JP2020536553A - ホットスポットを利用した新生抗原の特定 - Google Patents
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Abstract
Description
一般に、特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、当業者により理解される通常の意味を有するものとして解釈されるものとする。特定の用語を、さらなる明確性を与えるために下記に定義する。通常の意味と与えられる定義との間に矛盾が存在する場合、与えられる定義が用いられるものとする。
本明細書では、腫瘍細胞の表面上に提示される確率の高い、対象の腫瘍細胞由来の新生抗原を特定するための方法を開示する。本方法は、対象の腫瘍細胞及び正常細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、及び/または全ゲノムのヌクレオチドシークエンシングデータを取得することを含む。このヌクレオチドシークエンシングデータを用いて新生抗原のセット内の各新生抗原のペプチド配列が取得される。新生抗原のセットは、腫瘍細胞からのヌクレオチドシークエンシングデータと、正常細胞からのヌクレオチドシークエンシングデータと比較することによって特定される。具体的には、新生抗原のセット内の各新生抗原のペプチド配列は、ペプチド配列を対象の正常細胞から特定された対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を含む。本方法は、新生抗原のセット内の各新生抗原のペプチド配列を対応する数値ベクトルにコード化することをさらに含む。各数値ベクトルは、ペプチド配列を構成するアミノ酸及びペプチド配列内のアミノ酸の位置を記述する情報を含む。本方法は、新生抗原のそれぞれのペプチド配列を、対象のヌクレオチドシークエンシングデータの複数のkマーブロックのうちの1つ以上のkマーブロックと関連付けることを含む。本方法は、機械学習させた提示モデルに数値ベクトル及び関連付けられたkマーブロックを入力することにより新生抗原のセット内の各新生抗原について提示尤度を生成することをさらに含む。各提示尤度は、対応する新生抗原が対象の腫瘍細胞の表面上のMHCアレルによって提示される尤度を表す。機械学習させた提示モデルは、複数のパラメータ及び関数を含む。複数のパラメータは、訓練データセットに基づいて特定される。訓練データセットは、複数の試料の中のそれぞれの試料について、その試料中に存在するものとして特定されたMHCアレルのセット内の少なくとも1つのMHCアレルに結合したペプチドの存在を測定する質量分析によって得られた標識と、ペプチドを構成するアミノ酸及び/またはペプチド内のアミノ酸の位置を記述する情報を含む数値ベクターとしてコード化された訓練ペプチド配列と、試料の訓練ペプチド配列のそれぞれについて、訓練ペプチド配列と、訓練ペプチド配列のヌクレオチドシークエンシングデータの複数のkマーブロックのうちの1つ以上のkマーブロックとの間の関連付けと、を含む。関数は、機械学習させた提示モデルによって入力として受け取られる数値ベクトル及び関連付けられたkマーブロックと、数値ベクトル、関連付けられたkマーブロック、及び複数のパラメータに基づいて機械学習させた提示モデルによって出力として生成される提示尤度との間の関係を表す。本方法は、選択された新生抗原のセットを生成するために新生抗原のセットのサブセットを提示尤度に基づいて選択すること、及び選択された新生抗原のセットを返すことをさらに含む。
また、ある特定の変異(例えば、がん細胞中に存在する変異またはアレル)の特定のための方法も、本明細書に開示する。特に、これらの変異は、がんを有する対象のがん細胞のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはエクソーム中に存在し得るが、対象由来の正常組織には存在し得ない。
新生抗原は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、新生抗原は、ポリペプチド配列をコードするRNA配列であることができる。ワクチンにおいて有用な新生抗原は、したがって、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むことができる。
また、特異的な免疫応答、例えば、腫瘍特異的な免疫応答を生じることができる免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物も、本明細書に開示する。ワクチン組成物は、典型的に、例えば、本明細書に記載した方法を用いて選択された多数の新生抗原を含む。ワクチン組成物はまた、ワクチンと呼ぶこともできる。
IV.A.1.すべての腫瘍サブクローンをカバーするペプチドのセットの決定
すべての、または大部分の腫瘍サブクローンによって提示されるものを意味するトランカルペプチド(truncal peptide)が、ワクチン中への包含について優先される53。任意で、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドがない場合、または、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドの数が、追加的な非トランカルペプチドをワクチンに含めることができるほど少ない場合には、腫瘍サブクローンの数及び同一性を推定すること、及びワクチンによってカバーされる腫瘍サブクローンの数を最大化するようにペプチドを選ぶことによって、さらなるペプチドを優先順位付けすることができる54。
上記の新生抗原フィルターのすべてを適用した後、ワクチン技術が対応できるよりも多くの候補新生抗原が、依然としてワクチン包含に利用可能である可能性がある。追加的に、新生抗原解析の種々の態様についての不確定度が残っている可能性があり、候補ワクチン新生抗原の様々な性状の間にトレードオフが存在する可能性がある。したがって、選択プロセスの各段階でのあらかじめ決定されたフィルターの代わりに、少なくとも以下の軸を有する空間に候補新生抗原を置き、積分アプローチを用いて選択を最適化する、積分多次元モデルを考えることができる。
1. 自己免疫または寛容のリスク(生殖細胞系列のリスク)(より低い自己免疫のリスクが、典型的に好ましい)
2. シークエンシングアーチファクトの確率(より低いアーチファクトの確率が、典型的に好ましい)
3. 免疫原性の確率(より高い免疫原性の確率が、典型的に好ましい)
4. 提示の確率(より高い提示の確率が、典型的に好ましい)
5. 遺伝子発現(より高い発現が、典型的に好ましい)
6. HLA遺伝子のカバレッジ(新生抗原のセットの提示に関与する、より多い数のHLA分子は、腫瘍が、HLA分子の下方制御または変異を介して免疫攻撃を回避する確率を低くする可能性がある)
7. HLAクラスのカバレッジ(HLA−I及びHLA−IIの両方をカバーすることで、治療応答の確率が高まり、腫瘍の免疫回避の確率が低くなる可能性がある)
本明細書に開示する方法を用いて特定された複数の新生抗原などの1つ以上の新生抗原を対象に投与することにより、対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導する、腫瘍に対するワクチン接種を行う、対象のがんの症状を治療及び/または緩和する方法も提供される。
VI.A.新生抗原候補の特定
腫瘍及び正常のエクソーム及びトランスクリプトームのNGS解析のための研究法を、新生抗原の特定のスペースに記載し、適用している6,14,15。下記の例は、臨床設定における新生抗原の特定について、より大きな感度及び特異性のためのある特定の最適化を考慮している。これらの最適化は、実験室プロセスに関連するもの及びNGSデータ解析に関連するものの、2つの区域にグループ化することができる。
本明細書に提示したプロセスの改善は、標的とされるがんパネルにおける信頼できるがんドライバー遺伝子の評価について開発された概念16を、新生抗原の特定のために必要な全エクソーム設定及び全トランスクリプトーム設定に拡大することによって、低い腫瘍含量及び少ない体積の臨床標本からの高精度の新生抗原の発見における難題に対処する。具体的には、これらの改善は、以下を含む:
1.低い腫瘍含量またはサブクローン状態のいずれかにより、低い変異体アレル頻度で存在する変異を検出するための、腫瘍エクソームにわたる深い(500xよりも大きい)固有の平均カバレッジのターゲティング。
2.可能性のある新生抗原の見逃しが最も少ないように、100x未満でカバーされる塩基が5%未満である、例として、
a. 個々のプローブQCを有するDNAベースの捕捉プローブの使用17
b.十分にカバーされていない領域についての追加的なベイトの包含
3.可能性のある新生抗原が体細胞性/生殖細胞系列ステータスについて分類されていないままである(したがってTSNAとして使用可能ではない)ことが最も少ないように、20x未満でカバーされる塩基が5%未満である、正常エクソームにわたる均一カバレッジのターゲティング。
4.必要とされるシークエンシングの総量を最小化するために、配列捕捉プローブは、非コードRNAは新生抗原を生じることができないことから、遺伝子のコード領域のみについて設計される。追加的な最適化は、以下を含む:
a.GCリッチであり、標準的なエクソームシークエンシングでは十分に捕捉されないHLA遺伝子についての補充的プローブ18。
b.不十分な発現、プロテアソームによる最適に満たない消化、または異例の配列特性などの要因により、候補新生抗原を少ししかまたは全く生成しないと予測される遺伝子の排除。
5.変異検出、遺伝子及びスプライス変異体(「アイソフォーム」)発現の定量、ならびに融合物検出を可能にするために、腫瘍RNAが同様に、高深度(100Mリードよりも大きい)でシークエンシングされる。FFPE試料由来のRNAは、DNAにおいてエクソームを捕捉するために使用されるのと同じまたは類似したプローブで、プローブベース濃縮19を用いて抽出される。
解析法の改善は、一般的な研究変異コーリングアプローチの最適に満たない感度及び特異性に対処し、具体的には、臨床設定における新生抗原の特定のために関連するカスタマイズ化を考慮する。これらは、以下を含む:
1.アラインメントのための、HG38参照ヒトゲノムまたはより後のバージョンの使用(それが、以前のゲノムリリースとは対照的に、集団多型をより良好に反映する複数のMHC領域アセンブリーを含有するため)。
2.様々なプログラム5からの結果をマージすることによる、単一変異コーラー20の限界の克服。
a.単一ヌクレオチド変異及び挿入欠失は、以下を含む一連のツールで、腫瘍DNA、腫瘍RNA、及び正常DNAから検出される:Strelka21及びMutect22などの、腫瘍及び正常DNAの比較に基づくプログラム;ならびに、低純度の試料において特に有利である23、UNCeqRなどの、腫瘍DNA、腫瘍RNA、及び正常DNAを組み入れるプログラム。
b.挿入欠失は、Strelka及びABRA24などの、局所リアセンブリーを行うプログラムで決定される。
c.構造的再編成は、Pindel25またはBreakseq26などの専用のツールを用いて決定される。
3.試料スワップを検出して阻止するために、同じ患者についての試料由来の変異コールが、選ばれた数の多型部位で比較される。
4.例として、以下による、人工的コールの広範囲のフィルタリングが行われる:
a.潜在的に、低いカバレッジの例においては緩やかな検出パラメータで、及び挿入欠失の例においては許容的な近接基準での、正常DNAにおいて見出される変異の除去。
b.低いマッピング品質または低い塩基品質による変異の除去27。
c.たとえ対応する正常において観察されないとしても、再出現するシークエンシングアーチファクトから生じる変異の除去27。例は、主として1本の鎖上に検出される変異を含む。
d.無関連の対照のセットにおいて検出される変異の除去27。
5.seq2HLA28、ATHLATES29、またはOptitypeのうちの1つを使用する、かつまた、エクソーム及びRNAシークエンシングデータを組み合わせる28、正常エクソームからの正確なHLAコーリング。追加的な潜在的最適化は、ロングリードDNAシークエンシングなどの、HLAタイピングのための専用アッセイの採用30、または、RNA断片を連結して連続性を保持するための方法の適応31を含む。
6.腫瘍特異的スプライス変異体から生じた新生ORFの堅牢な検出は、CLASS32、Bayesembler33、StringTie34、またはそのリファレンスガイドモードにおける類似したプログラム(すなわち、各実験からそれらの全体の転写産物を再作製するように試みるよりもむしろ、公知の転写産物構造を用いる)を用いて、RNA−seqデータから転写産物をアセンブルすることによって、行われる。Cufflinks35が、この目的で一般的に使用されるが、それは頻繁に、信じ難いほど多数のスプライス変異体を産生し、それらの多くは、完全長遺伝子よりもはるかに短く、単純な陽性対照をリカバーすることができない場合がある。コード配列及び潜在的なナンセンス変異依存分解機構は、変異体配列を再導入した、SpliceR36及びMAMBA37などのツールで決定される。遺伝子発現は、Cufflinks35またはExpress(Roberts and Pachter,2013)などのツールで決定される。野生型及び変異体特異的な発現カウント及び/または相対レベルは、ASE38またはHTSeq39などの、これらの目的で開発されたツールで決定される。潜在的なフィルタリング段階は、以下を含む:
