfA依赖基因在其通常被下调的条件下组成型过表达。在一些情况下，PrfA^*多肽的突变可增强PrfA多肽与DNA的结合，例如，PrfA^*G145S和PrfA^*L140F；并且在一些情况下，PrfA^*突变可增强辅因子对PrfA多肽的结合，例如，PrfA^*Y63C(Miner，M.D.等人(2008)向J.Biol.Chem.投稿)。携带PrfA^*突变体的李斯特菌株具有毒力，并且至少在PrfA^*G155S的情况中，突变体李斯特菌具有超毒力。

除上述PrfA^*突变体多肽之外，本领域技术人员可制备其它PrfA^*突变体多肽。例如，李斯特菌可以接触免疫原如甲基磺酸乙酯，然后在PrfA依赖基因通常下调的条件下生长(Shetron-Rama，L.M.等人(2003)Mol.Microbiol.48：1537-1551)。抑制PrfA依赖基因表达的条件的实例包括存在易代谢糖和低pH。可以通过多种不同筛选方法鉴定携带PrfA^*突变体的李斯特菌，所述筛选方法包括但不限于直接测定PrfA依赖基因的表达(见表1)或PrfA-调节子启动子控制下的报告基因的表达。本领域中已知使prfA基因突变的其它方法，包括但不限于定点突变、化学合成在特定位置突变的基因和DNA改组技术。

已评估了包括G145S、G155S和Y63C在内的3种PrfA^*突变体对同基因型活减毒和KBMA疫苗株的效能的影响(见实施例1)。为了使人能够区分同基因型单核细胞增生性李斯特菌疫苗株之间的免疫效能差异，制备了编码5个充分确定的MHC I类表位的Ag表达盒，这5个充分确定的MHC I类表位此前已表明可引起小鼠的广泛CD8+T细胞应答(Moutaftsi，M.等人(2006)Nat Biotechnol 24：817-819)。虽然肉汤培养物中的同基因型株的生长曲线不可区分，但与具有天然prfA的单核细胞增生性李斯特菌株相比，在PrfA^*疫苗株中观察到显著增加的Ag表达和分泌水平。有趣的是，受感染巨噬细胞或树突细胞系的胞质溶胶中测定的Ag表达水平以及所有同基因型疫苗株之间的感染和细胞内生长均是等同的。然而令人吃惊的是，小鼠中的免疫原性是prfA依赖的，并且与所测定的其它prfA等位基因相比，PrfA^*G155S明显最优。与所测定的具有其它prfA等位基因的疫苗相比，通过针对细菌或病毒侵袭的保护测定的疫苗诱导的CD8+T细胞的量级和功能性在带有PrfA^*G155S的活减毒和KBMA重组单核细胞增生性李斯特菌疫苗株中显著改善。因此，虽然肉汤培养物中的相对PrfA依赖的表达不必然与疫苗效能相关，但是prfA G155S激活的突变确实增强了疫苗效能。综上，这些发现表明免疫之前prfA调节子的激活和Ag表达的诱导增强了基于Lm的疫苗的效能。

在本发明的一些方面，在含有PrfA^*突变体多肽的重组李斯特菌属细菌中在PrfA调节子的控制下表达异源多肽。在一些情况下，所述PrfA^*突变体是PrfA^*G155S突变体多肽。

III信号肽

术语“信号肽”和“信号序列”在本文中可互换使用。在一些实施方式中，信号肽有助于促进与该信号肽融合的多肽的跨细胞(例如，细菌细胞)的细胞膜运输，从而使多肽从细胞中分泌。因此，在一些实施方式中，信号肽是“分泌信号肽”或“分泌序列”。信号肽通常位于被分泌多肽的N-末端。

在一些实施方式中，作为由重组核酸分子、表达盒和/或表达载体编码的融合蛋白和/或蛋白嵌合体的一部分的信号肽，对于融合蛋白和/或蛋白嵌合体中的至少一种其它多肽序列是异源的。在一些实施方式中，作为由重组核酸分子、表达盒和/或表达载体编码的信号肽，对将引入或已引入了重组核酸分子、表达盒和/或表达载体的菌而言是异源(即外来)的。在一些实施方式中，信号肽对将引入重组核酸分子、表达盒和/或表达载体的菌而言是天然的。

在一些实施方式中，编码信号肽的多核苷酸对在菌(例如，李斯特菌如单核细胞增生性李斯特菌)中表达进行了密码子优化。在一些实施方式中，对特定细菌进行密码子优化的多核苷酸对该菌是外源的。在其它实施方式中，对特定细菌进行密码子优化的多核苷酸对该菌是天然的。

本领域中已知有很多种信号肽。而且，本领域中有多种算法和软件程序，例如“SignalP”算法可用于预测信号肽序列。例如，见：Antelmann等人，Genome Res.，11：1484-502(2001)；Menne等人，Bioinformatics，16：741-2(2000)；Nielsen等人，Protein Eng.，10：1-6(1997)；Zhang等人，Protein Sci.，13：2819-24(2004)；Bendtsen等人，J.Mol.Biol.，340：783-95(2004)(关于SignalP 3.0)；Hiller等人，Nucleic Acids Res.，32：W375-9(2004)；Schneider等人，Proteomics 4：1571-80(2004)；Chou，Curr.Protein Pept.Sci.，3：615-22(2002)；Shah等人，Bioinformatics，19：1985-96(2003)；和Yuan等人，Biochem Biophys Res.Commun.312：1278-83(2003)。

在一些实施方式中，信号肽是原核的。在一些替代性实施方式中，信号肽是真核的。Humphreys等人，Protein Expression and Purification，20：252-264(2000)描述了真核信号肽在大肠杆菌(Escherichia coli)中蛋白表达中的应用。

在一些实施方式中，信号肽是细菌信号肽。在一些实施方式中，信号肽是非李斯特菌信号肽。在一些实施方式中，信号肽是非李斯特菌信号肽。在一些实施方式中，信号肽源于革兰氏阳性菌。在一些实施方式中，信号肽源于细胞内细菌。

在一些实施方式中，重组核酸分子所用的信号肽源于李斯特菌。在另外的实施方式中，所述信号肽源于单核细胞增生性李斯特菌。在一些实施方式中，信号肽是来自单核细胞增生性李斯特菌的信号肽。在替代性实施方式中，细菌信号肽源于杆菌。在一些实施方式中，细菌信号肽源于葡萄球菌。在一些实施方式中，细菌信号肽源于乳球菌。在一些实施方式中，细菌信号肽源于杆菌、葡萄球菌或乳球菌。在一些实施方式中，细菌信号肽是来自杆菌、葡萄球菌或乳球菌等属菌的信号肽。在一些实施方式中，细菌信号肽是来自炭疽杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌或乳酸乳球菌的信号肽。

在本文所述的多核苷酸的一些实施方式中，源于诸如细菌等生物体的信号肽与获得自该生物体的天然存在的信号肽序列相似。在其它实施方式中，由重组核酸分子编码的信号肽序列是天然存在信号肽序列的片段和/或变体，其中该变体依然具有信号肽的功能。变体包括的多肽与最初序列相差一个或多个取代、缺失、添加、和/或插入。例如，在一些实施方式中，由多核苷酸编码的信号肽含有一个或多个保守突变。本领域普通技术人员公知可能的保守氨基酸改变。

另一信号肽衍生的信号肽(即其它信号肽的片段和/或变体)优选与最初信号肽实质等效。例如，另一信号肽衍生的信号肽发挥信号肽功能的能力应当实质上不受对最初信号肽序列所作的变化(缺失、突变等)的影响。在一些实施方式中，所衍生的信号肽能够发挥天然信号肽序列的至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％的信号肽功能。在一些实施方式中，所述信号肽与最初信号肽具有至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％的氨基酸序列同一性。在一些实施方式中，信号肽序列中产生的仅有变化是保守氨基酸取代。信号肽片段优选为最初信号肽长度的至少约80或90％。

在一些实施方式中，由编码异源多肽的多核苷酸所编码的信号肽是secA1信号肽、secA2信号肽或双精氨酸转运(Tat)信号肽。在一些实施方式中，信号肽是secA1信号肽信号肽。在一些实施方式中，信号肽是非secA1信号肽。在一些实施方式中，信号肽是secA2信号肽。在一些实施方式中，信号肽是双精氨酸转运(Tat)信号肽。在一些实施方式中，所述secA1、secA2或Tat信号肽源于李斯特菌。在一些实施方式中，所述secA1、secA2或Tat信号肽是非李斯特菌的。例如，在一些实施方式中，secA1、secA2和Tat信号肽源于属于以下属中一个属的细菌：杆菌、葡萄球菌或乳球菌。

在一些实施方式中，融合蛋白包含信号肽和异源多肽，所述信号肽是来自单核细胞增生性李斯特菌的ActA信号肽。在一些情况下，本发明在某些方面提供了包含与编码异源抗原的第二核酸可操纵连接并同框的编码经修饰ActA的第一核酸的多核苷酸。本发明还提供了含有多核苷酸的李斯特菌，其中所述多核苷酸的表达产生含有经修饰ActA和异源抗原的融合蛋白。经修饰ActA可包括ActA的天然分泌序列、另一李斯特菌蛋白衍生的分泌序列、非李斯特菌细菌蛋白衍生的分泌序列或所述经修饰ActA可不含任何分泌序列。

ActA衍生的融合蛋白伴侣可用于增加表达、增加稳定性、增加分泌、增强免疫递呈、刺激免疫应答、改善针对肿瘤的存活、改善针对癌症的存活、增加针对传染剂的存活，等等。

在一方面，本发明提供了包含与编码融合蛋白的核酸序列可操纵地连接的PrfA依赖启动子的多核苷酸，其中所述融合蛋白包含(a)经修饰ActA和(b)异源抗原。在一些实施方式中，所述启动子是ActA启动子。在一些实施方式中，所述经修饰ActA包含ActA的至少前59个氨基酸。在一些实施方式中，所述经修饰ActA包含ActA的多于前59个氨基酸。在一些实施方式中，所述经修饰ActA是包含ActA的信号序列的ActA的片段(或衍生自包含ActA的信号序列的ActA的片段)。在一些实施方式中，所述经修饰ActA包含ActA的至少前59个氨基酸，但少于ActA的约前265个氨基酸。在一些实施方式中，所述经修饰ActA包含ActA的多于前59个氨基酸，但少于ActA的约前265个氨基酸。换言之，在一些实施方式中，所述经修饰ActA序列对应于在ActA序列的氨基酸59至约氨基酸265之间某处截短的ActA(包含ActA信号序列)的N-末端片段。在一些实施方式中，所述经修饰ActA包含ActA的前59至200个氨基酸、ActA的前59至150个氨基酸、ActA的前59至125个氨基酸或ActA的前59至110个氨基酸。在一些实施方式中，所述经修饰ActA由ActA的前59至200个氨基酸、ActA的前59至150个氨基酸、ActA的前59至125个氨基酸或ActA的前59至110个氨基酸组成。在一些实施方式中，所述经修饰ActA包含ActA的约前65至200个氨基酸、ActA的约前65至150个氨基酸、ActA的约前65至125个氨基酸或ActA的约前65至110个氨基酸。在一些实施方式中，所述经修饰ActA由ActA的约前65至200个氨基酸、ActA的约前65至150个氨基酸、ActA的约前65至125个氨基酸或ActA的约前65至110个氨基酸组成。在一些实施方式中，所述经修饰ActA包含ActA的前70至200个氨基酸、ActA的前80至150个氨基酸、ActA的前85至125个氨基酸、ActA的前90至110个氨基酸、ActA的前95至105个氨基酸或ActA的约前100个氨基酸。在一些实施方式中，所述经修饰ActA由ActA的前70至200个氨基酸、ActA的前80至150个氨基酸、ActA的前85至125个氨基酸、ActA的前90至110个氨基酸、ActA的前95至105个氨基酸或ActA的约前100个氨基酸组成。在一些实施方式中，所述经修饰ActA包含ActA的氨基酸1至100。在一些实施方式中，经修饰ActA由ActA的氨基酸1至100组成。

在本发明的一些方面，利用ActA-N-100异源抗原融合伴侣构造的重组李斯特菌在功能上与具有自然actA启动子和5’非翻译区(UTR)RNA的所述抗原融合构建体有联系。从actA启动子的PrfA依赖的转录引起ActA蛋白GUG翻译起始位点之前的150核苷酸5’UTR RNA的合成。缺失actA启动子5’UTR的单核细胞增生性李斯特菌突变体表达低水平的ActA，与野生型亲本细菌相比，导致以不存在细胞内肌动蛋白募集、不能在细胞至细胞的传播和减毒为特征的表型(Wong等人Cellular Microbiology 6：155-166)。

在另一方面，本发明提供了包含与编码异源抗原的第二核酸可操纵地连接并同框的编码经修饰ActA的第一核酸的多核苷酸。在一些实施方式中，所述经修饰ActA包含ActA的至少前59个氨基酸，但少于ActA的约前265个氨基酸。在一些实施方式中，所述经修饰ActA包含ActA的前59至200个氨基酸、ActA的前59至150个氨基酸、ActA的前59至125个氨基酸或ActA的前59至110个氨基酸。在一些实施方式中，所述经修饰ActA包含ActA的前70至200个氨基酸、ActA的前80至150个氨基酸、ActA的前85至125个氨基酸、ActA的前90至110个氨基酸、ActA的前95至105个氨基酸或ActA的约前100个氨基酸。在一些实施方式中，所述第一核酸编码ActA的氨基酸1至100。在一些实施方式中，所述多核苷酸是基因组的多核苷酸。在一些替代性实施方式中，所述多核苷酸是基于质粒的多核苷酸。在一些实施方式中，所述多核苷酸与启动子可操纵地连接。

在一些实施方式中，编码ActA的前100个氨基酸的单核细胞增生性李斯特菌天然序列与理想的异源抗原序列功能性地同框连接。在一些实施方式中，所述异源抗原序列根据单核细胞增生性李斯特菌(低GC百分比生物体)使用的优化密码子进行合成。在一些实施方式中，理想的是利用actA启动子以及5’非翻译序列的组合物。

表2公开了用于制备含有作为融合蛋白伴侣的ActA N100的构建体的核酸和多肽。鉴定了为在单核细胞增生性李斯特菌中表达而优化的序列密码子和非密码子优化序列。

表2.ActA序列

本发明信号肽的其它实例包括但不限于来自单核细胞增生性李斯特菌的LLO信号肽、来自乳酸乳球菌的Usp45信号肽、来自炭疽杆菌的保护抗原信号肽、来自单核细胞增生性李斯特菌的p60信号肽、来自枯草杆菌的PhoD信号肽。

表3公开了用于制备含有作为融合蛋白伴侣的LLO和BaPa的构建体的核酸和多肽。鉴定了为在单核细胞增生性李斯特菌中表达而优化的序列密码子和非密码子优化序列。

表3LLO和BaPa序列

细菌利用多种途径进行蛋白分泌，包括secA1、secA2和双精氨酸转运(Tat)。采用何种途径主要取决于位于前体蛋白N-末端的信号序列的类型。大多数分泌蛋白利用Sec途径，该途径中蛋白以解折叠构象转运通过细菌膜包埋的蛋白质的Sec孔。相反，利用Tat途径的蛋白以折叠构象分泌。可以将编码与任何所述蛋白分泌途径相应的信号肽的核苷酸序列与所需异源蛋白编码序列基因工程同框融合。信号肽最优在其羧基端含有信号肽酶切割位点，以便将真正的所需蛋白释放到细胞外环境中(Sharkov和Cai.2002 J.Biol.Chem.277：5796-5803；Nielsen等人1997 Protein Engineering 10：1-6；和www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。

本发明多核苷酸中所用的信号肽不仅可源于各种分泌途径，还可以来自各种细菌属。信号肽通常具有同样的结构组织：具有带电的N-末端(N-结构域)、疏水核心区(H-结构域)和更具极性的C-末端区(C-结构域)；然而它们并未表现出序列保守性。在一些实施方式中，信号肽的C-结构域携带I型信号肽酶(SPase I)切割位点，在相对于切割位点的-1和-3位置具有共有序列A-X-A。经由sec途径分泌的蛋白具有平均28个残基的信号肽。在单核细胞增生性李斯特菌中首次发现了secA2蛋白分泌途径；secA2旁系同源物中的突变体的特征在于琼脂培养基上的粗糙菌落表型和小鼠中减弱的毒力表型(Lenz和Portnoy，2002 Mol.Microbiol.45：1043-1056；和Lenz等人2003 PNAS100：12432-12437)。与通过Tat途径分泌的蛋白相关的信号肽具有与Sec信号肽相似的3重结构，但特征是具有RR-基序(R-R-X-#-#，其中#是疏水残基)，位于N-结构域/H-结构域交界。细菌Tat信号肽比sec信号肽更长平均14个氨基酸。枯草杆菌分泌组可含有多达69个利用Tat分泌途径的推定蛋白，其中14个含有SPase I切割位点(Jongbloed等人2002 J.Biol.Chem.277：44068-44078；Thalsma等人，2000 Microbiol.Mol.Biol.Rev.64：515-547)。

IV异源多肽和编码异源多肽的多核苷酸

李斯特菌内的多核苷酸编码的“异源多肽”和/或由李斯特菌表达的“异源多肽”对李斯特菌而言是异源的。在某些实施方式中，异源多肽是非李斯特菌的。在某些实施方式中，异源多肽未见于自然中的李斯特菌的基因组DNA中或任何已感染李斯特菌的噬菌体中。在一些实施方式中，编码异源多肽的多核苷酸是重组多核苷酸。在某些实施方式中，所述异源多肽是非细菌的。

在一些实施方式中，当拟将编码异源多肽的多核苷酸在李斯特菌中表达时，优选与能够指导在李斯特菌中表达的启动子可操纵地连接的编码异源多肽的多核苷酸。在一些实施方式中，所述启动子是原核启动子(例如，李斯特菌的启动子，如hly或actA启动子)。在一些实施方式中，编码异源抗原的多核苷酸针对在李斯特菌中表达而优化密码子(例如见美国专利公开号2005/0249748，通过引用将其整体并入本文)。

在一些实施方式中，被本发明的李斯特菌输送至细胞(例如，哺乳动物细胞)内的异源多肽或由被本发明的李斯特菌输送到细胞内的核酸编码的异源多肽包含抗原。在一些实施方式中，所述抗原是肿瘤抗原(例如，人肿瘤抗原)或其抗原性片段或变体。在一些替代性实施方式中，所述抗原是来自传染剂的抗原，或其抗原性片段或变体。

本文所述的重组核酸分子以及本文所述的表达盒或表达载体可用于编码任何所需多肽。尤其是，重组核酸分子、表达盒和表达载体可用于在细菌中表达异源多肽。

在一些实施方式中(取决于所用的重组核酸分子、表达盒或表达载体)，本发明的多核苷酸编码的多肽作为带有信号肽的融合蛋白的一部分而被编码。在其它实施方式中，所编码的多肽作为分离的多肽由重组核酸分子编码。在又一些实施方式中，由重组核酸分子的多核苷酸编码的多肽作为不包含信号肽但确实包含重组核酸分子的融合蛋白的一部分被编码。在又一些实施方式中，由本发明的重组核酸分子的多核苷酸编码的多肽作为其中所述多肽嵌入另一多肽序列中的融合蛋白(此处也称为蛋白嵌合体)的一部分被编码。

因此，应当理解的是，由本发明的重组核酸分子的多核苷酸编码的本文(下文以及其它部分)所列出的各多肽，取决于具体重组核酸分子，可以作为融合蛋白(与信号肽融合，和/或与其它多肽融合或在其它多肽中融合)或作为分离多肽由重组核酸分子表达。

在一些实施方式中，所述多肽是由重组核酸分子编码的融合蛋白的一部分并且对融合蛋白的信号肽而言是异源的。在一些实施方式中，所述多肽位于另一异源多肽序列中。

在一些实施方式中，所述多肽是细菌多肽(李斯特菌多肽或非李斯特菌多肽)。在一些实施方式中，所述多肽不是细菌多肽。在一些实施方式中，由多核苷酸编码的多肽是哺乳动物多肽。例如，所述多肽可对应人中所见的多肽序列(即人的多肽)。在一些实施方式中，所述多肽是李斯特菌多肽。在一些实施方式中，所述多肽是非李斯特菌多肽。在一些实施方式中，所述多肽对将引入或已引入重组核酸分子的细菌而言不是天然的(即，是外来的)。

在一些实施方式中，编码多肽的多核苷酸为在细菌中表达而优化密码子。在一些实施方式中，编码多肽的多核苷酸为在细菌中表达而完全优化密码子。在一些实施方式中，由密码子优化的多核苷酸编码的多肽对细菌而言是外来的(即，对细菌是异源的)。

本文中术语“多肽”与“肽”和“蛋白”可互换使用，而不意图对其中所含氨基酸序列的长度或大小进行限制。不过，通常多肽含有至少约6个氨基酸。在一些实施方式中，多肽可包含至少约9、至少约12、至少约20、至少约30或至少约50个氨基酸。在一些实施方式中，多肽包含至少约100个氨基酸。在一些实施方式中，多肽是蛋白的一个具体结构域(例如，细胞外结构域、细胞内结构域、催化结构域或结合结构域)。在一些实施方式中，多肽包含整个(即全长)蛋白。

在一些实施方式中，重组核酸分子的多核苷酸编码的多肽是可提供对疾病的姑息治疗的抗原或蛋白。在一些实施方式中，所编码的多肽是治疗蛋白。

在一些实施方式中，重组核酸分子的多核苷酸编码的多肽是抗原。在一些实施方式中，所述抗原是细菌抗原。在一些实施方式中，所述抗原是非李斯特菌属细菌抗原。不过，在一些实施方式中，所述抗原是非李斯特菌抗原。在其它实施方式中，所述抗原是非细菌的抗原。在一些实施方式中，所述抗原是哺乳动物抗原。在一些实施方式中，所述抗原是人抗原。在一些实施方式中，所述多肽是含有一个或多个免疫原性表位的抗原。在一些实施方式中，所述抗原包含一个或多个MHC I类表位。在其它实施方式中，所述抗原包含一个或多个MHC II类表位。在一些实施方式中，所述表位是CD4+T细胞表位。在其它实施方式中，所述表位是CD8+T细胞表位。

编码抗原的多核苷酸不限于任何确切的核酸序列(即，编码天然存在的全长抗原的核酸序列)，但可以是任何编码下述多肽的序列：该多肽在细菌或本发明的组合物中施用于个体时足以引起所需的免疫应答。还应当理解，如本文所用的术语“抗原”可包括较大抗原蛋白的片段，只要该片段具有抗原性(即，免疫原性)即可。而且，在一些实施方式中，重组核酸的多核苷酸编码的抗原可以是天然存在的抗原序列的变体。(同样，对于编码其它非抗原蛋白的多核苷酸，编码给定蛋白的多核苷酸的序列可以有所变化，只要表达的所需蛋白在施用于个体时能提供所需效果(例如姑息治疗效果)即可。)

