CN108138099A - 用于个性化的基于递送载体的免疫疗法的制造装置和方法 - Google Patents

用于个性化的基于递送载体的免疫疗法的制造装置和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种针对患有疾病或病症的受试者提供个性化免疫治疗组合物的系统和形成所述个性化免疫治疗组合物的方法，所述个性化免疫治疗组合物包含治疗性疫苗递送载体，所述载体包含基因表达构建体，所述基因表达构建体表达与一个或多个新表位相关联的肽或含有为受试者癌症或不健康组织特异性的突变的肽。本发明还提供了一种可扩展的全封闭式单次使用细胞生长系统，其中制造个性化免疫治疗组合物直至并包括将所述组合物分配到用于患者递送的容器中的整个过程在单个封闭式流体流路内进行。

Description

用于个性化的基于递送载体的免疫疗法的制造装置和方法
技术领域
本公开提供了用于患有疾病或病症的受试者的个性化免疫治疗组合物的可扩展平行制造方法。此外，本公开提供了若干全封闭式单次使用细胞生长系统的平行使用，以便为患有疾病或病症的一名受试者或不同受试者生产多种个性化免疫治疗组合物。
背景技术
在个性化用药之前，患有特定类型和阶段的癌症的大多数患者都接受相同的治疗。然而，对于医生和患者而言清楚的是一些治疗对于一些患者作用良好而对于其他患者并不同样良好。因此，需要开发有效于特定肿瘤的有效个性化癌症疫苗。与在使用标准治疗的情况下将预期的相比，个性化治疗策略可以更有效并且引起更少副作用。
肿瘤由于个人DNA突变而形成，这些突变可引起突变的或异常的蛋白产生，这些蛋白包含不存在于由宿主所产生的对应正常蛋白内的新表位。这些新表位中的许多刺激T细胞应答并且导致免疫系统对早期癌细胞的破坏。然而，在已建立的癌症的情况下，免疫应答是不足的。在其他情况下，开发靶向癌症中的肿瘤抗原但不特异性靶向其新表位的有效的长期疫苗已被证明是困难的。其主要原因是肿瘤自身抗原特异性的T细胞通过耐受机制被消除或灭活。
新表位是存在于与疾病(例如癌症)相关的蛋白内的表位，其中特异性“新表位”不存在于与其中没有疾病或患病组织的受试者相关的相应正常蛋白内。鉴定新表位可以说是有挑战性的，然而进行此鉴定并开发靶向这些新表位的治疗对于用在个性化治疗策略中将是有利的，因为这些新表位是罕见的并可因人而异。
单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)(Lm)是导致李斯特菌病的革兰氏阳性兼性细胞内病原体。一旦侵入宿主细胞，Lm即可通过产生裂解血管膜的成孔蛋白李斯特菌溶血素O(LLO)而逃离吞噬溶酶体，使其进入细胞质，在该处根据肌动蛋白多聚化蛋白(ActA)的迁移性复制并传播到相邻的细胞。在细胞质中，Lm分泌蛋白被蛋白酶降解，并加工为内质网中与MHC I类分子相关的肽。此独特特性使其成为非常有吸引力的癌症疫苗载体，因为肿瘤抗原可通过MHC I类分子呈递，以活化肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
此外，一旦被吞噬，Lm即可在吞噬溶酶体隔室中加工，并且肽在MHC II类上呈递以用于Lm特异性CD4-T细胞应答的激活。或者，Lm可逃离吞噬体并进入胞质溶胶，在胞质溶胶中，肽聚糖被核寡聚域样受体识别以及Lm DNA被DNA传感蛋白AIM2识别将激活炎性级联反应。该炎性应答和抗原向MHC I和MHC II通路的有效递送的组合使Lm成为治疗肿瘤、防御肿瘤和诱导对肿瘤的免疫应答的强大疫苗载体。
靶向作为基于李斯特菌的疫苗的组分的对受试者癌症有特异性的新表位可提供对受试者的癌症个性化并有效治疗癌症的疫苗，所述基于李斯特菌的疫苗另外刺激T细胞应答或也与其他疗法组合使用。增加抗原的免疫原性或疫苗刺激具有逃逸耐受机制的T细胞的能力的抗原融合策略可以具有作为免疫疗法的特别潜力。
一旦患者被诊断患有癌症，确保个性化治疗的即时递送对于临床结局而言变得至关重要，因为个性化治疗的确定、测试和制造在患者疾病进展的同时发生。在使用符合适用法规的程序的同时，以临床足够的量制造靶向肿瘤新表位的个性化免疫治疗组合物可能造成很大程度的时间延迟，这使确定和测试此类组合物的时间密集过程更加严重。因此，需要开发用于制造免疫治疗组合物的简化方法，其确保快速周转、最大程度缩短生产时间并且同时符合为制造药物制定的标准。
本公开通过基于全封闭式单次使用细胞生长系统来提供免疫治疗组合物的简化制造方法而满足这种需求。本公开还通过提供免疫治疗组合物的制造方法的可扩展性来满足上述需求。
发明内容
在一个方面，公开了一种制造用于向患有疾病或病症的受试者施用的个性化免疫治疗组合物的方法，其中所述个性化免疫治疗组合物包含重组减毒李斯特菌菌株，其中所述李斯特菌菌株包含含有一个或多个开放阅读框的核酸序列，所述一个或多个开放阅读框编码含有一个或多个新表位的一种或多种肽，所述方法包括：
在来自患有疾病或病症的受试者的患病样品中获得并鉴定编码包含一个或多个新表位的一种或多种肽的所述核酸序列。
用包含编码含有所述一个或多个新表位的所述一种或多种肽的所述核酸序列的表达载体稳定转染减毒李斯特菌菌株；
获得表达含有所述一个或多个新表位的所述一种或多种肽的李斯特菌克隆；
将所述李斯特菌克隆扩增至预定的规模；
纯化扩增后的李斯特菌克隆；
用制剂缓冲液代替生长培养基；
收获所述李斯特菌克隆，
将所述收获的李斯特菌克隆稀释成具有预定浓度的溶液；和
将收获的李斯特菌克隆溶液分配到单剂量容器中以供后续储存或施用给受试者。
其中步骤c-i在全封闭式单次使用细胞生长系统中进行。
在一个相关方面，所述全封闭式单次使用细胞生长系统包括接种部分、发酵部分、浓缩部分、渗滤部分以及产品分配部分。
在另一相关方面，所述全封闭式单次使用细胞生长系统包括集成的全封闭式流体流路。
在又一相关方面，公开了一种全封闭式单次使用细胞生长系统，其中所述系统还包括一个或多个单次使用的搅拌式生物反应器。
在另一相关方面，所述全封闭式单次使用细胞生长系统的产品分配部分包括单剂量大小的产品容器，其可以用于立即施用给受试者，或者替代地冷冻以用于随后的运输和储存。
在另外的相关方面，公开了单名受试者规模的全封闭式单次使用细胞生长系统。在另一相关方面，本公开提供了若干全封闭式单次使用细胞生长系统的并行使用，以平行地制造用于同一受试者或不同受试者的多个个性化免疫治疗组合物。
在另一相关方面，所述疾病或病症包括感染性疾病或肿瘤或癌症。
在另一相关方面，本公开涉及包括浓缩部分和渗滤部分的切向流过滤(TFF)装置，其用于浓缩和渗滤包含重组李斯特菌菌株的药物产品，其中所述装置包括渗余物容器1，其经由流体流动导管5可操作地联接到渗透物容器2。
本公开的其他特征和优点将由于以下详细描述的实例和附图而变得显而易见。但是，应当理解，该详细描述和具体实例尽管指出了本发明的优选实施例，但是仅仅通过例证给出，因为本发明的精神和范围内的各种变化和修改对阅读了该详细描述的本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图说明
被视为本发明的主题在说明书的结论部分特别指出并明确要求进行保护。然而，在结合附图阅读时，通过参考以下具体实施方式，可以最好地理解本发明(对组织和操作方法来说皆是如此)及其目的、特征和优点，在附图中：
图1A和1B.Lm-E7和Lm-LLO-E7(ADXS11-001)使用不同的表达系统来表达和分泌E7。通过将基因盒引入单核细胞增多性李斯特菌基因组的orfZ域中来产生Lm-E7(图1A)。hly启动子驱动hly信号序列和LLO的前五个氨基酸(AA)以及随后的HPV-16E7的表达。(图1B)，通过以质粒pGG-55转化prfA-菌株XFL-7来产生Lm-LLO-E7。pGG-55具有驱动LLO-E7非溶血性融合体的表达的hly启动子。pGG-55也含有prfA基因，以选择XFL-7在体内对质粒的保留。
图2.Lm-E7和Lm-LLO-E7分泌E7。使Lm-Gag(泳道1)、Lm-E7(泳道2)、Lm-LLO-NP(泳道3)、Lm-LLO-E7(泳道4)、XFL-7(泳道5)和10403S(泳道6)在Luria-Bertoni液体培养基中于37℃生长过夜。沉淀相等数目的细菌(通过600nm处吸光度OD确定)，并将18ml的每种上清液进行TCA沉淀。通过Western印迹分析E7表达。用抗E7mAb、随后用HRP-偶联的抗小鼠(Amersham)探测该印迹，接着使用ECL检测试剂显影。
图3.LLO-E7融合体的肿瘤免疫抑制功效。显示了肿瘤接种后第7、第14、第21、第28和第56天小鼠中以毫米计的肿瘤大小。未暴露的小鼠：空心圆圈；Lm-LLO-E7：实心圆圈；Lm-E7：正方形；Lm-Gag：空心菱形；和Lm-LLO-NP：实心三角形。
图4.来自Lm-LLO-E7-免疫的小鼠的脾细胞在暴露于TC-1细胞时增殖。将C57BL/6小鼠用Lm-LLO-E7、Lm-E7或对照rLm菌株免疫和强化。在强化后6天收获脾细胞，并以显示的比率与经照射的TC-1细胞一起铺板。将细胞用3H胸苷脉冲处理并收获。将Cpm定义为(实验cpm)-(无TC-1对照)。
图5A和5B.(图5A)Western印迹证实Lm-ActA-E7分泌E7。泳道1：Lm-LLO-E7；泳道2：Lm-ActA-E7.001；泳道3；Lm-ActA-E7-2.5.3；泳道4：Lm-ActA-E7-2.5.4。(图5B)施用Lm-ActA-E7(矩形)、Lm-E7(椭圆形)、Lm-LLO-E7(X)和未暴露的小鼠(未接种疫苗；实心三角形)的小鼠中的肿瘤大小。
图6A-6C.(图6A)用于制备4种LM疫苗的质粒插入片段的示意图。Lm-LLO-E7插入片段含有所有使用的李斯特菌基因。它含有hly启动子、hly基因(其编码蛋白LLO)的前1.3kb和HPV-16E7基因。hly的该前1.3kb包括信号序列(ss)和PEST区域。Lm-PEST-E7包括hly启动子、信号序列以及PEST和E7序列，但是不包括截短的LLO基因的剩余部分。Lm-ΔPEST-E7不包括PEST区域，但是含有hly启动子、信号序列、E7和截短的LLO的剩余部分。Lm-E7epi仅具有hly启动子、信号序列和E7。(图6B)上部插图：含有PEST区域的李斯特菌构建体诱导肿瘤消退。下部插图：在2个单独实验中肿瘤挑战后第28天时的平均肿瘤大小。(图6C)含有PEST区域的李斯特菌构建体在脾中诱导更高百分比的E7特异性淋巴细胞。显示了来自3个实验的数据的平均值和SE。
图7A和7B.(图7A)在施用TC-1肿瘤细胞并随后施用Lm-E7、Lm-LLO-E7、Lm-ActA-E7或无疫苗(未暴露的)的小鼠中，脾中E7特异性的分泌IFN-γ的CD8+T细胞的诱导和浸润肿瘤的数目。(图7B)针对(图7A)描述的小鼠的脾和肿瘤中E7特异性的CD8+细胞的诱导和浸润。
图8A和8B.含有PEST区域的李斯特菌构建体在肿瘤中诱导更高百分比的E7特异性淋巴细胞。(图8A)来自1个实验的代表性数据。(图8B)来自所有3个实验的数据的平均值和SE。
图9.来自队列1和2的数据，指明在实例6所展示的临床试验中在患者中观察到的功效。
图10A和10B.(图10A)在klk3整合和actA缺失后Lmdd-143和LmddA-143的染色体区域的示意图；(图10B)klk3基因被整合进Lmdd和LmddA染色体。使用klk3特异性引物对来自各构建体的染色体DNA制备物进行的PCR扩增对应于klk3基因的714bp的条带，缺乏野生型蛋白的分泌信号序列。
图11A-11D.(图11A)pADV134质粒的图谱。(图11B)使来自LmddA-134培养上清液的蛋白质沉淀，在SDS-PAGE中分离，并且通过Western印迹使用抗E7单克隆抗体来检测LLO-E7蛋白。抗原表达盒由hly启动子、截短的LLO的ORF和人PSA基因(klk3)组成。(图11C)pADV142质粒的图谱。(图11D)Western印迹显示使用抗PSA和抗LLO抗体的LLO-PSA融合蛋白的表达。
图12A和12B.(图12A)在具有和不具有选择压力(D-丙氨酸)的情况下培养时LmddA-LLO-PSA的体外质粒稳定性。首先列出菌株和培养条件，然后列出用于CFU测定的板。(图12B)LmddA-LLO-PSA体内清除和此时间期间的潜在质粒损失的评价。静脉内注射细菌并且在指定时间点从脾脏分离。在BHI和BHI+D-丙氨酸板上测定CFU。
图13A和13B.(图13A)在C57BL/6小鼠中施用108个CFU之后的菌株LmddA-LLO-PSA的体内清除。通过在BHI/str板上铺板来测定CFU数量。此方法的检测限为100个CFU。(图13B)使用10403S、LmddA-LLO-PSA和XFL7菌株进行的J774细胞的细胞感染测定。
图14A-14E.(图14A)在强化剂量之后第6天时，未暴露的小鼠和LmddA-LLO-PSA免疫小鼠的脾细胞中的PSA四聚物特异性细胞。(图14B)使用PSA肽刺激未暴露的小鼠和LmddA-LLO-PSA免疫小鼠的脾细胞中IFN-γ的胞内细胞因子染色5小时。使用基于半胱天冬酶的测定法(图14C)和基于铕的测定法(图14D)，在不同效应子/靶比率下，来自LmddA-LLO-PSA免疫小鼠和未暴露的小鼠的体外刺激效应T细胞对用PSA肽脉冲处理的EL4细胞的特异性裂解。在PSA肽存在下或无肽存在下刺激24小时后获得的未暴露的和经免疫的脾细胞中的IFNγ斑点数(图14E)。
图15A-15C.用LmddA-142免疫引起Tramp-C1-PSA(TPSA)肿瘤消退。小鼠不做处理(n＝8)(图15A)或在第7天、第14天和第21天用LmddA-142(1×108个CFU/小鼠)(n＝8)(图15B)或Lm-LLO-PSA(n＝8)(图15C)腹膜内免疫。测量各个肿瘤的肿瘤大小并且值表示为以毫米为单位的平均直径。各线表示单个小鼠。
图16A和16B.(图16A)未处理的小鼠和用Lm对照菌株或LmddA-LLO-PSA(LmddA-142)免疫的小鼠的脾脏和浸润T-PSA-23肿瘤中的PSA-四聚物+CD8+T细胞的分析。(图16B)未处理的小鼠和用Lm对照菌株或LmddA-LLO-PSA的脾脏和浸润T-PSA-23肿瘤中的CD4+调节性T细胞(定义为CD25+FoxP3+)的分析。
图17A和17B.(图17A)在klk3整合和actA缺失后Lmdd-143和LmddA-143的染色体区域的示意图；(图17B)klk3基因被整合进Lmdd和LmddA染色体。使用klk3特异性引物对来自各构建体的染色体DNA制备物进行的PCR扩增对应于klk3基因的760bp的条带。
图18A-C.(图18A)Lmdd-143和LmddA-143分泌LLO-PSA蛋白。使来自细菌培养上清液的蛋白质沉淀，在SDS-PAGE中分离并且通过Western印迹使用抗LLO和抗PSA抗体来检测LLO和LLO-PSA蛋白；(图18B)Lmdd-143和LmddA-143产生的LLO保留溶血活性。将绵羊红细胞与细菌培养上清液的连续稀释液一起培育并且通过590nm下的吸光度测量溶血活性；(图18C)Lmdd-143和LmddA-143在巨噬细胞样J774细胞内部生长。将J774细胞与细菌一起培育1小时，随后用庆大霉素处理以杀死胞外细菌。通过对在指示时间点获得的J774裂解物的连续稀释液进行铺板来测量胞内生长。Lm10403S在这些实验中用作对照。
图19.用Lmdd-143和LmddA-143免疫小鼠诱导PSA特异性免疫应答。将C57BL/6小鼠用1×108个CFU的Lmdd-143、LmddA-143或LmddA-142以1周间隔免疫两次，并且在7天后收获脾脏。在莫能菌素(monensin)存在下用1μM PSA65-74肽刺激脾细胞5小时。针对CD8、CD3、CD62L和胞内IFN-γ对细胞进行染色并且在FACS Calibur细胞计数器中分析。
图20A和20B.ADXS31-164的构建。(图20A)pAdv164的质粒图谱，其具有在组成型李斯特菌p60启动子控制下的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)dal基因，用于补充LmddA菌株的染色体dal-dat缺失。它还含有截短的LLO(1-441)与嵌合人Her2/neu基因的融合体，该融合体通过直接融合3个片段Her2/neu：EC1(aa 40-170)、EC2(aa 359-518)和ICI(aa 679-808)的直接融合而构建。(图20B)通过对用抗LLO抗体印迹的TCA沉淀细胞培养上清液进行的Western印迹分析检测了Lm-LLO-ChHer2(Lm-LLO-138)和LmddA-LLO-ChHer2(ADXS31-164)中tLLO-ChHer2的表达和分泌。～104KD的差异条带对应于tLLO-ChHer2。检测到内源性LLO为58KD条带。李斯特菌对照缺乏ChHer2表达。
图21A-21C.ADXS31-164的免疫原性(图21A)基于Her2/neu李斯特菌的疫苗在免疫小鼠的脾细胞中引起的细胞毒性T细胞应答使用NT-2细胞作为刺激因子、3T3/neu细胞作为靶标进行测试。Lm-对照基于在各个方面相同但表达不相关抗原(HPV16-E7)的LmddA背景。(图21B)由来自免疫FVB/N小鼠的脾细胞分泌进细胞培养基中的IFN-g在使用丝裂霉素C处理的NT-2细胞体外刺激24小时后通过ELISA测定。(图21C)响应于与来自蛋白的不同区域的肽一起在体外温育，来自用嵌合疫苗免疫的HLA-A2转基因小鼠的脾细胞的IFN-g分泌。重组ChHer2蛋白用作阳性对照，不相关肽或无肽组构成阴性对照，如图例中所列出。使用72小时共温育后收集的细胞培养上清液进行ELISA分析，以测定IFN-γ分泌。每个数据点为一式三份数据的平均值+/-标准误差。*P值<0.001。
图22.李斯特菌-ChHER2/neu疫苗的肿瘤预防研究使用每种重组李斯特菌-ChHer2或对照李斯特菌疫苗注射HER2/neu转基因小鼠六次。免疫在6周龄开始，每三周一次延续直到第21周。每周监测肿瘤的外观并以无肿瘤小鼠的百分比表示。*p<0.05，N＝9只每组。
图23.ADXS31-164免疫对脾脏中％Treg的作用。给FVB/N小鼠皮下接种1×106个NT-2细胞，并且使用每种疫苗以一周为间隔免疫三次。在第二次免疫后7天收集脾脏。在分离免疫细胞后，对其进行染色，以通过抗CD3、CD4、CD25和FoxP3抗体检测Treg。得自代表性实验的Treg的点图，显示了CD25+/FoxP3+T细胞的频率，其表示为不同治疗组中总CD3+或CD3+CD4+ T细胞的百分率。
图24A和24B.ADXS31-164免疫对NT-2肿瘤中％肿瘤浸润Treg的作用。给FVB/N小鼠皮下接种1×106个NT-2细胞，并且使用每种疫苗以一周为间隔免疫三次。在第二次免疫后7天收集肿瘤。在分离免疫细胞后，对其进行染色，以通过抗CD3、CD4、CD25和FoxP3抗体检测Treg。(图24A).来自代表性实验的Treg的点图。(图24B).CD25+/FoxP3+ T细胞的频率，以不同治疗组之间总CD3+或CD3+CD4+ T细胞的百分比(左插图)和肿瘤内CD8/Treg比率(右插图)表示。数据以2个独立实验获得的平均值±SEM表示。
图25A-25C.ADXS31-164疫苗接种可延缓脑中乳腺癌细胞系的生长。Balb/c小鼠使用ADXS31-164或对照李斯特菌疫苗免疫三次。给麻醉小鼠颅内注射EMT6-Luc细胞(5,000个)。(图25A)小鼠的离体成像使用Xenogen X-100CCD照相机在指定的天数进行。(图25B)像素强度以光子数/秒/cm2表面积绘图；这以平均发光度表示。(图25C)EMT6-Luc细胞、4T1-Luc和NT-2细胞系的Her2/neu表达通过使用抗Her2/neu抗体的Western印迹检测。鼠科动物巨噬细胞样细胞系J774.A2细胞用作阴性对照。
图26A-C表示重组李斯特菌蛋白微基因构建体的示意性图谱。(图26A)表示产生卵清蛋白源SIINFEKL肽的构建体(SEQ ID NO:75)。(图26B)表示可比较的重组蛋白，其中已通过PCR克隆将GBM源肽引入，以代替SIINFEKL。(图26C)表示被设计为由李斯特菌菌株表达4种单独的肽抗原的构建体。
图27.示出质粒主链pAdv142(参见图11C)中不同ActA PEST区域的克隆以形成(图27)所示的质粒pAdv211、pAdv223和pAdv224的示意图。此示意图显示不同ActA编码区与使用XbaI和XhoI限制的主链质粒pAdv142中的李斯特菌溶血素O信号序列一起克隆在框架中。
图28A-B.(图28A)使用TPSA23作为可移植肿瘤模型进行的肿瘤消退研究。在第0天用1×106个肿瘤细胞植入三个组(每组八只小鼠)并且在第6天、第13天和第20天用108个CFU的不同疗法进行治疗：LmddA142、LmddA211、LmddA223以及LmddA224。未暴露小鼠未接受任何治疗。每周监测肿瘤并且如果平均肿瘤直径为14-18mm则处死小鼠。图表中的每个符号表示单个小鼠的肿瘤大小。将实验重复两次并且获得类似的结果。(图28B)未暴露小鼠和免疫小鼠在不同实验天数的存活百分比。
图29A-B.PSA特异性免疫应答通过四聚体染色(图29A)和用于IFN-γ的细胞内细胞因子染色(图29B)进行检查。将小鼠以周为间隔用108个CFU的不同疗法免疫三次：LmddA142(ADXS31-142)、LmddA211、LmddA223和LmddA224。对于免疫测定，在第二次加强之后第6天收获脾。将来自2只小鼠/组的脾合并以用于此实验。(A)在未暴露小鼠、LmddA142、LmddA211、LmddA223和LmddA224免疫的小鼠的脾中的PSA特异性T细胞使用PSA-表位特异性四聚体染色进行检测。将细胞用小鼠抗-CD8(FITC)、抗-CD3(Percp-Cy5.5)、抗-CD62L(APC)和PSA四聚体-PE染色并且通过FACS Calibur进行分析。(图29B)用于在未暴露小鼠和用1μMPSA特异性H-2Db肽(HCIRNKSVIL)刺激5h之后的免疫小鼠中检测分泌IFN-γ的CD8+CD62L低细胞的百分比的细胞内细胞因子染色。
图30A-C.使用TPSA23肿瘤模型，以通过使用ActA/PEST2(LA229)融合PSA和tLLO融合PSA研究C57BL6小鼠中的免疫应答生成。在第0天用1×106个肿瘤细胞植入四个组(每组五只小鼠)并且在第6天和第14天用108个CFU的不同疗法进行治疗：LmddA274、LmddA142(ADXS31-142)和LmddA211。未暴露小鼠未接受任何治疗。在最后免疫后的第6天，从每只小鼠收集脾和肿瘤。(图30A)表格示出在免疫后第13天的肿瘤体积。通过脾(图30B)和肿瘤(图30C)中的五聚体染色检查PSA特异性免疫应答。对于免疫测定，将来自2只小鼠/组或3小鼠/组的脾合并并且将来自5只小鼠/组的肿瘤合并。将细胞用小鼠抗-CD8(FITC)、抗-CD3(Percp-Cy5.5)、抗-CD62L(APC)和PSA五聚体-PE染色并且通过FACSCalibur进行分析。
图31A-31C.SOE诱变策略。通过使LLO的第4结构域突变实现LLO毒力的降低/下降。(图31A-31B).该结构域含有胆固醇结合位点，使得其能结合细胞膜，在这里其寡聚化以形成孔。图31C示出全长LLO(rLLO529)的片段。重组LLOrLLO493表示从氨基酸1跨越至493(包含信号序列)的LLO N-端片段。重组LLOrLLO482表示从氨基酸1跨越至482(包含信号序列)的N-端LLO片段(包括胆固醇结合结构域氨基酸483-493的缺失)。重组LLO rLLO415表示从氨基酸1跨越至415(包含信号序列)的N-端LLO片段(包括胆固醇结合结构域氨基酸483-493的缺失)。重组LLO rLLO59-415表示从氨基酸59跨越至415(排除胆固醇结合结构域)的N-端LLO片段。重组LLO rLLO416-529表示从氨基酸416跨越至529并包含胆固醇结合结构域的N-端LLO片段。
图32A和32B.在图32A中示出了通过考马斯染色获得的突变体LLO蛋白的表达并且在图32B中示出了通过Western印迹获得的所述表达。
图33A和33B.直方图呈现示出突变体LLO(mutLLO和ctLLO)蛋白在pH5.5(图33A)和7.4(图33B)下的溶血活性的数据。
图34.PAK6构建体(7605bp)的质粒图谱，其中PAK6表达为具有tLLO的融合蛋白。PAK6质粒的示意性图谱。该质粒含有李斯特菌(Rep R)和大肠杆菌(p15)复制起点。黑色箭头表示转录方向。枯草芽孢杆菌dal基因补充D-丙氨酸的合成。抗原表达盒由hly启动子、截短的LLO的ORF和人PAK6基因组成。
图35.如SEQ ID NO:78所列出的PAK6的核酸序列。
图36.如SEQ ID NO:79所列出的PAK6的氨基酸序列。
图37A.肿瘤测序和DNA生成工作流的总体概述。
图37B.DNA克隆和免疫疗法生产工作流的总体概述。
图38.布置成用于平行生产个性化免疫治疗组合物的全封闭式单次使用细胞生长系统的群集的图表。
图39.全封闭式单次使用细胞生长系统的接种和发酵区段的详细图表。
图40.全封闭式单次使用细胞生长系统的浓缩区段的详细图表。
图41.全封闭式单次使用细胞生长系统的渗滤区段的详细图表。
图42.全封闭式单次使用细胞生长系统的产品分配区段的详细图表。
图43A.使用一系列新表位选择以便提高免疫疗法的效率的方法的图表。
图43B.使用平行选择的多个新表位的方法的图表。
图44.显示了制备发酵培养基的过程。
图45.显示了制备1M氢氧化钠(NaOH)溶液的过程。
图45.显示了制备洗涤缓冲液的过程。
图46.工艺流程：接种袋的制造
图47.显示了进行本文所公开的李斯特菌构建体发酵的过程。
图48.显示了设置和执行切向流过滤和灌装的过程。
图49.显示了本文所公开的李斯特菌构建体的完整制造过程。
图50.显示了使用制造系统制造免疫治疗组合物的过程。
图51A-C.显示了根据本文讨论的一些实施例的切向流过滤(TFF)歧管。图51A显示了TFF歧管，而图51B显示了TFF歧管的若干部分的描述。图51C显示了根据本文讨论的一些实施例的另一TFF歧管。
图52.显示了可连接到TFF歧管的示例性灌装歧管。
图53.显示用于将最终产品收集在一个或多个袋子中的灌装歧管。
图54.显示了图51A至图53中的标记的图例。
图55.显示了对若干示例性实施例的雷诺数、泵流量、纤维计数、速度、运动粘度、流量/纤维、单位长度、内径、纤维体积和传送时间、特征长度进行比较的表格。
将领会的是，为了阐述的简洁和清楚，显示在图中的要素未必是按比率绘制的。例如，为了清楚，一些要素的大小可以是相对其他要素而放大的。另外，在认为适合时，附图标记可以在附图之间重复，以指出对应的或类似的要素。
具体实施方式
在以下具体实施方式中，陈述了多个具体细节，以提供对本发明的透彻理解。然而，本领域的技术人员将理解可在不具有这些具体细节的情况下实施本公开。在其他情况中，为避免使本公开复杂化，未对熟知的方法、工序和组分进行详细描述。
全封闭式单次使用细胞生长系统和制造方法
在一个实施例中，公开了一种制造用于向患有疾病或病症的受试者施用的个性化免疫治疗组合物的方法，其中所述个性化免疫治疗组合物包含重组减毒李斯特菌菌株，其中所述李斯特菌菌株包含含有一个或多个开放阅读框的核酸序列，所述一个或多个开放阅读框编码含有一个或多个新表位的一种或多种肽，所述方法包括：
在来自患有疾病或病症的受试者的患病样品中获得并鉴定编码包含一个或多个新表位的一种或多种肽的所述核酸序列。
用包含编码含有所述一个或多个新表位的所述一种或多种肽的所述核酸序列的表达载体稳定转染减毒李斯特菌菌株；
获得表达含有所述一个或多个新表位的所述一种或多种肽的李斯特菌克隆；
将所述李斯特菌克隆扩增至预定的规模；
纯化扩增后的李斯特菌克隆；
用制剂缓冲液代替生长培养基；
收获所述李斯特菌克隆，
将所述收获的李斯特菌克隆稀释成具有预定浓度的溶液；和
将收获的李斯特菌克隆溶液分配到单剂量容器中以供后续储存或施用给受试者。
其中步骤c-i在全封闭式单次使用细胞生长系统中进行。
在另一个实施例中，所述全封闭式单次使用细胞生长系统包括接种部分、发酵部分、浓缩部分/渗滤(图51A-B)部分以及产品分配部分。
在另一个实施例中，所述全封闭式单次使用细胞生长系统包括集成的全封闭式流体流路。
在又一个实施例中，本文公开了一种全封闭式单次使用细胞生长系统，其中所述系统还包括一个或多个单次使用的搅拌式生物反应器。
在另一个实施例中，所述全封闭式单次使用细胞生长系统的产品分配部分包括单剂量大小的产品容器，其可以用于立即施用给受试者，或者替代地冷冻以用于随后的运输和储存。
在另外的实施例中，本文公开的是单名受试者规模的全封闭式单次使用细胞生长系统。在另一个实施例中，本文所公开的方法允许并行使用若干全封闭式单次使用细胞生长系统来平行地制造用于同一受试者或不同受试者的多个个性化免疫治疗组合物。
在另一个实施例中，所述疾病或病症包括感染性疾病或肿瘤或癌症。
在一个实施例中，本文公开一种使用全封闭式单次使用制造系统(参见图50)制造个性化免疫治疗组合物的可扩展简化方法。
在一个实施例中，所述方法包括在来自患有疾病或病症的受试者的患病样品中鉴定编码包含一个或多个新表位的一种或多种肽的所述核酸序列；用表达载体稳定转染减毒李斯特菌菌株，所述表达载体包含编码含有所述一个或多个新表位的所述一种或多种肽的所述核酸序列；获得表达含有所述一个或多个新表位的所述一种或多种肽的李斯特菌克隆；将所述李斯特菌克隆扩增至预定的规模；纯化扩增后的李斯特菌克隆；用制剂缓冲液代更换长培养基；收获所述李斯特菌克隆；将收获的李斯特菌克隆稀释成具有预定浓度的溶液；以及将收获的李斯特菌克隆溶液分配到单剂量容器中用于后续储存或施用给受试者。在另一个实施例中，扩增、纯化、生长培养基更换、收获、稀释和分配步骤在本文公开的全封闭式单次使用细胞生长系统/一次性制造系统中进行。在另一个实施例中，全封闭式单次使用细胞生长系统包括集成的全封闭式流体流路。
在一个实施例中，所公开的一次性制造系统包括除制造过程完成之后丢弃的产品容器以外的所述集成全封闭式液体流路的部件。
根据本公开的制造系统包括以下部分：接种部分、发酵部分、浓缩/渗滤部分(参见图51A-B)和/或产品分配部分，其全部用于本文所公开的李斯特菌菌株制造方法。
在一个实施例中，该制造方法如图50所示进行。在一个实施例中，在制造过程的开始阶段，制备培养基/缓冲液，并从板上挑取含有李斯特菌构建体的集落以接种预定体积的发酵培养基(在适于温育的容器中)，并形成第一预培养物(PC1)。在温育PC1后，通过获得目标体积的PC1并接种到更大的预定体积的发酵培养基(在适于温育的容器中)以形成第二预培养物(PC2)来扩大培养。在另一个实施例中，预定体积可以在10ml至300ml的范围内。在另一个实施例中，PC1的预定体积是10ml。在另一个实施例中，PC2的预定体积是190ml。在另一个实施例中，将培养物(PC1、PC2)温育过夜或在本领域已知的适合生长/温育细菌(特别是李斯特菌的种)的条件下温育。
在另一个实施例中，在温育PC2之后，将预定体积的PC2灌装到一个或多个接种袋中。在另一个实施例中，在温育PC2之后，将预定体积的PC2灌装到4个接种袋中。在另一个实施例中，每个接种袋可以容纳至多250ml。在另一个实施例中，每个接种袋可以容纳至多1L。在另一个实施例中，每个接种袋可以容纳至多5L。在另一个实施例中，每个接种袋用25mLPC2灌装并且用发酵培养基灌装至100mL。在另一个实施例中，每个接种袋灌装1-10ml PC2并用发酵培养基灌装至50-250ml。在另一个实施例中，每个接种袋灌装1-20ml PC2并用发酵培养基灌装至50-250ml。在另一个实施例中，每个接种袋灌装1-40ml PC2并用发酵培养基灌装至100-500ml。在另一个实施例中，每个接种袋灌装1-50ml PC2并用发酵培养基灌装至100-500ml。在另一个实施例中，每个接种袋灌装1-100ml PC2并用发酵培养基灌装至150-500ml。在另一个实施例中，每个接种袋灌装适于在较大容量容器诸如接种袋中扩增或放大的期望体积的PC2。在另一个实施例中，每个接种袋灌装适于在具有预定较大体积的发酵培养基的较大容量容器中扩增或放大的期望体积的PC2。
在一个实施例中，含有扩增李斯特菌克隆(在一个实施例中在本文中称为“药物产品”或“产品”)的接种袋可以在-70℃至-80℃下冷冻以供随后使用。
在另一个实施例中，在PC2温育之后，将预定体积的PC2灌装到细胞袋生物反应器中以启动发酵过程(图50)。在另一个实施例中，发酵过程在制造系统的发酵部分中进行。在另一个实施例中，发酵部分包含细胞袋生物反应器。
在另一个实施例中，本文公开的制造系统的所有部分或部件可以可操作地连接以形成从接种部分到允许发酵、浓缩部分、渗滤和产品分配的单个全封闭式液体流路。在另一个实施例中，制造系统包括允许流体流绕过包括浓缩和渗滤部分的渗余物袋的附加连接器。在另一个实施例中，制造系统还包括从浓缩和渗滤部分通向接种或发酵部分的返回流体连接，从而允许生长培养物再循环以进一步生长。
在一个实施例中，所述流体连接包括流体导管。技术人员将会理解，合适的导管可以涵盖柔性的或不可弯曲的金属导管或者柔性的或不可弯曲的非金属导管。所述金属导管可以由钢、铜、黄铜或本领域已知的任何其他合适的金属制成。所述非金属导管可以由橡胶、塑料或本领域已知的任何其他有机或无机聚合物制成。在另一个实施例中，流体导管是柔性的非金属导管。在另一个实施例中，流体导管是PVC或PIV管线。
根据本公开，连接本发明的各个部分的流体导管被密封在一起，由此形成全封闭式流体流路。也可以使用无菌焊接、无菌管连接器或者在一个实施例中使用一次性无菌连接器来将导管密封。在另一个实施例中，一次性无菌连接器可以在非无菌环境中形成干式连接。在另一个实施例中，一次性无菌连接器的使用极大地减少了无菌焊接器的使用并且另外消除了另一个处理步骤(即灌装到小瓶)。在另一个实施例中，导管采用本领域已知的任何方法密封。
在一个实施例中，还公开了在本文所公开的制造系统的每个流体连接部上的流体流动中断构件，由此提供系统的一个或多个部分的流体隔离。在一个实施例中，流体流动中断构件是一次性阀。在另一个实施例中，流体流动中断构件是夹具。所述夹具可以是滚子夹、弹簧夹或本领域已知的任何夹具。在另一个实施例中，流体流动中断构件是本领域已知的任何此类构件。
本公开还提供了制造系统的各个部分之间的流体转移。在一个实施例中，流体转移可以通过自然重力流来致动。在另一个实施例中，流体转移可以通过诸如泵的机械构件来致动。合适的泵在本领域中是熟知的，并且包括但不限于离心泵、气泵和活塞泵。在一个实施例中，全封闭式细胞生长系统内的流体由蠕动泵致动。
根据本文的公开内容，本文公开的制造方法中的一个或多个步骤在恒定的预定温度下进行。在另一个实施例中，本文公开的制造方法的所有步骤都在恒定的预定温度下进行。在另一个实施例中，制造方法的接种和生长步骤在恒定的预定温度下进行。在一个实施例中，温度保持在约37℃。在另一个实施例中，温度为约37℃。在另一个实施例中，温度为约25℃。在另一个实施例中，温度为约27℃。在另一个实施例中，温度为28℃。在另一个实施例中，温度为约30℃。在另一个实施例中，温度为约32℃。在另一个实施例中，温度为约34℃。在另一个实施例中，温度为约35℃。在另一个实施例中，温度为约36℃。在另一个实施例中，温度为约38℃。在另一个实施例中，温度为约39℃。
在本文公开的方法和组合物的一个实施例中，全封闭式细胞生长系统的接种部分包括可操作地连接到所述全封闭式细胞生长系统的发酵部分的接种容器。在一个实施例中，所述接种容器是塑料烧瓶。在另一个实施例中，该接种容器是塑料小瓶。在另一个实施例中，该接种容器是塑料安瓿。在另一个实施例中，该接种容器是流体袋。在另一个实施例中，该接种容器还包括接种端口。
在一个实施例中，该接种容器具有约5ml的最大体积。在另一个实施例中，该接种容器具有约10ml的最大体积。在另一个实施例中，该接种容器具有约15ml的最大体积。在另一个实施例中，该接种容器具有约20ml的最大体积。在另一个实施例中，该接种容器具有约25ml的最大体积。在另一个实施例中，该接种容器具有约30ml的最大体积。在另一个实施例中，该接种容器具有约35ml的最大体积。在另一个实施例中，该接种容器具有约40ml的最大体积。在另一个实施例中，该接种容器具有约45ml的最大体积。在另一个实施例中，该接种容器具有约50ml的最大体积。
在本文公开的方法和组合物的一个实施例中，将接种容器灌装重组减毒李斯特菌菌株的培养物，其中所述李斯特菌菌株包含核酸序列，所述核酸序列含有一个或多个开放阅读框，所述开放阅读框编码包含一个或多个新表位的一种或多种肽。在一个实施例中，将李斯特菌菌株重悬在营养培养基中。在另一个实施例中，将李斯特菌菌株重悬在制剂缓冲液中。在又一个实施例中，将李斯特菌菌株重悬在冷冻储存溶液中。
在一个实施例中，接种容器中的营养培养基是用于细菌培养物生长的相同培养基。在另一个实施例中，接种容器中的营养培养基是用于培养细菌培养物的不同培养基。
在一个实施例中，本文公开的方法和组合物提供除了接种容器以外的全封闭式细胞生长系统的所有部分的灭菌。本领域技术人员将理解的是，药物制造仪器的合适灭菌方法可以包括蒸汽灭菌、干热灭菌和气体灭菌。在一个实施例中，全封闭式生长系统通过暴露于电离辐射而灭菌。
在一个实施例中，本文公开的方法和组合物提供将接种容器的内容物转移到全封闭式细胞生长系统的发酵部分以启动免疫治疗组合物的制造过程。在另一个实施例中，在转移之前将接种区段和发酵区段均加热至预定的恒定温度。
在本文公开的方法和组合物的一个实施例中，所述全封闭式细胞生长系统的发酵部分包含一个或多个搅拌式生物反应器。在一个实施例中，所述一个或多个搅拌式生物反应器是波混合生物反应器。在另一个实施例中，所述一个或多个搅拌式生物反应器是搅拌槽生物反应器。在另一个实施例中，所述一个或多个搅拌式生物反应器是机械振摇的生物反应器。在另一个实施例中，所述一个或多个搅拌式生物反应器是本领域已知的任何其他类型的生物反应器。在另一个实施例中，所述一个或多个搅拌式生物反应器是摇摆式搅拌生物反应器。在另一个实施例中，所述一个或多个搅拌式生物反应器是摇摆式袋微生物生长系统。
在本文公开的方法和组合物的一个实施例中，本文公开的一个或多个生物反应器中的每一个还包含一个或多个发酵容器，其可操作地连接至接种区段和浓缩/渗滤部分和/或产品分配部分。在另一个实施例中，所述一个或多个发酵容器是塑料容器。在另一个实施例中，所述一个或多个发酵容器是组织培养袋。
在一个实施例中，本文公开的发酵容器具有约100ml的最大体积。在另一个实施例中，该发酵容器具有约150ml的最大体积。在另一个实施例中，该发酵容器具有200ml的最大体积。在另一个实施例中，该发酵容器具有250ml的最大体积。在另一个实施例中，该发酵容器具有300ml的最大体积。在另一个实施例中，该发酵容器具有350ml的最大体积。在另一个实施例中，该发酵容器具有约400ml的最大体积。在另一个实施例中，该发酵容器具有约450ml的最大体积。在另一个实施例中，该发酵容器具有约500ml的最大体积。
在一个实施例中，每个生物反应器包含一个或多个发酵容器。在另一个实施例中，该生物反应器各自包含多于一个发酵容器。在另一个实施例中，该生物反应器各自包含至少两个发酵容器。在另一个实施例中，该生物反应器各自包含至少三个发酵容器。在另一个实施例中，该生物反应器各自包含至少四个发酵容器。在另一个实施例中，该生物反应器各自包含四个以上的发酵容器。
在一个实施例中，每个发酵容器还包括一个或多个采样器端口，其中采样器端口包括采样容器和到发酵容器的流体导管，其中所述采样容器包括采样鲁尔接口(luer)，并且其中所述流体导管包括永久密封导管以将采样容器与发酵容器隔离的构件。
在一个实施例中，每个采样容器具有约0.1ml的最大体积。在另一个实施例中，每个采样容器具有约0.2ml的最大体积。在另一个实施例中，每个采样容器具有约0.3ml的最大体积。在另一个实施例中，每个采样容器具有约0.4ml的最大体积。在另一个实施例中，每个采样容器具有约0.5ml的最大体积。在另一个实施例中，每个采样容器具有约0.6ml的最大体积。在另一个实施例中，每个采样容器具有约0.7ml的最大体积。在另一个实施例中，每个采样容器具有约0.8ml的最大体积。在另一个实施例中，每个采样容器具有约0.9ml的最大体积。在另一个实施例中，每个采样容器具有约1ml的最大体积。
在一个实施例中，每个发酵容器包括一个采样端口。在另一个实施例中，每个发酵容器包括多于一个采样端口。在另一个实施例中，每个发酵容器包括至少两个采样端口。在另一个实施例中，每个发酵容器包括至少三个采样端口。在另一个实施例中，每个发酵容器包括至少四个采样端口。在另一个实施例中，每个发酵容器包含多于四个采样端口。在另一个实施例中，所有采样端口都是单次使用端口。
采样端口可以可操作地连接到采样袋歧管(参见图52)以收集用于质量测试和纯度的样品。在一个实施例中，收集样品以确定外观、活细胞计数(VCC)、李斯特菌菌株中不存在actA基因(通过PCR、蛋白质western印迹等)、存在SIINFEKL肽标签(以测试抗原呈递)以及进行集落PCR和单菌(monosepsis)(纯度)分析。
在另一个实施例中，间歇地收集样品。在另一个实施例中，每10、20、30、40、50或60分钟收集样品。在另一个实施例中，每2小时、每3小时、每4小时或每5小时收集样品。在另一个实施例中，每1-60分钟收集样品用于采样。在另一个实施例中，每1-10小时收集样品用于采样。在另一个实施例中，如上述任一个实施例所述，间歇地收集样品，直到进行最终光密度(OD)采样。
在另一个实施例中，采样袋的体积范围为5-100ml、101-200ml、201-300ml、401-500ml或501-1000ml。在另一个实施例中，采样袋具有25ml的体积。在另一个实施例中，采样袋具有100ml的体积。
在另一个实施例中，将发酵容器灌装营养培养基，并在从接种区段转移接种物之前预热至预定温度。在另一个实施例中，用于生长李斯特菌菌株培养物的营养培养基是溶菌肉汤(Lysogeny Broth，LB)培养基。在另一个实施例中，营养培养基是极品肉汤(Terrific Broth，TB)培养基。在另一个实施例中，营养培养基是胰酶大豆肉汤(TSB)。在另一个实施例中，营养培养基是确定的培养基。在另一个实施例中，营养培养基是本文公开的确定的培养基。在另一个实施例中，营养培养基是本领域已知的任何其他类型的营养培养基。
在另一个实施例中，在培养物生长期间保持恒定的pH。在另一个实施例中，pH保持在约7.0。在另一个实施例中，pH为约6。在另一个实施例中，pH为约6.5。在另一个实施例中，pH为约7.5。在另一个实施例中，pH为约8。在另一个实施例中，pH为约6.5-7.5。在另一个实施例中，pH为约6-8。在另一个实施例中，pH为约6-7。在另一个实施例中，pH为约7-8。
在本文公开的方法和组合物的一个实施例中，使重组减毒李斯特菌菌株的培养物生长直至OD600达到预定值。在一个实施例中，OD600为约0.7个单位。在另一个实施例中，培养物的OD600为约0.8个单位。在另一个实施例中，OD600为约0.7个单位。在另一个实施例中，OD600为约0.8个单位。在另一个实施例中，OD60为约0.6个单位。在另一个实施例中，OD600为约0.65个单位。在另一个实施例中，OD600为约0.75个单位。在另一个实施例中，OD600为约0.85个单位。在另一个实施例中，OD600为约0.9个单位。在另一个实施例中，OD600为约1个单位。在另一个实施例中，OD600为约0.6-0.9个单位。在另一个实施例中，OD600为约0.65-0.9个单位。在另一个实施例中，OD600为约0.7-0.9个单位。在另一个实施例中，OD600为约0.75-0.9个单位。在另一个实施例中，OD600为约0.8-0.9个单位。在另一个实施例中，OD600为约0.75-1个单位。在另一个实施例中，OD600为约0.9-1个单位。在另一个实施例中，OD600大于1个单位。
在另一个实施例中，OD600明显大于1个单位。在另一个实施例中，OD600为约7.5-8.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约1.2个单位。在另一个实施例中，OD600为约1.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约2个单位。在另一个实施例中，OD600为约2.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约3个单位。在另一个实施例中，OD600为约3.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约4个单位。在另一个实施例中，OD600为约4.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约5个单位。在另一个实施例中，OD600为约5.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约6个单位。在另一个实施例中，OD600为约6.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约7个单位。在另一个实施例中，OD600为约7.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约8个单位。在另一个实施例中，OD600为约8.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约9个单位。在另一个实施例中，OD600为约9.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约10个单位。在另一个实施例中，OD600大于10个单位。
在另一个实施例中，OD600为约1-2个单位。在另一个实施例中，OD600为约1.5-2.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约2-3个单位。在另一个实施例中，OD600为约2.5-3.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约3-4个单位。在另一个实施例中，OD600为约3.5-4.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约4-5个单位。在另一个实施例中，OD600为约4.5-5.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约5-6个单位。在另一个实施例中，OD600为约5.5-6.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约1-3个单位。在另一个实施例中，OD600为约1.5-3.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约2-4个单位。在另一个实施例中，OD600为约2.5-4.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约3-5个单位。在另一个实施例中，OD600为约4-6个单位。在另一个实施例中，OD600为约5-7个单位。在另一个实施例中，OD600为约2-5个单位。在另一个实施例中，OD600为约3-6个单位。在另一个实施例中，OD600为约4-7个单位。在另一个实施例中，OD600为约5-8个单位。在另一个实施例中，OD600为约1.2-7.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约1.5-7.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约2-7.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约2.5-7.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约3-7.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约3.5-7.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约4-7.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约4.5-7.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约5-7.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约5.5-7.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约6-7.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约6.5-7.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约7-7.5个单位。在另一个实施例中，OD600约大于10个单位。在另一个实施例中，OD600为约1.2-8.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约1.5-8.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约2-8.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约2.5-8.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约3-8.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约3.5-8.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约4-8.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约4.5-8.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约5-8.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约5.5-8.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约6-8.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约6.5-8.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约7-8.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约7.5-8.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约8-8.5个单位。在另一个实施例中，OD600为约9.5-8.5个单位。在另一个实施例中，OD600为10个单位。
在另一个实施例中，使重组减毒李斯特菌菌株的培养物生长直至培养物的生物量达到预定值。在一个实施例中，生物量为约1×109个集落形成单位(CFU)/ml。在另一个实施例中，生物量为约1.5×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约1.5×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约2×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约3×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约4×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约5×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约7×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约9×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约10×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约12×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约15×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约20×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约25×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约30×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约33×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约40×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约50×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量大于50×109个CFR/ml。
切向流过滤歧管
在一个实施例中，当重组减毒李斯特菌的培养物达到预定的OD600或生物量时，然后将培养物转移到全封闭式细胞生长系统的浓缩和渗滤区段。
参照图51A-C，在一些实施例中，所公开的制造系统的浓缩和渗滤部分也被称为“切向流过滤歧管”。在一个实施例中，浓缩和渗滤部分包含浓缩培养物容器(也称为渗余物容器1)、一个或多个过滤器23和渗透物容器2。在另一个实施例中，所述浓缩和渗滤部分还包括将所述浓缩培养物容器1连接到发酵部分的一个或多个发酵容器的一个或多个流体导管5(例如5A-5Q，统称为“5”)(参见图50)。在另一个实施例中，渗余物1与发酵容器之间的每个流体导管5还包括永久中断流体流的构件，诸如夹具17或夹管阀20。在又一个实施例中，浓缩部分还包括将渗余物容器1连接到所述一个或多个过滤器23的一个或多个流体导管5。在另一个实施例中，连接渗余物容器1和所述过滤器23的流体导管5形成从渗余物容器1到过滤器23(例如经由导管5A和5B)并从过滤器23回到渗余物容器1(例如经由导管5D、5E和5F)的回路，由此在过滤器和渗余物容器之间形成再循环回路。将流体从渗余物袋1输送到过滤器23的流体导管5A、5B(例如，在图51A所示的实施例中以逆时针回路)可以任选地包括流动致动器，诸如蠕动泵40。在又一个实施例中，将流体从过滤器23输送回渗余物袋1的流体导管5C、5D、5E还可以包括中断流体流动的构件，诸如阀20或夹具17。在另一个实施例中，所述一个或多个过滤器23布置在过滤器阵列中，其中在一个实施例中，过滤器串联布置，或者在另一个实施例中，过滤器平行布置。
继续参考图51A-51C，渗余物袋1可以包括多个无菌开口以允许与一个或多个导管5的接合、混合物的循环以及下面讨论的渗滤缓冲液的引入。渗余物袋1可以包括：再循环出口P3，通过该再循环出口将混合物从渗余物袋中抽出；再循环入口P5，通过该再循环入口将剩余混合物在经过过滤器23后再次引入渗余物袋中；渗滤入口P11(图51A的细节C中所示)，通过该渗滤入口可以引入缓冲液。渗余物袋1和/或渗透物袋2还可以包括用于均衡相应袋中的压力的空气交换装置22。空气交换装置22可以包括用于清洁进入的空气并防止溢出的一个或多个阀和过滤器。渗余物袋1还可以包括用于在操作期间接纳温度计的温度计端口P10。参考图51C，在一些实施例中，温度计41可以定位在流体循环回路的导管4上。如本文详细描述的，渗余物袋1可以包括用于附加特征、歧管或采样装置的一个或多个另外的端口P1、P2、P9，并且类似地，渗透物袋2可以包括一个或多个端口P6、P7、P8，这些端口可以连接类似的空气交换装置、采样端口和过滤器23。在一些实施例中，一个或多个夹具8、9、17可以位于浓缩和渗滤系统的一个或多个导管5上，以用于控制通过其的流动。
如本文所讨论的，图51A-C所示的浓缩和渗滤部分可以在浓缩步骤中从构建体的流体混合物中除去培养基以浓缩构建体。在图51A、51C所描绘的实施例中，当通过泵40将混合物从渗余物容器1泵送穿过导管5、经过过滤器23并返回渗余物袋1中时，培养基穿过过滤器23的膜(例如中空纤维过滤器)进入渗透物袋2。通过分离原来的培养基，同时将构建体保持在渗余物袋1和导管5中，浓缩和渗滤部分可以浓缩构建体。例如，浓缩和渗滤部分可以执行2倍构建体浓缩。过滤器可以包括至少一个过滤器表面，该过滤器表面基本垂直于导管5中的流动方向而取向，使得混合物基本上切向地接合过滤器。
浓缩和渗滤部分还可以包括天平(未示出)，渗余物袋1可以定位在其上。基于渗余物袋1的初始重量和在浓缩过程期间的重量监测，可以基于去除的培养基重量间接地计算浓度变化。在一些实施例中，阀20(例如，螺旋阀或夹管阀)可以通过计算机操作的致动器或以手动方式来调节，以限制导管5中的流动并维持过滤器23处的导管5中的压力。循环系统中的混合物可保持在预定压力(例如3psi)以促进培养基通过过滤器的膜。在图51A和51C所示的实施例中，压力传感器(例如，图51C所示的压力传感器12)位于夹管阀20的上游，以有效地测量泵40和阀20之间的系统中的压力，包括在过滤器23处的压力。在一个实施例中，过滤器阵列包括一个过滤器23。在另一个实施例中，过滤器阵列包括多于一个过滤器单元。在又一个实施例中，过滤器阵列包括两个过滤器单元。在又一个实施例中，过滤器阵列包括三个过滤器单元。在又一个实施例中，过滤器阵列包括四个过滤器单元。在又一个实施例中，过滤器阵列包括五个过滤器单元。在又一个实施例中，过滤器阵列包括五个以上的过滤器单元。
在一个实施例中，过滤器23能够用渗余物袋1将细菌截留在再循环回路中，同时允许诸如培养基的流体穿过膜到达渗透物袋2。在另一个实施例中，过滤器另外允许大颗粒如病毒颗粒和大分子通过。
在一个实施例中，过滤器具有至少约0.01-100μm2的膜孔径。在另一个实施例中，过滤器通过渗滤进行操作。
浓缩部分还可以包括将过滤器23连接到渗透物容器2(例如袋)的流体导管5C、5G，所述流体导管还包括允许朝向渗透物容器单向流动的阀或夹具，并且任选地还包括流动致动器，诸如泵。
在另一个实施例中，浓缩培养物容器1和渗透物容器2是塑料容器。在另一个实施例中，浓缩培养物容器1和渗透物容器2是组织培养袋。
在一个实施例中，浓缩培养物容器1具有约100ml的最大体积。在另一个实施例中，浓缩培养物容器1具有约150ml的最大体积。在另一个实施例中，浓缩培养物容器1具有约200ml的最大体积。在另一个实施例中，浓缩培养物容器1具有约250ml的最大体积。在另一个实施例中，浓缩培养物容器1具有约300ml的最大体积。在另一个实施例中，浓缩培养物容器1具有约350ml的最大体积。在另一个实施例中，浓缩培养物容器1具有约400ml的最大体积。在另一个实施例中，浓缩培养物容器1具有约450ml的最大体积。在另一个实施例中，浓缩培养物容器1具有约500ml的最大体积。
在一个实施例中，渗透物容器2具有约100ml的最大体积。在另一个实施例中，渗透物容器2具有约150ml的最大体积。在另一个实施例中，渗透物容器2具有约200ml的最大体积。在另一个实施例中，渗透物容器2具有约250ml的最大体积。在另一个实施例中，渗透物容器2具有约300ml的最大体积。在另一个实施例中，渗透物容器2具有约350ml的最大体积。在另一个实施例中，渗透物容器2具有约400ml的最大体积。在另一个实施例中，渗透物容器具有约450ml的最大体积。在另一个实施例中，渗透物容器2具有约500ml的最大体积。在另一个实施例中，渗透物容器2具有约600ml的最大体积。在另一个实施例中，渗透物容器2具有约700ml的最大体积。在另一个实施例中，渗透物容器2具有约800ml的最大体积。在另一个实施例中，渗透物容器2具有约900ml的最大体积。在另一个实施例中，渗透物容器2具有约1L的最大体积。在另一个实施例中，渗透物容器2具有约1.2L的最大体积。在另一个实施例中，渗透物容器2具有约1.4L的最大体积。在另一个实施例中，渗透物容器2具有约1.6L的最大体积。在另一个实施例中，渗透物容器2具有约1.8L的最大体积。在另一个实施例中，渗透物容器2具有约2L的最大体积。在另一个实施例中，渗透物容器2具有大于2L的最大体积。
在一个实施例中，从发酵部分转移到渗余物容器1中的所公开的培养基通过过滤器阵列循环，并且穿过过滤器23的培养基退回渗透物容器2，由此实现减小的培养物体积并增加培养物中的细菌浓度。在另一个实施例中，细菌通过单次经过单次使用的过滤器阵列而浓缩。在一些实施例中，过滤器23包括中空纤维过滤器。在另一个实施例中，过滤过程使用跨膜压力渗滤来回收细胞浓缩物。这可以将本文公开的方法与使用跨膜压力过滤的其他方法区分开来。
在一个实施例中，培养物中细菌的最终目标浓度为约1-109个细菌/ml。
