CN106413745A - 用于提高效应t细胞与调节性t细胞的比率的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于提高效应T细胞与调节性T细胞的比率的方法。本发明还涉及治疗肿瘤、防御肿瘤以及诱导对肿瘤的免疫应答的方法，所述方法包括将重组李斯特菌菌株施用于受试者的步骤，所述菌株包含含有LLO片段和肿瘤相关抗原的融合肽。

Description

用于提高效应T细胞与调节性T细胞的比率的方法和组合物

政府利益

本发明获得合作研发协议(Cooperative Research and DevelopmentAgreement,CRADA)#02648的部分支持。美国政府可能具有本发明中的某些权利。

技术领域

本发明涉及用于提高效应T细胞与调节性T细胞的比率的方法。本发明还涉及治疗肿瘤、防御肿瘤以及诱导对肿瘤的免疫应答的方法，该方法包括将重组李斯特菌(Listeria)菌株施用于受试者的步骤，该菌株包含含有LLO片段和肿瘤相关抗原的融合肽。

背景技术

单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)(Lm)是导致李斯特菌溶血的革兰氏阳性兼性细胞内病原体。一旦侵入宿主细胞，Lm即可通过产生裂解血管膜的成孔蛋白李斯特菌溶血素O(LLO)而逃离吞噬溶酶体，使其进入细胞质，在该处根据肌动蛋白多聚化蛋白(ActA)的迁移性复制并传播到相邻的细胞。在细胞质中，Lm分泌蛋白被蛋白酶降解，并加工为内质网中与MHC I类分子相关的肽。此独特特性使其成为非常有吸引力的癌症疫苗载体，因为肿瘤抗原可通过MHC I类分子呈递，以活化肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。

虽然预防性HPV疫苗显示出能有效地防御HPV感染和宫颈上皮内瘤样病变(CIN)的发展，但晚期宫颈癌患者的治疗疫苗仍在开发中。基于Lm的减毒活疫苗Lm-LLO-E7疫苗的构建取得了一些进展，该疫苗产生并分泌由截短的LLO和全长E7抗原组成的融合蛋白。据显示，Lm-LLO-E7能够诱导小鼠中已建立的HPV永生化TC-1肿瘤的完全消退。Lm-LLO-E7诱导的抗肿瘤活性主要由CD8+T细胞介导，因为这些细胞的缺乏完全消除了肿瘤生长的抑制，并且还观察到Lm-LLO-E7疫苗减少了调节性T细胞(Treg)。Treg被鉴定为CD4+FoxP3+(或首次发现时CD4+CD25+)T细胞，是抑制免疫性的小群体。

可以想象，Lm-LLO-E7诱导的Treg减少可有助于其抗肿瘤效应，但Lm LLO-E7疫苗诱导Treg减少的方式仍不清楚。需要通过开发操纵Treg的新型治疗策略来鉴定Lm-LLO-E7引起Treg减少的机制，以进一步改善其抗肿瘤功效。

本发明提供有效且安全的免疫疗法，该疗法详细描述了可如何克服调节性T细胞的免疫抑制效应，以触发有用的免疫应答。此免疫疗法采用减毒重组李斯特菌，该减毒重组李斯特菌包含内源性dal、dat和actA的突变，并且游离型表达N末端截短的LLO。

发明内容

在一个实施例中，本发明涉及引起患有所述肿瘤的受试者中的抗肿瘤T细胞应答的方法，该方法包括将包含重组核酸的重组李斯特菌菌株施用于所述受试者的步骤，所述核酸分子包含编码重组多肽的第一开放阅读框和编码代谢的第二开放阅读框，其中所述重组多肽包含融合至异源性抗原或其片段的截短的LLO蛋白，其中所述李斯特菌包含内源性丙氨酸消旋酶基因(dal)、D-氨基酸转移酶基因(dat)和actA基因中的突变，其中所述T细胞应答包括提高所述受试者的脾脏中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率。在另一个实施例中，引起患有肿瘤或癌症的受试者中的抗肿瘤T细胞应答使得可以治疗所述受试者中的所述肿瘤或癌症。在另一个实施例中，引起患有肿瘤或癌症的受试者中的抗肿瘤T细胞应答防止所述受试者中转移的建立。

在另一个实施例中，本发明涉及用于提高受试者的脾脏中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率的方法，该方法包括将包含编码截短的LLO蛋白的重组核酸的重组李斯特菌菌株施用于所述受试者的步骤，其中所述李斯特菌包含内源性丙氨酸消旋酶基因(dal)、D-氨基酸转移酶基因(dat)和actA基因中的突变，其中所述T细胞应答包括提高效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率。

本发明的其他特征和优点将由于以下详细描述的实例和附图而变得显而易见。但是，应当理解，该详细描述和具体实例尽管指出了本发明的优选实施例，但是仅仅通过例证给出，因为本发明的精神和范围内的各种变化和修改对阅读了该详细描述的本领域技术人员而言将是显而易见的。

附图说明

以下附图形成了本说明书的一部分，将它们包括进来以进一步说明本公开的某些方面，通过参考一个或多个这些附图并结合本文提供的对具体实施例的描述可更好地理解本发明。本专利或申请文件包含至少一个用彩色表现的附图。根据请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。

图1.LmddA-LLO-E7诱导已建立的TC-1肿瘤的消退，伴随着Treg频率降低。给每只C57BL6小鼠皮下接种1×10⁵个TC-1肿瘤细胞，并且在肿瘤挑战后第10天和第17天腹膜内免疫溶于PBS(100μl)的0.1LD50LmddA-LLO-E7(1×10⁸CFU)、Lm-E7(1×10⁶CFU)或LmddA-LLO(1×10⁸CFU)。每周两次使用电子卡尺测量肿瘤。肿瘤体积以下式计算：长×宽×宽/2。当肿瘤直径达到大约2.0cm时或在第24天处死小鼠，以进行流式细胞分析。(A)从第10天至第24天的平均肿瘤体积。(B)第24天的肿瘤体积。(C)存活百分比。(D)CD4+T细胞中的CD4+FoxP3+T细胞的流式细胞谱。(E)在脾脏中CD4+T细胞中的CD4+FoxP3+T细胞的百分比。(F)在脾脏中CD4+FoxP3+T细胞与CD8+T细胞的比率。(G)在肿瘤中CD4+T细胞中的CD4+FoxP3+T细胞的百分比。(H)在肿瘤中CD4+FoxP3+T细胞与CD8+T细胞的比率。数据以平均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，以及***P<0.001(Mann-Whitney检验)。数据来自3个独立的实验(A和B)，并且代表3个独立的实验(C-H)。

图2.LmddA-LLO-E7诱导已建立的TC-1肿瘤的消退。给每只C57BL6小鼠皮下接种1×10⁵个TC-1肿瘤细胞，并且在肿瘤挑战后第10天和第17天腹膜内免疫溶于PBS(100μl)的0.1LD50LmddA-LLO-E7(1×10⁸CFU)、Lm-E7(1×10⁶CFU)或LmddA-LLO(1×10⁸CFU)。每周两次使用电子卡尺测量肿瘤。肿瘤体积以下式计算：长×宽×宽/2。(A)PBS。(B)LmddA。(C)Lm-E7。(D)LmddA-LLO-E7。数据来自3个独立的实验。

图3.LmddA-LLO-E7和Lm-E7诱导相似的E7特异性CD8+T细胞应答。给每只C57BL6小鼠皮下接种1×10⁵个TC-1肿瘤细胞，并且在肿瘤挑战后第10天和第17天腹膜内免疫溶于PBS(100μl)的0.1LD50LmddA-LLO-E7(1×10⁸CFU)、LmddA-LLO(1×10⁸CFU)、LmddA(1×10⁸CFU)、Lm-E7(1×10⁶CFU)或0.5LD50野生型Lm 10403S(1×10⁴CFU)。在第24天处死小鼠，并且通过流式细胞术分析从脾脏和肿瘤分离的淋巴细胞。A.在脾脏和肿瘤中CD8+T细胞中的H-2D^b E7四聚体+CD8+T细胞的流式细胞谱。(B和C)在脾脏(B)和肿瘤(C)中CD8+T细胞中的H-2D^b E7四聚体+CD8+T细胞的百分比。(D和E)每只小鼠脾脏(D)和每百万个肿瘤细胞(E)的H-2D^b E7四聚体+CD8+T细胞数量。n＝3-10。数据代表3个独立的实验。

图4.单核细胞增多性李斯特菌足以诱导Treg频率降低。给每只C57BL6小鼠皮下接种1×10⁵个TC-1肿瘤细胞，并且在肿瘤挑战后第10天和第17天腹膜内免疫溶于PBS(100μl)的0.1LD50LmddA(1×10⁸CFU)或0.5LD50野生型Lm 10403S(1×10⁴CFU)。在第24天处死小鼠，并且通过流式细胞术分析从脾脏和肿瘤分离的淋巴细胞。(A)CD4⁺T细胞中的CD4+FoxP3+T细胞的流式细胞谱。(B)在脾脏中CD4+T细胞中的CD4+FoxP3+T细胞的百分比。(C)在脾脏中CD4+FoxP3+T细胞与CD8+T细胞的比率。(D)在肿瘤中CD4+T细胞中的CD4+FoxP3+T细胞的百分比。(E)在肿瘤中CD4+FoxP3+T细胞与CD8+T细胞的比率。数据以平均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，以及***P<0.001(Mann-Whitney检验)。数据代表3个独立的实验。

图5.单核细胞增多性李斯特菌通过优先诱导CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞扩增而降低Treg频率。给每只C57BL6小鼠皮下接种1×10⁵个TC-1肿瘤细胞，并且在肿瘤挑战后第10天和第17天腹膜内免疫溶于PBS(100μl)的0.1LD50LmddA-LLO-E7(1×10⁸CFU)、LmddA-LLO(1×10⁸CFU)、LmddA(1×10⁸CFU)、Lm-E7(1×10⁶CFU)或0.5LD50野生型Lm 10403S(1×10⁴CFU)。在第24天处死小鼠，并且通过流式细胞术分析从肿瘤分离的淋巴细胞。数据以平均值±SEM表示。n＝3-10。*P<0.05，**P<0.01(Mann-Whitney检验)。数据代表3个独立的实验。

图6.单核细胞增多性李斯特菌诱导的CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞扩增依赖于LLO并由LLO介导。给C57BL6小鼠腹膜内注射溶于PBS(100μl)的1×10⁴CFU10403S、Δhly、Δhly::pfo或hly::Tn917-lac(pAM401-hly)。在注射后第7天处死小鼠，并且通过流式细胞术分析从脾脏分离的淋巴细胞。(A)脾脏中的T细胞数量。(B)CD4+T细胞中的CD4+FoxP3+T细胞的流式细胞谱。(C)CD4+T细胞中的CD4+FoxP3+T细胞的百分比。(D)CD4+FoxP3+T细胞与CD8+T细胞的比率。*P<0.05(Mann-Whitney检验)。数据代表3个独立的实验。

图7.LmddA中截短的LLO的游离型表达诱导CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞扩增达到较高水平。给C57BL6小鼠腹膜内注射溶于PBS(100μl)的1×10⁸CFU LmddA或LmddA-LLO。在注射后第7天处死小鼠，并且通过流式细胞术分析从脾脏分离的淋巴细胞。(A)脾脏中的T细胞数量。(B)CD4+T细胞中的CD4+FoxP3+T细胞的流式细胞谱。(C)CD4+T细胞中的CD4+FoxP3+T细胞的百分比。(D)CD4+FoxP3+T细胞与CD8+T细胞的比率。(E)Ki-67+T细胞的流式细胞谱。(F)Ki-67+T细胞的百分比。(G)Ki-67+T细胞的荧光强度。数据以平均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，以及***P<0.001(Mann-Whitney检验)。数据代表3个独立的实验。

图8.Lm-E7和LmddA-LLO的组合诱导已建立的TC-1肿瘤的消退。给每只C57BL/6小鼠皮下接种1×10⁵个TC-1肿瘤细胞，并且在肿瘤挑战后第10天和第17天腹膜内免疫溶于PBS(100μl)的0.05LD50Lm-E7(5×10⁵CFU)、0.05LD50LmddA-LLO(5×10⁷CFU)、0.05LD50Lm-E7加上0.05LD50LmddA-LLO。每周两次使用电子卡尺测量肿瘤，并且肿瘤体积以下式计算：长×宽×宽/2。观察小鼠的存活，或在第24天处死小鼠，并且通过流式细胞术分析从脾脏分离的淋巴细胞。(A)从第10天至第24天的平均肿瘤体积。(B)第24天的肿瘤体积。(C)存活百分比。(D)脾脏中的T细胞数量。(E)CD4+T细胞中的CD4+FoxP3+T细胞的流式细胞谱。(F)CD4+T细胞中的CD4+FoxP3+T细胞的百分比。(G)CD4+FoxP3+T细胞与CD8+T细胞的比率。数据以平均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，以及***P<0.001(Mann-Whitney检验)。数据代表2个独立的实验。

图9.Treg的过继转移危害LmddA-LLO-E7对已建立的TC-1肿瘤的抗肿瘤功效。给每只C57BL6小鼠(11周龄)皮下注射1×10⁵个TC-1肿瘤细胞，并且在肿瘤挑战后第9天静脉注射CD4+CD25+Treg(每只1×10⁶个细胞)。在肿瘤挑战后第10天和第17天给小鼠腹膜内免疫溶于PBS(100μl)的0.1LD50LmddA-LLO-E7(1×10⁸CFU)。每周两次使用电子卡尺测量肿瘤，并且肿瘤体积以下式计算：长×宽×宽/2。在第24天处死小鼠，并且通过流式细胞术分析从脾脏分离的淋巴细胞。(A)从第10天至第24天的平均肿瘤体积。(B)第24天的肿瘤体积。(C)CD4+T细胞中的CD4+FoxP3+T细胞的流式细胞谱。(D)在脾脏中CD4+T细胞中的CD4+FoxP3+T细胞的百分比。(E)在肿瘤中CD4+T细胞中的CD4+FoxP3+T细胞的百分比。(F)脾脏中的T细胞数量。(G)每百万个肿瘤细胞的T细胞数量。数据以平均值±SEM表示。*P<0.05，**P<0.01，以及***P<0.001(Mann-Whitney检验)。数据代表2个独立的实验。