a.不十分に発現されていると考えられる候補新生ORFの除去。
b.ナンセンス変異依存分解機構(NMD)を引き起こすと予測される候補新生ORFの除去。
7.腫瘍特異的と直接検証することができない、RNAにおいてのみ観察される候補新生抗原(例えば、新生ORF)は、例として以下を考慮することにより、追加的なパラメータにしたがって、腫瘍特異的である可能性が高いとして分類される:
a.腫瘍DNAのみのシス作用性フレームシフトまたはスプライス部位変異の支持の存在。
b.スプライシング因子における腫瘍DNAのみのトランス作用性変異の確証の存在。例として、R625変異体SF3B1での3つの独立して公開された実験において、最も差次的にスプライシングを呈する遺伝子は、1つの実験がブドウ膜黒色腫患者を検討し40、第2の実験がブドウ膜黒色腫細胞株を検討し41、及び第3の実験が乳がん患者を検討した42にもかかわらず、一致していた。
c.新規のスプライシングアイソフォームについては、RNASeqデータにおける「新規の」スプライス−ジャンクションリードの確証の存在。
d.新規の再編成については、正常DNAには存在しない腫瘍DNAにおけるエクソン近傍リードの確証の存在。
e.GTEx43などの遺伝子発現大要からの欠如(すなわち、生殖細胞系列起源の可能性をより低くする)。
8.アラインメント及びアノテーションベースのエラー及びアーチファクトを直接避けるために、アセンブルされたDNAの腫瘍及び正常リード(またはそのようなリード由来のkマー)を比較することによる、参照ゲノムアラインメントベースの解析の補完(例えば、生殖細胞系列変異またはリピートコンテクスト挿入欠失の近くに生じる体細胞性変異について)。
HLAペプチド分子の単離は、組織試料の溶解及び可溶化後に、古典的な免疫沈降(IP)法を用いて行った55〜58。清澄化した溶解物を、HLA特異的IPに使用した。
ペプチドYVYVADVAAKを用いて、何が検出の限界かを、LCカラム上にロードした様々な量のペプチドを用いて決定した。試験したペプチドの量は、1pmol、100fmol、10fmol、1fmol、及び100amolであった。(表1)結果を図1Fに示す。これらの結果は、検出の最低限界(LoD)がアトモルの範囲(10−18)にあること、ダイナミックレンジが5桁に及ぶこと、及び、シグナル対ノイズが、低いフェムトモル範囲(10−15)でシークエンシングに十分であるように見えることを示す。
VII.A.システムの概要
図2Aは、1つの実施形態にしたがう、患者におけるペプチド提示の尤度を特定するための環境100の概要である。環境100は、それ自体が提示情報記憶装置165を含む提示特定システム160を導入するコンテキストを提供する。
図2は、1つの実施形態にしたがう、提示情報を取得する方法を説明する。提示情報165は、2つの一般的部類の情報:アレル相互作用情報及びアレル非相互作用情報を含む。アレル相互作用情報は、MHCアレルのタイプに依存する、ペプチド配列の提示に影響を及ぼす情報を含む。アレル非相互作用情報は、MHCアレルのタイプに非依存的な、ペプチド配列の提示に影響を及ぼす情報を含む。
アレル相互作用情報は、主として、ヒト、マウスなど由来の1つ以上の特定されたMHC分子によって提示されていることが公知である、特定されたペプチド配列を含む。注目すべきことに、これは、腫瘍試料から取得されたデータを含んでもよく、または含まなくてもよい。提示されたペプチド配列は、単一のMHCアレルを発現する細胞から特定されてもよい。この例において、提示されたペプチド配列は、概して、あらかじめ決定されたMHCアレルを発現するように操作されてその後合成タンパク質に曝露された単一アレル細胞株から収集される。MHCアレル上に提示されたペプチドは、酸溶出などの技法によって単離され、質量分析により特定される。図2Bは、あらかじめ決定されたMHCアレルHLA−DRB1*12:01上に提示された例示的なペプチド
が単離され、質量分析により特定される、この例を示す。この状況においては、ペプチドが、単一のあらかじめ決定されたMHCタンパク質を発現するように操作された細胞を通して特定されるため、提示されたペプチドとそれが結合したMHCタンパク質との間の直接の関連が、決定的に既知である。
が、特定されたクラスI MHCアレルHLA−A*01:01、HLA−A*02:01、HLA−B*07:02、HLA−B*08:01、及びクラスII MHCアレルHLA−DRB1*10:01、HLA−DRB1:11:01上に提示されており、単離され、質量分析により特定される、この例を示す。単一アレル細胞株とは対照的に、結合したペプチドが、特定される前のMHC分子から単離されるため、提示されたペプチドとそれが結合したMHCタンパク質との間の直接の関連は、未知である可能性がある。
アレル非相互作用情報は、そのソースタンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するC末端配列を含むことができる。MHC−Iでは、C末端フランキング配列は、ペプチドのプロテアソームプロセシングに影響を及ぼし得る。しかし、C末端フランキング配列は、ペプチドが小胞体に輸送され、細胞の表面上のMHCアレルと遭遇する前に、プロテアソームによってペプチドから切断される。その結果、MHC分子は、C末端フランキング配列についてのいかなる情報も受け取らず、したがって、C末端フランキング配列の効果は、MHCアレルタイプに応じて変動することができない。例えば、図2Cに示した例に戻ると、提示情報165は、ペプチドのソースタンパク質から特定された、提示されたペプチドFJIEJFOESSのC末端フランキング配列FOEIFNDKSLDKFJIを含み得る。
i.EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異。
ii.抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、B2M、HLA−A、HLA−B、HLA−C、TAP−1、TAP−2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA−DM、HLA−DMA、HLA−DMB、HLA−DO、HLA−DOA、HLA−DOBHLA−DP、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DQ、HLA−DQA1、HLA−DQA2、HLA−DQB1、HLA−DQB2、HLA−DR、HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか)におけるもの。その提示が、腫瘍において機能喪失変異の影響下にある抗原提示マシナリーの構成要素に依拠するペプチドは、提示の確率が低減している。
i.抗原提示マシナリーに関与するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、B2M、HLA−A、HLA−B、HLA−C、TAP−1、TAP−2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA−DM、HLA−DMA、HLA−DMB、HLA−DO、HLA−DOA、HLA−DOBHLA−DP、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DQ、HLA−DQA1、HLA−DQA2、HLA−DQB1、HLA−DQB2、HLA−DR、HLA−DRA、HLA−DRB1、HLA−DRB3、HLA−DRB4、HLA−DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか)におけるもの。
図3は、1つの実施形態による、提示特定システム160のコンピュータ論理構成要素を説明する、ハイレベルブロック図である。この例示的実施形態において、提示特定システム160は、データ管理モジュール312、コード化モジュール314、訓練モジュール316、及び予測モジュール320を含む。提示特定システム160はまた、訓練データ記憶装置170及び提示モデル記憶装置175から構成される。モデル管理システム160のいくつかの実施形態は、本明細書に記載したものとは異なるモジュールを有する。同様に、機能は、本明細書に記載したものは異なる様式で、モジュールの間に分配され得る。
データ管理モジュール312は、提示情報165から訓練データ170のセットを生成する。各々の訓練データのセットは、多数のデータ例を含有し、各データ例iは、少なくとも、提示されるかまたは提示されないペプチド配列piと、ペプチド配列piと結合した1つ以上の関連するMHCアレルaiと、提示特定システム160が、独立変数の新たな値を予測することに関心があるという情報を表す従属変数yiとを含む、独立変数ziのセットを含有する。
からのペプチド提示情報を示す。訓練データ170A中の4番目のデータ例は、アレルHLA−B*07:02、HLA−C*01:03、HLA−A*01:01を含む複数アレル細胞株、及びペプチド配列QIEJOEIJEからのペプチド情報を示す。最初のデータ例は、ペプチド配列QCEIOWAREが、アレルHLA−DRB3:01:01によって提示されなかったことを示す。前の2つの段落において議論したように、ネガティブ標識されたペプチド配列は、データ管理モジュール312によってランダムに生成されてもよく、または提示されるペプチドのソースタンパク質から特定されてもよい。訓練データ170Aはまた、ペプチド配列−アレルペアについて、1000nMの結合親和性予測値及び1時間の半減期の安定性予測値も含む。訓練データ170Aはまた、ペプチドFJELFISBOSJFIEのC末端フランキング配列、及び102TPMのmRNA定量測定値などの、アレル非相互作用変数も含む。4番目のデータ例は、ペプチド配列QIEJOEIJEが、アレルHLA−B*07:02、HLA−C*01:03、またはHLA−A*01:01のうちの1つによって提示されたことを示す。訓練データ170Aはまた、アレルの各々についての結合親和性予測値及び安定性予測値、ならびに、ペプチドのC末端フランキング配列及びペプチドについてのmRNA定量測定値も含む。
コード化モジュール314は、訓練データ170に含有される情報を、1つ以上の提示モデルを生成するために使用することができる数値的表示へとコード化する。一実現形態では、コード化モジュール314は、配列(例えば、ペプチド配列またはC末端フランキング配列)を、あらかじめ決定された20文字のアミノ酸アルファベットについて、ワン・ホットでコード化する。具体的には、ki個のアミノ酸を有するペプチド配列piは、20・ki要素の行ベクトルとして表され、ペプチド配列のj番目の位置のアミノ酸のアルファベットに対応するpi 20・(j−1)+1,pi 20・(j−1)+2,...,pi 20・jの中の単一要素は、1の値を有する。その以外の、残りの要素は、0の値を有する。例として、所定のアルファベット{A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y}について、データ例iの3個のアミノ酸のペプチド配列EAFは、60個の要素の行ベクトル
によって表され得る。C末端フランキング配列ci、ならびに、MHCアレルについてのタンパク質配列dh、及び提示情報における他の配列データは、同様に、上記のようにコード化することができる。
によって表され得る。C末端フランキング配列ciまたは他の配列データは、同様に、上記のようにコード化することができる。したがって、ペプチド配列piまたはciにおける各々の独立変数または列は、配列の特定の位置の特定のアミノ酸の存在を表す。
(ただし、
は指標関数であり、Lkはペプチドpkの長さを意味する)として表す。ベクトルTkを、アレル相互作用変数xh iに含めることができる。別の例では、クラスIIのMHC分子によって提示されるペプチドについて、コード化モジュール314はペプチド長をベクトル
(ただし、
は指標関数であり、Lkはペプチドpkの長さを意味する)として表す。ベクトルTkを、アレル相互作用変数xh iに含めることができる。
訓練モジュール316は、ペプチド配列に関連するMHCアレルによってペプチド配列が提示されるかどうかの尤度を生成する、1つ以上の提示モデルを構築する。具体的には、ペプチド配列pk及びペプチド配列pkに関連するMHCアレルakのセットを与えられ、各提示モデルは、ペプチド配列pkが、関連するMHCアレルakのうちの1つ以上によって提示されるであろう尤度を示す、推定値ukを生成する。