在另一个实施例中，浓缩重组减毒李斯特菌菌株的培养物直至培养物的生物量达到预定值。在一个实施例中，生物量为约7×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约9×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约10×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约12×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约15×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约20×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约25×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约30×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约33×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约40×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量为约50×109个CFR/ml。在另一个实施例中，生物量大于50×109个CFR/ml。
在另外的实施例中，渗余物容器还包括用于连接一个或多个歧管(例如，图52-53所示的歧管39)的至少一个任选端口P1、P2，以用于采样和/或灌装产品容器，类似于在发酵部分和浓缩部分中的采样器端口。
在一个实施例中，切向流过滤歧管包括渗余物容器、被配置为经由一个或多个渗滤入口P11连接到渗余物容器的制剂缓冲液容器、一个或多个过滤器23和渗透物容器2。在另一个实施例中，浓缩和渗滤部分还包括将渗透物容器2连接到浓缩和渗滤部分的渗余物容器1的流体导管5。在又一个实施例中，浓缩和渗滤部分还包括将渗余物容器1连接到所述一个或多个过滤器23的一个或多个流体导管5。在另外的实施例中，连接渗余物容器1和过滤器23的流体导管包括被配置为将流体从渗余物袋1运送到过滤器23的直接流动导管5和被配置为将流体从过滤器运送回渗余物袋的反向流动导管，从而在过滤器和渗余物容器之间形成再循环回路。在另一个实施例中，所述直接流动流体导管任选地包括流动致动器40，诸如蠕动泵。在又一个实施例中，所述反向流动流体导管还包括减慢或中断流体流动的构件，诸如阀20或夹具17。在另一个实施例中，所述一个或多个过滤器被布置在过滤器阵列中，其中在一个实施例中，过滤器被串联布置，或者在另一个实施例中，过滤器被平行布置。
在浓缩过程期间浓缩构建体产物后，可以进行渗滤以清洁产物并用缓冲溶液更换原来的培养基。在渗滤期间，形成缓冲液容器经由一个或多个渗滤入口P11连接到渗余物袋1。形成缓冲液容器(例如，类似于袋28、29的容器)可以连接到经由导管5M连接到渗滤入口P11的无菌联接器11。一旦连接后，形成缓冲液容器便可以以受控的速率将缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液)引入到渗余物袋1中。浓缩和渗滤部分可继续使混合物循环经过过滤器23，以从混合物中除去流体(包括原来的培养基)。当引入缓冲液时，可以在保持构建体总浓度的同时稀释原来的培养基。在一些实施例中，渗滤可以通过挤压或泵送缓冲液进入渗余物袋1而手动控制。在一些实施例中，计算机系统(例如，与非暂态存储器耦合的控制器、微处理器等)可以控制缓冲液的入口。例如，在一些实施例中，人工或计算机化的操作员可以监视天平以维持渗余物袋1的稳定重量。参考图51C，连接到导管5M的附加泵42可被用于供应缓冲液。在一些实施例中，渗滤可以替代地与浓缩过程重叠，使得在添加新缓冲液的同时浓缩构建体的至少一部分。
在一些实施例中，所述缓冲液可以包含冷冻保护剂以免所述构建体在后来的冷冻过程期间受到冻害。例如，缓冲液可以包含2％的蔗糖。在一些替代实施例中，根据本公开，本领域的普通技术人员将认识到，可以使用任何溶液来实现冷冻保护剂效果，诸如甘油、二醇化合物和其他冷冻保护剂。
在一些实施例中，再循环出口P3、再循环入口P5和/或渗滤入口P11可以被定位成防止构建体在渗余物袋中沉降。例如，在所示实施例中，再循环出口P3和渗滤入口P11在其操作位置中靠近渗余物袋1的底部定位。再循环出口P3和渗滤入口P11可以定位在渗余物袋1的底部。在一些实施例中，再循环出口P3和渗滤入口P11可以彼此靠近定位以在渗余物袋1中形成涡流并防止沉降。在一些实施例中，再循环出口P3和渗滤入口P11可以被定位成彼此相距小于一英寸。在一些实施例中，再循环出口P3和渗滤入口P11可以被定位成彼此相距小于两英寸。在一些实施例中，再循环出口P3和渗滤入口P11可以被定位成彼此相距小于三英寸。在一些实施例中，再循环出口P3和渗滤入口P11可以被定位成彼此相距小于四英寸。在一些替代实施例中，再循环入口P5可以靠近再循环出口P3和渗滤入口P11中的至少一个定位以产生涡流。
在一些实施例中，通过再循环回路的流量可以保持在确定的流量。流量可以足够高以防止生物膜的形成和堵塞，并且流量可以足够低以防止剪切和杀死构建体。流量可以基于混合物的粘度和过滤器尺寸/流量(例如，中空纤维过滤器中的纤维的数量)通过实验来建立，并取决于雷诺数。在一些实施例中，流量可以足够高以在循环回路中引起湍流，其中湍流有助于防止生物膜形成。泵40可以手动控制，预设为预定的流量，或者由计算机系统自动控制以保持流量。
在一些实施例中，流量可以是从0.450L/min到0.850L/min。在一些实施例中，流量可以是从0.250L/min到1L/min，或者其任何单独的子增量。在一些实施例中，流量可以是0.600L/min。在一些实施例中，流量可以是0.650L/min。在一些实施例中，流量可以是从0.650L/min至0.850L/min。在一些实施例中，流量可以是从0.600L/min至0.850L/min。在一些实施例中，流量可以是从0.450L/min到0.650L/min。在一些实施例中，流量可以是从0.450L/min到0.600L/min。在一些实施例中，流量可以是从0.600L/min到0.650L/min。参见图55，显示了对若干示例性实施例的雷诺数、泵流量、纤维计数、速度、运动粘度、流量/纤维、单位长度、内径、纤维体积和传送时间、特征长度进行比较的表格。在一些实施例中，约700的雷诺数是优选的。在一些实施例中，在浓缩和渗滤期间，泵的速度可以保持恒定。在一些其他实施例中，随着雷诺数改变，泵速可增加或减小。在一些实施例中，在浓缩和/或渗滤期间泵速可增加。
如本文所详细描述的，浓缩和渗滤可以由一个或多个计算机系统控制，所述计算机系统包括处理器、存储器、一个或多个传感器、一个或多个致动器以及相关的分析和控制软件及硬件，如本领域普通技术人员根据本公开所理解的。一个或多个传感器可以设置在浓缩和渗滤部分中，以向用户或计算机提供操作数据。在一些实施例中，生物膜的积聚可以通过位于导管5中的一个或多个压力传感器(例如，图51C中所示的压力传感器12)来检测。压力读数可以在两个或更多个位置获取，以检测回路中的压降。检测到与基线压力差的变化可表明生物膜的形成，并因此表明通过回路的流量太低。响应于两个或更多个压力传感器之间的压力差的变化，该部分可以增加泵的速度，或者如果生物膜未被移除则发出错误信号。在一些实施例中，两个压力传感器可以定位在过滤器23的任一侧上。
在一些实施例中，可以通过一个或多个光密度传感器来检测构建体的剪切。在一些实施例中，混合物的光密度从基线光密度的变化可以指示剪切。基线值可以在浓缩或渗滤步骤开始时获取。在一些实施例中，可以获取活/死计数来确定最大流量。
光密度传感器可以定位在渗余物袋1中或导管5中以检测循环混合物的光密度。在一些实施例中，可以将两个或更多个光密度传感器定位在再循环回路中的不同位置处以检测光密度的变化。在一些其他实施例中，可以将光密度传感器定位在渗透物袋2中以检测光密度的变化。典型地，渗透物袋2将包含很少的构建体或不含构建体，并因此将具有低浑浊度或不浑浊。剪切后的构建体可以通过过滤器23而不是在浓缩回路中再循环，因此，渗透物袋2的光密度的变化(例如增加)可以指示正在发生剪切。响应于光密度的变化，泵40的速度可以由计算机系统或用户增加。
在一个实施例中，过滤器阵列包括一个过滤器单元。在另一个实施例中，过滤器阵列包括多于一个过滤器单元。在又一个实施例中，过滤器阵列包括两个过滤器单元。在又一个实施例中，过滤器阵列包括三个过滤器单元。在又一个实施例中，过滤器阵列包括四个过滤器单元。在又一个实施例中，过滤器阵列包括五个过滤器单元。在又一个实施例中，过滤器阵列包括五个以上的过滤器单元。
本文公开的过滤器可以是袋式膜过滤器、平坦表面膜过滤器、筒式过滤器、吸附剂过滤器或吸收剂过滤器。在另一个实施例中，过滤器是中空纤维过滤器。
在一个实施例中，过滤器能够截留细菌，同时允许培养基通过。在另一个实施例中，过滤器另外允许大颗粒如病毒颗粒和大分子通过。
在一个实施例中，过滤器具有至少约0.01-100μm2的膜孔径。在另一个实施例中，过滤器通过切向流过滤进行操作。
在另一个实施例中，浓缩和渗滤部分还包括将过滤器阵列连接到渗透物袋的流体导管，所述流体导管还包括允许朝向渗透物容器单向流动的阀，并且任选地还包括流动致动器，诸如泵。在另一个实施例中，浓缩和渗滤部分还包括将制剂缓冲液容器连接到渗余物容器的流体导管，所述流体导管还包括允许朝向渗余物容器单向流动的阀，并且任选地还包括流动致动器，诸如泵。
在另一个实施例中，渗余物、制剂缓冲液和渗透物容器是塑料容器。在另一个实施例中，渗余物、制剂缓冲液和渗透物容器是组织培养袋。
在一个实施例中，渗余物容器具有约100ml的最大体积。在另一个实施例中，渗余物容器具有约150ml的最大体积。在另一个实施例中，渗余物容器具有约200ml的最大体积。在另一个实施例中，渗余物容器具有约250ml的最大体积。在另一个实施例中，渗余物容器具有约300ml的最大体积。在另一个实施例中，渗余物容器具有约350ml的最大体积。在另一个实施例中，渗余物容器具有约400ml的最大体积。在另一个实施例中，渗余物容器具有约450ml的最大体积。在另一个实施例中，渗余物容器具有约500ml的最大体积。
在一个实施例中，制剂缓冲液容器具有约100ml的最大体积。在另一个实施例中，制剂缓冲液容器具有约150ml的最大体积。在另一个实施例中，制剂缓冲液容器具有约200ml的最大体积。在另一个实施例中，制剂缓冲液容器具有约250ml的最大体积。在另一个实施例中，制剂缓冲液容器具有约300ml的最大体积。在另一个实施例中，制剂缓冲液容器具有约350ml的最大体积。在另一个实施例中，制剂缓冲液容器具有约400ml的最大体积。在另一个实施例中，制剂缓冲液容器具有约450ml的最大体积。在另一个实施例中，制剂缓冲液容器具有约500ml的最大体积。
在一个实施例中，在制造过程开始之前，将制剂缓冲液容器灌装制剂缓冲液并将其整合到全封闭式细胞生长系统中。在另一个实施例中，在制造过程正在进行的同时，将制剂缓冲液容器灌装制剂缓冲液并经由例如一次性无菌连接器整合到全封闭式细胞生长系统中。
在另一个实施例中，制剂缓冲液在使用前等于预定温度。在另一个实施例中，渗余物容器和制剂缓冲液容器在渗滤过程之前等于预定温度。在一个实施例中，温度保持在约37℃。在另一个实施例中，温度为约37℃。在另一个实施例中，温度为约4℃。在另一个实施例中，温度为约8℃。在另一个实施例中，温度为约12℃。在另一个实施例中，温度为约16℃。在另一个实施例中，温度为约12℃。在另一个实施例中，温度为约20℃。在另一个实施例中，温度为约25℃。在另一个实施例中，温度为约27℃。在另一个实施例中，温度为约28℃。在另一个实施例中，温度为约30℃。在另一个实施例中，温度为约32℃。在另一个实施例中，温度为约34℃。在另一个实施例中，温度为约35℃。在另一个实施例中，温度为约36℃。在另一个实施例中，温度为约38℃。在另一个实施例中，温度为约39℃。
在另一个实施例中，将从浓缩部分转移到渗余物容器1中的培养基循环通过所述过滤器阵列，其中通过过滤器23的培养基被排出到渗透物容器2中，同时制剂缓冲液添加到渗余物容器1中，从而实现用制剂缓冲液代替营养培养基。在另一个实施例中，缓冲液通过单次经过单次使用的过滤器阵列而更换。在另外的实施例中，添加到渗余物袋1中的制剂缓冲液的体积小于移入渗透物容器2中的培养基体积，从而实现培养物体积的减小，并因此增加免疫治疗组合物中细菌的浓度。在另一个实施例中，添加到渗余物袋1中的制剂缓冲液的体积大于移入渗透物容器2中的培养基体积，从而实现培养物体积的增加，并因此降低免疫治疗组合物中细菌的浓度。在另一个实施例中，过滤过程使用跨膜压力渗滤来回收免疫治疗组合物。这将本发明的方法与使用跨膜压力过滤的其他方法区分开来。在一个实施例中，培养物中细菌的最终目标浓度为约1-109个细菌/ml。
在本文公开的方法和组合物的一个实施例中，随后通过上述流体导管将包含在制剂缓冲液中的重组减毒李斯特菌的免疫治疗组合物从渗余物容器1转移到全封闭式细胞生长系统的产品分配部分，所述流体导管包括允许向产品分配部分单向流动的阀20(图53)、永久中断流体流动的构件(诸如阀20或夹具17)并且任选地还包括流动致动器，诸如泵。
在一个实施例中，本文公开的制造系统的产品分配部分39也被称为“产品库歧管”或“歧管”(参见图52-53)。在一个实施例中，产品分配部分包括散装容器(例如，渗余物容器1)、清洗容器和一个或多个产品容器。在又一个实施例中，产品分配部分还包括一个或多个流体导管30，其将散装容器串联连接到所述清洗容器(例如，100mL袋29)和所述一个或多个产品容器(例如，25mL袋28)，其中清洗容器位于一系列连接器的远端，而产品容器在一系列连接中具有中间位置。在另一个实施例中，连接散装容器、清洗容器和产品容器的导管还包括永久中断向每个产品容器中流动的构件(诸如阀20、夹具17)或永久密封导管的构件，并且任选地包括流动致动器，诸如泵，其中所述致动器位于散装容器的近侧。歧管39可通过一个或多个连接器11无菌地附接到渗余物袋(例如，图51A-C所示的渗余物袋1的P1或P2)。
在一个实施例中，散装容器和清洗容器是塑料容器。在另一个实施例中，散装容器和清洗容器是组织培养袋。
在一个实施例中，产品容器是塑料容器、塑料安瓿、玻璃安瓿或单次使用注射器。在另一个实施例中，产品容器是还包括IV输送口的IV袋。在另一个实施例中，产品容器是单剂量IV袋。
在一个实施例中，产品分配部分(在本文中也被称为“产品库歧管”)包括一个单一剂量产品容器。在另一个实施例中，产品分配部分包括两个单剂量产品容器。在另一个实施例中，产品分配部分包括三个单剂量产品容器。在另一个实施例中，产品分配部分包括四个单剂量产品容器。在另一个实施例中，产品分配部分包括五个单剂量产品容器。在另一个实施例中，产品分配部分包括六个单剂量产品容器。在另一个实施例中，产品分配部分包括七个单剂量产品容器。在另一个实施例中，产品分配部分包括八个单剂量产品容器。在另一个实施例中，产品分配部分包括九个单剂量产品容器。在另一个实施例中，产品分配部分包括十个单剂量产品容器。在另一个实施例中，产品分配部分包括多于十个单剂量产品容器。
在一个实施例中，每个产品容器具有约1-500ml的体积。
在另外的实施例中，散装容器包括与发酵和浓缩/渗滤部分中的采样器端口相似的至少一个任选的采样器端口。
在另一个实施例中，本文公开的所述全封闭式细胞生长系统具有集中式结构，其中发酵部分的发酵容器还用作浓缩部分和渗滤部分的渗余物容器，以及用作产品分配部分的散装容器。在另一个实施例中，集中式全封闭式细胞生长系统还包括单独的多组流出流体导管，其将发酵/浓缩培养物/渗余物/散装容器连接到接种、浓缩/渗滤和产品分配部分中的每一个的相应部件，特别是连接到接种容器、连接到浓缩部分/渗滤部分的一个或多个过滤器以及连接到产品分配部分的产品和清洗容器。在另一个实施例中，集中式全封闭式细胞生长系统还包括一组将浓缩/渗滤部分的一个或多个过滤器连接到发酵/浓缩培养物/渗余物/散装容器的再循环导管。在另一个实施例中，将所述发酵/浓缩培养物/渗余物/散装容器连接到集中式全封闭式细胞生长系统的其他部分的流出流体导管还包括允许离开发酵/浓缩培养物/渗余物/散装容器单向流动的任选的阀。在另一个实施例中，流出流体导管中的一个或多个可选地包括流体流动致动器，诸如泵。在另外的实施例中，将浓缩部分/渗滤部分的所述一个或多个过滤器连接至发酵/浓缩培养物/渗余物/散装容器的再循环导管还包括允许向/从发酵/浓缩培养物/渗余物/散装容器单向流动的任选的阀。在另一个实施例中，连接到集中式全封闭式细胞生长系统的发酵/浓缩培养物/渗余物/散装容器的每个流体导管还包括永久中断流体流动的构件，诸如阀20或夹具17，或永久密封导管的构件。
本文公开了一种通过平行使用上文所述的若干全封闭式单次使用细胞生长系统来扩大制造个性化免疫治疗组合物的过程的方法。在一个实施例中，一组全封闭式细胞生长系统被用于为同一患者制备若干不同的个性化免疫治疗组合物。在另一个实施例中，一组全封闭式细胞生长系统用于为不同的患者制备若干不同的个性化免疫治疗组合物。在另一个实施例中，一组全封闭式细胞生长系统的平行使用允许个性化免疫治疗组合物的输出的巨大增加
在一个实施例中，所述组包括平行操作的两个全封闭式细胞生长系统。在另一个实施例中，该组包括平行操作的三个全封闭式细胞生长系统。在另一个实施例中，该组包括平行操作的四个全封闭式细胞生长系统。在另一个实施例中，该组包括平行操作的五个全封闭式细胞生长系统。在另一个实施例中，该组包括平行操作的六个全封闭式细胞生长系统。在另一个实施例中，该组包括平行操作的七个全封闭式细胞生长系统。在另一个实施例中，该组包括平行操作的八个全封闭式细胞生长系统。在另一个实施例中，该组包括平行操作的九个全封闭式细胞生长系统。在另一个实施例中，该组包括平行操作的十个全封闭式细胞生长系统。在另一个实施例中，该组包含多于十个平行操作的全封闭式细胞生长系统。
本文公开了用于在封闭的环境室中操作全封闭式一次性细胞生长系统或一组系统的过程。在一个实施例中，封闭的环境室是洁净室。在另一个实施例中，封闭的环境室是生物通风橱。
在一个实施例中，术语“封闭的环境室”是指完全或部分密封或与外部环境隔离的任何尺寸的外壳，并且其中一个或多个环境参数诸如温度、压力、气氛和空气中的颗粒物水平维持在特定的预设水平。
在另一个实施例中，制造个性化免疫治疗组合物的方法还提供了在制造过程的同时或在制造过程完成之后测试所制造的组合物。并行测试可以在制造过程的任何步骤中进行，并且在整个制造过程中提供持续监控产品质量的显著优点。并行测试还提供了消除后期测试的额外优点，从而节省了大量时间。在一个实施例中，所述测试包括但不限于纯度控制、安全性控制、效能控制、特性控制(identity control)和稳定性控制。
在一个实施例中，术语“纯度控制”是指测试个性化免疫治疗组合物是否存在工艺杂质，诸如残留的培养基组分、产物杂质和污染性危险原(adventurous agent)如噬菌体。
在另一个实施例中，术语“安全性控制”是指测试个性化免疫治疗组合物的毒力，具体地，就李斯特菌而言，将测试所制造的组合物的减毒活性。在另一个实施例中，术语“特性控制”是指测试个性化免疫治疗组合物是否存在预期的质量属性，诸如抗生素敏感性。在另一个实施例中，术语“效能控制”是指测试个性化免疫治疗组合物的疗效。疗效可以例如在体外模型系统中测试。
在另一个实施例中，术语“稳定性控制”是指测试个性化免疫治疗组合物在整个预期使用期限中维持质量属性的能力。
本文公开了一种按订单制造，从而允许在完成制造过程后立即将个性化免疫原性组合物递送给患者。在一个实施例中，一旦产品已经被输送到产品容器，便将至少一个单剂量产品容器(优选IV袋)从单次使用的全封闭式细胞生长系统脱离，并且将产品容器连接到细胞生长系统的流体导管被永久密封。在分离之后，使用产品容器将个性化免疫治疗组合物直接施用给患者，例如经由IV输注。
本文公开了一种用于储存个性化免疫治疗组合物以供随后使用或运输至远程位置的患者的系统。如本发明所考虑，一旦产品已经被输送到产品容器，便将一个或多个单剂量产品容器(优选单次使用的IV袋)从单次使用的全封闭式细胞生长系统脱离，并且将产品容器连接到细胞生长系统被永久密封。分离后，产品容器立即冷冻，并储存或运输。在一个实施例中，将个性化免疫原性组合物在低于-20摄氏度的温度下冷冻、储存并运输。在另一个实施例中，温度为约-70℃。在另一个实施例中，温度为约-70至-80℃。在另一个实施例中，将个性化免疫治疗组合物解冻，并且将细菌细胞在递送给患者之前立即重新悬浮在制剂缓冲液中。在一个实施例中，所述个性化免疫治疗组合物在即将递送给患者之前等于预定的温度。在另一个实施例中，该温度是环境温度。在另一个实施例中，该温度为约37℃。
在一个实施例中，本文公开的制造方法消除了将药物转移至单独的设施进行进一步加工(即灌装到小瓶中)的需要，从而降低了污染的风险并缩短了时间。在另一个实施例中，本文公开的制造方法允许在D级/100,000级/ISO 8或更高的环境中制造。
如本公开所提供，制造步骤将花费不超过两周。在另一个实施例中，制造步骤将花费约1-2周。在另一个实施例中，制造步骤将花费约1周。在另一个实施例中，制造步骤将花费不到1周。
如本公开进一步提供，免疫治疗剂的放行前测试和放行步骤将花费不超过五周。在另一个实施例中，免疫治疗剂的放行前测试和放行步骤将花费约4-5周。在另一个实施例中，免疫治疗剂的放行前测试和放行步骤将花费约4周。在另一个实施例中，免疫治疗剂的放行前测试和放行步骤将花费不到4周。
如本公开另外提供，运输步骤将花费不超过一周。在另一个实施例中，运输步骤将花费不到1周。
个性化免疫治疗过程
在一个实施例中，本文公开一种用于提供针对具有疾病或病症的受试者形成的个性化免疫疗法系统的系统，所述系统包括：
减毒李斯特菌菌株递送载体；以及
用于转化所述李斯特菌菌株的质粒载体，所述质粒载体包含含有一个或多个开放阅读框的核酸构建体，该一个或多个开放阅读框编码包含一个或多个新表位的一种或多种肽，其中所述新表位包含存在于具有所述疾病或病症的所述受试者的患有疾病组织或细胞中的免疫原性表位；
其中用所述质粒载体转化所述李斯特菌菌株形成了靶向所述受试者的疾病或病症的个性化免疫疗法系统。
在一个实施例中，本文公开一种用于针对具有疾病或病症的受试者形成个性化免疫疗法的方法，该方法包括以下步骤：
将从患有疾病生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个ORF相比较，其中所述比较鉴定编码一种或多种肽的一种或多种核酸序列，该一种或多种肽包含在来自该患有疾病样品的所述一个或多个ORF内编码的一个或多个新表位；
用包含编码含有a.中鉴定的所述该一个或多个新表位的一种或多种肽的核酸序列的载体转化减毒李斯特菌菌株；以及另选地储存所述减毒重组李斯特菌以在预定时间段时施用给所述受试者或者向所述受试者施用包含所述减毒重组李斯特菌菌株的组合物，并且其中所述施用引起针对所述疾病或所述病症的个性化T细胞免疫应答的生成；任选地，
从所述受试者获得包含来自所述T细胞免疫应答的T细胞克隆或T浸润细胞的第二生物样品并且表征包含由所述T细胞上的MHC I类或MHC II类分子结合的一个或多个免疫原性新表位的特异性肽，其中所述一个或多个新表位是免疫原性的；
筛选并选择编码包含c.中鉴定的一个或多个免疫原性新表位的一种或多种肽的核酸构建体；以及
用包含编码含有所述一个或多个免疫原性新表位的一种或多种肽的核酸序列的载体转化第二减毒重组李斯特菌菌株；以及另选地储存所述第二减毒重组李斯特菌以在预定时间段时施用给所述受试者或者向所述受试者施用包含所述第二减毒重组李斯特菌菌株的第二组合物，
其中所述方法形成用于所述受试者的个性化免疫疗法。
在一个实施例中，本文公开一种用于针对具有疾病或病症的受试者形成个性化免疫疗法的方法，该方法包括以下步骤：
将从患有疾病生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个ORF相比较，其中所述比较鉴定编码一种或多种肽的一种或多种核酸序列，该一种或多种肽包含在来自该患有疾病样品的所述一个或多个ORF内编码的一个或多个新表位；
用编码包含a.中鉴定的所述一个或多个新表位的一种或多种肽的核酸序列转化载体，或者使用包含编码含有a.中鉴定的所述一个或多个新表位的所述一种或多种肽的一个或多个ORF的所述核酸序列生成DNA疫苗载体或肽疫苗载体；以及另选地储存所述载体或所述DNA疫苗或所述肽疫苗以在预定时间段时施用给所述受试者或者向所述受试者施用包含所述载体、所述DNA疫苗或所述肽疫苗的组合物，并且其中所述施用引起针对所述疾病或所述病症的个性化T细胞免疫应答的生成；以及任选地，
从所述受试者获得包含T细胞克隆或T浸润细胞或血液或组织样品的第二生物样品，由此可基于增加或改变的T细胞免疫应答来鉴定和选择对潜在新表位肽的应答，并且通过以下方式来表征：通过与包含由所述T细胞上的MHC I类或MHC II类分子结合的一个或多个免疫原性新表位的特异性肽反应，其中所述一个或多个新表位是免疫原性的，或者通过基于PCR的对T细胞受体特异性的深度测序和对与新表位相关的增加的T细胞应答的评价；
筛选并选择编码包含c.中鉴定的一个或多个免疫原性新表位的一种或多种肽的核酸构建体；以及
用编码含有所述一个或多个免疫原性新表位的一种或多种肽的核酸序列转化载体，或者使用编码包含c.中鉴定的所述一个或多个免疫原性新表位的一种或多种肽的所述核酸序列生成DNA疫苗载体或肽疫苗载体；以及另选地储存所述载体或所述DNA疫苗或所述肽疫苗以在预定时间段时施用给所述受试者或者向所述受试者施用包含所述载体、所述DNA疫苗或所述肽疫苗的组合物，
其中所述方法形成用于所述受试者的个性化免疫疗法。
在另一个实施例中，本文公开一种用于提供针对具有疾病或病症的受试者的个性化免疫疗法的系统，该系统包括以下部件：
从具有所述疾病或病症的所述受试者获得的患有疾病生物样品；
健康生物样品，其中所述健康生物样品从具有所述疾病或病症的所述人受试者或另一个健康人受试者中获得；
筛选测定或筛选工具以及相关数字软件，其用于比较从所述患有疾病生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从所述健康生物样品中提取的核酸序列中的开放阅读框，并且用于鉴定由所述患有疾病样品的所述核酸序列编码的所述ORF中的突变，其中所述突变包含一个或多个新表位；
其中所述相关数字软件包括访问序列数据库，该序列数据库允许筛选所述ORF内的所述突变以用于鉴定一个或多个T细胞表位或免疫原性潜力或其任何组合；
核酸克隆和表达试剂盒，其用于克隆和表达来自所述患有疾病样品的编码含有所述一个或多个新表位的一种或多种肽的核酸；
免疫原性测定，其用于对含有一个或多个新表位的候选肽的T细胞免疫原性和/或结合进行测试；
分析装置和相关软件，其用于对核酸序列、肽氨基酸序列和T细胞受体氨基酸序列进行测序和分析。
减毒李斯特菌递送载体，其用于使用包含含有一个或多个开放阅读框的核酸构建体的质粒载体转化，该一个或多个开放阅读框编码所述鉴定的包含步骤(e)中的一个或多个免疫原性新表位的免疫原性肽，
其中一旦转化，所述李斯特菌就被储存或者作为免疫原性组合物的一部分施用给(a)中的所述人受试者；或者
递送载体；以及任选地
用于转化所述递送载体的载体，所述载体包含含有一个或多个开放阅读框的核酸构建体，该一个或多个开放阅读框编码包含一个或多个新表位的一种或多种肽，其中所述新表位包含存在于具有所述疾病或病症的所述受试者的患有疾病组织或细胞中的免疫原性表位。
在另一个实施例中，所述一种或多种肽由所述核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)编码。
在另一个实施例中，疾病是感染性疾病或肿瘤或癌症。
在另一个实施例中，所述递送载体包括细菌递送载体。在另一个相关方面，所述递送载体包括病毒载体递送载体。在另一个相关方面，所述递送载体包括肽疫苗递送载体。在另一个相关方面，所述递送载体包括DNA疫苗递送载体。
在一个实施例中，本文公开一种用于形成个性化免疫疗法的方法，该方法包括以下步骤：
从具有所述疾病或病症的受试者获得患有疾病生物样品；
从所述患有疾病样品中提取核酸；
从步骤(a)中的所述受试者中或者从相同物种的不同个体中获得健康生物样品；
从所述健康样品中提取核酸；
对来自步骤(b)和(d)的所提取的核酸进行测序；
比较从所述患有疾病生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从所述健康生物样品中提取的核酸序列中的开放阅读框，并且用于鉴定由所述患有疾病样品的所述ORF内的突变的核酸序列，其中所述ORF编码包含一个或多个新表位的肽；
鉴定所述患有疾病样品中的所述ORF内突变的序列，其中所述ORF编码包含一个或多个新表位的肽；
其中所述新表位使用本领域熟知的方法鉴定，这些方法包括但不限于T-细胞受体(TCR)测序或全基因组测序。
表达包含所述鉴定的突变的核酸序列的所述一种或多种肽；
针对免疫原性T细胞应答筛选包含所述一个或多个新表位的每种肽，其中免疫原性T细胞应答的存在与包括T细胞表位的一个或多个新表位的存在相关联；
鉴定和选择编码包含为T细胞表位的一个或多个免疫原性新表位的一种或多种免疫原性肽的核酸序列，并且用包含所述序列的质粒载体转化减毒李斯特菌菌株；
培养和表征所述减毒李斯特菌菌株以确认所述一种或多种免疫原性肽的表达和分泌素；以及
储存所述减毒李斯特菌，以用于在预定时间段时施用给所述受试者或者向所述受试者施用所述减毒李斯特菌菌株，其中所述减毒李斯特菌菌株作为免疫原性组合物的一部分施用。
在另一个实施例中，从所述受试者获得第二生物样品的方法包括获得包含在施用包含所述减毒重组李斯特菌菌株的所述第二组合物之后扩增的T细胞克隆或T浸润细胞的生物样品。
在另一个实施例中，表征包含由所述T细胞上的MHC I类或MHC II类分子结合的一个或多个免疫原性新表位的特异性肽的方法包括以下步骤：
鉴定、分离和扩增响应于所述疾病的T细胞克隆或T浸润细胞；
筛选并鉴定包含装载在结合所述T细胞上的T细胞受体的特异性MHC I类或MHC II类分子上的一个或多个免疫原性新表位的一种或多种肽。
在另一个实施例中，对包含装载在特异性MHC I类或MHC II类分子上的一个或多个免疫原性新表位的一种或多种肽的筛选步骤和鉴定包括使所述T细胞与所述一种或多种肽接触。在另一个实施例中，所述筛选步骤和鉴定包括执行T细胞受体测序、基于多路复用的流式细胞术或高效液相色谱法以确定肽特异性。技术人员将充分了解的是，用于确定结合至T细胞受体的肽的方法是本领域中熟知的。
在一个实施例中，在本文所公开的形成个性化免疫疗法的系统或方法中的比较步骤包括使用筛选测定或筛选工具和相关数字软件，以用于比较从所述患有疾病生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)与从所述健康生物样品中提取的核酸序列中的开放阅读框并且用于鉴定所述患有疾病样品的所述ORF内编码含有一个或多个新表位的肽或包含在所述肽内的突变的核酸序列。在另一个实施例中，相关数字软件包括访问序列数据库，该序列数据库允许筛选所述ORF内的所述患有疾病核酸序列或者相应地在数字上翻译的编码包含一个或多个新表位的所述肽的氨基酸序列，以用于鉴定T细胞表位或免疫原性潜力或其任何组合。
在一个实施例中，在提供的形成个性化免疫疗法的系统或方法中的筛选免疫原性T细胞应答的步骤包括使用本领域熟知的免疫应答测定，包括例如T-细胞增殖测定、使用利用所述新表位活化并与肿瘤细胞共同温育(使用51Cr-释放测定或3H-胸苷测定)的T细胞进行的体外肿瘤消退测定、ELISA测定、ELIspot测定以及FACS分析。(参见例如，美国专利号8,771,702，该专利以引用的方式整体并入本文)
在一个实施例中，本发明涉及一种重组减毒李斯特菌菌株，其包含以下各项：
核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合至包含本文所公开的一个或多个新表位的一种或多种肽的免疫原性多肽或其片段；或者
微基因核酸构建体，该构建体包含编码嵌合蛋白的一个或多个开放阅读框，其中所述嵌合蛋白包含：
细菌分泌信号序列，
泛素(Ub)蛋白，
包含本文所公开的一个或多个新表位的一种或多种肽；并且
其中a.-c.中的所述信号序列、所述泛素和所述一种或多种肽从氨基端到羧基端可操作性地串联连接或布置。
在另一个实施例中，细菌序列是李斯特菌序列，其中在一些实施例中，所述李斯特菌序列是hly信号序列或actA信号序列。
在另一个实施例中，该疾病是局部疾病。在另一个实施例中，该疾病是肿瘤或癌症。在另一个实施例中，该肿瘤或癌症是实体肿瘤或癌症。在另一个实施例中，该肿瘤或癌症是液体肿瘤或癌症。在另一个实施例中，异常或不健康生物样品包括肿瘤、癌症或其部分。
在一个实施例中，该疾病是感染性疾病。在另一个实施例中，该感染性疾病是感染性病毒疾病或感染性细菌疾病。在另一个实施例中，由本文所公开的方法鉴定的新表位是感染性疾病相关性特异性表位。
在另一个实施例中，新表位包括独特的肿瘤或癌症新表位。在另一个实施例中，新表位包括癌症特异性表位或肿瘤特异性表位。在另一个实施例中，新表位是免疫原性的。在另一个实施例中，新表位由T细胞识别。在另一个实施例中，包含一个或多个新表位的肽活化针对肿瘤或癌症的T细胞应答，其中所述应答对于所述受试者是个性化的。
在另一个实施例中，新表位包括独特的肿瘤或癌症新表位。在另一个实施例中，新表位包括与感染性疾病相关的独特表位。在一个实施例中，感染性疾病表位直接与该疾病相关。在一个另选实施例中，感染性疾病表位与该感染性疾病相关。
在另一个实施例中，本文所公开的方法允许在具有疾病的所述受试者中生成个性化的增强的抗病、或抗感染、或抗感染性疾病、或抗肿瘤免疫应答。在另一个实施例中，本文所公开的方法允许个性化治疗或预防受试者中的所述疾病、或所述感染或感染性疾病、或所述肿瘤或癌症。在另一个实施例中，本文所公开的方法增加具有所述疾病、或所述感染或感染性疾病、或所述肿瘤或癌症的所述受试者的存活时间。
在一个实施例中，本文公开提供一种免疫原性组合物，其包含本文所公开的重组李斯特菌菌株和药学上可接受的载剂。在另一个实施例中，本文公开一种或多种免疫原性组合物，其包含一种或多种重组李斯特菌菌株，其中每种减毒李斯特菌菌株表达包含一个或多个不同的新表位的一种或多种不同的肽。在另一个实施例中，每种李斯特菌表达一系列新表位。在另一个实施例中，每种肽包含为T细胞表位的一个或多个新表位。在一个实施例中，本文公开一种在受试者中引发靶向的个性化抗肿瘤T细胞应答的方法，该方法包括向受试者施用有效量的包含本文所公开的重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物的步骤，其中该李斯特菌菌株表达一个或多个新表位。在另一个实施例中，李斯特菌菌株包含以下各项之一：核酸分子，其包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中该融合多肽包含融合至含有与癌症疾病相关的一个或多个新表位的肽的免疫原性多肽或其片段；或者微基因核酸构建体，其包含编码嵌合蛋白的第一开放阅读框，其中所述嵌合蛋白包含李斯特菌分泌信号序列、泛素(Ub)蛋白和一种或多种肽，每种肽包含与肿瘤或癌症相关的一个或多个新表位，其中所述信号序列、所述泛素和所述一种或多种肽相应地从氨基端到羧基端串联布置，或者可操作地连接。
在另一个实施例中，融合肽还连接到HIS标签或SIINFECKL标签。技术人员将了解的是，这些标签的序列可并入到质粒或噬菌体载体上的融合肽序列中。可以表达这些标签并呈递抗原表位，从而使得临床医生可以通过跟踪针对这些“标签”序列肽的免疫应答而跟踪所分泌的肽的免疫原性。这样的免疫应答可使用多种试剂包括但不限于针对这些标签特异性的单克隆抗体和DNA或RNA探针来监测。
在另一个实施例中，一种本发明的方法是增加受试者的脾和肿瘤中的T效应细胞与调节T细胞(Tregs)的比率，其中所述T效应细胞靶向受试者的异常或不健康组织例如肿瘤组织或癌症内存在的新表位，该方法包括向受试者施用包含本文所公开的重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物的步骤。
在另一个实施例中，一种本发明的方法是用于增加受试者中的抗原特异性T细胞，其中所述抗原或其肽片段包含一个或多个新表位，该方法包括向受试者施用包含本文所公开的重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物的步骤。
在另一个实施例中，一种本发明的方法是用于增加具有肿瘤或罹患癌症或罹患感染性疾病的受试者的存活时间，该方法包括向受试者施用包含本文所公开的重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物的步骤。
在另一个实施例中，一种本发明的方法是治疗受试者中的肿瘤或癌症或感染或感染性疾病，该方法包括向受试者施用包含本文所公开的重组李斯特菌菌株的免疫原性组合物的步骤。
I.个性化免疫疗法
在一个实施例中，本发明的方法形成一种个性化免疫疗法。在另一个实施例中，形成针对具有疾病或病症的受试者的个性化免疫疗法的方法包括鉴定和选择对于所述患者的疾病有特异性的突变和变体抗原(新抗原)内的新表位。在另一个实施例中，用于形成针对受试者的个性化免疫疗法的方法是为了提供用于所述受试者的治疗。在另一个实施例中，个性化免疫疗法可用于治疗此类疾病诸如癌症、自身免疫疾病、器官移植排斥、细菌感染、病毒感染以及慢性病毒疾病诸如HIV。
在一个实施例中，形成个性化免疫疗法的方法中的步骤是从具有疾病或病症的受试者中获得异常或不健康生物样品。如本文所用，术语“异常或不健康的生物样品”与“患有疾病生物样品”或“患有疾病样品”可互换使用，它们具有所有相同的含义和性质。在一个实施例中，生物样品是组织、细胞、血液、从受试者获得的包含淋巴细胞的任何样品、从受试者获得的包含患有疾病细胞的任何样品、或者从受试者获得的健康但也与从相同受试者或类似个体获得的患有疾病样品相当的任何样品。
在一个实施例中，异常或不健康生物样品包括肿瘤组织或癌症组织或其部分。在另一个实施例中，肿瘤或癌症可以是实体肿瘤。在另一个实施例中，肿瘤或癌症不是实体肿瘤或癌症，例如肿瘤未形成的血癌或乳腺癌。
在另一个实施例中，肿瘤样品涉及来源于患者的含有或预期含有肿瘤或癌症细胞的任何样品，诸如身体样品。身体样品可以是任何组织样品诸如血液、从原发性肿瘤或肿瘤转移瘤中获得的组织样品或者含有肿瘤或癌症细胞的任何其他样品。在又一个实施例中，身体样品是血液、来自唾液的细胞或者来自脑脊液的细胞。在另一个实施例中，肿瘤样品涉及一种或多种分离的肿瘤或癌症细胞诸如循环肿瘤细胞(CTC)或含有一种或多种分离的肿瘤或癌症细胞诸如循环肿瘤细胞(CTC)的样品。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括乳腺癌或肿瘤。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括宫颈癌或肿瘤。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括含Her2肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括黑素瘤肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括胰腺肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括卵巢肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括胃肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括胰腺的癌性病变。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括肺腺癌肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括多形性成胶质细胞瘤肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括结肠直肠腺癌肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括肺鳞状腺癌肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括胃腺癌肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括卵巢表面上皮瘤(例如其良性的、增生性的或恶性的种类)肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括口腔鳞状细胞癌肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括非小细胞肺癌肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括子宫内膜癌肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括膀胱肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括头颈肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括前列腺癌肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括胃腺癌肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括口咽肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括肺肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括肛门肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括结肠直肠肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括食管肿瘤或癌症。在另一个实施例中，肿瘤或癌症包括间皮瘤肿瘤或癌症。
在另一个实施例中，异常或不健康生物样品包括非肿瘤或癌性组织。在另一个实施例中，异常或不健康的生物样品包含从血液样品分离的细胞、来自唾液的细胞或来自脑脊液的细胞。在另一个实施例中，异常或不健康生物样品包括被认为是异常或不健康的任何组织或其部分的样品。
在一个实施例中，本公开涵盖其他非肿瘤或非癌性疾病，包括可从其中获得患有疾病生物样品以用于根据本文所公开的方法进行分析的感染性疾病。在另一个实施例中，感染性疾病包括病毒感染。在另一个实施例中，感染性疾病包括慢性病毒感染。在另一个实施例中，感染性疾病包括慢性病毒疾病诸如HIV。在另一个实施例中，感染性疾病包括细菌感染。在另一个实施例中，感染性疾病是寄生虫感染。
在另一个实施例中，感染性疾病是由但不限于以下病原体中的任一种导致疾病：利什曼虫、溶组织内阿米巴(其导致阿米巴病)、鞭虫、BCG/结核病、疟疾、恶性疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫、轮状病毒、霍乱、白喉-破伤风、百日咳、流感嗜血杆菌、乙型肝炎、人乳头瘤病毒、季节性流感)、A型流感(H1N1)流行病、麻疹和风疹、腮腺炎、脑膜炎球菌A+C、口服脊髓灰质炎疫苗(单价、二价和三价)、肺炎球菌、狂犬病、破伤风类毒素、黄热病、炭疽芽孢杆菌(炭疽)、肉毒棱状芽孢杆菌毒素(肉毒中毒)、鼠疫耶尔森菌(瘟疫)、重型天花(天花)和其他有关的痘病毒、土拉热弗朗西丝菌(土拉菌病)、病毒性出血热、沙粒病毒(LCM、胡宁病毒、马丘波病毒、瓜纳瑞托病毒、拉沙热)、布尼亚病毒(汉坦病毒属、裂谷热)、黄病毒属(登革热)、线状病毒(埃博拉病毒、马尔堡病毒)、假鼻疽伯克霍尔德菌、伯内特考克斯体(Q热)、布鲁杆菌属种(布鲁杆菌病)、鼻疽伯克霍尔德菌(鼻疽)、鹦鹉衣原体(鹦鹉热)、蓖麻蛋白毒素(来自蓖麻)、产气荚膜梭菌的ε毒素、葡萄球菌肠毒素B、斑疹伤寒热(普氏立克次体)、其他立克次体、食品和水传播的病原体、细菌(致腹泻性的大肠杆菌、致病性的弧菌属、志贺氏菌属种、沙门氏菌属BCG/、空肠弯曲杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌)、病毒(杯状病毒、甲型肝炎、西尼罗病毒、LaCrosse、加利福尼亚脑炎、VEE、EEE、WEE、日本脑炎病毒、科萨努尔森林病毒、尼帕病毒、汉坦病毒属、蜱传出血热病毒、基孔肯雅病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、蜱传脑炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)、原生动物(小隐孢子虫、卡晏环孢子虫、兰伯贾第虫、溶组织内阿米巴、弓形虫属)、真菌(微孢子目)、黄热病、结核病(包括耐药的TB)、狂犬病、朊病毒、严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)、Coccidioidesposadasii、粗球孢子菌、细菌性阴道病、沙眼衣原体、巨细胞病毒、腹股沟肉芽肿、杜克雷嗜血杆菌、淋病奈瑟球菌、苍白密螺旋体、阴道毛滴虫或本领域已知的在本文中没有列出的任何其他感染性疾病。
在一个实施例中，病原性原生动物和寄生虫感染包括：
在另一个实施例中，该感染性疾病是家畜感染性疾病。在另一个实施例中，家畜疾病可传播给人，并被称作“人畜共患病”。在另一个实施例中，这些疾病包括但不限于口蹄疫、西尼罗病毒、狂犬病、犬细小病毒、猫白血病病毒、马流感病毒、传染性牛鼻气管炎(IBR)、伪狂犬病、古典猪瘟(CSF)、由牛1型牛疱疹病毒(BHV-1)感染造成的IBR以及猪伪狂犬病(奥尔斯基病)、弓形虫病、炭疽、水疱性口炎病毒、马红球菌、土拉菌病、瘟疫(鼠疫耶尔森菌)、毛滴虫。
在一个实施例中，本公开涵盖其他非肿瘤或非癌性疾病，包括可从其中获得患有疾病生物样品以用于根据本文所公开的方法进行分析的自身免疫疾病。技术人员将了解的是，术语“自身免疫疾病”是指由针对个体自身组织、器官的免疫反应产生的疾病或病症或该免疫反应的表现形式或者由该表现形式引起的病症。如本文所用的术语“自身免疫疾病”包括癌症和其他疾病状态，其中针对自身组织的抗体不一定参与疾病病症但在诊断中仍是重要的。另外，在一个实施例中，该术语是指由抗体的B细胞产生与正常身体组织和抗原反应的自身抗体引起或由此加重的病症。在其他实施例中，自身免疫疾病是涉及分泌对来自自身抗原(例如，核抗原)的表位有特异性的自身抗体的一种疾病。
在治疗具有自身免疫疾病的受试者的努力中，在一个实施例中，本发明包括鉴定自身反应性新表位的系统和方法，其中所述系统或方法包括使具有自身免疫疾病的受试者针对这些自身反应性新表位免疫以便诱导抗体或免疫抑制细胞(例如，Treg或MDSC)介导的耐受性的方法。
在一个实施例中，自身免疫疾病包括全身性自身免疫疾病。术语“全身性自身免疫疾病”是指由影响超过一种器官的自身免疫反应导致的疾病、病状或症状的组合。在另一个实施例中，自身免疫疾病包括但不限于抗-GBM肾炎(Goodpasture氏疾病)、肉芽肿病伴随多血管炎(GPA)、显微镜下多血管炎(MP A)、全身性红斑狼疮(SLE)、多肌炎(PM)或乳糜泻。
在一个实施例中，自身免疫疾病包括结缔组织疾病。术语“结缔组织疾病”是指由影响身体结缔组织的自身免疫反应导致的疾病、病症或症状的组合。在另一个实施例中，结缔组织疾病包括但不限于全身性红斑狼疮(SLE)、多肌炎(PM)、全身性硬化或混合型结缔组织疾病(MCTD)。
在一个实施例中，本公开涵盖其他非肿瘤或非癌性疾病，包括可从其中获得患有疾病生物样品以用于根据本文所公开的方法进行分析的器官移植排斥。在另一个实施例中，所排斥的器官是实体器官，包括但不限于心脏、肺、肾、肝、胰腺、肠、胃、睾丸、角膜、皮肤、心脏瓣膜、血管或骨。在另一个实施例中，所排斥的器官包括但不限于血液组织、骨髓或胰岛细胞。
在治疗具有移植器官排斥或经历移植物抗宿主病(GVhD)的受试者的努力中，在一个实施例中，本发明包括鉴定自身反应性新表位的系统和方法，其中所述系统或方法包括使具有自身免疫疾病的受试者针对这些自身反应性新表位免疫以便诱导抗体或免疫抑制细胞(例如，Treg或MDSC)介导的耐受性的方法。
样品可使用本领域熟知的常规活检程序获得。活检可包括由专业医学人员(例如，病理学家)从受试者中取出细胞或组织。存在许多不同类型的活检程序。最常见类型包括：(1)切取活检，其中仅取出组织样品；(2)切除活检，其中取出整个肿块或疑似区域；以及(3)针活检，其中用针取出组织或流体样品。当使用宽针时，程序称为组织芯活检。当使用薄针时，程序称为细针抽吸活检。
在一个实施例中，本发明的样品通过切取活检获得。在另一个实施例中，样品通过切除活检获得。在另一个实施例中，样品使用针活检获得。在另一个实施例中，针活检是组织芯活检。在另一个实施例中，活检是细针抽吸活检。在另一个实施例中，样品作为血液样品的一部分获得。在另一个实施例中，样品作为脸颊拭子的一部分获得。在另一个实施例中，样品作为唾液采样的一部分获得。在另一个实施例中，生物样品包括所有或部分组织活检。在另一个实施例中，获得组织活检物并且收集来自该组织样品的细胞，其中这些细胞构成本发明的生物样品。在另一个实施例中，本发明的样品作为细胞活检物的一部分获得。在另一个实施例中，多种活检物可从相同受试者中获得。在另一个实施例中，来自相同受试者的活检物可从相同组织或细胞中收集。在另一个实施例中，来自相同受试者的活检物可从受试者内的细胞来源的不同组织中收集。
在一个实施例中，活检物包括骨髓组织。在另一个实施例中，活检物包括血液样品。在另一个实施例中，活检物包括胃肠组织的活检物，例如食管、胃、十二指肠、直肠、结肠以及末端回肠。在另一个实施例中，活检物包括肺组织。在另一个实施例中，活检物包括前列腺组织。在另一个实施例中，活检物包括肝组织。在另一个实施例中，活检物包括神经系统组织，例如脑活检物、神经活检物或脑膜活检物。在另一个实施例中，活检物包括泌尿生殖器组织，例如肾活检物、子宫内膜活检物或子宫颈锥切术。在另一个实施例中，活检物包括乳腺活检物。在另一个实施例中，活检物包括淋巴结活检物。在另一个实施例中，活检物包括肌肉活检物。在又一个实施例中，活检物包括皮肤活检物。在另一个实施例中，活检物包括骨骼活检物。在另一个实施例中，检查每种样品的患有疾病样品病理学以确认对患病组织的诊断。在另一个实施例中，检查健康样品以确认对健康组织的诊断。
在一个实施例中，从受试者获得正常或健康的生物样品。在另一个实施例中，正常或健康的生物样品是与来源于受试者的任何样品诸如身体样品相关的非致瘤样品。该样品可以是从本文所公开的生物样品获得的任何组织样品，诸如健康细胞。在另一个实施例中，正常或健康的生物样品从另一个体中获得，在一个实施例中，该个体是相关个体。在另一个实施例中，另一个体是与受试者相同的物种。在另一个实施例中，另一个体是不含有或不预期含有患有疾病生物样品的健康个体。在另一个实施例中，另一个体是不含有或不预期含有肿瘤或癌症细胞的健康个体。技术人员将了解的是，健康个体可使用本领域已知的方法对疾病的存在进行筛选，以便确定他或她是健康的。
在另一个实施例中，正常或健康的生物样品同时获得。术语“正常或健康的生物样品”和“参考样品”或“参考组织”在全文中互换使用，其全部具有相同的含义和性质。在另一个实施例中，“参考”可用于关联并比较从肿瘤样品获得的结果。在另一个实施例中，“参考”可以凭经验通过测试足够大数量的来自相同物种的正常样品来确定。在另一个实施例中，正常或健康的生物样品在不同时间获得，其中该时间可以使得正常或健康的样品在获得异常或健康样品之前或之后获得。获得方法包括本领域常规地用于活检物或血液采集的那些方法。在另一个实施例中，样品是冷冻样品。在另一个实施例中，样品作为组织石蜡包埋(FFPE)组织嵌段被包括。
在一个实施例中，在获得所述正常或健康的生物样品之后，处理所述样品以用于使用本领域熟知的技术和方法提取核酸。在另一个实施例中，所提取的核酸包括DNA。在另一个实施例中，所提取的核酸包括RNA。在另一个实施例中，RNA是mRNA。在另一个实施例中，制备下一代测序(NGS)文库。下一代测序文库可被构建并且可经历外显子组或靶基因捕获。在另一个实施例中，cDNA表达文库使用本领域已知的技术制备，例如参见US20140141992，其完整并入本文。
一种本发明的用于形成个性化免疫疗法的方法可包括使用从异常或不健康样品中提取的核酸和从正常或健康参考样品中提取的核酸，以便鉴定与正常或健康样品相比存在于异常或不健康样品中的体细胞突变或序列差异，其中具有体细胞突变或差异的这些序列编码所表达的氨基酸序列。在一个实施例中，表达所述体细胞突变或序列差异的肽可在某些实施例中自始至终称之为“新表位”。
技术人员将了解的是，术语“新表位”也可以是指不存在于参考样品(诸如正常非癌性或生殖系细胞或组织)中但可见于患有疾病组织(例如，在癌症细胞)中的表位。在另一个实施例中，这包括以下情况，其中在正常非癌性或生殖系细胞中可见对应表位，然而由于癌细胞中的一个或多个突变，该表位的序列被改变以便产生新表位。在另一个实施例中，新表位包括突变的表位。在另一个实施例中，新表位在表位任一侧上具有非突变序列。在另一个实施例中，新表位包括线性表位。在另一个实施例中，新表位被认为是溶剂暴露的并且因此可被T细胞抗原受体接近。
在另一个实施例中，本文所公开的一种或多种肽不包含一个或多个免疫抑制性T调节性新表位。在另一个实施例中，通过本文所公开的方法鉴定和使用的新表位不包括免疫抑制表位。在另一个实施例中，通过本文所公开的方法鉴定和使用的新表位不活化T调节性(T-reg)细胞。
在另一个实施例中，新表位是免疫原性的。在另一个实施例中，新表位包括T细胞表位。在另一个实施例中，新表位包括适应性免疫应答表位。
在另一个实施例中，新表位包含单个突变。在另一个实施例中，新表位包含至少2个突变。在另一个实施例中，新表位包含至少2个突变。在另一个实施例中，新表位包含至少3个突变。在另一个实施例中，新表位包含至少4个突变。在另一个实施例中，新表位包含至少5个突变。在另一个实施例中，新表位包含至少6个突变。在另一个实施例中，新表位包含至少7个突变。在另一个实施例中，新表位包含至少8个突变。在另一个实施例中，新表位包含至少9个突变。在另一个实施例中，新表位包含至少10个突变。在另一个实施例中，新表位包含至少20个突变。在另一个实施例中，新表位包含1-10、11-20、20-30和31-40个突变。
在另一个实施例中，新表位与所述受试者的所述疾病或病症相关。在另一个实施例中，新表位是所述受试者的所述疾病或病症的要因。在另一个实施例中，新表位存在于患有所述疾病的生物样品内。在另一个实施例中，新表位存在于患有所述疾病的生物组织内，但并非所述疾病或病症的要因或与其相关。
在另一个实施例中，本发明的肽、多肽或融合肽包含一个新表位。在另一个实施例中，本发明的肽、多肽或融合肽包含两个新表位。在另一个实施例中，本发明的肽、多肽或融合肽包含3个新表位。在另一个实施例中，本发明的肽、多肽或融合肽包含4个新表位。在另一个实施例中，本发明的肽、多肽或融合肽包含5个新表位。在另一个实施例中，本发明的肽、多肽或融合肽包含6个新表位。在另一个实施例中，本发明的肽、多肽或融合肽包含7个新表位。在另一个实施例中，本发明的肽、多肽或融合肽包含8个新表位。在另一个实施例中，本发明的肽、多肽或融合肽包含9个新表位。在另一个实施例中，本发明的肽、多肽或融合肽包含10个或更多个新表位。
在一个实施例中，鉴定新表位的步骤包括对从异常或不健康生物组织中获得的所提取核酸进行测序并对从正常或健康的生物参考样品中获得的所提取核酸进行测序。在另一个实施例中，对整个基因组进行测序。在另一个实施例中，对外显子组进行测序。在又一个实施例中，对转录物组进行测序。在另一个实施例中，新表位使用T细胞受体测序来鉴定。
在另一个实施例中，新表位包括本领域已知的新表位，如以下所公开的：PavlenkoM,Leder C,Roos AK,Levitsky V,Pisa P.(2005)Identification of an immunodominantH-2D(b)-restricted CTL epitope of human PSA.Prostate.15；64(1):50-9(PSA新表位)；Maciag PC,Seavey MM,Pan ZK,Ferrone S,Paterson Y.(2008)Cancerimmunotherapy targeting the high molecular weight melanoma-associated antigenprotein results in a broad antitumor response and reduction of pericytes inthe tumor vasculature.Cancer Res.1；68(19):8066-75(在HLA-A2小鼠中的HMW-MAA表位)；Zhang KQ,Yang F,Ye J,Jiang M,Liu Y,Jin FS,Wu YZ.(2012)A novel DNA/peptidecombined vaccine induces PSCA-specific cytotoxic T-lymphocyteresponses andsuppresses tumor growth in experimental prostate cancer.Urology.；79(6):1410.e7-13.doi:10.1016/j.urology.2012.02.011.电子出版物2012年4月17日(HLA-A2表位PSCA)；Kouiavskaia DV,Berard CA,Datena E,Hussain A,Dawson N,KlyushnenkovaEN,Alexander RB.(2009)Vaccination with agonist peptide PSA:154-163(155L)derived from prostate
specific antigen induced CD8T-cell response to the native peptidePSA:154-163but failed to induce the reactivity against tumor targetsexpressing PSA:a phase 2study in patients with recurrent prostate cancer.JImmunother.；32(6):655-66(HLA-A2表位PSA)。
在一个实施例中，术语“基因组”涉及生物体的染色体中的遗传信息的总量。在另一个实施例中，术语“外显子组”是指基因组的编码区。在另一个实施例中，术语“转录物组”涉及所有RNA分子的集。
根据一个实施例，核酸分子是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，更优选地是RNA，最优选地是体外转录的RNA(ΓνRNA)或合成的RNA。根据本发明，核酸包括基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生和化学合成的分子。在另一个实施例中，核酸可作为单链或双链和线性或共价环状闭合的分子存在。在另一个实施例中，核酸可以是分离的。根据本发明，术语“分离的核酸”意指核酸(i)在体外例如通过聚合酶链反应(PCR)扩增，(ii)通过克隆重组产生，(iii)例如通过裂解和经由凝胶电泳进行的分离来纯化，或者(iv)例如通过化学合成来合成。核酸可用于引入即转染到细胞中，具体地是以可通过从DNA模板体外转录制备的RNA形式。RNA可另外在通过使序列稳定、加帽和聚腺苷酸化进行应用之前修饰。
技术人员将理解的是，术语“突变”可包括与参考序列相比的核酸序列的改变或差异(核苷酸取代、添加或缺失)。例如，存在于异常样品中的改变或差异不可见于正常样品中。“体细胞突变”可发生在身体的除了生殖细胞(精子和卵子)的任何细胞中，并且因此不会遗传给孩子。这些改变可以(但并不总是)引起癌症或其他疾病。在另一个实施例中，突变是非同义突变。术语“非同义突变”是指在翻译产物中不引起氨基酸改变诸如氨基酸取代的突变，优选地是核苷酸取代。
在异常样品是肿瘤或癌症细胞的情况下，在一个实施例中，突变可包括“癌症突变特征”。术语“癌症突变特征”是指当与非癌性参考细胞相比时存在于癌细胞中的突变集。
数字式染色体核型分析是用于分析染色体以便寻找可引起遗传病症的任何主要染色体异常的技术。在一个实施例中，数字式染色体核型分析可用于聚焦于染色体的用于测序和比较性分析的区域。在另一个实施例中，数字式染色体核型分析实际上执行分析来自基因组上的所有特异性基因座的DNA短序列，这些序列被分离的和计数。
根据本发明可使用任何适合的测序方法。在一个实施例中，使用下一代测序(NGS)技术。第三代测序方法在未来可能取代NGS技术以加速该方法的测序步骤。出于说明目的：在本公开背景下术语“下一代测序”或“NGS”意指所有新型高通量测序技术，这些技术与称为Sanger化学的“常规”测序方法相比，通过将整个基因组分裂成小片来沿着整个基因组平行地随机读取核酸模板。此类NGS技术(也称为大规模平行测序技术)能够在非常短的时间段内，例如在约1-2周内，优选地在约1-7天内或最优选地在少于24小时内递送全基因组、外显子组、转录物组(基因组的所有转录的序列)或甲基化组(基因组的所有甲基化序列)的核酸序列信息，并且在理论上允许单细胞测序方法。可商购获得的或在文献中提及的多个NGS平台可用于本公开的背景下，例如在以下文献中详细描述的那些：Zhang等人2011:Theimpact of next-generation sequencing on genomics.J.Genet Genomics 38(3),95-109；或者Voelkerding等人2009:Next generation sequencing:From basic research todiagnostics.Clinical chemistry 55,641-658。此类NGS技术/平台的非限制性例子包括：
