CN104955835B

CN104955835B - 促进抗原序列的李斯特菌表达的信号肽融合配偶体以及其制备和使用方法

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Publication number: CN104955835B
Application number: CN201380068458.4A
Authority: CN
Inventors: P·M·劳尔; W·G·汉森; J·斯库伯; M·L·L·梁; M·法森; D·布洛克斯泰德; T·W·杜本斯盖
Original assignee: Aduro Biotech Inc
Current assignee: Chinook Therapeutics Inc
Priority date: 2012-12-27
Filing date: 2013-12-27
Publication date: 2020-04-17
Anticipated expiration: 2033-12-27
Also published as: JP6671408B2; CN104955835A; AU2013370210A8; EP2938627A4; EA201590397A1; HK1215260A1; EP2938627A1; CA2888727A1; WO2014106123A8; BR112015015076A2; SG11201502792TA; KR20150099738A; JP2016503655A; AU2013370210A1; EA201590397A8; EP2938627B1; US9663557B2; SG10201700916SA; US20170253637A1; AU2018203555A1

Abstract

本发明提供核酸、表达系统和疫苗菌株，所述核酸、表达系统和疫苗菌株提供目标抗原向宿主细胞的胞质溶胶中的有效表达和分泌，并且通过将作为N‑末端融合配偶体的李斯特菌或其它细菌的信号肽/分泌陪伴分子在翻译读码框中与所选重组编码蛋白抗原功能性连接来引发有效的CD4和CD8T细胞反应。使这些N‑末端融合配偶体缺失(通过实际缺失、通过突变或通过这些途径的组合)所述序列原有的任何PEST序列和/或某些疏水性残基。

Description

促进抗原序列的李斯特菌表达的信号肽融合配偶体以及其制备和使用方法

本发明要求2012年12月27日提交的美国临时专利申请61/746,237和2013年3月13日提交的美国临时专利申请61/780,744的优先权，这两个美国临时专利申请各自以其整体(包括所有表、图和权利要求)特此以引用方式并入。

发明背景

提供以下对本发明背景技术的论述仅为了帮助读者理解本发明，而不承认是描述或构成本发明的现有技术。

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes/Lm)是兼性细胞内细菌，其特征在于其能够诱导深度的先天免疫反应，从而产生对疫苗编码的抗原具有特异性的稳健且高功能性的CD4和CD8T细胞免疫。Lm是在免疫受损个体(包括患有癌症或其它病毒诱发的免疫缺陷的患者、孕妇、老年人和婴儿)中的致病性增加的食源性细菌。

经工程化成编码与所选靶向病原体或恶性病相关的指定抗原的重组修饰的Lm疫苗平台已构成若干人类临床试验的基础。由于李斯特菌属(Listeria)可以是致病性生物体并且在免疫受损的情况下尤其如此，因此优选施用步骤包括施用编码目标抗原的可表达免疫活性部分的减毒李斯特菌属。“减毒”是指对细菌进行修饰以减少或消除其致病性，但保持其充当目标疾病的预防剂或治疗剂的能力的过程。举例来说，缺失两个毒力基因并且在小鼠李斯特菌病模型中减毒>3log的经遗传界定的减毒活LmΔactAΔinlB保持其免疫效力并且已在人疾病的小鼠模型中以及在人体中均显示诱导稳健的CD4和CD8T细胞免疫，并且已在患有不同实体瘤恶性病的患者中在临床环境中显示是安全和耐受良好的。

李斯特菌属菌株最通常经工程化成分泌作为与所分泌的李斯特菌蛋白(例如李斯特菌溶血素O(LLO)或ActA)的全部或一部分的融合物的肿瘤抗原。已表明，关于所述疫苗构建体的功效的可能原因可能是LLO和ActA内存在被称为“PEST”基序的氨基酸序列。PEST区(P，脯氨酸；E，谷氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸)是存在于某些蛋白的NH2或COOH末端附近的亲水性氨基酸序列。认为其靶向被细胞蛋白酶体快速降解的蛋白。为了被T淋巴细胞识别，必须将蛋白抗原转化成结合展示于抗原呈递细胞表面上的MHC分子的短肽。并且实际上已表明LLO的PEST区对于李斯特菌疫苗的成功至关重要，因为可通过缩短蛋白的细胞半衰期来增加可用于通过MHC I类分子呈递的肽的供应。

发明概要

本发明提供核酸、表达系统和疫苗菌株，所述核酸、表达系统和疫苗菌株提供目标抗原向宿主细胞的胞质溶胶中的有效表达和分泌，并且通过将作为N-末端融合配偶体的李斯特菌或其它细菌的信号肽/分泌陪伴分子在翻译读码框中与所选重组编码的蛋白抗原功能性连接来引发有效的CD4和CD8T细胞反应。这些细菌N-末端信号肽/分泌陪伴分子融合配偶体引导从重组细菌合成的融合蛋白在受感染宿主哺乳动物细胞中的分泌。如下文所述，使这些N-末端融合配偶体缺失(通过实际缺失、通过突变或通过这些途径的组合)所述序列原有的任何PEST序列。

相对于天然多肽序列在PEST序列的修饰方面以及任选地在长度和/或信号序列外部疏水性基序的存在方面对细菌N-末端信号肽/分泌陪伴分子融合配偶体进行了修饰。举例来说，ActA可被截短而缺失C-末端膜结合结构域，并且在某些实施方案中甚至进一步减少融合蛋白中非抗原残基的数目。另外，还使这些N-末端融合配偶体中并非信号序列的一部分以及形成多肽序列中的疏水性基序的一个或多个疏水性残基缺失(再次通过实际缺失，通过突变，或通过这些途径的组合)。所得融合蛋白以高水平表达并且对含于所述融合蛋白中的目标抗原产生稳健的免疫反应。

在第一方面，本发明涉及多核苷酸，其包含：

(a)启动子；和

(b)可操作地连接到所述启动子的核酸，其中所述核酸编码融合蛋白，所述融合蛋白包含：

通过分泌的李斯特菌蛋白序列的重组修饰衍生的多肽，呈未修饰形式的所述分泌的李斯特菌蛋白序列包含信号序列和一个或多个PEST基序，所述修饰包括通过或置换一个或多个残基来去除每个所述PEST基序以使得所述多肽缺少任何PEST基序；和

非李斯特菌抗原。

在某些实施方案中，可将N-末端信号肽/分泌陪伴分子融合配偶体衍生自ActA或LLO。将ActA或LLO多肽序列的PEST基序中的一个或多个P、E、S和T残基并且优选每个P、E、S和T残基用非P、E、S和T的残基置换。如下文所述，甚至去除单个残基也可使这一基序较不为“PEST样”。或者，可简单地使ActA或LLO多肽序列的PEST基序中的一个或多个P、E、S和T残基并且优选每个P、E、S和T残基缺失。举例来说，可将PEST基序中各P、E、S和T残基用K或R置换。衍生的多肽最优选保留呈未修饰形式的所述分泌的李斯特菌蛋白序列(例如，ActA或LLO)的信号序列。

在分泌的李斯特菌蛋白序列为ActA序列的情况下，优选使PEST基序KTEEQPSEVNTGP的至少75％缺失。在某些优选实施方案中，使序列KTEEQPSEVNTGP或KTEEQPSEVNTGPR缺失。在分泌的李斯特菌蛋白序列为LLO序列的情况下，优选使PEST基序KENSISSMAPPASPPASPK的至少75％缺失。在某些优选实施方案中，优选使序列KENSISSMAPPASPPASPK或NSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHAD缺失。

任选地，可将形成疏水性基序的序列用一个或多个非疏水性氨基酸置换。因此，N-末端信号肽/分泌陪伴分子融合配偶体的修饰可进一步包括去除并非分泌的李斯特菌蛋白序列中信号序列的一部分的一个或多个疏水性结构域；和/或用非疏水性氨基酸置换一个或多个疏水性结构域内并非分泌的李斯特菌蛋白序列中信号序列的一部分的一个或多个残基。就下文所述实施例来说，可将ActA中的序列LIAML用序列QDNKR替代。

如本文所述，任选地相对于亲本蛋白(例如，ActA或LLO)的天然长度截短N-末端信号肽/分泌陪伴分子融合配偶体。举例来说，ActA可被截短而缺失C-末端膜结合结构域，并且在某些实施方案中甚至进一步减少所述融合蛋白中非抗原残基的数目。类似地，LLO可约在残基484之前被截短以消除胆固醇结合，并且在某些实施方案中甚至进一步再次减少融合蛋白中非抗原残基的数目。

在优选实施方案中，所述分泌的李斯特菌蛋白序列衍生自ActA序列并且所述多肽包含图2中称作dlPEST和dlPEST qdnkr的序列中一者的至少前95个残基。

在优选实施方案中，所述分泌的李斯特菌蛋白序列衍生自LLO序列并且所述多肽包含图2中称作LLO dlPEST和LLO dl26的序列中一者的至少前95个残基。

在某些实施方案中，所述启动子提供在将细菌引入宿主生物体中后诱导融合蛋白在宿主细胞中表达的调控序列。仅举例来说，所述启动子是PrfA依赖型单核细胞增生李斯特菌启动子。PrfA依赖型启动子可选自inlA启动子、inlB启动子、inlC启动子、hpt启动子、hly启动子、plcA启动子、mpl启动子和actA启动子。