衍生自另一抗原的抗原包括是其它抗原的抗原性片段、其它抗原的抗原性变体或其它抗原的片段的抗原性变体的抗原。抗原的变体包括与最初抗原差异在于一个或多个取代、缺失、添加和/或插入的抗原。

抗原性片段可以为任何长度，但最通常为至少约6氨基酸、至少约9氨基酸、至少约12氨基酸、至少约20氨基酸、至少约30氨基酸、至少约50氨基酸或至少约100氨基酸。抗原的抗原性片段包含来自所述抗原的至少一个表位。在一些实施方式中，所述表位是MHC I类表位。在其它实施方式中，所述表位是MHC II类表位。在一些实施方式中，所述表位是CD4+T细胞表位。在其它实施方式中，所述表位是CD8+T细胞表位。

本领域技术人员可获得多种用于预测蛋白内的抗原性区域(包括表位)的算法和软件包。例如，可用于选择与MHC I类和II类分子结合的表位的算法可公开获得。例如，可利用公开可用算法“SYFPEITHI”来预测MHC-结合肽(Rammensee等人(1999)Immuno genetics 50：213-9)。对于公开可用算法的其它实例，请参见以下参考文件：Parker等人(1994)J.Immunol 152：163-75；Singh和Raghava(2001)Bioinformatics 17：1236-1237；Singh和Raghava(2003)Bioinformatics 19：1009-1014；Mallios(2001)Bioinformatics 17：942-8；Nielsen等人(2004)Bioinformatics 20：1388-97；Donnes等人(2002)BMC Bioinformatics3：25；Bhasin等人(2004)Vaccine 22：3195-204；Guan等人(2003)Nucleic Acids Res 31：3621-4；Reche等人(2002)Hum.Immunol.63：701-9；Schirle等人(2001)J.Immunol Methods 257：1-16；Nussbaum等人(2001)Immuno genetics(2001)53：87-94；Lu等人(2000)Cancer Res.60：5223-7。还可见，例如，Vector NTI

Suite(Informax，Inc，Bethesda，MD)、GCG Wisconsin Package(Accelrys，Inc.，San Diego，CA)、Welling等人(1985)FEBS Lett.188：215-218、Parker等人(1986)Biochemistry 25：5425-5432、Van Regenmortel和Pellequer(1994)Pept.Res.7：224-228、Hopp和Woods(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：3824-3828和Hopp(1993)Pept.Res.6：183-190。本段中以上列出的参考文件中所论述的算法或软件包中的一些涉及预测MHC I类和/或II类结合肽或表位，另一些涉及鉴定蛋白酶体切割位点，又一些涉及根据亲水性预测抗原性。

确信含有具有所需性质的至少一个表位的备选抗原性片段一旦得到鉴定，那么可将编码该序列的多核苷酸序列导入表达盒内并且引入李斯特菌疫苗载体或其它细菌疫苗载体内。然后通过评估由表达该片段的李斯特菌或其它细菌产生的免疫应答，可以确认抗原性片段的免疫原性。可利用如ELISPOT测试、细胞内细胞因子染色(ICS)测试或细胞毒T细胞活性测试等标准免疫测试来核实所选抗原的片段保持所需的免疫原性。而且，还可以利用已知方法来评估李斯特菌和/或细菌疫苗的抗肿瘤功效；例如，在小鼠中移植表达抗原片段的CT26鼠结肠细胞，然后以备选疫苗对所述小鼠进行接种，并观察与对照和/或全长抗原相比的对肿瘤大小、转移、生存等的影响。

而且，用于鉴定抗原性片段的含有表位和/或MHC配体信息的大型数据库可公开获得。例如见Brusic等人(1998)Nucleic Acids Res.26：368-371；Schonbach等人(2002)Nucleic Acids Research 30：226-9；和Bhasin等人(2003)Bioinformatics 19：665-666；和Rammensee等人(1999)Immunogenetics 50：213-9。

抗原性变体的氨基酸序列与最初抗原具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的同一性。

在一些实施方式中，抗原性变体是与最初抗原具有至少约80％同一性的保守变体，并且抗原性变体和最初抗原序列之间的取代是保守氨基酸取代。以下取代被认为是保守氨基酸取代：缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸取代丙氨酸；赖氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺取代精氨酸；谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸或精氨酸取代天冬酰胺；谷氨酸取代天冬氨酸；丝氨酸取代半胱氨酸；天冬酰胺取代谷氨酰胺；天冬氨酸取代谷氨酸；脯氨酸或丙氨酸取代甘氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸取代组氨酸；亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或正亮氨酸取代异亮氨酸；正亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸取代亮氨酸；精氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺取代赖氨酸；亮氨酸、苯丙氨酸或异亮氨酸取代甲硫氨酸；亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸或酪氨酸取代苯丙氨酸；丙氨酸取代脯氨酸；苏氨酸取代丝氨酸；丝氨酸取代苏氨酸；酪氨酸或苯丙氨酸取代色氨酸；色氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸取代酪氨酸；色氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸取代酪氨酸；异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸或正亮氨酸取代缬氨酸。在一些实施方式中，抗原性变体是与最初抗原具有至少约90％同一性的保守变体。

在一些实施方式中，衍生自另一抗原的重组核酸分子编码的抗原与其它抗原实质等效。如果衍生抗原与最初抗原具有至少约70％的氨基酸序列同一性并且保留了最初抗原的至少约70％的免疫原性，则衍生自另一抗原的抗原与其所衍生的最初抗原实质等效。在一些实施方式中，实质等效的抗原与最初抗原具有至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％氨基酸序列同一性。在一些实施方式中，实质等效抗原与最初抗原相比仅包含保守取代。在一些实施方式中，实质等效抗原保留了最初抗原的至少约80％、至少约90％或至少约95％的免疫原性。为了确定特定衍生抗原的免疫原性并与最初抗原的免疫原性进行比较以便确定衍生抗原是否实质等效于最初抗原，人们可以在本领域技术人员已知的多种免疫原性测试的任何测试中检测衍生抗原和最初抗原。例如，可以如本文所述制备表达最初抗原或衍生抗原的李斯特菌。利用ELISPOT测试、细胞内细胞因子染色(ICS)测试、细胞毒T细胞活性测试等标准技术，通过以李斯特菌接种小鼠，随后评估免疫原性应答，可测定表达不同抗原的那些李斯特菌产生免疫应答的能力。

在一些实施方式中，由重组核酸分子编码的抗原是肿瘤相关抗原或衍生自肿瘤相关抗原的抗原。在一些实施方式中，所述抗原是肿瘤相关抗原。

在一些实施方式中，重组核酸分子编码与肿瘤相关抗原不同但衍生自肿瘤相关抗原的抗原。例如，在一些实施方式中，由重组核酸分子的多核苷酸编码的抗原可以包含肿瘤相关抗原的片段、肿瘤相关抗原的变体或肿瘤相关抗原的片段的变体。在一些情况下，诸如肿瘤抗原等抗原的氨基酸序列在与宿主内源性氨基酸序列稍有不同的时候，能够在疫苗中诱导更显著的免疫应答。在其它情况中，衍生抗原诱导的免疫应答比最初抗原更不显著，但是例如由于大小较小而更便于在李斯特菌疫苗载体中异源表达。在一些实施方式中，肿瘤相关抗原的变体的氨基酸序列、或肿瘤相关抗原的片段的变体的氨基酸序列与肿瘤相关抗原或其相应片段的氨基酸序列相差一个或多个氨基酸。衍生自肿瘤相关抗原的抗原包含能够在编码抗原的多核苷酸在宿主内表达时诱导所需免疫应答的至少一个表位序列。

因此，在一些实施方式中，重组核酸分子中的多核苷酸编码衍生自肿瘤相关抗原的抗原，其中所述抗原包含肿瘤相关抗原的至少一个抗原性片段。抗原性片段包含肿瘤相关抗原的至少一个表位。在一些实施方式中，衍生自另一抗原的抗原是其它抗原的抗原性(即，免疫原性)片段或抗原性变体。在一些实施方式中，所述抗原是其它抗原的抗原性片段。在一些实施方式中，所述抗原是其它抗原的抗原性变体。

可被T细胞识别的大量肿瘤相关抗原已得到鉴定(Renkvist等人，Cancer Immunol Innumother 50：3-15(2001))。这些肿瘤相关抗原可以是分化抗原(例如，PSMA、酪氨酸激酶、gp100)、组织特异性抗原(例如PAP、PSA)、发育抗原、肿瘤相关病毒抗原(例如HPV 16 E7)、睾丸癌抗原(例如MAGE、BAGE、NY-ESO-1)、胚胎抗原(例如CEA、α-甲胎蛋白)、癌蛋白抗原(例如Ras、p53)、过表达蛋白抗原(例如ErbB2(Her2/Neu)、MUC1)或突变蛋白抗原。可由异源核酸序列编码的肿瘤相关抗原包括，但不限于707-AP、膜联蛋白II、AFP、ART-4、BAGE、β-连环蛋白/m、BCL-2、bcr-abl、bcr-ablp190、bcr-abl p210、BRCA-1、BRCA-2、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK-4/m、CEA(Huang等人，Exper Rev.Vaccines(2002)1：49-63)、CT9、CT10、Cyp-B、Dek-cain、DAM-6(MAGE-B2)、DAM-10(MAGE-B1)、EphA2(Zantek等人，Cell Growth Differ.(1999)10：629-38；Carles-Kinch等人，Cancer Res.(2002)62：2840-7)、ELF2M、EphA2(Zantek等人，Cell Growth Differ.(1999)10：629-38；Carles-Kinch等人，Cancer Res.(2002)62：2840-7)、ETV6-AML1、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GnT-V、gp100、HAGE、HER2/neu、HLA-A^*0201-R170I、HPV-E7、H-Ras、HSP70-2M、HST-2、hTERT、hTRT、iCE、凋亡抑制剂(例如存活素)、KIAA0205、K-Ras、12-K-Ras(带有密码子12突变的K-Ras)、LAGE、LAGE-1、LDLR/FUT、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-D、MART-1、MART-1/Melan-A、MC1R、MDM-2、间皮素、Myosin/m、MUC1、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、新-polyA聚合酶、NA88-A、N-Ras、NY-ESO-1、NY-ESO-1a(CAG-3)、PAGE-4、PAP、蛋白酶3(PR3)(Molldrem等人，Blood(1996)88：2450-7；Molldrem等人，Blood(1997)90：2529-34)、P15、p190、Pm1/RARα、PRAME、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RAS、RCAS1、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-2、SART-3、SP17、SPAS-1、TEL/AML1、TPI/m、酪氨酸激酶、TARP、TRP-1(gp75)、TRP-2、TRP-2/INT2、WT-1和源自NY-ESO-1和LAGE-1基因的可变翻译的NY-ESO-ORF2和CAMEL蛋白。

由重组核酸分子中的多核苷酸编码的抗原可包括能够引发肿瘤特异性免疫应答的任何肿瘤相关抗原，包括尚待鉴定的抗原。重组核酸还可以编码多于一种肿瘤相关抗原。

在一些实施方式中，所述抗原是间皮素(Argani等人，Clin Cancer Res.7(12)：3862-8(2001))、Sp17(Lim等人，Blood 97(5)：1508-10(2001))、gp100(Kawakami等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：6458(1994))、PAGE-4(Brinkmann等人，Cancer Res.59(7)：1445-8(1999))、TARP(Wolfgang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(17)：9437-42(2000))、EphA2(Tatsumi等人，Cancer Res.63(15)：4481-9(2003))、PR3(Muller-Berat等人，Clin.Immunol.Immunopath.70(1)：51-9(1994))、前列腺干细胞抗原(PSCA)(Reiter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，95：1735-40(1998)；Kiessling等人，Int.J.Cancer，102：390-7(2002))或SPAS-1(美国专利申请公布号2002/0150588)。

在本发明的一些实施方式中，由重组核酸分子或表达盒编码的抗原是CEA。在其它实施方式中，所述抗原是CEA的抗原性片段和/或抗原性变体。CEA是180-kDA膜细胞间粘附糖蛋白，在显著比例的人类肿瘤中过表达，包括90％的结肠直肠癌、胃癌和胰腺癌，70％的非小细胞肺癌，和50％的乳癌(Hammarstrom，Semin.Cancer Biol.，9：67-81)。已研究了多种免疫治疗剂，例如模拟CEA的抗独特型单克隆抗体(Foon等人，Clin.Cancer Res.，87：982-90(1995)或利用表达CEA的重组疫苗病毒进行的接种(Tsang等人，J.Natl.Cancer Inst.，87：982-90(1995))，然而不幸的是，成功非常有限。不过，研究者已鉴定了HLA^*0201限制性表位，CAP-1(CEA605-613)，其可被由被接种患者产生的人T细胞系识别。以该表位致敏的DC对患者接种不能诱导临床应答(Morse等人，Clin.Cancer Res.，5：1331-8(1999))。最近，鉴定CEA605-613肽激动剂具有610位的天冬氨酸到天冬酰胺的特殊变位取代(CAP1-6D)。虽然该氨基酸取代并未改变该肽的MHC结合亲和力，但改变的肽配体(APL)的使用导致了CEA特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)体外生成的改善。CAP1-6D特异性CTL保持了其识别和裂解表达天然CEA的肿瘤细胞的能力(Zaremba等人，Cancer Res.，57：4570-7(1997)；Salazar等人，Int.J.Cancer，85：829-38(2000))。Fong等人证实在以与该APL温育的Flt3-配体扩增DC接种的结肠癌患者中诱导了CEA特异性免疫。令人鼓舞的是，接种后，12名患者中的2名经历了与肽-MHC四聚物+T细胞的诱导相关的显著肿瘤抑制(Fong等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，98：8809-14(2001))。

在另一实施方式中，由重组核酸分子编码的抗原是作为蛋白酶-3或衍生自蛋白酶-3的抗原。例如，在一个实施方式中，抗原包含HLA-A2.1-限制肽PR1(aa 169-177；VLQELNVTV)。关于蛋白酶-3和/或PR1表位的信息可从以下参考文件中获得：美国专利号5,180,819，Molldrem等人，Blood，90：2529-2534(1997)；Molldrem等人，Cancer Research，59：2675-2681(1999)；Molldrem等人，Nature Medicine，6：1018-1023(2000)；和Molldrem等人，Oncogene，21：8668-8673(2002)。

在一些实施方式中，由重组核酸分子或表达盒编码的抗原是选自K-Ras、H-Ras、N-Ras、12-K-Ras、间皮素、PSCA、NY-ESO-1、WT-1、存活素、gp100、PAP、蛋白酶3、SPAS-1、SP-17、PAGE-4、TARP、B-raf、酪氨酸激酶、mdm-2、MAGE、RAGE、MART-1、bcr/abl、Her-2/neu、α甲胎蛋白、乳腺珠蛋白、hTERT(端粒酶)、PSA或CEA的抗原。在一些实施方式中，所述抗原是K-Ras。在一些实施方式中，所述抗原是H-Ras。在一些实施方式中，所述抗原是N-Ras。在一些实施方式中，所述抗原是K-Ras。在一些实施方式中，所述抗原是间皮素。在一些实施方式中，所述抗原是PSCA。在一些实施方式中，所述抗原是NY-ESO-1。在一些实施方式中，所述抗原是WT-1。在一些实施方式中，所述抗原是存活素。在一些实施方式中，所述抗原是gp100。在一些实施方式中，所述抗原是PAP。在一些实施方式中，所述抗原是蛋白酶3。在一些实施方式中，所述抗原是SPAS-1。在一些实施方式中，所述抗原是SP-17。在一些实施方式中，所述抗原是PAGE-4。在一些实施方式中，所述抗原是TARP。在一些实施方式中，所述抗原是CEA。

在一些实施方式中，所述抗原是人间皮素。

在一些实施方式中，所述抗原是间皮素、SPAS-1、蛋白酶-3、EphA2、SP-17、gp100、PAGE-4、TARP、B-raf、酪氨酸激酶、mdm-2、MAGE、RAGE、MART-1、bcr/abl、Her-2/neu、α甲胎蛋白、乳腺珠蛋白、hTERT(端粒酶)、PSA或CEA，或衍生自这些蛋白之一的抗原。在一些实施方式中，所述抗原是间皮素或衍生自间皮素。在其它实施方式中，所述抗原是EphA2或衍生自EphA2的抗原。在一些实施方式中，本文所述的重组核酸分子编码的抗原不是Epha2(或衍生自Epha2的抗原)。在一些实施方式中，所述抗原是除Epha2之外的肿瘤相关抗原。在一些实施方式中，所述抗原衍生自除Epha2之外的肿瘤相关抗原。

在一些实施方式中，重组核酸分子中的多核苷酸编码衍生自K-Ras、H-Ras、N-Ras、12-K-Ras、间皮素、PSCA、NY-ESO-1、WT-1、存活素、gp100、PAP、蛋白酶3、SPAS-1、SP-17、PAGE-4、TARP、B-raf、酪氨酸激酶、mdm-2、MAGE、RAGE、MART-1、bcr/abl、Her-2/neu、α甲胎蛋白、乳腺珠蛋白、hTERT(端粒酶)、PSA或CEA的抗原。在一些实施方式中，所述抗原衍生自K-Ras。在一些实施方式中，所述抗原衍生自H-Ras。在一些实施方式中，所述多肽是N-Ras。在一些实施方式中，所述抗原衍生自12-K-Ras。在一些实施方式中，抗原是衍生自间皮素的抗原。在一些实施方式中，抗原是衍生自PSCA的抗原。在一些实施方式中，抗原是衍生自NY-ESO-1的抗原。在一些实施方式中，抗原是衍生自WT-1的抗原。在一些实施方式中，抗原是衍生自存活素的抗原。在一些实施方式中，抗原是衍生自gp100的抗原。在一些实施方式中，抗原是衍生自PAP的抗原。在一些实施方式中，抗原是衍生自蛋白酶3的抗原。在一些实施方式中，抗原是衍生自SPAS-1的抗原。在一些实施方式中，抗原是衍生自SP-17的抗原。在一些实施方式中，抗原是衍生自PAGE-4的抗原。在一些实施方式中，抗原是衍生自TARP的抗原。在一些实施方式中，抗原是衍生自CEA的抗原。

在一些实施方式中，抗原是间皮素或其抗原性片段或抗原性变体。在一些实施方式中，抗原是间皮素信号肽和/或GPI锚点已被缺失的间皮素。在一些实施方式中，抗原是间皮素信号肽和/或GPI锚点已被缺失的人间皮素。在一些实施方式中，抗原是间皮素信号肽和GPI锚点已被缺失的人间皮素。

在一些实施方式中，抗原NY-ESO-1或其抗原性片段或抗原性变体。

在一些实施方式中，由重组核酸分子中的多核苷酸编码的多肽包括肿瘤相关抗原如人前列腺干细胞抗原(PSCA；GenBank登录号AF043498)、人睾丸抗原(NY-ESO-1；GenBank登录号NM_001327)、人癌胚胎抗原(CEA；GenBank登录号M29540)、人间皮素(GenBank登录号U40434)、人存活素(GenBank登录号U75285)、人蛋白酶3(GenBank登录号X55668)、人K-Ras(GenBank登录号M54969&P01116)、人H-Ras(GenBank登录号P01112)、人N-Ras(GenBank登录号P01111)和人12-K-Ras(含Gly12Asp突变的K-Ras)(例如见GenBank登录号K00654)的至少一个抗原性片段。在一些实施方式中，由重组核酸分子中的多核苷酸编码的多肽包括具有至少一个保守取代氨基酸的肿瘤相关抗原的抗原性片段。在一些实施方式中，由重组核酸分子中的多核苷酸编码的多肽包括具有至少一个缺失氨基酸残基的抗原性片段。在一些实施方式中，由重组核酸分子中的多核苷酸编码的多肽包括衍生自多于一种类型的肿瘤相关抗原的抗原性序列的组合，例如，衍生自间皮素和Ras的抗原性片段的组合。

经预测具有抗原性的肿瘤抗原的示例性区域包括以下区域：GenBank登录号AF043498中PSCA氨基酸序列的氨基酸25-35、氨基酸70-80和氨基酸90-118；GenBank登录号NM_001327的NY-ESO-1的氨基酸40-55、氨基酸75-85、氨基酸100-115和氨基酸128-146；GenBank登录号M29540的CEA氨基酸序列的氨基酸70-75、氨基酸150-155、氨基酸205-225、氨基酸330-340和氨基酸510-520；GenBank登录号U40434的间皮素多肽序列的氨基酸90-110、氨基酸140-150、氨基酸205-225、氨基酸280-310、氨基酸390-410、氨基酸420-425和氨基酸550-575；GenBank登录号U75285的存活多肽序列的氨基酸12-20、氨基酸30-40、氨基酸45-55、氨基酸65-82、氨基酸90-95、氨基酸102-115和氨基酸115-130；GenBank登录号X55668中发现的蛋白酶-3氨基酸序列的氨基酸10-20、氨基酸30-35、氨基酸65-75、氨基酸110-120和氨基酸160-170；GenBank登录号P01117或M54968(人K-Ras)的氨基酸10-20、氨基酸30-50、氨基酸55-75、氨基酸85-110、氨基酸115-135、氨基酸145-155和氨基酸160-185；GenBank登录号P01112(人H-Ras)的氨基酸10-20、氨基酸25-30、氨基酸35-45、氨基酸50-70、氨基酸90-110、氨基酸115-135和氨基酸145-175；GenBank登录号P01111(人N-Ras)的氨基酸10-20、氨基酸25-45、氨基酸50-75、氨基酸85-110、氨基酸115-135、氨基酸140-155和氨基酸160-180；和12-K-Ras(GenBank登录号K00654中公开的序列)的前25-氨基酸。这些抗原性区域由Hopp-Woods和Welling抗原性点图预测。

在一些实施方式中，作为分离的多肽、作为带有经选择的信号肽的融合蛋白或作为其中所述多肽已插入另一多肽中的蛋白嵌合体的由本发明的多核苷酸编码的多肽，是含有一种或多种人间皮素的以下肽的多肽：SLLFLLFSL(氨基酸20-28)；VLPLTVAEV(氨基酸530-538)；ELAVALAQK(氨基酸83-92)；ALQGGGPPY(氨基酸225-234)；FYPGYLCSL(氨基酸435-444)和LYPKARLAF(氨基酸475-484)。例如，在一些实施方式中，由本发明的多核苷酸编码的抗原是含有一个或多个所述肽的人间皮素的(抗原性)片段。有关这些间皮素肽序列和它们与医疗相关免疫应答的关系的其它信息可见于PCT公开WO 2004/006837。