1)称为焦磷酸测序的合成测序技术，例如在Roche-associated company 454LifeSciences(Branford,Connecticut)的GS-FLX 454Genome SequencerTM中实施，其首先描述于Ronaghi等人1998:A sequencing method based on real-time pyrophosphate".Science 281(5375),363-365。此技术使用乳液PCR，其中单链DNA结合珠粒通过剧烈涡旋成含有油包围的用于乳液PCR扩增的PCR反应物的水性胶束来包封。在焦磷酸测序过程期间，在聚合酶合成DNA链时，记录在核苷酸并入期间从磷酸盐分子中发射出的光。
2)由Solexa(如今是Illumina Inc.的一部分，San Diego,California)开发的合成测序方法，其基于可逆染料终止子并且例如在Illumina Solexa Genome AnalyzerTM和Illumina HiSeq 2000Genome AnalyzerTM中实施。在此技术中，将所有四个核苷酸连同DNA聚合酶同时添加到流动细胞通道中的寡聚引发的簇片段中。桥扩增使簇链延伸成具有用于测序的所有四个荧光标记的核苷酸。
3)连接测序方法，例如在Applied Biosystems(如今是Life TechnologiesCorporation,Carlsbad,California)的SOLidTM平台中实施。在此技术中，具有固定长度的所有可能的寡核苷酸池根据所测序位置进行标记。使寡核苷酸退火并进行连接；通过DNA连接酶进行的用于匹配序列的优选连接引起具有在该位置处的核苷酸的信息的信号。在测序之前，DNA通过乳液PCR扩增。将各自仅含有相同DNA分子的拷贝的所得珠粒沉积在载玻片上。作为第二例子，Dover Systems (Salem,New Hampshire)的PolonatorTM G.007平台也采用通过使用随机排列的基于珠粒的乳液PCR扩增DNA片段以用于平行测序的连接测序方法。
4)单分子测序技术，例如像在Pacific Biosciences(Menlo Park,California)的PacBio RS系统中或在Helicos Biosciences(Cambridge,Massachusetts)的HeliScopeTM平台中实施。此技术的独特特征在于其对单个DNA或RNA分子进行测序而无需扩增的能力，其被定义为单分子实时(SMRT)DNA测序。例如，HeliScope使用高度敏感的荧光检测系统在合成时直接检测每个核苷酸。基于荧光共振能量转移(FRET)的类似方法已由VisigenBiotechnology(Houston,Texas)开发。其他基于荧光的单分子技术是来自U.S.Genomics(GeneEngineTM)和Genovoxx(AnyGeneTM)。
5)用于单分子测序的纳米技术，其中使用各种纳米结构，这些结构例如布置在芯片上以在复制期间监测聚合酶分子在单链上的移动。基于纳米技术的方法的非限制性例子是Oxford Nanopore Technologies(Oxford,UK)的GridONTM平台、由Nabsys(Providence,Rhode Island)开发的杂交辅助纳米孔测序(HANSTM)平台和使用称为组合探针锚定连接的DNA纳米球(DNB)技术的基于专用连接酶的DNA测序平台(cPALTM)。
6)用于单分子测序的基于电子显微镜的技术，例如由LightSpeed Genomics(Sunnyvale,California)和Halcyon Molecular(Redwood City,California)开发的那些技术
7)离子半导体测序，其基于在DNA聚合期间释放的氢离子的检测。例如，IonTorrent Systems(San Francisco,California)使用显微机器加工孔的高密度阵列以大规模平行的方式执行此生物化学方法。每个孔保持不同的DNA模板。孔下方是离子敏感性层并且在该层下方是专用离子传感器。
在一些实施例中，DNA和RNA制备物用作NGS的起始材料。此类核酸可容易从样品诸如生物材料，例如从新鲜的、快速冷冻的或福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤组织(FFPE)或从新鲜分离的细胞或从存在于患者外周血液中存在的CTC中获得。正常的非突变基因组DNA或RNA可从正常的体细胞组织中提取，然而，在本公开的背景下生殖系细胞是优选的。生殖系DNA或RNA从具有非血液恶性肿瘤的患者的周围血液单核细胞(PBMC)中提取。尽管从FFPE组织或新鲜分离的单细胞中提取的核酸是高度片段化的，但是它们适用于NGS应用。
用于外显子组测序的若干靶向NGS方法描述于文献中(对于综述参考例如Teer和Mullikin 2010:Human Mol Genet 19(2),R145-51)，所有这些方法均可结合本公开来使用。许多这些方法(例如描述为基因组捕获、基因组分配、基因组富集等)使用杂交技术并且包括基于阵列的(例如，Hodges等人2007:Nat.Genet.39,1522-1527)和基于液体的(例如，Choi等人2009:Proc.Natl.Acad.Sci USA 106,19096-19101)杂交方法。用于DNA样品制备和随后外显子组捕获的商业试剂盒也是可获得的：例如，Illumina Inc.(San Diego,California)提供TruSeqTM DNA样品制备试剂盒和外显子组富集试剂盒TruSeqTM外显子组富集试剂盒。
如本公开所提供的，肿瘤测序的步骤，包括对患者肿瘤的活检样本进行突变鉴定，将花费不超过两周。在另一个实施例中，肿瘤测序的步骤将花费约1-2周。在另一个实施例中，肿瘤测序的步骤将花费约1周。在另一个实施例中，肿瘤测序的步骤将花费不到1周。
在本公开的背景下，术语“RNA”涉及包含至少一个核糖核苷酸残基并且优选地整体或基本上由核糖核苷酸残基组成的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2'-位置处具有羟基的核苷酸。术语“RNA”包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA(诸如部分或完全纯化的RNA)、基本上纯的RNA、合成的RNA和重组生成的RNA(诸如改性RNA)，该重组生成的RNA与天然存在的RNA的不同之处在于一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变。此类改变可包括非核苷酸材料诸如到RNA各端或在内部例如在RNA的一个或多个核苷酸处的添加。RNA分子中的核苷酸也可包括非标准核苷酸，诸如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可称为类似物或天然存在的RNA的类似物。
根据本公开，术语“RNA”包括并优选涉及“mRNA”。术语“mRNA”意指“信使-RNA”并且涉及通过使用DNA模板生成并编码肽或多肽的“转录物”。通常，mRNA包含5'-UTR、蛋白质编码区和3'-UTR。mRNA在细胞中和在体外仅具有有限的半衰期。在本公开的背景下，mRNA可通过体外转录由DNA模板生成。体外转录方法是技术人员已知的。例如，存在多种可商购获得的体外转录试剂盒。
在一个实施例中，比较来自患有疾病样品和健康样品的核酸序列以便鉴定新表位。新表位在ORF序列内包含氨基酸序列变化。如本文所用，关于肽或蛋白质的术语“序列变化”涉及氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体以及氨基酸取代变体，优选地是氨基酸取代变体。根据本发明的所有这些序列变化可潜在地形成新表位。
在一个实施例中，氨基酸插入变体包含特定氨基酸序列中的单个或两个或更多个氨基酸的插入片段。在另一个实施例中，氨基酸添加变体包括一个或多个氨基酸，诸如1、2、3、4或5或更多个氨基酸的氨基端和/或羧基端融合体。在另一个实施例中，氨基酸缺失变体的特征在于一个或多个氨基酸从序列中去除，诸如1、2、3、4或5或更多个氨基酸的去除。在另一个实施例中，氨基酸取代变体的特征在于序列中的至少一个残基被去除并且另一个残基被插入在其适当位置中。
分析所有样品在ORF内的新型遗传测序。用于比较从所述患有疾病生物样品和健康生物样品中提取的核酸序列中的一个或多个开放阅读框(ORF)的方法包括使用筛选测定或筛选工具和相关数字软件。用于执行生物信息学分析的方法是本领域中已知的，例如参见美国公布号US 2013/0210645、US 2014/0045881和国际公布WO 2014/052707，这些专利各自完整并入在本申请中。
人肿瘤通常具有显著数量的体细胞突变。而且，在任何特定基因中的相同突变在肿瘤中是少见的(并且对于最常见的驱动突变甚至也是在低频率下)。因此，在一个实施例中，综合鉴定患者特异性肿瘤突变的本发明方法为个性化免疫疗法提供靶标。
如本公开所提供的，从测序数据鉴定抗原的步骤将花费不超过两周。在另一个实施例中，从测序数据鉴定抗原的步骤将花费约1-2周。在另一个实施例中，从测序数据鉴定抗原的步骤将花费约1周。在另一个实施例中，从测序鉴定抗原的步骤将花费不到1周。
在一个实施例中，从患有疾病样品中鉴定的突变可以呈现在主要组织相容性复合I类分子(MHCI)上。在一个实施例中，含有新表位突变的肽是免疫原性的并且通过适应性免疫系统识别为‘非自身’新抗原。在另一个实施例中，使用肽、多肽或融合多肽中包含的一个或多个新表位序列提供靶向免疫疗法，在某些实施例中，该靶向免疫疗法可治疗性活化针对所述疾病或病症的T细胞免疫应答。在另一个实施例中，使用肽、多肽或融合多肽中包含的一个或多个新表位序列提供靶向免疫疗法，在某些实施例中，该靶向免疫疗法可治疗性活化针对疾病或病症的适应性免疫应答。
在另一个实施例中，使用肽、多肽或融合多肽中包含的一个或多个新表位序列提供治疗性抗肿瘤或抗癌T细胞免疫应答。在另一个实施例中，使用肽、多肽或融合多肽中包含的一个或多个新表位序列提供靶向免疫疗法，在某些实施例中，该靶向免疫疗法可治疗性活化抗肿瘤或抗癌适应性免疫应答。在另一个实施例中，使用肽、多肽或融合多肽中包含的一个或多个新表位序列提供治疗性抗自身免疫疾病T细胞免疫应答。在另一个实施例中，使用肽、多肽或融合多肽中包含的一个或多个新表位序列提供靶向免疫疗法，在某些实施例中，该靶向免疫疗法可治疗性活化抗自身免疫疾病适应性免疫应答。在另一个实施例中，使用肽、多肽或融合多肽中包含的一个或多个新表位序列提供治疗性抗感染疾病T细胞免疫应答。在另一个实施例中，使用肽、多肽或融合多肽中包含的一个或多个新表位序列提供靶向免疫疗法，在某些实施例中，该靶向免疫疗法可治疗性活化抗感染性疾病适应性免疫应答。在另一个实施例中，使用肽、多肽或融合多肽中包含的一个或多个新表位序列提供治疗性抗器官移植排斥T细胞免疫应答。在另一个实施例中，使用肽、多肽或融合多肽中包含的一个或多个新表位序列提供靶向免疫疗法，在某些实施例中，该靶向免疫疗法可治疗性活化抗器官移植排斥适应性免疫应答。
在另一个实施例中，其中免疫原性应答的存在与一个或多个免疫原性新表位的存在相关。在另一个实施例中，重组李斯特菌包含编码包括T细胞表位的新表位或适应性免疫应答表位或其任何组合的核酸。
在一个实施例中，该方法包括筛选包含用于免疫原性应答的一个或多个新表位的每个氨基酸序列，其中免疫原性应答的存在与包含免疫原性表位的一个或多个新表位相关。在另一个实施例中，一个或多个免疫原性新表位包含在肽中。在另一个实施例中，一个或多个免疫原性新表位包含在多肽中。在另一个实施例中，一个或多个免疫原性新表位包含在融合多肽中。在另一个实施例中，一个或多个免疫原性新表位包括融合至泛素多肽。
在另一个实施例中，该方法包括筛选包含用于免疫原性T细胞应答的一个或多个新表位的每个氨基酸序列，其中免疫原性T细胞应答的存在与包含T细胞表位的一个或多个新表位相关。在另一个实施例中，该方法包括筛选包含用于适应性免疫应答的一个或多个新表位的每个氨基酸序列，其中适应性免疫应答的存在与包含适应性免疫应答表位的一个或多个新表位相关。
在一个实施例中，在提供的形成个性化免疫疗法的系统或方法中的筛选免疫原性T细胞应答的步骤包括使用本领域熟知的免疫应答测定，包括例如T-细胞增殖测定、使用利用所述新表位活化并与肿瘤细胞共同温育(使用51Cr-释放测定或3H-胸苷测定)的T细胞进行的体外肿瘤消退测定、ELISA测定、ELIspot测定以及FACS分析。(参见例如美国专利号8,771,702和欧洲专利号EP_1774332_B1，其全文并入本文)。在另一个实施例中，用于筛选免疫原性应答的步骤检查非T细胞应答。在另一个实施例中，在形成所提供的个性化免疫疗法的系统或方法中筛选非T细胞应答的步骤包括使用本领域熟知的免疫应答测定，包括例如类似于以上对于T细胞的那些，不同的是检查细胞因子产生聚焦于细胞因子的不同子集，即IL-10和IL-1β。(参见例如美国专利号8962319和EP 177432，两份专利完整并入本文。例如，T-细胞免疫应答可通过51Cr释放测定来测定，其包括用包含一个或多个新表位的疫苗免疫小鼠，接着在免疫后约十天收获脾的步骤，其中脾细胞然后可在使用照射的TC-1细胞(100:1，脾细胞:TC-1)作为饲养细胞的培养物中建立；在体外刺激5天，然后用于标准51Cr释放测定中，使用包含一个或多个新表位的肽/多肽作为靶标。
在另一个实施例中，用于筛选免疫应答的步骤包括使用HLA-A2转基因小鼠，例如，如美国专利申请公布号US-2011-0129499中所公开的，该专利完整并入本文。
在一个实施例中，该方法包括选择编码所鉴定的T细胞新表位或编码包含所述鉴定的T细胞新表位的肽的核酸序列并且将所述序列转化到重组减毒李斯特菌菌株中。在一个实施例中，该方法包括选择编码所鉴定的适应性免疫应答新表位或编码包含所述鉴定的免疫应答新表位的肽的核酸序列并且将所述序列转化到重组减毒李斯特菌菌株中。
在一个实施例中，使用标准DNA扩增方法如PCR产生编码所鉴定的新表位的核酸。
如本公开所提供的，基于鉴定的表面产生DNA的步骤将花费不超过四周。在另一个实施例中，基于鉴定的靶标产生DNA的步骤将花费约3-4周。在另一个实施例中，基于鉴定的靶标产生DNA的步骤将花费约2-3周。在另一个实施例中，基于鉴定的靶标产生DNA的步骤将花费约1-2周。在另一个实施例中，基于鉴定的靶标产生DNA的步骤将花费约1周。在另一个实施例中，肿瘤测序的步骤将花费不到1周。
如本公开提供的，将DNA克隆到标记的质粒中并随后转染到李斯特菌中的步骤将花费不超过四周。在另一个实施例中，将DNA克隆到标记的质粒中并随后转染到李斯特菌中的步骤将花费约2-4周。在另一个实施例中，将DNA克隆到标记的质粒中并随后转染到李斯特菌中的步骤将花费约2-3周。在另一个实施例中，将DNA克隆到标记的质粒中并随后转染到李斯特菌中的步骤将花费约3周。在另一个实施例中，将DNA克隆到标记的质粒中并随后转染到李斯特菌中的步骤将花费约2周。在另一个实施例中，将DNA克隆到标记的质粒中并随后转染到李斯特菌中的步骤将花费少于2周。
在一个实施例中，本文所述的系统或方法包括培养并表征所述李斯特菌菌株以确认所述T细胞新表位的表达和分泌。在一个实施例中，本文所述的系统或方法包括培养并表征所述李斯特菌菌株以确认所述适应性免疫应答新表位的表达和分泌。
如本公开所提供的，鉴定最佳产物的培养和表征步骤将花费不超过两周。在另一个实施例中，鉴定最佳产物的培养和表征步骤将花费约1-2周。在另一个实施例中，鉴定最佳产物的培养和鉴定步骤将花费约1周。在另一个实施例中，鉴定最佳产物的培养和表征将花费不到1周。
在一个实施例中，本发明的系统和方法包括储存所述李斯特菌，以用于在预定时间段时施用给所述受试者或者向所述受试者施用所述李斯特菌，其中所述李斯特菌菌株作为免疫原性组合物的一部分施用。
II.重组李斯特菌菌株
在一个实施例中，本公开的重组李斯特菌菌株包含核酸分子，该核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中该融合多肽包括融合到包含一个或多个新表位的一种或多种肽的截短李斯特菌溶血素O(tLLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。技术人员将理解的是，本文所公开的包含一个或多个表位的一种或多种肽可以是免疫原性的以使用免疫原性多肽开始并且其免疫原性可通过与该免疫原性多肽融合或混合来增强，该免疫原性多肽诸如tLLO、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。在另一个实施例中，本公开的重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框。在一个实施例中，所述重组李斯特菌菌株是减毒的。
在一个实施例中，包含本文所公开的一个或多个免疫原性新表位的一种或多种肽各自融合至免疫原性多肽或其片段。
在另一个实施例中，截短李斯特菌O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列不融合到异源抗原或其片段。在另一个实施例中，截短李斯特菌O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列不融合到本文所公开的一种或多种肽。
在另一个实施例中，包含本文所公开的一个或多个免疫原性新表位的一种或多种肽作为免疫原性组合物的一部分与免疫原性多肽或其片段混合。
在一个实施例中，截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白包含推定的PEST序列。在一个实施例中，截短ActA蛋白包含含有PEST的氨基酸序列。在另一个实施例中，截短actA蛋白包含推定的含PEST的氨基酸序列。
在一个实施例中，PEST氨基酸(AA)序列包括截短LLO序列。在另一个实施例中，该PEST氨基酸序列为KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK(SEQ ID NO:1)。在另一个实施例中，抗原与来自李斯特菌的其他LM PEST AA序列的融合也将提高抗原的免疫原性。
本公开的方法和组合物的N末端LLO蛋白片段在另一个实施例中包含SEQ ID No:3。在另一个实施例中，该片段包含LLO信号肽。在另一个实施例中，该片段包含SEQ ID No:4。在另一个实施例中，该片段大约由SEQ ID No:4组成。在另一个实施例中，该片段基本上由SEQ ID No:4组成。在另一个实施例中，该片段对应于SEQ ID No:4。在另一个实施例中，该片段与SEQ ID No:4同源。在另一个实施例中，该片段与SEQ ID No:4的片段同源。在一个实施例中，所用的截短LLO不包含信号序列。在另一个实施例中，截短LLO包含信号序列。本领域的技术人员将会知道，无激活域具体地讲无半胱氨酸484的任何截短LLO均适用于本公开的方法和组合物。在另一个实施例中，异源抗原与任何截短LLO(包括PEST AA序列SEQ IDNO:1)的融合增强抗原的细胞介导的抗肿瘤免疫。
用于构建本公开的疫苗的LLO蛋白在另一个实施例中具有以下序列：
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE(GenBank登录号P13128；SEQ ID NO:2；核酸序列在GenBank登录号X15127(SEQ ID NO:81)中列出)。对应于该序列的前蛋白的前25个AA为信号序列，并在由细菌分泌时从LLO切割。因此，在本实施例中，全长的活性LLO蛋白为504个残基长。在另一个实施例中，将以上LLO片段用作并入本公开的疫苗中的LLO片段的来源。
在另一个实施例中，用于本公开的组合物和方法的LLO蛋白的N末端片段具有以下序列：
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYD(SEQ ID NO:3)。
在另一个实施例中，该LLO片段对应于本文所用的LLO蛋白的约AA 20-442。
在另一个实施例中，该LLO片段具有以下序列：
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTD(SEQ ID NO:4)。
在另一个实施例中，术语“N末端LLO片段”、“截短LLO”、“ΔLLO”或其语法等同形式在本文可互换使用并指非溶血的LLO片段。在另一个实施例中，该术语是指包含推定的PEST序列的LLO片段。
在另一个实施例中，该LLO片段因活化域的缺失或突变而成为非溶血的。在另一个实施例中，该LLO片段因包含半胱氨酸484的区域的缺失或突变而成为非溶血的。在另一个实施例中，该LLO因胆固醇结合域(CBD)的缺失或突变而成为非溶血性的，如美国专利No.8,771,702中所述，该专利以引用方式并入本文。
在一个实施例中，本公开提供包含李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白的重组蛋白或多肽，其中所述LLO蛋白包含所述LLO蛋白的胆固醇结合结构域(CBD)的残基C484、W491、W492或它们的组合的突变。在一个实施例中，所述C484、W491和W492残基是SEQ ID NO:2或80的残基C484、W491和W492，而在另一实施例中，它们是可以使用序列比对来推断的相应残基，如本领域技术人员已知的那样。在一个实施例中，残基C484、W491和W492是突变的。在一个实施例中，突变是置换，在另一个实施例中，突变是缺失。在一个实施例中，整个CBD是突变的，而在另一个实施例中，CBD的部分是突变的，而在另一个实施例中，仅CBD内的特定残基是突变的。
在一个实施例中，本公开提供包含突变LLO蛋白或其片段的重组蛋白或多肽，其中突变LLO蛋白或其片段包含突变LLO蛋白或其片段的突变区的非LLO肽置换，突变区包含选自C484、W491和W492的残基。在另一个实施例中，LLO片段是N末端LLO片段。在另一个实施例中，LLO片段的长度为至少492个氨基酸(AA)。在另一个实施例中，LLO片段的长度为492-528个AA。在另一个实施例中，非LLO肽的长度为1-50个氨基酸。在另一个实施例中，突变区的长度为1-50个氨基酸。在另一个实施例中，非LLO肽的长度与突变区相等。在另一个实施例中，非LLO肽的长度与突变区不同。在另一个实施例中，就溶血活性而言，该置换是失活突变。在另一个实施例中，重组蛋白或多肽相对于野生型LLO表现出溶血活性的降低。在另一个实施例中，重组蛋白或多肽是非溶血的。
如本文所公开的，形成突变体LLO蛋白，其中LLO的残基C484、W491和W492被丙氨酸残基取代(实例25)。突变的LLO蛋白mutLLO可以在大肠杆菌表达系统(实例27)中表达和纯化并且表现出相对于野生型LLO基本上减小的溶血活性(实例28)。
在另一个实施例中，本公开提供了重组多肽，其包含(a)突变的LLO蛋白，其中该突变的LLO蛋白含有内部缺失，该内部缺失包含该突变LLO蛋白的胆固醇结合结构域；和(b)目的异源肽。在另一个实施例中，胆固醇结合结构域的序列在SEQ ID NO:68或69中列出。在另一个实施例中，内部缺失为11-50个氨基酸的内部缺失。在另一个实施例中，内部缺失就该重组蛋白或多肽的溶血活性而言是去活性的。在另一个实施例中，重组蛋白或多肽相对于野生型LLO表现出溶血活性的降低。
在另一个实施例中，本公开提供了重组蛋白或多肽，其包含(a)突变LLO蛋白，其中突变LLO蛋白含有内部缺失，该内部缺失包含突变LLO蛋白的胆固醇结合结构域的片段；和(b)目的异源肽。在另一个实施例中，内部缺失为1-11个氨基酸的内部缺失。在另一个实施例中，胆固醇结合结构域的序列在SEQ ID NO:68或69中列出。在另一个实施例中，内部缺失就该重组蛋白或多肽的溶血活性而言是去活性的。在另一个实施例中，重组蛋白或多肽相对于野生型LLO表现出溶血活性的降低。
本公开的方法和组合物的突变区域在另一个实施例中包含SEQ ID NO:2或80的残基C484。在另一个实施例中，该突变区域包含同源LLO蛋白的相应半胱氨酸残基。在另一个实施例中，该突变区域包含SEQ ID NO:2或80的残基W491。在另一个实施例中，该突变区域包含同源LLO蛋白的相应色氨酸残基。在另一个实施例中，该突变区域包含SEQ ID NO:2或80的残基W492。在另一个实施例中，该突变区域包含同源LLO蛋白的相应色氨酸残基。鉴定同源蛋白的相应残基的方法在本领域是熟知的，并且例如包括序列比对。
在另一个实施例中，该突变区域包含残基C484和W491。在另一个实施例中，该突变区域包含残基C484和W492。在另一个实施例中，该突变区域包含残基C491和W492。在另一个实施例中，该突变区域包含残基C484、C491和W492。
在另一个实施例中，本公开的方法和组合物中的突变区域包含该突变的LLO蛋白或其片段的胆固醇结合结构域。例如，由SEQ ID NO:2或80的残基470-500、470-510或480-500构成的突变区域包含其CBD(残基483-493)。在另一个实施例中，该突变区域为该突变LLO蛋白或其片段的CBD的片段。例如，如本文所公开的，残基C484、W491和W492(每个都为CBD的片段)突变为丙氨酸残基(实例25)。另外，如本文所公开的，CBD的片段(残基484-492)被来自NY-ESO-1的异源序列所置换(实例26)。在另一个实施例中，该突变区域与该突变LLO蛋白或其片段的CBD重叠。例如，由SEQ ID NO:2或80的残基470-490、480-488、490-500或486-510构成的突变区域包含其CBD。在另一个实施例中，单一的肽可以具有信号序列中的缺失和CBD中的突变或置换。
在另一个实施例中，突变区域的长度为1-50个AA。在另一个实施例中，长度为1-11个AA。在另一个实施例中，长度为2-11个AA。在另一个实施例中，长度为3-11个AA。在另一个实施例中，长度为4-11个AA。在另一个实施例中，长度为5-11个AA。在另一个实施例中，长度为6-11个AA。在另一个实施例中，长度为7-11个AA。在另一个实施例中，长度为8-11个AA。在另一个实施例中，长度为9-11个AA。在另一个实施例中，长度为10-11个AA。在另一个实施例中，长度为1-2个AA。在另一个实施例中，长度为1-3个AA。在另一个实施例中，长度为1-4个AA。在另一个实施例中，长度为1-5个AA。在另一个实施例中，长度为1-6个AA。在另一个实施例中，长度为1-7个AA。在另一个实施例中，长度为1-8个AA。在另一个实施例中，长度为1-9个AA。在另一个实施例中，长度为1-10个AA。在另一个实施例中，长度为2-3个AA。在另一个实施例中，长度为2-4个AA。在另一个实施例中，长度为2-5个AA。在另一个实施例中，长度为2-6个AA。在另一个实施例中，长度为2-7个AA。在另一个实施例中，长度为2-8个AA。在另一个实施例中，长度为2-9个AA。在另一个实施例中，长度为2-10个AA。在另一个实施例中，长度为3-4个AA。在另一个实施例中，长度为3-5个AA。在另一个实施例中，长度为3-6个AA。在另一个实施例中，长度为3-7个AA。在另一个实施例中，长度为3-8个AA。在另一个实施例中，长度为3-9个AA。在另一个实施例中，长度为3-10个AA。在另一个实施例中，长度为11-50个AA。在另一个实施例中，长度为12-50个AA。在另一个实施例中，长度为11-15个AA。在另一个实施例中，长度为11-20个AA。在另一个实施例中，长度为11-25个AA。在另一个实施例中，长度为11-30个AA。在另一个实施例中，长度为11-35个AA。在另一个实施例中，长度为11-40个AA。在另一个实施例中，长度为11-60个AA。在另一个实施例中，长度为11-70个AA。在另一个实施例中，长度为11-80个AA。在另一个实施例中，长度为11-90个AA。在另一个实施例中，长度为11-100个AA。在另一个实施例中，长度为11-150个AA。在另一个实施例中，长度为15-20个AA。在另一个实施例中，长度为15-25个AA。在另一个实施例中，长度为15-30个AA。在另一个实施例中，长度为15-35个AA。在另一个实施例中，长度为15-40个AA。在另一个实施例中，长度为15-60个AA。在另一个实施例中，长度为15-70个AA。在另一个实施例中，长度为15-80个AA。在另一个实施例中，长度为15-90个AA。在另一个实施例中，长度为15-100个AA。在另一个实施例中，长度为15-150个AA。在另一个实施例中，长度为20-25个AA。在另一个实施例中，长度为20-30个AA。在另一个实施例中，长度为20-35个AA。在另一个实施例中，长度为20-40个AA。在另一个实施例中，长度为20-60个AA。在另一个实施例中，长度为20-70个AA。在另一个实施例中，长度为20-80个AA。在另一个实施例中，长度为20-90个AA。在另一个实施例中，长度为20-100个AA。在另一个实施例中，长度为20-150个AA。在另一个实施例中，长度为30-35个AA。在另一个实施例中，长度为30-40个AA。在另一个实施例中，长度为30-60个AA。在另一个实施例中，长度为30-70个AA。在另一个实施例中，长度为30-80个AA。在另一个实施例中，长度为30-90个AA。在另一个实施例中，长度为30-100个AA。在另一个实施例中，长度为30-150个AA。
在另一个实施例中，本公开的方法和组合物的取代突变是其中LLO蛋白或其片段的突变区域被同等数目的异源AA置换的突变。在另一个实施例中，引入比突变区域大小更大的数目的异源AA。在另一个实施例中，引入比突变区域大小更小的数目的异源AA。
在另一个实施例中，取代突变是单个残基的点突变。在另一个实施例中，取代突变是2个残基的点突变。在另一个实施例中，取代突变是3个残基的点突变。在另一个实施例中，取代突变是大于3个残基的点突变。在另一个实施例中，取代突变是若干个残基的点突变。在另一个实施例中，在点突变中包含的多个残基是连续的。在另一个实施例中，多个残基是不连续的。
在另一个实施例中，置换本公开的重组蛋白或多肽的突变区域的非-LLO肽的长度是1-50个AA。在另一个实施例中，长度为1-11个AA。在另一个实施例中，长度为2-11个AA。在另一个实施例中，长度为3-11个AA。在另一个实施例中，长度为4-11个AA。在另一个实施例中，长度为5-11个AA。在另一个实施例中，长度为6-11个AA。在另一个实施例中，长度为7-11个AA。在另一个实施例中，长度为8-11个AA。在另一个实施例中，长度为9-11个AA。在另一个实施例中，长度为10-11个AA。在另一个实施例中，长度为1-2个AA。在另一个实施例中，长度为1-3个AA。在另一个实施例中，长度为1-4个AA。在另一个实施例中，长度为1-5个AA。在另一个实施例中，长度为1-6个AA。在另一个实施例中，长度为1-7个AA。在另一个实施例中，长度为1-8个AA。在另一个实施例中，长度为1-9个AA。在另一个实施例中，长度为1-10个AA。在另一个实施例中，长度为2-3个AA。在另一个实施例中，长度为2-4个AA。在另一个实施例中，长度为2-5个AA。在另一个实施例中，长度为2-6个AA。在另一个实施例中，长度为2-7个AA。在另一个实施例中，长度为2-8个AA。在另一个实施例中，长度为2-9个AA。在另一个实施例中，长度为2-10个AA。在另一个实施例中，长度为3-4个AA。在另一个实施例中，长度为3-5个AA。在另一个实施例中，长度为3-6个AA。在另一个实施例中，长度为3-7个AA。在另一个实施例中，长度为3-8个AA。在另一个实施例中，长度为3-9个AA。在另一个实施例中，长度为3-10个AA。在另一个实施例中，长度为11-50个AA。在另一个实施例中，长度为12-50个AA。在另一个实施例中，长度为11-15个AA。在另一个实施例中，长度为11-20个AA。在另一个实施例中，长度为11-25个AA。在另一个实施例中，长度为11-30个AA。在另一个实施例中，长度为11-35个AA。在另一个实施例中，长度为11-40个AA。在另一个实施例中，长度为11-60个AA。在另一个实施例中，长度为11-70个AA。在另一个实施例中，长度为11-80个AA。在另一个实施例中，长度为11-90个AA。在另一个实施例中，长度为11-100个AA。在另一个实施例中，长度为11-150个AA。在另一个实施例中，长度为15-20个AA。在另一个实施例中，长度为15-25个AA。在另一个实施例中，长度为15-30个AA。在另一个实施例中，长度为15-35个AA。在另一个实施例中，长度为15-40个AA。在另一个实施例中，长度为15-60个AA。在另一个实施例中，长度为15-70个AA。在另一个实施例中，长度为15-80个AA。在另一个实施例中，长度为15-90个AA。在另一个实施例中，长度为15-100个AA。在另一个实施例中，长度为15-150个AA。在另一个实施例中，长度为20-25个AA。在另一个实施例中，长度为20-30个AA。在另一个实施例中，长度为20-35个AA。在另一个实施例中，长度为20-40个AA。在另一个实施例中，长度为20-60个AA。在另一个实施例中，长度为20-70个AA。在另一个实施例中，长度为20-80个AA。在另一个实施例中，长度为20-90个AA。在另一个实施例中，长度为20-100个AA。在另一个实施例中，长度为20-150个AA。在另一个实施例中，长度为30-35个AA。在另一个实施例中，长度为30-40个AA。在另一个实施例中，长度为30-60个AA。在另一个实施例中，长度为30-70个AA。在另一个实施例中，长度为30-80个AA。在另一个实施例中，长度为30-90个AA。在另一个实施例中，长度为30-100个AA。在另一个实施例中，长度为30-150个AA。
在另一个实施例中，本公开的方法和组合物的LLO片段的长度为至少484个AA。在另一个实施例中，长度为超过484个AA。在另一个实施例中，长度为至少489个AA。在另一个实施例中，长度为超过489。在另一个实施例中，长度为至少493个AA。在另一个实施例中，长度为超过493。在另一个实施例中，长度为至少500个AA。在另一个实施例中，长度为超过500。在另一个实施例中，长度为至少505个AA。在另一个实施例中，长度为超过505。在另一个实施例中，长度为至少510个AA。在另一个实施例中，长度为超过510。在另一个实施例中，长度为至少515个AA。在另一个实施例中，长度为超过515。在另一个实施例中，长度为至少520个AA。在另一个实施例中，长度为超过520。在另一个实施例中，长度为至少525个AA。在另一个实施例中，长度为超过520。当本文中提及LLO片段的长度时，包括信号序列。因此，CBD中的第一半胱氨酸的编号是484，并且AA残基的总数目是529。
在另一个实施例中，本公开提供了一种重组蛋白或多肽或包含该重组蛋白或多肽的本文所公开的减毒李斯特菌菌株，其包含(a)突变LLO蛋白，其中该突变LLO蛋白含有内部缺失，该内部缺失包含突变LLO蛋白的胆固醇结合结构域；以及(b)包含本文所公开的一个或多个表位的肽。在另一个实施例中，胆固醇结合结构域的序列在SEQ ID NO:68或69中列出。在另一个实施例中，内部缺失为1-11、1-50或11-50个氨基酸的内部缺失。在另一个实施例中，内部缺失就该重组蛋白或多肽的溶血活性而言是去活性的。在另一个实施例中，重组蛋白或多肽相对于野生型LLO表现出溶血活性的降低。
在另一个实施例中，本公开的肽为融合肽。在另一个实施例中，“融合肽”是指包含两个或更多个通过肽键或其他化学键连接在一起的蛋白的肽或多肽。在另一个实施例中，蛋白通过肽或其他化学键直接连接在一起。在另一个实施例中，蛋白通过两个或更多个蛋白之间的一个或多个AA(例如，“间隔物”)连接在一起。
如本文所公开的，形成突变体LLO蛋白，其中LLO的残基C484、W491和W492被来自抗原NY-ESO-1的CTL表位取代(实例26)。突变的LLO蛋白mutLLO可以在大肠杆菌表达系统(实例27)中表达和纯化并且表现出相对于野生型LLO基本上减小的溶血活性(实例28)。技术人员将了解的是，通过本文所公开的方法或过程鉴定的任何新表位可用于取代或置换LLO的CBD。
在另一个实施例中，本公开的方法和组合物的内部缺失的长度为1-50个AA。在另一个实施例中，长度为1-11个AA。在另一个实施例中，长度为2-11个AA。在另一个实施例中，长度为3-11个AA。在另一个实施例中，长度为4-11个AA。在另一个实施例中，长度为5-11个AA。在另一个实施例中，长度为6-11个AA。在另一个实施例中，长度为7-11个AA。在另一个实施例中，长度为8-11个AA。在另一个实施例中，长度为9-11个AA。在另一个实施例中，长度为10-11个AA。在另一个实施例中，长度为1-2个AA。在另一个实施例中，长度为1-3个AA。在另一个实施例中，长度为1-4个AA。在另一个实施例中，长度为1-5个AA。在另一个实施例中，长度为1-6个AA。在另一个实施例中，长度为1-7个AA。在另一个实施例中，长度为1-8个AA。在另一个实施例中，长度为1-9个AA。在另一个实施例中，长度为1-10个AA。在另一个实施例中，长度为2-3个AA。在另一个实施例中，长度为2-4个AA。在另一个实施例中，长度为2-5个AA。在另一个实施例中，长度为2-6个AA。在另一个实施例中，长度为2-7个AA。在另一个实施例中，长度为2-8个AA。在另一个实施例中，长度为2-9个AA。在另一个实施例中，长度为2-10个AA。在另一个实施例中，长度为3-4个AA。在另一个实施例中，长度为3-5个AA。在另一个实施例中，长度为3-6个AA。在另一个实施例中，长度为3-7个AA。在另一个实施例中，长度为3-8个AA。在另一个实施例中，长度为3-9个AA。在另一个实施例中，长度为3-10个AA。在另一个实施例中，长度为11-50个AA。在另一个实施例中，长度为12-50个AA。在另一个实施例中，长度为11-15个AA。在另一个实施例中，长度为11-20个AA。在另一个实施例中，长度为11-25个AA。在另一个实施例中，长度为11-30个AA。在另一个实施例中，长度为11-35个AA。在另一个实施例中，长度为11-40个AA。在另一个实施例中，长度为11-60个AA。在另一个实施例中，长度为11-70个AA。在另一个实施例中，长度为11-80个AA。在另一个实施例中，长度为11-90个AA。在另一个实施例中，长度为11-100个AA。在另一个实施例中，长度为11-150个AA。在另一个实施例中，长度为15-20个AA。在另一个实施例中，长度为15-25个AA。在另一个实施例中，长度为15-30个AA。在另一个实施例中，长度为15-35个AA。在另一个实施例中，长度为15-40个AA。在另一个实施例中，长度为15-60个AA。在另一个实施例中，长度为15-70个AA。在另一个实施例中，长度为15-80个AA。在另一个实施例中，长度为15-90个AA。在另一个实施例中，长度为15-100个AA。在另一个实施例中，长度为15-150个AA。在另一个实施例中，长度为20-25个AA。在另一个实施例中，长度为20-30个AA。在另一个实施例中，长度为20-35个AA。在另一个实施例中，长度为20-40个AA。在另一个实施例中，长度为20-60个AA。在另一个实施例中，长度为20-70个AA。在另一个实施例中，长度为20-80个AA。在另一个实施例中，长度为20-90个AA。在另一个实施例中，长度为20-100个AA。在另一个实施例中，长度为20-150个AA。在另一个实施例中，长度为30-35个AA。在另一个实施例中，长度为30-40个AA。在另一个实施例中，长度为30-60个AA。在另一个实施例中，长度为30-70个AA。在另一个实施例中，长度为30-80个AA。在另一个实施例中，长度为30-90个AA。在另一个实施例中，长度为30-100个AA。在另一个实施例中，长度为30-150个AA。
在另一个实施例中，包含内部缺失的本公开的突变LLO蛋白除了内部缺失之外是全长的。在另一个实施例中，突变LLO蛋白包含另外的内部缺失。在另一个实施例中，突变LLO蛋白不止一个另外的内部缺失。在另一个实施例中，突变LLO蛋白从C末端截短。
在另一个实施例中，本公开的方法和组合物的内部缺失包含突变LLO蛋白或其片段的CBD。例如，由SEQ ID NO:2或80的残基470-500、470-510或480-500构成的内部突变包含其CBD(残基483-493)。在另一个实施例中，内部缺失为突变LLO蛋白或其片段的CBD的片段。例如，残基484-492、485-490和486-488都为SEQ ID NO:2或80的CBD的片段。在另一个实施例中，内部缺失与突变LLO蛋白或其片段的CBD重叠。例如，由SEQ ID NO:2或80的残基470-490、480-488、490-500或486-510构成的内部缺失包含其CBD。
在另一个实施例中，该截短LLO片段包含LLO蛋白的前441个AA。在另一个实施例中，该LLO片段包含LLO的前420个AA。在另一个实施例中，该LLO片段为野生型LLO蛋白的非溶血形式。
在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-25构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-50构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-75构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-100构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-125构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-150构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-175构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-200构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-225构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-250构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-275构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-300构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-325构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-350构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-375构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-400构成。在另一个实施例中，该LLO片段由大约残基1-425构成。
在另一个实施例中，该LLO片段包含对应于以上AA范围之一的同源LLO蛋白的残基。残基编号在另一个实施例中不必精确对应以上列举的残基编号；例如，如果该同源LLO蛋白相对于本文所用的LLO蛋白具有插入或缺失，则可因此而调整该残基编号。在另一个实施例中，该LLO片段为本领域已知的任何其他LLO片段。
鉴定同源蛋白的对应残基的方法在本领域是熟知的，并且例如包括序列比对。在另一个实施例中，同源LLO是指与LLO序列(例如，与SEQ ID No:2-4或80之一)的同一性大于70％。在另一个实施例中，同源LLO是指与SEQ ID No:2-4或80之一的同一性大于72％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4或80之一的同一性大于75％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4或80之一的同一性大于78％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4或80之一的同一性大于80％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4或80之一的同一性大于82％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4或80之一的同一性大于83％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4或80之一的同一性大于85％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4或80之一的同一性大于87％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4或80之一的同一性大于88％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4或80之一的同一性大于90％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4或80之一的同一性大于92％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4或80之一的同一性大于93％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4或80之一的同一性大于95％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4或80之一的同一性大于96％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4或80之一的同一性大于97％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4或80之一的同一性大于98％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4或80之一的同一性大于99％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:2-4或80之一的同一性为100％。
术语“PEST氨基酸序列”、“PEST序列”、“PEST序列肽”、“PEST肽”或“含PEST序列的蛋白质或肽”在本文中可互换使用。技术人员将了解的是，这些术语可包括截短LLO蛋白，在一个实施例中，该蛋白是N-端LLO，或者在另一个实施例中是截短ActA蛋白。PEST序列肽在本领域是已知的，并在美国专利序列号7,635,479和美国专利公开序列号2014/0186387中有所描述，这两篇专利均据此全文并入本文。
在另一个实施例中，原核生物体的PEST序列可根据诸如Rechsteiner和Roberts(TBS 21:267-271,1996)针对单核细胞增多性李斯特菌所述的方法按照常规方式鉴定。或者，来自其他原核生物体的PEST氨基酸序列也可基于这种方法来鉴定。可预期其中存在PEST氨基酸序列的其他原核生物体包括但不限于其他李斯特菌菌种。例如，单核细胞增多性李斯特菌蛋白ActA包含四个这样的序列。这些序列为KTEEQPSEVNTGPR(SEQ ID NO:5)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(SEQ ID NO:6)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQ ID NO:7)和RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(SEQ ID NO:8)。来自链球菌菌种(Streptococcussp.)的链球菌溶血素O也包含PEST序列。例如，酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)链球菌溶血素O包含在氨基酸35-51处的PEST序列KQNTASTETTTTNEQPK(SEQ IDNO:9)，并且类马链球菌(Streptococcus equisimilis)链球菌溶血素O包含在氨基酸38-54处的PEST样序列KQNTANTETTTTNEQPK(SEQ ID NO:10)。另外，据信，PEST序列可嵌入抗原性蛋白内。因此，出于本公开的目的，当关于PEST序列融合时，所谓“融合”是指抗原性蛋白既包含抗原也包含连在抗原一端或嵌入抗原内的PEST氨基酸序列。在其他实施例中，PEST序列或包含PEST的多肽不是融合蛋白的一部分，该多肽也不包含异源抗原。
术语“核酸序列”、“核酸分子”、“多核苷酸”或“核酸构建体”可在本文中互换使用，并且可以是指DNA或RNA分子，其可包括但不限于原核序列、真核mRNA、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列以及甚至合成DNA序列。该术语还指包括任何已知的DNA和RNA碱基类似物的序列。这些术语也可以是指至少两个碱基-糖-磷酸盐组合的串。该术语也可以是指核酸聚合物的单体单元。在一个实施例中，RNA可为tRNA(转运RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和核糖酶的形式。siRNA和miRNA的使用已有所描述(Caudy AA等人Genes&Devel16:2491-96及其中引用的参考文献)。DNA可以是质粒DNA、病毒DNA、线性DNA或染色体DNA或这些分组的衍生物的形式。此外，这些形式的DNA和RNA可以是单链、双链、三链或四链的。这些术语还可以包括可含有其他类型的主链但具有相同碱基的人工核酸。在一个实施例中，人工核酸是PNA(肽核酸)。PNA包含肽主链和核苷酸碱基，并且在一个实施例中能够结合DNA和RNA两种分子。在另一个实施例中，核苷酸是氧杂环丁烷修饰的。在另一个实施例中，核苷酸通过用硫代磷酸键代替一个或多个磷酸二酯键来修饰。在另一个实施例中，人工核酸包含本领域已知的天然核酸的磷酸主链的任何其他变体。硫代磷酸核酸和PNA的使用是本领域的技术人员已知的，并且在例如Neilsen PE,Curr Opin Struct Biol 9:353-57和RazNK等人Biochem Biophys Res Commun.297:1075-84中有所描述。核酸的制备和使用是本领域的技术人员已知的，并且在例如Molecular Cloning,(2001),Sambrook和Russell编以及Methods in Enzymology:Methods for molecular cloning in eukaryotic cells(2003)Purchio and G.C.Fareed中有所描述。
在另一个实施例中，本文所公开的核酸分子从游离型载体或质粒载体表达。在另一个实施例中，该质粒在不存在抗生素选择的情况下稳定保持在重组李斯特菌疫苗菌株中。在另一个实施例中，该质粒不赋予重组李斯特菌抗生素抗性。
在一个实施例中，本文所公开的免疫原性多肽或其片段是ActA蛋白或其片段。在一个实施例中，ActA蛋白包含SEQ ID NO:11中列出的序列：
MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIEELEKSNKVKNTNKADLIAMLKAKAEKGPNNNNNNGEQTGNVAINEEASGVDRPTLQVERRHPGLSSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKANKRKVAKESVVDASESDLDSSMQSADESTPQPLKANQKPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPTPSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIMRETAPSLDSSFTSGDLASLRSAINRHSENFSDFPLIPTEEELNGRGGRPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDRLADLRDRGTGKHSRNAGFLPLNPFISSPVPSLTPKVPKISAPALISDITKKAPFKNPSQPLNVFNKKTTTKTVTKKPTPVKTAPKLAELPATKPQETVLRENKTPFIEKQAETNKQSINMPSLPVIQKEATESDKEEMKPQTEEKMVEESESANNANGKNRSAGIEEGKLIAKSAEDEKAKEEPGNHTTLILAMLAIGVFSLGAFIKIIQLRKNN(SEQ ID NO:11)。
对应于该序列的前蛋白的前29个AA为信号序列，并在由细菌分泌时从ActA蛋白切割。在一个实施例中，ActA多肽或肽包含信号序列，即以上SEQ ID NO:11的AA 1-29。在另一个实施例中，ActA多肽或肽不含信号序列，即以上SEQ ID NO:11的AA 1-29。
在一个实施例中，截短ActA蛋白包含ActA蛋白的N末端片段。在另一个实施例中，截短的ActA蛋白是ActA蛋白的N末端片段。在一个实施例中，截短ActA蛋白包含在SEQ IDNO:12中列出的序列：
MRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKGPNINNNNSEQTENAAINEEASGADRPAIQVERRHPGLPSDSAAEIKKRRKAIASSDSELESLTYPDKPTKVNKKKVAKESVADASESDLDSSMQSADESSPQPLKANQQPFFPKVFKKIKDAGKWVRDKIDENPEVKKAIVDKSAGLIDQLLTKKKSEEVNASDFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTDEELRLALPETPMLLGFNAPATSEPSSFEFPPPPTEDELEIIRETASSLDSSFTRGDLASLRNAINRHSQNFSDFPPIPTEEELNGRGGRP(SEQ ID NO:12)。
在另一个实施例中，ActA片段包含在SEQ ID NO:12中列出的序列。
在另一个实施例中，截短ActA蛋白包含在SEQ ID NO:13中列出的序列：MGLNRFMRAMMVVFITANCITINPDIIFAATDSEDSSLNTDEWEEEKTEEQPSEVNTGPRYETAREVSSRDIKELEKSNKVRNTNKADLIAMLKEKAEKG(SEQ ID NO:13)。
在另一个实施例中，ActA片段为本领域已知的任何其他ActA片段。在另一个实施例中，该ActA片段为免疫原性片段。
在另一个实施例中，ActA蛋白包含在SEQ ID NO:14中列出的序列：
对应于该序列的前蛋白的前29个AA为信号序列，并在由细菌分泌时从ActA蛋白切割。在一个实施例中，ActA多肽或肽包含信号序列，即SEQ ID NO:14的AA 1-29。在另一个实施例中，ActA多肽或肽不含信号序列，即SEQ ID NO:14的AA 1-29。
在另一个实施例中，截短ActA蛋白包含在SEQ ID NO:15中列出的序列：
在另一个实施例中，如SEQ ID NO:15中列出的截短ActA称为ActA/PEST1。在另一个实施例中，截短的ActA包含全长ActA序列的从第30到122个氨基酸。在另一个实施例中，SEQID NO:15包含全长ActA序列的从第30到122个氨基酸。在另一个实施例中，截短ActA包含SEQ ID NO:14的从第30到122个氨基酸。在另一个实施例中，SEQ ID NO:15包含SEQ ID NO:14的从第30到122个氨基酸。
在另一个实施例中，截短ActA蛋白包含在SEQ ID NO:16中列出的序列：
在另一个实施例中，如SEQ ID NO:16中列出的截短ActA称为ActA/PEST2。在另一个实施例中，如SEQ ID NO:16中列出的截短ActA称为LA229。在另一个实施例中，截短的ActA包含全长ActA序列的从第30到229个氨基酸。在另一个实施例中，SEQ ID NO:16包含全长ActA序列的从约第30到约229个氨基酸。在另一个实施例中，截短ActA包含SEQ ID NO:14的从约第30到229个氨基酸。在另一个实施例中，SEQ ID NO:16包含SEQ ID NO:14的从第30到229个氨基酸。
在另一个实施例中，截短ActA蛋白包含在SEQ ID NO:17中列出的序列：
在另一个实施例中，如SEQ ID NO:17中列出的截短ActA称为ActA/PEST3。在另一个实施例中，该截短ActA包含全长ActA序列的从第30到332个氨基酸。在另一个实施例中，SEQID NO:17包含全长ActA序列的从第30到332个氨基酸。在另一个实施例中，截短ActA包含SEQ ID NO:14的从第30到332个氨基酸。在另一个实施例中，SEQ ID NO:17包含SEQ ID NO:14的从第30到332个氨基酸。
在另一个实施例中，截短ActA蛋白包含在SEQ ID NO:18中列出的序列：
在另一个实施例中，如SEQ ID NO:18中列出的截短ActA称为ActA/PEST4。在另一个实施例中，该截短ActA包含全长ActA序列的从第30到399个氨基酸。在另一个实施例中，SEQID NO:18包含全长ActA序列的从第30到399个氨基酸。在另一个实施例中，截短ActA包含SEQ ID NO:14的从第30到399个氨基酸。在另一个实施例中，SEQ ID NO:18包含SEQ ID NO:14的从第30到399个氨基酸。
在另一个实施例中，“截短ActA”或“ΔActA”是指包含PEST结构域的ActA片段。在另一个实施例中，该术语是指包含PEST序列的ActA片段。
在另一个实施例中，编码截短的ActA蛋白的重组核苷酸包含SEQ ID NO:19中列出的序列：
atgcgtgcgatgatggtggttttcattactgccaattgcattacgattaaccccgacataatatttgcagcgacagatagcgaagattctagtctaaacacagatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcaaccaagcgaggtaaatacgggaccaagatacgaaactgcacgtgaagtaagttcacgtgatattaaagaactagaaaaatcgaataaagtgagaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagaaaaagcagaaaaaggtccaaatatcaataataacaacagtgaacaaactgagaatgcggctataaatgaagaggcttcaggagccgaccgaccagctatacaagtggagcgtcgtcatccaggattgccatcggatagcgcagcggaaattaaaaaaagaaggaaagccatagcatcatcggatagtgagcttgaaagccttacttatccggataaaccaacaaaagtaaataagaaaaaagtggcgaaagagtcagttgcggatgcttctgaaagtgacttagattctagcatgcagtcagcagatgagtcttcaccacaacctttaaaagcaaaccaacaaccatttttccctaaagtatttaaaaaaataaaagatgcggggaaatgggtacgtgataaaatcgacgaaaatcctgaagtaaagaaagcgattgttgataaaagtgcagggttaattgaccaattattaaccaaaaagaaaagtgaagaggtaaatgcttcggacttcccgccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacaccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcagaaccgagctcattcgaatttccaccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacgccaatgcttcttggttttaatgctcctgctacatcggaaccgagctcgttcgaatttccaccgcctccaacagaagatgaactagaaatcatccgggaaacagcatcctcgctagattctagttttacaagaggggatttagctagtttgagaaatgctattaatcgccatagtcaaaatttctctgatttcccaccaatcccaacagaagaagagttgaacgggagaggcggtagacca.