图10.LmddA不会增加Lm-E7抗肿瘤活性。给每只C57BL/6小鼠皮下接种1×10⁵个TC-1肿瘤细胞，并且在肿瘤挑战后第10天和第17天腹膜内免疫溶于PBS(100μl)的0.05LD50Lm-E7(5×10⁵CFU)、0.05LD50LmddA(5×10⁷CFU)或0.05LD50Lm-E7加上0.05LD50LmddA。使用电子卡尺测量肿瘤，并且肿瘤体积以下式计算：长×宽×宽/2。示出了第24天的肿瘤体积。数据以平均值±SEM表示。

具体实施方式

本发明在一个方面提供包含编码重组多肽的重组核酸的重组李斯特菌疫苗载体，其中重组多肽包含融合至异源性抗原的非溶血N末端李斯特菌溶血素(LLO)，其中所述李斯特菌包含内源性dal/dat和actA基因中的突变，其中所述T细胞应答包括提高所述受试者的脾脏中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率。

本发明在另一个方面提供引起患有所述肿瘤的受试者中的抗肿瘤T细胞应答的方法，该方法包括将包含重组核酸的重组李斯特菌菌株施用于所述受试者的步骤，所述核酸分子包含编码重组多肽的第一开放阅读框和编码代谢的第二开放阅读框，其中所述重组多肽包含融合至异源性抗原或其片段的截短的LLO蛋白，其中所述李斯特菌包含内源性丙氨酸消旋酶基因(dal)、D-氨基酸转移酶基因(dat)和actA基因中的突变，其中所述T细胞应答包括提高所述受试者的脾脏中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率。在另一个实施例中，引起患有肿瘤或癌症的受试者中的抗肿瘤T细胞应答使得可以治疗所述受试者中的所述肿瘤或癌症。在另一个实施例中，引起患有肿瘤或癌症的受试者中的抗肿瘤T细胞应答防止所述受试者中转移的建立。

在另一个实施例中，异源性抗原是肿瘤相关抗原。

在一个实施例中，提高所述受试者的脾脏中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率使得所述受试者中可以实现更明显的抗肿瘤应答。

在一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株缺乏抗生素抗性基因。

在另一个方面，本发明提供用于提高受试者的脾脏中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率的方法，该方法包括将包含编码截短的LLO蛋白的重组核酸的重组李斯特菌菌株施用于所述受试者的步骤，其中所述李斯特菌包含内源性丙氨酸消旋酶基因(dal)、D-氨基酸转移酶基因(dat)和actA基因中的突变，其中所述T细胞应答包括提高效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率。

在一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌能够逃离吞噬溶酶体。

在另一个实施例中，该效应T细胞包括CD4+FoxP3-T细胞。在另一个实施例中，该效应T细胞是CD4+FoxP3-T细胞。在另一个实施例中，该效应T细胞包括CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞。在另一个实施例中，该效应T细胞是CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞。在另一个实施例中，该调节性T细胞是CD4+FoxP3+T细胞。

在一个实施例中，本发明提供治疗肿瘤、防御肿瘤以及诱导对肿瘤或癌症的免疫应答的方法，该方法包括将本文提供的重组李斯特菌菌株施用于受试者的步骤。

在一个实施例中，本发明提供治疗人受试者中的肿瘤或癌症的方法，该方法包括将本文提供的重组李斯特菌菌株施用于受试者的步骤，该重组李斯特菌菌株包含含有LLO蛋白的N末端片段和肿瘤相关抗原的重组多肽，由此重组李斯特菌菌株诱导对肿瘤相关抗原的免疫应答，从而治疗人受试者中的肿瘤或癌症。在另一个实施例中，该免疫应答是T细胞应答。在另一个实施例中，该T细胞应答是CD4+FoxP3-T细胞应答。在另一个实施例中，该T细胞应答是CD8+T细胞应答。在另一个实施例中，该T细胞应答是CD4+FoxP3-和CD8+T细胞应答。

在另一个实施例中，本发明提供避免受试者罹患肿瘤或癌症的方法，该方法包括将本文提供的重组李斯特菌菌株施用于受试者的步骤。在另一个实施例中，本发明提供诱导受试者中的肿瘤消退的方法，该方法包括将本文提供的重组李斯特菌菌株施用于受试者的步骤。在另一个实施例中，本发明提供减少肿瘤或癌症的发生或复发的方法，该方法包括将本文提供的重组李斯特菌菌株施用于受试者的步骤。在另一个实施例中，本发明提供抑制受试者中的肿瘤形成的方法，该方法包括将本文提供的重组李斯特菌菌株施用于受试者的步骤。在另一个实施例中，本发明提供诱导受试者中的癌症缓解的方法，该方法包括将本文提供的重组李斯特菌菌株施用于受试者的步骤。

在一个实施例中，李斯特菌基因组包含内源性ActA基因的缺失，在一个实施例中，该基因是毒力因子。在一个实施例中，这样的缺失提供了供人类使用的进一步减毒从而更安全的李斯特菌菌株。根据该实施例，抗原多肽与LLO同框整合进李斯特菌染色体中。在另一个实施例中，该整合的核酸分子整合进ActA基因座。在另一个实施例中，编码ActA的染色体核酸被编码抗原的核酸分子替代。

在一个实施例中，本文提供的核酸分子包含编码重组多肽的第一开放阅读框，该重组多肽包含异源性抗原或其片段。在另一个实施例中，该重组多肽还包含融合至异源性抗原的N末端LLO。在另一个实施例中，本文提供的核酸分子还包含编码代谢酶的第二开放阅读框。在另一个实施例中，该代谢酶补充重组李斯特菌菌株的染色体中缺乏的内源性基因。在另一个实施例中，由该第二开放阅读框编码的代谢酶为丙氨酸消旋酶(dal)。在另一个实施例中，由该第二开放阅读框编码的代谢酶为D-氨基酸转移酶(dat)。在另一个实施例中，本文提供的李斯特菌菌株在基因组dal/dat基因中包含突变或缺失。在另一个实施例中，该李斯特菌缺乏dal/dat基因。

在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的核酸分子可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的第一开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的第二开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施例中，每个开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

“代谢酶”在另一个实施例中是指参与宿主细菌所需的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，该术语是指宿主细菌所需的营养物的合成所需的酶。在另一个实施例中，该术语是指参与宿主细菌所利用的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，该术语是指参与宿主细菌持续生长所需的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，该酶为营养物的合成所需。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在另一个实施例中，该重组李斯特菌为减毒的营养缺陷型菌株。

在一个实施例中，该减毒的菌株为Lm dal(-)dat(-)(Lmdd)。在另一个实施例中，该减毒的菌株为Lm dal(-)dat(-)ΔactA(LmddA)。LmddA基于李斯特菌疫苗载体，该载体因缺失毒力基因actA而为减毒的并保留了质粒，以通过补充dal基因用于期望的异源抗原或截短的LLO在体内和体外表达。

在另一个实施例中，该减毒菌株为Lmdda。在另一个实施例中，本文提供的李斯特菌菌株在基因组dal/dat/actA基因中包含突变或缺失。在另一个实施例中，该李斯特菌缺乏dal/dat/actA基因。在另一个实施例中，该减毒菌株为LmΔactA。在另一个实施例中，该减毒菌株为LmΔPrfA。在另一个实施例中，该减毒菌株为LmΔPlcB。在另一个实施例中，该减毒菌株为LmΔPlcA。在另一个实施例中，该菌株为任何上文提及的菌株的双突变体或三突变体。在另一个实施例中，该菌株发挥强烈的佐剂效应，这是基于李斯特菌的疫苗的固有特性。在另一个实施例中，该菌株从EGD李斯特菌骨架构建。在另一个实施例中，用于本发明的菌株为表达非溶血LLO的李斯特菌菌株。

在另一个实施例中，李斯特菌菌株为营养缺陷型突变体。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是编码维生素合成基因的基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是编码泛酸合酶的基因缺陷的。

在一个实施例中，D-丙氨酸缺陷的李斯特菌AA菌株的生成例如可以按本领域的技术人员熟知的多种方式实现，这些方式包括缺失诱变、插入诱变、以及导致生成移码突变的诱变、导致蛋白的提前终止的突变、或影响基因表达的调控序列的突变。在另一个实施例中，诱变可使用重组DNA技术或使用传统诱变技术实现，所述传统诱变技术使用诱变化学品或辐射，随后选择突变体。在另一个实施例中，由于伴随的营养缺陷型表型反转的可能性很低，缺失突变体是优选的。在另一个实施例中，可在简单的实验室培养分析中测试根据本文提供的方案生成的D-丙氨酸突变体在不存在D-丙氨酸的情况下的生长能力。在另一个实施例中，选择在不存在该化合物的情况下不能生长的那些突变体进行进一步研究。

在另一个实施例中，除上述D-丙氨酸相关基因之外，如本文所提供的涉及代谢酶合成的其他基因可用作李斯特菌诱变的靶标。

在另一个实施例中，该代谢酶补充重组细菌菌株的染色体其余部分中缺乏的内源性代谢基因。在另一个实施例中，该内源性代谢基因在染色体中是突变的。在另一个实施例中，该内源性代谢基因从染色体缺失。在另一个实施例中，所述代谢酶是氨基酸代谢酶。在另一个实施例中，所述代谢酶催化用于所述重组李斯特菌菌株中的细胞壁合成的氨基酸的形成。在另一个实施例中，所述代谢酶是丙氨酸消旋酶。在另一个实施例中，所述代谢酶是D-氨基酸转移酶。每种可能性代表了本文提供的方法和组合物的独立实施例。

在一个实施例中，所述营养缺陷型李斯特菌菌株包含游离型表达载体，该游离型表达载体包含补充所述营养缺陷型李斯特菌菌株的营养缺陷体的代谢酶。在另一个实施例中，该构建体以游离型形式包含于李斯特菌菌株中。在另一个实施例中，外源抗原从重组李斯特菌菌株携带的载体表达。在另一个实施例中，所述游离型表达载体缺乏抗生素抗性标记。在一个实施例中，如本文所提供的方法和组合物的抗原融合至包含PEST序列的多肽。在另一个实施例中，所述包含PEST序列的多肽是截短的LLO。在另一个实施例中，所述包含PEST序列的多肽是ActA。

在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是氨基酸代谢酶缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是D-谷氨酸合酶基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是dat基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是dal基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是dga基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是二氨基庚二酸合成中涉及到的基因缺陷的。CysK.在另一个实施例中，该基因为维生素-B12非依赖性甲硫氨酸合酶。在另一个实施例中，该基因为trpA。在另一个实施例中，该基因为trpB。在另一个实施例中，该基因为trpE。在另一个实施例中，该基因为asnB。在另一个实施例中，该基因为gltD。在另一个实施例中，该基因为gltB。在另一个实施例中，该基因为leuA。在另一个实施例中，该基因为argG。在另一个实施例中，该基因为thrC。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是一个或多个上文描述的基因缺陷的。

在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是合酶基因缺陷的。在另一个实施例中，该基因为氨基酸合成基因。在另一个实施例中，该基因为folP。在另一个实施例中，该基因为二氢尿苷合酶家族蛋白。在另一个实施例中，该基因为ispD。在另一个实施例中，该基因为ispF。在另一个实施例中，该基因为磷酸烯醇丙酮酸合酶。在另一个实施例中，该基因为hisF。在另一个实施例中，该基因为hisH。在另一个实施例中，该基因为fliI。在另一个实施例中，该基因为核糖体大亚基假尿苷合酶。在另一个实施例中，该基因为ispD。在另一个实施例中，该基因为双功能GMP合酶/谷氨酰胺氨基转移酶蛋白。在另一个实施例中，该基因为cobS。在另一个实施例中，该基因为cobB。在另一个实施例中，该基因为cbiD。在另一个实施例中，该基因为尿卟啉-III C-甲基转移酶/尿卟啉原-III合酶。在另一个实施例中，该基因为cobQ。在另一个实施例中，该基因为uppS。在另一个实施例中，该基因为truB。在另一个实施例中，该基因为dxs。在另一个实施例中，该基因为mvaS。在另一个实施例中，该基因为dapA。在另一个实施例中，该基因为ispG。在另一个实施例中，该基因为folC。在另一个实施例中，该基因为柠檬酸合酶。在另一个实施例中，该基因为argJ。在另一个实施例中，该基因为3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶。在另一个实施例中，该基因为吲哚-3-甘油-磷酸合酶。在另一个实施例中，该基因为邻氨基苯甲酸合酶/谷氨酰胺氨基转移酶组分。在另一个实施例中，该基因为menB。在另一个实施例中，该基因为甲基萘醌特异的异分支酸合酶。在另一个实施例中，该基因为磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶I或II。在另一个实施例中，该基因为磷酸核糖氨基咪唑-琥珀酸甲酰胺合酶。在另一个实施例中，该基因为carB。在另一个实施例中，该基因为carA。在另一个实施例中，该基因为thyA。在另一个实施例中，该基因为mgsA。在另一个实施例中，该基因为aroB。在另一个实施例中，该基因为hepB。在另一个实施例中，该基因为rluB。在另一个实施例中，该基因为ilvB。在另一个实施例中，该基因为ilvN。在另一个实施例中，该基因为alsS。在另一个实施例中，该基因为fabF。在另一个实施例中，该基因为fabH。在另一个实施例中，该基因为假尿苷合酶。在另一个实施例中，该基因为pyrG。在另一个实施例中，该基因为truA。在另一个实施例中，该基因为pabB。在另一个实施例中，该基因为atp合酶基因(例如，atpC、atpD-2、aptG、atpA-2等)。

在另一个实施例中，该基因为phoP。在另一个实施例中，该基因为aroA。在另一个实施例中，该基因为aroC。在另一个实施例中，该基因为aroD。在另一个实施例中，该基因为plcB。

