JP2018522548A

JP2018522548A - 個別化送達ベクターを基にした免疫療法のための方法及びデバイス製造方法

Info

Publication number: JP2018522548A
Application number: JP2017566624A
Authority: JP
Inventors: アニルエアペン，; ロバートプティ，; マヨプホルス，
Original assignee: アドバクシス，インコーポレイテッド
Priority date: 2015-06-24
Filing date: 2016-06-24
Publication date: 2018-08-16
Also published as: HK1254917A1; AU2016281958A1; CN108138099A; EP3313975A4; EP3313975A1; KR20180027501A; WO2016207859A1; IL256482A; CA2990570A1; TW201717974A; US20170204361A1; MX2018000210A; MA42263A

Abstract

本発明は、対象の癌または不健康な組織に特異的な変異を含有する１つ以上のネオエピトープまたはペプチドと関連したペプチドを発現する遺伝子発現コンストラクトを備える、治療用ワクチン送達ベクターを含む、疾患または症状を有する対象用の個別化免疫療法組成物を提供するシステムを提供し、および同組成物を生成する方法を提供する。本発明はさらに、拡張可能な完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムを提供するものであり、ここで個別化免疫療法組成物の全製造プロセスは、前記組成物を患者送達用容器に分注することまでを含み、１つの閉鎖型流体流路内で実行される。【選択図】図１

Description

本開示は、疾患または症状を有する対象に対する、個別化免疫療法組成物の並列製造に関する拡張可能な方法を提供する。さらに本開示は、疾患または症状を有する１つの対象、または別個の対象（複数含む）に対する、複数の個別化免疫療法組成物を作製するための、いくつかの完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムの並列使用を提供する。

個別化医療の前には特定のタイプおよびステージの癌を有する大半の患者が同じ治療を受けた。しかしながら、一部の治療は、一部の患者には奏功するが、他の患者に対しては効果がないことが、医師及び患者に明らかになってきた。したがって、特定の腫瘍に有効な、効果的な個別化癌ワクチンの開発に関するニーズが存在する。個別化治療戦略は、標準治療で予測されるものよりも、より効果的で、副作用の発生を少なくすることができる。

腫瘍は個人のＤＮＡにおける突然変異に起因して発生する。突然変異は、宿主によって産生される対応する正常タンパク質内には存在しないネオエピトープを含み、変異型タンパク質または異常型タンパク質の産生を引き起こす場合がある。これらのネオエピトープの多くは、Ｔ細胞応答を刺激し、初期段階の癌細胞の免疫系による破壊を生じさせる。しかしながら確立された癌の場合、その免疫応答では不充分である。他の例では、癌の腫瘍抗原を標的とするが、そのネオエピトープを特異的には標的としない、効果的な長期作用型のワクチンの開発は困難であることが証明されている。これに対する主な理由は、腫瘍自己抗原に特異的なＴ細胞は、寛容メカニズムの間に排除され、または不活化されるためである。

ネオエピトープは、例えば癌などの疾患に関連したタンパク質内に存在するエピトープであり、その固有の「ネオエピトープ」は、疾患を有していない対象に関連した対応する正常タンパク質内、または疾患を担持する組織に関連した対応する正常タンパク質内には存在していない。ネオエピトープを特定することは困難であり得るが、しかしながらネオエピトープを特定し、それらを標的とする治療法を開発することは個別化治療戦略内で使用するために有利になる。その理由は、ネオエピトープは稀であり、個人間で変化し得るためである。

リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）は、リステリア症の原因となるグラム陽性の通性細胞内病原体である。宿主細胞に侵入すると、Ｌｍは、血管膜を溶解し、細胞質の中に入ることを可能にして、そこで複製してアクチン重合化タンパク質（ＡｃｔＡ）の移動度に基づいて隣接する細胞に拡散する孔形成タンパク質、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の生成を通してファゴリソソームから脱出しうる。細胞質内では、Ｌｍ−分泌タンパク質はプロテアソームによって分解され、そして小胞体内のＭＨＣクラスＩ分子と関連するペプチドへと処理される。この特有の特徴により、これは大変魅力的なガンワクチンベクターとされ、この中で腫瘍抗原は腫瘍に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を活性化するためにＭＨＣクラスＩ分子を提示されうる。

さらに、いったん貪食されると、その後ＬｍはＬｍ特異的ＣＤ４−Ｔ細胞応答の活性化用のＭＨＣクラスＩＩ上に提供されたファゴリソソーム区画およびペプチド内で処理されうる。あるいは、Ｌｍは、ファゴソームを逃れてサイトゾルに入ることがあり、そこで核オリゴマー形成ドメイン様受容体によるペプチドグリカンの認識、およびＤＮＡセンサー（ＡＩＭ２）によるＬｍＤＮＡが、炎症カスケードを活性化する。この炎症性応答とＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩ経路への抗原の効率的な送達との組み合わせは、Ｌｍを腫瘍の治療、腫瘍に対する保護、および腫瘍に対する免疫応答の誘発における強力なワクチンベクターとしている。

Ｔ細胞応答を追加的に刺激する、または他の治療法と併用される、リステリアベースのワクチンの構成要素として、対象の癌に特異的なネオエピトープを標的化することによって、対象の癌に対する個別化と、癌治療の有効性の両方があるワクチンが提供され得る。抗原の免疫原性を高め、またはワクチンの性能を高めて、寛容メカニズムから逃れたＴ細胞を刺激する抗原融合戦略は、免疫療法として特に可能性を有し得る。

患者が癌と診断された時点で、個別化療法剤の迅速な送達を確保することは、臨床転帰にとって極めて重要となる。その理由は、個別化療法の特定、検証、及び製造は、患者の疾患進行と同時に行われるためである。腫瘍ネオエピトープを標的とする、臨床的に充分な量の個別化免疫療法組成物の製造は、一方で適切な規制を遵守した手順を使用している。これが遅延の主要な原因となる場合があり、当該組成物を特定及び検証する、非常に時間のかかるプロセスを組み合わせている。したがって、迅速な改良が確保され、製造時間を最短化し、それと同時に薬剤製造に関し確立されている基準に沿った免疫療法組成物の効率的な製造方法の開発に対するニーズが存在する。

本開示は、完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムに基づいた、免疫療法組成物のための効率的な製造方法を提供することによって、このニーズに合致するものである。本開示はさらに、免疫療法組成物の製造方法の拡張性を提供することによって、前述のニーズに合致するものである。

１つの態様において、疾患または症状を有する対象に投与するための個別化免疫療法組成物の製造方法が開示され、前述の個別化免疫療法組成物は、組換え型弱毒化リステリア株を含有し、前述のリステリア株は、１つ以上のネオエピトープを含有する１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを備えた核酸配列を含有し、前述の方法は、以下を含む：
疾患または症状を有する対象由来の病変サンプルにおいて、１つ以上のネオエピトープを含有する１つ以上のペプチドをコードする前述の核酸配列を取得及び特定する工程。

前述の１つ以上のネオエピトープを含有する前述の１つ以上のペプチドをコードする前述の核酸配列を備える発現ベクターで、弱毒化リステリア株を安定的にトランスフェクトする工程、
前述の１つ以上のネオエピトープを含有する前述の１つ以上のペプチドを発現するリステリアクローンを取得する工程、
前述のリステリアクローンを、所定の規模まで増殖させる工程、
その増殖リステリアクローンを精製する工程、
増殖培地を、製剤緩衝液と置き換える工程、
前述のリステリアクローンを集菌する工程、
前述の集菌されたリステリアクローンを、所定の濃度を有する溶液に希釈させる工程、及び
前述の集菌されたリステリアクローン溶液を、その後の保管または対象への投与のために単回用量容器へと分注する工程。

ここで、前述の工程ｃ〜ｉは、完全閉鎖型単回使用細胞増殖システム中で行われる。

関連する態様において、前述の完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムは、接種セクション、発酵セクション、濃縮セクション、透析ろ過セクション、及び製品分注セクションを備えている。

別の関連する態様において、前述の完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムは、統合完全閉鎖型流体経路を備えている。

さらなる関連態様において、完全閉鎖系単回使用細胞増殖システムが開示され、前述のシステムは１つ以上の単回使用攪拌型バイオリアクターをさらに備えている。

別の関連する態様において、前述の完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムの製品分注セクションは、対象への即時投与に使用することができる、またはあるいはその後の輸送及び保管のために凍結されることができる、単回投与サイズの製品容器を備えている。

追加の関連する態様において、一人対象規模の完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムが開示される。別の関連態様において、本開示は、同一の対象用の、または別個の対象用の、複数の個別化免疫療法組成物を並行製造するための、いくつかの完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムの同時使用を提供する。

別の関連態様において、前述の疾患または症状は、感染性疾患、または腫瘍もしくは癌を含む。

別の関連態様において、本開示は、接線流ろ過（ＴＦＦ：ｔａｎｇｅｎｔｉａｌｆｌｏｗｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）デバイスに関するものであり、当該デバイスは、組み換えリステリア株を含有する医薬品の濃縮及び透析ろ過のための濃縮セクション及び透析ろ過セクションを備え、ここで、前述は、フロー流体管５を介して透過物容器２に機能可能に連結されている保持物容器１を備えている。

以下の詳細な記載、実施例、および図面から、本開示の他の特徴および利点が明らかとなる。しかしながら、この発明を実施するための形態より本発明の趣旨および範囲内での様々な変更および修正が当業者に明らかとなるので、この発明を実施するための形態および具体的な実施例は本発明の好ましい実施形態を示す一方で、単に例示として提示されていることを理解するべきである。

本発明に関する主題は、本明細書の結論部分に特定的に指摘され、かつ明瞭に主張されている。しかしながら、本発明の構成および運用方法の両方については、その目的、特徴、および利点と共に、添付図面と共に読んだとき、以下の発明を実施するための形態を参照することによって最も良好に理解され得る。