作为另一种选择，重组核酸分子中的多核苷酸可编码自身免疫性疾病特异性抗原。在T细胞介导的自身免疫性疾病中，对自身抗原的T细胞应答导致自身免疫性疾病。用于与本发明的疫苗一起治疗自身免疫性疾病的抗原类型可靶向引起自身免疫应答的特异性T细胞。例如，所述抗原可以是T细胞受体的一部分，为独特型，具有对那些引起自身免疫应答的T细胞的特异性，其中导入本发明的疫苗的抗原可引起对那些导致自身免疫应答的T细胞特异的免疫应答。消除那些T细胞可成为减轻自身免疫性疾病的治疗机制。另一可能性是在重组核酸分子中导入编码可导致免疫应答的抗原的多核苷酸，靶向在自身免疫性疾病中对自身抗原产生的抗体或靶向可分泌抗体的特异性B细胞克隆。例如，可在重组核酸分子中导入编码独特型抗原的多核苷酸，从而导致针对与自身免疫性疾病中自身抗原反应的所述B细胞和/或抗体的抗独特型免疫应答。包含含有本发明的表达盒和重组核酸分子的细菌的疫苗可治疗的自身免疫性疾病包括，但不限于类风湿关节炎、多发性硬化症、克罗恩氏病、狼疮、重症肌无力、白癜风、硬皮症、银屑病、寻常性天疱疮、纤维肌痛、结肠炎和糖尿病。可采用相似的方法治疗过敏反应，其中导入疫苗微生物中的抗原靶向可有效调控过敏反应的T细胞、B细胞或抗体。在一些自身免疫性疾病如银屑病中，该疾病通过同样可被靶向的抗原的表达而导致过度增殖的细胞生长。可考虑会导致针对过度增殖的细胞的免疫应答的这种抗原。

可选的是，重组核酸分子编码靶向独特疾病相关蛋白结构的抗原。其一个实例是利用上述独特型抗原的抗体、B细胞或T细胞的靶向。另一可能性是靶向由特殊疾病导致的独特蛋白结构。其实例是导入可产生针对引起在诸如阿尔茨海默病、克雅氏病(CJD)和牛海绵状脑病(BSE)等疾病中观察到的淀粉样斑块的蛋白的免疫应答的抗原。虽然该方法可能仅减少斑块形成，但可能可以提供如CJD等疾病的治愈性疫苗。该病由朊蛋白的感染形式引起。在一些实施方式中，本发明的多核苷酸编码针对朊蛋白的感染形式的抗原，从而由疫苗产生的免疫应答可消除、减少或控制引起CJD的感染蛋白。

在一些实施方式中，由重组核酸分子编码的多肽是传染病抗原或衍生自传染病抗原。在一些实施方式中，由重组核酸分子编码的多肽是传染病抗原。在一些实施方式中，由重组核酸分子编码的多肽衍生自传染病抗原。

在本发明的其它实施方式中，上述抗原衍生自人或动物病原体。上述病原体可选为病毒、细菌、真菌、或原生动物。例如，上述抗原可以是病毒抗原或真菌抗原或细菌抗原。在一个实施方式中，衍生自病原体的重组核酸分子编码的抗原是由病原体产生的蛋白或衍生自由病原体产生的蛋白。例如，在一些实施方式中，由重组核酸分子、表达盒和/或表达载体编码的多肽是由病原体产生的蛋白的片段和/或变体。

例如，在一些实施方式中，所述抗原衍生自人类免疫缺陷病毒(例如gp120、gp 160、gp41、gag抗原例如p24gag和p55gag，以及衍生自pol、env、tat、vif、rev、nef、vpr、vpu和HIV的LTR区域的蛋白)、猫免疫缺陷病毒、或人或动物疱疹病毒。例如，在一些实施方式中，所述抗原是gp120。在一个实施方式中，所述抗原衍生自1型和2型单纯疱疹病毒(HSV)(例如gD、gB、gH、立即早期蛋白例如ICP27)、衍生自巨细胞病毒(例如gB和gH)、衍生自变形肺病毒、衍生自Epstein-Barr病毒或衍生自Varicella Zoster病毒(例如gp I、II或III)。(例如见Chee等人(1990)Cytomegaloviruses(J.K.McDougall，ed.，Springer Verlag，pp.125-169；McGeoch等人(1988)J.Gen.Virol.69：1531-1574；美国专利5,171,568；Baer等人(1984)Nature 310：207-211；和Davison等人(1986)J.Gen.Virol.67：1759-1816。)。

在另一实施方式中，所述抗原衍生自肝炎病毒，例如乙肝病毒(例如，乙肝表面抗原)、甲肝病毒、丙肝病毒、丁肝病毒、戊肝病毒或庚肝病毒。例如见WO 89/04669；WO 90/11089；和WO 90/14436。肝炎抗原可以是表面抗原、核心抗原或其它相关抗原。HCV基因组编码数种病毒蛋白，包括E1和E2。例如见Houghton等人，Hepatology 14：381-388(1991)。

作为病毒抗原的抗原可选地源自以下科中任一科的病毒：小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒、鼻病毒等)；杯状病毒科；披膜病毒科(例如，风疹病毒、登革病毒等)；黄病毒科；冠状病毒科；呼肠孤病毒科(例如，轮状病毒等)；双核糖核酸病毒科；单负股病毒目弹状病毒科例如，狂犬病病毒等)；正黏液病毒科(例如，甲型、乙型和丙型流感病毒等)；纤丝病毒科；副粘病毒科(例如，腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒等)；布尼雅病毒科；沙粒病毒科；逆转录病毒科(例如，HTLV-I；HTLV-11；HIV-1(也称为HTLV-111、LAV、ARV、hTLR，等))，包括但不限于来自分离株HIVI11b、HIVSF2、HTVLAV、HIVLAI、HIVMN的抗原)；HIV-1CM235、HIV-1；HIV-2，等等；猿免疫缺陷病毒(SIV))；乳头瘤病毒、蜱传脑炎病毒病毒；等等。这些病毒和其它病毒的描述，例如请见Virology，3rd Edition(W.K.Joklik ed.1988)；Fundamental Virology，3rd Edition(B.N.Fields，D.M.Knipe和P.M.Howley，Eds.1996)。在一个实施方式中，所述抗原是Flu-HA(Morgan等人，J.Immunol.160：643(1998))。

在一些替代性实施方式中，所述抗原源自细菌病原体，例如分支杆菌、杆菌、耶尔森氏菌、沙门氏菌、奈瑟氏菌、包柔氏螺旋体菌(例如，OspA或OspB或其衍生物)、衣原体或博德特氏菌(例如，P.69、PT和FHA)，或源自寄生生物例如疟原虫或弓形虫。在一个实施方式中，抗原源自结核分枝杆菌(例如ESAT-6、85A、85B、85C、72F)、炭疽杆菌(例如PA)或鼠疫耶尔森菌(例如F1、V)。此外，适用于本发明的抗原可获得自或源自引起疾病的已知致病剂，所述疾病包括但不限于白喉、百日咳、破伤风、结核、细菌或真菌性肺炎、中耳炎、淋病、霍乱、伤寒、脑膜炎、单核细胞增多症、鼠疫、志贺氏菌病或沙门氏菌病、军团病、莱姆病、麻风病、疟疾、钩虫病、盘尾丝虫病、血吸虫病、锥虫病、利什曼病、贾第鞭毛虫病、阿米巴病、丝虫病、包柔氏螺旋体菌病和旋毛虫病。又其它抗原可获得自或源自非常规病原体，例如苦鲁病、克雅氏病(CJD)、羊搔痒症、传染性水貂脑病和慢性消耗疾病的致病剂，或来自蛋白质的感染颗粒例如与疯牛病相关的朊蛋白。

在又一些实施方式中，所述抗原获得自或源自神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病)、代谢病(例如I型糖尿病)和药物成瘾(例如尼古丁成瘾)的发作或进展所涉及的生物剂。作为另一种选择，由重组核酸分子编码的抗原用于疼痛处理，并且所述抗原是参与疼痛信号传递的疼痛受体或其它试剂。

在一些实施方式中，所述抗原是人蛋白或衍生自人蛋白。在其它实施方式中，所述抗原是非人蛋白或衍生自非人蛋白(其片段和/或变体)。在一些实施方式中，表达盒编码的融合蛋白的抗原部分是来自非人动物的蛋白或是源自非人动物的蛋白。例如，即使所述抗原将在用于人的基于李斯特菌的疫苗中表达，那么在一些实施方式中，所述抗原可以是鼠间皮素或源自鼠间皮素。

V李斯特菌

在一些实施方式中，李斯特菌属于单核细胞增生性李斯特菌物种。在一些替代性实施方式中，所述细菌是绵羊李斯特杆菌、斯氏李斯特菌、无害李斯特菌、威尔斯李斯特菌或格氏李斯特菌物种的成员。

在一些实施方式中，李斯特菌是非天然存在的菌。在一些实施方式中，李斯特菌是减毒的菌。在一些实施方式中，李斯特菌是活菌。在一些实施方式中，李斯特菌是突变体李斯特菌、重组李斯特菌或经修饰李斯特菌。在一些实施方式中，李斯特菌是减毒的菌。在一些实施方式中，李斯特菌具有代谢活性。在某些实施方式中，李斯特菌未受噬菌体感染。本发明还提供了重组李斯特菌。而且，李斯特菌可以是分离的和/或基本纯化的。

在一些实施方式中，减毒李斯特菌在生长、细胞至细胞的传播、结合或进入宿主细胞、复制或DNA修复中的一个或多个方面减弱。在一些实施方式中，李斯特菌通过actA突变、inlB突变、uvrA突变、uvrB突变、uvrC突变、靶向核酸的化合物或uvrAB突变和靶向核酸的化合物中的一个或多个方面而减弱。在一些实施方式中，减毒李斯特菌在细胞至细胞的传播和/或进入非吞噬性细胞方面减弱。在一些实施方式中，李斯特菌通过actA突变或actA突变和inlB突变中的一个或多个方面而减弱。在一些实施方式中，李斯特菌是ΔactA或ΔactAΔinlB。

在一些实施方式中，减毒李斯特菌在细胞至细胞的传播方面减弱。在一些实施方式中，细胞至细胞的传播方面减弱的李斯特菌关于ActA是缺陷的(例如，相对于非修饰或野生型李斯特菌)。在一些实施方式中，李斯特菌含有actA基因的减毒突变。在一些实施方式中，李斯特菌含有actA基因的完全或部分缺失。

在一些实施方式中，与不带减毒突变的李斯特菌(例如，野生型李斯特菌)相比，减毒李斯特菌属细菌的细胞至细胞的传播能力减少至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约90％。在一些实施方式中，与不带减毒突变的李斯特菌相比，减毒李斯特菌属细菌的细胞至细胞的传播能力减少至少约25％。在一些实施方式中，与不带减毒突变的李斯特菌相比，减毒李斯特菌属细菌的细胞至细胞的传播能力减少至少约50％。

用于确定李斯特菌属细菌的细胞至细胞的传播是否减弱的体外测试是本领域普通技术人员已知的。例如，可以测定所选培养细胞单层感染后的随时间过程形成的斑块的直径。可以如Sun，A.，A.Camilli和D.A.Portnoy.(1990，Isolation of Listeria monocytogenes small-plaque mutants defective for intracellular growth and cell-to-cell spread.Infect.Immun.58：3770-3778)此前所述，进行L2细胞单层内的斑块测试，对测定方法的改变如Skoble，J.，D.A.Portnoy和M.D.Welch(2000，Three regions within ActA promote Arp2/3complex-mediated actin nucleation and Listeria monocytogenes motility.J.Cell Biol.150：527-538)所述。简单来说，L2细胞在6孔组织培养皿中生长至融合，然后以细菌感染1小时。感染之后，以由含0.8％琼脂糖的DME、胎牛血清(例如，2％)和所需浓度的庆大霉素组成的温热至40℃的培养基覆盖细胞。培养基中庆大霉素的浓度显著影响斑块大小，是所选李斯特菌株进行细胞至细胞的传播的能力的度量(Glomski，I J.，M.M.Gedde，A.W.Tsang，J.A.Swanson和D.A.Portnoy.2002.J.Cell Biol.156：1029-1038)。例如，在一些实施方式中，单层感染后第3天，当覆盖含有庆大霉素浓度为50μg/ml的培养基时，与野生型李斯特菌相比，具有缺陷细胞至细胞的传播表型的李斯特菌株的斑块大小减少至少约50％。另一方面，当受感染单层覆盖了仅含5μg/ml庆大霉素的培养基+琼脂糖时，具有缺陷细胞至细胞的传播表型的李斯特菌株与野生型李斯特菌之间的斑块尺寸是相似的。因此，通过改变含琼脂糖的培养基中的庆大霉素浓度，可以确定与野生型李斯特菌相比的所选择株进行受感染细胞单层中细胞至细胞的传播的相对能力。可选的是，通过在感染后48小时在覆层中加入含中性红(GIBCO BRL；以1∶250稀释于DME+琼脂糖培养基)的培养基，可以有利于斑块直径的可视化和测定。此外，斑块测试可以在衍生自其它原代细胞或传代细胞的单层中进行。例如，可使用HepG2细胞、肝细胞衍生细胞系或原代人肝细胞来评价所选李斯特菌突变体相对于野生型李斯特菌的进行细胞至细胞的传播的能力。在一些实施方式中，在高浓度的庆大霉素(约50μg/ml)下，含有减弱李斯特菌的细胞至细胞的传播的突变或其它改变的李斯特菌产生“针尖”斑块。

在一些实施方式中，李斯特菌在进入非吞噬细胞方面减弱(相对于非突变体或野生型李斯特菌)。在一些实施方式中，李斯特菌关于一种或多种内化素(或等同方式)具有缺陷。在一些实施方式中，李斯特菌关于内化素A具有缺陷。在一些实施方式中，李斯特菌关于内化素B具有缺陷。在一些实施方式中，李斯特菌包含inlA中的突变。在一些实施方式中，李斯特菌包含inlB中的突变。在一些实施方式中，李斯特菌同时包含actA中以及inlB中的突变。在一些实施方式中，李斯特菌缺失功能性ActA和内化素B。在一些实施方式中，减毒李斯特菌属细菌是ΔactAΔinlB双缺失突变体。在一些实施方式中，李斯特菌属细菌关于ActA和内化素B具有缺陷。

在一些实施方式中，与不带有减毒突变的李斯特菌(例如，野生型细菌)相比，减毒李斯特菌属细菌进入非吞噬细胞的能力减少至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约90％。在一些实施方式中，与不带有减毒突变的李斯特菌相比，减毒李斯特菌属细菌进入非吞噬细胞的能力减少至少约25％。在一些实施方式中，与不带有减毒突变的李斯特菌相比，减毒李斯特菌属细菌进入非吞噬细胞的能力减少至少约50％。在一些实施方式中，与不带有减毒突变的李斯特菌相比，减毒李斯特菌属细菌进入非吞噬细胞的能力减少至少约75％。

在一些实施方式中，减毒李斯特菌在进入多于一种类型的非吞噬细胞方面未减弱。例如，减毒株可以在进入肝细胞方面减弱，但在进入表皮细胞方面不减弱。作为另一实例，减毒株可以在进入表皮细胞方面减弱，但在进入肝细胞方面不减弱。还应当理解的是，特定经修饰李斯特菌进入非吞噬细胞方面的减弱是指定基因突变(如缺失突变)的结果，所述基因编码与特定细胞受体相互作用的侵袭素蛋白，结果有助于对非吞噬细胞的感染。例如，李斯特菌ΔinlB突变体株在进入表达肝细胞生长因子受体(c-met)的非吞噬细胞方面减弱，所述非吞噬细胞包括肝细胞细胞系(例如，HepG2)和原代人肝细胞。

在一些实施方式中，即使李斯特菌在进入非吞噬细胞方面减弱，李斯特菌仍然能够被吞噬细胞摄入，例如至少树突细胞和/或巨噬细胞。在一个实施方式中，减毒李斯特菌进入吞噬细胞的能力未被对该株所作的修饰(例如侵袭素的突变)消减(即该株经测定被吞噬细胞摄入的能力在修饰后保留约95％或以上)。在其它实施方式中，减毒李斯特菌进入吞噬细胞的能力被消减不超过约10％、不超过约25％、不超过约50％、或不超过约75％。

在本发明一些实施方式中，李斯特菌进入非吞噬细胞的能力的减弱量具有从减少2倍至更高水平的减弱的范围。在一些实施方式中，李斯特菌进入非吞噬细胞的能力的减弱为至少约0.3个数量级(log)、约1个数量级、约2个数量级、约3个数量级、约4个数量级、约5个数量级或至少约6个数量级。在一些实施方式中，减弱是在约0.3至＞8个数量级、约2至＞8个数量级、约4至＞8个数量级、约6至＞8个数量级、约0.3-8个数量级，以及约0.3-7个数量级、以及约0.3-6个数量级、以及约0.3-5个数量级、以及约0.3-4个数量级、以及约0.3-3个数量级、以及约0.3-2个数量级、以及约0.3-1个数量级。在一些实施方式中，减弱为约1至＞8个数量级、1-7个数量级、1-6个数量级、以及约2-6个数量级、以及约2-5个数量级、以及约3-5个数量级的范围中。

本领域普通技术人员已知用于确定李斯特菌属细菌是否在进入非吞噬细胞方面减弱的体外测试。例如，Dramsi等人，Molecular Microbiology 16：251-261(1995)和Gaillard等人，Cell 65：1127-1141(1991)均描述了用于筛选突变体单核细胞增生性李斯特菌株进入某些细胞系的能力的测试。例如，为了确定带有特定修饰的李斯特菌属细菌是否在进入特定类型非吞噬细胞方面减弱，可确定减毒李斯特菌属细菌进入特定类型的非吞噬细胞的能力，并与不带有修饰的相同李斯特菌属细菌进入非吞噬细胞的能力相比较。同样，为了确定带有特定突变的李斯特菌株是否在进入特定类型非吞噬细胞方面减弱，可测定突变体李斯特菌株进入特定类型的非吞噬细胞的能力，并与不带有突变的李斯特菌株进入非吞噬细胞的能力相比较。例如，可以比较经修饰李斯特菌属细菌感染非吞噬细胞(例如肝细胞)的能力和非修饰李斯特菌或野生型李斯特菌感染吞噬细胞的能力。在这种测试中，通常将经修饰的和非修饰的李斯特菌在体外加至非吞噬细胞并持续有限的一段时间(例如，1小时)，然后以含庆大霉素的溶液洗涤细胞以便杀死细胞外的细菌，将细胞裂解，随后铺板以评估滴度。这种测试的实例见美国专利公开号2004/0228877。而且，还可以通过比较该株的表型与此前报道的内化素B突变体的表型，来确认该株在内化素B方面缺陷。

按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的规定，单核细胞增生性李斯特菌ΔactAΔinlB株于2003年10月3日保藏在美国培养物物种保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209，美国(P.O.Box 1549，Manassas，Virginia，20108，美国)，保藏号为PTA-5562。按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的规定，另一单核细胞增生性李斯特菌株ΔactAΔuvrAB株也于2003年10月3日保藏在ATCC，保藏号为PTA-5563。

在一些实施方式中，李斯特菌在核酸修复方面减弱(例如，相对于野生型)。例如，在一些实施方式中，李斯特菌在至少一种DNA修复酶方面有缺陷(例如，单核细胞增生性李斯特菌uvrAB突变体)。在一些实施方式中，李斯特菌在PhrB、UvrA、UvrB、UvrC、UvrD和/或RecA方面有缺陷。在一些实施方式中，该细菌在UvrA、UvrB和/或UvrC方面有缺陷。在一些实施方式中，该细菌含有phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrD和/或recA基因中的减毒突变。在一些实施方式中，该细菌在uvrA、uvrB、和/或uvrC基因中含有一个或多个突变。在一些实施方式中，该细菌在UvrA、UvrB和/或UvrC中功能性缺失。在一些实施方式中，该细菌在UvrA和UvrB中功能性缺失。在一些实施方式中，细菌是uvrAB缺失突变体。在一些实施方式中，该细菌是ΔuvrABΔactA突变体。在一些实施方式中，核酸修复减弱和/或在至少一种DNA修复酶方面缺陷的细菌的核酸通过与靶向核酸的化合物的反应而被修饰。核酸修复突变体，例如ΔuvrAB单核细胞增生性李斯特菌突变体，以及制备突变体的方法详细描述于美国专利公开号2004/0197343中，通过参考方式将其整体并入本文(例如见U.S.2004/0197343的实施例7)。

在一些实施方式中，与不带有减毒突变的李斯特菌属细菌(例如，野生型细菌)相比，减毒李斯特菌属细菌的核酸修复的能力减少至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约90％。在一些实施方式中，与不带有减毒突变的李斯特菌属细菌相比，减毒李斯特菌属细菌的核酸修复的能力减少至少约25％。在一些实施方式中，与不带有减毒突变的李斯特菌属细菌相比，减毒李斯特菌属细菌的核酸修复的能力减少至少约50％。

可通过本领域技术人员已知的各种方法确认菌株中存在特定突变。例如，可以对该株的基因组的相关部分进行克隆和测序。作为另一种选择，利用编码与缺失或其它突变相邻的区域的引物对进行PCR，可以鉴定特定突变。还可以利用核酸印迹检测细菌基因组中的改变。此外，利用本领域标准技术例如蛋白印迹，可以分析所述株是否表达特定蛋白。通过比较该株的表型与此前报道表型，也可以获得对含有所需基因突变的株的确认。例如，采用检测细菌利用核苷酸切除修复(NER)装置修复其核酸的能力并将该能力与野生型细菌比较的测试，可以评估核苷酸切除修复突变例如uvrAB的缺失的存在。本领域已知这种功能测试。例如，可测定环丁烷二聚体切除或UV诱导(6-4)产物的切除，从而确定突变体中NER酶的缺陷(例如见Franklin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：3821-3824(1984))。作为另一种选择，可进行生存测定，从而评估核酸修复的缺陷。例如，可对李斯特菌进行补骨脂素/UVA处理，然后评估其与野生型相比的增殖和/或存活的能力。本发明提供了灭活但具有代谢活性(KBMA)的李斯特菌属细菌或李斯特菌株(例如见Brockstedt等人(2005)Nat.Med.[7月24日印刷前电子出版])。KBMA李斯特菌属细菌具有代谢活性，但不能在例如琼脂上形成集落。至少一种DNA修复基因中的失活突变，例如ΔuvrAB，能够利用低浓度的核酸交联剂(例如，补骨脂素)杀死李斯特菌，其中这些浓度足以防止集落形成，但不足以在实质上损害代谢。利用补骨脂素/UVA光进行的有限处理和/或以高特异性可使链间基因组交联的核酸交联剂进行的处理，结果是细菌细胞被杀死但保持代谢活性。