本发明融合蛋白的非李斯特菌抗原部分包含一个或多个经选择以诱导对编码的异源抗原具有特异性的所需免疫反应(即，使所治疗病况的症状减少、预防或改善)的序列。在某些实施方案中，非李斯特菌抗原包含一个或多个编码癌细胞、肿瘤或感染原抗原的序列。

在一个相关方面，本发明的多核苷酸是作为质粒、载体等的组分提供的。

在另一相关方面，本发明提供经修饰而包含本发明多核苷酸的重组李斯特菌属细菌。在各实施方案中，多核苷酸可以以附加方式提供，或可整合到细菌基因组中。重组李斯特菌属细菌可例如通过所述细菌的基因组actA和/或inlB基因的功能缺失加以进一步修饰以减毒。在某些实施方案中，将本发明的多核苷酸插入所述细菌的基因组actA或inlB基因中。本发明的细菌可用作表达所述细菌的一个或多个异源基因的表达平台，例如用于对从那些基因表达的异源蛋白产生免疫反应的用途。因此，该方面可提供包含重组李斯特菌属细菌和药理学上可接受的赋形剂的疫苗。

在又一相关方面，本发明提供用于在哺乳动物中刺激对非李斯特菌抗原的免疫反应的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的本文所述的李斯特菌属细菌，其中所述非李斯特菌抗原在所述哺乳动物的一个或多个细胞中表达。

附图简述

图1以示意形式绘示了ActA的某些功能属性。

图2绘示了ActA和LLO的序列的多种修饰。

图3绘示了使用epestfind算法评分的PEST基序在LLO序列中的位置。

图4绘示了使用epestfind算法评分的ActA序列中的4个PEST基序。

图5绘示了在用表达具有多种经修饰ActA和LLO融合配偶体的融合构建体的单核细胞增生李斯特菌免疫后的B3Z T-细胞活化测定的结果。

图6绘示了来自某些LLO441(A)和ActAN100(B)疫苗菌株的反应。

图7绘示了使用ActA作为模型系统用于使PEST基序缺失的若干置换和缺失。

图8绘示了在ActAN100的亲水性图上对疏水性基序LIAML进行修饰的结果。

图9绘示了在用CT-26肿瘤细胞激发后用表达具有融合至人间皮素残基35-621的经修饰ActAN100序列的融合构建体的单核细胞增生李斯特菌免疫的动物的存活百分比。

图10绘示了示意性地绘示的本发明EGFRvIII_20-40/NY-ESO-1_1-165融合构建体和通过蛋白质印迹确定的所述融合构建体的表达。

图11绘示了在用表达具有融合至EGFRvIII_20-40/NY-ESO-1_1-165的经修饰ActAN100序列的融合构建体的单核细胞增生李斯特菌免疫后，通过细胞内细胞因子染色作为(A)IFN-γ阳性EGFRvIII特异性CD8+T细胞百分比和(B)每个脾脏的IFN-γ阳性EGFRvIII特异性CD8+T细胞的绝对数目确定的EGFR特异性T细胞反应。

图12绘示了在用表达具有融合至EGFRvIII_20-40/NY-ESO-1_1-165的经修饰ActAN100序列的融合构建体的单核细胞增生李斯特菌免疫后的NY-ESO-1特异性CD8+T细胞反应。

发明详述

本发明涉及用于制备用于在李斯特菌属细菌中表达的抗原融合蛋白的组合物和方法。本发明可提供具有有利安全特性的减毒细菌疫苗菌株用于治疗或预防具有不适合于减毒活疫苗的风险-收益特性的疾病。虽然下文对单核细胞增生李斯特菌进行了详细地描述，但本领域技术人员将理解本文所述的方法和组合物通常可适用于李斯特菌种。

单核细胞增生李斯特菌(Lm)是兼性细胞内细菌，其特征在于其能够诱导深度的先天免疫反应，从而产生对疫苗编码的抗原具有特异性的稳健且高功能性的CD4和CD8T细胞免疫。Lm是在免疫受损个体(包括患有癌症或其它病毒诱发的免疫缺陷的患者、孕妇、老年人和婴儿)中的致病性增加的食源性细菌。为了引发所需的CD8T细胞反应，基于Lm的疫苗必须保持在通过称为李斯特菌溶血素O(LLO)的成孔溶细胞素的表达介导的过程中从受感染树突细胞(DC)的液泡逃逸的能力，并且所需抗原经工程化成从细菌表达并分泌于细胞质中，它们随后在细胞质中被加工并呈递于MHC I类分子上。

在Lm疫苗菌株的开发中，在抗原表达水平与对抗原加工的要求之间明显存在某种分立。虽然基于Lm的疫苗的免疫效力与宿主细胞中的抗原表达和分泌的水平直接相关，但已表明抗原特异性免疫反应的有效MHC I类和II类引发和诱导取决于细胞的蛋白水解机构对抗原的快速周转。

本文提供抗原表达盒，所述抗原表达盒引起编码的抗原向宿主细胞的胞质溶胶中的有效表达和分泌，并且通过将作为N-末端融合配偶体的李斯特菌或其它细菌的信号肽/分泌陪伴分子在翻译读码框中与所分泌的重组编码的蛋白抗原功能性连接来引发有效的CD4和CD8T细胞反应。这些细菌N-末端信号肽/分泌陪伴分子融合配偶体引导从重组细菌合成的融合蛋白在受感染宿主哺乳动物细胞中的分泌。如下文所述，使这些N-末端融合配偶体缺失(通过实际缺失、通过突变或通过这些途径的组合)所述序列原有的任何PEST序列。任选地，使这些N-末端融合配偶体中并非信号序列一部分的疏水性残基缺失(再次通过实际缺失、通过突变或通过这些途径的组合)。所得融合蛋白以高水平表达并且对含于所述融合蛋白中的目标抗原产生稳健的免疫反应。

在优选实施方案中，所述融合蛋白与Lm PrfA诱导型启动子功能性连接。在野生型单核细胞增生李斯特菌中，优选的非限制性实例分别是驱动李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白表达的hly启动子和驱动ActA蛋白表达的actA启动子。在受感染哺乳动物宿主细胞内诱导PrfA依赖型启动子并且以高水平合成功能性连接的蛋白。与PrfA依赖型启动子功能性连接的包含所选抗原的经编码融合蛋白在宿主细胞中时间上受调控的高水平表达促进抗原加工和呈递，从而引起最佳的由Lm疫苗诱导的免疫反应。

如下文所述，N-末端信号肽/分泌陪伴分子融合配偶体的优选非限制性实例是衍生自单核细胞增生李斯特菌的经修饰LLO或ActA蛋白。LLO和ActA N-末端信号肽/分泌陪伴分子融合配偶体可与李斯特菌PrfA依赖型启动子(例如，hly启动子或actA启动子)功能性连接。在优选实施方案中，提供用于与任何所选抗原序列框内融合的缺少任何PEST样序列基序的ActA和LLO N-末端信号肽/分泌陪伴分子融合配偶体。所述PEST^-N-末端融合配偶体在本文中被称作PEST^-ActA和PEST^-LLO。

图1以示意形式绘示了ActA的某些功能属性。加下划线区绘示了PEST序列在天然ActA序列中的位置。在某些实施方案中，N-末端信号肽/分泌陪伴分子衍生自ActA，因为其包含ActA的信号序列并且约在ActA的残基389氨基酸处被截短以使包含跨膜区的C-末端结构域缺失。如本文所用的术语“约”在此背景下是指+/-25个氨基酸残基。

就对分泌的李斯特菌蛋白进行修饰以提供供N-末端融合配偶体使用的信号肽/分泌陪伴分子来说，如本文所用的术语“衍生的”是指去除李斯特菌蛋白原有的PEST序列，并且还任选地相对于天然长度截短和/或对信号序列外部的一个或多个疏水性基序进行修饰。举例来说，ActA可被截短而缺失C-末端膜结合结构域，并且在某些实施方案中甚至进一步减少融合蛋白中非抗原残基的数目。另外，还使这些N-末端融合配偶体中并非信号序列的一部分以及形成多肽序列中的疏水性基序的一个或多个疏水性残基缺失(再次通过实际缺失、通过突变或通过这些途径的组合)。如下文所述，所得融合蛋白以高水平表达并且对含于所述融合蛋白中的目标抗原产生稳健的免疫反应。

类似地，天然LLO含有529个残基并且包含25个残基的信号序列以及之后的4个结构域。结构域4大约是残基415-529并且含有胆固醇结合区。结构域1含有单个PEST序列。在某些实施方案中，N-末端信号肽/分泌陪伴分子衍生自LLO，因为其包含LLO的信号序列并且约在残基484之前被截短以消除胆固醇结合。如本文所用的术语“衍生的”在此背景下是指相对于天然LLO序列在长度、PEST序列的存在和信号序列外部疏水性基序的存在方面被修饰。优选的，经修饰ActA约在残基441处被截短。

如下文所证实，PEST序列和疏水性结构域可通过将其去除或通过残基的非保守置换或通过这些途径的组合发生功能缺失。仅举例来说，下面的实施例证明了序列QDNKR对ActA中LIAML疏水性基序的替代；以及全部或一部分ActA PEST序列的实际缺失。

应理解，本发明在其应用上并不限于以下说明书中所陈述的或附图中所图解说明的构造细节和组件布置。本发明能够具有除所述实施方案以外的实施方案，并且能够以多种方式实践和实施。还应理解，本文以及摘要所用的措辞和术语是出于说明目的且不应视为限制。