図１Ａおよび１ＢはＬｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（ＡＤＸＳ１１−００１）は異なる発現系を使用してＥ７を発現および分泌する。Ｌｍ−Ｅ７は、Ｌ．モノサイトゲネスゲノムのｏｒｆＺドメインの中へと遺伝子カセットを導入することによって生成された（図１Ａ）。ｈｌｙプロモーターはｈｌｙシグナル配列、およびＨＰＶ−１６Ｅ７が後に続くＬＬＯの最初の５つのアミノ酸（ＡＡ）の発現を引き起こす。（図１Ｂ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を、ｐｒｆＡ−株ＸＦＬ−７をプラスミドｐＧＧ−５５で形質転換することによって生成した。ｐＧＧ−５５は、ＬＬＯ−Ｅ７の非溶血性の融合の発現を駆動するｈｌｙプロモーターを有する。ｐＧＧ−５５は、ｐｒｆＡ遺伝子も含有し、インビボでＸＦＬ−７によってプラスミドの保持を選択する。Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７はＥ７を分泌する。Ｌｍ−Ｇａｇ（レーン１）、Ｌｍ−Ｅ７（レーン２）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（レーン３）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（レーン４）、ＸＦＬ−７（レーン５）、および１０４０３Ｓ（レーン６）をルリア−ベルターニ培地中、３７℃で一晩増殖させた。６００ｎｍのＯＤ吸光度によって決定される同等数の細菌をペレット化し、そして各上清１８ｍＬをＴＣＡ沈殿した。Ｅ７発現をウエスタンブロットによって分析した。ブロットを抗Ｅ７ｍＡｂで調査し、それに続いてＨＲＰ結合抗マウス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で調査し、次いでＥＣＬ検出試薬を使用して発色させた。ＬＬＯ−Ｅ７融合体の腫瘍免疫療法有効性腫瘍接種の７日、１４日、２１日、２８日、および５６日後におけるマウス内の腫瘍サイズがミリメートルで示されている。未感作マウス：白丸、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７：黒丸、Ｌｍ−Ｅ７：正方形、Ｌｍ−Ｇａｇ：白ひし形、そしてＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ：黒三角。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７−免疫されたマウスに由来する脾細胞はＴＣ−１細胞に曝露されると増殖する。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７株、Ｌｍ−Ｅ７株、または対照ｒＬｍ株を用いてＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫および追加免疫した。追加免疫の６日後に脾細胞を採取し、そして放射線照射したＴＣ−１細胞と共に表示されている比で培養皿に蒔いた。細胞を^３Ｈチミジンでパルスラベルし、採取した。ｃｐｍは、（実験的ｃｐｍ）−（非ＴＣ−１対照）と定義される。（図５Ａ）Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７がＥ７を分泌することを実証するウエスタンブロット。レーン１：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、レーン２：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７．００１、レーン３：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−２．５．３、レーン４：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−２．５．４。（図５Ｂ）Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（長方形）、Ｌｍ−Ｅ７（楕円）、およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（×）を投与したマウス、ならびに無処置マウス（非ワクチン接種、黒三角形）内の腫瘍サイズ。（図６Ａ）４つのＬＭワクチンを作り出すために使用されるプラスミドインサートの概略表示。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７インサートは、使用されるすべてのリステリア遺伝子を含有する。これはｈｌｙプロモーター、ｈｌｙ遺伝子の最初の１．３ｋｂ（タンパク質ＬＬＯをコードする）、およびＨＰＶ−１６Ｅ７遺伝子を含有する。ｈｌｙの最初の１．３ｋｂはシグナル配列（ｓｓ）およびＰＥＳＴ領域を含む。Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７はｈｌｙプロモーター、シグナル配列、ならびにＰＥＳＴ配列およびＥ７配列を含むが、短縮型ＬＬＯ遺伝子の残りの部分を除外する。Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７はＰＥＳＴ領域を除外するが、ｈｌｙプロモーター、シグナル配列、Ｅ７、および短縮型ＬＬＯの残りの部分を含有する。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉはｈｌｙプロモーター、シグナル配列、およびＥ７のみを有する。（図６Ｂ）上のパネル：リステリア構築体は、腫瘍退行を誘発するＰＥＳＴ領域を含有する。下のパネル：２つの別個の実験での腫瘍移植後２８日目における平均腫瘍サイズ。（図６Ｃ）脾臓内にＥ７特異的なリンパ球のより高いパーセンテージを誘発するＰＥＳＴ領域を含有するリステリア構築体。３回の実験からのデータの平均およびＳＥが図示されている。（図７Ａ）ＴＣ−１腫瘍細胞を投与し、これに続いてＬｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、もしくはＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７を投与した、またはワクチンを投与しなかった（無処置）マウスでの、脾臓内でのＥ７特異的なＩＦＮ−ガンマ−分泌ＣＤ８^＋Ｔ細胞の誘導、および腫瘍に浸透する数。（図７Ｂ）図７Ａに記述したマウスの脾臓および腫瘍でのＥ７特異的ＣＤ８^＋細胞の誘導および浸透。図８Ａおよび図８Ｂは腫瘍の中のＥ７特異的リンパ球のより高いパーセンテージを誘発するＰＥＳＴ領域を含有するリステリア構築体。（図８Ａ）１つの実験からの代表的データ。（図８Ｂ）３つのすべての実験からのデータの平均およびＳＥ。実施例６で提示された臨床試験で患者に観察された有効性を示すコホート１およびコホート２からのデータ。（図１０Ａ）ｋｌｋ３統合およびＡｃｔＡ欠失の後でのＬｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の染色体領域の概略図を示す。（図１０Ｂ）ｋｌｋ３遺伝子がＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ染色体に統合されている。ｋｌｋ３特異的プライマーを使用した、それぞれのコンストラクトからの染色体ＤＮＡ調製物からのＰＣＲにより、野生型タンパク質の分泌シグナル配列を欠失しているｋｌｋ３遺伝子に対応する７１４ｂｐのバンドが増幅される。（図１１Ａ）ｐＡＤＶ１３４プラスミドのマップである。（図１１Ｂ）ＬｍｄｄＡ−１３４培養上清からのタンパク質を沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＬＬＯ−Ｅ７タンパク質が抗Ｅ７モノクローナル抗体を使用したウエスタンブロットにより検出された。抗原発現カセットは、ｈｌｙプロモーター、短縮型ＬＬＯのためのＯＲＦおよびヒトＰＳＡ遺伝子（ｋｌｋ３）からなる。（図１１Ｃ）ｐＡＤＶ１４２プラスミドのマップである。（図１１Ｄ）抗ＰＳＡおよび抗ＬＬＯ抗体を使用してＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現を示したウエスタンブロットである。（図１２Ａ）選択圧のある場合とない場合とで培養した場合の、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのインビトロでのプラスミド安定性を示す（Ｄ−アラニン）。株および培養条件が先に挙げられており、ＣＦＵ決定に使用されたプレートが後に挙げられている。（図１２Ｂ）インビボでのＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの除去、およびこの間の潜在的なプラスミド損失を評価したものである。細菌が静脈内注入され、示された時点で脾臓から単離された。ＣＦＵは、ＢＨＩプレートおよびＢＨＩ＋Ｄ−アラニンプレート上で決定された。（図１３Ａ）１０８のＣＦＵをＣ５７ＢＬ／６マウスに投与した後での、株ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの^インビボでの除去を示す。ＣＦＵの数は、ＢＨＩ／ｓｔｒプレート上でのプレーティングにより決定された。この方法での検出限界は１００ＣＦＵであった。（図１３Ｂ）１０４０３Ｓ、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡおよびＸＦＬ７菌株を用いたＪ７７４細胞の細胞感染アッセイ。（図１４Ａ）追加免疫投与後６日目における無処置およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスの脾細胞内のＰＳＡ四量体特異的な細胞を示す。（図１４Ｂ）無処置およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスの脾細胞内のＩＦＮ−γについての細胞内サイトカイン染色が、ＰＳＡペプチドで５ｈにわたり刺激された。異なるエフェクター／標的比での、カスパーゼをベースにしたアッセイ（図１４Ｃ）およびユーロピウムをベースにしたアッセイ（図１４Ｄ）を使用して、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ免疫化マウスおよび無処置マウスからのインビトロで刺激したエフェクターＴ細胞を含むＰＳＡペプチドでパルスしたＥＬ４細胞の特異的溶解である。ＰＳＡペプチドの存在下またはペプチドなし（図１４Ｅ）で、刺激後２４時間にわたり取得した、無処置および免疫化の脾細胞内のＩＦＮγスポット数。ＬｍｄｄＡ−１４２での免疫がＴｒａｍｐ−Ｃ１−ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）腫瘍の退行を誘導する。マウスは、未処置のまま（ｎ＝８）（図１５Ａ）または７日目、１４日目および２１日目にＬｍｄｄＡ−１４２（１×１０^８ＣＦＵ／マウス）（ｎ＝８）（図１５Ｂ）もしくはＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（ｎ＝８）（図１５Ｃ）で腹腔内で免疫化した。腫瘍のサイズが個別の各腫瘍について測定され、それらの値がミリメートル単位での平均直径として表されている。それぞれの線は個別のマウスを示す。（図１６Ａ）未処置マウスおよび^Ｌｍ対照株または^{ＬｍｄｄＡ}−ＬＬＯ−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ−１４２）のいずれかで免疫化したマウスの脾臓および浸潤性Ｔ−ＰＳＡ−２３腫瘍内のＰＳＡ−四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の分析を示す。（図１６Ｂ）未処置マウスおよび^Ｌｍ対照株または^{ＬｍｄｄＡ}−ＬＬＯ−ＰＳＡのいずれかで免疫化したマウスの脾臓および浸潤性Ｔ−ＰＳＡ−２３腫瘍内での、ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３＋として定義されたＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の分析。（図１７Ａ）ｋｌｋ３組込およびａｃｔＡ欠失の後でのＬｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３の染色体領域の概略図を示す。（図１７Ｂ）ｋｌｋ３遺伝子がＬｍｄｄおよびＬｍｄｄＡ染色体に組み込まれている。ｋｌｋ３特異的プライマーを使用した各コンストラクトからの染色体ＤＮＡ調製物からのＰＣＲにより、ｋｌｋ３遺伝子に対応する７６０ｂｐのバンドが増幅される。（図１８Ａ）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３がＬＬＯ−ＰＳＡタンパク質を分泌することを示す。細菌培養上清からのタンパク質を沈殿させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させ、抗ＬＬＯおよび抗ＰＳＡ抗体を使用してウエスタンブロットにより検出したＬＬＯおよびＬＬＯ−ＰＳＡタンパク質。（図１８Ｂ）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３により生成されたＬＬＯでは溶血活性が保持された。ヒツジ赤血球が細菌培養上清の段階希釈で培養され、溶血活性が５９０ｎｍでの吸光度により測定された。（図１８Ｃ）Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３がマクロファージ様のＪ７７４細胞内部で成長した。細菌と共にＪ７４４細胞を１時間にわたって培養し、続いてゲンタマイシン処理を行って細胞外の細菌を殺菌した。表示した時点で獲得したＪ７７４溶菌液の段階希釈物のプレーティングにより細胞内増殖を測定した。これらの実験でＬｍ１０４０３Ｓが対照として使用された。Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３でのマウスの免疫がＰＳＡ特異的な免疫応答を誘導する。１×１０^８ＣＦＵのＬｍｄｄ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４３、またはＬｍｄｄＡ−１４２を用いてＣ５７ＢＬ／６マウスを１週間間隔で２回免疫し、７日後に脾臓を採取した。モネンシンの存在下で脾細胞を１μＭのＰＳＡ_{６５−７４}ペプチドで５時間にわたり刺激した。ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ６２Ｌおよび細胞内ＩＦＮ−γについて細胞を染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒサイトメーター内で分析した。ＡＤＸＳ３１−１６４の構築。（図２０Ａ）ＬｍｄｄＡ株の染色体ｄａｌ−ｄａｔ欠失の補完のために、構造性リステリアｐ６０プロモーターの制御下で、バシラス・サブチリス（ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｄａｌ遺伝子を保有するｐＡｄｖ１６４のプラスミド地図。これは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕの３つの断片：ＥＣ１（ａａ４０−１７０）、ＥＣ２（ａａ３５９−５１８）およびＩＣＩ（ａａ６７９−８０８）の直接融合によって構造化された、短縮型ＬＬＯ_{（１−４４１）}のキメラ型ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子への融合も含有する。（図２０Ｂ）抗ＬＬＯ抗体でブロットされた、ＴＣＡ沈殿細胞培養上清のウエスタンブロット解析によって、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（Ｌｍ−ＬＬＯ−１３８）およびＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（ＡＤＸＳ３１−１６４）内で、ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌が検出された。約１０４ＫＤの差次的なバンドがｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２に対応する。内在性ＬＬＯは５８ＫＤのバンドとして検出される。リステリア対照はＣｈＨｅｒ２発現を欠いている。ＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性特性（図２１Ａ）ＮＴ−２細胞を刺激物として、及び３Ｔ３／ｎｅｕ細胞を標的物として使用し、免疫化マウス由来の脾細胞内でＨｅｒ２／ｎｅｕリステリアベースのワクチンにより惹起した細胞障害性Ｔ細胞応答を検証した。Ｌｍ対照は、無関連の抗原（ＨＰＶ１６−Ｅ７）を発現することを除いて全ての点で同一であるＬｍｄｄＡバックグラウンドに基づいた。（図２１Ｂ）免疫化ＦＶＢ／Ｎマウス由来の脾細胞によって細胞培養培地中へと分泌されたＩＦＮ−γは、マイトマイシンＣ処置されたＮＴ−２細胞を用いたインビトロ刺激の２４時間後、ＥＬＩＳＡによって測定された。（図２１Ｃ）タンパク質の異なる領域由来のペプチドを用いたインビトロインキュベーションに反応した、キメラワクチンで免疫化されたＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス由来の脾細胞によるＩＦＮ−γ分泌。図の凡例にリスト表示したように、組み換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質が正の対照として使用され、無関連ペプチドまたはペプチドを含まない群が負の対照を構成要素とした。７２時間のコインキュベーションの後に採取された細胞培養上清を使用するＥＬＩＳＡアッセイによって、ＩＦＮ−γ分泌が検出された。各データ点は３回のデータの平均値±標準誤差であった。＊Ｐ値＜０．００１。リステリア−ＣｈＨｅｒ２／ｎｅｕワクチンのための腫瘍防止研究Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスに各々組み換え型リステリア−ＣｈＨｅｒ２または対照リステリアワクチンを６回注射した。６週齢で免疫を開始し、２１週目まで３週ごとに免疫を継続した。腫瘍の外観を毎週観察し、腫瘍を有しないマウスのパーセンテージとしてそれを表現した。＊ｐ＜０．０５、グループ当たりＮ＝９。脾臓中のＴｒｅｇのパーセンテージに対するＡＤＸＳ３１−１６４を用いる免疫の効果を示す図である。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０^６ＮＴ−２細胞を用いて皮下で接種し、各々のワクチンを用いて一週間間隔で３回免疫化した。２回目の免疫の７日後に脾臓を採取した。免疫細胞の単離後、Ｔｒｅｇの検出のために抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、および抗ＦｏｘＰ３抗体によってこれらを染色した。代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロットは、異なる治療群の間での全ＣＤ３^＋細胞または全ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対するパーセンテージとして表されるＣＤ２５^＋／ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞の頻度を示す。ＮＴ−２腫瘍内の腫瘍浸潤Ｔｒｅｇのパーセンテージに対するＡＤＸＳ３１−１６４を用いる免疫の効果。ＦＶＢ／Ｎマウスに１×１０^６ＮＴ−２細胞を用いて皮下で接種し、各々のワクチンを用いて一週間間隔で３回免疫化した。２回目の免疫の７日後に腫瘍を採取した。免疫細胞の単離後、Ｔｒｅｇの検出のために抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、および抗ＦｏｘＰ３抗体によってこれらを染色した。（図２４Ａ）代表的な実験からのＴｒｅｇのドットプロット。（図２４Ｂ）異なる投与群の間での全ＣＤ３^＋Ｔ細胞またはＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対するパーセンテージとして表され（左のパネル）、且つ、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（右のパネル）として表される、ＣＤ２５^＋／ＦｏｘＰ３^＋Ｔ細胞の頻度を示す図である。データは２つの独立した実験から得られた平均値±ＳＥＭとして示される。ＡＤＸＳ３１−１６４を用いたワクチン接種は乳癌細胞株の脳内での増殖を遅延することができる。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＡＤＸＳ３１−１６４または対照リステリアワクチンを用いて３回免疫化した。麻酔をかけたマウスの頭蓋内にＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞（５，０００細胞）を注射した。（２５Ａ）指定日に、ＸｅｎｏｇｅｎＸ−１００ＣＣＤカメラを使用してマウスのエクスビボ撮像を遂行した。（図２５Ｂ）ピクセルの輝度は、１秒当たり表面積１平方ｃｍ当たりの光子数としてグラフ表示され、平均放射輝度として示される。（図２５Ｃ）抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体を使用して、ウエスタンブロットにより、ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞、４Ｔ１−Ｌｕｃ、およびＮＴ−２細胞株によるＨＥＲ２／ｎｅｕの発現が検出された。マウスのマクロファージ様細胞株のＪ７７４．Ａ２細胞を負の対照として使用した。図２６Ａ〜Ｃは、組み換え型リステリアタンパク質ミニ遺伝子コンストラクトの概略地図を表す。（図２６Ａ）オボアルブミン由来ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号７５）を産生するコンストラクトを表す。（図２６Ｂ）ＰＣＲクローニングによって、ＳＩＩＮＦＥＫＬの代わりにＧＢＭ派生ペプチドが導入された同等の組み換え型タンパク質を表す。（図２６Ｃ）は、リステリアの株から４つの別個のペプチド抗原を発現するように設計されたコンストラクトを表す。プラスミドｐＡｄｖ２１１、ｐＡｄｖ２２３及びｐＡｄｖ２２４を作製するためのプラスミド骨格ｐＡｄｖ１４２内の異なるＡｃｔＡＰＥＳＴ領域（図１１Ｃ参照）のクローニングを示す概略図が（図２７）に示される。この模式図は、異なるＡｃｔＡコード領域がＸｂａＩおよびＸｈｏＩで制限処理されて骨格プラスミドｐＡｄｖ１４２内にリステリオリジンＯシグナル配列とインフレームでクローニングされたことを示している。図２８Ａ〜Ｂ。（図２８Ａ）移植可能腫瘍モデルとしてＴＰＳＡ２３を使用した腫瘍退縮試験。８匹のマウスの３群に、１×１０^６個の腫瘍細胞を０日目に移植し、１０^８ＣＦＵの様々な治療剤：ＬｍｄｄＡ１４２、ＬｍｄｄＡ２１１、ＬｍｄｄＡ２２３、およびＬｍｄｄＡ２２４を用いて、６日目、１３日目、および２０日目に処置した。未感作マウスはどの処置も受けなかった。腫瘍を毎週モニターし、平均腫瘍径が１４〜１８ｍｍであった場合にマウスを殺処理した。グラフ中の各シンボルは個別のマウスの腫瘍サイズを表す実験を二回繰り返し、同様の結果を得た。（図２８Ｂ）実験の別々の日での、未感作マウスと免疫化マウスの生存率。図２９Ａ〜Ｂ。ＰＳＡ特異的免疫応答を、四量体染色（図２９Ａ）、及びＩＦＮ−γの細胞内サイトカイン染色（図２９Ｂ）により調査した。１０^８ＣＦＵのさまざまな療法剤：ＬｍｄｄＡ１４２（ＡＤＸＳ３１−１４２）、ＬｍｄｄＡ２１１、ＬｍｄｄＡ２２３、及びＬｍｄｄＡ２２４を用いて、マウスを１週間隔で３回免疫した。免疫アッセイのため、２回目の追加免疫後の６日目に脾臓を採取した。この実験のために群当たり２匹のマウスの脾臓をプールした。（Ａ）ＰＳＡエピトープ特異的四量体染色を用いて未感作マウス、ＬｍｄｄＡ１４２を免疫されたマウス、ＬｍｄｄＡ２１１を免疫されたマウス、ＬｍｄｄＡ２２３を免疫されたマウス、およびＬｍｄｄＡ２２４を免疫されたマウスの脾臓内のＰＳＡ特異的Ｔ細胞を検出した。細胞をマウス抗ＣＤ８（ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ３（Ｐｅｒｃｐ−Ｃｙ５．５）、抗ＣＤ６２Ｌ（ＡＰＣ）、およびＰＳＡ四量体−ＰＥで染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにより分析した。（図２９Ｂ）１μＭのＰＳＡ特異的Ｈ−２Ｄｂペプチド（ＨＣＩＲＮＫＳＶＩＬ）を用いた５時間の刺激後の未感作マウスと免疫化マウスにおける、ＩＦＮ−γ分泌性ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞のパーセンテージを検出するための細胞内サイトカイン染色。図３０Ａ〜Ｃ。腫瘍モデルであるＴＰＳＡ２３を使用して、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２（ＬＡ２２９）融合ＰＳＡ及びｔＬＬＯ融合ＰＳＡを使用することによる、Ｃ５７ＢＬ６マウスにおける免疫応答の発生を検討した。５匹のマウスの４群に、１×１０^６個の腫瘍細胞を０日目に移植し、１０^８ＣＦＵの様々な治療剤：ＬｍｄｄＡ２７４、ＬｍｄｄＡ１４２（ＡＤＸＳ３１−１４２）、及びＬｍｄｄＡ２１１を用いて、６日目と１４日目に処置した。未感作マウスはどの処置も受けなかった。最後の免疫後の６日目に各マウスから脾臓と腫瘍を採取した。（図３０Ａ）表は、免疫後１３日目の腫瘍体積を示している。五量体染色によって、脾臓（図３０Ｂ）および腫瘍（図３０Ｃ）におけるＰＳＡ特異的免疫応答を調査した。免疫アッセイのために群当たり２匹のマウスまたは群当たり３匹のマウスの脾臓をプールし、群あたり５匹のマウスの腫瘍をプールした。細胞をマウス抗ＣＤ８（ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ３（Ｐｅｒｃｐ−Ｃｙ５．５）、抗ＣＤ６２Ｌ（ＡＰＣ）、およびＰＳＡ五量体−ＰＥで染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒにより分析した。図３１Ａ〜３１Ｃ。ＳＯＥ突然変異形成戦略。ＬＬＯの第４ドメインに突然変異を形成することによってＬＬＯの病原性の減少／低下が達成された。（図３１Ａ〜３１Ｂ）。このドメインは、それがオリゴマー形成して孔を形成する場所である膜に結合できるようにするコレステロール結合部位を含有する。図３１Ｃは、全長型ＬＬＯ（ｒＬＬＯ５２９）の断片を示している。組換え型ＬＬＯであるｒＬＬＯ４９３は、アミノ酸１〜４９３（シグナル配列を含む）にわたるＬＬＯのＮ末端断片を表す。組換え型ＬＬＯであるｒＬＬＯ４８２は、アミノ酸１〜４８２（シグナル配列を含む）にわたるＮ末端ＬＬＯ断片（アミノ酸４８３〜４９３のコレステロール結合ドメインの欠失を含む）を表す。組換え型ＬＬＯであるｒＬＬＯ４１５は、アミノ酸１〜４１５（シグナル配列を含む）にわたるＮ末端ＬＬＯ断片（アミノ酸４８３〜４９３のコレステロール結合ドメインの欠失を含む）を表す。組換え型ＬＬＯであるｒＬＬＯ５９−４１５は、アミノ酸５９〜４１５にわたるＮ末端ＬＬＯ断片（コレステロール結合ドメインを含まない）を表す。組換え型ＬＬＯであるｒＬＬＯ４１６−５２９はアミノ酸４１６〜５２９にわたり、且つ、コレステロール結合ドメインを含むＮ末端ＬＬＯ断片を表す。同上。図３２Ａ及び３２Ｂクマシー染色による突然変異型ＬＬＯタンパク質の発現は、図３２Ａに示されており、ウエスタンブロットによるものは、図３２Ｂに示されている。図３３Ａ及び３３Ｂ。ヒストグラムは、突然変異型ＬＬＯ（ｍｕｔＬＬＯ及びｃｔＬＬＯ）タンパク質の、ｐＨ５．５（図３３Ａ）、及びｐＨ７．４（図３３Ｂ）での溶血活性を示すデータを示している。図３４ＰＡＫ６をｔＬＬＯとの融合タンパク質として発現するＰＡＫ６コンストラクト（７６０５ｂｐ）のプラスミドマップを示す図である。ＰＡＫ６のプラスミドの模式的マップ。そのプラスミドはリステリアの複製起点（ＲｅｐＲ）と大腸菌の複製起点（ｐ１５）の両方を含有する。黒の矢印は転写方向を表す。枯草菌ｄａｌ遺伝子はＤ−アラニン合成を相補する。抗原発現カセットはｈｌｙプロモーター、短縮型ＬＬＯのＯＲＦ、およびヒトＰＡＫ６遺伝子からなる。図３５配列番号７８で表されるＰＡＫ６の核酸配列。図３６配列番号７９で表されるＰＡＫ６のアミノ酸配列。図３７Ａ腫瘍のシーケンシング、及びＤＮＡ生成のワークストリームの概略。図３７ＢＤＮＡクローニング、及び免疫療法剤製造のワークストリームの概略。図３８個別免疫療法組成物の並行製造のための完全閉鎖型単回使用細胞培養システムのクラスターの図である。図３９完全閉鎖型単回使用細胞培養システムの接種部分と発酵部分の詳細図である。図４０完全閉鎖型単回使用細胞培養システムの濃縮部分の詳細図である。図４１完全閉鎖型単回使用細胞培養システムの透析濾過部分の詳細図である。図４２完全閉鎖型単回使用細胞培養システムの製品分配部分の詳細図である。図４３Ａ免疫療法の効率を改善するためにネオエピトープの段階選択を用いる過程の図である。図４３Ｂ複数のネオエピトープの並行選択を用いる過程の図である。図４４発酵培地調製プロセスを示す。図４５１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液調製プロセスを示す。図４５洗浄緩衝液調製プロセスを示す。図４６プロセスの流れ：接種バッグ（複数含む）の製造図４７本明細書に開示されるリステリアコンストラクトの発酵を行うためのプロセスを示す。図４８接線流ろ過及び注入を設定ならびに実行するためのプロセスを示す。図４９本明細書に開示されるリステリアコンストラクトの完全製造プロセスを示す。図５０製造システムを使用して免疫療法組成物を作製するためのプロセスを示す。図５１Ａ〜Ｃ本明細書に検討される一部の実施形態に従う、接線流ろ過（ＴＦＦ）マニホールドを示す。図５１Ａは、ＴＦＦマニホールドを示し、図５１Ｂは、ＴＦＦマニホールドの数か所の描写を示す。図５１Ｃは、本明細書に検討される一部の実施形態に従う、他のＴＦＦマニホールドを示す。同上。同上。図５２ＴＦＦマニホールドに接続され得る、注入マニホールドの例を示す。図５３１つ以上のバッグに最終産物を集めるために使用される注入マニホールドを示す。図５４図５１Ａ〜図５３のラベルに対する説明を示す。図５５レイノルド数、ポンプ流速、ファイバー数、速度、動粘性率、フロー／ファイバー、単位長、内部直径、ファイバー体積、及び移動時間、いくつかの実施例形態に特徴的な長さを比較する表を示す。