本发明提供了多种李斯特菌株，以用于制备或工程化本发明的减毒李斯特菌(表4)。本发明的李斯特菌不限于该表公开的株。

表4.本发明中用作亲本株的李斯特菌的示例性株

在一些实施方式中，可以在李斯特菌对宿主的生物学效应方面，测定李斯特菌的减弱。通过测定小鼠或其它脊椎动物中的LD₅₀，可以评估株的致病性。LD₅₀是引起50％的脊椎动物死亡所需的李斯特菌在脊椎动物中注射的量或剂量。比较具有特定修饰(例如，突变)的细菌与不具有特定修饰的细菌的LD₅₀值作为减毒水平的测量。例如，如果不具有特定突变的细菌株的LD₅₀为10³个细菌，而具有特定突变的细菌株的LD₅₀为10⁵个细菌，则该株经减毒而使LD₅₀增加100倍或2个数量级。

在一些实施方式中，减毒李斯特菌的LD₅₀为亲本或野生型李斯特菌LD₅₀的至少约5倍以上、至少约10倍以上、至少约100倍以上、至少约1000倍以上或至少约1x10⁴倍以上。

作为另一实例，减毒的程度还可以通过其它生物学效应来定量测量，例如组织病理学的程度或血清肝脏酶水平。在临床实验室确定注射有李斯特菌(或其它细菌)的小鼠的血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、白蛋白和胆红素水平。对于带有和不带有特定修饰/突变的李斯特菌，进行小鼠或其它脊椎动物中这些效应的比较可以作为评估李斯特菌的减毒的方法。还可通过组织病理学来测定李斯特菌的减毒。通过比较注射有突变体和非突变体李斯特菌的脊椎动物中的这些值，可从受感染脊椎动物的各种组织，例如肝脏、脾脏和神经系统中回收的李斯特菌的量也可用作减毒水平的衡量。例如，通过比较注射有突变体和非突变体李斯特菌的小鼠中的这些值，作为时间函数的可从受感染组织例如肝脏或脾脏回收的李斯特菌的量可用作减毒的衡量。

因此，在已知为野生型李斯特菌的靶的小鼠的特定选择器官中的细菌载量方面，可以测定李斯特菌的减毒。例如，将肝脏或脾脏匀浆(在H₂O+0.2％NP40中匀化)稀释物在BHI琼脂培养基上铺板，并对所产生的集落(集落形成单位；CFU或cfu)进行计数，可以测定李斯特菌的减毒。例如，通过任何途径包括静脉内、腹膜内、肌肉内和皮下施用经修饰李斯特菌之后，随时间过程测定肝脏或脾脏cfu。此外，如所述，通过竞争指数测试，可以测定施用后随时间过程的肝脏和脾脏(或任何其它所选器官)中的李斯特菌，并与耐药性、野生型李斯特菌(或任何其它所选李斯特菌株)比较。

本领域中公知突变体李斯特菌制备方法。通过传统诱变方法，例如诱变化学剂或辐射，然后选择突变体，可以实现细菌突变。通过重组DNA技术，本领域技术人员也可以实现细菌突变。例如，利用Camilli等人(Molecular Micro.8：143-157(1993))中所述的pKSV7载体的等位基因交换法适合用于产生包括缺失突变体在内的突变体。(Camilli等人(1993)，通过引用方式整体并入本文)。作为另一种选择，可以使用Biswas等人(J.Bacteriol.175：3628-3635(1993))中所述的基因替换方案。其它相似方法是本领域普通技术人员已知的。

各种细菌突变体的构建在美国专利申请序列号10/883,599、美国专利公开号2004/0197343和美国专利公开号2004/0228877中有所描述，将各篇上述文件通过引用整体并入本文。

为了提供安全有效的疫苗，减毒细菌被非吞噬细胞摄取的减弱程度不必是绝对减弱。在一些实施方式中，减弱程度提供的毒性的减少足以防止毒性的症状或将其降低至不威胁生命的水平。

在一些实施方式中，李斯特菌不能形成集落、复制和/或分裂。在本发明的一些实施方式中，李斯特菌与亲本或野生型李斯特菌相比，增殖减弱。

在一些实施方式中，减毒李斯特菌被杀死但具有代谢活性(KBMA)(美国专利公开号2004/0197343和Brockstedt等人，Nat.Med.，11：853-60(2005)，将其通过引用整体并入本文)。

李斯特菌群的核酸可通过多种方法进行修饰。微生物的核酸可通过物理方式进行修饰，例如以紫外光或电离辐射进行照射。电离辐射例如x射线或γ射线可用于引起核酸的单链或双链断裂。紫外照射可用于引起核酸中的嘧啶二聚体。如上所述通过评估辐射对复制和蛋白表达的影响，确定辐射的适合剂量。

还可以通过化学方式修饰李斯特菌的核酸，例如与核酸靶向的化合物(此处也称为靶向核酸的化合物)反应。在一些实施方式中，用可修饰核酸的核酸靶向的化合物处理李斯特菌，从而减弱李斯特菌的增殖。在一些实施方式中，用可修饰核酸的核酸靶向的化合物处理李斯特菌，从而减弱李斯特菌的增殖，其中李斯特菌群仍能够以足以引起免疫应答的程度表达所需蛋白抗原。核酸靶向的化合物不限于修饰核酸的具体机制。所述化合物通过下述方式修饰核酸：与核酸直接反应(即化合物的所有或一些部分与核酸共价结合)，或间接引起核酸的修饰(例如经由产生单线态氧或氧自由基引起氧损伤，通过产生引起损伤的化合物自由基，或通过还原或氧化核酸的其它机制)。烯二炔是可形成自由基物种并导致DNA双链断裂的一类化合物中的一个实例[Nicolaou等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5881-5888(1993)]。直接与核酸反应的化合物可以在该化合物被激活时，例如在对该化合物进行辐射时，进行反应。间接反应引起核酸修饰的化合物可需要相似的激活，从而产生该化合物的活性物种或产生一些其它活性物种。虽然不限制激活核酸靶向的化合物的方式，但本发明的一个实施方式包括使用光激活化合物，该光激活化合物可与核酸直接反应或产生活性物种例如活性氧族(例如单线态氧)，该活性氧族随后与核酸反应。

核酸靶向的化合物优选修饰核酸，而不显著地修饰生物样品的其它组分。所述化合物提供了对核酸的足够修饰，而不显著地改变或损害细胞膜、蛋白和脂类。这些化合物可对这些其它细胞组分进行程度不显著的修饰。如果这些细胞组分如细胞膜、蛋白和脂类的生物学功能足以得到保存，则它们未被显著改变。在以核酸靶向的化合物处理李斯特菌的情况中，核酸修饰使得李斯特菌的复制减弱，而李斯特菌的细胞膜、蛋白和脂类基本未受影响，从而李斯特菌具有基因表达活性(例如基因表达所需的酶未受显著影响)，并且李斯特菌表面基本保持与未受化合物处理的李斯特菌相同的抗原性。结果，由于李斯特菌的增殖足够地减弱但保持足以用作疫苗的抗原性或免疫原性，这种化合物可用于制备用作疫苗的灭活李斯特菌。由于该化合物特异性修饰核酸，因此可将修饰控制在所需水平，从而减弱复制并同时保持足够水平的蛋白表达。可通过改变反应的参数来控制修饰，例如化合物浓度、反应介质、控制化合物激活因子例如光剂量或pH，或通过控制氧浓度(物理方式如通过除气，或化学方式，使用氧清除剂)而控制引起氧损伤的化合物。核酸靶向的化合物是任何具有优选结合核酸的趋势，即具有可测定的对核酸的亲和力的化合物。这种化合物对核酸的亲和力比对生物样品中大多数其它组分的亲和力更强，其它组分尤其是诸如蛋白、酶、脂类和膜等组分。核酸靶向提供了对核酸修饰的特异性，而不显著地影响生物样品的其它组分，例如基因转录和蛋白翻译的机构。

化合物可以以多种模式靶向核酸。以下述模式或它们的组合进行结合的化合物被认为是核酸靶向的化合物。嵌插、小沟结合、大沟结合、静电结合(例如磷酸骨架结合)和序列特异性结合(经由大沟或小沟中的序列识别)都是与核酸的非共价结合模式。包含这些结合模式中的一种或多种的化合物对核酸有高亲和力。本发明不限于以下化合物，具有对核酸的这些结合模式的化合物的一些实例如下：以吖啶、吖啶酮、原黄素、吖黄素、放线菌素、蒽环酮、β-紫红霉素A、柔红霉素、噻吨酮、米来西D、安曲霉素、丝裂霉素、棘霉素、醌霉素、三骨霉素、二吖啶、椭圆烯(ellipticene)(包括二聚体、三聚体和类似物)、norphilin A、芴和芴酮、芴酮二胺、喹吖因、苯吖啶、吩嗪、啡啶、吩噻嗪、氯丙嗪、吩噁嗪、苯并噻唑、占吨和硫占吨、蒽酮、蒽吡唑、苯硫吡唑吲哚、3，4-苯并芘、苯并芘二醇环氧化物、1-并芘氧蒽、苯并蒽-5，6-氧化物、苯并二芘、苯并噻唑、喹诺酮、氯喹、奎宁、氨甲酰苯基喹啉、呋喃香豆素(例如补骨脂素、异补骨脂素及其硫类似物)、溴化乙锭盐、碘化丙啶、甲氧檗因、玫瑰树碱阳离子和衍生物、多环烃及其氧环衍生物和棘霉素为示例的嵌插剂；以远霉素、丝裂霉素、纺锤菌素、其它lexitropsin、Hoechst 33258和其它Hoechst染料、DAPI(4′，6′-二脒-2-苯基吲哚)、重氮氨苯脒乙酰甘氨酸盐和三酰基甲烷染料为示例的小沟结合剂；以黄曲霉素为示例的大沟结合剂；以精胺、亚精胺和其它多胺为示例的静电结合剂；和以通过诸如三螺旋形成、D-loop形成和与单链靶的直接碱基配对等序列特异性相互作用而结合的核酸或类似物为示例的序列特异性结合剂。其它序列特异性结合化合物包括多吡咯化合物、多吡咯咪唑化合物、环丙吡咯吲哚化合物和有关的小沟结合化合物[Wemmer，Nature Structural Biology，5(3)：169-171(1998)，Wurtz等人，Chemistry&Biology 7(3)：153-161(2000)，Anthoney等人，Am.J.Pharmacogenomics 1(1)：67-81(2001)]。

除了靶向核酸，所述化合物还能够与核酸反应，导致与核酸共价结合。核酸烷基化剂是一类能够与核酸共价反应的化合物，包括但不限于，芥子(例如单或双卤代乙胺基团，和单卤代乙基硫化物基团)、芥子等效物(例如环氧化物、α-卤代酮)和芥子中间体(例如氮丙啶、吖丙啶和其硫类似物)、甲烷磺酸酯和亚硝基尿素。核酸烷基化剂通常与核酸上的亲核基团反应。正是这些化合物的核酸烷基化活性和核酸靶向能力的联合赋予其与核酸特异性共价反应的能力，从而提供对本发明所用的李斯特菌核酸的所需修饰。通过使用不进入李斯特菌的淬灭剂，可以进一步增强这些化合物的特异性。这种淬灭剂可淬灭与李斯特菌表面的反应，同时使核酸靶向的化合物依然与李斯特菌核酸反应。对这种淬灭的论述可见于美国专利号6,270,952，通过引用将其公开内容并入本文。通过调节化合物浓度和反应条件，可以控制对李斯特菌核酸的修饰。通过评估其对上述复制和蛋白表达的影响，来确定适宜的浓度和反应条件。本发明中所用化合物的有效浓度为约10pM至10mM、还约100pM至1mM、还约1nM至10μM、还约1-500nM、还约1-200nM或约1-100nM。对被靶向的核酸，用于与核酸、特别是李斯特菌核酸特异性反应的核酸反应性化合物的论述见于美国专利6,143,490和6,093,725，通过引用将其公开内容并入本文。

可以利用需要通过辐射激活以引起核酸修饰的核酸靶向的化合物来修饰核酸。所述化合物靶向上述核酸。这些化合物包括，但不限于吖啶、吖啶酮、蒽基衍生物、咯嗪(例如核黄素)、苯并三唑衍生物、平面芳香重氮衍生物、平面芳香氰基衍生物、甲苯胺、黄素、吩噻嗪(例如亚甲基蓝)、呋喃香豆素、白芷素、补骨脂素、补骨脂素的含硫类似物、喹诺酮、喹啉、喹喔啉、二氮杂萘、氟代喹诺酮、蒽醌和蒽。这些化合物中的许多用作DNA光断裂剂[Da Ros等人，Current Pharmaceutical Design 7：1781(2001)]。虽然本发明不限制激活核酸靶向的化合物的方法，但通常可通过特定波长的光激活所述化合物。光的有效波长取决于化合物的性质并可以为大约200至1200nm范围的任何一处。对于这些化合物中的一些化合物，激活例如可通过在核酸附近产生活性氧族而引起对核酸的修饰，而不是化合物与核酸的直接结合。对于这些化合物中的一些化合物，激活导致化合物直接结合核酸(即化合物共价结合)。这些化合物中的一些化合物能够与核酸反应形成链间交联。补骨脂素是使核酸交联的一类化合物的实例。这些化合物通常由UVA光线激活(320-400nm)。可用于本发明的补骨脂素化合物在美国专利6,133,460和5,593,823中有所例举，通过引用将其公开内容并入本文。同样，正是核酸靶向和激活时修饰核酸的能力的联合提供了与核酸的特异反应性。通过调整化合物浓度、反应条件和光的剂量，可以控制李斯特菌核酸的修饰。通过评估其对以上详述的复制和蛋白表达的影响，可以确定合适的浓度和光的剂量。除了化合物浓度和光暴露水平，对样品给予UVA光的条件也影响反应。例如，照射缓冲培养基中李斯特菌群所需的总体浓度将随着生长培养基(例如BHI，Triptase Soy Broth)中生长的群而变化。光反应可受到生长培养基的内容物的影响，所述内容物可与补骨脂素相互作用，从而需要更高的补骨脂素的总体浓度。而且，李斯特菌的有效剂量给药可取决于生物体的生长阶段以及该生长阶段中化合物的有无。在一个实施方式中，在补骨脂素UVA处理期间，李斯特菌群包含生长培养基。在一个实施方式中，将补骨脂素加入李斯特菌群，对该群进行培养从而使李斯特菌在补骨脂素和生长培养基的存在下生长，并在李斯特菌的生长阶段中的某一点进行UVA处理。在一个实施方式中，在以适当剂量的UVA光照射之前，使所述群在补骨脂素存在下生长至OD为0.5-1(1x10⁷至1x10⁹CFU/mL)。补骨脂素化合物的有效浓度为约10pM至10mM、还约100pM至1mM、还约1nM至10μM、还约1-500nM、还约1-200nM或约1-100nM，UVA光剂量的范围为约0.1-100J/cm²、还约0.1-20J/cm²或约0.5-10J/cm²、0.5-6J/cm²或约2-6J/cm²。在一个实施方式中，在生长培养基的存在下对李斯特菌以浓度为约10pM至10mM、还约1-5000nM、还约1-500nM、还约5-500nM或约10-400nM补骨脂素进行处理。在一个实施方式中，经处理的李斯特菌在生长培养基的存在下在浓度为约10pM至10mM、还约1-5000nM、还约1-500nM、还约5-500nM或约10-400nM的补骨脂素的存在下生长至OD为0.5-1。生长至OD为0.5-1后，以剂量范围为约0.1-100J/cm²、还约0.1-20J/cm²或约0.5-10J/cm²、0.5-6J/cm²或约2-6J/cm²的UVA光对李斯特菌群进行照射。

在一些实施方式中，用于修饰李斯特菌的核酸的靶向核酸的化合物是烷基化剂，例如β-丙氨酸、N-(蒽-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙基酯。在其它实施方式中，用于修饰李斯特菌的核酸的靶向核酸的化合物是由UVA照射激活的补骨脂素化合物(例如，4′-(4-氨基-2-氧)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素，本文也称为“S-59”)。

在一个实施方式中，本发明包括制备疫苗组合物的方法，所述方法包括处理李斯特菌群从而修饰李斯特菌核酸，从而减弱李斯特菌群的增殖，其中李斯特菌基因表达实质上未受影响。在另一实施方式中，本发明包括制备疫苗组合物的方法，所述方法包括处理李斯特菌群从而修饰李斯特菌核酸，从而减弱李斯特菌群的增殖，其中李斯特菌基因表达实质上未受影响，随后利用李斯特菌群使抗原递呈细胞加载抗原并诱导抗原递呈细胞的激活/成熟。在一个实施方式中，李斯特菌群通过照射处理。在一个实施方式中，李斯特菌群通过与可间接引起核酸修饰的核酸靶向的化合物的反应而被处理。在另一个实施方式中，核酸靶向的化合物通过照射而激活，其中化合物的激活引起对核酸的间接修饰。在另一个实施方式中，核酸靶向的化合物的激活产生可修饰核酸的活性氧族。在一个实施方式中，李斯特菌群通过与可直接与核酸反应的核酸靶向的化合物反应而得到处理。在一个实施方式中，核酸靶向的化合物的反应浓度为约10pM至10mM、还约100pM至1mM、还约1-500nM、还约1-200nM或约1-100nM。在一个实施方式中，核酸靶向的化合物包括烷基化剂。在一个实施方式中，烷基化剂选自芥子、芥子中间体和芥子等效物。在一个实施方式中，核酸靶向的化合物包含选自嵌插剂、小沟结合剂、大沟结合剂、静电结合剂和序列特异性结合剂的靶向核酸基团。在一个实施方式中，核酸靶向的化合物在该化合物激活时与核酸直接反应。在一个实施方式中，化合物的激活通过照射进行。在一个实施方式中，所述照射是UVA照射。在优选的实施方式中，核酸靶向的化合物是通过UVA照射激活的补骨脂素化合物。在一个实施方式中，补骨脂素化合物的浓度为约10pM至10mM、还约100pM至1mM、还约1-500nM、还约1-200nM或约1-100nM，UVA照射剂量为约0.1-100J/cm²、还约0.1-20J/cm²或约0.5-5J/cm²或约2-4J/cm²。在一个实施方式中，李斯特菌群的增殖减弱至少约0.3个数量级、还至少约1个数量级、约2个数量级、约3个数量级、约4个数量级、约6个数量级或至少约8个数量级。在另一实施方式中，李斯特菌群的增殖减弱约0.3至＞10个数量级、约2至＞10个数量级、约4至＞10个数量级、约6至＞10个数量级、约0.3-8个数量级、约0.3-6个数量级、约0.3-5个数量级、约1-5个数量级或约2-5个数量级。在一个实施方式中，李斯特菌群的抗原的表达是未接受修饰核酸处理的李斯特菌群的抗原的表达的至少约10％、约25％、约50％、约75％或至少约90％。在一个实施方式中，所表达的抗原是来自抗原李斯特菌自身的抗原。在一个实施方式中，李斯特菌包含编码抗原的异源核酸序列。在一个实施方式中，抗原是疾病相关抗原。在一个实施方式中，抗原与选自传染病、自身免疫性疾病、过敏、癌症和其它过度增殖疾病的疾病有关。在一个实施方式中，抗原是肿瘤相关抗原。在一个实施方式中，肿瘤抗原选自分化抗原、组织特异性抗原、发育抗原、肿瘤相关病毒抗原、睾丸癌抗原、胚胎抗原、癌蛋白抗原、过表达蛋白抗原和突变蛋白抗原。在一个实施方式中，肿瘤抗原选自间皮素、Sp17、gp100、PR3、PAGE-4、TARP、WT-1、NY-ESO-1和SPAS-1。在一个实施方式中，李斯特菌包含基因突变。在一个实施方式中，基因突变导致李斯特菌修复被修饰的李斯特菌核酸的能力减弱。在一个实施方式中，取决于李斯特菌的属和种，基因突变位于选自phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrD和recA的基因中，或其功能等效基因中。在一个实施方式中，基因突变位于选自phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrD和recA的基因，或其功能等效基因中的一个或多个内。在一个实施方式中，基因突变导致选自PhrB、UvrA、UvrB、UvrC、UvrD和RecA的DNA修复酶活性减弱。在另一个实施方式中，对具有这些突变的李斯特菌以经UVA照射激活的补骨脂素进行处理。在一个实施方式中，所述李斯特菌是单核细胞增生性李斯特菌。在一个实施方式中，所述李斯特菌包含的突变导致李斯特菌侵入非吞噬细胞的能力减弱，而不显著地影响吞噬细胞对李斯特菌的摄取。在一个实施方式中，李斯特菌突变位于内化素基因中。在一个实施方式中，李斯特菌突变位于选自inlA、inlB和任何编码内化素的基因的基因中。在一个实施方式中，单核细胞增生性李斯特菌包含的基因突变位于inlA和inlB基因中。在一个实施方式中，李斯特菌包含的突变导致李斯特菌逃避受感染细胞的吞噬溶酶体的能力减弱。在一个实施方式中，李斯特菌突变位于hly基因。在一个实施方式中，李斯特菌包含的突变导致李斯特菌进行的肌动蛋白的聚合减弱。在优选的实施方式中，李斯特菌突变位于actA基因中。在一个实施方式中，李斯特菌包含的突变位于actA基因和一个或多个内化素基因中。在优选的实施方式中，李斯特菌包含的突变位于actA基因和inlB基因，优选李斯特菌包含actA/inlB缺失突变体。在优选的实施方式中，单核细胞增生性李斯特菌actA/inlB缺失突变体还包含uvrAB基因的缺失突变。

在一些实施方式中，可以通过靶向核酸的化合物来使李斯特菌减弱。在一些实施方式中，靶向核酸的化合物是核酸烷基化剂，例如β-丙氨酸、N-(蒽-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙基酯。在一些实施方式中，靶向核酸的化合物通过照射如UVA照射来激活。在一些实施方式中，对李斯特菌以补骨脂素化合物进行处理。例如，在一些实施方式中，对细菌通过补骨脂素例如4’-(4-氨基-2-氧)丁基-4，5’，8-三甲基补骨脂素(“S-59”)和UVA光处理进行修饰。在一些实施方式中，通过用补骨脂素化合物和UVA照射进行处理，而修饰细菌的核酸。美国专利公开号2004/0197343和Brockstedt等人，Nat.Med.，11：853-60(2005)中描述了利用靶向核酸的化合物修饰细菌从而减弱其增殖的方法。在一些实施方式中，李斯特菌在DNA修复方面减弱。

