JP7227237B2 - ホットスポットを利用した新生抗原の特定 - Google Patents

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腫瘍特異的な新生抗原に基づいた治療用ワクチン及びＴ細胞療法は、次世代の個別化がん免疫療法として極めて有望である１～３。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及びメラノーマなどの高い遺伝子変異量を有するがんは、新生抗原を生じる可能性が比較的高いことから、かかる治療法の特に有望な標的である４，５。初期の証拠により、新生抗原に基づいたワクチン接種がＴ細胞応答を誘発し６、新生抗原を標的としたＴ細胞療法が、選択された患者において腫瘍退縮を引き起こしうる７ことが示されている。ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩはいずれもＴ細胞の応答に影響を及ぼす７０～７１。
しかしながら、新生抗原及び新生抗原認識Ｔ細胞の特定は、腫瘍応答を評価し７７，１１０、腫瘍進化を調べ１１１、次世代の個別化療法を設計する１１２うえで中心的な課題となっている。現在の新生抗原特定法は、時間と手間がかかるか８４，９６、または精度が充分とはいえない８７，９１－９３。新生抗原認識Ｔ細胞は、ＴＩＬの主成分であり８４，９６，１１３，１１４、がん患者の末梢血中を循環している１０７ことが近年、示されたが、新生抗原反応性Ｔ細胞を特定するための現在の方法は、（１）ＴＩＬ９７，９８または白血球除去療法１０７などの取得困難な臨床検体に頼ったものである、（２）非実用的に大きなペプチドのライブラリーをスクリーニングする必要がある、または（３）少数のＭＨＣアレルについてのみ実用上、利用可能であり得るＭＨＣアレルに頼ったものである、という制約条件のいくつかの組み合わせを有している。
さらに、次世代のシークエンシング、ＲＮＡ遺伝子発現、及び新生抗原ペプチドのＭＨＣ結合親和性の予測を用いた、変異に基づいた分析を取り入れた初期の方法が提案されている８。しかしながら、これらの提案されている方法では、遺伝子発現及びＭＨＣ結合以外の多くの段階（例えば、ＴＡＰ輸送、プロテアソーム切断、ＭＨＣ結合、ペプチド－ＭＨＣ複合体の細胞表面への輸送、及び／またはＭＨＣ－ＩのＴＣＲによる認識；エンドサイトーシスまたはオートファジー、細胞外またはリソソームプロテアーゼ（例えばカテプシン）による切断、ＨＬＡ－ＤＭにより触媒されるＨＬＡ結合に対するＣＬＩＰペプチドとの競合、ペプチド－ＭＨＣ複合体の細胞表面への輸送、及び／またはＭＨＣ－ＩＩのＴＣＲによる認識）を含む９エピトープ生成プロセスの全体をモデル化することはできない。したがって、既存の方法は、陽性適中率（ＰＰＶ）が低くなるという問題を有する傾向にある（図１Ａ）。
実際、複数の群によって実施された、腫瘍細胞により提示されるペプチドの分析は、遺伝子発現及びＭＨＣ結合親和性を用いて提示されることが予測されたペプチドの５％未満しか腫瘍表面のＭＨＣ上に見られないことを示している１０，１１（図１Ｂ）。結合予測とＭＨＣ提示との間のこのような低い相関は、変異の数単独に対してチェックポイント阻害剤反応について結合に制限された新生抗原の予測精度の向上が認められないことによってさらに指示されている１２。
提示を予測するための既存の方法のこのような低い陽性適中率（ＰＰＶ）は、新生抗原に基づいたワクチンの設計における、また、新生抗原に基づいたＴ細胞療法における問題を提示する。ＰＰＶの低い予測を用いてワクチンが設計される場合、大部分の患者で治療用新生抗原が投与される可能性は低くなり、複数の新生抗原が投与される患者はさらに少なくなるものと考えられる（提示されるペプチドのすべてが免疫原性であると仮定したとしても）。同様に、治療用のＴ細胞がＰＰＶの低い予測に基づいて設計される場合、大部分の患者で腫瘍新生抗原に対する反応性を有するＴ細胞が投与される可能性が低くなり、予測後に下流の検査方法を用いて予測新生抗原を特定する時間及び物理的リソースのコストが不要に高くなり得る。したがって、現行の方法による新生抗原ワクチン接種及びＴ細胞療法は、腫瘍を有する対象の相当数において奏功する可能性は低い（図１Ｃ）。
さらに、これまでのアプローチは、シス作用性の変異のみを用いて候補新生抗原を生成するものであり、複数の腫瘍タイプで生じ、多くの遺伝子で異常スプライシングにつながるスプライシング因子の変異１３、及びプロテアーゼ切断部位を生じるかまたは除去する変異を含む、新生ＯＲＦのさらなるソースをほとんどの場合で考慮していなかった。
最後に、腫瘍ゲノム及びトランスクリプトーム解析に対する標準的アプローチは、ライブラリ構築、エクソーム及びトランスクリプトームの捕捉、シークエンシング、またはデータ分析における最適に満たない条件のために、候補新生抗原を生ずる体細胞突然変異を見逃す可能性がある。同様に、標準的な腫瘍分析のアプローチでは、配列アーチファクトまたは生殖系列多型を新生抗原として誤って助長してしまう場合があり、それぞれワクチン容量の非効率的な利用または自己免疫のリスクにつながりうる。
本明細書では、個別化がんワクチン用の、Ｔ細胞療法用の、またはその両方のための新生抗原を特定及び選択するための最適化されたアプローチが開示される。第１に、次世代新生抗原（ＮＧＳ）を用いた新生抗原候補を特定するための最適化された腫瘍エクソーム及びトランスクリプトーム解析アプローチに対する取り組みを行う。これらの方法は、最も感度及び特異性の高い新生抗原候補がすべてのクラスのゲノム変化にわたって発展されるように、ＮＧＳによる腫瘍解析の標準的アプローチに立脚したものである。第２に、特異性の問題を克服し、ワクチン添加用に、及び／またはＴ細胞療法の標的として開発される新生抗原が抗腫瘍免疫をより誘発しやすくするために高ＰＰＶの新生抗原選択に対する新規なアプローチが提供される。これらのアプローチには、実施形態に応じて、ペプチド－アレルマッピングを共にモデル化する訓練された統計学的回帰または非線形ディープラーニングモデル、ならびに異なる長さのペプチドにわたって統計学的効力を共有する、複数の長さのペプチドについてのアレル毎モチーフが含まれる。これらのディープラーニングモデルは、ペプチドの提示尤度を決定するうえでペプチド配列に関連付けられたｋマーブロック内の提示ホットスポットの有無を記述するパラメータも利用する。特に非線形ディープラーニングモデルは同じ細胞内の異なるＭＨＣアレルを独立したものとして扱うように設計及び訓練することができるため、線形モデル同士が互いに干渉する線形モデルに伴う問題が解決される。最後に、新生抗原に基づいた個別化ワクチンの設計及び製造に関する、また、Ｔ細胞療法用の個別化新生抗原特異的なＴ細胞の製造におけるさらなる懸案事項が解決される。
本明細書で開示されるモデルは、結合親和性で訓練された最新の予測ツール及びＭＳペプチドデータに基づいた初期の予測ツールの性能を最大で一桁上回る。ペプチドの提示をより高い信頼性で予測することにより、本モデルは、限られた量の患者の末梢血を使用し、患者当たりにつきスクリーニングするペプチドの数が少なく、ＭＨＣマルチマーに必ずしも頼らない、臨床的実用性のあるプロセスを用いた個別化療法のための新生抗原特異的または腫瘍抗原特異的なＴ細胞のより時間効率かつ費用効率の高い特定を可能とする。しかしながら、別の実施形態では、本明細書に開示されるモデルを用いることで、新生抗原または腫瘍抗原特異的なＴ細胞を特定するためにスクリーニングする必要がある、ＭＨＣマルチマーに結合したペプチドの数が少なくなることによって、ＭＨＣマルチマーを用いた腫瘍抗原特異的なＴ細胞のより時間効率及び費用効率の高い特定が可能となる。
ＴＩＬ新生エピトープデータセット及び予想される新生抗原反応性Ｔ細胞の特定タスクにおける本明細書に開示されるモデルの予測性能は、ＨＬＡのプロセシング及び提示をモデル化することによって、治療に有用な新生エピトープの予測を得ることが今や可能であることを示す。要約すると、この作業は、抗原標的化免疫療法のための実用的なインシリコの抗原特定を可能とすることにより、患者の治癒に向かう進行を加速するものである。
[本発明1001]
腫瘍細胞の表面上に提示される可能性の高い、対象の1つ以上の腫瘍細胞に由来する1つ以上の新生抗原を特定するための方法であって、
前記対象の前記腫瘍細胞及び正常細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記ヌクレオチドシークエンシングデータが、前記腫瘍細胞からの前記ヌクレオチドシークエンシングデータと前記正常細胞からの前記ヌクレオチドシークエンシングデータとを比較することにより特定された新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられ、各新生抗原のペプチド配列が、前記ペプチド配列を前記対象の前記正常細胞から特定される対応する野生型のペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を含む、前記取得する工程；
前記新生抗原のそれぞれのペプチド配列を、対応する数値ベクトルにコード化する工程であって、各数値ベクトルが、前記ペプチド配列を構成する複数のアミノ酸と前記ペプチド配列内の前記アミノ酸の位置のセットとに関する情報を含む、前記コード化する工程；
前記新生抗原のそれぞれのペプチド配列を、前記対象の前記ヌクレオチドシークエンシングデータの複数のｋマーブロックのうちの1つ以上のｋマーブロックと関連付ける工程；
前記新生抗原のセットについて提示尤度のセットを生成するために、コンピュータプロセッサを使用して、前記数値ベクトル及び前記1つ以上の関連付けられたｋマーブロックを機械学習させた提示モデルに入力する工程であって、前記セット内の各提示尤度が、対応する新生抗原が1つ以上のＭＨＣアレルによって前記対象の前記腫瘍細胞の表面上に提示される尤度を表し、前記機械学習させた提示モデルが、
訓練データセットに少なくとも基づいて特定される複数のパラメータであって、前記訓練データセットが、
複数の試料の各試料について、前記試料中に存在するものとして特定されたＭＨＣアレルのセット内の少なくとも1つのＭＨＣアレルに結合したペプチドの存在を測定する質量分析によって得られた標識、
前記試料のそれぞれについて、前記ペプチドを構成する複数のアミノ酸と前記ペプチド内の前記アミノ酸の位置のセットとに関する情報を含む数値ベクトルとしてコード化された訓練ペプチド配列、及び
前記試料のそれぞれについて、前記試料の前記訓練ペプチド配列のそれぞれについて、前記訓練ペプチド配列と、前記訓練ペプチド配列の前記ヌクレオチドシークエンシングデータの複数のｋマーブロックのうちの1つ以上のｋマーブロックとの間の関連付け
を含み、
前記複数のパラメータのサブセットが、前記1つ以上のｋマーブロックにおける提示ホットスポットの有無を表す、前記複数のパラメータと、
入力として受け取られた前記数値ベクトル及び前記1つ以上のｋマーブロックと、前記数値ベクトル、前記1つ以上のｋマーブロック、及び前記パラメータに基づいた出力として生成された前記提示尤度との間の関係を表す関数と
を含む、
前記入力する工程；
選択された新生抗原のセットを生成するために、前記新生抗原のセットのサブセットを、前記提示尤度のセットに基づいて選択する工程；ならびに
前記選択された新生抗原のセットを返す工程
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記数値ベクトルを前記機械学習させた提示モデルに入力する工程が、
前記ペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸に基づいてＭＨＣアレルが前記新生抗原を提示するかどうかを示す依存性スコアを前記1つ以上のＭＨＣアレルのそれぞれについて生成するために、前記機械学習させた提示モデルを前記新生抗原のペプチド配列に適用すること
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記数値ベクトルを前記機械学習させた提示モデルに入力する工程が、
各ＭＨＣアレルについて、対応するＭＨＣアレルが対応する新生抗原を提示するであろう尤度を示す対応するアレル毎尤度を生成するために、前記依存性スコアを変換することと、
前記アレル毎尤度を組み合わせて前記新生抗原の提示尤度を生成することと
をさらに含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記依存性スコアを変換することが、前記新生抗原の提示を前記1つ以上のＭＨＣアレルにわたって相互排他的なものとしてモデル化する、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記数値ベクトルを前記機械学習させた提示モデルに入力する工程が、前記提示尤度を生成するために前記依存性スコアの組み合わせを変換することをさらに含み、前記依存性スコアの組み合わせを変換することが、前記新生抗原の提示を前記1つ以上のＭＨＣアレル間で干渉するものとしてモデル化する、本発明1002の方法。
[本発明1006]
前記提示尤度のセットが、少なくとも1つ以上のアレル非相互作用特性によってさらに特定され、
前記アレル非相互作用特性に基づいて前記対応する新生抗原のペプチド配列が提示されるかどうかを示す前記アレル非相互作用特性についての依存性スコアを生成するために、前記機械学習させた提示モデルを前記アレル非相互作用特性に適用すること
をさらに含む、本発明1002～1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記1つ以上のＭＨＣアレルの各ＭＨＣアレルについての前記依存性スコアを、前記アレル非相互作用特性についての前記依存性スコアと組み合わせることと、
対応するＭＨＣアレルが対応する新生抗原を提示する尤度を示す、各ＭＨＣアレルについてのアレル毎尤度を生成するために、各ＭＨＣアレルについての前記組み合わされた依存性スコアを変換することと、
前記提示尤度を生成するために、前記アレル毎尤度を組み合わせることと
をさらに含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記ＭＨＣアレルのそれぞれについての前記依存性スコアと、前記アレル非相互作用特性についての前記依存性スコアとを組み合わせることと、
前記提示尤度を生成するために、前記組み合わされた依存性スコアを変換することと
をさらに含む、本発明1006の方法。
[本発明1009]
前記少なくとも1つ以上のアレル非相互作用特性が、前記新生抗原のペプチド配列と、前記新生抗原の前記ヌクレオチドシークエンシングデータの複数のｋマーブロックのうちの1つ以上のｋマーブロックとの間の関連付けを含む、本発明1006～1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記1つ以上のＭＨＣアレルが2つ以上の異なるＭＨＣアレルを含む、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記ペプチド配列が、アミノ酸9個以外の長さを有するペプチド配列を含む、本発明1001～1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記ペプチド配列をコード化することが、ワン・ホットエンコーディングスキームを用いて前記ペプチド配列をコード化することを含む、本発明1001～1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記複数の試料が、
（ａ）単一のＭＨＣアレルを発現するように操作された1つ以上の細胞株、
（ｂ）複数のＭＨＣアレルを発現するように操作された1つ以上の細胞株、
（ｃ）複数の患者から得られた、または複数の患者に由来する1つ以上のヒト細胞株、
（ｄ）複数の患者から得られた新鮮なまたは凍結された腫瘍試料、及び
（ｅ）複数の患者から得られた新鮮なまたは凍結された組織試料
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1001～1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記訓練データセットが、
（ａ）前記ペプチドのうちの少なくとも1つについてのペプチド－ＭＨＣ結合親和性の測定値に関連するデータ、及び
（ｂ）前記ペプチドのうちの少なくとも1つについてのペプチド－ＭＨＣ結合安定性の測定値に関連するデータ
のうちの少なくとも1つをさらに含む、本発明1001～1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記提示尤度のセットが、ＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析により測定される、前記対象における前記1つ以上のＭＨＣアレルの少なくとも発現レベルによってさらに特定される、本発明1001～1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記提示尤度のセットが、
（ａ）前記新生抗原のセット内の新生抗原と前記1つ以上のＭＨＣアレルとの間の予測される親和性、及び
（ｂ）前記新生抗原コード化ペプチド－ＭＨＣ複合体の予測される安定性
のうちの少なくとも1つを含む特性によってさらに特定される、本発明1001～1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記数値的尤度のセットが、
（ａ）そのソースタンパク質配列内の、前記新生抗原コード化ペプチド配列に隣接するＣ末端配列、及び
（ｂ）そのソースタンパク質配列内の、前記新生抗原コード化ペプチド配列に隣接するＮ末端配列
のうちの少なくとも1つを含む特性によってさらに特定される、本発明1001～1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記機械学習させた提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較して前記腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している新生抗原を選択することを含む、本発明1001～1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記機械学習させた提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較して前記対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含む、本発明1001～1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較してプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含み、任意で、前記ＡＰＣが樹状細胞（ＤＣ）である、本発明1001～1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記機械学習させた提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較して中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している新生抗原を選択することを含む、本発明1001～1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記機械学習させた提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較して前記対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している新生抗原を選択することを含む、本発明1001～1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記1つ以上の腫瘍細胞が、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される、本発明1001～1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記選択された新生抗原のセットから個別化がんワクチンを構築するための出力を生成することをさらに含む、本発明1001～1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記個別化がんワクチン用の出力が、前記選択された新生抗原のセットをコードした少なくとも1つのペプチド配列または少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記機械学習させた提示モデルが、ニューラルネットワークモデルである、本発明1001～1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記ニューラルネットワークモデルがＭＨＣアレルについての複数のネットワークモデルを含み、それぞれのネットワークモデルが複数のＭＨＣアレルのうちの対応するＭＨＣアレルに割り当てられ、かつ1つ以上の層に配置された一連のノードを含む、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記ニューラルネットワークモデルが、前記ニューラルネットワークモデルのパラメータを更新することによって訓練され、少なくとも2つのネットワークモデルの前記パラメータが、少なくとも1回の訓練イテレーションについて一緒に更新される、本発明1027の方法。
[本発明1029]
前記機械学習させた提示モデルが、ノードの1つ以上の層を含むディープラーニングモデルである、本発明1026～1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記1つ以上のＭＨＣアレルが、クラスＩ ＭＨＣアレルである、本発明1001～1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
コンピュータプロセッサと、
前記コンピュータプロセッサにより実行されると、前記コンピュータプロセッサに、
対象の腫瘍細胞及び正常細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得することであって、前記ヌクレオチドシークエンシングデータが、前記腫瘍細胞からの前記ヌクレオチドシークエンシングデータと前記正常細胞からの前記ヌクレオチドシークエンシングデータとを比較することにより特定された新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられ、各新生抗原のペプチド配列が、前記ペプチド配列を前記対象の前記正常細胞から特定される対応する野生型のペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を含む、前記取得すること；
前記新生抗原のそれぞれのペプチド配列を、対応する数値ベクトルにコード化することであって、各数値ベクトルが、前記ペプチド配列を構成する複数のアミノ酸と前記ペプチド配列内の前記アミノ酸の位置のセットとに関する情報を含む、前記コード化すること；
前記新生抗原のそれぞれのペプチド配列を、前記対象の前記ヌクレオチドシークエンシングデータの複数のｋマーブロックのうちの1つ以上のｋマーブロックと関連付けること；
前記新生抗原のセットについて提示尤度のセットを生成するために、前記数値ベクトル及び前記1つ以上の関連付けられたｋマーブロックを機械学習させた提示モデルに入力することであって、前記セット内の各提示尤度が、対応する新生抗原が1つ以上のＭＨＣアレルによって前記対象の前記腫瘍細胞の表面上に提示される尤度を表し、前記機械学習させた提示モデルが、
訓練データセットに少なくとも基づいて特定される複数のパラメータであって、前記訓練データセットが、
複数の試料の各試料について、前記試料中に存在するものとして特定されたＭＨＣアレルのセット内の少なくとも1つのＭＨＣアレルに結合したペプチドの存在を測定する質量分析によって得られた標識、
前記試料のそれぞれについて、前記ペプチドを構成する複数のアミノ酸と前記ペプチド内の前記アミノ酸の位置のセットとに関する情報を含む数値ベクトルとしてコード化された訓練ペプチド配列、及び
前記試料のそれぞれについて、前記試料の前記訓練ペプチド配列のそれぞれについて、前記訓練ペプチド配列と、前記訓練ペプチド配列の前記ヌクレオチドシークエンシングデータの前記ｋマーブロックのうちの1つ以上のｋマーブロックとの間の関連付け
を含み、
前記複数のパラメータのサブセットが、前記1つ以上のｋマーブロックにおける提示ホットスポットの有無を表す、前記複数のパラメータと、
入力として受け取られた前記数値ベクトル及び前記1つ以上のｋマーブロックと、前記数値ベクトル、前記1つ以上のｋマーブロック、及び前記パラメータに基づいた出力として生成された前記提示尤度との間の関係を表す関数と
を含む、
前記入力すること；
選択された新生抗原のセットを生成するために、前記新生抗原のセットのサブセットを、前記提示尤度のセットに基づいて選択すること；ならびに
前記選択された新生抗原のセットを返すこと
を行わせるコンピュータプログラム命令を格納したメモリと
を含む、コンピュータシステム。
本発明のこれらの特徴、態様、及び側面、ならびに他の特徴、態様、及び側面は、以下の説明文及び添付の図面に関してより深い理解が得られるであろう。
新生抗原の特定に対する現在の臨床的アプローチを示す。 予測された結合ペプチドのうち、腫瘍細胞上に提示されるものは５％未満であることを示す。 新生抗原予測の特異性の問題の影響を示す。 結合予測が、新生抗原の特定に充分ではないことを示す。 ペプチド長の関数としてのＭＨＣ－Ｉ提示の確率を示す。 Ｐｒｏｍｅｇａ社のダイナミックレンジ標準から生成された、例示的なペプチドスペクトルを示す。 特性の追加が、いかにモデルの陽性適中率を増大させるかを示す。 一実施形態による、患者におけるペプチド提示の尤度を特定するための環境の概略である。 一実施形態による、提示情報を取得する方法を説明する。 一実施形態による、提示情報を取得する方法を説明する。 一実施形態による、提示特定システムのコンピュータ論理構成要素を説明する、ハイレベルブロック図である。 一実施形態による、訓練データの例示的なセットを説明する。 ＭＨＣアレルに関連した例示的なネットワークモデルを説明する。 一実施形態による、ＭＨＣアレルによって共有される例示的なネットワークモデルＮＮＨ（・） 別の実施形態による、ＭＨＣアレルによって共有される例示的なネットワークモデルＮＮＨ（・） 例示的なネットワークモデルを用いた、ＭＨＣアレルに関連したペプチドの提示尤度の生成を説明する。 例示的なネットワークモデルを用いた、ＭＨＣアレルに関連したペプチドの提示尤度の生成を説明する。 例示的なネットワークモデルを用いた、ＭＨＣアレルに関連したペプチドの提示尤度の生成を説明する。 例示的なネットワークモデルを用いた、ＭＨＣアレルに関連したペプチドの提示尤度の生成を説明する。 例示的なネットワークモデルを用いた、ＭＨＣアレルに関連したペプチドの提示尤度の生成を説明する。 例示的なネットワークモデルを用いた、ＭＨＣアレルに関連したペプチドの提示尤度の生成を説明する。 ＮＳＣＬＣ患者における変異負荷の標本度数分布を示す。 一実施形態による、患者が最小変異負荷を満たすかどうかの選択基準に基づいて選択された患者に対してシミュレートしたワクチン中の提示新生抗原の数を示す。 一実施形態による、提示モデルに基づいて特定された治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた選択された患者と、従来技術のモデルによって特定された治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた選択された患者との間のシミュレートしたワクチン中の提示新生抗原の数を比較したものである。 ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１についての単一アレル毎提示モデルに基づいて特定された治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた選択された患者と、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２についてのアレル毎提示モデルの両方に基づいて特定された治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた選択された患者との間のシミュレートしたワクチン中の提示新生抗原の数を比較したものである。一実施形態によれば、ワクチン容量は、ｖ＝２０個のエピトープに設定される。 一実施形態による、変異負荷に基づいて選択された患者と、期待効用値スコアにより選択された患者との間でシミュレートしたワクチン中の提示新生抗原の数を比較したものである。 各試験試料が１：２５００の提示ペプチドと非提示ペプチドとの比を有する除外腫瘍試料を含む５種類の異なる除外試験試料からなる試験セットで各モデルを試験する場合のヒト腫瘍におけるＨＬＡ提示ペプチドをモデル化するためのＭＳモデルの異なるバージョン及び初期のアプローチ２９の再現率４０％での陽性適中率（ＰＰＶ）を比較したものである。 各モデルを５つの除外試験試料で試験した場合に、提示ホットスポットパラメータを使用する提示モデルと提示ホットスポットパラメータを使用しない提示モデルの再現率にわたった平均の陽性適中率（ＰＰＶ）を比較したものである。 各モデルを除外試験試料０で試験した場合の、提示ホットスポットパラメータを使用した提示モデルと提示ホットスポットパラメータを使用しない提示モデルの適合率－再現率曲線を比較したものである。 各モデルを除外試験試料１で試験した場合の、提示ホットスポットパラメータを使用した提示モデルと提示ホットスポットパラメータを使用しない提示モデルの適合率－再現率曲線を比較したものである。 各モデルを除外試験試料２で試験した場合の、提示ホットスポットパラメータを使用した提示モデルと提示ホットスポットパラメータを使用しない提示モデルの適合率－再現率曲線を比較したものである。 各モデルを除外試験試料３で試験した場合の、提示ホットスポットパラメータを使用した提示モデルと提示ホットスポットパラメータを使用しない提示モデルの適合率－再現率曲線を比較したものである。 各モデルを除外試験試料４で試験した場合の、提示ホットスポットパラメータを使用した提示モデルと提示ホットスポットパラメータを使用しない提示モデルの適合率－再現率曲線を比較したものである。 提示ホットスポットパラメータを用いた提示モデル及び提示ホットスポットパラメータを用いない提示モデルによって特定された上位５、１０、２０、及び３０位にランクされたペプチドにおけるＴ細胞により認識された体細胞変異にわたるペプチドの割合を、少なくとも１つの既存のＴ細胞応答を有する患者から採取された試験試料からなる試験セットについて比較したものである。 ９人の患者における患者特異的新生抗原ペプチドプールに対するＴ細胞応答の検出を示す。 ４人の患者における個々の患者特異的新生抗原ペプチドに対するＴ細胞応答の検出を示す。 患者ＣＵ０４についてＥＬＩＳｐｏｔウェルの例示的画像を示す。 ＨＬＡを一致させた健康なドナーにおいて新生抗原を用いた対照実験の結果を示す。 図１８Ａ－１の続きである。 ＨＬＡを一致させた健康なドナーにおいて新生抗原を用いた対照実験の結果を示す。 図１８Ｂ－１の続きである。 図１７Ａに示される各ドナー及び各インビトロ増殖についてＰＨＡ陽性対照に対するＴ細胞応答の検出を示す。 患者ＣＵ０４におけるプール＃２中のそれぞれの個々の患者特異的新生抗原ペプチドに対するＴ細胞応答の検出を示す。 患者ＣＵ０４の３回の来院のそれぞれにおける、また、患者１－０２４－００２の２回の来院のそれぞれにおける（各来院は異なる時点で行われる）、個々の患者特異的新生抗原ペプチドに対するＴ細胞応答の検出を示す。 患者ＣＵ０４の２回の来院のそれぞれにおける、また、患者１－０２４－００２の２回の来院のそれぞれにおける（各来院は異なる時点で行われる）、個々の患者特異的新生抗原ペプチドに対する、及び患者特異的新生抗原ペプチドプールに対するＴ細胞応答の検出を示す。 図１７Ａの患者について２つの患者特異的新生抗原ペプチドプール及びＤＭＳＯ陰性対照に対するＴ細胞応答の検出を示す。 ＭＨＣクラスＩＩ分子による新生抗原の提示を予測する際の提示ホットスポットパラメータを用いた提示モデルの予測性能を、提示ホットスポットパラメータを用いない提示モデルと比較したものである。 ＮＳＣＬＣ患者の末梢血由来の新生抗原特異的メモリーＴ細胞のＴＣＲをシークエンシングするための方法を示す。 図２３－１の続きである。 ＴＣＲをレシピエント細胞に導入するためのＴＣＲコンストラクトの例示的な実施形態を示す。 治療法の開発のためにＴＣＲを発現系にクローニングするための例示的なＰ５２６コンストラクト骨格のヌクレオチド配列を示す。 図２５－１の続きである。 治療法の開発のために患者の新生抗原特異的ＴＣＲのクロノタイプ１を発現系にクローニングするための例示的なコンストラクト配列を示す。 図２６－１の続きである。 治療法の開発のために患者の新生抗原特異的ＴＣＲのクロノタイプ３を発現系にクローニングするための例示的なコンストラクト配列を示す。 図２７－１の続きである。 一実施形態により、患者に個別化された新生抗原特異的治療を行うための方法のフローチャートである。 図１及び３に示した実体を実施するための例示的なコンピュータを説明する。
Ｉ．定義
一般に、特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、当業者により理解される通常の意味を有するものとして解釈されるものとする。特定の用語を、さらなる明確性を与えるために下記に定義する。通常の意味と与えられる定義との間に矛盾が存在する場合、与えられる定義が用いられるものとする。
本明細書で使用するところの「抗原」という用語は、免疫反応を誘導する物質のことである。
本明細書で使用するところの「新生抗原」という用語は、例えば、腫瘍細胞の変異、または腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾によって、抗原を対応する野生型の親抗原とは異なるものとする少なくとも１つの変化を有する抗原のことである。新生抗原は、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列を含んでよい。変異は、フレームシフトもしくは非フレームシフト挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ＯＲＦを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化を含むことができる。変異はまた、スプライス変異体も含むことができる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾は、異常リン酸化を含むことができる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾はまた、プロテアソームによって生成されるスプライス抗原も含むことができる。Ｌｉｅｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｌａｒｇｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆＨＬＡｃｌａｓｓ Ｉ ｌｉｇａｎｄｓａｒｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ－ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｐｌｉｃｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６ Ｏｃｔ ２１；３５４（６３１０）：３５４－３５８を参照されたい。
本明細書で使用するところの「腫瘍新生抗原」という用語は、対象の腫瘍細胞または組織中に存在するが、対象の対応する正常細胞または組織中には存在しない新生抗原のことである。
本明細書において使用される場合、「新生抗原ベースのワクチン」という用語は、１つ以上の新生抗原、例えば複数の新生抗原に基づいたワクチンコンストラクトのことである。
本明細書において使用される場合、「候補新生抗原」という用語は、新生抗原を表しうる新たな配列を生じる変異、または他の異常のことである。
本明細書において使用される場合、「コード領域」という用語は、タンパク質をコード化する遺伝子の部分のことである。
本明細書において使用される場合、「コード変異」という用語は、コード領域で生じる変異のことである。
本明細書において使用される場合、「ＯＲＦ」という用語は、オープンリーディングフレームを意味する。
本明細書において使用される場合、「新生ＯＲＦ」という用語は、変異またはスプライシングなどの他の異常により生じる腫瘍特異的なＯＲＦのことである。
本明細書において使用される場合、「ミスセンス変異」という用語は、１つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「ナンセンス変異」という用語は、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「フレームシフト変異」という用語は、タンパク質のフレームに変更を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「挿入欠失」という用語は、１つ以上の核酸の挿入または欠失である。
本明細書において使用される場合、２つ以上の核酸またはポリペプチドの配列との関連での「同一率」（％）という用語は、下記の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ、または当業者が利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを用いて、または目視検査により測定される、最大の一致について比較し、整列させた場合に、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定の比率（％）が同じである２つ以上の配列または部分配列のことを指す。用途に応じて、「同一率」（％）は、比較される配列の領域にわたって、例えば、機能ドメインにわたって存在するか、あるいは、比較される２つの配列の完全長にわたって存在することができる。
配列比較では、一般的に、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合には部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一率（％）を算出する。あるいは、配列の類似性または相違性は、選択された配列位置（例えば、配列モチーフ）における特定のヌクレオチドの、または翻訳後の配列ではアミノ酸の有無の組み合わせによって確立することもできる。
比較を行うための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性の探索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理による実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって実施することができる（一般的には、下記のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．を参照）。
配列同一率（％）及び配列類似率（％）を決定するのに適したアルゴリズムの１つの例として、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムがある。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公に入手可能である。
本明細書において使用される場合、「ノンストップまたはリードスルー」という用語は、天然の終止コドンの除去を引き起こす変異のことである。
本明細書において使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体が一般的に結合する、抗原の特異的な部分のことである。
本明細書において使用される場合、「免疫原性」という用語は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはその両方を介して免疫応答を誘発する能力のことである。
本明細書において使用される場合、「ＨＬＡ結合親和性」、「ＭＨＣ結合親和性」という用語は、特異的な抗原と特異的なＭＨＣアレルとの結合の親和性を意味する。
本明細書において使用される場合、「ベイト」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの特異的な配列を試料から濃縮するために使用される核酸プローブのことである。
本明細書において使用される場合、「変異」という用語は、対象の核酸と、対照として使用される参照ヒトゲノムとの差である。
本明細書において使用される場合、「変異コール」という用語は、典型的にはシークエンシングからの、変異の存在のアルゴリズム的決定である。
本明細書において使用される場合、「多型」という用語は、生殖細胞系列変異、すなわち、個体のすべてのＤＮＡ保有細胞において見出される変異である。
本明細書において使用される場合、「体細胞変異」という用語は、個体の非生殖系列細胞において生じる変異である。
本明細書において使用される場合、「アレル」という用語は、遺伝子の１つのバージョンまたは遺伝子配列の１つのバージョンまたはタンパク質の１つのバージョンのことである。
本明細書において使用される場合、「ＨＬＡ型」という用語は、ＨＬＡ遺伝子アレルの相補体のことである。
本明細書において使用される場合、「ナンセンス変異依存分解機構」または「ＮＭＤ」という用語は、未成熟な終止コドンに起因する細胞によるｍＲＮＡの分解のことである。
本明細書において使用される場合、「トランカル変異（ｔｒｕｎｃａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」という用語は、腫瘍の発生の初期に生じ、腫瘍の細胞の大部分に存在する変異である。
本明細書において使用される場合、「サブクローナル変異」という用語は、腫瘍の発生において後期に生じ、腫瘍の細胞の一部のみに存在する変異である。
本明細書において使用される場合、「エクソーム」という用語は、タンパク質をコードするゲノムのサブセットである。エクソームは、ゲノムの集合的なエクソンでありうる。
本明細書において使用される場合、「ロジスティック回帰」という用語は、従属変数が１に等しい確率のロジットが従属変数の線形関数としてモデル化される、統計からのバイナリデータ用の回帰モデルである。
本明細書において使用される場合、「ニューラルネットワーク」という用語は、多層の線形変換に続いて一般的に確率的勾配降下法及び逆伝搬により訓練された要素ごとの非線形変換を行うことからなる分類または回帰のための機械学習モデルである。
本明細書において使用される場合、「プロテオーム」という用語は、細胞、細胞の群、または個体によって発現される、及び／または翻訳されるすべてのタンパク質のセットのことである。
本明細書において使用される場合、「ペプチドーム」という用語は、細胞表面上のＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩによって提示されるすべてのペプチドのセットのことである。ペプチドームは、細胞または細胞の集合の性質を指す場合もある（例えば、腫瘍ペプチドームは、腫瘍を含むすべての細胞のペプチドームの和集合を意味する）。
本明細書において使用される場合、「ＥＬＩＳＰＯＴ」という用語は、ヒト及び動物において免疫応答を観察するための一般的な方法である、酵素結合免疫吸着スポットアッセイを意味する。
本明細書において使用される場合、「デキサトラマー」という用語は、フローサイトメトリーにおいて抗原特異的Ｔ細胞染色に使用される、デキストランベースのペプチド－ＭＨＣマルチマーである。
本明細書において使用される場合、「ＭＨＣマルチマー」という用語は、複数のペプチド－ＭＨＣモノマー単位からなるペプチド－ＭＨＣ複合体である。
本明細書において使用される場合、「ＭＨＣテトラマー」という用語は、４つのペプチド－ＭＨＣモノマー単位からなるペプチド－ＭＨＣ複合体である。
本明細書において使用される場合、「寛容または免疫寛容」という用語は、１つ以上の抗原、例えば、自己抗原に対する免疫不応答の状態のことである。
本明細書において使用される場合、「中枢性寛容」という用語は、自己反応性Ｔ細胞クローンを欠失させること、または自己反応性Ｔ細胞クローンの免疫抑制性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）への分化を促進することのいずれかにより、胸腺において与えられる寛容である。
本明細書において使用される場合、「末梢性寛容」という用語は、中枢性寛容を生き延びた自己反応性Ｔ細胞を下方制御もしくはアネルギー化すること、またはこれらのＴ細胞のＴｒｅｇへの分化を促進することにより、末梢系において与えられる寛容である。
「試料」という用語は、静脈穿刺、排泄、射精、マッサージ、生検、針吸引、洗浄試料、擦過、外科的切開、もしくは介入、または当技術分野において公知の他の手段を含む手段によって対象から採取された、単一細胞、または複数の細胞、または細胞の断片、または体液のアリコートを含むことができる。
「対象」という用語は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロ、雄または雌のいずれかの、細胞、組織、または生物体、ヒトまたは非ヒトを包含する。対象という用語は、ヒトを含む哺乳動物を含める。
「哺乳動物」という用語は、ヒト及び非ヒトの両方を包含し、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、及びブタを含むが、それらに限定されない。
「臨床的因子」という用語は、対象の状態、例えば、疾患の活性または重症度の測定を指す。「臨床的因子」は、非試料マーカーを含む、対象の健康状態のすべてのマーカー、ならびに／または、非限定的に年齢及び性別などの、対象の他の特徴を包含する。臨床的因子は、対象または所定の条件下の対象由来の試料（または試料の集団）の評定から取得され得るスコア、値、または値のセットであることができる。臨床的因子はまた、マーカー、及び／または遺伝子発現代替物などの他のパラメータによっても予測することができる。臨床的因子は、腫瘍タイプ、腫瘍サブタイプ、及び喫煙歴を含むことができる。
略語：ＭＨＣ：主要組織適合性複合体；ＨＬＡ：ヒト白血球抗原、またはヒトＭＨＣ遺伝子座；ＮＧＳ：次世代シークエンシング；ＰＰＶ：陽性適中率；ＴＳＮＡ：腫瘍特異的新生抗原；ＦＦＰＥ：ホルマリン固定パラフィン包埋；ＮＭＤ：ナンセンス変異依存分解機構；ＮＳＣＬＣ：非小細胞肺癌；ＤＣ：樹状細胞。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈によってそうでない旨が明示されない限り、複数の指示物を含む点に留意されたい。
本明細書において直接定義されていない用語は、本発明の技術分野の範囲内で理解されるような、一般的にそれらに付随する意味を有するものとして理解されるべきである。本発明の態様の組成物、装置、方法など、ならびにそれらの製造または使用法を説明するうえで実施者にさらなる手引きを与える目的で特定の用語が本明細書で検討される。同じものについて複数の言い方がなされうる点は認識されるであろう。したがって、代替的な語及び同義語が、本明細書で検討される用語の任意の１つ以上について用いられる場合がある。本明細書においてある用語が詳述または検討されているか否かに重きが置かれるべきではない。いくつかの同義語または代用可能な方法、材料などが提供される。１つまたは数個の同義語または均等物の記載は、明確に述べられない限り、他の同義語または均等物の使用を除外しない。用語の例を含む例の使用は、あくまで説明を目的としたものにすぎず、本明細書における発明の態様の範囲及び意味を限定しない。
本明細書の本文において引用されるすべての参照文献、発行特許、及び特許出願は、あらゆる目的でそれらの全容を参照により本明細書に援用するものである。
ＩＩ．新生抗原を特定する方法
本明細書では、腫瘍細胞の表面上に提示される確率の高い、対象の腫瘍細胞由来の新生抗原を特定するための方法を開示する。本方法は、対象の腫瘍細胞及び正常細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、及び／または全ゲノムのヌクレオチドシークエンシングデータを取得することを含む。このヌクレオチドシークエンシングデータを用いて新生抗原のセット内の各新生抗原のペプチド配列が取得される。新生抗原のセットは、腫瘍細胞からのヌクレオチドシークエンシングデータと、正常細胞からのヌクレオチドシークエンシングデータと比較することによって特定される。具体的には、新生抗原のセット内の各新生抗原のペプチド配列は、ペプチド配列を対象の正常細胞から特定された対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものとする少なくとも１つの変化を含む。本方法は、新生抗原のセット内の各新生抗原のペプチド配列を対応する数値ベクトルにコード化することをさらに含む。各数値ベクトルは、ペプチド配列を構成するアミノ酸及びペプチド配列内のアミノ酸の位置を記述する情報を含む。本方法は、新生抗原のそれぞれのペプチド配列を、対象のヌクレオチドシークエンシングデータの複数のｋマーブロックのうちの１つ以上のｋマーブロックと関連付けることを含む。本方法は、機械学習させた提示モデルに数値ベクトル及び関連付けられたｋマーブロックを入力することにより新生抗原のセット内の各新生抗原について提示尤度を生成することをさらに含む。各提示尤度は、対応する新生抗原が対象の腫瘍細胞の表面上のＭＨＣアレルによって提示される尤度を表す。機械学習させた提示モデルは、複数のパラメータ及び関数を含む。複数のパラメータは、訓練データセットに基づいて特定される。訓練データセットは、複数の試料の中のそれぞれの試料について、その試料中に存在するものとして特定されたＭＨＣアレルのセット内の少なくとも１つのＭＨＣアレルに結合したペプチドの存在を測定する質量分析によって得られた標識と、ペプチドを構成するアミノ酸及び／またはペプチド内のアミノ酸の位置を記述する情報を含む数値ベクターとしてコード化された訓練ペプチド配列と、試料の訓練ペプチド配列のそれぞれについて、訓練ペプチド配列と、訓練ペプチド配列のヌクレオチドシークエンシングデータの複数のｋマーブロックのうちの１つ以上のｋマーブロックとの間の関連付けと、を含む。関数は、機械学習させた提示モデルによって入力として受け取られる数値ベクトル及び関連付けられたｋマーブロックと、数値ベクトル、関連付けられたｋマーブロック、及び複数のパラメータに基づいて機械学習させた提示モデルによって出力として生成される提示尤度との間の関係を表す。本方法は、選択された新生抗原のセットを生成するために新生抗原のセットのサブセットを提示尤度に基づいて選択すること、及び選択された新生抗原のセットを返すことをさらに含む。
いくつかの実施形態では、機械学習させた提示モデルに数値ベクトルを入力することは、機械学習させた提示モデルを新生抗原のペプチド配列に適用してＭＨＣアレルのそれぞれについて依存性スコアを生成することを含む。あるＭＨＣアレルについての依存性スコアは、ペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸に基づいてそのＭＨＣアレルが新生抗原を提示するかどうかを示す。さらなる実施形態では、機械学習させた提示モデルに数値ベクトルを入力することは、各ＭＨＣアレルについて、対応するＭＨＣアレルが対応する新生抗原を提示する尤度を示す、対応するアレル毎尤度を生成するために、依存性スコアを変換することと、アレル毎尤度を組み合わせることによって新生抗原の提示尤度を生成することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、依存性スコアを変換することは、新生抗原の提示をＭＨＣアレルにわたって相互排他的なものとしてモデル化する。代替的な実施形態では、機械学習させた提示モデルに数値ベクトルを入力することは、依存性スコアの組み合わせを変換して提示尤度を生成することをさらに含む。かかる実施形態では、依存性スコアの組み合わせを変換することは、新生抗原の提示をＭＨＣアレル間の干渉としてモデル化する。
いくつかの実施形態では、提示尤度のセットは、１つ以上のアレル非相互作用特性によってさらに特定される。かかる実施形態では、本方法は、機械学習させた提示モデルをアレル非相互作用特性に適用することによってアレル非相互作用特性に対する依存性スコアを生成することをさらに含む。依存性スコアは、対応する新生抗原のペプチド配列が、アレル非相互作用特性に基づいて提示されるかどうかを示す。いくつかの実施形態では、１つ以上のアレル非相互作用特性は、各新生抗原のペプチド配列のそれぞれのｋマーブロックにおける提示ホットスポットの有無を示す値を含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、各ＭＨＣアレルについての依存性スコアをアレル非相互作用特性についての依存性スコアと組み合わせることと、各ＭＨＣアレルについての組み合わされた依存性スコアを変換して各ＭＨＣアレルについてアレル毎尤度を生成することと、アレル毎尤度を組み合わせて提示尤度を生成することと、をさらに含む。あるＭＨＣアレルについてのアレル毎尤度は、そのＭＨＣアレルが対応する新生抗原を提示する湯戸を示す。代替的な実施形態では、本方法は、ＭＨＣアレルについての依存性スコアとアレル非相互作用特性についての依存性スコアとを組み合わせることと、組み合わされた依存性スコアを変換して提示尤度を生成することと、をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣアレルは２つ以上の異なるＭＨＣアレルを含む。
いくつかの実施形態では、ペプチド配列は、アミノ酸９個以外の長さを有するペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチド配列をコード化することは、ワン・ホットエンコーディングスキームを用いてペプチド配列をコード化することを含む。