在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是肽转运蛋白缺陷的。在另一个实施例中，该基因为ABC转运蛋白/ATP结合/通透酶蛋白。在另一个实施例中，该基因为寡肽ABC转运蛋白/寡肽结合蛋白。在另一个实施例中，该基因为寡肽ABC转运蛋白/通透酶蛋白。在另一个实施例中，该基因为锌ABC转运蛋白/锌结合蛋白。在另一个实施例中，该基因为糖ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为磷酸转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为ZIP锌转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为EmrB/QacA家族的耐药转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为硫酸转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为质子依赖性寡肽转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为镁转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为甲酸/硝酸转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为亚精胺/腐胺ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为Na/Pi-协同转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为磷酸糖转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为谷氨酰胺ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为主要协助家族转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为甘氨酸甜菜碱/L-脯氨酸ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为钼ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为磷壁酸ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为钴ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为铵转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为氨基酸ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为细胞分裂ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为锰ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为铁化合物ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为麦芽糖/麦芽糖糊精ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为Bcr/CflA家族的耐药转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为上述蛋白之一的亚基。

在一个实施例中，本文提供了核酸分子，该核酸分子用于转化李斯特菌以便获得重组李斯特菌。在另一个实施例中，本文提供的用于转化李斯特菌的核酸缺乏毒力基因。在另一个实施例中，该核酸分子整合进李斯特菌基因组并携带非功能性毒力基因。在另一个实施例中，该毒力基因在该重组李斯特菌基因组中是突变的。在另一个实施例中，该毒力基因在该重组李斯特菌基因组中是缺失的。在另一个实施例中，该毒力基因在该重组李斯特菌基因组中是截短的。在又一个实施例中，该核酸分子用于使李斯特菌基因组中存在的内源性基因失活。在又一个实施例中，毒力基因是actA基因、inlA基因和inlB基因、inlC基因、inlJ基因、plbC基因、bsh基因、prfA基因或它们的组合。技术人员应当理解，毒力基因可以是重组李斯特菌中与毒力相关的本领域已知的任何基因。

在又一个实施例中，李斯特菌菌株是inlA突变体、inlB突变体、inlC突变体、inlJ突变体、prfA突变体、actA突变体、prfA突变体、plcB缺失突变体、plcA和plcB基因的双突变体、或actA和inlB基因的双突变体。在另一个实施例中，该李斯特菌包含这些基因的缺失或突变，无论是单独的，还是组合的。在另一个实施例中，本文提供的李斯特菌缺乏所述基因的每一个。在另一个实施例中，本文提供的李斯特菌缺乏至少1个且最多10个本文提供的任何基因，包括actA、prfA以及dal/dat基因。在一个实施例中，减毒活李斯特菌为重组李斯特菌。在另一个实施例中，该重组李斯特菌包含基因组内化素C(inlC)基因的突变或缺失。在另一个实施例中，该重组李斯特菌包含基因组actA基因和基因组内化素C基因的突变或缺失。在一个实施例中，李斯特菌向邻近细胞的迁移通过参与该过程的actA基因和/或inlC基因的缺失而被抑制，由此产生出乎意料的高水平减毒，具有增加的免疫原性，并用作疫苗的骨架。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在一个实施例中，代谢基因、毒力基因等是李斯特菌菌株的染色体中缺乏的。在另一个实施例中，代谢基因、毒力基因等是李斯特菌菌株的染色体以及任何游离型遗传元件中缺乏的。在另一个实施例中，代谢基因、毒力基因等是毒力菌株的染色体中缺乏的。在另一个实施例中，该毒力基因是染色体中突变的。在另一个实施例中，该毒力基因从染色体缺失。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在一个实施例中，为了选择包含编码代谢酶或补充本文提供的基因的质粒的营养缺陷型细菌，使转化的营养缺陷型细菌在将会选择氨基酸代谢基因或补充基因的表达的培养基上生长。在另一个实施例中，用包含用于D-谷氨酸合成的基因的质粒转化D-谷氨酸合成缺陷型细菌，并且该营养缺陷型细菌将在不存在D-谷氨酸的情况下生长，而未被该质粒转化或者不表达编码用于D-谷氨酸合成的蛋白的质粒的营养缺陷型细菌将不会生长。在另一个实施例中，如果本发明的质粒包含编码用于D-丙氨酸合成的氨基酸代谢酶的分离的核酸，则D-丙氨酸合成营养缺陷型的细菌在被转化且表达所述质粒时，将在不存在D-丙氨酸的情况下生长。这样的用于制备适当的培养基(其包含或缺少必需生长因子、补充物、氨基酸、维生素、抗生素等)的方法是本领域熟知的，且可商购获得(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)。每种方法代表了本发明的独立实施例。

在另一个实施例中，一旦在适当培养基上选择了包含本发明的质粒的营养缺陷型细菌，细菌即可在存在选择压力的情况下繁殖。这样的繁殖包括使细菌在无营养缺陷因子的培养基中生长。表达氨基酸代谢酶的质粒在营养缺陷型细菌中的存在将确保，该质粒将与该细菌一起复制，从而连续地选择携带该质粒的细菌。技术人员在获知本文的公开内容和方法后将能够容易地通过调整培养基(包含质粒的营养缺陷型细菌在其中生长)的体积来放大李斯特菌疫苗载体的生产。

技术人员应当理解，在另一个实施例中，其他营养缺陷型菌株和互补系统适合与本发明一起使用。

在一个实施例中，N末端LLO蛋白片段和异源性抗原在另一个实施例中直接互相融合。在另一个实施例中，编码N末端LLO蛋白片段和异源性抗原的基因直接互相融合。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段和异源性抗原通过接头肽连接。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段和异源性抗原通过异源性肽连接。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段是异源性抗原的N末端。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段是融合蛋白的最N末端部分。每种可能性代表了本发明的独立实施例。如本文所提供，表达LLO的重组李斯特菌菌株出乎意料地使脾脏中CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞数量增加至高于不表达截短的LLO的重组李斯特菌菌株的水平(实例5)，从而显示CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的扩增直接由LLO介导(实例4)。如本文所进一步提供，游离型表达截短的LLO的重组李斯特菌，通过诱导CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T的扩增，而不减少Treg的数量，出乎意料地提高了CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞与CD4+FoxP3+T细胞(调节性T细胞或Treg)的比率，从而以成比例的方式降低Treg频率。如本文所进一步提供，在含LLO的融合蛋白的背景中，表达HPV-E7的重组李斯特菌优先诱导CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞扩增，这增加了疫苗的抗肿瘤活性，并且上调了CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞上而不是CD4+FoxP3+T细胞上趋化因子受体CCR5和CXCR3的表达，从而显示了CCR5和CXCR3是Th1和CD8+T细胞运输关键的(参见实例7)。

在一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株包含重组多肽。在另一个实施例中，本文提供的重组李斯特菌菌株表达重组多肽。在另一个实施例中，该重组李斯特菌菌株包含编码重组多肽的质粒。在另一个实施例中，重组李斯特菌菌株包含编码本文提供的重组多肽的重组核酸。在另一个实施例中，本文提供的质粒是不整合进所述重组李斯特菌菌株染色体中的游离型质粒。在另一个实施例中，该质粒是整合进所述李斯特菌菌株染色体中的整合型质粒。在另一个实施例中，该质粒为多拷贝质粒。

在另一个实施例中，本发明的方法还包括用包含本文提供的减毒李斯特菌菌株的免疫原性组合物强化受试者。在另一个实施例中，本发明的方法包括施用强化剂量的免疫原性组合物的步骤，该组合物包含本文提供的减毒李斯特菌菌株。在另一个实施例中，该强化剂量是所述免疫原性组合物的替代形式。在另一个实施例中，本发明的方法还包括将强化免疫原性组合物施用于受试者的步骤。在一个实施例中，该强化剂量在所述免疫原性组合物的单次初免剂量之后。在另一个实施例中，单次强化剂量在初免剂量后施用。在另一个实施例中，两次强化剂量在初免剂量后施用。在另一个实施例中，三次强化剂量在初免剂量后施用。在一个实施例中，包含本文提供的减毒李斯特菌的免疫原性组合物的初免和强化剂量之间的周期由技术人员以实验方法确定。在另一个实施例中，该剂量由技术人员以实验方法确定。在另一个实施例中，初免和强化剂量之间的周期为1周，在另一个实施例中为2周，在另一个实施例中为3周，在另一个实施例中为4周，在另一个实施例中为5周，在另一个实施例中为6-8周，在又一个实施例中强化剂量在免疫原性组合物的初免剂量后8-10周施用。

异源性“初免强化”策略对于增强免疫应答和防御众多病原体是有效的。Schneider et al.,Immunol.Rev.170:29-38(1999)；Robinson,H.L.,Nat.Rev.Immunol.2:239-50(2002)；Gonzalo,R.M.et al.,Strain 20:1226-31(2002)；Tanghe,A.,Infect.Immun.69:3041-7(2001)。抗原以不同形式在初免和强化注射中提供似乎使对该抗原的免疫应答最大化。以DNA菌株初免，接着以佐剂中的蛋白或者通过病毒载体递送编码抗原的DNA来强化似乎是改善抗原特异性抗体以及各自的CD4+T细胞应答或CD8+T细胞应答的最有效方式。Shiver J.W.et al.,Nature 415:331-5(2002)；Gilbert,S.C.et al.,Strain20:1039-45(2002)；Billaut-Mulot,O.et al.,Strain 19:95-102(2000)；Sin,J.I.etal.,DNA Cell Biol.18:771-9(1999)。最近的来自猴疫苗接种研究的数据提示，当以HIVgag DNA对猴进行初免接种后接着以表达HIV gag的腺病毒载体(Ad5-gag)强化时，向编码HIV gag抗原的DNA添加CRL1005泊洛沙姆(12kDa,5％POE)增强了T细胞应答。针对DNA/泊洛沙姆初免和随后的Ad5-gag强化的细胞免疫应答强于以DNA(无泊洛沙姆)初免和随后进行Ad5-gag强化所诱导的应答或者针对单独的Ad5-gag的应答。Shiver,J.W.et al.Nature415:331-5(2002)。美国专利申请公开US 2002/0165172 A1描述了以编码抗原的免疫原性部分的载体构建体和包含抗原的该免疫原性部分的蛋白同时施用，由此产生免疫应答。该文献仅限于乙型肝炎抗原和HIV抗原。此外，美国专利No.6,500,432涉及通过以所关注的多核苷酸和多肽同时施用来增强核酸疫苗接种的免疫应答的方法。根据该专利，同时施用意指在相同的免疫应答期间，优选地在彼此的0-10天或3-7天内施用多核苷酸和多肽。该专利所考虑的抗原包括：肝炎(所有形式)、HSV、HIV、CMV、EBV、RSV、VZV、HPV、脊髓灰质炎、流感、寄生虫(例如，来自疟原虫(Plasmodium)属)以及病原体细菌(包括但不限于结核杆菌(M.Tuberculosis)、麻风杆菌(M.leprae)、衣原体(Chlamydia)、志贺氏菌(Shigella)、伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、肠毒素大肠杆菌(E.coli)、伤寒沙门氏菌(S.typhosa)、幽门螺旋杆菌(H.pylori)、霍乱弧菌(V.cholerae)、百日咳杆菌(B.pertussis)等)抗原等等。通过引用将以上所有文献全文并入本文。

在另一个实施例中，重组李斯特菌菌株用于强化接种。在另一个实施例中，用于强化接种的重组李斯特菌菌株与用于初始的“初免”接种的菌株相同。在另一个实施例中，该强化菌株不同于初免菌株。在另一个实施例中，用于强化接种的重组免疫检查点抑制剂与用于初始的“初免”接种的抑制剂相同。在另一个实施例中，该强化抑制剂不同于初免抑制剂。在另一个实施例中，将相同的剂量用于初免和强化接种。在另一个实施例中，将大剂量用于强化。在另一个实施例中，将小剂量用于强化。在另一个实施例中，本发明的方法还包括将强化疫苗接种施用于受试者的步骤。在一个实施例中，该强化疫苗接种在单次初免疫苗接种之后。在另一个实施例中，单次强化疫苗接种在初免疫苗接种后施用。在另一个实施例中，两次强化疫苗接种在初免疫苗接种后施用。在另一个实施例中，三次强化疫苗接种在初免疫苗接种后施用。在一个实施例中，初免和强化菌株之间的周期由技术人员通过实验确定。在另一个实施例中，初免和强化菌株之间的周期为1周，在另一个实施例中为2周，在另一个实施例中为3周，在另一个实施例中为4周，在另一个实施例中为5周，在另一个实施例中为6-8周，在又一个实施例中强化菌株在初免菌株后8-10周施用。

在一个实施例中，本发明的处理方案为治疗性的。在另一个实施例中，该方案为预防性的。在另一个实施例中，将本发明的组合物用于保护人们免于诸如乳腺癌的癌症或其他类型的肿瘤的风险，因为家族性遗传或其他情况使得它们易于罹患这些类型的疾病，如技术人员将理解的那样。在另一个实施例中，本文提供的组合物在通过手术、常规化疗或放疗摧毁肿瘤生长后用作癌症免疫疗法。在这些治疗后，施用本发明的疫苗，以使得对疫苗的肿瘤抗原的CTL应答破坏剩余的转移并延长癌症的缓解。在另一个实施例中，将本发明的疫苗用于影响之前建立的肿瘤的生长并杀死现有的肿瘤细胞。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在一个实施例中，本文提供的方法包括用本发明的重组李斯特菌菌株强化人受试者的步骤。在另一个实施例中，该方法还包括用包含E7抗原的免疫原性组合物强化人受试者的步骤。在另一个实施例中，该方法还包括用免疫原性组合物强化人受试者的步骤，该组合物引导受试者的细胞表达E7抗原。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在另一个实施例中，“强化”是指给受试者施用另外的疫苗剂量或另外的疗法剂量。在本发明方法的另一个实施例中，施用2次强化(或总共3次接种)。在另一个实施例中，施用3次强化。在另一个实施例中，施用4次强化。在另一个实施例中，施用5次强化。在另一个实施例中，施用6次强化。在另一个实施例中，施用超过6次强化。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在一个实施例中，本文提供的方法包括将重组李斯特菌与另外的疗法共施用的步骤。在另一个实施例中，该另外的疗法是手术、化疗、免疫疗法或它们的组合。在另一个实施例中，该另外的疗法在重组李斯特菌的施用之前。在另一个实施例中，该另外的疗法在重组李斯特菌的施用之后。在另一个实施例中，该另外的疗法是抗体疗法。在另一个实施例中，该抗体疗法是抗PD1、抗CTLA4。在另一个实施例中，该重组李斯特菌以增大剂量施用，以提高效应T细胞与调节性T细胞的比率，并产生更强大的抗肿瘤免疫应答。技术人员将会理解，抗肿瘤免疫应答可通过给患有肿瘤的受试者提供细胞因子进一步增强，该细胞因子包括但不限于IFN-γ、TNF-α以及本领域已知的增强细胞免疫应答的其他细胞因子，这些细胞因子中的一些可见于美国专利No.6,991,785，该专利以引用方式并入本文。