在另一个实施例中，重组核苷酸具有在SEQ ID NO:19中列出的序列。在另一个实施例中，重组核苷酸包含任何其他的编码ActA蛋白的片段的序列。
在另一个实施例中，该ActA片段由ActA蛋白的大约前100个AA构成。
在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-25构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-50构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-75构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-100构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-125构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-150构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-175构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-200构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-225构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-250构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-275构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-300构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-325构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-338构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-350构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-375构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-400构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-450构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-500构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-550构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-600构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-639构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-100构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-125构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-150构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-175构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-200构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-225构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-250构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-275构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-300构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-325构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-338构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-350构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-375构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-400构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-450构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-500构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-550构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基1-600构成。在另一个实施例中，该ActA片段由大约残基30-604构成。
在另一个实施例中，该ActA片段含有对应于以上AA范围之一的同源ActA蛋白的残基。残基编号在另一个实施例中不必精确对应以上列举的残基编号；例如，如果该同源ActA蛋白相对于本文所用的ActA蛋白具有插入或缺失，则可因此而调整该残基编号。在另一个实施例中，ActA片段为本领域已知的任何其他ActA片段。
在另一个实施例中，同源ActA是指与ActA序列(例如，与SEQ ID No:11-18之一)的同一性大于70％。在另一个实施例中，同源ActA是指与SEQ ID No:11-18之一的同一性大于72％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:11-18之一的同一性大于75％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:11-18之一的同一性大于78％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:11-18之一的同一性大于80％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ IDNo:11-18之一的同一性大于82％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:11-18之一的同一性大于83％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:11-18之一的同一性大于85％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:11-18之一的同一性大于87％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:11-18之一的同一性大于88％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:11-18之一的同一性大于90％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ IDNo:11-18之一的同一性大于92％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:11-18之一的同一性大于93％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:11-18之一的同一性大于95％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:11-18之一的同一性大于96％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:11-18之一的同一性大于97％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:11-18之一的同一性大于98％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ IDNo:11-18之一的同一性大于99％。在另一个实施例中，同源是指与SEQ ID No:11-18之一的同一性为100％。
技术人员将了解的是，当提及本文所公开的任何核酸序列时，术语“同源性”可以包括候选序列中与相应天然核酸序列的核苷酸相同的核苷酸的百分比。
在一个实施例中，通过序列比对的计算机算法、通过本领域中充分描述的方法来确定同源性。例如，核酸序列同源性的计算机算法分析可以包括使用多种可用软件包，比如BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLAST Enhanced Alignment Utility)、GENPEPT和TREMBL软件包。
在另一个实施例中，“同源性”是指与选自本文所公开的序列的序列的同一性大于68％。在另一个实施例中，“同源性”是指与选自本文所公开的序列的序列的同一性大于70％。在另一个实施例中，“同源性”是指与选自本文所公开的序列的序列的同一性大于72％。在另一个实施例中，该同一性大于75％。在另一个实施例中，该同一性大于78％。在另一个实施例中，该同一性大于80％。在另一个实施例中，该同一性大于82％。在另一个实施例中，该同一性大于83％。在另一个实施例中，该同一性大于85％。在另一个实施例中，该同一性大于87％。在另一个实施例中，该同一性大于88％。在另一个实施例中，该同一性大于90％。在另一个实施例中，该同一性大于92％。在另一个实施例中，该同一性大于93％。在另一个实施例中，该同一性大于95％。在另一个实施例中，该同一性大于96％。在另一个实施例中，该同一性大于97％。在另一个实施例中，该同一性大于98％。在另一个实施例中，该同一性大于99％。在另一个实施例中，该同一性为100％。
在另一个实施例中，通过确定候选序列杂交来确定同源性，其方法在现有技术中有充分描述(参见，例如“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.和Higgins S.J.编(1985)；Sambrook等人,2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Press,N.Y.；以及Ausubel等人,1989,Current Protocols in MolecularBiology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y)。例如，可在中等至严格条件下进行与编码天然半胱天冬酶肽的DNA的互补序列杂交的方法。杂交条件为例如在包含以下物质的溶液中42℃下温育过夜：10-20％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×登哈特溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的经剪切的鲑鱼精DNA。
在一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株缺乏抗生素抗性基因。
在一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌能够逃离吞噬溶酶体。
在一个实施例中，李斯特菌基因组包含内源性actA基因的缺失，在一个实施例中，该基因是毒力因子。在一个实施例中，异源性抗原或抗原多肽与LLO同框整合进李斯特菌染色体中。在另一个实施例中，整合的核酸分子与ActA同框整合进actA基因座。在另一个实施例中，编码ActA的染色体核酸被编码抗原的核酸分子替代。
在一个实施例中，本文所公开的肽包含一个或多个新表位。在一个实施例中，本文所公开的肽由抗原包含。在另一个实施例中，本文所公开的肽是抗原片段。在一个实施例中，本文所公开的抗原包含一个或多个新表位。在另一个实施例中，该抗原是异源抗原或自身抗原。在一个实施例中，本文所公开的异源抗原或自身抗原是肿瘤相关抗原。技术人员将了解的是，术语“异源的”可以是指非天然或正常地由细菌表达的抗原或其部分。在一个实施例中，异源抗原包含非天然或正常地由李斯特菌菌株表达的抗原。在另一个实施例中，肿瘤相关抗原是天然存在的肿瘤相关抗原。在另一个实施例中，肿瘤相关抗原是合成的肿瘤相关抗原。在又一个实施例中，肿瘤相关抗原是嵌合的肿瘤相关抗原。在又一个实施例中，肿瘤相关抗原包含一个或多个新表位。在又一个实施例中，肿瘤相关抗原是新抗原。
在一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌包含核酸分子，该核酸分子包含编码含有一种或多种肽的重组多肽的第一开放阅读框，其中所述一种或多种肽包含一个或多个新表位。在另一个实施例中，该重组多肽还包含融合至本文所公开的肽的截短LLO蛋白、截短ActA蛋白或PEST序列。
在另一个实施例中，本文所公开的核酸分子包含编码重组多肽的第一开放阅读框，该重组多肽包含截短LLO蛋白、截短ActA蛋白或PEST序列，其中该截短LLO蛋白、截短ActA蛋白或PEST序列不融合到异源抗原。在另一个实施例中，第一开放阅读框编码截短LLO蛋白。在另一个实施例中，第一开放阅读框编码截短ActA蛋白。在另一个实施例中，第一开放阅读框编码截短LLO蛋白。在另一个实施例中，第一开放阅读框编码截短ActA蛋白。在另一个实施例中，第一开放阅读框编码截短LLO蛋白。在另一个实施例中，第一开放阅读框编码由N末端ActA蛋白或其片段组成的截短ActA蛋白。
技术人员将了解的是，术语“抗原”、“抗原片段”、“抗原部分”、“异源蛋白”、“异源抗原”、“异源蛋白抗原”、“蛋白抗原”、“抗原”、“抗原性多肽”或其语法等同形式在本文可互换使用并且可以是指在存在于受试者细胞中的MHC I类和/或II类分子上加工和呈递从而当存在于宿主体内时或在另一个实施例中被宿主检测到时导致产生免疫应答的如本文所述的多肽、肽或重组肽。在一个实施例中，抗原可以是宿主外源的。在另一个实施例中，抗原可以存在于宿主中，但宿主因免疫耐受而不引起对该抗原的免疫应答。在另一个实施例中，抗原是包含一个或多个新表位的新抗原，其中一个或多个新表位是T细胞表位。在另一个实施例中，抗原或其肽片段包含为T细胞表位的一个或多个新表位。
在另一个实施例中，抗原包含至少一个新表位。在一个实施例中，抗原是包含至少一个新表位的新抗原。在一个实施例中，新表位是先前未被免疫系统识别的表位。新抗原往往与肿瘤抗原相关并且可见于致癌细胞中。当蛋白质在生物化学通路内经历进一步改性(诸如糖基化、磷酸化或蛋白质水解)时，可形成新抗原并且通过延伸形成相关地新抗原决定簇(新表位)。通过改变蛋白质的结构，这可产生新型或“新”表位。
在一个实施例中，本文所公开的李斯特菌包含微基因核酸构建体，所述构建体包含编码嵌合蛋白的一个或多个开放阅读框，其中所述嵌合蛋白包含：
细菌分泌信号序列；
泛素(Ub)蛋白；
一种或多种肽，其包含一个或多个新表位；并且
其中a.-c.中的所述信号序列、所述泛素和所述一种或多种肽从氨基端到羧基端分别串联布置或可操作性地连接。
在另一个实施例中，本文所公开的细菌信号序列是李斯特菌信号序列，在另一个实施例中，这些信号序列是hly或actA信号序列。在另一个实施例中，细菌信号序列是本领域已知的任何其他信号序列。在另一个实施例中，包含微基因核酸构建体的重组李斯特菌还包含在每个开放阅读框之间由Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的两个或更多个开放阅读框。在另一个实施例中，包含微基因核酸构建体的重组李斯特菌还包含在每个开放阅读框之间由Shine-Dalgarno核糖体结合位点核酸序列连接的一个至四个开放阅读框。在另一个实施例中，每个开放阅读框编码不同的肽。
在另一个实施例中，本文公开了包含重组核酸构建体的重组减毒李斯特菌菌株，所述构建体包含编码细菌分泌信号序列(SS)、泛素(Ub)蛋白和肽序列的开放阅读框。在另一个实施例中，该核酸构建体编码嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含细菌分泌信号序列、泛素蛋白和肽序列。在一个实施例中，该嵌合蛋白按以下方式(SS-Ub-肽)布置。
在一个实施例中，包含对应于肽部分的羧基末端的密码子的核酸构建体后面跟着两个终止密码子，以确保蛋白合成的终止。
在一个实施例中，本文所述的组合物和方法中提供的微基因核酸构建体包含设计成有利于在羧基端含有不同肽部分的重组蛋白小组的表达系统。这在一个实施例中通过将编码细菌分泌信号序列-泛素-肽(SS-Ub-肽)构建体之一的序列用作模板而进行的PCR反应来实现。在一个实施例中，使用延伸到Ub序列的羧基末端区域中的引物并在该引物的3’端引入所需肽序列的密码子，可以在单个PCR反应中生成新的SS-Ub-肽序列(参见本文的实例)。编码细菌启动子的5’引物和细菌分泌信号序列的前几个核苷酸对于所有构建体而言可以是相同的。该构建体的示意图在本文的图26A-C中提供。
在一个实施例中，编码本文所公开的重组多肽的核酸还包含信号肽或信号序列。在一个实施例中，由本文所公开的核酸构建体或核酸分子编码的细菌分泌信号序列是李斯特菌分泌信号序列。在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的融合蛋白包含来自李斯特菌溶血素O(LLO)的LLO信号序列。技术人员将了解的是，包含本文所公开的一个或多个新表位的抗原或肽可通过使用信号序列，诸如李斯特菌信号序列，例如溶血素(hly)信号序列或actA信号序列来表达。或者，例如，外源基因可在单核细胞增多性李斯特菌启动子下游表达，而不形成融合蛋白。在另一个实施例中，信号肽是细菌的(李斯特菌的或非李斯特菌的)。在一个实施例中，信号肽是细菌天然的。在另一个实施例中，信号肽是细菌外源的。在另一个实施例中，信号肽是单核细胞增多性李斯特菌的信号肽，诸如secA1信号肽。在另一个实施例中，信号肽是来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的Usp45信号肽，或者来自炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的保护性抗原信号肽。在另一个实施例中，信号肽是secA2信号肽，例如单核细胞增多性李斯特菌的p60信号肽。此外，重组核酸分子任选地包含编码p60或其片段的第三多核苷酸序列。在另一个实施例中，信号肽是Tat信号肽，诸如枯草芽孢杆菌Tat信号肽(如，PhoD)。在一个实施例中，信号肽在编码重组多肽的相同翻译阅读框中。
在另一个实施例中，分泌信号序列来自李斯特菌蛋白。在另一个实施例中，分泌信号为ActA300分泌信号。在另一个实施例中，分泌信号为ActA100分泌信号。
在一个实施例中，核酸构建体包含编码泛素蛋白的开放阅读框。在一个实施例中，泛素为全长蛋白。技术人员将领会的是，在本文所公开的表达构建体中的泛素(从本文所公开的核酸构建体表达的)在进入宿主细胞的胞质溶胶时通过水解酶的作用而在羧基端与从核酸构建体表达的重组嵌合蛋白的其余部分切开。这释放出肽部分的氨基末端，从而在宿主细胞的胞质溶胶中产生肽(长度取决于特定的肽)。
在一个实施例中，由本文所公开的核酸构建体编码的肽的长度为8-10个氨基酸(AA)。在另一个实施例中，肽的长度为10-20个AA。在另一个实施例中，肽的长度为21-30个AA。在另一个实施例中，肽的长度为31-50个AA。在另一个实施例中，肽的长度为51-100个AA。
在一个实施例中，本文公开的核酸分子还包含编码代谢酶的第二开放阅读框。在另一个实施例中，该代谢酶补充重组李斯特菌菌株的染色体中缺乏的内源性基因。在另一个实施例中，该代谢酶补充重组李斯特菌菌株的染色体中突变的内源性基因。在另一个实施例中，由该第二开放阅读框编码的代谢酶为丙氨酸消旋酶(dal)。在另一个实施例中，由该第二开放阅读框编码的代谢酶为D-氨基酸转移酶(dat)。在另一个实施例中，本文所公开的李斯特菌菌株在内源性dal/dat基因中包含突变。在另一个实施例中，该李斯特菌缺乏dal/dat基因。
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的核酸分子可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的第一开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的第二开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。在另一个实施例中，每个开放阅读框可操作地连接至启动子/调控序列。
“代谢酶”在另一个实施例中是指参与宿主细菌所需的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，该术语是指宿主细菌所需的营养物的合成所需的酶。在另一个实施例中，该术语是指参与宿主细菌所利用的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，该术语是指参与宿主细菌持续生长所需的营养物的合成的酶。在另一个实施例中，酶为营养物的合成所需。
在另一个实施例中，该重组李斯特菌为减毒的营养缺陷型菌株。在另一个实施例中，该重组李斯特菌是如美国专利No.8,114,414中所述的Lm-LLO-E7菌株，该专利以引用方式全文并入本文。
在一个实施例中，减毒的菌株为Lm dal(-)dat(-)(Lmdd)。在另一个实施例中，减毒的菌株为Lm dal(-)dat(-)ΔactA(LmddA)。LmddA基于李斯特菌疫苗载体，该载体因缺失毒力基因actA而为减毒的并保留了质粒，以通过补充dal基因用于期望的异源抗原或截短的LLO在体内和体外表达。
在另一个实施例中，该减毒菌株为LmddA。在另一个实施例中，该减毒菌株为LmΔactA。在另一个实施例中，该减毒菌株为LmΔPrfA。在另一个实施例中，该减毒菌株为LmΔPrfA*。在另一个实施例中，该减毒菌株为LmΔPlcB。在另一个实施例中，该减毒菌株为LmΔPlcA。在另一个实施例中，该菌株为任何上文提及的菌株的双突变体或三突变体。在另一个实施例中，该菌株发挥强烈的佐剂效应，这是基于李斯特菌的疫苗的固有特性。在另一个实施例中，该菌株从EGD李斯特菌骨架构建。在另一个实施例中，用于本发明的菌株为表达非溶血LLO的李斯特菌菌株。
在另一个实施例中，该李斯特菌菌株为营养缺陷型突变体。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是编码维生素合成基因的基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是编码泛酸合酶的基因缺陷的。
在一个实施例中，D-丙氨酸缺陷的李斯特菌AA菌株的生成例如可以按本领域的技术人员熟知的多种方式实现，这些方式包括缺失诱变、插入诱变、以及导致生成移码突变的诱变、导致蛋白的提前终止的突变、或影响基因表达的调控序列的突变。在另一个实施例中，诱变可使用重组DNA技术或使用传统诱变技术实现，所述传统诱变技术使用诱变化学品或辐射，随后选择突变体。在另一个实施例中，由于伴随的营养缺陷型表型反转的可能性很低，缺失突变体是优选的。在另一个实施例中，可在简单的实验室培养分析中测试根据本文提供的方案生成的D-丙氨酸突变体在不存在D-丙氨酸的情况下的生长能力。在另一个实施例中，选择在不存在该化合物的情况下不能生长的那些突变体进行进一步研究。
在另一个实施例中，除上述D-丙氨酸相关基因之外，如本文所公开的涉及代谢酶合成的其他基因可用作李斯特菌诱变的靶标。
在另一个实施例中，代谢酶补充重组细菌菌株的染色体其余部分中缺乏的内源性代谢基因。在另一个实施例中，内源性代谢基因在染色体中是突变的。在另一个实施例中，内源性代谢基因从染色体缺失。在另一个实施例中，代谢酶为氨基酸代谢酶。在另一个实施例中，代谢酶催化用于重组李斯特菌菌株中的细胞壁合成的氨基酸的形成。在另一个实施例中，代谢酶为丙氨酸消旋酶。在另一个实施例中，代谢酶为D-氨基酸转移酶。每种可能性代表了本文所公开的方法和组合物的独立实施例。
在一个实施例中，营养缺陷型李斯特菌菌株包含游离型表达载体，该游离型表达载体包含补充营养缺陷型李斯特菌菌株的营养缺陷体的代谢酶。在另一个实施例中，该构建体以游离型形式包含于李斯特菌菌株中。在另一个实施例中，外源抗原从重组李斯特菌菌株携带的质粒载体表达。在另一个实施例中，游离型表达质粒载体缺乏抗生素抗性标记。在一个实施例中，本文公开的方法和组合物的抗原融合到包含PEST序列的多肽。
在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是氨基酸(AA)代谢酶缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是D-谷氨酸合酶基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是dat基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是dal基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是dga基因缺陷的。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是二氨基庚二酸合成中涉及到的基因缺陷的。CysK.在另一个实施例中，该基因为维生素-B12非依赖性甲硫氨酸合酶。在另一个实施例中，该基因为trpA。在另一个实施例中，该基因为trpB。在另一个实施例中，该基因为trpE。在另一个实施例中，该基因为asnB。在另一个实施例中，该基因为gltD。在另一个实施例中，该基因为gltB。在另一个实施例中，该基因为leuA。在另一个实施例中，该基因为argG。在另一个实施例中，该基因为thrC。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是一个或多个上文描述的基因缺陷的。
在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是合酶基因缺陷的。在另一个实施例中，该基因为氨基酸合成基因。在另一个实施例中，该基因为folP。在另一个实施例中，该基因为二氢尿苷合酶家族蛋白。在另一个实施例中，该基因为ispD。在另一个实施例中，该基因为ispF。在另一个实施例中，该基因为磷酸烯醇丙酮酸合酶。在另一个实施例中，该基因为hisF。在另一个实施例中，该基因为hisH。在另一个实施例中，该基因为fliI。在另一个实施例中，该基因为核糖体大亚基假尿苷合酶。在另一个实施例中，该基因为ispD。在另一个实施例中，该基因为双功能GMP合酶/谷氨酰胺氨基转移酶蛋白。在另一个实施例中，该基因为cobS。在另一个实施例中，该基因为cobB。在另一个实施例中，该基因为cbiD。在另一个实施例中，该基因为尿卟啉-III C-甲基转移酶/尿卟啉原-III合酶。在另一个实施例中，该基因为cobQ。在另一个实施例中，该基因为uppS。在另一个实施例中，该基因为truB。在另一个实施例中，该基因为dxs。在另一个实施例中，该基因为mvaS。在另一个实施例中，该基因为dapA。在另一个实施例中，该基因为ispG。在另一个实施例中，该基因为folC。在另一个实施例中，该基因为柠檬酸合酶。在另一个实施例中，该基因为argJ。在另一个实施例中，该基因为3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸合酶。在另一个实施例中，该基因为吲哚-3-甘油-磷酸合酶。在另一个实施例中，该基因为邻氨基苯甲酸合酶/谷氨酰胺氨基转移酶组分。在另一个实施例中，该基因为menB。在另一个实施例中，该基因为甲基萘醌特异的异分支酸合酶。在另一个实施例中，该基因为磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶I或II。在另一个实施例中，该基因为磷酸核糖氨基咪唑-琥珀酸甲酰胺合酶。在另一个实施例中，该基因为carB。在另一个实施例中，该基因为carA。在另一个实施例中，该基因为thyA。在另一个实施例中，该基因为mgsA。在另一个实施例中，该基因为aroB。在另一个实施例中，该基因为hepB。在另一个实施例中，该基因为rluB。在另一个实施例中，该基因为ilvB。在另一个实施例中，该基因为ilvN。在另一个实施例中，该基因为alsS。在另一个实施例中，该基因为fabF。在另一个实施例中，该基因为fabH。在另一个实施例中，该基因为假尿苷合酶。在另一个实施例中，该基因为pyrG。在另一个实施例中，该基因为truA。在另一个实施例中，该基因为pabB。在另一个实施例中，该基因为atp合酶基因(例如，atpC、atpD-2、aptG、atpA-2等)。
在另一个实施例中，该基因为phoP。在另一个实施例中，该基因为aroA。在另一个实施例中，该基因为aroC。在另一个实施例中，该基因为aroD。在另一个实施例中，该基因为plcB。
在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是肽转运蛋白缺陷的。在另一个实施例中，该基因为ABC转运蛋白/ATP结合/通透酶蛋白。在另一个实施例中，该基因为寡肽ABC转运蛋白/寡肽结合蛋白。在另一个实施例中，该基因为寡肽ABC转运蛋白/通透酶蛋白。在另一个实施例中，该基因为锌ABC转运蛋白/锌结合蛋白。在另一个实施例中，该基因为糖ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为磷酸转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为ZIP锌转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为EmrB/QacA家族的耐药转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为硫酸转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为质子依赖性寡肽转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为镁转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为甲酸/硝酸转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为亚精胺/腐胺ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为Na/Pi-协同转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为磷酸糖转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为谷氨酰胺ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为主要协助家族转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为甘氨酸甜菜碱/L-脯氨酸ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为钼ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为磷壁酸ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为钴ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为铵转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为氨基酸ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为细胞分裂ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为锰ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为铁化合物ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为麦芽糖/麦芽糖糊精ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为Bcr/CflA家族的耐药转运蛋白。在另一个实施例中，该基因为上述蛋白之一的亚基。
在一个实施例中，本文公开了核酸分子，该核酸分子用于转化李斯特菌以便获得重组李斯特菌。在另一个实施例中，本文公开的用于转化李斯特菌的核酸缺乏毒力基因。在另一个实施例中，该核酸分子整合进李斯特菌基因组并携带非功能性毒力基因。在另一个实施例中，该毒力基因在该重组李斯特菌中是突变的。在又一个实施例中，该核酸分子用于使李斯特菌基因组中存在的内源性基因失活。在又一个实施例中，该毒力基因为actA基因、inlA基因和inlB基因、inlC基因、inlJ基因、plbC基因、bsh基因或prfA基因。技术人员应当理解，该毒力基因可为本领域已知的任何与重组李斯特菌中的毒力相关的基因。
在又一个实施例中，李斯特菌菌株为inlA突变体、inlB突变体、inlC突变体、inlJ突变体、prfA突变体、actA突变体、dal/dat突变体、prfA突变体、plcB缺失突变体或缺乏plcA和plcB或actA和inlB的双突变体。在另一个实施例中，该李斯特菌包含这些基因的缺失或突变，无论是单独的，还是组合的。在另一个实施例中，本文所公开的李斯特菌缺乏所述基因的每一个。在另一个实施例中，本文所公开的李斯特菌缺乏至少1个且最多10个本文所公开的任何基因，包括actA、prfA和dal/dat基因。在另一个实施例中，该prfA突变体为D133V prfA突变体。
在一个实施例中，减毒活李斯特菌为重组李斯特菌。在另一个实施例中，该重组李斯特菌包含基因组内化素C(inlC)基因的突变或缺失。在另一个实施例中，该重组李斯特菌包含基因组actA基因和基因组内化素C基因的突变或缺失。在一个实施例中，李斯特菌向邻近细胞的迁移通过参与该过程的actA基因和/或inlC基因的缺失而被抑制，由此产生出乎意料的高水平减毒，具有增加的免疫原性，并用作疫苗的骨架。
在一个实施例中，代谢基因、毒力基因等是李斯特菌菌株的染色体中缺乏的。在另一个实施例中，代谢基因、毒力基因等是李斯特菌菌株的染色体以及任何游离型遗传元件中缺乏的。在另一个实施例中，代谢基因、毒力基因等是毒力菌株的染色体中缺乏的。在另一个实施例中，毒力基因在染色体中是突变的。在另一个实施例中，毒力基因从染色体缺失。
在一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌菌株为减毒的。在另一个实施例中，重组李斯特菌缺乏actA毒力基因。在另一个实施例中，重组李斯特菌缺乏prfA毒力基因。在另一个实施例中，重组李斯特菌缺乏inlB基因。在另一个实施例中，重组李斯特菌同时缺乏actA和inlB基因。在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含内源性actA基因的失活突变。在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含内源性inlB基因的失活突变。在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含内源性inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含内源性actA和inlB基因的失活突变。在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含内源性actA和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含内源性actA、inlB和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含内源性actA、inlB和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含内源性actA、inlB和inlC基因的失活突变。在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含以下基因中任何单个基因或组合中的失活突变：actA、dal、dat、inlB、inlC、prfA、plcA、plcB。
技术人员将理解的是，术语“突变”及其语法等同形式包括对序列(核酸或氨基酸序列)的任何类型的突变或修饰，并且包括缺失突变、截短、失活、断裂或易位。这些类型的突变是本领域众所周知的。
在一个实施例中，为了选择包含编码代谢酶或补充本文公开的基因的质粒的营养缺陷型细菌，使转化的营养缺陷型细菌在将会选择氨基酸代谢基因或补充基因的表达的培养基上生长。在另一个实施例中，用包含用于D-谷氨酸合成的基因的质粒转化D-谷氨酸合成缺陷型细菌，并且该营养缺陷型细菌将在不存在D-谷氨酸的情况下生长，而未被该质粒转化或者不表达编码用于D-谷氨酸合成的蛋白的质粒的营养缺陷型细菌将不会生长。在另一个实施例中，如果本文所公开的质粒包含编码用于D-丙氨酸合成的氨基酸代谢酶的分离的核酸，D-丙氨酸合成营养缺陷型的细菌当被转化且表达所述质粒时，将在不存在D-丙氨酸的情况下生长。这样的用于制备适当的培养基(其包含或缺少必需生长因子、补充剂、氨基酸、维生素、抗生素等)的方法是本领域熟知的，且可商购获得(Becton-Dickinson,FranklinLakes,NJ)。每种方法代表了本文所公开的独立实施例。
在另一个实施例中，一旦在适当培养基上选择了包含本文所公开的质粒的营养缺陷型细菌，细菌即可在存在选择压力的情况下繁殖。这样的繁殖包括使细菌在无营养缺陷因子的培养基中生长。表达氨基酸代谢酶的质粒在营养缺陷型细菌中的存在将确保，该质粒将与该细菌一起复制，从而连续地选择携带该质粒的细菌。技术人员在获知本文的公开内容和方法后将能够容易地通过调整培养基(包含质粒的营养缺陷型细菌在其中生长)的体积来放大李斯特菌疫苗载体的生产。
技术人员将领会的是，在另一个实施例中，其他营养缺陷型菌株和互补系统适合与本发明一起使用。
在一个实施例中，N末端LLO蛋白片段和异源抗原直接互相融合。在另一个实施例中，编码N末端LLO蛋白片段和异源抗原的基因直接互相融合。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段和异源抗原通过接头肽可操作地连接。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段和异源抗原通过异源肽连接。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段是异源抗原的N末端。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段单独即以非融合形式表达和使用。在另一个实施例中，N末端LLO蛋白片段是融合蛋白的最N末端部分。在另一个实施例中，截短LLO在C末端截短以得到N末端LLO。在另一个实施例中，截短LLO是非溶血LLO。
在一个实施例中，N末端ActA蛋白片段和异源抗原直接互相融合。在另一个实施例中，编码N末端ActA蛋白片段和异源抗原的基因直接互相融合。在另一个实施例中，N末端ActA蛋白片段和异源抗原通过接头肽可操作地连接。在另一个实施例中，N末端ActA蛋白片段和异源抗原通过异源肽连接。在另一个实施例中，N末端ActA蛋白片段是异源抗原的N末端。在另一个实施例中，N末端ActA蛋白片段单独即以非融合形式表达和使用。在另一个实施例中，N末端ActA蛋白片段是融合蛋白的最N末端部分。在另一个实施例中，截短ActA在C末端截短的以得到N末端ActA。
在另一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株表达重组多肽。在另一个实施例中，该重组李斯特菌菌株包含编码重组多肽的质粒。在另一个实施例中，本文所公开的重组核酸在本文所公开的重组李斯特菌菌株的质粒中。在另一个实施例中，该质粒是不整合进重组李斯特菌菌株染色体中的游离型质粒。在另一个实施例中，该质粒是整合进李斯特菌菌株染色体中的整合型质粒。在另一个实施例中，该质粒为多拷贝质粒。
在一个实施例中，该异源抗原是肿瘤相关抗原。在一个实施例中，本文所公开的组合物和方法的重组李斯特菌菌株表达异源抗原性多肽，所述异源抗原性多肽被肿瘤细胞表达。在一个实施例中，肿瘤相关抗原为前列腺特异性抗原(PSA)。在另一个实施例中，肿瘤相关抗原为人乳头瘤病毒(HPV)抗原。在又一个实施例中，肿瘤相关抗原为美国专利公开No.US2011/014279中描述的Her2/neu嵌合抗原，这些文献全文以引用方式并入本文。在又一个实施例中，肿瘤相关抗原是血管新生抗原。
在一个实施例中，本文所公开的肽是抗原性肽。在另一个实施例中，本文所公开的肽衍生自肿瘤抗原。在另一个实施例中，本文所公开的肽衍生自感染性疾病抗原。在另一个实施例中，本文所公开的肽衍生自自身抗原。在另一个实施例中，本文所公开的肽衍生自血管新生抗原。
在一个实施例中，本文所公开的肽衍生自的抗原来源于真菌病原体、细菌、寄生虫、蠕虫或病毒。在另一个实施例中，本文的肽所衍生自的抗原选自破伤风类毒素、来自流感病毒的血凝素分子、白喉类毒素、HIV gp120、HIV gag蛋白、IgA蛋白酶、胰岛素肽B、马铃薯粉痂病菌(Spongospora subterranea)抗原、弧菌抗原、沙门氏菌(Salmonella)抗原、肺炎球菌抗原、呼吸道合胞体病毒抗原、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)外膜蛋白、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)脲酶、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)菌毛蛋白、淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)菌毛蛋白、黑素瘤相关抗原(TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、gp-100、酪氨酸酶、MART-1、HSP-70、β-HCG)、来自HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35或HPV-45型人乳头瘤病毒的人乳头瘤病毒抗原E1和E2、肿瘤抗原CEA、突变或者其他形式的ras蛋白、突变或者其他形式的p53蛋白、Muc1、间皮素、EGFRVIII或pSA。
在其他实施例中，肽衍生自与以下疾病之一相关的抗原：霍乱、白喉、嗜血杆菌、甲型肝炎、乙型肝炎、流感、麻疹、脑膜炎、腮腺炎、百日咳、天花、肺炎球菌肺炎、脑灰质炎、狂犬病、风疹、破伤风、肺结核、伤寒、水痘-带状疱疹、百日咳、黄热病、来自爱迪生氏病的免疫原和抗原、过敏症、过敏反应、布鲁顿综合征、癌症、包括实体和血源性肿瘤、湿疹、桥本氏甲状腺炎、多肌炎、皮肌炎、1型糖尿病、获得性免疫缺陷综合征、移植排斥、例如肾、心脏、胰腺、肺、骨骼和肝脏移植物、格雷夫斯病、多内分泌自身免疫病、肝炎、显微镜下多动脉炎、结节性多动脉炎、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、恶性贫血、乳糜泻、抗体介导的肾炎、血管球性肾炎、风湿病、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、血清阴性脊椎关节病、鼻炎、Sjogren综合征、全身性硬化症、硬化性胆管炎、韦格纳氏肉芽肿、疱疹样皮炎、牛皮癣、白癜风、多发性硬化症、脑脊髓炎、吉兰-巴雷综合征、重症肌无力、兰伯特-伊顿综合征、巩膜、巩膜外层、色素层炎、慢性粘膜皮肤念珠菌病、风疹、婴儿短暂性低丙种球蛋白血症、骨髓瘤、X-连锁高IgM综合征、斯科特-奥尔德里奇综合征、共济失调性毛细血管扩张症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性中性粒细胞减少症、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血、淀粉样变性、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、疟疾circumsporozite蛋白、微生物抗原、病毒抗原、自身抗原以及李斯特菌病。
在另一个实施例中，本文所公开的肽所衍生自的抗原为肿瘤相关抗原，其在一个实施例中为以下肿瘤抗原之一：MAGE(黑素瘤相关抗原E)蛋白，例如MAGE1、MAGE 2、MAGE 3、MAGE 4、酪氨酸酶；突变体ras蛋白；突变体p53蛋白；p97黑素瘤抗原、与晚期癌症相关的ras肽或p53肽；与宫颈癌相关的HPV 16/18抗原、与乳腺癌相关的KLH抗原、与结肠直肠癌相关的CEA(癌胚抗原)、gp100、与黑素瘤相关的MART1抗原或与前列腺癌相关的PSA抗原。在另一个实施例中，用于如本文所公开的组合物和方法的抗原为黑素瘤相关抗原，其在一个实施例中为TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、gp-100、酪氨酸酶、HSP-70、β-HCG或它们的组合。本公开还考虑了本领域已知的其他肿瘤相关抗原。
在一个实施例中，肽衍生自在美国专利申请序列号12/945,386中描述的嵌合Her2抗原，该专利全文据此以引用方式并入。
在另一个实施例中，肽衍生自选自以下各项的抗原：HPV-E7(来自HPV16或HPV18菌株)、HPV-E6(来自HPV16或HPV18菌株)、Her-2/neu、NY-ESO-1、端粒酶(TERT、SCCE、CEA、LMP-1、p53、碳酸酐酶IX(CAIX)、PSMA、前列腺干细胞抗原(PSCA)、HMW-MAA、WT-1、HIV-1Gag、蛋白酶3、酪氨酸酶相关蛋白2、PSA(前列腺特异性抗原)、EGFR-III、生存素、含凋亡重复序列的杆状病毒抑制因子5(BIRC5)、LMP-1、p53、PSMA、PSCA、Muc1、PSA(前列腺特异性抗原)或其组合。
在一个实施例中，本公开的李斯特菌表达的多肽可为神经肽生长因子拮抗剂，其在一个实施例中为[D-Arg1,D-Phe5,D-Trp7,9,Leu11]物质P、[Arg6,D-Trp7,9,NmePhe8]物质P(6-11)。这些实施例和相关的实施例是本领域技术人员可理解的。
在一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含编码肿瘤相关抗原的核酸分子，其中该抗原包含HPV-E7蛋白。在一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含编码HPV-E7蛋白的核酸分子。
在一个实施例中，整个E7蛋白或其片段融合至LLO蛋白或其截短或肽、ActA蛋白或其截短或肽或含PEST样序列肽，以生成本公开的组合物和方法的重组多肽或肽。所用的E7蛋白(作为整体或作为片段的来源)在另一个实施例中具有序列
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ ID No:20)。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:20的同源物。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:20的变体。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:20的异构体。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:20的片段。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:20的同源物的片段。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:20的变体的片段。在另一个实施例中，该E7蛋白是SEQ ID No:20的异构体的片段。
在另一个实施例中，E7蛋白的序列为：
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ(SEQ ID No:21)。在另一个实施例中，该E6蛋白是SEQ IDNo:21的同源物。在另一个实施例中，该E6蛋白是SEQ ID No:21的变体。在另一个实施例中，该E6蛋白是SEQ ID No:21的异构体。在另一个实施例中，该E6蛋白是SEQ ID No:21的片段。在另一个实施例中，该E6蛋白是SEQ ID No:21的同源物的片段。在另一个实施例中，该E6蛋白是SEQ ID No:21的变体的片段。在另一个实施例中，该E6蛋白是SEQ ID No:21的异构体的片段。
在另一个实施例中，该E7蛋白具有以下GenBank条目之一所示的序列：M24215(SEQID NO:83)、NC_004500(SEQ ID NO:84)、V01116(SEQ ID NO:85)、X62843(SEQ ID NO:86)或M14119(SEQ ID NO:87)。在另一个实施例中，该E7蛋白为来自以上GenBank条目之一的序列的同源物。在另一个实施例中，该E7蛋白为来自以上GenBank条目之一的序列的变体。在另一个实施例中，该E7蛋白为来自以上GenBank条目之一的序列的异构体。在另一个实施例中，该E7蛋白为来自以上GenBank条目之一的序列的片段。在另一个实施例中，该E7蛋白为来自以上GenBank条目之一的序列的同源物的片段。在另一个实施例中，该E7蛋白为来自以上GenBank条目之一的序列的变体的片段。在另一个实施例中，该E7蛋白为来自以上GenBank条目之一的序列的异构体的片段。
在一个实施例中，该HPV抗原为HPV 16。在另一个实施例中，该HPV为HPV-18。在另一个实施例中，该HPV选自HPV-16和HPV-18。在另一个实施例中，该HPV为HPV-31。在另一个实施例中，该HPV为HPV-35。在另一个实施例中，该HPV为HPV-39。在另一个实施例中，该HPV为HPV-45。在另一个实施例中，该HPV为HPV-51。在另一个实施例中，该HPV为HPV-52。在另一个实施例中，该HPV为HPV-58。在另一个实施例中，该HPV为高风险HPV型。在另一个实施例中，该HPV为粘膜HPV型。
在一个实施例中，HPV E6来自HPV-16。在另一个实施例中，HPV E7来自HPV-16。在另一个实施例中，HPV-E6来自HPV-18。在另一个实施例中，HPV-E7来自HPV-18。在另一个实施例中，在用于治疗或改善HPV相关疾病、障碍或症状的本公开的组合物和方法中，代替E7抗原或作为其补充，使用HPV E6抗原。在另一个实施例中，代替HPV-18E6和E7或与之组合，使用HPV-16E6和E7。在这样的实施例中，重组李斯特菌可从染色体表达HPV-16E6和E7并从质粒表达HPV-18E6和E7，或反之亦然。在另一个实施例中，HPV-16E6和E7抗原以及HPV-18E6和E7抗原从存在于本文公开的重组李斯特菌中的质粒表达。在另一个实施例中，HPV-16E6和E7抗原以及HPV-18E6和E7抗原从本文公开的重组李斯特菌的染色体表达。在另一个实施例中，HPV-16E6和E7抗原以及HPV-18E6和E7抗原在以上实施例的任何组合中表达，包括其中得自各HPV株的各E6和E7抗原从质粒或染色体表达的实施例。
在一个实施例中，本文公开的重组李斯特菌菌株包含编码肿瘤相关抗原的核酸分子，其中肿瘤相关抗原包含Her-2/neu肽。在一个实施例中，肿瘤相关抗原包含Her-2/neu抗原。在一个实施例中，Her-2/neu肽包含嵌合Her-2/neu抗原(cHer-2)。
在一个实施例中，减毒的营养缺陷型李斯特菌菌株基于李斯特菌疫苗载体，该载体由于毒力基因actA的缺失而减毒，并且由于dal基因的互补而维持用于Her2/neu的体内和体外表达的质粒。在一个实施例中，李斯特菌菌株表达和分泌融合到李斯特菌溶血素O(LLO)的前441个氨基酸的嵌合Her2/neu蛋白。在另一个实施例中，李斯特菌是在dal、dat和actA内源性基因中具有突变的dal/dat/actA李斯特菌。在另一个实施例中，突变是突变基因的缺失、截短或失活。在另一个实施例中，李斯特菌菌株发挥强烈的和抗原特异性的抗肿瘤应答，在转基因动物中能够打破对HER2/neu的耐受性。在另一个实施例中，dal/dat/actA菌株是高度减毒的，并且具有比前一代李斯特菌疫苗更高的安全谱，因为它能更迅速地从免疫小鼠的脾脏清除。在另一个实施例中，李斯特菌菌株使转基因动物中的肿瘤发作延缓期比Lm-LLO-ChHer2(该疫苗的抗生素抗性和毒性更强的形式)更长，参见USSN 12/945,386；美国公开号2011/0142791，这些文献全文以引用方式并入本文。在另一个实施例中，李斯特菌菌株使肿瘤内调节性T细胞(Treg)显著减少。在另一个实施例中，LmddA疫苗处理的肿瘤中Treg频率的下降使肿瘤内CD8/Treg比率升高，暗示在LmddA疫苗免疫后可获得更有利的肿瘤微环境。在一个实施例中，本公开提供包含融合至Her-2嵌合蛋白或融合至其片段的LLO蛋白的N末端片段的重组多肽。在一个实施例中，本公开提供由融合至Her-2嵌合蛋白或融合至其片段的LLO蛋白的N末端片段组成的重组多肽。在该实施例中，异源抗原是Her-2嵌合蛋白或其片段。
在另一个实施例中，本文公开的方法和组合物的Her-2嵌合蛋白是人Her-2嵌合蛋白。在另一个实施例中，Her-2嵌合蛋白是小鼠Her-2嵌合蛋白。在另一个实施例中，Her-2嵌合蛋白是大鼠Her-2嵌合蛋白。在另一个实施例中，Her-2嵌合蛋白是灵长类Her-2嵌合蛋白。在另一个实施例中，Her-2蛋白是本领域已知的人或任何其他动物物种的Her-2嵌合蛋白或它们的组合。
在另一个实施例中，Her-2蛋白是称为“HER-2/neu”、“Erbb2”、“v-erb-b2”、“c-erb-b2”、“neu”或“cNeu”的蛋白。
在一个实施例中，Her2-neu嵌合蛋白具有Her2/neu抗原的两个胞外片段和一个胞内片段，该抗原示出癌基因的MHC I类表位簇，其中在另一个实施例中，嵌合蛋白具有3个H2Dq和至少17个Her2/neu抗原的标绘的人MHC I类表位(片段EC1、EC2和IC1)(图20A)。在另一个实施例中，嵌合蛋白具有至少13个标绘的人MHC I类表位(片段EC2和IC1)。在另一个实施例中，嵌合蛋白具有至少14个标绘的人MHC I类表位(片段EC1和IC1)。在另一个实施例中，嵌合蛋白具有至少9个标绘的人MHC I类表位(片段EC1和IC2)。在另一个实施例中，Her2-neu嵌合蛋白融合到非溶血李斯特菌溶血素O(LLO)。在另一个实施例中，Her2-neu嵌合蛋白融合到单核细胞增多性李斯特菌的李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白的前441个氨基酸，并且由单核细胞增多性李斯特菌减毒营养缺陷型菌株LmddA表达和分泌。在另一个实施例中，来自本文公开的减毒营养缺陷型菌株(表达嵌合Her2/neu抗原/LLO融合蛋白)的融合蛋白tLLO-ChHer2的表达和分泌与体外生长8小时后TCA沉淀细胞培养上清液中Lm-LLO-ChHer2的表达和分泌相当(图20B)。
在一个实施例中，在未暴露的动物(animal)或不相关李斯特菌疫苗注射的小鼠中未检测到CTL活性(图21A)。而在另一个实施例中，本文公开的减毒营养缺陷型菌株能够通过得自野生型FVB/N小鼠的脾细胞刺激IFN-γ的分泌(图21B和21C)。
在另一个实施例中，Her-2嵌合蛋白由以下SEQ ID NO:22所示的核酸序列编码
gagacccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaacctggaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggaggtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctgcggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaatggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggagctgcagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccccagctctgctaccaggacacgattttgtggaagaatatccaggagtttgctggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttctgccggagagctttgatggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagcagctccaagtgtttgagactctggaagagatcacaggttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcctgacctcagcgtcttccagaacctgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcctactcgctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaactgggcagtggactggccctcatccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtgccctgggaccagctctttcggaacccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggccagaggacgagtgtgtgggcgagggcctggcctgccaccagctgtgcgcccgagggcagcagaagatccggaagtacacgatgcggagactgctgcaggaaacggagctggtggagccgctgacacctagcggagcgatgcccaaccaggcgcagatgcggatcctgaaagagacggagctgaggaaggtgaaggtgcttggatctggcgcttttggcacagtctacaagggcatctggatccctgatggggagaatgtgaaaattccagtggccatcaaagtgttgagggaaaacacatcccccaaagccaacaaagaaatcttagacgaagcatacgtgatggctggtgtgggctccccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacagcttatgccctatggctgcctcttagactaa(SEQ ID NO:22)。
在另一个实施例中，Her-2嵌合蛋白具有以下序列：
在一个实施例中，本文公开的方法和组合物的Her2嵌合蛋白或其片段不包括其信号序列。在另一个实施例中，由于信号序列的高疏水性，信号序列的省去使Her2片段能够在李斯特菌中成功表达。
在另一个实施例中，本文所公开的方法和组合物的Her2嵌合蛋白的片段不包括其跨膜域(TM)。在一个实施例中，由于TM的高疏水性，TM的省去使Her2片段能够在李斯特菌中成功表达。
据报道，当基于小片段李斯特菌的疫苗或曲妥单抗(针对位于Her2/neu抗原的胞外域的表位的单克隆抗体)靶向耐药肿瘤时，致癌蛋白Her2/neu中的点突变或氨基酸缺失介导了这些肿瘤细胞的治疗。本文描述了基于嵌合Her2/neu的组合物，该组合物具有Her2/neu抗原的两个胞外片段和一个胞内片段，该抗原示出癌基因的MHC I类表位簇。具有3个H2Dq和至少17个Her2/neu抗原的标绘的人MHC I类表位的该嵌合蛋白融合到单核细胞增多性李斯特菌李斯特菌溶血素O蛋白的前441个氨基酸，且由单核细胞增多性李斯特菌减毒菌株LmddA表达和分泌。
在另一个实施例中，该肿瘤相关抗原是血管新生抗原。在另一个实施例中，该血管新生抗原在肿瘤新生血管中的激活周细胞和周细胞二者上表达，在另一个实施例中，它与体内新血管形成相关。在另一个实施例中，该血管新生抗原是HMW-MAA。在另一个实施例中，该血管新生抗原是本领域已知的抗原，并且在WO2010/102140中提供，该专利以引用方式并入本文。
在一个实施例中，通过本领域充分描述的方法确定蛋白和/或肽对本文列出的任何氨基酸序列的同源性，包括免疫印迹分析，或通过建立的方法采用多种可用软件包中的任一种通过氨基酸序列的计算机算法分析进行。例如，这些软件包中的一些可包括FASTA、BLAST、MPsrch或Scanps软件包，并且可利用Smith和Waterman算法，和/或整体/局部或BLOCKS比对用于分析。
在一个实施例中，使用同源重组将包含本文所公开的微基因核酸构建体或编码含有融合至本文所公开的一种或多种肽的免疫原性多肽的融合蛋白的核酸分子的质粒整合进李斯特菌染色体。用于同源重组的技术是本领域熟知的，并且例如在Baloglu S,BoyleSM等人(Immune responses of mice to vaccinia virus recombinants expressingeither Listeriamonocytogenes partial listeriolysin or Brucella abortusribosomal L7/L12protein.Vet Microbiol 2005,109(1-2):11-7)和Jiang LL,Song HH等人(Characterization of a mutant Listeriamonocytogenes strain expressing greenfluorescent protein.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)2005,37(1):19-24)中有所描述。在另一个实施例中，如美国专利No.6,855,320所述进行同源重组。在这种情况下，通过hly启动子控制下的E7基因的染色体整合，制备表达E7的重组Lm菌株，并且包含hly信号序列以确保基因产物的分泌，从而产生称作Lm-AZ/E7的重组体。在另一个实施例中，将温敏质粒用于选择重组体。
在另一个实施例中，该构建体或核酸分子采用转座子插入整合进李斯特菌染色体。用于转座子插入的技术在本领域是熟知的，尤其是Sun等人(Infection and Immunity1990,58:3770-3778)在DP-L967的构建中所描述的。在另一个实施例中，转座子诱变具有可形成稳定的基因组插入突变体的优点，但缺点是外源基因在基因组中的插入位置是未知的。
在一个实施例中，本文所公开的载体是本领域中已知的载体，包括质粒或噬菌体载体。在另一个实施例中，使用包含噬菌体整合位点的噬菌体载体将该构建体或核酸分子整合进李斯特菌染色体(Lauer P、Chow MY等人，Construction,characterization,anduse of two Listeriamonocytogenes site-specific phage integration vectors.JBacteriol 2002；184(15):4177-86)。在该方法的某些实施例中，使用噬菌体(例如U153或PSA李斯特噬菌体)的整合酶基因和连接位点将异源基因插入对应的连接位点，该连接位点可以是基因组中的任何适当的位点(例如comK，或arg tRNA基因的3’端)。在另一个实施例中，内源性原噬菌体在构建体或异源基因整合之前从所利用的连接位点解离。在另一个实施例中，这种方法产生单拷贝的整合体。在另一个实施例中，本公开还包括用于临床应用的基于噬菌体的染色体整合系统，其中可使用必需酶(包括但不限于d-丙氨酸消旋酶)营养缺陷的宿主菌株，例如Lmdal(-)dat(-)。在另一个实施例中，为了避免“噬菌体解离步骤”，使用基于PSA的噬菌体整合系统。这在另一个实施例中需要通过抗生素持续选择以维持整合基因。因此，在另一个实施例中，本发明使得能建立基于噬菌体的染色体整合系统，该系统不需要以抗生素选择。作为替代，可补充营养缺陷型宿主菌株。
在另一个实施例中，本文所公开的载体是本领域中已知的递送载体，包括细菌递送载体、病毒载体递送载体、肽疫苗递送载体和DNA疫苗递送载体。本领域技术人员将了解的是，术语“递送载体”是指能够递送一个或多个新表位或包含一个或多个新表位的肽并且在某些实施例内能够在宿主细胞中表达这些新表位或肽的构建体。此类载体的代表性例子包括病毒载体、核酸表达载体、裸DNA和某些真核细胞(例如，生产细胞)。在一个实施例中，递送载体不同于质粒或噬菌体载体。在另一个实施例中，本发明的递送载体和质粒或噬菌体载体是相同的。
在如本文所公开的方法和组合物的一个实施例中，术语“重组位点”或“位点特异性重组位点”是指核酸分子中的碱基序列，该序列可被重组酶(在一些情况下连同相关蛋白)识别，该重组酶介导位于重组位点侧翼的核酸区段的交换或切除。重组酶及相关蛋白统称为“重组蛋白”，参见例如Landy,A.,(Current Opinion in Genetics&Development)3:699-707；1993)。
“噬菌体表达载体”、“噬菌体载体”或“噬粒”是指用于在体外或体内在任何细胞(包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞)中组成型或诱导型表达本文所公开的方法和组合物的核酸序列的目的的任何基于噬菌体的重组表达系统。噬菌体表达载体通常既可在细菌细胞中繁殖，又可在适合条件下产生噬菌体颗粒。该术语还包括线状或环状表达系统，并涵盖保持游离或者整合进宿主细胞基因组的两种基于噬菌体的表达载体。
在一个实施例中，如本文所用的术语“可操作地连接”意味着将转录和翻译调控核酸相对于任何编码序列以使得引发转录的方式定位。一般来讲，这意味着将启动子和转录引发或起始序列定位在编码区的5'。
在一个实施例中，“开放阅读框”或“ORF”为生物体基因组的一部分，其含有可潜在地编码蛋白的碱基序列。在另一个实施例中，ORF的开始和结束端不等同于mRNA的末端，但它们通常包含在该mRNA内。在一个实施例中，ORF位于基因的开始密码子序列(起始密码子)和结束密码子序列(终止密码子)之间。因此，在一个实施例中，可操作地整合进基因组中与内源多肽一起作为开放阅读框的核酸分子为已整合进基因组中与内源多肽处于相同开放阅读框中的核酸分子。
在一个实施例中，本公开提供包含接头序列的融合多肽。在一个实施例中，“接头序列”是指连接两个异源多肽或其片段或域的氨基酸序列。一般来讲，如本文所用，接头是共价连接多肽以形成融合多肽的氨基酸序列。接头通常包含在从展示载体移除报告基因后从剩余重组信号翻译的氨基酸，以产生包含由开放阅读框编码的氨基酸序列和展示蛋白的融合蛋白。如本领域技术人员将了解是，接头可包含另外的氨基酸，诸如甘氨酸和其他小中性氨基酸。
在一个实施例中，如本文所用的“内源性”描述已在参考生物体内发育或起源的或因参考生物体内的成因而产生的某物。在另一个实施例中，内源性是指天然的。
在另一个实施例中，“稳定保持”是指核酸分子或质粒在不存在选择(例如抗生素选择)的情况下保持10代，而没有可检测的损失。在另一个实施例中，周期为15代。在另一个实施例中，周期为20代。在另一个实施例中，周期为25代。在另一个实施例中，周期为30代。在另一个实施例中，周期为40代。在另一个实施例中，周期为50代。在另一个实施例中，周期为60代。在另一个实施例中，周期为80代。在另一个实施例中，周期为100代。在另一个实施例中，周期为150代。在另一个实施例中，周期为200代。在另一个实施例中，周期为300代。在另一个实施例中，周期为500代。在另一个实施例中，周期为更多代。在另一个实施例中，该核酸分子或质粒在体外(例如培养物中)稳定保持。在另一个实施例中，该核酸分子或质粒在体内稳定保持。在另一个实施例中，该核酸分子或质粒在体外和体内都稳定保持。
在另一个实施例中，本文公开一种重组李斯特菌菌株，其包含作为具有内源ActA序列的开放阅读框可操作地整合进李斯特菌基因组的核酸分子。在另一个实施例中，如本文所公开的方法和组合物的重组李斯特菌菌株包含游离型表达质粒载体，该质粒载体包含编码融合蛋白的核酸分子，该融合蛋白包含融合到ActA或截短的ActA的抗原。在一个实施例中，抗原的表达和分泌受actA启动子和ActA信号序列的控制，并且其作为与ActA的1-233号氨基酸(截短的ActA或tActA)的融合体而表达。在另一个实施例中，截短的ActA由野生型ActA蛋白的前390个氨基酸组成，如美国专利No.7,655,238中所述，该专利以引用方式全文并入本文。在另一个实施例中，截短的ActA是ActA-N100或其修饰型式(称为ActA-N100*)，其中PEST基序已缺失，并且含有非保守性QDNKR取代，如美国专利公布序列号2014/0186387中所述。
在一个实施例中，本文所公开的片段为功能性片段。在另一个实施例中，“功能性片段”为当向受试者单独施用或者以本文所公开的疫苗组合物施用时能够引起免疫应答的免疫原性片段。在另一个实施例中，功能性片段具有生物学活性，如技术人员所了解的并且如本文所进一步公开。
在一个实施例中，本文所公开的李斯特菌菌株为减毒菌株。在另一个实施例中，本文所公开的李斯特菌菌株为重组菌株。在另一个实施例中，本文所公开的李斯特菌菌株为活的减毒重组李斯特菌菌株。
本文所公开的方法和组合物的重组李斯特菌菌株在另一个实施例中是重组单核细胞增多性李斯特菌菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是重组西尔李斯特菌(Listeria seeligeri)菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是重组格雷李斯特菌(Listeria grayi)菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是重组伊万诺夫李斯特菌(Listeria ivanovii)菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是重组默里李斯特菌(Listeria murrayi)菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是重组威耳逊李斯特菌(Listeria welshimeri)菌株。在另一个实施例中，该李斯特菌菌株是本领域已知的任何其他李斯特菌属菌种的重组菌株。
在另一个实施例中，本文所公开的重组李斯特菌菌株已经在动物宿主中传代。在另一个实施例中，该传代让该菌株作为疫苗载体的效能最佳化。在另一个实施例中，该传代稳定李斯特菌菌株的免疫原性。在另一个实施例中，该传代稳定李斯特菌菌株的毒力。在另一个实施例中，该传代增强李斯特菌菌株的免疫原性。在另一个实施例中，该传代增强李斯特菌菌株的毒力。在另一个实施例中，该传代除去李斯特菌菌株的不稳定亚株。在另一个实施例中，该传代降低李斯特菌菌株的不稳定亚株的普遍性。在另一个实施例中，李斯特菌菌株包含编码含抗原重组肽的基因的基因组插入。在另一个实施例中，李斯特菌菌株携带包含编码含抗原重组肽的基因的质粒。在另一个实施例中，该传代如本文所述进行。在另一个实施例中，该传代通过本领域已知的任何其他方法进行。
在另一个实施例中，本文公开的重组核酸可操作地连接至驱动编码肽在李斯特菌菌株中表达的启动子/调控序列。可用于驱动基因的组成型表达的启动子/调控序列是本领域熟知的，并且包括但不限于例如李斯特菌的PhlyA、PActA和p60启动子，链球菌(Streptococcus)bac启动子，灰色链霉菌(Streptomyces griseus)sgiA启动子以及苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)phaZ启动子。
在另一个实施例中，编码本文所公开的肽的核酸的诱导型和组织特异性表达通过将编码该肽的核酸置于诱导型或组织特异性启动子/调控序列的调控下实现。可用于此目的的组织特异性或诱导型启动子/调控序列的例子包括但不限于MMTV LTR诱导型启动子和SV40晚期增强子/启动子。在另一个实施例中，采用响应于诱导剂(诸如金属、糖皮质素等等)而诱导的启动子。因此，将了解是，本发明包括使用任何已知或未知的并且能够驱动与其可操作地连接的所需蛋白的表达的启动子/调控序列。技术人员将了解是，术语“异源的”涵盖源自与参考物种不同的物种的核酸、氨基酸、肽、多肽或蛋白。因此，例如，表达异源多肽的李斯特菌菌株在一个实施例中将表达不是该李斯特菌菌株天然的或内源性的多肽，或在另一个实施例中，通常不由该李斯特菌菌株表达的多肽，或在另一个实施例中，来自该李斯特菌菌株之外的来源的多肽。在另一个实施例中，异源的可用于描述源自同一物种内的不同生物体的某物。在另一个实施例中，异源抗原由李斯特菌的重组菌株表达，并在哺乳动物细胞被该重组菌株感染后加工且呈递到细胞毒性T细胞。在另一个实施例中，由李斯特菌菌种表达的异源抗原不需要与肿瘤细胞或传染原中对应的未修饰的抗原或蛋白精确匹配，只要其导致可识别在哺乳动物中天然表达的未修饰抗原或蛋白的T细胞应答即可。术语异源抗原在本文可称为“抗原性多肽”、“异源蛋白”、“异源蛋白抗原”、“蛋白抗原”、“抗原”等。