訓練モジュール316は、165に保存された提示情報から生成された、記憶装置170に保存された訓練データセットに基づいて、1つ以上の提示モデルを構築する。概して、提示モデルの具体的なタイプに関わらず、提示モデルのすべては、損失関数が最小化されるように、訓練データ170における独立変数と従属変数との間の依存性を捕捉する。具体的には、損失関数
は、訓練データ170における1つ以上のデータ例Sについての従属変数yi∈Sの値と、提示モデルによって生成されたデータ例Sについての推定された尤度ui∈Sとの間の矛盾を表す。本明細書の残りの部分を通じて言及される1つの特定の実現形態において、損失関数
は、以下のような等式(1a)によって与えられる負のlog尤度関数である。
しかし、実際には、別の損失関数が使用されてもよい。例えば、質量分析イオン電流について予測がなされる場合、損失関数は、以下のような等式1bによって与えられる平均二乗損失である。
を最小化するパラメトリックタイプの提示モデルの種々のパラメータは、例えば、バッチ勾配アルゴリズム、確率的勾配アルゴリズムなどの、勾配ベースの数値的最適化アルゴリズムを通して決定される。あるいは、提示モデルは、モデル構造が、訓練データ170から決定され、固定されたパラメータのセットに厳密には基づかない、ノンパラメトリックモデルであり得る。
訓練モジュール316は、アレル毎ベースでペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルを構築し得る。この例において、訓練モジュール316は、単一のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170におけるデータ例Sに基づいて、提示モデルを訓練し得る。
によって、特定のアレルhについてのペプチドpkの推定提示尤度ukをモデル化し、ただし、ペプチド配列xh kは、ペプチドpk及び対応するMHCアレルhについてのコード化されたアレル相互作用変数を意味し、f(・)は、任意の関数であり、記載の便宜上、本明細書中を通して変換関数と呼ばれる。さらに、gh(・)は、任意の関数であり、記載の便宜上、本明細書中を通して依存性関数と呼ばれ、MHCアレルhについて決定されたパラメータθhのセットに基づいて、アレル相互作用変数xh kについての依存性スコアを生成する。各MHCアレルhについてのパラメータθhのセットの値は、θhに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、ここでiは、単一のMHCアレルhを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。
によって与えられるexpit関数である。
別の例として、f(・)はまた、ドメインzの値が0以上である場合、
によって与えられる双曲線正接関数であることもできる。あるいは、予測が、範囲[0,1]の外側の値を有する質量分析イオン電流についてなされる場合、f(・)は、例えば、恒等関数、指数関数、log関数などの任意の関数であることができる。
本明細書を通して言及される1つの特定の実現形態において、依存性関数gh(・)は、xh kにおける各アレル相互作用変数を、関連するMHCアレルhについて決定されたパラメータθhのセットにおける対応するパラメータと線形結合する、
によって与えられるアフィン関数である。
によって与えられるネットワーク関数である。ノードは、パラメータθhのセットにおける関連するパラメータを各々有する接続を通して、他のノードに接続され得る。1つの特定のノードでの値は、特定のノードに関連する活性化関数によってマッピングされた関連するパラメータによって重み付けられた、特定のノードに接続されたノードの値の和として表され得る。アフィン関数と対照的に、ネットワークモデルは、提示モデルが非線形性、及び異なる長さのアミノ酸配列を有するプロセスデータを組み入れることができるため、有利である。具体的には、非線形モデリングを通して、ネットワークモデルは、ペプチド配列中の異なる位置のアミノ酸間の相互作用、及びこの相互作用がペプチド提示にいかに影響を及ぼすかを捕捉することができる。
として表すことができ、式中、g’h(xh k;θ’h)は、パラメータθ’hのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、MHCアレルhについての提示のベースライン確率を表す、MHCアレルのアレル相互作用変数についてのパラメータのセットにおけるバイアスパラメータθh 0を伴う。
によって生成することができ、式中、x3 kは、MHCアレルh=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ3は、損失関数最小化を通してMHCアレルh=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、x3 kは、MHCアレルh=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ3は、MHCアレルh=3に関連するネットワークモデルNN3(・)について決定されたパラメータのセットである。
一実現形態では、訓練モジュール316は、アレル非相互作用変数を組み入れて、
によって、ペプチドpkの推定提示尤度ukをモデル化し、式中、wkは、ペプチドpkについてのコード化されたアレル非相互作用変数を意味し、gw(・)は、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータθwのセットに基づく、アレル非相互作用変数wkについての関数である。具体的には、各MHCアレルhについてのパラメータθhのセット及びアレル非相互作用変数についてのパラメータθwのセットの値を、θh及びθwに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。
によって与えられ得る。
アレル相互作用変数についての依存性関数gh(・)と同様に、アレル非相互作用変数についての依存性関数gw(・)は、アフィン関数、または別々のネットワークモデルがアレル非相互作用変数wkに関連しているネットワーク関数であり得る。
によって与えられるネットワーク関数である。ネットワーク関数は、異なるアレル非相互作用変数をそれぞれが入力として取る1つ以上のネットワークモデルを含んでもよい。
によって与えられ得、式中、g’w(wk;θ’w)は、アレル非相互作用パラメータθ’wのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、mkは、ペプチドpkについてのmRNA定量測定値であり、h(・)は、定量測定値を変換する関数であり、かつθw mは、mRNA定量測定値についての依存性スコアを生成するようにmRNA定量測定値と組み合わされる、アレル非相互作用変数についてのパラメータのセットにおけるパラメータである。本明細書の残りの部分を通じて言及される1つの特定の実施形態において、h(・)はlog関数であるが、実際には、h(・)は、様々な異なる関数のうちのいずれか1つであり得る。
によって与えられ、式中、g’w(wk;θ’w)は、アレル非相互作用パラメータθ’wのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、okは、ペプチドpkについてヒトプロテオームにおけるタンパク質及びアイソフォームを表す、セクションVII.C.2で述べた指標ベクトルであり、かつθw oは、指標ベクトルと組み合わされるアレル非相互作用変数についてのパラメータのセットにおける、パラメータのセットである。1つのバリエーションにおいて、ok及びパラメータθw oのセットの次元が有意に高い場合、
(
は、L1ノルム、L2ノルム、組み合わせなどを表す)などのパラメータ正則化項を、パラメータの値を決定する時に損失関数に加えることができる。ハイパーパラメータλの最適値を、適切な方法を通して決定することができる。
ただし、g’w(wk;θ’w)は、アレル非相互作用パラメータθ’wのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、
は、ペプチドpkがアレル非相互作用変数に関して上記に述べたソース遺伝子lに由来するものである場合に1に等しいインジケータ関数であり、θw lはソース遺伝子lの「抗原性」を示すパラメータである。1つのバリエーションにおいて、Lが充分に大きく、したがって、パラメータの数θw l=1, 2,...,Lが充分に大きい場合、
のようなパラメータ正則化項(ただし、
は、L1ノルム、L2ノルム、組み合わせなど)をパラメータの値を決定する際に損失関数に加えることができる。ハイパーパラメータλの最適値は適当な方法によって決定することができる。
ただし、g’w(wk;θ’w)は、アレル非相互作用パラメータθ’wのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、
は、アレル非相互作用変数に関して上記に述べたようにペプチドpkがソース遺伝子lに由来するものである場合、かつペプチドpkが組織タイプmに由来するものである場合に1に等しいインジケータ関数であり、θw lmはソース遺伝子lと組織タイプmとの組み合わせの抗原性を示すパラメータである。詳細には、組織タイプmの遺伝子lの抗原性は、組織タイプmの細胞が、RNA発現及びペプチド配列コンテキストについての調節後に遺伝子l由来のペプチドを提示する残留傾向を示し得る。
のようなパラメータ正則化項(ただし、
は、L1ノルム、L2ノルム、組み合わせなど)をパラメータの値を決定する際に損失関数に加えることができる。ハイパーパラメータλの最適値は適当な方法によって決定することができる。別のバリエーションにおいて、同じソース遺伝子に対する係数が組織タイプ間で大きく異ならないように、パラメータの値を決定する際にパラメータ正則化項を損失関数に加えることができる。例えば、以下のようなペナルティ項:
(ただし、
はソース遺伝子lの組織タイプにわたった平均の抗原性である)は、損失関数中の異なる組織タイプにわたった抗原性の標準偏差にペナルティを付加することができる。
式中、g’w(wk;θ’w)はアフィン関数であり、アレル非相互作用パラメータのセットθ’wなどを伴うネットワーク関数
は、ペプチドpkがアレル非相互作用変数に関して上記に述べたソース遺伝子l 由来のものである場合に1に等しいインジケータ関数であり、θw lは、ソース遺伝子lの「抗原性」を示すパラメータであり、
は、ペプチドpkがプロテオーム位置 mからのものである場合に1に等しいインジケータ関数であり、θw mは、プロテオーム位置mが提示「ホットスポット」である程度を示すパラメータである。一実施形態では、プロテオーム位置は、同じタンパク質からのn個の隣接するペプチドのブロックを含んでよく、nは、グリッドサーチ交差検証などの適当な方法により決定されるモデルのハイパーパラメータである。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
訓練モジュール316はまた、2つ以上のMHCアレルが存在する複数アレル設定においてペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルを構築し得る。この例において、訓練モジュール316は、単一のMHCアレルを発現する細胞、複数のMHCアレルを発現する細胞、またはそれらの組み合わせから生成された訓練データ170におけるデータ例Sに基づいて、提示モデルを訓練し得る。
一実現形態では、訓練モジュール316は、複数のMHCアレルHのセットに関連したペプチドpkの推定提示尤度ukを、等式(2)〜(11)と共に上記で説明したような、単一アレルを発現する細胞に基づいて決定されたセットHにおけるMHCアレルhの各々について決定された提示尤度
の関数としてモデル化する。具体的には、提示尤度ukは、
の任意の関数であることができる。一実現形態では、等式(12)に示すように、関数は最大値関数であり、提示尤度ukは、セットHにおける各MHCアレルhについての提示尤度の最大値として決定することができる。
一実現形態では、訓練モジュール316は、ペプチドpkの推定提示尤度ukを、
によってモデル化し、式中、要素ah kは、ペプチド配列pkに関連する複数のMHCアレルHについて1であり、xh kは、ペプチドpk及び対応するMHCアレルについてのコード化されたアレル相互作用変数を意味する。各MHCアレルhについてのパラメータθhのセットの値は、θhに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。依存性関数ghは、セクションVIII.B.1.において上記で導入された依存性関数ghのいずれかの形態であり得る。
によって生成することができ、式中、x2 k、x3 kは、MHCアレルh=2、h=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、NN2(・)、NN3(・)は、MHCアレルh=2、h=3について特定されたネットワークモデルであり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