図示の単純化および明瞭化のために図に示される要素は必ずしも実寸に比例していないことを理解されたい。例えば、一部の要素の寸法は、明瞭化のために他の要素に対して相対的に誇張されている場合がある。さらに、適切と考えられる場合には、参照番号は対応するかまたは類似する要素を示す図の間で繰り返される場合がある。

以下の発明を実施するための形態では、本発明の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示される。しかしながら、本開示はこれらの具体的な詳細を含まずに実施されうることが当業者には理解されるであろう。他の事例では、本開示を不明瞭にしないために周知の方法、手順、および構成成分は詳細には記述されていない。

完全閉鎖単回使用細胞増殖システム、及び製造方法
１つの態様において、疾患または症状を有する対象に投与するための個別化免疫療法組成物を製造する方法が開示され、前述の個別化免疫療法組成物は、組換え型弱毒化リステリア株を含有し、前述のリステリア株は、１つ以上のネオエピトープを含有する１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを備えた核酸配列を含有し、前述の方法は、以下を含む：
疾患または症状を有する対象由来の病変サンプルにおいて、１つ以上のネオエピトープを含有する１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を取得及び特定する工程。

別の実施形態において、前述の完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムは、接種セクション、発酵セクション、濃縮セクション／透析ろ過（図５１Ａ〜Ｂ）セクション、及び製品分注セクションを備えている。

別の実施形態において、前述の完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムは、統合完全閉鎖型流体経路を備えている。

さらなる実施形態において、完全閉鎖系単回使用細胞増殖システムが本明細書に開示され、前述のシステムは１つ以上の単回使用攪拌型バイオリアクターをさらに備えている。

別の実施形態において、前述の完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムの製品分注セクションは、対象への即時投与に使用することができる、またはあるいはその後の輸送及び保管のために凍結されることができる、単回投与サイズの製品容器を備えている。

追加の実施形態において、一人対象規模の完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムが開示される。別の実施形態において、本明細書に開示される方法によって、同一の対象用の、または別個の対象用の、複数の個別化免疫療法組成物を並行製造するための、いくつかの完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムの同時使用が可能となる。

別の実施形態において、前述の疾患または症状は、感染性疾患、または腫瘍もしくは癌を含む。

１つの実施形態において、完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムを使用した、個別化免疫療法組成物の拡張可能で効率的な製造方法が本明細書に開示される（図５０を参照）。

１つの実施形態において、前述の方法は、疾患または症状を有する対象由来の病変サンプルにおいて、１つ以上のネオエピトープを含有する１つ以上のペプチドをコードする前述の核酸配列を特定すること；前述の１つ以上のネオエピトープを含有する前述の１つ以上のペプチドをコードする前述の核酸配列を備えた発現ベクターを、弱毒化リステリア株にトランスフェクトすること；前述の１つ以上のネオエピトープを含有する前述の１つ以上のペプチドを発現するリステリアクローンを取得すること；所定の規模まで前述のリステリアクローンを増殖させること；前述の増殖されたリステリアクローンを精製すること；増殖培地を製剤緩衝液と置き換えること；前述のリステリアクローンを集菌すること；前述の集菌されたリステリアクローンを、所定の濃度を有する溶液に希釈すること；及び前述の集菌リステリアクローン溶液を、その後の保管または対象への投与のために、単回投与容器へと分注すること、を含む。別の実施形態において、増殖、精製、増殖培地の置換、集菌、希釈、及び分注の工程は、本明細書に開示される完全閉鎖型単回使用細胞増殖システム／ディスポーザブル製造システムにおいて実施される。別の実施形態において、前述の完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムは、統合完全閉鎖型流体経路を備えている。

１つの実施形態において、開示されるディスポーザブル製造システムは、製造方法が完了した時点で廃棄される、製品容器以外の前述の統合完全閉鎖型流体経路の構成要素を備えている。

本開示に従う製造システムは、以下のセクションを備えている；接種セクション、発酵セクション、濃縮／透析ろ過セクション（図５１Ａ〜Ｂを参照）、及び／または製品分注システム。それらすべてが、本明細書に開示されるリステリア株の製造方法において使用される。

１つの実施形態において、製造方法は、図５０に示されるように実施される。１つの実施形態において、製造方法の開始段階で、培地／緩衝液が調製され、リステリアコンストラクトを含有するコロニーがプレートから採取され、所定量の発酵培地（インキュベーションに適した容器中にある）に接種され、第一のプレカルチャー（Ｐｒｅ−Ｃｕｌｔｕｒｅ）（ＰＣ１）が形成される。ＰＣ１のインキュベーション後、標的量のＰＣ１を取得し、より多くの所定量の発酵培地（インキュベーションに適した容器中にある）に接種することにより、培養がスケールアップされ、第二のプレカルチャー（ＰＣ２）が形成される。別の実施形態において、所定量は、１０ｍｌ〜３００ｍｌの範囲であってもよい。別の実施形態において、ＰＣ１の所定量は、１０ｍｌである。別の実施形態において、ＰＣ２の所定量は、１９０ｍｌである。別の実施形態において、培養物（ＰＣ１、ＰＣ２）は一晩インキュベートされ、または細菌、特にリステリア種の増殖／インキュベートに適していると当分野において高知である条件でインキュベートされる。

別の実施形態において、ＰＣ２のインキュベーション後、所定量のＰＣ２が、１つ以上の接種バッグへと注入される。別の実施形態において、ＰＣ２のインキュベーション後、所定量のＰＣ２が、４つの接種バッグへと注入される。別の実施形態において、各接種バッグは、２５０ｍｌまで入れることができる。別の実施形態において、各接種バッグは、１Ｌまで入れることができる。別の実施形態において、各接種バッグは、５Ｌまで入れることができる。別の実施形態において、各接種バッグは、２５ｍｌのＰＣ２で満たされ、及び発酵培地で最大１００ｍｌまで満たされる。別の実施形態において、各接種バッグは、１〜１０ｍｌのＰＣ２で満たされ、及び発酵培地で最大５０〜２５０ｍｌまで満たされる。別の実施形態において、各接種バッグは、１〜２０ｍｌのＰＣ２で満たされ、及び発酵培地で最大５０〜２５０ｍｌまで満たされる。別の実施形態において、各接種バッグは、１〜４０ｍｌのＰＣ２で満たされ、及び発酵培地で最大１００〜５００ｍｌまで満たされる。別の実施形態において、各接種バッグは、１〜５０ｍｌのＰＣ２で満たされ、及び発酵培地で最大１００〜５００ｍｌまで満たされる。別の実施形態において、各接種バッグは、１〜１００ｍｌのＰＣ２で満たされ、及び発酵培地で最大１５０〜５００ｍｌまで満たされる。別の実施形態において、各接種バッグは、例えば接種バッグなどのより大きな体積の容器中での増殖または規模拡張に適した、所望される量のＰＣ２が注入される。別の実施形態において、各接種バッグは、所定のより多量の発酵培地を有する、より大きな体積の容器中での増殖または規模拡張に適した、所望される量のＰＣ２で満たされる。

１つの実施形態において、増殖したリステリアクローンを含有する接種バッグは、その１つの実施形態において本明細書では「医薬品」または「製品」と呼称され、その後の使用のために、−７０℃〜−８０℃で凍結され得る。

別の実施形態において、ＰＣ２のインキュベーション後、発酵プロセス開始のために、所定量のＰＣ２が、細胞バッグバイオリアクターへと注入される（図５０）。別の実施形態において、発酵プロセスは、製造システムの発酵セクションにおいて実施される。別の実施形態において、発酵セクションは、細胞バッグバイオリアクターを備えている。

別の実施形態において、本明細書に開示される製造システムのすべてのセクションまたは構成要素は機能可能に連結され、接種セクションからの単一完全閉鎖型液体流路を生成し、発酵、濃縮セクション、透析ろ過、及び製品注入を可能としてもよい。別の実施形態において、製造システムは、流体流れに、濃縮及び透析ろ過セクションを含有する保持物バッグをバイパスさせる、追加のコネクターを備えている。別の実施形態において、製造システムは、濃縮及び透析ろ過セクションから、接種または発酵セクションへと導く、戻り流体接続をさらに備えており、それによって、増殖培養物が再循環し、さらなる増殖が可能となる。

１つの実施形態において、前述の流体接続は、流体管を備えている。適切な管は、柔軟性のある、もしくは柔軟性のない金属の管、または柔軟性のある、もしくは柔軟性のない非金属の管を包含し得ることが、当業者には明らかである。前述の金属の管は、スチール、銅、真鍮、または当分野に公知の任意の適切な金属から作製され得る。前述の非金属の管は、ゴム、プラスチック、または当分野に公知の任意の他の無機もしくは有機のポリマーから作製され得る。別の実施形態において、流体管は、柔軟性のある非金属の管である。別の実施形態において、流体管は、ＰＶＣ管、またはＰＩＶ管の系統である。

本開示によると、本発明の様々なセクションを接続する流体管は、ともに密封され、それによって、完全閉鎖型流体流路が形成される。管は、滅菌溶接、管類コネクター、または１つの実施形態においては、ディスポーザブルの無菌コネクターを使用して密封されてもよい。別の実施形態において、ディスポーザブルの無菌コネクターは、非無菌環境下で、ドライ‐ドライ接続を生じさせ得る。別の実施形態において、ディスポーザブルの無菌コネクターを使用することにより、滅菌溶接の使用が大幅に減り、さらには他の処理工程（すなわち、バイアルへの注入）も排除される。別の実施形態では、管は、当分野に公知の任意の方法を使用して密封される。

１つの実施形態において、本明細書に開示される製造システムの各流体接続上で、流体流れを遮断する手段もまた開示される。１つの実施形態において、流体流れを遮断する手段は、ディスポーザブルのバルブである。別の実施形態において、流体流れを遮断する手段は、クランプである。前述のクランプは、ローラークランプ、ピンチクランプ、または当分野に公知の任意のクランプであってもよい。別の実施形態において、流体流れを遮断する手段は、当分野に公知の任意のかかる手段である。

本開示はさらに、製造システムの様々なセクション間の流体移送を提供する。流体移送は、１つの実施形態において、自然な重力流により駆動されてもよい。別の実施形態において、流体移送は、例えばポンプなどの機械的な手段により駆動されてもよい。当分野において適切なポンプは良く知られており、限定されないが、遠心力ポンプ、エアーポンプ、及びピストンポンプが挙げられる。１つの実施形態において、完全閉鎖型細胞増殖システム内の流体は、蠕動ポンプにより駆動される。

本明細書の開示によると、本明細書に開示される製造方法中の１つ以上の工程が、一定の所定温度で行われる。別の実施形態において、本明細書に開示される製造方法のすべての工程が、一定の所定温度で行われる。別の実施形態において、製造方法の接種工程及び増殖工程が、一定の所定温度で行われる。１つの実施形態において、温度は、約３７℃で維持される。別の実施形態において、温度は、約３７℃である。別の実施形態において、温度は、約２５℃である。別の実施形態において、温度は、約２７℃である。別の実施形態において、温度は、約２８℃である。別の実施形態において、温度は、約３０℃である。別の実施形態において、温度は、約３２℃である。別の実施形態において、温度は、約３４℃である。別の実施形態において、温度は、約３５℃である。別の実施形態において、温度は、約３６℃である。別の実施形態において、温度は、約３８℃である。別の実施形態において、温度は、約３９℃である。

本明細書に開示される方法及び組成物の１つの実施形態において、完全閉鎖型細胞増殖システムの接種セクションは、前述の完全閉鎖型細胞増殖システムの発酵セクションに機能可能に接続された接種容器を備えている。１つの実施形態において、前述の接種容器は、プラスチックフラスコである。別の実施形態において、前述の接種容器は、プラスチックバイアルである。別の実施形態において、前述の接種容器は、プラスチックアンプルである。別の実施形態において、前述の接種容器は、流体バッグである。別の実施形態において、前述の接種容器は、接種ポートをさらに備えている。

１つの実施形態において、前述の接種容器は、約５ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、前述の接種容器は、約１０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、前述の接種容器は、約１５ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、前述の接種容器は、約２０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、前述の接種容器は、約２５ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、前述の接種容器は、約３０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、前述の接種容器は、約３５ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、前述の接種容器は、約４０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、前述の接種容器は、約４５ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、前述の接種容器は、約５０ｍｌの最大体積を有している。

本明細書に開示される方法及び組成物の１つの実施形態において、接種容器は、組み換え型弱毒化リステリア株の培養物で満たされ、前述のリステリア株は、１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを備えた核酸配列を含む。１つの実施形態において、リステリア株は、栄養培地中に再懸濁される。別の実施形態において、リステリア株は、製剤緩衝液中に再懸濁される。さらに別の実施形態において、リステリア株は、凍結保管溶液中に再懸濁される。

１つの実施形態において、接種容器中の栄養培地は、細菌培養の増殖に使用されるものと同じ培地である。別の実施形態において、接種容器中の栄養培地は、細菌培養の増殖に使用されるものとは異なる培地である。

１つの実施形態において、本明細書に開示される方法及び組成物は、接種容器を除く、完全閉鎖型細胞増殖システムのすべてのセクションの滅菌を提供する。医薬品製造機器の適切な滅菌方法は、蒸気滅菌、乾熱滅菌、及びガス滅菌を包含し得ることが、当業者により認識されるであろう。１つの実施形態において、完全閉鎖型増殖システムは、電離放射線への暴露を介して滅菌される。

１つの実施形態において、本明細書に開示される方法及び組成物は、免疫療法組成物の製造プロセスを開始させるための、完全閉鎖型細胞増殖システムの発酵セクションへの接種容器の内容物の移送を提供する。別の実施形態において、接種セグメント及び発酵セグメントの両方が、移送前に所定の一定温度にまで加温される。

本明細書に開示される方法及び組成物の１つの実施形態において、前述の完全閉鎖型細胞増殖システムの発酵セクションは、１つ以上の攪拌型バイオリアクターを備えている。１つの実施形態において、１つ以上の攪拌型バイオリアクターは、ウェーブ混合型バイオリアクター（ｗａｖｅｍｉｘｅｄｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）である。別の実施形態において、１つ以上の攪拌型バイオリアクターは、攪拌型タンクバイオリアクター（ｓｔｉｒｒｅｄｔａｎｋｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）である。別の実施形態において、１つ以上の攪拌型バイオリアクターは、機械的振とうバイオリアクター（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｙｓｈａｋｅｎｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）である。別の実施形態において、１つ以上の攪拌型バイオリアクターは、当分野に公知の任意の型のバイオリアクターである。別の実施形態において、前述の１つ以上の攪拌型バイオリアクターは、ロッカー攪拌型バイオリアクター（ｒｏｃｋｅｒ−ａｇｉｔａｔｅｄｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）である。別の実施形態において、前述の１つ以上の攪拌型バイオリアクターは、ロッカーバッグ微生物増殖システム（ｒｏｃｋｅｒｂａｇｍｉｃｒｏｂｉａｌｇｒｏｗｔｈｓｙｓｔｅｍ）である。

本明細書に開示される方法及び組成物の１つの実施形態において、本明細書に開示される１つ以上のバイオリアクターの各々は、接種セグメント、及び濃縮／透析ろ過セクション、及び／または製品分注セクションに機能可能に接続された１つ以上発酵容器をさらに備えている。別の実施形態において、前述の１つ以上の発酵容器は、プラスチック容器である。別の実施形態において、前述の１つ以上の発酵容器は、組織培養バッグである。

１つの実施形態において、本明細書に開示される発酵容器は、約１００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、発酵容器は、約１５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、発酵容器は、２００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、発酵容器は、２５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、発酵容器は、３００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、発酵容器は、３５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、発酵容器は、約４００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、発酵容器は、約４５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、発酵容器は、約５００ｍｌの最大体積を有している。