特定の実施形態では、複数の試料は、単一のＭＨＣアレルを発現するように操作された細胞株、複数のＭＨＣアレルを発現するように操作された細胞株、複数の患者から得られたまたは由来するヒト細胞株、複数の患者から得られた新鮮なまたは凍結された組織試料のうちの少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、訓練データセットは、前記ペプチドのうちの少なくとも１つについてのペプチド－ＭＨＣ結合親和性の測定値に関連したデータ、及び、前記ペプチドのうちの少なくとも１つについてのペプチド－ＭＨＣ結合安定性の測定値に関連したデータのうちの少なくとも１つをさらに含む。
いくつかの実施形態では、提示尤度のセットは、ＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析により測定される、対象内のＭＨＣアレルの発現レベルによってさらに特定される。
いくつかの実施形態では、提示尤度のセットは、新生抗原のセット内の新生抗原とＭＨＣアレルとの間の予測される親和性、及び、新生抗原コード化ペプチド－ＭＨＣ複合体の予測される安定性少なくとも一方を含む特性によってさらに特定される。
いくつかの実施形態では、数値的尤度のセットは、そのソースタンパク質配列内の新生抗原コード化ペプチド配列に隣接するＣ末端配列、及びそのソースタンパク質配列内の新生抗原コード化ペプチド配列に隣接するＮ末端配列のうちの少なくとも１つを含む特性によってさらに特定される。
いくつかの実施形態では、選択された新生抗原のセットを選択することは、機械学習させた提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較して腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している新生抗原を選択することを含む。
いくつかの実施形態では、選択された新生抗原のセットを選択することは、機械学習させた提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較して対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含む。
いくつかの実施形態では、選択された新生抗原のセットを選択することは、提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較してプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含む。かかる実施形態では、ＡＰＣは任意で樹状細胞（ＤＣ）である。
いくつかの実施形態では、選択された新生抗原のセットを選択することは、機械学習させた提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較して中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している新生抗原を選択することを含む。
いくつかの実施形態では、選択された新生抗原のセットを選択することは、機械学習させた提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較して対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している新生抗原を選択することを含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の腫瘍細胞は、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、及びＴ細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本方法は、選択された新生抗原のセットから個別化がんワクチンを構築するための出力を生成することをさらに含む。かかる実施形態では、個別化がんワクチン用の出力は、選択された新生抗原のセットをコードした少なくとも１つのペプチド配列または少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことができる。
いくつかの実施形態では、機械学習させた提示モデルは、ニューラルネットワークモデルである。かかる実施形態では、ニューラルネットワークモデルは、それぞれのネットワークモデルが複数のＭＨＣアレルのうちの対応するＭＨＣアレルに割り当てられ、かつ１つ以上の層に配置された一連のノードを含む、ＭＨＣアレルについての複数のネットワークモデルを含み得る。かかる実施形態では、ニューラルネットワークモデルは、ニューラルネットワークモデルのパラメータを更新することによって訓練することができ、少なくとも２つのネットワークモデルのパラメータが少なくとも１回の訓練イテレーションについて一緒に更新される。いくつかの実施形態では、機械学習させた提示モデルは、ノードの１つ以上の層を含むディープラーニングモデルとすることができる。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣアレルは、クラスＩ ＭＨＣアレルである。
本明細書では、コンピュータプロセッサと、コンピュータプログラム命令を格納したメモリとを含むコンピュータシステムも開示する。コンピュータプログラム命令がコンピュータプロセッサにより実行されると、命令はコンピュータプロセッサに上記に述べた方法のいずれかを実施させる。
ＩＩＩ．新生抗原における腫瘍特異的変異の特定
また、ある特定の変異（例えば、がん細胞中に存在する変異またはアレル）の特定のための方法も、本明細書に開示する。特に、これらの変異は、がんを有する対象のがん細胞のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはエクソーム中に存在し得るが、対象由来の正常組織には存在し得ない。
腫瘍における遺伝子変異は、それらが腫瘍において排他的にタンパク質のアミノ酸配列における変更をもたらす場合、腫瘍の免疫学的ターゲティングに有用と考えることができる。有用な変異は、以下を含む：（１）タンパク質において異なるアミノ酸をもたらす非同義変異；（２）Ｃ末端に新規の腫瘍特異的配列を有する、より長いタンパク質の翻訳をもたらす、終止コドンが修飾されているかまたは欠失しているリードスルー変異；（３）成熟ｍＲＮＡにおけるイントロンの包含、したがって固有の腫瘍特異的タンパク質配列をもたらす、スプライス部位変異；（４）２種類のタンパク質の接合部に腫瘍特異的配列を有するキメラタンパク質を生じる、染色体再編成（すなわち、遺伝子融合）；（５）新規の腫瘍特異的タンパク質配列を有する新たなオープンリーディングフレームをもたらす、フレームシフト変異または欠失。変異はまた、非フレームシフト挿入欠失、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ＯＲＦを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化のうちの１つ以上も含むことができる。
例えば、腫瘍細胞におけるスプライス部位、フレームシフト、リードスルー、または遺伝子融合の変異から生じた、変異を有するペプチドまたは変異したポリペプチドは、腫瘍対正常細胞において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質をシークエンシングすることによって特定することができる。
また、変異は、以前に特定された腫瘍特異的変異を含むことができる。公知の腫瘍変異は、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）データベースで見出すことができる。
様々な方法を、個体のＤＮＡまたはＲＮＡにおいて特定の変異またはアレルの存在を検出するために利用可能である。この分野における進歩は、正確で、容易な、かつ安価な大規模ＳＮＰ遺伝子型判定を提供している。例えば、動的アレル特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイ対角線ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）、パイロシークエンシング、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、ＴａｑＭａｎシステム、及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰチップなどの種々のＤＮＡ「チップ」技術を含むいくつかの技法が、記載されている。これらの方法は、典型的にはＰＣＲによる、標的遺伝子領域の増幅を利用する。さらに他の方法は、侵襲性切断による小さなシグナル分子の生成及びその後の質量分析、または、固定化されたパッドロックプローブ及びローリングサークル増幅に基づく。特異的な変異を検出するための、当技術分野において公知の方法のいくつかを、下記に要約する。
ＰＣＲベースの検出手段は、多数のマーカーの多重増幅を同時に含むことができる。例えば、サイズがオーバーラップせず、同時に解析することができるＰＣＲ産物を生成するようにＰＣＲプライマーを選択することが、当技術分野において周知である。あるいは、差次的にラベル化され、したがって、各々を差次的に検出することができるプライマーで異なるマーカーを増幅することが可能である。当然、ハイブリダイゼーションベースの検出手段により、試料における複数のＰＣＲ産物の差次的な検出が可能になる。複数のマーカーの多重解析を可能にする他の技法が、当技術分野において公知である。
いくつかの方法が、ゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡにおける単一ヌクレオチド多型の解析を容易にするために開発されている。例えば、一塩基多型は、例えば、Ｍｕｎｄｙ，Ｃ．Ｒ．（米国特許第４，６５６，１２７号）において開示されているような、特化されたエキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチドを用いることによって検出することができる。この方法にしたがって、多型部位のすぐ３’のアレル配列に対して相補的なプライマーを、特定の動物またはヒトから取得された標的分子に対してハイブリダイズさせる。標的分子上の多型部位が、存在する特定のエキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチド誘導体に対して相補的であるヌクレオチドを含有する場合、その誘導体は、ハイブリダイズされたプライマーの末端上に組み込まれる。そのような組み込みのために、プライマーはエキソヌクレアーゼに対して抵抗性になり、それによりその検出が可能になる。試料のエキソヌクレアーゼ抵抗性誘導体の同一性は既知であるため、プライマーがエキソヌクレアーゼに対して抵抗性になったという知見により、標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドが、反応において使用されたヌクレオチド誘導体のものに対して相補的であることが明らかになる。この方法は、多量の外来性配列データの決定を必要としないという利点を有する。
多型部位のヌクレオチドの同一性を決定するために、溶液ベースの方法を使用することができる（Ｃｏｈｅｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（フランス国特許第２，６５０，８４０号；ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号）。米国特許第４，６５６，１２７号のＭｕｎｄｙの方法におけるように、多型部位のすぐ３’のアレル配列に対して相補的であるプライマーを使用する。この方法は、多型部位のヌクレオチドに対して相補的である場合は、プライマーの末端上に組み込まれるようになる、ラベル化ジデオキシヌクレオチド誘導体を用いて、その部位のヌクレオチドの同一性を決定する。Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ ＡｎａｌｙｓｉｓまたはＧＢＡとして公知である代替的な方法が、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（ＰＣＴ出願第９２／１５７１２号）により記載されている。Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．の方法は、ラベル化ターミネーターと、多型部位の３’の配列に対して相補的であるプライマーとの混合物を使用する。Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．の方法は、ラベル化ターミネーターと、多型部位の３’の配列に対して相補的であるプライマーとの混合物を使用する。Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（フランス国特許第２，６５０，８４０号；ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号）の方法とは対照的に、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．の方法は、プライマーまたは標的分子が固相に固定化される、不均一相アッセイであることができる。
ＤＮＡにおいて多型部位をアッセイするための、いくつかのプライマーガイドヌクレオチド組み込み手順が、記載されている（Ｋｏｍｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７７７９－７７８４（１９８９）；Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３６７１（１９９０）；Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．－Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８：６８４－６９２（１９９０）；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１４３－１１４７（１９９１）；Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１：１５９－１６４（１９９２）；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，ＧＡＴＡ ９：１０７－１１２（１９９２）；Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１－１７５（１９９３））。これらの方法は、それらが、多型部位で塩基間を識別するためにラベル化デオキシヌクレオチドの組み込みを利用する点で、ＧＢＡとは異なる。そのような形式において、シグナルは、組み込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同じヌクレオチドのランにおいて起こる多型は、ランの長さに比例するシグナルを結果としてもたらすことができる（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．－Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：４６－５９（１９９３））。
数多くのイニシアティブは、ＤＮＡまたはＲＮＡの何百万もの個々の分子から並行して直接、配列情報を取得する。リアルタイムの単一分子の合成によるシークエンシング技術は、シークエンシングされる鋳型に対して相補的であるＤＮＡの新生鎖の中に組み込まれる際の、蛍光ヌクレオチドの検出に依拠する。１つの方法において、長さが３０～５０塩基のオリゴヌクレオチドを、ガラスのカバーガラスに、５’端で共有結合性に固着させる。これらの固着した鎖は、２つの機能を果たす。第１に、それらは、鋳型が、表面結合オリゴヌクレオチドに対して相補的な捕捉尾部を有して構成されている場合に、標的鋳型鎖の捕捉部位として作用する。それらはまた、配列読み取りの基礎を形成する、鋳型指向性プライマー伸長のためのプライマーとしても作用する。捕捉プライマーは、複数サイクルの合成、検出、及び、色素を除去するための色素－リンカーの化学的切断を用いた、配列決定のための、固定された位置部位として機能する。各サイクルは、ポリメラーゼ／ラベル化ヌクレオチド混合物の添加、リンス、画像化、及び色素の切断からなる。代替的な方法において、ポリメラーゼは、蛍光ドナー分子で修飾されてスライドガラス上に固定化され、他方、各ヌクレオチドは、γ－ホスファートに付着したアクセプター蛍光部分で色分けされている。ヌクレオチドが、新規の鎖の中に組み込まれるようになる際に、システムが、蛍光タグ付加されたポリメラーゼと蛍光修飾されたヌクレオチドとの間の相互作用を検出する。他の合成によるシークエンシング技術もまた、存在する。
任意の適している合成によるシークエンシングプラットフォームを、変異を特定するために使用することができる。上記のように、４種類の主要な合成によるシークエンシングプラットフォームを、現在利用可能である：Ｒｏｃｈｅ／４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓより販売されるＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａより販売される１Ｇ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓより販売されるＳＯＬｉＤシステム、及びＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅより販売されるＨｅｌｉｓｃｏｐｅシステム。合成によるシークエンシングプラットフォームはまた、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ及びＶｉｓｉＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによっても記載されている。いくつかの実施形態において、シークエンシングされる多数の核酸分子は、支持体（例えば、固体支持体）に結合している。核酸を支持体上に固定化するために、捕捉配列／万能プライミング部位を、鋳型の３’端及び／または５’端に付加することができる。核酸は、支持体に共有結合性に付着した相補的配列に対して捕捉配列をハイブリダイズすることによって、支持体に結合させることができる。捕捉配列（万能捕捉配列とも呼ばれる）は、万能プライマーとして二重に働き得る、支持体に付着した配列に対して相補的な核酸配列である。
捕捉配列に対する代替物として、カップリングペア（例えば、抗体／抗原、受容体／リガンド、または、例えば米国特許出願第２００６／０２５２０７７号に記載されているようなアビジン－ビオチンペアなど）のメンバーを、各断片に連結させて、そのカップリングペアのそれぞれの第２のメンバーでコーティングされた表面上に捕捉させることができる。
捕捉に続いて、配列を、例えば、鋳型依存的な合成によるシークエンシングを含む、例えば、実施例及び米国特許第７，２８３，３３７号に記載されているような、単一分子検出／シークエンシングによって解析することができる。合成によるシークエンシングにおいて、表面に結合した分子は、ポリメラーゼの存在下で、多数のラベル化ヌクレオチド三リン酸に曝露される。鋳型の配列は、成長する鎖の３’端の中に組み込まれるラベル化ヌクレオチドの順序によって決定される。これは、リアルタイムで行うことができ、ステップ・アンド・リピートモードで行うことができる。リアルタイム解析のために、各ヌクレオチドに対して異なる光ラベルを組み込むことができ、複数のレーザーを、組み込まれたヌクレオチドの刺激のために利用することができる。
シークエンシングはまた、他の大規模並列処理シークエンシング、または次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技法及びプラットフォームも含むことができる。大規模並列処理シークエンシング技法及びプラットフォームの追加的な例は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑまたはＭｉＳｅｑ、ＴｈｅｒｍｏＰＧＭまたはＰｒｏｔｏｎ、Ｐａｃ Ｂｉｏ ＲＳ ＩＩまたはＳｅｑｕｅｌ、ＱｉａｇｅｎのＧｅｎｅ Ｒｅａｄｅｒ、及びＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮである。追加的な類似した現在の大規模並列処理シークエンシング技術、及びこれらの技術の将来世代を、使用することができる。
任意の細胞タイプまたは組織を利用して、本明細書に記載した方法における使用のための核酸試料を取得することができる。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料を、腫瘍または体液、例えば、公知の技法（例えば、静脈穿刺）によって取得された血液、もしくは唾液から取得することができる。あるいは、核酸試験を、乾燥試料（例えば、髪または皮膚）に対して行うことができる。加えて、試料を、シークエンシングのために腫瘍から取得することができ、別の試料を、正常組織が腫瘍と同じ組織タイプのものである場合に、シークエンシングのために正常組織から取得することができる。試料を、シークエンシングのために腫瘍から取得することができ、別の試料を、正常試料が腫瘍とは別個の組織タイプのものである場合に、シークエンシングのために正常組織から取得することができる。
腫瘍は、肺癌、黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、及びＴ細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌のうちの１つ以上を含むことができる。
あるいは、タンパク質質量分析を使用して、腫瘍細胞上のＭＨＣタンパク質に結合した変異したペプチドの存在を特定または実証することができる。ペプチドは、腫瘍細胞から、または腫瘍から免疫沈降させたＨＬＡ分子から酸溶出することができ、次いで、質量分析を用いて特定することができる。
ＩＶ．新生抗原
新生抗原は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、新生抗原は、ポリペプチド配列をコードするＲＮＡ配列であることができる。ワクチンにおいて有用な新生抗原は、したがって、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むことができる。
本明細書に開示する方法によって特定された腫瘍特異的変異を含む単離されたペプチド、公知の腫瘍特異的変異を含むペプチド、及び、本明細書に開示する方法によって特定された変異ポリペプチドまたはその断片を、本明細書に開示する。新生抗原ペプチドは、新生抗原が関連するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む場合に、それらのコード配列の文脈において記載することができる。
新生抗原ヌクレオチド配列によってコードされる１つ以上のポリペプチドは、以下のうちの少なくとも１つを含むことができる：１０００ｎＭ未満のＩＣ５０値でのＭＨＣとの結合親和性、ＭＨＣクラスＩペプチドについてはアミノ酸８～１５個、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の長さ、プロテアソーム切断を促進するペプチド内またはその近くの配列モチーフの存在、及び、ＴＡＰ輸送を促進する配列モチーフの存在。ＭＨＣクラスＩＩのポリペプチドではアミノ酸６～３０、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の長さ、細胞外またはリソソームプロテアーゼ（例えば、カテプシン類）による切断またはＨＬＡ－ＤＭにより触媒されるＨＬＡ結合を促進するペプチド内またはその近くの配列モチーフの存在。
１つ以上の新生抗原は、腫瘍の表面上に存在することができる。
１つ以上の新生抗原は、腫瘍を有する対象において免疫原性であることができ、例えば、対象においてＴ細胞応答またはＢ細胞応答を惹起することができ得る。
対象において自己免疫応答を誘導する１つ以上の新生抗原は、腫瘍を有する対象のためのワクチン生成の文脈において、考察から排除することができる。
少なくとも１つの新生抗原性ペプチド分子のサイズは、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２１個、約２２個、約２３個、約２４個、約２５個、約２６個、約２７個、約２８個、約２９個、約３０個、約３１個、約３２個、約３３個、約３４個、約３５個、約３６個、約３７個、約３８個、約３９個、約４０個、約４１個、約４２個、約４３個、約４４個、約４５個、約４６個、約４７個、約４８個、約４９個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、またはそれよりも多いアミノ分子残基、及びこれらの範囲から導出される任意の範囲を含むことができるが、それらに限定されない。具体的な実施形態において、新生抗原性ペプチド分子は、アミノ酸５０個以下である。
新生抗原性ペプチド及びポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩについては長さが１５残基以下で、通常約８～約１１残基の間からなり、特に９または１０残基であることができ；ＭＨＣクラスＩＩについては、６～３０残基であることができる。
望ましい場合、より長いペプチドを、いくつかのやり方において設計することができる。１つの例において、ＨＬＡアレル上のペプチドの提示尤度が予測されるかまたは公知である場合、より長いペプチドは、（１）各々の対応する遺伝子産物のＮ末端及びＣ末端に向かって２～５アミノ酸の伸長を有する個々の提示されるペプチド；（２）各々について伸長した配列を有する、提示されるペプチドのいくつかまたはすべての連鎖のいずれかからなることができる。別の例において、シークエンシングにより、腫瘍中に存在する長い（１０残基より長い）新生エピトープ配列（例えば、新規のペプチド配列をもたらすフレームシフト、リードスルー、またはイントロンの包含による）が明らかになる場合、より長いペプチドは、（３）新規の腫瘍特異的アミノ酸のストレッチ全体からなることになり、したがって、最強のＨＬＡに提示されるより短いペプチドの計算的なまたはインビトロ試験ベースの選択の必要を回避する。いずれの例においても、より長いペプチドの使用によって、患者細胞による内因性のプロセシングが可能になり、より有効な抗原提示及びＴ細胞応答の誘導がもたらされ得る。
新生抗原性ペプチド及びポリペプチドは、ＨＬＡタンパク質上に提示されることができる。いくつかの態様において、新生抗原性ペプチド及びポリペプチドは、野生型ペプチドよりも強い親和性でＨＬＡタンパク質上に提示される。いくつかの態様において、新生抗原性ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも５０００ｎＭ未満、少なくとも１０００ｎＭ未満、少なくとも５００ｎＭ未満、少なくとも２５０ｎＭ未満、少なくとも２００ｎＭ未満、少なくとも１５０ｎＭ未満、少なくとも１００ｎＭ未満、少なくとも５０ｎＭ未満、またはそれよりも小さいＩＣ５０を有することができる。
いくつかの態様において、新生抗原性ペプチド及びポリペプチドは、対象に投与された場合に、自己免疫応答を誘導せず、及び／または免疫寛容を引き起こさない。
また、少なくとも２種類以上の新生抗原性ペプチドを含む組成物も提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも２種類の異なるペプチドを含有する。少なくとも２種類の異なるペプチドは、同じポリペプチドに由来することができる。異なるポリペプチドとは、ペプチドが、長さ、アミノ酸配列、またはその両方において異なることを意味する。ペプチドは、腫瘍特異的変異を含有することが知られているか、または見出されている任意のポリペプチドに由来する。新生抗原性ペプチドが由来することができる、適しているポリペプチドは、例えば、ＣＯＳＭＩＣデータベースにおいて見出すことができる。ＣＯＳＭＩＣは、ヒトがんにおける体細胞性変異についての総合的な情報の管理を行う。ペプチドは、腫瘍特異的変異を含有する。いくつかの態様において、腫瘍特異的変異は、特定のがんタイプについてのドライバー変異である。
望ましい活性または性質を有する新生抗原性ペプチド及びポリペプチドは、望ましいＭＨＣ分子に結合して適切なＴ細胞を活性化する非改変ペプチドの生物学的活性を増大させるかまたは実質的にそのすべてを少なくとも保持しつつ、特定の望ましい属性、例えば、改善された薬理学的特徴を与えるように改変することができる。例として、新生抗原性ペプチド及びポリペプチドを、保存的または非保存的のいずれかの置換などの、種々の改変にさらに供することができ、そのような改変は、改善されたＭＨＣ結合、安定性、または提示などの、それらの使用におけるある特定の利点を提供し得る。保存的置換とは、アミノ酸残基を、生物学的及び／または化学的に類似している別のもので、例えば、１つの疎水性残基を別の疎水性残基、または１つの極性残基を別の極性残基で置き換えることを意味する。置換は、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及びＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組み合わせを含む。単一アミノ酸置換の効果はまた、Ｄ－アミノ酸を用いて探査してもよい。そのような改変は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１－３４７（１９８６），Ｂａｒａｎｙ ＆ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ ＆ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．（Ｎ．Ｙ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．１－２８４（１９７９）；及びＳｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｐｉｅｒｃｅ），２ｄ Ｅｄ．（１９８４）に記載されているように、周知のペプチド合成手順を用いて行うことができる。
種々のアミノ酸模倣物または非天然アミノ酸でのペプチド及びポリペプチドの改変は、インビボでのペプチド及びポリペプチドの安定性の増大に特に有用である場合がある。安定性は多くの方法でアッセイすることができる。例として、ペプチダーゼ、ならびに、ヒト血漿及び血清などの種々の生物学的媒質が、安定性を試験するために使用されている。例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．１１：２９１－３０２（１９８６）を参照されたい。ペプチドの半減期は、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを用いて好都合に決定することができる。プロトコールは、概して以下のようなものである。プールしたヒト血清（タイプＡＢ、非熱不活性化）を、使用前に遠心分離によって脱脂する。次いで、血清を、ＲＰＭＩ組織培養培地で２５％に希釈し、ペプチド安定性を試験するために使用する。あらかじめ決定された時間間隔で、少量の反応溶液を取り出して、６％水性トリクロロ酢酸またはエタノールのいずれかに添加する。濁った反応試料を１５分間冷却（４℃）し、次いで、スピンして沈降血清タンパク質を沈殿させる。次いで、ペプチドの存在を、安定性特異的クロマトグラフィー条件を用いた逆相ＨＰＬＣによって決定する。
ペプチド及びポリペプチドを、改善された血清半減期以外の望ましい属性を提供するために修飾することができる。例として、ＣＴＬ活性を誘導するペプチドの能力を、Ｔヘルパー細胞応答を誘導することができる少なくとも１つのエピトープを含有する配列への連結によって増強することができる。免疫原性ペプチド／Ｔヘルパーコンジュゲートは、スペーサー分子によって連結することができる。スペーサーは、典型的には、生理学的条件下で実質的に無電荷である、アミノ酸またはアミノ酸模倣物などの相対的に小さな中性分子から構成される。スペーサーは、典型的には、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、または、非極性アミノ酸もしくは中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意で存在するスペーサーは、同じ残基から構成される必要はなく、したがって、ヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーであり得ることが、理解されるであろう。存在する場合、スペーサーは、通常、少なくとも１または２残基、より通常は、３～６残基であろう。あるいは、ペプチドを、スペーサーなしでＴヘルパーペプチドに連結することができる。
新生抗原性ペプチドは、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、直接またはスペーサーを介してのいずれかでＴヘルパーペプチドに連結することができる。新生抗原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端を、アシル化することができる。例示的なＴヘルパーペプチドは、破傷風毒素の８３０～８４３、インフルエンザの３０７～３１９、マラリアスポロゾイトの周囲３８２～３９８及び３７８～３８９を含む。
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技法を通したタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの発現、天然由来源からのタンパク質もしくはペプチドの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に公知の任意の技法によって作製することができる。種々の遺伝子に対応する、ヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチド及びペプチドの配列は、以前に開示されており、当業者に公知のコンピュータ処理されたデータベースで見出すことができる。１つのそのようなデータベースは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈのウェブサイトに位置する、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＧｅｎｂａｎｋ及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースである。公知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示する技法を用いて、または当業者に公知であるように、増幅及び／または発現させることができる。あるいは、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドの種々の商業的調製物が、当業者に公知である。
さらなる態様において、新生抗原は、新生抗原性ペプチドまたはその一部をコードする核酸（例えば、ポリヌクレオチド）を含む。ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、例えば、ホスホロチオアートバックボーンを有するポリヌクレオチドなどの、ポリヌクレオチドの一本鎖及び／もしくは二本鎖、または天然形態もしくは安定化形態のいずれか、または、それらの組み合わせであることができ、イントロンを含有してもよく、または含有しなくてもよい。またさらなる態様は、ポリペプチドまたはその一部を発現することができる発現ベクターを提供する。様々な細胞タイプ用の発現ベクターが、当技術分野において周知であり、過度の実験なしで選択することができる。概して、ＤＮＡを、プラスミドなどの発現ベクター中に、発現のための適正な方向及び正確なリーディングフレームで挿入する。必要な場合は、ＤＮＡを、望ましい宿主によって認識される適切な転写及び翻訳調節性制御ヌクレオチド配列に連結することができるが、そのような制御は、概して発現ベクターにおいて利用可能である。次いで、ベクターを、標準的な技法を通して宿主中に導入する。手引きは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．において見出すことができる。
ＩＶ．ワクチン組成物
また、特異的な免疫応答、例えば、腫瘍特異的な免疫応答を生じることができる免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物も、本明細書に開示する。ワクチン組成物は、典型的に、例えば、本明細書に記載した方法を用いて選択された多数の新生抗原を含む。ワクチン組成物はまた、ワクチンと呼ぶこともできる。
ワクチンは、１～３０種類のペプチド、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０種類の異なるペプチド、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４種類の異なるペプチド、または１２、１３、もしくは１４種類の異なるペプチドを含有することができる。ペプチドは、翻訳後修飾を含むことができる。ワクチンは、１～１００種類もしくはそれよりも多いヌクレオチド配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００種類もしくはそれよりも多い異なるヌクレオチド配列、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４種類の異なるヌクレオチド配列、または１２、１３、もしくは１４種類の異なるヌクレオチド配列を含有することができる。ワクチンは、１～３０種類の新生抗原配列、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００種類もしくはそれよりも多い異なる新生抗原配列、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４種類の異なる新生抗原配列、または１２、１３、もしくは１４種類の異なる新生抗原配列を含有することができる。
一実施形態では、異なるペプチド及び／もしくはポリペプチド、またはそれらをコードするヌクレオチド配列は、ペプチド及び／またはポリペプチドが、異なるＭＨＣクラスＩ分子及び／または異なるＭＨＣクラスＩＩ分子などの異なるＭＨＣ分子と結合することができるように選択される。いくつかの態様において、１つのワクチン組成物は、最も頻繁に存在するＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子と結合することができるペプチド及び／またはポリペプチドのコード配列を含む。したがって、ワクチン組成物は、少なくとも２種類の好ましい、少なくとも３種類の好ましい、または少なくとも４種類の好ましいＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子と結合することができる異なる断片を含むことができる。
ワクチン組成物は、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答、及び／または特異的なヘルパーＴ細胞応答を生じることができる。
ワクチン組成物は、アジュバント及び／または担体をさらに含むことができる。有用なアジュバント及び担体の例を、本明細書の下記に示す。組成物は、例えば、タンパク質などの担体、または、例えば、Ｔ細胞に対してペプチドを提示することができる樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞と結合することができる。
アジュバントは、ワクチン組成物中へのその混合が、新生抗原に対する免疫応答を増大させるか、または別の方法で修飾する任意の物質である。担体は、新生抗原がそれに結合することができる足場構造、例えば、ポリペプチドまたは多糖であることができる。任意で、アジュバントは、共有結合性または非共有結合性にコンジュゲートされる。
抗原に対する免疫応答を増大させるアジュバントの能力は、典型的に、免疫媒介性反応の有意なもしくは実質的な増大、または疾患症候の低減によって明示される。例えば、体液性免疫の増大は、典型的に、抗原に対して生じた抗体の力価の有意な増大によって明示され、Ｔ細胞活性の増大は、典型的に、細胞増殖、または細胞性細胞傷害、またはサイトカイン分泌の増大において明示される。アジュバントはまた、例えば、主として体液性またはＴｈ応答を、主として細胞性またはＴｈ応答へと変更することによって、免疫応答を変化させ得る。
適しているアジュバントは、１０１８ ＩＳＳ、アラム、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリル脂質Ａ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳ １３１２、ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌベクターシステム、ＰＬＧマイクロ粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及び他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、β－グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニンに由来するＡｑｕｉｌａ’ｓ ＱＳ２１ ｓｔｉｍｕｌｏｎ（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）、マイコバクテリア抽出物及び合成細菌細胞壁模倣物、及びＲｉｂｉ’ｓ Ｄｅｔｏｘ．ＱｕｉｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓなどの他の専売アジュバントを含むが、それらに限定されない。不完全フロインドまたはＧＭ－ＣＳＦなどのアジュバントが、有用である。樹状細胞に特異的ないくつかの免疫学的アジュバント（例えば、ＭＦ５９）及びそれらの調製物が、以前に記載されている（Ｄｕｐｕｉｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１８６（１）：１８－２７；Ａｌｌｉｓｏｎ Ａ Ｃ；Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ．１９９８；９２：３－１１）。また、サイトカインを使用することもできる。いくつかのサイトカインは、リンパ組織に対する樹状細胞の遊走への影響（例えば、ＴＮＦ－α）、Ｔリンパ球に対する効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟の加速化（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１、及びＩＬ－４）（具体的にその全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，８４９，５８９号）、及び免疫アジュバントとしての作用（例えば、ＩＬ－１２）に直接結び付けられている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ Ｄ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ ＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒＥｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６（６）：４１４－４１８）。
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドもまた、ワクチン設定においてアジュバントの効果を増強することが報告されている。ＴＬＲ ７、ＴＬＲ ８、及び／またはＴＬＲ ９に結合するＲＮＡなどの他のＴＬＲ結合分子がまた、使用されてもよい。
有用なアジュバントの他の例は、化学的に修飾されたＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（例えば、ｐｏｌｙｉ：ＣＩ２Ｕ）、非ＣｐＧ細菌ＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびに、治療的に及び／またはアジュバントとして作用し得る、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、セレブレックス、ＮＣＸ－４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフィニブ、ＸＬ－９９９、ＣＰ－５４７６３２、パゾパニブ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、イピリムマブ、トレメリムマブ、及びＳＣ５８１７５などの免疫活性小分子及び抗体を含むが、それらに限定されない。アジュバント及び添加物の量及び濃度は、当業者が過度の実験なしで容易に決定することができる。追加的なアジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、サルグラモスチム）などのコロニー刺激因子を含む。
ワクチン組成物は、１種類よりも多い異なるアジュバントを含むことができる。さらに、治療用組成物は、上記の任意またはそれらの組み合わせを含む、任意のアジュバント物質を含むことができる。ワクチン及びアジュバントを、任意の適切な配列において、一緒にまたは別々に投与できることもまた、企図される。
担体（または賦形剤）は、アジュバントから独立して存在することができる。担体の機能は、例えば、活性または免疫原性を増大させるため、安定性を与えるため、生物学的活性を増大させるため、または血清半減期を増大させるために、特に変異体の分子量を増大させることであり得る。さらに、担体は、Ｔ細胞に対してペプチドを提示するのを助けることができる。担体は、当業者に公知の任意の適している担体、例えば、タンパク質または抗原提示細胞であることができる。担体タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、トランスフェリンなどの血清タンパク質、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、サイログロブリンもしくはオボアルブミン、免疫グロブリン、またはインスリンなどのホルモン、またはパルミチン酸であることができるが、それらに限定されない。ヒトの免疫化のためには、担体は概して、ヒトに許容されかつ安全な、生理学的に許容される担体である。しかし、破傷風トキソイド及び／またはジフテリアトキソイドは、適している担体である。あるいは、担体は、デキストラン、例えばセファロースであることができる。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、無傷の外来抗原自体よりも、ＭＨＣ分子に結合したペプチドの形態において抗原を認識する。ＭＨＣ分子自体は、抗原提示細胞の細胞表面に位置する。したがって、ＣＴＬの活性化は、ペプチド抗原、ＭＨＣ分子、及びＡＰＣの三量体複合体が存在する場合に可能である。対応して、ペプチドがＣＴＬの活性化のために使用される場合だけではなく、追加的にそれぞれのＭＨＣ分子を有するＡＰＣが添加される場合に、それは免疫応答を増強し得る。したがって、いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、追加的に、少なくとも１つの抗原提示細胞を含有する。
新生抗原はまた、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４）１０，６１６－６２９を参照されたい）、または、第２、第３、もしくはハイブリッド第２／第３世代のレンチウイルス、及び特異的な細胞タイプもしくは受容体を標的とするように設計された任意の世代の組換えレンチウイルスを含むがそれらに限定されないレンチウイルス（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１１）２３９（１）：４５－６１、Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１２）４４３（３）：６０３－１８、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒｏｎ ｌｏｓｓ ｍａｘｉｍｉｚｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１５）４３（１）：６８２－６９０、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２（１２）：９８７３－９８８０を参照されたい）などの、ウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームに含めることもできる。上述のウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームのパッケージング能力に依存して、このアプローチは、１つ以上の新生抗原ペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を送達することができる。配列は、非変異配列が隣接していてもよく、リンカーによって分離されていてもよく、または、細胞内区画を標的とする１つもしくは複数の配列が先行していてもよい（例えば、Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１６）２２（４）：４３３－８、Ｓｔｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１６）３５２（６２９１）：１３３７－４１、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｕｒａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４）２０（ １３）：３４０１－１０を参照されたい）。宿主中への導入時に、感染した細胞は、新生抗原を発現し、それにより、ペプチドに対する宿主免疫（例えば、ＣＴＬ）応答を惹起する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６－４６０（１９９１））に記載されている。新生抗原の治療的投与または免疫化に有用な、多種多様の他のワクチンベクター、例えば、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクターなどが、本明細書における記載から当業者に明らかであろう。
ＩＶ．Ａ．ワクチン設計及び製造のさらなる考慮事項
ＩＶ．Ａ．１．すべての腫瘍サブクローンをカバーするペプチドのセットの決定
すべての、または大部分の腫瘍サブクローンによって提示されるものを意味するトランカルペプチド（ｔｒｕｎｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）が、ワクチン中への包含について優先される５３。任意で、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドがない場合、または、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドの数が、追加的な非トランカルペプチドをワクチンに含めることができるほど少ない場合には、腫瘍サブクローンの数及び同一性を推定すること、及びワクチンによってカバーされる腫瘍サブクローンの数を最大化するようにペプチドを選ぶことによって、さらなるペプチドを優先順位付けすることができる５４。
ＩＶ．Ａ．２．新生抗原の優先順位決定
上記の新生抗原フィルターのすべてを適用した後、ワクチン技術が対応できるよりも多くの候補新生抗原が、依然としてワクチン包含に利用可能である可能性がある。追加的に、新生抗原解析の種々の態様についての不確定度が残っている可能性があり、候補ワクチン新生抗原の様々な性状の間にトレードオフが存在する可能性がある。したがって、選択プロセスの各段階でのあらかじめ決定されたフィルターの代わりに、少なくとも以下の軸を有する空間に候補新生抗原を置き、積分アプローチを用いて選択を最適化する、積分多次元モデルを考えることができる。
１． 自己免疫または寛容のリスク（生殖細胞系列のリスク）（より低い自己免疫のリスクが、典型的に好ましい）
２． シークエンシングアーチファクトの確率（より低いアーチファクトの確率が、典型的に好ましい）
３． 免疫原性の確率（より高い免疫原性の確率が、典型的に好ましい）
４． 提示の確率（より高い提示の確率が、典型的に好ましい）
５． 遺伝子発現（より高い発現が、典型的に好ましい）
６． ＨＬＡ遺伝子のカバレッジ（新生抗原のセットの提示に関与する、より多い数のＨＬＡ分子は、腫瘍が、ＨＬＡ分子の下方制御または変異を介して免疫攻撃を回避する確率を低くする可能性がある）
７． ＨＬＡクラスのカバレッジ（ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩの両方をカバーすることで、治療応答の確率が高まり、腫瘍の免疫回避の確率が低くなる可能性がある）
Ｖ．治療及び製造方法
本明細書に開示する方法を用いて特定された複数の新生抗原などの１つ以上の新生抗原を対象に投与することにより、対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導する、腫瘍に対するワクチン接種を行う、対象のがんの症状を治療及び／または緩和する方法も提供される。
いくつかの態様において、対象は、がんと診断されているか、またはがんを発症するリスクにある。対象は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、または、腫瘍特異的な免疫応答が望ましい任意の動物であることができる。腫瘍は、乳、卵巣、前立腺、肺、腎臓、胃、結腸、精巣、頭頸部、膵臓、脳、黒色腫、及び他の組織器官の腫瘍などの、任意の固形腫瘍、ならびに、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ球性白血病、及びＢ細胞リンパ腫を含むリンパ腫及び白血病などの、血液腫瘍であることができる。
新生抗原は、ＣＴＬ応答を誘導するのに十分な量で投与することができる。
新生抗原は、単独で、または他の治療用物質との組み合わせで投与することができる。治療用物質は、例えば、化学療法剤、放射線、または免疫療法である。特定のがんのための任意の適している治療的処置を、施すことができる。