技术人员将了解的是，术语“游离型表达载体”涵盖这样的核酸质粒载体，其可以为线性的或环状的，并且其通常为双链的形式且在染色体外，因为其存在于宿主细菌或细胞的细胞质中，而不是整合进细菌或细胞的基因组。在一个实施例中，游离型表达载体包含所关注的基因。在另一个实施例中，游离型载体在细菌细胞质中保持多个拷贝，从而导致所关注的基因的扩增，并在另一个实施例中，在必要时提供病毒反式作用因子。在另一个实施例中，游离型表达载体在本文可被称为质粒。在另一个实施例中，“整合型质粒”包含这样的序列，该序列将该质粒的插入或所携带的所关注基因的插入靶向宿主基因组内。在另一个实施例中，插入的所关注基因不中断，或不受到通常因整合进细胞DNA中而发生的调控约束。在另一个实施例中，存在所插入的异源基因不导致细胞自身重要区域的重排或中断。在另一个实施例中，在稳定的转染程序中，使用游离型载体通常导致比使用染色体整合质粒更高的转染效率(Belt,P.B.G.M.等人(1991)Efficient cDNAcloning by directphenotypic correction of a mutant human cell line(HPRT2)using an Epstein-Barrvirus-derived cDNA expression plasmid vector.Nucleic Acids Res.19,4861-4866；Mazda,O.等人(1997)Extremely efficient gene transfection into lympho-hematopoietic cell lines by Epstein-Barr virus-basedvectors.J.Immunol.Methods 204,143-151)。在一个实施例中，如本文所公开的方法和组合物的游离型表达载体可通过用于将DNA分子递送到细胞的多种方法中的任一种递送到体内、离体、体外细胞。质粒载体也可以单独地或以增强向受试者细胞递送的药物组合物的形式递送。
在一个实施例中，术语“融合”是指通过共价键合可操作地连接。在一个实施例中，该术语包括(核酸序列或其开放阅读框的)重组融合。在另一个实施例中，该术语包括化学偶联。
在一个实施例中，“转化”是指将细菌细胞工程化为吸收质粒或其他异源性DNA分子。在另一个实施例中，“转化”是指将细菌细胞工程化为表达质粒的基因或其他异源DNA分子。
在另一个实施例中，使用接合将遗传物质和/或质粒引入细菌中。接合的方法是本领域熟知的，并例如在Nikodinovic J.等人(A second generation snp-derivedEscherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that is generallytransferable by conjugation.Plasmid.2006年11月；56(3):223-7)和Auchtung JM等人(Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellularsignaling and the global DNA damage response.Proc Natl Acad Sci U S A.2005年8月30日；102(35):12554-9)中有所描述。
在一个实施例中，术语“减毒”是指细菌在动物中的致病能力降低。换句话讲，减毒李斯特菌菌株的病原学特性与野生型李斯特菌相比已降低，虽然减毒李斯特菌能够在培养中生长和维持。例如，使用减毒李斯特菌对Balb/c小鼠的静脉内接种，50％的接种动物存活所处的致死剂量(LD50)优选地比野生型李斯特菌的LD50升高至少约10倍，更优选地至少约100倍，更优选地至少约1,000倍，甚至更优选地至少约10,000倍，最优选地至少约100,000倍。李斯特菌的减毒菌株因此是不杀死施用该菌株的动物的菌株，或是仅当施用的细菌数远高于杀死相同动物所需的野生型非减毒细菌数时才杀死动物的菌株。减毒细菌还应被解释为意指不能够在一般环境中复制的细菌，因为在该环境中不存在其生长所需的营养物。因此，该细菌在提供了所需营养物的受控环境中以受限方式复制。本文所公开的减毒菌株因此是环境安全的，因为它们不能以不可控制的方式复制。
组合物
在一个实施例中，本文所公开的组合物是免疫原性组合物。在一个实施例中，本文所公开的组合物诱导强烈的干扰素-γ先天刺激，该干扰素-γ在一个实施例中具有抗血管新生性质。在一个实施例中，本文所公开的李斯特菌诱导强烈的干扰素-γ先天刺激，该干扰素-γ在一个实施例中具有抗血管新生性质(Dominiecki等人,Cancer ImmunolImmunother.2005年5月；54(5):477-88.2004年10月6日电子版，以引用方式全文并入本文；Beatty和Paterson,J.Immunol.2001年2月15日；166(4):2276-82，以引用方式全文并入本文)。在一个实施例中，李斯特菌的抗血管新生性质通过CD4+T细胞介导(Beatty和Paterson，2001)。在另一个实施例中，李斯特菌的抗血管新生性质通过CD8+T细胞介导。在另一个实施例中，因李斯特菌疫苗接种导致的IFN-γ分泌由NK细胞、NKT细胞、Th1CD4+ T细胞、TC1CD8+ T细胞或它们的组合介导。
在另一个实施例中，本文公开的组合物的施用诱导一种或多种抗血管新生蛋白或因子的生成。在一个实施例中，该抗血管新生蛋白为IFN-γ。在另一个实施例中，该抗血管新生蛋白为色素上皮衍生因子(PEDF)、血管新生抑制素、内皮抑素、fms样酪氨酸激酶(sFlt)-1或可溶性内皮因子(sEng)。在一个实施例中，本文所公开的李斯特菌参与抗血管新生因子的释放，由此，在一个实施例中，除了作为用于将抗原引入受试者的质粒载体之外还具有治疗作用。
如本文所公开的方法和组合物所诱导的免疫应答在另一个实施例中为T细胞应答。在另一个实施例中，免疫应答包括T细胞应答。在另一个实施例中，应答为CD8+ T细胞应答。在另一个实施例中，该应答包括CD8+ T细胞应答。每种可能性代表了如本文所公开的独立实施例。
在另一个实施例中，施用本文所公开的组合物增加抗原特异性T细胞的数量。在另一个实施例中，施用组合物激活T细胞上的共刺激受体。在另一个实施例中，施用组合物诱导记忆和/或效应T细胞的增殖。在另一个实施例中，施用组合物增加T细胞的增殖。每种可能性代表了如本文所公开的独立实施例。
如全文所用，术语“组合物”和“免疫原性组合物”可互换使用，均具有相同的含义和特性。在一个实施例中，用于同时或顺序施用各组分的包含重组李斯特菌菌株并且还包含抗体的本文公开的免疫原性组合物也称为“组合疗法”。技术人员应当理解的是，组合疗法也可以包括另外的组分、抗体、疗法等。在一些实施例中，术语“药物组合物”是指适用于药物用途，例如给需要的受试者施用的组合物。在一个实施例中，本公开提供一种药物组合物，其包含本文所公开的减毒李斯特菌菌株和药学上可接受的载剂。在另一个实施例中，本公开提供一种药物组合物，其包含本文所公开的DNA疫苗和药学上可接受的载剂。在另一个实施例中，本公开提供一种药物组合物，其包含本文所公开的牛痘病毒株或病毒样颗粒和药学上可接受的载剂。在另一个实施例中，本公开提供一种药物组合物，其包含本文所公开的肽和药学上可接受的载剂。
在另一个实施例中，本公开提供了一种重组疫苗载体，其包含本文所公开的核苷酸分子。在另一个实施例中，载体是表达载体。在另一个实施例中，表达载体是质粒。在另一个实施例中，本公开提供了一种用于将本文所公开的核苷酸分子引入到细胞中的方法。用于构建和利用重组载体的方法是本领域中熟知的并且描述于例如Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和Brent等人(2003,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NewYork)中。在另一个实施例中，该载体为细菌载体。在其他实施例中，载体选自沙门氏菌(Salmonella sp.)、志贺氏菌(Shigella sp.)、BCG、单核细胞增多性李斯特菌、大肠杆菌以及戈氏链球菌(S.gordonii)。在另一个实施例中，由经修饰以逃避吞噬溶酶体融合并生存在细胞的细胞质中的重组细菌载体来递送一种或多种肽。在另一个实施例中，载体为病毒载体。在其他实施例中，载体选自牛痘病毒、禽痘病毒、腺病毒、AAV、牛痘病毒NYVAC、经修饰的安卡拉株牛痘病毒(MVA)、塞姆利基森林病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、疱疹病毒以及逆转录病毒。在另一个实施例中，载体为裸DNA载体。在另一个实施例中，载体为本领域已知的任何其他载体。
本发明的组合物可用于本发明的方法，以便引发受试者中的增强的抗肿瘤T细胞应答，以便抑制受试者中的肿瘤介导的免疫抑制，或用于提高受试者的脾脏和肿瘤中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率，或它们的任何组合。
在另一个实施例中，包含本文公开的李斯特菌菌株的组合物还包含佐剂。在一个实施例中，本文所公开的组合物还包含佐剂。本文所公开的方法和组合物所用的佐剂在另一个实施例中为粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白。在另一个实施例中，该佐剂包含GM-CSF蛋白。在另一个实施例中，该佐剂为编码GM-CSF的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂为包含编码GM-CSF的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂为皂苷QS21。在另一个实施例中，该佐剂包含皂苷QS21。在另一个实施例中，该佐剂为单磷酰脂质A。在另一个实施例中，该佐剂包含单磷酰脂质A。在另一个实施例中，该佐剂为SBAS2。在另一个实施例中，该佐剂包含SBAS2。在另一个实施例中，该佐剂为含有未甲基化的CpG的寡核苷酸。在另一个实施例中，该佐剂包含含有未甲基化的CpG的寡核苷酸。在另一个实施例中，该佐剂为免疫刺激性细胞因子。在另一个实施例中，该佐剂包含免疫刺激性细胞因子。在另一个实施例中，该佐剂为编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂包含编码免疫刺激性细胞因子的核苷酸分子。在另一个实施例中，该佐剂为或包含刺糖苷(quillglycoside)。在另一个实施例中，该佐剂为或包含细菌有丝分裂原。在另一个实施例中，该佐剂为或包含细菌毒素。在另一个实施例中，该佐剂为或包含本领域已知的任何其他佐剂。
在一个实施例中，本发明的免疫源性组合物包含重组李斯特菌菌株，该菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。在另一个实施例中，本发明的免疫源性组合物包含重组李斯特菌菌株，该重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框。
在一个实施例中，本发明的免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，该重组李斯特菌菌株包含核酸分子，所述核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中所述融合多肽包含融合到异源抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，所述组合物还包含抗体或其片段。在另一个实施例中，所述抗体或其片段包括多克隆抗体、单克隆抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、单链抗体或其任何组合。
在一个实施例中，本发明的免疫原性组合物包含本文所公开的重组李斯特菌菌株，所述组合物还包含抗体或其片段。在另一个实施例中，所述抗体或其片段包括多克隆抗体、单克隆抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、单链抗体或其任何组合。
在另一个实施例中，本发明的免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，所述组合物还包含抗体或其片段。在另一个实施例中，所述抗体或其片段包括多克隆抗体、单克隆抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、单链抗体或其任何组合。
在一些实施例中，术语“抗体”是指完整分子以及其功能片段，在本文中也称为“抗原结合片段”，诸如能够与本文所述的所需靶标特异性相互作用，例如阻断检查点抑制剂的结合的Fab、F(ab’)2和Fv。在另一个实施例中，抗体或其功能性片段包括免疫检查点抑制剂拮抗剂。在另一个实施例中，抗体或其功能性片段包括抗-PD-L1/PD-L2抗体或其片段。在另一个实施例中，抗体或其功能性片段包括抗-PD-1抗体或其片段。在另一个实施例中，抗体或其功能性片段包括抗-CTLA-4抗体或其片段。在另一个实施例中，抗体或其功能性片段包括抗-B7-H4抗体或其片段。
在一些实施例中，该抗体片段包括：(1)Fab，即包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段，它可通过用木瓜蛋白酶消化全抗体以生成完整轻链和一条重链的一部分来制备；(2)Fab’，即这样的抗体分子的片段：其可通过用胃蛋白酶处理全抗体，然后还原，以生成完整轻链和重链的一部分来获得；每个抗体分子获得两个Fab’片段；(3)(Fab’)2，即这样的抗体的片段：其可通过用胃蛋白酶处理全抗体，然后不用还原来获得；F(ab’)2是两个Fab’片段通过两个二硫键保持在一起形成的二聚体；(4)Fv，即包含轻链可变区和重链可变区的基因工程片段，所述轻链可变区和重链可变区以两条链表达；或(5)单链抗体(”SCA”)，即包含轻链可变区和重链可变区的基因工程分子，所述轻链可变区和重链可变区通过合适的多肽接头连接为基因融合的单链分子。
这些片段的制备方法是本领域已知的。(参见例如Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1988，该文献以引用方式并入本文)。
在一些实施例中，抗体片段可通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵细胞培养物或其他蛋白表达系统)中表达编码该片段的DNA来制备。
在一些实施例中，抗体片段可通过常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全抗体获得。例如，抗体片段可通过用胃蛋白酶对抗体进行酶裂解，从而得到以F(ab’)2表示的5S片段来制备。该片段可使用硫醇还原剂，以及任选地使用从二硫键的裂解获得的巯基基团的封端基团进一步裂解，以生成3.5S Fab’单价片段。或者，使用胃蛋白酶进行酶裂解直接生成两个单价Fab’片段和Fc片段。这些方法例如由Goldenberg在美国专利No.4,036,945和4,331,647以及其中包含的参考文献中进行了描述，这些专利的全文据此以引用方式并入。另见Porter,R.R.,Biochem.J.,73:119-126,1959。只要片段结合到由完整抗体识别的抗原，也可使用裂解抗体的其他方法，诸如分离重链以形成单价轻链-重链片段，进一步裂解片段，或其他酶学、化学或基因技术。
Fv片段包含VH和VL链的缔合。该缔合可以是非共价的，如在Inbar等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 69:2659-62,1972中所述。或者，可变链可通过分子间二硫键连接，或通过化合物诸如戊二醛交联。优选地，Fv片段包含通过肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(sFv)通过构建包含DNA序列的结构基因来制备，该DNA序列编码通过寡核苷酸连接的VH和VL域。该结构基因插入表达载体，随后将该表达载体引入宿主细胞诸如大肠杆菌。重组宿主细胞合成具有桥接两个V域的接头肽的单条多肽链。sFv的制备方法例如在Whitlow和Filpula,Methods,2:97-105,1991；Bird等人,Science 242:423-426,1988；Pack等人,Bio/Technology 11:1271-77,1993；以及Ladner等人的美国专利No.4,946,778中有所描述，这些文献全文据此以引用方式并入。
抗体片段的另一种形式是编码单互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可通过构建编码所关注的抗体的CDR的基因获得。这样的基因例如使用聚合酶链式反应合成产抗体细胞的RNA的可变区来制备。参见例如Larrick和Fry,Methods,2:106-10,1991。
在一些实施例中，如本文所述的抗体或片段可包括抗体的“人源化形式”。在一些实施例中，术语“抗体的人源化形式”是指非人(如鼠科动物)抗体，它是免疫球蛋白的嵌合分子、免疫球蛋白链或其包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中形成受体的互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔子的CDR的残基替代。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人残基替代。人源化抗体还可包含既不存在于受体抗体也不存在于导入CDR或框架序列中的残基。一般来讲，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个且通常两个可变域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些FR区。最佳地，人源化抗体还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白恒定区的至少一部分[Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。
人源化非人抗体的方法是本领域熟知的。一般来讲，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为导入残基，它们通常取自导入可变域。人源化基本上可按照Winter及其同事的方法[Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988)]，通过将啮齿动物CDR或CDR序列替换为人抗体的对应序列来进行。因此，此类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中远小于完整人可变域被非人物种的对应序列替代。在实施过程中，人源化抗体是通常其中一些CDR残基以及可能地一些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基替代的人抗体。
人抗体也可使用本领域已知的各种技术，包括噬菌体展示文库制备[Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)]。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于人单克隆抗体的制备[Cole等人,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)和Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)]。相似地，人可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物如小鼠来制备，其中该内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活。在挑战后，观察人抗体的产生，该抗体在所有方面与人密切相似，包括基因重排、组装和抗体谱。该方法例如在美国专利No.5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016和以下科学出版物中有所描述：Marks等人,Bio/Technology 10,779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368 856-859(1994)；Morrison,Nature 368 812-13(1994)；Fishwild等人,NatureBiotechnology 14,845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14,826(1996)；Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995)。
在一个实施例中，本文所公开的疾病为癌症或肿瘤。在一个实施例中，由本文所公开的方法治疗的癌症为乳腺癌。在另一个实施例中，该癌症为宫颈癌。在另一个实施例中，该癌症为含Her2的癌症。在另一个实施例中，该癌症为黑素瘤。在另一个实施例中，该癌症为胰腺癌。在另一个实施例中，该癌症为卵巢癌。在另一个实施例中，该癌症为胃癌。在另一个实施例中，该癌症为胰腺的癌性病变。在另一个实施例中，该癌症为肺腺癌。在另一个实施例中，该癌症为肺腺癌。在另一个实施例中，其为多形性胶质母细胞瘤。在另一个实施例中，该癌症为结直肠腺癌。在另一个实施例中，该癌症为肺鳞癌。在另一个实施例中，该癌症为胃腺癌。在另一个实施例中，该癌症为卵巢表面上皮肿瘤(例如其良性的、增生性的或恶性的种类)。在另一个实施例中，该癌症为口腔鳞状细胞癌。在另一个实施例中，该癌症为非小细胞肺癌。在另一个实施例中，该癌症为子宫内膜癌。在另一个实施例中，该癌症为膀胱癌。在另一个实施例中，该癌症为头颈癌。在另一个实施例中，该癌症为前列腺癌。在另一个实施例中，该癌症为口咽癌。在另一个实施例中，该癌症为肺癌。在另一个实施例中，该癌症为肛门癌。在另一个实施例中，该癌症为结肠直肠癌。在另一个实施例中，该癌症为食道癌。在另一个实施例中，该癌症为间皮瘤。
在一个实施例中，本文公开的异源性抗原为HPV-E7。在另一个实施例中，该抗原为HPV-E6。在另一个实施例中，HPV E7来自HPV株16。在另一个实施例中，HPV E7来自HPV株18。在另一个实施例中，HPV-E6来自HPV株16。在另一个实施例中，HPV E7来自HPV株18。在另一个实施例中，本公开也涵盖本文所公开的异源性抗原的片段。
在另一个实施例中，该抗原为Her-2/ne。在另一个实施例中，该抗原为NY-ESO-1。在另一个实施例中，该抗原为端粒酶(TERT)。在另一个实施例中，该抗原为SCCE。在另一个实施例中，该抗原为CEA。在另一个实施例中，该抗原为LMP-1。在另一个实施例中，该抗原为p53。在另一个实施例中，该抗原为碳酸酐酶IX(CAIX)。在另一个实施例中，该抗原为PSMA。在另一个实施例中，该抗原为前列腺干细胞抗原(PSCA)。在另一个实施例中，该抗原为HMW-MAA。在另一个实施例中，该抗原为WT-1。在另一个实施例中，该抗原为HIV-1Gag。在另一个实施例中，该抗原为蛋白酶3。在另一个实施例中，该抗原为酪氨酸酶相关蛋白2。在另一个实施例中，该抗原为PSA(前列腺特异性抗原)。在另一个实施例中，该抗原为二价PSA。在另一个实施例中，该抗原为ERG。在另一个实施例中，该抗原为ERG构建体III型。在另一个实施例中，该抗原为ERG构建体VI型。在另一个实施例中，该抗原为雄激素受体(AR)。在另一个实施例中，该抗原为PAK6。在另一个实施例中，该抗原包括PAK6的富含表位区域。在另一个实施例中，该抗原选自HPV-E7、HPV-E6、Her-2、NY-ESO-1、端粒酶(TERT)、SCCE、HMW-MAA、EGFR-III、存活素、凋亡重复序列包含棒状病毒抑制因子5(BIRC5)、WT-1、HIV-1Gag、CEA、LMP-1、p53、PSMA、PSCA、蛋白酶3、酪氨酸酶相关蛋白2、Muc1、PSA(前列腺特异性抗原)或它们的组合。在另一个实施例中，抗原包括野生型形式的抗原。在另一个实施例中，抗原包括突变体形式的抗原。
在一个实施例中，PAK6的核酸序列在SEQ ID NO:78中列出。在另一个实施例中，PAK6的氨基酸序列在SEQ ID NO:79中列出。(参见Kwek等人(2012)J Immunol 2012年9月5日在线出版，该文献完整并入本文。)
在另一个实施例中，“免疫原性片段”为当向受试者单独施用或在本文公开的疫苗组合物中施用时引起免疫应答的片段。在另一个实施例中，这样的片段包含必要的表位，以引起体液免疫应答和/或适应性免疫应答。
在一个实施例中，本发明的组合物包含抗体或其功能性片段。在另一个实施例中，本发明的组合物包含至少一种抗体或其功能性片段。在另一个实施例中，组合物可包含2种抗体、3种抗体、4种抗体或多于4种抗体。在另一个实施例中，本发明的组合物包含Lm菌株和抗体或其功能性片段。在另一个实施例中，本发明的组合物包含Lm菌株和至少一种抗体或其功能性片段。在另一个实施例中，本发明的组合物包含Lm菌株和2种抗体、3种抗体、4种抗体或多于4种抗体。在另一个实施例中，本发明的组合物包含抗体或其功能性片段，其中该组合物不包含本文所公开的李斯特菌菌株。存在于相同或不同组合物中的不同抗体不必具有相同的形式，例如一种抗体可以是单克隆抗体，另一种可以是Fab片段。每种可能性代表了不同实施例。
在一个实施例中，本发明的组合物包含特异性结合GITR或其部分的抗体或其功能性片段。在另一个实施例中，本发明的组合物包含特异性结合OX40或其部分的抗体或其功能性片段。在另一个实施例中，组合物可包含特异性结合GITR或其部分的抗体和特异性结合OX40的抗体。在另一个实施例中，本发明的组合物包含Lm菌株和特异性结合GITR的抗体或其功能性片段。在另一个实施例中，本发明的组合物包含Lm菌株和特异性结合OX40的抗体或其功能性片段。在另一个实施例中，本发明的组合物包含Lm菌株以及特异性结合GITR或其部分的抗体和特异性结合OX40或其部分的抗体。在另一个实施例中，本发明的组合物包含特异性结合GITR的抗体或其功能性片段，其中该组合物不含本文公开李斯特菌菌株。在另一个实施例中，本发明的组合物包含特异性结合OX40的抗体或其功能性片段，其中该组合物不含本文公开李斯特菌菌株。在另一个实施例中，本发明的组合物包含特异性结合GITR的抗体或其功能性片段和特异性结合GITR的抗体，其中该组合物不含本文公开李斯特菌菌株。存在于相同或不同组合物中的不同抗体不必具有相同的形式，例如一种抗体可以是单克隆抗体，另一种可以是Fab片段。每种可能性代表了本发明的不同实施例。
术语“抗体功能性片段”是指完整抗体的能够特异性结合抗原以导致本公开所预期的生物作用的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、scFv抗体以及从抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，“抗体重链”是指在所有抗体分子中以其天然存在的构象存在的两种类型多肽链中的较大者。
如本文所用，“抗体轻链”是指在所有抗体分子中以其天然存在的构象存在的两种类型多肽链中的较小者，κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所用，所谓术语“合成抗体”意指使用重组DNA技术生成的抗体，比如由本文所述的噬菌体表达的抗体。该术语还应被理解为意指这样的抗体：其通过编码抗体的DNA分子的合成而生成，并且该DNA分子表达抗体蛋白或约定该抗体的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列使用本领域可用的和熟知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
在一个实施例中，抗体或其功能性片段包括抗原结合区。在一个实施例中，抗原结合区是抗体或其抗原结合域。在一个实施例中，其抗原结合域是Fab或scFv。
技术人员将领会的是，就抗体而言的术语“结合”或“特异性结合”涵盖抗体或其功能性片段，其识别特异抗原，而基本上不识别或结合样品中的其他分子。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体可能也结合来自一个或多个物种的该抗原，但是，这种跨物种反应性本身不改变将抗体分类为特异性的。在另一例子中，特异性结合抗原的抗体可能也结合该抗原的不同等位基因形式。但是，这种交叉反应性不改变将抗体分类为特异性的。在一些情况下，可在提及抗体、蛋白或肽与第二化学物相互作用中使用术语“特异性结合”或“特异地结合”，指该相互作用依赖于该化学物上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特异蛋白结构而不是特异氨基酸序列。
在一个实施例中，本发明的组合物包含重组单核细胞增多性李斯特菌(Lm)菌株。在另一个实施例中，本发明的组合物包含抗体或其功能性片段，如本文所描述的。
在一个实施例中，免疫原性组合物包含本文公开的抗体或其功能性片段，和本文公开的重组减毒李斯特菌。在另一个实施例中，本文公开的免疫原性组合物的各组分在本文公开的免疫原性组合物的另一组分之前、同时或之后施用。在一个实施例中，即使同时施用时，Lm组合物和抗体或其功能性片段也可以作为两个分开的组合物施用。替代性地，在另一个实施例中，Lm组合物可以包含抗体或其功能性片段。
在另一个实施例中，本发明的组合物通过本领域技术人员已知的任何方法向受试者施用，例如胃肠外、癌旁、透粘膜、透皮、肌肉内、静脉内、真皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内、阴道内或肿瘤内施用。
在另一个实施例中，该组合物经口施用，并因此将其被配制为适合经口施用的形式，即，作为固体或液体制备物。适合的固体口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、药丸等。适合的液体口服制剂包括溶液、混悬液、分散剂、乳剂、油剂等。在另一个实施例中，将活性成分配制在胶囊中。根据该实施例，除活性化合物和惰性载体或稀释剂之外，本文所公开的组合物还包括硬明胶胶囊。
在另一个实施例中，通过静脉内、动脉内或肌肉内注射液体制剂来施用组合物。适合的液体制剂包括溶液、混悬液、分散剂、乳剂、油剂等。在一个实施例中，将药物组合物静脉内施用，因此将其配制为适合静脉内施用的形式。在另一个实施例中，将药物组合物动脉内施用，因此将其配制为适合动脉内施用的形式。在另一个实施例中，将药物组合物肌肉内施用，因此将其配制为适合肌肉内施用的形式。
在一些实施例中，当抗体或其功能性片段与包含重组Lm菌株的组合物分开施用时，该抗体可以静脉内注射、皮下注射或直接注射进肿瘤或瘤床中。在一个实施例中，将包含抗体的组合物注射进肿瘤手术摘除后留下的空间内，例如在摘除前列腺肿瘤后的前列腺腺体内的空间。
在一个实施例中，术语“免疫原性组合物”可以涵盖本文公开的重组李斯特菌、佐剂、和抗体或其功能性片段或者它们的组合。在另一个实施例中，免疫原性组合物包含本文所公开的重组李斯特菌。在另一个实施例中，免疫原性组合物包含本领域已知的或如本文所公开的佐剂。还应理解的是，这些组合物的施用增强免疫应答或增加T效应细胞与调节性T细胞比率或者引起抗肿瘤免疫应答，如本文进一步公开的。
在一个实施例中，本发明提供使用方法，该方法包括施用包含所述李斯特菌菌株并且还包含抗体或其功能性片段的组合物。在另一个实施例中，使用方法包括施用多于一种本文所公开的抗体，该抗体可以存在于相同或不同的组合物中，并且可以存在于与李斯特菌相同的组合物中或单独的组合物中。每种可能性代表了本发明的不同实施例。
在一个实施例中，术语“药物组合物”涵盖治疗有效量的一种或多种活性成分(包括李斯特菌菌株)，和至少一种抗体或其功能性片段，以及药学上可接受的载体或稀释剂。应当理解，术语“治疗有效量”是指为给定病症和施用方案提供治疗效果的量。
技术人员应当理解，术语“施用”涵盖使受试者与本文所公开的组合物接触。在一个实施例中，施用可在体外即在试管中实现，或在体内即活生物体(例如人)的细胞或组织内实现。在一个实施例中，本公开涵盖向受试者施用本公开的李斯特菌菌株及其组合物。
如本文所用，术语“约”是数量术语，意指加或减5％，或在另一个实施例中，加或减10％，或在另一个实施例中，加或减15％，或在另一个实施例中，加或减20％。技术人员理解，术语“受试者”可涵盖哺乳动物，包括需要治疗病症或其后遗症或易受其影响的人类成人或儿童、少年或青少年，并且还可包括非人类哺乳动物，诸如狗、猫、猪、乳牛、绵羊、山羊、马、大鼠和小鼠。还将领会的是，该术语可以涵盖家畜。术语”受试者”不排除在所有方面都正常的个体。
在施用本文公开的免疫原性组合物之后，本文公开的方法诱导外周淋巴器官中的效应T细胞扩增，从而导致肿瘤部位存在的效应T细胞增加。在另一个实施例中，本文所公开的方法诱导外周淋巴器官中的效应T细胞扩增，从而导致外周存在的效应T细胞增加。效应T细胞的这种扩增导致外周中和肿瘤部位的效应T细胞与调节性T细胞的比率提高，而不影响Treg的数量。技术人员将领会的是，外周淋巴器官包括但不限于脾脏、培氏斑、淋巴结、腺状肿等。在一个实施例中，效应T细胞与调节性T细胞的比率提高出现于外周中，而不影响Treg的数量。在另一个实施例中，效应T细胞与调节性T细胞的比率提高出现于外周、淋巴器官和肿瘤部位，而不影响这些部位的Treg数量。在另一个实施例中，效应T细胞的比率提高降低Treg的频率，而非这些部位的Treg总数。
组合疗法及其使用方法
在一个实施例中，本发明提供了一种引起受试者中的增强的抗肿瘤T细胞应答的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的免疫原性组合物的步骤，该免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，该李斯特菌菌株包含核酸分子，该核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中该融合多肽包含融合到异源抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列，其中所述方法还包括施用有效量的包含检查点抑制剂拮抗剂的组合物的步骤。
在一个实施例中，免疫检查点抑制剂拮抗剂是抗-PD-L1/PD-L2抗体或其片段、抗-PD-1抗体或其片段、抗-CTLA-4抗体或其片段或抗-B7-H4抗体或其片段。
在另一个实施例中，本发明提供一种引起受试者中的增强的抗肿瘤T细胞应答的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的免疫原性组合物的步骤，该免疫原性组合物包含重组李斯特菌菌株，该李斯特菌菌株包含核酸分子，该核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的包含抗体或其片段的组合物的步骤。在另一个实施例中，抗体为激动剂抗体或其抗原结合片段。在另一个实施例中，抗体为抗TNF受体抗体或其抗原结合片段。在另一个实施例中，抗体为抗OX40抗体或其抗原结合片段。在另一个实施例中，抗体为抗GITR抗体或其抗原结合片段。在另一个实施例中，所述方法包括施用另外的抗体，该抗体可包含在含有所述重组李斯特菌菌株的组合物中或可包含在单独的组合物中。
在一个实施例中，包含本文所述的李斯特菌菌株的任何组合物均可用于本发明的方法。在一个实施例中，包含李斯特菌菌株和抗体或其片段(例如，如本文所述的结合TNF受体超家族成员的抗体，或结合到T细胞受体共刺激分子的抗体，或结合到抗原呈递细胞受体结合性共刺激分子的抗体)的任何组合物均可用在本发明的方法中。在一个实施例中，包含本文所述的抗体或其功能性片段的任何组合物均可用于本发明的方法。包含李斯特菌菌株的具有和不具有抗体的组合物已在上文详细描述。具有抗体的组合物也已在上文详细描述。在一些实施例中，在本发明的方法中，包含抗体或其片段(例如，结合到TNF受体超家族成员的抗体，或结合到T细胞受体共刺激分子的抗体，或结合到抗原呈递细胞受体结合性共刺激分子的抗体)的组合物可在施用包含李斯特菌菌株的组合物之前、同时或之后施用。
在一个实施例中，本发明的组合物的重复施用(剂量)可在治疗的第一疗程后立即进行或在几天、几周或几个月的间隔后进行，以实现肿瘤消退。在另一个实施例中，重复剂量可在治疗的第一疗程后立即进行或在几天、几周或几个月的间隔后进行，以实现肿瘤生长的抑制。评估可通过本领域已知的任何技术确定，包括诊断方法诸如成像技术、血清肿瘤标志物分析、活组织检查、肿瘤相关症状的存在、不存在或改善。
在一个实施例中，本文公开了用于预防、治疗表达异源性抗原的肿瘤和针对所述肿瘤进行疫苗接种，并且诱导对异源性抗原的次优势表位的免疫应答同时防止肿瘤的逃逸突变的方法和组合物。
在一个实施例中，用于预防、治疗表达异源性抗原的肿瘤和针对所述肿瘤进行疫苗接种的方法和组合物包括使用截短李斯特菌溶血素(tLLO)蛋白。在另一个实施例中，本文公开的方法和组合物包含过表达tLLO的重组李斯特菌。在另一个实施例中，tLLO从李斯特菌内的质粒表达。
在另一个实施例中，本文提供一种预防或治疗受试者中的肿瘤生长或癌症的方法，该方法包括向该受试者施用免疫源性组合物的步骤，该组合物包含如本文所述的抗体或其功能性片段以及包含核酸分子的重组李斯特菌疫苗株，该核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中该融合多肽包含融合到异源抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。在另一个实施例中，本文公开一种预防或治疗受试者中的肿瘤生长或癌症的方法，该方法包括向该受试者施用免疫源性组合物的步骤，该组合物包含如本文所述的抗体或其功能性片段以及包含核酸分子的重组李斯特菌疫苗株，该核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框。
在一个实施例中，术语“治疗”是指治愈疾病。在另一个实施例中，“治疗”是指防止疾病。在另一个实施例中，“治疗”是指减少疾病的发生。在另一个实施例中，“治疗”是指改善疾病的症状。在另一个实施例中，“治疗”是指提高患者的无进展存活期或总体存活期。在另一个实施例中，“治疗”是指稳定疾病的进展。在另一个实施例中，“治疗”是指诱导缓解。在另一个实施例中，“治疗”是指减缓疾病的进展。在另一个实施例中，术语“减少”、“阻遏”和“抑制”是指减轻或降低。
在一个实施例中，本文公开了提高受试者脾脏和肿瘤微环境中的效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率的方法，包括施用本文提供的免疫原性组合物。在另一个实施例中，提高受试者的脾脏和肿瘤微环境中效应T细胞与调节性T细胞(Treg)的比率使得受试者中可以实现更明显的抗肿瘤应答。
在另一个实施例中，该效应T细胞包括CD4+FoxP3- T细胞。在另一个实施例中，该效应T细胞是CD4+FoxP3- T细胞。在另一个实施例中，该效应T细胞包括CD4+FoxP3- T细胞和CD8+ T细胞。在另一个实施例中，该效应T细胞是CD4+FoxP3- T细胞和CD8+ T细胞。在另一个实施例中，该调节性T细胞是CD4+FoxP3+ T细胞。
在一个实施例中，本公开提供治疗肿瘤、防御肿瘤以及诱导对肿瘤或癌症的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用本文公开的免疫原性组合物的步骤。
在一个实施例中，本公开提供预防或治疗人受试者中的肿瘤或癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文公开的免疫原性组合物菌株的步骤，所述重组李斯特菌菌株包含含有LLO蛋白的N末端片段和肿瘤相关抗原的重组多肽，由此重组李斯特菌菌株诱导对肿瘤相关抗原的免疫应答，从而治疗人受试者中的肿瘤或癌症。在另一个实施例中，该免疫应答是T细胞应答。在另一个实施例中，该T细胞应答是CD4+FoxP3- T细胞应答。在另一个实施例中，该T细胞应答是CD8+ T细胞应答。在另一个实施例中，该T细胞应答是CD4+FoxP3-和CD8+T细胞应答。在另一个实施例中，本公开提供避免受试者罹患肿瘤或癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文公开的免疫原性组合物的步骤。在另一个实施例中，本公开提供诱导受试者中的肿瘤消退的方法，该方法包括向受试者施用本文公开的免疫原性组合物的步骤。在另一个实施例中，本公开提供减少肿瘤或癌症的发生或复发的方法，该方法包括向受试者施用本文公开的免疫原性组合物的步骤。在另一个实施例中，本文公开了抑制受试者中的肿瘤形成的方法，该方法包括向受试者施用本文公开的免疫原性组合物的步骤。在另一个实施例中，本公开提供诱导受试者中的癌症缓解的方法，该方法包括向受试者施用本文公开的免疫原性组合物的步骤。在一个实施例中，包含编码融合多肽的第一开放阅读框的核酸分子整合进李斯特菌基因组。在另一个实施例中，核酸在重组李斯特菌疫苗株的质粒中。在另一个实施例中，核酸在重组李斯特菌疫苗株的细菌人工染色体中。
在一个实施例中，所述方法包括将重组李斯特菌与另外的疗法共施用的步骤。在另一个实施例中，该另外的疗法是手术、化学疗法、免疫疗法、放射疗法基于抗体的免疫疗法或其组合。在另一个实施例中，该另外的疗法在重组李斯特菌的施用之前进行。在另一个实施例中，该另外的疗法在重组李斯特菌的施用之后进行。在另一个实施例中，该另外的疗法是抗体疗法。在另一个实施例中，该重组李斯特菌以增大剂量施用，以提高效应T细胞与调节性T细胞的比率，并产生更强大的抗肿瘤免疫应答。技术人员将领会的是，抗肿瘤免疫应答可通过给患有肿瘤的受试者提供细胞因子进一步增强，该细胞因子包括但不限于IFN-γ、TNF-α以及本领域已知的增强细胞免疫应答的其他细胞因子，这些细胞因子中的一些可见于美国专利No.6,991,785，该专利以引用方式并入本文。
在一个实施例中，本文所公开的方法还包括将本文所公开的免疫原性组合物与在所述受试者中增强抗肿瘤免疫应答的抗体或其功能片段共施用的步骤。
在一个实施例中，本文公开的方法还包括将本文公开的免疫原性组合物与吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)通路抑制剂共施用的步骤。用于本公开的IDO通路抑制剂包括任何本领域已知的IDO通路抑制剂，其包括但不限于1-甲基色氨酸(1MT)、1-甲基色氨酸(1MT)、Necrostatin-1、吡哆醛异烟腙、依布硒啉、5-甲基吲哚M-3-甲醛、CAY10581、抗IDO抗体或小分子IDO抑制剂。在另一个实施例中，本文公开的组合物和方法还与在前的或随后的化疗或放疗方案联合使用。在另一个实施例中，IDO抑制增强化疗剂的功效。
在另一个实施例中，本文公开一种增加罹患癌症或具有肿瘤的受试者的存活的方法，该方法包括向该受试者施用免疫源性组合物的步骤，该组合物包含如本文所述的抗体或其功能性片段以及包含核酸分子的重组李斯特菌疫苗株，该核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中该融合多肽包含融合到异源抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。
在另一个实施例中，本文公开一种增加罹患癌症或具有肿瘤的受试者中的抗原特异性T细胞的方法，该方法包括向该受试者施用免疫源性组合物的步骤，该组合物包含如本文所述的抗体或其功能性片段以及包含核酸分子的重组李斯特菌疫苗株，该核酸分子包含编码融合多肽的第一开放阅读框，其中该融合多肽包含融合到异源抗原或其片段的截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列。在另一个实施例中，本文公开一种增加罹患癌症或具有肿瘤的受试者中的T细胞的方法，该方法包括向该受试者施用免疫源性组合物的步骤，该组合物包含如本文所述的抗体或其功能性片段以及包含核酸分子的重组李斯特菌疫苗株，该核酸分子包含编码截短李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白、截短ActA蛋白或PEST氨基酸序列的第一开放阅读框。
在另一个实施例中，本发明的方法还包括用如本文所公开的重组李斯特菌菌株或抗体或其功能性片段强化受试者的步骤。在另一个实施例中，用于强化接种的重组李斯特菌菌株与用于初始的“初免”接种的菌株相同。在另一个实施例中，强化菌株不同于初免菌株。在另一个实施例中，用于强化接种的抗体与用于初始的“初免”接种的抗体结合相同的抗原。在另一个实施例中，强化抗体不同于初免抗体。在另一个实施例中，将相同的剂量用于初免和强化接种。在另一个实施例中，将大剂量用于强化。在另一个实施例中，将小剂量用于强化。在另一个实施例中，本文所公开的方法还包括向受试者施用强化疫苗接种的步骤。在一个实施例中，强化疫苗接种在单次初免疫苗接种之后。在另一个实施例中，单次强化疫苗接种在初免疫苗接种后施用。在另一个实施例中，两次强化疫苗接种在初免疫苗接种后施用。在另一个实施例中，三次强化疫苗接种在初免疫苗接种后施用。在一个实施例中，初免和强化菌株之间的周期由技术人员通过实验确定。在另一个实施例中，初免和强化菌株之间的周期为1周，在另一个实施例中为2周，在另一个实施例中为3周，在另一个实施例中为4周，在另一个实施例中为5周，在另一个实施例中为6-8周，在又一个实施例中强化菌株在初免菌株后8-10周施用。
在另一个实施例中，本文所公开的方法还包括用包含本文公开的减毒李斯特菌菌株的免疫原性组合物强化受试者。在另一个实施例中，本文所公开的方法包括施用强化剂量的免疫原性组合物的步骤，该组合物包含本文公开的减毒李斯特菌菌株。在另一个实施例中，该强化剂量是所述免疫原性组合物的替代形式。在另一个实施例中，本文所公开的方法还包括向受试者施用强化免疫原性组合物的步骤。在一个实施例中，该强化剂量在所述免疫原性组合物的单次初免剂量之后。在另一个实施例中，单次强化剂量在初免剂量后施用。在另一个实施例中，两次强化剂量在初免剂量后施用。在另一个实施例中，三次强化剂量在初免剂量后施用。在一个实施例中，包含本文所公开的减毒李斯特菌的免疫原性组合物的初免和强化剂量之间的周期由技术人员以实验方法确定。在另一个实施例中，剂量由技术人员以实验方法确定。在另一个实施例中，初免和强化剂量之间的周期为1周，在另一个实施例中为2周，在另一个实施例中为3周，在另一个实施例中为4周，在另一个实施例中为5周，在另一个实施例中为6-8周，在又一个实施例中强化剂量在免疫原性组合物的初免剂量后8-10周施用。
异源“初免强化”策略对于增强免疫应答和防御众多病原体是有效的。Schneider等人,Immunol.Rev.170:29-38(1999)；Robinson,H.L.,Nat.Rev.Immunol.2:239-50(2002)；Gonzalo,R.M.等人,Strain 20:1226-31(2002)；Tanghe,A.,Infect.Immun.69:3041-7(2001)。抗原以不同形式在初免和强化注射中提供似乎使对该抗原的免疫应答最大化。以DNA菌株初免，接着以佐剂中的蛋白或者通过病毒载体递送编码抗原的DNA来强化似乎是改善抗原特异性抗体以及各自的CD4+ T细胞应答或CD8+ T细胞应答的最有效方式。Shiver J.W.等人,Nature 415:331-5(2002)；Gilbert,S.C.等人,Strain 20:1039-45(2002)；Billaut-Mulot,O.等人,Strain 19:95-102(2000)；Sin,J.I.等人,DNA CellBiol.18:771-9(1999)。最近的来自猴疫苗接种研究的数据提示，当以HIV gag DNA对猴进行初免接种后接着以表达HIVgag的腺病毒载体(Ad5-gag)强化时，向编码HIV gag抗原的DNA添加CRL1005泊洛沙姆(12kDa,5％POE)增强了T细胞应答。针对DNA/泊洛沙姆初免和随后的Ad5-gag强化的细胞免疫应答强于以DNA(无泊洛沙姆)初免和随后进行Ad5-gag强化所诱导的应答或者针对单独的Ad5-gag的应答。Shiver,J.W.等人Nature 415:331-5(2002)。美国专利申请公开US 2002/0165172A1描述了以编码抗原的免疫原性部分的载体构建体和包含抗原的该免疫原性部分的蛋白同时施用，由此产生免疫应答。该文献仅限于乙型肝炎抗原和HIV抗原。此外，美国专利No.6,500,432涉及通过以所关注的多核苷酸和多肽同时施用来增强核酸疫苗接种的免疫应答的方法。根据该专利，同时施用意指在相同的免疫应答期间，优选地在彼此的0-10天或3-7天内施用多核苷酸和多肽。该专利所考虑的抗原包括：肝炎(所有形式)、HSV、HIV、CMV、EBV、RSV、VZV、HPV、脊髓灰质炎、流感、寄生虫(例如，来自疟原虫(Plasmodium)属)和病原菌(包括但不限于结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风杆菌(M.leprae)、衣原体(Chlamydia)、志贺氏菌(Shigella)、伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli)、伤寒沙门氏菌(S.typhosa)、幽门螺杆菌(H.pylori)、霍乱弧菌(V.cholerae)、百日咳杆菌(B.pertussis)等)抗原等。通过引用将以上所有文献全文并入本文。
在一个实施例中，本文所公开的处理方案为治疗性的。在另一个实施例中，该方案为预防性的。在另一个实施例中，将本文所公开的组合物用于保护人们免于诸如乳腺癌的癌症或其他类型的肿瘤的风险，因为家族性遗传或其他情况使得它们易于罹患这些类型的疾病，如技术人员将理解的那样。在另一个实施例中，疫苗在通过手术、常规化疗或放疗摧毁肿瘤生长后用作癌症免疫疗法。在此类治疗后，本文所公开的疫苗的施用使得对疫苗的肿瘤抗原的CTL应答破坏了其余的转移并且延长了癌症的缓解。在另一个实施例中，将本文所公开的疫苗用于影响之前建立的肿瘤的生长并杀死现有的肿瘤细胞。
在一些实施例中，术语“包含”或其语法形式是指包括指定的活性剂，诸如本发明的Lm菌株，以及包括其他活性剂，诸如抗体或其功能性片段，以及制药行业已知的药学上可接受的载体、赋形剂、缓和剂、稳定剂等。在一些实施例中，术语“基本上由…组成”是指这样的组合物：其唯一的活性成分是指定的活性成分，然而，可包括用于稳定、保存制剂等等但不直接涉及指定的活性成分的治疗效果的其他化合物。在一些实施例中，术语“基本上由…组成”可以指这样的组分：其通过不同于指定的活性成分的机制发挥治疗效果。在一些实施例中，术语“基本上由…组成”可以指这样的组分：其发挥治疗效果并且属于与指定的活性成分不同的一类化合物。在一些实施例中，术语“基本上由…组成”可以指这样的组分：其例如通过不同作用机制的作用而发挥治疗效果并且可以不同于指定的活性成分。在一些实施例中，术语“基本上由…组成”可以指有助于释放活性成分的组分。在一些实施例中，术语“由...组成”是指这样的组合物：其包含活性成分和药学上可接受的载体或赋形剂。
如本文所用，除非上下文明确地相反指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数含义。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括它们的混合物。
遍及本申请，本发明的各个实施例可以以范围的形式表示。应理解，以范围形式描述仅是出于方便和简洁，而不应认为是对发明范围的呆板限制。因此，对范围的描述应认为是已具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应理解为已具体公开了诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及该范围内的各个数值，例如1、2、3、4、5和6。这种适用性与范围的广度无关。
每当在本文中指出数值范围时，其旨在包括该指出的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语第一指定数和第二指定数“之间的范围”和“从”第一指定数“至”第二指定数的“范围”在本文中可互换使用，旨在包括第一和第二指定数以及它们之间的所有分数和整数。
如本文所用，术语“方法”是指用于实现给定任务的方式、手段、技术和工序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的专业人员已知的或易于从已知的方式、手段、技术和工序开发的那些方式、手段、技术和工序。
在以下实例中，陈述了多个具体细节，以提供对本发明的透彻理解。然而，本领域的技术人员将理解可在不具有这些具体细节的情况下实施本公开。在其他情况中，为避免使本公开复杂化，未对熟知的方法、工序和组分进行详细描述。
实例
材料和实验方法(实例1-2)
细胞系
C57BL/6同基因TC-1肿瘤经HPV-16E6和E7永生化并以c-Ha-ras癌基因转化。T.C.Wu(Johns Hopkins University School of Medicine,Baltimore,MD)提供的TC-1为高度致瘤的肺上皮细胞，该细胞表达低水平的HPV-16E6和E7，并被c-Ha-ras癌基因转化。让TC-1于37℃及10％CO2下生长在RPMI 1640、10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、100μM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、50微摩尔(mcM)2-ME、400微克(mcg)/mlG418以及10％国家典型菌种保藏中心-109培养基(National Collection Type Culture-109medium)中。C3为来自C57BL/6小鼠的小鼠胚胎细胞，该细胞经完整HPV 16基因组永生化并经pEJ-ras转化。EL-4/E7为经E7逆转录病毒转导的胸腺瘤EL-4。
单核细胞增多性李斯特菌菌株和繁殖
所用的李斯特菌菌株为Lm-LLO-E7，本文也称为ADXS11-001(在游离型表达系统中的hly-E7融合基因；图1A)、Lm-E7(整合进李斯特菌基因组中的单拷贝E7基因盒)、Lm-LLO-NP(“DP-L2028”；在游离型表达系统中的hly-NP融合基因)和Lm-Gag(“ZY-18”；整合进染色体中的单拷贝HIV-1Gag基因盒)。将E7用引物5'-GGCTCGAGCATGGAGATACACC-3'(SEQ ID No:24；XhoI位点标有下划线)和5'-GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA-3'(SEQ ID No:25；SpeI位点标有下划线)通过PCR扩增并连接进pCR2.1(Invitrogen,San Diego,CA)。通过XhoI/SpeI消化从pCR2.1切离E7，并将其连接进pGG-55。将hly-E7融合基因和多能转录因子prfA克隆进pAM401，即一种多拷贝穿梭质粒(Wirth R等人,JBacteriol,165:831,1986)，从而生成pGG-55。hly启动子驱动hly基因产物的前441个氨基酸(缺乏溶血性C-端，在下文中被称作“ΔLLO”，并具有SEQ ID No:3所示的序列)的表达，其通过XhoI位点连接至E7基因，从而产生hly-E7融合基因，该基因被转录和分泌成LLO-E7。用为了在体内保留质粒而选择的pGG-55转化prfA阴性李斯特菌菌株XFL-7(由Hao Shen博士提供，University ofPennsylvania)(图1A-B)。使用引物5'-GGGGGCTAGCCCTCCTTTGATTAGTATATTC-3'(SEQ IDNo:26；NheI位点标有下划线)和5'-CTCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATC-3'(SEQ ID No:27；XhoI位点标有下划线)生成hly启动子和基因片段。将prfA基因用引物5'-GACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3'(SEQ ID No:28；XbaI位点标有下划线)和5'-CCCGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3'(SEQ ID No:29；SalI位点标有下划线)进行PCR扩增。通过将含有驱动E7的表达和分泌的hly启动子和信号序列的表达盒引入LM基因组的orfZ域中，产生Lm-E7。将E7用引物5'-GCGGATCCCATGGAGATACACCTAC-3'(SEQ ID No:30；BamHI位点标有下划线)和5'-GCTCTAGATTATGGTTTCTGAG-3'(SEQ ID No:31；XbaI位点标有下划线)通过PCR扩增。然后将E7连接进pZY-21穿梭载体。用得到的质粒pZY-21-E7转化LM菌株10403S，该质粒包括插入在与LM基因组的orfX、Y、Z域对应的1.6-kb序列的中央的表达盒。该同源域允许E7基因盒通过同源重组插入orfZ域中。针对E7基因盒在orfZ域中的整合，筛选克隆。在含有(Lm-LLO-E7和Lm-LLO-NP)或不含(Lm-E7和ZY-18)氯霉素(20μg/ml)的脑心浸液培养基中培养细菌。在-80℃以等分试样冷冻细菌。通过Western印迹法验证表达(图2)。
Western印迹法
使李斯特菌菌株在Luria-Bertoni培养基中于37℃生长，并在600nm处测得的相同光密度下收获。将上清液TCA沉淀，并重悬于补充了0.1N NaOH的1x样品缓冲液中。将相同量的每种细胞沉淀物或每种经TCA沉淀的上清液上样至4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶(NOVEX,San Diego,CA)。将凝胶转移至聚偏二氟乙烯，并用抗-E7单克隆抗体(mAb)(ZymedLaboratories,South San Francisco,CA)探测，然后与HRP-偶联的抗小鼠二抗(AmershamPharmacia Biotech,Little Chalfont,U.K.)一起温育，用Amersham ECL检测试剂显影，并暴露于Hyperfilm(Amersham Pharmacia Biotech)。
肿瘤生长的测量
每隔一天用卡尺跨最短和最长表面直径测量肿瘤。将这两个测量结果的平均值作为平均肿瘤直径(以毫米计)相对于不同时间点作图。当肿瘤直径达到20mm时，处死小鼠。仅显示存活小鼠在每个时间点的肿瘤测量结果。
李斯特菌重组体对建立的肿瘤生长的影响
6-8周龄C57BL/6小鼠(Charles River)在左胁腹皮下接受2×105个TC-1细胞。肿瘤接种后一周，肿瘤已经达到直径为4-5mm的可触知大小。然后在第7和14天用0.1LD50腹膜内Lm-LLO-E7(107个CFU)、Lm-E7(106个CFU)、Lm-LLO-NP(107个CFU)或Lm-Gag(5×105个CFU)处理8只小鼠的组。
51Cr释放测定
以0.1LD50Lm-LLO-E7、Lm-E7、Lm-LLO-NP或Lm-Gag腹膜内免疫6-8周龄C57BL/6小鼠。免疫接种后十天，收获脾。将经照射的TC-1细胞作为饲养细胞，在培养物中建立脾细胞(100:1，脾细胞:TC-1)；在体外刺激5天，然后用在标准51Cr释放测定中，其中使用下述靶标：EL-4、EL-4/E7或经E7H-2b肽(RAHYNIVTF)脉冲处理的EL-4。一式三份地进行的E:T细胞比率为：80:1、40:1、20:1、10:1、5:1和2.5:1。在37℃温育4h以后，将细胞沉淀，并从每个孔取出50μl上清液。以Wallac 1450闪烁计数器(Gaithersburg,MD)测定样品。将特异性裂解百分比确定为[(每分钟的实验计数(cpm)-自发cpm)/(总cpm-自发cpm)]×100。
TC-1特异性增殖
将C57BL/6小鼠用0.1LD50免疫，并在20天后通过腹膜内注射1LD50Lm-LLO-E7、Lm-E7、Lm-LLO-NP或Lm-Gag进行强化。强化后六天，从经免疫的小鼠和未暴露的小鼠收获脾。以2.5×104、1.25×104、6×103或3×103个经照射的TC-1细胞/孔作为E7Ag的来源，或不用TC-1细胞或用10μg/ml Con A，在平底96孔平板中以5×105个/孔在培养物中建立脾细胞。45h后以0.5μCi[3H]胸苷/孔脉冲处理细胞。18h以后，采用Tomtec采集器96(Orange,CT)收获平板，并用Wallac 1450闪烁计数器评估增殖。将以cpm计的变化计算为实验cpm–无Ag cpm。
流式细胞术分析
将C57BL/6小鼠用0.1LD50Lm-LLO-E7或Lm-E7静脉内(i.v.)免疫，并在30天后强化。采用带软件(Becton Dickinson,Mountain View,CA)的流式细胞计对CD8(53-6.7，PE偶联的)、CD62配体(CD62L；MEL-14，APC偶联的)和E7H-2Db四聚体进行三色流式细胞术。将强化后第5天收获的脾细胞在室温(rt)用负载了E7肽(RAHYNIVTF)或对照(HIV-Gag)肽的H-2Db四聚体染色。以1/200稀释度使用四聚体，其由Larry R.Pease博士(MayoClinic,Rochester,MN)以及由NIAID Tetramer Core Facility和NIH AIDSResearch and Reference Reagent Program提供。分析了四聚体+、CD8+、CD62L低细胞。
B16F0-Ova实验
给24只C57BL/6小鼠接种5×105个B16F0-Ova细胞。在第3、10和17天，将8只小鼠的组用0.1LD50Lm-OVA(106个cfu)、Lm-LLO-OVA(108个cfu)免疫，另八只动物保持不处理。
统计
为了对比肿瘤直径，确定每个组的肿瘤大小的平均值和SD，并通过学生t检验确定统计显著性。p≤0.05视作显著的。
实例1：LLO-抗原融合体诱导抗肿瘤免疫
结果
对比了Lm-E7和Lm-LLO-E7影响TC-1生长的能力。在C57BL/6小鼠的左胁腹上建立皮下肿瘤。七天后，肿瘤已经达到可触知的大小(4-5mm)。在第7和14天，给小鼠接种0.1LD50Lm-E7、Lm-LLO-E7或作为对照的Lm-Gag和Lm-LLO-NP。Lm-LLO-E7诱导75％的建立的TC-1肿瘤的完全消退，而在该组中的其他2只小鼠中控制了肿瘤生长(图3)。相反，使用Lm-E7和Lm-Gag的免疫接种没有诱导肿瘤消退。该实验重复多次，总是得到非常类似的结果。另外，在不同的免疫方案下，Lm-LLO-E7也得到了类似的结果。在另一实验中，单次免疫能够治愈小鼠建立的5mm TC-1肿瘤。
在其他实验中，用另外2个表达E7的肿瘤细胞系得到了类似的结果：C3和EL-4/E7。为了确认以Lm-LLO-E7接种的功效，分别在第60天或第40天用TC-1或EL-4/E7肿瘤细胞重新挑战已经消除了它们的肿瘤的动物。经Lm-LLO-E7免疫的动物保持无肿瘤直到实验终止(就TC-1而言，第124天；就EL-4/E7而言，第54天)。
因此，抗原作为与ΔLLO的融合蛋白的表达会增强所述抗原的免疫原性。
实例2：LM-LLO-E7处理引起TC-1特异性脾细胞增殖
为了用Lm-LLO-E7测量Lm-E7对T细胞的诱导，在经免疫的小鼠中测量了TC-1特异性增殖性应答(抗原特异性免疫活性的度量)。来自经Lm-LLO-E7免疫的小鼠的脾细胞当以20:1、40:1、80:1和160:1的脾细胞:TC-1比率暴露于经照射的TC-1细胞(作为E7的来源)时发生增殖(图4)。反之，来自经Lm-E7和rLm对照免疫的小鼠的脾细胞仅表现出背景水平的增殖。
实例3：ActA-E7和PEST-E7融合体赋予抗肿瘤免疫
材料和方法
Lm-ActA-E7的构建
Lm-ActA-E7是LM的重组菌株，其包含表达与截短形式的actA蛋白融合的E7蛋白的质粒。通过将质粒载体pDD-1引入李斯特菌而生成Lm-actA-E7，所述质粒载体通过修改pDP-2028而构建。pDD-1包含表达310bp hly启动子和hly信号序列(ss)的拷贝的表达盒，该表达盒驱动ActA-E7的表达和分泌；包含四个PEST序列(SEQ ID NO:19)的1170bp actA基因(截短的ActA多肽由分子的前390个AA组成，SEQ ID NO:11)、300bp HPV E7基因、1019bp prfA基因(控制毒力基因的表达)和CAT基因(氯霉素抗性基因)用于选择所转化的细菌克隆(Sewell等人(2004),Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg.,130:92-97)。
使用引物5'-GGGGTCTAGACCTCCTTTGATTAGTATATTC-3'(Xba I位点标有下划线；SEQID NO:32)和引物5'-ATCTTCGCTATCTGTCGCCGCGGCGCGTGCTTCAGTTTGTTGCGC-'3(Not I位点标有下划线；前18个核苷酸为ActA基因重叠；SEQ ID NO:33)从pGG55(实例1)对hly启动子(pHly)和基因片段进行PCR扩增。使用引物5'-GCGCAACAAACTGAAGCAGCGGCCGCGGCGACAGATAGCGAAGAT-3'
(NotI位点标有下划线；SEQ ID NO:34)和引物5'-TGTAGGTGTATCTCCATGCTCGAGAGCTAGGCGATCAATTTC-3'(XhoI位点标有下划线；SEQ ID NO:35)从LM 10403s野生型基因组对actA基因进行PCR扩增。使用引物5'-GGAATTGATCGCCTAGCTCTCGAGCATGGAGATACACCTACA-3'(XhoI位点标有下划线；SEQ ID NO:36)和引物5'-AAACGGATTTATTTAGATCCCGGGTTATGGTTTCTGAGAACA-3'(XmaI位点标有下划线；SEQ ID NO:37)从pGG55(pLLO-E7)对E7基因进行PCR扩增。使用引物5'-TGTTCTCAGAAACCATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3'(XmaI位点标有下划线；SEQ ID NO:38)和引物5'-GGGGGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3'(SalI位点标有下划线；SEQ ID NO:39)从LM 10403s野生型基因组对prfA基因进行PCR扩增。通过PCR生成hly启动子-actA基因融合体(pHly-actA)，并使用上游pHly引物(SEQ ID NO:32)和下游actA引物(SEQ ID NO:35)从纯化的pHly DNA和纯化的actA DNA进行扩增。
通过PCR生成与prfA基因融合的E7基因(E7-prfA)，并使用上游E7引物(SEQ IDNO:36)和下游prfA基因引物(SEQ ID NO:39)从纯化的E7DNA和纯化的prfA DNA进行扩增。
通过PCR产生与E7-prfA融合产物融合的pHly-actA融合产物，并使用上游pHly引物(SEQ ID NO:32)和下游prfA基因引物(SEQ ID NO:39)从纯化的融合pHly-actA DNA基因产物和纯化的融合E7-prfA DNA产物进行扩增，且连接进pCRII(Invitrogen,La Jolla,Calif.)中。用pCRII-ActAE7转化感受态大肠杆菌(TOP10'F,Invitrogen,La Jolla,Calif.)。在裂解和分离后，使用BamHI(预期片段大小770bp和6400bp(或当插入片段逆向插入载体时：2500bp和4100bp))和BstXI(预期片段大小2800bp和3900bp)通过限制性分析筛选质粒，并且还使用上游pHly引物(SEQ ID NO:32)和下游prfA基因引物(SEQ ID NO:39)通过PCR分析进行了筛选。
将pHly-actA-E7-prfA DNA插入片段通过用Xba I和Sal I双重消化而从pCRII切割，并连接进也用Xba I和Sal I消化的pDP-2028。在用表达系统pActAE7转化TOP10'F感受态大肠杆菌(Invitrogen,La Jolla,Calif.)后，使用上游pHly引物(SEQ ID NO:32)和下游PrfA基因引物(SEQ ID NO:39)通过PCR分析来筛选耐氯霉素克隆。使包含pActAE7的克隆在脑心浸液培养基(具有氯霉素(20mcg(微克)/ml(毫升)，Difco,Detroit,Mich.)中生长，并使用小量提取DNA纯化系统试剂盒(midiprep DNA purification system kit)(Promega,Madison,Wis.)分离pActAE7。如在Ikonomidis等人(1994,J.Exp.Med.180:2209-2218)中所描述的那样，用表达系统pActAE7转化经青霉素处理的李斯特菌(菌株XFL-7)的prfA阴性菌株。于37℃在含有氯霉素(20mcg/ml)的脑心浸液中培养克隆。在-80℃在等分试样中冷冻细菌。
抗原表达的免疫印迹验证
为了验证Lm-ActA-E7分泌ActA-E7(约64kD)，使李斯特菌菌株在Luria-Bertoni(LB)培养基中在37℃培养。用三氯乙酸(TCA)从培养物上清液中沉淀蛋白，重悬于含有0.1N氢氧化钠的1x样品缓冲液中。将相等量的每种经TCA沉淀的上清液加样至4％至20％Tris-甘氨酸十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(NOVEX,San Diego,Calif)。将凝胶转移至聚偏二氟乙烯膜，并用1:2500抗-E7单克隆抗体(Zymed Laboratories,South San Francisco,Calif)探测，然后用1:5000辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG(Amersham PharmaciaBiotech,Little Chalfont,England)探测。将印迹用Amersham增强的化学发光检测试剂显影，并暴露于放射自显影胶片(Amersham)(图5A)。
Lm-PEST-E7、Lm-ΔPEST-E7和Lm-E7epi的构建(图6A)
Lm-PEST-E7与Lm-LLO-E7相同，但是它仅含有hly基因的启动子和PEST序列，具体而言，LLO的前50个氨基酸。为了构建Lm-PEST-E7，使用SOE(通过重叠延伸实现的基因剪接)PCR技术，让hly启动子和PEST区域与全长E7基因融合。从质粒pGG-55(其含有LLO的前441个氨基酸)扩增E7基因和hly-PEST基因片段，并通过常规PCR技术剪接到一起。为了建立最终的质粒pVS16.5，将hly-PEST-E7片段和prfA基因亚克隆进质粒pAM401(其包括用于体外选择的氯霉素抗性基因)中，并使用得到的质粒转化XFL-7。
Lm-ΔPEST-E7是与Lm-LLO-E7相同的重组李斯特菌菌株，但是它缺少PEST序列。基本上如针对Lm-PEST-E7所描述的那样进行制备，但是使用设计成从hly-E7融合基因除去含有PEST的区域(bp 333-387)的引物来构建游离型表达系统。Lm-E7epi是分泌不含PEST区域或LLO的E7的重组菌株。用于转化该菌株的质粒含有与E7基因融合的hly启动子和信号序列的基因片段。该构建体不同于原始的Lm-E7，该Lm-E7表达整合进染色体中的单个拷贝的E7基因。除了表达的E7抗原的形式以外，Lm-E7epi是与Lm-LLO-E7、Lm-PEST-E7和Lm-ΔPEST-E7完全同基因的。
结果
为了对比Lm-ActA-E7相对于Lm-LLO-E7诱导的抗肿瘤免疫，将2×105个TC-1肿瘤细胞皮下植入小鼠中，并让其生长至可触知的大小(大约5毫米[mm])。在第7和14天，用1LD50的Lm-ActA-E7(5×108个CFU)(十字叉)、Lm-LLO-E7(108个CFU)(正方形)或Lm-E7(106个CFU)(圆形)腹膜内免疫小鼠。到第26天，在Lm-LLO-E7和Lm-ActA-E7中的所有动物都没有肿瘤且保持如此，而所有未暴露的动物(三角形)和用Lm-E7免疫的动物生长出大肿瘤(图5B)。因而，使用ActA-E7融合体的接种造成肿瘤消退。
另外，针对它们引起表达E7的肿瘤的消退的能力，对比了Lm-LLO-E7、Lm-PEST-E7、Lm-ΔPEST-E7和Lm-E7epi。40只C57BL/6小鼠的左胁腹上建立皮下TC-1肿瘤。在肿瘤已经达到4-5mm后，将小鼠分成5组，每组8只。每组用4种重组LM疫苗之一处理，1个组保持不处理。Lm-LLO-E7和Lm-PEST-E7分别在5/8和3/8的病例中诱导了建立的肿瘤的消退。在任何时间点在用Lm-PEST-E7或Lm-LLO-E7处理的小鼠的平均肿瘤大小之间没有统计差异。但是，表达不含PEST序列的E7、Lm-ΔPEST-E7和Lm-E7epi的疫苗在除了一只以外的所有小鼠中没有造成肿瘤消退(图6B，上方插图)。这代表2个实验，其中在用Lm-LLO-E7或Lm-PEST-E7处理的肿瘤与用Lm-E7epi或Lm-ΔPEST-E7处理的肿瘤之间，观察到在第28天时平均肿瘤大小的统计上显著的差异；P<0.001，学生t检验；图6B，下方插图)。另外，在经含有PEST的疫苗接种的小鼠的脾中，在3个实验中可再现地观察到四聚体阳性脾细胞的增加的百分比(图6C)。因而，使用PEST-E7融合体的接种造成肿瘤消退。
实例4：E7与LLO、ActA或PEST样序列的融合增强E7特异性免疫并产生浸润肿瘤的E7特异性CD8+细胞
材料和实验方法
在12只C57BL/6小鼠(n＝3)的左胁腹皮下植入500mcl(微升)其包含100微升的在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的2×105个TC-1肿瘤细胞和400微升的(BD Biosciences,Franklin Lakes,N.J.)。在第7、14和21天腹膜内免疫小鼠，并在第28天收获脾和肿瘤。将肿瘤MATRIGEL从小鼠取出，并在含有2毫升(ml)RP 10培养基的试管中在冰上4℃温育过夜。将肿瘤用镊子切碎，切成2mm块，并与3ml酶混合物(PBS中0.2mg/ml胶原酶P、1mg/ml DNAse-1)一起在37℃温育1小时。将组织悬液穿过尼龙网过滤，并用5％胎牛血清+0.05％的NaN3在PBS中的溶液洗涤，以用于四聚体和IFN-γ染色。