在一些实施例中，术语“抗体”是指完整分子以及它们的功能片段，诸如能够与本文所述的所需靶标特异性相互作用，例如结合到吞噬细胞的Fab、F(ab’)2和Fv。在一些实施例中，该抗体片段包括：

(1)Fab，即包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段，它可通过用木瓜蛋白酶消化全抗体以生成完整轻链和一条重链的一部分来制备；

(2)Fab’，即这样的抗体分子的片段：其可通过用胃蛋白酶处理全抗体，然后还原，以生成完整轻链和重链的一部分来获得；每个抗体分子获得两个Fab’片段；

(3)(Fab’)2，即这样的抗体的片段：其可通过用胃蛋白酶处理全抗体，然后不用还原来获得；F(ab’)2是两个Fab’片段通过两个二硫键保持在一起形成的二聚体；

(4)Fv，即包含轻链可变区和重链可变区的基因工程片段，所述轻链可变区和重链可变区以两条链表达；以及

(5)单链抗体(”SCA”)，即包含轻链可变区和重链可变区的基因工程分子，所述轻链可变区和重链可变区通过合适的多肽接头连接为基因融合的单链分子。

这些片段的制备方法是本领域已知的。(参见例如Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1988，该文献以引用的方式并入本文)。

在一些实施例中，抗体片段可通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵细胞培养物或其他蛋白表达系统)中表达编码该片段的DNA来制备。

在一些实施例中，抗体片段可通过常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全抗体获得。例如，抗体片段可通过用胃蛋白酶对抗体进行酶裂解，从而得到以F(ab’)2表示的5S片段来制备。该片段可使用硫醇还原剂，以及任选地使用从二硫键的裂解获得的巯基基团的封端基团进一步裂解，以生成3.5S Fab’单价片段。或者，使用胃蛋白酶进行酶裂解直接生成两个单价Fab’片段和Fc片段。这些方法例如由Goldenberg在美国专利No.4,036,945和4,331,647以及其中包含的参考文献中进行了描述，这些专利的全文据此以引用的方式并入。还可参见Porter,R.R.,Biochem.J.,73:119-126,1959。只要片段结合到由完整抗体识别的抗原，也可使用裂解抗体的其他方法，诸如分离重链以形成单价轻链-重链片段，进一步裂解片段，或其他酶学、化学或基因技术。

Fv片段包含VH和VL链的缔合。该缔合可以是非共价的，如Inbar et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 69:2659-62,1972中所述。或者，可变链可通过分子间二硫键连接，或通过化合物诸如戊二醛交联。优选地，Fv片段包含通过肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(sFv)通过构建包含DNA序列的结构基因来制备，该DNA序列编码通过寡核苷酸连接的VH和VL域。该结构基因插入表达载体，随后将该表达载体引入宿主细胞诸如大肠杆菌。重组宿主细胞合成具有桥接两个V域的接头肽的单条多肽链。sFv的制备方法例如在Whitlow and Filpula,Methods,2:97-105,1991；Bird et al.,Science 242:423-426,1988；Pack et al.,Bio/Technology 11:1271-77,1993；以及Ladner等人的美国专利No.4,946,778中有所描述，这些文献全文据此以引用的方式并入。

抗体片段的另一种形式是编码单互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可通过构建编码所关注的抗体的CDR的基因获得。这样的基因例如使用聚合酶链式反应合成产抗体细胞的RNA的可变区来制备。参见例如Larrick and Fry,Methods,2:106-10,1991。

在一些实施例中，如本文所述的抗体或片段可包括抗体的“人源化形式”。在一些实施例中，术语“抗体的人源化形式”是指非人(如鼠科动物)抗体，它是免疫球蛋白的嵌合分子、免疫球蛋白链或其包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab').sub.2或抗体的其他抗原结合子序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中形成受体的互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔子的CDR的残基替代。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人残基替代。人源化抗体还可包含既不存在于受体抗体也不存在于导入CDR或框架序列中的残基。一般来讲，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个且通常两个可变域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些FR区。最佳地，人源化抗体还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白恒定区的至少一部分[Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。

人源化非人抗体的方法是本领域熟知的。一般来讲，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为导入残基，它们通常取自导入可变域。人源化基本上可按照Winter及其同事的方法[Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988)]，通过将啮齿动物CDR或CDR序列替换为人抗体的对应序列来进行。因此，这样的人源化抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中远小于完整人可变域被非人物种的对应序列替代。在实施过程中，人源化抗体是通常其中一些CDR残基以及可能地一些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基替代的人抗体。

人抗体也可使用本领域已知的各种技术，包括噬菌体展示文库制备[Hoogenboomand Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991)]。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于人单克隆抗体的制备[Cole et al.,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)和Boerner et al.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)]。相似地，人可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物如小鼠来制备，其中该内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活。在挑战后，观察人抗体的产生，该抗体在所有方面与人密切相似，包括基因重排、组装和抗体谱。该方法例如在美国专利No.5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016和以下科学出版物中有所描述：Marks et al.,Bio/Technology 10,779-783(1992)；Lonberg etal.,Nature 368 856-859(1994)；Morrison,Nature 368 812-13(1994)；Fishwild etal.,Nature Biotechnology 14,845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14,826(1996)；Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995)。

术语“表位”或“抗原决定簇”是指免疫球蛋白或抗体或其片段特异性结合的抗原上的位点。表位可从通过蛋白的三级折叠并置的连续氨基酸或不连续氨基酸形成。从连续氨基酸形成的表位通常保持暴露至变性溶剂，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常丢失。表位通常包括处于独特空间构象的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。表位空间构象的确定方法包括例如X射线晶体学和二维核磁共振。

在一个实施例中，本发明的组合物包含治疗性或免疫调节性单克隆抗体。在另一个实施例中，本发明的组合物包含Lm菌株和治疗性或免疫调节性单克隆抗体。在另一个实施例中，本发明的组合物包含治疗性或免疫调节性单克隆抗体，其中该组合物不包含本文提供的李斯特菌菌株。

在一个实施例中，该异源性抗原是肿瘤相关抗原。在另一个实施例中，该肿瘤相关抗原为HPV-E7。在另一个实施例中，该抗原为HPV-E6。在另一个实施例中，该抗原为Her-2。在另一个实施例中，该抗原为NY-ESO-1。在另一个实施例中，该抗原为端粒酶。在另一个实施例中，该抗原为SCCE。在另一个实施例中，该抗原为WT-1。在另一个实施例中，该抗原为HIV-1Gag。在另一个实施例中，该抗原为蛋白酶3。在另一个实施例中，该抗原为酪氨酸酶相关蛋白2。在另一个实施例中，该抗原为PSA(前列腺特异性抗原)。在另一个实施例中，该抗原选自E7、E6、Her-2、NY-ESO-1、端粒酶、SCCE、WT-1、HIV-1Gag、蛋白酶3、酪氨酸酶相关蛋白2、PSA(前列腺特异性抗原)。在另一个实施例中，该抗原是肿瘤相关抗原。在另一个实施例中，该抗原是感染性疾病抗原。

在另一个实施例中，该肿瘤相关抗原是血管新生抗原。在另一个实施例中，该血管新生抗原在肿瘤新生血管中的活化周细胞和周细胞二者上表达，在另一个实施例中，它与体内新血管形成相关。在另一个实施例中，该血管新生抗原是HMW-MAA。在另一个实施例中，该血管新生抗原是本领域已知的抗原，并且在WO2010/102140中提供，该专利以引用的方式并入本文。

在一个实施例中，本发明的组合物诱导强烈的干扰素-γ刺激，该干扰素-γ在一个实施例中具有抗血管新生性质。在一个实施例中，本发明的李斯特菌诱导强烈的干扰素-γ刺激，该干扰素-γ在一个实施例中具有抗血管新生性质(Dominiecki et al.,CancerImmunol Immunother.2005年5月；54(5):477-88.2004年10月6日电子版，该文献全文以引用的方式并入本文；Beatty and Paterson,J Immunol.2001年2月15日；166(4):2276-82，该文献全文以引用的方式并入本文)。在一个实施例中，李斯特菌的抗血管新生性质通过CD4⁺T细胞介导(Beatty and Paterson,2001)。在另一个实施例中，李斯特菌的抗血管新生性质通过CD8⁺T细胞介导。在另一个实施例中，因李斯特菌疫苗接种导致的IFN-γ分泌由NK细胞、NKT细胞、Th1CD4⁺T细胞、TC1CD8⁺T细胞或它们的组合介导。

在另一个实施例中，本发明的组合物诱导一种或多种抗血管新生蛋白或因子的生成。在一个实施例中，该抗血管新生蛋白为IFN-γ。在另一个实施例中，该抗血管新生蛋白为色素上皮衍生因子(PEDF)、血管新生抑制素、内皮抑素、fms样酪氨酸激酶(sFlt)-1或可溶性内皮因子(sEng)。在一个实施例中，本发明的李斯特菌参与抗血管新生因子的释放，由此，在一个实施例中，除了作为用于将抗原引入受试者的载体之外还具有治疗作用。每个李斯特菌菌株及其类型代表了本发明的独立实施例。

在其他实施例中，用于本文提供的组合物和方法的抗原来源于真菌病原体、细菌、寄生虫、蠕虫或病毒。在另一个实施例中，该抗原选自破伤风类毒素、来自流感病毒的血凝素分子、白喉类毒素、HIV gp120、HIV gag蛋白、IgA蛋白酶、胰岛素肽B、马铃薯粉痂病菌(Spongospora subterranea)抗原、弧菌抗原、沙门氏菌(Salmonella)抗原、肺炎球菌抗原、呼吸道合胞体病毒抗原、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)外膜蛋白、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)脲酶、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)菌毛蛋白、淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)菌毛蛋白、黑素瘤相关抗原(TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、gp-100、酪氨酸酶、MART-1、HSP-70、β-HCG)、来自HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35或HPV-45型人类乳头瘤病毒的人类乳头瘤病毒抗原E1和E2、肿瘤抗原CEA、突变或者其他形式的ras蛋白、突变或者其他形式的p53蛋白、Muc1、间皮素、EGFRVIII或pSA。

在其他实施例中，用于本文提供的组合物和方法的抗原与以下疾病之一相关：霍乱、白喉、嗜血杆菌、甲型肝炎、乙型肝炎、流感、麻疹、脑膜炎、腮腺炎、百日咳、天花、肺炎球菌肺炎、脊髓灰质炎、狂犬病、风疹、破伤风、肺结核、伤寒、水痘-带状疱疹、百日咳、黄热病、来自爱迪生氏病的免疫原和抗原、过敏症、过敏反应、布鲁顿综合征、癌症、包括实体和血源性肿瘤、湿疹、桥本氏甲状腺炎、多肌炎、皮肌炎、1型糖尿病、获得性免疫缺陷综合征、移植物例如肾、心脏、胰腺、肺、骨骼和肝脏移植物排斥、格雷夫斯病、多内分泌自体免疫病、肝炎、显微镜下多动脉炎、结节性多动脉炎、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、恶性贫血、乳糜泻、抗体介导的肾炎、血管球性肾炎、风湿病、全身性红斑性狼疮、类风湿性关节炎、血清阴性脊椎关节病、鼻炎、Sjogren综合征、全身性硬化症、硬化性胆管炎、韦格纳氏肉芽肿、疱疹样皮炎、牛皮癣、白癜风、多发性硬化症、脑脊髓炎、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征、巩膜、巩膜外层、色素层炎、慢性粘膜皮肤念珠菌病、风疹、婴儿短暂性低丙种球蛋白血症、骨髓瘤、X-连锁高IgM综合征、斯科特-奥尔德里奇综合征、共济失调性毛细血管扩张症、自体免疫性溶血性贫血、自体免疫性血小板减少症、自体免疫性中性粒细胞减少症、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、淀粉样变性、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、疟疾环子孢子蛋白、微生物抗原、病毒抗原、自体抗原以及李斯特菌病。

在其他实施例中，用于本文提供的组合物和方法的抗原为以下肿瘤抗原之一：MAGE(黑素瘤相关抗原E)蛋白，例如MAGE 1、MAGE 2、MAGE 3、MAGE 4、酪氨酸酶；突变体ras蛋白；突变体p53蛋白；p97黑素瘤抗原、与晚期癌症相关的ras肽或p53肽；与宫颈癌相关的HPV 16/18抗原、与乳腺癌相关的KLH抗原、与结肠直肠癌相关的CEA(癌胚抗原)、gp100、与黑素瘤相关的MART1抗原或与前列腺癌相关的PSA抗原。

作为本发明方法的靶标的HPV在另一个实施例中是HPV 16。在另一个实施例中，该HPV是HPV-18。在另一个实施例中，该HPV选自HPV-16和HPV-18。在另一个实施例中，该HPV是HPV-31。在另一个实施例中，该HPV是HPV-35。在另一个实施例中，该HPV是HPV-39。在另一个实施例中，该HPV是HPV-45。在另一个实施例中，该HPV是HPV-51。在另一个实施例中，该HPV是HPV-52。在另一个实施例中，该HPV是HPV-58。在另一个实施例中，该HPV是高风险HPV型。在另一个实施例中，该HPV是粘膜HPV型。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在一个实施例中，本文提供的疾病是感染性疾病、癌症或肿瘤。