加えて、対象に、チェックポイント阻害因子などの抗免疫抑制性／免疫刺激性物質をさらに投与することができる。例えば、対象に、抗ＣＴＬＡ抗体または抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１をさらに投与することができる。抗体によるＣＴＬＡ－４またはＰＤ－Ｌ１の遮断は、患者においてがん性細胞に対する免疫応答を増強することができる。特に、ＣＴＬＡ－４遮断は、ワクチン接種プロトコールを採用した場合に有効であることが示されている。
ワクチン組成物に含まれるべき各新生抗原の最適量、及び最適投薬レジメンを、決定することができる。例えば、新生抗原またはその変異体は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射のために調製することができる。注射の方法は、ｓ．ｃ．、ｉ．ｄ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、及びｉ．ｖ．を含む。ＤＮＡまたはＲＮＡ注射の方法は、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、及びｉ．ｖ．を含む。ワクチン組成物の投与の他の方法は、当業者に公知である。
ワクチンは、組成物中に存在する新生抗原の選択、数、及び／または量が、組織、がん、及び／または患者に特異的であるように編集することができる。例として、ペプチドの厳密な選択は、所定の組織における親タンパク質の発現パターンによって手引きされ得る。選択は、がんの特異的なタイプ、疾患の状態、より早期の処置レジメン、患者の免疫状態、及び当然、患者のＨＬＡハロタイプに依存し得る。さらに、ワクチンは、特定の患者の個人的な必要にしたがって、個別化された構成要素を含有することができる。例は、特定の患者における新生抗原の発現にしたがって新生抗原の選択を変えること、または、処置の第１のラウンドまたはスキームの後の二次的処置についての調整を含む。
がんのためのワクチンとして使用されるべき組成物について、正常組織において多量に発現している類似した正常な自己ペプチドを有する新生抗原は、本明細書に記載した組成物において、避けられるか、または少量で存在することができる。他方で、患者の腫瘍が、多量のある特定の新生抗原を発現することが公知である場合、このがんの処置のためのそれぞれの薬学的組成物は、多量に存在することができ、及び／または、この特定の新生抗原もしくはこの新生抗原の経路に特異的な１種類よりも多い新生抗原を含めることができる。
新生抗原を含む組成物を、既にがんを患っている個体に投与することができる。治療的適用において、組成物は、腫瘍抗原に対する有効なＣＴＬ応答を惹起し、かつ、症候及び／または合併症を治癒するかまたは少なくとも部分的に停止するのに十分な量で、患者に投与される。これを達成するのに妥当な量を、「治療的有効用量」として定義する。この用途のために有効な量は、例えば、組成物、投与の様式、処置される疾患の病期及び重症度、患者の体重及び健康の全身状態、ならびに処方医の判断に依存するであろう。組成物は、概して、重篤な疾患状態、すなわち、命に関わるか、または潜在的に命に関わる状況、特にがんが転移している場合に使用できることを、心に留めるべきである。そのような例において、外来性物質の最小化、及び新生抗原の相対的な非毒性の性質を考慮して、実質的過剰量のこれらの組成物を投与することが、可能であり、かつ処置する医師が望ましいと感じることができる。
治療的用途のために、投与は、腫瘍の検出または外科的除去時に始めることができる。これに、少なくとも症候が実質的に減ずるまで、及びその後ある期間にわたって、ブースト用量が続く。
治療的処置のための薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）は、非経口、局部、経鼻、経口、または局所投与について意図される。薬学的組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内に投与することができる。組成物は、腫瘍に対する局所免疫応答を誘導するために、外科的切除の部位に投与することができる。新生抗原の溶液を含む非経口投与用の組成物を、本明細書に開示し、ワクチン組成物は、許容される担体、例えば、水性担体に溶解または懸濁される。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．９％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などを使用することができる。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌することができ、または滅菌濾過することができる。結果として生じた水溶液を、そのままで使用のためにパッケージングするか、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液と組み合わされる。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミンオレアートなどのような、生理学的条件に近づけるために必要とされる、薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。
新生抗原はまた、それらをリンパ組織などの特定の細胞組織にターゲティングする、リポソームを介して投与することもできる。リポソームはまた、半減期を増大させるのにも有用である。リポソームは、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、ラメラ層などを含む。これらの調製物において、送達されるべき新生抗原は、単独で、または、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体などの、例えば、リンパ系細胞の間で優性な受容体に結合する分子、または他の治療用組成物もしくは免疫原性組成物と共に、リポソームの一部として組み込まれる。したがって、所望の新生抗原で満たされたリポソームは、リンパ系細胞の部位へ方向付けられることができ、そこで、リポソームは次いで、選択された治療用／免疫原性組成物を送達する。リポソームは、概して、中性及び負電荷を有するリン脂質、及びコレステロールなどのステロールを含む、標準的な小胞形成脂質から形成され得る。脂質の選択は、概して、例えば、リポソームサイズ、酸不安定性、及び血流におけるリポソームの安定性の考慮により手引きされる。例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９；４６７ （１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、及び第５，０１９，３６９号に記載されているように、様々な方法を、リポソームを調製するために利用可能である。
免疫細胞へのターゲティングのために、リポソーム中に組み込まれるべきリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはその断片を含むことができる。リポソーム懸濁液は、とりわけ、投与の様式、送達されるペプチド、及び処置される疾患の病期にしたがって変動する用量で、静脈内、局所、局部などに投与することができる。
治療目的または免疫化目的で、本明細書に記載したペプチド、及び任意でペプチドの１つ以上をコードする核酸をまた、患者に投与することもできる。数多くの方法が、核酸を患者に送達するために好都合に使用される。例として、核酸を、「裸のＤＮＡ」として直接送達することができる。このアプローチは、例として、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５－１４６８ （１９９０）、ならびに米国特許第５，５８０，８５９号及び第５，５８９，４６６号に記載されている。核酸はまた、例として、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されているような弾道送達を用いて投与することもできる。単にＤＮＡからなる粒子を、投与することができる。あるいは、ＤＮＡを、金粒子などの粒子に接着させることができる。核酸配列を送達するためのアプローチは、エレクトロポレーションを伴うかまたは伴わない、ウイルスベクター、ｍＲＮＡベクター、及びＤＮＡベクターを含むことができる。
核酸はまた、カチオン性脂質などのカチオン性化合物に複合体化させて送達することもできる。脂質媒介性遺伝子送達法は、例として、９６１８３７２ＷＯＡＷＯ ９６／１８３７２；９３２４６４０ＷＯＡＷＯ ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ ＆ Ｇｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）： ６８２－６９１ （１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号 Ｒｏｓｅ、米国特許第５，２７９，８３３号；９１０６３０９ＷＯＡＷＯ ９１／０６３０９；及びＦｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４： ７４１３－７４１４ （１９８７）に記載されている。
新生抗原はまた、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ （２００４） １０， ６１６－６２９を参照されたい）、または、第２、第３、もしくはハイブリッド第２／第３世代のレンチウイルス、及び特異的な細胞タイプもしくは受容体を標的とするように設計された任意の世代の組換えレンチウイルスを含むがそれらに限定されないレンチウイルス（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１１） ２３９（１）： ４５－６１、Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．（２０１２） ４４３（３）：６０３－１８、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒｏｎ ｌｏｓｓ ｍａｘｉｍｉｚｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ， Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１５） ４３ （１）： ６８２－６９０、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８） ７２ （１２）： ９８７３－９８８０を参照されたい）などの、ウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームに含めることもできる。上述のウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームのパッケージング能力に依存して、このアプローチは、１つ以上の新生抗原ペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を送達することができる。配列は、非変異配列が隣接していてもよく、リンカーによって分離されていてもよく、または、細胞内区画を標的とする１つもしくは複数の配列が先行していてもよい（例えば、Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１６） ２２ （４）：４３３－８、Ｓｔｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２０１６） ３５２ （６２９１）：１３３７－４１、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｕｒａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４） ２０（ １３）：３４０１－１０を参照されたい）。宿主中への導入時に、感染した細胞は、新生抗原を発現し、それにより、ペプチドに対する宿主免疫（例えば、ＣＴＬ）応答を惹起する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６－４６０ （１９９１））に記載されている。新生抗原の治療的投与または免疫化に有用な、多種多様の他のワクチンベクター、例えば、チフス菌ベクターなどが、本明細書における記載から当業者に明らかであろう。
核酸を投与する手段は、１つ以上のエピトープをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。ヒト細胞における発現のための、選択されたＣＴＬエピトープをコードするＤＮＡ配列（ミニ遺伝子）を作製するために、エピトープのアミノ酸配列を逆翻訳する。各アミノ酸に対するコドン選択を手引きするために、ヒトコドン使用頻度表を使用する。これらのエピトープをコードするＤＮＡ配列を、直接隣り合わせて、連続的なポリペプチド配列を作製する。発現及び／または免疫原性を最適化するために、追加の要素を、ミニ遺伝子設計中に組み入れることができる。逆翻訳して、ミニ遺伝子配列に含めることができるアミノ酸配列の例は、ヘルパーＴリンパ球エピトープ、リーダー（シグナル）配列、及び小胞体保持シグナルを含む。加えて、ＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示は、ＣＴＬエピトープに近接した合成の（例えば、ポリアラニン）または天然に存在するフランキング配列を含むことによって、改善することができる。ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖及びマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドをアセンブルすることによって、ＤＮＡに変換される。オーバーラップするオリゴヌクレオチド（３０～１００塩基長）を、周知の技法を用いて適切な条件下で、合成し、リン酸化し、精製し、アニーリングする。オリゴヌクレオチドの端は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。ＣＴＬエピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子を、次いで、望ましい発現ベクター中にクローニングすることができる。
精製プラスミドＤＮＡは、様々な製剤を用いて、注射のために調製することができる。これらのうちでもっとも単純なものは、滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）における凍結乾燥ＤＮＡの再構成である。様々な方法が記載されており、新たな技法が利用可能になり得る。上記で言及したように、核酸は、カチオン性脂質で好都合に製剤化される。加えて、糖脂質、融合性リポソーム、ペプチド、及び保護的、相互作用的、非縮合性（ＰＩＮＣ）と集合的に呼ばれる化合物もまた、精製プラスミドＤＮＡと複合体化させて、安定性、筋肉内分散、または特異的な器官もしくは細胞タイプへの輸送などの変数に影響を及ぼすことができる。
また、本明細書に開示する方法の工程を行うこと；及び、多数の新生抗原または多数の新生抗原のサブセットを含む腫瘍ワクチンを生産する工程を含む、腫瘍ワクチンを製造する方法も、本明細書に開示する。
本明細書に開示する新生抗原は、当技術分野において公知の方法を用いて製造することができる。例えば、本明細書に開示する新生抗原またはベクター（例えば、１つ以上の新生抗原をコードする少なくとも１つの配列を含むベクター）を生産する方法は、新生抗原またはベクターを発現するのに適している条件下で宿主細胞を培養する工程であって、宿主細胞が、新生抗原またはベクターをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む工程、及び、新生抗原またはベクターを精製する工程を含むことができる。標準的な精製法は、クロマトグラフィー技法、電気泳動技法、免疫学的技法、沈降技法、透析技法、濾過技法、濃縮技法、及びクロマトフォーカシング技法を含む。
宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、酵母、またはＨＥＫ２９３細胞を含むことができる。宿主細胞は、本明細書に開示する新生抗原またはベクターをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、１つ以上のポリヌクレオチドで形質転換することができ、任意で、単離されたポリヌクレオチドは、新生抗原またはベクターをコードする少なくとも１つの核酸配列に機能的に連結されたプロモーター配列をさらに含む。ある特定の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであることができる。
ＶＩ．新生抗原の特定
ＶＩ．Ａ．新生抗原候補の特定
腫瘍及び正常のエクソーム及びトランスクリプトームのＮＧＳ解析のための研究法を、新生抗原の特定のスペースに記載し、適用している６，１４，１５。下記の例は、臨床設定における新生抗原の特定について、より大きな感度及び特異性のためのある特定の最適化を考慮している。これらの最適化は、実験室プロセスに関連するもの及びＮＧＳデータ解析に関連するものの、２つの区域にグループ化することができる。
ＶＩ．Ａ．１．実験室プロセスの最適化
本明細書に提示したプロセスの改善は、標的とされるがんパネルにおける信頼できるがんドライバー遺伝子の評価について開発された概念１６を、新生抗原の特定のために必要な全エクソーム設定及び全トランスクリプトーム設定に拡大することによって、低い腫瘍含量及び少ない体積の臨床標本からの高精度の新生抗原の発見における難題に対処する。具体的には、これらの改善は、以下を含む：
１．低い腫瘍含量またはサブクローン状態のいずれかにより、低い変異体アレル頻度で存在する変異を検出するための、腫瘍エクソームにわたる深い（５００ｘよりも大きい）固有の平均カバレッジのターゲティング。
２．可能性のある新生抗原の見逃しが最も少ないように、１００ｘ未満でカバーされる塩基が５％未満である、例として、
ａ． 個々のプローブＱＣを有するＤＮＡベースの捕捉プローブの使用１７
ｂ．十分にカバーされていない領域についての追加的なベイトの包含
３．可能性のある新生抗原が体細胞性／生殖細胞系列ステータスについて分類されていないままである（したがってＴＳＮＡとして使用可能ではない）ことが最も少ないように、２０ｘ未満でカバーされる塩基が５％未満である、正常エクソームにわたる均一カバレッジのターゲティング。
４．必要とされるシークエンシングの総量を最小化するために、配列捕捉プローブは、非コードＲＮＡは新生抗原を生じることができないことから、遺伝子のコード領域のみについて設計される。追加的な最適化は、以下を含む：
ａ．ＧＣリッチであり、標準的なエクソームシークエンシングでは十分に捕捉されないＨＬＡ遺伝子についての補充的プローブ１８。
ｂ．不十分な発現、プロテアソームによる最適に満たない消化、または異例の配列特性などの要因により、候補新生抗原を少ししかまたは全く生成しないと予測される遺伝子の排除。
５．変異検出、遺伝子及びスプライス変異体（「アイソフォーム」）発現の定量、ならびに融合物検出を可能にするために、腫瘍ＲＮＡが同様に、高深度（１００Ｍリードよりも大きい）でシークエンシングされる。ＦＦＰＥ試料由来のＲＮＡは、ＤＮＡにおいてエクソームを捕捉するために使用されるのと同じまたは類似したプローブで、プローブベース濃縮１９を用いて抽出される。
ＶＩ．Ａ．２．ＮＧＳデータ解析の最適化
解析法の改善は、一般的な研究変異コーリングアプローチの最適に満たない感度及び特異性に対処し、具体的には、臨床設定における新生抗原の特定のために関連するカスタマイズ化を考慮する。これらは、以下を含む：
１．アラインメントのための、ＨＧ３８参照ヒトゲノムまたはより後のバージョンの使用（それが、以前のゲノムリリースとは対照的に、集団多型をより良好に反映する複数のＭＨＣ領域アセンブリーを含有するため）。
２．様々なプログラム５からの結果をマージすることによる、単一変異コーラー２０の限界の克服。
ａ．単一ヌクレオチド変異及び挿入欠失は、以下を含む一連のツールで、腫瘍ＤＮＡ、腫瘍ＲＮＡ、及び正常ＤＮＡから検出される：Ｓｔｒｅｌｋａ２１及びＭｕｔｅｃｔ２２などの、腫瘍及び正常ＤＮＡの比較に基づくプログラム；ならびに、低純度の試料において特に有利である２３、ＵＮＣｅｑＲなどの、腫瘍ＤＮＡ、腫瘍ＲＮＡ、及び正常ＤＮＡを組み入れるプログラム。
ｂ．挿入欠失は、Ｓｔｒｅｌｋａ及びＡＢＲＡ２４などの、局所リアセンブリーを行うプログラムで決定される。
ｃ．構造的再編成は、Ｐｉｎｄｅｌ２５またはＢｒｅａｋｓｅｑ２６などの専用のツールを用いて決定される。
３．試料スワップを検出して阻止するために、同じ患者についての試料由来の変異コールが、選ばれた数の多型部位で比較される。
４．例として、以下による、人工的コールの広範囲のフィルタリングが行われる：
ａ．潜在的に、低いカバレッジの例においては緩やかな検出パラメータで、及び挿入欠失の例においては許容的な近接基準での、正常ＤＮＡにおいて見出される変異の除去。
ｂ．低いマッピング品質または低い塩基品質による変異の除去２７。
ｃ．たとえ対応する正常において観察されないとしても、再出現するシークエンシングアーチファクトから生じる変異の除去２７。例は、主として１本の鎖上に検出される変異を含む。
ｄ．無関連の対照のセットにおいて検出される変異の除去２７。
５．ｓｅｑ２ＨＬＡ２８、ＡＴＨＬＡＴＥＳ２９、またはＯｐｔｉｔｙｐｅのうちの１つを使用する、かつまた、エクソーム及びＲＮＡシークエンシングデータを組み合わせる２８、正常エクソームからの正確なＨＬＡコーリング。追加的な潜在的最適化は、ロングリードＤＮＡシークエンシングなどの、ＨＬＡタイピングのための専用アッセイの採用３０、または、ＲＮＡ断片を連結して連続性を保持するための方法の適応３１を含む。
６．腫瘍特異的スプライス変異体から生じた新生ＯＲＦの堅牢な検出は、ＣＬＡＳＳ３２、Ｂａｙｅｓｅｍｂｌｅｒ３３、ＳｔｒｉｎｇＴｉｅ３４、またはそのリファレンスガイドモードにおける類似したプログラム（すなわち、各実験からそれらの全体の転写産物を再作製するように試みるよりもむしろ、公知の転写産物構造を用いる）を用いて、ＲＮＡ－ｓｅｑデータから転写産物をアセンブルすることによって、行われる。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ３５が、この目的で一般的に使用されるが、それは頻繁に、信じ難いほど多数のスプライス変異体を産生し、それらの多くは、完全長遺伝子よりもはるかに短く、単純な陽性対照をリカバーすることができない場合がある。コード配列及び潜在的なナンセンス変異依存分解機構は、変異体配列を再導入した、ＳｐｌｉｃｅＲ３６及びＭＡＭＢＡ３７などのツールで決定される。遺伝子発現は、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ３５またはＥｘｐｒｅｓｓ（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｐａｃｈｔｅｒ，２０１３）などのツールで決定される。野生型及び変異体特異的な発現カウント及び／または相対レベルは、ＡＳＥ３８またはＨＴＳｅｑ３９などの、これらの目的で開発されたツールで決定される。潜在的なフィルタリング段階は、以下を含む：
ａ．不十分に発現されていると考えられる候補新生ＯＲＦの除去。
ｂ．ナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）を引き起こすと予測される候補新生ＯＲＦの除去。
７．腫瘍特異的と直接検証することができない、ＲＮＡにおいてのみ観察される候補新生抗原（例えば、新生ＯＲＦ）は、例として以下を考慮することにより、追加的なパラメータにしたがって、腫瘍特異的である可能性が高いとして分類される：
ａ．腫瘍ＤＮＡのみのシス作用性フレームシフトまたはスプライス部位変異の支持の存在。
ｂ．スプライシング因子における腫瘍ＤＮＡのみのトランス作用性変異の確証の存在。例として、Ｒ６２５変異体ＳＦ３Ｂ１での３つの独立して公開された実験において、最も差次的にスプライシングを呈する遺伝子は、１つの実験がブドウ膜黒色腫患者を検討し４０、第２の実験がブドウ膜黒色腫細胞株を検討し４１、及び第３の実験が乳がん患者を検討した４２にもかかわらず、一致していた。
ｃ．新規のスプライシングアイソフォームについては、ＲＮＡＳｅｑデータにおける「新規の」スプライス－ジャンクションリードの確証の存在。
ｄ．新規の再編成については、正常ＤＮＡには存在しない腫瘍ＤＮＡにおけるエクソン近傍リードの確証の存在。
ｅ．ＧＴＥｘ４３などの遺伝子発現大要からの欠如（すなわち、生殖細胞系列起源の可能性をより低くする）。
８．アラインメント及びアノテーションベースのエラー及びアーチファクトを直接避けるために、アセンブルされたＤＮＡの腫瘍及び正常リード（またはそのようなリード由来のｋマー）を比較することによる、参照ゲノムアラインメントベースの解析の補完（例えば、生殖細胞系列変異またはリピートコンテクスト挿入欠失の近くに生じる体細胞性変異について）。
ポリアデニル化ＲＮＡを有する試料において、ＲＮＡ－ｓｅｑデータにおけるウイルスＲＮＡ及び微生物ＲＮＡの存在は、患者の応答を予測し得る追加的因子の特定に向かって、ＲＮＡ ＣｏＭＰＡＳＳ４４または類似した方法を用いて評価される。
ＶＩ．Ｂ．ＨＬＡペプチドの単離及び検出
ＨＬＡペプチド分子の単離は、組織試料の溶解及び可溶化後に、古典的な免疫沈降（ＩＰ）法を用いて行った５５～５８。清澄化した溶解物を、ＨＬＡ特異的ＩＰに使用した。
免疫沈降は、抗体がＨＬＡ分子に特異的である、ビーズにカップリングした抗体を用いて行った。汎クラスＩ ＨＬＡ免疫沈降のためには、汎クラスＩ ＣＲ抗体を使用し、クラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲのためには、ＨＬＡ－ＤＲ抗体を使用する。抗体を、一晩インキュベーション中に、ＮＨＳ－セファロースビーズに共有結合で付着させる。共有結合性の付着後、ビーズを洗浄して、ＩＰのために等分した５９、６０。ビーズに共有結合されていない抗体を用いて免疫沈降を行うこともできる。一般的に、これは、抗体をカラムに保持するためにＰｒｏｔｅｉｎＡ及び／またはＰｒｏｔｅｉｎＧでコーティングしたセファロースまたは磁気ビーズを使用して行われる。ＭＨＣ／ペプチド複合体を選択的に濃縮するために使用することができるいくつかの抗体を下記に示す。
Figure 0007227237000001
清澄化した組織溶解物を、免疫沈降のために抗体ビーズに添加する。免疫沈降後、ビーズを溶解物から除去し、追加的なＩＰを含む追加的な実験のために、溶解物を保存する。標準的な技法を用いて、ＩＰビーズを洗浄して非特異的結合を除去し、ＨＬＡ／ペプチド複合体をビーズから溶出する。分子量スピンカラムまたはＣ１８分画を用いて、タンパク質構成要素をペプチドから除去する。結果として生じたペプチドを、ＳｐｅｅｄＶａｃ蒸発によって乾燥させ、いくつかの場合には、ＭＳ解析の前に－２０℃で保存する。
乾燥したペプチドを、逆相クロマトグラフィーに適しているＨＰＬＣ緩衝液において再構成し、Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）における勾配溶出のために、Ｃ－１８マイクロキャピラリーＨＰＬＣカラム上にロードする。ペプチド質量／電荷（ｍ／ｚ）のＭＳ１スペクトルを、Ｏｒｂｉｔｒａｐ検出器において高解像度で収集し、その後、ＭＳ２低解像度スキャンを、選択イオンのＨＣＤフラグメンテーション後にイオントラップ検出器において収集した。追加的に、ＭＳ２スペクトルは、ＣＩＤもしくはＥＴＤフラグメンテーション法、または、ペプチドのより大きなアミノ酸カバレッジを獲得するための３つの技法の任意の組み合わせのいずれかを用いて、取得することができる。ＭＳ２スペクトルはまた、Ｏｒｂｉｔｒａｐ検出器において高解像度質量精度で測定することもできる。
各解析由来のＭＳ２スペクトルを、Ｃｏｍｅｔ６１、６２を用いてタンパク質データベースに対して検索し、ペプチド特定を、Ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒ６３～６５を用いてスコア化する。ＰＥＡＫＳ ｓｔｕｄｉｏ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）及び他のサーチエンジンを用いてさらなるシークエンシングを行うか、またはスペクトルマッチング及びデノボシークエンシング７５を含むシークエンシング法を用いることができる。
ＶＩ．Ｂ．１．総合的ＨＬＡペプチドシークエンシングのためのＭＳ検出限界の研究
ペプチドＹＶＹＶＡＤＶＡＡＫを用いて、何が検出の限界かを、ＬＣカラム上にロードした様々な量のペプチドを用いて決定した。試験したペプチドの量は、１ｐｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、１ｆｍｏｌ、及び１００ａｍｏｌであった。（表１）結果を図１Ｆに示す。これらの結果は、検出の最低限界（ＬｏＤ）がアトモルの範囲（１０－１８）にあること、ダイナミックレンジが５桁に及ぶこと、及び、シグナル対ノイズが、低いフェムトモル範囲（１０－１５）でシークエンシングに十分であるように見えることを示す。
Figure 0007227237000002
ＶＩＩ．提示モデル
ＶＩＩ．Ａ．システムの概要
図２Ａは、１つの実施形態にしたがう、患者におけるペプチド提示の尤度を特定するための環境１００の概要である。環境１００は、それ自体が提示情報記憶装置１６５を含む提示特定システム１６０を導入するコンテキストを提供する。
提示特定システム１６０は、図２９に関して下記で議論されるようなコンピュータ計算システムにおいて具現化された、１つまたはコンピュータモデルであり、ＭＨＣアレルのセットに関連するペプチド配列を受け取り、ペプチド配列が、関連するＭＨＣアレルのセットの１つ以上によって提示されるであろう尤度を決定する。提示特定システム１６０はクラスＩ及びクラスＩＩ ＭＨＣアレルの両方に適用することができる。これは、様々なコンテキストにおいて有用である。提示特定システム１６０の１つの具体的な用途の例は、患者１１０の腫瘍細胞由来のＭＨＣアレルのセットに関連する候補新生抗原のヌクレオチド配列を受け取り、候補新生抗原が、腫瘍の関連するＭＨＣアレルの１つ以上によって提示され、及び／または患者１１０の免疫系において免疫原性応答を誘導するであろう尤度を決定することができることである。システム１６０によって決定された際に高い尤度を有するそれらの候補新生抗原を、ワクチン１１８における包含のために選択することができ、そのような抗腫瘍免疫応答が、腫瘍細胞を提供する患者１１０の免疫系から誘発され得る。さらに、高い提示尤度を有する候補新生抗原に対する反応性を有するＴＣＲを有するＴ細胞をＴ細胞療法で使用するために作製することが可能であり、これにより、患者１１０の免疫系から抗腫瘍免疫応答も誘発される。
提示特定システム１６０は、１つ以上の提示モデルを通して提示尤度を決定する。具体的には、提示モデルは、所定のペプチド配列が、関連するＭＨＣアレルのセットについて提示されるかどうかの尤度を生成し、尤度は、記憶装置１６５に保存された提示情報に基づいて生成される。例えば、提示モデルは、ペプチド配列「ＹＶＹＶＡＤＶＡＡＫ」が、試料の細胞表面上のアレルのセットＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０４について提示されるかどうかの尤度を生成し得る。提示情報１６５は、ＭＨＣアレルによってペプチドが提示されるようにこれらのペプチドが様々なタイプのＭＨＣアレルに結合するかどうかについての情報を含有し、これは、モデルにおいて、ペプチド配列中のアミノ酸の位置に応じて決定される。提示モデルは、提示情報１６５に基づいて、認識されていないペプチド配列が、ＭＨＣアレルの関連するセットと結合して提示されるかどうかを予測することができる。上記に述べたように、提示モデルはクラスＩ及びクラスＩＩ ＭＨＣアレルの両方に適用することができる。
ＶＩＩ．Ｂ．提示情報
図２は、１つの実施形態にしたがう、提示情報を取得する方法を説明する。提示情報１６５は、２つの一般的部類の情報：アレル相互作用情報及びアレル非相互作用情報を含む。アレル相互作用情報は、ＭＨＣアレルのタイプに依存する、ペプチド配列の提示に影響を及ぼす情報を含む。アレル非相互作用情報は、ＭＨＣアレルのタイプに非依存的な、ペプチド配列の提示に影響を及ぼす情報を含む。
ＶＩＩ．Ｂ．１．アレル相互作用情報
アレル相互作用情報は、主として、ヒト、マウスなど由来の１つ以上の特定されたＭＨＣ分子によって提示されていることが公知である、特定されたペプチド配列を含む。注目すべきことに、これは、腫瘍試料から取得されたデータを含んでもよく、または含まなくてもよい。提示されたペプチド配列は、単一のＭＨＣアレルを発現する細胞から特定されてもよい。この例において、提示されたペプチド配列は、概して、あらかじめ決定されたＭＨＣアレルを発現するように操作されてその後合成タンパク質に曝露された単一アレル細胞株から収集される。ＭＨＣアレル上に提示されたペプチドは、酸溶出などの技法によって単離され、質量分析により特定される。図２Ｂは、あらかじめ決定されたＭＨＣアレルＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１２：０１上に提示された例示的なペプチド
Figure 0007227237000003
が単離され、質量分析により特定される、この例を示す。この状況においては、ペプチドが、単一のあらかじめ決定されたＭＨＣタンパク質を発現するように操作された細胞を通して特定されるため、提示されたペプチドとそれが結合したＭＨＣタンパク質との間の直接の関連が、決定的に既知である。
提示されたペプチド配列はまた、複数のＭＨＣアレルを発現する細胞から収集されてもよい。典型的にヒトにおいては、６種類の異なるタイプのＭＨＣＩ分子及び最大で１２種類の異なるタイプのＭＨＣＩＩ分子が細胞で発現している。そのような提示されたペプチド配列は、複数のあらかじめ決定されたＭＨＣアレルを発現するように操作されている複数アレル細胞株から特定されてもよい。そのような提示されたペプチド配列はまた、正常組織試料または腫瘍組織試料のいずれかの、組織試料から特定されてもよい。この例において特に、ＭＨＣ分子は、正常組織または腫瘍組織から免疫沈降させることができる。複数のＭＨＣアレル上に提示されたペプチドは、同様に、酸溶出などの技法によって単離され、質量分析により特定されることができる。図２Ｃは、６種類の例示的なペプチド
Figure 0007227237000004
が、特定されたクラスＩ ＭＨＣアレルＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、及びクラスＩＩ ＭＨＣアレルＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１０：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１：１１：０１上に提示されており、単離され、質量分析により特定される、この例を示す。単一アレル細胞株とは対照的に、結合したペプチドが、特定される前のＭＨＣ分子から単離されるため、提示されたペプチドとそれが結合したＭＨＣタンパク質との間の直接の関連は、未知である可能性がある。
アレル相互作用情報はまた、ペプチド－ＭＨＣ分子複合体の濃度、及びペプチドのイオン化効率の両方に依存する、質量分析イオン電流も含むことができる。イオン化効率は、配列依存性様式で、ペプチドごとに変動する。概して、イオン効率は、およそ２桁にわたってペプチドごとに変動し、他方、ペプチド－ＭＨＣ複合体の濃度は、それよりも大きい範囲にわたって変動する。
アレル相互作用情報はまた、所定のＭＨＣアレルと所定のペプチドとの間の結合親和性の測定値または予測値も含むことができる。１つ以上の親和性モデルが、そのような予測値を生成することができる（７２，７３，７４）。例えば、図１Ｄに示した例に戻ると、提示情報１６５は、ペプチドＹＥＭＦＮＤＫＳＦとクラスＩアレルＨＬＡ－Ａ＊０１：０１との間の１０００ｎＭの結合親和性予測値を含み得る。ＩＣ５０＞１０００ｎｍであるペプチドはわずかしか、ＭＨＣによって提示されず、より低いＩＣ５０値が、提示の確率を増大させる。提示情報１６５は、ペプチドＫＮＦＬＥＮＦＩＥＳＯＦＩとクラスＩＩアレルＨＬＡ－ＤＲＢ１：１１：０１との間の結合親和性予測値を含み得る。
アレル相互作用情報はまた、ＭＨＣ複合体の安定性の測定値または予測値も含むことができる。１つ以上の安定性モデルが、そのような予測値を生成することができる。より安定なペプチド－ＭＨＣ複合体（すなわち、より長い半減期を有する複合体）は、腫瘍細胞上、及びワクチン抗原に遭遇する抗原提示細胞上に高コピー数で提示される可能性がより高い。例えば、図２Ｃに示した例に戻ると、提示情報１６５は、クラスＩ分子ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１について１時間の半減期の安定性予測値を含み得る。提示情報１６５はクラスＩＩ分子ＨＬＡ－ＤＲＢ１：１１：０１の半減期の安定性予測値も含み得る。
アレル相互作用情報はまた、ペプチド－ＭＨＣ複合体の形成反応の、測定されたかまたは予測された速度も含むことができる。より速い速度で形成する複合体は、高濃度で細胞表面上に提示される可能性がより高い。
アレル相互作用情報はまた、ペプチドの配列及び長さも含むことができる。ＭＨＣクラスＩ分子は典型的に、８～１５ペプチドの長さを有するペプチドを提示することを好む。提示されたペプチドの６０～８０％は、長さ９を有する。ＭＨＣクラスＩＩ分子は一般的にペプチド６～３０個の長さを有するペプチドを提示する傾向にある。
アレル相互作用情報はまた、新生抗原コード化ペプチド上のキナーゼ配列モチーフの存在、及び新生抗原コード化ペプチド上の特異的な翻訳後修飾の有無も含むことができる。キナーゼモチーフの存在は、ＭＨＣ結合を増強または干渉し得る、翻訳後修飾の確率に影響を及ぼす。
アレル相互作用情報はまた、（ＲＮＡ ｓｅｑ、質量分析、または他の方法によって測定されたかまたは予測された際の）翻訳後修飾のプロセスに関与するタンパク質、例えば、キナーゼの発現または活性レベルも含むことができる。
アレル相互作用情報はまた、質量分析プロテオミクスまたは他の手段によって評価された際の、特定のＭＨＣアレルを発現する他の個体由来の細胞における、類似した配列を有するペプチドの提示の確率も含むことができる。
アレル相互作用情報はまた、（例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析によって測定された際の）問題の個体における特定のＭＨＣアレルの発現レベルも含むことができる。高レベルで発現しているＭＨＣアレルに最も強く結合するペプチドは、低レベルで発現しているＭＨＣアレルに最も強く結合するペプチドよりも、提示される可能性がより高い。
アレル相互作用情報はまた、特定のＭＨＣアレルを発現する他の個体における、特定のＭＨＣアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列非依存的確率も含むことができる。
アレル相互作用情報はまた、他の個体における同じファミリーの分子（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ）のＭＨＣアレルによる提示の、全体的なペプチド配列に非依存的な確率も含むことができる。例えば、ＨＬＡ－Ｃ分子は典型的に、ＨＬＡ－ＡまたはＨＬＡ－Ｂ分子よりも低いレベルで発現しており、したがって、ＨＬＡ－Ｃによるペプチドの提示は、ＨＬＡ－ＡまたはＨＬＡ－Ｂ ＩＩによる提示よりも先験的に確率が低い。別の例として、ＨＬＡ－ＤＰは一般的にＨＬＡ－ＤＲまたはＨＬＡ－ＤＱよりも低いレベルで発現されることから、ＨＬＡ－ＤＰによるペプチドの提示はＨＬＡ－ＤＲまたはＨＬＡ－ＤＱによる提示よりもより確率が低いものと推測される。
アレル相互作用情報はまた、特定のＭＨＣアレルのタンパク質配列も含むことができる。
下記のセクションに列挙される任意のＭＨＣアレル非相互作用情報もまた、ＭＨＣアレル相互作用情報としてモデル化することができる。
ＶＩＩ．Ｂ．２．アレル非相互作用情報
アレル非相互作用情報は、そのソースタンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するＣ末端配列を含むことができる。ＭＨＣ－Ｉでは、Ｃ末端フランキング配列は、ペプチドのプロテアソームプロセシングに影響を及ぼし得る。しかし、Ｃ末端フランキング配列は、ペプチドが小胞体に輸送され、細胞の表面上のＭＨＣアレルと遭遇する前に、プロテアソームによってペプチドから切断される。その結果、ＭＨＣ分子は、Ｃ末端フランキング配列についてのいかなる情報も受け取らず、したがって、Ｃ末端フランキング配列の効果は、ＭＨＣアレルタイプに応じて変動することができない。例えば、図２Ｃに示した例に戻ると、提示情報１６５は、ペプチドのソースタンパク質から特定された、提示されたペプチドＦＪＩＥＪＦＯＥＳＳのＣ末端フランキング配列ＦＯＥＩＦＮＤＫＳＬＤＫＦＪＩを含み得る。
アレル非相互作用情報はまた、ｍＲＮＡ定量測定値も含むことができる。例えば、ｍＲＮＡ定量データは、質量分析訓練データを提供する同じ試料について取得することができる。図１３Ｈに関して後に記載するように、ＲＮＡ発現は、ペプチド提示の強い予測因子であると特定された。一実施形態では、ｍＲＮＡ定量測定値は、ソフトウェアツールＲＳＥＭから特定される。ＲＳＥＭソフトウェアツールの詳細な実行は、Ｂｏ Ｌｉ ａｎｄ Ｃｏｌｉｎ Ｎ．Ｄｅｗｅｙ．ＲＳＥＭ： ａｃｃｕｒａｔｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＲＮＡ－Ｓｅｑ ｄａｔａ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１２：３２３，Ａｕｇｕｓｔ ２０１１で見出すことができる。一実施形態では、ｍＲＮＡ定量は、１００万個のマップされたリードあたりの転写産物のキロ塩基あたりの断片の単位（ＦＰＫＭ）で測定される。
アレル非相互作用情報はまた、そのソースタンパク質配列内の、ペプチドに隣接するＮ末端配列も含むことができる。
アレル非相互作用情報はペプチド配列のソース遺伝子も含むことができる。ソース遺伝子はペプチド配列のＥｎｓｅｍｂｌタンパク質ファミリーとして定義することができる。他の例では、ソース遺伝子はペプチド配列のソースＤＮＡまたはソースＲＮＡとして定義することができる。ソース遺伝子は、例えば、タンパク質をコードするヌクレオチドのストリングとして表すか、またはその代わりに、特定のタンパク質をコードしていることが知られている既知のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の命名されたセットに基づいてよりカテゴリー化された形で表すことができる。別の例では、アレル非相互作用情報は、ＥｎｓｅｍｂｌまたはＲｅｆＳｅｑのようなデータベースから抽出されたペプチド配列のソース転写産物もしくはアイソフォームまたは潜在的なソース転写産物もしくはアイソフォームのセットも含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、ペプチド配列が由来する細胞の組織タイプ、細胞タイプ、または腫瘍タイプも含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、（ＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析によって測定された際の）任意で、腫瘍細胞における対応するプロテアーゼの発現にしたがって重み付けされる、ペプチドにおけるプロテアーゼ切断モチーフの存在も含むことができる。プロテアーゼ切断モチーフを含有するペプチドは、プロテアーゼによってより容易に分解され、したがって細胞内で安定性がより低いことになるため、提示される可能性がより低い。
アレル非相互作用情報はまた、適切な細胞タイプにおいて測定された際の、ソースタンパク質の代謝回転速度も含むことができる。より速い代謝回転速度（すなわち、より低い半減期）は提示の確率を増大させるが、類似していない細胞タイプにおいて測定された場合、この特性の予測力は低い。
アレル非相互作用情報はまた、ＲＮＡ－ｓｅｑもしくはプロテオーム質量分析によって測定された際、または、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列データにおいて検出される生殖細胞系列もしくは体細胞性スプライシング変異のアノテーションから予測された際の、任意で、腫瘍細胞において最も高発現している特異的なスプライス変異体（「アイソフォーム」）を考慮する、ソースタンパク質の長さも含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、（ＲＮＡ－ｓｅｑ、プロテオーム質量分析、または免疫組織化学によって測定され得る）腫瘍細胞におけるプロテアソーム、イムノプロテアソーム、胸腺プロテアソーム、または他のプロテアーゼの発現のレベルも含むことができる。異なるプロテアソームは、異なる切断部位の好みを有する。より大きい重みが、その発現レベルに比例して、プロテアソームの各タイプの切断の好みに与えられる。
アレル非相互作用情報はまた、（例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析によって測定された際の）ペプチドのソース遺伝子の発現も含むことができる。可能な最適化は、腫瘍試料内の間質細胞及び腫瘍浸潤リンパ球の存在を説明する、測定された発現を調整することを含む。より高発現している遺伝子由来のペプチドは、提示される可能性がより高い。検出不可能なレベルの発現を有する遺伝子由来のペプチドは、考察から排除することができる。
アレル非相互作用情報はまた、新生抗原コード化ペプチドのソースｍＲＮＡが、ナンセンス変異依存分解機構のモデル、例えば、Ｒｉｖａｓ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５からのモデルによって予測されるようなナンセンス変異依存分解機構に供されるであろう確率も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、細胞周期の種々の段階の最中の、ペプチドのソース遺伝子の典型的な組織特異的発現も含むことができる。（ＲＮＡ－ｓｅｑまたは試料分析プロテオミクスによって測定された際に）全体的に低いレベルで発現しているが、細胞周期の特異的な段階の最中に高レベルで発現していることが公知である遺伝子は、非常に低いレベルで安定に発現している遺伝子よりも、より提示されるペプチドを産生する可能性が高い。
アレル非相互作用情報はまた、例えば、ｕｎｉＰｒｏｔまたはＰＤＢ http://www.rcsb.org/pdb/home/home.doにおいて与えられるような、ソースタンパク質の特性の総合的なカタログも含むことができる。これらの特性は、とりわけ、タンパク質の二次構造及び三次構造、細胞内局在化１１、遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語を含み得る。具体的には、この情報は、タンパク質のレベルで作用するアノテーション、例えば、５’ＵＴＲ長、及び特異的残基のレベルで作用するアノテーション、例えば、残基３００～３１０のヘリックスモチーフを含有し得る。これらの特性はまた、ターンモチーフ、シートモチーフ、及び無秩序残基も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、ペプチドを含有するソースタンパク質のドメインの性状を説明する特性、例えば、二次構造または三次構造（例えば、αヘリックス対βシート）；選択的スプライシングも含むことができる。
アレル非相互作用情報は、新生抗原のペプチド配列と新生抗原のソース遺伝子の複数のｋマーブロックのうちの１つ以上のｋマーブロックとの間の関連付けも含むことができる（対象のヌクレオチドシークエンシングデータ内に存在するものとして）。提示モデルの訓練時に、新生抗原のペプチド配列と新生抗原のヌクレオチドシークエンシングデータのｋマーブロックとの間のこれらの関連付けをモデルに入力し、モデルがその一部を用いることで訓練ペプチド配列に関連付けられたｋマーブロックにおける提示ホットスポットの有無を表すモデルパラメータを学習させる。次いで、訓練後のモデルの使用時に、試験ペプチド配列と試験ペプチド配列のソース遺伝子の１つ以上のｋマーブロックとの間の関連付けをモデルに入力し、訓練時にモデルにより学習されたパラメータによって、試験ペプチド配列の提示尤度のより正確な予測を提示モデルが行うことが可能となる。
一般的に、ｋマーブロックにおける提示ホットスポットの有無を表すモデルのパラメータは、他のすべての変数（例えば、ペプチド配列、ＲＮＡ発現、ＨＬＡ結合ペプチドに一般に見出されるアミノ酸）について制御した後、ｋマーブロックが提示ペプチドを生じる残留傾向を表す。ｋマーブロックにおける提示ホットスポットの有無を表すパラメータは、バイナリー係数（例えば、０または１）、または特定のスケールに沿ったアナログ係数（例えば、包括的に０～１）とすることができる。いずれの場合も、係数が大きいほど（例えば、１に近いかまたは１）他の因子を制御する提示ペプチドを生じる尤度が高く、係数が小さいほど（例えば、０に近いかまたは０）ｋマーブロックが提示ペプチドを生じる尤度は低い。例えば、ホットスポット係数が低いｋマーブロックは、ＨＬＡ結合ペプチドに一般的に見られるアミノ酸について高いＲＮＡ発現を示す遺伝子からのｋマーブロックである場合があり、その場合、ソース遺伝子が多くの他の提示ペプチドを生じるが、ｋマーブロック内では提示ペプチドがほとんど見られない。ペプチドの存在の他のソースは他のパラメータ（例えば、ＨＬＡ結合ペプチドに一般的に見られるｋマーブロックまたはより大きな単位でのＲＮＡ発現）によって既に説明されていることから、これらのホットスポットパラメータは、他のパラメータによって捉えられる情報を「二重カウント」しない、新たな別の情報を与えるものである。
アレル非相互作用情報はまた、他の個体における問題のペプチドのソースタンパク質由来のペプチドの提示の確率（それらの個体におけるソースタンパク質の発現レベル、及びそれらの個体の様々なＨＬＡタイプの影響を調整した後）も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、ペプチドが、技術的バイアスのために質量分析によって検出されないか、または過剰に表されるであろう確率も含むことができる。
腫瘍細胞、間質、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の状態について情報を与える、ＲＮＡＳｅｑ、マイクロアレイ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇなどの標的化パネルなどの、遺伝子発現アッセイ、または、ＲＴ－ＰＣＲなどのアッセイによって測定される遺伝子モジュールを代表する単一／複数遺伝子によって測定された際の、種々の遺伝子モジュール／経路の発現（ペプチドのソースタンパク質を含有する必要はない）。
アレル非相互作用情報はまた、腫瘍細胞におけるペプチドのソース遺伝子のコピー数も含むことができる。例えば、腫瘍細胞においてホモ接合性欠失に供される遺伝子由来のペプチドは、ゼロの提示確率を割り当てることができる。
アレル非相互作用情報はまた、ペプチドがＴＡＰに結合する確率、または、測定されたかもしくは予測された、ＴＡＰに対するペプチドの結合親和性も含むことができる。ＴＡＰに結合する可能性がより高いペプチド、またはより高い親和性でＴＡＰに結合するペプチドは、ＭＨＣ－Ｉによって提示される可能性がより高い。
アレル非相互作用情報はまた、（ＲＮＡ－ｓｅｑ、プロテオーム質量分析、免疫組織化学によって測定され得る）腫瘍細胞におけるＴＡＰの発現レベルも含むことができる。ＭＨＣ－Ｉでは、より高いＴＡＰ発現レベルは、すべてのペプチドの提示の確率を増大させる。
アレル非相互作用情報はまた、以下を含むがそれらに限定されない、腫瘍変異の有無も含むことができる：
ｉ．ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異。
ｉｉ．抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＴＡＰ－１、ＴＡＰ－２、ＴＡＰＢＰ、ＣＡＬＲ、ＣＮＸ、ＥＲＰ５７、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）におけるもの。その提示が、腫瘍において機能喪失変異の影響下にある抗原提示マシナリーの構成要素に依拠するペプチドは、提示の確率が低減している。
以下を含むがそれらに限定されない、機能的生殖細胞系列多型の有無：
ｉ．抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＴＡＰ－１、ＴＡＰ－２、ＴＡＰＢＰ、ＣＡＬＲ、ＣＮＸ、ＥＲＰ５７、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）におけるもの。
アレル非相互作用情報はまた、腫瘍タイプ（例えば、ＮＳＣＬＣ、黒色腫）も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、例としてＨＬＡアレル接尾辞によって反映されるような、ＨＬＡアレルの公知の機能性も含むことができる。例えば、アレル名ＨＬＡ－Ａ＊２４：０９ＮにおけるＮの接尾辞は、発現せず、したがってエピトープを提示する可能性が低いヌルアレルを示し；完全なＨＬＡアレル接尾辞の命名法は、https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/nomenclature/suffixes.htmlに記載されている。
アレル非相互作用情報はまた、臨床的腫瘍サブタイプ（例えば、扁平上皮肺癌対非扁平上皮）も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、喫煙歴も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、日焼け、日光曝露、または他の変異原に対する曝露の経歴も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、任意でドライバー変異によって層別化される、関連性のある腫瘍タイプまたは臨床的サブタイプにおけるペプチドのソース遺伝子の局部的発現も含むことができる。関連性のある腫瘍タイプにおいて典型的に高レベルで発現している遺伝子は、提示される可能性がより高い。