因此，本领域技术人员将了解，可容易地利用本公开所基于的概念作为设计其它结构、方法和系统的基础以供实施本发明的若干目的。因此，重要的是将权利要求视为包括此类等同构造，只要它们不脱离本发明的精神和范围。

1.定义

用于指示基因中的突变或包含所述基因的细菌中的突变的缩写如下。举例来说，缩写“单核细胞增生李斯特菌ΔactA”意指缺失一部分或全部actA基因。德尔塔(delta)符号(Δ)意指缺失。包括上标减号的缩写(李斯特菌属ActA^-)意指例如通过缺失、点突变或移码突变但不限于这些突变类型使actA基因突变。

当应用于人、哺乳动物、哺乳动物受试者、动物、兽类受试者、安慰剂受试者、研究受试者、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，“施用”是指而不限于外源性配体、试剂、安慰剂、小分子、药剂、治疗剂、诊断剂或组合物与所述受试者、细胞、组织、器官或生物流体等的接触。“施用”可指例如治疗方法、药代动力学方法、诊断方法、研究方法、安慰剂方法和实验方法。细胞的处理涵盖使试剂接触细胞以及使试剂接触流体，其中所述流体与所述细胞接触。"施用"还涵盖例如通过试剂、诊断剂、结合组合物或通过另一细胞对细胞的体外和离体处理。

当涉及配体和受体时，“激动剂”包含刺激受体的分子、分子组合、复合物或试剂组合。例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)激动剂可涵盖GM-CSF、GM-CSF的突变蛋白质或衍生物、GM-CSF的肽模拟物、模拟GM-CSF的生物功能的小分子或刺激GM-CSF受体的抗体。

当涉及配体和受体时，“拮抗剂”包含抑制、抵消、下调受体和/或使受体不敏感的分子、分子组合或复合物。“拮抗剂”涵盖任何抑制受体的组成性活性的试剂。组成性活性是没有配体/受体相互作用时显现的活性。“拮抗剂”还涵盖任何抑制或阻止受体的受刺激(或受调控)活性的试剂。举例来说，GM-CSF受体拮抗剂包括(并不意味任何限制)结合配体(GM-CSF)并且阻止其结合受体的抗体、或结合受体并且阻止配体结合受体的抗体，或其中所述抗体将受体锁定为非活性构象。

如本文所用，关于肽、多肽或蛋白质的“类似物”或“衍生物”是指与原始肽、多肽或蛋白质具有类似或相同的功能，但未必包含原始肽、多肽或蛋白质的类似或相同氨基酸序列或结构的另一肽、多肽或蛋白质。类似物优选满足下列至少一项：(a)具有与原始氨基酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列的蛋白剂；(b)由在严格条件下与编码原始氨基酸序列的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的蛋白剂；和(c)由与编码原始氨基酸序列的核苷酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列编码的蛋白剂。

“抗原呈递细胞”(APC)是用于将抗原呈递给T细胞的免疫系统细胞。APC包括树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、边缘区库普弗细胞(Kupffer cell)、小胶质细胞、郎格汉斯细胞(Langerhans cell)、T细胞和B细胞。树突细胞出现在至少两个谱系中。第一谱系涵盖前DC1、骨髓DC1和成熟DC1。第二谱系涵盖CD34⁺CD45RA^-早期多能祖细胞、CD34⁺CD45RA⁺细胞、CD34⁺CD45RA⁺CD4⁺IL-3Rα⁺前DC2细胞、CD4⁺CD11c^-类浆细胞前DC2细胞、人淋巴DC2类浆细胞源性DC2和成熟DC2。

“减毒”和“减毒的”涵盖经修饰以降低对宿主的毒性的细菌、病毒、寄生物、传染性生物体、朊病毒、肿瘤细胞、传染性生物体中的基因等。宿主可为人或动物宿主、或器官、组织或细胞。举个非限制性实例，细菌可被减毒以减少与宿主细胞的结合，减少从一个宿主细胞向另一宿主细胞的传播，减少胞外生长，或减少在宿主细胞中的细胞内生长。减毒可通过测量例如毒性的一个或多个征象、LD₅₀、从器官中的清除率、或竞争指数(参见例如Auerbuch等(2001)Infect.Immunity 69:5953-5957)来评估。通常，减毒导致LD₅₀增加和/或清除率增加至少25％；更通常增加至少50％；最通常增加至少100％(1倍)；正常增加到至少5倍；更正常增加到至少10倍；最正常增加到至少50倍；经常增加到至少100倍；更经常增加到至少500倍；并且最经常增加到至少1000倍；一般增加到至少5000倍；更一般增加到至少10,000倍；并且最一般增加到至少50,000倍；并且最经常增加到至少100,000倍。

“减毒基因”涵盖介导对宿主的毒性、病理或毒力、在宿主内生长或在宿主内存活的基因，其中所述基因以减轻、降低或消除毒性、病理或毒力的方式突变。可通过比较由突变基因介导的毒力或毒性与由非突变(或亲本)基因介导的毒力或毒性来评估所述降低或消除。“突变基因”涵盖基因调控区、基因编码区、基因非编码区或其任一组合中的缺失、点突变和移码突变。

“保守修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。对于特定核酸序列，保守修饰变体是指编码相同氨基酸序列或具有一个或多个保守置换的氨基酸序列的核酸。保守置换的实例为将下列其中一组中的氨基酸交换为同一组的另一种氨基酸(颁发给Lee等的美国专利号5,767,063；Kyte和Doolittle(1982)J.Mol.Biol.157:105-132)。相反，非保守置换是将下列其中一组中的氨基酸交换为不同组的另一种氨基酸。

(1)疏水性：正亮氨酸、Ile、Val、Leu、Phe、Cys、Met；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳族：Trp、Tyr、Phe；和

(7)小氨基酸：Gly、Ala、Ser。

“有效量”涵盖但不限于可改善、逆转、减轻、预防或诊断医学病况或病症的症状或迹象的量。除非明确地或由上下文另外规定，否则“有效量”不限于足以改善病况的最小量。

“胞外液”涵盖例如血清、血浆、血液、间质液、脑脊髓液、分泌液、淋巴液、胆汁、汗液、粪便物和尿液。“胞外液”可包括胶体或悬浮液，例如全血或凝固血液。

在多肽的背景下，术语“片段”包括如下的肽或多肽，其包含较大多肽的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列。

“基因”是指编码寡肽或多肽的核酸序列。寡肽或多肽可具生物活性、抗原活性、无生物活性或无抗原活性等。术语基因涵盖例如编码特定寡肽或多肽的开放读码框(ORF)的总和；ORF加编码内含子的核酸的总和；ORF与可操作地连接的启动子的总和；ORF与可操作地连接的启动子和任何内含子的总和；ORF与可操作地连接的启动子、内含子和启动子以及其它调控元件(例如增强子)的总和。在某些实施方案中，“基因”涵盖调控基因表达所需的任何顺式序列。术语基因还可指编码涵盖抗原的肽或者肽、寡肽、多肽或蛋白质的抗原活性片段的核酸。术语基因不一定意味编码的肽或蛋白质具有任何生物活性，或甚至肽或蛋白质具抗原活性。通常将编码不可表达序列的核酸序列视为假基因。术语基因还涵盖编码核糖核酸例如rRNA、tRNA或核酶的核酸序列。

细菌例如李斯特菌的“生长”涵盖而不限于细菌生理学功能和涉及定植、复制、蛋白质含量增加和/或脂质含量增加的基因功能。除非明确地或由上下文另外说明，否则李斯特菌的生长涵盖细菌在宿主细胞外的生长以及在宿主细胞内的生长。生长相关基因包括(而不意味任何限制)介导能量产生(例如，糖酵解、克雷布斯循环(Krebs cycle)、细胞色素)、氨基酸、糖类、脂质、矿物质、嘌呤和嘧啶的同化和/或异化作用、养分运输、转录、翻译和/或复制的基因。在一些实施方案中，李斯特菌的“生长”指李斯特菌的胞内生长，即在宿主细胞例如哺乳动物细胞内的生长。虽然可通过光学显微镜或菌落形成单位(CFU)测定来测量李斯特菌的胞内生长，但生长不受任何测量技术限制。生物化学参数例如李斯特菌抗原的量、李斯特菌核酸序列或对李斯特菌有特异性的脂质，均可用于评估生长。在一些实施方案中，介导生长的基因是特异性介导胞内生长的基因。在一些实施方案中，特异性介导胞内生长的基因涵盖但不限于其失活会降低胞内生长速率，但未显著、大幅或明显降低胞外生长(例如，在肉汤中生长)速率的基因，或其失活降低胞内生长速率的程度比其降低胞外生长速率更高的基因。为了提供非限制性实例，在一些实施方案中，失活降低胞内生长速率的程度比胞外生长更高的基因涵盖失活使胞内生长降低至不到正常值或最大值的50％，而使胞外生长降低至最大值的仅1-5％、5-10％或10-15％的情况。在某些方面，本发明涵盖在胞内生长中减毒而在胞外生长中未减毒的李斯特菌、在胞内生长中未减毒并在胞外生长中未减毒的李斯特菌、以及在胞内生长中未减毒而在胞外生长中减毒的李斯特菌。