１つの実施形態において、各バイオリアクターは、１つ以上の発酵容器を備えている。１つの実施形態において、各バイオリアクターは、１つ以上の発酵容器を備えている。別の実施形態において、各バイオリアクターは、少なくとも２つの発酵容器を備えている。別の実施形態において、各バイオリアクターは、少なくとも３つの発酵容器を備えている。別の実施形態において、各バイオリアクターは、少なくとも４つの発酵容器を備えている。別の実施形態において、各バイオリアクターは、５個以上の発酵容器を備えている。

１つの実施形態において、発酵容器の各々は、１つ以上のサンプラーポートをさらに備えており、当該サンプラーポートは、サンプリング容器と、発酵容器への流体管を備えており、当該サンプリング容器は、サンプリングルアーを備えており、当該流体管は、影響的に当該管を密封する手段を備えており、それによって、発酵容器からサンプリング容器を単離させている。

１つの実施形態において、サンプリング容器の各々は、約０．１ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、サンプリング容器の各々は、約０．２ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、サンプリング容器の各々は、約０．３ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、サンプリング容器の各々は、約０．４ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、サンプリング容器の各々は、約０．５ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、サンプリング容器の各々は、約０．６ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、サンプリング容器の各々は、約０．７ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、サンプリング容器の各々は、約０．８ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、サンプリング容器の各々は、約０．９ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、サンプリング容器の各々は、約１ｍｌの最大体積を有している。

１つの実施形態において、発酵容器の各々は、１個のサンプリングポートを備えている。別の実施形態において、発酵容器の各々は、２個以上のサンプリングポートを備えている。別の実施形態において、発酵容器の各々は、少なくとも２個のサンプリングポートを備えている。別の実施形態において、発酵容器の各々は、少なくとも３個のサンプリングポートを備えている。別の実施形態において、発酵容器の各々は、少なくとも４個のサンプリングポートを備えている。別の実施形態において、発酵容器の各々は、５個以上のサンプリングポートを備えている。別の実施形態において、すべてのサンプリングポートは、単回使用ポートである。

サンプリングポートは、クオリティ検査及び純度に関するサンプル収集のために、サンプリングバッグマニホールド（図５２を参照）に機能可能に接続されていてもよい。１つの実施形態において、サンプルは、外観、生細胞数（ＶＣＣ：ｖｉａｂｌｅｃｅｌｌｃｏｕｎｔ）、リステリア株中のａｃｔＡ遺伝子の非存在（ＰＣＲ、タンパク質に関してはウェスタンブロッティングなどを介する）、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドタグ（抗原提示を検証するため）の存在を測定するため、ならびにコロニーＰＣＲ及びモノセプシス（ｍｏｎｏｓｅｐｓｉｓ）（純度）解析を行うために収集される。

別の実施形態において、サンプルは、断続的に収集される。別の実施形態において、サンプルは、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、または６０分ごとに収集される。別の実施形態において、サンプルは、２時間ごと、３時間ごと、４時間ごと、または５時間ごとに収集される。別の実施形態において、サンプルは、サンプリングの１〜６０分ごとに収集される。別の実施形態において、サンプルは、サンプリングの１〜１０時間ごとに収集される。別の実施形態において、サンプルは、上述の実施形態のいずれか１つに記載されるように断続的に、及び最終光学密度（ＯＤ：ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ）に達するまで収集される。

別の実施形態において、サンプリングバッグは、５〜１００ｍｌ、１０１〜２００ｍｌ、２０１〜３００ｍｌ、４０１〜５００ｍｌ、または５０１〜１０００ｍｌの範囲の体積を有している。別の実施形態において、サンプリングバッグは、２５ｍｌの体積を有する。別の実施形態において、サンプリングバッグは、１００ｍｌの体積を有する。

別の実施形態において、発酵容器は、栄養培地で満たされ、接種セグメントから接種物を移送する前に、所定の温度まで従前に加温される。別の実施形態において、リステリア株の培養物の増殖に利用される栄養培地は、ＬｙｓｏｇｅｎｙＢｒｏｔｈ（ＬＢ）培地である。別の実施形態において、栄養培地は、ＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ（ＴＢ）培地である。別の実施形態において、栄養培地は、トリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ：ｔｒｙｐｔｉｃｓｏｙｂｒｏｔｈ）培地である。別の実施形態において、栄養培地は、規定の培地である。別の実施形態において、栄養培地は、本明細書に開示される規定の培地である。別の実施形態では、栄養培地は当分野で公知の任意の他のタイプの栄養培地である。

別の実施形態において、培養物の増殖の間、一定のｐＨが維持される。別の実施形態において、ｐＨは、約７．０で維持される。別の実施形態において、ｐＨは、約６である。別の実施形態において、ｐＨは、約６．５である。別の実施形態において、ｐＨは、約７．５である。別の実施形態において、ｐＨは、約８である。別の実施形態において、ｐＨは、約６．５〜７．５である。別の実施形態において、ｐＨは、約６〜８である。別の実施形態において、ｐＨは、約６〜７である。別の実施形態において、ｐＨは、約７〜８である。

本明細書に開示される方法及び組成物の１つの実施形態において、組み換え型弱毒化リステリア株の培養物は、ＯＤ_６００が、所定の値に達するまで増殖される。１つの実施形態において、ＯＤ６００は、約０．７単位である。別の実施形態において、培養物は、０．８単位のＯＤ_６００を有する。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約０．７単位である。別の実施形態において、ＯＤ_６００は、約０．８単位である。別の実施形態において、ＯＤ６０は、約０．６単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約０．６５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約０．７５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約０．８５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約０．９単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約１単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約０．６〜０．９単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約０．６５〜０．９単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約０．７〜０．９単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約０．７５〜０．９単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約０．８〜０．９単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約０．７５〜１単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約０．９〜１単位である。別の実施形態において、ＯＤ_６００は、１単位よりも大きい。

別の実施形態において、ＯＤ_６００は、１単位よりも有意に大きい。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約７．５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約１．２単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約１．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約２単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約２．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約３単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約３．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約４単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約４．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約５．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約６単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約６．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約７単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約８単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約９単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約９．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約１０単位である。別の実施形態において、ＯＤ_６００は、１０単位よりも大きい。

別の実施形態において、ＯＤ６００は、約１〜２単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約１．５〜２．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約２〜３単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約２．５〜３．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約３〜４単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約３．５〜４．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約４〜５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約４．５〜５．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約５〜６単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約５．５〜６．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約１〜３単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約１．５〜３．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約２〜４単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約２．５〜４．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約３〜５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約４〜６単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約５〜７単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約２〜５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約３〜６単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約４〜７単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約５〜８単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約１．２〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約１．５〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約２〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約２．５〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約３〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約３．５〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約４〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約４．５〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約５〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約５．５〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約６〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約６．５〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約７〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、およそ１０単位よりも大きい。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約１．２〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約１．５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約２〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約２．５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約３〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約３．５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約４〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約４．５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約５．５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約６〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約６．５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約７〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約７．５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約８〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は、約９．５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ_６００は、１０単位である。

別の実施形態において、組み換え型弱毒化リステリア株の培養物は、培養物のバイオマスが、所定の値に達するまで増殖される。１つの実施形態において、バイオマスは、約１ｘ１０^９コロニー形成単位（ＣＦＵ：ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔｓ）／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約１．５ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約１．５ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約２ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約３ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約４ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約５ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約７ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約９ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約１０ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約１２ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約１５ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約２０ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約２５ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約３０ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約３３ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約４０ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約５０ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、５０ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌよりも大きい。

接線流ろ過マニホールド
組み換え型弱毒化リステリア培養物が、所定のＯＤ_６００またはバイオマスに到達した場合の１つの実施形態において、その後、その培養物は完全閉鎖型細胞増殖システムの濃縮及び透析ろ過セグメントへと移送される。

図５１Ａ〜Ｃに関連して、一部の実施形態において、本開示製造システムの濃縮及び透析ろ過セクションは、「接線流ろ過マニホールド」とも呼称される。１つの実施形態において、濃縮及び透析ろ過セクションは、保持物容器１とも呼ばれる濃縮培養物容器、１つ以上のフィルター２３、及び透過物容器２を備えている。別の実施形態において、当該濃縮及び透析ろ過セクションは、当該濃縮培養物容器を、当該発酵セクションの１つ以上の発酵容器へと接続する、１つ以上の流体管５（例えば、５Ａ〜５Ｑ、総称的に「５」と参照される）をさらに備えている（図５０参照）。別の実施形態において、保持物１と発酵容器の間の各流体管５は、永続的に流体の流れを遮断するための手段、例えばクランプ１７またはピンチバルブ２０をさらに備えている。さらに別の実施形態において、濃縮セクションは、保持物容器１を、当該１つ以上のフィルター２３へと接続する、１つ以上の流体管５をさらに備えている。さらなる実施形態において、当該保持物容器１と当該フィルター２３を接続する流体管５は、（例えば、管５Ａ及び５Ｂを介して）保持物容器１からフィルター２３へと、及び（例えば、管５Ｄ、５Ｅ、及び５Ｆを介して）フィルター２３から保持物容器１へと戻るループを形成し、それによってフィルターと保持物容器の間に再循環ループを形成する。（例えば、図５１Ａに示される実施形態中の反時計方向のループにおいて）流体管５Ａ、５Ｂは、流体を保持物バッグ１からフィルター２３へと運び、任意で、例えば蠕動ポンプ４０などのフローアクチュエーターを備えていてもよい。さらなる実施形態において、流体管５Ｃ、５Ｄ、５Ｅは、流体をフィルター２３から保持物バッグ１へと送り返し、例えばバルブ２０またはクランプ１７などの流体の流れを遮断する手段をさらに備えていてもよい。別の実施形態において、当該１つ以上のフィルター２３は、フィルター配列中に配置され、ここで１つの実施形態において、当該フィルターは、直列に配置されるか、または別の実施形態においては、当該フィルターは並列に配置される。

図５１Ａ〜５１Ｃに連続的に関連して、保持物バッグ１は、複数の滅菌開口部を含んでいてもよく、それによって、１つ以上の管５とのエンゲージメントが可能となり、混合物の循環が可能となり、そして以下に検討される透析ろ過緩衝液の導入が可能となる。保持物バッグ１は、再循環出口Ｐ３があってもよく、それを通って、混合物が保持物バッグから引き出される。また再循環入口Ｐ５があってもよく、それを通って、残りの混合物が、フィルター２３を通過した後に保持物バッグへと再導入される。また透析ろ過入口Ｐ１１（図５１Ａの詳細Ｃに示される）があってもよく、それを通って、緩衝液が導入され得る。保持物バッグ１、及び／または透過物バッグ２はさらに、各バッグ内の圧力を等しくするための空気交換デバイス２２があってもよい。空気交換デバイス２２は、入ってくる空気を浄化し、漏出を防ぐための、１つ以上のバルブとフィルターがあってもよい。保持物バッグ１はさらに、操作中に温度計を受け入れるための温度計ポートＰ１０があってもよい。図５１Ｃに関連して、一部の実施形態において、温度計４１は、流体循環ループの管４の上に位置付けられてもよい。本明細書に詳述されるように、保持物バッグ１は、追加の機構、マニホールド、またはサンプリングデバイスのために、１つ以上の追加のポートＰ１、Ｐ２、Ｐ９があってもよい。同様に、透過物バッグ２は、空気交換デバイス、サンプリングポート、及びフィルター２３が接続され得る、類似した１つ以上のポートＰ６、Ｐ７、Ｐ８があってもよい。一部の実施形態において、通過する流体制御のために、濃縮及び透析ろ過システムの１つ以上の管５の上に、１つ以上のクランプ８、９、１７が位置付けられていてもよい。

本明細書において検討されるように、図５１Ａ〜Ｃに示される濃縮及び透析ろ過セクションは、濃縮工程において、コンストラクトの流体混合物から培地を取り除き、コンストラクトを濃縮することができる。図５１Ａ、５１Ｃに示される実施形態において、培地は、ポンプ４０によって、混合物が保持物容器１から送り出されるにつれて、フィルター２３（例えば、中空糸フィルター）の膜を通過して浸透物バッグ２に至り、管５を通り、フィルター２３を過ぎて、保持物バッグ１へと戻る。古い培地を分離することによって、構築物を保持物バッグ１と管５に保持しながら、濃縮及び透析ろ過セクションは、コンストラクトを濃縮することができる。例えば、濃縮及び透析ろ過セクションは、コンストラクトの２倍濃縮を行ってもよい。フィルターは、混合物がフィルターと実質的に接線方向でエンゲージするよう、管５の流れの方向に対し実質的に垂直方向のフィルター表面を少なくとも１つ含んでもよい。

濃縮及び透析ろ過セクションは、目盛り（示されていない）をさらに含んでいてもよく、その上に保持物バッグ１が位置付けられていてもよい。保持物バッグ１の当初重量と、濃縮プロセスの間の重量のモニタリングに基づいて、濃縮中の変化が、取り除かれた培地重量に基づいて間接的に算出され得る。一部の実施形態においては、バルブ２０（例えば、スクリューバルブまたはピンチバルブ）を、コンピューター操作型のアクチュエーター、または手動のいずれかにより調節し、管５の流れを制限して、フィルター２３での管５の圧力を維持してもよい。循環システム中の混合物を、所定の圧力（例えば、３ｐｓｉ）で維持し、培地のフィルター膜通過を促進してもよい。図５１Ａ及び５１Ｃに示される実施形態において、圧力センサー（例えば、図５１Ｃに示される圧力センサー１２）は、フィルター２３での圧力を含む、ポンプ４０とバルブ２０の間のシステム中の圧力が効率的に測定されるように、ピンチバルブ２０の上流に位置付けられる。１つの実施形態において、フィルター配列は、１つのフィルター２３を備えている。別の実施形態において、フィルター配列は、２個以上のフィルターユニットを備えている。さらに別の実施形態において、フィルター配列は、２個のフィルターユニットを備えている。さらに別の実施形態において、フィルター配列は、３個のフィルターユニットを備えている。さらに別の実施形態において、フィルター配列は、４個のフィルターユニットを備えている。さらに別の実施形態において、フィルター配列は、５個のフィルターユニットを備えている。さらに別の実施形態において、フィルター配列は、６個以上のフィルターユニットを備えている。

１つの実施形態において、フィルター２３は、例えば培地などの流体を、膜を通過させて透過物バッグ２へと向かわせながら、保持物バッグ１を有する再循環ループ中に細菌を保持することができる。別の実施形態において、フィルターはさらに、例えばウイルス粒子などのマクロ粒子や高分子を通過させる。

１つの実施形態において、フィルターは、少なくとも約０．０１〜１００μｍ^２の膜孔サイズを有している。別の実施形態において、フィルターは、透析ろ過を通して作動する。

濃縮セクションはさらに、フィルター２３を透過物容器２（例えば、バッグ）へと接続する流体管５Ｃ、５Ｇを備えていてもよく、当該流体管はさらに、透過物容器への一方向性の流れを可能とさせるバルブまたはクランプを備えており、任意でさらに、例えばポンプなどのフローアクチュエーターを備えている。

別の実施形態において、濃縮培養物容器１及び透過物容器２は、プラスチック容器である。別の実施形態において、濃縮培養物容器１及び透過物容器２は、組織培養バッグである。

１つの実施形態において、濃縮培養物容器１は、約１００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、濃縮培養物容器１は、約１５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、濃縮培養物容器１は、約２００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、濃縮培養物容器１は、約２５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、濃縮培養物容器１は、約３００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、濃縮培養物容器１は、約３５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、濃縮培養物容器１は、約４００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、濃縮培養物容器１は、約４５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、濃縮培養物容器１は、約５００ｍｌの最大体積を有している。

１つの実施形態において、透過物容器２は、約１００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、透過物容器２は、約１５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、透過物容器２は、約２００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、透過物容器２は、約２５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、透過物容器２は、約３００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、透過物容器２は、約３５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、透過物容器２は、約４００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、透過物容器は、約４５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、透過物容器２は、約５００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、透過物容器２は、約６００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、透過物容器２は、約７００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、透過物容器２は、約８００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、透過物容器２は、約９００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、透過物容器２は、約１Ｌの最大体積を有している。別の実施形態において、透過物容器２は、約１．２Ｌの最大体積を有している。別の実施形態において、透過物容器２は、約１．４Ｌの最大体積を有している。別の実施形態において、透過物容器２は、約１．６Ｌの最大体積を有している。別の実施形態において、透過物容器２は、約１．８Ｌの最大体積を有している。別の実施形態において、透過物容器２は、約２Ｌの最大体積を有している。別の実施形態において、透過物容器２は、２Ｌ超の最大体積を有している。

１つの実施形態において、発酵セクションから保持物容器１へと運ばれる本開示培養培地は、フィルター配列を通って循環し、フィルター２３を通過する培地は、透過物容器２内に引き出され、それによって、培養物体積の減少がもたらされ、培養物中の細菌の濃度が上昇する。別の実施形態において、細菌は、単回使用フィルター配列を１回通過することによって濃縮される。一部の実施形態において、フィルター２３は、中空糸フィルターを含む。別の実施形態において、ろ過プロセスは、細胞濃縮物を回収するための膜間圧透析ろ過を使用する。これによって、本明細書に開示される方法と、膜間圧ろ過を使用する他の方法が差別化される。

１つの実施形態において、培養物中の最終標的細菌濃度は、約１〜１０^９細菌／ｍｌである。

別の実施形態において、組み換え型弱毒化リステリア株の培養物は、培養物のバイオマスが、所定の値に達するまで増殖される。１つの実施形態において、バイオマスは、約７ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約９ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約１０ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約１２ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約１５ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約２０ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約２５ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約３０ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約３３ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約４０ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、約５０ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは、５０ｘ１０^９ＣＦＲ／ｍｌよりも大きい。