アレル非相互作用情報はまた、すべての腫瘍における、または同じタイプの腫瘍における、または少なくとも１つの共有されたＭＨＣアレルを有する個体由来の腫瘍における、または少なくとも１つの共有されたＭＨＣアレルを有する個体中の同じタイプの腫瘍における、変異の頻度も含むことができる。
変異した腫瘍特異的ペプチドの例において、提示の確率を予測するために使用される特性の一覧はまた、変異のアノテーション（例えば、ミスセンス、リードスルー、フレームシフト、融合など）、または、変異がナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）を結果としてもたらすと予測されるかどうかも含み得る。例えば、ホモ接合性早期終止変異のために腫瘍細胞において翻訳されないタンパク質セグメント由来のペプチドは、ゼロの提示確率を割り当てることができる。ＮＭＤは、提示の確率を減少させる、ｍＲＮＡ翻訳の減少を結果としてもたらす。
ＶＩＩ．Ｃ．提示特定システム
図３は、１つの実施形態による、提示特定システム１６０のコンピュータ論理構成要素を説明する、ハイレベルブロック図である。この例示的実施形態において、提示特定システム１６０は、データ管理モジュール３１２、コード化モジュール３１４、訓練モジュール３１６、及び予測モジュール３２０を含む。提示特定システム１６０はまた、訓練データ記憶装置１７０及び提示モデル記憶装置１７５から構成される。モデル管理システム１６０のいくつかの実施形態は、本明細書に記載したものとは異なるモジュールを有する。同様に、機能は、本明細書に記載したものは異なる様式で、モジュールの間に分配され得る。
ＶＩＩ．Ｃ．１．データ管理モジュール
データ管理モジュール３１２は、提示情報１６５から訓練データ１７０のセットを生成する。各々の訓練データのセットは、多数のデータ例を含有し、各データ例ｉは、少なくとも、提示されるかまたは提示されないペプチド配列ｐｉと、ペプチド配列ｐｉと結合した１つ以上の関連するＭＨＣアレルａｉと、提示特定システム１６０が、独立変数の新たな値を予測することに関心があるという情報を表す従属変数ｙｉとを含む、独立変数ｚｉのセットを含有する。
本明細書の残りの部分を通じて言及される１つの特定の実現形態において、従属変数ｙｉは、ペプチドｐｉが、１つ以上の関連するＭＨＣアレルａｉによって提示されたかどうかを示す、バイナリーラベルである。しかし、他の実現形態において、従属変数ｙｉは、提示特定システム１６０が、独立変数ｚｉに依存して予測することに関心があるという任意の他の種類の情報を表し得ることが、認識される。例えば、別の実現形態において、従属変数ｙｉはまた、データ例について特定された質量分析イオン電流を示す数値であってもよい。
データ例ｉについてのペプチド配列ｐｉは、ｋｉ個のアミノ酸の配列であり、ｋｉは、データ例ｉの間で、ある範囲内で変動し得る。例えば、その範囲は、ＭＨＣクラスＩについては８～１５、またはＭＨＣクラスＩＩについては６～３０であり得る。システム１６０の１つの具体的な実現形態において、訓練データセット中のすべてのペプチド配列ｐｉは、同じ長さ、例えば９を有し得る。ペプチド配列中のアミノ酸の数は、ＭＨＣアレルのタイプ（例えば、ヒトにおけるＭＨＣアレルなど）に応じて変動し得る。データ例ｉについてのＭＨＣアレルａｉは、どのＭＨＣアレルが対応するペプチド配列ｐｉと結合して存在したかを示す。
データ管理モジュール３１２はまた、訓練データ１７０に含有されるペプチド配列ｐｉ及び結合したＭＨＣアレルａｉと共に、結合親和性ｂｉ及び安定性ｓｉの予測値などの追加的なアレル相互作用変数も含み得る。例えば、訓練データ１７０は、ペプチドｐｉと、ａｉにおいて示される結合したＭＨＣ分子の各々との間の結合親和性予測値ｂｉを含有し得る。別の例として、訓練データ１７０は、ａｉにおいて示されるＭＨＣアレルの各々についての安定性予測値ｓｉを含有し得る。
データ管理モジュール３１２はまた、ペプチド配列ｐｉと共に、Ｃ末端フランキング配列及びｍＲＮＡ定量測定値などのアレル非相互作用変数ｗｉも含み得る。
データ管理モジュール３１２はまた、ＭＨＣアレルによって提示されないペプチド配列も特定して、訓練データ１７０を生成する。概して、これは、提示の前に、提示されるペプチド配列を含むソースタンパク質の「より長い」配列を特定することを含む。提示情報が、操作された細胞株を含有する場合、データ管理モジュール３１２は、細胞のＭＨＣアレル上に提示されなかった、細胞がそれに対して曝露された合成タンパク質における一連のペプチド配列を特定する。提示情報が、組織試料を含有する場合、データ管理モジュール３１２は、提示されたペプチド配列の起源であるソースタンパク質を特定して、組織試料細胞のＭＨＣアレル上に提示されなかった、ソースタンパク質における一連のペプチド配列を特定する。
データ管理モジュール３１２はまた、ランダム配列のアミノ酸を有するペプチドを人工的に生成し、生成された配列を、ＭＨＣアレル上に提示されないペプチドとして特定する。これは、ペプチド配列をランダムに生成することによって達成することができ、ＭＨＣアレル上に提示されないペプチドについての多量の合成データをデータ管理モジュール３１２が容易に生成することを可能にする。実際には、小さなパーセンテージのペプチド配列がＭＨＣアレルによって提示されるため、合成で生成されたペプチド配列は、たとえそれらが細胞によってプロセシングされたタンパク質に含まれたとしても、ＭＨＣアレルによって提示されていない可能性が非常に高い。
図４は、１つの実施形態による、訓練データ１７０Ａの例示的なセットを説明する。具体的には、訓練データ１７０Ａ中の最初の３つのデータ例は、アレルＨＬＡ－Ｃ＊０１：０３を含む単一アレル細胞株、ならびに３種類のペプチド配列
Figure 0007227237000005
からのペプチド提示情報を示す。訓練データ１７０Ａ中の４番目のデータ例は、アレルＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０３、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１を含む複数アレル細胞株、及びペプチド配列ＱＩＥＪＯＥＩＪＥからのペプチド情報を示す。最初のデータ例は、ペプチド配列ＱＣＥＩＯＷＡＲＥが、アレルＨＬＡ－ＤＲＢ３：０１：０１によって提示されなかったことを示す。前の２つの段落において議論したように、ネガティブ標識されたペプチド配列は、データ管理モジュール３１２によってランダムに生成されてもよく、または提示されるペプチドのソースタンパク質から特定されてもよい。訓練データ１７０Ａはまた、ペプチド配列－アレルペアについて、１０００ｎＭの結合親和性予測値及び１時間の半減期の安定性予測値も含む。訓練データ１７０Ａはまた、ペプチドＦＪＥＬＦＩＳＢＯＳＪＦＩＥのＣ末端フランキング配列、及び１０２ＴＰＭのｍＲＮＡ定量測定値などの、アレル非相互作用変数も含む。４番目のデータ例は、ペプチド配列ＱＩＥＪＯＥＩＪＥが、アレルＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０３、またはＨＬＡ－Ａ＊０１：０１のうちの１つによって提示されたことを示す。訓練データ１７０Ａはまた、アレルの各々についての結合親和性予測値及び安定性予測値、ならびに、ペプチドのＣ末端フランキング配列及びペプチドについてのｍＲＮＡ定量測定値も含む。
ＶＩＩ．Ｃ．２．コード化モジュール
コード化モジュール３１４は、訓練データ１７０に含有される情報を、１つ以上の提示モデルを生成するために使用することができる数値的表示へとコード化する。一実現形態では、コード化モジュール３１４は、配列（例えば、ペプチド配列またはＣ末端フランキング配列）を、あらかじめ決定された２０文字のアミノ酸アルファベットについて、ワン・ホットでコード化する。具体的には、ｋｉ個のアミノ酸を有するペプチド配列ｐｉは、２０・ｋｉ要素の行ベクトルとして表され、ペプチド配列のｊ番目の位置のアミノ酸のアルファベットに対応するｐｉ ２０・（ｊ－１）＋１，ｐｉ ２０・（ｊ－１）＋２，．．．，ｐｉ ２０・ｊの中の単一要素は、１の値を有する。その以外の、残りの要素は、０の値を有する。例として、所定のアルファベット｛Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ｝について、データ例ｉの３個のアミノ酸のペプチド配列ＥＡＦは、６０個の要素の行ベクトル
Figure 0007227237000006
によって表され得る。Ｃ末端フランキング配列ｃｉ、ならびに、ＭＨＣアレルについてのタンパク質配列ｄｈ、及び提示情報における他の配列データは、同様に、上記のようにコード化することができる。
訓練データ１７０が、異なる長さのアミノ酸の配列を含有する場合、コード化モジュール３１４は、さらに、あらかじめ決定されたアルファベットを拡張するようにＰＡＤ文字を追加することによって、ペプチドを同等の長さのベクトルへとコード化し得る。例えば、これは、ペプチド配列の長さが、訓練データ１７０において最大の長さを有するペプチド配列に達するまで、ペプチド配列をＰＡＤ文字でレフトパディングすることによって行われ得る。したがって、最大の長さを有するペプチド配列がｋ最大個のアミノ酸を有する場合、コード化モジュール３１４は、各配列を、（２０＋１）・ｋ最大個の要素の行ベクトルとして数値的に表す。例として、拡張されたアルファベット｛ＰＡＤ，Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙ｝及びｋ最大＝５の最大アミノ酸長について、３個のアミノ酸の同じ例示的なペプチド配列ＥＡＦは、１０５要素の行ベクトル
Figure 0007227237000007
によって表され得る。Ｃ末端フランキング配列ｃｉまたは他の配列データは、同様に、上記のようにコード化することができる。したがって、ペプチド配列ｐｉまたはｃｉにおける各々の独立変数または列は、配列の特定の位置の特定のアミノ酸の存在を表す。
配列データをコード化する上記の方法は、アミノ酸配列を有する配列に関して記載したが、方法を、同様に、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列データなどの、他のタイプの配列データに拡張することができる。
コード化モジュール３１４はまた、データ例ｉについての１つ以上のＭＨＣアレルａｉを、ｍ要素の行ベクトルへとコード化し、各要素ｈ＝１，２，．．．，ｍは、固有の特定されたＭＨＣアレルに対応する。データ例ｉについて特定されたＭＨＣアレルに対応する要素は、１の値を有する。その以外の、残りの要素は、０の値を有する。例として、ｍ＝４の固有の特定されたＭＨＣアレルタイプ｛ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１，ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０８，ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２，ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１０：０１｝の中の、複数アレル細胞株に対応するデータ例ｉについてのアレルＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１０：０１は、４要素の行ベクトルａｉ＝［０ ０ １ １］によって表され得、ａ３ ｉ＝１及びａ４ ｉ＝１である。４種類の特定されたＭＨＣアレルタイプでの例を、本明細書に記載するが、ＭＨＣアレルタイプの数は、実際には数百または数千であることができる。上記で述べたように、各データ例ｉは、典型的に、ペプチド配列ｐｉに関連して最大で６種類の異なるＭＨＣアレルタイプをを含む。
コード化モジュール３１４はまた、各データ例ｉについてのラベルｙｉを、｛０，１｝のセットからの値を有するバイナリー変数としてコード化し、１の値は、ペプチドｘｉが、関連するＭＨＣアレルａｉのうちの１つによって提示されたことを示し、０の値は、ペプチドｘｉが、関連するＭＨＣアレルａｉのいずれによっても提示されなかったことを示す。従属変数ｙｉが、質量分析イオン電流を表す場合、コード化モジュール３１４は、［０，∞］の間のイオン電流値について［－∞，∞］の範囲を有するｌｏｇ関数などの種々の関数を用いて、値を追加的にスケール調整し得る。
コード化モジュール３１４は、ペプチドｐｉ及び関連するＭＨＣアレルｈについてのアレル相互作用変数ｘｈ ｉのペアを、アレル相互作用変数の数値的表示が次々に連結されている行ベクトルとして表し得る。例えば、コード化モジュール３１４は、ｘｈ ｉを、［ｐｉ］、［ｐｉｂｈ ｉ］、［ｐｉｓｈ ｉ］、または［ｐｉｂｈ ｉｓｈ ｉ］と同等の行ベクトルとして表し得、ｂｈ ｉは、ペプチドｐｉ及び関連するＭＨＣアレルｈについての結合親和性予測値であり、同様に、ｓｈ ｉは、安定性についてのものである。あるいは、アレル相互作用変数の１つ以上の組み合わせは、個々に（例えば、個々のベクトルまたは行列として）保存されてもよい。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、結合親和性について測定されたかまたは予測された値をアレル相互作用変数ｘｈ ｉに組み入れることによって、結合親和性情報を表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、結合安定性について測定されたかまたは予測された値をアレル相互作用変数ｘｈ ｉに組み入れることによって、結合安定性情報を表す
１つの例において、コード化モジュール３１４は、結合オンレートについて測定されたかまたは予測された値をアレル相互作用変数ｘｈ ｉに組み入れることによって、結合オンレート情報を表す。
１つの例において、クラスＩ ＭＨＣ分子によって提示されるペプチドについて、コード化モジュール３１４は、ペプチド長を、ベクトル
Figure 0007227237000008
（ただし、
Figure 0007227237000009
は指標関数であり、Ｌｋはペプチドｐｋの長さを意味する）として表す。ベクトルＴｋを、アレル相互作用変数ｘｈ ｉに含めることができる。別の例では、クラスＩＩのＭＨＣ分子によって提示されるペプチドについて、コード化モジュール３１４はペプチド長をベクトル
Figure 0007227237000010
（ただし、
Figure 0007227237000011
は指標関数であり、Ｌｋはペプチドｐｋの長さを意味する）として表す。ベクトルＴｋを、アレル相互作用変数ｘｈ ｉに含めることができる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、ＭＨＣアレルのＲＮＡ－ｓｅｑベースの発現レベルをアレル相互作用変数ｘｈｉに組み入れることによって、ＭＨＣアレルのＲＮＡ発現情報を表す。
同様に、コード化モジュール３１４は、アレル非相互作用変数ｗｉを、アレル非相互作用変数の数値的表示が次々に連鎖している行ベクトルとして表し得る。例えば、ｗｉは、［ｃｉ］または［ｃｉｍｉｗｉ］と同等の行ベクトルであってもよく、ｗｉは、ペプチドｐｉのＣ末端フランキング配列及びペプチドに関連するｍＲＮＡ定量測定値ｍｉに加えて任意の他のアレル非相互作用変数を表す、行ベクトルである。あるいは、アレル非相互作用変数の１つ以上の組み合わせは、個々に（例えば、個々のベクトルまたは行列として）保存されてもよい。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、代謝回転速度または半減期をアレル非相互作用変数ｗｉに組み入れることによって、ペプチド配列についてのソースタンパク質の代謝回転速度を表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、タンパク質長をアレル非相互作用変数ｗｉに組み入れることによって、ソースタンパク質またはアイソフォームの長さを表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、β１ｉ、β２ｉ、β５ｉサブユニットを含むイムノプロテアソーム特異的プロテアソームサブユニットの平均発現を、アレル非相互作用変数ｗｉに組み入れることによって、イムノプロテアソームの活性化を表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、（ＲＳＥＭなどの技法によってＦＰＫＭ、ＴＰＭの単位で定量された）ペプチド、またはペプチドの遺伝子もしくは転写産物のソースタンパク質のＲＮＡ－ｓｅｑ存在量を、ソースタンパク質の存在量をアレル非相互作用変数ｗｉに組み入れることによって表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、例えば、Ｒｉｖａｓ ｅｔ．ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５におけるモデルによって推定されるような、ペプチドの起源の転写産物がナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）を受けるであろう確率を、この確率をアレル非相互作用変数ｗｉに組み入れることによって表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、ＲＮＡ－ｓｅｑを介して評価された遺伝子モジュールまたは経路の活性化状況を、例えば、経路における遺伝子の各々について、例えばＲＳＥＭを用いてＴＰＭの単位で、経路における遺伝子の発現を定量すること、次いで、経路における遺伝子にわたる要約統計量、例えば平均値をコンピュータ計算することによって表す。平均を、アレル非相互作用変数ｗｉに組み入れることができる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、ソース遺伝子のコピー数を、コピー数をアレル非相互作用変数ｗｉに組み入れることによって表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、（例えば、ナノモル単位での）測定されたかまたは予測されたＴＡＰ結合親和性をアレル非相互作用変数ｗｉに含むことによって、ＴＡＰ結合親和性を表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、ＲＮＡ－ｓｅｑによって測定され（かつ、例えばＲＳＥＭによってＴＰＭの単位で定量された）ＴＡＰ発現レベルをアレル非相互作用変数ｗｉに含むことによって、ＴＡＰ発現レベルを表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、腫瘍変異を、アレル非相互作用変数ｗｉにおける指標変数のベクトル（すなわち、ペプチドｐｋがＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異を有する試料に由来するならばｄｋ＝１、それ以外は０）として表す。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、抗原提示遺伝子における生殖細胞系列多型を、指標変数のベクトル（すなわち、ペプチドｐｋがＴＡＰにおいて特異的な生殖細胞系列多型を有する試料に由来するならばｄｋ＝１）として表す。これらの指標変数を、アレル非相互作用変数ｗｉに含めることができる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、腫瘍タイプを、腫瘍タイプ（例えば、ＮＳＣＬＣ、黒色腫、大腸癌など）のアルファベットについての長さ１のワン・ホットエンコーディングベクトルとして表す。これらのワン・ホットエンコーディング変数を、アレル非相互作用変数ｗｉに含めることができる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、ＭＨＣアレル接尾辞を、４桁のＨＬＡアレルを様々な接尾辞で処理することによって表す。例えば、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０９Ｎは、モデルの目的で、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０９とは異なるアレルと考えられる。あるいは、Ｎ接尾辞で終わるＨＬＡアレルは発現しないため、Ｎ接尾辞のＭＨＣアレルによる提示の確率は、すべてのペプチドについてゼロに設定することができる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、腫瘍サブタイプを、腫瘍サブタイプ（例えば、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌など）のアルファベットについての長さ１のワン・ホットエンコーディングベクトルとして表す。これらのワン・ホットエンコーディング変数を、アレル非相互作用変数ｗｉに含めることができる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、喫煙歴を、アレル非相互作用変数ｗｉに含めることができる、バイナリー指標変数（患者が喫煙歴を有するならばｄｋ＝１、それ以外は０）として表す。あるいは、喫煙歴を、喫煙の重症度のアルファベットについての長さ１のワン・ホットエンコーディング変数としてコード化することができる。例えば、喫煙状況を、１が非喫煙者を示し、５が現在の大量喫煙者を示す、１～５のスケールに査定することができる。喫煙歴は、主として肺腫瘍と関連性があるため、複数の腫瘍タイプに対するモデルを訓練する場合、この変数は、患者が喫煙の経歴を有し、かつ腫瘍タイプが肺腫瘍であるならば１と同等であり、それ以外はゼロであると定義することもできる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、日焼け歴を、アレル非相互作用変数ｗｉに含めることができる、バイナリー指標変数（患者が重症の日焼けの経歴を有するならばｄｋ＝１、それ以外は０）として表す。重症の日焼けは、主として黒色腫と関連性があるため、複数の腫瘍タイプに対するモデルを訓練する場合、この変数は、患者が重症の日焼けの経歴を有し、かつ腫瘍タイプが黒色腫であるならば１と同等であり、それ以外はゼロであると定義することもできる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、ヒトゲノムにおける各遺伝子または転写産物についての特定の遺伝子または転写産物の発現レベルの分布を、ＴＣＧＡなどの参照データベースを用いることによって、発現レベルの分布の要約統計量（例えば、平均値、中央値）として表す。具体的には、腫瘍タイプ黒色腫を有する試料におけるペプチドｐｋについて、ペプチドｐｋの起源の遺伝子または転写産物の、測定された遺伝子または転写産物の発現レベルをアレル非相互作用変数ｗｉに含むことができるだけでなく、ＴＣＧＡによって測定された際の、黒色腫におけるペプチドｐｋの起源の遺伝子または転写産物の、平均値及び／または中央値の遺伝子または転写産物発現も含むことができる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、変異タイプを、変異タイプ（例えば、ミスセンス、フレームシフト、ＮＭＤ誘導性など）のアルファベットについての長さ１のワン・ホットエンコーディング変数として表す。これらのワン・ホットエンコーディング変数を、アレル非相互作用変数ｗｉに含めることができる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、タンパク質のタンパク質レベルの特性を、ソースタンパク質のアノテーション（例えば、５’ＵＴＲ長）の値として、アレル非相互作用変数ｗｉにおいて表す。別の例において、コード化モジュール３１４は、ペプチドｐiについてのソースタンパク質の残基レベルのアノテーションを、ペプチドｐiがヘリックスモチーフとオーバーラップするならば１と同等であり、それ以外は０であるか、または、ペプチドｐiがヘリックスモチーフ内に完全に含有されるならば１と同等である指標変数を、アレル非相互作用変数ｗｉに含むことによって表す。別の例において、ヘリックスモチーフアノテーション内に含有されるペプチドｐiにおける残基の割合を表す特性を、アレル非相互作用変数ｗｉに含めることができる。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、ヒトプロテオームにおけるタンパク質またはアイソフォームのタイプを、ヒトプロテオームにおけるタンパク質またはアイソフォームの数と同等の長さを有する指標ベクトルｏｋとして表し、対応する要素ｏｋ ｉは、ペプチドｐｋがタンパク質ｉに由来するならば１であり、それ以外は０である。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、ペプチドｐｉのソース遺伝子Ｇ＝ｇｅｎｅ（ｐｉ）をＬ個の可能なカテゴリーを有するカテゴリー変数として表す（ただし、Ｌは添え字を付したソース遺伝子の数の上限１，２，．．．，Ｌを示す）。
１つの例において、コード化モジュール３１４は、ペプチドｐｉの組織タイプ、細胞タイプ、腫瘍タイプ、または腫瘍組織学タイプＴ＝組織（ｐｉ）をＭ個の可能なカテゴリーを有するカテゴリー変数として表す（ただし、Ｍは添え字を付したタイプ１，２，．．．，Ｍの数の上限を示す）。組織のタイプとしては、例えば、肺組織、心組織、腸組織、神経組織などを挙げることができる。細胞のタイプとしては、樹状細胞、マクロファージ、ＣＤ４ Ｔ細胞などを挙げることができる。肺腺癌、肺扁平上皮癌、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫などを挙げることができる。
コード化モジュール３１４はまた、ペプチドｐｉ及び関連するＭＨＣアレルｈについての変数ｚｉの全体的なセットを、アレル相互作用変数ｘｉ及びアレル非相互作用変数ｗｉの数値的表示が次々に連鎖している行ベクトルとしても表し得る。例えば、コード化モジュール３１４は、ｚｈ ｉを、［ｘｈ ｉｗｉ］または［ｗｉｘｈ ｉ］と同等の行ベクトルとして表し得る。
ＶＩＩＩ．訓練モジュール
訓練モジュール３１６は、ペプチド配列に関連するＭＨＣアレルによってペプチド配列が提示されるかどうかの尤度を生成する、１つ以上の提示モデルを構築する。具体的には、ペプチド配列ｐｋ及びペプチド配列ｐｋに関連するＭＨＣアレルａｋのセットを与えられ、各提示モデルは、ペプチド配列ｐｋが、関連するＭＨＣアレルａｋのうちの１つ以上によって提示されるであろう尤度を示す、推定値ｕｋを生成する。
ＶＩＩＩ．Ａ．概要
訓練モジュール３１６は、１６５に保存された提示情報から生成された、記憶装置１７０に保存された訓練データセットに基づいて、１つ以上の提示モデルを構築する。概して、提示モデルの具体的なタイプに関わらず、提示モデルのすべては、損失関数が最小化されるように、訓練データ１７０における独立変数と従属変数との間の依存性を捕捉する。具体的には、損失関数
Figure 0007227237000012
は、訓練データ１７０における１つ以上のデータ例Ｓについての従属変数ｙｉ∈Ｓの値と、提示モデルによって生成されたデータ例Ｓについての推定された尤度ｕｉ∈Ｓとの間の矛盾を表す。本明細書の残りの部分を通じて言及される１つの特定の実現形態において、損失関数
Figure 0007227237000013
は、以下のような等式（１ａ）によって与えられる負のｌｏｇ尤度関数である。
Figure 0007227237000014
しかし、実際には、別の損失関数が使用されてもよい。例えば、質量分析イオン電流について予測がなされる場合、損失関数は、以下のような等式１ｂによって与えられる平均二乗損失である。
Figure 0007227237000015
提示モデルは、１つ以上のパラメータθが、独立変数と従属変数との間の依存性を数学的に明記する、パラメトリックモデルであり得る。典型的に、損失関数
Figure 0007227237000016
を最小化するパラメトリックタイプの提示モデルの種々のパラメータは、例えば、バッチ勾配アルゴリズム、確率的勾配アルゴリズムなどの、勾配ベースの数値的最適化アルゴリズムを通して決定される。あるいは、提示モデルは、モデル構造が、訓練データ１７０から決定され、固定されたパラメータのセットに厳密には基づかない、ノンパラメトリックモデルであり得る。
ＶＩＩＩ．Ｂ．アレル毎モデル
訓練モジュール３１６は、アレル毎ベースでペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルを構築し得る。この例において、訓練モジュール３１６は、単一のＭＨＣアレルを発現する細胞から生成された訓練データ１７０におけるデータ例Ｓに基づいて、提示モデルを訓練し得る。
一実現形態では、訓練モジュール３１６は、
Figure 0007227237000017
によって、特定のアレルｈについてのペプチドｐｋの推定提示尤度ｕｋをモデル化し、ただし、ペプチド配列ｘｈ ｋは、ペプチドｐｋ及び対応するＭＨＣアレルｈについてのコード化されたアレル相互作用変数を意味し、ｆ（・）は、任意の関数であり、記載の便宜上、本明細書中を通して変換関数と呼ばれる。さらに、ｇｈ（・）は、任意の関数であり、記載の便宜上、本明細書中を通して依存性関数と呼ばれ、ＭＨＣアレルｈについて決定されたパラメータθｈのセットに基づいて、アレル相互作用変数ｘｈ ｋについての依存性スコアを生成する。各ＭＨＣアレルｈについてのパラメータθｈのセットの値は、θｈに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、ここでｉは、単一のＭＨＣアレルｈを発現する細胞から生成された訓練データ１７０のサブセットＳにおける各例である。
依存性関数ｇｈ（ｘｈ ｋ；θｈ）の出力は、ＭＨＣアレルｈが、少なくともアレル相互作用特性ｘｈ ｋに基づいて、及び特に、ペプチドｐｋのペプチド配列のアミノ酸の位置に基づいて、対応する新生抗原を提示するかどうかを示す、ＭＨＣアレルｈについての依存性スコアを表す。例えば、ＭＨＣアレルｈについての依存性スコアは、ＭＨＣアレルｈが、ペプチドｐｋを提示する可能性が高い場合に、高い値を有し得、提示の可能性が高くない場合に、低い値を有し得る。変換関数ｆ（・）は、入力を変換し、より具体的には、この例においてｇｈ（ｘｈ ｋ；θｈ）によって生成された依存性スコアを、ペプチドｐｋがＭＨＣアレルによって提示されるであろう尤度を示す適切な値に変換する。
本明細書の残りの部分を通じて言及される１つの特定の実現形態において、ｆ（・）は、適切なドメイン範囲について［０，１］内の範囲を有する関数である。１つの例において、ｆ（・）は、
Figure 0007227237000018
によって与えられるｅｘｐｉｔ関数である。
別の例として、ｆ（・）はまた、ドメインｚの値が０以上である場合、
Figure 0007227237000019
によって与えられる双曲線正接関数であることもできる。あるいは、予測が、範囲［０，１］の外側の値を有する質量分析イオン電流についてなされる場合、ｆ（・）は、例えば、恒等関数、指数関数、ｌｏｇ関数などの任意の関数であることができる。
したがって、ペプチド配列ｐｋがＭＨＣアレルｈによって提示されるであろうアレル毎尤度は、ＭＨＣアレルｈについての依存性関数ｇｈ（・）をペプチド配列ｐｋのコード化されたバージョンに適用して、対応する依存性スコアを生成することによって、生成することができる。依存性スコアは、ペプチド配列ｐｋがＭＨＣアレルｈによって提示されるであろうアレル毎尤度を生成するように、変換関数ｆ（・）によって変換されてもよい。
ＶＩＩＩ．Ｂ．１ アレル相互作用変数についての依存性関数
本明細書を通して言及される１つの特定の実現形態において、依存性関数ｇｈ（・）は、ｘｈ ｋにおける各アレル相互作用変数を、関連するＭＨＣアレルｈについて決定されたパラメータθｈのセットにおける対応するパラメータと線形結合する、
Figure 0007227237000020
によって与えられるアフィン関数である。
本明細書を通して言及される別の特定の実現形態において、依存性関数ｇｈ（・）は、１つ以上の層において配置された一連のノードを有するネットワークモデルＮＮｈ（・）によって表される、
Figure 0007227237000021
によって与えられるネットワーク関数である。ノードは、パラメータθｈのセットにおける関連するパラメータを各々有する接続を通して、他のノードに接続され得る。１つの特定のノードでの値は、特定のノードに関連する活性化関数によってマッピングされた関連するパラメータによって重み付けられた、特定のノードに接続されたノードの値の和として表され得る。アフィン関数と対照的に、ネットワークモデルは、提示モデルが非線形性、及び異なる長さのアミノ酸配列を有するプロセスデータを組み入れることができるため、有利である。具体的には、非線形モデリングを通して、ネットワークモデルは、ペプチド配列中の異なる位置のアミノ酸間の相互作用、及びこの相互作用がペプチド提示にいかに影響を及ぼすかを捕捉することができる。
概して、ネットワークモデルＮＮｈ（・）は、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）、深層ニューラルネットワーク（ＤＮＮ）などのフィードフォワードネットワーク、及び／または、長・短期記憶ネットワーク（ＬＳＴＭ）、双方向再帰型ネットワーク、深層双方向再帰型ネットワークなどの再帰型ネットワークなどとして、構造化され得る。
本明細書の残りの部分を通じて言及される１つの例において、ｈ＝１，２，．．．，ｍにおける各ＭＨＣアレルは、別々のネットワークモデルに関連し、ＮＮｈ（・）は、ＭＨＣアレルｈに関連するネットワークモデルからの出力を意味する。
図５は、任意のＭＨＣアレルｈ＝３に関連した例示的なネットワークモデルＮＮ３（・）を説明する。図５に示すように、ＭＨＣアレルｈ＝３についてのネットワークモデルＮＮ３（・）は、層ｌ＝１での３種類の入力ノード、層ｌ＝２での４種類のノード、層ｌ＝３での２種類のノード、及び層ｌ＝４での１種類の出力ノードを含む。ネットワークモデルＮＮ３（・）は、１０種類のパラメータθ３（１），θ３（２），．．．，θ３（１０）のセットに関連している。ネットワークモデルＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝３についての３種類のアレル相互作用変数ｘ３ ｋ（１）、ｘ３ ｋ（２）、及びｘ３ ｋ（３）についての入力値（コード化されたポリペプチド配列データ及び使用される任意の他の訓練データを含む、個々のデータ例）を受け取り、値ＮＮ３（ｘ３ ｋ）を出力する。ネットワーク関数は、異なるアレル相互作用変数をそれぞれが入力として取る１つ以上のネットワークモデルを含んでもよい。
別の例において、特定されたＭＨＣアレルｈ＝１，２，．．．，ｍは、単一ネットワークモデルＮＮＨ（・）に関連しており、ＮＮｈ（・）は、ＭＨＣアレルｈに関連する単一ネットワークモデルの１つ以上の出力を意味する。そのような例において、パラメータθｈのセットは、単一ネットワークモデルについてのパラメータのセットに対応し得、したがって、パラメータθｈのセットは、すべてのＭＨＣアレルによって共有され得る。
図６Ａは、ＭＨＣアレルｈ＝１，２，．．．，ｍによって共有される例示的なネットワークモデルＮＮＨ（・）を説明する。図６Ａに示すように、ネットワークモデルＮＮＨ（・）は、ＭＨＣアレルに各々対応する、ｍ個の出力ノードを含む。ネットワークモデルＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝３についてのアレル相互作用変数ｘ３ ｋを受け取り、ＭＨＣアレルｈ＝３に対応する値ＮＮ３（ｘ３ ｋ）を含む、ｍ個の値を出力する。
さらに別の例において、単一ネットワークモデルＮＮＨ（・）は、ＭＨＣアレルｈのアレル相互作用変数ｘｈ ｋ及びコード化されたタンパク質配列ｄｈを与えられて依存性スコアを出力する、ネットワークモデルであり得る。そのような例において、パラメータθｈのセットは、再び、単一ネットワークモデルについてのパラメータのセットに対応し得、したがって、パラメータθｈのセットは、すべてのＭＨＣアレルによって共有され得る。したがって、そのような例において、ＮＮｈ（・）は、単一ネットワークモデルに対して入力［ｘｈ ｋｄｈ］を与えられた、単一ネットワークモデルＮＮＨ（・）の出力を意味する。そのようなネットワークモデルは、訓練データにおいて未知であったＭＨＣアレルについてのペプチド提示確率を、単にそれらのタンパク質配列を特定することによって正しく予測することができるため、有利である。
図６Ｂは、ＭＨＣアレルによって共有される例示的なネットワークモデルＮＮＨ（・）を説明する。図６Ｂに示すように、ネットワークモデルＮＮＨ（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝３のアレル相互作用変数及びタンパク質配列を入力として受け取り、ＭＨＣアレルｈ＝３に対応する依存性スコアＮＮ３（ｘ３ ｋ）を出力する。
さらに別の例において、依存性関数ｇｈ（・）は、
Figure 0007227237000022
として表すことができ、式中、ｇ’ｈ（ｘｈ ｋ；θ’ｈ）は、パラメータθ’ｈのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、ＭＨＣアレルｈについての提示のベースライン確率を表す、ＭＨＣアレルのアレル相互作用変数についてのパラメータのセットにおけるバイアスパラメータθｈ ０を伴う。
別の実現形態において、バイアスパラメータθｈ ０は、ＭＨＣアレルｈの遺伝子ファミリーにしたがって共有されてもよい。すなわち、ＭＨＣアレルｈについてのバイアスパラメータθｈ ０はθ遺伝子（ｈ） ０と同等であり得、遺伝子（ｈ）は、ＭＨＣアレルｈの遺伝子ファミリーである。例えば、クラスＩ ＭＨＣアレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、及びＨＬＡ－Ａ＊０２：０３は、「ＨＬＡ－Ａ」の遺伝子ファミリーに割り当てられてもよく、これらのＭＨＣアレルの各々についてのバイアスパラメータθｈ ０が共有されてもよい。別の例として、クラスＩＩ ＭＨＣアレルＨＬＡ－ＤＲＢ１：１０：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１：１１：０１、及びＨＬＡ－ＤＲＢ３：０１：０１を「ＨＬＡ－ＤＲＢ」の遺伝子ファミリーに割り当て、これらのＭＨＣアレルのそれぞれのバイアスパラメータθｈ ０を共有することができる。
例として、等式（２）に戻ると、アフィン依存性関数ｇｈ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007227237000023
によって生成することができ、式中、ｘ３ ｋは、ＭＨＣアレルｈ＝３について特定されたアレル相互作用変数であり、θ３は、損失関数最小化を通してＭＨＣアレルｈ＝３について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、別々のネットワーク変換関数ｇｈ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007227237000024
によって生成することができ、式中、ｘ３ ｋは、ＭＨＣアレルｈ＝３について特定されたアレル相互作用変数であり、θ３は、ＭＨＣアレルｈ＝３に関連するネットワークモデルＮＮ３（・）について決定されたパラメータのセットである。
図７は、例示的なネットワークモデルＮＮ３（・）を用いた、ＭＨＣアレルｈ＝３に関連したペプチドｐｋの提示尤度の生成を説明する。図７に示すように、ネットワークモデルＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝３についてのアレル相互作用変数ｘ３ ｋを受け取り、出力ＮＮ３（ｘ３ ｋ）を生成する。出力は、関数ｆ（・）によってマッピングされて、推定提示尤度ｕｋを生成する。
ＶＩＩＩ．Ｂ．２．アレル非相互作用変数を伴うアレル毎
一実現形態では、訓練モジュール３１６は、アレル非相互作用変数を組み入れて、
Figure 0007227237000025
によって、ペプチドｐｋの推定提示尤度ｕｋをモデル化し、式中、ｗｋは、ペプチドｐｋについてのコード化されたアレル非相互作用変数を意味し、ｇｗ（・）は、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータθｗのセットに基づく、アレル非相互作用変数ｗｋについての関数である。具体的には、各ＭＨＣアレルｈについてのパラメータθｈのセット及びアレル非相互作用変数についてのパラメータθｗのセットの値を、θｈ及びθｗに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、ｉは、単一のＭＨＣアレルを発現する細胞から生成された訓練データ１７０のサブセットＳにおける各例である。
依存性関数ｇｗ（ｗｋ；θｗ）の出力は、アレル非相互作用変数の影響に基づいて、１つ以上のＭＨＣアレルによってペプチドｐｋが提示されるかどうかを示す、アレル非相互作用変数についての依存性スコアを表す。例えば、アレル非相互作用変数についての依存性スコアは、ペプチドｐｋの提示に正の影響を及ぼすことが公知であるＣ末端フランキング配列とペプチドｐｋが結合している場合は、高い値を有し得、ペプチドｐｋの提示に負の影響を及ぼすことが公知であるＣ末端フランキング配列とペプチドｐｋが結合している場合は、低い値を有し得る。
等式（８）によると、ペプチド配列ｐｋがＭＨＣアレルｈによって提示されるであろうアレル毎尤度は、ＭＨＣアレルｈについての関数ｇｈ（・）を、ペプチド配列ｐｋのコード化されたバージョンに適用して、アレル相互作用変数について対応する依存性スコアを生成することによって、生成することができる。アレル非相互作用変数についての関数ｇｗ（・）もまた、アレル非相互作用変数についての依存性スコアを生成するように、アレル非相互作用変数のコード化されたバージョンに適用される。両方のスコアが組み合わされ、組み合わされたスコアが、ＭＨＣアレルｈによってペプチド配列ｐｋが提示されるであろうアレル毎尤度を生成するように、変換関数ｆ（・）によって変換される。
あるいは、訓練モジュール３１６は、等式（２）においてアレル非相互作用変数ｗｋをアレル相互作用変数ｘｈ ｋに付加することにより、予測におけるアレル非相互作用変数ｗｋを含んでもよい。したがって、提示尤度は、
Figure 0007227237000026
によって与えられ得る。
ＶＩＩＩ．Ｂ．３ アレル非相互作用変数についての依存性関数
アレル相互作用変数についての依存性関数ｇｈ（・）と同様に、アレル非相互作用変数についての依存性関数ｇｗ（・）は、アフィン関数、または別々のネットワークモデルがアレル非相互作用変数ｗｋに関連しているネットワーク関数であり得る。
具体的には、依存性関数ｇｗ（・）は、ｗｋにおけるアレル非相互作用変数を、パラメータθｗのセットにおける対応するパラメータと線形結合する、
Figure 0007227237000027
によって与えられるアフィン関数である。
依存性関数ｇｗ（・）はまた、パラメータθｗのセットにおける関連するパラメータを有するネットワークモデルＮＮｗ（・）によって表される、
Figure 0007227237000028
によって与えられるネットワーク関数である。ネットワーク関数は、異なるアレル非相互作用変数をそれぞれが入力として取る１つ以上のネットワークモデルを含んでもよい。
別の例において、アレル非相互作用変数についての依存性関数ｇｗ（・）は、
Figure 0007227237000029
によって与えられ得、式中、ｇ’ｗ（ｗｋ；θ’ｗ）は、アレル非相互作用パラメータθ’ｗのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、ｍｋは、ペプチドｐｋについてのｍＲＮＡ定量測定値であり、ｈ（・）は、定量測定値を変換する関数であり、かつθｗ ｍは、ｍＲＮＡ定量測定値についての依存性スコアを生成するようにｍＲＮＡ定量測定値と組み合わされる、アレル非相互作用変数についてのパラメータのセットにおけるパラメータである。本明細書の残りの部分を通じて言及される１つの特定の実施形態において、ｈ（・）はｌｏｇ関数であるが、実際には、ｈ（・）は、様々な異なる関数のうちのいずれか１つであり得る。
さらに別の例において、アレル非相互作用変数についての依存性関数ｇｗ（・）は、
Figure 0007227237000030
によって与えられ、式中、ｇ’ｗ（ｗｋ；θ’ｗ）は、アレル非相互作用パラメータθ’ｗのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、ｏｋは、ペプチドｐｋについてヒトプロテオームにおけるタンパク質及びアイソフォームを表す、セクションＶＩＩ．Ｃ．２で述べた指標ベクトルであり、かつθｗ ｏは、指標ベクトルと組み合わされるアレル非相互作用変数についてのパラメータのセットにおける、パラメータのセットである。１つのバリエーションにおいて、ｏｋ及びパラメータθｗ ｏのセットの次元が有意に高い場合、
Figure 0007227237000031
（
Figure 0007227237000032
は、Ｌ１ノルム、Ｌ２ノルム、組み合わせなどを表す）などのパラメータ正則化項を、パラメータの値を決定する時に損失関数に加えることができる。ハイパーパラメータλの最適値を、適切な方法を通して決定することができる。
さらに別の例において、アレル非相互作用変数に対する依存性関数ｇｗ（・）は下式により与えられる。すなわち、
Figure 0007227237000033
ただし、ｇ’ｗ（ｗｋ；θ’ｗ）は、アレル非相互作用パラメータθ’ｗのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、
Figure 0007227237000034
は、ペプチドｐｋがアレル非相互作用変数に関して上記に述べたソース遺伝子ｌに由来するものである場合に１に等しいインジケータ関数であり、θｗ ｌはソース遺伝子ｌの「抗原性」を示すパラメータである。１つのバリエーションにおいて、Ｌが充分に大きく、したがって、パラメータの数θｗ ｌ＝１， ２，．．．，Ｌが充分に大きい場合、
Figure 0007227237000035
のようなパラメータ正則化項（ただし、
Figure 0007227237000036
は、Ｌ１ノルム、Ｌ２ノルム、組み合わせなど）をパラメータの値を決定する際に損失関数に加えることができる。ハイパーパラメータλの最適値は適当な方法によって決定することができる。
さらに別の例において、アレル非相互作用変数に対する依存性関数ｇｗ（・）は下式により与えられる。すなわち、
Figure 0007227237000037
ただし、ｇ’ｗ（ｗｋ；θ’ｗ）は、アレル非相互作用パラメータθ’ｗのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、
Figure 0007227237000038
は、アレル非相互作用変数に関して上記に述べたようにペプチドｐｋがソース遺伝子ｌに由来するものである場合、かつペプチドｐｋが組織タイプｍに由来するものである場合に１に等しいインジケータ関数であり、θｗ ｌｍはソース遺伝子ｌと組織タイプｍとの組み合わせの抗原性を示すパラメータである。詳細には、組織タイプｍの遺伝子ｌの抗原性は、組織タイプｍの細胞が、ＲＮＡ発現及びペプチド配列コンテキストについての調節後に遺伝子ｌ由来のペプチドを提示する残留傾向を示し得る。
１つのバリエーションにおいて、ＬまたはＭが充分に大きく、したがって、パラメータの数θｗ ｌｍ＝１， ２，．．．，ＬＭが充分に大きい場合、
Figure 0007227237000039
のようなパラメータ正則化項（ただし、
Figure 0007227237000040
は、Ｌ１ノルム、Ｌ２ノルム、組み合わせなど）をパラメータの値を決定する際に損失関数に加えることができる。ハイパーパラメータλの最適値は適当な方法によって決定することができる。別のバリエーションにおいて、同じソース遺伝子に対する係数が組織タイプ間で大きく異ならないように、パラメータの値を決定する際にパラメータ正則化項を損失関数に加えることができる。例えば、以下のようなペナルティ項：
Figure 0007227237000041
（ただし、
Figure 0007227237000042
はソース遺伝子lの組織タイプにわたった平均の抗原性である）は、損失関数中の異なる組織タイプにわたった抗原性の標準偏差にペナルティを付加することができる。
さらに別の例において、アレル非相互作用変数に対する依存性関数ｇｗ（・）は下式により与えられる。すなわち、
Figure 0007227237000043
式中、g’w(wk;θ’w)はアフィン関数であり、アレル非相互作用パラメータのセットθ’wなどを伴うネットワーク関数
Figure 0007227237000044
は、ペプチドpkがアレル非相互作用変数に関して上記に述べたソース遺伝子ｌ 由来のものである場合に１に等しいインジケータ関数であり、θw lは、ソース遺伝子lの「抗原性」を示すパラメータであり、
Figure 0007227237000045
は、ペプチドpkがプロテオーム位置 ｍからのものである場合に１に等しいインジケータ関数であり、θw mは、プロテオーム位置ｍが提示「ホットスポット」である程度を示すパラメータである。一実施形態では、プロテオーム位置は、同じタンパク質からのｎ個の隣接するペプチドのブロックを含んでよく、ｎは、グリッドサーチ交差検証などの適当な方法により決定されるモデルのハイパーパラメータである。
実際には、式（１０）、（１１）、（１２ａ）、（１２ｂ）、及び（１２ｃ）のいずれかの追加項を組み合わせることによってアレル非相互作用変数に関する依存性関数ｇｗ（・）を生成することができる。例えば、式（１０）のｍＲＮＡ定量測定値を示す項ｈ（・）と式（１２）のソース遺伝子の抗原性を示す項とを他の任意のアフィン関数またはネットワーク関数とともに互いに加え合わせることにより、アレル非相互作用変数に関する依存性関数を生成することができる。
例として、等式（８）に戻ると、アフィン変換関数ｇｈ（・）、ｇｗ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007227237000046
によって生成することができ、式中、ｗｋは、ペプチドｐｋについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θｗは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、ネットワーク変換関数ｇｈ（・）、ｇｗ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007227237000047
によって生成することができ、式中、ｗｋは、ペプチドｐｋについて特定されたアレル相互作用変数であり、θｗは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
図８は、例示的なネットワークモデルＮＮ３（・）及びＮＮｗ（・）を用いた、ＭＨＣアレルｈ＝３に関連したペプチドｐｋの提示尤度の生成を説明する。図８に示すように、ネットワークモデルＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝３についてのアレル相互作用変数ｘ３ ｋを受け取り、出力ＮＮ３（ｘ３ ｋ）を生成する。ネットワークモデルＮＮｗ（・）は、ペプチドｐｋについてのアレル非相互作用変数ｗｋを受け取り、出力ＮＮｗ（ｗｋ）を生成する。出力は、組み合わされ、関数ｆ（・）によってマッピングされて、推定提示尤度ｕｋを生成する。
ＶＩＩＩ．Ｃ．複数アレルモデル
訓練モジュール３１６はまた、２つ以上のＭＨＣアレルが存在する複数アレル設定においてペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルを構築し得る。この例において、訓練モジュール３１６は、単一のＭＨＣアレルを発現する細胞、複数のＭＨＣアレルを発現する細胞、またはそれらの組み合わせから生成された訓練データ１７０におけるデータ例Ｓに基づいて、提示モデルを訓練し得る。
ＶＩＩＩ．Ｃ．１．実施例１：アレル毎モデルの最大値
一実現形態では、訓練モジュール３１６は、複数のＭＨＣアレルＨのセットに関連したペプチドｐｋの推定提示尤度ｕｋを、等式（２）～（１１）と共に上記で説明したような、単一アレルを発現する細胞に基づいて決定されたセットＨにおけるＭＨＣアレルｈの各々について決定された提示尤度
Figure 0007227237000048
の関数としてモデル化する。具体的には、提示尤度ｕｋは、
Figure 0007227237000049
の任意の関数であることができる。一実現形態では、等式（１２）に示すように、関数は最大値関数であり、提示尤度ｕｋは、セットＨにおける各ＭＨＣアレルｈについての提示尤度の最大値として決定することができる。
Figure 0007227237000050
ＶＩＩＩ．Ｃ．２．実施例２．１：和の関数モデル
一実現形態では、訓練モジュール３１６は、ペプチドｐｋの推定提示尤度ｕｋを、
Figure 0007227237000051
によってモデル化し、式中、要素ａｈ ｋは、ペプチド配列ｐｋに関連する複数のＭＨＣアレルＨについて１であり、ｘｈ ｋは、ペプチドｐｋ及び対応するＭＨＣアレルについてのコード化されたアレル相互作用変数を意味する。各ＭＨＣアレルｈについてのパラメータθｈのセットの値は、θｈに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、ｉは、単一のＭＨＣアレルを発現する細胞及び／または複数のＭＨＣアレルを発現する細胞から生成された訓練データ１７０のサブセットＳにおける各例である。依存性関数ｇｈは、セクションＶＩＩＩ．Ｂ．１．において上記で導入された依存性関数ｇｈのいずれかの形態であり得る。
等式（１３）によると、ペプチド配列ｐｋが１つ以上のＭＨＣアレルｈによって提示されるであろう提示尤度は、依存性関数ｇｈ（・）を、ＭＨＣアレルＨの各々についてペプチド配列ｐｋのコード化されたバージョンに適用して、アレル相互作用変数についての対応するスコアを生成することによって、生成することができる。各ＭＨＣアレルｈについてのスコアが組み合わされて、ペプチド配列ｐｋがＭＨＣアレルＨのセットによって提示されるであろう提示尤度を生成するように変換関数ｆ（・）によって変換される。
等式（１３）の提示モデルは、各ペプチドｐｋについての関連するアレルの数が１よりも大きいことができる点で、等式（２）のアレル毎モデルとは異なる。換言すると、ａｈ ｋにおける１つよりも多い要素が、ペプチド配列ｐｋに関連する複数のＭＨＣアレルＨについて１の値を有することができる。
例として、アフィン変換関数ｇｈ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007227237000052