在存在布雷菲德菌素A的情况下以107个细胞/ml将脾细胞和肿瘤细胞与1微摩尔(mcm)E7肽一起温育5小时。将细胞洗涤两次，并在50微升的抗小鼠Fc受体上清液(2.4G2)中4℃温育1小时或过夜。针对表面分子CD8和CD62L将细胞染色，渗透化，使用渗透化试剂盒或(Pharmingen,San Diego,Calif.)固定，并针对IFN-γ染色。使用双激光流式细胞计FACSCalibur获取500,000个事件，并使用Cellquest软件(BectonDickinson,Franklin Lakes,NJ)分析。计算活化的(CD62L低)CD8+ T细胞内的IFN-γ分泌细胞的百分比。
对于四聚体染色，让H-2Db四聚体负载藻红蛋白(PE)偶联的E7肽(RAHYNIVTF、SEQID NO:40)，在室温染色1小时，并用抗别藻蓝蛋白(APC)偶联的MEL-14(CD62L)和FITC偶联的CD8+在4℃染色30min。通过对比脾中和肿瘤中的四聚体+CD8+CD62L低细胞来分析细胞。
结果
为了分析Lm-ActA-E7增强抗原特异性免疫的能力，给小鼠植入TC-1肿瘤细胞，并用Lm-LLO-E7(1×107个CFU)、Lm-E7(1×106个CFU)或Lm-ActA-E7(2×108个CFU)免疫，或者不处理(未暴露的)。来自Lm-LLO-E7和Lm-ActA-E7组的小鼠肿瘤含有比在Lm-E7或未暴露的小鼠中更高百分比的分泌IFN-γ的CD8+细胞(图7A)和四聚体特异性CD8+细胞(图7B)。
在另一个实验中，给荷瘤小鼠施用Lm-LLO-E7、Lm-PEST-E7、Lm-ΔPEST-E7或Lm-E7epi，并测量肿瘤内的E7特异性淋巴细胞的水平。在第7和14天用0.1LD50的4种疫苗处理小鼠。在第21天收获肿瘤，并用针对CD62L、CD8的抗体和用E7/Db四聚体染色。在接种Lm-LLO-E7和Lm-PEST-E7的小鼠中观察到四聚体阳性的淋巴细胞在肿瘤内增加的百分比(图8A)。该结果在三个实验中是可再现的(图8B)。
因而，Lm-LLO-E7、Lm-ActA-E7和Lm-PEST-E7各自有效地诱导浸润肿瘤的CD8+ T细胞和肿瘤消退。
实例5：LLO和ActA融合体减小E6/E7转基因小鼠中的原部位(自发)肿瘤
为了确定Lm-LLO-E7和Lm-ActA-E7疫苗对E6/E7转基因小鼠中原部位肿瘤的影响，将6至8周大的小鼠用1×108Lm-LLO-E7或2.5×108Lm-ActA-E7每月一次进行免疫，持续8个月。在最后一次免疫后20天处死小鼠，摘取其甲状腺并称重。该实验重复两次(表1)。
表1.未接种疫苗和接种疫苗的转基因小鼠在8月龄时的甲状腺重量(mg)*。
*使用学生t检验进行的统计分析表明，经Lm-LLO-NP处理的小鼠与未处理的小鼠之间甲状腺重量的差异不显著，但经Lm-LLO-E7与Lm-ActA-E7处理的小鼠之间的差异非常显著(p<0.001)
两个实验的Lm-LLO-E7处理的小鼠与未经处理的小鼠之间以及Lm-LLO-ActA处理的小鼠与未经处理的小鼠之间的甲状腺重量差异显著(分别p<0.001和p<0.05)，而Lm-LLO-NP处理的小鼠(不相关抗原对照)与未经处理的小鼠之间的差异不显著(学生t检验)，显示Lm-LLO-E7和Lm-ActA-E7控制了自发肿瘤生长。因此，本文所公开的疫苗防止形成新的表达E7的肿瘤。
为了概述以上实例中的发现，LLO抗原和ActA抗原融合体(a)诱导包括肿瘤浸润性抗原特异性T细胞的肿瘤特异性免疫应答；并且对于正常尤其是侵袭性肿瘤能够诱导肿瘤消退和控制肿瘤生长；(b)克服对自身抗原的耐受性；以及(c)防止自发肿瘤生长。如用多种不同的抗原、PEST样序列和肿瘤类型成功实施所证明，这些发现可适用于大量抗原、PEST样序列和肿瘤类型。
实例6：LM-LLO-E7疫苗是安全的并改善宫颈癌患者的临床指标
材料和实验方法
入选标准.试验中的全部患者均诊断为“晚期、进展性或复发性宫颈癌”且入选时的评估指示全部分级为患有IVB疾病。全部患者均表现出对含有选自制念珠菌素、流行性腮腺炎、破伤风或结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)的3种记忆抗原的失能组(anergy panel)具有阳性免疫应答，未怀孕或HIV阳性，在4周内未服用试验药且未接受类固醇。
方案：以3周的间隔以250ml生理盐水中的30分钟静脉内(IV)输注形式向住院病人施用2次疫苗接种。5天后，患者接受单一疗程的IV氨苄西林且出院，额外口服10天氨苄西林。Karnofsky机能状况量表(Karnofsky performance index)为整体活力和生活质量(诸如食欲、完成每日任务的能力、平静睡眠等)的量度，其用于确定总体幸福感。另外，确定以下安全性和一般幸福感指标：碱性磷酸酶；直接胆红素和总胆红素；γ谷氨酰转肽酶(ggt)；胆固醇；心脏收缩、心脏舒张和心率；用于评估疾病进展的美国东部肿瘤协作组(ECOG)准则-Karnofsky类生活质量指标；血容比；血红蛋白；血小板水平；淋巴细胞水平；AST(天冬氨酸转氨酶)；ALT(丙氨酸转氨酶)；以及LDH(乳酸脱氢酶)。在第二次给药之后的3周和3个月对患者进行随访，此时确定患者的实体瘤治疗疗效评价标准(RECIST)评分，进行扫描以测定肿瘤大小，且收集血液样品用于在试验结束时进行免疫分析，其包括评价IFN-γ、IL-4、CD4+和CD8+细胞群。
李斯特菌菌株：LM-LLO-E7的产生在实例1中描述。
结果
在临床试验前，开展了临床前实验以确定LM-LLO-E7的静脉内(i.v.)对比i.p.施用的抗肿瘤功效。在皮下建立了含有1×104个TC-1细胞的肿瘤。在第7和14天，将小鼠用108LM-LLO-E7i.p.或LM-LLO-E7i.v.以108、107、106或105的剂量免疫。在第35天，接受108LM-LLO-E7(通过任一途径)或107LM-LLO-E7i.v.的8只小鼠中的5只，以及接受106LM-LLO-E7的8只小鼠中的4只被治愈。相比之下，i.p.施用的小于107或者在一些情况下甚至108LM-LLO-E7的剂量对于控制肿瘤生长无效。因此，LM-LLO-E7的i.v.施用比i.p.施用更有效。
临床试验
开展了I/II期临床试验以评估LM-LLO-E7疫苗在具有晚期、进展性或复发性宫颈癌的患者中的安全性和疗效。5名患者各自被分配到分别接受1×109或3.3×109个CFU的队列1-2。另外5名患者各自将被分配到分别接受1×1010或3.31×1010个CFU的队列3-4。
安全性数据
第一队列
第一队列中的全部患者在输注开始后1-2小时内均报导出现轻度至中度发热和发冷。一些患者表现出伴有恶心或不伴有恶心的呕吐。1个例外(下文描述)，单次剂量的非类固醇药剂(诸如扑热息痛)足以解决这些症状。观察到轻微、短暂的心血管作用，与发热相符且与发热同时。未报导其他不良作用。
在此宫颈癌的晚期，1年存活率通常为10-15％患者且尚无有效的肿瘤疗法。实际上，患者2为患有极具侵袭性疾病的年轻患者，其在完成试验之后不久去世。
在施用后第2天、第3天和第5天评估定量血液培养物。在此队列中的5名可评估患者中，4名在任何时间均表现出无血清李斯特菌，而1名在第2天具有极少量(35个cfu)的循环李斯特菌，在第3天或第5天具有不可检测的李斯特菌。
对初始疫苗接种起反应的患者5在施用之后48小时具有轻度发热，且用抗炎剂治疗。在1个情景中，发热升至中等严重程度(任何时间均不超过38.4℃)，此后向她给予一个疗程的氨苄西林，发热消退。在抗生素施用期间，她经历轻度风疹，在抗生素施用后结束。血液培养物全部无菌，心血管数据在针对其他患者观测到的范围内，且血清化学值正常，显示此患者不具有李斯特菌疾病。另外，失能组指示对1/3记忆抗原的稳健应答，指示存在功能性免疫(类似于其他患者)。患者5随后证明类似于全部其他患者在接受强化时的应答。
第二队列和总体安全性观测
在两个队列中，在输注后观察到肝功能测试中的轻微和短暂改变。这些改变由监控试验的主治医生确定为不具有临床意义，且预期存在从全身循环快速移除至肝脏和脾脏的短暂细菌感染。一般而言，上文的方法章节中所述的全部安全性指标几乎不或不显示出净变化，指示优异的安全特性。此队列中的副作用特性与初始队列中所见的几乎完全相同，且似乎为与细胞因子和类似因子的后果相关的一系列非剂量依赖性症状，其因引起医源性感染而产生。在任何时间均未观测到血清李斯特菌且任一队列中均未观测到剂量限制性毒性。
功效-第一队列
在完成试验的第一队列的3名患者中观察到以下功效指示：(图9)。
入选试验的患者1具有2个各为20mm的肿瘤，其在试验过程中缩小至18和14mm，指示疫苗的治疗功效。另外，入选试验的患者1的Karnofsky机能状况量表为70，其在给药后升至90。在安全性审查小组(Safety Review Panel)会议中，塞尔维亚贝尔格莱德肿瘤学和放射学研究所肿瘤科(Department of Oncology,Institute for Oncology and Radiology,Belgrade,Serbia)主任Radulovic向开展试验的单位的代表展示了结果：作为该单位的顾问工作的独立肿瘤学家Michael Kurman；艾莫利大学(Emory University)的理论妇科肿瘤学家Kevin Ault，其为Merck开展III期Gardasil试验且为Glaxo SmithKline开展Cervarix试验；以及Tate Thigpen，其为NCI妇科肿瘤学小组(Gynecologic OncologyGroup)创始人和密西西比大学(University of Mississippi)妇科肿瘤学教授。在Radulovic博士的观点中，患者1表现出来自用疫苗治疗的临床益处。
在去世之前，患者2表现出混合应答，肿瘤缩小1/2。
入选的患者3患有副肿瘤疾病(癌症附带现象，其中患者的整体虚弱状态具有继发于癌症的其他后遗症)，包括血小板数升至936×109/ml。在第一剂之后，该计数降至405×109/ml，大致为正常水平。
入选试验的患者4具有2个各为20mm的肿瘤，其在试验过程中缩小至18和14mm，指示疫苗的治疗功效。患者4在第一和第二剂之间表现出1.6Kg的体重增加和约10％的血红蛋白计数增加。
功效-第二队列和一般观察
在最低剂量队列中，2名患者证实肿瘤缩小。此作用的时间与免疫应答中观察到的相符，因为其遵循免疫应答的时间顺序发展。第二队列中迄今为止评估肿瘤负荷的2名患者中的一名在疫苗接种后的时间点表现出显著的肿瘤负荷降低。在试验开始时，此患者具有13、13和14mm的3个肿瘤。2剂疫苗后，2个肿瘤缩小至9.4和12mm，且第三个不再可检测。
图13B中描绘了2个队列的肿瘤负荷。总体而言，即使在包括初免注射和单次强化的治疗方案中施用的相对低剂量的LM-LLO-E7也在6名已收集数据的患者中获得3个客观反应。
讨论
在此宫颈癌的晚期，1年存活率通常为10-15％患者且尚无有效的肿瘤疗法。没有治疗显示出能有效逆转IVB期宫颈癌。尽管治疗此阶段的宫颈癌有困难，但在2/6名患者中观察到抗肿瘤作用。另外，如上文所述，在完成试验的患者中观察到其他功效指示。
因此，LM-LLO-E7在人类受试者中是安全的且即使在相对低的剂量下施用时也改善宫颈癌患者的临床指标。当增加强化接种的剂量和数量时；和/或当以较低的剂量或在输注后较晚的时间点施用抗生素时，可能观察到额外的阳性结果。临床前研究已显示单个数量级的剂量增加可引起反应率的显著改变(例如，从0％反应率变为50-100％完全缓解率。额外的强化剂量还极有可能进一步提高所得的免疫应答。此外，观察到的治疗性免疫应答的阳性作用可能随着额外时间的推移而继续，因为免疫系统继续攻击癌症。
实例7：构建减毒李斯特菌菌株-LmddΔactA并且将人klk3基因同框插入Lmdd和Lmdda菌株中的hly基因。
材料和方法
开发了分泌融合到tLLO的PSA的重组Lm(Lm-LLO-PSA)，该重组Lm引起与前列腺癌小鼠模型中的肿瘤消退相关的强效PSA特异性免疫应答，其中tLLO-PSA的表达源自基于pGG55的质粒(表2)，其赋予载体以抗生素抗性。我们最近开发出用于基于pADV142质粒的PSA疫苗的新菌株，其不具有抗生素抗性标记并且称为LmddA-142(表3)。此新菌株与Lm-LLO-PSA相比减毒10倍。另外，LmddA-142比Lm-LLO-PSA略微更具免疫原性并且显著更有效地消退PSA表达肿瘤。
表2.质粒和菌株
质粒pAdv142(6523bp)的序列如下：
cggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttctagccctcctttgattagtatattcctatcttaaagttacttttatgtggaggcattaacatttgttaatgacgtcaaaaggatagcaagactagaataaagctataaagcaagcatataatattgcgtttcatctttagaagcgaatttcgccaatattataattatcaaaagagaggggtggcaaacggtatttggcattattaggttaaaaaatgtagaaggagagtgaaacccatgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatctcgagattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctc 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ID NO:41)。2008年2月20日在Genewiz实验室从大肠杆菌菌株对此质粒进行测序。
通过毒力因子ActA的不可逆缺失，使菌株Lm dal dat(Lmdd)减毒。构建actA在Lmdal/dat(Lmdd)背景下的框内缺失，以避免对下游基因的表达的任何极化效应。Lm daldatΔactA含有在N-端处的前19个氨基酸和C-端的28个氨基酸残基，缺失了ActA的591个氨基酸。
通过扩增对应于actA的上游(657bp-寡核苷酸的Adv 271/272)部分和下游(625bp-寡核苷酸的Adv273/274)部分的染色体区域并且通过PCR接合而产生actA缺失突变体。用于此扩增的引物序列在表3中给出。actA的上游和下游DNA区在EcoRI/PstI限制位点克隆到pNEB193中并且来自此质粒，EcoRI/PstI进一步克隆到温敏质粒pKSV7中，从而产生ΔactA/pKSV7(pAdv120)。
表3：用于扩增actA的上游和下游的DNA序列的引物序列
使用外部结合至actA缺失区域的引物来验证从其染色体位置的基因缺失，所述引物在图10A和图10B中显示为引物3(Adv 305-tgggatggccaagaaattc；SEQ ID NO:46)和引物4(Adv304-ctaccatgtcttccgttgcttg；SEQ ID NO:47)。在分离自Lmdd和Lm-ddΔactA的染色体DNA上进行PCR分析。预期在Lmdd染色体DNA中用两组不同的引物对1/2和3/4扩增以后的DNA片段的大小为3.0Kb和3.4Kb。另一方面，对于LmddΔactA，使用引物对1/2和3/4的PCR的预期大小为1.2Kb和1.6Kb。因此，在图10A和图10B中的PCR分析确认actA的1.8kb区域在LmddΔactA菌株中缺失。还对PCR产物进行了DNA测序，以证实含有actA的区在菌株Lm-ddΔactA中的缺失。
实例8：构建用于Lm载体的抗原递送的与抗生素无关的游离型表达系统。
用于Lm载体(pAdv142)的抗原递送的与抗生素无关的游离型表达系统为不含抗生素的质粒pTV3的下一代(Verch等人,Infect Immun,2004.72(11):6418-25，以引用方式并入本文中)。用于毒力基因转录激活因子的基因prfA从pTV3缺失，因为李斯特菌菌株Lmdd在染色体中含有prfA基因的拷贝。此外，NheI/PacI限制位点的p60-李斯特菌dal的盒置换为p60-枯草芽孢杆菌dal，从而产生质粒pAdv134(图11A)。李斯特菌和芽孢杆菌dal基因的相似性为～30％，从而实际上消除了质粒与Lmdd染色体中的dal基因的剩余片段之间重组的机会。质粒pAdv134含有抗原表达盒tLLO-E7。将LmddA菌株用pADV134质粒转化并且通过Western印迹确认来自所选克隆的LLO-E7蛋白的表达(图11B)。源自10403S野生型菌株的Lmdd系统缺乏抗生素抗性标记，但具有Lmdd链霉素抗性。
另外，将pAdv134用XhoI/XmaI限制以克隆人PSA klk3，从而产生质粒pAdv142。新质粒pAdv142(图11C，表2)含有在李斯特菌p60启动子控制下的芽孢杆菌dal(B-Dal)。穿梭质粒pAdv142在无外源性D-丙氨酸存在下补充大肠杆菌ala drx MB2159和单核细胞增多性李斯特菌菌株Lmdd的生长。质粒pAdv142中的抗原表达盒由hly启动子和LLO-PSA融合蛋白组成(图11C)。
质粒pAdv142转化至李斯特菌背景菌株LmddactA菌株，从而产生Lm-ddA-LLO-PSA。LLO-PSA融合蛋白经菌株Lm-ddA-LLO-PSA的表达和分泌通过Western印迹使用抗LLO和抗PSA抗体来确认(图11D)。在两次体内传代后，菌株Lm-ddA-LLO-PSA稳定表达和分泌LLO-PSA融合蛋白。
实例9：菌株LmddA-LLO-PSA的体外和体内稳定性
通过在选择性压力存在或不存在下培养LmddA-LLO-PSA李斯特菌菌株八天来检验质粒的体外稳定性。菌株LmddA-LLO-PSA的选择性压力为D-丙氨酸。因此，菌株LmddA-LLO-PSA在脑-心输注(BHI)和BHI+100μg/ml D-丙氨酸中传代。在铺板于选择性(BHI)和非选择性(BHI+D-丙氨酸)培养基上之后测定每天的CFU。预期质粒损失将导致铺板于非选择性培养基(BHI+D-丙氨酸)上之后CFU较高。如图12A中所示，选择性和非选择性培养基中的CFU数量之间不存在差异。这表明当实验终止时，质粒pAdv142稳定至少50代。
通过在C57BL/6小鼠中静脉内注射5×107个CFU LmddA-LLO-PSA来测定质粒体内维持。在24小时和48小时从在PBS中均质化的脾脏分离有活力的细菌。在BHI板和BHI+100g/ml D-丙氨酸上测定各时间点的各样品的CFU。将脾细胞铺板于选择性和非选择性培养基之后，在24小时后回收集落。由于此菌株高度减毒，因此在24小时内体内清除细菌负荷。选择性和非选择性板上未检测到显著CFU差异，指示重组质粒在所有分离的细菌中稳定存在(图12B)。
实例10：菌株LmddA-142(LmddA-LLO-PSA)的体内传代、毒力和清除率
LmddA-142为分泌游离型表达的tLLO-PSA融合蛋白的重组李斯特菌菌株。为了测定安全剂量，将小鼠用多种剂量的LmddA-LLO-PSA免疫并且测定毒性效应。LmddA-LLO-PSA引起最小毒性效应(数据未示出)。结果表明小鼠良好耐受108个CFU LmddA-LLO-PSA剂量。毒力研究指示菌株LmddA-LLO-PSA高度减毒。
测定在C57BL/6小鼠中腹膜内施用安全剂量108个CFU后LmddA-LLO-PSA的体内清除率。第2天后，用LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠的肝脏和脾脏中不存在可检测的集落。因为此菌株高度减毒，所以其在48小时时完全体内清除(图13A)。
为了确定LmddA-LLO-PSA的减毒是否会减弱菌株LmddA-LLO-PSA感染巨噬细胞和胞内生长的能力，进行了感染测定。将诸如J774A.1的小鼠巨噬细胞样细胞系用李斯特菌构建体体外感染并且对胞内生长进行定量。阳性对照菌株野生型李斯特菌菌株10403S胞内生长，并且prfA突变体阴性对照XFL7不能逃离吞噬溶菌体并且因此不会在J774细胞中生长。LmddA-LLO-PSA的胞质内生长比10403S缓慢，因为此菌株失去从细胞扩散至细胞的能力(图13B)。结果指示LmddA-LLO-PSA有能力感染巨噬细胞和胞质内生长。
实例11：菌株-LmddA-LLO-PSA在C57BL/6小鼠中的免疫原性
使用PSA四聚物染色测定C57BL/6小鼠中由构建体LmddA-LLO-PSA引起的PSA特异性免疫应答。小鼠以一周间隔用LmddA-LLO-PSA免疫两次并且在强化后第6天将脾细胞针对PSA四聚物染色。用PSA特异性四聚物对脾细胞的染色显示LmddA-LLO-PSA引起23％的PSA四聚物+CD8+CD62L低细胞(图14A)。使用胞内细胞因子染色检验PSA特异性T细胞在用PSA肽刺激5小时后分泌IFN-γ的功能性能力。LmddA-LLO-PSA组相较于未暴露的小鼠，用PSA肽刺激的CD8+CD62L低IFN-γ分泌细胞的百分比提高200倍(图14B)，指示LmddA-LLO-PSA极具免疫原性并且在脾脏中针对PSA引起高水平的功能活性PSA CD8+ T细胞应答。
为了测定用LmddA-LLO-PSA免疫小鼠后针对PSA产生的细胞毒性T细胞的功能性活性，我们在体外测定中测试了PSA特异性CTL对用H-2Db肽脉冲处理的细胞EL4细胞进行裂解的能力。使用基于FACS的卡斯蛋白酶测定(图14C)和铕释放(图14D)来测量细胞裂解。用LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠的脾细胞含有对呈现PSA肽作为靶抗原的细胞具有高细胞溶解活性的CTL。
进行Elispot来测定效应T细胞在用抗原刺激24小时后分泌IFN-γ的能力。使用ELISpot，观察到来自用特异性肽刺激的LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠的脾细胞中的IFN-γ斑点数相较于未暴露的小鼠的脾细胞提高20倍(图14E)。
实例12：用LmddA-142菌株免疫诱导表达PSA的肿瘤的消退和PSA特异性CTL对肿瘤的浸润。
使用工程化以表达PSA的前列腺腺癌细胞系测定构建体LmddA-142(LmddA-LLO-PSA)的治疗功效(Tramp-C1-PSA(TPSA)；Shahabi等人，2008年)。将小鼠皮下植入2×106个TPSA细胞。当肿瘤在肿瘤接种后第6天达到4-6mm可触大小时，小鼠以一周间隔用108个CFULmddA-142、107个CFU Lm-LLO-PSA(阳性对照)免疫三次或不做处理。未暴露的小鼠逐渐产生肿瘤(图15A)。用LmddA-142免疫的小鼠直至第35天全部无肿瘤并且8只小鼠中有3只逐渐产生肿瘤，其相较于未暴露的小鼠以慢得多的速率生长(图15B)。在第70天，八只小鼠中有五只仍无肿瘤。正如预期，Lm-LLO-PSA接种的小鼠的肿瘤比未暴露的对照小并且肿瘤产生比对照中缓慢(图15C)。因此，构建体LmddA-LLO-PSA可消退TPSA细胞系建立的60％肿瘤并且减缓其他小鼠中的肿瘤生长。仍无肿瘤的治愈小鼠在第68天用TPSA肿瘤再挑战。
用LmddA-142免疫小鼠可控制7天建立的Tramp-C1肿瘤的生长和诱导其消退，相较于未暴露的组中的无结果(图15A)，所述肿瘤经工程化以在超过60％的实验动物中表达PSA(图15B)。使用高度减毒载体(LmddA)和质粒pADV142来构建LmddA-142(表2)。
另外，研究了LmddA-LLO-PSA构建体产生的PSA特异性CD8淋巴细胞浸润肿瘤的能力。将肿瘤和基质胶的混合物皮下植入小鼠，随后以七天间隔用未暴露的或对照(Lm-LLO-E7)李斯特菌或用LmddA-LLO-PSA免疫两次。在第21天切除肿瘤并且分析肿瘤中浸润的CD8+CD62L低PSA四聚物+和CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞群体。
观察到极低数量的CD8+CD62L低PSA四聚物+肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)对未暴露的和Lm-LLO-E7对照免疫小鼠中存在的PSA具有特异性。然而，用LmddA-LLO-PSA免疫的小鼠中PSA特异性CD8+CD62L低PSA四聚物+TIL百分比增加10-30倍(图7A)。有趣的是，脾脏中的CD8+CD62L低PSA四聚物+细胞群体比肿瘤中少7.5倍(图16A)。
另外，测定未处理的小鼠和李斯特菌免疫小鼠的肿瘤中CD4+/CD25+/Foxp3+ T调节细胞(Treg)的存在。有趣的是，用李斯特菌免疫导致肿瘤而非脾脏中的CD4+ CD25+FoxP3+T-reg数量显著降低(图16B)。然而，构建体LmddA-LLO-PSA对降低肿瘤中的CD4+ CD25+FoxP3+ T-reg的频率的影响比未暴露的和Lm-LLO-E7免疫组强(图16B)。
因此，LmddA-142疫苗可诱导能够浸润肿瘤部位的PSA特异性CD8+ T细胞(图16A)。有趣的是，用LmddA-142免疫与肿瘤中的调节性T细胞数量减少有关(图16B)，从而可能形成对高效抗肿瘤CTL活性更有利的环境。
实例13：尽管PSA融合，但Lmdd-143和LmddA-143分泌功能性LLO。
Lmdd-143和LmddA-143含有全长人klk3基因，其编码PSA蛋白，该蛋白经同源重组下游插入并且与染色体中的hly基因同框。这些构建体使用pKSV7质粒(Smith和Biochimie.1992；74(7-8)第705-711页)通过同源重组制备，所述质粒为温敏复制子，携带hly-klk3-mpl重组盒。因为第二重组事件之后切除质粒，所以失去用于整合选择的抗生素抗性标记。此外，actA基因在LmddA-143菌株中缺失(图17A)。通过两个构建体中的PCR(图17B)和测序(数据未示出)来验证klk3与hly向染色体中的同框插入。
这些染色体构建体的一个重要方面为LLO-PSA的产生将不会完全消除LLO功能，李斯特菌从单核细胞增多性李斯特菌产生的吞噬体、胞质溶胶侵袭和高效免疫性逃离需要所述LLO功能。对来自Lmdd-143和LmddA-143培养上清液的分泌的蛋白质的Western印迹分析揭示出，对应于LLO-PSA融合蛋白的～81kDa条带和～60kDa条带(其为LLO的预期大小)(图18A)，指示LLO从LLO-PSA融合物裂解或仍作为单个蛋白质由单核细胞增多性李斯特菌产生，而与染色体中的融合基因无关。Lmdd-143和LmddA-143分泌的LLO相较于野生型单核细胞增多性李斯特菌10403S保留50％的溶血活性(图18B)。与这些结果一致，Lmdd-143和LmddA-143能够在巨噬细胞样J774细胞系中胞内复制(图18C)。
实例14：Lmdd-143和LmddA-143均引起针对PSA抗原的细胞介导的免疫应答。
在显示Lmdd-143和LmddA-143能够分泌融合到LLO的PSA之后，研究了这些菌株是否可在体内引起PSA特异性免疫应答的问题。C57Bl/6小鼠不做处理或用Lmdd-143、LmddA-143或LmddA-142免疫两次。通过用PSA65-74肽刺激脾细胞和针对IFN-γ进行胞内染色来测量PSA特异性CD8+ T细胞应答。如图19中示出，染色体和基于质粒的载体诱导的免疫应答类似。
材料与方法(实例15-20)
寡核苷酸由Invitrogen(Carlsbad,CA)合成，并且DNA测序由Genewiz Inc,SouthPlainfield,NJ进行。流式细胞术试剂购自Becton Dickinson Biosciences(BD,SanDiego,CA)。除非另外指明，否则细胞培养基、补充剂和所有其他试剂均购自Sigma(St.Louise,MO)。由EZbiolabs(Westfield,IN)合成Her2/neu HLA-A2肽。完全RPMI 1640(C-RPMI)培养基包含2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠、10％胎牛血清、青霉素/链霉素、Hepes(25mM)。之前描述了多克隆抗LLO抗体，抗Her2/neu抗体购自Sigma。
小鼠和细胞系
所有动物实验均根据University of Pennsylvania或Rutgers University的IACUC批准的方案进行。FVB/N小鼠购自Jackson laboratories(Bar Harbor,ME)。在University of Pennsylvania的动物中心机构安置和饲养FVB/N Her2/neu转基因小鼠，其过表达大鼠Her2/neu肿瘤蛋白。NT-2肿瘤细胞系表达高水平的大鼠Her2/neu蛋白，源自这些小鼠中的自发性乳腺肿瘤，并按之前的描述生长。DHFR-G8(3T3/neu)细胞得自ATCC并且根据ATCC推荐方案生长。EMT6-Luc细胞系由John Ohlfest博士(University ofMinnesota,MN)慷慨赠送，并在完全C-RPMI培养基中生长。生物荧光工作在University ofPennsylvania(Philadelphia,PA)的Small Animal Imaging Facility(SAIF)的指导下进行。
李斯特菌构建体和抗原表达
Her2/neu-pGEM7Z由University of Pennsylvania的Mark Greene博士友好提供，并含有克隆进pGEM7Z质粒(Promega,Madison WI)中的全长人Her2/neu(hHer2)基因。将该质粒用作模板，以使用表4所示的pfx DNA聚合酶(Invitrogen)和寡聚物，通过PCR扩增hHer-2/neu的三个区段，即EC1、EC2和IC1。
表4：用于克隆人her-2嵌合体的引物
通过SOEing PCR方法，并将每个单独的hHer-2/neu区段作为模板，通过直接融合产生Her-2/neu嵌合构建体。引物显示在表5中。
表5
用于扩增不同片段人Her2区域的引物序列
使用XhoI和SpeI限制性酶从pAdv138切离ChHer2基因，并将其与LLO的截短的、非溶血性片段同框克隆进Lmdd穿梭载体pAdv134中。插入序列LLO和hly启动子通过DNA测序分析确认。将该质粒电穿孔转化至电感受态actA、dal、dat突变单核细胞增多性李斯特菌菌株，在包含链霉素(250μg/ml)的脑心浸液(BHI)琼脂平板上选择LmddA和阳性克隆。在一些实验中，表达hHer2/neu(Lm-hHer2)片段的类似李斯特菌菌株用于对比目的。在所有研究中，包括不相关李斯特菌构建体(Lm-对照)，以考虑到李斯特菌对免疫系统的抗原非依赖性效应。Lm对照基于与ADXS31-164(LmddA-ChHer2)相同的李斯特菌平台，但表达不同的抗原，诸如HPV16-E7或NY-ESO-1。测试李斯特菌的融合蛋白的表达和分泌。每个构建体体内传代两次。
细胞毒性分析
以3-5只FVB/N小鼠为一组，使用1×108个集落形成单位(CFU)的Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164、Lm-hHer2ICI或Lm-对照(表达不相关抗原)以一周为间隔免疫三次或保持未暴露的。使NT-2细胞体外生长，通过胰蛋白酶脱壁，并用丝裂霉素C(250μg/ml，溶于无血清C-RPMI培养基)在37℃下处理45分钟。在洗涤5次后，将其与从免疫或未暴露的动物收集的脾细胞以1:5(刺激因子:应答细胞)的比率在37℃和5％CO2下一起温育5天。标准细胞毒性分析使用铕标记的3T3/neu(DHFR-G8)细胞作为靶标根据前述方法进行。在4小时温育后使用分光光度计(Perkin Elmer，Victor2)在590nm下测定从杀死的靶细胞释放的铕。特异性裂解的百分比定义为(实验组的裂解-自发性裂解)/(最大裂解-自发性裂解)。
免疫小鼠的脾细胞分泌的干扰素-γ
以3-5只FVB/N或HLA-A2转基因小鼠为一组，使用1×108个CFU的阴性李斯特菌对照ADXS31-164(表达不相关抗原)以一周为间隔免疫三次或保持未暴露的。在最后免疫后一周分离FVB/N小鼠的脾细胞，并以5×106个细胞/孔在24孔板中的C-RPMI培养基中在存在丝裂霉素C处理的NT-2细胞的情况下共培养。在1μM HLA-A2特异性肽或1μg/ml重组His-标记的ChHer2蛋白(大肠杆菌中产生并且通过基于镍的亲和色谱系统纯化)存在下，温育来自HLA-A2转基因小鼠的脾细胞。在24或72小时后从上清液获得样品，使用小鼠IFN-γ酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒根据制造商的推荐方案测试干扰素-γ(IFN-γ)的存在。
Her2转基因动物中的肿瘤研究
用5×108个CFU的Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164或Lm对照免疫六周龄FVB/N大鼠Her2/neu转基因小鼠(9-14只/组)6次。每周观察自发性乳腺肿瘤的出现两次，使用电子卡尺测量肿瘤，最多52周。当平均直径大小达到1cm2时切下逃逸的肿瘤，在-20℃下保存于RNAlater中°。为了确定Her2/neu蛋白中的突变对这些肿瘤逃逸的影响，使用基因组DNA分离试剂盒提取基因组DNA并且测序。
ADXS31-164对脾脏和肿瘤中调节性T细胞的作用
将小鼠皮下(s.c.)植入1×106个NT-2细胞。在第7、14和21天，使用1×108个CFU的ADXS31-164、LmddA-对照对它们进行免疫或保持未暴露的。在第28天提取肿瘤和脾脏并通过FACS分析测试CD3+/CD4+/FoxP3+ Treg的存在。简而言之，通过在C-RPMI培养基中匀化两个载玻片之间的脾脏而分离脾细胞。使用无菌刀片切碎肿瘤，并用包含DNA酶(12U/ml)和溶于PBS的胶原酶(2mg/ml)的缓冲液消化。在室温下搅拌温育60min后，通过猛烈吹打而分离细胞。用RBC裂解缓冲液裂解红细胞，然后用包含10％FBS的完全RPMI-1640培养基洗涤多次。在通过尼龙网过滤后，将肿瘤细胞和脾细胞重悬于FACS缓冲液(2％FBS/PBS)中，用抗CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC、CD25-APC抗体染色，然后进行透化和抗Foxp3-PE染色。使用4色FACS calibur(BD)进行流式细胞分析，使用cell quest软件(BD)分析数据。
统计学分析
将对数秩卡方检验用于存活期数据，并将学生t-检验用于CTL和ELISA分析，所述分析一式三份地进行。在这些分析中，小于0.05的p-值(以*标记)被视为具有统计学上的显著性。所有统计学分析均使用Prism软件V.4.0a(2006)或SPSS软件V.15.0(2006)进行。除非另有说明，否则对于所有的FVB/N大鼠Her2/neu转基因研究，我们均使用8-14只小鼠/组，对于所有野生型FVB/N研究，我们均使用至少8只小鼠/组。除了在Her2/neu转基因小鼠模型中的长期肿瘤研究以外，所有研究重复至少一次。
实例15：分泌与Her-2片段融合的LLO片段的单核细胞增多性李斯特菌菌株的制备：ADXS31-164的构建
嵌合的Her2/neu基因(ChHer2)的构建如下文所述。简而言之，通过SOEingPCR方法，通过直接融合Her2/neu蛋白的两个胞外片段(氨基酸40-170和氨基酸359-433)和一个胞内片段(氨基酸678-808)，制备ChHer2基因。嵌合蛋白具有蛋白的大部分已知的人MHC I类表位。从质粒pAdv138(其用于构建Lm-LLO-ChHer2)切离ChHer2基因，并克隆进LmddA穿梭质粒，从而产生质粒pAdv164(图20A)。这两个质粒骨架之间有两个主要差异。1)pAdv138使用氯霉素抗性标记(cat)进行重组细菌的体外选择，而pAdv164具有枯草芽孢杆菌的D-丙氨酸消旋酶基因(dal)，它使用缺乏dal-dat基因的LmddA菌株中的体外选择和体内质粒保持的代谢互补通路。此疫苗平台被设计和开发成解决FDA对工程化李斯特菌疫苗株的抗生素抗性的关注。2)与pAdv138不同，pAdv164不具有质粒中的prfA基因拷贝(参见以下序列和图20A)，因为这不是Lmdd菌株的体内互补必需的。LmddA疫苗株还缺乏actA基因(负责李斯特菌的胞内移动和细胞间播散)，因此来源于此骨架的重组疫苗株的毒性比来源于其亲代菌株Lmdd的那些小100倍。基于LmddA的疫苗从免疫小鼠脾脏的清除也比基于Lmdd的疫苗快(在不到48小时内)。体外生长8小时之后经TCA沉淀的细胞培养物上清液中，来自该菌株的融合蛋白tLLO-ChHer2的表达和分泌与Lm-LLO-ChHer2的表达和分泌相当(图20B)，因为使用Western印迹分析通过抗LLO抗体检测到～104KD的带。仅表达tLLO的李斯特菌骨架菌株用作阴性对照。
pAdv164序列(7075个碱基对)(参见图20A和20B)：
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IDNO:77)
实例16：ADXS31-164的免疫原性与Lm-LLO-ChHER2一样
在标准CTL测定中，将ADXS31-164在产生抗Her2/neu特异性细胞毒性T细胞方面的免疫原性性质与Lm-LLO-ChHer2疫苗的进行比较。两种疫苗引起对由3T3/neu靶细胞表达的Her2/neu抗原强烈的但是相当的细胞毒性T细胞应答。因此，使用仅表达融合至LLO的Her2胞内片段的李斯特菌免疫的小鼠显示出比包含多个MHC I类表位的嵌合体更低的裂解活性。在未暴露的动物或不相关李斯特菌疫苗注射的小鼠中未检测到CTL活性(图21A)。ADXS31-164也能够刺激得自野生型FVB/N小鼠的脾细胞分泌IFN-γ(图21B)。这在与经丝裂霉素C处理的表达高水平的Her2/neu抗原的NT-2细胞共培养的这些细胞的培养物上清液中检测到(图21C)。
在HLA-A2小鼠中测试了ADXS31-164免疫后人MHC I类表位的适当处理和呈递。将来自经免疫的HLA-A2转基因动物的脾细胞与对应于标绘的HLA-A2限制性表位的肽一起温育72小时，所述HLA-A2限制性表位位于Her2/neu分子的胞外(HLYQGCQVV SEQ ID NO:59或KIFGSLAFL SEQ ID NO:60)或胞内(RLLQETELV SEQ ID NO:61)结构域(图21C)。重组ChHer2蛋白用作阳性对照，不相关肽或无肽作为阴性对照。来自该实验的数据表明：ADXS31-164能够引起针对位于靶抗原的不同域处的人表位的抗Her2/neu特异性免疫应答。
实例17：ADXS31-164在预防自发性乳腺肿瘤的发作中比LM-LLO-ChHER2更有效
对比了ADXS31-164与Lm-LLO-ChHer2在Her2/neu转基因动物中的抗肿瘤效果，该转基因动物在20-25周龄时产生缓慢生长的、自发性乳腺肿瘤。所有使用不相关李斯特菌对照疫苗免疫的动物在21-25周内患上乳腺肿瘤并且在第33周前处死。相比而言，李斯特菌-Her2/neu重组疫苗导致乳腺肿瘤形成的明显延迟。在第45周，超过50％的ADXS31-164疫苗接种的小鼠(9只中的5只)仍无肿瘤，相比之下，使用Lm-LLO-ChHer2免疫的小鼠只有25％。在第52周，8只经ADXS31-164免疫的小鼠中的2只仍保持无肿瘤，而来自其他实验组的所有小鼠均已死于它们的疾病(图22)。这些结果指出：尽管ADXS31-164更加减毒，但是其在Her2/neu转基因动物中预防自发性乳腺肿瘤的发作方面比Lm-LLO-ChHer2更有效。
实例18：经ADXS31-164免疫后HER2/NEU基因的突变
Her2/neu的MHC I类表位中的突变已被认为是造成以小片段疫苗或曲妥珠单抗(赫赛汀，一种靶向Her2/neu的胞外域中的表位的单克隆抗体)免疫后的肿瘤逃逸的原因。为评估该作用，从转基因动物中的逃逸肿瘤提取基因组物质，并对嵌合或对照疫苗免疫的肿瘤中neu基因的对应片段进行测序。在任何接种疫苗的肿瘤样品的Her-2/neu基因中均未观察到突变，这提示替代性逃逸机制(数据未显示)。
实例19：ADXS31-164引起肿瘤内调节性T细胞的明显下降
为阐明ADXS31-164对脾脏和肿瘤中调节性T细胞频率的影响，将NT-2肿瘤细胞植入小鼠。在三次免疫后分离脾细胞和肿瘤内淋巴细胞并对Treg染色，Treg定义为CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+细胞，但是当单独分析时，FoxP3或CD25标记获得了类似的结果。结果指出：与不相关李斯特菌或未暴露的动物相比，ADXS31-164免疫对脾中Treg的频率没有影响(图23)。相比之下，李斯特菌疫苗免疫对肿瘤中Treg的存在产生很大的影响(图24A)。然而在未处理肿瘤中所有CD3+ T细胞中平均19.0％是Treg，该频率对于不相关疫苗而言下降至4.2％，并且对于ADXS31-164而言下降至3.4％，肿瘤内Treg的频率下降了5倍(图24B)。任一LmddA疫苗治疗的小鼠中肿瘤内Treg的频率降低不能归因于肿瘤大小的差异。在代表性实验中，ADXS31-164免疫的小鼠的肿瘤显著小于[平均直径(mm)±SD，6.71±0.43，n＝5]未治疗的小鼠(8.69±0.98,n＝5,p<0.01)或不相关疫苗治疗的小鼠(8.41±1.47,n＝5,p＝0.04)的肿瘤，而最后两组的比较未显示出肿瘤大小的统计学上的显著差异(p＝0.73)。LmddA疫苗处理的肿瘤中Treg频率的下降使肿瘤内CD8/Treg比率升高，暗示在LmddA疫苗免疫后可获得更有利的肿瘤微环境。然而，只有表达靶抗原HER2/neu的疫苗(ADXS31-164)能够减缓肿瘤生长，表明Treg的减少仅在肿瘤中存在抗原特异性应答的情况下具有作用。
实例20：ADXS31-164的外周免疫可延缓脑中转移性乳腺癌细胞系的生长
使用ADXS31-164或不相关Lm-对照疫苗IP免疫小鼠，然后颅内植入5,000个表达荧光素酶和低水平Her2/neu的EMT6-Luc肿瘤细胞(图25A)。在接种后的不同时间通过麻醉小鼠的离体成像监测肿瘤。在肿瘤接种后第8天，检测所有对照动物中的肿瘤，但ADXS31-164中的小鼠均未显示出任何可检测的肿瘤(图25A和25B)。ADXS31-164可明显延缓这些肿瘤的发病，因为在肿瘤接种后第11天阴性对照组中的所有小鼠已死于肿瘤，但ADXS31-164组中的所有小鼠仍然存活，并且仅显示出少量肿瘤生长的迹象。这些结果强烈暗示，ADXS31-164的外周施用得到的免疫应答可能到达中枢神经系统，并且基于LmddA的疫苗可具有治疗CNS肿瘤的潜在用途。
实例21：肽“微基因”表达系统
材料和方法
该表达系统被设计成有利于在羧基端包含不同肽部分的成组的重组蛋白的克隆。这通过将编码SS-Ub-肽构建体之一的序列用作模板而进行的简单PCR反应来实现。通过使用延伸到Ub序列的羧基末端区域中的引物并在该引物的3’端引入所需肽序列的密码子，可以在单个PCR反应中生成新的SS-Ub-肽序列。编码细菌启动子的5’引物和ActA信号序列的前几个核苷酸对于所有构建体而言是相同的。使用该策略生成的构建体在图26A-26C中示意性地示出。在该实例中，描述两个构建体。一个构建体包含在小鼠MHC I类上呈递的模型肽抗原，第二个构建体指明治疗性相关肽(诸如源自人胶质母细胞瘤(GBM)TAA的肽)将被取代的位置。为了清楚起见，我们设计了在图26A-C中图示为包含ActA1-100分泌信号的构建体。然而，可以用基于LLO的分泌信号代替而获得等同效果。
所提出的系统的优点之一在于将可能使用单个李斯特菌载体构建体来加载具有多个肽的细胞。使用对上述单肽表达系统的修改，可以将多个肽引入重组减毒李斯特菌(例如，prfA突变体李斯特菌或dal/dat/actA突变体李斯特菌)。编码多个不同肽的嵌合蛋白来自在一个插入片段中编码的顺序SS-Ub-肽序列。在每个SS-Ub-肽编码序列之前引入Shine-Dalgarno核糖体结合位点，以使得能够单独翻译每个肽构建体。图26C说明了被设计为由重组李斯特菌的一个菌株表达4种单独的肽抗原的构建体的示意图。由于这严格上讲是一般表达策略的表示，我们包括了源自已知小鼠或人肿瘤相关抗原或感染性疾病抗原的4种不同的MHC I类结合肽。
材料与方法(实例22-24)
质粒pAdv142和菌株LmddA142已在以上实例7处描述。下文提供了另外的详情。
质粒pAdv142和菌株LmddA142的构建
此质粒是下一代无抗生素质粒pTV3，其先前由Verch等人构建。毒力基因转录激活因子的非必需拷贝prfA从质粒pTV3缺失，因为Lm-ddA在染色体中含有prfA基因的拷贝。因此，prfA基因在含有dal的质粒中的存在不是必需的。此外，NheI/PacI限制位点处的p60-李斯特菌dal的盒置换为p60-枯草芽孢杆菌dal(dalBs)，从而产生质粒pAdv134。另外，将pAdv134用XhoI/XmaI限制以克隆人PSAklk3，从而产生质粒pAdv142。新质粒pAdv 142(图11C)含有dalBs并且其表达是在Lm p60启动子的控制下。穿梭质粒pAdv142在无外源添加的D-丙氨酸存在下补充大肠杆菌ala drxMB2159以及Lmdd的生长。质粒pAdv142中的抗原表达盒由hly启动子和LLO-PSA融合蛋白组成(图27)。
质粒pAdv142转化至李斯特菌背景菌株LmddactA菌株，从而产生LmddA142或ADXS31-142。LLO-PSA融合蛋白经菌株ADXS31-142的表达和分泌通过western分析使用抗LLO和抗PSA抗体来确认并且示出在图11D中。在C57BL/6小鼠中在两次体内传代后，菌株ADXS31-142稳定表达和分泌LLO-PSA融合蛋白。
LmddA211、LmddA223和LmddA224菌株的构建
将不同ActA/PEST区域克隆在质粒pAdv142中以形成含有ActA蛋白的不同截短片段的三个不同质粒pAdv211、pAdv223和pAdv224。
LLO信号序列(LLOss)-ActAPEST2(pAdv211)/LmddA211
通过使用SOEing PCR方法扩增前两个片段PsiI-LLOss-XbaI(大小817bp)和LLOss-XbaI-ActA-PEST2(大小602bp)并随后将其融合在一起，其中有25个碱基的重叠。此PCR产物此时含有762bp大小的PsiI-LLOss-Xbal-ActAPEST2-XhoI片段。用PsiI/XhoI限制性酶消化新PsiI-LLOss-Xbal-ActAPEST2-XhoI PCR产物和pAdv142(LmddA-PSA)质粒并纯化。建立连接并将其转化到MB2159电感受态细胞中并接种到LB琼脂板上。选择PsiI-LLOss-Xbal-ActAPEST2/pAdv 142(PSA)克隆并且通过插入片段特异性PCR反应进行筛选PsiI-LLOss-Xbal-ActAPEST2/pAdv 142(PSA)克隆#9、10是阳性的并且通过小量制备物来纯化质粒。在通过PCR筛选对克隆进行筛选之后，对来自阳性克隆的插入片段进行测序。将称为pAdv211.10的质粒PsiI-LLOss-Xbal-ActAPEST2/pAdv142(PSA)转化到李斯特菌LmddA突变体电感受态细胞中并将其接种到BHI/strep琼脂板上。通过菌落PCR筛选所得LmddA211菌株。选择若干种李斯特菌菌落并且针对内源LLO和ActAPEST2-PSA(LA229-PSA)蛋白的表达和分泌进行筛选。在小鼠中两次体内传代之后ActAPEST2-PSA融合蛋白稳定表达。
LLOss-ActAPEST3和PEST4：
通过PCR方法形成ActAPEST3和ActAPEST4片段。将含有LLOss-XbaI-ActAPEST3-XhoI(大小839bp)和LLOss-XbaI-ActAPEST4-XhoI片段(大小1146bp)的PCR产物克隆在pAdv142中。选择所得质粒pAdv223(PsiI-LLOss-Xbal-ActAPEST3-XhoI/pAdv 142)和pAdv224(PsiI-LLOss-Xbal-ActAPEST4/pAdv 142)克隆，并且通过插入片段特异性PCR反应对其进行筛选。将质粒pAdv223和pAdv224转化到LmddA骨架中，从而分别产生LmddA223和LmddA224。选择若干种李斯特菌菌落并且针对内源LLO、ActAPEST3-PSA(LmddA223)或ActAPEST4-PSA(LmddA224)蛋白的表达和分泌进行筛选。在小鼠中在两次体内传代后，融合蛋白ActAPEST3-PSA(LmddA223)或ActAPEST4-PSA(LmddA224)稳定表达和分泌。
实验计划1
使用TPSA23(PSA表达肿瘤模型)评价和比较ActA-PEST-PSA(PEST3、PEST2和PEST4序列)和tLLO-PSA的治疗功效。将未治疗小鼠用作对照组。也使用干扰素-γ的细胞内细胞因子染色和PSA四聚体染色平行评价免疫应答。
关于肿瘤消退研究。在第0天将1×106个TPSA23细胞皮下植入十组(每组八只)C57BL/6小鼠(7周龄雄性)。在第6天，这些小鼠接受免疫，该免疫之后以1周为间隔给予2个强化剂量。每周监测肿瘤生长，直到其达到平均直径1.2cm的大小。
免疫原性研究。
将2组C57BL/6小鼠(7周龄雄性)以一周为间隔用以下表所列出的疫苗免疫3次。在最后一次强化注射后六天，处死小鼠，并且将收获脾并且通过细胞内细胞因子染色对于四聚体染色和IFN-γ分泌测试免疫应答。
实验计划2
此实验是实验计划1的重复实验，然而，仅包括未暴露的、tLLO、ActA/PEST2-PSA和tLLO-PSA组。类似于实验计划1，使用TPSA23(PSA表达肿瘤模型)评价治疗功效。在第0天将1×106个TPSA23细胞皮下植入每组的五只C57BL/6小鼠。在第6天，这些小鼠接受免疫(1×108 个CFU/mL)，之后在1周后接受强化免疫。在最后一次治疗后第6天收集脾和肿瘤。使用脾和肿瘤中的PSA五聚体染色监测免疫应答。
材料与方法：
在完全培养基中培养TPSA23细胞。在将肿瘤细胞植入小鼠中之前两天，在完全培养基中次级培养TPSA23细胞。在实验当天(第0天)，将细胞胰蛋白酶处理并用PBS洗涤两次。将细胞计数并且以1×106个细胞/200ul的浓度重悬浮在PBS中/只小鼠以用于注射。在每只小鼠的侧腹皮下注射肿瘤细胞。
用于TPSA23细胞的完全培养基
通过将430ml DMEM与葡萄糖、45ml胎牛血清(FCS)、25ml Nu-血清IV、5ml100X L-谷氨酰胺、5ml 100mM丙酮酸钠、5ml 10,000U/mL青霉素/链霉素混合来制备用于TPSA23细胞的完全培养基。在细胞分裂时将0.005mg/ml牛胰岛素和10nM脱氢表雄甾酮添加到烧瓶中。
用于脾细胞的完全培养基(c-RPMI)
通过将450ml RPMI 1640、50ml胎牛血清(FCS)、5ml 1M HEPES、5ml 100X非必需氨基酸(NEAA)、5ml 100X L-谷氨酰胺、5ml 100mM丙酮酸钠、5ml10,000U/mL青霉素/链霉素和129ul 14.6M 2-巯基乙醇混合来制备完全培养基。
制备分离的脾细胞
在生物危害通风厨中进行工作。使用无菌钳和剪刀从实验和对照小鼠组中收获脾。将它们在含有10ml PBS的15ml管中转移到实验室。单独处理来自每只小鼠的脾。将脾放入无菌培养皿中并且使用来自3mL注射器的柱塞背面捣碎。将脾细胞转移到含有10ml RPMI1640的15ml管中。通过在4℃下以1,000RPM离心5min来使细胞沉淀。将上清液丢弃在10％漂白剂中。通过轻敲来轻轻破碎细胞沉淀物。通过将2ml RBC裂解缓冲液/脾添加到细胞沉淀物中来裂解RBC。使RBC裂解2min。立即将10ml c-RPMI培养基添加到细胞悬浮液中以使RBC裂解缓冲液失活。通过在4℃下以1,000RPM离心5min来使细胞沉淀。丢弃上清液并且将细胞沉淀物重悬于10ml c-RPMI中并且使其穿过细胞过滤网。使用血细胞计数器计数细胞并且通过将10μl细胞悬浮液与90μl台盼蓝染料混合来检查生活力。将约2×106个细胞用于五聚体染色。(注意：每个脾应产生1-2×108个细胞)。
使用Miltenyi小鼠肿瘤解离试剂盒由肿瘤制备单细胞悬浮液
通过将2.35mL RPMI 1640、100μL酶D、50μL酶R和12.5μL酶A添加到gentleMACS C管中来制备酶混合物。将肿瘤(0.04–1g)切成2–4mm的小块并且将其转移到含有酶混合物的gentleMACS C管中。将管倒置地连接到gentleMACS分离器的套筒上并且运行程序m_impTumor_02。在终止程序之后，将C管从gentleMACS分离器中脱离。在使用MACSmix管旋转机连续旋转的情况下将样品在37℃下孵育40分钟。在完成温育之后，再将C管倒置地连接到gentleMACS分离器的套筒上并且运行程序m_impTumor_03。使细胞悬浮液过滤穿过放置在15mL管上的70μm过滤器。将过滤器还用10mL RPMI 1640洗涤。将这些细胞以300×g离心7分钟。丢弃上清液并且将细胞重悬于10ml RPMI 1640中。此时可分出细胞以用于五聚体染色。
脾细胞的五聚体染色
使用从ProImmune可商购获得的PSA-H-2Db五聚体使用制造商推荐的方案检测PSA特异性T细胞。针对CD8、CD62L、CD3和五聚体对脾细胞进行染色。同时针对CD8、CD62L、CD45和五聚体对肿瘤细胞进行染色。门控CD3+CD8+CD62L低细胞以确定CD3+CD8+CD62L低PSA五聚体+细胞的频率。获得染色的细胞并使用Cell quest软件在FACS Calibur上进行分析。
五聚体染色所需要的材料
脾细胞(上文所述的制备物)、偶联至PE.的重组MHC PSA五聚体。(注意：确保储备五聚体一直储存在4℃下的黑暗中，其中盖紧密关闭)、偶联至PerCP Cy5.5的抗-CD3抗体、偶联至FITC的抗-CD8抗体以及偶联至APC的抗-CD62L抗体、洗涤缓冲液(于PBS中的0.1％BSA)和固定溶液(1％加热灭活胎牛血清(HI-FCBS)、于PBS中的2.5％甲醛)
标准染色方案
将PSA五聚体在冷却微型离心机中以14,000×g离心5-10分钟，以去除存在于溶液中的任何蛋白质聚集物。这些聚集物如果包含在测试体积中可导致非特异性染色。每个染色条件分配2×106个脾细胞并且每个管添加1ml洗涤缓冲液。将细胞在冷却离心机中在4℃下以500×g离心5min。将细胞沉淀物重悬于残余体积(～50μl)中。将所有管在冰上冷却以用于随后的步骤，除非另外指出。将10μl标记的五聚体添加到细胞中并且通过吹打进行混合。在避光的情况下，将细胞在室温(22℃)下温育10分钟。将细胞用每管2ml洗涤缓冲液洗涤并且重悬于残余液体(～50μl)中。添加最佳量的抗-CD3、抗-CD8和抗-CD62L抗体(1:100稀释)并且通过吹打进行混合。也在此时制成单染色对照样品。在避光的情况下，将样品在冰上温育20分钟。将细胞用每管2ml洗涤缓冲液洗涤两次。将细胞沉淀物重悬于残余体积(～50μl)中。将200μl固定溶液添加到每个管中并且涡旋。将这些管储存在黑暗的冷藏库中，直到准备好进行数据采集。(注意：细胞的形态在固定之后发生改变，因此可建议将样品静置3小时，之后进行数据采集。样品可储存最多2天)。
细胞内细胞因子染色(IFN-γ)方案：
将2×107个细胞/ml脾细胞放在FACS管中并且将100μl布雷菲德菌素A(BDGolgiPlug)添加到管中。对于刺激，将2μM肽添加到管中并且将细胞在室温下温育10-15分钟。对于阳性对照样品，将PMA(10ng/ml)(2x)和离子霉素(1μg/ml)(2x)添加到对应管中。将来自每次处理的100μl培养基添加到U-底96-孔板中的对应孔中。将100μl细胞添加到对应孔中(200μl最终体积–培养基+细胞)。将该板以600rpm离心2分钟并且在37℃ 5％CO2下温育5小时。将来自板的内容物转移到FACS管中。将1ml FACS缓冲液添加到每个管中并且以1200rpm离心5min。丢弃上清液。将200μl 2.4G2上清液和10μl兔血清添加到细胞中并且在室温下温育10分钟。将细胞用1mL FACS缓冲液洗涤。通过1200rpm离心5分钟来收集细胞。将细胞悬浮于含有荧光团偶联单克隆抗体(CD8FITC、CD3PerCP-Cy5.5、CD62L APC)的50μl FACS缓冲液中并且在4℃下在黑暗中温育30分钟。将细胞用1mL FACS缓冲液洗涤两次并且将其重悬于200μl 4％福尔马林溶液中并且在4℃下温育20min。将这些细胞用1mL FACS缓冲液洗涤两次并且将其重悬于BDPerm/Wash(0.25ml/管)中15分钟。通过离心收集细胞并且将其重悬于50μl含有针对感兴趣细胞因子(IFNg-PE)的荧光团偶联单克隆抗体的BD Perm/Wash溶液中。将这些细胞在4℃下在黑暗中温育30分钟。将细胞用BD Perm/Wash(1ml/管)洗涤两次并且在分析之前重悬于200μl FACS缓冲液中。
结果
实例22：使用重组李斯特菌构建体进行疫苗接种导致肿瘤消退
数据显示至第1周，所有组均产生平均大小为2-3mm的肿瘤。在第3周(第20天)用ActA/PEST2(也称为“LA229”)-PSA、ActA/PEST3-PSA和ActA/PEST3-PSA以及表达tLLO融合PSA的LmddA-142(ADXS31-142)免疫的小鼠显示肿瘤消退和肿瘤生长减慢。至第6周，未暴露组中的所有小鼠和ActAPEST4-PSA治疗组中的大部分小鼠具有大肿瘤并且必须安乐死(图28A)。然而，LmddA-142、ActA-PEST2和ActA-PEST3小鼠组显示更好的肿瘤消退和存活率(图28A和图28B)。
实例23：用重组李斯特菌进行接种生成高水平的抗原特异性细胞
LmddA-ActAPEST2-PSA疫苗与LmddA-ActAPEST(3或4)-PSA或LmddA-142相比生成高水平的PSA特异性T细胞应答(图29A)。在PSA特异性疫苗中PSA四聚体特异性T细胞的数量比未暴露小鼠高30倍。类似地，对于LmddA-ActAPEST2-PSA疫苗响应于使用PSA特异性抗原进行的刺激观察到更高水平的IFN-γ分泌(图29B)。
实例24：使用ACTA/PEST2(LA229)进行的接种在脾中生成高数目的抗原特异性CD8+ T细胞
与Lm表达的tLLO融合PSA或tLLO治疗组相比，Lm表达的ActA/PEST2融合PSA能够在脾中生成更高数目的PSA特异性CD8+ T细胞。对于Lm-tLLO-PSA和Lm-ActA/PEST2-PSA免疫的小鼠而言，PSA特异性CD8+ T细胞浸润肿瘤的数目是类似的(图30B和30C)。而且，Lm表达的ActA/PEST2-PSA的肿瘤消退能力类似于对于表达tLLO-PSA的LmddA-142所见的能力(图30A)。
实例25：LLO胆固醇结合结构域的定点突变
采用以下策略对LLO进行定点突变，以便在CBD中引入失活点突变。所得的蛋白命名为“mutLLO”：
将LLO亚克隆进pET29b
野生型LLO的氨基酸序列为：
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE(SEQ IDNO:80)所示的序列编码。信号肽和胆固醇结合结构域(CBD)标有下划线，CBD中的3个关键性残基(C484、W491和W492)为加粗斜体。
在LLO的C末端添加6xHis标签(HHHHHH(SEQ ID NO:82))。加了His标签的LLO的氨基酸序列为：
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSVAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIEHHHHHH(SEQID NO:62)。
将编码加His标签的LLO蛋白的基因以NdeI/BamHI消化，并将NdeI/BamHI亚克隆进表达载体pET29b的NdeI和BamHI位点之间。编码LLO蛋白的基因的序列为：
catatgaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccgtggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttattcaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatcctgaaggtaacgaaattgttcaacataaaaactggagcgaaaacaataaaagcaagctagctcatttcacatcgtccatctatttgcctggtaacgcgagaaatattaatgtttacgctaaagaatgc actggtttagcttgggaatggtggagaacggtaattgatgaccggaacttaccacttgtgaaaaatagaaatatctccatctggggcaccacgctttatccgaaatatagtaataaagtagataatccaatcgaacaccaccaccaccaccactaataaggatcc(SEQ ID NO:63)。从序列起点开始，标下划线的序列为NdeI位点、NheI位点、CBG编码区、6x His标签和BamHI位点。将在下一步中突变的CBD残基为加粗斜体。
重叠延伸拼接(SOE)PCR
步骤1：PCR反应#1和#2在pET29b-LLO模板上进行。PCR反应#1利用引物#1和#2扩增NheI位点和CBD(含)之间的片段，向CBD中引入突变。PCR反应#2利用引物#3和#4扩增CBD和BamHI(含)之间的片段，向CBD中引入突变(图31A)。
PCR反应#1循环：A)94℃ 2min30s，B)94℃ 30s，C)55℃ 30s，D)72℃ 1min，重复步骤B至D 29次(一共30个循环)，E)72℃ 10min。
PCR反应#2循环：A)94℃ 2min30s，B)94℃ 30s，C)60℃ 30s，D)72℃ 1min，重复步骤B至D 29次(一共30个循环)，E)72℃ 10min。
步骤2：将PCR反应#1和#2的产物混合，让它们退火(在突变的CBD编码区)，并用引物#1和#4再进行PCR 25个循环(图31B)。PCR反应循环：A)94℃2min30s，B)94℃ 30s，C)72℃1min，重复步骤B至C 9次(一共10个循环)，添加引物#1和#4，D)94℃ 30s，E)55℃ 30s，F)72℃ 1min，重复步骤D至F 24次(一共25个循环)，G)72℃ 10min。
引物序列：
引物1：GCTAGCTCATTTCACATCGT(SEQ ID NO:64；NheI序列标有下划线)。
引物2：
TCTTGCAGCTTCCCAAGCTAAACCAGTCGCTTCTTTAGCGTAAACATTAATATT(SEQ ID NO:65；CBD编码序列标有下划线；突变的密码子为加粗斜体)。
引物3：
GAAGCGACTGGTTTAGCTTGGGAAGCTGCAAGAACGGTAATTGATGACCGGAAC(SEQ ID NO:66；CBD编码序列标有下划线；突变的密码子为加粗斜体)。
引物4：GGATCCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGATTGG(SEQID NO:67；BamHI序列标有下划线)。
野生型CBD序列为ECTGLAWEWWR(SEQ ID NO:68)。
突变的CBD序列为EATGLAWEAAR(SEQ ID NO:69)。
突变的NheI-BamHI片段的序列为
GCTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGCCTGGTAACGCGAGAAATATTAATGTTTACGCTAAAGAAGCGACTG GTTTAGCTTGGGAAGCTGCAAGAACGGTAATTGATGACCGGAACTTACCACTTGTGAAAAATAGAAATATCTCCATCTGGGGCACCACGCTTTATCCGAAATATAGTAATAAAGTAGATAATCCAATCGAACACCACCACCACCACCACTAATAAGGATCC(SEQ ID NO:70)。
实例26：以CTL表位替换LLO CBD的一部分
对LLO进行定点突变，以将CBD的9个氨基酸(AA)用来自抗原NY-ESO-1的CTL表位替换。CBD(SEQ ID NO:68)的序列被置换为序列ESLLMWITQCR(SEQ ID NO:71；突变的残基标有下划线)，其含有来自NY-ESO-1的HLA-A2限制性表位157-165，称为“ctLLO”。
所采用的亚克隆策略与之前的实例类似。
所用的引物如下：
引物1：GCTAGCTCATTTCACATCGT(SEQ ID NO:64；NheI序列标有下划线)。
引物2：
TCTGCACTGGGTGATCCACATCAGCAGGCTTTCTTTAGCGTAAACATTAATATT(SEQ ID NO:72；CBD编码序列标有下划线；突变的(NY-ESO-1)密码子为加粗斜体)。
引物3：
GAAAGCCTGCTGATGTGGATCACCCAGTGCAGAACGGTAATTGATGACCGGAAC(SEQ ID NO:73；CBD编码序列标有下划线；突变的(NY-ESO-1)密码子为加粗斜体)。
引物4：GGATCCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGATTGG(SEQID NO:67；BamHI序列标有下划线)。
所得的NheI/BamHI片段的序列如下：GCTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGCCTGGTAACGCGAGAAATATTAATGTTTACGCTAAAGAAAGCCTGC TGATGTGGATCACCCAGTGCAGAACGGTAATTGATGACCGGAACTTACCACTTGTGAAAAATAGAAATATCTCCATCTGGGGCACCACGCTTTATCCGAAATATAGTAATAAAGTAGATAATCCAATCGAACACCACCACCACCACCACTAATAAGGATCC(SEQ ID NO:74)。
实例27：:mutLLO和ctLLO能够在大肠杆菌表达系统中表达和纯化
为了表明mutLLO和ctLLO可在大肠杆菌中表达，用pET29b转化大肠杆菌并且用0.5mM IPTG诱导，然后4小时后收获细胞裂解物并且在SDS-PAGE凝胶中分离总蛋白质并且使其经受考马斯染色(图32A)和使用单克隆抗体B3-19进行的抗-LLO Western印迹(图32B)。因此，含有CBD中的点突变或取代的LLO蛋白可在大肠杆菌表达系统中表达和纯化。
实例28：mutLLO和ctLLO表现出溶血活性的显著减小
材料和实验方法
溶血测定：
1.将野生型和突变的LLO在900μl 1x PBS-半胱氨酸中(使用0.5M盐酸半胱氨酸将PBS调节至pH 5.5或者调节至7.4)稀释至图33A-B中所指示的稀释液。2.通过在37℃下温育30分钟来活化LLO。3.将绵羊红细胞(200μl/样品)在PBS-半胱氨酸中洗涤两次并且在1xPBS中洗涤3至5次，直到上清液相对澄清。4.将绵羊红细胞的最终沉淀物重悬于PBS-半胱氨酸中并且将100μl细胞悬浮液添加到900μl LLO溶液(10％最终溶液)中。5.将50μl绵羊红细胞添加到950μl水+10％Tween 20(细胞裂解的阳性对照，将含有所裂解细胞的量的50％，作为添加到其他管中的细胞的总量；“50％对照”)。6.将所有管轻轻混合并且在37℃下温育45分钟。7.将红细胞在微型离心机中以1500rpm离心10分钟。8.将200μl等分试样的上清液转移到96-孔ELISA板中并且在570nm下读取以测量在溶血之后所释放的血红蛋白的浓度，并且根据50％对照滴定样品。
结果
使用绵羊红细胞测定确定mutLLO和ctLLO的溶血活性。mutLLO在pH 5.5下表现出显著降低的(在100倍与1000倍之间)溶血滴度，并且在pH 7.4下表现出不可检测的溶血活性。ctLLO在任一pH下表现出不可检测的溶血活性(图33A-B)。
因此，LLO CBD残基(包括C484、W491和W492)的点突变(mutLLO)或取代突变(ctLLO)消除或显著降低溶血活性。另外，用异源抗原肽置换CBD是形成异源表位的免疫原性载体的有效方式，其具有相对于野生型LLO显著降低的溶血活性。
虽然本文已示出和描述了本发明的某些特征，但现在本领域的普通技术人员将想到许多修改、置换、变化和等同形式。因此，应当理解，所附权利要求书旨在涵盖落在本发明的真实精神范围内的所有此类修改和变化。
实例29：全封闭式单次使用细胞生长系统
新颖系统利用容易获得的以独特配置布置的生物处理部件和技术，从而使得可以生长工程化Lm细菌、浓缩发酵液、洗涤和纯化系统、用制剂缓冲液交换发酵培养基，并且使用单个全封闭式系统将患者特异性剂量分配到即用型IV袋中。这种类型的系统提供对每种患者免疫疗法的完全分离和控制。此系统特别良好地适用于整合在鉴定的总体工作流和个性化新表位靶向性免疫治疗剂的临床使用中(图37A-B)。
定制设计的系统用单次使用生物处理袋、患者IV袋、采样袋、管、过滤器、快速连接器以及传感器组装。其小足迹允许为单名患者制造但可被重复来平行制造用于多名患者的产品(图38)。整个组件包括4个部分：1)接种和发酵、2)浓缩、3)渗滤，以及4)药物产品灌装。由于该系统具有全封闭式流体流路并且在使用之前杀菌，所以可以将最终配制的免疫疗法直接分配到IV袋中，将其冷冻并且运输到健康护理中心。因此，这消除了对在分配到小瓶或预充式注射器中时所涉及的典型灌装/完工和包装的需要。这解决了对快速转变和递送至患者的预期。
将组件的接种和发酵部分(图39)灌装生长培养基并且将其升温至指定温度。然后将细胞库接种到单次使用/一次性摇摆型袋发酵器中或者接种到单次使用/一次性搅拌式生物反应器容器中。一旦细菌生长至特定密度，就使用组件的浓缩部分(图40)移除发酵培养基并且使用中空纤维过滤器浓缩该批次。将洗涤/制剂缓冲液袋连接至组件的渗滤部分(图41)并且洗涤/纯化细菌细胞，在中空纤维过滤器中通过错流过滤将其余培养基用制剂缓冲液交换，并且将产物稀释至最终浓度。最终，使用组件的药物产品灌装部分将该批次等分到无菌单次使用IV袋和用于QC测试的采样袋中(图42)。患者特异性免疫疗法将以小体积胃肠外IV袋冷冻供应，该袋含有指定浓度的活减毒工程化Lm细菌的纯培养菌株。在患者施用之前，将IV袋解冻，将细胞重悬浮，并且用注射器抽取所需剂量并且将其添加到较大输注IV袋中。
若干全封闭式组件将平行地用于制造用于多名患者或用于单名患者的个性化免疫治疗组合物(图43)。为了增加生产量，根据需要将额外的摇摆器或搅拌槽生物反应器系统添加到处理系列(参见例如图38)。
全封闭式设计的生长系统将允许在制造过程的同时进行免疫治疗性组合物的完整质量控制，这产生另外的时间节约。完整的分析控制策略将与生长李斯特菌递送载体平行地实施(表6)。因此，分配的产品将准备好立即递送至患者而无需另外的测试。
表6.分析控制策略
实例30：减毒单核细胞增多性李斯特菌细胞库的制造方法
制造方法如图50所示，并按照以下步骤进行：
1.培养基/缓冲液制备。
在该步骤中，使用表7中列出的材料并根据图44-46中的步骤制备发酵培养基(胰酶大豆肉汤)和洗涤缓冲液(PBS/蔗糖)溶液。还制备了用于pH调节的碱溶液(2M NaOH-图45)。
表7.
材料说明 需要的量
铂固化硅胶管 根据需要
供应商制备的胰酶大豆肉汤(TSB) 1000mL
经γ照射的5L袋(具有0.2μm过滤器) 1
适当大小的塑料盒 根据需要
带刻度的量筒或适当的血清移液管 1
适当大小的鲁尔锁注射器 根据需要
供应商制备的1M NaOH 75mL
经γ照射的100mL袋 1
10L玻璃瓶 1
供应商制备的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS) 5000ML
蔗糖 100g
经γ照射的5L袋(具有0.2μm过滤器) 1
此外还进行了以下过程中控制：1)洗涤缓冲液的前后生物负载，2)洗涤缓冲液的过滤器完整性测试，3)发酵培养基的前后生物负载，和4)发酵培养基的过滤器完整性测试。
2.0预培养步骤编号1
为了制备预培养物1(PC1)，将单个单核细胞增多性李斯特菌集落分离并在10mlTSB管中扩增，且在37℃、180-220rpm下培养6-8小时。
3.0预培养步骤编号2
为了制备预培养物2(PC2)，用PC1接种190ml的TSB并在37℃、180-220rpm下培养16-18小时(或过夜)。
准备接种物袋
从PC2获得25ml的等分试样并注入250ml的袋中，且足量(qs)至100ml以制成接种袋。共获得4袋(100ml，250ml×4袋)。1袋(称为“工作细胞库”)用于随后的发酵过程。作为内部处理对照，每30分钟针对外观、活细胞计数(VCC)、actA基因不存在、SIINFEKL肽标签的存在、集落PCR和单菌(纯化)对接种袋采样(使用采样袋歧管，参见图53A)，并且该采样一直进行到最终OD采样。其余的袋子在TSB中在-70℃至-80℃下冷冻。从这以后，该过程在封闭系统中进行。
设备设置
在该步骤中，设置Wave生物反应器，设置切向流过滤(TFF)系统(图51A)，并设置产品库歧管(图53)。
发酵过程
将组件的接种和发酵部分(图39)灌装生长培养基并且将其升温至指定温度。然后将细胞库接种到单次使用/一次性摇摆型袋发酵器中或者接种到单次使用/一次性搅拌式生物反应器容器中。该步骤利用GE Wave袋作为Wave生物反应器设置的一部分。在该步骤中，将培养基在接种之前进行调节，并且一旦调节好培养基，就将生物反应器用100ml接种袋接种。然后在37℃下，以20rpm的摇摆速率和12°的摇摆角度发酵2-4小时。作为过程中控制，针对OD600、pH和溶解氧(dO2)对发酵过程采样。一旦达到0.65+/-0.05的OD600，反应/过程终止。
切向流过滤(浓缩/渗滤)
一旦细菌生长至特定的密度，就将组件的浓缩和渗滤部分(图51A、C)用于移除发酵培养基，并通过将包括发酵培养基和构建体的流体混合物再循环通过包括导管5、中空纤维过滤器23和渗余物袋2的回路。进行2倍浓缩，并且循环可以持续直到产物达到其最终的2倍浓度。
在渗滤期间，洗涤/制剂缓冲液袋(例如，容纳洗涤/制剂缓冲液的袋29)连接到联接器11，对切向流过滤组件的渗余物袋1(用于发酵培养基的浓缩/渗滤)(图51A-C)和细菌细胞进行洗涤/纯化(渗滤：≥8倍渗滤体积≥4L)，同时泵40继续循环剩余的混合物且过滤器23继续从混合物中移除培养基。剩余培养基经由中空纤维过滤器中的交叉流过滤用制剂缓冲液代替，并且产物稀释至最终浓度。在一些实施例中，制剂缓冲液可以以与通过过滤器23将流体移除到渗透物袋2的速率相同的速率添加，使得维持基本上恒定的构建体浓度，同时用制剂缓冲液更换原来的培养基，并在达到浓度后开始渗滤。渗余物袋1可保持在天平上以在渗滤过程中测量并维持袋中的恒定体积。
在等分患者之前，可以对药物产品进行pH、外观、渗透压、集落PCR、actA基因存在、SIINFEKL标签(抗原呈递)、单菌、活细胞计数、活/死％和内毒素％的采样。
灌装/冷冻和储存
最终，使用图52-53所示的组件的歧管39将该批次等份(40×10mL体积)分到无菌单次使用IV袋和用于QC测试的采样袋中。由于该系统具有全封闭式流体流路并且在使用之前杀菌，所以可以将最终配制的免疫疗法直接分配到IV袋中，将其冷冻并且运输到健康护理中心。因此，这消除了对在分配到小瓶或预充式注射器中时所涉及的典型灌装/完工和包装的需要。这解决了对快速转变和递送至患者的预期。