追加の実施形態において、保持物容器はさらに、製品容器のサンプリング及び／または充填のための１つ以上のマニホールド（例えば、図５２〜５３に示されるマニホールド３９）を、発酵セクション及び濃縮セクションのサンプラーポートに接続するための、少なくとも１つの任意のポートＰ１、Ｐ２を備えている。

１つの実施形態において、接線流ろ過マニホールドは、１つ以上の透析ろ過入口Ｐ１１に接続するよう作られた保持物容器、製剤緩衝液容器；１つ以上のフィルター２３；及び透過物容器２を備えている。別の実施形態において、濃縮及び透析ろ過セクションは、透過物容器２を、濃縮及び透析ろ過セクションの保持物容器１に接続する流体管５をさらに備えている。さらに別の実施形態において、濃縮及び透析ろ過セクションは、保持物容器１を、当該１つ以上のフィルター２３へと接続する、１つ以上の流体管５をさらに備えている。さらなる実施形態において、保持物容器１とフィルター２３を接続する流体管は、流体を保持物バッグ１からフィルター２３へと運ぶよう構成された直流管５と、流体をフィルターから保持物バッグへと運び戻すよう構成された逆流管の両方を備えており、それによって、フィルターと保持物容器の間に再循環ループが形成される。さらなる実施形態において、当該直流流体管は任意で、例えば蠕動ポンプなどのフローアクチュエーター４０を備えている。さらなる実施形態において、当該逆流流体管はさらに、流体の流れを減速させる、または遮断する、例えばバルブ２０またはクランプ１７などの手段を備えている。別の実施形態において、当該１つ以上のフィルターは、フィルター配列中に配置され、ここで１つの実施形態において、当該フィルターは、直列に配置されるか、または別の実施形態においては、当該フィルターは並列に配置される。

濃縮プロセスの間にコンストラクト製品を濃縮した後に透析ろ過を行い、製品を浄化させ、古い培地を緩衝液と交換してもよい。透析ろ過の間、構成緩衝液容器は、１つ以上の透析ろ過入口Ｐ１１を介して保持物バッグ１に接続される。構成緩衝液容器（例えば、バッグ２８、２９に似た容器）は、管５Ｍを介して透析ろ過入口Ｐ１１に接続された無菌カップリング１１に接続されてもよい。接続されることで、構成緩衝液容器は、制御された速度で、保持物バッグ１へと緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液）を導入し得る。濃縮及び透析ろ過セクションは、古い培地を含む流体を混合物から取り除くために、フィルター２３を過ぎた混合物を循環させ続けることができる。緩衝液が導入され、古い培地が希釈される一方で、全体的なコンストラクト濃度は維持されている。一部の実施形態において、透析ろ過は、緩衝液を保持物バッグ１へと押し込む、またはポンピングすることにより、手動で制御されてもよい。一部の実施形態において、コンピューターシステム（例えば、非一過性メモリーに連結されたコントローラー、マイクロプロセッサーなど）が、緩衝液の入口を制御してもよい。例えば一部の実施形態において、手動またはコンピューター化されたオペレーターが、保持物バッグ１の一定重量を維持するために目盛りを監視してもよい。図５１Ｃに関連して、管５Ｍに接続された追加ポンプ４２を使用して、緩衝液を供給してもよい。一部の実施形態において、透析ろ過は、濃縮プロセスと交互に重複していてもよく、それによって、新しい緩衝液が追加されながら、コンストラクトの少なくとも一部が濃縮される。

一部の実施形態において、緩衝液は、後の凍結プロセスの間の凍結ダメージからコンストラクトを保護するために、抗凍結剤を含有してもよい。例えば、緩衝液は２％スクロースを含有してもよい。一部の別の実施形態において、任意の溶液、例えばグリセロール、グリコール化合物、及び本開示内容を考慮して当分野の当業者により認識され得る他の抗凍結剤などを使用して、抗凍結作用を得てもよい。

一部の実施形態において、再循環出口Ｐ３、再循環入口Ｐ５、及び／または透析ろ過入口Ｐ１１は、保持物バッグ中でコンストラクトが沈殿するのを防ぐように位置付けられてもよい。例えば、記載される実施形態において、再循環出口Ｐ３と、透析ろ過入口Ｐ１１は、その使用可能な位置で、保持物バッグ１の底に近接して位置付けられる。再循環出口Ｐ３及び透析ろ過入口Ｐ１１は、保持物バッグ１の底に位置付けられてもよい。一部の実施形態において、再循環出口Ｐ３及び透析ろ過入口Ｐ１１は、保持物バッグ１中で渦が生じ、沈殿が防がれるように互いに近接して位置付けられてもよい。一部の実施形態において、再循環出口Ｐ３及び透析ろ過入口Ｐ１１は、互いに１インチ（２．５４センチ）未満で位置付けられてもよい。一部の実施形態において、再循環出口Ｐ３及び透析ろ過入口Ｐ１１は、互いに２インチ（５．０８センチ）未満で位置付けられてもよい。一部の実施形態において、再循環出口Ｐ３及び透析ろ過入口Ｐ１１は、互いに３インチ（７．６２センチ）未満で位置付けられてもよい。一部の実施形態において、再循環出口Ｐ３及び透析ろ過入口Ｐ１１は、互いに４インチ（１０．１６センチ）未満で位置付けられてもよい。一部の別の実施形態において、再循環入口Ｐ５は、渦を生じさせるために、再循環出口Ｐ３及び透析ろ過入口Ｐ１１のうちの少なくとも１つに近接して位置付けられてもよい。

一部の別の実施形態において、再循環ループを通る流速は、所定の流速に維持され得る。流速は、バイオフィルムの形成及び目詰まりを防ぐために充分に高い速度であってもよく、及び流速は、コンストラクトのせん断及び殺傷を防ぐために充分に低い速度であってもよい。流速は、混合物の粘度、及びフィルターサイズ／流速（例えば、中空糸フィルター中のファイバー数）に応じて実験的に確立されてもよく、及びレイノルド数に依存している。一部の別の実施形態において、流速は、循環ループ中に乱流を生じさせるために充分に高い速度であってもよく、その乱流は、バイオフィルム形成阻害に役に立つ。ポンプ４０は、流速を維持するために、手動で制御されていてもよく、前もって所定の流速に設定されていてもよく、またはコンピューターシステムにより自動的に制御されていてもよい。

一部の別の実施形態において、流速は、０．４５０Ｌ／分〜０．８５０Ｌ／分であってもよい。一部の別の実施形態において、流速は、０．２５０Ｌ／分〜１Ｌ／分であってもよく、またはその任意の個々の下位増分であってもよい。一部の別の実施形態において、流速は、０．６００Ｌ／分であってもよい。一部の別の実施形態において、流速は、０．６５０Ｌ／分であってもよい。一部の別の実施形態において、流速は、０．６５０Ｌ／分〜０．８５０Ｌ／分であってもよい。一部の別の実施形態において、流速は、０．６００Ｌ／分〜０．８５０Ｌ／分であってもよい。一部の別の実施形態において、流速は、０．４５０Ｌ／分〜０．６５０Ｌ／分であってもよい。一部の別の実施形態において、流速は、０．４５０Ｌ／分〜０．６００Ｌ／分であってもよい。一部の別の実施形態において、流速は、０．６００Ｌ／分〜０．６５０Ｌ／分であってもよい。図５５に関して、レイノルド数、ポンプ流速、ファイバー数、速度、動粘性率、フロー／ファイバー、単位長、内部直径、ファイバー体積、及び移動時間、いくつかの実施例形態に特徴的な長さを比較する表を示す。一部の別の実施形態において、およそ７００のレイノルド数が好ましい。一部の別の実施形態において、ポンプの速さは、濃縮及び透析ろ過の間、一定に維持されてもよい。一部の他の実施形態において、ポンプの速さは、レイノルド数が変化した場合に、増加または減少する。一部の別の実施形態において、ポンプの速さは、濃縮及び／または透析ろ過の間に増加してもよい。

本明細書に詳述されるように、濃縮及び透析ろ過は、本開示内容を考慮し、当分野の当業者により理解され得る、プロセッサー、メモリー、１つ以上のセンサー、１つ以上のアクチュエーター、ならびに関連解析及び制御ソフトウェアならびにハードウェアを含む１つ以上のコンピューターシステムにより制御されてもよい。１つ以上のセンサーが濃縮及び透析ろ過セクション中に配置され、ユーザーまたはコンピューターに機能可能なデータを提供してもよい。一部の実施形態において、バイオフィルムの蓄積は、管５に位置付けられた１つ以上の圧力センサー（例えば、図５１Ｃに示される圧力センサー１２）により検出されてもよい。圧力の読み取りは、ループ内圧力の低下を検出するために、２以上の位置で行われてもよい。基準圧力の差からの変化の検出は、バイオフィルムの形成を示唆しており、従って、ループを通過する流速が低すぎることを示唆し得る。２個以上の圧力センサー間の圧力の差における変化に反応し、セクションはポンプの速度を上げてもよく、またはバイオフィルムが取り除かれない場合にはエラーを信号を送ってもよい。一部の実施形態において、圧力センサーのうちの２個が、フィルター２３のいずれかの側面上に位置付けられてもよい。

一部の実施形態において、コンストラクトのせん断は、１つ以上の光学密度センサーにより検出されてもよい。一部の実施形態において、混合物光学密度の基準光学密度からの変化は、せん断を示唆し得る。基準値は、濃縮または透析ろ過工程の開始時に取得される。一部の実施形態において、最大流速を決定するために、生きている個数／死んでいる個数が取得されてもよい。

光学密度センサーは、循環混合物の光学密度を検出するために、管５の保持物バッグ１中に位置付けられてもよい。一部の実施形態において、光学密度における変化を検出するために、再循環ループの異なる位置に、２個以上の光学密度センサーが置かれてもよい。一部の実施形態において、光学密度における変化を検出するために、透過物バッグ２に、光学密度センサーが置かれてもよい。典型的には、透過物バッグ２には、コンストラクトが含まれていないか、またはほとんど含まれておらず、したがって、不透明度は低いか、あるいは透明である。せん断されたコンストラクトは、濃縮ループ中で再循環するよりもむしろフィルター２３を通過し、そのため、透過物バッグ２の光学密度における変化（例えば、上昇）は、せん断の発生を示唆し得る。光学密度の変化に反応して、コンピューターシステム、またはユーザーによりポンプ４０の速さを上げてもよい。

１つの実施形態において、フィルター配列は、１個のフィルターユニットを備えている。別の実施形態において、フィルター配列は、２個以上のフィルターユニットを備えている。さらに別の実施形態において、フィルター配列は、２個のフィルターユニットを備えている。さらに別の実施形態において、フィルター配列は、３個のフィルターユニットを備えている。さらに別の実施形態において、フィルター配列は、４個のフィルターユニットを備えている。さらに別の実施形態において、フィルター配列は、５個のフィルターユニットを備えている。さらに別の実施形態において、フィルター配列は、６個以上のフィルターユニットを備えている。

本明細書に開示されるフィルターは、袋膜フィルター、平面膜フィルター、カートリッジフィルター、吸着フィルター、または吸収フィルターであってもよい。別の実施形態において、フィルターは中空糸フィルターである。

１つの実施形態において、フィルターは、培地は通過させながら、細菌を保持することができる。別の実施形態において、フィルターはさらに、例えばウイルス粒子などのマクロ粒子や高分子を通過させる。

１つの実施形態において、フィルターは、少なくとも約０．０１〜１００μｍ^２の膜孔サイズを有している。別の実施形態において、フィルターは、接線流ろ過を通して作動する。

別の実施形態において、濃縮及び透析ろ過セクションはさらに、フィルター配列を透過物バッグに接続する流体管を備えており、当該流体管はさらに、透過物容器への一方向性の流れを可能とさせるバルブを備えており、及び任意でさらに、例えばポンプなどのフローアクチュエーターを備えている。別の実施形態において、濃縮及び透析ろ過セクションはさらに、製剤緩衝液容器を保持物容器に接続する流体管を備えており、当該流体管はさらに、保持物容器への一方向性の流れを可能とさせるバルブを備えており、及び任意でさらに、例えばポンプなどのフローアクチュエーターを備えている。

別の実施形態において、保持物、製剤緩衝液、及び透過物容器は、プラスチック容器である。別の実施形態において、保持物、製剤緩衝液、及び透過物容器は、組織培養バッグである。

１つの実施形態において、保持物容器は、約１００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、保持物容器は、約１５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、保持物容器は、約２００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、保持物容器は、約２５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、保持物容器は、約３００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、保持物容器は、約３５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、保持物容器は、約４００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、保持物容器は、約４５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、保持物容器は、約５００ｍｌの最大体積を有している。

１つの実施形態において、製剤緩衝液容器は、約１００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、製剤緩衝液容器は、約１５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、製剤緩衝液容器は、約２００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、製剤緩衝液容器は、約２５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、製剤緩衝液容器は、約３００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、製剤緩衝液容器は、約３５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、製剤緩衝液容器は、約４００ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、製剤緩衝液容器は、約４５０ｍｌの最大体積を有している。別の実施形態において、製剤緩衝液容器は、約５００ｍｌの最大体積を有している。

１つの実施形態において、製剤緩衝液容器は、製剤緩衝液で満たされており、製造プロセスの開始前に、完全閉鎖型細胞増殖システムに統合される。別の実施形態において、製剤緩衝液容器は、製剤緩衝液で満たされており、製造プロセスの進行中に、例えばディスポーザブルの無菌コネクターを介して完全閉鎖型細胞増殖システムに統合される。

別の実施形態において、製剤緩衝液は、使用前に所定の温度にされる。別の実施形態において、保持物容器と製剤緩衝液容器の両方が、保持物容器及び製剤緩衝液容器の両方が、透析ろ過プロセスの前に所定の温度にされる。１つの実施形態において、温度は、約３７℃で維持される。別の実施形態において、温度は約３７℃である。別の実施形態において、温度は約４℃である。別の実施形態において、温度は約８℃である。別の実施形態において、温度は約１２℃である。別の実施形態において、温度は約１６℃である。別の実施形態において、温度は、約１２℃である。別の実施形態において、温度は約２０℃である。別の実施形態において、温度は約２５℃である。別の実施形態において、温度は約２７℃である。別の実施形態において、温度は約２８℃である。別の実施形態において、温度は約３０℃である。別の実施形態において、温度は約３２℃である。別の実施形態において、温度は約３４℃である。別の実施形態において、温度は約３５℃である。別の実施形態において、温度は約３６℃である。別の実施形態において、温度は約３８℃である。別の実施形態において、温度は約３９℃である。

別の実施形態において、濃縮セクションから保持物容器１へと移送された培養培地は、当該フィルター配列を通って循環され、当該フィルター２３を通過した培地は、透過物容器２へと引き出され、それと同時に製剤緩衝液が保持物容器１に加えられ、それによって、栄養培地が製剤緩衝液と置き換えられる。別の実施形態において、緩衝液は、単回使用フィルター配列を１回通過することによって置き換えられる。追加の実施形態において、保持物バッグ１に加えられる製剤緩衝液の量は、透過物容器２へと取り除かれる培地量よりも少なく、それによって、培養物量が減少し、従い、免疫療法組成物中の細菌濃度が上昇する。さらに別の実施形態において、保持物バッグ１に加えられる製剤緩衝液の量は、透過物容器２へと取り除かれる培地量よりも多く、それによって、培養物量が増加し、従い、免疫療法組成物中の細菌濃度が低下する。別の実施形態において、ろ過プロセスは、免疫療法組成物を回収するための膜間圧透析ろ過を使用する。これによって、本明細書方法と、膜間圧ろ過を使用する他の方法が差別化される。１つの実施形態において、培養物中の最終標的細菌濃度は、約１〜１０^９細菌／ｍｌである。

本明細書に開示される方法及び組成物の１つの実施形態において、製剤緩衝液中に組み換え型弱毒化リステリアを含有する免疫療法組成物は、その後、保持物容器１から、上述の流体管を通って完全閉鎖型細胞増殖システムの製品分注セクションへと運ばれる。当該流体管は、製品分注セクションへの一方向性の流れを可能とするバルブ２０（図５３）、例えばバルブ２０またはクランプ１７などの永続的に流体の流れを遮断する手段を備えており、及び任意で例えばポンプなどのフローアクチュエーターをさらに備えている。

１つの実施形態において、本明細書に開示される製造システムの製品分注セクション３９は、「製品バンクマニホールド」または「マニホールド」とも呼称される（図５２〜５３を参照）。１つの実施形態において、製品分注セクションは、バルク容器（例えば、保持物容器１）、パージ容器、及び１つ以上の製品容器を備えている。さらに別の実施形態において、製品分注セクションはさらに、バルク容器を、当該パージ容器（例えば、１００ｍＬバッグ２９）へ、及び当該１つ以上の製品容器（例えば、２５ｍＬバッグ２８）へと順次接続する、１つ以上の流体管３０を備えており、当該パージ容器は、一連の接続の末端終結部分に置かれ、一方で製品容器は一連の接続の中間位置にある。さらなる実施形態において、バルク容器、パージ容器、及び製品容器を接続する管はさらに、例えばバルブ２０、クランプ１７などの各製品容器への流れを永続的に遮断する手段、または永続的に管を密封する手段を備えており、任意で例えばポンプなどのフローアクチュエーターを備えており、当該アクチュエーターは、バルク容器に近接して配置されている。マニホールド３９は、保持部バッグ（例えば、図５１Ａ〜Ｃに示される保持物バッグ１のＰ１またはＰ２）に、１つ以上のコネクター１１を用いて無菌的に付加されていてもよい。