可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、同位素或化学方法直接或间接检测“标记的”组合物。例如，可用标记包括³²P、³³P、³⁵S、¹⁴C、³H、¹²⁵I、稳定同位素、表位标签、荧光染料、电子致密试剂、底物或酶(例如用于酶联免疫测定者)、或fluorettes(参见例如Rozinov和Nolan(1998)Chem.Biol.5:713-728)。

如本文所用的“疏水性基序”是指在其为整个蛋白中的一部分的背景下通过亲水性分析展现疏水特征的一组连续氨基酸残基。“亲水性分析”是指通过Kyte和Doolittle的方法("A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of a Protein".J.Mol.Biol.157(1982)105-132)对多肽序列的分析。在此方法中，对每个氨基酸给出4.6到-4.6的疏水性评分。4.6的评分是最疏水的，且-4.6的评分是最亲水的。然后设定窗口大小。窗口大小为疏水性评分将被取平均值并分配给所述窗口中第一氨基酸的氨基酸的数目。计算开始于第一氨基酸窗口并且计算该窗口中所有疏水性评分的平均值。然后窗口下移一个氨基酸并计算第二窗口中所有疏水性评分的平均值。此模式继续到蛋白末端，计算每个窗口的平均评分并将其分配给窗口中的第一个氨基酸。然后将平均值标绘于图上。y轴代表疏水性评分且x轴代表窗口号。对20种常见氨基酸使用以下疏水性评分。

“配体”是指为受体的激动剂或拮抗剂的小分子、肽、多肽或膜缔合或膜结合分子。“配体”还涵盖非激动剂或拮抗剂并且无激动剂或拮抗剂性质的结合剂。常规地，配体在第一细胞上与膜结合时，受体通常出现在第二细胞上。第二细胞可具有与第一细胞相同的身份(同名)，或其可具有不同身份(异名)。配体或受体可完全在细胞内，即，其可留在胞质溶胶、细胞核或在一些其它细胞内隔室中。配体或受体可改变其位置，例如从细胞内隔室到质膜的外面。配体与受体的复合物称为“配体受体复合物”。配体和受体参与信号传导路径时，配体出现在信号传导路径的上游位置，而受体出现在信号传导路径的下游位置。

“核酸”是指呈单链、双链形式或多链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合物。核酸的非限制性实例是例如cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸。特定核酸序列还可隐含地涵盖“等位基因变体”和“剪接变体”。

在启动子和编码mRNA的核酸的背景下，“可操作地连接”意指启动子可用于引发该核酸的转录。

术语“序列同一性百分比”和“序列同一性％”是指通过比较或比对两个或更多个氨基酸或核酸序列发现的序列相似性百分比。同一性百分比可如下确定，通过比对序列直接比较两种分子之间的序列信息，对两个比对序列之间的精确匹配数进行计数，除以较短序列的长度并将结果乘以100。用于计算序列同一性的算法为Smith-Waterman同源性搜索算法(参见例如Kann和Goldstein(2002)Proteins 48:367-376；Arslan等(2001)Bioinformatics 17:327-337)。

当提及多肽时，“纯化的”和“分离的”意指多肽在于自然界中与之缔合的其它生物大分子实质性缺乏时存在。如本文所用的术语“纯化的”意指鉴别的多肽经常占所存在多肽的至少50重量％，更经常占至少60重量％，通常占至少70重量％，更通常占至少75重量％，最通常占至少80重量％，一般占至少85重量％，更一般占至少90重量％，最一般占至少95重量％，并且常规占至少98重量％或更大。水、缓冲液、盐、洗洁剂、还原剂、蛋白酶抑制剂、稳定剂(包括添加的蛋白质，例如白蛋白)和赋形剂以及分子量小于1000的分子的重量通常不用于多肽纯度的测定。参见例如颁发给Covacci等的美国专利号6,090,611中对纯度的论述。

“肽”是指其中氨基酸通过肽键彼此连接的短氨基酸序列。肽可游离或与另一部分(例如大分子、脂质、寡糖或多糖、和/或多肽)结合存在。当肽并入多肽链时，术语“肽”仍可用于特指短氨基酸序列。“肽”可通过肽键或一些其它类型的键合与另一部分连接。肽的长度为至少两个氨基酸并且长度通常小于约25个氨基酸，其中最大长度取决于惯例或背景。术语“肽”和“寡肽”可互换使用。

“PEST基序”在本文中被定义为至少12个氨基酸长度的亲水性区段，其具有高局部浓度的P、E、S和T氨基酸，并且根据epestfind算法将其评分为有效PEST基序。带负电氨基酸在这些基序内成簇存在，而带正电氨基酸精氨酸(R)、组氨酸(H)和赖氨酸(K)通常是被禁止的。epestfind算法更严格地定义了最后准则，因为要求PEST基序侧接带正电氨基酸。对带正电侧部之间的所有氨基酸进行计数并且仅进一步考虑那些含有大量等于或高于窗口大小参数的氨基酸的基序。另外，要求所有'有效的'PEST区含有至少一个脯氨酸(P)、一个天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)和至少一个丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。将不满足上述准则的序列归类为'无效的'PEST基序。

借助于基于关键氨基酸的局部富集度以及基序的疏水性的评分参数对“有效的”PEST基序进行精确化。将D、E、P、S和T的富集度以质量百分比(w/w)表示并且针对1当量的D或E、1当量的P和1当量的S或T进行校正。疏水性的计算原则上遵循J.Kyte和R.F.Doolittle的方法。为了简化计算，将最初在-4.5(对于精氨酸)到+4.5(对于异亮氨酸)范围内的Kyte-Doolittle亲水性指数转化为正整数。这是通过下面的线性变换实现的，从而得到0(对于精氨酸)到90(对于异亮氨酸)的值。

亲水性指数＝10*Kyte-Doolittle亲水性指数+45

将基序的疏水性计算为每一氨基酸种类的的摩尔百分比和疏水性指数的乘积的总和。所需PEST评分是作为局部富集度项与疏水性项的组合获得，如由下面的公式表示：

PEST评分＝0.55*DEPST-0.5*疏水性指数。

另外，epestfind算法包括由南加利福尼亚大学的Robert H.Stellwagen提出的对酪氨酸亲水性指数的校正。然而，PEST评分可在-45(对于聚异亮氨酸)到约+50(对于聚天冬氨酸加上一个脯氨酸和一个丝氨酸)范围内。'有效的'PEST基序是高于阈值评分5.0的那些并视为具有真正的生物学价值。

“蛋白质”通常是指构成多肽链的氨基酸序列。蛋白质还可指多肽的三维结构。“变性蛋白质”是指具有一些残留三维结构的局部变性多肽，或可选地，指基本上随机的三维结构，即完全变性。本发明涵盖多肽变体的试剂和使用多肽变体的方法，例如包括糖基化、磷酸化、硫酸化、二硫键形成、脱酰胺、异构化、信号或前导序列加工中的裂解点、共价和非共价结合的辅因子、氧化变体等。描述了二硫键连接的蛋白质的形成(参见例如Woycechowsky和Raines(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.4:533-539；Creighton等(1995)TrendsBiotechnol.13:18-23)。

提及例如核酸、细胞、动物、病毒、质粒、载体等时所使用的“重组”指示通过引入外源非天然核酸、改变天然核酸或通过由重组核酸、细胞、病毒、质粒或载体全部或部分衍生进行的修饰。重组蛋白是指衍生自重组核酸、病毒、质粒、载体等的蛋白质。“重组细菌”涵盖其中基因组通过重组方法(例如通过突变、缺失、插入和/或重排的方式)工程化的细菌。“重组细菌”还涵盖经修饰以包括重组基因组外核酸(例如质粒或第二条染色体)的细菌、或现有基因组外核酸改变的细菌。

“样品”是指来自人、动物、安慰剂或研究样品的样品，例如细胞、组织、器官、流体、气体、气溶胶、浆液、胶体或凝固材料。“样品”可在体内测试，例如无需从人或动物体内取出，或可在体外测试。例如可在通过组织学方法加工后进行测试样品。“样品”还是指例如包含流体或组织样品的细胞、或从流体或组织样品分离的细胞。“样品”还可指从人或动物刚刚采集的细胞、组织、器官或流体，或指加工或储存的细胞、组织、器官或流体。

“可选标记物”涵盖允许人们选出或淘汰含有可选标记物的细胞的核酸。可选标记物的实例包括但不限于例如：(1)编码对原本有毒的化合物(例如抗菌素)提供抗性的产物或编码对原本无害的化合物(例如蔗糖)的敏感性的核酸；(2)编码受体细胞中原本缺乏的产物(例如tRNA基因、营养缺陷型标记物)的核酸；(3)编码抑制基因产物活性的产物的核酸；(4)编码可容易地鉴别的产物(例如表型标记物，例如β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)、细胞表面蛋白、表位标签、FLAG标签)的核酸；(5)编码可通过杂交技术(例如PCR或分子信标)鉴别的核酸。

当提及配体/受体、核酸/互补核酸、抗体/抗原或其它结合对(例如细胞因子与细胞因子受体)时，“特异性”或“选择性”结合指示决定蛋白质和其它生物制剂的异源群体中蛋白质的存在的结合反应。因此，在指定条件下，指定配体结合特定受体而未大量结合样品中存在的其它蛋白质。特异性结合还可意指例如衍生自预期方法的抗体的抗原结合位点的结合化合物、核酸配体、抗体或结合组合物与其靶结合，其中亲和力比与任何其它结合化合物的亲和力经常高至少25％，更经常高至少50％，最经常高至少100％(1倍)，正常高至少9倍，更正常高至少19倍，最正常高至少99倍。