例如，为了处理李斯特菌例如ΔactAΔuvrAB单核细胞增生性李斯特菌，在一些实施方式中，在(大约)OD₆₀₀＝0.5的对数期培养物中加入S-59补骨脂素至200nM，然后当培养物达到1的光密度时以6J/m²的UVA光进行失活。通过改变S-59的浓度、UVA剂量、UVA处理前S-59的暴露时间以及改变李斯特菌actA/uvrAB株的细菌生长过程中的处理时间，可以优化失活条件。亲本李斯特菌株用作对照。通过细菌不能在BHI(脑心浸液)琼脂板上形成集落，可以确定李斯特菌的失活(对数杀死，log-kill)。而且，利用³⁵S-搀加-追踪实验确定S-59/UVA失活后新表达蛋白的合成和分泌，可以在S-59/UVA失活的李斯特菌中确认细菌中持续的代谢活性和蛋白例如LLO的表达。利用³⁵S-代谢标记的LLO的表达可以常规确定。S-59/UVA失活的李斯特菌actA/uvrAB可以在³⁵S-甲硫氨酸的存在下温育1小时。蛋白例如LLO的表达和/或分泌可通过全细胞裂解物和细菌培养液的TCA沉淀来确定。可利用LLO特异性单克隆抗体进行免疫沉淀从而核实失活后由重组李斯特菌持续进行的表达和分泌。

在一些实施方式中，增殖减弱的李斯特菌还在核酸修复方面减弱和/或在至少一种DNA修复酶方面有缺陷。例如，在一些实施方式中，其中核酸已被靶向核酸的化合物例如补骨脂素修饰(与UVA处理联合)的细菌是uvrAB缺失突变体。

在一些实施方式中，李斯特菌的增殖减弱至少约0.3个数量级、还至少约1个数量级、约2个数量级、约3个数量级、约4个数量级、约6个数量级或至少约8个数量级。在另一实施方式中，李斯特菌的增殖减弱约0.3至＞10个数量级、约2至＞10个数量级、约4至＞10个数量级、约6至＞10个数量级、约0.3-8个数量级、约0.3-6个数量级、约0.3-5个数量级、约1-5个数量级或约2-5个数量级。在一些实施方式中，李斯特菌进行的LLO的表达为未经修饰的李斯特菌中LLO的表达的至少约10％、约25％、约50％、约75％或至少约90％。

VI.药物组合物、免疫原性组合物和/或疫苗

本发明还提供了包含本文所述的李斯特菌的各种不同的组合物，例如药物组合物、免疫原性组合物和疫苗。在一些实施方式中，所述组合物是分离的。

如本文所用，“载体”包括任何的和所有的溶剂、分散介质、载质、包衣、稀释剂、抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮剂和胶体等。药学上可接受的载体是本领域普通技术人员公知的，包括任何在与活性成分组合时可使该成分保持生物学活性并且不与受试对象的免疫系统反应的材料。例如，药学上可接受的载体包括，但不限于水、缓冲盐溶液(例如，0.9％盐水)、乳液例如油/水乳液以及各种类型的湿润剂。可能的载体还包括，但不限于油(例如，矿物油)、右旋糖溶液、甘油溶液、白垩、淀粉、盐、甘油和明胶。

虽然任何本领域普通技术人员已知的适合载体均可用于所述药物组合物，但载体的类型随施用模式而变化。可配制本发明的组合物以用于任何适合的施用方式，包括：例如局部施用、口腔施用、经鼻施用、静脉内施用、颅腔内施用、腹膜内施用、皮下施用或肌肉内施用。在一些实施方式中，对于胃肠外施用，例如皮下注射，载体包括水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲剂。在一些实施方式中，任何上述载体或固体载体，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁均可用于口腔施用。

包含这些载体的组合物通过公知的常规方法配制(例如见，Remington′sPharmaceutical Sciences，18th edition，A.Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990；和Remington，The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing，2000)。

除了药物组合物，还提供了免疫原性组合物。例如，本发明提供了包含本文所述重组细菌的免疫原性组合物。

在一些实施方式中，免疫原性组合物中的重组细菌释放包含抗原的多肽，所述抗原的水平足以在所述组合物施用于宿主(例如，哺乳动物，例如人)时诱导针对所述抗原的免疫应答。在一些实施方式中，由免疫原性组合物所刺激的免疫应答是细胞-介导的免疫应答。在一些实施方式中，由免疫原性组合物所刺激的免疫应答是体液免疫应答。在一些实施方式中，由免疫原性组合物所刺激的免疫应答包括体液免疫应答和细胞-介导的免疫应答。

通过在体外或在模型系统中测试重组细菌刺激免疫应答的能力，可以确定特定形式的重组细菌(和/或特定表达盒)是否可用于免疫原性组合物(或用作疫苗)中。

可以通过体外和体内方法测定这些免疫细胞应答，从而确定特定重组细菌(和/或特定表达盒)的免疫应答是否有效。一种可能是测定已与重组细菌的群混合的抗原递呈细胞对令人感兴趣的蛋白或抗原的递呈。重组细菌可以与适合的抗原递呈细胞或细胞系如树突细胞混合，并测定由树突细胞向识别蛋白或抗原的T细胞进行的抗原递呈。如果重组细菌表达足够水平的蛋白或抗原，则其将被树突细胞加工为肽片段，并以MHC I类或II类的情况递呈至T细胞。为了检测所递呈的蛋白或抗原，可以使用对特定蛋白或抗原应答的T细胞克隆或T细胞系。T细胞还可以是T细胞杂交瘤，杂交瘤中T细胞通过与癌细胞系融合而永生化。所述T细胞杂交瘤、T细胞克隆或T细胞系可以包含CD8+或CD4+T细胞。取决于加工抗原的途径，树突细胞可以递呈至CD8+或CD4+T细胞。CD8+T细胞以MHC I类的方式识别抗原，而CD4+以MHC II类的方式识别抗原。T细胞通过其T细胞受体进行的特异性识别而受到所递呈的抗原刺激，导致产生某些蛋白，例如IL-2、肿瘤坏死因子-1(TNF-α)或干扰素-γ(IFN-γ)，这些蛋白可定量测定(例如，利用ELISA测试、ELISPOT测试或细胞内细胞因子染色(ICS))。这些技术在本领域中众所周知。

作为另一种选择，可以设计包含报告基因的杂交瘤，所述报告基因例如为β-半乳糖苷酶，在所递呈的抗原刺激T细胞杂交瘤时得到激活。β-半乳糖苷酶的生产的增加可通过其对底物(例如氯酚红-B-半乳糖苷)的活性来容易地进行测定，其导致颜色变化。可直接测定颜色变化作为特异性抗原递呈的指示剂。

本领域普通技术人员已知评估本发明的重组细菌疫苗的抗原表达的另外的体外和体内方法。还可以直接测定重组细菌进行的特定异源抗原的表达。例如，可以向细胞群中加入放射性标记的氨基酸，并确定结合到特定蛋白中的放射性的量。可以分离由细胞群所合成的蛋白，例如通过凝胶电泳或毛细管电泳进行分离，并定量测定放射性的量，从而评估特定蛋白的表达水平。作为另一种选择，可以表达不具有放射性的蛋白，并通过各种方法可视化，例如ELISA测试或凝胶电泳和蛋白质印迹，利用酶联抗体或荧光标记抗体进行检测。

Elispot测试、细胞内细胞因子染色测试(ICS)、测定受刺激脾脏细胞的细胞因子表达以及体外和体内评估细胞毒T细胞活性均是本领域技术人员已知的用于评估免疫原性的所有技术。

而且，通过向动物模型例如小鼠模型施用免疫原性组合物或疫苗，然后评估存活率或肿瘤生长，可以更直接地评估疫苗组合物的治疗效能。例如，可以在施用李斯特菌和侵袭之后测定存活率。

通过首先修饰肿瘤细胞从而使其表达令人感兴趣的抗原或模型抗原，然后将表达令人感兴趣的抗原的肿瘤细胞植入小鼠，从而可以产生用于测定表达特定抗原的免疫原性组合物或疫苗的免疫原性的小鼠模型。在小鼠中植入肿瘤细胞之前(用于检测备选组合物的预防效能)或植入肿瘤细胞之后(用于检测备选组合物的治疗效能)，可以以包含重组细菌的备选免疫原性组合物或疫苗接种小鼠，所述重组细菌表达含有令人感兴趣的抗原或模型抗原的多肽。

例如，可以利用本领域中的标准技术以适当的载体转染CT26小鼠鼠结肠癌细胞，所述载体含有编码所需抗原或模型抗原的表达盒。然后可以使用标准技术例如流式细胞术和蛋白质印迹来鉴定表达抗原或模型抗原的克隆，并且抗原或模型抗原的表达水平足以用于免疫原性和/或效能测试。

作为另一种选择，可以测试包含重组细菌的备选组合物，所述重组细菌表达的抗原对应于或衍生自肿瘤细胞系的内源抗原(例如，CT26小鼠鼠结肠癌细胞的内源逆转录病毒gp70肿瘤抗原AH1，或特殊变位表位AH1-A5)。在这种测试中，可将肿瘤细胞植入动物模型，而不进行进一步修饰，从而表达另外的抗原。然后可测试包含抗原的备选疫苗。

如所述，还提供了包含本文所述细菌的疫苗组合物。

在一些实施方式中，疫苗组合物包含已受到本文所述的任何重组细菌感染的抗原递呈细胞(APC)。在一些实施方式中，疫苗(或免疫原性或药物组合物)不含有抗原递呈细胞(即，疫苗或组合物是基于细菌的疫苗或组合物，而不是基于APC的疫苗或组合物)。

本领域中已知适合用于施用疫苗组合物(和药物组合物及免疫原性组合物)的施用方法，包括口腔、静脉内、皮内、腹膜内、肌肉内、淋巴内、鼻内和皮下途径施用。

疫苗制剂是本领域已知的，并且在一些实施方式中可以包括多种添加剂，例如防腐剂(例如，水杨乙汞、2-苯氧乙醇)、稳定剂、佐剂(例如氢氧化铝、磷酸铝、细胞因子)、抗生素(例如，新霉素、链霉素)和其它物质。在一些实施方式中，加入例如乳糖或谷氨酸一钠(MSG)等稳定剂以使疫苗制剂对各种条件，例如温度变化或冷冻干燥过程稳定。在一些实施方式中，疫苗制剂还可以含有悬浮液或稀释剂，例如无菌水、盐水或等渗缓冲盐水(例如，缓冲至生理pH的磷酸盐)。疫苗还可以包含少量来自制造过程的残余材料。

例如，在一些实施方式中，疫苗组合物被冻干(即，冷冻干燥)。施用前，可以将冻干制品与无菌溶液(例如，柠檬酸盐-碳酸氢盐缓冲液、经缓冲的水或0.4％盐水等)结合。

在一些实施方式中，疫苗组合物可以进一步含有本领域中已知可改善针对疫苗的免疫应答的附加组分，例如佐剂或共刺激分子。除了以上所列的之外，可能的佐剂包括趋化因子和细菌核酸序列，如CpG。在一些实施方式中，疫苗包含可改善针对疫苗的免疫应答的抗体，例如CTLA4。在一些实施方式中，共刺激分子包括选自GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-14、IL-15、IL-18、B7.1、B7.2和B7-DC的一种或多种因子，所述因子可选包含在本发明的疫苗组合物中。本领域普通技术人员已知其它共刺激分子。

在另外的方面，本发明提供了改善包含表达抗原的李斯特菌的疫苗或免疫原性组合物的方法。

还提供了本发明的重组李斯特菌、免疫原性组合物或疫苗的制备方法。例如，在一个实施方式中，含有重组细菌(例如重组李斯特菌属细菌)的疫苗的制备方法包括在细菌中引入重组核酸分子，其中该重组核酸分子编码抗原。在一些情况下，重组李斯特菌含有PrfA^*突变。在其它情况中，重组李斯特菌含有无效prfA等位基因。在该情况下，基因工程化的prfA^*等位基因整合在李斯特菌基因组中；例如整合在tRNA^arg基因中(Port，G.C.和Freitag，N.E.(2007)Infect.Immunity 75：5886-5897)。在一些实施方式中，与PrfA应答调控元件可操纵地连接的重组多核苷酸引入到重组PrfA^*细菌中，其中所述重组多核苷酸编码抗原。在一些实施方式中，为了产生疫苗，在PrfA^*细菌中引入包含(a)编码信号肽的第一多核苷酸和(b)编码抗原的第二多核苷酸的重组核酸分子，其中第二多核苷酸的翻译阅读框与第一多核苷酸相同，其中所述重组核酸分子编码含有信号肽和抗原的融合蛋白，并且其中融合蛋白可操纵地连接于PrfA应答调控元件。用于产生疫苗的重组核酸分子在一些实施方式中是含有(a)编码李斯特菌ActA、ActA片段或其变体的第一多核苷酸和(b)编码多肽的第二多核苷酸的重组核酸分子，其中第二多核苷酸的翻译阅读框与第一多核苷酸相同，其中所述重组核酸分子编码蛋白嵌合体，所述蛋白嵌合体中非李斯特菌多肽与ActA、ActA片段或其变体融合，或插入在ActA、ActA片段或其变体中。

VII.应用方法

提供了应用本文所述的李斯特菌或药物组合物、免疫原性组合物或疫苗组合物的各种方法，用以诱导免疫应答和/或预防或治疗宿主(例如哺乳动物)的状态。在一些实施方式中，所治疗或预防的状态是疾病。在一些实施方式中，所述疾病是癌症。在一些实施方式中，所述疾病是传染病。

如本文所用，(对于状态或疾病)的“治疗”(“treatment”或“treating”)涵盖了用于获得有益结果或所需结果的方法。在优选的实施方式中，这些结果包括临床结果。对于本发明的目的，关于疾病的有益结果或所需结果可包括，但不限于以下情况中的一种或多种：改善疾病相关的状态、治愈疾病、减少疾病的严重性、延缓疾病进展、减轻疾病相关的一个或多个症状、提高患病患者的生命质量、和/或延长生存。类似地，对于本发明的目的，关于状态的有益结果或所需结果可包括，但不限于以下情况中的一种或多种：改善状态、治愈状态、减少状态的严重性、延缓状态进展、减轻状态相关的一个或多个症状、提高患有状态个体的生命质量、和/或延长生存。例如，在使用本文所述组合物治疗癌症的那些实施方式中，有益结果或所需结果可包括，但不限于以下情况中的一种或多种：减少肿瘤细胞或癌细胞增殖(或破坏肿瘤细胞或癌细胞)、降低癌症中发现的肿瘤细胞的转移、缩小肿瘤的大小、减少癌症所导致的症状、提高癌症患者的生命质量、减少治疗疾病所需的其它药物的剂量、延缓癌症的进展和/或延长癌症患者的生存。

如本文所用，术语“预防”疾病或“保护宿主免于”疾病(在本文中可互换使用)涵盖但不限于以下情况中的一种或多种：停止、推迟、阻碍、减缓、延迟和/或延缓疾病的发作或进展，稳定疾病的进展，和/或延滞疾病的发展。术语“预防”状态或“保护宿主免于”状态(在本文中可互换使用)涵盖但不限于以下情况中的一种或多种：停止、推迟、阻碍、减缓、延迟和/或延缓状态的发作或进展，稳定状态的进展，和/或延滞状态的发展。取决于疾病或状态的历史和/或所治疗的个体，这种预防的时期可以具有各种时间长度。例如，当疫苗经设计可预防由病原体所致的传染病或保护免于由病原体所致的传染病时，术语“预防”疾病或“保护宿主免于”疾病涵盖但不限于以下情况中的一种或多种：停止、推迟、阻碍、减缓、延迟和/或延缓宿主的病原体引起的感染、宿主的病原体引起的感染的进展或与病原体对宿主的感染相关的疾病的发作或进展和/或稳定与病原体对宿主的感染相关的疾病的进展。又例如，当疫苗为抗癌疫苗时，术语“预防”疾病或“保护宿主免于”疾病涵盖但不限于以下情况中的一种或多种：停止、推迟、阻碍、减缓、延迟和/或延缓癌症的发展或转移、癌症的进展或癌症的复发。

在一方面，本发明提供了诱导宿主(例如，哺乳动物)中针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括对宿主施用有效量的本文所述的细菌或有效量的包含本文所述的细菌的组合物(例如，药物组合物、免疫原性组合物或疫苗)。

在一些实施方式中，所述免疫应答是MHC I类免疫应答。在其它实施方式中，所述免疫应答是MHC II类免疫应答。在又一些实施方式中，通过施用细菌或组合物而诱导的免疫应答是MHC I类和MHC II类应答。因此，在一些实施方式中，免疫应答包括CD4+T细胞应答。在一些实施方式中，免疫应答包括CD8+T细胞应答。在一些实施方式中，免疫应答同时包括CD4+T细胞应答和CD8+T细胞应答。在一些实施方式中，免疫应答包括B细胞应答和/或T-细胞应答。利用本领域普通技术人员已知的方法，通过确定应用的针对抗原的抗体的滴度，可以测定B细胞应答。在一些实施方式中，由本文所述组合物诱导的免疫应答是体液应答。在其它实施方式中，所诱导的免疫应答是细胞免疫应答。在一些实施方式中，免疫应答同时包括细胞免疫应答和体液免疫应答。在一些实施方式中，免疫应答具有抗原特异性。在一些实施方式中，免疫应答是抗原特异性T细胞应答.

除了提供诱导免疫应答的方法，本发明还提供了预防或治疗宿主(例如，哺乳动物受试对象，例如人类患者)的状态或疾病的方法。所述方法包括对宿主施用有效量的本文所述的细菌或含有本文所述细菌的组合物。在一些实施方式中，所述疾病是癌症。在一些实施方式中，所述疾病是传染病。

在一些实施方式中，所述疾病是癌症。在一些实施方式中，当所治疗或预防的状态是癌症时，所述疾病是黑色素瘤、乳癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、结肠直肠癌、肺癌、脑癌、睾丸癌、卵巢癌、鳞状细胞癌、胃肠癌、宫颈癌、肾癌、甲状腺癌或前列腺癌。在一些实施方式中，癌症是黑色素瘤。在一些实施方式中，癌症是胰腺癌。在一些实施方式中，癌症是结肠癌。在一些实施方式中，癌症是前列腺癌。在一些实施方式中，癌症是转移癌。

在其它实施方式中，疾病是传染病或例如病毒、细菌、真菌或原生动物等病原体引起的另一种疾病。在一些实施方式中，疾病是传染病。

在一些实施方式中，李斯特菌在癌症的预防或治疗中的应用包括向个体的免疫系统的细胞输送李斯特菌，从而预防或治疗存在的癌症或具有例如环境暴露和/或家族素因等增高的风险因素的个体输送李斯特菌。在其它实施方式中，该细菌在癌症的预防或治疗中的应用包括向已去除肿瘤的个体或过去患有癌症但现在已经好转的个体输送细菌。

在一些实施方式中，向宿主施用包含本文所述的细菌的组合物引发宿主的CD4+T细胞应答。在其它一些实施方式中，向宿主施用包含本文所述的细菌的组合物引发宿主的CD8+T细胞应答。在一些实施方式中，向宿主施用包含本文所述的细菌的组合物同时引发宿主的CD4+T细胞应答和CD8+T细胞应答。

可以在个体(例如在小鼠中)中评价用于治疗状态的疫苗或其它组合物的效能。小鼠模型被认为是用于人类中效能的模型，并可用于评估和限定本发明的疫苗。利用小鼠模型证明在任何个体中的疫苗有效性的潜能。可评价疫苗提供针它们对具体疾病的预防或治疗效果的能力。例如，在传染病的情况下，可以对小鼠群接种所需量的适合的本发明的疫苗，所述疫苗中细菌表达传染病相关的抗原。随后可使小鼠感染与疫苗抗原有关的传染剂，并对抵抗感染的保护进行评估。可以观察相对于对照群(未进行接种，或者仅接种了载质或不含适合抗原的细菌)的传染病进展。

在癌疫苗的情况中，可用的有肿瘤细胞模型，在该模型中可在接种包含本发明的含有所需肿瘤抗原的细菌的组合物之前(治疗模型)或之后(预防模型)，向小鼠群注射表达所需肿瘤抗原的肿瘤细胞系。可以将以包含肿瘤抗原的细菌进行的接种与未接种的、以载质或表达不相关抗原的细菌接种的对照群进行比较。对于作为肿瘤注射后时间的函数的肿瘤体积，或作为肿瘤注射后时间的函数的存活群而言，可以来评估所述模型中疫苗的有效性。在一个实施方式中，接种有包含细菌的组合物的小鼠中的肿瘤体积比未接种的、以载质或表达不相关抗原的细菌接种的小鼠中的肿瘤体积小约5％、约10％、约25％、约50％、约75％、约90％或约100％。在另一实施方式中，肿瘤体积的这种差异在肿瘤植入小鼠后至少约10、约17或约24天可观察到。在一个实施方式中，接种有包含细菌的组合物的小鼠的中位存活时间比未接种的、以载质或表达不相关抗原的细菌接种的小鼠长至少约2、约5、约7或至少约10天。

本文所述的方法中的宿主(即受试对象)是任何脊椎动物，优选为哺乳动物，包括家畜、比赛用动物和包括人在内的灵长类动物。在一些实施方式中，宿主是哺乳动物。在一些实施方式中，宿主是人。

可通过任何适合方法输送李斯特菌或包含所述株的组合物，例如皮内、皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内、淋巴内、口腔或鼻内，以及通过任何指定的恶性病或传染病或其它状态的任何相关途径。在一些实施方式中，施用方法是粘膜施用。

包含细菌的组合物和免疫刺激剂可以同时、顺序地或分开地施用于宿主。免疫刺激剂的实例包括，但不限于IL-2、IL-12、GMCSF、IL-15、B7.1、B7.2和B7-DC和IL-14。