１つの実施形態において、バルク容器とパージ容器は、プラスチック容器である。別の実施形態において、バルク容器とパージ容器は、組織培養バッグである。

１つの実施形態において、製品容器はプラスチック容器、プラスチックアンプル、ガラスアンプル、または単回使用シリンジである。別の実施形態において、製品容器は、ＩＶ送達ポートをさらに備えたＩＶバッグである。別の実施形態において、製品容器は、単回投与ＩＶバッグである。

１つの実施形態において、製品分注セクションは本明細書において「製品バンクマニホールド」とも呼称されており、１個の単回投与製品容器を備えている。別の実施形態において、製品分注セクションは、２個の単回投与製品容器を備えている。別の実施形態において、製品分注セクションは、３個の単回投与製品容器を備えている。別の実施形態において、製品分注セクションは、４個の単回投与製品容器を備えている。別の実施形態において、製品分注セクションは、５個の単回投与製品容器を備えている。別の実施形態において、製品分注セクションは、６個の単回投与製品容器を備えている。別の実施形態において、製品分注セクションは、７個の単回投与製品容器を備えている。別の実施形態において、製品分注セクションは、８個の単回投与製品容器を備えている。別の実施形態において、製品分注セクションは、９個の単回投与製品容器を備えている。別の実施形態において、製品分注セクションは、１０個の単回投与製品容器を備えている。別の実施形態において、製品分注セクションは、１０個超の単回投与製品容器を備えている。

１つの実施形態において、各製品容器は、約１〜５００ｍｌの体積を有している。

追加の実施形態において、バルク容器は、発酵及び濃縮／透析ろ過セクションのサンプラーポートに類似した、少なくとも１つの任意のサンプラーポートを備えている。

別の実施形態において、本明細書に開示される当該完全閉鎖型細胞増殖システムは、中央集中型構造を有しており、発酵セクションの発酵容器は、濃縮セクションと透析ろ過セクションの保持物容器としても機能し、及び製品分注セクションのバルク容器としても機能する。別の実施形態において、中央集中型完全閉鎖型細胞増殖システムはさらに、発酵／濃縮された培養物／保持物／バルクの容器を、接種、濃縮／透析ろ過及び製品分注セクションの各々の各構成要素に、特に接種容器に、接続する、濃縮セクション／透析ろ過セクションの１つ以上のフィルターに接続する、または製品分注セクションの製品容器及びパージ容器に接続する、外部流体管の個別セットを備えている。別の実施形態において、中央集中型完全閉鎖型細胞増殖システムはさらに、濃縮／透析ろ過セクションの１つ以上のフィルターを、発酵／濃縮された培養物／保持物／バルクの容器へと接続する再循環管のセットを備えている。別の実施形態において、当該発酵／濃縮された培養物／保持物／バルクの容器を、中央集中型完全閉鎖型細胞増殖システムの他のセクションへと接続する外部流体管はさらに、発酵／濃縮された培養物／保持物／バルクの容器からの一方向性の流出を可能とする任意のバルブを備えている。別の実施形態において、外部流体管のうちの１つ以上はさらに、例えばポンプなどの流体フローアクチュエーターを備えている。追加の実施形態において、濃縮セクション／透析ろ過セクションの一つ以上のフィルターを当該発酵／濃縮された培養物／保持物／バルクの容器に接続する再循環管はさらに、発酵／濃縮された培養物／保持物／バルクの容器からの一方向性の流出を可能とする任意のバルブを備えている。別の実施形態において、中央集中型完全閉鎖型細胞増殖システムの発酵／濃縮された培養物／保持物／バルクの容器に接続された各流体管はさらに、例えばバルブ２０またはクランプ１７などの流体の流れを永続的に遮断する手段、または管を永続的に密封する手段を備えている。

本明細書において、蒸気に開示される完全閉鎖型細胞増殖システムをいくつか並行使用することによる、個別化免疫療法組成物の製造方法をスケールアップする方法が開示される。１つの実施形態において、完全閉鎖型細胞増殖システムのセットを使用して、同一患者用の異なるいくつかの個別化免疫療法組成物が作製される。別の実施形態において、完全閉鎖型細胞増殖システムのセットを使用して、異なる患者用の異なるいくつかの個別化免疫療法組成物が作製される。別の実施形態において、完全閉鎖型細胞増殖システムのセットを並行使用することにより、個別化免疫療法組成物の生産量において驚異的な増加がもたらされる。

１つの実施形態において、当該セットは、並行動作する、２個の完全閉鎖型細胞増殖システムを備えている。別の実施形態において、当該セットは、並行動作する、３個の完全閉鎖型細胞増殖システムを備えている。別の実施形態において、当該セットは、並行動作する、４個の完全閉鎖型細胞増殖システムを備えている。別の実施形態において、当該セットは、並行動作する、５個の完全閉鎖型細胞増殖システムを備えている。別の実施形態において、当該セットは、並行動作する、６個の完全閉鎖型細胞増殖システムを備えている。別の実施形態において、当該セットは、並行動作する、７個の完全閉鎖型細胞増殖システムを備えている。別の実施形態において、当該セットは、並行動作する、８個の完全閉鎖型細胞増殖システムを備えている。別の実施形態において、当該セットは、並行動作する、９個の完全閉鎖型細胞増殖システムを備えている。別の実施形態において、当該セットは、並行動作する、１０個の完全閉鎖型細胞増殖システムを備えている。別の実施形態において、当該セットは、並行動作する、１０個超の完全閉鎖型細胞増殖システムを備えている。

本明細書において、完全閉鎖型ディスポーザブル細胞増殖システム、または当該システムのセットを、閉環境チャンバー内で操作するための方法が開示される。１つの実施形態において、閉環境チャンバーは、クリーンルームである。別の実施形態において、閉環境チャンバーは、バイオフードである。

１つの実施形態において、「閉環境チャンバー」という用語は、外部環境から完全に、もしくは部分的に密閉された、または単離された任意の大きさの閉鎖系を指し、ここでは例えば温度、圧力、大気、及び空気中の特定物質のレベルなどの１つ以上の環境パラメーターが、特定のプリセットレベルに維持されている。

別の実施形態において、個別化免疫療法組成物の製造方法はさらに、当該製造方法と同時に、または当該製造方法の完了後のいずれかで製造された組成物の検査を提供する。同時検査は、製造方法のいずれか工程で行うことができ、製造方法全体を通じた、製品の質の連続的モニタリングに関する大きな利益をもたらす。同時検査はさらに、製造後検査を省くという追加の利益を提供するものであり、それによって、大きく時間が節約される。１つの実施形態において、当該検査は、純度対照、安全性対照、有効性対照、同一性対照、及び安定性対照を含むが、これらに限定されない。

１つの実施形態において、「純度対照」という用語は、例えば残余培地成分、製品不純物、及び例えばバクテリオファージなどの危険な物質のコンタミネーションなどのプロセス不純物の存在に関し、個別化免疫療法組成物を検査することを意味する。

別の実施形態において、「安全性対照」という用語は、毒性、特異性に関し、個別化免疫療法組成物を検査することを意味し、リステリアの場合には、製造された組成物は、弱毒性に関して検査される。別の実施形態において、「同一性対照」という用語は、例えば抗生物質感受性などの、予測される品質特性の存在に関し、個別化免疫療法組成物を検査することを指す。別の実施形態において、「有効性対照」という用語は、治療効果に関し、個別化免疫療法組成物を検査することを指す。治療効果は、例えばｉｎｖｉｔｒｏシステムのモデルで検査されることができる。

別の実施形態において、「安定性対照」という用語は、予測される用法による品質特性の維持能力に関し、個別化免疫療法組成物を検査することを意味する。

本明細書において、製造プロセス完了直後に、患者に個別化免疫療法組成物を送達することが可能となる、受注生産が開示される。１つの実施形態において、少なくとも１つの単回投与製品容器、好ましくはＩＶバッグは、製品が製品容器へと送達され、製品容器を細胞増殖システムへと接続する流体管が永続的に切り離された時点で、単回使用完全閉鎖型細胞増殖システムから取り外される。取り外し後、製品容器を使用して、例えばＩＶ点滴などを介して、患者に個別化免疫療法組成物が直接投与される。

本明細書において、その後の使用のための、または離れた場所にいる患者に輸送するための、個別化免疫療法組成物の保存システムが開示される。本発明により予期されるように、１つ以上の単回投与製品容器、好ましくは単回使用ＩＶバッグは、製品が製品容器へと送達され、製品容器を細胞増殖システムへと接続する流体管が永続的に切り離された時点で、単回使用完全閉鎖型細胞増殖システムから取り外される。取り外し後、製品容器は直ちに凍結され、保存または輸送される。１つの実施形態において、個別化免疫療法組成物は−２０℃以下の温度で凍結され、保存され、または輸送される。別の実施形態では、温度は約−７０℃である。別の実施形態では、温度約⁻７０〜⁻８０℃である。別の実施形態において、個別化免疫療法組成物は溶解され、患者への送達直前に、製剤緩衝液中に均一に細菌細胞が再懸濁される。１つの実施形態において、個別化免疫療法組成物は、患者への送達直前に、所定の温度にされる。別の実施形態において、温度は、大気温度である。別の実施形態において、温度は、約３７℃である。

１つの実施形態において、本明細書に開示される製造方法により、さらなる処理（すなわち、バイアルへの充填）のために、別個の施設へ製剤原料を運ぶ必要性が無くなる。別の実施形態において、本明細書に開示される製造方法により、ＧｒａｄｅＤ／Ｃｌａｓｓ１００，０００／ＩＳＯ８またはさらに高い環境での製造が可能となる。

本明細書開示内容により提示されるように、製造工程は、２週以上かからない。別の実施形態において、製造工程は、約１〜２週かかる。別の実施形態において、製造工程は、約１週かかる。別の実施形態において、製造工程は、１週以上かからない。

本明細書開示内容によりさらに提示されるように、免疫療法剤の前放出検査、及び放出工程は、５週以上かからない。別の実施形態において、免疫療法剤の前放出検査、及び放出工程は、約４〜５週かかる。別の実施形態において、免疫療法剤の前放出検査、及び放出工程は、約４週かかる。別の実施形態において、免疫療法剤の前放出検査、及び放出工程は、４週以上かからない。

本明細書開示内容によりさらに提示されるように、輸送工程は、１週以上かからない。別の実施形態において、輸送工程は、１週以上かからない。

個別化免疫療法プロセス
１つの実施形態において、疾患または症状を有する対象に対し生成された個別化免疫療法システムを提供するためのシステムであって、以下を含む前述のシステムが開示される：
弱毒化リステリア株送達ベクター、および
前述のリステリア株を形質転換するためのプラスミドベクターであって、１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前述のネオエピトープが前述の疾患または症状を有する前述の対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性のエピトープを備える前述のプラスミドベクター、
を含み、前述のプラスミドベクターで前述のリステリア株を形質転換することにより、前述の対象の疾患または症状を標的とする個別化免疫療法システムが生成される。

１つの実施形態において、疾患または症状を有する対象に対する、個別化免疫療法を生成するための方法であって、以下の工程を含む方法：
疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を、健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較し、前述の疾患担持試料の前述の１つ以上のＯＲＦ内にコードされる１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を前述の比較により特定する工程、
ａ．において特定された前述の１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで弱毒化リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前述の対象に投与するために前述の弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前述の弱毒化リステリア株を含む組成物を前述の対象に投与し、前述の投与により前述の疾患または前述の症状に対する個別化Ｔ細胞免疫応答を生じさせる工程、所望により、
前述のＴ細胞免疫応答に由来するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む前述の対象の第２生体試料を取得し、前述のＴ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子により結合される１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴解析を行う工程であって、前述の１つ以上のネオエピトープが、免疫原性である工程、
ｃ．において特定された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択する工程、および
前述の１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列を備えるベクターで第２弱毒化組換え型リステリア株を形質転換し、二者択一的に、所定の時点で前述の対象に投与するために前述の第２弱毒化組換え型リステリアを保存するか、あるいは前述の第２弱毒化組換え型リステリア株を含む第２組成物を前述の対象に投与する工程を含み、
それにより前述の対象向けの個別免疫療法を作成する前述の方法。

１つの実施形態では疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を作成するための方法であって、
疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を、健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のＯＲＦと比較し、前述の疾患担持試料の前述の１つ以上のＯＲＦ内にコードされる１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を前述の比較により特定する工程、
ａ．において特定された前述の１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列でベクターを形質転換し、またはａ．において特定された前述の１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のＯＲＦを含む前述の核酸配列を使用してＤＮＡワクチンベクターまたはペプチドワクチンベクターを作製し、及び二者択一的に、所定の時点で前述の対象に投与するために前述のベクターまたは前述のＤＮＡワクチンまたは前述のペプチドワクチンを保存するか、または前述のベクター、前述のＤＮＡワクチン、または前述のペプチドワクチンを含む組成物を前述の対象に投与し、前述の投与により前述の疾患または前述の症状に対する個別化Ｔ細胞免疫応答を生じさせる工程、および任意で、
Ｔ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞または血液または組織標本を含む前述の対象の第２生体試料であって、潜在的なネオエピトープペプチドに対する応答の特定及び選択をＴ細胞免疫応答の増加または変化に基づいて可能にする前述の第２生体試料を取得し、前述のＴ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子が結合する１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドとの反応により特徴解析する工程であって、前述の１つ以上のネオエピトープは免疫原性であるか、またはＴ細胞受容体特異性についてのＰＣＲベースのディープシーケンシングおよびネオエピトープと関連して増加したＴ細胞応答の評価により特徴解析する工程、
ｃ．において特定された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸コンストラクトをスクリーニングし、且つ、選択する工程、および
前述の１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸配列で第２ベクターを形質転換するか、またはｃ．において特定された前述の１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする前述の核酸配列を使用してＤＮＡワクチンベクターまたはペプチドワクチンベクターを作製し、及び二者択一的に、所定の時点で前述の対象に投与するために前述のベクターまたは前述のＤＮＡワクチンまたは前述のペプチドワクチンを保存するか、または前述のベクター、前述のＤＮＡワクチン、または前述のペプチドワクチンを含む組成物を前述の対象に投与する工程を含み、
それにより前述の対象向けの個別免疫療法を作成する前述の方法。

別の実施形態において、疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法を提供するシステムが提示され、前述のシステムは、以下の構成要素を含む：
前述の疾患または症状を有する前述の対象より獲得される疾患担持生体試料、
前述の疾患または症状を有する前述の対象、または別の健常ヒト対象より獲得される健常生体試料、
前述の疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を前述の健常生体試料より抽出された核酸配列内のオープン・リーディング・フレームと比較し、及び前述の疾患担持試料の前述の核酸配列によりコードされる前述のＯＲＦ中の突然変異であって、１つ以上のネオエピトープを含む、前述の突然変異を特定するためのスクリーニングアッセイまたはスクリーニングツール及び、関連デジタルソフトウェアであって、
前述の関連デジタルソフトウェアは、Ｔ細胞エピトープ（複数含む）または免疫原性の可能性、またはそれらのあらゆる組合せの特定のために前述のＯＲＦ中の前述の突然変異のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含み、
前述の疾患担持試料に由来する前述の１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする核酸をクローニングし、且つ、発現させるための核酸クローニングおよび発現キット、
Ｔ細胞の免疫原性および／または１つ以上のネオエピトープを含む候補ペプチドの結合を検査するための免疫原性アッセイ、
核酸配列、ペプチドアミノ酸配列、およびＴ細胞受容体アミノ酸配列をシーケンシングし、分析するための分析装置および関連のソフトウェア、
工程（ｅ）の１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む前述の特定済み免疫原性ペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備えるプラスミドベクターで形質転換するための弱毒化リステリア送達ベクターであって、
一度形質転換されると前述のリステリアが保存されるか、または免疫原性組成物の一部として（ａ）の前述のヒト対象に投与される前述の弱毒化リステリア送達ベクター、または
送達ベクター、および所望により
前述の送達ベクターを形質転換するためのベクターであって、１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含む核酸コンストラクトを備え、前述のネオエピトープが前述の疾患または症状を有する前述の対象の疾患担持組織または細胞に存在する免疫原性エピトープを含む前述のベクターを含む前述の系が提供される。

別の実施形態において、前述の１つ以上のペプチドは前述の核酸配列中の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）によってコードされる。

別の実施形態では疾患は感染症、または腫瘍もしくは癌である。

別の実施形態では前述の送達ベクターは細菌性送達ベクターを含む。別の関連の態様では前述の送達ベクターはウイルスベクター送達ベクターを含む。別の関連の態様では前述の送達ベクターはペプチドワクチン送達ベクターを含む。別の関連の態様では前述の送達ベクターはＤＮＡワクチン送達ベクターを含む。