一実現形態では、訓練モジュール316は、アレル非相互作用変数を組み入れて、
によって、ペプチドpkの推定提示尤度ukをモデル化し、式中、wkは、ペプチドpkについてのコード化されたアレル非相互作用変数を意味する。具体的には、各MHCアレルhについてのパラメータθhのセット及びアレル非相互作用変数についてのパラメータθwのセットの値を、θh及びθwに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。依存性関数gwは、セクションVIII.B.3.において上記で導入された依存性関数gwのいずれかの形態であり得る。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって与えられ得る。
別の実現形態において、訓練モジュール316は、ペプチドpkの推定提示尤度ukを、
によってモデル化し、式中、要素ah kは、ペプチド配列pkに関連する複数のMHCアレルh∈Hについて1であり、u’k hは、MHCアレルhについての暗黙のアレル毎提示尤度であり、ベクトルvは、要素vhが、ah k・u’k hに対応するベクトルであり、s(・)は、vの要素をマッピングする関数であり、かつr(・)は、入力の値を所定の範囲中にクリップするクリッピング関数である。より詳細に下記に記載するように、s(・)は、総和関数または二次関数であってもよいが、他の実施形態において、s(・)は、最大値関数などの任意の関数であり得ることが認識される。暗黙のアレル毎尤度についてのパラメータθのセットの値は、θに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。
r(z)=min(max(z,0),1)
であってもよく、zと1の間の最小値が、提示尤度ukとして選ばれる。別の実現形態において、r(・)は、
r(z)=tanh(z)
として与えられる双曲線正接関数であり、ドメインzの値は、0以上である。
によって生成することができ、式中、x2 k、x3 kは、MHCアレルh=2、h=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、NN2(・)、NN3(・)は、MHCアレルh=2、h=3について特定されたネットワークモデルであり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
1つの実現形態では、MHCアレルhについての暗黙のアレル毎提示尤度を、
によって生成して、提示尤度が、
によって生成されるようにして、ペプチド提示に、アレル非相互作用変数の影響を組み入れる。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
一実現形態では、s(・)は、二次関数であり、ペプチドpkの推定提示尤度ukは、
によって与えられ、式中、要素u’k hは、MHCアレルhについての暗黙のアレル毎提示尤度である。暗黙のアレル毎尤度についてのパラメータθのセットの値は、θに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞及び/または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。暗黙のアレル毎提示尤度は、上記の等式(18)、(20)、及び(22)において示すいずれかの形態であり得る。
によって生成することができ、式中、x2 k、x3 kは、HLAアレルh=2、h=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ2、θ3は、HLAアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
によって生成することができ、式中、NN2(・)、NN3(・)は、HLAアレルh=2、h=3について特定されたネットワークモデルであり、θ2、θ3は、HLAアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
予測モジュール320は、配列データを受け取って、提示モデルを用いて配列データ中の候補新生抗原を選択する。具体的には、配列データは、患者の腫瘍組織細胞から抽出されたDNA配列、RNA配列、及び/またはタンパク質配列であってよい。予測モジュール320は、配列データを、MHC−Iについては8〜15個のアミノ酸を有する、またはMHC−IIについては6〜30個のアミノ酸を有する複数のペプチド配列pkに処理する。例えば、予測モジュール320は、所定の配列IEFROEIFJEFを、9個のアミノ酸を有する3種類のペプチド配列
に処理することができる。一実施形態では、予測モジュール320は、患者の正常組織細胞から抽出された配列データをその患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データと比較して1つ以上の変異を有する部分を特定することによって、変異したペプチド配列である候補新生抗原を特定することができる。
患者選択モジュール324は、患者が選択基準を満たすかどうかに基づいてワクチン治療及び/またはT細胞療法に対する患者のサブセットを選択する。一実施形態では、選択基準は、提示モデルによって生成される患者の新生抗原候補の提示尤度に基づいて決定される。選択基準を調整することにより、患者選択モジュール324は、患者の新生抗原候補の提示尤度に基づいてワクチン投与及び/またはT細胞療法を受ける患者数を調整することができる。具体的には、厳密な選択基準では、ワクチン及び/またはT細胞療法によって治療される患者の数はより少なくなるが、有効な治療(例えば、1つ以上の腫瘍特異的新生抗原(TSNA)及び/または1つ以上の新生抗原応答性T細胞)を受けるワクチン及び/またはT細胞療法による治療患者の比率は高くなり得る。これに対して、緩い選択基準では、ワクチン及び/またはT細胞療法で治療される患者の数はより多くなるが、有効な治療を受けるワクチン及び/またはT細胞療法による治療患者の比率は低くなり得る。患者選択モジュール324は、治療を受ける患者の目標比率と、有効な治療を受ける患者の比率との間の所望のバランスに基づいて選択基準を変更する。
一実施形態では、患者に、ワクチン容量vを有するその患者に対する個別化ワクチンに潜在的に含ませることが可能なv個の新生抗原候補の対応する治療サブセットが関連付けられる。一実施形態では、ある患者に対する治療サブセットは、提示モデルによって決定される最も高い提示尤度を有する新生抗原候補である。例えば、ワクチンがv=20個のエピトープを含み得る場合、ワクチンは、提示モデルによって決定される最も高い提示尤度を有する各患者の治療サブセットを含み得る。しかしながら、他の実施形態では、ある患者に対する治療サブセットは、他の方法に基づいて決定することもできる点は認識される。例えば、ある患者に対する治療サブセットは、その患者に対する新生抗原候補のセットからランダムに選択することができ、または、ペプチド配列の結合親和性もしくは安定性をモデル化する従来技術のモデル、または提示モデルから得られる提示尤度及びこれらのペプチド配列に関する親和性または安定性情報を含む特定の因子の組み合わせに一部基づいて決定することができる。
である。
提示される新生抗原の期待数は、各新生抗原候補の提示尤度の総和により与えられる。換言すれば、患者iの効用値スコアは、
として表される。
患者選択モジュール324は、ワクチン治療について最小効用値に等しいかまたはそれよりも高い効用値スコアを有する患者のサブセットを選択する。
であり、式中、PBD(・)は、ポアソン二項分布を示す。少なくとも閾値数の新生抗原kが提示される確率は、提示抗原の数Niがkに等しいかまたはそれよりも大きい確率の操作によって与えられる。換言すれば、患者iの効用値スコアは、
として表される。
患者選択モジュール324は、ワクチン治療について最小効用値に等しいかまたはそれよりも高い効用値スコアを有する患者のサブセットを選択する。
別の実施形態では、ワクチン治療を受けることに代えて、またはそれに加えて、患者はT細胞療法を受けることができる。ワクチン治療と同様、患者がT細胞療法を受ける実施形態では、患者を上記に述べたようなv個の新生抗原候補の対応する治療サブセットと関連付けることができる。このv個の新生抗原候補の治療サブセットを、v個の新生抗原候補のうちの1つ以上に対する反応性を有する、患者由来のT細胞のインビトロでの特定に用いることができる。次に、これらの特定されたT細胞を増殖させて個別化T細胞療法において患者に注入することができる。
セクションXで述べた患者選択の妥当性を、質量分析データにおいてシミュレートした新生抗原のサブセットが提示されていることが分かっている、シミュレートした新生抗原候補の試験セットがそれぞれに関連付けられたシミュレートした患者のセットで患者の選択を行うことにより検証する。詳細には、試験セット内のそれぞれのシミュレートした新生抗原候補に、その新生抗原がバッサーニ−スターンバーグデータセット(データセット「D1」)(データは、www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD0000394にみることができる)からの複数アレルJY細胞株HLA−A*02:01及びHLA−B*07:02の質量分析データセットにおいて提示されているかどうかを示すラベルを関連付ける。図13Aとともに下記に詳細に述べるように、シミュレートした患者について多数の新生抗原候補を、非小細胞肺癌(NSCLC)患者における変異負荷の既知の度数分布に基づいてヒトプロテオームからサンプリングする。
図13Aは、NSCLC患者における変異負荷の標本度数分布を示す。NSCLCを含む異なる腫瘍タイプにおける変異負荷及び変異は、例えば、がんゲノムアトラス(the cancer genome atlas)(TCGA) (https://cancergenome.nih.gov)にみることができる。X軸は各患者の非同義変異の数を表し、Y軸は特定の数の非同義変異を有する標本患者の比率を表す。図13Aの標本度数分布は、3〜1786個の変異の範囲を示し、患者の30%は100個よりも少ない変異を有している。図13Aには示されていないが、変異負荷は非喫煙者と比較して喫煙者でより高く、変異負荷が患者における新生抗原負荷の強力な指標となり得ることが研究によって示されている。
図13Bは、患者が最小変異負荷を満たすかどうかの選択基準に基づいて選択された患者に対してシミュレートしたワクチン中の提示新生抗原の数を示す。対応する試験において少なくとも特定の数の提示新生抗原を有する選択された患者の比率を特定する。
図13Cは、提示モデルに基づいて特定された治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた選択された患者と、従来技術のモデルによって特定された治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた選択された患者との間のシミュレートしたワクチン中の提示新生抗原の数を比較したものである。左側のプロットは、限定的なワクチン容量としてv=10を仮定しており、右側のプロットは限定的なワクチン容量としてv=20を仮定している。患者は、提示された新生抗原の期待数を示す効用値スコアに基づいて選択される。
図13Dは、HLA−A*02:01についての単一アレル毎提示モデルに基づいて特定された治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた選択された患者と、HLA−A*02:01及びHLA−B*07:02についてのアレル毎提示モデルの両方に基づいて特定された治療サブセットを含むワクチンに関連付けられた選択された患者との間のシミュレートしたワクチン中の提示新生抗原の数を比較したものである。ワクチン容量は、v=20個のエピトープに設定する。各実験について、異なる治療サブセットに基づいて決定された期待効用値スコアに基づいて患者を選択する。
図13Eは、変異負荷に基づいて選択された患者と、期待効用値スコアにより選択された患者との間でシミュレートしたワクチン中の提示新生抗原の数を比較したものである。期待効用値スコアは、v=20個のエピトープのサイズを有する提示モデルにより特定された治療サブセットに基づいて決定する。