在一个实施例中，感染性疾病为由以下病原体的任一种但并不限于它们所引起的感染性疾病：BCG/结核病、疟疾、恶性疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫、轮状病毒、霍乱、白喉-破伤风、百日咳、流感嗜血杆菌、乙型肝炎、人乳头瘤病毒、季节性流感、A型流感(H1N1)流行病、麻疹和风疹、腮腺炎、脑膜炎球菌A+C、口服脊髓灰质炎疫苗(单价、二价和三价)、肺炎球菌、狂犬病、破伤风类毒素、黄热病、炭疽芽孢杆菌(炭疽)、肉毒芽孢杆菌毒素(肉毒中毒)、鼠疫耶尔森氏菌(瘟疫)、重型天花(天花)和其他相关的痘病毒、土拉热弗朗西丝菌(兔热病)、病毒性出血热、沙状病毒(LCM、胡宁病毒、马丘波病毒、瓜纳瑞托病毒、拉沙热)、布尼亚病毒(汉坦病毒、裂谷热)、黄病毒(登革热)、丝状病毒(埃博拉病毒、马尔堡病毒)、类鼻疽伯克氏菌、伯内特考克斯体(Q热)、布鲁氏杆菌属物种(布鲁氏杆菌病)、鼻疽伯克氏菌(鼻疽)、鹦鹉热衣原体(鹦鹉热)、蓖麻毒蛋白毒素(来自蓖麻)、产气荚膜梭菌的ε毒素、葡萄球菌肠毒素B、斑疹伤寒(普氏立克次氏体)、其他立克次体、食物和水传播的病原体、细菌(致泻性大肠杆菌、病原性的弧菌、志贺氏菌属物种、沙门氏菌属BCG/、空肠弯曲杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌)、病毒(杯状病毒、甲型肝炎、西尼罗病毒、拉克罗斯(LaCrosse)病毒、加利福尼亚脑炎、VEE、EEE、WEE、日本脑炎病毒、科萨努尔森林病毒、立百病毒、汉坦病毒、蜱传出血热病毒、基孔肯雅热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、蜱传脑炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类乳头瘤病毒(HPV)、原生动物(小隐孢子虫、环孢子虫、蓝氏贾第鞭毛虫、溶组织内阿米巴、弓形虫)、真菌(微孢子虫)、黄热病、结核病(包括耐药的TB)、狂犬病、朊病毒、严重急性呼吸道综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)、Coccidioides posadasii、粗球孢子菌、细菌性阴道病、沙眼衣原体、巨细胞病毒、腹股沟肉芽肿、杜克雷嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、苍白密螺旋体、阴道毛滴虫或本领域已知的在本文中没有列出的任何其他感染性疾病。在另一个实施例中，当受试者的免疫系统可能受损时，感染在移植之后发生。

在另一个实施例中，该感染性疾病是家畜感染性疾病。在另一个实施例中，家畜疾病可传播给人，并被称作“人畜共患病”。在另一个实施例中，这些疾病包括但不限于口蹄疫、西尼罗病毒、狂犬病、犬细小病毒、猫白血病病毒、马流感病毒、传染性牛鼻气管炎(IBR)、伪狂犬病、古典猪瘟(CSF)、牛疱疹病毒1型(BHV-1)感染牛导致的IBR以及猪伪狂犬病(奥尔斯基病)、弓形虫病、炭疽、水疱性口炎病毒、马红球菌、兔热病、瘟疫(鼠疫耶尔森氏菌)、毛滴虫。

在一个实施例中，本发明的方法治疗的癌症为乳腺癌。在另一个实施例中，该癌症为宫颈癌。在另一个实施例中，该癌症为表达HER2的癌症。在另一个实施例中，该癌症为黑素瘤。在另一个实施例中，该癌症为胰腺癌。在另一个实施例中，该癌症为卵巢癌。在另一个实施例中，该癌症为胃癌。在另一个实施例中，该癌症为胰腺的癌性病变。在另一个实施例中，该癌症为肺腺癌。在另一个实施例中，其为多形性胶质母细胞瘤。在另一个实施例中，该癌症为结直肠腺癌。在另一个实施例中，该癌症为肺鳞癌。在另一个实施例中，该癌症为胃腺癌。在另一个实施例中，该癌症为卵巢表面上皮肿瘤(例如其良性的、增生性的或恶性的种类)。在另一个实施例中，其为缺氧实体肿瘤。在另一个实施例中，该癌症为口腔鳞状细胞癌。在另一个实施例中，该癌症为非小细胞肺癌。在另一个实施例中，该癌症为子宫内膜癌。在另一个实施例中，该癌症为膀胱癌。在另一个实施例中，该癌症为头颈癌。在另一个实施例中，该癌症为前列腺癌。在另一个实施例中，该癌症为口咽癌。在另一个实施例中，该癌症为肺癌。在另一个实施例中，该癌症为肛门癌。在另一个实施例中，该癌症为结肠直肠癌。在另一个实施例中，该癌症为食道癌。在另一个实施例中，该癌症为间皮瘤。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在一个实施例中，本文提供的截短的LLO包含推定的PEST氨基酸(AA)序列。在另一个实施例中，该PEST氨基酸序列为KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK(SEQ ID NO:1)。在另一个实施例中，抗原与李斯特菌的其他LM PEST AA序列的融合也将提高抗原的免疫原性。

本发明的方法和组合物的N末端LLO蛋白片段在另一个实施例中包含SEQ ID No:1。在另一个实施例中，该片段包含LLO信号肽。在另一个实施例中，该片段包含SEQ ID No:2。在另一个实施例中，该片段大约由SEQ ID No:2构成。在另一个实施例中，该片段基本上由SEQ ID No:2构成。在另一个实施例中，该片段对应于SEQ ID No:2。在另一个实施例中，该片段与SEQ ID No:2同源。在另一个实施例中，该片段与SEQ ID No:2的片段同源。用于一些实例的ΔLLO的长度为416个AA(不包括信号序列)，因为包括含有半胱氨酸484的激活域在内的氨基末端的88个残基被截短。本领域的技术人员将会知道，无激活域具体地讲无半胱氨酸484的任何ΔLLO均适用于本发明的方法和组合物。在另一个实施例中，异源性抗原与任何ΔLLO(包括PEST AA序列SEQ ID NO:1)的融合增强了抗原的细胞介导的抗肿瘤免疫性。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在另一个实施例中，用于构建本发明的疫苗的LLO蛋白具有以下序列：

MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE(GenBank登录号P13128；SEQ ID NO:3；核酸序列在GenBank登录号X15127中示出)。对应于该序列的前蛋白的前25个AA为信号序列，并在由细菌分泌时从LLO切除。因此，在本实施例中，全长活性LLO蛋白的长度为504个残基。在另一个实施例中，将以上LLO片段用作并入本发明的疫苗中的LLO片段的来源。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在另一个实施例中，用于本发明的组合物和方法的LLO蛋白的N末端片段具有以下序列：

MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYD(SEQ ID NO:2)。

在另一个实施例中，该LLO片段对应于本文所用的LLO蛋白的约AA20-442。

在另一个实施例中，该LLO片段具有以下序列：

MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTD(SEQ ID NO:4)。

在一个实施例中，本发明提供包含李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白的重组蛋白或多肽或表达所述重组蛋白或多肽的重组李斯特菌，其中所述LLO蛋白包含所述LLO蛋白的胆固醇结合域(CBD)的残基C484、W491、W492或它们的组合的突变(参见美国专利8,771,702，该专利据此以引用的方式并入本文)。在一个实施例中，所述C484、W491和W492残基是SEQ IDNO:3的残基C484、W491和W492，而在另一个实施例中，它们是可使用本领域的技术人员已知的序列比对推导的对应残基。在一个实施例中，残基C484、W491和W492是突变的。在一个实施例中，突变是置换，在另一个实施例中，突变是缺失。在一个实施例中，整个CBD是突变的，而在另一个实施例中，CBD的部分是突变的，而在另一个实施例中，仅CBD内的特定残基是突变的。

在另一个实施例中，“截短的LLO”或“ΔLLO”是指包含PEST序列的LLO的非溶血片段。在另一个实施例中，该术语是指包含PEST域的LLO片段。在另一个实施例中，该LLO片段是N末端LLO片段。在另一个实施例中，该LLO片段的长度为至少492个氨基酸(AA)。在另一个实施例中，该LLO片段的长度为492-528个AA。在另一个实施例中，该非LLO肽的长度为1-50个氨基酸。在另一个实施例中，该突变区的长度为1-50个氨基酸。在另一个实施例中，该非LLO肽的长度与该突变区相等。在另一个实施例中，该非LLO肽的长度比该突变区短，或在另一个实施例中，比该突变区长。在另一个实施例中，就溶血活性而言，该置换是失活突变。在另一个实施例中，该重组肽相对于野生型LLO表现出溶血活性的降低。在另一个实施例中，该重组肽是非溶血的。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在一个实施例中，本发明提供包含突变LLO蛋白或其片段的重组蛋白或多肽，其中该突变LLO蛋白或其片段包含该突变LLO蛋白或其片段的突变区的非LLO肽置换，该突变区包含选自C484、W491和W492的残基。

如本文所提供，突变体LLO蛋白包含野生型LLO的残基C484、W491和W492的置换。

在另一个实施例中，该LLO片段由该LLO蛋白的大约前441个AA构成。在另一个实施例中，该LLO片段由LLO的大约前420个AA构成。在另一个实施例中，该LLO片段是该LLO蛋白的非溶血形式。

在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-25构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-50构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-75构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-100构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-125构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-150构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-175构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-200构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-225构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-250构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-275构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-300构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-325构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-350构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-375构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-400构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-425构成。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在另一个实施例中，该LLO片段包含对应于以上AA范围之一的同源LLO蛋白的残基。残基编号在另一个实施例中不必精确对应以上列举的残基编号；例如，如果该同源LLO蛋白相对于本文所用的LLO蛋白具有插入或缺失，则可因此而调整该残基编号。在另一个实施例中，该LLO片段为本领域已知的任何其他LLO片段。

在另一个实施例中，同源LLO是指与LLO序列(如，SEQ ID No:2-4之一)的同一性大于70％。在另一个实施例中，同源LLO是指与SEQ ID No:2-4之一的同一性大于72％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4之一的同一性大于75％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4之一的同一性大于78％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4之一的同一性大于80％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4之一的同一性大于82％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4之一的同一性大于83％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4之一的同一性大于85％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4之一的同一性大于87％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4之一的同一性大于88％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4之一的同一性大于90％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4之一的同一性大于92％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4之一的同一性大于93％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4之一的同一性大于95％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4之一的同一性大于96％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4之一的同一性大于97％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4之一的同一性大于98％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4之一的同一性大于99％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4之一的同一性为100％。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在另一个实施例中，当提及本文提供的任何核酸序列时，术语“同源性”类似地指候选序列中与相应天然核酸序列的核苷酸相同的核苷酸的百分比。

在一个实施例中，通过序列比对的计算机算法、通过本领域中充分描述的方法来确定同源性。例如，核酸序列同源性的计算机算法分析可以包括使用多种可用软件包，比如BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLAST Enhanced Alignment Utility)、GENPEPT和TREMBL软件包。

在另一个实施例中，“同源性”是指与选自SEQ ID No:1-5的序列的同一性大于70％。在另一个实施例中，“同源性”是指与选自SEQ ID No:1-5的序列的同一性大于72％。在另一个实施例中，该同一性大于75％。在另一个实施例中，该同一性大于78％。在另一个实施例中，该同一性大于80％。在另一个实施例中，该同一性大于82％。在另一个实施例中，该同一性大于83％。在另一个实施例中，该同一性大于85％。在另一个实施例中，该同一性大于87％。在另一个实施例中，该同一性大于88％。在另一个实施例中，该同一性大于90％。在另一个实施例中，该同一性大于92％。在另一个实施例中，该同一性大于93％。在另一个实施例中，该同一性大于95％。在另一个实施例中，该同一性大于96％。在另一个实施例中，该同一性大于97％。在另一个实施例中，该同一性大于98％。在另一个实施例中，该同一性大于99％。在另一个实施例中，该同一性为100％。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在另一个实施例中，通过确定候选序列杂交来确定同源性，其方法在现有技术中有充分描述(参见，例如“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,Eds.(1985)；Sambrook et al.,2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Press,N.Y.；以及Ausubel et al.,1989,Current Protocols inMolecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y)。例如，可在中等至严格条件下进行与编码天然半胱天冬酶肽的DNA的互补序列杂交的方法。杂交条件为例如在包含以下物质的溶液中42℃下温育过夜：10-20％甲酰胺、5×SSC(150mMNaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×登哈特溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性、剪切的鲑鱼精DNA。

在一个实施例中，通过本领域充分描述的方法确定蛋白和/或肽对本文列出的任何氨基酸序列的同源性，包括免疫印迹分析，或通过建立的方法采用多种可用软件包中的任一种通过氨基酸序列的计算机算法分析进行。例如，这些软件包中的一些可包括FASTA、BLAST、MPsrch或Scanps软件包，并且可利用Smith和Waterman算法，和/或整体/局部或BLOCKS比对用于分析。每种确定同源性的方法代表了本发明的独立实施例。

在另一个实施例中，本文提供的构建体或核酸分子使用同源重组整合进李斯特菌染色体。用于同源重组的技术是本领域熟知的，并且例如在Baloglu S,Boyle SM,et al.(Immune responses of mice to vaccinia virus recombinants expressing eitherListeriamonocytogenes partial listeriolysin or Brucella abortus ribosomal L7/L12protein.Vet Microbiol 2005,109(1-2):11-7)；和Jiang LL,Song HH,et al.,(Characterization of a mutant Listeriamonocytogenes strain expressing greenfluorescent protein.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)2005,37(1):19-24)中有所描述。在另一个实施例中，如美国专利No.6,855,320所述进行同源重组。在这种情况下，通过hly启动子控制下的E7基因的染色体整合，制备表达E7的重组Lm菌株，并且包含hly信号序列以确保基因产物的分泌，从而产生称作Lm-AZ/E7的重组体。在另一个实施例中，将温敏质粒用于选择重组体。每种技术代表了本发明的独立实施例。

在另一个实施例中，该构建体或核酸分子采用转座子插入整合进李斯特菌染色体。用于转座子插入的技术在本领域是熟知的，尤其是Sun et al.(Infection andImmunity 1990,58:3770-3778)在DP-L967的构建中所描述的。在另一个实施例中，转座子诱变具有可形成稳定的基因组插入突变体的优点，但缺点是外源基因在基因组中的插入位置是未知的。