在典型实施方案中，抗体的亲和力大于约10⁹升/mol，如例如通过斯卡查德分析(Scatchard analysis)测定(Munsen等(1980)Analyt.Biochem.107:220-239)。本领域技术人员认识到，一些结合化合物可与一种以上靶特异性结合，例如抗体与其抗原特异性结合，通过抗体的寡糖与凝集素特异性结合，和/或通过抗体的Fc区与Fc受体特异性结合。

细菌的“传播”涵盖如例如通过囊泡介导的“细胞到细胞的传播”，即，将细菌从第一宿主细胞传递到第二宿主细胞。涉及传播的功能包括但不限于例如肌动蛋白尾的形成、伪足样延伸的形成和双膜液泡的形成。

如本文所用的术语“受试者”是指人或非人生物体。因此，本文所述的方法和组合物适用于人与兽类疾病两者。在某些实施方案中，受试者是“患者”，即，接受对疾病或病况的医疗护理的活人。这包括正在被调查病理学体征的无限定疾病的人。

重组酶的“靶位点”是被重组酶识别、结合和/或作用的核酸序列或区域(参见例如颁发给Graham等的美国专利号6,379,943；Smith和Thorpe(2002)Mol.Microbiol.44:299-307；Groth和Calos(2004)J.Mol.Biol.335:667-678；Nunes-Duby等(1998)Nucleic AcidsRes.26:391-406)。

“治疗有效量”定义为试剂或药物组合物足以诱导对编码的异源抗原具有特异性的所需免疫反应、显示患者益处即使受治病况的症状减少、抑制或改善的的量。当试剂或药物组合物包含诊断剂时，将“诊断有效量”定义为足以产生信号、图像或其它诊断参数的量。药物制剂的有效量将根据多种因素而变化，例如受试者的敏感程度、受试者的年龄、性别和体重以及受试者的特异体质反应(参见例如颁发给Netti等的美国专利号5,888,530)。

“治疗(Treatment/treating)”(关于病况或疾病)是用于获得优选包括临床结果在内的有益或预期结果的方法。出于本发明的目的，关于疾病的有益或预期结果包括但不限于以下一项或多项：改善与疾病相关的病况、治愈疾病、减轻疾病的严重程度、延缓疾病进展、缓解与疾病相关的一种或多种症状、提高患病者的生活质量和/或延长存活期。同样，出于本发明的目的，关于病况的有益或预期结果包括但不限于但不限于以下一项或多项：改善与病况、治愈病况、减轻病况的严重程度、延缓病况进展、缓解与病况相关的一种或多种症状、提高患有病况者的生活质量和/或延长存活期。

“疫苗”涵盖预防性疫苗。疫苗还涵盖治疗性疫苗，例如向包含与所述疫苗提供的抗原或表位相关的病况或疾病的哺乳动物施用的疫苗。已开发了许多细菌种类用作疫苗并且其可用于本发明中，包括但不限于弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、大肠杆菌(Escherichia coli)、单核细胞增生李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)或分支杆菌属种(mycobacterium species)。此列表并非意在限制。参见例如WO04/006837；WO07/103225；和WO07/117371，所述专利各自以其整体(包括所有表、图和权利要求)特此以引用方式并入。疫苗组合物中使用的细菌载体可为兼性细胞内细菌载体。所述细菌可用于将本文所述的多肽递送至宿主生物体中的抗原呈递细胞。如本文所述，单核细胞增生李斯特菌为本发明抗原的表达提供了优选的疫苗平台。

抗原构建体

靶抗原

本文所述融合蛋白的优选特征是当通过单核细胞增生李斯特菌疫苗平台在宿主中重组表达时能够引发对抗原的先天免疫反应以及抗原特异性T细胞反应。例如，如本文所述表达抗原的单核细胞增生李斯特菌可诱导1型干扰素(IFN-α/β)和使疫苗诱导的免疫反应的性质定形的一系列共调趋化因子和细胞因子蛋白。响应于这种免疫刺激，依照静脉内接种途径将NK细胞和抗原呈递细胞(APC)募集到肝，或可选地，依照其它接种途径(例如，通过肌肉、皮下或皮内免疫途径)募集到接种部位。在某些实施方案中，在将本发明的疫苗平台递送至受试者24小时后，所述疫苗平台诱导选自IL-12p70、IFN-γ、IL-6、TNFα和MCP-1的一种或多种且优选全部细胞因子和趋化因子的血清浓度的增加；并且诱导对疫苗平台表达的一种或多种抗原的CD4+和/或CD8+抗原特异性T细胞反应。在其它实施方案中，本发明的疫苗平台还诱导固有未成熟肝NK细胞的成熟，如通过在小鼠模型系统中活化标记物例如DX5、CD11b和CD43的上调，或通过使用用作靶细胞的经⁵¹Cr-标记的YAC-1细胞测量的NK细胞介导的细胞溶解活性所证实。

单核细胞增生李斯特菌充当疫苗载体的能力已在Wesikirch等，Immunol.Rev.158:159-169(1997)中进行了综述。单核细胞增生李斯特菌的许多合意的自然生物学特征使其成为应用于治疗性疫苗的有吸引力的平台。主要基本原理是单核细胞增生李斯特菌的细胞内生命周期使得能够有效刺激CD4+和CD8+T细胞免疫。多种病原相关分子模式(PAMP)受体(包括TLR(TLR2、TLR5、TLR9))、核苷酸结合寡聚结构域(NOD)和干扰素基因刺激物(STING)响应于感染后与单核细胞增生李斯特菌大分子的相互作用而被触发，导致先天免疫效应子全激活和Th-1极化细胞因子释放，从而对针对表达的抗原的CD4+和CD8+T细胞反应的发生产生深远影响。

最近已开发了单核细胞增生李斯特菌菌株作为异源蛋白的有效细胞内递送媒介物，提供抗原向免疫系统的递送以诱导对不允许注射致病剂的临床病况(例如癌症和HIV)的免疫反应。参见例如美国专利号6,051,237；Gunn等，J.Immunol.,167:6471-6479(2001)；Liau等，Cancer Research,62:2287-2293(2002)；美国专利号6,099,848；WO99/25376；WO96/14087；和美国专利号5,830,702)，所述文献中各自以其整体(包括所有表、图和权利要求)特此以引用方式并入。还已经证实了表达淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)抗原的重组单核细胞增生李斯特菌疫苗显示诱导对抗原的保护性细胞介导的免疫(Shen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:3987-3991(1995)。

在某些实施方案中，本发明的疫苗组合物中使用的单核细胞增生李斯特菌包含actA和/或inlB的减毒突变，且优选actA和inlB全部或一部分缺失(在本文中称作“LmΔactA/ΔinlB”)，并且含有编码一种或多种目标抗原的表达的重组DNA。所述抗原优选受细菌表达序列控制且稳定地整合到单核细胞增生李斯特菌基因组中。

本发明还涵盖至少一种调控因子(例如，启动子或转录因子)减毒的李斯特菌属。以下关于启动子。ActA的表达由两种不同的启动子调控(Vazwuez-Boland等(1992)Infect.Immun.60:219-230)。InlA和InlB的表达由五种启动子共同调控(Lingnau等(1995)Infect.Immun.63:3896-3903)。许多单核细胞增生李斯特菌基因(例如，hly、plcA、ActA、mpl、prfA和iap)的转录需要转录因子prfA。PrfA的调控性质由例如PrfA依赖型启动子(PinlC)和PrfA盒介导。在某些实施方案中，本发明提供编码ActA启动子、inlB启动子、PrfA、PinlC、PrfA盒等中至少一个失活、突变或缺失的核酸(参见例如Lalic Mullthaler等(2001)Mol.Microbiol.42:111-120；Shetron-Rama等(2003)Mol.Microbiol.48:1537-1551；Luo等(2004)Mol.Microbiol.52:39-52)。可通过Gly145Ser突变、Gly155Ser突变或Glu77Lys突变使PrfA具组成性活性(参见例如Mueller和Freitag(2005)Infect.Immun.73:1917-1926；Wong和Freitag(2004)J.Bacteriol.186:6265-6276；Ripio等(1997)J.Bacteriol.179:1533-1540)。

可用于本发明的靶抗原的实例列示于下表中。靶抗原还可为包含表中所列示抗原的免疫活性部分的片段或融合多肽。此列表并非意在限制。

表1.抗原。

本领域内已知作为适合抗原的其它生物体包括但不限于沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A群链球菌)、无乳链球菌(Streptococcus agalactia)(B群链球菌)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrheae)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、沙门氏菌属种(包括伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌)、肠道菌(enterica)(包括幽门螺杆菌(Helicobactor pylori)、弗氏志贺菌和其它D群志贺菌属种)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、梭菌属种(Clostridium species)(包括艰难梭菌(C.difficile))、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和创伤弧菌(V.vulnificus)。此列表并非意在限制。

如本文所述的抗原序列优选作为与ActA或LLO分泌性信号序列框内融合至单核细胞增生李斯特菌ActA或LLO蛋白的经修饰氨基末端部分的单一多肽表达。ActA信号序列是MGLNRFMRAMMVVFITANCITINPDIIFA；LLO信号序列是MKKIMLVFIT LILVSLPIAQ QTE。优选地，所用天然信号序列在构建体中未经修饰。