腫瘍細胞によるHLAペプチド提示は抗腫瘍免疫における主要な必要条件であるため91,96,97、ペアリングしたクラスI HLAペプチド配列、HLA型、及びトランスクリプトームRNA−seq(方法)を含むヒト腫瘍及び正常組織試料の大規模な(N=74人の患者)統合データセットを、ヒトのがんにおける抗原提示を予測するためにこれらのデータ及び公表されているデータ92,98,99を用いて新規なディープラーニングモデルを訓練する100ことを目的として生成した。免疫療法の開発用の対象とするいくつかの腫瘍タイプの中から組織の入手しやすさに基づいて試料を選択した。質量分析によって、試料当たり平均で3704種のペプチドが、0.1未満のペプチドレベルFDRで特定された(344〜11301種の範囲)。これらのペプチドは、アミノ酸8〜15個の長さであり、モーダル長さ9(ペプチドの56%)の特徴的なクラスI HLA長の分布に従った。従来の報告と一致して、ペプチドの大部分(中央値79%)が、MHCflurryにより、標準的な500nMの親和性閾値で少なくとも1つの患者のHLAアレルに結合することが予測された90が、試料間でかなりのばらつきがみられた(例えば、1つの試料ではペプチドの33%で予測された親和性は500nM超であった)。一般的に用いられる101「強い結合物質」の閾値である50nMは、提示されたペプチドのわずか42%の中央値しか捕捉しなかった。トランスクリプトームシークエンシングでは、試料当たり平均で131Mの固有のリードが得られ、遺伝子の68%が少なくとも1つの試料で少なくとも1TPM(transcript per million)のレベルで発現され、これは、最大数の遺伝子の発現が観察されるように設定された大規模かつ多様な試料の価値を強調するものである。HLAによるペプチド提示は、mRNA発現と強い相関があった。RNA発現または配列のみにおける差異によって説明されるよりも大きな、顕著でかつ再現可能なペプチド提示の割合の差異が遺伝子間で観察された。観察されたHLA型は、主としてヨーロッパ系の祖先を有する患者群由来の試料についての予想と一致した。
HLA提示をモデル化するうえで提示ホットスポットパラメータを用いることの利点を具体的に評価するため、提示ホットスポットパラメータを組み込んだニューラルネットワーク提示モデルの性能を、提示ホットスポットパラメータを組み込まないニューラルネットワーク提示モデルの性能と比較した。基本のニューラルネットワークアーキテクチャは両方のモデルで同じであり、セクションVIIで上記に述べた提示モデルと同じであった。簡単に述べると、モデルは、ペプチド及びフランキングアミノ酸配列パラメータ、RNAシークエンシング転写データ(TPM)、タンパク質ファミリーデータ、試料ごとの識別子、及びHLA−A、B、Cタイプを含むものとした。5つのネットワークのアンサンブルを各モデルで使用した。提示ホットスポットパラメータを含むモデルでは、遺伝子ごとプロテオームブロックサイズ10、及びペプチド長8〜12として、セクションVIII.B.3.で上記に述べた式12cを使用した。
ヒト腫瘍CD8 T細胞エピトープ(すなわち、免疫療法のターゲット)を特定するためにHLA提示をモデル化するうえで提示ホットスポットパラメータを使用することの利点をさらに直接試験した。この評価を行うための適当な試験データセットを定義することは、試験データセットが、T細胞によって認識され、かつHLAにより腫瘍細胞表面上に提示されるペプチドを含まなければならないことから困難である。さらに、正式な性能評価は、陽性標識された(すなわち、T細胞に認識された)ペプチドだけでなく、充分な数の陰性標識された(すなわち、試験したが、認識されなかった)ペプチドも必要とする。質量分析データセットは、腫瘍提示に対応するがT細胞認識には対応せず、逆に、ワクチン接種後のプライミングまたはT細胞アッセイはT細胞認識に対応するが腫瘍提示には対応しない。
本発明者らは、Gros et al.84、Tran et al.140、Stronen et al.141及びZacharakis et al.、及びKosaloglu−Yalcin et al.160の補足情報から変異コール、HLA型、及びT細胞認識データを得た。
本実施例では、改善された予測が通常の患者試料からの新生抗原の特定を可能とすることを実証する。これを行うため、アーカイブしたFFPE腫瘍生検及び5〜30mlの末梢血を、抗PD(L)1療法を行っている転移性NSCLCを有する9人の患者で分析した(補足の表2:図17A〜Cで調べたN=9人の患者についての患者人口統計及び治療情報。主なフィールドは、腫瘍ステージ及びサブタイプ、行った抗PD1療法、及びNGSの結果の概要を含む)。腫瘍全エクソームシークエンシング、腫瘍トランスクリプトームシークエンシング、及びマッチド正常エクソームシークエンシングにより、患者当たり、平均で198個の体細胞変異(SNV及び短いindel)が得られ、そのうち、平均で118個が発現された(「方法」、補足の表2)。完全MSモデルを適用して既存の抗腫瘍T細胞応答に対して試験を行うために患者当たり20個の新生エピトープを優先順位付けした。可能性の高いCD8応答に集中して分析を行うため、優先順位付けしたペプチドを8〜11マーの最小エピトープとして合成し(「方法」)、次いで末梢血単核細胞(PBMC)を合成したペプチドと短期インビトロ刺激(IVS)培養中で培養して新生抗原応答性T細胞を増殖させた(補足の表3)。2週間後、抗原特異的T細胞の存在を優先順位付けした新生エピトープに対するIFN−γELISpotを用いて評価した。充分なPBMCが利用可能な7人の患者で別々の実験をさらに行って認識された特異的抗原の完全または部分的な畳み込みを行った。これらの結果を図17A〜C及び図18A〜21に示す。
特注の組換え凍結乾燥ペプチドをJPT Peptide Technologies(Berlin,Germany)またはGenscript(Piscataway,NJ,USA)より購入し、滅菌DMSO(VWR International,Pittsburgh,PA,USA)中、10〜50mMで戻し、一定の分量に分けて−80℃で保存した。
健康なドナーからの凍結乾燥したHLAタイピングしたPBMC(HIV、HCV及びHBVについて血清反応陰性であることを確認したもの)を、Precision for Medicine(Gladstone,NJ,USA)またはCellular Technology,Ltd.(Cleveland,OH,USA)より購入し、液体窒素中で使用時まで保存した。新鮮な血液試料をResearch Blood Components(Boston,MA,USA)より、leukopakをAllCells(Boston,MA,USA)より購入し、PBMCをFicoll−Paque密度勾配(GE Healthcare Bio,Marlborough,MA,USA)により単離した後、凍結保存した。患者のPBMCを地域の臨床処理センターで地域臨床標準業務手順書(SOP)及びIRBにより承認されたプロトコールに従って処理した。承認IRBは、Quorum Review IRB、Comitato Etico Interaziendale A.O.U.San Luigi Gonzaga di Orbassano、及びComite Etico de la Investigacion del Grupo Hospitalario Quiron en Barcelonaであった。
健康なドナーまたは患者試料から得た既存のT細胞を、Ott et alにより適用されたアプローチ81と同様のアプローチで同族ペプチド及びIL−2の存在下で増殖させた。簡単に述べると、解凍したPBMCを一晩休ませ、24ウェル組織培養プレート中で10IU/mlのrhIL−2(R&D Systems Inc.,Minneapolis,MN)を添加したImmunoCult(商標)−XF T−cell Expansion Medium(STEMCELL Technologies)中、ペプチドプール(ペプチド当たり10μM、プール当たり10種のペプチド)の存在下で14日間、刺激した。細胞を2x106細胞/ウェルで播種し、培地の2/3を2〜3日ごとに交換することによって培養した。1つの患者試料はプロトコールからの逸脱を示し、潜在的な偽陰性とみなすべきものと考えられた。患者CU03は、解凍後に充分な数の細胞を生じなかったため、細胞をペプチドプール当たり2x105細胞で播種した(プロトコールの記載よりも10倍少ない数)。
IFNγ産生T細胞の検出をELISpotアッセイ142により行った。簡単に述べると、PBMC(エクスビボまたはインビトロ増殖後のもの)を回収し、無血清RPMI(VWR International)中で洗浄し、抗ヒトIFNγ捕捉抗体(Mabtech,Cincinatti,OH,USA)をコーティングしたELISpot Multiscreenプレート(EMD Millipore)中、OpTmizer T−cell Expansion Basal Medium(エクスビボ)またはImmunoCult(商標)−XF T−cell Expansion Medium(増殖させた培養物)中でコントロールまたは同族ペプチドの存在下で培養した。5%CO2、37℃の加湿したインキュベーター内で18時間インキュベートした後、細胞をプレートから除去し、膜に結合したIFNγを抗ヒトIFNγ検出抗体(Mabtech)、Vectastain Avidinペルオキシダーゼ複合体(Vector Labs,Burlingame,CA,USA)及びAEC Substrate(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)を用いて検出した。ELISpotプレートを乾燥させ、遮光して保存し、標準化された評価143を行うためにZellnet Consulting,Inc.,Fort Lee,NJ,USA)に送った。データをプレートに播種した細胞の数当たりのスポット形成単位(SFU)として示す。
ELISpot上清中に分泌されたIL−2、IL−5及びTNF−αの検出をトリプレックスアッセイであるMSD U−PLEX Biomarkerアッセイ(カタログ番号 K15067L−2)を使用して行った。アッセイは製造者の指示にしたがって行った。被検物質濃度(pg/ml)を、各サイトカインについて既知の標準物質の連続希釈を用いて計算した。データをグラフ化するため、標準曲線の最小範囲よりも低い値を0に等しくなるように示した。ELISpot上清中のグランザイムBの検出を、GranzymeB DuoSet(登録商標)ELISA(R&D Systems,Minneapolis,MN)を製造者の指示に従って使用して行った。簡単に述べると、ELISpot上清を試料希釈剤中、1:4に希釈し、グランザイムB標準の連続希釈液に並べて流して濃度(pg/ml)を計算した。データをグラフ化するため、標準曲線の最小範囲よりも低い値を0に等しくなるように示した。
図18Aは、健康なドナーで試験した腫瘍細胞株由来の新生抗原についてのIVSアッセイの陰性対照実験を示す。健康なドナーのPBMCを、IVS培養中、陽性対照ペプチド(感染症に予め曝露したもの)、腫瘍細胞株由来のHLAを一致させた新生抗原(曝露しないもの)、及びドナーが血清反応陰性であった病原体に由来するペプチドを含むペプチドプールで刺激した。次いで、増殖させた細胞を、DMSO(陰性対照、黒い丸)、PHA及び一般的な感染症ペプチド(陽性対照、赤い丸)、新生抗原(非曝露、水色の丸)、またはHIV及びHCVペプチド(ドナーが血清反応陰性であったもの。濃紺色、A及びB)で刺激した後、IFNγ ELISpot (105細胞/ウェル)により分析した。データを播種細胞105個当たりのスポット形成単位(SFU)として示す。平均及びSEMを含む生物学的レプリケートを示す。新生抗原またはドナーが曝露されていない病原体由来のペプチド(血清反応陰性)に対する応答は観察されなかった。
図18Aは、健康なドナーにおける応答性について試験した患者由来の新生抗原についてのIVSアッセイの陰性対照実験を示す。HLAを一致させた新生抗原ペプチドプールに対する健康なドナーにおけるT細胞応答の評価。左パネル:健康なドナーのPBMCを、エクスビボのIFNγELISpotにおいて対照(DMSO、CEF、及びPHA)またはHLA一致させた患者由来新生抗原ペプチドで刺激した。データを3重のウェルについてプレートに播種した細胞2x105個当たりのスポット形成単位(SFU)として示す。右パネル:新生抗原プールまたはCEFプールの存在下で増殖させたIVS培養後の健康なドナーのPBMCを、IFNγELISpotにおいて対照(DMSO、CEF、及びPHA)またはHLAを一致させた患者由来の新生抗原ペプチドプールで刺激した。データを3重のウェルについてプレートに播種した細胞1x105個当たりのSFUとして示す。健康なドナーにおいて新生抗原に対する応答は認められなかった。
図17A〜Cで調べたN=9人の患者で試験した新生抗原ペプチドの詳細(NSCLC患者由来の新生抗原応答性T細胞の特定)。主なフィールドは、ソース変異、ペプチド配列、ならびに観察されたプール及び個々のペプチド配列を含む。列「most_probable_restriction」は、モデルが予測したどのアレルが各ペプチドを提示する可能性が最も高かったかを示す。結合親和性予測(「方法」)により計算した各患者のすべての変異ペプチド間でのこれらのペプチドのランクも含まれる。
は、MHCflurryによって2、14、7、及び9位にランクされたのに対して、モデルによってそれぞれ0、4、5、7位にランクされた)。ペプチドGTKKDVDVLKはCD8T細胞により認識され、モデルによって1位にランクされたが、MHCflurryによるランクは70位であり、予測結合親和性は2169nMであった。