如本文所用，细菌或组合物(例如药物组合物或免疫原性组合物)的“有效量”是足以产生有益结果或所需结果的量。对于预防应用，有益结果或所需结果包括的结果例如有：消除或降低疾病的风险、减轻疾病的严重性或延滞疾病的开始，包括疾病的生化、组织学和/或行为症状，其并发症和疾病发展期间存在的中间病理表型。对于治疗应用，有益结果或所需结果包括的临床结果例如有：抑制或压制疾病、减少疾病带来的一个或多个症状(生化、组织学和/或行为症状)，包括其并发症和疾病发展期间存在的中间病理表型，提高那些患病者的生命质量、减少治疗疾病所需的其它药物的剂量、增强另一药物的效果、延滞疾病的进展和/或延长患者的生存。有效量可以在一次或多次施用中施用。为了本发明的目的，药剂、化合物或药物组合物的有效量是足以直接或间接完成预防或治疗的量。在临床环境中可以理解的是，药剂、化合物或药物组合物的有效量可以与或可以不与另一种药剂、化合物或药物组合物联合实现。因此，可以在施用一种或多种治疗剂的情况下考虑有效量，并且如果在与一种或多种其它试剂联合时可以取得或取得了所需结果，则可以考虑给予有效量的单一试剂。

在一些实施方式中，对于癌症的治疗，有效量包括可引起所需免疫应答的量，其中所述免疫应答减慢所靶向的肿瘤的生长，减小肿瘤的大小或优选完全消除肿瘤。疫苗的施用可以以适当的间隔重复进行，并且可以同时施用于所接种个体的多个不同位点。在一些实施方式中，对于癌症的预防性处理，有效量包括可引起保护性免疫应答从而使个体发生癌症的可能性显著降低的剂量。接种治疗方案可以由单剂量组成，或可以以适当的间隔重复进行直到建立保护性免疫应答。

本发明涵盖了引发免疫应答的方法，特别是涵盖了引发加强免疫应答的方法，包括针对存在于对哺乳动物施用的初免疫苗中的靶抗原的增强的加强应答。靶抗原可以是与疾病状态相关的抗原，例如，经鉴定存在于癌细胞或致病剂上的那些抗原。在有效剂量的初免疫苗之后，施用包含代谢活性减弱的PrfA^*李斯特菌的第二疫苗，所述PrfA^*李斯特菌编码并表达靶抗原的免疫活性部分。本发明的方法中，通过对哺乳动物施用有效剂量的初免疫苗从而引起初始免疫应答。除了PrfA^*李斯特菌之外的初免疫苗不含有编码靶抗原的代谢活性的李斯特菌。初免疫苗可含有靶抗原本身，例如带有或不带有佐剂的蛋白、肿瘤细胞裂解物、经辐射的肿瘤细胞、以靶抗原的肽致敏的抗原递呈细胞(例如树突细胞)，或者其可以含有可提供靶抗原的试剂。适合提供靶抗原的试剂包括重组载体，例如细菌、病毒和裸DNA。重组载体利用本领域中已知的标准技术制备，并且含有适合的控制原件，该控制原件与编码靶抗原的核苷酸序列可操纵地连接。例如见，Plotkin等人(eds.)(2003)Vaccines，4th ed.，W.B.Saunders，Co.，Phila.，PA.；Sikora等人(eds.)(1996)Tumor Immunology Cambridge University Press，Cambridge，UK；Hackett和Harn(eds.)Vaccine Adjuvants，Humana Press，Totowa，NJ；Isaacson(eds.)(1992)Recombinant DNA Vaccines，Marcel Dekker，NY，NY；Morse等人(eds.)(2004)Handbook of Cancer Vaccine s，Humana Press，Totowa，NJ)，Liao等人(2005)Cancer Res.65：9089-9098；Dean(2005)Expert Opin.Drug Deliv.2：227-236；Arlen等人(2003)Expert Rev.Vaccines 2：483-493；Dela Cruz等人(2003)Vaccine 21：1317-1326；Johansen等人(2000)Eur.J.Pharm.Biopharm.50：413-417；Excler(1998)Vaccine 16：1439-1443；Disis等人(1996)J.Immunol.156：3151-3158)。对肽疫苗有所描述(例如见McCabe等人(1995)Cancer Res.55：1741-1747；Minev等人(1994)Cancer Res.54：4155-4161；Snyder等人(2004)J.Virology 78：7052-7060。

病毒来源的载体包括病毒、经修饰病毒和病毒颗粒。可以将病毒来源的载体直接施用于哺乳动物受试对象，也可以将其在体外引入抗原递呈细胞(APC)，随后将该APC施用于受试对象。

表达载体可以基于，例如披膜病毒，包括α病毒和黄病毒；α病毒，例如辛德贝斯病毒、辛德贝斯株SAAR86、塞姆利基森林病毒(SFV)、委内瑞拉马脑炎(VEE)、东方马脑炎病毒(EEE)、西方马脑炎病毒、罗斯河病毒、雅美病毒、阿尼昂尼昂病毒、高原J病毒。黄病毒，例如黄热病毒、黄热株17D、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、库京病毒(西尼罗河病毒的亚型)；动脉炎病毒，例如马动脉炎病毒；和风疹病毒(rubivirus)，例如风疹病毒(rubella virus)、疱疹病毒、经修饰的安卡拉痘苗(MVA)；禽痘载体；鸟痘载体；疫苗病毒载体；流感病毒载体；腺病毒载体、人乳头瘤病毒载体；牛乳头瘤病毒载体等等。病毒载体可以基于正痘病毒，例如天花病毒(天花痘)，痘病毒(天花痘)，安卡拉病毒(MVA)或哥本哈根株，骆驼痘、猴痘或牛痘。病毒载体可以基于禽痘病毒类病毒，例如鸟痘病毒或金丝雀痘病毒。病毒载体可以基于水疱性口炎病毒(VSV)或黄热病毒(YFV)。

可使用的有：腺病毒载体和腺相关病毒载体(AAV)，此处腺病毒载体包括腺病毒血清型5(腺5；Ad5)、腺6、腺11、腺26和腺35。可使用的有至少约51种人腺病毒血清型，分为6个亚类(亚类A、B、C、D、E和F)。腺病毒蛋白，例如可用于评估针对“空”腺病毒载体的免疫应答的腺病毒蛋白包括六邻体蛋白，例如六邻体3蛋白、纤维蛋白和五邻体类蛋白，针对腺病毒蛋白的人免疫应答已经有所描述(例如见Wu等人(2002)J.Virol.76：12775-12782；Mascola(2006)Nature 441：161-162；Roberts等人(2006)Nature441：239-243)。

抗原递呈细胞(APC)载体，例如树突细胞(DC)载体包括加载有抗原的细胞、加载有肿瘤裂解物的细胞或转染有含核酸的组合物的细胞，其中所述核酸可以是例如质粒、mRNA或病毒。还可以使用DC/肿瘤融合疫苗。例如见Di Nicola等人(2004)Clin.Cancer Res.10：5381-5390；Cerundolo等人(2004)Nature Immunol.5：7-10；Parmiani等人(2002)J.Natl.Cancer Inst.94：805-818；Kao等人(2005)Immunol.Lett.101：154-159；Geiger等人(2005)J.Transl.Med.3：29；Osada等人(2005)Cancer Immunol.Immunother.Nov.5，1-10[印刷前电子出版]；Malowany等人(2005)Mol.Ther.13：766-775；Morse和Lyerly(2002)World J.Surg.26：819-825；Gabrilovich(2002)Curr.Opin.Mol.Ther.4：454-458；Morse等人(2003)Clin.Breast Cancer 3 Suppl.4：S164-S172；Morse等人(2002)Cancer Chemother.Biol.Response Modif.20：385-390；Arlen等人(2003)Expert Rev.Vaccines 2：483-493；Morse和Lyerly(1998)Expert Opin.Investig.Drugs 7：1617-1627；Hirschowitz等人(2004)J.Clin.Oncol.22：2808-2815；Vasir等人(2005)Br.J.Haematol.129：687-700；Koido等人(2005)Gynecol.Oncol.99：462-471。

可用作疫苗的有肿瘤细胞，例如自体肿瘤细胞和异体肿瘤细胞(Arlen等人(2005)Semin.Oncol.32：549-555)。疫苗还可以含有经修饰的肿瘤细胞，例如，肿瘤细胞裂解物或经照射的肿瘤细胞。还可以通过导入编码分子的核酸来修饰肿瘤细胞，所述分子例如有细胞因子(GM CSF、IL 12和IL 15等)、NKG2D配体、CD40L、CD80和CD86等(例如见Dranoff(2002)Immunol.Rev.188：147-154；Jain等人(2003)Ann.Surg.Oncol.10：810-820；Borrello和Pardoll(2002)Cytokine Growth Factor Rev.13：185-193；Chen等人(2005)Cancer Immunol.Immunother.27：1-11；Kjaergaard等人(2005)J.Neurosurg.103：156-164；Tai等人(2004)J.Biomed.Sci.11：228-238；Schwaab等人(2004)J.Urol.171：1036-1042；Friese等人(2003)Cancer Res.63：8996-9006；Briones等人(2002)Cancer Res.62：3195-3199；Vieweg和Dannull(2003)Urol.Clin.North Am.30：633-643；Mincheff等人(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.39：125-132)。

疫苗可包括裸DNA载体和裸RNA载体。这些含有核酸的疫苗可通过基因枪、电穿孔、细菌影膜(bacterial ghost)、微球、微粒、脂质体和聚阳离子纳米颗粒等进行施用(例如见Donnelly等人(1997)Ann.Rev.Immunol.15：617-648；Mincheff等人(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.39：125-132；Song等人(2005)J.Virol.79：9854-9861；Estcourt等人(2004)Immunol.Rev.199：144-155)。

通过例如基因枪、皮内、肌肉内和电穿孔法施用裸核酸的试剂和方法是已有的。核酸疫苗可包括锁核酸(LNA)，其中LNA使功能性部分与质粒DNA结合，并且其中所述功能性部分可以是佐剂(例如见Fensterle等人(1999)J.Immunol.163：4510-4518；Strugnell等人(1997)Immunol.Cell Biol.75：364-369；Hertoughs等人(2003)Nucleic Acids Res.31：5817-5830；Trimble等人(2003)Vaccine 21：4036-4042；Nishitani等人(2000)Mol.Urol.4：47-50；Tuting(1999)Curr.Opin.Mol.Ther.1：216-225)。可以将核酸疫苗与试剂联合使用，所述试剂为促进未成熟树突细胞向疫苗迁移的试剂，和促进成熟DC向可发生初免的引流淋巴结迁移的试剂，其中这些试剂涵盖了MIP 1α和Flt3L(例如见Kutzler和Weiner(2004)J.Clin.Invest.114：1241-1244；Sumida等人(2004)J.Clin.Invest.114：1334-1342)。

细菌载体包括：例如沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏、乳杆菌、链球菌、结核活菌苗、炭疽杆菌和大肠杆菌。细菌可以工程化以含有编码重组抗原、异源抗原或源自肿瘤、癌细胞的抗原或者传染剂的核酸。而且，可对细菌进行修饰以减毒。在另一方面，非李斯特菌属细菌疫苗可不含有任何编码重组抗原的核酸(例如见Xu等人(2003)Vaccine 21：644-648；Pasetti等人(2003)J.Virol.77：5209-5219；Loessner和Weiss(2004)Expert Opin.Biol.Ther.4：157-168；Grangette等人(2002)Vaccine 20：3304-3309；Byrd等人(2002)Vaccine20：2197-2205；Edelman等人(1999)Vaccine 17：904-914；Domenech等人(2005)Microbes and Infection 7：860-866)。

本领域技术人员可确定以一剂量或多剂量疫苗所供应的初免载体或加强载体的有效量。这一量将落入可经过常规试验确定的范围内。

初免疫苗和加强疫苗可通过下述途径中的任何一种或途径的组合来施用。在一方面，初免疫苗和加强疫苗通过相同途径施用。在另一方面，初免疫苗和加强疫苗通过不同途径施用。术语“不同途径”涵盖但不限于身体的不同位点，例如，口腔、非口腔、经肠、胃肠外、直肠、结内(淋巴结内)、静脉内、动脉、皮下、肌肉内、肿瘤内、肿瘤周围、肿瘤内、注输、粘膜、鼻、脑脊空间内或脑脊液内等位点，以及通过不同模式，例如口腔、静脉内和肌肉内。

有效量的初免或加强疫苗可以以一剂量给予，但不限于一剂量。因此，所述施用可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次施用疫苗。当疫苗的施用超过1次时，施用间距的时间间隔可以为1分钟、2分钟、3、4、5、6、7、8、9、10或更多分钟，间隔约1小时、2小时、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时，等等。对于小时，术语“约”是指加或减30分钟以内的任何时间间隔。施用的间隔时间还可以为1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天及其组合。本发明不限于时间均等分隔的给药间隔，而涵盖了不均等间隔的给药，例如初免计划表由在1天、4天、7天和25天的施用组成，这仅为了提供一个不具限制性的例子。

在确定初免疫苗和加强疫苗的相对时机时可以考虑以下情况。已经发现施用抗原或编码抗原的核酸可刺激抗原特异性免疫细胞的扩增，导致峰值，然后抗原特异性免疫细胞数量缩小(例如见Badovinac等人(2002)Nature Immunol.3：619-626)。加强接种的启动施用可以在达到峰值之前、同时或之后进行。

当抗原特异性免疫细胞的群已扩增(数量增加)达到最终获得抗原特异性免疫细胞最大数量的至少约20％时，达到最终获得抗原特异性免疫细胞最大数量的至少约30％；至少约40％；至少约50％；至少约60％；至少约70％；至少约80％；至少约90％；至少约95％；至少约99％时，启动加强接种的施用。可用的有另外的初免加强疫苗方案，例如，当抗原特异性细胞的群缩减至小于抗原特异性细胞最大数量的90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于1.0％、小于0.5％、小于0.1％、小于0.05％或小于0.01％时，可以启动加强接种。抗原特异性细胞可以鉴定为具有对载体特异性抗原的特异性(对空载体的特异性)，或具有对该载体所含核酸表达的异源抗原的特异性。

在其它方面，可以在初免接种启动后的约5天、在初免接种启动后的约10天、约15天、约20天、约25天、约30天、约35天、约40天、约45天、约50天、约55天、约60天、约65天、约70天、约75天、约80天、约6个月和初免接种的施用启动后约1年启动加强接种的施用。

加强接种可以在初免接种后5-10天；初免接种后10-15天；初免接种后15-20天；初免接种后20-25天；初免接种后25-30天；初免接种后30-40天；初免接种后40-50天；初免接种后50-60天；初免接种后60-70初天；等等时间处施用。

本领域技术人员可以确定初免接种启动和加强接种启动之间的时间段。例如，可以基于对在初免免疫发生后测定的生理参数敏感的算法。

可以确定用量和治疗方案，剂量和治疗方案至少部分地通过模态的效能、所采用的疫苗输送、受试对象的要求确定，并取决于有经验医师的判断。

例如，可以以剂量或用量施用本发明所用疫苗中的PrfA^*李斯特菌，其中每一剂量包含10⁷和10⁸之间李斯特菌每70kg体重；2x10⁷和2x10⁸之间李斯特菌每70kg体重；5x10⁷和5x10⁸之间李斯特菌每70kg体重；10⁸和10⁹之间李斯特菌每70kg体重；2.0x10⁸和2.0x10⁹之间李斯特菌每70kg；5.0x10⁸和5.0x10⁹之间李斯特菌每70kg；10⁹和10¹⁰之间李斯特菌每70kg；2x10⁹和2x10¹⁰之间李斯特菌每70kg；5x10⁹和5x10¹⁰之间李斯特菌每70kg；10¹¹和10¹²之间李斯特菌每70kg；2x10¹¹和2x10¹²之间李斯特菌每70kg；5x10¹¹和5x10¹²之间李斯特菌每70kg；10¹²和10¹³之间李斯特菌每70kg；2x10¹²和2x10¹³之间李斯特菌每70kg；5x10¹²和5x10¹³之间李斯特菌每70kg等净重。还提供了基于每1.7平方米表面积计或根据1.5kg肝脏重量计的上述各剂量。施用本发明的李斯特菌时需要注意的是，小鼠肝脏重约1.5克，人肝脏重约1.5千克。

在本发明一些实施方式中，PrfA^*李斯特菌的加强剂量可使初免剂量免疫应答增强至少约2倍，有时在约3和5倍或5倍和10倍之间，或从10倍至100倍或更大。在本发明一些实施方式中，初免剂量和加强剂量对免疫应答具有协调效应。在本发明一些实施方式中，增强的免疫应答包括T细胞应答，而在一些实施方式中，T细胞应答可以是CD8+T细胞应答。在本发明一些实施方式中，初免剂量和加强剂量将打破哺乳动物对靶抗原的耐受状态。下文提供了所有这些实施方式的实施例。

通过施用可调控免疫系统的试剂，能够治疗和/或抑制癌症和感染。本发明所涵盖的初免-加强方法可导致上调的免疫应答，并且包括打破对自身抗原的耐受。因此，可预期这些初免-加强方法可用于抑制癌症的生长和/或减轻与癌症相关的一个或多个症状。还可以预期初免-加强方法可用于预防和/或治疗由致病剂引起的疾病。

除了以上情况，还可以利用这些治疗方案确定哺乳动物是否会对治疗有应答。例如，当使用了针对特异性抗原的初免-加强治疗方案时，加强后不能获得显著的免疫应答表明哺乳动物对靶抗原不应答，应继续找寻替代性治疗模式。其实例可能是：癌症或致病剂的遗传背景为不存在靶抗原，或者靶抗原经修饰后而与靶抗原无交叉反应性。

在一些实施方式中，对个体的癌症的治疗可以是对已诊断患癌症的个体开始的初始治疗，或可以与其它治疗联合使用。例如，对已通过外科手术去除肿瘤的个体或已接受放疗或化疗的个体可以用疫苗进行治疗，从而减少或消除个体中任何残余的肿瘤，或降低癌症复发的风险。在一些实施方式中，对个体的癌症的预防可以对由于环境情况或遗传素因而患某些癌症的风险增加的个体开始。

给予宿主的药物组合物或疫苗的用量根据宿主的物种、宿主的大小和宿主的状态或疾病而变化。组合物的用量还取决于组合物的施用频率和施用途径。确切用量由各医师根据所治疗的患者而选择。

在一些实施方式中，包含本文所述的李斯特菌的药物组合物、免疫原性组合物或疫苗的单剂量含有约10²至约10¹²的细菌生物体。在另一实施方式中，单剂量含有约10⁵至约10¹¹的细菌生物体。在另一实施方式中，单剂量含有约10⁶至约10¹¹的细菌生物体。在又一实施方式中，单剂量的药物组合物或疫苗含有约10⁷至约10¹⁰的细菌生物体。在又另一实施方式中，单剂量的药物组合物或疫苗含有约10⁷至约10⁹的细菌生物体。

本发明的李斯特菌在一些实施方式中以剂量或用量施用，其中各剂量包含至少约1000李斯特菌单位/kg体重、至少约10,000李斯特菌单位/kg体重、至少约100,000李斯特菌单位/kg体重、至少约1百万李斯特菌单位/kg体重或至少约1千万李斯特菌单位/kg体重。本发明提供的上述剂量中，所述李斯特菌单位是集落形成单位(CFU)、补骨脂素处理前的CFU的当量，或所述单位是李斯特菌细胞的数量。在一些实施方式中，经测定的减毒李斯特菌的有效量含有至少约1x10³CFU/kg或至少约1x10³李斯特菌细胞/kg。在一些实施方式中，经测定的减毒李斯特菌的有效量含有至少约1x10⁵CFU/kg或至少约1x10⁵李斯特菌细胞/kg。在某些实施方式中，经测定的减毒李斯特菌的有效量含有至少约1x10⁶CFU/kg或至少约1x10⁶李斯特菌细胞/kg。在一些实施方式中，经测定的减毒李斯特菌的有效量含有至少约1x10⁷CFU/kg或至少约1x10⁷李斯特菌细胞/kg。在其它一些实施方式中，经测定的减毒李斯特菌的有效量含有至少约1x10⁸CFU/kg或至少约1x10⁸李斯特菌细胞/kg。

在一些实施方式中，单剂量的包含本文所述的李斯特菌的药物组合物、免疫原性组合物或疫苗含有约1CFU/kg至约1x10¹⁰CFU/kg(CFU＝集落形成单位)。在一些实施方式中，单剂量的组合物含有约10CFU/kg至约1x10⁹CFU/kg。在另一实施方式中，单剂量的组合物或疫苗包含约1x10²CFU/kg至约1x10⁸CFU/kg。在又一实施方式中，单剂量的组合物或疫苗包含约1x10³CFU/kg至约1x10⁸CFU/kg。在又一实施方式中，单剂量的组合物或疫苗包含约1x10⁴CFU/kg至约1x10⁷CFU/kg。在一些实施方式中，单剂量的组合物包含至少约1CFU/kg。在一些实施方式中，单剂量的组合物包含至少约10CFU/kg。在另一实施方式中，单剂量的组合物或疫苗包含至少约1x10²CFU/kg。在又一实施方式中，单剂量的组合物或疫苗包含至少约1x10³CFU/kg。在又一实施方式中，单剂量的组合物或疫苗包含至少约1x10⁴CFU/kg。

在一些实施方式中，从一宿主(例如小鼠)的LD₅₀数据，利用本领域技术人员已知的方法可以外推出另一种宿主(例如人)的适合(即有效的)用量。

在一些实施方式中，施用本发明的药物组合物、免疫原性组合物或疫苗可不用后续施用抗生素。在对宿主施用活李斯特菌的情况中，可能需要对宿主施用抗生素从而在接种后限制李斯特菌复制。不过，在对李斯特菌进行减毒以便在宿主中生长的情况下，可能不需要施用抗生素来控制李斯特菌在宿主中的生长。在本发明的一些方面，对李斯特菌进行减毒以便在宿主中生长。例如，在本发明的一些方面，李斯特菌被杀死，但具有代谢活性。在这些情况中，可以不需要施用抗生素来控制李斯特菌在宿主中的生长。

在一些实施方式中，药物组合物、免疫原性组合物或疫苗包含已感染有本文所述的李斯特菌的抗原递呈细胞，例如树突细胞。在一些实施方式中，含有细菌(例如本文所述的那些细菌)的基于抗原递呈细胞的疫苗的各体用量含有在约1x10³和约1x10¹⁰之间的抗原递呈细胞。在一些实施方式中，疫苗的个体用量含有在约1x10⁵和约1x10⁹之间的抗原递呈细胞。在一些实施方式中，疫苗的个体用量含有在约1x10⁷和约1x10⁹之间的抗原递呈细胞。

在一些实施方式中，优选用量单位的多次施用，所述多次施用可以在1天内，或在1周或月或年或数年的过程中。在一些实施方式中，用量单位在多天中每天施用，或在多周内每周施用一次。在一些实施方式中，将李斯特菌对哺乳动物受试对象施用至少2次，至少3次，至少4次，至少5次，至少10次或至少20次。