在一些实施方案中，经修饰ActA包含ActA的约前100个氨基酸的经修饰形式，在本文中称作ActA-N100。ActA-N100具有以下序列：

VGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE50

QPSEVNTGPR YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG

100

在此序列中，第一残基被绘示为缬氨酸；所述多肽是通过李斯特菌属合成的，在此位置具有甲硫氨酸。因此，ActA-N100还可具有以下序列：

MGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE

50

QPSEVNTGPR YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG

100

本发明的构建体还可包含一个或多个位于经修饰ActA的C-末端残基与抗原序列之间的额外非ActA残基。在以下序列中，ActA-N100通过引入BamH1位点而添加的两个残基得以延伸：

VGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE50

QPSEVNTGPR YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG

100

GS

当被合成为具有第一残基甲硫氨酸时，其具有序列：

MGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE

50

QPSEVNTGPR YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG

100

GS。

这些序列然后可充当用于通过PEST基序和任何现有疏水性基序的缺失(实际或功能)来进行修饰的基础。因此，本发明的经修饰ActA可包含以下序列或由以下序列组成(虚线指示缺失并且粗体文体指示置换)：

VGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEE----

50

----------YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADQDNKRKAKAEKG 100

在此序列中，第一残基被绘示为缬氨酸；所述多肽是通过李斯特菌属合成的，在此位置具有甲硫氨酸。因此，经修饰者还可包含以下序列(SEQ ID NO:4)或由以下序列(SEQID NO:4)组成：

MGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEE---- 50

----------YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADQDNKRKAKAEKG 100

在这些情况下，任选地包括用QDNKR进行的置换与PEST基序的缺失，并且如上所述，本发明的这些构建体还可包含一个或多个位于经修饰ActA的C-末端残基与抗原序列之间的额外非ActA残基。

或者，抗原序列优选作为融合至单核细胞增生李斯特菌LLO蛋白的经修饰氨基末端部分的单一多肽表达，这允许来自所述细菌的融合蛋白在接种宿主内表达和分泌。在这些实施方案中，抗原构建体可为包含可操作地连接到编码融合蛋白的核酸序列的启动子的多核苷酸，其中所述融合蛋白包含(a)经修饰LLO和(b)一个或多个在经修饰LLO序列后待作为融合蛋白表达的抗原表位。LLO信号序列是MKKIMLVFIT LILVSLPIAQ QTEAK。在一些实施方案中，启动子是hly启动子。

在一些实施方案中，经修饰LLO包含LLO的约前441个氨基酸的经修饰形式，在本文中称作LLO-N441。LLO-N441具有以下序列：

在此序列中，PEST基序由KENSISSMA PPASPPASPK表示。该基序可通过用以下序列(虚线指示缺失并且粗体文本指示置换)：

KE-----------------替代或通过其完全缺失来功能性地缺失。这意为仅是示例。

由于由一种生物体编码的序列未必是经优化用于在所选疫苗平台细菌菌株中最佳表达的密码子，因此本发明还提供利用经优化用于通过细菌(例如单核细胞增生李斯特菌)表达的密码子改变的核酸。

在各实施方案中，改变至少1％的任何非最佳密码子以提供最佳密码子，更正常改变至少5％，最正常改变至少10％，经常改变至少20％，更经常改变至少30％，最经常改变至少40％，一般改变至少50％，更一般改变至少60％，最一般改变至少70％，较佳地改变至少80％，更佳地改变至少90％，最佳地改变至少95％，并且常规对100％的任何非最佳密码子进行密码子优化以用于李斯特菌属表达(表2)。

表2.用于在李斯特菌属中表达的最佳密码子。

本发明供应大量用于制备或工程化本发明细菌的李斯特菌属种和菌株。本发明的李斯特菌属并不限于表3中公开的菌种和菌株。

表3.适用于本发明(例如，作为疫苗或作为核酸源)的李斯特菌属菌株。

治疗组合物。

本文所述的细菌组合物可以足以诱导适当免疫反应的量单独或与药学上可接受的赋形剂组合施用至宿主。免疫反应可包括但不限于特异性免疫反应、非特异性免疫反应、特异性反应与非特异性反应两者、先天反应、初次免疫反应、适应性免疫、二次免疫反应、记忆免疫反应、免疫细胞活化、免疫细胞增殖、免疫细胞分化和细胞因子表达。本发明的疫苗可例如冷冻、冻干、作为悬浮液、作为细胞糊剂或与固体基质或凝胶基质复合储存。

在某些实施方案中，在对受试者施用有效剂量的第一疫苗以引发免疫反应后，施用第二疫苗。这在本领域中称作“初免-加强”方案。在所述方案中，本发明的组合物和方法可用作“初免”递送，用作“加强”递送，或用作“初免”与“加强”两者。可递送任何次数的“加强”免疫以维持疫苗诱导的免疫反应的量级或有效性。

例如，包含编码且表达抗原多肽的杀死但具代谢活性的李斯特菌属的第一疫苗可作为“初免”递送，并且包含编码抗原多肽的减毒(活的或杀死但具代谢活性的)李斯特菌属的第二疫苗可作为“加强”递送。然而，应理解，初免和加强各自皆不必利用本发明的方法和组合物。而是，本发明涵盖使用其它疫苗形式以及本发明的细菌疫苗方法和组合物。以下是适合的混合初免-加强方案的实例：DNA(例如，质粒)疫苗初免/细菌疫苗加强；病毒疫苗初免/细菌疫苗加强；蛋白质疫苗初免/细菌疫苗加强；DNA初免/细菌疫苗加强加上蛋白质疫苗加强；细菌疫苗初免/DNA疫苗加强；细菌疫苗初免/病毒疫苗加强；细菌疫苗初免/蛋白质疫苗加强；细菌疫苗初免/细菌疫苗加强加上蛋白质疫苗加强等。此列表并非意在限制。

初免疫苗和加强疫苗可通过相同途径或通过不同途径施用。术语“不同途径”涵盖但不限于不同的身体部位，例如口服、非口服、肠、肠胃外、直肠、节内(淋巴节)、静脉内、动脉、皮下、皮内、肌内、瘤内、瘤周围、输注、粘膜、鼻、在脑脊髓空间或脑脊髓液内等部位，以及通过不同模式，例如口服、静脉内和肌内。

初免或加强疫苗的有效量可以单剂量给予，但不限于单剂量。因此，施用可以是2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次、20次或更多次的疫苗施用。如果在本发明方法中有多于一次的一种或多种疫苗的施用，则施用隔开的时间间隔可为1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟或更多分钟，间隔可为约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时等。在小时的背景下，术语“约”意指加或减30分钟内的任何时间。施用隔开的时间间隔还可为1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天和其组合。本发明并不限于时间相等隔开的给药间隔，而是涵盖以不相等的间隔来给药，例如由在1天、4天、7天和25天施用组成的初免方案，这只是为了提供非限制性实例。

在某些实施方案中，加强接种的施用可在开始初免接种后约5天开始；开始初免接种后约10天开始；开始施用初免接种后约15天；约20天；约25天；约30天；约35天；约40天；约45天；约50天；约55天；约60天；约65天；约70天；约75天；约80天；约6个月和约1年开始。优选地，初免和加强接种中的一者和两者包括递送本发明的组合物。

“药学上可接受的赋形剂”或“诊断上可接受的赋形剂”包括但不限于无菌蒸馏水、盐水、磷酸盐缓冲溶液、基于氨基酸的缓冲液或碳酸氢盐缓冲溶液。所选赋形剂和所用赋形剂的量将取决于施用方式。施用可为口服、静脉内、皮下、皮肤、皮内、肌内、粘膜、肠胃外、器官内、病灶内、鼻内、吸入、眼内、肌内、血管内、节点内、通过划痕、直肠、腹膜内或多种熟知施用途径中的任一种或组合。施用可包括注射、输注或其组合。

通过非口服途径施用本发明的疫苗可避免耐受性。本领域中已知用于以以下方式施用的方法：静脉内、皮下、皮内、肌内、腹膜内、口服、粘膜、经由尿道、经由生殖道、经由胃肠道或通过吸入。

用于特定患者的有效量可根据例如所治疗病况、患者的总体健康状况、施用的途径和剂量以及副作用严重程度的因素而变化。治疗和诊断的方法的指南是可获得的(参见例如Maynard等(1996)A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice,InterpharmPress,Boca Raton,FL；Dent(2001)Good Laboratory and Good Clinical Practice,UrchPubl.,London,UK)。

本发明的疫苗可以如下的剂量或剂量方案来施用，其中各剂量包含至少100个细菌细胞/kg体重或更多；在某些实施方案中1000个细菌细胞/kg体重或更多；正常至少10,000个细胞/kg体重；更正常至少100,000个细胞/kg体重；最正常至少1百万个细胞/kg体重；经常至少1千万个细胞/kg体重；更经常至少1亿个细胞/kg体重；通常至少10亿个细胞/kg体重；一般至少100亿个细胞/kg体重；常规至少1000亿个细胞/kg体重；并且有时至少1兆个细胞/kg体重。本发明提供上述剂量，其中细菌施用单位是菌落形成单位(CFU)(在补骨脂素处理之前CFU的等价物)或其中单位是细菌细胞数。