陽性ELISpot (IFNγ)ウェルから得た上清中で検出された被検物質をグランザイムB(ELISA)、TNFα、IL−2及びIL−5 (MSD)について示す。値はテクニカルレプリケートからの平均のpg/mlとして示す。陽性値を斜体で示す。グランザイムB ELISA:DMSOバックグラウンドよりも1.5倍以上の値を陽性とみなした。U−Plex MSDアッセイ:DMSOバックグラウンドよりも1.5倍以上の値を陽性とみなした。
図18A〜Bに示されるIVS対照実験で試験した腫瘍細胞株新生抗原及びウイルスペプチドの詳細主なフィールドには、ソース細胞株またはウイルス、ペプチド配列、及び予測された提示HLAアレルが含まれる。
予測モデルを訓練及び試験するために使用したMSペプチドデータセット(図16)は、MassIVEアーカイブ(massive.ucsd.edu)、アクセッション番号MSV000082648で取得可能である。ELISpot (図17A〜C及び図18A〜B)により試験される新生抗原ペプチドはマニュスクリプトとともに含まれている(補足の表3及び5)。
XVI.A.質量分析
XVI.A.1.試料
質量分析分析用のアーカイブされた凍結組織試料は、BioServe(Beltsville,MD)、ProteoGenex(Culver City,CA)、iSpecimen (Lexington,MA)、及びIndivumed(Hamburg,Germany)を含む販売元から入手した。試料のサブセットも、Comite de Protection des Personnes,Ile−de−France VIIによって承認されたリサーチプロトコールに基づき、Hopital Marie Lannelongue (Le Plessis−Robinson, France)で患者から予め採取した。
HLAペプチド分子の単離を、組織試料の溶解及び可溶化後87,124−126に免疫沈降(IP)法を用いて行った。新鮮な凍結組織を粉砕し(CryoPrep;Covaris,Woburn,MA)、溶解バッファー(1%CHAPS、20mM Tris−HCl、150mM NaCl、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤、pH=8)を加えて組織を可溶化し、得られた溶液を4℃で2時間遠心して破片をペレット化した。清澄化したライセートをHLA特異的IPに使用した。免疫沈降はこれまでに述べられているようにして抗体W6/32を使用して行った127。ライセートを抗体ビーズに加え、4℃で一晩回転し、免疫沈降を行った。免疫沈降後、ビーズをライセートから除去した。IPビーズを洗浄して非特異的結合を除去し、HLA/ペプチド複合体を2N酢酸でビーズから溶出させた。タンパク質成分を分子量スピンカラムを使用してペプチドから除去した。得られたペプチドをSpeedVac蒸発により乾燥状態とし、MS分析を行うまで−20℃で保存した。
乾燥させたペプチドをHPLCバッファーA中で戻し、C−18マイクロキャピラリーHPLCカラムにロードして質量分析計に勾配溶出した。180分の0〜40%B (溶媒A:0.1%ギ酸、溶媒B:80%アセトニトリル中0.1%ギ酸)の勾配を用いてペプチドをFusion Lumos質量分析計 (Thermo)中に溶出した。ペプチドの質量/電荷(m/z)のMS1スペクトルを分解能120,000でOrbitrap検出器中に収集し、続いて選択したイオンのHCD断片化後に20回のMS2の低分解能スキャンをOrbitrapまたはイオントラップ検出器中に収集した。MS2イオンの選択は、データ依存性取得モード及びイオンのMS2選択後に30秒間の動的排除を用いて行った。MS1スキャンの自動利得制御(AGC)を4x105に設定し、MS2スキャンについては1x104に設定した。HLAペプチドのシークエンシングには、MS2断片化を行うために+1、+2及び+3の荷電状態を選択することができる。
XVI.B.1.データのコード化
各試料について、訓練データポイントは、試料中で発現された正確に1つの遺伝子にマッピングされる参照プロテオームからのすべての8〜11マー(包括する)ペプチドとした。全体の訓練データセットは、各訓練試料からの訓練データセットを連結することにより生成した。8〜11個の範囲はすべてのHLAクラスI提示ペプチドの約95%を捕捉するため、この長さの範囲を選択したが、12〜15個の長さを加えることも、計算需要の中度の増大を代償として同じ方法を用いて実現することが可能である。ペプチド及びフランキング配列を、ワン・ホットエンコーディングスキームを用いてベクトル化した。複数の長さ(8〜11)のペプチドを、アミノ酸のアルファベットをパッド文字で増やし、すべてのペプチドを最大長さ11までパディングすることにより固定長さのベクターとして表した。訓練ペプチドのソースタンパク質のRNA存在量を、RSEM133から得られたイソフォームレベルのTPM(transcripts per million)推定値の対数として表した。各ペプチドについて、ペプチドごとTPMを、ペプチドを含むイソフォームのそれぞれについてイソフォームごとTPM推定値の総和として計算した。0TPMで発現された遺伝子からのペプチドは訓練データから除外し、試験時に、非発現遺伝子からのペプチドに提示確率0を割り当てた。最後に、各ペプチドに、Ensemblタンパク質ファミリーIDを割り当て、各固有のEnsemblタンパク質ファミリーIDは遺伝子ごと提示傾向切片に対応した(次のセクションを参照)。
完全提示モデルは以下の関数形を有する。すなわち、
式中、kは、1〜mまでのデータセット内のHLAアレルの添え字であり、
は、標識変数であり、アレルkがペプチドiが由来する試料中に存在する場合にその値は1であり、そうでない場合には0である。特定のペプチドiについて、
のうちの最大6個 (ペプチドiの由来する試料のHLA型に対応する6個)以外のすべては、0である。確率の総和は、例えば、
で、
でクリップする。
Pr(アレルaによる提示ペプチドi)=sigmoid{NNa(ペプチドi)+NNフランキング(フランキングi)+NNRNA(log(TPMi))+α試料(i)+βタンパク質(i)}
式中、変数は以下の意味を有する。sigmoidは、シグモイド(expitとしても知られる)関数であり、ペプチドiは、ペプチドiのワンホットコード化された中間パディングされたアミノ酸配列であり、NNaは、提示の確率に対するペプチド配列の寄与をモデル化する線形最終層活性化によるニューラルネットワークであり、フランキングiは、ソースタンパク質中のペプチドiのワンホットコード化されたフランキング配列であり、NNフランキングは、提示の確率に対するフランキング配列の寄与をモデル化する線形最終層活性化によるニューラルネットワークであり、TPMiは、TPM単位内のペプチドiのソースmRNAの発現であり、試料(i)は、ペプチドiの由来する試料(すなわち患者)であり、α試料(i)は試料ごと切片であり、タンパク質(i)は、ペプチドiのソースタンパク質であり、βタンパク質(i)はタンパク質ごと切片である(提示の遺伝子ごと傾向としても知られる)。
・ NNaのそれぞれは、入力次元数231(11残基×残基ごとに21個の可能な文字(パッド文字を含む))、幅256、隠れ層の整流線形単位(ReLU)活性化、出力層の線形活性化、及び訓練データセットのHLAアレルaごとに1個の出力ノードを有する単一隠れ層の多層パーセプトロン(MLP)の1個の出力ノードである。
・ NNフランキングは、入力次元数210(N末端フランキング配列の5残基+C末端フランキング配列の5残基×残基ごとに21個の可能な文字(パッド文字を含む))、幅32、隠れ層の整流線形単位(ReLU)活性化、及び出力層の線形活性化を有する単一隠れ層のMLPである。
・ NNRNAは、入力次元数1、幅16、隠れ層の整流線形単位(ReLU)活性化、及び出力層の線形活性化を有する単一隠れ層のMLPである。
Pr(アレルaによる提示ペプチドi)=sigmoid{NNa(ペプチドi)}
本発明者らは、以下の手順を用いて訓練/検証/試験セットのうちの2つ以上に現れるペプチドがないようにした。すなわち、最初に、2つ以上のタンパク質に現れるすべてのペプチドを参照プロテオームから除去し、次に、プロテオームを10個の隣接したペプチドに分配する。各ブロックを訓練、検証、及び試験セットに固有に割り当てる。これにより、訓練、検証、または試験データセットのうちの2つ以上のデータセットに現れるペプチドはなくなる。検証セットは、早期終了のみに用いた。図14〜図16の腫瘍試料試験データは、訓練及び検証セットから完全に除外された5つの腫瘍試料からの試験セットペプチド(すなわち、試験セットに固有に割り当てられた隣接するペプチドのブロックからのペプチド)を表す。
モデルを訓練するため、ペプチドごと損失が負のベルヌーイ対数尤度損失関数である(対数損失としても知られる)ものとして、すべてのペプチドを独立したものとしてモデル化した。正式には、ペプチドiの全体の損失に対する寄与は、
Loss(i)=−log(Bernoulli(yi|Pr(提示ペプチドi)))
であり、ただし、yiは、ペプチドiのラベルである(すなわち、ペプチドiが提示される場合にyi=1であり、そうでない場合には0であり、i.i.d.の2項観測ベクトルyが与えられるものとして、Bernoulli(y|P)は、は、パラメータp∈[0,1]のベルヌーイ尤度を示す)。このモデルを損失関数を最小化することにより訓練した。
モチーフロゴを、weblogolib Python API v3.5.0138を用いて生成した。結合親和性ロゴを生成するため、mhc_ligand_full.csv ファイルを2017年7月にImmune Epitope Database (IEDB88)からダウンロードし、以下の基準を満たすペプチドを保持した。すなわち、ナノモル(nM)単位の測定値、参照日が2000年以降であり、オブジェクトタイプが「直鎖状ペプチド」に等しく、ペプチド内のすべての残基が標準的な20文字のアミノ酸アルファベットから引用されるもの。測定された結合親和性が従来の結合閾値である500nMよりも低いフィルタリングされたペプチドのサブセットを使用してロゴを生成した。IEDBの結合物質の数が少なすぎるアレルペアについてはロゴは生成されなかった。学習された提示モデルを表すロゴを生成するため、2,000,000種のランダムなペプチドについてモデル予測を各アレル及び各ペプチド長で予測した。各アレル及び各長さについて、学習された提示モデルにより上位1%(すなわち、上位の20,000種)にランク付けされたペプチドを用いてロゴを生成した。重要な点として、IEDBからのこの結合親和性データは、モデルの訓練または試験では使用せず、学習されたモチーフの比較にのみ使用した。
本発明者らは、モデルのNetMHCファミリーに匹敵する性能を有するオープンソースのGPU互換性HLAクラスI結合親和性予測ツールであるMHCflurry v1.2.0139からの結合親和性のみの予測ツールを使用してペプチド−MHC結合親和性を予測した。複数のHLAアレルにわたって単一のペプチドについての結合親和性予測を組み合わせるため、最小の結合親和性を選択した。複数のペプチドにわたって結合親和性を組み合わせるため(すなわち、図16に示されるように、複数の変異ペプチドがまたがった変異をランク付けするため)、ペプチドにわたった最小の結合親和性を選択した。T細胞データセットに対するRNA発現の閾値を決定するため、TPM>1の閾値までのTCGAからの腫瘍型が一致したRNA−seqデータを使用した。初期のT細胞データセットのすべてを初期の公表中、TPM>0でフィルタリングしたため、TPM>0でフィルタリングされるTCGAのRNA−seqデータは使用されなかった。
複数のHLAアレルにわたった単一のペプチドについて提示の確率を加え合わせるため、確率の総和を式1に示されるように特定した。複数のペプチドにわたって提示の確率を加え合わせるため(すなわち、図16に示されるように、複数の変異ペプチドがまたがった変異をランク付けするため)、提示の確率の総和を特定した。確率的には、ペプチドの提示がi.i.d.のベルヌーイランダム変数とみなされる場合、確率の総和は提示される変異ペプチドの予想数に対応する。すなわち、
ただし、Pr[提示エピトープj]は、エピトープjに訓練された提示モデルを適用することによって得られ、niは、変異iにまたがる変異エピトープの数を示す。例えば、そのソース遺伝子の末端から遠いSNViについて、8個のまたがった8マー、9個のまたがった9マー、10個のまたがった10マー、及び11個のまたがった11マーが、全部でni=38個のまたがった変異エピトープについて存在する。
XVI.C.1.試料
凍結切除された腫瘍のトランスクリプトーム分析を行うため、MS分析に使用したのと同じ組織試料(腫瘍または隣接する正常組織)からRNAを得た。抗PD1療法を行っている患者の新生抗原エクソーム及びトランスクリプトーム分析を行うため、DNA及びRNAをアーカイブされたFFPE腫瘍生検から得た。隣接正常組織、一致血液、またはPBMCを用いて正常エクソーム及びHLAタイピングを行うための正常DNAを得た。