在另一个实施例中，使用噬菌体整合位点将该构建体或核酸分子整合进李斯特菌染色体(Lauer P,Chow MY et al,Construction,characterization,and use of twoListeriamonocytogenes site-specific phage integration vectors.J Bacteriol2002；184(15):4177-86)。在该方法的某些实施例中，使用噬菌体(例如U153或PSA李斯特噬菌体)的整合酶基因和连接位点将异源基因插入对应的连接位点，该连接位点可以是基因组中的任何适当的位点(例如comK，或arg tRNA基因的3’末端)。在另一个实施例中，内源性原噬菌体在构建体或异源基因整合之前从所利用的连接位点解离。在另一个实施例中，该方法产生单拷贝整合体。在另一个实施例中，本发明还包括用于临床应用的基于噬菌体的染色体整合系统，其中可使用必需酶(包括但不限于D-丙氨酸消旋酶)营养缺陷的宿主菌株，例如Lmdal(-)dat(-)。在另一个实施例中，为了避免“噬菌体解离步骤”，使用基于PSA的噬菌体整合系统。这在另一个实施例中需要通过抗生素持续选择以维持整合基因。因此，在另一个实施例中，本发明使得能建立基于噬菌体的染色体整合系统，该系统不需要以抗生素选择。作为替代，可补充营养缺陷型宿主菌株。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在另一个实施例中，该构建体或核酸分子从游离型或质粒载体表达，该游离型或质粒载体具有编码LLO、PEST或ActA序列或其片段的核酸序列。在另一个实施例中，该质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定保持在重组李斯特菌疫苗菌株中。在另一个实施例中，该质粒不赋予重组李斯特菌抗生素抗性。在另一个实施例中，该片段为功能性片段。在另一个实施例中，该片段为免疫原性片段。

在另一个实施例中，“免疫原性片段”为当给受试者单独或在本文提供的疫苗或组合物中施用时引起免疫应答的片段。在另一个实施例中，这样的片段包含必要的表位，以引起适应性免疫应答。

在另一个实施例中，“稳定保持”是指核酸分子或质粒在不存在选择(例如抗生素选择)的情况下保持10代，而没有可检测的损失。在另一个实施例中，该周期为15代。在另一个实施例中，该周期为20代。在另一个实施例中，该周期为25代。在另一个实施例中，该周期为30代。在另一个实施例中，该周期为40代。在另一个实施例中，该周期为50代。在另一个实施例中，该周期为60代。在另一个实施例中，该周期为80代。在另一个实施例中，该周期为100代。在另一个实施例中，该周期为150代。在另一个实施例中，该周期为200代。在另一个实施例中，该周期为300代。在另一个实施例中，该周期为500代。在另一个实施例中，该周期为更多代。在另一个实施例中，该核酸分子或质粒在体外(例如培养物中)稳定保持。在另一个实施例中，该核酸分子或质粒在体内稳定保持。在另一个实施例中，该核酸分子或质粒在体外和体内都稳定保持。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在另一个实施例中，“功能性片段”是免疫原性片段，当给受试者单独或在本文提供的疫苗组合物中施用时引起免疫应答。在另一个实施例中，功能性片段具有生物学活性，如技术人员所了解的并且如本文所进一步提供。

在另一个实施例中，将重组李斯特菌菌株以1×10⁹-3.31×10¹⁰CFU的剂量施用于人受试者。在另一个实施例中，该剂量为5-500×10⁸CFU。在另一个实施例中，该剂量为7-500×10⁸CFU。在另一个实施例中，该剂量为10-500×10⁸CFU。在另一个实施例中，该剂量为20-500×10⁸CFU。在另一个实施例中，该剂量为30-500×10⁸CFU。在另一个实施例中，该剂量为50-500×10⁸CFU。在另一个实施例中，该剂量为70-500×10⁸CFU。在另一个实施例中，该剂量为100-500×10⁸CFU。在另一个实施例中，该剂量为150-500×10⁸CFU。在另一个实施例中，该剂量为5-300×10⁸CFU。在另一个实施例中，该剂量为5-200×10⁸CFU。在另一个实施例中，该剂量为5-150×10⁸CFU。在另一个实施例中，该剂量为5-100×10⁸CFU。在另一个实施例中，该剂量为5-70×10⁸CFU。在另一个实施例中，该剂量为5-50×10⁸CFU。在另一个实施例中，该剂量为5-30×10⁸CFU。在另一个实施例中，该剂量为5-20×10⁸CFU。在另一个实施例中，该剂量为1-30×10⁹CFU。在另一个实施例中，该剂量为1-20×10⁹CFU。在另一个实施例中，该剂量为2-30×10⁹CFU。在另一个实施例中，该剂量为1-10×10⁹CFU。在另一个实施例中，该剂量为2-10×10⁹CFU。在另一个实施例中，该剂量为3-10×10⁹CFU。在另一个实施例中，该剂量为2-7×10⁹CFU。在另一个实施例中，该剂量为2-5×10⁹CFU。在另一个实施例中，该剂量为3-5×10⁹CFU。

在另一个实施例中，该剂量为1×10⁹个生物体。在另一个实施例中，该剂量为1.5×10⁹个生物体。在另一个实施例中，该剂量为2×10⁹个生物体。在另一个实施例中，该剂量为3×10⁹个生物体。在另一个实施例中，该剂量为4×10⁹个生物体。在另一个实施例中，该剂量为5×10⁹个生物体。在另一个实施例中，该剂量为6×10⁹个生物体。在另一个实施例中，该剂量为7×10⁹个生物体。在另一个实施例中，该剂量为8×10⁹个生物体。在另一个实施例中，该剂量为10×10⁹个生物体。在另一个实施例中，该剂量为1.5×10¹⁰个生物体。在另一个实施例中，该剂量为2×10¹⁰个生物体。在另一个实施例中，该剂量为2.5×10¹⁰个生物体。在另一个实施例中，该剂量为3×10¹⁰个生物体。在另一个实施例中，该剂量为3.3×10¹⁰个生物体。在另一个实施例中，该剂量为4×10¹⁰个生物体。在另一个实施例中，该剂量为5×10¹⁰个生物体。

每个剂量和剂量范围代表了本发明的独立实施例。

在另一个实施例中，本发明的方法的重组多肽由重组李斯特菌菌株表达。在另一个实施例中，该表达由重组李斯特菌菌株携带的核苷酸分子介导。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在另一个实施例中，本发明的方法和组合物的重组李斯特菌菌株是重组单核细胞增多性李斯特菌菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是重组西尔李斯特菌(Listeriaseeligeri)菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是重组格雷李斯特菌(Listeriagrayi)菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是重组伊万诺夫李斯特菌(Listeriaivanovii)菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是重组默里李斯特菌(Listeriamurrayi)菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是重组威耳逊李斯特菌(Listeriawelshimeri)菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是本领域已知的任何其他李斯特菌菌属物种的重组菌株。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在另一个实施例中，本发明的重组李斯特菌菌株已在动物宿主中传代。在另一个实施例中，该传代使该菌株作为疫苗载体的功效最大化。在另一个实施例中，该传代稳定李斯特菌菌株的免疫原性。在另一个实施例中，该传代稳定李斯特菌菌株的毒力。在另一个实施例中，该传代增强李斯特菌菌株的免疫原性。在另一个实施例中，该传代增强李斯特菌菌株的毒力。在另一个实施例中，该传代除去李斯特菌菌株的不稳定亚株。在另一个实施例中，该传代降低李斯特菌菌株的不稳定亚株的普遍性。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株包含编码含抗原重组肽的基因的基因组插入。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株携带包含编码含抗原重组肽的基因的质粒。在另一个实施例中，该传代如本文所述进行。在另一个实施例中，该传代通过本领域已知的任何其他方法进行。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在另一个实施例中，本发明的疫苗还包含佐剂。在另一个实施例中，本发明的方法和组合物所用的佐剂是粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白。在另一个实施例中，该佐剂包含GM-CSF蛋白。在另一个实施例中，该佐剂为编码GM-CSF的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂包含编码GM-CSF的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂为皂草苷QS21。在另一个实施例中，该佐剂包含皂草苷QS21。在另一个实施例中，该佐剂为单磷酰脂质A。在另一个实施例中，该佐剂包含单磷酰脂质A。在另一个实施例中，该佐剂为SBAS2。在另一个实施例中，该佐剂包含SBAS2。在另一个实施例中，该佐剂为含有未甲基化的CpG的寡核苷酸。在另一个实施例中，该佐剂包含含有未甲基化的CpG的寡核苷酸。在另一个实施例中，该佐剂为免疫刺激性细胞因子。在另一个实施例中，该佐剂包含免疫刺激性细胞因子。在另一个实施例中，该佐剂为编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂包含编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂为或包含羽管糖苷(quill glycoside)。在另一个实施例中，该佐剂为或包含细菌有丝分裂原。在另一个实施例中，该佐剂为或包含细菌毒素。在另一个实施例中，该佐剂为或包含本领域已知的任何其他佐剂。每种可能性代表了本发明的独立实施例。

在一个实施例中，本文提供的方法还包括在所述重组李斯特菌菌株施用之前或之后，共施用包含免疫检查点蛋白抑制剂的免疫原性组合物的步骤。在另一个实施例中，该免疫原性组合物是免疫检查点蛋白抑制剂。技术人员应当理解，本领域已知的任何免疫检查点蛋白都可被免疫检查点抑制剂靶向。免疫检查点蛋白可以选自但不限于：程序性细胞死亡蛋白1(PD1)、T细胞膜蛋白3(TIM3)、腺苷A2a受体(A2aR)和淋巴细胞活化基因3(LAG3)、杀伤细胞免疫球蛋白受体(KIR)或细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)。在另一个实施例中，该检查点抑制剂蛋白是属于B7/CD28受体超家族的蛋白。

在一个实施例中，本文提供的方法还包括共施用包含细胞因子的免疫原性组合物的步骤，该细胞因子增强所述受试者中的抗肿瘤免疫应答。起到增强免疫应答作用的细胞因子是熟知的，并且技术人员将会理解为包括I型干扰素(IFN-α/IFN-β)、TNF-α、IL-1、IL-4、IL-12、INF-γ以及已知增强免疫应答的任何其他细胞因子。在另一个实施例中，该细胞因子是炎性细胞因子。

应当理解“免疫原性组合物”可包含本文提供的重组李斯特菌，以及佐剂、免疫检查点蛋白抑制剂和本文提供的细胞因子。在另一个实施例中，免疫原性组合物包含本文提供的重组李斯特菌。在另一个实施例中，免疫原性组合物包含本领域已知的或本文提供的佐剂。在另一个实施例中，免疫原性组合物包含本领域已知的或本文提供的免疫检查点抑制剂。在另一个实施例中，免疫原性组合物包含本领域已知的或本文提供的细胞因子。还应当理解，这样的组合物增强免疫应答或提高效应T细胞与调节性T细胞比率或引起抗肿瘤免疫应答，如本文进一步提供的。

在施用本文提供的重组李斯特菌之后，单独或与本文提供的免疫原性组合物共施用时，本文提供的方法诱导外周淋巴器官中的效应T细胞扩增，从而导致肿瘤部位存在的效应T细胞增加。在另一个实施例中，本文提供的方法诱导外周淋巴器官中的效应T细胞扩增，从而导致外周存在的效应T细胞增加。效应T细胞的这种扩增导致外周中和肿瘤部位的效应T细胞与调节性T细胞的比率提高，而不影响Treg的数量，如本文所示(参见实例)。技术人员将会理解，外周淋巴器官包括但不限于脾脏、培氏斑、淋巴结、腺状肿等。在一个实施例中，效应T细胞与调节性T细胞的比率提高出现于外周中，而不影响Treg的数量。在另一个实施例中，效应T细胞与调节性T细胞的比率提高出现于外周、淋巴器官和肿瘤部位，而不影响这些部位的Treg数量。在另一个实施例中，效应T细胞的比率提高降低Treg的频率，而非这些部位的Treg总数。

在一个实施例中，使表达截短的LLO和异源性抗原的融合蛋白的减毒重组李斯特菌菌株与表达相同抗原的重组李斯特菌组合导致完全肿瘤消退，如本文所示(参见实例6)。

在另一个实施例中，本发明的重组核酸可操作地连接至驱动编码肽在李斯特菌菌株中表达的启动子/调控序列。可用于驱动基因的组成型表达的启动子/调控序列是本领域熟知的，并且包括但不限于例如李斯特菌的P_hlyA、P_ActA和p60启动子，链球菌(Streptococcus)bac启动子，灰色链霉菌(Streptomyces griseus)sgiA启动子以及苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)phaZ启动子。在另一个实施例中，编码本发明的肽的核酸的诱导型和组织特异性表达通过将编码该肽的核酸置于诱导型或组织特异性启动子/调控序列的调控下实现。可用于此目的的组织特异性或诱导型启动子/调控序列的例子包括但不限于MMTV LTR诱导型启动子和SV40晚期增强子/启动子。在另一个实施例中，采用响应于诱导剂(诸如金属、糖皮质素等等)而诱导的启动子。因此，应当理解，本发明包括使用任何已知或未知的并且能够驱动与其可操作地连接的所需蛋白的表达的启动子/调控序列。

药物组合物

在另一个实施例中，通过本领域的技术人员已知的任何方法，诸如肠胃外、癌旁侧、经粘膜、鼻内、肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内、阴道内或肿瘤内将包含本发明的疫苗和组合物的药物组合物施用于受试者。

在一个实施例中，本发明的组合物包含重组单核细胞增多性李斯特菌(Lm)菌株。

如全文所用，术语“组合物”、“疫苗”和“免疫原性组合物”可互换使用，均具有相同的含义和特性。在一些实施例中，术语“药物组合物”是指适用于药物用途，例如给需要的受试者施用的组合物。在另一个实施例中，术语“药物组合物”涵盖治疗有效量的一种或多种活性成分，包括李斯特菌菌株，以及药学上可接受的载体或稀释剂。应当理解，术语“治疗有效量”是指为给定病症和施用方案提供治疗效果的量。

本发明的组合物可用于本发明的方法，以便引发受试者中的增强的抗肿瘤T细胞应答，以便抑制受试者中的肿瘤介导的免疫抑制，或用于提高受试者的脾脏和肿瘤中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率，或它们的任何组合。

在本文提供的方法和组合物的另一个实施例中，经口施用组合物，因此配制为适用于经口施用的形式，即固体或液体制剂。适合的固体口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、药丸等。适合的液体口服制剂包括溶液、混悬液、分散剂、乳剂、油剂等。在本发明的另一个实施例中，将活性成分配制在胶囊中。根据该实施例，除活性化合物和惰性载体或稀释剂之外，本发明的组合物还包括硬明胶胶囊。