患者特异性免疫疗法可以小体积胃肠外IV袋冷冻供应，该袋含有指定浓度的活减毒工程化Lm细菌的纯培养菌株。在患者施用之前，将IV袋解冻，将细胞重悬浮，并且用注射器抽取所需剂量并且将其添加到较大输注IV袋中。
若干全封闭式组件平行地用于制造用于多名患者或用于单名患者的个性化免疫治疗组合物(图43)。为了增加生产量，根据需要将额外的摇摆器或搅拌槽生物反应器系统添加到处理系列(参见例如图38)。
全封闭式设计的生长系统可允许在制造过程的同时进行免疫治疗性组合物的完整质量控制，这产生另外的时间节约。完整的分析控制策略将与生长李斯特菌递送载体平行地实施(表6)。因此，分配的产品将准备好立即递送至患者而无需另外的测试。
虽然本文已示出和描述了本发明的某些特征，但现在本领域的普通技术人员将想到许多修改、置换、变化和等同形式。因此，应当理解，所附权利要求书旨在涵盖落在本发明的真实精神范围内的所有此类修改和变化。
序列表
<110> 阿德瓦希斯公司
R·珀蒂
A·伊彭
M·普侯斯
<120> 用于个性化的基于递送载体的免疫疗法的制造装置和方法
<130> 062384/479818
<150> US 62/184,125
<151> 2015-06-24
<150> US 62/342,037
<151> 2016-05-26
<160> 87
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PEST氨基酸序列
<400> 1
Lys Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys
20 25 30
<210> 2
<211> 529
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 2
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val
435 440 445
Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe
450 455 460
Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr
465 470 475 480
Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile
485 490 495
Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp
500 505 510
Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile
515 520 525
Glu
<210> 3
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LLO蛋白的N端片段
<400> 3
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp
435 440
<210> 4
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LLO片段
<400> 4
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 5
Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg
1 5 10
<210> 6
<211> 28
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 6
Lys Ala Ser Val Thr Asp Thr Ser Glu Gly Asp Leu Asp Ser Ser Met
1 5 10 15
Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys
20 25
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 7
Lys Asn Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp
1 5 10 15
Glu Glu Leu Arg
20
<210> 8
<211> 33
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 8
Arg Gly Gly Ile Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly
1 5 10 15
Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp
20 25 30
Arg
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 酿脓链球菌
<400> 9
Lys Gln Asn Thr Ala Ser Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro
1 5 10 15
Lys
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 类马链球菌
<400> 10
Lys Gln Asn Thr Ala Asn Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro
1 5 10 15
Lys
<210> 11
<211> 633
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ActA蛋白
<400> 11
Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr Ala Asn Cys Ile Thr Ile
1 5 10 15
Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu
20 25 30
Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu
35 40 45
Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg
50 55 60
Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys
65 70 75 80
Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn
85 90 95
Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu
100 105 110
Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His
115 120 125
Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys
130 135 140
Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp
145 150 155 160
Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val
165 170 175
Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu
180 185 190
Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys
195 200 205
Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly
225 230 235 240
Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala
245 250 255
Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu
260 265 270
Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Thr Pro Ser Glu
275 280 285
Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg
290 295 300
Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala
305 310 315 320
Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp
325 330 335
Glu Leu Glu Ile Met Arg Glu Thr Ala Pro Ser Leu Asp Ser Ser Phe
340 345 350
Thr Ser Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ser Ala Ile Asn Arg His Ser
355 360 365
Glu Asn Phe Ser Asp Phe Pro Leu Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn
370 375 380
Gly Arg Gly Gly Arg Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser
385 390 395 400
Gly Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ile
405 410 415
Asp Arg Leu Ala Asp Leu Arg Asp Arg Gly Thr Gly Lys His Ser Arg
420 425 430
Asn Ala Gly Phe Leu Pro Leu Asn Pro Phe Ile Ser Ser Pro Val Pro
435 440 445
Ser Leu Thr Pro Lys Val Pro Lys Ile Ser Ala Pro Ala Leu Ile Ser
450 455 460
Asp Ile Thr Lys Lys Ala Pro Phe Lys Asn Pro Ser Gln Pro Leu Asn
465 470 475 480
Val Phe Asn Lys Lys Thr Thr Thr Lys Thr Val Thr Lys Lys Pro Thr
485 490 495
Pro Val Lys Thr Ala Pro Lys Leu Ala Glu Leu Pro Ala Thr Lys Pro
500 505 510
Gln Glu Thr Val Leu Arg Glu Asn Lys Thr Pro Phe Ile Glu Lys Gln
515 520 525
Ala Glu Thr Asn Lys Gln Ser Ile Asn Met Pro Ser Leu Pro Val Ile
530 535 540
Gln Lys Glu Ala Thr Glu Ser Asp Lys Glu Glu Met Lys Pro Gln Thr
545 550 555 560
Glu Glu Lys Met Val Glu Glu Ser Glu Ser Ala Asn Asn Ala Asn Gly
565 570 575
Lys Asn Arg Ser Ala Gly Ile Glu Glu Gly Lys Leu Ile Ala Lys Ser
580 585 590
Ala Glu Asp Glu Lys Ala Lys Glu Glu Pro Gly Asn His Thr Thr Leu
595 600 605
Ile Leu Ala Met Leu Ala Ile Gly Val Phe Ser Leu Gly Ala Phe Ile
610 615 620
Lys Ile Ile Gln Leu Arg Lys Asn Asn
625 630
<210> 12
<211> 390
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的ActA蛋白
<400> 12
Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr Ala Asn Cys Ile Thr Ile
1 5 10 15
Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu
20 25 30
Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu
35 40 45
Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg
50 55 60
Asp Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Arg Asn Thr Asn Lys
65 70 75 80
Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Glu Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn
85 90 95
Ile Asn Asn Asn Asn Ser Glu Gln Thr Glu Asn Ala Ala Ile Asn Glu
100 105 110
Glu Ala Ser Gly Ala Asp Arg Pro Ala Ile Gln Val Glu Arg Arg His
115 120 125
Pro Gly Leu Pro Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys
130 135 140
Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp
145 150 155 160
Lys Pro Thr Lys Val Asn Lys Lys Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Ala
165 170 175
Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu
180 185 190
Ser Ser Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln Gln Pro Phe Phe Pro Lys
195 200 205
Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile
210 215 220
Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly
225 230 235 240
Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala
245 250 255
Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu
260 265 270
Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu
275 280 285
Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg
290 295 300
Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala
305 310 315 320
Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp
325 330 335
Glu Leu Glu Ile Ile Arg Glu Thr Ala Ser Ser Leu Asp Ser Ser Phe
340 345 350
Thr Arg Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Asn Ala Ile Asn Arg His Ser
355 360 365
Gln Asn Phe Ser Asp Phe Pro Pro Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn
370 375 380
Gly Arg Gly Gly Arg Pro
385 390
<210> 13
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的ActA蛋白
<400> 13
Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr
1 5 10 15
Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp
20 25 30
Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr
35 40 45
Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala
50 55 60
Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys
65 70 75 80
Val Arg Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Glu Lys
85 90 95
Ala Glu Lys Gly
100
<210> 14
<211> 639
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ActA蛋白
<400> 14
Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr
1 5 10 15
Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp
20 25 30
Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr
35 40 45
Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala
50 55 60
Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys
65 70 75 80
Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys
85 90 95
Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Gln Thr Gly
100 105 110
Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg Pro Thr Leu
115 120 125
Gln Val Glu Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser Ala Ala Glu
130 135 140
Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu
145 150 155 160
Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys Arg Lys Val
165 170 175
Ala Lys Glu Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser
180 185 190
Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln
195 200 205
Lys Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys
210 215 220
Trp Val Arg Asp Lys Ile Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Ala Gly Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys
245 250 255
Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu
260 265 270
Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn
275 280 285
Ala Pro Thr Pro Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro
290 295 300
Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu
305 310 315 320
Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro
325 330 335
Pro Pro Pro Thr Glu Asp Glu Leu Glu Ile Met Arg Glu Thr Ala Pro
340 345 350
Ser Leu Asp Ser Ser Phe Thr Ser Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ser
355 360 365
Ala Ile Asn Arg His Ser Glu Asn Phe Ser Asp Phe Pro Leu Ile Pro
370 375 380
Thr Glu Glu Glu Leu Asn Gly Arg Gly Gly Arg Pro Thr Ser Glu Glu
385 390 395 400
Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu
405 410 415
Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp Arg Leu Ala Asp Leu Arg Asp Arg Gly
420 425 430
Thr Gly Lys His Ser Arg Asn Ala Gly Phe Leu Pro Leu Asn Pro Phe
435 440 445
Ile Ser Ser Pro Val Pro Ser Leu Thr Pro Lys Val Pro Lys Ile Ser
450 455 460
Ala Pro Ala Leu Ile Ser Asp Ile Thr Lys Lys Ala Pro Phe Lys Asn
465 470 475 480
Pro Ser Gln Pro Leu Asn Val Phe Asn Lys Lys Thr Thr Thr Lys Thr
485 490 495
Val Thr Lys Lys Pro Thr Pro Val Lys Thr Ala Pro Lys Leu Ala Glu
500 505 510
Leu Pro Ala Thr Lys Pro Gln Glu Thr Val Leu Arg Glu Asn Lys Thr
515 520 525
Pro Phe Ile Glu Lys Gln Ala Glu Thr Asn Lys Gln Ser Ile Asn Met
530 535 540
Pro Ser Leu Pro Val Ile Gln Lys Glu Ala Thr Glu Ser Asp Lys Glu
545 550 555 560
Glu Met Lys Pro Gln Thr Glu Glu Lys Met Val Glu Glu Ser Glu Ser
565 570 575
Ala Asn Asn Ala Asn Gly Lys Asn Arg Ser Ala Gly Ile Glu Glu Gly
580 585 590
Lys Leu Ile Ala Lys Ser Ala Glu Asp Glu Lys Ala Lys Glu Glu Pro
595 600 605
Gly Asn His Thr Thr Leu Ile Leu Ala Met Leu Ala Ile Gly Val Phe
610 615 620
Ser Leu Gly Ala Phe Ile Lys Ile Ile Gln Leu Arg Lys Asn Asn
625 630 635
<210> 15
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的ActA蛋白
<400> 15
Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu
1 5 10 15
Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr
20 25 30
Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys
35 40 45
Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu
50 55 60
Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu
65 70 75 80
Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly
85 90
<210> 16
<211> 200
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的ActA蛋白
<400> 16
Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu
1 5 10 15
Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr
20 25 30
Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys
35 40 45
Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu
50 55 60
Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu
65 70 75 80
Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg
85 90 95
Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser
100 105 110
Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser
115 120 125
Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys
130 135 140
Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu
145 150 155 160
Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys
165 170 175
Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp
180 185 190
Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys
195 200
<210> 17
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的ActA蛋白
<400> 17
Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu
1 5 10 15
Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr
20 25 30
Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys
35 40 45
Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu
50 55 60
Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu
65 70 75 80
Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg
85 90 95
Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser
100 105 110
Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser
115 120 125
Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys
130 135 140
Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu
145 150 155 160
Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys
165 170 175
Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp
180 185 190
Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys
195 200 205
Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr
210 215 220
Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro
225 230 235 240
Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu
245 250 255
Gly Phe Asn Ala Pro Thr Pro Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro
260 265 270
Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro
275 280 285
Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser
290 295 300
<210> 18
<211> 370
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的ActA蛋白
<400> 18
Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu
1 5 10 15
Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr
20 25 30
Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys
35 40 45
Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu
50 55 60
Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu
65 70 75 80
Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg
85 90 95
Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser
100 105 110
Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser
115 120 125
Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys
130 135 140
Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu
145 150 155 160
Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys
165 170 175
Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp
180 185 190
Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys
195 200 205
Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr
210 215 220
Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro
225 230 235 240
Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu
245 250 255
Gly Phe Asn Ala Pro Thr Pro Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro
260 265 270
Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro
275 280 285
Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe
290 295 300
Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp Glu Leu Glu Ile Met Arg Glu
305 310 315 320
Thr Ala Pro Ser Leu Asp Ser Ser Phe Thr Ser Gly Asp Leu Ala Ser
325 330 335
Leu Arg Ser Ala Ile Asn Arg His Ser Glu Asn Phe Ser Asp Phe Pro
340 345 350
Leu Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn Gly Arg Gly Gly Arg Pro Thr
355 360 365
Ser Glu
370
<210> 19
<211> 1170
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的ActA
<400> 19
atgcgtgcga tgatggtggt tttcattact gccaattgca ttacgattaa ccccgacata 60
atatttgcag cgacagatag cgaagattct agtctaaaca cagatgaatg ggaagaagaa 120
aaaacagaag agcaaccaag cgaggtaaat acgggaccaa gatacgaaac tgcacgtgaa 180
gtaagttcac gtgatattaa agaactagaa aaatcgaata aagtgagaaa tacgaacaaa 240
gcagacctaa tagcaatgtt gaaagaaaaa gcagaaaaag gtccaaatat caataataac 300
aacagtgaac aaactgagaa tgcggctata aatgaagagg cttcaggagc cgaccgacca 360
gctatacaag tggagcgtcg tcatccagga ttgccatcgg atagcgcagc ggaaattaaa 420
aaaagaagga aagccatagc atcatcggat agtgagcttg aaagccttac ttatccggat 480
aaaccaacaa aagtaaataa gaaaaaagtg gcgaaagagt cagttgcgga tgcttctgaa 540
agtgacttag attctagcat gcagtcagca gatgagtctt caccacaacc tttaaaagca 600
aaccaacaac catttttccc taaagtattt aaaaaaataa aagatgcggg gaaatgggta 660
cgtgataaaa tcgacgaaaa tcctgaagta aagaaagcga ttgttgataa aagtgcaggg 720
ttaattgacc aattattaac caaaaagaaa agtgaagagg taaatgcttc ggacttcccg 780
ccaccaccta cggatgaaga gttaagactt gctttgccag agacaccaat gcttcttggt 840
tttaatgctc ctgctacatc agaaccgagc tcattcgaat ttccaccacc acctacggat 900
gaagagttaa gacttgcttt gccagagacg ccaatgcttc ttggttttaa tgctcctgct 960
acatcggaac cgagctcgtt cgaatttcca ccgcctccaa cagaagatga actagaaatc 1020
atccgggaaa cagcatcctc gctagattct agttttacaa gaggggattt agctagtttg 1080
agaaatgcta ttaatcgcca tagtcaaaat ttctctgatt tcccaccaat cccaacagaa 1140
gaagagttga acgggagagg cggtagacca 1170
<210> 20
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E7蛋白
<400> 20
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro
<210> 21
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E7蛋白
<400> 21
Met His Gly Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu
1 5 10 15
Pro Gln Asn Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser
20 25 30
Asp Ser Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His
35 40 45
Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met
50 55 60
Cys Cys Lys Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala
65 70 75 80
Asp Asp Leu Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe
85 90 95
Val Cys Pro Trp Cys Ala Ser Gln Gln
100 105
<210> 22
<211> 1263
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合Her-2
<400> 22
gagacccacc tggacatgct ccgccacctc taccagggct gccaggtggt gcagggaaac 60
ctggaactca cctacctgcc caccaatgcc agcctgtcct tcctgcagga tatccaggag 120
gtgcagggct acgtgctcat cgctcacaac caagtgaggc aggtcccact gcagaggctg 180
cggattgtgc gaggcaccca gctctttgag gacaactatg ccctggccgt gctagacaat 240
ggagacccgc tgaacaatac cacccctgtc acaggggcct ccccaggagg cctgcgggag 300
ctgcagcttc gaagcctcac agagatcttg aaaggagggg tcttgatcca gcggaacccc 360
cagctctgct accaggacac gattttgtgg aagaatatcc aggagtttgc tggctgcaag 420
aagatctttg ggagcctggc atttctgccg gagagctttg atggggaccc agcctccaac 480
actgccccgc tccagccaga gcagctccaa gtgtttgaga ctctggaaga gatcacaggt 540
tacctataca tctcagcatg gccggacagc ctgcctgacc tcagcgtctt ccagaacctg 600
caagtaatcc ggggacgaat tctgcacaat ggcgcctact cgctgaccct gcaagggctg 660
ggcatcagct ggctggggct gcgctcactg agggaactgg gcagtggact ggccctcatc 720
caccataaca cccacctctg cttcgtgcac acggtgccct gggaccagct ctttcggaac 780
ccgcaccaag ctctgctcca cactgccaac cggccagagg acgagtgtgt gggcgagggc 840
ctggcctgcc accagctgtg cgcccgaggg cagcagaaga tccggaagta cacgatgcgg 900
agactgctgc aggaaacgga gctggtggag ccgctgacac ctagcggagc gatgcccaac 960
caggcgcaga tgcggatcct gaaagagacg gagctgagga aggtgaaggt gcttggatct 1020
ggcgcttttg gcacagtcta caagggcatc tggatccctg atggggagaa tgtgaaaatt 1080
ccagtggcca tcaaagtgtt gagggaaaac acatccccca aagccaacaa agaaatctta 1140
gacgaagcat acgtgatggc tggtgtgggc tccccatatg tctcccgcct tctgggcatc 1200
tgcctgacat ccacggtgca gctggtgaca cagcttatgc cctatggctg cctcttagac 1260
taa 1263
<210> 23
<211> 420
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Her-2嵌合蛋白
<400> 23
Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val
1 5 10 15
Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu
20 25 30
Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala
35 40 45
His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg
50 55 60
Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn
65 70 75 80
Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly
85 90 95
Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly
100 105 110
Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile
115 120 125
Leu Trp Lys Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly
130 135 140
Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu
165 170 175
Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro
180 185 190
Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu
195 200 205
His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp
210 215 220
Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile
225 230 235 240
His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln
245 250 255
Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro
260 265 270
Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala
275 280 285
Arg Gly Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg Arg Leu Leu Gln
290 295 300
Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Ala Met Pro Asn
305 310 315 320
Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu Arg Lys Val Lys
325 330 335
Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Trp Ile
340 345 350
Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Val Leu Arg
355 360 365
Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr
370 375 380
Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu Gly Ile
385 390 395 400
Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu Met Pro Tyr Gly
405 410 415
Cys Leu Leu Asp
420
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
ggctcgagca tggagataca cc 22
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
ggggactagt ttatggtttc tgagaaca 28
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
gggggctagc cctcctttga ttagtatatt c 31
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
ctccctcgag atcataattt acttcatc 28
<210> 28
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
gactacaagg acgatgaccg acaagtgata acccgggatc taaataaatc cgttt 55
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
cccgtcgacc agctcttctt ggtgaag 27
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
gcggatccca tggagataca cctac 25
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
gctctagatt atggtttctg ag 22
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
ggggtctaga cctcctttga ttagtatatt c 31
<210> 33
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
atcttcgcta tctgtcgccg cggcgcgtgc ttcagtttgt tgcgc 45
<210> 34
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
gcgcaacaaa ctgaagcagc ggccgcggcg acagatagcg aagat 45
<210> 35
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
tgtaggtgta tctccatgct cgagagctag gcgatcaatt tc 42
<210> 36
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
ggaattgatc gcctagctct cgagcatgga gatacaccta ca 42
<210> 37
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
aaacggattt atttagatcc cgggttatgg tttctgagaa ca 42
<210> 38
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
tgttctcaga aaccataacc cgggatctaa ataaatccgt tt 42
<210> 39
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
gggggtcgac cagctcttct tggtgaag 28
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 藻红蛋白(PE)偶联的E7肽
<400> 40
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
1 5
<210> 41
<211> 6523
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pAdv142
<400> 41
cggagtgtat actggcttac tatgttggca ctgatgaggg tgtcagtgaa gtgcttcatg 60
tggcaggaga aaaaaggctg caccggtgcg tcagcagaat atgtgataca ggatatattc 120
cgcttcctcg ctcactgact cgctacgctc ggtcgttcga ctgcggcgag cggaaatggc 180
ttacgaacgg ggcggagatt tcctggaaga tgccaggaag atacttaaca gggaagtgag 240
agggccgcgg caaagccgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacaagca tcacgaaatc 300
tgacgctcaa atcagtggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 360
cctggcggct ccctcgtgcg ctctcctgtt cctgcctttc ggtttaccgg tgtcattccg 420
ctgttatggc cgcgtttgtc tcattccacg cctgacactc agttccgggt aggcagttcg 480
ctccaagctg gactgtatgc acgaaccccc cgttcagtcc gaccgctgcg ccttatccgg 540
taactatcgt cttgagtcca acccggaaag acatgcaaaa gcaccactgg cagcagccac 600
tggtaattga tttagaggag ttagtcttga agtcatgcgc cggttaaggc taaactgaaa 660
ggacaagttt tggtgactgc gctcctccaa gccagttacc tcggttcaaa gagttggtag 720
ctcagagaac cttcgaaaaa ccgccctgca aggcggtttt ttcgttttca gagcaagaga 780
ttacgcgcag accaaaacga tctcaagaag atcatcttat taatcagata aaatatttct 840
agccctcctt tgattagtat attcctatct taaagttact tttatgtgga ggcattaaca 900
tttgttaatg acgtcaaaag gatagcaaga ctagaataaa gctataaagc aagcatataa 960
tattgcgttt catctttaga agcgaatttc gccaatatta taattatcaa aagagagggg 1020
tggcaaacgg tatttggcat tattaggtta aaaaatgtag aaggagagtg aaacccatga 1080
aaaaaataat gctagttttt attacactta tattagttag tctaccaatt gcgcaacaaa 1140
ctgaagcaaa ggatgcatct gcattcaata aagaaaattc aatttcatcc atggcaccac 1200
cagcatctcc gcctgcaagt cctaagacgc caatcgaaaa gaaacacgcg gatgaaatcg 1260
ataagtatat acaaggattg gattacaata aaaacaatgt attagtatac cacggagatg 1320
cagtgacaaa tgtgccgcca agaaaaggtt acaaagatgg aaatgaatat attgttgtgg 1380
agaaaaagaa gaaatccatc aatcaaaata atgcagacat tcaagttgtg aatgcaattt 1440
cgagcctaac ctatccaggt gctctcgtaa aagcgaattc ggaattagta gaaaatcaac 1500
cagatgttct ccctgtaaaa cgtgattcat taacactcag cattgatttg ccaggtatga 1560
ctaatcaaga caataaaata gttgtaaaaa atgccactaa atcaaacgtt aacaacgcag 1620
taaatacatt agtggaaaga tggaatgaaa aatatgctca agcttatcca aatgtaagtg 1680
caaaaattga ttatgatgac gaaatggctt acagtgaatc acaattaatt gcgaaatttg 1740
gtacagcatt taaagctgta aataatagct tgaatgtaaa cttcggcgca atcagtgaag 1800
ggaaaatgca agaagaagtc attagtttta aacaaattta ctataacgtg aatgttaatg 1860
aacctacaag accttccaga tttttcggca aagctgttac taaagagcag ttgcaagcgc 1920
ttggagtgaa tgcagaaaat cctcctgcat atatctcaag tgtggcgtat ggccgtcaag 1980
tttatttgaa attatcaact aattcccata gtactaaagt aaaagctgct tttgatgctg 2040
ccgtaagcgg aaaatctgtc tcaggtgatg tagaactaac aaatatcatc aaaaattctt 2100
ccttcaaagc cgtaatttac ggaggttccg caaaagatga agttcaaatc atcgacggca 2160
acctcggaga cttacgcgat attttgaaaa aaggcgctac ttttaatcga gaaacaccag 2220
gagttcccat tgcttataca acaaacttcc taaaagacaa tgaattagct gttattaaaa 2280
acaactcaga atatattgaa acaacttcaa aagcttatac agatggaaaa attaacatcg 2340
atcactctgg aggatacgtt gctcaattca acatttcttg ggatgaagta aattatgatc 2400
tcgagattgt gggaggctgg gagtgcgaga agcattccca accctggcag gtgcttgtgg 2460
cctctcgtgg cagggcagtc tgcggcggtg ttctggtgca cccccagtgg gtcctcacag 2520
ctgcccactg catcaggaac aaaagcgtga tcttgctggg tcggcacagc ctgtttcatc 2580
ctgaagacac aggccaggta tttcaggtca gccacagctt cccacacccg ctctacgata 2640
tgagcctcct gaagaatcga ttcctcaggc caggtgatga ctccagccac gacctcatgc 2700
tgctccgcct gtcagagcct gccgagctca cggatgctgt gaaggtcatg gacctgccca 2760
cccaggagcc agcactgggg accacctgct acgcctcagg ctggggcagc attgaaccag 2820
aggagttctt gaccccaaag aaacttcagt gtgtggacct ccatgttatt tccaatgacg 2880
tgtgtgcgca agttcaccct cagaaggtga ccaagttcat gctgtgtgct ggacgctgga 2940
cagggggcaa aagcacctgc tcgggtgatt ctgggggccc acttgtctgt tatggtgtgc 3000
ttcaaggtat cacgtcatgg ggcagtgaac catgtgccct gcccgaaagg ccttccctgt 3060
acaccaaggt ggtgcattac cggaagtgga tcaaggacac catcgtggcc aacccctaac 3120
ccgggccact aactcaacgc tagtagtgga tttaatccca aatgagccaa cagaaccaga 3180
accagaaaca gaacaagtaa cattggagtt agaaatggaa gaagaaaaaa gcaatgattt 3240
cgtgtgaata atgcacgaaa tcattgctta tttttttaaa aagcgatata ctagatataa 3300
cgaaacaacg aactgaataa agaatacaaa aaaagagcca cgaccagtta aagcctgaga 3360
aactttaact gcgagcctta attgattacc accaatcaat taaagaagtc gagacccaaa 3420
atttggtaaa gtatttaatt actttattaa tcagatactt aaatatctgt aaacccatta 3480
tatcgggttt ttgaggggat ttcaagtctt taagaagata ccaggcaatc aattaagaaa 3540
aacttagttg attgcctttt ttgttgtgat tcaactttga tcgtagcttc taactaatta 3600
attttcgtaa gaaaggagaa cagctgaatg aatatccctt ttgttgtaga aactgtgctt 3660
catgacggct tgttaaagta caaatttaaa aatagtaaaa ttcgctcaat cactaccaag 3720
ccaggtaaaa gtaaaggggc tatttttgcg tatcgctcaa aaaaaagcat gattggcgga 3780
cgtggcgttg ttctgacttc cgaagaagcg attcacgaaa atcaagatac atttacgcat 3840
tggacaccaa acgtttatcg ttatggtacg tatgcagacg aaaaccgttc atacactaaa 3900
ggacattctg aaaacaattt aagacaaatc aataccttct ttattgattt tgatattcac 3960
acggaaaaag aaactatttc agcaagcgat attttaacaa cagctattga tttaggtttt 4020
atgcctacgt taattatcaa atctgataaa ggttatcaag catattttgt tttagaaacg 4080
ccagtctatg tgacttcaaa atcagaattt aaatctgtca aagcagccaa aataatctcg 4140
caaaatatcc gagaatattt tggaaagtct ttgccagttg atctaacgtg caatcatttt 4200
gggattgctc gtataccaag aacggacaat gtagaatttt ttgatcccaa ttaccgttat 4260
tctttcaaag aatggcaaga ttggtctttc aaacaaacag ataataaggg ctttactcgt 4320
tcaagtctaa cggttttaag cggtacagaa ggcaaaaaac aagtagatga accctggttt 4380
aatctcttat tgcacgaaac gaaattttca ggagaaaagg gtttagtagg gcgcaatagc 4440
gttatgttta ccctctcttt agcctacttt agttcaggct attcaatcga aacgtgcgaa 4500
tataatatgt ttgagtttaa taatcgatta gatcaaccct tagaagaaaa agaagtaatc 4560
aaaattgtta gaagtgccta ttcagaaaac tatcaagggg ctaataggga atacattacc 4620
attctttgca aagcttgggt atcaagtgat ttaaccagta aagatttatt tgtccgtcaa 4680
gggtggttta aattcaagaa aaaaagaagc gaacgtcaac gtgttcattt gtcagaatgg 4740
aaagaagatt taatggctta tattagcgaa aaaagcgatg tatacaagcc ttatttagcg 4800
acgaccaaaa aagagattag agaagtgcta ggcattcctg aacggacatt agataaattg 4860
ctgaaggtac tgaaggcgaa tcaggaaatt ttctttaaga ttaaaccagg aagaaatggt 4920
ggcattcaac ttgctagtgt taaatcattg ttgctatcga tcattaaatt aaaaaaagaa 4980
gaacgagaaa gctatataaa ggcgctgaca gcttcgttta atttagaacg tacatttatt 5040
caagaaactc taaacaaatt ggcagaacgc cccaaaacgg acccacaact cgatttgttt 5100
agctacgata caggctgaaa ataaaacccg cactatgcca ttacatttat atctatgata 5160
cgtgtttgtt tttctttgct ggctagctta attgcttata tttacctgca ataaaggatt 5220
tcttacttcc attatactcc cattttccaa aaacatacgg ggaacacggg aacttattgt 5280
acaggccacc tcatagttaa tggtttcgag ccttcctgca atctcatcca tggaaatata 5340
ttcatccccc tgccggccta ttaatgtgac ttttgtgccc ggcggatatt cctgatccag 5400
ctccaccata aattggtcca tgcaaattcg gccggcaatt ttcaggcgtt ttcccttcac 5460
aaggatgtcg gtccctttca attttcggag ccagccgtcc gcatagccta caggcaccgt 5520
cccgatccat gtgtcttttt ccgctgtgta ctcggctccg tagctgacgc tctcgccttt 5580
tctgatcagt ttgacatgtg acagtgtcga atgcagggta aatgccggac gcagctgaaa 5640
cggtatctcg tccgacatgt cagcagacgg gcgaaggcca tacatgccga tgccgaatct 5700
gactgcatta aaaaagcctt ttttcagccg gagtccagcg gcgctgttcg cgcagtggac 5760
cattagattc tttaacggca gcggagcaat cagctcttta aagcgctcaa actgcattaa 5820
gaaatagcct ctttcttttt catccgctgt cgcaaaatgg gtaaataccc ctttgcactt 5880
taaacgaggg ttgcggtcaa gaattgccat cacgttctga acttcttcct ctgtttttac 5940
accaagtctg ttcatccccg tatcgacctt cagatgaaaa tgaagagaac cttttttcgt 6000
gtggcgggct gcctcctgaa gccattcaac agaataacct gttaaggtca cgtcatactc 6060
agcagcgatt gccacatact ccgggggaac cgcgccaagc accaatatag gcgccttcaa 6120
tccctttttg cgcagtgaaa tcgcttcatc caaaatggcc acggccaagc atgaagcacc 6180
tgcgtcaaga gcagcctttg ctgtttctgc atcaccatgc ccgtaggcgt ttgctttcac 6240
aactgccatc aagtggacat gttcaccgat atgttttttc atattgctga cattttcctt 6300
tatcgcggac aagtcaattt ccgcccacgt atctctgtaa aaaggttttg tgctcatgga 6360
aaactcctct cttttttcag aaaatcccag tacgtaatta agtatttgag aattaatttt 6420
atattgatta atactaagtt tacccagttt tcacctaaaa aacaaatgat gagataatag 6480
ctccaaaggc taaagaggac tataccaact atttgttaat taa 6523
<210> 42
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
cggaattcgg atccgcgcca aatcattggt tgattg 36
<210> 43
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
gcgagtcgac gtcggggtta atcgtaatgc aattggc 37
<210> 44
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
gcgagtcgac ccatacgacg ttaattcttg caatg 35
<210> 45
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
gatactgcag ggatccttcc cttctcggta atcagtcac 39
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
tgggatggcc aagaaattc 19
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
ctaccatgtc ttccgttgct tg 22
<210> 48
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
tgatctcgag acccacctgg acatgctc 28
<210> 49
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
ctaccaggac acgattttgt ggaagaatat ccaggagttt gctggctgc 49
<210> 50
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
gcagccagca aactcctgga tattcttcca caaaatcgtg tcctggtag 49
<210> 51
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
ctgccaccag ctgtgcgccc gagggcagca gaagatccgg aagtacacga 50
<210> 52
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
gtggcccggg tctagattag tctaagaggc agccatagg 39
<210> 53
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
ccgcctcgag gccgcgagca cccaagtg 28
<210> 54
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
cgcgactagt ttaatcctct gctgtcacct c 31
<210> 55
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 55
ccgcctcgag tacctttcta cggacgtg 28
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
cgcgactagt ttactctggc cggttggcag 30
<210> 57
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
ccgcctcgag cagcagaaga tccggaagta c 31
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 58