血液由来の正常/生殖系DNAを、Qiagen DNeasyカラム(Hilden,Germany)を製造者の推奨する手順に従って使用して単離した。組織試料からのDNA及びRNAをQiagen Allprep DNA/RNA単離キットを製造者の推奨する手順に従って使用して単離した。これらのDNA及びRNAをPicogreen及びRibogreen Fluorescence(Molecular Probes)によりそれぞれ定量し、収量が50ng超の試料をライブラリーの構築に進めた。DNAシークエンシングライブラリーを超音波せん断(Covaris,Woburn,MA)に続き、DNA Ultra II(NEB,Beverly,MA)ライブラリー調製キットを製造者の推奨するプロトコールに従って使用することにより作製した。RNA Ultra II(NEB)による熱断片化及びライブラリー構築により腫瘍RNAシークエンシングライブラリーを作製した。得られたライブラリーをPicogreen(Molecular Probes)により定量した。
DNA及びRNAシークエンシングライブラリーのエクソン濃縮を、xGEN Whole Exome Panel(Integrated DNA Technologies)を使用して行った。1〜1.5μgの正常DNAまたは腫瘍DNAもしくはRNA由来ライブラリーを入力として用い、12時間よりも長い時間にわたってハイブリダイズさせた後、ストレプトアビジン精製を行った。捕捉されたライブラリーをPCRにより最小限増幅し、NEBNext Library Quant Kit(NEB)により定量した。捕捉された各ライブラリーを等モル濃度でプールし、c−bot (Illumina)を用いてクラスター化し、75塩基対の端部においてHiSeq4000(Illumina)で、500x超の腫瘍エクソーム、100x超の正常エクソーム、及び100M超のリードの腫瘍トランスクリプトームのターゲットユニークな平均カバレッジにまでシークエンシングした。
エクソームリード(FFPE腫瘍エクソーム及び一致させた正常エクソーム)を、BWA−MEM144(v.0.7.13−r1126)を使用して参照ヒトゲノム(hg38)とアラインした。RNA−seqリード(FFPE及び凍結腫瘍組織試料)を、STAR(v.2.5.1b)を使用してゲノム及びGENCODE転写産物(v. 25)とアラインした。RNA発現を、同じ参照転写産物でRSEM133(v.1.2.31)を使用して定量した。Picard (v.2.7.1)を使用してデュプリケートアラインメントをマークし、アラインメントメトリックを計算した。GATK145(v.3.5−0)による塩基のクオリティー補正(base quality score recalibration)後のFFPE腫瘍試料について、FreeBayes146(1.0.2)によりペアリングした腫瘍−正常エクソームを用いて置換及び短いindel変異を検出した。フィルターには、アレル頻度>4%;塩基クオリティーの中央値>25、支持リードの最小マッピングクオリティー30、及び充分なカバレッジが得られたとして正常の代替的リードカウント≦2が含まれた。変異体はまた、両方の鎖で検出されなければならない。反復領域に生じる体細胞変異体は除外した。翻訳及びアノテーションは、RefSeq転写産物を用いてsnpEff147(v.4.2)により行った。腫瘍RNAアラインメントで確認された非同義、ノンストップ変異体を新生抗原予測に進めた。Optitype1481.3.1を使用してHLA型を生成した。
腫瘍細胞株H128、H122、H2009、H2126、Colo829及びそれらの正常なドナー一致した対照細胞株BL128、BL2122、BL2009、BL2126 and Colo829BLをすべて、ATCC (Manassas,VA)より購入し、販売業者の指示にしたがって1083〜1084個の細胞にまで増殖させた後、核酸抽出及びシークエンシング用にスナップ凍結した。NGSを、MuTect149(3.1−0) を置換変異の検出にのみ用いた点以外は、概ね上記に述べたのと同様にして行った。IVS対照アッセイで使用したペプチドを、補足の表5に示す。
本発明者らは、提示ホットスポットパラメータを用いた場合と、提示ホットスポットパラメータを用いない場合における、クラスII HLAペプチド提示に対する本明細書に開示されるモデルの性能の評価も行った。クラスI複合体がサイトゾルタンパク質を提示し、ヒトのすべての有核細胞の表面に見られるのに対して、クラスII複合体は抗原提示細胞上に大部分が見られ、主に細胞外(外因性)タンパク質を提示する役割を担っている。クラスIとクラスIIとは結合機序及びペプチド長の点でも相違している。
図23は、NSCLC患者の末梢血由来の新生抗原特異的メモリーT細胞のTCRをシークエンシングするための方法を示す。NSCLC患者CU04からの末梢血単核細胞(PBMC)(図17A〜21に関して上記に述べたもの)をELISpotインキュベーション後に回収した。詳細には、上記に述べたように、患者CU04の2回の来院からインビトロ増殖させたPBMCをIFNγELISpotにおいてCU04特異的な個別の新生抗原ペプチド(図20C)、CU04特異的な新生抗原ペプチドプール(図20C)、及びDMSO陰性対照(図21)で刺激した。インキュベーション後、検出抗体の添加に先立って、PBMCを新しい培養プレートに移し、ELISpotアッセイが完了する間、インキュベーター内で維持した。陽性(応答性)ウェルをELISpotの結果に基づいて特定した。図20に示されるように、特定された陽性ウェルには、CU04特異的な個別のペプチド8で刺激したウェル、及びCU04特異的な新生抗原ペプチドプールで刺激したウェルが含まれる。これらの陽性ウェル及び陰性対照(DMSO)ウェルからの細胞を加え合わせて、磁気標識抗体でCD137について染色し、Miltenyi磁気単離カラムを使用して濃縮を行った。
患者の腫瘍によって提示される新生抗原に対して新生抗原特異的であるT細胞及び/またはTCRが特定された後、これらの特定された新生抗原特異的T細胞及び/またはTCRを患者のT細胞療法に使用することができる。詳細には、これらの特定された新生抗原特異的T細胞及び/またはTCRを使用してT細胞療法において患者に注入するための治療量の新生抗原特異的T細胞を作製することができる。患者のT細胞療法で使用するための治療量の新生抗原特異的T細胞を作製するための2つの方法を、本明細書のセクションXVII.A.及びXVII.B.で考察する。第1の方法は、患者試料から特定された新生抗原特異的T細胞を増殖させることを含む(セクションXVII.A.)。第2の方法は、特定された新生抗原特異的T細胞のTCRをシークエンシングすることと、シークエンシングされたTCRを新たなT細胞にクローニングすることとを含む(セクションXVII.B.)。本明細書では明示的に触れられていないT細胞療法で使用するための新生抗原特異的T細胞を作製するための代替的な方法を用いて、T細胞療法で使用するための治療量の新生抗原特異的T細胞を作製することもできる。これらの方法の1つ以上によって新生抗原特異的T細胞が得られた後、これらの新生抗原特異的T細胞をT細胞療法を行うために患者に注入することができる。
患者のT細胞療法に使用するための治療量の新生抗原特異的T細胞を作製するための第1の方法は、患者試料から特定された新生抗原特異的T細胞を増殖させることを含む。
患者にT細胞療法を使用するための治療量の新生抗原特異的T細胞を作製するための第2の方法は、患者試料から新生抗原特異的T細胞を特定することと、特定された新生抗原特異的T細胞のTCRをシークエンシングすることと、シークエンシングされたTCRを新たなT細胞をクローニングすることと、を含む。
図28は、一実施形態による、患者に個別化された新生抗原特異的治療を行うための方法のフローチャートである。他の実施形態では、本方法は、図28に示されるもの以外の異なる及び/またはさらなる工程を含んでもよい。さらに、本方法の各工程は、異なる実施形態において、図28に関連して述べられる順序とは異なる順序で行うことができる。
図29は、図1及び図3に示した実体を実施するための例示的なコンピュータ2900を説明する。コンピュータ2900は、チップセット2904に連結された少なくとも1つのプロセッサ2902を含む。チップセット2904は、メモリコントローラハブ2920及び入力/出力(I/O)コントローラハブ2922を含む。メモリ2906及びグラフィックスアダプタ2912は、メモリコントローラハブ2920に連結されており、ディスプレイ2918は、グラフィックスアダプタ2912に連結されている。記憶デバイス2908、入力装置2914、及びネットワークアダプタ2916は、I/Oコントローラハブ2922に連結されている。コンピュータ2900の他の実施形態は、異なるアーキテクチャを有する。
陽性値は斜体で示す。* グランザイムB ELISA: DMSOバックグラウンドよりも1.5倍以上高い値は陽性とみなした。# U-Plex MSD アッセイ:DMSOバックグラウンドよりも1.5倍以上高い値は陽性とみなした。
Claims (31)
- 腫瘍細胞の表面上に提示される可能性の高い、対象の1つ以上の腫瘍細胞に由来する1つ以上の新生抗原を特定するための方法であって、
前記対象の前記腫瘍細胞及び正常細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、前記ヌクレオチドシークエンシングデータが、前記腫瘍細胞からの前記ヌクレオチドシークエンシングデータと前記正常細胞からの前記ヌクレオチドシークエンシングデータとを比較することにより特定された新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられ、各新生抗原のペプチド配列が、前記ペプチド配列を前記対象の前記正常細胞から特定される対応する野生型のペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を含む、前記取得する工程;
前記新生抗原のそれぞれのペプチド配列を、対応する数値ベクトルにコード化する工程であって、各数値ベクトルが、前記ペプチド配列を構成する複数のアミノ酸と前記ペプチド配列内の前記アミノ酸の位置のセットとに関する情報を含む、前記コード化する工程;
前記新生抗原のそれぞれのペプチド配列を、前記対象の前記ヌクレオチドシークエンシングデータの複数のkマーブロックのうちの1つ以上のkマーブロックと関連付ける工程;
前記新生抗原のセットについて提示尤度のセットを生成するために、コンピュータプロセッサを使用して、前記数値ベクトル及び前記1つ以上の関連付けられたkマーブロックを機械学習させた提示モデルに入力する工程であって、前記セット内の各提示尤度が、対応する新生抗原が1つ以上のMHCアレルによって前記対象の前記腫瘍細胞の表面上に提示される尤度を表し、前記機械学習させた提示モデルが、
訓練データセットに少なくとも基づいて特定される複数のパラメータであって、前記訓練データセットが、
複数の試料の各試料について、前記試料中に存在するものとして特定されたMHCアレルのセット内の少なくとも1つのMHCアレルに結合したペプチドの存在を測定する質量分析によって得られた標識、
前記試料のそれぞれについて、前記ペプチドを構成する複数のアミノ酸と前記ペプチド内の前記アミノ酸の位置のセットとに関する情報を含む数値ベクトルとしてコード化された訓練ペプチド配列、及び
前記試料のそれぞれについて、前記試料の前記訓練ペプチド配列のそれぞれについて、前記訓練ペプチド配列と、前記訓練ペプチド配列の前記ヌクレオチドシークエンシングデータの複数のkマーブロックのうちの1つ以上のkマーブロックとの間の関連付け
を含み、
前記複数のパラメータのサブセットが、前記1つ以上のkマーブロックにおける提示ホットスポットの有無を表す、前記複数のパラメータと、
入力として受け取られた前記数値ベクトル及び前記1つ以上のkマーブロックと、前記数値ベクトル、前記1つ以上のkマーブロック、及び前記パラメータに基づいた出力として生成された前記提示尤度との間の関係を表す関数と
を含む、
前記入力する工程;
選択された新生抗原のセットを生成するために、前記新生抗原のセットのサブセットを、前記提示尤度のセットに基づいて選択する工程;ならびに
前記選択された新生抗原のセットを返す工程
を含む、前記方法。 - 前記数値ベクトルを前記機械学習させた提示モデルに入力する工程が、
前記ペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸に基づいてMHCアレルが前記新生抗原を提示するかどうかを示す依存性スコアを前記1つ以上のMHCアレルのそれぞれについて生成するために、前記機械学習させた提示モデルを前記新生抗原のペプチド配列に適用すること