在另一个实施例中，本文提供的组合物通过液体制剂的静脉内、动脉内或肌肉内注射而施用。适合的液体制剂包括溶液、混悬剂、分散剂、乳剂、油剂等。在一个实施例中，将药物组合物静脉内施用，因此将其配制为适合静脉内施用的形式。在另一个实施例中，将药物组合物动脉内施用，因此将其配制为适合动脉内施用的形式。在另一个实施例中，将药物组合物肌肉内施用，因此将其配制为适合肌肉内施用的形式。

技术人员应当理解，术语“施用”涵盖使受试者与本发明的组合物接触。在一个实施例中，施用可在体外即在试管中实现，或在体内即活生物体(例如人)的细胞或组织内实现。在一个实施例中，本发明涵盖将本发明的李斯特菌菌株及其组合物施用于受试者。

遍及本申请，本发明的各个实施例可以以范围的形式表示。应当理解，以范围形式描述仅是出于方便和简洁，而不应认为是对发明范围的呆板限制。因此，对范围的描述应认为是已具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应理解为已具体公开了诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及该范围内的各个数值，例如1、2、3、4、5和6。这种适用性与范围的广度无关。

每当在本文中指出数值范围时，其旨在包括该指出的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语第一指定数和第二指定数“之间的范围”和“从”第一指定数“至”第二指定数的“范围”在本文中可互换使用，旨在包括第一和第二指定数以及它们之间的所有分数和整数。

如本文所用，术语“方法”是指用于实现给定任务的方式、手段、技术和工序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的专业人员已知的或易于从已知的方式、手段、技术和工序开发的那些方式、手段、技术和工序。

如本文所用，除非上下文明确地相反指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数含义。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括它们的混合物。

如本文所用，术语“约”是数量术语，意指加或减5％，或在另一个实施例中，加或减10％，或在另一个实施例中，加或减15％，或在另一个实施例中，加或减20％。

在一个实施例中，术语“受试者”是指需要治疗病症或其后遗症或易受该病症或其后遗症影响的哺乳动物(包括人)。该受试者可包括狗、猫、猪、牛、绵羊、山羊、马、大鼠和小鼠以及人。术语”受试者”不排除在所有方面都正常的个体。

为了更充分地举例说明本发明的优选实施例，提供了以下实例。然而，它们绝不应解释为限制本发明的广泛范围。

实例

材料和方法：

小鼠

雌性6-8周龄C57BL/6小鼠(除非另外指明)购自弗雷德里克国家癌症研究实验室(Frederick National Laboratory for Cancer Research,FNLCR)。小鼠在贝塞斯达国家癌症研究所(National Cancer Institute,Bethesda)的动物设施安置。实验小鼠的使用方案经美国国立卫生研究院的动物护理和使用委员会(Animal Care and Use Committee atNational Institutes of Health)批准。

细胞系

表达低水平E6和E7的TC-1细胞通过用HPV-16E6和E7以及活化的ras癌基因转化而来源于原代C57BL/6小鼠肺上皮细胞。细胞在补充有10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100μM非必需氨基酸和0.4mg/ml G418的RPMI 1640中在37℃和5％CO₂下生长。

单核细胞增多性李斯特菌菌株

LmddA-LLO-E7及其对照LmddA-LLO和LmddA在Advaxis Inc(Princeton,NJ)生成。dal datΔactA菌株(LmddA)从dal dat菌株构建，dal dat菌株基于Lm野生型菌株10403S，其中链霉素抗性基因整合进染色体。由于dal、dat和actA突变，LmddA是高度减毒的。在质粒中缺失prfA以及氯霉素抗性基因后，用pTV3质粒转化LmddA来构建LmddA-LLO-E7菌株。LLO-E7融合蛋白的表达和分泌在LmddA-LLO-E7菌株的培养物上清液中通过前述Western印迹确定。LmddA-LLO对照菌株的构建类似于LmddA-LLO-E7菌株，但pTV3质粒中缺失prfA和E7。Lm野生型菌株10403S和一些突变菌株，包括Δhly、Δhly::pfo和hly::Tn917-lac(pAM401-hly)，由D.Portnoy博士(University of California,Berkeley,CA)慷慨提供。菌株hly::Tn917-lac是野生型Lm的非溶血突变体，其中Tn917-lac融合基因插入hly基因(编码LLO的基因)，以破坏LLO溶血活性。当用表达LLO的质粒(pAM401-hly)转染该突变体时，由于具有LLO再次获得溶血活性。其中E7基因的全长整合进Lm染色体的Lm-E7菌株由Y.Paterson博士(University of Pennsylvania,Philadelphia,PA)慷慨提供。细菌在脑心浸液培养基加上链霉素(100μg/ml)中在存在或不存在D-丙氨酸(100μg/ml)的情况下培养。

试剂

荧光偶联的抗小鼠抗体CD4-PerCP-Cy5.5(GK1.5)和CD8-Brillient Violet 421(53-6.7)得自Biolegend(San Diego,CA)。FoxP3-FITC(FJK-16s)得自eBioscience(SanDiego,CA)。载有E7肽(RAHYNIVTF)SEQ ID NO:5的H-2D^b四聚体由美国国家过敏症及传染病研究所四聚体核心实验室(National Institute of Allergy and Infectious DiseasesTetramer Core Facility)和美国国立卫生研究院艾滋病研究和参考试剂计划(NationalInstitutes of Health AIDS Research and Reference Reagent Program)慷慨提供。CountBright^TM绝对计数微珠得自Life Technologies(Grand Island,NY)。

肿瘤接种和小鼠疫苗接种

第0天在小鼠的右胁腹皮下植入TC-1细胞(10⁵个细胞/小鼠)。在第10天，当肿瘤的直径变为5-6mm时，给小鼠腹膜内注射0.1LD50剂量的LmddA-LLO-E7疫苗或适当的对照。在第17天强化疫苗接种。每周两次使用电子卡尺测量肿瘤，并且肿瘤尺寸以下式计算：长×宽×宽/2。当肿瘤的直径达到2.0cm时对小鼠实施安乐死。

流式细胞术

用CD4-PerCP-Cy5.5、CD8-Brillient Violet 421和H-2D^b E7四聚体-APC给小鼠脾细胞或从肿瘤收集的细胞染色30min。将细胞固定、透化并用FoxP3-FITC染色过夜。通过流式细胞术分析细胞。对淋巴细胞设门，其中Treg被鉴定为CD4+FoxP3+。加入CountBright^TM绝对计数微珠，以进行绝对细胞数量计数。

CD4+CD25+Treg的过继转移

通过CD4+CD25+Treg试剂盒(Life Technologies,Grand Island,NY)从小鼠脾脏分离CD4+CD25+T细胞。在肿瘤细胞接种后第9天，将细胞静脉注入具有TC-1肿瘤的小鼠。在Treg转移后一天，给小鼠腹膜内免疫LmddA-LLO-E7(0.1LD50)两次，间隔一周。监测肿瘤生长。

统计

使用非参数Mann-Whitney检验分析数据。以P<0.05确定显著性。

实例1：LmddA-LLO-E7诱导已建立的TC-1肿瘤的消退，伴随着Treg频率降低

据此前报道，其中融合蛋白LLO-E7以及PrfA在李斯特菌XFL-7的prfA阴性菌株中游离型表达的基于Lm的疫苗Lm-LLO-E7诱导了已建立的TC-1肿瘤的完全消退。此处，研究了另一个高减毒的基于Lm的疫苗LmddA-LLO-E7(它在dal、dat和actA突变的Lm菌株中通过质粒生成融合蛋白LLO-E7)的抗肿瘤活性。与Lm-LLO-E7相比，LmddA-LLO-E7是进一步减毒的，因为氯霉素抗性基因和PrfA已从质粒移除。据观察，与Lm-LLO-E7类型，LmddA-LLO-E7显著抑制了已建立的TC-1肿瘤的生长(图1A和B、图2)。在大约40％的具有TC-1肿瘤的小鼠中，LmddA-LLO-E7疫苗接种两次后肿瘤完全消退(图1B和图2)。除一只小鼠复发并且在3个月时死亡之外，显示出肿瘤消退的其他小鼠(总动物的33％)存活至少6个月无复发(图1C)。虽然Lm-E7减缓了TC-1肿瘤生长，但它不能诱导完全的肿瘤消退(图1A和B以及图2)。LmddA-LLO(无E7)不能显著抑制TC-1肿瘤生长(图1A和B以及图2)，暗示先天免疫应答不足以根除TC-1肿瘤细胞。LmddA-LLO-E7和Lm-E7在脾脏中诱导了类似的H-2D^b E7四聚体+CD8+T细胞应答(图3，A-上插图、B和D)，与先前的发现一致。然后分析CD4+FoxP3+Treg。出乎意料的是，据观察，与PBS对照相比，LmddA-LLO-E7、Lm-E7和LmddA-LLO在脾脏中均显著降低了Treg频率，并且在肿瘤中更显著，尽管与Lm-E7相比，LmddA-LLO-E7和LmddA-LLO更能降低频率(图1D-H)。

实例2：Lm足以诱导Treg频率降低

最初，怀疑Treg频率降低由截短的LLO介导。但不表达截短的LLO的Lm-E7也能降低Treg频率(图1D-H)。此观察结果暗示，Lm也许能够降低Treg频率。实际上，LmddA-LLO-E7的载体对照LmddA以及野生型Lm菌株和Lm-E7的载体对照10403S均显著降低了脾脏中尤其是肿瘤中的Treg频率(图4)。

实例3：Lm通过优先诱导CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞扩增降低Treg频率

相对Treg频率(总T细胞的比例)不仅通过Treg的数量而且还通过CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的数量确定。为研究Lm如何降低Treg频率，对LmddA-LLO-E7、LmddA-LLO、LmddA、Lm-E7或Lm(10403S)处理的具有TC-1肿瘤的小鼠中CD4+FoxP3+Treg、CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的数量进行定量。如图5所示，出乎意料的是，据发现，LmddA不会显著改变肿瘤中CD4+FoxP3+T细胞的数量。它实际上增加了CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞，从而按比例降低了Treg频率。截短的LLO在LmddA-LLO和LmddA-LLO-E7中的游离型表达还增加了CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞，从而进一步降低了CD4+FoxP3+T细胞频率。野生型Lm 10403S和Lm-E7还诱导了CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的增加，而不显著改变CD4+FoxP3+T细胞的数量。Lm-LLO-E7显著增加了肿瘤中CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的密度。这些结果显示，Lm优先诱导CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞扩增，以提高CD4+FoxP3+T细胞频率。

实例4：Lm诱导的CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞扩增依赖于LLO并且由LLO介导

hly基因编码的LLO是Lm逃离宿主细胞吞噬体液泡进入细胞质所依赖的成孔溶细胞素。由于LmddA-LLO-E7、Lm-E7以及所有它们的对照均产生LLO，所以使用来源于10403S的LLO缺陷型Lm突变体(其中hly基因使用穿梭载体然后是同源重组而缺失)研究LLO是否在诱导CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的扩增中发挥作用。据发现，在单次施用后第7天Δhly Lm不能增加小鼠脾脏中的CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞(图6A)，表明CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞扩增的诱导依赖于LLO。这可以是LLO的直接效应或逃离吞噬溶酶体的必要条件。为解决这个问题，我们研究了LLO被PFO替换的LM。产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)产生的产气夹膜羧菌溶血素O(PFO)与LLO具有43％的氨基酸同一性，并且还可裂解液泡膜。将编码在hly启动子控制下的PFO的pfo基因重组至Δhly菌株的染色体，形成Δhly::pfo菌株。虽然Δhly::pfo能够逃离吞噬进入细胞质，但它不能增加小鼠脾脏中的CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞(图6A)。相比之下，用表达LLO的质粒pAM401-hly转染的野生型Lm的非溶血Tn917-lac突变体hly::Tn917-lac(pAM401-hly)(其中Tn917-lac融合基因插入hly基因，以破坏LLO溶血活性)诱导了小鼠脾脏CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞扩增(图6A)。这些结果暗示，CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的扩增由LLO直接介导。由于Lm不会显著诱导CD4+FoxP3+T细胞扩增，CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的增加导致了Lm诱导的Treg的频率降低(图6A-D)。

实例5：LmddA中截短的LLO的游离型表达诱导CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞扩增达到较高水平

接下来，比较LmddA和LmddA-LLO在健康、不具有肿瘤的小鼠中的T细胞增殖的诱导，其中后者通过质粒游离型生成截短的LLO。据发现，在单次施用后第7天LmddA能够稍微增加小鼠脾脏中CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞数量，但LmddA-LLO进一步诱导这种增加达到较高水平(图7A)。相比之下，在LmddA或LmddA-LLO感染后，CD4+FoxP3+T细胞数量无显著变化(图7A)。与PBS对照相比，在LmddA-LLO施用后，这导致Treg显著地按比例减少(图7B-D)。检查了这些细胞中细胞增殖标记Ki-67的存在。LmddA提高了Ki-67+CD4+FoxP3-T细胞和Ki-67+CD8+T细胞的频率和绝对数量，但LmddA-LLO使该数量增加至更大的程度(图7，E-G)。因此CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞中Ki-67的表达水平也提高(图7H)。相比之下，Ki-67+CD4+FoxP3+T细胞的频率和绝对数量以及CD4+FoxP3+T细胞中的Ki-67表达无显著变化，表明LmddA和LmddA-LLO并未诱导它们的增殖。

实例6：Lm-E7和LmddA-LLO的组合诱导已建立的TC-1肿瘤的消退。

Lm-E7疫苗单独不能诱导CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的大量扩增(图5)。这可解释其不能诱导TC-1肿瘤消退。由于LmddA-LLO诱导了CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞扩增(图5和图7A)，可以想象，在存在LmddA-LLO的情况下，可改善Lm-E7的抗肿瘤效应。实际上，Lm-E7和LmddA-LLO的组合诱导了已建立的TC-1肿瘤的几乎完全消退(图8，A-C)。相比之下，LmddA的加入未能增加Lm-E7诱导的抗肿瘤活性(数据未示出)，表明截短的非溶血LLO在改善Lm-E7疫苗的抗肿瘤功效中的重要性。可以预知，与Lm-E7或PBS处理的那些小鼠相比，组合组小鼠的脾脏中CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的数量显著增加(图8D)。再次，因为CD4+FoxP3+数量相对无变化，通过组合Lm-E7和LmddA-LLO使CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的数量增加至较高水平导致了CD4+FoxP3+T细胞比例的更大下降(图8，E-G)。