によって生成することができ、式中、ｘ２ ｋ、ｘ３ ｋは、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３について特定されたアレル相互作用変数であり、θ２、θ３は、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、ネットワーク変換関数ｇｈ（・）、ｇｗ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007227237000053
によって生成することができ、式中、ＮＮ２（・）、ＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３について特定されたネットワークモデルであり、θ２、θ３は、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３について決定されたパラメータのセットである。
図９は、例示的なネットワークモデルＮＮ２（・）及びＮＮ３（・）を用いた、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３に関連したペプチドｐｋの提示尤度の生成を説明する。図９に示すように、ネットワークモデルＮＮ２（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝２についてのアレル相互作用変数ｘ２ ｋを受け取り、出力ＮＮ２（ｘ２ ｋ）を生成し、ネットワークモデルＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝３についてのアレル相互作用変数ｘ３ ｋを受け取り、出力ＮＮ３（ｘ３ ｋ）を生成する。出力は、組み合わされ、関数ｆ（・）によってマッピングされて、推定提示尤度ｕｋを生成する。
ＶＩＩＩ．Ｃ．３．実施例２．２：アレル非相互作用変数を伴う和の関数モデル
一実現形態では、訓練モジュール３１６は、アレル非相互作用変数を組み入れて、
Figure 0007227237000054
によって、ペプチドｐｋの推定提示尤度ｕｋをモデル化し、式中、ｗｋは、ペプチドｐｋについてのコード化されたアレル非相互作用変数を意味する。具体的には、各ＭＨＣアレルｈについてのパラメータθｈのセット及びアレル非相互作用変数についてのパラメータθｗのセットの値を、θｈ及びθｗに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、ｉは、単一のＭＨＣアレルを発現する細胞及び／または複数のＭＨＣアレルを発現する細胞から生成された訓練データ１７０のサブセットＳにおける各例である。依存性関数ｇｗは、セクションＶＩＩＩ．Ｂ．３．において上記で導入された依存性関数ｇｗのいずれかの形態であり得る。
したがって、等式（１４）によると、１つ以上のＭＨＣアレルＨによってペプチド配列ｐｋが提示されるであろう提示尤度は、関数ｇｈ（・）を、ＭＨＣアレルＨの各々についてペプチド配列ｐｋのコード化されたバージョンに適用して、各ＭＨＣアレルｈのアレル相互作用変数について対応する依存性スコアを生成することによって、生成することができる。アレル非相互作用変数についての関数ｇｗ（・）もまた、アレル非相互作用変数についての依存性スコアを生成するように、アレル非相互作用変数のコード化されたバージョンに適用される。スコアが組み合わされ、組み合わされたスコアが、ＭＨＣアレルＨによってペプチド配列ｐｋが提示されるであろう提示尤度を生成するように、変換関数ｆ（・）によって変換される。
等式（１４）の提示モデルにおいて、各ペプチドｐｋについての関連するアレルの数は、１よりも大きいことができる。換言すると、ａｈ ｋにおける１つよりも多い要素が、ペプチド配列ｐｋに関連する複数のＭＨＣアレルＨについて１の値を有することができる。
例として、アフィン変換関数ｇｈ（・）、ｇｗ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007227237000055
によって生成することができ、式中、ｗｋは、ペプチドｐｋについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θｗは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、ネットワーク変換関数ｇｈ（・）、ｇｗ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007227237000056
によって生成することができ、式中、ｗｋは、ペプチドｐｋについて特定されたアレル相互作用変数であり、θｗは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
図１０は、例示的なネットワークモデルＮＮ２（・）、ＮＮ３（・）、及びＮＮｗ（・）を用いた、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３に関連したペプチドｐｋの提示尤度の生成を説明する。図１０に示すように、ネットワークモデルＮＮ２（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝２についてのアレル相互作用変数ｘ２ ｋを受け取り、出力ＮＮ２（ｘ２ ｋ）を生成する。ネットワークモデルＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝３についてのアレル相互作用変数ｘ３ ｋを受け取り、出力ＮＮ３（ｘ３ ｋ）を生成する。ネットワークモデルＮＮｗ（・）は、ペプチドｐｋについてのアレル非相互作用変数ｗｋを受け取り、出力ＮＮｗ（ｗｋ）を生成する。出力は、組み合わされ、関数ｆ（・）によってマッピングされて、推定提示尤度ｕｋを生成する。
あるいは、訓練モジュール３１６は、等式（１５）においてアレル非相互作用変数ｗｋをアレル相互作用変数ｘｈ ｋに付加することにより、予測におけるアレル非相互作用変数ｗｋを含んでもよい。したがって、提示尤度は、
Figure 0007227237000057
によって与えられ得る。
ＶＩＩＩ．Ｃ．４．実施例３．１：暗黙のアレル毎尤度を用いたモデル
別の実現形態において、訓練モジュール３１６は、ペプチドｐｋの推定提示尤度ｕｋを、
Figure 0007227237000058
によってモデル化し、式中、要素ａｈ ｋは、ペプチド配列ｐｋに関連する複数のＭＨＣアレルｈ∈Ｈについて１であり、ｕ’ｋ ｈは、ＭＨＣアレルｈについての暗黙のアレル毎提示尤度であり、ベクトルｖは、要素ｖｈが、ａｈ ｋ・ｕ’ｋ ｈに対応するベクトルであり、ｓ（・）は、ｖの要素をマッピングする関数であり、かつｒ（・）は、入力の値を所定の範囲中にクリップするクリッピング関数である。より詳細に下記に記載するように、ｓ（・）は、総和関数または二次関数であってもよいが、他の実施形態において、ｓ（・）は、最大値関数などの任意の関数であり得ることが認識される。暗黙のアレル毎尤度についてのパラメータθのセットの値は、θに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、ｉは、単一のＭＨＣアレルを発現する細胞及び／または複数のＭＨＣアレルを発現する細胞から生成された訓練データ１７０のサブセットＳにおける各例である。
等式（１７）の提示モデルにおける提示尤度は、各々が、個々のＭＨＣアレルｈによってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度に対応する、暗黙のアレル毎提示尤度ｕ’ｋ ｈの関数としてモデル化される。暗黙のアレル毎尤度は、暗黙のアレル毎尤度についてのパラメータが、単一アレル設定に加えて、提示されるペプチドと対応するＭＨＣアレルとの間の直接の関連が未知である複数アレル設定から学習され得る点で、セクションＶＩＩＩ．Ｂのアレル毎提示尤度とは異なる。したがって、複数アレル設定において、提示モデルは、ペプチドｐｋが全体としてＭＨＣアレルＨのセットによって提示されるかどうかを推定できるだけではなく、どのＭＨＣアレルｈがペプチドｐｋを提示した可能性が最も高いかを示す個々の尤度ｕ’ｋ ｈ∈Ｈも提供することもできる。これの利点は、提示モデルが、単一のＭＨＣアレルを発現する細胞についての訓練データを伴わずに暗黙の尤度を生成できることである。
本明細書の残りの部分を通じて言及される１つの特定の実現形態において、ｒ（・）は、範囲［０，１］を有する関数である。例えば、ｒ（・）は、クリップ関数：
ｒ（ｚ）＝ｍｉｎ（ｍａｘ（ｚ，０），１）
であってもよく、ｚと１の間の最小値が、提示尤度ｕｋとして選ばれる。別の実現形態において、ｒ（・）は、
r(z)＝tanh(z)
として与えられる双曲線正接関数であり、ドメインｚの値は、０以上である。
ＶＩＩＩ．Ｃ．５．実施例３．２：関数の和モデル
１つの特定の実現形態において、ｓ（・）は、総和関数であり、提示尤度は、暗黙のアレル毎提示尤度を総和することによって与えられる。
Figure 0007227237000059
１つの実現形態では、ＭＨＣアレルｈについての暗黙のアレル毎提示尤度を、
Figure 0007227237000060
によって生成して、提示尤度が、
Figure 0007227237000061
によって推定されるようにする。
等式（１９）によると、１つ以上のＭＨＣアレルＨによってペプチド配列ｐｋが提示されるであろう提示尤度は、関数ｇｈ（・）を、ＭＨＣアレルＨの各々についてペプチド配列ｐｋのコード化されたバージョンに適用して、アレル相互作用変数についての対応する依存性スコアを生成することによって、生成することができる。各依存性スコアは、最初に、暗黙のアレル毎提示尤度ｕ’ｋ ｈを生成するように、関数ｆ（・）によって変換される。アレル毎尤度ｕ’ｋ ｈが組み合わされ、組み合わされた尤度にクリッピング関数が、値を範囲［０，１］中にクリップするために適用されて、ペプチド配列ｐｋがＭＨＣアレルＨのセットによって提示されるであろう提示尤度が生成され得る。依存性関数ｇｈは、セクションＶＩＩＩ．Ｂ．１．において上記で導入された依存性関数ｇｈのいずれかの形態であり得る。
例として、アフィン変換関数ｇｈ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007227237000062
によって生成することができ、式中、ｘ２ ｋ、ｘ３ ｋは、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３について特定されたアレル相互作用変数であり、θ２、θ３は、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、ネットワーク変換関数ｇｈ（・）、ｇｗ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007227237000063
によって生成することができ、式中、ＮＮ２（・）、ＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３について特定されたネットワークモデルであり、θ２、θ３は、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３について決定されたパラメータのセットである。
図１１は、例示的なネットワークモデルＮＮ２（・）及びＮＮ３（・）を用いた、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３に関連したペプチドｐｋの提示尤度の生成を説明する。図９に示すように、ネットワークモデルＮＮ２（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝２についてのアレル相互作用変数ｘ２ ｋを受け取り、出力ＮＮ２（ｘ２ ｋ）を生成し、ネットワークモデルＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝３についてのアレル相互作用変数ｘ３ ｋを受け取り、出力ＮＮ３（ｘ３ ｋ）を生成する。各出力は、関数ｆ（・）によってマッピングされ、組み合わされて、推定提示尤度ｕｋを生成する。
別の実現形態において、予測が、質量分析イオン電流のｌｏｇについてなされる場合、ｒ（・）はｌｏｇ関数であり、ｆ（・）は指数関数である。
ＶＩＩＩ．Ｃ．６．実施例３．３：アレル非相互作用変数を伴う関数の和モデル
１つの実現形態では、ＭＨＣアレルｈについての暗黙のアレル毎提示尤度を、
Figure 0007227237000064
によって生成して、提示尤度が、
Figure 0007227237000065
によって生成されるようにして、ペプチド提示に、アレル非相互作用変数の影響を組み入れる。
等式（２１）によると、１つ以上のＭＨＣアレルＨによってペプチド配列ｐｋが提示されるであろう提示尤度は、関数ｇｈ（・）を、ＭＨＣアレルＨの各々についてペプチド配列ｐｋのコード化されたバージョンに適用して、各ＭＨＣアレルｈのアレル相互作用変数について対応する依存性スコアを生成することによって、生成することができる。アレル非相互作用変数についての関数ｇｗ（・）もまた、アレル非相互作用変数についての依存性スコアを生成するように、アレル非相互作用変数のコード化されたバージョンに適用される。アレル非相互作用変数のスコアが、アレル相互作用変数の依存性スコアの各々に組み合わされる。組み合わされたスコアの各々が、暗黙のアレル毎提示尤度を生成するように、関数ｆ（・）によって変換される。暗黙の尤度が組み合わされ、組み合わされた出力にクリッピング関数が、値を範囲［０，１］中にクリップするために適用されて、ＭＨＣアレルＨによってペプチド配列ｐｋが提示されるであろう提示尤度が生成され得る。依存性関数ｇｗは、セクションＶＩＩＩ．Ｂ．３．において上記で導入された依存性関数ｇｗのいずれかの形態であり得る。
例として、アフィン変換関数ｇｈ（・）、ｇｗ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007227237000066
によって生成することができ、式中、ｗｋは、ペプチドｐｋについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θｗは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、ネットワーク変換関数ｇｈ（・）、ｇｗ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＭＨＣアレルの中でＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007227237000067
によって生成することができ、式中、ｗｋは、ペプチドｐｋについて特定されたアレル相互作用変数であり、θｗは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
図１２は、例示的なネットワークモデルＮＮ２（・）、ＮＮ３（・）、及びＮＮｗ（・）を用いた、ＭＨＣアレルｈ＝２、ｈ＝３に関連したペプチドｐｋの提示尤度の生成を説明する。図１２に示すように、ネットワークモデルＮＮ２（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝２についてのアレル相互作用変数ｘ２ ｋを受け取り、出力ＮＮ２（ｘ２ ｋ）を生成する。ネットワークモデルＮＮｗ（・）は、ペプチドｐｋについてのアレル非相互作用変数ｗｋを受け取り、出力ＮＮｗ（ｗｋ）を生成する。出力は、組み合わされ、関数ｆ（・）によってマッピングされる。ネットワークモデルＮＮ３（・）は、ＭＨＣアレルｈ＝３についてのアレル相互作用変数ｘ３ ｋを受け取り、出力ＮＮ３（ｘ３ ｋ）を生成し、これも、同じネットワークモデルＮＮｗ（・）の出力ＮＮｗ（ｗｋ）と組み合わされ、関数ｆ（・）によってマッピングされる。両方の出力が組み合わされて、推定提示尤度ｕｋを生成する。
別の実現形態では、ＭＨＣアレルｈについての暗黙のアレル毎提示尤度を、
Figure 0007227237000068
によって生成して、提示尤度が、
Figure 0007227237000069
によって生成されるようにする。
ＶＩＩＩ．Ｃ．７．実施例４：二次モデル
一実現形態では、ｓ（・）は、二次関数であり、ペプチドｐｋの推定提示尤度ｕｋは、
Figure 0007227237000070
によって与えられ、式中、要素ｕ’ｋ ｈは、ＭＨＣアレルｈについての暗黙のアレル毎提示尤度である。暗黙のアレル毎尤度についてのパラメータθのセットの値は、θに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、ｉは、単一のＭＨＣアレルを発現する細胞及び／または複数のＭＨＣアレルを発現する細胞から生成された訓練データ１７０のサブセットＳにおける各例である。暗黙のアレル毎提示尤度は、上記の等式（１８）、（２０）、及び（２２）において示すいずれかの形態であり得る。
一態様において、等式（２３）のモデルは、ペプチド配列ｐｋが、２つのＭＨＣアレルによって同時に提示されるであろう可能性が存在し、２つのＨＬＡアレルによる提示は統計学的に独立していることを含意し得る。
等式（２３）によると、１つ以上のＭＨＣアレルＨによってペプチド配列ｐｋが提示されるであろう提示尤度は、暗黙のアレル毎提示尤度を組み合わせること、及び、ＭＨＣアレルＨによってペプチド配列ｐｋが提示されるであろう提示尤度を生成するように、ＭＨＣアレルの各ペアがペプチドｐｋを同時に提示するであろう尤度を総和から差し引くことによって、生成することができる。
例として、アフィン変換関数ｇｈ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＨＬＡアレルの中でＨＬＡアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007227237000071
によって生成することができ、式中、ｘ２ ｋ、ｘ３ ｋは、ＨＬＡアレルｈ＝２、ｈ＝３について特定されたアレル相互作用変数であり、θ２、θ３は、ＨＬＡアレルｈ＝２、ｈ＝３について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、ネットワーク変換関数ｇｈ（・）、ｇｗ（・）を用いた、ｍ＝４の異なる特定されたＨＬＡアレルの中でＨＬＡアレルｈ＝２、ｈ＝３によってペプチドｐｋが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007227237000072
によって生成することができ、式中、ＮＮ２（・）、ＮＮ３（・）は、ＨＬＡアレルｈ＝２、ｈ＝３について特定されたネットワークモデルであり、θ２、θ３は、ＨＬＡアレルｈ＝２、ｈ＝３について決定されたパラメータのセットである。
ＩＸ 実施例５：予測モジュール
予測モジュール３２０は、配列データを受け取って、提示モデルを用いて配列データ中の候補新生抗原を選択する。具体的には、配列データは、患者の腫瘍組織細胞から抽出されたＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及び／またはタンパク質配列であってよい。予測モジュール３２０は、配列データを、ＭＨＣ－Ｉについては８～１５個のアミノ酸を有する、またはＭＨＣ－ＩＩについては６～３０個のアミノ酸を有する複数のペプチド配列ｐｋに処理する。例えば、予測モジュール３２０は、所定の配列ＩＥＦＲＯＥＩＦＪＥＦを、９個のアミノ酸を有する３種類のペプチド配列
Figure 0007227237000073
に処理することができる。一実施形態では、予測モジュール３２０は、患者の正常組織細胞から抽出された配列データをその患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データと比較して１つ以上の変異を有する部分を特定することによって、変異したペプチド配列である候補新生抗原を特定することができる。
予測モジュール３２０は、提示モデルの１つ以上を処理されたペプチド配列に適用してペプチド配列の提示尤度を推定する。具体的には、予測モジュール３２０は、提示モデルを候補新生抗原に適用することによって、腫瘍ＨＬＡ分子上に提示される可能性が高い１つ以上の候補新生抗原ペプチド配列を選択することができる。一実現形態では、予測モジュール３２０は、あらかじめ決定された閾値を上回る推定提示尤度を有する候補新生抗原配列を選択する。別の実現形態では、提示モデルは、最も高い推定提示尤度を有するｖ個の候補新生抗原配列を選択する（ｖは、一般的に、ワクチン中で送達することができるエピトープの最大数である）。所定の患者について選択された候補新生抗原を含むワクチンを患者に注射して免疫応答を誘導することができる。
Ｘ．実施例６：患者選択モジュール
患者選択モジュール３２４は、患者が選択基準を満たすかどうかに基づいてワクチン治療及び／またはＴ細胞療法に対する患者のサブセットを選択する。一実施形態では、選択基準は、提示モデルによって生成される患者の新生抗原候補の提示尤度に基づいて決定される。選択基準を調整することにより、患者選択モジュール３２４は、患者の新生抗原候補の提示尤度に基づいてワクチン投与及び／またはＴ細胞療法を受ける患者数を調整することができる。具体的には、厳密な選択基準では、ワクチン及び／またはＴ細胞療法によって治療される患者の数はより少なくなるが、有効な治療（例えば、１つ以上の腫瘍特異的新生抗原（ＴＳＮＡ）及び／または１つ以上の新生抗原応答性Ｔ細胞）を受けるワクチン及び／またはＴ細胞療法による治療患者の比率は高くなり得る。これに対して、緩い選択基準では、ワクチン及び／またはＴ細胞療法で治療される患者の数はより多くなるが、有効な治療を受けるワクチン及び／またはＴ細胞療法による治療患者の比率は低くなり得る。患者選択モジュール３２４は、治療を受ける患者の目標比率と、有効な治療を受ける患者の比率との間の所望のバランスに基づいて選択基準を変更する。
いくつかの実施形態では、ワクチン治療を受ける患者を選択するための選択基準は、Ｔ細胞療法を受ける患者を選択するための選択基準と同じである。しかしながら、代替的な実施形態では、ワクチン治療を受ける患者を選択するための選択基準は、Ｔ細胞療法を受ける患者を選択するための選択基準と異なり得る。以下のセクションＸ．Ａ及びＸ．Ｂでは、ワクチン治療を受ける患者を選択するための選択基準、及びＴ細胞療法を受ける患者を選択するための選択基準についてそれぞれ検討する。
Ｘ．Ａ．ワクチン治療を行う患者の選択
一実施形態では、患者に、ワクチン容量ｖを有するその患者に対する個別化ワクチンに潜在的に含ませることが可能なｖ個の新生抗原候補の対応する治療サブセットが関連付けられる。一実施形態では、ある患者に対する治療サブセットは、提示モデルによって決定される最も高い提示尤度を有する新生抗原候補である。例えば、ワクチンがｖ＝２０個のエピトープを含み得る場合、ワクチンは、提示モデルによって決定される最も高い提示尤度を有する各患者の治療サブセットを含み得る。しかしながら、他の実施形態では、ある患者に対する治療サブセットは、他の方法に基づいて決定することもできる点は認識される。例えば、ある患者に対する治療サブセットは、その患者に対する新生抗原候補のセットからランダムに選択することができ、または、ペプチド配列の結合親和性もしくは安定性をモデル化する従来技術のモデル、または提示モデルから得られる提示尤度及びこれらのペプチド配列に関する親和性または安定性情報を含む特定の因子の組み合わせに一部基づいて決定することができる。
一実施形態では、患者選択モジュール３２４は、患者の腫瘍変異負荷が最小の変異負荷に等しいかまたはそれよりも高い場合に患者が選択基準を満たすものと判定する。ある患者の腫瘍変異負荷（ＴＭＢ）は、腫瘍エクソームの非同義変異の総数を示す。一実施形態では、患者選択モジュール３２４は、患者のＴＭＢの絶対数が所定の閾値に等しいかまたはそれよりも高い場合にワクチン治療を行う患者を選択する。別の実現形態では、患者選択モジュール３２４は、患者のＴＭＢが患者のセットについて決定されたＴＭＢ間の閾値パーセンタイル内にある場合にワクチン治療を行う患者を選択する。
別の実施形態では、患者選択モジュール３２４は、患者の治療サブセットに基づく患者の効用値スコアが最小の効用値スコアに等しいかまたはそれよりも高い場合に患者が選択基準を満たすものと判定する。一実施形態では、効用値スコアは、治療サブセットからの提示抗原の推定数の尺度である。
提示抗原の推定数は、新生抗原の提示を１つ以上の確率分布のランダム変数としてモデル化することによって予測することができる。一実現形態では、患者ｉの効用値スコアは、治療サブセットからの提示新生抗原候補の期待数、またはその特定の関数である。例として、各新生抗原の提示は、提示（成功）の確率が新生抗原候補の提示尤度によって与えられるベルヌーイのランダム変数としてモデル化することができる。詳細には、それぞれが最も高い提示尤度ｕｉ１、ｕｉ２、…、ｕｉｖを有するｖ個の新生抗原候補ｐｉ１、ｐｉ２、…、ｐｉｖの治療サブセットＳｉについて、新生抗原候補ｐｉｊの提示は、ランダム変数Ａｉｊによって与えられ、ここで、
Figure 0007227237000074
である。
提示される新生抗原の期待数は、各新生抗原候補の提示尤度の総和により与えられる。換言すれば、患者ｉの効用値スコアは、
Figure 0007227237000075
として表される。
患者選択モジュール３２４は、ワクチン治療について最小効用値に等しいかまたはそれよりも高い効用値スコアを有する患者のサブセットを選択する。
別の実現形態では、患者ｉの効用値スコアは、少なくとも閾値数の新生抗原ｋが提示される確率である。１つの例では、新生抗原候補の治療サブセットＳｉ内の提示抗原の数は、提示（成功）の確率がエピトープのそれぞれの提示尤度によって与えられるポアソン二項ランダム変数としてモデル化される。詳細には、患者ｉの提示抗原の数は、ランダム変数Ｎｉによって与えることができ、ここで、
Figure 0007227237000076
であり、式中、ＰＢＤ（・）は、ポアソン二項分布を示す。少なくとも閾値数の新生抗原ｋが提示される確率は、提示抗原の数Ｎｉがｋに等しいかまたはそれよりも大きい確率の操作によって与えられる。換言すれば、患者ｉの効用値スコアは、
Figure 0007227237000077
として表される。
患者選択モジュール３２４は、ワクチン治療について最小効用値に等しいかまたはそれよりも高い効用値スコアを有する患者のサブセットを選択する。
別の実現形態では、患者ｉの効用値スコアは、１つ以上の患者のＨＬＡアレルに対して固定閾値（例えば５００ｎＭ）よりも低い結合親和性または予測される結合親和性を有する新生抗原候補の治療サブセットＳｉ内の新生抗原の数である。１つの例では、固定閾値は、１０００ｎＭ～１０ｎＭの範囲である。任意で、効用値スコアは、ＲＮＡ－ｓｅｑによって発現されたものとして検出された新生抗原のみをカウントしてもい。
別の実現形態では、患者ｉの効用値スコアは、その患者の１つ以上のＨＬＡアレルに対する結合親和性がそのＨＬＡアレルに対するランダムなペプチドの結合親和性の閾値パーセンタイル以下である、新生抗原候補の治療サブセットＳｉ内の新生抗原の数である。１つの例では、閾値パーセンタイルは、１０パーセンタイル～０．１パーセンタイルの範囲である。任意で、効用値スコアは、ＲＮＡ－ｓｅｑによって発現されたものとして検出された新生抗原のみをカウントしてもよい。
式（２５）及び（２７）に関して説明した効用値スコアの例はあくまで例示的なものに過ぎず、患者選択モジュール３２４は他の統計学または確率分布を用いて効用値スコアを生成することもできる点は認識されよう。
Ｘ．Ｂ． Ｔ細胞療法を行う患者の選択
別の実施形態では、ワクチン治療を受けることに代えて、またはそれに加えて、患者はＴ細胞療法を受けることができる。ワクチン治療と同様、患者がＴ細胞療法を受ける実施形態では、患者を上記に述べたようなｖ個の新生抗原候補の対応する治療サブセットと関連付けることができる。このｖ個の新生抗原候補の治療サブセットを、ｖ個の新生抗原候補のうちの１つ以上に対する反応性を有する、患者由来のＴ細胞のインビトロでの特定に用いることができる。次に、これらの特定されたＴ細胞を増殖させて個別化Ｔ細胞療法において患者に注入することができる。
２つの異なる時点においてＴ細胞療法を受ける患者を選択することができる。第１の時点は、患者に対するｖ個の新生抗原候補の治療サブセットがモデルを用いて予測された後であるが、予測されたｖ個の新生抗原候補の治療サブセットに対して特異的であるＴ細胞のインビトロスクリーニングを行う前である。第２の時点は、予測されたｖ個の新生抗原候補の治療サブセットに対して特異的であるＴ細胞のインビトロスクリーニングを行った後である。
最初に、その患者に対するｖ個の新生抗原候補の治療サブセットが予測された後で、かつ予測されたｖ個の新生抗原候補の治療サブセットに対して特異的である患者由来のＴ細胞のインビトロでの特定を行う前に、Ｔ細胞療法を受ける患者を選択することができる。詳細には、患者由来の新生抗原特異的なＴ細胞のインビトロスクリーニングはコストが嵩み得るため、患者が新生抗原特異的Ｔ細胞を有する可能性が高い場合にのみ、新生抗原特異的Ｔ細胞についてスクリーニングする患者を選択することが望ましいと考えられる。インビトロＴ細胞スクリーニング工程の前に患者を選択するには、ワクチン治療を行う患者を選択するために用いられるものと同じ基準を用いることができる。詳細には、いくつかの実施形態において、患者選択モジュール３２４は、患者の腫瘍変異負荷が上記に述べたような最小の変異負荷に等しいかまたはそれよりも高い場合にＴ細胞療法を受ける患者を選択することができる。別の実施形態では、患者選択モジュール３２４は、その患者についてのｖ個の新生抗原候補の治療サブセットに基づく患者の効用値スコアが、上記に述べたような最小の効用値スコアに等しいかまたはそれよりも高い場合にＴ細胞療法を受ける患者を選択することができる。
第２に、予測されたｖ個の新生抗原候補の治療サブセットに対して特異的である患者由来のＴ細胞のインビトロ特定を行う前にＴ細胞療法を受ける患者を選択することに加えて、またはそれに代えて、予測されたｖ個の新生抗原候補の治療サブセットに対して特異的であるＴ細胞のインビトロ特定を行った後でＴ細胞療法を受ける患者を選択することもできる。詳細には、ある患者は、新生抗原認識についての患者のＴ細胞のインビトロスクリーニングにおいてその患者について新生抗原特異的なＴＣＲの少なくとも閾値量が特定された場合にＴ細胞療法を受けるものとして選択することができる。例えば、ある患者は、少なくとも２つの新生抗原特異的なＴＣＲがその患者について特定された場合にのみ、または２つの異なる新生抗原に対して新生抗原特異的なＴＣＲが特定された場合にのみ、Ｔ細胞療法を受けるものとして選択することができる。
別の実施形態では、ある患者は、その患者に対するｖ個の新生抗原候補の治療サブセットの閾値量の新生抗原が患者のＴＣＲによって認識された場合にのみ、Ｔ細胞療法を受けるものとして選択することができる。例えば、ある患者は、その患者に対するｖ個の新生抗原候補の治療サブセットのうちの少なくとも１つの新生抗原が患者のＴＣＲによって認識された場合にのみ、Ｔ細胞療法を受けるものとして選択することができる。さらなる実施形態では、ある患者は、その患者に対するＴＣＲの少なくとも閾値量が、特定のＨＬＡ制限クラスの新生抗原ペプチドに対して新生抗原特異的なものとして特定された場合にのみ、Ｔ細胞療法を受けるものとして選択することができる。例えば、ある患者は、その患者に対する少なくとも１つのＴＣＲが、新生抗原特異的なＨＬＡクラスＩ制限新生抗原ペプチドとして特定された場合にのみ、Ｔ細胞療法を受けるものとして選択することができる。
いっそうさらなる実施形態では、ある患者は、特定のＨＬＡ制限クラスの新生抗原ペプチドの少なくとも閾値量が患者のＴＣＲによって認識された場合にのみ、Ｔ細胞療法を受けるものとして選択することができる。例えば、ある患者は、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ制限新生抗原ペプチドがその患者のＴＣＲによって認識された場合にのみ、Ｔ細胞療法を受けるものとして選択することができる。他の例では、ある患者は、少なくとも２つのＨＬＡクラスＩＩ制限新生抗原ペプチドがその患者のＴＣＲによって認識された場合にのみ、Ｔ細胞療法を受けるものとして選択することができる。上記の基準の任意の組み合わせを、その患者について予測されたｖ個の新生抗原候補の治療サブセットに対して特異的であるＴ細胞をインビトロで特定した後でＴ細胞療法を受ける患者を選択するために用いることもできる。
ＸＩ．実施例７：例示的な患者選択性能を示す実験結果
セクションＸで述べた患者選択の妥当性を、質量分析データにおいてシミュレートした新生抗原のサブセットが提示されていることが分かっている、シミュレートした新生抗原候補の試験セットがそれぞれに関連付けられたシミュレートした患者のセットで患者の選択を行うことにより検証する。詳細には、試験セット内のそれぞれのシミュレートした新生抗原候補に、その新生抗原がバッサーニ－スターンバーグデータセット（データセット「Ｄ１」）（データは、www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD0000394にみることができる）からの複数アレルＪＹ細胞株ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２の質量分析データセットにおいて提示されているかどうかを示すラベルを関連付ける。図１３Ａとともに下記に詳細に述べるように、シミュレートした患者について多数の新生抗原候補を、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者における変異負荷の既知の度数分布に基づいてヒトプロテオームからサンプリングする。
同じＨＬＡアレルについてのアレル毎提示モデルを、ＩＥＤＢデータセット（データセット「Ｄ２」）（データは、http://www.iedb.org/doc/mhc_ligand_full.zipにみることができる）からの単一アレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２の質量分析データのサブセットである訓練セットを用いて訓練する。詳細には、各アレルの提示モデルを、Ｎ末端側及びＣ末端側のフランキング配列をアレル非相互作用変数として、ネットワーク依存性関数ｇｈ（・）及びｇｗ（・）ならびにｅｘｐｉｔ関数ｆ（・）とともに組み入れた式（８）に示されるアレル毎モデルとした。アレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１の提示モデルは、アレル相互作用変数としてペプチド配列が、アレル非相互作用変数としてＮ末端側及びＣ末端側のフランキング配列が与えられるものとして、特定のペプチドがアレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１上に提示される提示尤度を生成する。アレルＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２の提示モデルは、アレル相互作用変数としてペプチド配列が、アレル非相互作用変数としてＮ末端側及びＣ末端側のフランキング配列が与えられるものとして、特定のペプチドがアレルＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２上に提示される提示尤度を生成する。
以下の例に図１３Ａ～１３Ｅを参照して開示するように、ペプチド結合の予測について訓練された提示モデル及び従来技術のモデルなどの異なるモデルを、それぞれのシミュレートした患者に対する新生抗原候補の試験セットに適用することによって予測に基づき患者に対する異なる治療サブセットを特定する。ワクチン治療について選択基準を満たす患者を選択し、患者の治療サブセットにエピトープを含む個別化ワクチンに関連付ける。治療サブセットのサイズは、異なるワクチン容量に応じて異なる。提示モデルを訓練するために用いられる訓練セットとシミュレートした新生抗原候補の試験セットとの間の重複は導入されない。
以下の例では、ワクチンに含まれるエピトープ間で少なくとも特定の数の提示新生抗原を有する選択された患者の比率を分析する。この統計は、患者に免疫応答を誘発する潜在的な新生抗原を送達するうえでのシミュレートしたワクチンの有効性を示すものである。詳細には、ある試験セット内のシミュレートした新生抗原は、その新生抗原が質量分析データセットＤ２において提示されている場合に提示される。提示された新生抗原を有する患者の高い比率は、免疫応答を誘導することによって新生抗原ワクチンによる治療の奏功の可能性を示す。
ＸＩ．Ａ．実施例７Ａ：ＮＳＣＬＣがん患者における変異負荷の度数分布
図１３Ａは、ＮＳＣＬＣ患者における変異負荷の標本度数分布を示す。ＮＳＣＬＣを含む異なる腫瘍タイプにおける変異負荷及び変異は、例えば、がんゲノムアトラス（ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅ ａｔｌａｓ）（ＴＣＧＡ） （https://cancergenome.nih.gov）にみることができる。Ｘ軸は各患者の非同義変異の数を表し、Ｙ軸は特定の数の非同義変異を有する標本患者の比率を表す。図１３Ａの標本度数分布は、３～１７８６個の変異の範囲を示し、患者の３０％は１００個よりも少ない変異を有している。図１３Ａには示されていないが、変異負荷は非喫煙者と比較して喫煙者でより高く、変異負荷が患者における新生抗原負荷の強力な指標となり得ることが研究によって示されている。
上記のセクションＸＩの冒頭で導入したように、シミュレートした患者の数のそれぞれに、新生抗原候補の試験セットが関連付けられる。各患者の試験セットは、各患者について図１３Ａに示される度数分布から変異負荷ｍｉをサンプリングすることによって生成される。各変異について、ヒトプロテオーム由来の２１マーのペプチド配列を、シミュレートする変異配列を表すようにランダムに選択する。新生抗原候補配列の試験セットを、２１マー内の変異にわたった各（８、９、１０、１１）マーのペプチド配列を特定することにより患者ｉについて生成する。各新生抗原候補に、新生抗原候補配列が質量分析Ｄ１データセット内に存在するかどうかを示すラベルを関連付ける。例えば、データセットＤ１内に存在する新生抗原候補配列にはラベル「１」を関連付け、データセットＤ１内に存在しない配列にはラベル「０」を関連付けることができる。以下でより詳細に述べるように、図１３Ｂ～１３Ｅは、試験セット内の患者の提示新生抗原に基づいた患者選択の実験結果を示している。
ＸＩ．Ｂ．実施例７Ｂ：変異負荷の選択基準に基づく新生抗原提示を有する選択された患者の比率
図１３Ｂは、患者が最小変異負荷を満たすかどうかの選択基準に基づいて選択された患者に対してシミュレートしたワクチン中の提示新生抗原の数を示す。対応する試験において少なくとも特定の数の提示新生抗原を有する選択された患者の比率を特定する。
図１３Ｂにおいて、ｘ軸は、「最小数の変異」のラベルで示される、腫瘍変異負荷に基づいたワクチン治療から除外される患者の比率を示す。例えば、「最小数の変異」２００におけるデータポイントは、患者選択モジュール３２４が、少なくとも変異が２００個の変異負荷を有するシミュレートした患者のサブセットのみを選択したことを示す。別の例として、「最小数の変異」３００におけるデータポイントは、患者選択モジュール３２４が、少なくとも３００個の変異を有するより低い比率のシミュレートした患者を選択したことを示す。ｙ軸は、ワクチン容量ｖを有さない試験セット内の少なくとも特定の数の提示された新生抗原が関連付けられた選択された患者の比率を示す。詳細には、上のプロットは、少なくとも１個の新生抗原を提示する選択された患者の比率を示し、中間のプロットは、少なくとも２個の抗原を提示する選択された患者の比率を示し、下のプロットは、少なくとも３個の抗原を提示する選択された患者の比率を示す。
図１３Ｂに示されるように、提示された新生抗原を有する患者の比率は、変異負荷が高くなるほど顕著に増大している。これは、選択基準としての変異負荷が、新生抗原ワクチンが効果的な免疫反応を誘導する可能性の高い患者を選択するうえで効果的であり得ることを示している。
ＸＩ．Ｃ．実施例７Ｃ：提示モデルと従来技術のモデルとによって特定されたワクチンおける新生抗原提示の比較
図１３Ｃは、提示モデルに基づいて特定された治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた選択された患者と、従来技術のモデルによって特定された治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた選択された患者との間のシミュレートしたワクチン中の提示新生抗原の数を比較したものである。左側のプロットは、限定的なワクチン容量としてｖ＝１０を仮定しており、右側のプロットは限定的なワクチン容量としてｖ＝２０を仮定している。患者は、提示された新生抗原の期待数を示す効用値スコアに基づいて選択される。
図１３Ｃにおいて、実線は、アレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２に対する提示モデルに基づいて特定された治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた患者を示す。各患者に対する治療サブセットは、試験セット内の配列に提示モデルのそれぞれを適用し、最も高い提示尤度を有するｖ個の新生抗原候補を特定することによって特定される。点線は、単一アレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する従来技術のモデルＮＥＴＭＨＣｐａｎに基づいて特定された治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた患者を示す。ＮＥＴＭＨＣｐａｎについての実施の詳細は、http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpanに示されている。各患者に対する治療サブセットは、試験セット内の配列にＮＥＴＭＨＣｐａｎモデルを適用し、最も高い推定される結合親和性を有するｖ個の新生抗原候補を特定することによって特定される。両グラフのｘ軸は、提示モデルに基づいて特定された治療サブセット内の提示新生抗原の期待数を示す期待効用値スコアに基づいてワクチン治療から除外された患者の比率を示す。期待効用値スコアは、セクションＸにおいて式（２５）に関連して述べたようにして決定される。ｙ軸は、ワクチンに含まれる少なくとも特定の数の新生抗原（１、２、または３個の新生抗原）を提示する選択された患者の比率を示す。
図１３Ｃに示されるように、提示モデルに基づいた治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた患者には、従来技術のモデルに基づいた治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた患者よりも有意に高い割合で提示新生抗原を含むワクチンが投与される。例えば、右側のグラフに示されるように、従来技術のモデルに基づいたワクチンに関連付けられた選択された患者のわずか４０％と比較して、提示モデルに基づいたワクチンに関連付けられた選択された患者の８０％に、ワクチン中で少なくとも１つの提示新生抗原が投与される。これらの結果は、本明細書に述べられる提示モデルは、腫瘍を治療するための免疫反応を誘発する可能性の高いワクチンの新生抗原候補を選択するうえで効果的であることを示している。
ＸＩ．Ｄ．実施例７Ｄ：提示モデルにより特定されたワクチンの新生抗原提示に対するＨＬＡカバレッジの影響
図１３Ｄは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１についての単一アレル毎提示モデルに基づいて特定された治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた選択された患者と、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２についてのアレル毎提示モデルの両方に基づいて特定された治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた選択された患者との間のシミュレートしたワクチン中の提示新生抗原の数を比較したものである。ワクチン容量は、ｖ＝２０個のエピトープに設定する。各実験について、異なる治療サブセットに基づいて決定された期待効用値スコアに基づいて患者を選択する。
図１３Ｄにおいて、実線は、ＨＬＡアレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１及びＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２に対する提示モデルの両方に基づいた治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた患者を示す。各患者に対する治療サブセットは、試験セット内の配列に提示モデルのそれぞれを適用し、最も高い提示尤度を有するｖ個の新生抗原候補を特定することによって特定される。点線は、ＨＬＡアレルＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に対する単一提示モデルに基づいた治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた患者を示す。各患者に対する治療サブセットは、試験セット内の配列に単一ＨＬＡアレルのみについての提示モデルを適用し、最も高い提示尤度を有するｖ個の新生抗原候補を特定することによって特定される。実線のプロットでは、ｘ軸は、両方の提示モデルにより特定された治療サブセットに対する期待効用値スコアに基づいてワクチン治療から除外された患者の比率を示す。点線のプロットでは、ｘ軸は、単一の提示モデルにより特定された治療サブセットに対する期待効用値スコアに基づいてワクチン治療から除外された患者の比率を示す。ｙ軸は、少なくとも特定の数の新生抗原（１、２、または３個の新生抗原）を提示する選択された患者の比率を示す。
図１３Ｄに示されるように、両方のＨＬＡアレルに対する提示モデルより特定された治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた患者は、単一の提示モデルにより特定された治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた患者よりも有意に高い割合で新生抗原を提示する。これらの結果は、高いＨＬＡカバレッジを有する提示モデルを確立することの重要性を示すものである。
ＸＩ．Ｅ．実施例７Ｅ：変異負荷と提示新生抗原の期待数とによって選択された患者における新生抗原提示の比較
図１３Ｅは、変異負荷に基づいて選択された患者と、期待効用値スコアにより選択された患者との間でシミュレートしたワクチン中の提示新生抗原の数を比較したものである。期待効用値スコアは、ｖ＝２０個のエピトープのサイズを有する提示モデルにより特定された治療サブセットに基づいて決定する。
図１３Ｅにおいて、実線は、提示モデルにより特定された治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた期待効用値スコアに基づいて選択された患者を示す。各患者に対する治療サブセットは、試験セット内の配列に提示モデルのそれぞれを適用し、最も高い提示尤度を有するｖ＝２０個の新生抗原候補を特定することによって特定される。治療効用値スコアは、セクションＸで式（２５）に基づいて特定された治療サブセットの提示尤度に基づいて決定される。点線は、提示モデルにより特定された治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた変異負荷に基づいて選択された患者を示す。ｘ軸は、実線のプロットの期待効用値スコアに基づいてワクチン治療から除外された患者の比率、及び点線のプロットの変異負荷に基づいて除外された患者の比率を示す。ｙ軸は、少なくとも特定の数の提示新生抗原（１、２、または３個の新生抗原）を含むワクチンが投与される選択された患者の比率を示す。
図１３Ｅに示されるように、期待効用値スコアに基づいて選択された患者には、変異負荷に基づいて選択された患者よりも高い割合で提示新生抗原を含むワクチンが投与される。しかしながら、変異負荷に基づいて選択された患者には、選択されない患者よりも高い割合で提示新生抗原を含むワクチンが投与される。したがって、変異負荷は効果的な新生抗原ワクチン遅漏における効果的な患者選択基準であるが、期待効用値スコアはより効果的である。
ＸＩＩ．実施例８：除外（Ｈｅｌｄ－Ｏｕｔ）質量分析データに対する質量分析訓練モデルの評価
腫瘍細胞によるＨＬＡペプチド提示は抗腫瘍免疫における主要な必要条件であるため９１，９６，９７、ペアリングしたクラスＩ ＨＬＡペプチド配列、ＨＬＡ型、及びトランスクリプトームＲＮＡ－ｓｅｑ（方法）を含むヒト腫瘍及び正常組織試料の大規模な（Ｎ＝７４人の患者）統合データセットを、ヒトのがんにおける抗原提示を予測するためにこれらのデータ及び公表されているデータ９２，９８，９９を用いて新規なディープラーニングモデルを訓練する１００ことを目的として生成した。免疫療法の開発用の対象とするいくつかの腫瘍タイプの中から組織の入手しやすさに基づいて試料を選択した。質量分析によって、試料当たり平均で３７０４種のペプチドが、０．１未満のペプチドレベルＦＤＲで特定された（３４４～１１３０１種の範囲）。これらのペプチドは、アミノ酸８～１５個の長さであり、モーダル長さ９（ペプチドの５６％）の特徴的なクラスＩ ＨＬＡ長の分布に従った。従来の報告と一致して、ペプチドの大部分（中央値７９％）が、ＭＨＣｆｌｕｒｒｙにより、標準的な５００ｎＭの親和性閾値で少なくとも１つの患者のＨＬＡアレルに結合することが予測された９０が、試料間でかなりのばらつきがみられた（例えば、１つの試料ではペプチドの３３％で予測された親和性は５００ｎＭ超であった）。一般的に用いられる１０１「強い結合物質」の閾値である５０ｎＭは、提示されたペプチドのわずか４２％の中央値しか捕捉しなかった。トランスクリプトームシークエンシングでは、試料当たり平均で１３１Ｍの固有のリードが得られ、遺伝子の６８％が少なくとも１つの試料で少なくとも１ＴＰＭ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）のレベルで発現され、これは、最大数の遺伝子の発現が観察されるように設定された大規模かつ多様な試料の価値を強調するものである。ＨＬＡによるペプチド提示は、ｍＲＮＡ発現と強い相関があった。ＲＮＡ発現または配列のみにおける差異によって説明されるよりも大きな、顕著でかつ再現可能なペプチド提示の割合の差異が遺伝子間で観察された。観察されたＨＬＡ型は、主としてヨーロッパ系の祖先を有する患者群由来の試料についての予想と一致した。
これらの、及び公表されているＨＬＡペプチドデータ９２，９８，９９を用いて、ＨＬＡ抗原提示を予測するためにニューラルネットワーク（ＮＮ）モデルを訓練した。腫瘍の質量分析データから、各ペプチドが６つのＨＬＡアレルのいずれか１つによって提示されている可能性のあるアレル特異的モデルを学習するため、アレルペプチドマッピング及びアレル特異的提示モチーフを一緒に学習することが可能な新規なネットワークアーキテクチャ（方法）を開発した。各患者について、陽性として示されたデータポイントは、質量分析によって検出されたペプチドであり、陰性として示されたデータポイントは、その試料中で質量分析によって検出されなかった、参照プロテオーム（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）からのペプチドとした。データを、訓練、検証、及び試験セットに分けた（方法）。訓練セットは、１０１個の試料（６９個の本研究で新たに記載されるもの、及び３２個の従来公表されているもの）から得られた１４２，８４４種のＨＬＡ提示ペプチド（ＦＤＲ＜約０．０２）で構成されるものとした。検証セット（早期終了に用いた）は、同じ１０１個の試料からの１８，００４種の提示ペプチドで構成されるものとした。以下の２つの質量分析データセットを試験に用いた。すなわち、（１）訓練データから外された５つのさらなる腫瘍試料（２個の肺、２個の結腸、１個の卵巣）から得た５７１種の提示ペプチドで構成される腫瘍試料試験セット、及び（２）訓練データに含まれる単一アレルペプチドの位置に隣接した（ただし、異なる）ゲノム位置ウインドウ（ブロック）からの２，１２８種の提示ペプチドで構成される単一アレル細胞株試験セット（訓練／試験分割に関するさらなる詳細は「方法」を参照）。
訓練データは、５３種のＨＬＡアレルについて予測モデルを特定した。従来の研究９２，１０４と異なり、これらのモデルは、複数の長さのペプチドにおける各配列位置に対するＨＬＡ提示の依存度を捕捉した。このモデルは、遺伝子ＲＮＡ発現及び遺伝子特異的提示傾向に対する臨界依存度を適正に学習し、ｍＲＮＡ存在量及び学習された遺伝子当たりの提示の傾向を独立して組み合わせると、発現量が最低で最も提示されにくい遺伝子と発現量が最高で最も提示されやすい遺伝子との間の提示の割合に最大約６０倍の差を生じた。このモデルは、予測された結合親和性の制御後であっても、ＩＥＤＢにおけるＨＬＡ／ペプチド複合体の測定される安定性８８を予測する（１０個のアレルに対してｐ＜１ｅ－１０）ことがさらに観察された（試験した１０個のアレルのうちの８個についてｐ＜０．０５）。これらをまとめると、これらの特性は、免疫原性のＨＬＡクラスＩペプチドの改善された予想の基礎をなすものである。
除外質量分析試験セットに対するＨＬＡ提示の予測因子としてのこのＮＮモデルの性能を評価した。詳細には、図１４は、各モデルを５種類の異なる除外試験試料で試験した場合の、ＭＳモデルの異なるバージョンと、質量分析から溶出ペプチドをモデル化する近年公開されたアプローチ（ＭｉｘＭＨＣＰｒｅｄ）の再現率４０％での陽性適中率（ＰＰＶ）を比較したものである。図１４はまた、５種類の試験試料について各モデルの再現率４０％での平均のＰＰＶも示している。