本发明还提供了对抗原递呈细胞诱导MHC I类抗原递呈或MHC II类抗原递呈的方法，所述方法包括使本文所述的细菌与抗原递呈细胞接触。

本发明还提供了在宿主中诱导针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使本文所述的李斯特菌属细菌与来自宿主的抗原递呈细胞在适合状态下接触足够的时间，从而加载抗原递呈细胞；和(b)对宿主施用抗原递呈细胞。

VIII.试剂盒

本发明还提供了含有本文所述的李斯特菌的试剂盒和制造品，或含有包含本文所述的李斯特菌的组合物的试剂盒和制造品。

实施例

提供以下实施例以说明本发明，但不限制本发明。

实施例1

在该研究中，评估了包括G145S、G155S和Y63C在内的3种PrfA^*突变体多肽对同基因型活减毒和KBMA疫苗株的效能的影响。

材料和方法

小鼠。6-12周龄雌性C57BL/6和Balb/c小鼠获得自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)。研究按照安萨机构动物照顾与使用委员会(Anza Institutional Animal Care and Use Committee)批准的动物协议进行。

细菌株。在单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB/ΔuvrAB株中构建单核细胞增生性李斯特菌疫苗株(9)。通过将侧翼同源性的具有800bp至1kb的各种prfA等位基因克隆到温度敏感的等位基因交换载体pKSV7中构建PrfA^*变体，并利用标准程序将其用于替换野生型等位基因(12)。筛选在卵黄覆盖平板上磷脂酶活性增加的区域(50)并且在马血琼脂上溶血增加(Remel)的区域的具有激活prfA表型的株。通过对基因组prfA基因座测序，确认表型正确的克隆。用计算机设计名为“Quadvac”构建体的抗原表达盒，“Quadvac”构建体表达4种不同强度的疫苗性CD8+T细胞表位和来自单一合成基因的卵清蛋白(OVA)来源的CD8+T细胞表位SIINFEKL，其中表位串联在一起并间隔有连接物序列。为了在单核细胞增生性李斯特菌中表达，利用基因设计软件(48)对氨基酸序列进行密码子优化，合成(DNA2.0，Menlo Park，CA)，克隆到actA启动子的下游并与actA基因的氨基末端同框。将该构建体克隆到pPL2整合载体的衍生物中，并稳定整合在前述各种prfA^*株背景中的细菌染色体的tRNA^Arg基因座(23)。所有分子构建体通过DNA测序进行确认。

异源抗原表达的蛋白质印迹检测。以在酵母提取物培养基中生长至OD₆₀₀为0.7(后对数期)的细菌培养物的等量TCA沉淀上清进行肉汤培养物的蛋白质印迹。对于单核细胞增生性李斯特菌感染宿主细胞的蛋白质印迹，以50或100的感染复数(MOI)接种J774细胞或DC2.4细胞1小时，将细胞以PBS和补充有50μg/mL庆大霉素的DMEM培养基洗涤3次。对于早期时点，在感染后1.5或2.5小时收获DC2.4。对于后期时点，在7小时收获J774细胞。细胞以SDS样品缓冲液裂解，收集并在4-12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，转移至硝酸纤维素膜上进行蛋白质印迹分析。所有蛋白质印迹利用针对ActA蛋白的成熟N-末端产生的多克隆抗体。

免疫。由酵母提取物培养基中过夜生长的培养物制备用于免疫的活减毒细菌。如此前所述(9)对KBMA单核细胞增生性李斯特菌株进行S59-补骨脂素和UVA处理。将光化学失活的细菌(KBMA Lm)以DPBS洗涤一次，重悬在8％DMSO中，然后储存在-80℃。将细菌稀释在注射用Hank平衡盐溶液(HBSS)中。将活减毒细菌的注射储备液铺板，以确定集落形成单位(CFU)。将5×10⁶CFU的活减毒细菌和1×10⁸颗粒的KBMA细菌以200μL体积静脉内施用于尾静脉，或以30μL体积肌肉内(i.m.)施用于单侧胫颅肌(tibialis cranialis muscle)，加强接种在另一胫颅肌内给予。

血清细胞因子和趋化因子的检测。在接种KBMA后2、4和8小时或在接种活减毒Lm后4、8和24小时，通过眼窝放血从小鼠收集血清。利用小鼠炎性流式微球阵列试剂盒(BD Biosciences，San Jose，CA)根据制造商说明书测定细胞因子/趋化因子。利用FACSCan to流式细胞仪(BD Biosciences)获取样品。利用流式微球阵列软件(BD Biosciences)分析数据。

肽。通过Synthetic Biomolecules(San Diego，CA)合成OVA_257-264(SIINFEKL)、LLO_190-201(NEKYAQAYPNVS)、HSV-gB2(SSIEFARL)、B8R_20-27(TSYKFESV)、K3L_6-15(YSLPNAGDVI)、C4L_125-132(LNFRFENV)、A42R_88-96(YAPVSPIVI)(27)等肽。

流式细胞术用试剂。CD3FITC或PE-Cy7(克隆145-2C11)、CD4FITC(克隆GK1.5)、CD8PE-Cy7或APC-Cy7(克隆53-6.7)、CD19FITC(克隆MB19-1)、TNF PE(克隆MP6-XT22)、IFN-γAPC(克隆XMG1.2)购自eBioscience(San Diego，CA)。CD8αPerCP(克隆53-6.7)购自BD Biosciences(San Jose，CA)。

体内细胞毒性测试。对天然接受者的脾细胞以1μM浓度的对照(HSV-gB2)或靶(B8R或A42R)肽致敏。然后以0.2μM(CFSE^lo)、1μM(CFSE^med)或5μM(CFSE^hi)浓度的羧基荧光素二乙酸琥珀酰胺酯(CFSE，Molecular Probes，Eugene，OR)标记细胞。将各群的3×10⁶标记脾脏细胞混合并静脉注射。16小时后收获脾脏，确定靶标群相对于对照群的比例，并计算杀死百分数。

抗原特异性T细胞的细胞内染色。如此前所述(Brockstedt，D.G等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837)，在布雷菲德菌素A的存在下以相关肽刺激脾细胞5小时，以用于细胞内细胞因子染色。对经刺激的细胞进行CD4和CD8表面染色，然后利用cytofix/cytoperm试剂盒(BD Biosciences，San Jose，CA)进行固定和渗透。然后对细胞进行IFN-γ、TNF-α和/或IL-2染色。利用FACSCanto流式细胞仪(BD Biosciences)获取样品。对数据设门，以专门包括CD4+或CD8+事件，然后确定表达IFN-γ的这些细胞的百分数。利用FlowJo软件(Treestar，Ashland，OR)分析数据。

单核细胞增生性李斯特菌保护研究。为了评估保护性免疫，对Balb/c小鼠接种所指示的株，并在接种后14天以2×LD₅₀的野生型单核细胞增生性李斯特菌(1×10⁵集落形成单位；CFU)进行侵袭，3天后在器官匀浆中测定脾脏中的CFU(如此前所述(Bahjat，K.S.等人(2005)J.Immunol.179：7376-7384))。如此前所述(10)，确定中位致死性率(LD₅₀)的值。

疫苗病毒保护研究。对C57BL/6小鼠给予单核细胞增生性李斯特菌Quadvac株的相隔27天的初免接种和加强接种，并在28天后以1×10⁷斑块形成单位(PFU)的疫苗病毒对小鼠进行腹膜内侵袭。如所述(1)，病毒侵袭5天后通过测定卵巢中的病毒滴度来对保护进行评估。

统计学分析。通过学生T检验确定针对疫苗病毒或单核细胞增生性李斯特菌侵袭的保护的差异。除非另外指出，所有实验均进行至少2次。除非另外指出，所有实验均进行至少2次。

结果

同基因型PrfA^*单核细胞增生性李斯特菌疫苗株的构建和表征.我们假设，在免疫之前诱导PrfA调节子将增加重组活减毒和KBMA单核细胞增生性李斯特菌疫苗的免疫效能。为了验证这一假设，我们构建了单核细胞增生性李斯特菌背景的同基因型株组，该同基因型株组含有actA、inlB、uvrA和uvrB的完整编码区缺失(单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB/ΔuvrAB)，仅在prfA有变化。我们选择了3个prfA突变体，所述突变体通过化学诱变产生或者是自发突变体，并且编码组成型活性PrfA^*蛋白(37，41)。此前已表明，带有PrfA^*G155S、G145S或Y63C的株与带有天然prfA的同基因型株相比可增加actA启动子依赖的β半乳糖苷酶报告蛋白的表达，并且在一些情况下可增加野生型(WT)单核细胞增生性李斯特菌的毒力(26，28，37，41)。

为了能够区分同基因型单核细胞增生性李斯特菌疫苗株之间的免疫效能差异，我们构建了Ag表达盒，该Ag表达盒编码此前已被证明可引发小鼠的多种CD8+T细胞应答的5种已充分确定的H-2^b-限制MHC I类表位。合成了编码4个串联间隔疫苗病毒(A42R，C4L，K3L，B8R)表位和鸡卵清蛋白(SL8)表位的构建体，然后将其克隆从而受PrfA-调控actA启动子控制并与ActA的100个N-末端氨基酸蛋白融合。如此前所述(图1A)(23)，将称为“Quadvac”的构建体克隆到pPL2的衍生物中，然后整合在携带WT、G145S、G155S，或Y63C prfA等位基因的4种同基因型株(单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB/ΔuvrAB)中的tRNA^Arg基因座处。4种同基因型疫苗株均同等地生长在酵母提取物中或脑心浸液肉汤培养物中(数据未示出)。如前所述(9)，将酵母提取物肉汤培养物中生长的疫苗株直接用作活减毒单核细胞增生性李斯特菌疫苗(10)，或通过合成补骨脂素S-59和长波UV光进行光化学失活，从而产生KBMA单核细胞增生性李斯特菌疫苗。

我们比较了来自4种活减毒单核细胞增生性李斯特菌疫苗的肉汤培养物中的Ag表达和分泌水平，如所预期的，在PrfA^*株中观察到比带有WT prfA等位基因的株更高的表达水平(图1B)。虽然结合表皮细胞增强侵入，对肉汤培养物中生长的PrfA^*株的PrfA依赖基因的过表达已有充分描述(28，34，41，47)，但对在受感染的培养哺乳动物细胞中是否再现(recapitulate)PrfA^*表型所知很少。我们评估了分别在吞噬性小鼠巨噬细胞或树突细胞(DC)系J774和DC2.4(而不是非吞噬细胞系例如HepG2(肝脏)或PtK2(表皮))中的单核细胞增生性李斯特菌疫苗株的Ag表达。单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB株不能介导对表达肝细胞生长因子受体的肝脏细胞的InlB依赖的感染，并且表皮组织不代表与本研究中肌肉内和静脉内免疫途径应用相关的主要靶标。令人惊讶的是，感染同基因型单核细胞增生性李斯特菌疫苗株的J774巨噬细胞中的Ag表达水平相等(无论何种prfA等位基因)(图1C)。引人注意的是，在DC2.4DC的早期时间，Ag表达水平也相等(图1D)。J774(图1E)和DC2.4(未示出)细胞系中所有单核细胞增生性李斯特菌疫苗株的感染(摄取)和细胞内生长相等，并且不依赖于prfA等位基因。

PrfA^*最小程度地增加了单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB/ΔuvrAB株的毒力。此前已报道PrfA^*突变体李斯特菌在Balb/c小鼠中具有增加多达10倍的毒力。例如，prfA G155S将其同基因型野生型株的LD₅₀值从2×10⁴cfu降低至3×10³cfu(41)。然而，PrfA^*突变体对减毒株毒力的影响是未知的。由于用于小鼠的单核细胞增生性李斯特菌疫苗研究的免疫剂量通常为LD₅₀值的十分之一，我们测定了本研究中所用的3种PrfA^*突变体对单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB/ΔuvrAB毒力所具有的影响，单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB/ΔuvrAB株可在IV施用后快速从肝中清除，并且与WT单核细胞增生性李斯特菌相比在小鼠中减弱了大于3个数量级的(6，9，10)。PrfA^*少量增加了单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB/ΔuvrAB毒力的毒力，LD₅₀值在携带prfA G145S或prfA Y63C等位基因的同基因型株中仅减少2.1倍(3.5×10⁷cfu对7.3×10⁷cfu)，在携带prfA G155S等位基因的同基因型株中仅减少1.4倍(5.2×10⁷cfu对7.3×10⁷cfu)(表5)。

在针对IV施用的应答中所诱导的Th1极化促炎血清细胞因子概况反应出来的是，基于Lm的疫苗，包括基于减毒单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB的株是先天免疫的强力激活剂(4)。由于先天免疫的激活与单核细胞增生性李斯特菌疫苗诱导的免疫应答的质量相关，因此我们在IV施用同基因型疫苗株之后的头24小时期间的几个时间点测定了血清细胞因子水平。C57BL/6小鼠静脉内注射5×10⁶cfu，该剂量大约为4种同基因型疫苗株的LD₅₀值的0.1。与带有天然prfA的疫苗株相比，在施用8小时内，所有3种PrfA^*疫苗株诱导的促炎细胞因子/趋化因子的水平统计学上显著更高(图2A)。未观察到3种PrfA^*株之间的显著差异；然而，在给予PrfA^*Y63C疫苗株的小鼠中观察到增加的小鼠至小鼠的变化性。

表5.活减毒单核细胞增生性李斯特菌株的毒力

PrfA^*增加活减毒单核细胞增生性李斯特菌疫苗的免疫原性。我们评价了同基因型疫苗株的免疫原性，从而评估PrfA^*对疫苗效能的影响。为了便于比较，同基因型疫苗株表达由多限定H-2^b-限制性MHC I类疫苗病毒表位(A42R，C4L，K3L，B8R)以及此外强OVA表位SL8组成的常用异源Ag(称为“Quadvac”)，已表明所述表位(A42R，C4L，K3L，B8R)在疫苗病毒感染后可引起高、中和低频率的T细胞应答。这一策略使我们可以将疫苗诱导的CD8+T细胞应答的量级在免疫剂量范围上进行分级，同时评估以疫苗病毒进行侵袭而带来的应答的质量。

以5×10⁶cfu的4种同基因型单核细胞增生性李斯特菌Quadvac株对雌性C57BL/6小鼠组进行IV免疫，单免疫后7天，通过应答峰处的细胞内细胞因子染色(10)确定CD8+和(Lm-特异性)CD4+T细胞频率。PrfA^*G155S单核细胞增生性李斯特菌疫苗诱导的抗原特异性T细胞应答量级比G145S和Y63CPrfA^*疫苗株以及带有WT prfA的株更大(图2B和2C)。PrfA^*G155S单核细胞增生性李斯特菌疫苗免疫小鼠中的抗原特异性IFN-γ+T细胞的增加的量级不仅因免疫显性的(immunodominant)SL8和B8R表位而变得更大，而且也因中间表位和低表位A42R、C4L和K3L而变大。在PrfA^*G155S疫苗株免疫的小鼠中的LLO特异性CD4+T细胞应答比其它疫苗株增加2倍。

PrfA^*G155S增加KBMA单核细胞增生性李斯特菌疫苗的免疫原性。我们假设PrfA的组成型激活和PrfA调节子的诱导可通过各种机制改善KBMA单核细胞增生性李斯特菌的免疫原性，所述机制包括增加从液泡的逃避以及增加在抗原递呈细胞的胞质溶胶中的异源抗原的表达水平。我们此前证实，CD8+T细胞效能和保护性免疫需要免疫性单核细胞增生性李斯特菌株达到胞质溶胶(5)。由于KBMA疫苗株不能在胞质溶胶中扩增，通过LLO和磷脂酶C表达的增加从吞噬体中逃避的效率可能增强疫苗效能。

为了评估针对KBMA单核细胞增生性李斯特菌株的先天免疫和适应性免疫，对C57BL/6小鼠以1×10⁸的颗粒(良好耐受的剂量)进行IV免疫。如此前所述，我们使用导致单核细胞增生性李斯特菌疫苗制品的10个数量级杀死的光化学失活条件(9)。因此，各小鼠有10^-2的机会接受非免疫剂量的单减毒单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB/ΔuvrAB细菌。在感染最初8小时内测定血清细胞因子/趋化因子水平，该水平已在包括应答峰的此前实验中进行观察，该峰然后在24小时内返回到背景水平(6)。KBMA PrfA^*疫苗株诱导的MCP-1、IL-12p70和IFN-γ水平更高于带有WT prfA的KBMA疫苗所诱导的水平(图3A)。在3种PrfA^*株之间未观察到显著差异，但KBMA PrfA^*G155S疫苗所诱导的细胞因子水平趋于更高于KBMA PrfA^*G145S或Y63C疫苗所诱导的水平。

我们比较了给予2次接种(相隔两周)的C57BL/6小鼠中同基因型KBMA疫苗株的免疫原性。在KBMA PrfA^*G155S免疫小鼠中观察到，对5种Quadvac表位特异的第二抗原特异性CD8+T细胞应答的最高量级(图3B和3C)。虽然在以其它2种KBMA PrfA^*疫苗株免疫的小鼠中的CD8+应答的量级通常更高于KBMA WT prfA，但并不是对所有接受评价的CD8T细胞表位都如此(图3B和3C)。有趣的是，与活减毒疫苗株相比，以KBMA单核细胞增生性李斯特菌PrfA^*株免疫的小鼠中的LLO特异性CD4+T细胞应答量级并不更高。因此，prfA G155S等位基因给活减毒疫苗株和KBMA疫苗株带来了最高的免疫原性。

KBMA PrfA^*G155S疫苗具有增加的免疫效能.已经很好确定的是，诱导出的T细胞应答的量级不必然代表应答的效能。为了评估疫苗诱导的CD8+T细胞应答的效能，我们评估了对2个疫苗性表位A42R和B8R特异的体内细胞溶解活性。以4种同基因型KBMA单核细胞增生性李斯特菌株对C57BL/6小鼠免疫2次。我们评价了2种替代性免疫途径(静脉内(IV)和肌肉内(IM))后的免疫原性。我们评价IM免疫，从而评估通过传统接种途径施用时KBMA PrfA^*疫苗株的效能。在所有以KBMA PrfA^*或WT prfA疫苗免疫的组中观察到，通过对强B8R表位特异的体内细胞毒性而测定的强健应答。在IV免疫的小鼠中，靶标杀死程度是稍稍更高的(图4A和4B)。在以KBMA PrfA^*G155S进行IV或IM免疫的小鼠中，针对A42R疫苗病毒表位也引起了强力的杀死活性。不过，与PrfA^*G155S相比，由基于野生型PfrA^*并IM给予的KBMA疫苗所诱导的针对A42R的杀死活性减少2倍。基于G145S或Y63C的KBMA疫苗在通过IM途径给予时具有中等效能(图4B)。在剂量-应答实验中可以见到，与用携带WT prfA的KBMA免疫的小鼠相比，KBMA PrfA^*G155S诱导B8R应答的效能优异(图4C)。

疫苗诱导的T细胞效能的相关测量是针对活病原体侵袭的保护性免疫。我们通过以WT单核细胞增生性李斯特菌或疫苗病毒进行的侵袭，评价了以KBMA PrfA^*G155S或WT prfA免疫的小鼠中的T细胞效能。不能逃避吞噬溶酶体的单核细胞增生性李斯特菌株不能诱导保护性免疫，虽然可引起在二次侵袭时能够扩增的抗原特异性T细胞应答(5，20)。我们此前描述了基于KBMA Lm的接种可导致针对致死性野生型单核细胞增生性李斯特菌侵袭的瞬时保护。所诱导的T细胞应答随时间减小，使人想到在CD4+T细胞辅助不存在的情况下诱导的T细胞应答(3，45)。以KBMA单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB/ΔuvrAB对小鼠免疫在14天时导致2个数量级的保护。为了评价KBMA PrfA^*G155S疫苗诱导的适应性应答的效能，以1×10⁸颗粒对小鼠免疫1次，并在14天后以2×LD₅₀的野生型单核细胞增生性李斯特菌进行侵袭。3天后在脾脏和肝脏中确定集落形成单位(cfu)(数据未示出)。如图4D所示，与带有WT prfA的KBMA相比，KBMA PrfA^*G155S免疫的小鼠中针对野生型单核细胞增生性李斯特菌的保护改善了3个数量级。

我们随后确定KBMA PrfA^*G155S的增强免疫效能是否也能扩展至疫苗病毒侵袭。通过IM途径，以KBMA PrfA^*G155S或WT prfA疫苗或者以携带WT prfA并且不编码Quadvac Ag的KBMA对照对C57BL/6小鼠相隔2周进行2次免疫。为了评价保护性记忆免疫，在最后免疫之后30天以1×10⁷pfu的疫苗病毒侵袭小鼠，并在5天后确定小鼠卵巢的病毒滴度。与针对各种疫苗病毒表位诱导的T细胞应答的改善的量级一致，我们观察到：在接受以KBMA单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB株为背景的PrfA^*G155S突变体李斯特菌的小鼠中，有针对病毒侵袭的统计学显著改善(改善2个数量级)的保护。

这些结果证明，PrfA^*G155S给活减毒和KBMA单核细胞增生性李斯特菌疫苗带来了增加的免疫效能，并且明显地提供了KBMA疫苗在烈性传染病侵袭模型中进行常规免疫途径之后引发保护性免疫的能力。

讨论

由于刺激强力的先天免疫和获得性细胞免疫的固有性质，开发了基于活减毒单核细胞增生性李斯特菌的疫苗平台，并进行了临床评价(临床试验政府鉴定NCT00327652和NCT00585845)。在实施例1的实验中，我们表明：在对小鼠接种之前激活PrfA调节子显著增强了活减毒和KBMA单核细胞增生性李斯特菌疫苗诱导的先天和细胞免疫的水平，该水平与针对用同源野生型细菌病原体或疫苗病毒进行的侵袭的改善的保护相关。这些结果先于临床形成了将prfA G155S等位基因包含在未来的基于Lm的疫苗中的理论基础。

活减毒和KBMA疫苗的免疫效能通过在免疫前激活prfA调节子而得到显著增强。PrfA^*免疫效能的增强对于KBMA疫苗更明显。我们此前表明，虽然被杀死，但KBMA疫苗仍能够逃避吞噬溶酶体，这是诱导抗原递呈细胞中IFN-β和其它激活信号的必须步骤，而所述信号是引发针对野生型单核细胞增生性李斯特菌侵袭的保护性细胞免疫所需要的(5，9，30)。然而，只有当α-CD40 Ab提供的代理帮助(surrogate help)联合施用时或当利用同源初免和加强免疫治疗方案时，KBMA单核细胞增生性李斯特菌疫苗才能在单免疫后引起保护性免疫(5)。这些结果证明：与活减毒单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB疫苗株相比降低的KBMA疫苗的免疫效能在单免疫后能引起保护性免疫，其类似于野生型单核细胞增生性李斯特菌。在受感染巨噬细胞的细胞质中，活单核细胞增生性李斯特菌株7小时体外扩增100倍(图1D)，导致PrfA的完全激活和prfA依赖基因(包括来源于actA启动子的编码抗原)的诱导表达。因此，在各种活减毒疫苗之间的免疫效能的差异不像对KBMAPrfA^*疫苗株观察到的那样显著，这并不令人惊讶。KBMA疫苗不能在所免疫的宿主的细胞中繁殖，并且在非复制载体的情况下，接种之前的PrfA调节子的诱导和编码Ag的表达显著增强了免疫效能。