１つの実施形態において、個別免疫療法を生成するための方法であって、以下の工程を含む、前述の方法：
前述の疾患または症状を有する対象より疾患担持生体試料を獲得する工程、
前述の疾患担持試料より核酸を抽出する工程、
工程（ａ）の前述の対象または同じ種の異なる個体より健常生体試料を獲得する工程、
前述の健常試料より核酸を抽出する工程、
工程（ｂ）と工程（ｄ）の抽出された核酸をシーケンシングする工程、
前述の疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を前述の健常生体試料より抽出された核酸配列内のオープン・リーディング・フレームと比較し、及び前述の疾患担持資料の前述のＯＲＦ内の突然変異核酸配列を特定するこ工程であって、前述のＯＲＦは、１つ以上のネオエピトープを含有するペプチドをコードしており、
前述の疾患担持試料の前述のＯＲＦ内の突然変異配列を特定する工程であって、前述のＯＲＦは、１つ以上のネオエピトープを含むペプチドをコードしており、
限定されないが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シーケンシング、またはホールエクソームシーケンシングを含む当技術分野においてよく知られている方法を用いて前述のネオエピトープが特定される前述の工程、
前述の特定済み変異核酸配列を含む前述の１つ以上のペプチドを発現させる工程、
免疫原性Ｔ細胞応答の存在がＴ細胞エピトープを含む１つ以上のネオエピトープの存在と相関する、その免疫原性Ｔ細胞応答について前述の１つ以上のネオエピトープを含む各ペプチドをスクリーニングする工程、
Ｔ細胞エピトープである１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上の免疫原性ペプチドをコードする核酸配列を特定および選択し、前述の配列を備えるプラスミドベクターで弱毒化リステリア株を形質転換する工程、
前述の１つ以上の免疫原性ペプチドの発現と分泌を確認するために前述の弱毒化リステリア株を培養し、その特徴を分析する工程、および
所定の時点で前述の対象に投与するために前記弱毒化リステリアを保存するか、または免疫原性組成物の一部として投与される前述の弱毒化リステリア株を前述の対象に投与する工程を含む前述の方法が提供される。

別の実施形態では前述の対象より第２生体試料を獲得する工程は、前述の弱毒化組換え型リステリア株を含む前述の第２組成物の投与の後に増殖するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を含む生体試料を獲得することを含む。

別の実施形態では前述のＴ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子が結合する１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む特定のペプチドの特徴を分析する工程は、
前述の疾患に対して応答するＴ細胞クローンまたはＴ浸潤細胞を特定し、単離し、且つ、増殖させる工程、
前述のＴ細胞上のＴ細胞受容体が結合する特定のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子上に負荷された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定する工程を含む。

別の実施形態では特定のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子上に負荷された１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドをスクリーニングし、且つ、特定する工程は、前述のＴ細胞を前述の１つ以上のペプチドと接触させることを含む。別の実施形態では前述のスクリーニングおよび特定工程は、Ｔ細胞受容体シーケンシング、マルチプレックスベースフローサイトメトリー、または高速液体クロマトグラフィーを実施してペプチド特異性を決定することを含む。当業者は、Ｔ細胞受容体に結合するペプチドを決定する方法が当技術分野においてよく知られていることを充分に理解する。

１つの実施形態において、本明細書に開示される個別免疫療法を生成するシステムまたは方法における比較工程は、スクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールの使用、および前述の疾患担持生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を前述の健常生体試料より抽出された核酸配列内のオープン・リーディング・フレームと比較し、及び前述の疾患担持試料の前述のＯＲＦであって、１つ以上のネオエピトープを含むペプチドをコードする、またはそれらのペプチド内に含有される前述のＯＲＦ内の突然変異核酸配列を特定するための関連デジタルソフトウェアの使用を含む。別の実施形態において、その関連デジタルソフトウェアは、Ｔ細胞エピトープまたは免疫原性の可能性またはそれらのあらゆる組合せの特定のために前述のＯＲＦ内の前述の疾患担持核酸配列のスクリーニング、または１つ以上のネオエピトープを含む前述のペプチドをコードするデジタル翻訳された対応するアミノ酸配列のスクリーニングを可能にする配列データベースへのアクセスを含む。

１つの実施形態において、提供される個別化免疫療法を生成するための前述のシステムまたは方法における免疫原性Ｔ細胞応答のスクリーニング工程は、例えばＴ細胞増殖アッセイ、前述のネオエピトープで活性化され、及び腫瘍細胞と共培養されたＴ細胞と、^５１Ｃｒ放出アッセイまたは^３Ｈチミジンアッセイを使用するｉｎｖｉｔｒｏ腫瘍退行アッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＥＬＩｓｐｏｔアッセイ、およびＦＡＣＳ分析をはじめとする当技術分野において公知の免疫応答アッセイの使用を含む。（例えば、その全体が本明細書に援用される米国特許第８，７７１，７０２号明細書を参照されたい）。

１つの実施形態において、本発明は、以下を含む、組み換え型弱毒化リステリア株に関する：
核酸分子であって、融合ポリペプチドをコードする第１のオープン・リーディング・フレームを含有し、ここで前述の融合ポリペプチドは、本明細書に開示される１つ以上のネオエピトープを含有する１つ以上のペプチドに融合された免疫原性ポリペプチドまたはその断片を含む、前述の核酸分子、又は
キメラタンパク質をコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含むミニ遺伝子核酸コンストラクトであって、前述のキメラタンパク質は、
細菌分泌シグナル配列、
ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、
本明細書において開示される１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドを含む、前述のコンストラクトであって、
（ａ）〜（ｃ）の前述のシグナル配列、前述のユビキチン、および前述の１つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと機能的であるように連結されているか、または直列に配置されている、組み換え型弱毒化リステリア株。

別の実施形態において、前述の細菌性配列はリステリアの列であり、一部施形態においては、前述のリステリアの配列は、ｈｌｙシグナル配列またはａｃｔＡシグナル配列である。

別の実施形態では前述の疾患は局所性疾患である。別の実施形態では前述の疾患は腫瘍または癌である。別の実施形態ではその腫瘍または癌は固形腫瘍または固形癌である。別の実施形態ではその腫瘍または癌は液性腫瘍または液性癌である。別の実施形態では異常生体試料または非健常生体試料は腫瘍、または癌、またはそれらの一部分を含む。

１つの実施形態では前述の疾患は感染症である。別の実施形態ではその感染症は感染性ウイルス病または感染性細菌病である。別の実施形態において、本明細書において開示される前述の方法により特定されるネオエピトープは、感染症関連特異的エピトープである。

別の実施形態ではネオエピトープは特有の腫瘍または癌ネオエピトープを含む。別の実施形態ではネオエピトープは癌特異的または腫瘍特異的エピトープを含む。別の実施形態ではネオエピトープは免疫原性である。別の実施形態ではネオエピトープはＴ細胞によって認識される。別の実施形態では１つ以上のネオエピトープを含むペプチドは、腫瘍または癌に対するＴ細胞応答であって、前述の対象に対して個別化されている前述の応答を活性化する。

別の実施形態ではネオエピトープは特有の腫瘍または癌ネオエピトープを含む。別の実施形態ではネオエピトープは感染症に関連する特有のエピトープを含む。１つの実施形態ではその感染症エピトープは前述の疾患と直接的に相関する。交互の実施形態ではその感染症エピトープは前述の感染症と関連する。

別の実施形態において、本明細書において開示される前述の方法により、疾患を有する前述の対象において、抗疾患性、すなわち、抗感染症性、または抗感染性疾患性、または抗腫瘍性の免疫応答の個別化増強の生成が可能になる。別の実施形態において、本明細書において開示される前述の方法により、対象における前述の疾患、すなわち、前述の感染もしくは感染性疾患、または前述の腫瘍もしくは癌の個別化治療または予防が可能になる。別の実施形態において、本明細書において開示される前述の方法により、前述の疾患、すなわち、前述の感染もしくは感染性疾患、または前述の腫瘍もしくは癌を有する前述の対象の生存時間が増加する。

１つの実施形態において、本明細書に開示される組換え型リステリア株、及び薬学的に許容可能な担体を含む免疫原性組成物が提供される。別の実施形態において、本明細書において、１つ以上の組み換え型リステリア株を含有する１つ以上の免疫原性組成物が開示され、ここで各リステリア株は、１つ以上の異なるネオエピトープを含む１つ以上の異なるペプチドを発現する。別の実施形態において、各リステリアは、ある範囲のネオエピトープを発現する。別の実施形態では各ペプチドはＴ細胞エピトープである１つ以上のネオエピトープを含む。１つの実施形態において、対象において標的とされる個別化抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発する方法が本明細書に開示され、前述の方法は、本明細書に開示される組換え型リステリア株を含有する免疫原性組成物の有効量を対象に投与する工程を含み、ここで前述のリステリア株は、１つ以上のネオエピトープを発現する。別の実施形態において、リステリア株は以下のうちの１つを含む：融合ポリペプチドをコードする第１のオープン・リーディング・フレームを含有する核酸分子であって、前述の融合ポリペプチドは、癌疾患に関連する１つ以上のネオエピトープを含むペプチドに融合している免疫原性ポリペプチドまたはその断片を含む、前述の核酸分子；またはキメラタンパク質をコードする第１のオープン・リーディング・フレームを含むミニ遺伝子核酸コンストラクトであって、前述のキメラタンパク質は、リステリア分泌シグナル配列、ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、および腫瘍または癌に関連する１つ以上のネオエピトープをそれぞれ含む１つ以上のペプチドを含み、ここで前述のシグナル配列、前述のユビキチン、および前述の１つ以上のペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端へとそれぞれ直列に配置されているか、または機能可能であるように連結されている前述の核酸コンストラクト。

別の実施形態では前述の融合ペプチドはＨＩＳタグまたはＳＩＩＮＦＥＫＬタグにさらに連結されている。当業者は、それらのタグの配列が前述のプラスミドベクターまたはファージベクター上の融合ペプチド配列に組み込まれる場合があることを理解する。これらのタグが発現し、臨床医がこれらの「タグ」配列ペプチドに対する免疫応答を追跡することにより、分泌されたペプチドの免疫原性を追跡することを可能にする抗原性エピトープが提示される場合がある。そのような免疫応答は、限定されないが、これらのタグに対して特異的なモノクローナル抗体およびＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブをはじめとする多数の試薬を使用してモニターされ得る。

別の実施形態において、本発明の方法は、対象の脾臓および腫瘍内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＴエフェクター細胞の比率を上昇させるものであり、ここで前述のＴエフェクター細胞は、対象の異常組織または非健常組織、例えば腫瘍組織または癌の内部に存在するネオエピトープを標的とするものであり、前述の方法は、本明細書に開示される組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前述の対象に投与する工程を含む。

別の実施形態において、本発明方法は、対象において抗原特異的Ｔ細胞を増加させるための方法であり、ここで前述の抗原またはそのペプチド断片は１つ以上のネオエピトープを含み、前述の方法は、本明細書に開示される組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前述の対象に投与する工程を含む。

別の実施形態において、本発明方法は、腫瘍を有するか、または癌を患う対象、または感染症を患う対象の生存時間を増加させるための方法であり、前述の方法は、本明細書に開示される組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前述の対象に投与する工程を含む。

別の実施形態において、本発明の方法は、対象における腫瘍または癌または感染または感染性疾患を治療することであって、前述の方法は、本明細書に開示される組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物を前述の対象に投与する工程を含む。

Ｉ．免疫療法の個別化
１つの実施形態では本発明の方法により個別免疫療法が作成される。別の実施形態では疾患または症状を有する対象向けの個別免疫療法の作成方法は、前述の患者の疾患に特異的である変異および異型抗原（新抗原）内のネオエピトープを特定および選択することを含む。別の実施形態では対象向けの個別免疫療法の作成方法は前述の対象への治療を提供するためにある。別の実施形態では個別免疫療法は、癌、自己免疫疾患、臓器移植拒絶反応、細菌感染症、ウイルス感染症、およびＨＩＶなどの慢性ウイルス病のような疾患を治療するために用いられ得る。

１つの実施形態では個別免疫療法の作成方法の一工程は疾患または症状を有する対象より異常生体試料または非健常生体試料を獲得することである。本明細書において使用される場合、「異常生体試料または非健常生体試料」という用語は「疾患担持生体試料」または「疾患担持試料」と互換的に使用され、全て同じ意味と質を有する。１つの実施形態では生体試料は組織、細胞、血液、リンパ球を含む対象から得られるあらゆる試料、疾患担持細胞を含む対象から得られるあらゆる試料、または対象から得られる健常であるが、同じ対象もしくは類似の個体から得られる疾患担持試料にも匹敵するあらゆる試料である。

１つの実施形態では異常生体試料または非健常生体試料は腫瘍組織または癌組織またはそれらの一部分を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は固形腫瘍であり得る。別の実施形態では腫瘍または癌は固形腫瘍または固形癌、例えば血液癌または腫瘍が生じない乳癌ではない。

別の実施形態では腫瘍試料は、腫瘍細胞または癌細胞を含有する患者、または腫瘍細胞または癌細胞を含有することが疑われる患者に由来する生体試料などのあらゆる試料に関する。その生体試料は血液、原発腫瘍から得られる組織試料、または腫瘍転移癌、もしくは腫瘍細胞もしくは癌細胞を含有する他のあらゆる試料から得られる組織試料などのあらゆる組織試料であり得る。さらに別の実施形態では生体試料は血液、唾液に由来する細胞、または脳脊髄液に由来する細胞である。別の実施形態では腫瘍試料は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの１つ以上の単離腫瘍細胞または癌細胞、または循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの１つ以上の単離腫瘍細胞もしくは癌細胞を含む試料に関する。別の実施形態では腫瘍または癌は乳癌または乳房腫瘍を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は子宮頚部癌または子宮頚部腫瘍を含む。別の実施形態では腫瘍または癌はＨｅｒ２含有腫瘍またはＨｅｒ２含有癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は黒色腫の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は膵臓腫瘍または膵臓癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は卵巣腫瘍または卵巣癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は胃腫瘍または胃癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は膵臓の癌病巣を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は肺性腺癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は多形神経膠芽腫の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は大腸腺癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は肺扁平腺癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は胃腺癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は卵巣表面上皮性新生物（例えばその良性、増殖性、または悪性の変種）の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は口腔扁平上皮癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は肺非小細胞癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は子宮内膜癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は膀胱腫瘍または膀胱癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は頭頚部腫瘍または頭頚部癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は前立腺癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は胃腺癌の腫瘍または癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は口腔咽頭腫瘍または口腔咽頭癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は肺腫瘍または肺癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は肛門腫瘍または肛門癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は大腸腫瘍または大腸癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は食道腫瘍または食道癌を含む。別の実施形態では腫瘍または癌は中皮腫の腫瘍または癌を含む。

別の実施形態では異常生体試料または非健常生体試料は非腫瘍組織または癌組織を含む。別の実施形態では異常生体試料または非健常生体試料は血液試料から単離された細胞、唾液に由来する細胞、または脳脊髄液に由来する細胞を含む。別の実施形態では異常生体試料または非健常生体試料は異常または非健常であると考えられるあらゆる組織またはその部分の試料を含む。

１つの実施形態において、本明細書に開示される前述の方法に従う分析のために、疾患担持生体試料を獲得することができる感染症をはじめとする他の非腫瘍性疾患または非癌性疾患が、本明細書開示内容に包含される。別の実施形態では感染症はウイルス感染症を含む。別の実施形態では感染症は慢性ウイルス感染症を含む。別の実施形態では感染症はＨＩＶなどの慢性ウイルス病を含む。別の実施形態では感染症は細菌感染症を含む。別の実施形態では前述の感染症は寄生虫感染症である。

１つの実施形態において、感染性疾患は、以下の病原体のいずれか１つによって発生するものであるが、これらに限定されない。リーシュマニア、赤痢アメーバ（アメーバ症を発生する）、鞭虫属、ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、経口ポリオワクチン、一価、二価、および三価、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）、および他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シェードマレイ、コクシエラ・バーネティー（Ｑ熱）、ブルセラ種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シタッシ（オウム病）、リシン毒素（リシナス・コンムニス由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア食品由来および水由来の病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎、西ナイルウイルス、ラクロス、カリフォルニア脳炎、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、コロナウイルスに関連付けられた重症急性呼吸器症候（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性腟症、トラコーマクラミジア、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、腟トリコモナス、または本明細書に列挙されていない当分野で既知の任意の他の感染性疾患。

１つの実施形態では病原性原生動物および蠕虫による感染症にアメーバ症、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、トキソプラズマ症、ニューモシスティス・カリニ、バベシア症、ランブル鞭毛虫症、旋毛虫病、フィラリア症、住血吸虫症、線虫症、吸虫症、または肝蛭症、および条虫（サナダムシ）症が挙げられる。

別の実施形態では前述の感染症は家畜の感染症である。別の実施形態では家畜の疾患は、人間に伝染する可能性があり、「人獣共通感染症」と呼ばれる。別の実施形態ではこれらの疾患に口蹄疫、西ナイルウイルス、狂犬病、イヌパルボウイルス、ネコ白血病ウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ウシ感染性鼻気管炎（ＩＢＲ）、仮性狂犬病、ブタコレラ（ＣＳＦ）、牛の１型ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ−１）感染によって生じるＩＢＲ、および豚の仮性狂犬病（オーエスキー病）、トキソプラズマ症、炭疽病、水疱性口内炎ウイルス、ロドコッカス・エクイ、野兎病、ペスト（エルシニア・ペスチス）、トリコモナスが挙げられるがこれらに限定されない。

１つの実施形態では、本明細書に開示される前述の方法に従う分析のために疾患担持生体試料を取得することができる自己免疫疾患をはじめとする他の非腫瘍性疾患または非癌性疾患が本発明開示内容に包含される。当業者は、「自己免疫疾患」という用語が個体自身の組織、器官に対する免疫反応、またはその出現より生じる疾患または症状、またはその結果の状態を指すことを理解する。本明細書において使用される場合、「自己免疫疾患」という用語には診断学において自己組織を指向する抗体が必ずしも癌および他の疾患の状態に関与していないが、それでもなお重要であるその疾患の状態が含まれる。さらに、１つの実施形態ではその用語は、正常身体組織および正常な抗原と反応する抗体に関わるＢ細胞による自己抗体の産生により生じる、またはその自己抗体の産生により悪化する症状を指す。他の実施形態では自己免疫疾患は、自己抗原（例えば核抗原）に由来するエピトープに特異的である自己抗体の分泌を伴う疾患である。