図１４で試験した各モデルは（左から右の順に）、「完全ＭＳモデル」（「方法」に記載される完全ＮＮモデル）、「ＭＳモデル、フランキング配列なし」（フランキング配列特性を除いた点以外は完全ＮＮモデルと同じ）、「ＭＳモデル、フランキング配列も遺伝子毎パラメータもなし」（フランキング配列及び遺伝子毎パラメータ特性を除いた点以外は完全ＮＮモデルと同じ）、「ペプチドのみのＭＳモデル、すべての長さを一緒に訓練」（使用した特性はペプチド配列及びＨＬＡ型のみである点以外は完全ＮＮモデルと同じ）、「ペプチドのみのＭＳモデル、それぞれの長さを別々に訓練」（このモデルでは、９マー及び１０マーについて別々のモデルを訓練した点以外、モデル構造は、ペプチドのみのＭＳモデルと同じ）、「線形のペプチドのみのＭＳモデル（アンサンブリングを伴う）」（ニューラルネットワークを用いてペプチド配列をモデル化する代わりに、完全モデルで使用され、「方法」に記載されるものと同じ最適化手順を用いて訓練された線形モデルのアンサンブルを用いた点以外は、それぞれのペプチド長さを別々に訓練したペプチドのみのＭＳモデルと同じ）；「ＭｉｘＭＨＣＰｒｅｄ １．１」は、デフォルト設定のＭｉｘＭＨＣＰｒｅｄである；「結合親和性」は同じＭＨＣｆｌｕｒｒｙ １．２．０である。
「完全ＭＳモデル」、「ＭＳモデル、フランキング配列なし」、「ＭＳモデル、フランキング配列も遺伝子毎パラメータもなし」、「ペプチドのみのＭＳモデル、すべての長さを一緒に訓練」、「ペプチドのみのＭＳモデル、すべての長さを別々に訓練」、及び「線形のペプチドのみのＭＳモデル」は、いずれも上記に述べた質量分析データで訓練されたニューラルネットワークモデルである。しかしながら、各モデルは試料の異なる特性を用いて訓練及び試験される。「ＭｉｘＭＨＣＰｒｅｄ １．１」モデル及び「結合親和性」モデルは、ＨＬＡ提示ペプチドをモデル化するための初期のアプローチである１０４。ＭｉｘＭＨＣＰｒｅｄは、９個及び１０個以外の長さのペプチドは現時点でモデル化していないため、９マー及び１０マーのみを比較で用いた。最後の５つのモデル（「ペプチドのみのＭＳモデル、すべての長さを一緒に訓練」～「結合親和性」）は、ペプチド配列及びＨＬＡ型のみの同じ入力を有する。詳細には、最後の５つのモデルのいずれも予想を行ううえでＲＮＡ存在量を用いていない。
最も性能の良いペプチドのみのモデル（「ペプチドのみのＭＳモデル、すべての長さを一緒に訓練」）が再現率４０％において０．４１の平均ＰＰＶを与えたのに対して、最も性能の低い質量分析データで訓練されたペプチドのみのモデル（「線形のペプチドのみのＭＳモデル」）では、平均ＰＰＶはわずか２８％であり（ＭｉｘＭＨＣｐｒｅｄ１．１の１８％の平均ＰＰＶよりもごくわずかに高かった）、ペプチド配列の改善されたＮＮモデル化の値を強調するものである。ＭｉｘＭＨＣｐｒｅｄ１．１は、線形のペプチドのみのＭＳモデルとは異なるデータで訓練されるが、同じモデル化特性の多くを有する（例えば、それぞれのペプチド長が別々に訓練される線形モデルである）点に留意されたい。
全体として、ＮＮモデルはＨＬＡペプチド提示の有意に改善された予測を実現し、ＰＰＶは、腫瘍試験セットで標準的な結合親和性＋遺伝子発現よりも最大で９倍高かった。ＭＳを用いたＮＮモデルのＰＰＶの大きな利点は、異なる再現率閾値にわたって維持され、統計的に有意であった（すべての腫瘍試料についてｐ＜１０－６）。ＨＬＡペプチド提示についての標準的な結合親和性＋遺伝子発現の陽性適中率は、６％と低い値に達し、従来の推定値と一致した８７，９３。しかしながら、わずかな割合のペプチドしか提示されているものとして検出されないことから（例えば、腫瘍ＭＳ試験データセットでは２５００のうち約１）、この約６％のＰＰＶは、ベースライン存在率と比較して１００倍超の改善を表す点に留意されたい。
入力としてＨＬＡ型及びペプチド配列のみを用いた質量分析データで訓練された縮小モデルを完全ＭＳモデルと比較することにより、結合親和性の予測に対するＰＰＶの増加の約３０％は、質量分析によって捕捉することができるが結合親和性アッセイによっては捕捉されないペプチドの外因性特性（ＲＮＡ存在量、フランキング配列、遺伝子毎パラメータ）のモデル化に起因するものと判断された。増加の残りの約７０％は、ペプチド配列の改善されたモデル化に起因した。このモデル化は、ヒト腫瘍におけるＨＬＡ提示ペプチドのモデル化における初期のアプローチ１０４よりも高い性能を示したことから、性能の改善に寄与したのは、訓練データセット（ＨＬＡ提示ペプチド）の性質だけではなく、全体のモデルアーキテクチャであった。この新たなモデルアーキテクチャにより、結合親和性予測またはハードクラスタリングアプローチ１０４～１０６を用いた、想定される提示アレルに対するペプチドの事前の割り当てを必要としない、エンド・ツー・エンド訓練プロセスによるアレル特異的モデルの学習が可能となった。重要な点として、このモデルアーキテクチャでは、線形畳み込みなどの畳み込みの必須条件としてアレル特異的なサブモデルに対して精度を低下させる制限を課すこと、または、各ペプチド長を別々に考慮する１０４ことも避けられる。完全モデルは、いくつかの単純化されたモデル及びこれらの制限が課される従来公開されているアプローチの性能を上回る。
ＸＩＩＩ．実施例９：提示ホットスポットモデル化を含む実験結果
ＨＬＡ提示をモデル化するうえで提示ホットスポットパラメータを用いることの利点を具体的に評価するため、提示ホットスポットパラメータを組み込んだニューラルネットワーク提示モデルの性能を、提示ホットスポットパラメータを組み込まないニューラルネットワーク提示モデルの性能と比較した。基本のニューラルネットワークアーキテクチャは両方のモデルで同じであり、セクションＶＩＩで上記に述べた提示モデルと同じであった。簡単に述べると、モデルは、ペプチド及びフランキングアミノ酸配列パラメータ、ＲＮＡシークエンシング転写データ（ＴＰＭ）、タンパク質ファミリーデータ、試料ごとの識別子、及びＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃタイプを含むものとした。５つのネットワークのアンサンブルを各モデルで使用した。提示ホットスポットパラメータを含むモデルでは、遺伝子ごとプロテオームブロックサイズ１０、及びペプチド長８～１２として、セクションＶＩＩＩ．Ｂ．３．で上記に述べた式１２ｃを使用した。
２つのモデルを、セクションＸＩＩで上記に述べた質量分析データセットを使用して実験を行うことにより比較した。詳細には、競合するモデルを公平に評価する目的で５つの試料をモデル訓練及び評価から除外（ｈｅｌｄ－ｏｕｔ）した。残りの試料の９０％をモデル訓練用に、１０％を訓練の検証用にランダムに分けた。
図１５Ａは、各モデルを５つの除外試験試料で試験した場合に、提示ホットスポットパラメータを使用した提示モデルと提示ホットスポットパラメータを使用しない提示モデルの再現率にわたった平均の陽性適中率（ＰＰＶ）を比較したものである。提示ホットスポットパラメータを組み込んだモデルは、試料のそれぞれで個別に提示ホットスポットパラメータを組み込まないモデルの性能を上回り、提示ホットスポットパラメータ有りでは０．８２の平均適合率であり、提示ホットスポットパラメータ無しでは０．７７であった。
図１５Ｂ～Ｆは、各モデルを５つの除外試験試料のそれぞれで試験した場合に、提示ホットスポットパラメータを使用した提示モデルと提示ホットスポットパラメータを使用しない提示モデルの適合率－再現率曲線を比較したものである。
ＸＩＶ．実施例１０：Ｔ細胞エピトープを特定するための提示ホットスポットパラメータの評価
ヒト腫瘍ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープ（すなわち、免疫療法のターゲット）を特定するためにＨＬＡ提示をモデル化するうえで提示ホットスポットパラメータを使用することの利点をさらに直接試験した。この評価を行うための適当な試験データセットを定義することは、試験データセットが、Ｔ細胞によって認識され、かつＨＬＡにより腫瘍細胞表面上に提示されるペプチドを含まなければならないことから困難である。さらに、正式な性能評価は、陽性標識された（すなわち、Ｔ細胞に認識された）ペプチドだけでなく、充分な数の陰性標識された（すなわち、試験したが、認識されなかった）ペプチドも必要とする。質量分析データセットは、腫瘍提示に対応するがＴ細胞認識には対応せず、逆に、ワクチン接種後のプライミングまたはＴ細胞アッセイはＴ細胞認識に対応するが腫瘍提示には対応しない。
適当なデータセットを得るため、本発明者らは、公表されているＣＤ８ Ｔ細胞エピトープを、必要な基準を満たす以下の５つの最近の研究から集めた。すなわち、研究Ａ９６は、消化管腫瘍を有する９人の患者でＴＩＬを調べ、自家ＤＣ中でタンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）法を用いてＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴにより試験した、１，０５３個の体細胞ＳＮＶ変異のうち１２個のＴ細胞による認識を報告している。研究Ｂ８４もＴＭＧを用い、5人の黒色腫患者から得たＣＤ８＋ＰＤ－１＋循環リンパ球による５７４個のＳＮＶのうち６個のＴ細胞による認識を報告している。研究Ｃ９７は、パルス化ペプチド刺激を用いて３人の黒色腫患者から得たＴＩＬを評価し、３８１個の試験したＳＮＶ変異のうち５個に対する応答を見出している。研究Ｄ１０８は、ＴＭＧアッセイの組み合わせを用い、最小エピトープペプチドでパルスして１人の乳がん患者から得たＴＩＬを評価し、６２個のＳＮＶのうち２個の認識を報告している。研究Ｅ１６０は、５２種類のＴＳＮＡを有するアメリカ国立がん研究所より得た１７人の患者においてＴＩＬを評価した。組み合わせたデータセットは、既存のＴ細胞反応を示す７５種類のＴＳＮＡを含む、３３人の患者から得た４，８４３個のアッセイされたＳＮＶを含んでいた。重要な点として、データセットは大部分が腫瘍浸潤リンパ球による新生抗原認識からなるため、このデータセットに対する効果的な予測は、このモデルが上記のセクションに記載されるようにＴ細胞をプライミングできる新生抗原だけでなく、腫瘍によりＴ細胞に対して提示される新生抗原を特定する能力を有することを示す。
個別化免疫療法用の抗原のセレクションを刺激するため、体細胞変異を２つの方法を用いて提示の確率の順にランク付けした。すなわち、(1)ホットスポット特性を含むＭＳモデル（ブロックサイズｎ＝１０として式１２ｃで記述される）、及び（２）ホットスポット特性を含まない従来のＭＳモデル。抗原特異的な免疫療法の能力は、標的とされる特異性の数において制約されているため（例えば、現在の個別化ワクチンは約１０～２０個の変異をコードしている６、８１～８２）、それぞれの患者について上位５、１０、２０、または３０位にランク付けされたペプチドにおける既存のＴ細胞応答の数をカウントすることにより予測方法を比較した。結果を表１６に示す。
詳細には、図１６は、提示ホットスポットパラメータを用いた提示モデル及び提示ホットスポットパラメータを用いない提示モデルによって特定された上位５、１０、２０、及び３０位にランクされたペプチドにおけるＴ細胞により認識された体細胞変異にわたるペプチドの割合を、少なくとも１つの既存のＴ細胞応答を有する患者から採取された試験試料からなる試験セットについて比較したものである。図１６に示されるように、ホットスポット特性を含むモデルは、ホットスポット特性を含まないモデルと同等の性能を示し、いずれのモデルも上位２０位及び１０位にランクされたペプチドでそれぞれ４５回及び３１回のＴ細胞応答を予測した。しかしながら、ホットスポットモデルは、上位３０位及び上位５位のペプチドを予測する際には改善を示し、ホットスポットモデルはそれぞれ、６回及び４回多いＴ細胞応答を含んだ。
ＸＩＩＩ．Ａ．データ
本発明者らは、Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．８４、Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．１４０、Ｓｔｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．１４１及びＺａｃｈａｒａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．、及びＫｏｓａｌｏｇｌｕ－Ｙａｌｃｉｎ ｅｔ ａｌ．１６０の補足情報から変異コール、ＨＬＡ型、及びＴ細胞認識データを得た。
変異レベルの分析（図１６）では、Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｚａｃｈａｒａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．１０８、及びＫｏｓａｌｏｇｌｕ－Ｙａｌｃｉｎ ｅｔ ａｌ．１６０における陽性として示されるデータポイントは、ＴＭＧアッセイまたは最小エピトープペプチドパルスアッセイの両方において患者Ｔ細胞によって認識される変異とした。陰性として示されるデータポイントは、ＴＭＧアッセイで試験した他のすべての変異とした。Ｓｔｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌでは、陽性として示される変異は、少なくとも１つの認識されるペプチドがまたがる変異とし、陰性のデータポイントは、試験されたがテトラマーアッセイにおいて認識されなかったすべての変異とした。変異した２５マーＴＭＧアッセイは変異にまたがるすべてのペプチドのＴ細胞による認識を試験するため、Ｇｒｏｓ、Ｔｒａｎ及びＺａｃｈａｒａｋｉｓのデータとしては、変異を、変異にまたがるすべてのペプチドにわたって提示の確率を総和するかまたは最小結合親和性を取ることによってランク付けした。Ｓｔｒｏｎｅｎのデータとしては、変異をテトラマーアッセイで試験した変異にまたがるすべてのペプチドにわたって提示の確率を総和するかまたは最小結合親和性を取ることによってランク付けした。変異及び特性の完全なリストを補足の表１に示す。
エピトープレベルの分析では、陽性として示されるデータポイントは、ペプチドパルスアッセイまたはテトラマーアッセイにおいて患者Ｔ細胞によって認識されたすべての最小エピトープとし、陰性データポイントは、ペプチドパルスアッセイまたはテトラマーアッセイにおいてＴ細胞によって認識されなかったすべての最小エピトープ、及び患者Ｔ細胞によって認識されなかった、試験したＴＭＧからの変異にまたがるすべてのペプチドとした。Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ、Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ及びＺａｃｈａｒａｋｉｓ ｅｔ ａｌの場合では、ペプチドパルスアッセイによって試験しなかった、ＴＭＧ分析において認識された変異にまたがる最小エピトープペプチドは、これらのペプチドのＴ細胞認識状態は実験的に調べられなかったため、分析から除外した。
ＸＶ．実施例１１：がん患者における新生抗原応答性Ｔ細胞の特定
本実施例では、改善された予測が通常の患者試料からの新生抗原の特定を可能とすることを実証する。これを行うため、アーカイブしたＦＦＰＥ腫瘍生検及び５～３０ｍｌの末梢血を、抗ＰＤ（Ｌ）１療法を行っている転移性ＮＳＣＬＣを有する９人の患者で分析した（補足の表２：図１７Ａ～Ｃで調べたＮ＝９人の患者についての患者人口統計及び治療情報。主なフィールドは、腫瘍ステージ及びサブタイプ、行った抗ＰＤ１療法、及びＮＧＳの結果の概要を含む）。腫瘍全エクソームシークエンシング、腫瘍トランスクリプトームシークエンシング、及びマッチド正常エクソームシークエンシングにより、患者当たり、平均で１９８個の体細胞変異（ＳＮＶ及び短いｉｎｄｅｌ）が得られ、そのうち、平均で１１８個が発現された（「方法」、補足の表２）。完全ＭＳモデルを適用して既存の抗腫瘍Ｔ細胞応答に対して試験を行うために患者当たり２０個の新生エピトープを優先順位付けした。可能性の高いＣＤ８応答に集中して分析を行うため、優先順位付けしたペプチドを８～１１マーの最小エピトープとして合成し（「方法」）、次いで末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を合成したペプチドと短期インビトロ刺激（ＩＶＳ）培養中で培養して新生抗原応答性Ｔ細胞を増殖させた（補足の表３）。２週間後、抗原特異的Ｔ細胞の存在を優先順位付けした新生エピトープに対するＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔを用いて評価した。充分なＰＢＭＣが利用可能な７人の患者で別々の実験をさらに行って認識された特異的抗原の完全または部分的な畳み込みを行った。これらの結果を図１７Ａ～Ｃ及び図１８Ａ～２１に示す。
図１７Ａは、９人の患者における患者特異的新生抗原ペプチドプールに対するＴ細胞応答の検出を示す。それぞれの患者について、予測された新生抗原を、モデルランク付け及び任意の配列ホモロジーにそれぞれ従って１０個のペプチドの２つのプールに組み合わせた（相同ペプチドは異なるプールに分割した）。次いで、それぞれの患者について、その患者についてインビトロ増殖させたＰＢＭＣをＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔで２つの患者特異的新生抗原ペプチドプールにより刺激した。図１７Ａのデータは、バックグラウンド（対応するＤＭＳＯ陰性対照）を引いた播種細胞１０５個当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として示す。バックグラウンド測定値（ＤＭＳＯ陰性対照）を図２１に示す。患者１－０３８－００１、１－０５０－００１、１－００１－００２、ＣＵ０４、１－０２４－００１、１－０２４－００２及びＣＵ０５について、同族のペプチドプール＃１及び＃２に対する単一のウェル（患者１－０３８－００１、ＣＵ０２、ＣＵ０３及び１－０５０－００１）または平均及び標準偏差を含むレプリケート（他のすべての患者）の応答を示す。患者ＣＵ０２及びＣＵ０３では、細胞数のために、特異的ペプチドプール＃１に対してのみ試験が可能であった。バックグラウンドよりも２倍超高い増加倍率の値を有する試料は陽性とみなし、星印で示した（応答性ドナーには、患者１－０３８－００１、ＣＵ０４、１－０２４－００１、１－０２４－００２、及びＣＵ０２が含まれる）。非応答性ドナーには、患者１－０５０－００１、１－００１－００２、ＣＵ０５、及びＣＵ０３が含まれる。図１７Ｃは、ＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔにおいて、ＤＭＳＯ陰性対照、ＰＨＡ陽性対照、ＣＵ０４特異的新生抗原ペプチドプール＃１、ＣＵ０４特異的ペプチド１、ＣＵ０４特異的ペプチド６、及びＣＵ０４特異的ペプチド８で刺激した患者ＣＵ０４由来のインビトロ増殖させたＰＢＭＣを含むＥＬＩＳｐｏｔウェルの写真を示す。
図１８Ａ～Ｂは、ＨＬＡを一致させた健康なドナーにおいて患者新生抗原を用いた対照実験の結果を示す。これらの実験の結果は、インビトロ培養条件は、インビトロでのデノボプライミングを可能とするのではなく、既存のインビボプライミングされたメモリーＴ細胞のみを増殖させたことを示す。
図１９は、図１７Ａに示される各ドナー及び各インビトロ増殖についてＰＨＡ陽性対照に対するＴ細胞応答の検出を示す。図１７Ａの各ドナー及び各インビトロ増殖について、インビトロ増殖させた患者ＰＢＭＣを最大のＴ細胞活性化となるようにＰＨＡで刺激した。図１９のデータは、バックグラウンド（対応するＤＭＳＯ陰性対照）を引いた播種細胞１０５個当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として示す。単一ウェルまたは生物学的レプリケートの応答を、患者１－０３８－００１、１－０５０－００１、１－００１－００２、ＣＵ０４、１－０２４－００１、１－０２４－００２、ＣＵ０５及びＣＵ０３について示す。患者ＣＵ０２ではＰＨＡによる試験は行わなかった。ペプチドプール＃１に対する陽性応答（図１７Ａ）が生存可能かつ機能性のＴ細胞を示したため、患者ＣＵ０２由来の細胞を分析に含めた。図１７Ａに示されるように、ペプチドプールに応答性を示したドナーには、患者１－０３８－００１、ＣＵ０４、１－０２４－００１、及び１－０２４－００２が含まれる。やはり図１７Ａに示されるように、ペプチドプールに応答性を示さなかったドナーには、患者１－０５０－００１、１－００１－００２、ＣＵ０５、及びＣＵ０３が含まれる。
図２０Ａは、患者ＣＵ０４におけるプール＃２中のそれぞれの個々の患者特異的新生抗原ペプチドに対するＴ細胞応答の検出を示す。図２０Ａは、患者ＣＵ０４におけるＰＨＡ陽性対照に対するＴ細胞応答の検出も示す。（この陽性対照データは図１９にも示される。）患者ＣＵ０４では、その患者のインビトロ増殖させたＰＢＭＣをＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔにおいて患者ＣＵ０４に対するプール＃２からの患者特異的な個々の新生抗原ペプチドで刺激した。患者のインビトロ増殖させたＰＢＭＣをＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔにおいて陽性対照としてのＰＨＡでも刺激した。データは、バックグラウンド（対応するＤＭＳＯ陰性対照）を引いた播種細胞１０５個当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として示す。
図２０Ｂは、患者ＣＵ０４の３回の来院のそれぞれにおける、また、患者１－０２４－００２の２回の来院のそれぞれにおける（各来院は異なる時点で行われる）、個々の患者特異的新生抗原ペプチドに対するＴ細胞応答の検出を示す。両方の患者において、その患者のインビトロ増殖させたＰＢＭＣをＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔにおいて患者特異的な個々の新生抗原ペプチドで刺激した。各患者について、各来院のデータは、バックグラウンド（対応するＤＭＳＯ対照）を引いた播種細胞１０５個当たりの累積（総和）スポット形成単位（ＳＦＵ）として示す。患者ＣＵ０４のデータは、バックグラウンドを引いた３回の来院の累積ＳＦＵとして示す。患者ＣＵ０４では、バックグラウンドを引いたＳＦＵを、最初の来院（Ｔ０）ならびに最初の来院（Ｔ０）の２ヶ月（Ｔ０＋２ヶ月）及び１４ヶ月（Ｔ０＋１４ヶ月）後のその後の来院について示す。患者１－０２４－００２のデータは、バックグラウンドを引いた２回の来院の累積ＳＦＵとして示す。患者１－０２４－００２では、バックグラウンドを引いたＳＦＵを、最初の来院（Ｔ０）及び最初の来院（Ｔ０）の１ヶ月（Ｔ０＋１ヶ月）後のその後の来院について示す。バックグラウンドよりも２倍超高い増加倍率の値を有する試料を陽性とみなし、星印で示した。
図２０Ｃは、患者ＣＵ０４の２回の来院のそれぞれにおける、また、患者１－０２４－００２の２回の来院のそれぞれにおける（各来院は異なる時点で行われる）、個々の患者特異的新生抗原ペプチドに対する、及び患者特異的新生抗原ペプチドプールに対するＴ細胞応答の検出を示す。両方の患者において、その患者のインビトロ増殖させたＰＢＭＣをＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔにおいて患者特異的な個々の新生抗原ペプチド及び患者特異的な新生抗原ペプチドプールで刺激した。具体的には、患者ＣＵ０４では、患者ＣＵ０４のインビトロ増殖させたＰＢＭＣをＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔにおいてＣＵ０４特異的な個々の新生抗原ペプチド６及び８ならびにＣＵ０４特異的な新生抗原ペプチドプールで、患者１－０２４－００２では、患者１－０２４－００２のインビトロ増殖させたＰＢＭＣをＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔにおいて１－０２４－００２特異的な個々の新生抗原ペプチド１６及び１－０２４－００２特異的な新生抗原ペプチドプールで刺激した。図２０Ｃのデータは、平均及び範囲を有する各テクニカルレプリケートについて、バックグラウンド（対応するＤＭＳＯ対照）を引いた播種細胞１０５個当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として示す。患者ＣＵ０４のデータは、バックグラウンドを引いた２回の来院のＳＦＵとして示す。患者ＣＵ０４では、バックグラウンドを引いたＳＦＵを、最初の来院（Ｔ０、テクニカルトリプリケート）及び最初の来院（Ｔ０）の２ヶ月（Ｔ０＋２ヶ月、テクニカルトリプリケート）後のその後の来院について示す。患者１－０２４－００２のデータは、バックグラウンドを引いた２回の来院のＳＦＵとして示す。患者１－０２４－００２では、バックグラウンドを引いたＳＦＵを、最初の来院（Ｔ０、テクニカルトリプリケート）及び最初の来院（Ｔ０）の１ヶ月（Ｔ０＋１ヶ月、患者１－０２４－００２特異的な新生抗原ペプチドプールで刺激した試料を除くテクニカルデュプリケート）後のその後の来院について示す。
図２１は、図１７Ａの患者について２つの患者特異的新生抗原ペプチドプール及びＤＭＳＯ陰性対照に対するＴ細胞応答の検出を示す。それぞれの患者について、その患者についてインビトロ増殖させたＰＢＭＣをＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔで２つの患者特異的新生抗原ペプチドプールにより刺激した。各ドナー及び各インビトロ増殖について、インビトロ増殖させた患者ＰＢＭＣをＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔにおいて陰性対照としてのＤＭＳＯでも刺激した。図２１のデータは、患者特異的新生抗原ペプチドプール及び対応するＤＭＳＯコントロールについてバックグラウンド（対応するＤＭＳＯ陰性対照）を含めた播種細胞１０５個当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として示す。患者１－０３８－００１、１－０５０－００１、１－００１－００２、ＣＵ０４、１－０２４－００１、１－０２４－００２及びＣＵ０５について、同族のペプチドプール＃１及び＃２に対する単一のウェル（患者１－０３８－００１、ＣＵ０２、ＣＵ０３及び１－０５０－００１）または生物学的デュプリケートの標準偏差を含む平均（他のすべての試料）の応答を示す。患者ＣＵ０２及びＣＵ０３では、細胞数のために、特異的ペプチドプール＃１に対してのみ試験が可能であった。バックグラウンドよりも２倍超高い増加倍率の値を有する試料は陽性とみなし、星印で示した（応答性ドナーには、患者１－０３８－００１、ＣＵ０４、１－０２４－００１、１－０２４－００２、及びＣＵ０２が含まれる）。非応答性ドナーには、患者１－０５０－００１、１－００１－００２、ＣＵ０５、及びＣＵ０３が含まれる。
図１８Ａ～Ｂに関して上記で簡単に述べたように、インビトロ培養条件が、インビトロでのデノボプライミングを可能とするのではなく、既存のインビボプライミングされたメモリーＴ細胞のみを増殖させたことを確認するため、ＨＬＡを一致させた健康なドナーで新生抗原を用いて一連の対照実験を行った。これらの実験の結果を図１８Ａ～Ｂ及び補足の表５に示す。これらの実験の結果により、ＩＶＳ培養法を用いて健康なドナーにデノボプライミングが生じないこと及び検出可能な新生抗原特異的Ｔ細胞応答が生じないことが確認された。
これに対して、既存の新生抗原応答性Ｔ細胞が、ＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔを用いて患者特異的ペプチドプールで試験した患者の大部分（５／９、５６％）（図１７Ａ及び図１９～２１）で特定された。細胞数が個々の新生抗原同族ペプチドの完全または部分的な試験を可能とした７人の患者のうち、４人の患者が試験した新生抗原ペプチドのうちの少なくとも１つに応答し、これらの患者のすべてが対応するプールに対する応答を示した（図１７Ｂ）。個々の新生抗原で試験した残りの３人の患者（患者１－００１－００２、１－０５０－００１及びＣＵ０５）は、単一のペプチドに対する検出可能な応答は示さず（データは示さず）、これらの患者で新生抗原プールに対して見られた応答がないことが確認された（図１７Ａ）。４人の応答患者のうち、１回の来院からの試料が、応答を示した２人の患者で得られており（患者１－０２４－００１及び１－０３８－００１）、複数回の来院からの試料が応答を示した残りの２人の患者で得られた（ＣＵ０４及び１－０２４－００２）。複数の来院からの試料がある２人の患者について、３回の来院（患者ＣＵ０４）及び２回の来院（患者１－０２４－００２）からの累積（総和）スポット形成単位（ＳＦＵ）を図１７Ｂに示し、来院ごとの内訳を図２０Ｂに示す。同じ来院からのさらなるＰＢＭＣ試料が患者１－０２４－００２及びＣＵ０４でやはり得られており、反復ＩＶＳ培養及びＥＬＩＳｐｏｔにより患者特異的新生抗原に対する応答が確認された（図２０Ｃ）。
全体として、図１７Ａの１０種のペプチドのプールに対する応答によって示されるように少なくとも１つのＴ細胞認識新生エピトープが特定された患者のうち、認識された新生エピトープの数は患者当たり平均で少なくとも２個であった（１個の認識されるペプチドとして逆畳み込みできない認識されたプールをカウントし、５人の患者で最小で１０個のエピトープが特定された）。ＥＬＩＳｐｏｔによってＩＦＮ－γ応答について試験を行うことに加え、培養上清をＥＬＩＳＡによってグランザイムＢについて、さらにＭＳＤサイトカインマルチプレックスアッセイによりＴＮＦ－α、ＩＬ－２、及びＩＬ－５についても試験した。陽性ＥＬＩＳｐｏｔを示した５人の患者のうち、４人からの細胞がグランザイムＢを含む３種類以上の被検物質を分泌し（補足の表４）、新生抗原特異的Ｔ細胞の多機能性を示した。重要な点として、予測及びＩＶＳ法の組み合わせは利用可能なＭＨＣマルチマーの限定されたセットに頼らないことから、応答は制限ＨＬＡアレルにわたって広く試験された。さらに、このアプローチは、認識された変異を特定し、最小エピトープを特定するうえで別の逆畳み込み工程を必要とするタンデムミニ遺伝子スクリーニングと異なり、最小エピトープを直接特定する。全体として、新生抗原の特定収率は、アフェレーシス試料を用いてすべての変異に対してＴＩＬを試験する従来の最良の方法９６と同等であった一方で、通常の５～３０ｍＬの全血を用いてわずか２０種の合成ペプチドをスクリーニングするだけでよい。
ＸＶ．Ａ．ペプチド
特注の組換え凍結乾燥ペプチドをＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）より購入し、滅菌ＤＭＳＯ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）中、１０～５０ｍＭで戻し、一定の分量に分けて－８０℃で保存した。
ＸＶ．Ｂ．ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
健康なドナーからの凍結乾燥したＨＬＡタイピングしたＰＢＭＣ（ＨＩＶ、ＨＣＶ及びＨＢＶについて血清反応陰性であることを確認したもの）を、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）またはＣｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｔｄ．（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，ＵＳＡ）より購入し、液体窒素中で使用時まで保存した。新鮮な血液試料をＲｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）より、ｌｅｕｋｏｐａｋをＡｌｌＣｅｌｌｓ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）より購入し、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度勾配（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）により単離した後、凍結保存した。患者のＰＢＭＣを地域の臨床処理センターで地域臨床標準業務手順書（ＳＯＰ）及びＩＲＢにより承認されたプロトコールに従って処理した。承認ＩＲＢは、Ｑｕｏｒｕｍ Ｒｅｖｉｅｗ ＩＲＢ、Ｃｏｍｉｔａｔｏ Ｅｔｉｃｏ Ｉｎｔｅｒａｚｉｅｎｄａｌｅ Ａ．Ｏ．Ｕ．Ｓａｎ Ｌｕｉｇｉ Ｇｏｎｚａｇａ ｄｉ Ｏｒｂａｓｓａｎｏ、及びＣｏｍｉｔｅ Ｅｔｉｃｏ ｄｅ ｌａ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ ｄｅｌ Ｇｒｕｐｏ Ｈｏｓｐｉｔａｌａｒｉｏ Ｑｕｉｒｏｎ ｅｎ Ｂａｒｃｅｌｏｎａであった。
簡単に述べると、ＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって単離し、洗浄、カウントし、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｖ６Ａ １Ｂ６，Ｃａｎａｄａ）中、５ｘ１０６細胞／ｍｌで凍結保存した。凍結保存した細胞をｃｒｙｏｐｏｒｔで発送し、到着後に移してＬＮ２中で保管した。患者の人口統計を補足の表２に示す。凍結保存細胞を解凍し、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を加えたＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）中で２回洗浄し、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅなしで１回洗浄した。細胞カウント及び生存率をＧｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬及びＧｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ＨＴサイトメーター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上のモジュールを用いて評価した。次いで、細胞をその後のアッセイに適した濃度でアッセイに適した培地中に再懸濁した（次のセクションを参照）。
ＸＶ．Ｃ．インビトロ刺激（ＩＶＳ）培養
健康なドナーまたは患者試料から得た既存のＴ細胞を、Ｏｔｔ ｅｔ ａｌにより適用されたアプローチ８１と同様のアプローチで同族ペプチド及びＩＬ－２の存在下で増殖させた。簡単に述べると、解凍したＰＢＭＣを一晩休ませ、２４ウェル組織培養プレート中で１０ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を添加したＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＸＦ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、ペプチドプール（ペプチド当たり１０μＭ、プール当たり１０種のペプチド）の存在下で１４日間、刺激した。細胞を２ｘ１０６細胞／ウェルで播種し、培地の２／３を２～３日ごとに交換することによって培養した。１つの患者試料はプロトコールからの逸脱を示し、潜在的な偽陰性とみなすべきものと考えられた。患者ＣＵ０３は、解凍後に充分な数の細胞を生じなかったため、細胞をペプチドプール当たり２ｘ１０５細胞で播種した（プロトコールの記載よりも１０倍少ない数）。
ＸＶ．Ｄ．ＩＦＮγ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイ
ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の検出をＥＬＩＳｐｏｔアッセイ１４２により行った。簡単に述べると、ＰＢＭＣ（エクスビボまたはインビトロ増殖後のもの）を回収し、無血清ＲＰＭＩ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）中で洗浄し、抗ヒトＩＦＮγ捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｃｉｎｃｉｎａｔｔｉ，ＯＨ，ＵＳＡ）をコーティングしたＥＬＩＳｐｏｔ Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎプレート（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中、ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（エクスビボ）またはＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＸＦ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（増殖させた培養物）中でコントロールまたは同族ペプチドの存在下で培養した。５％ＣＯ２、３７℃の加湿したインキュベーター内で１８時間インキュベートした後、細胞をプレートから除去し、膜に結合したＩＦＮγを抗ヒトＩＦＮγ検出抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ）、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ａｖｉｄｉｎペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＡＥＣ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて検出した。ＥＬＩＳｐｏｔプレートを乾燥させ、遮光して保存し、標準化された評価１４３を行うためにＺｅｌｌｎｅｔ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｒｔ Ｌｅｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）に送った。データをプレートに播種した細胞の数当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として示す。
ＸＶ．Ｅ．グランザイムＢ ＥＬＩＳＡ及びＭＳＤマルチプレックスアッセイ
ＥＬＩＳｐｏｔ上清中に分泌されたＩＬ－２、ＩＬ－５及びＴＮＦ－αの検出をトリプレックスアッセイであるＭＳＤ Ｕ－ＰＬＥＸ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒアッセイ（カタログ番号 Ｋ１５０６７Ｌ－２）を使用して行った。アッセイは製造者の指示にしたがって行った。被検物質濃度（ｐｇ／ｍｌ）を、各サイトカインについて既知の標準物質の連続希釈を用いて計算した。データをグラフ化するため、標準曲線の最小範囲よりも低い値を０に等しくなるように示した。ＥＬＩＳｐｏｔ上清中のグランザイムＢの検出を、ＧｒａｎｚｙｍｅＢ ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を製造者の指示に従って使用して行った。簡単に述べると、ＥＬＩＳｐｏｔ上清を試料希釈剤中、１：４に希釈し、グランザイムＢ標準の連続希釈液に並べて流して濃度（ｐｇ／ｍｌ）を計算した。データをグラフ化するため、標準曲線の最小範囲よりも低い値を０に等しくなるように示した。
ＸＶ．Ｆ．ＩＶＳアッセイの陰性対照実験－健康なドナーで試験した腫瘍細胞株由来の新生抗原
図１８Ａは、健康なドナーで試験した腫瘍細胞株由来の新生抗原についてのＩＶＳアッセイの陰性対照実験を示す。健康なドナーのＰＢＭＣを、ＩＶＳ培養中、陽性対照ペプチド（感染症に予め曝露したもの）、腫瘍細胞株由来のＨＬＡを一致させた新生抗原（曝露しないもの）、及びドナーが血清反応陰性であった病原体に由来するペプチドを含むペプチドプールで刺激した。次いで、増殖させた細胞を、ＤＭＳＯ（陰性対照、黒い丸）、ＰＨＡ及び一般的な感染症ペプチド（陽性対照、赤い丸）、新生抗原（非曝露、水色の丸）、またはＨＩＶ及びＨＣＶペプチド（ドナーが血清反応陰性であったもの。濃紺色、Ａ及びＢ）で刺激した後、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ （１０５細胞／ウェル）により分析した。データを播種細胞１０５個当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として示す。平均及びＳＥＭを含む生物学的レプリケートを示す。新生抗原またはドナーが曝露されていない病原体由来のペプチド（血清反応陰性）に対する応答は観察されなかった。
ＸＶ．Ｇ．ＩＶＳアッセイの陰性対照実験－健康なドナーで試験した患者由来の新生抗原
図１８Ａは、健康なドナーにおける応答性について試験した患者由来の新生抗原についてのＩＶＳアッセイの陰性対照実験を示す。ＨＬＡを一致させた新生抗原ペプチドプールに対する健康なドナーにおけるＴ細胞応答の評価。左パネル：健康なドナーのＰＢＭＣを、エクスビボのＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔにおいて対照（ＤＭＳＯ、ＣＥＦ、及びＰＨＡ）またはＨＬＡ一致させた患者由来新生抗原ペプチドで刺激した。データを３重のウェルについてプレートに播種した細胞２ｘ１０５個当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として示す。右パネル：新生抗原プールまたはＣＥＦプールの存在下で増殖させたＩＶＳ培養後の健康なドナーのＰＢＭＣを、ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔにおいて対照（ＤＭＳＯ、ＣＥＦ、及びＰＨＡ）またはＨＬＡを一致させた患者由来の新生抗原ペプチドプールで刺激した。データを３重のウェルについてプレートに播種した細胞１ｘ１０５個当たりのＳＦＵとして示す。健康なドナーにおいて新生抗原に対する応答は認められなかった。
ＸＶ．Ｈ．補足の表３：ＮＳＣＬＣ患者におけるＴ細胞認識について試験したペプチド
図１７Ａ～Ｃで調べたＮ＝９人の患者で試験した新生抗原ペプチドの詳細（ＮＳＣＬＣ患者由来の新生抗原応答性Ｔ細胞の特定）。主なフィールドは、ソース変異、ペプチド配列、ならびに観察されたプール及び個々のペプチド配列を含む。列「ｍｏｓｔ＿ｐｒｏｂａｂｌｅ＿ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ」は、モデルが予測したどのアレルが各ペプチドを提示する可能性が最も高かったかを示す。結合親和性予測（「方法」）により計算した各患者のすべての変異ペプチド間でのこれらのペプチドのランクも含まれる。
４つのペプチドが、完全ＭＳモデルによって高い順位にランクされ、予測された結合親和性が低いかまたは結合親和性予測によって低い順位にランクされたＣＤ８Ｔ細胞によって認識された。
これらのペプチドのうちの３つでは、これはモデルとＭＨＣｆｌｕｒｒｙ１．２．０との間のＨＬＡカバレッジの差による。ペプチドＹＥＨＥＤＶＫＥＡは、ＭＨＣｆｌｕｒｒｙ１．２．０によってカバーされていないＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１によって提示されると予測される。同様に、ペプチドＳＳＡＡＡＰＦＰＬ及びＦＶＳＴＳＤＩＫＳＭは、やはりＭＨＣｆｌｕｒｒｙ１．２．０によってカバーされていないＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４により提示されると予測される。原理的にはすべてのアレルをカバーするｐａｎ得的結合親和性予測ツールであるオンラインＮｅｔＭＨＣｐａｎ ４．０ （ＢＡ）予測ツールは、ＳＳＡＡＡＰＦＰＬをＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４に対する強い結合物質としてランクし（２３．２ｎＭ、患者１－０２４－００２で２位にランク）、ＦＶＳＴＳＤＩＫＳＭのＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４に対する弱い結合（９４３．４ｎＭ、患者１－０２４－００２で３９位にランク） 及びＹＥＨＥＤＶＫＥＡのＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１に対する弱い結合 （３３８７．８ｎＭ）を、また、やはりこの患者に存在するがモデルによってカバーされていないＨＬＡ－Ｂ＊４１：０１に対するより強い結合 （２０８．９ｎＭ、患者１－０３８－００１で１１位にランク）を予測している。したがって、これら３つのペプチドのうち、ＦＶＳＴＳＤＩＫＳＭは結合親和性予測によれば漏れていたであろうし、ＳＳＡＡＡＰＦＰＬは捕捉されていたであろうし、ＹＥＨＥＤＶＫＥＡのＨＬＡ制限は不明である。
ペプチド特異的Ｔ細胞応答が逆畳み込みされた残りの５つのペプチドは、モデルによって判定された最も可能性の高い提示アレルがやはりＭＨＣｆｌｕｒｒｙ１．２．０によってカバーされていた患者に由来するものであった。これら５つのペプチドのうち４つ（４／５）は標準的な５００ｎＭの閾値よりも強い予測結合親和性を有し、上位２０位にランクされたが、モデルによるランクよりもいくぶん低いランクであった（ペプチド
Figure 0007227237000078
は、ＭＨＣｆｌｕｒｒｙによって２、１４、７、及び９位にランクされたのに対して、モデルによってそれぞれ０、４、５、７位にランクされた）。ペプチドＧＴＫＫＤＶＤＶＬＫはＣＤ８Ｔ細胞により認識され、モデルによって１位にランクされたが、ＭＨＣｆｌｕｒｒｙによるランクは７０位であり、予測結合親和性は２１６９ｎＭであった。
全体として、完全ＭＳモデルにより高い順位にランクされた８つの個々に認識されたペプチドのうちの６つ（６／８）が、結合親和性予測を用いた場合にもやはり高い順位にランクされ、予測結合親和性が５００ｎＭ未満であったのに対して、８つの個々に認識されたペプチドのうちの２つ（２／８）は、完全ＭＳモデルの代わりに結合親和性予測が用いられていたならば漏れていたであろうと考えられる。
ＸＶ．Ｉ．補足の表４：ＮＳＣＬＣ新生抗原ペプチドから得たＥＬＩＳｐｏｔ上清に対するＭＳＤサイトカインマルチプレックス及びＥＬＩＳＡアッセイ
陽性ＥＬＩＳｐｏｔ （ＩＦＮγ）ウェルから得た上清中で検出された被検物質をグランザイムＢ（ＥＬＩＳＡ）、ＴＮＦα、ＩＬ－２及びＩＬ－５ （ＭＳＤ）について示す。値はテクニカルレプリケートからの平均のｐｇ／ｍｌとして示す。陽性値を斜体で示す。グランザイムＢ ＥＬＩＳＡ：ＤＭＳＯバックグラウンドよりも１．５倍以上の値を陽性とみなした。Ｕ－Ｐｌｅｘ ＭＳＤアッセイ：ＤＭＳＯバックグラウンドよりも１．５倍以上の値を陽性とみなした。
ＸＶ．Ｊ．補足の表５：ＩＶＳ対照実験における新生抗原及び感染症エピトープ
図１８Ａ～Ｂに示されるＩＶＳ対照実験で試験した腫瘍細胞株新生抗原及びウイルスペプチドの詳細主なフィールドには、ソース細胞株またはウイルス、ペプチド配列、及び予測された提示ＨＬＡアレルが含まれる。
ＸＶ．Ｋ．データ
予測モデルを訓練及び試験するために使用したＭＳペプチドデータセット（図１６）は、ＭａｓｓＩＶＥアーカイブ（ｍａｓｓｉｖｅ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ）、アクセッション番号ＭＳＶ００００８２６４８で取得可能である。ＥＬＩＳｐｏｔ （図１７Ａ～Ｃ及び図１８Ａ～Ｂ）により試験される新生抗原ペプチドはマニュスクリプトとともに含まれている（補足の表３及び５）。
ＸＶＩ．実施例８～１１の方法
ＸＶＩ．Ａ．質量分析
ＸＶＩ．Ａ．１．試料
質量分析分析用のアーカイブされた凍結組織試料は、ＢｉｏＳｅｒｖｅ（Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ（Ｃｕｌｖｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ｉＳｐｅｃｉｍｅｎ （Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）、及びＩｎｄｉｖｕｍｅｄ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む販売元から入手した。試料のサブセットも、Ｃｏｍｉｔｅ ｄｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｄｅｓ Ｐｅｒｓｏｎｎｅｓ，Ｉｌｅ－ｄｅ－Ｆｒａｎｃｅ ＶＩＩによって承認されたリサーチプロトコールに基づき、Ｈｏｐｉｔａｌ Ｍａｒｉｅ Ｌａｎｎｅｌｏｎｇｕｅ （Ｌｅ Ｐｌｅｓｓｉｓ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｆｒａｎｃｅ）で患者から予め採取した。
ＸＶＩ．Ａ．２．ＨＬＡ免疫沈降
ＨＬＡペプチド分子の単離を、組織試料の溶解及び可溶化後８７，１２４－１２６に免疫沈降（ＩＰ）法を用いて行った。新鮮な凍結組織を粉砕し（ＣｒｙｏＰｒｅｐ；Ｃｏｖａｒｉｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）、溶解バッファー（１％ＣＨＡＰＳ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤、ｐＨ＝８）を加えて組織を可溶化し、得られた溶液を４℃で２時間遠心して破片をペレット化した。清澄化したライセートをＨＬＡ特異的ＩＰに使用した。免疫沈降はこれまでに述べられているようにして抗体Ｗ６／３２を使用して行った１２７。ライセートを抗体ビーズに加え、４℃で一晩回転し、免疫沈降を行った。免疫沈降後、ビーズをライセートから除去した。ＩＰビーズを洗浄して非特異的結合を除去し、ＨＬＡ／ペプチド複合体を２Ｎ酢酸でビーズから溶出させた。タンパク質成分を分子量スピンカラムを使用してペプチドから除去した。得られたペプチドをＳｐｅｅｄＶａｃ蒸発により乾燥状態とし、ＭＳ分析を行うまで－２０℃で保存した。
ＸＶＩ．Ａ．３ ペプチドシークエンシング
乾燥させたペプチドをＨＰＬＣバッファーＡ中で戻し、Ｃ－１８マイクロキャピラリーＨＰＬＣカラムにロードして質量分析計に勾配溶出した。１８０分の０～４０％Ｂ （溶媒Ａ：０．１％ギ酸、溶媒Ｂ：８０％アセトニトリル中０．１％ギ酸）の勾配を用いてペプチドをＦｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計 （Ｔｈｅｒｍｏ）中に溶出した。ペプチドの質量／電荷（ｍ／ｚ）のＭＳ１スペクトルを分解能１２０，０００でＯｒｂｉｔｒａｐ検出器中に収集し、続いて選択したイオンのＨＣＤ断片化後に２０回のＭＳ２の低分解能スキャンをＯｒｂｉｔｒａｐまたはイオントラップ検出器中に収集した。ＭＳ２イオンの選択は、データ依存性取得モード及びイオンのＭＳ２選択後に３０秒間の動的排除を用いて行った。ＭＳ１スキャンの自動利得制御（ＡＧＣ）を４ｘ１０５に設定し、ＭＳ２スキャンについては１ｘ１０４に設定した。ＨＬＡペプチドのシークエンシングには、ＭＳ２断片化を行うために＋１、＋２及び＋３の荷電状態を選択することができる。
各分析からのＭＳ２スペクトルをＣｏｍｅｔ１２８，１２９を用いてタンパク質データベースに対して検索し、ペプチド特定をＰｅｒｃｏｌａｔｏｒ１３０～１３２を使用してスコア付けした。
ＸＶＩ．Ｂ．機械学習
ＸＶＩ．Ｂ．１．データのコード化
各試料について、訓練データポイントは、試料中で発現された正確に１つの遺伝子にマッピングされる参照プロテオームからのすべての８～１１マー（包括する）ペプチドとした。全体の訓練データセットは、各訓練試料からの訓練データセットを連結することにより生成した。８～１１個の範囲はすべてのＨＬＡクラスＩ提示ペプチドの約９５％を捕捉するため、この長さの範囲を選択したが、１２～１５個の長さを加えることも、計算需要の中度の増大を代償として同じ方法を用いて実現することが可能である。ペプチド及びフランキング配列を、ワン・ホットエンコーディングスキームを用いてベクトル化した。複数の長さ（８～１１）のペプチドを、アミノ酸のアルファベットをパッド文字で増やし、すべてのペプチドを最大長さ１１までパディングすることにより固定長さのベクターとして表した。訓練ペプチドのソースタンパク質のＲＮＡ存在量を、ＲＳＥＭ１３３から得られたイソフォームレベルのＴＰＭ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）推定値の対数として表した。各ペプチドについて、ペプチドごとＴＰＭを、ペプチドを含むイソフォームのそれぞれについてイソフォームごとＴＰＭ推定値の総和として計算した。０ＴＰＭで発現された遺伝子からのペプチドは訓練データから除外し、試験時に、非発現遺伝子からのペプチドに提示確率０を割り当てた。最後に、各ペプチドに、Ｅｎｓｅｍｂｌタンパク質ファミリーＩＤを割り当て、各固有のＥｎｓｅｍｂｌタンパク質ファミリーＩＤは遺伝子ごと提示傾向切片に対応した（次のセクションを参照）。
ＸＶＩ．Ｂ．２．モデルアーキテクチャの仕様
完全提示モデルは以下の関数形を有する。すなわち、
Figure 0007227237000079
式中、ｋは、１～ｍまでのデータセット内のＨＬＡアレルの添え字であり、
Figure 0007227237000080
は、標識変数であり、アレルｋがペプチドｉが由来する試料中に存在する場合にその値は１であり、そうでない場合には０である。特定のペプチドｉについて、
Figure 0007227237000081
のうちの最大６個 （ペプチドｉの由来する試料のＨＬＡ型に対応する６個）以外のすべては、０である。確率の総和は、例えば、
Figure 0007227237000082
で、
Figure 0007227237000083
でクリップする。
提示のアレル毎確率を下記のようにモデル化する。すなわち、
Ｐｒ（アレルａによる提示ペプチドｉ）＝ｓｉｇｍｏｉｄ｛ＮＮａ（ペプチドｉ）＋ＮＮフランキング（フランキングｉ）＋ＮＮＲＮＡ（ｌｏｇ（ＴＰＭｉ））＋α試料（ｉ）＋βタンパク質（ｉ）｝
式中、変数は以下の意味を有する。ｓｉｇｍｏｉｄは、シグモイド（ｅｘｐｉｔとしても知られる)関数であり、ペプチドｉは、ペプチドｉのワンホットコード化された中間パディングされたアミノ酸配列であり、ＮＮａは、提示の確率に対するペプチド配列の寄与をモデル化する線形最終層活性化によるニューラルネットワークであり、フランキングｉは、ソースタンパク質中のペプチドｉのワンホットコード化されたフランキング配列であり、ＮＮフランキングは、提示の確率に対するフランキング配列の寄与をモデル化する線形最終層活性化によるニューラルネットワークであり、ＴＰＭｉは、ＴＰＭ単位内のペプチドｉのソースｍＲＮＡの発現であり、試料（ｉ）は、ペプチドｉの由来する試料（すなわち患者）であり、α試料（ｉ）は試料ごと切片であり、タンパク質（ｉ）は、ペプチドｉのソースタンパク質であり、βタンパク質（ｉ）はタンパク質ごと切片である（提示の遺伝子ごと傾向としても知られる）。
結果のセクションに記載されるモデルでは、各コンポーネントのニューラルネットワークは以下のアーキテクチャを有する。すなわち、
・ ＮＮａのそれぞれは、入力次元数２３１（１１残基×残基ごとに２１個の可能な文字（パッド文字を含む））、幅２５６、隠れ層の整流線形単位（ＲｅＬＵ）活性化、出力層の線形活性化、及び訓練データセットのＨＬＡアレルａごとに１個の出力ノードを有する単一隠れ層の多層パーセプトロン（ＭＬＰ）の１個の出力ノードである。