在近期发表的研究中，将野生型单核细胞增生性李斯特菌株10403的免疫原性与不同野生型单核细胞增生性李斯特菌株43251做了比较，野生型单核细胞增生性李斯特菌株43251含有未知的激活prfA突变(42)。虽然单核细胞增生性李斯特菌株引起增强的LLO-和p60-特异性免疫并增加针对野生型李斯特菌侵袭的保护，但由于该研究利用了不同的野生型单核细胞增生性李斯特菌株，因此对于内在机制和对适于在人中进行测试的重组减毒疫苗平台的可能应用，难以得出结论。此外，该研究中并未评价组成型PrfA激活对重组单核细胞增生性李斯特菌疫苗株中的表达的异源抗原的免疫原性的影响。

基于KBMA PrfA^*的疫苗的免疫效能的增强可能由几种独立机制引起。起作用的因素可包括：逃避吞噬溶酶体的效率增加，和胞质溶胶中Ag表达和分泌的增加，最终导致MHC I类分子上展示的更高的表位密度和CD8+T细胞的更有效的初免。虽然PrfA依赖的毒力基因的过表达可增加细胞毒性、导致野生型株的毒力降低和疫苗效能降低(10，17，46)，但如J774细胞中等同的细胞内生长所示，该机制并未表现出影响了该研究中所用疫苗株的相对免疫原性(图1E)。其它可能性可包括：由于感染位点处促炎细胞因子环境的改善，或InlA介导的上皮钙粘蛋白DC-DC粘附的破坏增加，树突细胞(DC)向以PrfA^*疫苗免疫的动物的淋巴结的迁移增强(22)。虽然InlA对小鼠上皮钙粘蛋白的结合与对其人同源物的结合相比减少了(24，49)，但来自PrfA^*株的InlA水平的增加仍可增强这一过程。另一方面，看起来不可能的是：KBMAPrfA^*疫苗的免疫效能的增强是由于宿主范围的增加或靶细胞感染的增强。值得注意的是，虽然对该研究中所用的口腔感染、肌肉内或静脉内途径是重要的，但InlA在介导非吞噬细胞的感染中并未起到同要重要的作用。此外，InlB通过肝细胞生长因子受体介导的肝细胞感染无相关性，这是因为该毒力决定物在该研究中所用的疫苗株内缺失。支持这一观点的是以下综合观察到的情况：对培养的巨噬细胞或树突细胞的感染在所测试的所有疫苗株之间不能区分(图1C&1D)，并且与单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB亲本株相比，单核细胞增生性李斯特菌ΔactA/ΔinlB PrfA^*株的毒力仅增加2至4倍，其与野生型单核细胞增生性李斯特菌相比减弱了大于3个数量级(10)(表5)。

虽然此处呈现的结果证明了PrfA调节子激活对增加单核细胞增生性李斯特菌疫苗效能的重要性，但在肉汤培养物中观察到的Ag过表达并不必然与增强的免疫效能相关。引人注目的是，虽然prfA G155S、G145S和Y63C突变均对肉汤培养物中生长的疫苗株的PrfA依赖的Ag表达赋予了高(并且同等的)的过表达，但只有PrfA^*G155S疫苗株具有显著增加的免疫效能。由于宿主-病原体反应由多因素过程限定，因此PrfA依赖表达的增强不必然与最优免疫原性关联，这并不令人惊讶。PrfA依赖基因的临时调控提供了适当细胞区室中特定细菌蛋白的表达，从而促进发病。例如，在细胞质中诱导ActA表达200倍，从而促进宿主细胞肌动蛋白聚合和细胞至细胞的传播(35，40)。该研究中Ag作为与ActA的前100个氨基酸融合的N-末端，由天然actA启动子驱动表达。在KBMA疫苗的情况中，prfA G155S提供了适当水平的PrfA依赖的诱导从而增加效能，但使光化学失活细菌能够负担足够的代谢经济平衡。在最近利用prfA L104F表征PrfA依赖的单核细胞增生性李斯特菌分泌组的研究中(34)，鉴定了几种蛋白，此前不知道这些蛋白的表达与活化PrfA相关。这一数据提供了多细菌蛋白参与野生型单核细胞增生性李斯特菌的致病的证据，并且表明PrfA^*突变体可能对单核细胞增生性李斯特菌疫苗的效能有复杂影响。

绝大多数对单核细胞增生性李斯特菌疫苗的临床前研究利用了IV或腹膜内施用。很少有检验IM和皮下免疫途径的报告(10，15)。然而，已在小鼠、非人的灵长动物和一项对人的研究中探索了口服免疫(2，8，29，33)。进行至今或继续进行的3项对单核细胞增生性李斯特菌的临床试验已采用了IV施用。虽然KBMA单核细胞增生性李斯特菌疫苗与活减毒疫苗相比可能具有改善的风险-益处概况，但可能需要传统的免疫施用途径以便广泛采用和/或批准，特别是对于预防的情况。此处，我们表明，通过初免-加强免疫治疗方案，在IM免疫之后KBMA PrfA^*G155S疫苗引起了与活减毒单核细胞增生性李斯特菌疫苗相当的功能性细胞免疫。

通过评价含有各种prfA等位基因的同基因型活减毒和KBMA单核细胞增生性李斯特菌疫苗组的免疫效能，我们已经表明，利用常规的免疫途径，免疫之前PrfA调节子的组成型诱导可显著增强活减毒KBMA疫苗引起功能性细胞免疫的能力。

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实施例2

作为活减毒或作为KBMA疫苗，比较了单核细胞增生性李斯特菌株ΔactA/ΔinlB/ΔuvrAB-HPV E7(BH1409)和ΔactA/ΔinlB/ΔuvrAB/PrfA^*G155S-HPV E7(BH1633或BH1733)的免疫原性。

材料和方法

如同实施例1中对QuadVac疫苗所述的野生型和表达HPV E7的PrfA^*G155S单核细胞增生性李斯特菌。

以1×10⁷CFU的活减毒单核细胞增生性李斯特菌的单施用或3×10⁷颗粒的KBMA Lm的2次接种对C57BL/6小鼠进行静脉内接种。初次接种之后14天，施用KBMA加强接种。最后一次接种后7天收获脾脏。通过IFN-γELISpot或通过细胞内细胞因子染色测定HPV E7_49-57特异性CD8+和LLO_190- ₂₀₁特异性CD4+T细胞。

结果

为了确定PrfA^*G155S对基于Lm的疫苗的免疫效能的影响，以含有WT PrfA或PrfA^*G155S突变的表达HPV E7的单核细胞增生性李斯特菌株接种C57BL/6小鼠。最后一次接种后7天收获脾脏，并通过实施例1中所述的g-IFN ELISpot测试或细胞内细胞因子染色测定E7_49-57-和LLO_190-201-特异性免疫应答。在以活减毒单核细胞增生性李斯特菌(1×10⁷CFU i.v.)进行单接种后，或光化学失活、核苷酸切除修复缺失的单核细胞增生性李斯特菌(KBMA；3×10⁷颗粒i.v.)的2次接种后，评估免疫应答。PrfA^*G155S的包含显著增强了由活减毒单核细胞增生性李斯特菌和KBMA单核细胞增生性李斯特菌疫苗株诱导的E7特异性CD8+T细胞应答(图5)。此外，CD4+LLO_190-201特异性应答在以活减毒PrfA^*G155S株进行接种后，与WT PrfA株相比也显著增加(图6)。

将本文所引用的所有出版物、专利、专利申请、互联网站点和登录号/数据库序列(包括多核苷酸序列和多肽序列)在各个方面通过引用方式整体并入本文，其程度如同具体和单独指出将各出版物、专利、专利申请、互联网站点或登录号/数据库序列通过引用方式并入。

Claims

1.一种重组李斯特菌属细菌，所述重组李斯特菌属细菌包含

(a)编码PrfA^*突变体多肽的多核苷酸；和

(b)重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含

(i)prfA应答调控元件；和

(ii)编码异源多肽的多核苷酸，其中所述编码异源多肽的多核苷酸可操纵地连接于所述prfA应答调控元件，并且其中所述异源多肽是非细菌的多肽或者是异源传染病病原体的抗原。

2.如权利要求1所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述PrfA^*突变体多肽包含选自Y63C、E77K、L149F、G145S、G155S和S183A的突变。

3.如权利要求2所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述PrfA^*突变体多肽包含G155S突变。

4.如权利要求1-3中任一项所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述重组多核苷酸编码融合蛋白，该融合蛋白包含信号肽和所述异源多肽。

5.如权利要求1-4中任一项所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述prfA应答调控元件选自hly启动子、plcA启动子、plcB启动子、mpl启动子、hpt启动子、inlC启动子、inlA启动子、inlB启动子、prfA启动子和actA启动子。

6.如权利要求5所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述prfA应答调控元件是actA启动子。

7.如权利要求4所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述信号肽是选自单核细胞增生性李斯特菌的ActA信号肽、单核细胞增生性李斯特菌的LLO信号肽、乳酸乳球菌的Usp45信号肽、炭疽杆菌的保护抗原信号肽、单核细胞增生性李斯特菌的p60信号肽、枯草杆菌的PhoD信号肽、secA2信号肽和Tat信号肽的信号肽。

8.如权利要求7所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述信号肽是单核细胞增生性李斯特菌的ActA信号肽。

9.如权利要求4所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述融合蛋白包含ActA的前100个氨基酸。

10.如权利要求1-9中任一项所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述异源多肽包含选自肿瘤相关抗原、肿瘤相关抗原衍生的多肽、传染病抗原和传染病抗原衍生的多肽的抗原。

11.如权利要求10所述的重组李斯特菌，其中所述异源多肽是选自K-Ras、H-Ras、N-Ras、12-K-Ras、间皮素、PSCA、NY-ESO-1、WT-1、存活素、gp100、PAP、蛋白酶3、SPAS-1、B-raf、酪氨酸激酶、mdm-2、MAGE、RAGE、MART-1、bcr/abl、Her-2/neu、α甲胎蛋白、乳腺珠蛋白、hTERT(端粒酶)、PSA和CEA的抗原，或包含选自K-Ras、H-Ras、N-Ras、12-K-Ras、间皮素、PSCA、NY-ESO-1、WT-1、存活素、gp100、PAP、蛋白酶3、SPAS-1、B-raf、酪氨酸激酶、mdm-2、MAGE、RAGE、MART-1、bcr/abl、Her-2/neu、α甲胎蛋白、乳腺珠蛋白、hTERT(端粒酶)、PSA和CEA的抗原所衍生的多肽。

12.如权利要求10所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述传染病抗原来自病毒或异源传染病病原体，该病毒或异源传染病病原体选自肝炎病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒、乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、巨细胞病毒、结核分枝杆菌、恶性疟原虫或沙眼衣原体。

13.如权利要求12所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述传染病抗原来自甲肝病毒、乙肝病毒或丙肝病毒。

14.如权利要求1-13中任一项所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述李斯特菌属细菌属于单核细胞增生性李斯特菌种。

15.如权利要求1-14中任一项所述的重组李斯特菌属细菌，所述重组李斯特菌属细菌在细胞至细胞的传播、进入非吞噬细胞、增殖或DNA修复的一个方面或多个方面减弱。

16.如权利要求15所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述李斯特菌通过以下方式中的一种或多种方式被减毒：

a.actA突变；

b.inlB突变；

c.uvrA突变；

d.uvrB突变；

e.uvrC突变；

f.核酸靶向的化合物；或

g.uvrAB突变和靶向核酸的化合物。

17.如权利要求16所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述靶向核酸的化合物是补骨脂素。

18.如权利要求1-14中任一项所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述细菌的核酸通过与和该核酸直接反应的靶向核酸的化合物反应而得到修饰，从而减弱所述细菌的增殖。

19.如权利要求1-14中任一项所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述细菌包含减弱经修饰细菌增殖的核酸交联物。

20.如权利要求1-14中任一项所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述细菌包含减弱所述细菌增殖的补骨脂素-核酸加合物。

21.如权利要求18-20中任一项所述重组李斯特菌属细菌，其中所述细菌还包含减弱所述细菌修复其经修饰核酸能力的基因突变。

22.如权利要求21所述的重组李斯特菌属细菌，其中所述细菌包含actA、inlB、uvrA和uvrB中的失活突变；并且其中已通过补骨脂素-核酸交联物减弱所述细菌的增殖。

23.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-22中任一项所述的重组李斯特菌属细菌以及药学上可接受的赋形剂、佐剂和共刺激分子中一种或多种。

24.如权利要求23中所述的药物组合物，其中所述组合物还包含治疗剂。

25.一种在宿主中诱导针对非李斯特菌抗原的免疫应答的方法，所述方法包括对所述宿主施用有效量的组合物，所述组合物含有：

重组李斯特菌属细菌，所述重组李斯特菌属细菌包含

(a)编码PrfA^*突变体多肽的多核苷酸；和

(b)重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含

(i)prfA应答调控元件；和

(ii)编码异源多肽的多核苷酸，

其中所述编码异源多肽的多核苷酸可操纵地连接于所述prfA应答调控元件，并且

其中所述异源多肽包含所述抗原。

26.一种在宿主中增强非李斯特菌抗原的免疫原性的方法，所述方法包括对所述宿主施用有效量的组合物，所述组合物含有：

重组李斯特菌属细菌，所述重组李斯特菌属细菌包含

(a)编码PrfA^*突变体多肽的多核苷酸；和

(b)重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含

(i)prfA应答调控元件；和

(ii)编码异源多肽的多核苷酸，

其中所述编码异源多肽的多核苷酸可操纵地连接于所述prfA应答调控元件，

其中所述异源多肽包含所述抗原。

27.一种预防或治疗宿主中非李斯特菌的传染病症或癌性病症的方法，所述方法包括对所述宿主施用有效量的组合物，所述组合物含有重组李斯特菌属细菌，所述重组李斯特菌属细菌包含：

(a)编码PrfA^*突变体多肽的多核苷酸；和

(b)重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含

(i)prfA应答调控元件；和

(ii)编码异源多肽的多核苷酸，其中所述编码异源多肽的多核苷酸可操纵地连接于所述prfA应答调控元件。

28.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述PrfA^*突变体多肽包含选自Y63C、E77K、L149F、G145S、G155S和S183A的突变。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述PrfA^*突变体多肽包含G155S突变。

30.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述重组多核苷酸编码融合蛋白，该融合蛋白包含信号肽和所述异源多肽。

31.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述prfA应答调控元件选自hly启动子、plcA启动子、plcB启动子、mpl启动子、hpt启动子、inlC启动子、inlA启动子、inlB启动子、prfA启动子和actA启动子。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述prfA应答调控元件是actA启动子。

33.如权利要求30所述的方法，其中所述信号肽是选自单核细胞增生性李斯特菌的ActA信号肽、单核细胞增生性李斯特菌的LLO信号肽、乳酸乳球菌的Usp45信号肽、炭疽杆菌的保护抗原信号肽、单核细胞增生性李斯特菌的p60信号肽、枯草杆菌的PhoD信号肽、secA2信号肽和Tat信号肽的信号肽。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述信号肽是单核细胞增生性李斯特菌的ActA信号肽。

35.如权利要求30所述的方法，其中所述融合蛋白包含ActA的前100个氨基酸。

36.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述异源多肽是非细菌的。

37.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述异源多肽包含选自肿瘤相关抗原、肿瘤相关抗原衍生的多肽、传染病抗原和传染病抗原衍生的多肽的抗原。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述异源多肽是选自K-Ras、H-Ras、N-Ras、12-K-Ras、间皮素、PSCA、NY-ESO-1、WT-1、存活素、gp100、PAP、蛋白酶3、SPAS-1、B-raf、酪氨酸激酶、mdm-2、MAGE、RAGE、MART-1、bcr/abl、Her-2/neu、α甲胎蛋白、乳腺珠蛋白、hTERT(端粒酶)、PSA和CEA的抗原，或者包含选自K-Ras、H-Ras、N-Ras、12-K-Ras、间皮素、PSCA、NY-ESO-1、WT-1、存活素、gp100、PAP、蛋白酶3、SPAS-1、B-raf、酪氨酸激酶、mdm-2、MAGE、RAGE、MART-1、bcr/abl、Her-2/neu、α甲胎蛋白、乳腺珠蛋白、hTERT(端粒酶)、PSA和CEA的抗原衍生的多肽。

39.如权利要求37所述的方法，其中所述传染病抗原来自病毒或异源传染病病原体，该病毒或异源传染病病原体选自肝炎病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒、乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、巨细胞病毒、结核分枝杆菌、恶性疟原虫或沙眼衣原体。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述传染病抗原来自甲肝病毒、乙肝病毒或丙肝病毒。

41.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述李斯特菌属细菌属于单核细胞增生性李斯特菌种。

42.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述李斯特菌在细胞至细胞的传播、进入非吞噬细胞、增殖或DNA修复的一个方面或多个方面减弱。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述李斯特菌通过以下方式中的一种或多种方式被减毒：

a.actA突变；

b.inlB突变；

c.uvrA突变；

d.uvrB突变；

e.uvrC突变；

f.核酸靶向的化合物；或

g.uvrAB突变和靶向核酸的化合物。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述靶向核酸的化合物是补骨脂素。

45.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述细菌的核酸通过与该核酸直接反应的靶向核酸的化合物反应而得到修饰，从而减弱所述细菌的增殖。

46.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述细菌包含减弱经修饰细菌增殖的核酸交联物。

47.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述细菌包含减弱所述细菌增殖的补骨脂素-核酸加合物。

48.如权利要求45-47中任一项所述的方法，其中所述细菌还包含减弱所述细菌修复其经修饰核酸能力的基因突变。

49.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述细菌包含actA、inlB、uvrA和uvrB的失活突变；并且其中已通过补骨脂素-核酸交联物减弱所述细菌的增殖。

50.如权利要求25或26所述的方法，其中所述免疫应答包括先天免疫应答。

51.如权利要求25或26所述的方法，其中所述免疫应答包括适应性免疫应答。

52.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌属细菌与佐剂和/或共刺激分子一起施用。

53.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌属细菌与治疗剂联合施用。

54.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述重组李斯特菌属细菌的施用反复进行。

55.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中在所述李斯特菌属细菌的第一次施用之后约2周后，重复所述重组李斯特菌属细菌的第二次施用。

56.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中在所述重组李斯特菌属细菌施用后，施用疫苗，该疫苗不含有活的、具有代谢活性的李斯特菌并且编码所述非李斯特菌抗原。

57.一种增强哺乳动物中针对非李斯特菌抗原的免疫应答的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用有效加强剂量的编码所述非李斯特菌抗原的权利要求1-22中任一项所述的重组李斯特菌，其中所述哺乳动物此前已被施用有效初免剂量的提供所述非李斯特菌抗原的疫苗，其中：

(a)所述疫苗不含有活的、具有代谢活性并且编码所述非李斯特菌抗原的李斯特菌；和

(b)所述疫苗含有编码所述非李斯特菌抗原的裸露DNA。

58.如权利要求26所述的方法，其中针对所述抗原的免疫原性相对于下述抗原的免疫原性得到增强：该抗原由含有所述编码异源多肽的多核苷酸的重组李斯特菌属细菌诱导，其中所述编码异源多肽的多核苷酸的表达受到野生型PrfA多肽的控制。

59.如权利要求26所述的方法，其中增强的免疫原性包括MCP-1、IL-6、IFN-γ、TNFα或IL-12p70的一种或任意组合的表达增加。

60.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述宿主是人。

61.一种制备重组李斯特菌属细菌的方法，所述方法包括在李斯特菌属细菌中稳定地引入编码异源多肽的重组多核苷酸，

其中所述李斯特菌属细菌包含编码PrfA^*突变体多肽的多核苷酸；和，

其中所述异源多肽是非细菌的；和，

其中在引入到所述李斯特菌属细菌中之后，所述编码异源多肽的重组多核苷酸可操纵地连接于PrfA应答调控元件。

62.如权利要求61所述的方法，其中所述重组多核苷酸包含与所述异源多肽可操纵地连接的所述PrfA-应答调控元件。

63.如权利要求61所述的方法，其中所述重组多核苷酸编码融合蛋白，该融合蛋白包含信号多肽和所述异源多肽。

64.如权利要求61所述的方法，其中所述编码异源多肽的重组多核苷酸整合在所述李斯特菌染色体中。

65.如权利要求64所述的方法，其中所述编码异源多肽的重组多核苷酸整合在所述李斯特菌染色体的tRNA^arg基因中。

66.如权利要求63所述的方法，其中所述信号多肽是ActA信号多肽，并且其中，所述编码异源多肽的重组多核苷酸被引入所述李斯特菌的actA基因中。

67.一种制备重组李斯特菌属细菌的方法，其中将

(a)编码PrfA^*突变体多肽的重组多核苷酸，和

(b)编码异源多肽的重组多核苷酸，

稳定地引入李斯特菌属细菌中，其中所述李斯特菌属细菌包含非功能性prfA等位基因，并且其中在引入所述编码异源多肽的重组多核苷酸之后所述核酸可操纵地连接于PrfA应答调控元件。

68.如权利要求67所述的方法，其中所述编码异源多肽的重组多核苷酸可操纵地连接于PrfA-应答调控元件。

69.如权利要求67所述的方法，其中所述重组多核苷酸编码融合蛋白，该融合蛋白包含信号多肽和所述异源多肽。

70.如权利要求67所述的方法，其中所述编码PrfA^*突变体多肽的重组多核苷酸整合在所述李斯特菌染色体中。

71.如权利要求67所述的方法，其中所述编码异源多肽的重组多核苷酸整合在所述李斯特菌染色体中。

72.如权利要求70所述的方法，其中可操纵地连接于PrfA-应答调控元件的所述编码异源多肽的重组多核苷酸整合在所述李斯特菌染色体的tRNA^arg基因中。

73.如权利要求69所述的方法，其中所述信号多肽是ActA信号多肽，并且其中将编码异源多肽的所述核酸引入到所述李斯特菌的actA基因中。