cgcgactagt ttaagcccct tcggagggtg 30
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 位于Her2/neu分子的胞外域中的标绘的HLA-A2限制性表位
<400> 59
His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 位于Her2/neu分子的胞外域中的标绘的HLA-A2限制性表位
<400> 60
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 位于Her2/neu分子的胞外域中的标绘的HLA-A2限制性表位
<400> 61
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val
1 5
<210> 62
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 加了His标签的LLO
<400> 62
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val
435 440 445
Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe
450 455 460
Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr
465 470 475 480
Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile
485 490 495
Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp
500 505 510
Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile
515 520 525
Glu His His His His His His
530 535
<210> 63
<211> 1551
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码LLO蛋白的基因
<400> 63
catatgaagg atgcatctgc attcaataaa gaaaattcaa tttcatccgt ggcaccacca 60
gcatctccgc ctgcaagtcc taagacgcca atcgaaaaga aacacgcgga tgaaatcgat 120
aagtatatac aaggattgga ttacaataaa aacaatgtat tagtatacca cggagatgca 180
gtgacaaatg tgccgccaag aaaaggttac aaagatggaa atgaatatat tgttgtggag 240
aaaaagaaga aatccatcaa tcaaaataat gcagacattc aagttgtgaa tgcaatttcg 300
agcctaacct atccaggtgc tctcgtaaaa gcgaattcgg aattagtaga aaatcaacca 360
gatgttctcc ctgtaaaacg tgattcatta acactcagca ttgatttgcc aggtatgact 420
aatcaagaca ataaaatagt tgtaaaaaat gccactaaat caaacgttaa caacgcagta 480
aatacattag tggaaagatg gaatgaaaaa tatgctcaag cttattcaaa tgtaagtgca 540
aaaattgatt atgatgacga aatggcttac agtgaatcac aattaattgc gaaatttggt 600
acagcattta aagctgtaaa taatagcttg aatgtaaact tcggcgcaat cagtgaaggg 660
aaaatgcaag aagaagtcat tagttttaaa caaatttact ataacgtgaa tgttaatgaa 720
cctacaagac cttccagatt tttcggcaaa gctgttacta aagagcagtt gcaagcgctt 780
ggagtgaatg cagaaaatcc tcctgcatat atctcaagtg tggcgtatgg ccgtcaagtt 840
tatttgaaat tatcaactaa ttcccatagt actaaagtaa aagctgcttt tgatgctgcc 900
gtaagcggaa aatctgtctc aggtgatgta gaactaacaa atatcatcaa aaattcttcc 960
ttcaaagccg taatttacgg aggttccgca aaagatgaag ttcaaatcat cgacggcaac 1020
ctcggagact tacgcgatat tttgaaaaaa ggcgctactt ttaatcgaga aacaccagga 1080
gttcccattg cttatacaac aaacttccta aaagacaatg aattagctgt tattaaaaac 1140
aactcagaat atattgaaac aacttcaaaa gcttatacag atggaaaaat taacatcgat 1200
cactctggag gatacgttgc tcaattcaac atttcttggg atgaagtaaa ttatgatcct 1260
gaaggtaacg aaattgttca acataaaaac tggagcgaaa acaataaaag caagctagct 1320
catttcacat cgtccatcta tttgcctggt aacgcgagaa atattaatgt ttacgctaaa 1380
gaatgcactg gtttagcttg ggaatggtgg agaacggtaa ttgatgaccg gaacttacca 1440
cttgtgaaaa atagaaatat ctccatctgg ggcaccacgc tttatccgaa atatagtaat 1500
aaagtagata atccaatcga acaccaccac caccaccact aataaggatc c 1551
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 64
gctagctcat ttcacatcgt 20
<210> 65
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 65
tcttgcagct tcccaagcta aaccagtcgc ttctttagcg taaacattaa tatt 54
<210> 66
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 66
gaagcgactg gtttagcttg ggaagctgca agaacggtaa ttgatgaccg gaac 54
<210> 67
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
ggatccttat tagtggtggt ggtggtggtg ttcgattgg 39
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型CBD序列
<400> 68
Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg
1 5 10
<210> 69
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变的CBD序列
<400> 69
Glu Ala Thr Gly Leu Ala Trp Glu Ala Ala Arg
1 5 10
<210> 70
<211> 238
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实例25的突变的NheI-BamHI片段
<400> 70
gctagctcat ttcacatcgt ccatctattt gcctggtaac gcgagaaata ttaatgttta 60
cgctaaagaa gcgactggtt tagcttggga agctgcaaga acggtaattg atgaccggaa 120
cttaccactt gtgaaaaata gaaatatctc catctggggc accacgcttt atccgaaata 180
tagtaataaa gtagataatc caatcgaaca ccaccaccac caccactaat aaggatcc 238
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ctLLO，包含来自NY-ESO-1的HLA-A2限制性表位157-165的置换序列
<400> 71
Glu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Arg
1 5 10
<210> 72
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 72
tctgcactgg gtgatccaca tcagcaggct ttctttagcg taaacattaa tatt 54
<210> 73
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 73
gaaagcctgc tgatgtggat cacccagtgc agaacggtaa ttgatgaccg gaac 54
<210> 74
<211> 238
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自实例25的所得的NheI/BamHI片段
<400> 74
gctagctcat ttcacatcgt ccatctattt gcctggtaac gcgagaaata ttaatgttta 60
cgctaaagaa agcctgctga tgtggatcac ccagtgcaga acggtaattg atgaccggaa 120
cttaccactt gtgaaaaata gaaatatctc catctggggc accacgcttt atccgaaata 180
tagtaataaa gtagataatc caatcgaaca ccaccaccac caccactaat aaggatcc 238
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卵清蛋白衍生的肽
<400> 75
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5
<210> 76
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 76
tcgtgtactt ccggatcttc tgctgccctc gggcgcacag ctggtggcag 50
<210> 77
<211> 7075
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAdv164序列
<400> 77
cggagtgtat actggcttac tatgttggca ctgatgaggg tgtcagtgaa gtgcttcatg 60
tggcaggaga aaaaaggctg caccggtgcg tcagcagaat atgtgataca ggatatattc 120
cgcttcctcg ctcactgact cgctacgctc ggtcgttcga ctgcggcgag cggaaatggc 180
ttacgaacgg ggcggagatt tcctggaaga tgccaggaag atacttaaca gggaagtgag 240
agggccgcgg caaagccgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacaagca tcacgaaatc 300
tgacgctcaa atcagtggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 360
cctggcggct ccctcgtgcg ctctcctgtt cctgcctttc ggtttaccgg tgtcattccg 420
ctgttatggc cgcgtttgtc tcattccacg cctgacactc agttccgggt aggcagttcg 480
ctccaagctg gactgtatgc acgaaccccc cgttcagtcc gaccgctgcg ccttatccgg 540
taactatcgt cttgagtcca acccggaaag acatgcaaaa gcaccactgg cagcagccac 600
tggtaattga tttagaggag ttagtcttga agtcatgcgc cggttaaggc taaactgaaa 660
ggacaagttt tggtgactgc gctcctccaa gccagttacc tcggttcaaa gagttggtag 720
ctcagagaac cttcgaaaaa ccgccctgca aggcggtttt ttcgttttca gagcaagaga 780
ttacgcgcag accaaaacga tctcaagaag atcatcttat taatcagata aaatatttct 840
agccctcctt tgattagtat attcctatct taaagttact tttatgtgga ggcattaaca 900
tttgttaatg acgtcaaaag gatagcaaga ctagaataaa gctataaagc aagcatataa 960
tattgcgttt catctttaga agcgaatttc gccaatatta taattatcaa aagagagggg 1020
tggcaaacgg tatttggcat tattaggtta aaaaatgtag aaggagagtg aaacccatga 1080
aaaaaataat gctagttttt attacactta tattagttag tctaccaatt gcgcaacaaa 1140
ctgaagcaaa ggatgcatct gcattcaata aagaaaattc aatttcatcc atggcaccac 1200
cagcatctcc gcctgcaagt cctaagacgc caatcgaaaa gaaacacgcg gatgaaatcg 1260
ataagtatat acaaggattg gattacaata aaaacaatgt attagtatac cacggagatg 1320
cagtgacaaa tgtgccgcca agaaaaggtt acaaagatgg aaatgaatat attgttgtgg 1380
agaaaaagaa gaaatccatc aatcaaaata atgcagacat tcaagttgtg aatgcaattt 1440
cgagcctaac ctatccaggt gctctcgtaa aagcgaattc ggaattagta gaaaatcaac 1500
cagatgttct ccctgtaaaa cgtgattcat taacactcag cattgatttg ccaggtatga 1560
ctaatcaaga caataaaata gttgtaaaaa atgccactaa atcaaacgtt aacaacgcag 1620
taaatacatt agtggaaaga tggaatgaaa aatatgctca agcttatcca aatgtaagtg 1680
caaaaattga ttatgatgac gaaatggctt acagtgaatc acaattaatt gcgaaatttg 1740
gtacagcatt taaagctgta aataatagct tgaatgtaaa cttcggcgca atcagtgaag 1800
ggaaaatgca agaagaagtc attagtttta aacaaattta ctataacgtg aatgttaatg 1860
aacctacaag accttccaga tttttcggca aagctgttac taaagagcag ttgcaagcgc 1920
ttggagtgaa tgcagaaaat cctcctgcat atatctcaag tgtggcgtat ggccgtcaag 1980
tttatttgaa attatcaact aattcccata gtactaaagt aaaagctgct tttgatgctg 2040
ccgtaagcgg aaaatctgtc tcaggtgatg tagaactaac aaatatcatc aaaaattctt 2100
ccttcaaagc cgtaatttac ggaggttccg caaaagatga agttcaaatc atcgacggca 2160
acctcggaga cttacgcgat attttgaaaa aaggcgctac ttttaatcga gaaacaccag 2220
gagttcccat tgcttataca acaaacttcc taaaagacaa tgaattagct gttattaaaa 2280
acaactcaga atatattgaa acaacttcaa aagcttatac agatggaaaa attaacatcg 2340
atcactctgg aggatacgtt gctcaattca acatttcttg ggatgaagta aattatgatc 2400
tcgagaccca cctggacatg ctccgccacc tctaccaggg ctgccaggtg gtgcagggaa 2460
acctggaact cacctacctg cccaccaatg ccagcctgtc cttcctgcag gatatccagg 2520
aggtgcaggg ctacgtgctc atcgctcaca accaagtgag gcaggtccca ctgcagaggc 2580
tgcggattgt gcgaggcacc cagctctttg aggacaacta tgccctggcc gtgctagaca 2640
atggagaccc gctgaacaat accacccctg tcacaggggc ctccccagga ggcctgcggg 2700
agctgcagct tcgaagcctc acagagatct tgaaaggagg ggtcttgatc cagcggaacc 2760
cccagctctg ctaccaggac acgattttgt ggaagaatat ccaggagttt gctggctgca 2820
agaagatctt tgggagcctg gcatttctgc cggagagctt tgatggggac ccagcctcca 2880
acactgcccc gctccagcca gagcagctcc aagtgtttga gactctggaa gagatcacag 2940
gttacctata catctcagca tggccggaca gcctgcctga cctcagcgtc ttccagaacc 3000
tgcaagtaat ccggggacga attctgcaca atggcgccta ctcgctgacc ctgcaagggc 3060
tgggcatcag ctggctgggg ctgcgctcac tgagggaact gggcagtgga ctggccctca 3120
tccaccataa cacccacctc tgcttcgtgc acacggtgcc ctgggaccag ctctttcgga 3180
acccgcacca agctctgctc cacactgcca accggccaga ggacgagtgt gtgggcgagg 3240
gcctggcctg ccaccagctg tgcgcccgag ggcagcagaa gatccggaag tacacgatgc 3300
ggagactgct gcaggaaacg gagctggtgg agccgctgac acctagcgga gcgatgccca 3360
accaggcgca gatgcggatc ctgaaagaga cggagctgag gaaggtgaag gtgcttggat 3420
ctggcgcttt tggcacagtc tacaagggca tctggatccc tgatggggag aatgtgaaaa 3480
ttccagtggc catcaaagtg ttgagggaaa acacatcccc caaagccaac aaagaaatct 3540
tagacgaagc atacgtgatg gctggtgtgg gctccccata tgtctcccgc cttctgggca 3600
tctgcctgac atccacggtg cagctggtga cacagcttat gccctatggc tgcctcttag 3660
actaatctag acccgggcca ctaactcaac gctagtagtg gatttaatcc caaatgagcc 3720
aacagaacca gaaccagaaa cagaacaagt aacattggag ttagaaatgg aagaagaaaa 3780
aagcaatgat ttcgtgtgaa taatgcacga aatcattgct tattttttta aaaagcgata 3840
tactagatat aacgaaacaa cgaactgaat aaagaataca aaaaaagagc cacgaccagt 3900
taaagcctga gaaactttaa ctgcgagcct taattgatta ccaccaatca attaaagaag 3960
tcgagaccca aaatttggta aagtatttaa ttactttatt aatcagatac ttaaatatct 4020
gtaaacccat tatatcgggt ttttgagggg atttcaagtc tttaagaaga taccaggcaa 4080
tcaattaaga aaaacttagt tgattgcctt ttttgttgtg attcaacttt gatcgtagct 4140
tctaactaat taattttcgt aagaaaggag aacagctgaa tgaatatccc ttttgttgta 4200
gaaactgtgc ttcatgacgg cttgttaaag tacaaattta aaaatagtaa aattcgctca 4260
atcactacca agccaggtaa aagtaaaggg gctatttttg cgtatcgctc aaaaaaaagc 4320
atgattggcg gacgtggcgt tgttctgact tccgaagaag cgattcacga aaatcaagat 4380
acatttacgc attggacacc aaacgtttat cgttatggta cgtatgcaga cgaaaaccgt 4440
tcatacacta aaggacattc tgaaaacaat ttaagacaaa tcaatacctt ctttattgat 4500
tttgatattc acacggaaaa agaaactatt tcagcaagcg atattttaac aacagctatt 4560
gatttaggtt ttatgcctac gttaattatc aaatctgata aaggttatca agcatatttt 4620
gttttagaaa cgccagtcta tgtgacttca aaatcagaat ttaaatctgt caaagcagcc 4680
aaaataatct cgcaaaatat ccgagaatat tttggaaagt ctttgccagt tgatctaacg 4740
tgcaatcatt ttgggattgc tcgtatacca agaacggaca atgtagaatt ttttgatccc 4800
aattaccgtt attctttcaa agaatggcaa gattggtctt tcaaacaaac agataataag 4860
ggctttactc gttcaagtct aacggtttta agcggtacag aaggcaaaaa acaagtagat 4920
gaaccctggt ttaatctctt attgcacgaa acgaaatttt caggagaaaa gggtttagta 4980
gggcgcaata gcgttatgtt taccctctct ttagcctact ttagttcagg ctattcaatc 5040
gaaacgtgcg aatataatat gtttgagttt aataatcgat tagatcaacc cttagaagaa 5100
aaagaagtaa tcaaaattgt tagaagtgcc tattcagaaa actatcaagg ggctaatagg 5160
gaatacatta ccattctttg caaagcttgg gtatcaagtg atttaaccag taaagattta 5220
tttgtccgtc aagggtggtt taaattcaag aaaaaaagaa gcgaacgtca acgtgttcat 5280
ttgtcagaat ggaaagaaga tttaatggct tatattagcg aaaaaagcga tgtatacaag 5340
ccttatttag cgacgaccaa aaaagagatt agagaagtgc taggcattcc tgaacggaca 5400
ttagataaat tgctgaaggt actgaaggcg aatcaggaaa ttttctttaa gattaaacca 5460
ggaagaaatg gtggcattca acttgctagt gttaaatcat tgttgctatc gatcattaaa 5520
ttaaaaaaag aagaacgaga aagctatata aaggcgctga cagcttcgtt taatttagaa 5580
cgtacattta ttcaagaaac tctaaacaaa ttggcagaac gccccaaaac ggacccacaa 5640
ctcgatttgt ttagctacga tacaggctga aaataaaacc cgcactatgc cattacattt 5700
atatctatga tacgtgtttg tttttctttg ctggctagct taattgctta tatttacctg 5760
caataaagga tttcttactt ccattatact cccattttcc aaaaacatac ggggaacacg 5820
ggaacttatt gtacaggcca cctcatagtt aatggtttcg agccttcctg caatctcatc 5880
catggaaata tattcatccc cctgccggcc tattaatgtg acttttgtgc ccggcggata 5940
ttcctgatcc agctccacca taaattggtc catgcaaatt cggccggcaa ttttcaggcg 6000
ttttcccttc acaaggatgt cggtcccttt caattttcgg agccagccgt ccgcatagcc 6060
tacaggcacc gtcccgatcc atgtgtcttt ttccgctgtg tactcggctc cgtagctgac 6120
gctctcgcct tttctgatca gtttgacatg tgacagtgtc gaatgcaggg taaatgccgg 6180
acgcagctga aacggtatct cgtccgacat gtcagcagac gggcgaaggc catacatgcc 6240
gatgccgaat ctgactgcat taaaaaagcc ttttttcagc cggagtccag cggcgctgtt 6300
cgcgcagtgg accattagat tctttaacgg cagcggagca atcagctctt taaagcgctc 6360
aaactgcatt aagaaatagc ctctttcttt ttcatccgct gtcgcaaaat gggtaaatac 6420
ccctttgcac tttaaacgag ggttgcggtc aagaattgcc atcacgttct gaacttcttc 6480
ctctgttttt acaccaagtc tgttcatccc cgtatcgacc ttcagatgaa aatgaagaga 6540
accttttttc gtgtggcggg ctgcctcctg aagccattca acagaataac ctgttaaggt 6600
cacgtcatac tcagcagcga ttgccacata ctccggggga accgcgccaa gcaccaatat 6660
aggcgccttc aatccctttt tgcgcagtga aatcgcttca tccaaaatgg ccacggccaa 6720
gcatgaagca cctgcgtcaa gagcagcctt tgctgtttct gcatcaccat gcccgtaggc 6780
gtttgctttc acaactgcca tcaagtggac atgttcaccg atatgttttt tcatattgct 6840
gacattttcc tttatcgcgg acaagtcaat ttccgcccac gtatctctgt aaaaaggttt 6900
tgtgctcatg gaaaactcct ctcttttttc agaaaatccc agtacgtaat taagtatttg 6960
agaattaatt ttatattgat taatactaag tttacccagt tttcacctaa aaaacaaatg 7020
atgagataat agctccaaag gctaaagagg actataccaa ctatttgtta attaa 7075
<210> 78
<211> 1761
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAK6的氨基酸序列
<400> 78
gggctgctca acgacatcca gaagttgtca gtcatcagct ccaacaccct gcgtggccgc 60
agccccacca gccggcggcg ggcacagtcc ctggggctgc tgggggatga gcactgggcc 120
accgacccag acatgtacct ccagagcccc cagtctgagc gcactgaccc ccacggcctc 180
tacctcagct gcaacggggg cacaccagca ggccacaagc agatgccgtg gcccgagcca 240
cagagcccac gggtcctgcc caatgggctg gctgcaaagg cacagtccct gggccccgcc 300
gagtttcagg gtgcctcgca gcgctgtctg cagctgggtg cctgcctgca gagctcccca 360
ccaggagcct cgccccccac gggcaccaat aggcatggaa tgaaggctgc caagcatggc 420
tctgaggagg cccggccaca gtcctgcctg gtgggctcag ccacaggcag gccaggtggg 480
gaaggcagcc ctagccctaa gacccgggag agcagcctga agcgcaggct attccgaagc 540
atgttcctgt ccactgctgc cacagcccct ccaagcagca gcaagccagg ccctccacca 600
cagagcaagc ccaactcctc tttccgaccg ccgcagaaag acaacccccc aagcctggtg 660
gccaaggccc agtccttgcc ctcggaccag ccggtgggga ccttcagccc tctgaccact 720
tcggatacca gcagccccca gaagtccctc cgcacagccc cggccacagg ccagcttcca 780
ggccggtctt ccccagcggg atccccccgc acctggcacg cccagatcag caccagcaac 840
ctgtacctgc cccaggaccc cacggttgcc aagggtgccc tggctggtga ggacacaggt 900
gttgtgacac atgagcagtt caaggctgcg ctcaggatgg tggtggacca gggtgacccc 960
cggctgctgc tggacagcta cgtgaagatt ggcgagggct ccaccggcat cgtctgcttg 1020
gcccgggaga agcactcggg ccgccaggtg gccgtcaaga tgatggacct caggaagcag 1080
cagcgcaggg agctgctctt caacgaggtg gtgatcatgc gggactacca gcacttcaac 1140
gtggtggaga tgtacaagag ctacctggtg ggcgaggagc tgtgggtgct catggagttc 1200
ctgcagggag gagccctcac agacatcgtc tcccaagtca ggctgaatga ggagcagatt 1260
gccactgtgt gtgaggctgt gctgcaggcc ctggcctacc tgcatgctca gggtgtcatc 1320
caccgggaca tcaagagtga ctccatcctg ctgaccctcg atggcagggt gaagctctcg 1380
gacttcggat tctgtgctca gatcagcaaa gacgtcccta agaggaagtc cctggtggga 1440
accccctact ggatggctcc tgaagtgatc tccaggtctt tgtatgccac tgaggtggat 1500
atctggtctc tgggcatcat ggtgattgag atggtagatg gggagccacc gtacttcagt 1560
gactccccag tgcaagccat gaagaggctc cgggacagcc ccccacccaa gctgaaaaac 1620
tctcacaagg tctccccagt gctgcgagac ttcctggagc ggatgctggt gcgggacccc 1680
caagagagag ccacagccca ggagctccta gaccacccct tcctgctgca gacagggcta 1740
cctgagtgcc tggtgcccct g 1761
<210> 79
<211> 587
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAK6的氨基酸序列
<400> 79
Gly Leu Leu Asn Asp Ile Gln Lys Leu Ser Val Ile Ser Ser Asn Thr
1 5 10 15
Leu Arg Gly Arg Ser Pro Thr Ser Arg Arg Arg Ala Gln Ser Leu Gly
20 25 30
Leu Leu Gly Asp Glu His Trp Ala Thr Asp Pro Asp Met Tyr Leu Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Ser Glu Arg Thr Asp Pro His Gly Leu Tyr Leu Ser Cys
50 55 60
Asn Gly Gly Thr Pro Ala Gly His Lys Gln Met Pro Trp Pro Glu Pro
65 70 75 80
Gln Ser Pro Arg Val Leu Pro Asn Gly Leu Ala Ala Lys Ala Gln Ser
85 90 95
Leu Gly Pro Ala Glu Phe Gln Gly Ala Ser Gln Arg Cys Leu Gln Leu
100 105 110
Gly Ala Cys Leu Gln Ser Ser Pro Pro Gly Ala Ser Pro Pro Thr Gly
115 120 125
Thr Asn Arg His Gly Met Lys Ala Ala Lys His Gly Ser Glu Glu Ala
130 135 140
Arg Pro Gln Ser Cys Leu Val Gly Ser Ala Thr Gly Arg Pro Gly Gly
145 150 155 160
Glu Gly Ser Pro Ser Pro Lys Thr Arg Glu Ser Ser Leu Lys Arg Arg
165 170 175
Leu Phe Arg Ser Met Phe Leu Ser Thr Ala Ala Thr Ala Pro Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Lys Pro Gly Pro Pro Pro Gln Ser Lys Pro Asn Ser Ser Phe
195 200 205
Arg Pro Pro Gln Lys Asp Asn Pro Pro Ser Leu Val Ala Lys Ala Gln
210 215 220
Ser Leu Pro Ser Asp Gln Pro Val Gly Thr Phe Ser Pro Leu Thr Thr
225 230 235 240
Ser Asp Thr Ser Ser Pro Gln Lys Ser Leu Arg Thr Ala Pro Ala Thr
245 250 255
Gly Gln Leu Pro Gly Arg Ser Ser Pro Ala Gly Ser Pro Arg Thr Trp
260 265 270
His Ala Gln Ile Ser Thr Ser Asn Leu Tyr Leu Pro Gln Asp Pro Thr
275 280 285
Val Ala Lys Gly Ala Leu Ala Gly Glu Asp Thr Gly Val Val Thr His
290 295 300
Glu Gln Phe Lys Ala Ala Leu Arg Met Val Val Asp Gln Gly Asp Pro
305 310 315 320
Arg Leu Leu Leu Asp Ser Tyr Val Lys Ile Gly Glu Gly Ser Thr Gly
325 330 335
Ile Val Cys Leu Ala Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Gln Val Ala Val
340 345 350
Lys Met Met Asp Leu Arg Lys Gln Gln Arg Arg Glu Leu Leu Phe Asn
355 360 365
Glu Val Val Ile Met Arg Asp Tyr Gln His Phe Asn Val Val Glu Met
370 375 380
Tyr Lys Ser Tyr Leu Val Gly Glu Glu Leu Trp Val Leu Met Glu Phe
385 390 395 400
Leu Gln Gly Gly Ala Leu Thr Asp Ile Val Ser Gln Val Arg Leu Asn
405 410 415
Glu Glu Gln Ile Ala Thr Val Cys Glu Ala Val Leu Gln Ala Leu Ala
420 425 430
Tyr Leu His Ala Gln Gly Val Ile His Arg Asp Ile Lys Ser Asp Ser
435 440 445
Ile Leu Leu Thr Leu Asp Gly Arg Val Lys Leu Ser Asp Phe Gly Phe
450 455 460
Cys Ala Gln Ile Ser Lys Asp Val Pro Lys Arg Lys Ser Leu Val Gly
465 470 475 480
Thr Pro Tyr Trp Met Ala Pro Glu Val Ile Ser Arg Ser Leu Tyr Ala
485 490 495
Thr Glu Val Asp Ile Trp Ser Leu Gly Ile Met Val Ile Glu Met Val
500 505 510
Asp Gly Glu Pro Pro Tyr Phe Ser Asp Ser Pro Val Gln Ala Met Lys
515 520 525
Arg Leu Arg Asp Ser Pro Pro Pro Lys Leu Lys Asn Ser His Lys Val
530 535 540
Ser Pro Val Leu Arg Asp Phe Leu Glu Arg Met Leu Val Arg Asp Pro
545 550 555 560
Gln Glu Arg Ala Thr Ala Gln Glu Leu Leu Asp His Pro Phe Leu Leu
565 570 575
Gln Thr Gly Leu Pro Glu Cys Leu Val Pro Leu
580 585
<210> 80
<211> 529
<212> PRT
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 80
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val
435 440 445
Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe
450 455 460
Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr
465 470 475 480
Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile
485 490 495
Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp
500 505 510
Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile
515 520 525
Glu
<210> 81
<211> 2048
<212> DNA
<213> 单核细胞增多性李斯特菌
<400> 81
taacgacgat aaagggacag caggactaga ataaagctat aaagcaagca tataatattg 60
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acattagtgg aaagatggaa tgaaaaatat gctcaagctt atccaaatgt aagtgcaaaa 780
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6x组氨酸标签
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His His His His His His
1 5
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<211> 123
<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒16型
<400> 83
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ggt 123
<210> 84
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒92型
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<212> DNA
<213> 人乳头瘤病毒1a型
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aatcctatga gcatagatag aaaacataga gcattaacat taattaagtg tccaccgcta 2520
ctggttacat caaatataga cattagcaaa gaggagaaat acaaatattt acatagtaga 2580
gttaccacat ttacatttcc aaatccattc ccctttgaca gaaatgggaa tgcagtatat 2640
gaactatcag atgcaaactg gaaatgtttc tttgaaagac tgtcgtccag cctagacatt 2700
gaggattcag aggacgagga agatggaagc aatagccaag cgtttagatg cgtgccagga 2760
tcagttgtta gaactttatg aagaaaacag tattgatata cacaaacaca ttatgcattg 2820
gaaatgcata cgattggaaa gtgtattact acacaaagca aaacaaatgg gcctgagcca 2880
catcgggtta caagtagtac caccattaac tgtgtcagag actaaaggac ataatgctat 2940
tgaaatgcaa atgcatttag aatccttagc aaaaactcag tatggtgtgg aaccttggac 3000
attacaggac accagttatg aaatgtggct aacaccaccc aaacggtgct ttaaaaaaca 3060
gggaaatact gtggaggtaa aatttgatgg ctgtgaagac aatgtaatgg agtatgtggt 3120
atggacacat atatacctgc aggacaacga ctcatgggta aaagtaacta gttccgtaga 3180
tgccaagggc atatattata catgtggaca atttaaaaca tattatgtaa attttaataa 3240
agaggcacaa aagtatggta gtaccaatca ttgggaagta tgttatggca gcacagttat 3300
atgttctcct gcatctgtat ctagcactgt acgagaagta tccattgctg aacctactac 3360
atacaccccc gcacagacca ccgcccctac agtgtccgcc tgcaccacgg aagacggcgt 3420
gtcggcgccg cctaggaagc gagcacgtgg accgtccact aacaacaccc tgtgtgtggc 3480
caacatcaga tccgtggaca gtacaatcaa caacatcgtc actgacaatt acaacaagca 3540
ccaaagaagg aacaactgtc acagtgcagc tacgcctata gtgcaactgc aaggtgattc 3600
caattgttta aaatgtttta gatatagact gaatgacaaa tataaacatt tgtttgaatt 3660
agcatcttca acgtggcatt gggcctcacc tgaggcacca cataaaaatg caattgtaac 3720
attaacatat agcagtgagg aacaacgtca gcaattttta aacagtgtaa aaataccacc 3780
caccattagg cataaggtgg ggtttatgtc attacattta ttgtaaccat tacacctgta 3840
tatatgtata tgtgtacata acatacgtgt atggaggtag tgcctgtaca aattgctgca 3900
gcaacaacta caacattgat attgcctgtt gttattgcat ttgcagtatg tattcttagt 3960
attgtactta taatattaat atctgatttt gtagtatata catctgtgct ggtactaaca 4020
cttcttttat atttgctttt gtggctttta ttaacaaccc ctttgcaatt ctttttacta 4080
acactgtgtg tgtgctattt tcctgccttt tatatacaca tatacattgt gcaaacgcaa 4140
caataatggt gatgttaacc tgtcacttaa atgatggtga tacatggttg tttctgtggt 4200
tgtttactgc atttgttgta gctgtacttg gattgttgtt actacattac agggctgtac 4260
atggtactga aaaaactaaa tgtgctaagt gtaaatcaaa ccgcaatact actgtggatt 4320
atgtgtatat gtcacatggt gataatggag attatgtgta catgaactag agtaaacctt 4380
ttttatacag tgtgtggtgt acgttagtta tatataatga aacctagggc acgcagacgt 4440
aaacgtgcgt cagccacaca actatatcaa acatgcaagg ccactggtac atgtccccca 4500
gatgtaattc ctaaagttga acatactact attgcagatc aaatattaaa atggggaagc 4560
ttaggggttt tttttggtgg gttaggtatt ggtacagggg ctggtagtgg cggtcgtgca 4620
gggtatatac ccttgggaag ctctcccaag cctgctatta ctggggggcc agcagcacgt 4680
ccgccagtgc ttgtggagcc tgttgcccct tccgatccct ccattgtgtc cttaattgag 4740
gagtctgcta ttattaatgc tggtgcacct gaggtggtac cccctacaca gggtggcttt 4800
actataacat catctgaatc gactacacct gctattttag atgtgtctgt taccaatcac 4860
actaccacta gtgtgtttca aaatcccctg tttacagaac cgtctgtaat acagccccaa 4920
ccacctgtgg aggccagtgg tcacatactt atatctgccc caacaataac atcccaacat 4980
gtagaagaca ttccactaga cacttttgtt gtatcctcta gtgatagtgg acctacatcc 5040
agtactcctc ttcctcgtgc ttttcctcgg cctcgggtgg gtttgtatag tcgtgcctta 5100
cagcaggtac aggttacgga ccccgcgttt ttgtccacgc cacagcgatt ggtaacttat 5160
gacaaccctg tctatgaagg agaagatgta agtttacaat ttacccatga gtctatccac 5220
aatgcacctg atgaagcatt tatggatatt attagactac atagaccagc tataacgtcc 5280
agacggggtc ttgtgcgttt tagtcgcatt gggcaacggg ggtccatgta cacacgcagt 5340
ggacaacata taggtgcccg catacattat tttcaggaca tttcaccagt tacacaagct 5400
gcagaggaaa tagaactgca ccctctagtg gctgcagaaa atgacacgtt tgatatttat 5460
gctgaaccat ttgaccctat ccctgaccct gtccaacatt ctgttacaca gtcttatctt 5520
acctccacac ctaataccct ttcacaatcg tggggtaata ccacagtccc attgtcaatc 5580
cctagtgact ggtttgtgca gtctgggcct gacataactt ttcctactgc atctatggga 5640
acacccttta gtcctgtaac tcctgcttta cctacaggcc ctgtttttat tacaggttct 5700
gacttctatt tgcatcctac atggtacttt gcacgcagac gccgtaaacg tattccctta 5760
ttttttacag atgtggcggc ctagcgacag cacagtatat gtgcctcctc ccaaccctgt 5820
atccaaggtt gttgccacgg atgcgtatgt taaacgcacc aacatatttt atcatgccag 5880
cagttctaga ctccttgctg tgggacatcc atattactct atcaaaaaag ttaacaaaac 5940
agttgtacca aaggtgtctg gatatcaata tagagtgttt aaggtagtgt tgccagatcc 6000
taacaagttt gcattacctg attcatccct gtttgacccc actacacagc gtttagtatg 6060
ggcgtgcaca gggttggagg taggcagggg tcaaccttta ggcgttggtg ttagtgggca 6120
tccattgcta aacaaatatg atgatgtaga aaatagtggt gggtatggtg gtaatcctgg 6180
tcaggataat agggttaatg taggtatgga ttataaacaa acccagctat gtatggtggg 6240
ctgtgctcca ccgttaggtg aacattgggg taagggtaca caatgttcaa atacctctgt 6300
acaaaatggt gactgccccc cgttggaact tattaccagt gttatacagg atggggacat 6360
ggttgataca ggctttggtg ctatgaattt tgcagactta caaaccaata aatcggatgt 6420
tccccttgat atttgtggaa ctgtctgcaa atatcctgat tatttgcaaa tggctgcaga 6480
cccttatggt gataggttgt ttttttattt gcgaaaggaa caaatgtttg ctagacactt 6540
ttttaatagg gccggtactg tgggggaacc tgtgcctgat gacctgttgg taaaaggggg 6600
taataacaga tcatctgtag ctagtagtat ttatgtacat acacctagtg gctcattggt 6660
gtcttcagag gctcaattat ttaataaacc atattggctt caaaaggctc agggacataa 6720
caatggtatt tgctggggaa accacttgtt tgttactgtg gtagatacca cacgcagtac 6780
aaatatgaca ctatgtgcat ctgtgtctaa atctgctaca tacactaatt cagattataa 6840
ggaatacatg cgccatgtgg aggagtttga tttacagttt atttttcaat tgtgtagcat 6900
tacattatct gcagaagtca tggcctatat acacacaatg aatccttctg ttttggagga 6960
ctggaacttt ggtttatcgc ctccaccaaa tggtacactg gaggatactt atagatatgt 7020
acagtcacag gccattacct gtcagaaacc cacacctgaa aaagaaaaac aggatcccta 7080
taaggatatg agtttttggg aggttaactt aaaagaaaag ttttcaagtg aattagatca 7140
gtttcccctt ggacgtaagt ttttattgca aagtggatat cgaggacgga cgtctgctcg 7200
tacaggtata aagcgcccag ctgtgtctaa gccctctaca gcccccaaac gaaaacgtac 7260
caaaaccaaa aagtaatata tgtgtgtcag tgtgttgtgt tatttatatg ttgttgtagt 7320
gtgtatatgt ttcttgtatt gtgtatatgt gtatatgttt gtgtatatgt gtatgttatg 7380
tatgttatgt tgttatgtat gtttgtgtgt ttagtgtgtg tatatatttg tggaatgtgt 7440
atgtatgttt ttgtgcaata aacaattatt atgtgtgtcc tgttacaccc agtgactaag 7500
ttgtgttttg cacgcgccgt ttgtgttgcc ttcatattat attatatata tttgtaatat 7560
acctatacta tgttaccccc ccccacttgc aaccgttttc ggttgccctt acatacactt 7620
acctcaaatt tgttataacg tgttttgtac taatcccata tgttgtgtgc caaggtacat 7680
attgccctgc caagtatctt gccaacaaca cacctggcca gggcgcggta ttgcatgact 7740
aatgtacaat aaacctgtcg gtttgtacaa tgttgtggat tgcagccaaa ggttaaaagc 7800
atttttggct tctagctgaa catttttgta cccttagtat attatgcaca atacccacaa 7860
aatgagtaac ctaaggtcac acacctgcaa ccggtttcgg ttacccacac cctacatatt 7920
tccttcttat a 7931

Claims (72)

1.一种制造用于向患有疾病或病症的受试者施用的个性化免疫治疗组合物的方法，其中所述个性化免疫治疗组合物包含重组减毒李斯特菌菌株，其中所述李斯特菌菌株包含含有一个或多个开放阅读框的核酸序列，所述一个或多个开放阅读框编码含有一个或多个新表位的一种或多种肽，所述方法包括：
a.在来自患有疾病或病症的受试者的患病样品中获得并鉴定编码包含一个或多个新表位的一种或多种肽的所述核酸序列；
b.用包含编码含有所述一个或多个新表位的所述一种或多种肽的所述核酸序列的表达载体稳定转染减毒李斯特菌菌株；
c.获得表达含有所述一个或多个新表位的所述一种或多种肽的李斯特菌克隆；
d.将所述李斯特菌克隆扩增至预定的规模；
e.纯化扩增后的李斯特菌克隆；
f.用制剂缓冲液代替生长培养基；
g.收获所述李斯特菌克隆，
h.将所述收获的李斯特菌克隆稀释成具有预定浓度的溶液；和
i.将收获的李斯特菌克隆溶液分配到单剂量容器中以供后续储存或施用给受试者，
其中步骤d-i在全封闭式单次使用细胞生长系统中进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述全封闭式单次使用细胞生长系统包括接种部分、发酵部分、浓缩和渗滤部分以及产品分配部分。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述全封闭式单次使用细胞生长系统还包括生物处理袋、患者IV袋、采样袋、管、泵、阀、过滤器、快速连接器和传感器。
4.根据权利要求2-3中任一项所述的方法，其中所述全封闭式单次使用细胞生长系统的所有部件都是一次性的。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述全封闭式单次使用细胞生长系统包括集成的全封闭式流体流路。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述集成的全封闭式流体流路在使用前灭菌。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其中所述全封闭式单次使用细胞生长系统的所述接种部分包括一个或多个接种袋。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述全封闭式单次使用细胞生长系统的所述接种部分的每个接种袋可操作地连接至所述发酵部分。
9.根据权利要求8所述的方法，其中与所述发酵部分的所述连接通过无菌焊接器或一次性无菌连接器来固定。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中每个接种袋具有约25ml至约100ml的体积。
11.根据权利要求2-10中任一项所述的方法，其中所述全封闭式单次使用细胞生长系统的所述发酵部分包括一个或多个单次使用的搅拌式生物反应器。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物反应器是一次性波混袋式生物反应器。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物反应器是一次性搅拌槽生物反应器。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物反应器是一次性机械振摇生物反应器。
15.根据权利要求2-14中任一项所述的方法，其中所述全封闭式单次使用细胞生长系统的所述发酵部分还包含一个或多个培养袋。
16.根据权利要求15所述的方法，其中每个培养袋的体积不超过500ml。
17.根据权利要求16所述的方法，其中每个培养袋可操作地连接到所述全封闭式单次使用细胞生长系统的所述接种部分和所述浓缩部分。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述连接通过无菌焊接器或一次性无菌连接器来固定。
19.根据权利要求2-18中任一项所述的方法，其中将所述全封闭式单次使用细胞生长系统的所述接种和发酵部分灌装加热到规定温度的生长培养基。
20.根据权利要求2-19中任一项所述的方法，其中所述全封闭式单次使用细胞生长系统的所述浓缩部分包括以下中的一个或多个：过滤器、泵、渗透物容器或袋以及浓缩渗余物容器或袋。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述一个或多个过滤器是单次使用中空纤维过滤器。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述一个或多个过滤器可操作地串联连接。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述一个或多个过滤器可操作地并联连接。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述全封闭式单次使用细胞生长系统的所述浓缩部分的所述渗余物容器可操作地连接到所述发酵部分的所述培养袋并连接到所述过滤器，并且其中所述渗余物容器和所述过滤器之间的连接形成再循环回路。
25.根据权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述过滤器还可操作地连接到所述渗透物容器。
26.根据权利要求20-25中任一项所述的方法，其中所述浓缩部分内的流体流动由所述一个或多个泵致动。
27.根据权利要求20-26中任一项所述的方法，其中所述扩增的李斯特菌克隆的所述纯化通过对所述扩增的李斯特菌克隆进行浓缩和跨膜压力渗滤来完成，其中所述浓缩和渗滤通过使所述李斯特菌克隆通过所述全封闭式单次使用细胞生长系统的所述浓缩部分的所述单次使用中空纤维过滤器来完成。
28.根据权利要求2-27中任一项所述的方法，其中所述全封闭式单次使用细胞生长系统的所述产品分配部分包括以下中的一个或多个：泵、散装袋、清洗袋、采样袋和产品袋。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述一个或多个产品袋是单剂量袋。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述单剂量产品袋是IV袋。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述单剂量产品IV袋具有约25ml至约100ml的体积。
32.根据权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述全封闭式单次使用细胞生长系统的所述产品分配部分的所述散装袋可操作地连接到所述渗滤部分的所述渗余物袋，并且连接到所述一个或多个采样袋、清洗袋和产品袋。
33.根据权利要求28-32中任一项所述的方法，其中所述浓缩部分内的流体流动由所述一个或多个泵致动。
34.根据权利要求28-33中任一项所述的方法，其中将所述产品袋中的所述一个或多个灌装预定浓度的活减毒工程化李斯特菌的纯化培养菌株。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述产品袋中的所述一个或多个在灌装之后立即密封并且直接递送给患者以便进行治疗。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述产品袋在灌装之后立即密封和冷冻以供随后储存或运输。
37.根据权利要求36所述的方法，其中将所述冷冻产品袋解冻，并且就在施用给患者之前将所述李斯特菌重悬。
38.根据权利要求2-37中任一项所述的方法，其中所述全封闭式单次使用细胞生长系统具有集中式结构，其中所述发酵部分的所述发酵袋独立地用作所述浓缩和渗滤部分的所述渗余物和渗透物容器，以及用作所述产品分配部分的所述散装袋。
39.根据权利要求38所述的集中式全封闭式单次使用细胞生长系统，其中所述发酵袋可操作地连接到所述系统的每个其他区段，并且其中此类连接是可密封的。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述全封闭式单次使用细胞生长系统是基于生物通风橱的。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述单次使用细胞生长系统是单名患者规模的细胞生长系统。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中多个所述全封闭式单次使用细胞生长系统同时用于为多名受试者制造个性化治疗组合物。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中多个所述全封闭式单次使用细胞生长系统同时用于为一名受试者制造多个个性化治疗组合物。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，还包括表征所述免疫治疗组合物的安全性、纯度、效能、质量和稳定性。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述表征在将收获的李斯特菌克隆溶液分配到单剂量容器中的步骤之前的任何时间点进行。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述表征在将收获的李斯特菌克隆溶液分配到单剂量容器中的步骤之后进行。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括感染性疾病或肿瘤或癌症。
48.一种切向流过滤装置，包括：
渗余物袋，所述渗余物袋包括：
再循环出口；
再循环入口；和
渗滤入口；
渗透物袋；
过滤器；和
循环泵；
其中第一导管限定从所述再循环出口到所述再循环入口的第一流体路径，并且其中所述第一导管流体连接所述渗余物袋、所述循环泵和所述过滤器，使得所述循环泵被配置为将混合物从所述渗余物袋泵送到所述过滤器并泵送回所述渗余物袋；
其中第二导管限定从所述过滤器到所述渗透物袋的第二流体路径，其中所述过滤器被配置为允许所述混合物的至少一部分进入所述渗透物袋；并且
其中所述再循环出口被限定在所述渗余物出口附近，使得所述渗余物出口被配置为将所述渗余物袋的所述混合物在所述渗余物出口附近混合。
49.根据权利要求48所述的装置，还包括位于所述第一导管上的阀，其中所述阀被配置为选择性地控制所述第一导管中的压力。
50.根据权利要求49所述的装置，其中所述压力为3psi。
51.根据权利要求48-50中任一项所述的装置，其中所述再循环出口、再循环入口或渗滤入口中的至少一个在操作位置中设置在所述渗余物袋的底部处或附近。
52.根据权利要求51所述的装置，其中所述再循环出口和所述渗滤入口设置在所述渗余物袋的底部处或附近。
53.根据权利要求48-52中任一项所述的装置，还包括至少一个光密度传感器，所述至少一个光密度传感器被配置为检测所述混合物的光密度。
54.根据权利要求53所述的装置，其中所述至少一个光密度传感器光学连接到所述渗余物袋。
55.根据权利要求53所述的装置，其中所述至少一个光密度传感器光学连接到所述渗透物袋。
56.根据权利要求53所述的装置，其中所述至少一个光密度传感器光学连接到所述第一导管。
57.根据权利要求48-56中任一项所述的装置，还包括联接到所述第一导管的至少一个压力传感器。
58.一种制造构建体的方法，所述方法包括：
提供具有第一流体和构建体的混合物的渗余物袋；
通过以下方式浓缩所述构建体：
使所述混合物循环至过滤器，
其中所述过滤器流体地连接到渗透物袋，使得所述过滤器被配置为引导所述第一流体的至少一部分穿过所述膜进入所述渗透物袋并且允许所述混合物的剩余部分返回到所述渗余物袋，
通过以下方式渗滤：
将第二流体添加到所述混合物的所述剩余部分以形成第二混合物；以及
使所述第二混合物循环至所述过滤器；
其中使至少所述第二混合物以某一流量循环，
其中所述流量引起所述第二混合物的至少部分湍流流动，并且
其中所述流量被限定在很少或不剪切所述构建体的程度。
59.根据权利要求58所述的方法，其中将所述构建体浓缩2倍。
60.根据权利要求58-59中任一项所述的方法，其中所述流量为0.450L/min至0.850L/min。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述流量为0.650L/min。
62.根据权利要求58-62中任一项所述的方法，还包括在所述过滤器处保持预定压力。
63.根据权利要求62所述的方法，其中通过对阀进行控制以限制所述第一混合物或所述第二混合物的流动来维持所述预定压力。
64.根据权利要求58-63中任一项所述的方法，其中所述至少部分湍流流动利用位于流体导管中的所述过滤器之前和之后的压力传感器检测。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述压力传感器被配置为检测指示生物膜形成的高压差。
66.根据权利要求65所述的方法，还包括响应于高压差而增加所述流量。
67.根据权利要求58-66中任一项所述的方法，其中用一个或多个光密度传感器检测所述剪切。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述一个或多个光密度传感器检测所述第一混合物或所述第二混合物的所述光密度的变化。
69.根据权利要求67所述的方法，其中所述一个或多个光密度传感器设置在所述渗透物袋中。
70.根据权利要求67-69中任一项所述的方法，其中所述变化通过比较基线光密度来检测。
71.根据权利要求58-70中任一项所述的方法，还包括流量控制器，所述流量控制器电连接到所述循环泵并且被配置为控制所述流量。
72.根据权利要求58-71中任一项所述的方法，还包括至少一个流量传感器，其中所述至少一个流量传感器包括设置在所述过滤器上游的第一压力传感器和设置在所述过滤器下游的第二压力传感器，并且其中当由所述第一压力传感器检测到的第一压力和由所述第二压力传感器检测到的第二压力之间的差达到预定阈值时限定最小阈值。
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