・ ＮＮフランキングは、入力次元数２１０（Ｎ末端フランキング配列の５残基＋Ｃ末端フランキング配列の５残基×残基ごとに２１個の可能な文字（パッド文字を含む））、幅３２、隠れ層の整流線形単位（ＲｅＬＵ）活性化、及び出力層の線形活性化を有する単一隠れ層のＭＬＰである。
・ ＮＮＲＮＡは、入力次元数１、幅１６、隠れ層の整流線形単位（ＲｅＬＵ）活性化、及び出力層の線形活性化を有する単一隠れ層のＭＬＰである。
モデルの一部のコンポーネント（例えば、ＮＮａ）は、特定のＨＬＡに依存するが、多くのコンポーネント（ＮＮフランキング、ＮＮＲＮＡ、α試料（ｉ）、βタンパク質（ｉ））は依存しない。前者は「アレル相互作用性」と呼ばれ、後者は「アレル非相互作用性」と呼ばれる。アレル相互作用性及びアレル相互作用性としてモデル化するための特性は、従来の生物学的知見に基づいて選択される。すなわち、ＨＬＡアレルはペプチドを見るため、ペプチド配列はアレル相互作用性としてモデル化されるべきであるが、ソースタンパク質、ＲＮＡ発現またはフランキング配列に関する情報はＨＬＡアレルに伝達されず（ペプチドは小胞体内でＨＬＡと出合うまでにそのソースタンパク質から分離されているため）、したがってこれらの特性はアレル非相互作用性としてモデル化されるべきである。このモデルを、Ｋｅｒａｓ ｖ２．０．４１３４及びＴｈｅａｎｏ ｖ０．９．０１３５で実施した。
ペプチドＭＳモデルは、完全ＭＳモデル（式１）と同じ逆畳み込み手順を用いるが、提示のアレル毎確率はペプチド配列及びＨＬＡアレルのみを考慮した縮小アレル毎モデルを用いて生成した。
Ｐｒ（アレルａによる提示ペプチドｉ）＝ｓｉｇｍｏｉｄ｛ＮＮａ（ペプチドｉ）｝
ペプチドＭＳモデルは結合親和性予測と同じ特性を用いるが、モデルの重みは異なるデータタイプ（すなわち、ＨＬＡペプチド結合親和性データに対する質量分析データ）で訓練される。したがって、ペプチドＭＳモデルの予測性能を完全ＭＳモデルと比較することで、全体の予測性能に対する非ペプチド特性（すなわち、ＲＮＡ存在量、フランキング配列、遺伝子ＩＤ）の寄与が明らかとなり、ペプチドＭＳモデルの予測性能を結合親和性モデルと比較することで、全体の予測性能に対するペプチド配列の改善されたモデル化の重要度が明らかとなる。
ＸＶＩ．Ｂ．３． 訓練／検証／試験の分割
本発明者らは、以下の手順を用いて訓練／検証／試験セットのうちの２つ以上に現れるペプチドがないようにした。すなわち、最初に、２つ以上のタンパク質に現れるすべてのペプチドを参照プロテオームから除去し、次に、プロテオームを１０個の隣接したペプチドに分配する。各ブロックを訓練、検証、及び試験セットに固有に割り当てる。これにより、訓練、検証、または試験データセットのうちの２つ以上のデータセットに現れるペプチドはなくなる。検証セットは、早期終了のみに用いた。図１４～図１６の腫瘍試料試験データは、訓練及び検証セットから完全に除外された５つの腫瘍試料からの試験セットペプチド（すなわち、試験セットに固有に割り当てられた隣接するペプチドのブロックからのペプチド）を表す。
ＸＶＩ．Ｂ．４．モデルの訓練
モデルを訓練するため、ペプチドごと損失が負のベルヌーイ対数尤度損失関数である（対数損失としても知られる）ものとして、すべてのペプチドを独立したものとしてモデル化した。正式には、ペプチドｉの全体の損失に対する寄与は、
Ｌｏｓｓ（ｉ）＝－ｌｏｇ（Ｂｅｒｎｏｕｌｌｉ（ｙｉ｜Ｐｒ（提示ペプチドｉ）））
であり、ただし、ｙｉは、ペプチドｉのラベルである（すなわち、ペプチドｉが提示される場合にｙｉ＝１であり、そうでない場合には０であり、ｉ．ｉ．ｄ．の２項観測ベクトルyが与えられるものとして、Ｂｅｒｎｏｕｌｌｉ（ｙ｜Ｐ）は、は、パラメータp∈［０，１］のベルヌーイ尤度を示す）。このモデルを損失関数を最小化することにより訓練した。
訓練時間を低減するため、陰性標識された訓練データの９０％を無作為に除去することによりクラスバランスを調整し、全体の訓練セットクラスバランスを約２０００個の非提示ペプチドごとに１個の提示ペプチドとした。モデル重みを、Ｇｌｏｒｏｔ均一手順６１を用いて初期化し、標準的なパラメータを用いたＡＤＡＭ６２確率論的オプティマイザを用いてＮｖｉｄｉａ Ｍａｘｗｅｌｌ ＴＩＴＡＮ Ｘ ＧＰＵで訓練した。全データの１０％からなる検証セットを早期終了に用いた。このモデルを１／４エポックごとに検証セットで評価し、モデル訓練を検証損失（すなわち、検証セットでの負のベルヌーイ対数尤度）が低下しなくなった最初の１／４エポック後に終了した。
完全提示モデルは、アンサンブル内のすべてのモデルについてモデル重さの異なるランダム初期化を行った同じ訓練データのシャッフルしたコピーで各レプリケートを独立して訓練した１０個のモデルレプリケートのアンサンブルとした。試験時に、モデルレプリケートによって出力された確率の平均を取ることによって予測を生成した。
ＸＶＩ．Ｂ．５．モチーフロゴ
モチーフロゴを、ｗｅｂｌｏｇｏｌｉｂ Ｐｙｔｈｏｎ ＡＰＩ ｖ３．５．０１３８を用いて生成した。結合親和性ロゴを生成するため、ｍｈｃ＿ｌｉｇａｎｄ＿ｆｕｌｌ．ｃｓｖ ファイルを２０１７年７月にＩｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ （ＩＥＤＢ８８）からダウンロードし、以下の基準を満たすペプチドを保持した。すなわち、ナノモル（ｎＭ）単位の測定値、参照日が２０００年以降であり、オブジェクトタイプが「直鎖状ペプチド」に等しく、ペプチド内のすべての残基が標準的な２０文字のアミノ酸アルファベットから引用されるもの。測定された結合親和性が従来の結合閾値である５００ｎＭよりも低いフィルタリングされたペプチドのサブセットを使用してロゴを生成した。ＩＥＤＢの結合物質の数が少なすぎるアレルペアについてはロゴは生成されなかった。学習された提示モデルを表すロゴを生成するため、２，０００，０００種のランダムなペプチドについてモデル予測を各アレル及び各ペプチド長で予測した。各アレル及び各長さについて、学習された提示モデルにより上位１％（すなわち、上位の２０，０００種）にランク付けされたペプチドを用いてロゴを生成した。重要な点として、ＩＥＤＢからのこの結合親和性データは、モデルの訓練または試験では使用せず、学習されたモチーフの比較にのみ使用した。
ＸＶＩ．Ｂ．６．結合親和性の予測
本発明者らは、モデルのＮｅｔＭＨＣファミリーに匹敵する性能を有するオープンソースのＧＰＵ互換性ＨＬＡクラスＩ結合親和性予測ツールであるＭＨＣｆｌｕｒｒｙ ｖ１．２．０１３９からの結合親和性のみの予測ツールを使用してペプチド－ＭＨＣ結合親和性を予測した。複数のＨＬＡアレルにわたって単一のペプチドについての結合親和性予測を組み合わせるため、最小の結合親和性を選択した。複数のペプチドにわたって結合親和性を組み合わせるため(すなわち、図１６に示されるように、複数の変異ペプチドがまたがった変異をランク付けするため）、ペプチドにわたった最小の結合親和性を選択した。Ｔ細胞データセットに対するＲＮＡ発現の閾値を決定するため、ＴＰＭ＞１の閾値までのＴＣＧＡからの腫瘍型が一致したＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用した。初期のＴ細胞データセットのすべてを初期の公表中、ＴＰＭ＞０でフィルタリングしたため、ＴＰＭ＞０でフィルタリングされるＴＣＧＡのＲＮＡ－ｓｅｑデータは使用されなかった。
ＸＶＩ．Ｂ．７．提示の予測
複数のＨＬＡアレルにわたった単一のペプチドについて提示の確率を加え合わせるため、確率の総和を式１に示されるように特定した。複数のペプチドにわたって提示の確率を加え合わせるため(すなわち、図１６に示されるように、複数の変異ペプチドがまたがった変異をランク付けするため）、提示の確率の総和を特定した。確率的には、ペプチドの提示がｉ．ｉ．ｄ．のベルヌーイランダム変数とみなされる場合、確率の総和は提示される変異ペプチドの予想数に対応する。すなわち、
Figure 0007227237000084
ただし、Ｐｒ［提示エピトープｊ］は、エピトープｊに訓練された提示モデルを適用することによって得られ、niは、変異ｉにまたがる変異エピトープの数を示す。例えば、そのソース遺伝子の末端から遠いＳＮＶｉについて、８個のまたがった８マー、９個のまたがった９マー、１０個のまたがった１０マー、及び１１個のまたがった１１マーが、全部でｎｉ＝３８個のまたがった変異エピトープについて存在する。
ＸＶＩ．Ｃ．次世代シークエンシング
ＸＶＩ．Ｃ．１．試料
凍結切除された腫瘍のトランスクリプトーム分析を行うため、ＭＳ分析に使用したのと同じ組織試料（腫瘍または隣接する正常組織）からＲＮＡを得た。抗ＰＤ１療法を行っている患者の新生抗原エクソーム及びトランスクリプトーム分析を行うため、ＤＮＡ及びＲＮＡをアーカイブされたＦＦＰＥ腫瘍生検から得た。隣接正常組織、一致血液、またはＰＢＭＣを用いて正常エクソーム及びＨＬＡタイピングを行うための正常ＤＮＡを得た。
ＸＶＩ．Ｃ．２．核酸抽出及びライブラリーの構築
血液由来の正常／生殖系ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙカラム（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者の推奨する手順に従って使用して単離した。組織試料からのＤＮＡ及びＲＮＡをＱｉａｇｅｎ Ａｌｌｐｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ単離キットを製造者の推奨する手順に従って使用して単離した。これらのＤＮＡ及びＲＮＡをＰｉｃｏｇｒｅｅｎ及びＲｉｂｏｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）によりそれぞれ定量し、収量が５０ｎｇ超の試料をライブラリーの構築に進めた。ＤＮＡシークエンシングライブラリーを超音波せん断（Ｃｏｖａｒｉｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）に続き、ＤＮＡ Ｕｌｔｒａ ＩＩ（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）ライブラリー調製キットを製造者の推奨するプロトコールに従って使用することにより作製した。ＲＮＡ Ｕｌｔｒａ ＩＩ（ＮＥＢ）による熱断片化及びライブラリー構築により腫瘍ＲＮＡシークエンシングライブラリーを作製した。得られたライブラリーをＰｉｃｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）により定量した。
ＸＶＩ．Ｃ．３．全エクソーム捕捉
ＤＮＡ及びＲＮＡシークエンシングライブラリーのエクソン濃縮を、ｘＧＥＮ Ｗｈｏｌｅ Ｅｘｏｍｅ Ｐａｎｅｌ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。１～１．５μｇの正常ＤＮＡまたは腫瘍ＤＮＡもしくはＲＮＡ由来ライブラリーを入力として用い、１２時間よりも長い時間にわたってハイブリダイズさせた後、ストレプトアビジン精製を行った。捕捉されたライブラリーをＰＣＲにより最小限増幅し、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）により定量した。捕捉された各ライブラリーを等モル濃度でプールし、ｃ－ｂｏｔ （Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてクラスター化し、７５塩基対の端部においてＨｉＳｅｑ４０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で、５００ｘ超の腫瘍エクソーム、１００ｘ超の正常エクソーム、及び１００Ｍ超のリードの腫瘍トランスクリプトームのターゲットユニークな平均カバレッジにまでシークエンシングした。
ＸＶＩ．Ｃ．４分析
エクソームリード（ＦＦＰＥ腫瘍エクソーム及び一致させた正常エクソーム）を、ＢＷＡ－ＭＥＭ１４４（ｖ．０．７．１３－ｒ１１２６）を使用して参照ヒトゲノム（ｈｇ３８）とアラインした。ＲＮＡ－ｓｅｑリード（ＦＦＰＥ及び凍結腫瘍組織試料）を、ＳＴＡＲ（ｖ．２．５．１ｂ）を使用してゲノム及びＧＥＮＣＯＤＥ転写産物（ｖ． ２５）とアラインした。ＲＮＡ発現を、同じ参照転写産物でＲＳＥＭ１３３（ｖ．１．２．３１）を使用して定量した。Ｐｉｃａｒｄ （ｖ．２．７．１）を使用してデュプリケートアラインメントをマークし、アラインメントメトリックを計算した。ＧＡＴＫ１４５（ｖ．３．５－０）による塩基のクオリティー補正（ｂａｓｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅ ｒｅｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）後のＦＦＰＥ腫瘍試料について、ＦｒｅｅＢａｙｅｓ１４６（１．０．２）によりペアリングした腫瘍－正常エクソームを用いて置換及び短いｉｎｄｅｌ変異を検出した。フィルターには、アレル頻度＞４％；塩基クオリティーの中央値＞２５、支持リードの最小マッピングクオリティー３０、及び充分なカバレッジが得られたとして正常の代替的リードカウント≦２が含まれた。変異体はまた、両方の鎖で検出されなければならない。反復領域に生じる体細胞変異体は除外した。翻訳及びアノテーションは、ＲｅｆＳｅｑ転写産物を用いてｓｎｐＥｆｆ１４７（ｖ．４．２）により行った。腫瘍ＲＮＡアラインメントで確認された非同義、ノンストップ変異体を新生抗原予測に進めた。Ｏｐｔｉｔｙｐｅ１４８１．３．１を使用してＨＬＡ型を生成した。
ＸＶＩ．Ｃ．５．図１８Ａ～Ｂ：ＩＶＳ対照実験用の腫瘍細胞株及び一致した正常細胞株
腫瘍細胞株Ｈ１２８、Ｈ１２２、Ｈ２００９、Ｈ２１２６、Ｃｏｌｏ８２９及びそれらの正常なドナー一致した対照細胞株ＢＬ１２８、ＢＬ２１２２、ＢＬ２００９、ＢＬ２１２６ ａｎｄ Ｃｏｌｏ８２９ＢＬをすべて、ＡＴＣＣ （Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）より購入し、販売業者の指示にしたがって１０８３～１０８４個の細胞にまで増殖させた後、核酸抽出及びシークエンシング用にスナップ凍結した。ＮＧＳを、ＭｕＴｅｃｔ１４９（３．１－０） を置換変異の検出にのみ用いた点以外は、概ね上記に述べたのと同様にして行った。ＩＶＳ対照アッセイで使用したペプチドを、補足の表５に示す。
ＸＶＩ．Ｄ．ＭＨＣクラスＩＩ分子の提示ホットスポットモデル化
本発明者らは、提示ホットスポットパラメータを用いた場合と、提示ホットスポットパラメータを用いない場合における、クラスＩＩ ＨＬＡペプチド提示に対する本明細書に開示されるモデルの性能の評価も行った。クラスＩ複合体がサイトゾルタンパク質を提示し、ヒトのすべての有核細胞の表面に見られるのに対して、クラスＩＩ複合体は抗原提示細胞上に大部分が見られ、主に細胞外（外因性）タンパク質を提示する役割を担っている。クラスＩとクラスＩＩとは結合機序及びペプチド長の点でも相違している。
提示ホットスポットパラメータを用いた場合と提示ホットスポットパラメータを用いない場合におけるクラスＩＩ ＨＬＡペプチド提示に対する本明細書に開示されるモデルの性能を評価するため、公開されているクラスＩＩの質量分析データを、それぞれが単一のＨＬＡクラスＩアレルを発現する２つの細胞株について得た。一方の細胞株はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１を発現し、他方はＨＬＡ－ＤＲＢ５＊０１：０１を発現した１５０。これら２つの細胞株を訓練データ用に使用した。試験データ用には、クラスＩＩの質量分析データをＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ５＊０１：０１の両方を発現する別の細胞株から取得した１５１ 。ＲＮＡシークエンシングデータは、訓練用及び試験用細胞株のいずれでも入手できなかったため、異なるＢ細胞株Ｂ７２１．２２１からのＲＮＡシークエンシングデータ９２で代用した。
ペプチドセットを、クラスＩＩのデータでは、９～２０個の長さを有するペプチドを含めた点を除いてＨＬＡクラスＩデータと同じ手順を用いて、訓練、検証、及び試験セットに分割した。訓練データは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１により提示された３３０種のペプチド、及びＨＬＡ－ＤＲＢ５＊０１：０１により提示された１０３種のペプチドを含むものとした。検査データセットは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１またはＨＬＡ－ＤＲＢ５＊０１：０１により提示された２２３種のペプチド及び４７０８種の非提示ペプチドを含むものとした。
図２２に示される結果を生成するために用いた提示モデルは、本明細書に開示されるＭＨＣクラスＩＩ提示予測モデルである。提示モデルは、ＨＬＡクラスＩＩのペプチド提示を予測するために訓練データセットで訓練した１０個のモデルのアンサンブルとした。これらのモデルのアーキテクチャ及び訓練手順は、クラスＩＩのモデルでは入力ペプチドとして長さ１１個ではなく長さ２０個にワンホットコード化され、パディングが０の配列を採用した点を除き、クラスＩの提示を予測するために用いたものと同じとした。図２２は、ＭＨＣクラスＩＩ分子による新生抗原の提示を予測する際の提示ホットスポットパラメータを用いた提示モデルの予測性能を、提示ホットスポットパラメータを用いない提示モデルと比較したものである。詳細には、図２２は、提示モデルのこれら２つのバージョンについて受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。ホットスポットモデルが改善された性能を与え、０．９６のＲＯＣ曲線下面積（ＲＯＣ ＡＵＣ）を実現したのに対して、ホットスポットを含まないモデルではＲＯＣ ＡＵＣはわずか０．９３であった。
ＸＶＩＩ．実施例１２： ＮＳＣＬＣ患者の末梢血由来の新生抗原特異的メモリーＴ細胞のＴＣＲのシークエンシング
図２３は、ＮＳＣＬＣ患者の末梢血由来の新生抗原特異的メモリーＴ細胞のＴＣＲをシークエンシングするための方法を示す。ＮＳＣＬＣ患者ＣＵ０４からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（図１７Ａ～２１に関して上記に述べたもの）をＥＬＩＳｐｏｔインキュベーション後に回収した。詳細には、上記に述べたように、患者ＣＵ０４の２回の来院からインビトロ増殖させたＰＢＭＣをＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔにおいてＣＵ０４特異的な個別の新生抗原ペプチド（図２０Ｃ）、ＣＵ０４特異的な新生抗原ペプチドプール（図２０Ｃ）、及びＤＭＳＯ陰性対照（図２１）で刺激した。インキュベーション後、検出抗体の添加に先立って、ＰＢＭＣを新しい培養プレートに移し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイが完了する間、インキュベーター内で維持した。陽性（応答性）ウェルをＥＬＩＳｐｏｔの結果に基づいて特定した。図２０に示されるように、特定された陽性ウェルには、ＣＵ０４特異的な個別のペプチド８で刺激したウェル、及びＣＵ０４特異的な新生抗原ペプチドプールで刺激したウェルが含まれる。これらの陽性ウェル及び陰性対照（ＤＭＳＯ）ウェルからの細胞を加え合わせて、磁気標識抗体でＣＤ１３７について染色し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ磁気単離カラムを使用して濃縮を行った。
上記に述べたように単離して増殖させたＣＤ１３７濃縮及び枯渇Ｔ細胞画分を１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓシングルセル・レゾルーション・ペアド免疫ＴＣＲプロファイリングアプローチを用いてシークエンシングした。詳細には、生Ｔ細胞を、続くシングルセルｃＤＮＡ作製及び完全長ＴＣＲのプロファイリング（５’ＵＴＲ～定常領域、αとβを対合させる）を行うためにシングルセルエマルション中に分配した。１つのアプローチでは、転写産物の５’末端の分子バーコード付けしたテンプレート交換オリゴを利用し、第２のアプローチでは、３’末端の分子バーコード付けした定常領域オリゴを利用し、第３のアプローチでは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをＴＣＲの５’末端または３’末端に連結する。これらのアプローチはいずれも、シングルセルレベルでのα及びβＴＣＲペアの特定及び逆畳み込みを可能とするものである。得られたバーコード付けしたｃＤＮＡ転写産物に最適化した酵素及びライブラリー構築ワークフローを行ってバイアスを低減し、細胞のプール内のクロノタイプの正確な表現を確実とした。各ライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉＳｅｑまたはＨｉＳｅｑ４０００装置（対合末端１５０サイクル）で細胞当たり約５千～５万リードのターゲットシークエンシング深さに対してシークエンシングした。得られたＴＣＲ核酸配列を補足の表６に示す。補足の表６に記載されるＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖の存在を、オーソゴナルなアンカーＰＣＲベースＴＣＲシークエンシングアプローチ（Ａｒｃｈｅｒ）によって確認した。この特定のアプローチは、１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓベースのＴＣＲシークエンシングと比較して限定された数の細胞を入力として使用し、用いられる酵素的操作の数が少ないという利点を有する。
シークエンシングの出力を１０ｘソフトウェア及びカスタムバイオインフォマティクスパイプラインを使用して分析して、やはり補足の表６に示されるようなＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α及びβ鎖を特定した。補足の表６は、α及びβ可変（Ｖ）領域、連結（Ｊ）領域、定常（Ｃ）領域、及びβ多様性（Ｄ）領域、ならびに大部分の優位なＴＣＲクロノタイプのＣＤＲ３アミノ酸配列をさらに示す。クロノタイプは、固有のＣＤＲ３アミノ酸配列のα、β鎖のペアとして定義される。クロノタイプを、２細胞よりも高い頻度で存在する１個のα鎖と１個のβ鎖のペアについてフィルタリングして患者ＣＵ０４のターゲットペプチド当たりのクロノタイプの最終リストを得た（補足の表６）。
要約すると、図２３に関して述べた方法を用いることで、セクションＸＩＶの実施例１０に関して上記に述べたようにして特定された患者ＣＵ０４の腫瘍新生抗原に対して新生抗原特異的である患者ＣＵ０４の末梢血由来のメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞が特定された。これらの特定された新生抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲをシークエンシングした。またさらに、上記の提示モデルにより特定された患者ＣＵ０４の腫瘍新生抗原に対して新生抗原特異的であるシークエンシングしたＴＣＲが特定された。
ＸＶＩＩＩ．実施例１３：Ｔ細胞療法の新生抗原特異的メモリーＴ細胞の使用
患者の腫瘍によって提示される新生抗原に対して新生抗原特異的であるＴ細胞及び／またはＴＣＲが特定された後、これらの特定された新生抗原特異的Ｔ細胞及び／またはＴＣＲを患者のＴ細胞療法に使用することができる。詳細には、これらの特定された新生抗原特異的Ｔ細胞及び／またはＴＣＲを使用してＴ細胞療法において患者に注入するための治療量の新生抗原特異的Ｔ細胞を作製することができる。患者のＴ細胞療法で使用するための治療量の新生抗原特異的Ｔ細胞を作製するための２つの方法を、本明細書のセクションＸＶＩＩ．Ａ．及びＸＶＩＩ．Ｂ．で考察する。第１の方法は、患者試料から特定された新生抗原特異的Ｔ細胞を増殖させることを含む（セクションＸＶＩＩ．Ａ．）。第２の方法は、特定された新生抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲをシークエンシングすることと、シークエンシングされたＴＣＲを新たなＴ細胞にクローニングすることとを含む（セクションＸＶＩＩ．Ｂ．）。本明細書では明示的に触れられていないＴ細胞療法で使用するための新生抗原特異的Ｔ細胞を作製するための代替的な方法を用いて、Ｔ細胞療法で使用するための治療量の新生抗原特異的Ｔ細胞を作製することもできる。これらの方法の１つ以上によって新生抗原特異的Ｔ細胞が得られた後、これらの新生抗原特異的Ｔ細胞をＴ細胞療法を行うために患者に注入することができる。
ＸＶＩＩＩ．Ａ．Ｔ細胞療法用の患者試料からの新生抗原特異的メモリーＴ細胞の特定及び増殖
患者のＴ細胞療法に使用するための治療量の新生抗原特異的Ｔ細胞を作製するための第１の方法は、患者試料から特定された新生抗原特異的Ｔ細胞を増殖させることを含む。
詳細には、新生抗原特異的Ｔ細胞を患者のＴ細胞療法に使用するための治療量にまで増殖させるため、患者のがん細胞によって提示される可能性が最も高い新生抗原ペプチドのセットを、上記に述べた提示モデルを使用して特定する。さらに、Ｔ細胞を含有する患者試料を患者から得る。患者試料は、患者の末梢血、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはリンパ節細胞を含み得る。
患者試料が患者の末梢血を含む実施形態では、以下の方法を用いて新生抗原特異的Ｔ細胞を治療量にまで増殖させることができる。一実施形態では、プライミングを行うことができる。別の実施形態では、既に活性化されているＴ細胞を上記に述べた方法のうちの１つ以上を用いて特定することができる。別の実施形態では、プライミング及び既に活性化されているＴ細胞の特定の両方を行うことができる。プライミング及び既に活性化されているＴ細胞の特定の両方を行うことの利点は、表現される特異性の数が最大となることである。プライミング及び既に活性化されているＴ細胞の特定の両方を行うことの難点は、このアプローチは困難で時間がかかることである。別の実施形態では、必ずしも活性化されていない新生抗原特異的細胞を単離することができる。かかる実施形態では、これらの新生抗原特異的細胞の抗原特異的または非特異的増殖を行うこともできる。これらのプライミングされたＴ細胞を回収した後、プライミングされたＴ細胞を迅速増殖プロトコールに供することができる。例えば、いくつかの実施形態では、プライミングされたＴ細胞をＲｏｓｅｎｂｅｒｇ迅速増殖プロトコール（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2978753/、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2305721/）１５３，１５４に供することができる。
患者試料が患者のＴＩＬを含む実施形態では、以下の方法を用いて新生抗原特異的Ｔ細胞を治療量にまで増殖させることができる。一実施形態では、新生抗原特異的ＴＩＬは、エクスビボで選別されたテトラマー／マルチマーとし、次いで選別されたＴＩＬを上記に述べたような迅速増殖プロトコールに供することができる。別の実施形態では、ＴＩＬの新生抗原非特異的増殖を行った後、新生抗原特異的ＴＩＬをテトラマー選別し、その後、選別されたＴＩＬを上記に述べたような迅速増殖プロトコールに供することができる。別の実施形態では、ＴＩＬを迅速増殖プロトコールに供する前に抗原特異的培養を行うことができる（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4607110/, https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1002/eji.201545849）１５５，１５６。
いくつかの実施形態では、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ迅速増殖プロトコールを改変することができる。例えば、抗ＰＤ１及び／または抗４１ＢＢをＴＩＬ培養に加えてより迅速な増殖を刺激することができる（https://jitc.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40425-016-0164-7）１５７。
ＸＶＩＩＩ．Ｂ．新生抗原特異的Ｔ細胞の特定、特定された新生抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲのシークエンシング、及びシークエンシングされたＴＣＲの新たなＴ細胞へのクローニング
患者にＴ細胞療法を使用するための治療量の新生抗原特異的Ｔ細胞を作製するための第２の方法は、患者試料から新生抗原特異的Ｔ細胞を特定することと、特定された新生抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲをシークエンシングすることと、シークエンシングされたＴＣＲを新たなＴ細胞をクローニングすることと、を含む。
最初に、新生抗原特異的Ｔ細胞を患者試料から特定し、特定された新生抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲをシークエンシングする。Ｔ細胞を単離することができる患者試料は、血液、リンパ節、または腫瘍のうちの１つ以上を含み得る。より詳細には、Ｔ細胞を単離することができる患者試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）、解離腫瘍細胞（ＤＴＣ）、インビトロでプライミングされたＴ細胞、及び／またはリンパ球から単離された細胞のうちの１つ以上を含み得る。これらの細胞は、新鮮なもの及び／または凍結されたものであってよい。ＰＢＭＣ及びインビトロでプライミングされたＴ細胞は、がん患者及び／または健康な対象から得ることができる。
患者試料が得られた後、試料を増殖させ、かつ／またはプライミングすることができる。さまざまな方法を実施して患者試料を増殖させ、プライミングすることができる。一実施形態では、新鮮な及び／または凍結したＰＢＭＣをペプチドまたはタンデムミニ遺伝子の存在下で刺激することができる。別の実施形態では、新鮮な及び／または凍結した単離されたＴ細胞をペプチドまたはタンデムミニ遺伝子の存在下で抗原提示細胞（ＡＰＣ）により刺激及びプライミングすることができる。ＡＰＣの例としては、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、マクロファージまたは人工抗原提示細胞（関連するＨＬＡ及び／または共刺激分子を提示する細胞またはビーズなど、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2929753に概説されている）。別の実施形態では、ＰＢＭＣ、ＴＩＬ、及び／または単離されたＴ細胞をサイトカインの存在下で刺激することができる（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及び／またはＩＬ－１５）。別の実施形態では、ＴＩＬ及び／または単離されたＴ細胞を、最大刺激、サイトカイン（複数可）、及び／またはフィーダー細胞の存在下で刺激することができる。そのような実施形態では、Ｔ細胞は、活性化マーカー及び／またはマルチマー（例えば、テトラマー）によって単離することができる。別の実施形態では、ＴＩＬ及び／または単離されたＴ細胞を、刺激性及び／または共刺激性マーカー（例えば、ＣＤ３抗体、ＣＤ２８抗体）及び／またはビーズ（例えば、ＤｙｎａＢｅａｄｓ）で刺激することができる。別の実施形態では、ＤＴＣを、リッチ培地中、高用量のＩＬ－２でフィーダー細胞上で急速増殖プロトコールを用いて増殖させることができる。
次に、新生抗原特異的Ｔ細胞を特定して単離する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、予め増殖させることなく患者試料からエクスビボで単離される。一実施形態では、セクションＸＶＩに関連して上記に述べた方法を用いて患者試料から新生抗原特異的Ｔ細胞を特定することができる。代替的な実施形態では、単離は、ポジティブセレクションによって特定の細胞集団について濃縮するか、またはネガティブセレクションにより特定の細胞集団を枯渇させることによって行われる。いくつかの実施形態では、ポジティブまたはネガティブセレクションは、それぞれポジティブまたはネガティブに選択された細胞上で発現されるか（マーカー＋）または比較的高いレベルで発現される（マーカー高）１つ以上の表面マーカーに特異的に結合する１つ以上の抗体または他の結合物質と細胞を培養することによって行われる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ１４などの、Ｂ細胞、単球、または他の白血球細胞などの非Ｔ細胞上で発現されるマーカーのネガティブセレクションによってＰＢＭＣ試料から分離される。いくつかの態様では、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋の選択工程を用いてＣＤ４＋ヘルパー及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を分離する。そのようなＣＤ４＋及びＣＤ８＋の集団は、１つ以上のナイーブ、メモリー、及び／またはエフェクターＴ細胞の亜集団上で発現される、または比較的高い程度で発現されるマーカーについてポジティブまたはネガティブセレクションによって亜集団にさらに分別することができる。
いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、それぞれの亜集団に関連付けられた表面抗原に基づいたポジティブまたはネガティブセレクションなどによって、ナイーブ、中枢メモリー、エフェクターメモリー、及び／または中枢メモリー幹細胞についてさらに濃縮されるか、または枯渇される。いくつかの実施形態では、中枢メモリーＴ細胞（ＴＣＭ）細胞の濃縮を行うことで、例えば投与後の長期の生存、増殖、及び／または生着を改善させるなど、有効性が高められ、これはいくつかの態様で、かかる亜集団において特に安定的である（Ｔｅｒａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｂｌｏｏｄ．１：７２－８２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ３５（９）：６８９－７０１を参照）。いくつかの実施形態では、ＴＣＭを濃縮したＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞を組み合わせることでさらに有効性が高められる。
複数の実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ－サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣは、例えば抗ＣＤ８及び抗ＣＤ６２Ｌ抗体を用いることなどにより、ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ８＋及び／またはＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分を濃縮または枯渇させることができる。
いくつかの実施形態では、中枢メモリーＴ（ＴＣＭ）細胞の濃縮は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、及び／またはＣＤ１２７の陽性または高い表面発現に基づいたものであり、いくつかの態様では、ＣＤ４５ＲＡ及び／またはグランザイムＢを発現するか、または高度に発現する細胞のネガティブセレクションに基づいたものである。いくつかの態様では、ＴＣＭ細胞について濃縮されたＣＤ８＋集団の単離は、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞の枯渇、及びＣＤ６２Ｌを発現する細胞のポジティブセレクションまたは濃縮によって行われる。一態様では、中枢メモリーＴ（ＴＣＭ）細胞の濃縮は、ＣＤ４発現に基づいて選択された陰性画分から出発し、これにＣＤ１４及びＣＤ４５ＲＡの発現に基づいてネガティブセレクションを、また、ＣＤ６２Ｌに基づいてポジティブセレクションを行うことによって行われる。これらの選択はいくつかの態様では同時に行われ、他の態様では、いずれかの順序で順次行われる。いくつかの態様では、ＣＤ８＋細胞集団または亜集団を調製するのに用いたのと同じＣＤ４発現に基づく選択工程をさらに用いて、ＣＤ４＋細胞集団または亜集団を生成することにより、ＣＤ４に基づいた選択からの陽性及び陰性画分が保持され、必要に応じて１つ以上のさらなるポジティブまたはネガティブセレクション工程を行った後、方法の次の工程で用いられる。
特定の例では、ＰＢＭＣの試料または他の白血球試料にＣＤ４＋細胞の選択を行う（陰性及び陽性画分の両方が保持される）。次に、陰性画分に、ＣＤ１４及びＣＤ４５ＲＡまたはＲＯＲ１の発現に基づいたネガティブセレクションを、また、ＣＤ６２ＬまたはＣＣＲ７などの中枢メモリーＴ細胞のマーカー特性に基づいたポジティブセレクションを行う（ポジティブセレクション及びネガティブセレクションはいずれかの順序で行う）。
ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を特定することにより、ナイーブ、中枢メモリー、及びエフェクター細胞に分別される。ＣＤ４＋リンパ球は標準的方法によって得ることができる。いくつかの実施形態では、ナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、中枢メモリーＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋かつＣＤ４５ＲＯ＋である。いくつかの実施形態では、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ－かつＣＤ４５ＲＯ－である。
一実施形態では、ネガティブセレクションによってＣＤ４＋細胞について濃縮するため、モノクローナル抗体カクテルは通常、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体または結合パートナーは、磁性ビーズまたは常磁性ビーズのような固体支持体またはマトリックスに結合されることでポジティブ及び／またはネガティブセレクション用の細胞の分離を可能とする。例えば、いくつかの実施形態では、細胞及び細胞集団は免疫磁気（または親和性磁気）分離法を用いて分離または単離される（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．５８：Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖｏｌ．２：Ｃｅｌｌ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ，ｐ １７－２５ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ： Ｓ．Ａ．Ｂｒｏｏｋｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．に概説されている）。
いくつかの態様では、分離する細胞の試料または組成を、常磁性ビーズ（例えば、ＤｙｎａｂｅａｄｓまたはＭＡＣＳビーズなど）などの磁気応答性粒子または微粒子などの微小な磁化可能または磁気応答性材料とインキュベートする。磁気応答性材料、例えば粒子は、材料が分離することが望ましい、例えば材料がネガティブまたはポジティブに選択することが望ましい細胞、複数の細胞、または細胞の集団に存在する分子、例えば表面マーカーに特異的に結合する結合パートナー、例えば抗体に直接的または間接的に付着される。
いくつかの実施形態では、磁性粒子またはビーズは、抗体または他の結合パートナーのような特定の結合要素に結合された磁気応答性材料を含む。磁気分離法に使用される多くの周知の磁気応答性材料が存在する。適当な磁性粒子としては、本明細書に参照により援用するところのＭｏｌｄａｙによる米国特許第４，４５２，７７３号、及び欧州特許明細書ＥＰ ４５２３４２ Ｂ号に記載されるものがある。他の例としては、Ｏｗｅｎによる米国特許第４，７９５，６９８号、及びＬｉｂｅｒｔｉらによる米国特許第５，２００，０８４号に記載されるものなどのコロイド粒径の粒子がある。
インキュベーションは、磁性粒子またはビーズに付着された、抗体または結合パートナーと特異的に結合する抗体もしくは結合パートナー、または分子（二次抗体または他の試薬など）が、試料中の細胞上に存在する場合に細胞表面分子に特異的に結合するような条件下で一般的に行われる。
いくつかの態様では、試料は磁場の中に置かれ、磁気応答性または磁化可能な粒子が付着された細胞が磁石に引き寄せられて非標識細胞から分離される。ポジティブセレクションでは、磁石に引き寄せられた細胞が保持され、ネガティブセレクションでは引き寄せられなかった細胞（非標識細胞）が保持される。いくつかの態様では、ポジティブセレクションとネガティブセレクションとの組み合わせが同じ選択工程において行われ、陽性及び陰性画分が保持され、さらに処理されるかまたはさらなる分離工程に供される。
特定の実施形態では、磁気応答性粒子は、一次抗体もしくは他の結合パートナー、二次抗体、レクチン、酵素、またはストレプトアビジンでコーティングされる。特定の実施形態では、磁性粒子は１つ以上のマーカーに特異的な一次抗体のコーティングによって細胞に付着される。特定の実施形態では、ビーズではなく、細胞を一次抗体または結合パートナーで標識し、次いで、細胞型に特異的な二次抗体または他の結合パートナー（例えばストレプトアビジン）でコーティングした磁性ビーズを加える。特定の実施形態では、ストレプトアビジンでコーティングされた磁性ビーズがビオチン化された一次または二次抗体と組み合わせて使用される。
いくつかの態様では、磁気応答性粒子は、後でインキュベート、培養、及び／または操作しようとする細胞に付着されたままとされ、いくつかの態様では、粒子は患者に投与される細胞に付着されたままとされる。いくつかの実施形態では、磁化可能な、または磁気応答性粒子は細胞から除去される。磁化可能な粒子を細胞から除去するための方法は周知のものであり、例えば、非標識抗体、磁化可能な粒子、または切断可能なリンカーと結合させた抗体などの使用が含まれる。いくつかの実施形態では、磁化可能な粒子は生分解性である。
いくつかの実施形態では、親和性に基づく選択は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆ．）により行われる。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）システムは、磁化粒子が付着された細胞を高純度で選択することが可能である。いくつかの実施形態では、ＭＡＣＳは、外部磁場の印可後に非標的種と標的種が順次溶出されるモードで動作する。すなわち、磁化粒子に付着された細胞が保持される一方で付着していない種は溶出する。次いで、この第１の溶出工程が完了した後、磁場に捕捉され、溶出が防止された種が、溶出して回収できるような何らかの形で遊離される。特定の実施形態では、大型Ｔ細胞以外のＴ細胞が標識され、細胞の不均質集団から枯渇される。
特定の実施形態では、単離または分離は、本方法の単離、細胞調製、分離、プロセシング、インキュベーション、培養、及び／または配合工程のうちの１つ以上を行うシステム、機器、または装置を用いて行われる。いくつかの態様では、例えば、エラー、ユーザによる取り扱い、及び／または汚染を最小限に抑制するため、これらの工程のそれぞれを閉鎖または滅菌環境内で行うシステムが用いられる。１つの例では、システムは、国際公開第ＷＯ２００９／０７２００３号、または米国特許出願公開第ＵＳ２０１１０００３３８０Ａ１号である。
いくつかの態様では、システムまたは装置は、単離、プロセシング、及び配合工程のうちの１つ以上、例えばすべてを、統合された、または自給式システムで、及び／または自動化若しくはプログラム可能な形で行う。いくつかの態様では、システムまたは装置は、ユーザがプロセシング、単離、操作、及び配合工程をプログラムし、制御し、その結果を評価し、及び／またはそのさまざまな側面を調節することを可能とする、システムまたは装置と通信するコンピュータ及び／またはコンピュータプログラムを含む。
いくつかの態様では、分離及び／または他の工程は、例えば、閉鎖及び滅菌システム内で臨床規模レベルの細胞の自動化分離を行うためのＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｉｃ）を用いて行われる。構成要素としては、統合マイクロコンピュータ、磁気分離ユニット、蠕動ポンプ、及びさまざまなピンチバルブが含まれ得る。統合コンピュータは、いくつかの態様では、機器のすべての構成要素を制御し、システムに、繰り返し手順を標準化された順序で実行するように指示する。磁気分離ユニットは、いくつかの態様では、可動式永久磁石及び選択カラム用のホルダーを含む。蠕動ポンプはピンチバルブとともに、チューブセット全体にわたった流量を制御し、システムを通るバッファーの制御された流れ及び細胞の継続的な懸濁を確実とする。
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムは、いくつかの態様では、滅菌された非発熱性溶液中で供給される、抗体と結合された磁化可能な粒子を使用する。いくつかの実施形態では、磁性粒子で細胞を標識した後、細胞を洗浄して余分な粒子を除去する。次いで、細胞調製バッグをチューブセットに接続し、チューブセットをバッファーの入ったバッグと細胞回収バッグに接続する。チューブセットは、予備カラム及び分離カラムを含む予め組み立てられた滅菌チューブで構成され、１回使用のみである。分離プログラムの開始後、システムは細胞試料を分離カラムに自動的に適用する。標識細胞がカラムに保持されるのに対して、非標識細胞は一連の洗浄工程により除去される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法とともに使用される細胞集団は非標識細胞であり、カラムに保持されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法とともに使用される細胞集団は標識細胞であり、カラムに保持される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法とともに使用される細胞集団は、磁場の除去後にカラムから溶出され、細胞回収バッグ内に回収される。
いくつかの実施形態では、分離及び／または他の工程は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して行われる。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステムは、いくつかの実施形態では、遠心分離による細胞の自動洗浄及び分画化を可能とする細胞プロセシングユニットを備えている。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステムは、オンボードカメラ及びソース細胞産物のマクロスコピック層を判別することによって最適な細胞分画化エンドポイントを決定する画像認識ソフトウェアも含むことができる。例えば、末梢血を、赤血球、白血球、及び血漿層に自動的に分離することができる。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステムは、例えば、細胞分化及び増殖、抗原ローディング、及び長期の細胞培養などの細胞培養プロトコールを行う統合型細胞培養チャンバも含むことができる。入力ポートによって培地の無菌的な除去及び補充が可能であり、統合型顕微鏡を使用して細胞を監視することができる（例えば、Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６５１－６６０，Ｔｅｒａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｌｏｏｄ．１：７２－８２，ａｎｄ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６８９－７０１を参照）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞集団は、複数の細胞表面マーカーについて染色された細胞が流体流で搬送されるフローサイトメトリーによって回収及び濃縮（または枯渇）される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞集団は、分取スケール（ＦＡＣＳ）ソーティングにより回収及び濃縮（または枯渇）される。特定の実施形態では、本明細書に記載される細胞集団は、ＦＡＣＳに基づいた検出システムと組み合わせた微小電気機械的システム（ＭＥＭＳ）チップの使用により回収及び濃縮（または枯渇）される（例えば、ＷＯ２０１０／０３３１４０，Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １０，１５６７－１５７３；及びＧｏｄｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｊ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎ．１（５）：３５５－３７６を参照）。いずれの場合も、細胞を複数のマーカーで標識することができ、明確に定義された高純度のＴ細胞サブセットの単離を可能とする。
いくつかの実施形態では、ポジティブ及び／またはネガティブセレクションによる分離を容易とするため、抗体または結合パートナーは１つ以上の検出可能なマーカーで標識される。例えば、分離は、蛍光標識された抗体との結合に基づいたものとすることができる。いくつかの例では、１つ以上の細胞表面マーカーに対して特異的な抗体または他の結合パートナーの結合に基づいた細胞の分離は、例えばフローサイトメトリー検出システムと組み合わせた、分取スケール（ＦＡＣＳ）及び／または微小電気機械的（ＭＥＭＳ）チップを含む、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）などにより、流体流で搬送される。かかる方法は、同時に複数のマーカーに基づいたポジティブ及びネガティブセレクションを可能とするものである。
いくつかの実施形態では、調製法は、単離、インキュベーション、及び／または操作の前または後で細胞を凍結、例えば凍結保存する工程を含む。いくつかの実施形態では、凍結工程及びそれに続く解凍工程により、細胞集団中の顆粒球及びある程度の単球が除去される。いくつかの実施形態では、細胞は、血漿及び血小板を除去するために、例えば洗浄工程後に凍結溶液中に懸濁される。いくつかの態様では、各種の公知の凍結溶液及びパラメータのいずれをも使用することができる。１つの例では、２０％ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するＰＢＳまたは他の適当な細胞凍結媒体を使用する。次いで、これを、媒体で１：１に希釈することにより、それぞれ、ＤＭＳＯ及びＨＳＡの最終濃度を１０％及び４％とする。他の例としては、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）、ＣＴＬ－Ｃｒｙｏ（商標）ＡＢＣ凍結媒などが挙げられる。その後、細胞を毎分１℃の速度で－８０℃にまで凍結し、液体窒素貯蔵タンクの蒸気相中で保存する。
いくつかの実施形態では、提供される方法には、培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）、インキュベーション、培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）、及び／または遺伝子操作の工程が含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、枯渇させた細胞集団をインキュベート及び／または操作する方法、ならびに培養開始組成物が提供される。
したがって、いくつかの実施形態では、細胞集団は培養開始組成物中でインキュベートされる。インキュベーション及び／または操作は、ユニット、チャンバ、ウェル、カラム、チューブ、チューブセット、バルブ、バイアル、培養皿、バッグ、または他の培養または細胞培養用の容器などの培養容器中で行われる。
いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子操作に先立って、または遺伝子操作に関連してインキュベートかつ／または培養される。インキュベーション工程は、培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）、培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）、刺激、活性化、及び／または増殖を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物または細胞は、刺激条件または刺激剤の存在下でインキュベートされる。かかる条件としては、例えば、組換え抗原受容体を導入する目的などで、抗原曝露を模倣し、及び／または遺伝子操作を行うために細胞をプライミングするために、集団内の細胞の分裂、増殖、活性化、及び／または生存を誘導するように設計されたものが挙げられる。
こうした条件には、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、作用物質、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、及び／または刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、ならびに細胞を活性化するように設計された他の任意の作用物質のうちの１つ以上が含まれ得る。
いくつかの実施形態では、刺激条件または刺激剤には、ＴＣＲ複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することができる１つ以上の作用物質、例えばリガンドが含まれる。いくつかの態様では、作用物質は、Ｔ細胞におけるTCR/CD3細胞内シグナル伝達カスケードをオンするか、または開始する。このような作用物質には、例えば、ビーズなどの固体支持体に結合した、例えば、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８などの、ＴＣＲ成分及び／または共刺激受容体に対して特異的な抗体などの抗体、及び／または１つ以上のサイトカインが含まれ得る。任意で、増殖方法は、抗ＣＤ３及び／または抗ＣＤ２８抗体を（例えば、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で）培地に添加する工程をさらに含んでもよい。一部の態様において、刺激剤は、ＩＬ－２及び／またはＩＬ－１５、例えば、少なくとも約１０単位／ｍＬの濃度のＩＬ－２が含まれる。