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記数値ベクトルを前記機械学習させた提示モデルに入力する工程が、
各MHCアレルについて、対応するMHCアレルが対応する新生抗原を提示するであろう尤度を示す対応するアレル毎尤度を生成するために、前記依存性スコアを変換することと、
前記アレル毎尤度を組み合わせて前記新生抗原の提示尤度を生成することと
をさらに含む、請求項2に記載の方法。 - 前記依存性スコアを変換することが、前記新生抗原の提示を前記1つ以上のMHCアレルにわたって相互排他的なものとしてモデル化する、請求項3に記載の方法。
- 前記数値ベクトルを前記機械学習させた提示モデルに入力する工程が、前記提示尤度を生成するために前記依存性スコアの組み合わせを変換することをさらに含み、前記依存性スコアの組み合わせを変換することが、前記新生抗原の提示を前記1つ以上のMHCアレル間で干渉するものとしてモデル化する、請求項2に記載の方法。
- 前記提示尤度のセットが、少なくとも1つ以上のアレル非相互作用特性によってさらに特定され、
前記アレル非相互作用特性に基づいて前記対応する新生抗原のペプチド配列が提示されるかどうかを示す前記アレル非相互作用特性についての依存性スコアを生成するために、前記機械学習させた提示モデルを前記アレル非相互作用特性に適用すること
をさらに含む、請求項2〜5のいずれか1項に記載の方法。 - 前記1つ以上のMHCアレルの各MHCアレルについての前記依存性スコアを、前記アレル非相互作用特性についての前記依存性スコアと組み合わせることと、
対応するMHCアレルが対応する新生抗原を提示する尤度を示す、各MHCアレルについてのアレル毎尤度を生成するために、各MHCアレルについての前記組み合わされた依存性スコアを変換することと、
前記提示尤度を生成するために、前記アレル毎尤度を組み合わせることと
をさらに含む、請求項6に記載の方法。 - 前記MHCアレルのそれぞれについての前記依存性スコアと、前記アレル非相互作用特性についての前記依存性スコアとを組み合わせることと、
前記提示尤度を生成するために、前記組み合わされた依存性スコアを変換することと
をさらに含む、請求項6に記載の方法。 - 前記少なくとも1つ以上のアレル非相互作用特性が、前記新生抗原のペプチド配列と、前記新生抗原の前記ヌクレオチドシークエンシングデータの複数のkマーブロックのうちの1つ以上のkマーブロックとの間の関連付けを含む、請求項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つ以上のMHCアレルが2つ以上の異なるMHCアレルを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペプチド配列が、アミノ酸9個以外の長さを有するペプチド配列を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペプチド配列をコード化することが、ワン・ホットエンコーディングスキームを用いて前記ペプチド配列をコード化することを含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の試料が、
(a)単一のMHCアレルを発現するように操作された1つ以上の細胞株、
(b)複数のMHCアレルを発現するように操作された1つ以上の細胞株、
(c)複数の患者から得られた、または複数の患者に由来する1つ以上のヒト細胞株、
(d)複数の患者から得られた新鮮なまたは凍結された腫瘍試料、及び
(e)複数の患者から得られた新鮮なまたは凍結された組織試料
のうちの少なくとも1つを含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 前記訓練データセットが、
(a)前記ペプチドのうちの少なくとも1つについてのペプチド−MHC結合親和性の測定値に関連するデータ、及び
(b)前記ペプチドのうちの少なくとも1つについてのペプチド−MHC結合安定性の測定値に関連するデータ
のうちの少なくとも1つをさらに含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。 - 前記提示尤度のセットが、RNA−seqまたは質量分析により測定される、前記対象における前記1つ以上のMHCアレルの少なくとも発現レベルによってさらに特定される、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記提示尤度のセットが、
(a)前記新生抗原のセット内の新生抗原と前記1つ以上のMHCアレルとの間の予測される親和性、及び
(b)前記新生抗原コード化ペプチド−MHC複合体の予測される安定性
のうちの少なくとも1つを含む特性によってさらに特定される、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。 - 前記数値的尤度のセットが、
(a)そのソースタンパク質配列内の、前記新生抗原コード化ペプチド配列に隣接するC末端配列、及び
(b)そのソースタンパク質配列内の、前記新生抗原コード化ペプチド配列に隣接するN末端配列
のうちの少なくとも1つを含む特性によってさらに特定される、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。 - 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記機械学習させた提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較して前記腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している新生抗原を選択することを含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記機械学習させた提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較して前記対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含む、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較してプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)によってナイーブT細胞に対して提示されることができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含み、任意で、前記APCが樹状細胞(DC)である、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記機械学習させた提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較して中枢性寛容または末梢性寛容によって阻害される尤度が減少している新生抗原を選択することを含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記選択された新生抗原のセットを選択することが、前記機械学習させた提示モデルに基づいて、選択されない新生抗原と比較して前記対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している新生抗原を選択することを含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つ以上の腫瘍細胞が、肺癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、胃癌、結腸癌、精巣癌、頭頸部癌、膵臓癌、脳癌、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、T細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記選択された新生抗原のセットから個別化がんワクチンを構築するための出力を生成することをさらに含む、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記個別化がんワクチン用の出力が、前記選択された新生抗原のセットをコードした少なくとも1つのペプチド配列または少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記機械学習させた提示モデルが、ニューラルネットワークモデルである、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ニューラルネットワークモデルがMHCアレルについての複数のネットワークモデルを含み、それぞれのネットワークモデルが複数のMHCアレルのうちの対応するMHCアレルに割り当てられ、かつ1つ以上の層に配置された一連のノードを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記ニューラルネットワークモデルが、前記ニューラルネットワークモデルのパラメータを更新することによって訓練され、少なくとも2つのネットワークモデルの前記パラメータが、少なくとも1回の訓練イテレーションについて一緒に更新される、請求項27に記載の方法。
- 前記機械学習させた提示モデルが、ノードの1つ以上の層を含むディープラーニングモデルである、請求項26〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つ以上のMHCアレルが、クラスI MHCアレルである、請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
- コンピュータプロセッサと、
前記コンピュータプロセッサにより実行されると、前記コンピュータプロセッサに、
対象の腫瘍細胞及び正常細胞からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシークエンシングデータのうちの少なくとも1つを取得することであって、前記ヌクレオチドシークエンシングデータが、前記腫瘍細胞からの前記ヌクレオチドシークエンシングデータと前記正常細胞からの前記ヌクレオチドシークエンシングデータとを比較することにより特定された新生抗原のセットのそれぞれのペプチド配列を表すデータを取得するために用いられ、各新生抗原のペプチド配列が、前記ペプチド配列を前記対象の前記正常細胞から特定される対応する野生型のペプチド配列とは異なるものとする少なくとも1つの変化を含む、前記取得すること;
前記新生抗原のそれぞれのペプチド配列を、対応する数値ベクトルにコード化することであって、各数値ベクトルが、前記ペプチド配列を構成する複数のアミノ酸と前記ペプチド配列内の前記アミノ酸の位置のセットとに関する情報を含む、前記コード化すること;
前記新生抗原のそれぞれのペプチド配列を、前記対象の前記ヌクレオチドシークエンシングデータの複数のkマーブロックのうちの1つ以上のkマーブロックと関連付けること;
前記新生抗原のセットについて提示尤度のセットを生成するために、前記数値ベクトル及び前記1つ以上の関連付けられたkマーブロックを機械学習させた提示モデルに入力することであって、前記セット内の各提示尤度が、対応する新生抗原が1つ以上のMHCアレルによって前記対象の前記腫瘍細胞の表面上に提示される尤度を表し、前記機械学習させた提示モデルが、
訓練データセットに少なくとも基づいて特定される複数のパラメータであって、前記訓練データセットが、
複数の試料の各試料について、前記試料中に存在するものとして特定されたMHCアレルのセット内の少なくとも1つのMHCアレルに結合したペプチドの存在を測定する質量分析によって得られた標識、
前記試料のそれぞれについて、前記ペプチドを構成する複数のアミノ酸と前記ペプチド内の前記アミノ酸の位置のセットとに関する情報を含む数値ベクトルとしてコード化された訓練ペプチド配列、及び
前記試料のそれぞれについて、前記試料の前記訓練ペプチド配列のそれぞれについて、前記訓練ペプチド配列と、前記訓練ペプチド配列の前記ヌクレオチドシークエンシングデータの前記kマーブロックのうちの1つ以上のkマーブロックとの間の関連付け
を含み、
前記複数のパラメータのサブセットが、前記1つ以上のkマーブロックにおける提示ホットスポットの有無を表す、前記複数のパラメータと、
入力として受け取られた前記数値ベクトル及び前記1つ以上のkマーブロックと、前記数値ベクトル、前記1つ以上のkマーブロック、及び前記パラメータに基づいた出力として生成された前記提示尤度との間の関係を表す関数と
を含む、
前記入力すること;
選択された新生抗原のセットを生成するために、前記新生抗原のセットのサブセットを、前記提示尤度のセットに基づいて選択すること;ならびに
前記選択された新生抗原のセットを返すこと
を行わせるコンピュータプログラム命令を格納したメモリと
を含む、コンピュータシステム。
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