此外，LmddA还与Lm-E7对照共施用，以确定LmddA-LLO和Lm-E7的共施用期间非溶血、截短的LLO发挥的作用。据观察，LmddA菌株的加入未能增加Lm-E7诱导的抗肿瘤活性，表明LmddA产生的内源性LLO不能促进Lm-E7诱导的抗肿瘤活性(图10)。

实例7：Treg的过继转移危害LmddA-LLO-E7对已建立的TC-1肿瘤的抗肿瘤功效

LmddA-LLO-E7并未显著改变Treg的数量，虽然它降低了Treg的频率(图1，D-H)。Treg与CD4+FoxP3-T细胞或与CD8+T细胞的比率是确定Treg的抑制能力的公认参数。为确定Treg比例是否对LmddA-LLO-E7的抗肿瘤功效有任何影响，我们从未暴露的C57BL/6小鼠分离了CD4+CD25+Treg，并将其静脉注入具有TC-1肿瘤的小鼠，然后进行LmddA-LLO-E7疫苗接种。LmddA-LLO-E7在无Treg过继转移的小鼠中显著抑制了TC-1肿瘤生长(图9A和B)。然而，在给予Treg的小鼠中，LmddA-LLO-E7未能显著抑制TC-1肿瘤生长(图9A和B)。接受Treg的小鼠显示出脾脏中的Treg数量稍微增加，但肿瘤中进一步减少。在另一个方面，与LmddA-LLO-E7对照相比，在LmddA-LLO-E7疫苗接种后，接受Treg的小鼠具有的CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞更少，表明Treg的过继转移抑制了CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的扩增(图9F和G)。这些共同导致了Treg受体小鼠中Treg频率的提高(图9，C-E)。

肿瘤抗原特异性CTL在杀死肿瘤细胞的过程中具有支配作用，并且Lm作为细胞内细菌可递送与MHC I类分子相关的抗原以活化CTL。然而，为什么两个基于Lm的疫苗Lm-LLO-E7和Lm-E7在脾脏中诱导了相似水平的HPV E7特异性CTL，但表现出明显不同的抗肿瘤活性，而前者(Lm-LLO-E7)诱导了强得多的抗肿瘤效应？(图1A-C、图2、图3)。毫无疑问，CD8+T细胞参与杀死肿瘤细胞，因为它们的缺失消除了Lm-LLO-E7诱导的肿瘤消退。同样明确的是，一定水平的肿瘤抗原特异性CTL对于杀死肿瘤细胞是必需的，因为缺乏E7表达的LmddA-LLO不能显著抑制TC-1肿瘤生长(图1，A-C和图2)。据提出，Lm-E7诱导了Treg的增加，抑制了宿主免疫应答，从而破坏了其抗肿瘤免疫性。然而，就我们的研究而言，我们发现实际上与PBS对照相比，Lm-E7和LmddA-LLO-E7均降低了TC-1肿瘤模型中的Treg频率(图1，D-H)。此外，据发现，在疫苗接种后，无论是Lm-E7还是LmddA-LLO-E7均未显著增加TC-1肿瘤中的Treg总数(图5)。

实际上，据发现，LmddA-LLO-E7和Lm-E7之间的主要差异是，前者能够诱导CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞数量的显著增加，而后者诱导的增加程度低得多(图5)。这解释了为什么LmddA-LLO-E7降低Treg百分比的程度大于Lm-E7(图1，D-H)。据观察，Lm载体足以增加CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的数量。然而，对于截短的LLO的游离型表达，Lm使CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的数量显著增加至较高水平，从而更进一步地降低Treg的频率(图7)。因此，可以想象，LLO在诱导CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞数量的增加中具有关键作用。实际上，LLO不仅是单核细胞增多性李斯特菌逃离吞噬体必需的，而且还直接引起CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞扩增，因为无论是LLO缺失(Δhly)单核细胞增多性李斯特菌菌株，还是Δhly::pfo菌株(其表达使Lm能够进入细胞质的PFO)，均不能成功诱导CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞增殖，但用表达LLO的质粒转化非溶血LLO突变体Lm菌株恢复了CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的扩增(图6)。LLO诱导的CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞扩增与其溶血活性不相关，因为LmddA中非溶血、截短的LLO的游离型表达大大增加了CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的扩增(图7)。虽然LLO引起的CD4+T细胞和CD8+T细胞的扩增应答似乎具有抗原非特异性佐剂效应，但LLO也可包含这两种细胞类型的免疫显性表位。实际上，早期研究发现，LLO具有两个CD4+T细胞表位(分别为残基189-201和残基215-226)和一个CD8+T细胞表位(残基91-99)。

LmddA-LLO-E7的优异抗肿瘤效应可能是由于以下事实：它诱导了CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的显著增加。相比之下，Lm-E7不能诱导CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞数量的显著增加解释了它不能有效根除肿瘤的原因，因为Lm-E7和LmddA-LLO的组合(与单独Lm-E7相比，该组合显著增加了CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的数量)诱导了已建立的TC-1肿瘤的几乎完全消退(图8)。我们的数据表明，LmddA-LLO-E7诱导的Treg频率降低是CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞数量增加的结果。对于CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞功能的抑制，Treg与CD4+FoxP3-T细胞或与CD8+T细胞的比率是关键的。实际上，通过Treg过继转移到具有肿瘤的小鼠然后进行LmddA-LLO-E7疫苗接种来提高体内Treg的比率抑制了CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的扩增，并因此破坏了疫苗的抗肿瘤功效(图9)。

除优先诱导CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的扩增之外，截短的非溶血LLO对于LmddA-LLO-E7疫苗的抗肿瘤功效的改善还具有其他贡献。据观察，虽然Lm-E7和LmddA-LLO-E7诱导了类似的E7特异性CD8+T细胞扩增，但在肿瘤中并非如此。就截短的LLO(LmddA-LLO-E7)的游离型表达而言，更多的E7特异性CD8+T细胞趋于在肿瘤中诱导(图3E)。我们发现，LmddA-LLO-E7上调了CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞上，而非CD4+FoxP3+T细胞上的趋化因子受体CCR5和CXCR3的表达，显示CCR5和CXCR3对于Th1和CD8+T细胞运输是关键的。这些结果暗示，LLO通过CCR5和CXCR3的上调，诱导CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T抗原特异性细胞迁移至肿瘤微环境。此外，已知的是，截短的LLO对于抗原从Lm的有效分泌是必需的，而不从Lm载体分泌的抗原导致诱导不太有效的抗肿瘤免疫性。因此，缺乏Lm-E7载体的强大抗肿瘤活性不仅是由于缺乏CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞的有效扩增，而且还由于在受感染的抗原呈递细胞和低效抗原特异性T细胞应答的启动的背景中，来自Lm的抗原的低效分泌。

总之，据显示，LmddA-LLO-E7疫苗中非溶血、截短的LLO的游离型表达优先诱导了CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞扩增，这增强了疫苗的抗肿瘤活性。最后，结果显示，很多因素如一定水平的抗原特异性CTL和非肿瘤抗原特异性CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞，以及Treg比例降低，对于触发有效的抗肿瘤免疫应答均是必需的，并且这可通过本文提供的李斯特菌构建体实现。另外，本研究表明，LLO是有潜力的疫苗佐剂，因为它优先诱导CD4+FoxP3-T细胞和CD8+T细胞扩增，因此总体上提高了Treg频率，并促进免疫应答来杀死肿瘤细胞。

已参考附图对本发明的优选实施例进行了描述，应当理解，本发明不限于精确的实施例，本领域技术人员可在不脱离所附权利要求书中定义的本发明范围和精神的情况下对其进行各种改动和修饰。

Claims (46)

1.一种引起患有肿瘤或癌症的受试者中的抗肿瘤T细胞应答的方法，所述方法包括将包含重组核酸的重组李斯特菌菌株施用于所述受试者的步骤，所述核酸分子包含编码重组多肽的第一开放阅读框和编码代谢的第二开放阅读框，其中所述重组多肽包含融合至异源性抗原或其片段的截短的LLO蛋白，其中所述李斯特菌包含内源性丙氨酸消旋酶基因(dal)、D-氨基酸转移酶基因(dat)和actA基因中的突变，并且其中所述T细胞应答包括提高效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率，从而引起所述受试者中的抗肿瘤T细胞应答。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤相关抗原是人乳头瘤病毒E7抗原。

3.根据权利要求1至权利要求2中任一项所述的方法，其中所述截短的LLO蛋白是N末端LLO。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述LLO以SEQ ID NO:2示出。

5.根据权利要求1至权利要求4中任一项所述的方法，其中所述异源性抗原是肿瘤相关抗原。

6.根据权利要求1至权利要求4中任一项所述的方法，其中所述肿瘤相关抗原是血管新生抗原。

7.根据权利要求1至权利要求6中任一项所述的方法，其中所述李斯特菌缺乏抗生素抗性基因。

8.根据权利要求1至权利要求7中任一项所述的方法，其中所述重组核酸在所述李斯特菌中的质粒中。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述质粒是游离型质粒。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述质粒是多拷贝质粒。

11.根据权利要求8所述的方法，其中所述质粒是整合型质粒。

12.根据权利要求1至权利要求11中任一项所述的方法，其中所述代谢酶是氨基酸代谢酶。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述代谢酶是D-氨基酸转移酶或丙氨酸消旋酶。

14.根据权利要求1至权利要求13中任一项所述的方法，还包括将佐剂施用于所述受试者。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述佐剂包含粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、皂草苷QS21、单磷酰脂质A、包含CpG的寡核苷酸或细菌毒素。

16.根据权利要求1至权利要求15中任一项所述的方法，还包括在所述重组李斯特菌施用之前或之后，共施用免疫检查点蛋白抑制剂。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白是程序性细胞死亡蛋白1(PD1)、T细胞膜蛋白3(TIM3)、腺苷A2a受体(A2aR)和淋巴细胞活化基因3(LAG3)、杀伤细胞免疫球蛋白受体(KIR)或细胞毒性T-淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)。

18.根据权利要求1至权利要求15或权利要求1至权利要求16中任一项所述的方法，还包括共施用增强所述抗肿瘤免疫应答的细胞因子。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞因子是：I型干扰素(IFN-α/IFN-β)、TNF-α、IL-1、IL-4、IL-12、INF-γ。

20.根据权利要求1至权利要求19中任一项所述的方法，其中所述方法诱导外周淋巴器官中效应T细胞的扩增，导致所述肿瘤部位存在的效应T细胞增加。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述效应T细胞的扩增导致所述外周中和所述肿瘤部位的效应T细胞与调节性T细胞的比率提高，而不影响Treg的数量。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述效应T细胞是CD4+FoxP3-和CD8+T细胞。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述效应T细胞是CD4+FoxP3-T细胞。

24.根据权利要求21所述的方法，其中所述调节性T细胞是CD4+FoxP+T细胞。

25.一种用于提高受试者脾脏中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率的方法，所述方法包括将包含编码截短的LLO蛋白的重组核酸的重组李斯特菌菌株施用于所述受试者的步骤，其中所述李斯特菌包含内源性丙氨酸消旋酶基因(dal)、D-氨基酸转移酶基因(dat)和actA基因中的突变，其中所述T细胞应答包括提高效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述肿瘤相关抗原是人乳头瘤病毒E7抗原。

27.根据权利要求25至权利要求26中任一项所述的方法，其中所述截短的LLO蛋白是N末端LLO。

28.根据权利要求25至权利要求27中任一项所述的方法，其中所述LLO以SEQ ID NO:2示出。

29.根据权利要求25至权利要求28中任一项所述的方法，其中所述李斯特菌缺乏抗生素抗性基因。

30.根据权利要求25至权利要求29中任一项所述的方法，其中所述核酸在所述李斯特菌中的质粒中。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述质粒是游离型质粒。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述质粒是多拷贝质粒。

33.根据权利要求30所述的方法，其中所述质粒是整合型质粒。

34.根据权利要求25至权利要求33中任一项所述的方法，还包括将佐剂施用于所述受试者。

35.根据权利要求25至权利要求34中任一项所述的方法，其中所述佐剂包含粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、皂草苷QS21、单磷酰脂质A、包含CpG的寡核苷酸或细菌毒素。

36.根据权利要求25至权利要求35中任一项所述的方法，还包括在所述重组李斯特菌施用之前或之后，共施用免疫检查点蛋白抑制剂。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述免疫检查点蛋白是程序性细胞死亡蛋白1(PD1)、T细胞膜蛋白3(TIM3)、腺苷A2a受体(A2aR)和淋巴细胞活化基因3(LAG3)、杀伤细胞免疫球蛋白受体(KIR)或细胞毒性T-淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)。

38.根据权利要求25至权利要求35或权利要求25至权利要求36中任一项所述的方法，还包括共施用增强所述抗肿瘤免疫应答的细胞因子。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述细胞因子是：I型干扰素(IFN-α/IFN-β)、TNF-α、IL-1、IL-4、IL-12、INF-γ。

40.根据权利要求25至权利要求39中任一项所述的方法，其中所述方法诱导外周淋巴器官中效应T细胞的扩增。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述效应T细胞的扩增导致所述外周中的效应T细胞与调节性T细胞的比率提高，而不影响Treg的数量。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述效应T细胞是CD4+FoxP3-和CD8+T细胞。

43.根据权利要求41所述的方法，其中所述效应T细胞是CD4+FoxP3-T细胞。

44.根据权利要求41所述的方法，其中所述调节性T细胞是CD4+FoxP+T细胞。

45.根据权利要求1至权利要求24中任一项所述的方法，其中引起患有肿瘤或癌症的受试者中的抗肿瘤T细胞应答使得可以治疗所述受试者中的所述肿瘤或癌症。

46.根据权利要求25至权利要求44中任一项所述的方法，其中引起患有肿瘤或癌症的受试者中的抗肿瘤T细胞应答使得可以治疗所述受试者中的所述肿瘤或癌症。