いくつかの態様では、インキュベーションは、Ｒｉｄｄｅｌｌらへの米国特許第６，０４０，１７７号、Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６５１－６６０、Ｔｅｒａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｌｏｏｄ．１：７２－８２、及び／またはＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６８９－７０１に記載されるものなどの方法に従って行われる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、（例えば、結果として生じる細胞集団が、増殖させようとする初期集団中で各Ｔリンパ球について少なくとも約５個、１０個、２０個、または４０個、またはそれよりも多いＰＢＭＣフィーダー細胞を含有するように）、例えば、非分裂末梢血単核球（ＰＢＭＣ）などのフィーダー細胞を培養開始組成物に添加し、培養物を（例えば、Ｔ細胞の数を増やすのに充分な時間にわたって）インキュベートすることによって増殖される。いくつかの態様では、非分裂フィーダー細胞は、γ線を照射したＰＢＭＣフィーダー細胞を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣに約３０００～３６００ラドの範囲のγ線を照射して細胞分裂を阻止する。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣフィーダー細胞をマイトマイシンＣで不活化する。いくつかの態様では、Ｔ細胞の集団を加える前にフィーダー細胞を培地に加える。
いくつかの実施形態では、刺激条件は、ヒトＴリンパ球の増殖に適した温度、例えば、少なくとも約２５℃、一般的には少なくとも約３０度、及び一般的には３７℃または約３７℃を含む。必要に応じて、インキュベーションは、フィーダー細胞として非分裂性のＥＢＶで形質転換したリンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）を添加することをさらに含んでもよい。ＬＣＬに、約６０００～１０，０００ラドの範囲のγ線を照射することができる。ＬＣＬフィーダー細胞はいくつかの態様では、ＬＣＬフィーダー細胞と初期Ｔリンパ球との比が少なくとも約１０：１など、任意の適切な量で提供される。
各実施形態において、抗原特異的Ｔ細胞、例えば、抗原特異的ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、ナイーブまたは抗原特異的なＴリンパ球を抗原で刺激することによって得られる。例えば、サイトメガロウイルス抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞株またはクローンを、感染させた対象からＴ細胞を単離し、この細胞をインビトロで同じ抗原で刺激することによって作製することができる。
いくつかの実施形態では、新生抗原特異的Ｔ細胞は、機能性アッセイ（例えば、ＥＬＩＳｐｏｔ）による刺激後に特定及び／または単離される。いくつかの実施形態では、新生抗原特異的Ｔ細胞は、細胞内サイトカイン染色によって多機能性細胞によって単離される。いくつかの実施形態では、新生抗原特異的Ｔ細胞は、活性化マーカー（例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ３８、ＣＤ３８／ＨＬＡ－ＤＲ二重陽性、及び／またはＣＤ６９）を用いて特定及び／または単離される。いくつかの実施形態では、新生抗原特異的ＣＤ８＋、ナチュラルキラーＴ細胞、メモリーＴ細胞、及び／またはＣＤ４＋Ｔ細胞は、クラスＩまたはクラスＩＩマルチマー及び／または活性化マーカーを用いて特定及び／または単離される。いくつかの実施形態では、新生抗原特異的ＣＤ８＋及び／またはＣＤ４＋Ｔ細胞はメモリーマーカー（例えば、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、及び／またはＣＤ６２Ｌ）を用いて特定及び／または単離される。いくつかの実施形態では、増殖中の細胞が特定及び／または単離される。いくつかの実施形態では、活性化されたＴ細胞が特定及び／または単離される。
患者試料からの新生抗原特異的Ｔ細胞の特定後、特定された新生抗原特異的Ｔ細胞の新生抗原特異的ＴＣＲをシークエンシングする。新生抗原特異的ＴＣＲをシークエンシングするには、最初にＴＣＲを特定する必要がある。Ｔ細胞の新生抗原特異的ＴＣＲを特定する１つの方法は、Ｔ細胞を少なくとも１つの新生抗原を含むＨＬＡマルチマー（例えばテトラマー）と接触させ、ＨＬＡマルチマーとＴＣＲとの間の結合によりＴＣＲを特定することを含むことができる。新生抗原特異的ＴＣＲを特定する別の方法は、ＴＣＲを有する１つ以上のＴ細胞を得ることと、１つ以上のＴ細胞を少なくとも１つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示された少なくとも１つの新生抗原により活性化することと、少なくとも１つの新生抗原との相互作用により活性化された１つ以上の細胞を選択することによりＴＣＲを特定することと、を含むことができる。
新生抗原特異的ＴＣＲの特定後、ＴＣＲをシークエンシングすることができる。一実施形態では、セクションＸＶＩに関連して上記に述べた方法を用いてＴＣＲをシークエンシングすることができる。別の実施形態では、ＴＣＲのＴＣＲａ及びＴＣＲｂをバルクシークエンシングした後、頻度に基づいてペアリングすることができる。別の実施形態では、ＴＣＲは、Ｈｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１５（ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｃ５６２４）の方法を用いてシークエンシングし、ペアリングすることができる。別の実施形態では、ＴＣＲは、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０１４ （ＰＭＩＤ ２４９５２９０２，ｄｏｉ １０．１０３８／ｎｂｔ．２９３８）の方法を用いてシークエンシングし、ペアリングすることができる。別の実施形態では、ペアリングされたＴＣＲ配列を、https://www.biorxiv.org/content/early/2017/05/05/134841及び／またはhttps://patents.google.com/patent/US20160244825A1/により記載される方法を用いて得ることができる１５８，１５９。
別の実施形態では、Ｔ細胞のクローン集団を、希釈を限定し、次いでＴ細胞のクローン集団のＴＣＲａ及びＴＣＲｂをシークエンシングすることによって得ることができる。さらに別の実施形態では、Ｔ細胞をウェルを有するプレート上でウェル１つ当たり１個のＴ細胞となるように選別し、次いで各Ｔ細胞のＴＣＲａ及びＴＣＲｂをシークエンシング及びペアリングすることができる。
次に、新生抗原特異的Ｔ細胞を患者試料から特定し、特定された新生抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲをシークエンシングした後、シークエンシングされたＴＣＲを新たなＴ細胞にクローニングする。これらのクローニングされたＴ細胞は、新生抗原特異的受容体を含む（例えば、ＴＣＲを含む細胞外ドメインを含む）。そのような細胞の集団、及びそのような細胞を含む組成物も提供される。いくつかの実施形態では、組成物または集団は、そのような細胞について濃縮される（例えば、ＴＣＲを発現する細胞が、組成物中の全細胞、またはＴ細胞またはＣＤ８＋もしくはＣＤ４＋細胞などの特定の細胞の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９％超を構成するように）。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に開示されるＴＣＲを有する少なくとも１つの細胞を含む。かかる組成物には、養子細胞療法などで投与するための医薬組成物及び製剤がある。細胞及び組成物を対象、例えば患者に投与するための治療方法も提供される。
したがって、ＴＣＲ（複数可）を発現する遺伝子操作された細胞も提供される。細胞は、一般的に哺乳動物細胞などの真核細胞であり、通常はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、血液、骨髄、リンパ、またはリンパ器官に由来するものであり、自然免疫または獲得免疫などの免疫系の細胞である（例えば、リンパ球を含む骨髄細胞またはリンパ系細胞、典型的にはＴ細胞及びＮＫ細胞）。他の例示的な細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、多能性及び万能幹細胞などの幹細胞が含まれる。細胞は通常、対象から直接単離されるか、かつ／または対象から単離されて凍結されたものなどの初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞には、１つ以上のＴ細胞または全Ｔ細胞集団、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ならびに機能、活性化状態、成熟度、分化能、増殖、再循環、局在化、及び／または持続能力、抗原特異性、抗原受容体の種類、特定の臓器またはコンパートメントにおける存在、マーカーまたはサイトカイン分泌プロファイル、及び／または分化の程度によって規定されるものなどのこれらの亜集団などの他の細胞タイプが含まれる。治療される対象に関連して、細胞は、同種及び／または自家であってよい。方法には、オフザシェルフ法が含まれる。オフザシェルフ法用などのいくつかの態様では、細胞は、例えば幹細胞、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの態様では、方法は、本明細書に記載されるようにして、対象から細胞を単離することと、それらの細胞を調製、プロセシング、培養、及び／または操作することと、凍結保存の前または後でそれらの細胞を同じ患者に再導入することと、を含む。
Ｔ細胞及び／またはＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のサブタイプ及び亜集団としては、ナイーブＴ（ＴＮ）細胞、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、メモリーＴ細胞そのサブタイプ、例えば、幹細胞メモリーＴ（ＴＳＣＭ）、中枢メモリーＴ（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ）、または最終分化したエフェクターメモリーＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、未成熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＬＴ）細胞、天然および適応制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ヘルパーＴ細胞、例えばＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２細胞、濾胞ヘルパーＴ細胞、アα／βＴ細胞、及びδ／γＴ細胞がある。
いくつかの態様において、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの態様において、細胞は、単球または顆粒球、例えば骨髄性細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好酸球、及び／または好塩基球である。
細胞は、内因性ＴＣＲの発現を低減するかまたはノックアウトするように遺伝子改変することができる。かかる改変は、本明細書に参照により援用するところのＭｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１２ Ｄｅｃ；１（１２）：ｅ６３；Ｂｌｏｏｄ．２０１１ Ａｕｇ １１；１１８（６）：１４９５－５０３；Ｂｌｏｏｄ．２０１２ Ｊｕｎ １４；１１９（２４）：５６９７－５７０５；Ｔｏｒｉｋａｉ，Ｈｉｒｏｋｉ ｅｔ ａｌ“ＨＬＡ ａｎｄ ＴＣＲ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｂｙ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ：Ｔｏｗａｒｄ “ｏｆｆ－ｔｈｅ－Ｓｈｅｌｆ” Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ＣＤ１９＋ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．．”Ｂｌｏｏｄ １１６．２１ （２０１０）：３７６６；Ｂｌｏｏｄ．２０１８ Ｊａｎ １８；１３１（３）：３１１－３２２．ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１７－０５－７８７５９８；及びＷＯ２０１６０６９２８３に記載されている。
細胞は、サイトカイン分泌を促進するために遺伝子改変することができる。かかる改変は、Ｈｓｕ Ｃ、Ｈｕｇｈｅｓ ＭＳ、Ｚｈｅｎｇ Ｚ、Ｂｒａｙ ＲＢ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ、Ｍｏｒｇａｎ ＲＡ、Ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｄｏｎ－ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＩＬ－１５ ｇｅｎｅ ｒｅｓｉｓｔ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｅｒｓｉｓｔ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｃｙｔｏｋｉｎｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；１７５：７２２６－３４；Ｑｕｉｎｔａｒｅｌｌｉ Ｃ，Ｖｅｒａ ＪＦ，Ｓａｖｏｌｄｏ Ｂ，Ｇｉｏｒｄａｎｏ Ａｔｔｉａｎｅｓｅ ＧＭ，Ｐｕｌｅ Ｍ，Ｆｏｓｔｅｒ ＡＥ，Ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｄ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｂｌｏｏｄ．２００７；１１０：２７９３－８０２；及び、Ｈｓｕ Ｃ，Ｊｏｎｅｓ ＳＡ，Ｃｏｈｅｎ ＣＪ，Ｚｈｅｎｇ Ｚ，Ｋｅｒｓｔａｎｎ Ｋ，Ｚｈｏｕ Ｊ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｃｌｏｎａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋ Ｔ－ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＩＬ－１５ ｇｅｎｅ．Ｂｌｏｏｄ．２００７；１０９：５１６８－７７に記載されている。
Ｔ細胞上のケモカイン受容体と腫瘍分泌ケモカインのミスマッチが、腫瘍微小環境内へのＴ細胞の不適当なトラフィッキングの主要因であることが示されている。治療効果を高めるため、腫瘍微小環境中でのケモカインの認識を高めるように遺伝子改変することができる。そのような改変の例は、Ｍｏｏｎ，ＥＫＣａｒｐｅｎｉｔｏ，ＣＳｕｎ，ＪＷａｎｇ，ＬＣＫａｐｏｏｒ，ＶＰｒｅｄｉｎａ，Ｊ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣＣＲ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｕｍｏｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１；１７：４７１９－４７３０；及びＣｒａｄｄｏｃｋ，ＪＡＬｕ，ＡＢｅａｒ，ＡＰｕｌｅ，ＭＢｒｅｎｎｅｒ，ＭＫＲｏｏｎｅｙ，ＣＭ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｍｏｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ ＧＤ２ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＣＲ２ｂ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１０；３３：７８０－７８８に記載されている。
細胞を、ＣＤ２８及び４１ＢＢなどの共刺激／増強受容体の発現を増大させるために遺伝子改変することができる。
Ｔ細胞療法の副作用には、サイトカイン放出症候群及び長期のＢ細胞枯渇が含まれ得る。レシピエント細胞への自殺／安全スイッチの導入によって細胞療法の安全性プロファイルを改善することができる。したがって、細胞を自殺／安全スイッチを含むように遺伝子改変することができる。自殺／安全スイッチは、遺伝子が発現される細胞に作用物質、例えば薬物に対する感度を与え、細胞が作用物質と接触する際に死なせる遺伝子であってよい。例示的な自殺／安全スイッチについては、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ．２０１７ Ａｕｇ；８（８）：５７３－５８９に記載されている。自殺／安全スイッチはＨＳＶ－ＴＫとすることができる。自殺／安全スイッチはシトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、またはニトロレダクターゼであってもよい。自殺／安全スイッチは、米国特許出願公開第 ＵＳ２０１７０１６６８７７Ａ１号に記載されるＲａｐａＣＩＤｅ（商標）であってもよい。自殺／安全スイッチシステムは、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２００９ Ｓｅｐ；９４（９）：１３１６－１３２０に記載されるＣＤ２０／リツキシマブであってもよい。これらの参照文献は、それらの全容を参照により援用するものである。
ＴＣＲは、ヘテロ二量体化小分子の存在下でのみアセンブルする分割受容体としてレシピエント細胞に導入することができる。かかるシステムについては、本明細書に参照により援用するところのＳｃｉｅｎｃｅ．２０１５ Ｏｃｔ １６；３５０（６２５８）：ａａｂ４０７７、及び米国特許第９，５８７，０２０号に記載されている。
いくつかの実施形態では、細胞は１つ以上の核酸、例えば、本明細書に開示されるＴＣＲをコードしたポリヌクレオチドを含み、かかるポリヌクレオチドは遺伝子操作により導入され、それにより本明細書に開示される組換えまたは遺伝子操作されたＴＣＲを発現する。いくつかの実施形態では、核酸は、異種、すなわち、別の生物または細胞から得られたものなどの、細胞または細胞から得られる試料中に通常は存在していないものであって、例えば、操作される細胞及び／またはかかる細胞が由来する生物には通常みられないものである。いくつかの実施形態では、核酸は、複数の異なる細胞タイプからの異なるドメインをコードした核酸のキメラ複合体を含むものなど、自然界にはみられない核酸など、天然に存在しないものである。
核酸は、コドン最適化されたヌクレオチド配列を含むことができる。特定の理論または機序に束縛されるものではないが、ヌクレオチド配列のコドン最適化はｍＲＮＡ転写産物の翻訳効率を高めるものと考えられる。ヌクレオチド配列のコドン最適化では、天然のコドンを、同じアミノ酸をコードしているが細胞内でより利用されやすいｔＲＮＡによって翻訳されうる別のコドンに置換することにより、翻訳効率を高めることを行うことができる。ヌクレオチド配列の最適化は、翻訳を妨げる二次ｍＲＮＡ構造を低減させることで翻訳効率を高めることもできる。
コンストラクトまたはベクターを用いてレシピエント細胞にＴＣＲを導入することができる。例示的なコンストラクトを本明細書に記載する。ＴＣＲのα鎖及びβ鎖をコードするポリヌクレオチドは、単一のコンストラクト内にあってもよく、別々のコンストラクト内にあってもよい。α鎖及びβ鎖をコードするポリヌクレオチドは、プロモーター、例えば異種プロモーターと機能的に連結することができる。異種プロモーターは、例えば、ＥＦ１α、ＣＭＶ、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、βアクチン、ＣＡＧプロモーターのような強力なプロモーターとすることができる。異種プロモーターは、弱いプロモーターであってもよい。異種プロモーターは誘導性プロモーターであってもよい。例示的な誘導性プロモーターとしては、これらに限定されるものではないが、ＴＲＥ、ＮＦＡＴ、ＧＡＬ４、ＬＡＣなどが挙げられる。他の例示的な誘導性発現系は、本明細書にその全容を援用するところの米国特許第５，５１４，５７８号、同第６，２４５，５３１号、同第７，０９１，０３８号、及び欧州特許第０５１７８０５号に記載されている。
ＴＣＲをレシピエント細胞に導入するためのコンストラクトは、シグナルペプチドをコードしたポリヌクレオチド（シグナルペプチドエレメント）を含んでもよい。シグナルペプチドは、導入されたＴＣＲの表面トラフィッキングを促進することができる。例示的なシグナルペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、ＣＤ８シグナルペプチド、免疫グロブリンシグナルペプチドが挙げられ、具体例としてはＧＭ－ＣＳＦ及びＩｇＧκが挙げられる。かかるシグナルペプチドは、本明細書に参照により援用するところのＴｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２００６ Ｏｃｔ；３１（１０）：５６３－７１．Ｅｐｕｂ ２００６ Ａｕｇ ２１；及びＡｎ，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｅｗ Ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｎｔｉ－Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌｓ．” Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７．９（２０１６）：１０６３８－１０６４９．ＰＭＣ．Ｗｅｂ．１６ Ａｕｇ．２０１８に記載されている。
場合により、例えば、α鎖及びβ鎖が単一のコンストラクトまたはオープンリーディングフレームから発現される場合、またはコンストラクトにマーカー遺伝子が含まれるような場合では、コンストラクトはリボソームスキップ配列を含むことができる。リボソームスキップ配列は、２Ａペプチド、例えば、Ｐ２ＡまたはＴ２Ａペプチドであってよい。例示的なＰ２ＡまたはＴ２Ａペプチドは、本明細書に参照によりその全容を援用するところのＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ７，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：２１９３（２０１７）に記載されている。場合により、ＦＵＲＩＮ／ＰＡＣＥ切断部位が２Ａエレメントの上流に導入される。FURIN/PACE切断部位は、例えば、http://www.nuolan.net/substrates.html.に記載されている。切断ペプチドは、第Ｘａ因子の切断部位であってもよい。α鎖及びβ鎖が単一のコンストラクトまたはオープンリーディングフレームから発現される場合、コンストラクトは配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含むことができる。
コンストラクトは、１つ以上のマーカー遺伝子をさらに含むことができる。例示的なマーカー遺伝子としては、これらに限定されるものではないが、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ、ＨＡ、ｌａｃＺが挙げられる。マーカーは、当業者には周知の抗生物質耐性マーカー、重金属耐性マーカー、または殺生物剤耐性マーカーなどの選択可能なマーカーであってよい。マーカーは、栄養要求性宿主で使用するための補完的マーカーとすることができる。例示的な補完的マーカー及び栄養要求性宿主は、Ｇｅｎｅ．２００１ Ｊａｎ ２４；２６３（１－２）：１５９－６９に記載されている。かかるマーカーは、ＩＲＥＳ、フレームシフト配列、２Ａペプチドリンカー、ＴＣＲとの融合体によって発現させるか、または別のプロモーターから別に発現させることができる。
ＴＣＲをレシピエント細胞に導入するための例示的なベクターとしては、これらに限定されるものではないが、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス＋改変ワクシニア、アンカラウイルス（ＭＶＡ）、アデノウイルス＋レトロウイルス、アデノウイルス＋センダイウイルス、アデノウイルス＋ワクシニアウイルス、アルファウイルス（ＶＥＥ）レプリコンワクチン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、Ｅ．ｃｏｌｉ、フラビウイルス、遺伝子銃、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、ラクトコッカス・ラクティス、電気穿孔法、レンチウイルス、リポフェクション、リステリア・モノサイトゲネス、麻疹ウイルス、改変ワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）、ｍＲＮＡ電気穿孔法、ネイキッド／プラスミドＤＮＡ、ネイキッド／プラスミドＤＮＡ＋アデノウイルス、ネイキッド／プラスミドＤＮＡ＋改変ワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）、ネイキッド／プラスミドＤＮＡ＋ＲＮＡトランスファー、ネイキッド／プラスミドＤＮＡ＋ワクシニアウイルス、ネイキッド／プラスミドＤＮＡ＋水泡口炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、非ウイルス性ＰｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポゾン、ナノ粒子ベースのシステム、ポリオウイルス、ポックスウイルス、ポックスウイルス＋ワクシニアウイルス、レトルウイルス、ＲＮＡトランスファー、ＲＮＡトランスファー＋ネイキッド／プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡウイルス、サッカロマイセス・セレビシエ、サルモネラ・ティフィムリウム、セムリキ森林ウイルス、センダイウイルス、志賀赤痢菌、シミアンウイルス、ｓｉＲＮＡ、スリーピング・ビューティートランスポゾン、ストレプトコッカス・ミュータンス、ワクシニアウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン、水泡口炎ウイルス、及びコレラ菌が挙げられる。
好ましい実施形態では、ＴＣＲは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、リポフェクション、ｍＲＮＡ電気穿孔法、ＰｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポゾン、レトロウイルス、ＲＮＡトランスファー、またはスリーピング・ビューティートランスポゾンによってレシピエント細胞に導入される。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲをレシピエント細胞に導入するためのベクターは、ウイルスベクターである。例示的なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。かかるベクターは本明細書に記載される。
ＴＣＲをレシピエント細胞に導入するためのＴＣＲコンストラクトの例示的な実施形態を図２４に示す。いくつかの実施形態では、ＴＣＲコンストラクトは、５’～３’の方向に以下のポリヌクレオチド配列、すなわち、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、ＴＣＲβ可変（ＴＣＲβｖ）配列、ＴＣＲβ定常（ＴＣＲβｃ）配列、切断ペプチド（例えば、Ｐ２Ａ）、シグナルペプチド配列、ＴＣＲα可変（ＴＣＲαｖ）配列、及びＴＣＲα定常（ＴＣＲαｃ）配列を含む。いくつかの実施形態では、コンストラクトのＴＣＲβｃ及びＴＣＲαｃ配列は、１つ以上のマウス領域、例えば、本明細書に記載される完全マウス定常配列またはヒト→マウスへのアミノ酸交換を含む。いくつかの実施形態では、コンストラクトはさらに、ＴＣＲαｃ配列の３’末端、切断ペプチド配列（例えば、Ｔ２Ａ）に続くレポーター遺伝子を含む。一実施形態では、コンストラクトは、５’～３’の方向に以下のポリヌクレオチド配列、すなわち、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、ＴＣＲβ可変（ＴＣＲβｖ）配列、１つ以上のマウス領域を含むＴＣＲβ定常（ＴＣＲβｃ）配列、切断ペプチド（例えば、Ｐ２Ａ）、シグナルペプチド配列、ＴＣＲα可変（ＴＣＲαｖ）配列、及び１つ以上のマウス領域を含むＴＣＲα定常（ＴＣＲαｃ）配列、切断ペプチド配列（例えば、Ｔ２Ａ）、及びレポーター遺伝子を含む。
図２５は、治療法の開発のためにＴＣＲを発現系にクローニングするための例示的なＰ５２６コンストラクト骨格のヌクレオチド配列を示す。
図２６は、治療法の開発のために患者の新生抗原特異的ＴＣＲのクロノタイプ１を発現系にクローニングするための例示的なコンストラクト配列を示す。
図２７は、治療法の開発のために患者の新生抗原特異的ＴＣＲのクロノタイプ３を発現系にクローニングするための例示的なコンストラクト配列を示す。
ＴＣＲをコードする単離された核酸、かかる核酸を含むベクター、及びかかるベクターを含む宿主細胞、ならびにＴＣＲを作製するための組換え法も提供される。
核酸は組換え体であってよい。組換え核酸は、天然または合成核酸セグメントを、生細胞内で複製可能な核酸分子またはその複製産物に連結することにより生細胞の外部で構築することができる。本明細書の目的では、複製はインビトロ複製またはインビボ複製であってよい。
ＴＣＲの組換え作製を行うには、ＴＣＲをコードする核酸（複数可）を単離してさらなるクローニング（すなわち、ＤＮＡの増幅）または発現を行うための複製可能なベクターに挿入することができる。いくつかの態様では、核酸は、例えば本明細書に参照により援用するところの米国特許第５，２０４，２４４号に記載されるような相同組み換えによって作製することができる。
多くの異なるベクターが当該技術分野では周知である。ベクターの構成要素は一般的に以下のもの、すなわち、例えば、本明細書にその全容を参照により援用するところの米国特許第５，５３４，６１５号に記載されるような、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上を含む。
ＴＣＲ、抗体、またはその抗原結合フラグメントを発現させるのに適した例示的なベクターまたはコンストラクトとしては、例えば、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）が挙げられる。ＡＧＴｌＯ、ＡＧＴｌ１、ＡＺａｐＩＩ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＡＥＭＢＬ４、及びＡＮＭｌ１４９などのバクテリオファージも本明細書に開示されるＴＣＲを発現させるうえで適当である。
ＸＩＸ．治療の概要のフローチャート
図２８は、一実施形態による、患者に個別化された新生抗原特異的治療を行うための方法のフローチャートである。他の実施形態では、本方法は、図２８に示されるもの以外の異なる及び／またはさらなる工程を含んでもよい。さらに、本方法の各工程は、異なる実施形態において、図２８に関連して述べられる順序とは異なる順序で行うことができる。
提示モデルを、上記に述べた質量分析データを用いて訓練する（２８０１）。患者試料を取得する（２８０２）。いくつかの実施形態では、患者試料は、腫瘍生検及び／または患者の末梢血を含む。工程２８０２で得られた患者試料をシークエンシングして、患者試料からの腫瘍抗原ペプチドが提示される尤度を予測するための提示モデルに入力するデータを特定する。工程２８０２で得られた患者試料からの腫瘍抗原ペプチドの提示尤度を、訓練された提示モデルを用いて予測する（２８０３）。予測された提示尤度に基づいて患者に対する治療抗原を特定する（２８０４）。次いで、別の患者試料を取得する（２８０５）。患者試料は、患者の末梢血、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンパ、リンパ節細胞、及び／または他のＴ細胞源を含み得る。工程２８０５で得られた患者試料を新生抗原特異的Ｔ細胞についてインビボでスクリーニングする（２８０６）。
治療プロセスのこの時点において、患者は、Ｔ細胞療法及び／またはワクチン治療を受けることができる。ワクチン治療を受けるには、患者のＴ細胞が特異的である新生抗原を特定する（２８１４）。次いで、特定された新生抗原を含むワクチンを作製する（２８１５）。最後に、ワクチンを患者に投与する（２８１６）。
Ｔ細胞治療を受けるには、新生抗原特異的Ｔ細胞を増殖させるか、及び／または新たな新生抗原特異的Ｔ細胞を遺伝子操作する。Ｔ細胞療法で使用するための新生抗原特異的Ｔ細胞を増殖させるには、細胞を単純に増殖させ（２８０７）、患者に注入する（２８０８）。
Ｔ細胞療法用の新たな新生抗原特異的Ｔ細胞を遺伝子操作するには、インビボで特定された新生抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲをシークエンシングする（２８０９）。次いで、これらのＴＣＲ配列を発現ベクターにクローニングする（２８１０）。次にこの発現ベクター２８１０を新たなＴ細胞にトランスフェクトする（２８１１）。トランスフェクトしたＴ細胞を増殖させる（２８１２）。そして最後に、増殖させたＴ細胞を患者に注入する（２８１３）。
患者はＴ細胞療法及びワクチン療法の療法を受けることができる。一実施形態では、患者は最初にワクチン療法を受け、その後、Ｔ細胞療法を受ける。このアプローチの利点の１つは、ワクチン療法により、検出可能なレベルのＴ細胞によって認識される腫瘍特異的Ｔ細胞の数及び新生抗原の数を増やすことができる点である。
別の実施形態では、患者はＴ細胞療法を受けた後、ワクチン療法を受けることができ、その場合、ワクチンに含まれるエピトープのセットは、Ｔ細胞療法のターゲットとなるエピトープのうちの１つ以上を含む。このアプローチの利点の１つは、ワクチンの投与によって治療Ｔ細胞の増殖及び持続を促進することができる点である。
ＸＸ．例示的なコンピュータ
図２９は、図１及び図３に示した実体を実施するための例示的なコンピュータ２９００を説明する。コンピュータ２９００は、チップセット２９０４に連結された少なくとも１つのプロセッサ２９０２を含む。チップセット２９０４は、メモリコントローラハブ２９２０及び入力／出力（Ｉ／Ｏ）コントローラハブ２９２２を含む。メモリ２９０６及びグラフィックスアダプタ２９１２は、メモリコントローラハブ２９２０に連結されており、ディスプレイ２９１８は、グラフィックスアダプタ２９１２に連結されている。記憶デバイス２９０８、入力装置２９１４、及びネットワークアダプタ２９１６は、Ｉ／Ｏコントローラハブ２９２２に連結されている。コンピュータ２９００の他の実施形態は、異なるアーキテクチャを有する。
記憶デバイス２９０８は、ハードドライブ、コンパクトディスク読み出し専用メモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）、ＤＶＤ、またはソリッドステートメモリ装置などの、非一時的なコンピュータ可読の記憶媒体である。メモリ２９０６は、プロセッサ２９０２によって使用される命令及びデータを保持する。入力インターフェイス２９１４は、タッチスクリーンインターフェイス、マウス、トラックボール、もしくは他のタイプのポインティングデバイス、キーボード、またはそれらのいくつかの組み合わせであり、データをコンピュータ２９００中に入力するために使用される。いくつかの実施形態において、コンピュータ２９００は、ユーザからのジェスチャーを介して、入力インターフェイス２９１４からの入力（例えば、コマンド）を受け取るように構成されていてもよい。グラフィックスアダプタ２９１２は、ディスプレイ２９１８上に画像及び他の情報を表示する。ネットワークアダプタ２９１６は、コンピュータ２９００を、１つ以上のコンピュータネットワークに連結する。
コンピュータ２９００は、本明細書に記載した機能性を提供するためのコンピュータプログラムモジュールを遂行するように適合している。本明細書において使用される場合、「モジュール」という用語は、特定の機能性を提供するために使用されるコンピュータプログラム論理を指す。したがって、モジュールは、ハードウェア、ファームウェア、及び／またはソフトウェアにおいて実行されることができる。一実施形態では、プログラムモジュールは、記憶デバイス２９０８に保存され、メモリ２９０６中にロードされ、プロセッサ２９０２によって遂行される。
図１の実体によって使用されるコンピュータ２９００のタイプは、実体によって必要とされる実施形態及びプロセシングパワーに応じて変動することができる。例えば、提示特定システム１６０は、単一のコンピュータ２９００、または、例えばサーバーファームにおいてネットワークを通して互いに通信する複数のコンピュータ２９００において、起動することができる。コンピュータ２９００は、グラフィックスアダプタ２９１２及びディスプレイ２９１８などの、上記の構成要素のうちのいくつかを欠いてもよい。
参考文献
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補足の表１
既存の応答による予測された変異のランク
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Figure 0007227237000094
補足の表２
ＮＳＣＬＳ患者の人口統計
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補足の表３
ＮＳＣＬＳ患者においてＴ細胞認識について試験したペプチド
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補足の表４
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陽性値は斜体で示す。* グランザイムB ELISA: ＤＭＳＯバックグラウンドよりも1.5倍以上高い値は陽性とみなした。# U-Plex MSD アッセイ:ＤＭＳＯバックグラウンドよりも1.5倍以上高い値は陽性とみなした。
補足の表５
ＩＶＳ対照実験におけるＴＳＮＡ及び感染症エピトープ
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補足の表６
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Claims (15)

  1. 腫瘍細胞の表面上に提示される可能性の高い、対象の1つ以上の腫瘍細胞に由来する1つ以上の新生抗原を特定するための方法であって、
    前記対象の前記腫瘍細胞及び正常細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記ヌクレオチドシークエンシングデータが、前記腫瘍細胞からの前記ヌクレオチドシークエンシングデータと前記正常細胞からの前記ヌクレオチドシークエンシングデータとを比較することにより特定された新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられ、各新生抗原のペプチド配列が、前記ペプチド配列を前記対象の前記正常細胞から特定される対応する野生型のペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を含む、前記取得する工程；
    前記新生抗原のそれぞれのペプチド配列を、対応する数値ベクトルにコード化する工程であって、各数値ベクトルが、前記ペプチド配列を構成する複数のアミノ酸と前記ペプチド配列内の前記アミノ酸の位置のセットとに関する情報を含む、前記コード化する工程；
    前記新生抗原のそれぞれのペプチド配列を、前記対象の前記ヌクレオチドシークエンシングデータの複数のｋマーブロックのうちの1つ以上のｋマーブロックと関連付ける工程；
    前記新生抗原のセットについて提示尤度のセットを生成するために、コンピュータプロセッサを使用して、前記数値ベクトル及び前記1つ以上の関連付けられたｋマーブロックを機械学習させた提示モデルに入力する工程であって、前記セット内の各提示尤度が、対応する新生抗原が1つ以上のＭＨＣアレルによって前記対象の前記腫瘍細胞の表面上に提示される尤度を表し、前記機械学習させた提示モデルが、
    訓練データセットに少なくとも基づいて特定される複数のパラメータであって、前記訓練データセットが、
    複数の試料の各試料について、前記試料中に存在するものとして特定されたＭＨＣアレルのセット内の少なくとも1つのＭＨＣアレルに結合したペプチドの存在を測定する質量分析によって得られた標識、
    前記試料のそれぞれについて、前記ペプチドを構成する複数のアミノ酸と前記ペプチド内の前記アミノ酸の位置のセットとに関する情報を含む数値ベクトルとしてコード化された訓練ペプチド配列、及び
    前記試料のそれぞれについて、前記試料の前記訓練ペプチド配列のそれぞれについて、前記訓練ペプチド配列と、前記訓練ペプチド配列の前記ヌクレオチドシークエンシングデータの複数のｋマーブロックのうちの1つ以上のｋマーブロックとの間の関連付け
    を含み、
    前記複数のパラメータのサブセットが、前記1つ以上のｋマーブロックにおける提示ホットスポットの有無を表す、前記複数のパラメータと、
    入力として受け取られた前記数値ベクトル及び前記1つ以上のｋマーブロックと、前記数値ベクトル、前記1つ以上のｋマーブロック、及び前記パラメータに基づいた出力として生成された前記提示尤度との間の関係を表す関数と
    を含む、
    前記入力する工程；
    選択された新生抗原のセットを生成するために、前記新生抗原のセットのサブセットを、前記提示尤度のセットに基づいて選択する工程；ならびに
    前記選択された新生抗原のセットを返す工程
    を含む、前記方法。
  2. 前記数値ベクトルを前記機械学習させた提示モデルに入力する工程が、
    前記ペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸に基づいてＭＨＣアレルが前記新生抗原を提示するかどうかを示す依存性スコアを前記1つ以上のＭＨＣアレルのそれぞれについて生成するために、前記機械学習させた提示モデルを前記新生抗原のペプチド配列に適用すること
    を含む、請求項1に記載の方法。
  3. 前記数値ベクトルを前記機械学習させた提示モデルに入力する工程が、各ＭＨＣアレルについて、対応するＭＨＣアレルが対応する新生抗原を提示するであろう尤度を示す対応するアレル毎尤度を生成するために、前記依存性スコアを変換することと、前記アレル毎尤度を組み合わせて前記新生抗原の提示尤度を生成することとをさらに含み、前記依存性スコアを変換することが、前記新生抗原の提示を前記1つ以上のＭＨＣアレルにわたって相互排他的なものとして、または前記1つ以上のＭＨＣアレル間で干渉するものとして、モデル化する、
    請求項2に記載の方法。
  4. 前記提示尤度のセットが、少なくとも1つ以上のアレル非相互作用特性によってさらに特定され、
    前記アレル非相互作用特性に基づいて前記対応する新生抗原のペプチド配列が提示されるかどうかを示す前記アレル非相互作用特性についての依存性スコアを生成するために、前記機械学習させた提示モデルを前記アレル非相互作用特性に適用すること
    をさらに含む、請求項2または3に記載の方法。
  5. (A) 前記1つ以上のＭＨＣアレルの各ＭＨＣアレルについての前記依存性スコアを、前記アレル非相互作用特性についての前記依存性スコアと組み合わせることと、
    対応するＭＨＣアレルが対応する新生抗原を提示する尤度を示す、各ＭＨＣアレルについてのアレル毎尤度を生成するために、各ＭＨＣアレルについての前記組み合わされた依存性スコアを変換することと、
    前記提示尤度を生成するために、前記アレル毎尤度を組み合わせることと
    をさらに含む；または
    (B) 前記ＭＨＣアレルのそれぞれについての前記依存性スコアと、前記アレル非相互作用特性についての前記依存性スコアとを組み合わせることと、
    前記提示尤度を生成するために、前記組み合わされた依存性スコアを変換することと
    をさらに含む、
    請求項4に記載の方法。
  6. 前記少なくとも1つ以上のアレル非相互作用特性が、前記新生抗原のペプチド配列と、前記新生抗原の前記ヌクレオチドシークエンシングデータの複数のｋマーブロックのうちの1つ以上のｋマーブロックとの間の関連付けを含む、請求項4または5に記載の方法。
  7. (A) 前記1つ以上のＭＨＣアレルが2つ以上の異なるＭＨＣアレルを含む；
    (B) 前記ペプチド配列が、アミノ酸9個以外の長さを有するペプチド配列を含む；
    (C) 前記ペプチド配列をコード化することが、ワン・ホットエンコーディングスキームを用いて前記ペプチド配列をコード化することを含む；
    (D) 前記複数の試料が、
    （ａ）単一のＭＨＣアレルを発現するように操作された1つ以上の細胞株、
    （ｂ）複数のＭＨＣアレルを発現するように操作された1つ以上の細胞株、
    （ｃ）複数の患者から得られた、または複数の患者に由来する1つ以上のヒト細胞株、
    （ｄ）複数の患者から得られた新鮮なまたは凍結された腫瘍試料、及び
    （ｅ）複数の患者から得られた新鮮なまたは凍結された組織試料
    のうちの少なくとも1つを含む；かつ／または
    (E) 前記訓練データセットが、
    （ａ）前記ペプチドのうちの少なくとも1つについてのペプチド－ＭＨＣ結合親和性の測定値に関連するデータ、及び
    （ｂ）前記ペプチドのうちの少なくとも1つについてのペプチド－ＭＨＣ結合安定性の測定値に関連するデータ
    のうちの少なくとも1つをさらに含む、
    請求項1～6のいずれか1項に記載の方法。
  8. (A) 前記提示尤度のセットが、ＲＮＡ－ｓｅｑまたは質量分析により測定される、前記対象における前記1つ以上のＭＨＣアレルの少なくとも発現レベルによってさらに特定される；
    (B) 前記提示尤度のセットが、
    （ａ）前記新生抗原のセット内の新生抗原と前記1つ以上のＭＨＣアレルとの間の予測される親和性、及び
    （ｂ）前記新生抗原コード化ペプチド－ＭＨＣ複合体の予測される安定性
    のうちの少なくとも1つを含む特性によってさらに特定される；かつ／または
    (C) 前記提示尤度のセットが、
    （ａ）そのソースタンパク質配列内の、前記新生抗原コード化ペプチド配列に隣接するＣ末端配列、及び
    （ｂ）そのソースタンパク質配列内の、前記新生抗原コード化ペプチド配列に隣接するＮ末端配列
    のうちの少なくとも1つを含む特性によってさらに特定される、
    請求項1～7のいずれか1項に記載の方法。
  9. 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、
    (A) 前記機械学習させた提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較して前記腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している新生抗原；
    (B) 前記機械学習させた提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較して前記対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している新生抗原；
    (C) 前記提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較してプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってナイーブＴ細胞に対して提示されることができる尤度が増大している新生抗原；
    (D) 前記機械学習させた提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較して中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している新生抗原；及び／または
    (E) 前記機械学習させた提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較して前記対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している新生抗原
    を選択することを含む、請求項1～8のいずれか1項に記載の方法。
  10. (A) 前記1つ以上の腫瘍細胞が、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｔ細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される；かつ／または
    (B) 前記方法が、前記選択された新生抗原のセットから個別化がんワクチンを構築するための出力を生成することをさらに含み、前記個別化がんワクチン用の出力が、前記選択された新生抗原のセットをコードした少なくとも1つのペプチド配列または少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、
    請求項1～9のいずれか1項に記載の方法。
  11. 前記機械学習させた提示モデルが、ニューラルネットワークモデルである、請求項1～10のいずれか1項に記載の方法。
  12. 前記ニューラルネットワークモデルがＭＨＣアレルについての複数のネットワークモデルを含み、それぞれのネットワークモデルが複数のＭＨＣアレルのうちの対応するＭＨＣアレルに割り当てられ、かつ1つ以上の層に配置された一連のノードを含む、請求項11に記載の方法。
  13. 前記機械学習させた提示モデルが、ノードの1つ以上の層を含むディープラーニングモデルである、請求項11または12に記載の方法。
  14. 前記1つ以上のＭＨＣアレルが、クラスＩ ＭＨＣアレルである、請求項1～13のいずれか1項に記載の方法。
  15. コンピュータプロセッサと、
    前記コンピュータプロセッサにより実行されると、前記コンピュータプロセッサに、
    対象の腫瘍細胞及び正常細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得することであって、前記ヌクレオチドシークエンシングデータが、前記腫瘍細胞からの前記ヌクレオチドシークエンシングデータと前記正常細胞からの前記ヌクレオチドシークエンシングデータとを比較することにより特定された新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられ、各新生抗原のペプチド配列が、前記ペプチド配列を前記対象の前記正常細胞から特定される対応する野生型のペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を含む、前記取得すること；
    前記新生抗原のそれぞれのペプチド配列を、対応する数値ベクトルにコード化することであって、各数値ベクトルが、前記ペプチド配列を構成する複数のアミノ酸と前記ペプチド配列内の前記アミノ酸の位置のセットとに関する情報を含む、前記コード化すること；
    前記新生抗原のそれぞれのペプチド配列を、前記対象の前記ヌクレオチドシークエンシングデータの複数のｋマーブロックのうちの1つ以上のｋマーブロックと関連付けること；
    前記新生抗原のセットについて提示尤度のセットを生成するために、前記数値ベクトル及び前記1つ以上の関連付けられたｋマーブロックを機械学習させた提示モデルに入力することであって、前記セット内の各提示尤度が、対応する新生抗原が1つ以上のＭＨＣアレルによって前記対象の前記腫瘍細胞の表面上に提示される尤度を表し、前記機械学習させた提示モデルが、
    訓練データセットに少なくとも基づいて特定される複数のパラメータであって、前記訓練データセットが、
    複数の試料の各試料について、前記試料中に存在するものとして特定されたＭＨＣアレルのセット内の少なくとも1つのＭＨＣアレルに結合したペプチドの存在を測定する質量分析によって得られた標識、
    前記試料のそれぞれについて、前記ペプチドを構成する複数のアミノ酸と前記ペプチド内の前記アミノ酸の位置のセットとに関する情報を含む数値ベクトルとしてコード化された訓練ペプチド配列、及び
    前記試料のそれぞれについて、前記試料の前記訓練ペプチド配列のそれぞれについて、前記訓練ペプチド配列と、前記訓練ペプチド配列の前記ヌクレオチドシークエンシングデータの前記ｋマーブロックのうちの1つ以上のｋマーブロックとの間の関連付け
    を含み、
    前記複数のパラメータのサブセットが、前記1つ以上のｋマーブロックにおける提示ホットスポットの有無を表す、前記複数のパラメータと、
    入力として受け取られた前記数値ベクトル及び前記1つ以上のｋマーブロックと、前記数値ベクトル、前記1つ以上のｋマーブロック、及び前記パラメータに基づいた出力として生成された前記提示尤度との間の関係を表す関数と
    を含む、
    前記入力すること；
    選択された新生抗原のセットを生成するために、前記新生抗原のセットのサブセットを、前記提示尤度のセットに基づいて選択すること；ならびに
    前記選択された新生抗原のセットを返すこと
    を行わせるコンピュータプログラム命令を格納したメモリと
    を含む、コンピュータシステム。
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