本发明的疫苗可以以一个剂量或多个剂量施用，其中各剂量包含10⁷至10⁸个细菌/70kg体重(或/1.7平方米表面积；或/1.5kg肝重)；2×10⁷至2×10⁸个细菌/70kg体重(或/1.7平方米表面积；或/1.5kg肝重)；5×10⁷至5×10⁸个细菌/70kg体重(或/1.7平方米表面积；或/1.5kg肝重)；10⁸至10⁹个细菌/70kg体重(或/1.7平方米表面积；或/1.5kg肝重)；2.0×10⁸至2.0×10⁹个细菌/70kg(或/1.7平方米表面积、或/1.5kg肝重)；5.0×10⁸至5.0×10⁹个细菌/70kg(或/1.7平方米表面积、或/1.5kg肝重)；10⁹至10¹⁰个细菌/70kg(或/1.7平方米表面积、或/1.5kg肝重)；2×10⁹至2×10¹⁰个细菌/70kg(或/1.7平方米表面积、或/1.5kg肝重)；5×10⁹至5×10¹⁰个细菌/70kg(或/1.7平方米表面积、或/1.5kg肝重)；10¹¹至10¹²个细菌/70kg(或/1.7平方米表面积、或/1.5kg肝重)；2×10¹¹至2×10¹²个细菌/70kg(或/1.7平方米表面积、或/1.5kg肝重)；5×10¹¹至5×10¹²个细菌/70kg(或/1.7平方米表面积、或/1.5kg肝重)；10¹²至10¹³个细菌/70kg(或/1.7平方米表面积)；2×10¹²至2×10¹³个细菌/70kg(或/1.7平方米表面积、或/1.5kg肝重)；5×10¹²至5×10¹³个细菌/70kg(或/1.7平方米表面积、或/1.5kg肝重)；10¹³至10¹⁴个细菌/70kg(或/1.7平方米表面积、或/1.5kg肝重)；2×10¹³至2×10¹⁴个细菌/70kg(或/1.7平方米表面积、或/1.5kg肝重)；5×10¹³至5×10¹⁴个细菌/70kg(或/1.7平方米表面积、或/1.5kg肝重)；10¹⁴至10¹⁵个细菌/70kg(或/1.7平方米表面积、或/1.5kg肝重)；2×10¹⁴至2×10¹⁵个细菌/70kg(或/1.7平方米表面积、或/1.5kg肝重)等(湿重)。

还提供上述剂量中的一种或多种，其中剂量通过以下方式施用：每天注射一次、每2天注射一次、每3天注射一次、每4天注射一次、每5天注射一次、每6天注射一次或每7天注射一次，其中注射方案维持例如仅1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、5周或更久。本发明还包括上述剂量和方案的组合，例如，相对大的初始细菌剂量，随后是相对小的后续剂量，或者相对小的初始剂量，随后是大剂量。

例如每周1次、每周2次、每周3次、每周4次、每周5次、每周6次、每周7次、每2周1次、每3周1次、每4周1次、每5周1次等的给药方案可用于本发明。给药方案涵盖给药的总时间段为例如1周、2周、3周、4周、5周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月和12个月。

提供上述给药方案的周期。所述周期可约例如每7天；每14天；每21天；每28天；每35天；42天；每49天；每56天；每63天；每70天等重复。非给药的间隔可出现在周期之间，其中间隔可为约例如7天；14天；21天；28天；35天；42天；49天；56天；63天；70天等。在此背景下，术语“约”意指加或减1天、加或减2天、加或减3天、加或减4天、加或减5天、加或减6天或加或减7天。

本发明涵盖口服施用李斯特菌属的方法。还提供静脉内施用李斯特菌属的方法。此外，提供口服、肌内、静脉内、皮内和/或皮下施用李斯特菌属的方法。本发明供应通过在为肉基或者含有源自肉或动物产品的多肽的培养基中生长来制备的李斯特菌属细菌、或李斯特菌属细菌的培养物或悬浮物。本发明还供应通过在不含肉或动物产品的培养基中生长来制备，通过在含有植物多肽的培养基上生长来制备，通过在不基于酵母产物的培养基上生长来制备，或通过在含有酵母多肽的培养基上生长来制备的李斯特菌属细菌、或李斯特菌属细菌的培养物或悬浮物。

与其它治疗剂共同施用的方法为本领域内所熟知(Hardman等(编)(2001)Goodmanand Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill,NewYork,NY；Poole和Peterson(编)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Pactice:APractical Approach,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,PA；Chabner和Longo(编)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,PA)。

还可使用其它有益于提高胞溶性T细胞反应的试剂。所述试剂在本文中被称为载体。这些包括但不限于B7共刺激分子、白介素-2、干扰素-γ、GM-CSF、CTLA-4拮抗剂、OX-40/OX-40配体、CD40/CD40配体、沙格司亭、左旋咪唑、牛痘病毒、卡介苗(BCG)、脂质体、明矾、弗氏完全或不完全佐剂、经去毒的内毒素、矿物油、表面活性物质(例如卵磷脂(lipolecithin))、普流尼克多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子、肽和油或烃乳液。优选相对于抗体反应优先刺激胞溶性T细胞反应的用于诱导T细胞免疫反应的载体，但也可使用刺激两种类型反应的那些。在试剂是多肽的情况下，可施用多肽本身或编码多肽的多核苷酸。载体可为细胞，例如抗原呈递细胞(APC)或树突细胞。抗原呈递细胞包括例如巨噬细胞、树突细胞和B细胞等细胞类型。其它专业抗原呈递细胞包括单核细胞、边缘区库普弗细胞、小胶质细胞、郎格汉斯细胞、指突状树突细胞、滤泡树突细胞和T细胞。还可使用兼性抗原呈递细胞。兼性抗原呈递细胞的实例包括星形细胞、滤泡细胞、内皮细胞和成纤维细胞。载体可为经转化以表达多肽或递送多核苷酸的细菌细胞，所述多核苷酸随后在接种受试者的细胞中表达。可添加例如氢氧化铝或磷酸铝等佐剂以提高疫苗触发、增强或延长免疫反应的能力。单独或与所述组合物组合使用的其它物质，例如细胞因子、趋化因子和细菌核酸序列(如CpG)、toll样受体(TLR)9激动剂以及用于TLR 2、TLR 4、TLR 5、TLR 7、TLR 8、TLR9的其它激动剂，包括脂蛋白、LPS、单磷酰脂质A、脂磷壁酸、咪喹莫特、瑞喹莫德和其它类似免疫调节剂例如环状二核苷酸STING激动剂(包括c-二-GMP、c-二-AMP、c-二-IMP和c-AMP-GMP)也是潜在佐剂。佐剂的其它代表性实例包括包含从皂树(Quillaja saponaria)树皮纯化的均质皂苷的合成佐剂QS-21和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)(McCune等，Cancer,1979；43:1619)。应理解，佐剂经过优化。换句话说，本领域技术人员可进行常规实验来确定使用的最佳佐剂。

治疗剂的有效量是将症状减少或改善正常至少10％、更正常至少20％、最正常至少30％、通常至少40％、更通常至少50％、最通常至少60％、经常至少70％、更经常至少80％、且最经常至少90％、常规至少95％、更常规至少99％、且最常规至少99.9％的量。

本发明的试剂和方法提供仅包含一次接种、或包含第一次接种、或包含至少一次加强接种、至少两次加强接种或至少三次加强接种的疫苗。用于加强接种的参数指南是可获得的。参见例如Marth(1997)Biologicals 25:199-203；Ramsay等(1997)Immunol.CellBiol.75:382-388；Gherardi等(2001)Histol.Histopathol.16:655-667；Leroux-Roels等(2001)ActA Clin.Belg.56:209-219；Greiner等(2002)Cancer Res.62:6944-6951；Smith等(2003)J.Med.Virol.70:增刊1:S38-S41；Sepulveda-Amor等(2002)Vaccine 20:2790-2795)。

治疗剂制剂可通过与生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂以例如冻干粉末、浆液、水溶液或悬浮液形式混合来制备以供储存(参见例如Hardman等(2001)Goodman andGilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis等(编)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等(编)(1990)PharmaceuticalDosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等(编)(1990)PharmaceuticalDosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.，New York,NY)。

实施例

以下实施例用于说明本发明。这些实施例决非意在限制本发明的范围。

实施例1.

图2绘示了在以下实施例中测试的ActA和LLO的序列的多种修饰。

关于经修饰ActA序列，将亲本ActA序列于残基100处截短，并经通过引入BamH1位点而添加的两个残基得以延伸，这两个残基作为残基G101和S102示于图中。PEST序列的修饰涉及图中所示的缺失，并且还绘示了疏水性基序LIAML对QDNKR的任选置换。关于经修饰LLO序列，将亲本LLO序列于残基441处截短。PEST序列的修饰涉及图中所示的缺失。在每种情况下，使所绘示的信号肽/分泌陪伴分子元件与所选抗原序列框内功能性连接。

实施例2.

图3绘示了使用epestfind算法评分的PEST基序在LLO序列中的位置。如上文实施例1中所述对具有+4.72的评分的单个基序进行修饰。所述图的顶部还示出了亲水性图。显示了可如本文所述修饰的多个疏水性基序(在序列示意图上方上升的峰)。

类似地，图4绘示了使用epestfind算法评分的ActA序列中的四个PEST基序。这些基序中的第一个具有+10.27的评分，并且如上文实施例1中所述进行修饰。其余PEST基序通过于残基100处截短ActA序列而缺失。在所述图的顶部还示出了亲水性图。疏水性基序LIAML显然为ActAN100中序列示意图的上方上升的峰。

实施例3.

图5显示在用图中所示构建体免疫后的B3Z T细胞活化测定的结果。在每种抗原构建体中，将HIVgag表达融合至SIINFEKL(“SL8”)表位标签并且插入宿主LmΔactAΔinlB疫苗菌株的基因组中。将DC2.4细胞用所选菌株感染，并且与OVA_257-264-特异性T细胞杂交瘤B3Z一起培育。通过使用显色底物测量β-半乳糖苷酶表达来评估SIINFEKL表位在H-2K^b I类分子上的呈递。如图中所示，PEST序列的缺失对测定结果具有正面或中性作用。

实施例4.

图6显示来自LLO441(A)和ActAN100疫苗菌株的反应。对BALB/c小鼠以5×10⁶个菌落形成单位(cfu)静脉内接种一次含有N-末端融合配偶体(其含有PEST基序或缺失PEST基序)的指定疫苗菌株，以直接比较这些仅在N-末端LLO或ActA融合配偶体的组成上不同的同基因菌株的免疫原性。在接种后7天的Lm疫苗反应峰时，收获小鼠脾脏并且通过IFN-γELISpot测定来确定对H2K^d-限制性HIV Gag_197-205表位AMQMLKETI具有特异性的HIV-GagCD8T细胞反应，所述测定是使用Lympholyte-Mammal(Cedarlane Labs,Burlin gton,NC)和鼠类IFN-γELISpot对(BD Biosciences,San Jose,CA)利用从小鼠全血分离的淋巴细胞进行的。在实验结束时，对脾细胞进行ELISpot测定。在37℃下将2×10⁵个细胞/孔与适当的肽在抗鼠类IFN-γ涂覆的ELISpot板(Millipore,Billerica,MA)中培育过夜。作为阴性对照，不将细胞与肽一起培育。使用碱性磷酸酶检测试剂(Inv itrogen,Carlsbad,CA)使鼠类ELISpot显色并使用Immunospot读板仪和软件(CTL Ltd,Cleveland,OH)扫描和定量。

接种含有PEST^-LLO₄₄₁N-末端分泌/陪伴分子元件的Lm疫苗菌株的小鼠产生的HIVGag-特异性CD8T细胞反应高于接种含有具有PEST基序的LLO₄₄₁N-末端分泌/陪伴分子元件的同基因Lm疫苗菌株的小鼠。接种含有PEST^-ActAN100N-末端分泌/陪伴分子元件的Lm疫苗菌株的小鼠产生的HIV Gag-特异性CD8T细胞反应至少等同于接种含有具有PEST基序的ActAN100N-末端分泌/陪伴分子元件的同基因Lm疫苗菌株的小鼠。

实施例5.

图7绘示了使用ActA作为模型系统用于使PEST基序缺失的若干替代性置换和缺失。ActAN100序列中5个P、E、S和T氨基酸(E50、P52、S53、E54、T57)中的任一个对带正电残基(R、K或H)的置换足以消除使用pestfinder算法获得的正评分。

图8.更详细地绘示了在所得亲水性图上对疏水性基序LIAML进行修饰的结果。对QDNKR的非保守置换足以去除此序列的疏水性质。

实施例6.

使用ActA-N100(MGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEQPSEVNTGPR YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG gs)和其中PEST基序已缺失并且含有非保守QDNKR置换的其经修饰形式(MGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAATDSEDSSLNT DEWEEEYETA REVSSRDIEE LEKSNKVKNT NKADQDNKRK AKAEKgl；在本文中称作ActA-N100*)来制备具有人间皮素残基35-621的融合构建体(上面的小写残基因用于制备框内融合物的限制位点而被包括在ActA序列与间皮素序列之间)。所述构建体整合于单核细胞增生李斯特菌ΔactAΔinlB的染色体tRNA^Arg基因座。在第0天用2×10⁵个表达人间皮素的CT-26肿瘤细胞激发Balb/c小鼠。在第4天和第17天对小鼠治疗性地接种李斯特菌属疫苗菌株。此实验的结果是作为接种动物的存活百分比绘示于图9中。如所示，基于ActA-N100的疫苗与基于ActA-N100*的疫苗之间在功效上没有差异。

实施例7.

制备类似于实施例6的单核细胞增生李斯特菌ΔactAΔinlB，其中间皮素抗原序列由5拷贝的EGFRvIII_20-40序列和NY-ESO-1_1-165替代。用于抗原构建体中的DNA和蛋白序列如下(小写，未加下划线：actA启动子；小写，加下划线：限制位点；大写，粗体：ActAN100*序列；大写，加下划线：EGFRvIII20-40x5；大写，斜体：NY-ESO-1(1-165)(将肽序列中的每个EGFRvIII_20-40重复加双下划线，并且使用前导Val密码子来编码Met)：

融合构建体示意性地绘示于图10的左图中。用LmΔactA/ΔinlB(图10，右图，泳道1)、BH3763(EGFRvIII_20-40/NY-ESO-1_1-165)或BH3816(其中选择标记物已缺失的具有EGFRvIII_20-40/NY-ESO-1_1-165的临床菌株)感染小鼠树突细胞系DC2.4。7小时后，将细胞洗涤，溶解，在SDS-PAGE上运行，并且转移至硝酸纤维素。利用针对ActA蛋白的氨基末端产生的兔多克隆抗体探测蛋白质印迹并且将表达水平归一化为与受感染细胞的细菌计数相关的李斯特菌属P60蛋白。通过研究菌株与临床菌株两者来使高水平的融合构建体表达。

对雌性B10.Br小鼠(n＝5只/组)静脉内接种不同剂量的BH3816(LmΔactAΔinlBEGFRvIII-NY-ESO-1)。通过细胞内细胞因子染色来确定EGFR-特异性T细胞反应，并且将其作为(A)IFN-γ阳性EGFRvIII-特异性CD8+T细胞百分比；和(B)每个脾脏的IFN-γ阳性EGFRvIII-特异性CD8+T细胞的绝对数目绘示于图11中。观察到稳健的EGFR T细胞反应。如图12中所绘示，还观察到NY-ESO-1-特异性CD8+T细胞反应，如在使用已确定的H-2^d限制性表位ARGPESRLL进行初免接种后7天通过细胞内细胞因子染色所确定。

本领域技术人员容易了解，本发明非常适合于实现所述目标并获得所提及的目的和优点，以及其中固有的目的和优点。本文所提供的实施例代表优选实施方案，其为例示性的且并非意在作为对本发明范围的限制。

本领域技术人员将容易明了，可在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本文所公开的发明进行各种替代和修改。

说明书中所提及的所有专利和出版物均表明本发明所属领域技术人员的水平。所有专利和出版物均以引用方式并入本文中，其并入程度如同具体地且个别地指示将每一个别出版物以引用方式并入一般。

本文适当地说明性描述的发明可在没有本文未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下实施。因此，例如，在本文中的每种情况下，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中任一者均可被另两个术语中任一者替代。所采用的术语和表达是以描述而非限制的术语使用，并且使用这些术语和表达并非意在排除所显示和描述的特征或其部分的任何等同物，而应认识到可在所要求的本发明范围内作出各种修改。因此，应理解，虽然已通过优选实施方案和任选特征具体地披露了本发明，但本文披露的构思的修改和变更可为本领域技术人员采用，并且认为这些修改和变更在如由所附权利要求书所界定的本发明范围内。

其它实施方案陈述于下面的权利要求书内。

Claims

1.一种多核苷酸，其包含：

(a)启动子；和

通过李斯特菌ActA蛋白序列的重组修饰衍生的多肽，所述多肽的序列为MGLNRFMRAMMVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEYETA REVSSRDIEE LEKSNKVKNT NKADQDNKRKAKAEKG；和

非李斯特菌抗原。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多肽保留了呈未修饰形式的所述李斯特菌ActA蛋白序列的所述信号序列。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的多核苷酸，其中所述启动子是actA或hly启动子。

4.根据权利要求1-2中任一项所述的多核苷酸，其中所述非李斯特菌抗原是癌细胞、肿瘤或感染原抗原。

5.一种质粒，其包含根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸。

6.一种李斯特菌属细菌，其包含根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸。

7.根据权利要求6所述的李斯特菌属细菌，其为单核细胞增生李斯特菌。

8.根据权利要求7所述的李斯特菌属细菌，其通过所述细菌的基因组actA基因的功能缺失来减毒。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的李斯特菌属细菌，其中将根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸插入所述细菌的基因组actA或inlB基因中。

10.有效量的根据权利要求6-9中任一项所述的李斯特菌属细菌在制备用于在哺乳动物中刺激对非李斯特菌抗原的免疫反应的药物中的用途，其中所述非李斯特菌抗原在所述哺乳动物的一个或多个细胞中表达。

11.一种疫苗，其包含根据权利要求6-9中任一项所述的李斯特菌属细菌和药理学上可接受的赋形剂。

12.一种产生用于疫苗中的李斯特菌属细菌的方法，其包括：

将根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸整合到所述李斯特菌属细菌的基因组中。

13.根据权利要求12所述的方法，其中将根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸插入所述细菌的基因组actA或inlB基因中。