１つの実施形態では、自己免疫疾患を有する対象を治療しようとする努力の中で本発明は、自己反応性ネオエピトープを特定する系および方法であって、抗体または免疫抑制細胞、例えばＴｒｅｇまたはＭＤＳＣが介在する寛容を誘導するためにこれらの自己反応性ネオエピトープに対して自己免疫疾患を有する対象を免疫する方法を含む前述の系または方法を含む。

１つの実施形態では自己免疫疾患は全身性自己免疫疾患を含む。「全身性自己免疫疾患」という用語は１つより多くの器官に影響する自己免疫反応が原因の疾患、障害、または一群の症状を指す。別の実施形態では全身性自己免疫疾患には抗ＧＢＭ腎炎（グッドパスチャー病）、多発性血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）、顕微鏡的多発性血管炎（ＭＰＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性筋炎（ＰＭ）またはセリアック病が含まれるがこれらに限定されない。

１つの実施形態では自己免疫疾患は結合組織疾患を含む。「結合組織疾患」という用語は身体の結合組織に影響する自己免疫反応が原因の疾患、病気、または一群の症状を指す。別の実施形態では結合組織疾患には全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性筋炎（ＰＭ）、全身性硬化症または混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）が含まれるがこれらに限定されない。

１つの実施形態では、本明細書に開示される前述の方法に従う分析のために疾患担持生体試料を獲得することができる臓器移植拒絶反応をはじめとする他の非腫瘍性疾患または非癌性疾患が本開示内容に包含される。別の実施形態では拒絶される器官は、限定されないが、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、腸、胃、精巣、角膜、皮膚、心臓弁、血管、または骨をはじめとする固形器官である。別の実施形態では拒絶される器官には血液組織、骨髄、またはランゲルハンス島細胞が含まれるがこれらに限定されない。

１つの実施形態では、移植された器官の拒絶を有する移植対象、または移植片宿主病（ＧＶｈＤ）を経験している移植対象を治療しようとする努力の中で本発明は、自己反応性ネオエピトープを特定する系および方法であって、抗体または免疫抑制細胞、例えばＴｒｅｇまたはＭＤＳＣが介在する寛容を誘導するためにこれらの自己反応性ネオエピトープに対して自己免疫疾患を有する対象を免疫する方法を含む前述の系または方法を含む。

試料は当技術分野においてよく知られている日常的な生検技法を用いて獲得され得る。生検は医療専門家、例えば病理医による対象からの細胞または組織の摘出を含み得る。多種多様なタイプの生検技法がある。最も一般的なタイプには（１）組織試料だけが摘出される切開生検、（２）一塊の領域または疑わしい領域が摘出される切除生検、および（３）組織試料または液体試料が針で摘出される針生検が含まれる。太い針を使用するとき、その技法はコア生検と呼ばれる。細い針を使用するとき、その技法は細針生検と呼ばれる。

１つの実施形態では本発明の試料は切開生検によって獲得される。別の実施形態では試料は切除生検によって取得される。別の実施形態では試料は針生検を用いて獲得される。別の実施形態では針生検はコア生検である。別の実施形態では生検は細針吸引生検である。別の実施形態では試料は血液試料の一部から獲得される。別の実施形態では試料は頬スワブの一部として獲得される。別の実施形態では試料は唾液試料採取の一部として獲得される。別の実施形態では生体試料は組織生検材料の全部または一部を含む。別の実施形態では組織生検材料が採取され、その組織試料に由来する細胞であって、本発明の生体試料を含む前述の細胞が収集される。別の実施形態では本発明の試料は細胞生検材料の一部として獲得される。別の実施形態では同じ対象から複数の生検材料が採取され得る。別の実施形態では同じ組織または細胞から同じ対象に由来する複数の生検材料が収集され得る。別の実施形態では前述の対象内の異なる組織の細胞源から同じ対象に由来する複数の生検材料が収集され得る。

１つの実施形態では生検材料は骨髄組織を含む。別の実施形態では生検材料は血液資料を含む。別の実施形態では生検材料は胃腸組織、例えば食道、胃、十二指腸、直腸、結腸、および末端回腸の生検材料を含む。別の実施形態では生検材料は肺組織を含む。別の実施形態では生検材料は前立腺組織を含む。別の実施形態では生検材料は肝臓組織を含む。別の実施形態では生検材料は神経系組織、例えば脳生検材料、神経生検材料、または髄膜生検材料を含む。別の実施形態では生検材料は泌尿生殖器組織、例えば腎臓生検材料、子宮内膜生検材料、または子宮頸部錐体生検材料を含む。別の実施形態では生検材料は乳房生検材料を含む。別の実施形態では生検材料はリンパ節生検材料を含む。別の実施形態では生検材料は筋肉生検材料を含む。さらに別の実施形態では生検材料は皮膚生検材料を含む。別の実施形態では生検材料は骨生検材料を含む。別の実施形態では疾患組織の診断を確認するために各試料についての疾患担持試料病理検査が行われる。別の実施形態では健常組織の診断を確認するために健常試料が検査される。

１つの実施形態では正常生体試料または健常生体試料が前述の対象から獲得される。別の実施形態ではその正常生体試料または健常生体試料は、対象に由来する例えば生体試料などのあらゆる試料に関連する非腫瘍性試料である。その試料は本明細書に開示される生体試料から取得される例えば健常細胞などのあらゆる組織試料であり得る。別の実施形態ではその正常生体試料または健常生体試料は、１つの実施形態では関連の個体である別の個体から獲得される。別の実施形態では別の個体は前述の対象と同じ種の個体である。別の実施形態では別の個体は、疾患担持生体試料を含有していない、または疾患担持生体試料を含有することが疑われていない健康な個体である。別の実施形態では別の個体は、腫瘍細胞または癌細胞を含有しない、または腫瘍細胞もしくは癌細胞を含有することが疑われていない健康な個体である。当業者は、その個体が健康であることを判定するために疾患の存在についての当技術分野において知られている方法を用いてその健康な個体がスクリーニングされ得ることを理解する。

別の実施形態ではその正常生体試料または健常生体試料は同時に取得される。「正常生体試料または健常生体試料」および「基準試料」または「基準組織」という用語は全体を通して互換的に使用され、全て同じ意味と質を有する。別の実施形態では「基準」は、腫瘍標本より得られた結果との相互関係を示し、且つ、腫瘍標本より得られた結果を比較するために使用され得る。別の実施形態では「基準」は、同じ種の充分に多数の正常標本を検査することにより経験的に決定され得る。別の実施形態ではその正常生体試料または健常生体試料は、異常試料または健常試料を獲得する前、またはその後にその正常試料または健常試料が獲得されるような時間であり得る異なる時点で獲得される。獲得方法は生検または採血について当技術分野において日常的に用いられている方法を含む。別の実施形態では試料は凍結試料である。別の実施形態では試料は組織パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織ブロックとして構成される。

１つの実施形態では前述の正常生体試料または健常生体試料の獲得の後に前述の試料は、当技術分野においてよく知られている技術および方法を用いて核酸抽出のために加工される。別の実施形態では抽出された核酸はＤＮＡを含む。別の実施形態では抽出された核酸はＲＮＡを含む。別の実施形態ではＲＮＡはｍＲＮＡである。別の実施形態では次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ライブラリーが調製される。次世代シーケンシングライブラリーが構築されてよく、次世代シーケンシングライブラリーがエクソームキャプチャまたは標的遺伝子キャプチャを行ってよい。別の実施形態では当技術分野において知られている技術を用いてｃＤＮＡ発現ライブラリーが作製される。例えば、ここに完全に援用される米国特許出願公開第２０１４０１４１９９２号明細書を参照されたい。

個別免疫療法を作成するための本発明の方法は、正常または健常試料と比べて異常試料または非健常試料に存在する体細胞突然変異または配列差異であって、発現されるアミノ酸をコードするこれらの配列にある前述の体細胞突然変異または前述の差異を特定するためにその異常試料または非健常試料に由来する抽出核酸とその正常試料または健常基準試料に由来する抽出核酸の使用を含み得る。１つの実施形態では前述の体細胞突然変異または配列差異を発現するペプチドは、特定の実施形態では全体を通して「ネオエピトープ」と呼称され得る。

当業者は、「ネオエピトープ」という用語が基準試料、例えば正常非癌性細胞もしくは組織または生殖系列細胞もしくは組織などには存在しないが疾患担持組織、例えば癌細胞には見つかるエピトープも意味し得ることを理解する。別の実施形態では、これには正常非癌細胞または生殖系列細胞において対応するエピトープが見つかるが、しかしながら癌細胞では１つ以上の突然変異に起因してそのエピトープの配列がネオエピトープになるように変化している状況が含まれる。別の実施形態ではネオエピトープは変異型エピトープを含む。別の実施形態ではネオエピトープはそのエピトープの両側に非変異配列を有する。１つの実施形態ではネオエピトープは直鎖状エピトープである。別の実施形態ではネオエピトープは溶媒曝露されると考えられており、したがってＴ細胞抗原受容体にアクセス可能であると考えらえる。

別の実施形態では本明細書に開示される１つ以上のペプチドは１つ以上の免疫抑制性Ｔ調節性ネオエピトープを含まない。別の実施形態では本明細書に開示される前述の方法により特定され、及び使用されるネオエピトープは免疫抑制性エピトープを含まない。別の実施形態では本明細書に開示される前述の方法により特定され、及び使用されるネオエピトープはＴ調節性（Ｔｒｅｇ）細胞を活性化しない。

別の実施形態ではネオエピトープは免疫原性である。別の実施形態ではネオエピトープはＴ細胞エピトープを含む。別の実施形態ではネオエピトープは適応免疫応答エピトープを含む。

別の実施形態ではネオエピトープは単一の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも２か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも２か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも３か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも４か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも５か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも６か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも７か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも８か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも９か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも１０か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは少なくとも２０か所の突然変異を含む。別の実施形態ではネオエピトープは１〜１０か所、１１〜２０か所、２０〜３０か所、および３１〜４０か所の突然変異を含む。

別の実施形態ではネオエピトープは前述の対象の前述の疾患または症状と関連する。別の実施形態ではネオエピトープは前述の対象の前述の疾患または症状を引き起こす。別の実施形態ではネオエピトープは前述の疾患担持生体試料内に存在する。別の実施形態ではネオエピトープは前述の疾患担持生体組織内に存在するが、前述の疾患または症状を引き起こさず、または前述の疾患もしくは症状と関係ない。

別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは１個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは２個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは３個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは４個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは５個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは６個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは７個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは８個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは９個のネオエピトープを含む。別の実施形態では本発明のペプチド、ポリペプチド、または融合ペプチドは１０個またはそれより多くのネオエピトープを含む。

１つの実施形態ではネオエピトープの特定工程は、異常生体試料または非健常生体試料より得られた抽出核酸をシーケンシングすること、および正常生体基準試料または健常生体基準試料より得られた抽出核酸をシーケンシングすることを含む。別の実施形態では全ゲノムがシーケンシングされる。別の実施形態ではエクソームがシーケンシングされる。さらに別の実施形態ではトランスクリプトームがシーケンシングされる。別の実施形態ではＴ細胞受容体シーケンシングを使用してネオエピトープが特定される。

別の実施形態ではネオエピトープは以下、すなわち、ＰａｖｌｅｎｋｏＭ，ＬｅｄｅｒＣ，ＲｏｏｓＡＫ，ＬｅｖｉｔｓｋｙＶ，ＰｉｓａＰ．（２００５）ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔＨ−２Ｄ（ｂ）−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄＣＴＬｅｐｉｔｏｐｅｏｆｈｕｍａｎＰＳＡ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ．１５；６４（１）：５０−９（ＰＳＡネオエピトープ）、ＭａｃｉａｇＰＣ，ＳｅａｖｅｙＭＭ，ＰａｎＺＫ，ＦｅｒｒｏｎｅＳ，ＰａｔｅｒｓｏｎＹ．（２００８）Ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｈｅｈｉｇｈｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｐｒｏｔｅｉｎｒｅｓｕｌｔｓｉｎａｂｒｏａｄａｎｔｉｔｕｍｏｒｒｅｓｐｏｎｓｅａｎｄｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐｅｒｉｃｙｔｅｓｉｎｔｈｅｔｕｍｏｒｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１；６８（１９）：８０６６−７５（ＨＬＡ−Ａ２マウスのＨＭＷ−ＭＡＡエピトープ）、ＺｈａｎｇＫＱ，ＹａｎｇＦ，ＹｅＪ，ＪｉａｎｇＭ，ＬｉｕＹ，ＪｉｎＦＳ，ＷｕＹＺ．（２０１２）ＡｎｏｖｅｌＤＮＡ／ｐｅｐｔｉｄｅｃｏｍｂｉｎｅｄｖａｃｃｉｎｅｉｎｄｕｃｅｓＰＳＣＡ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓａｎｄｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ．Ｕｒｏｌｏｇｙ．；７９（６）：１４１０．ｅ７−１３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｕｒｏｌｏｇｙ．２０１２．０２．０１１．Ｅｐｕｂ２０１２Ａｐｒ１７（ＨＬＡ−Ａ２ｅｐｉｔｏｐｅＰＳＣＡ）；ＫｏｕｉａｖｓｋａｉａＤＶ，ＢｅｒａｒｄＣＡ，ＤａｔｅｎａＥ，ＨｕｓｓａｉｎＡ，ＤａｗｓｏｎＮ，ＫｌｙｕｓｈｎｅｎｋｏｖａＥＮ，ＡｌｅｘａｎｄｅｒＲＢ．（２００９）ＶａｃｃｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈａｇｏｎｉｓｔｐｅｐｔｉｄｅＰＳＡ：１５４−１６３（１５５Ｌ）ｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｐｒｏｓｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎｉｎｄｕｃｅｄＣＤ８Ｔ−ｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｔｈｅｎａｔｉｖｅｐｅｐｔｉｄｅＰＳＡ：１５４−１６３ｂｕｔｆａｉｌｅｄｔｏｉｎｄｕｃｅｔｈｅｒｅａｃｔｉｖｉｔｙａｇａｉｎｓｔｔｕｍｏｒｔａｒｇｅｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＰＳＡ：ａｐｈａｓｅ２ｓｔｕｄｙｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｒｅｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ．ＪＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．；３２（６）：６５５−６６（ＨＬＡ−Ａ２エピトープＰＳＡ）において開示される、当技術分野において知られているネオエピトープを含む。

１つの実施形態において、「ゲノム」という用語は生物の染色体中の遺伝情報の総量に関するものである。別の実施形態において、「エクソーム」という用語はゲノムのコード領域を指す。別の実施形態において、「トランスクリプトーム」という用語は全ＲＮＡ分子のセットに関するものである。

１つの実施形態によると核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり、より好ましくはＲＮＡであり、最も好ましくはインビトロ転写されたＲＮＡ（ΓνＲＮＡ）または合成ＲＮＡである。本発明によると核酸にはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え技術により生産された分子、および化学合成された分子が含まれる。別の実施形態では核酸は一本鎖または二本鎖の直鎖状または共有結合により閉環した分子として存在し得る。別の実施形態では核酸は単離されたものでよい。本発明によると「単離核酸」という用語は、その核酸が（ｉ）インビトロで、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して増幅され、（ｉｉ）クローニングにより組換え技術で生産され、（ｉｉｉ）例えば、切断とゲル電気泳動による分離により精製され、または（ｉｖ）例えば、化学合成により合成されたことを意味する。核酸は、特に鋳型ＤＮＡからのインビトロ転写により調製することができるＲＮＡの形態で細胞への導入、すなわち、細胞の形質移入に使用され得る。また、ＲＮＡは使用前に配列の安定化、キャッピング、およびポリアデニル化により修飾され得る。

当業者であれば、「突然変異」という用語は基準配列と比較した前述の核酸配列の変化または差異（ヌクレオチド置換、付加、または欠失）を包含し得ることを理解するであろう。例えば、異常試料中に存在する変化または差異は正常試料には見られない。「体細胞突然変異」は生殖細胞（精子および卵）を除く体の細胞のいずれにおいても起こる可能性があり、したがって子供には受け渡されない。これらの変化は（常にというわけではないが）癌または他の疾患の原因となり得る。１つの実施形態では突然変異は非同義突然変異である。「非同義突然変異」という用語は翻訳産物中のアミノ酸置換などのアミノ酸変化を引き起こす突然変異、好ましくはヌクレオチド置換を指す。

異常試料が腫瘍または癌組織である場合、１つの実施形態では突然変異は「癌突然変異シグネチャ」を含むことがあり得る。「癌突然変異シグネチャ」という用語は、非癌性基準細胞と比較すると癌細胞中に存在する突然変異のセットを指す。

デジタル核型分析は遺伝病の原因となり得るあらゆる大きな染色体異常を見つけるために染色体分析に用いられる技術である。１つの実施形態ではデジタル核型分析を用いてシーケンシングおよび比較分析される染色体領域に焦点を合わせることができる。別の実施形態ではデジタル核型分析は、ゲノム全体の特定の座位に由来する、単離され、且つ、列挙されている短いＤＮＡ配列を分析して仮想的に実施される。

あらゆる適切なシーケンシング法を本発明に従って用いることができる。１つの実施形態では次世代シーケンシング（ＮＧＳ）テクノロジーが用いられる。本方法のシーケンシング工程にかかる時間を短くするために将来的に第三世代のシーケンシング法がＮＧＳテクノロジーの代わりになる可能性がある。明確化を目的として、本開示内容と関連した場合の「次世代シーケンシング」または「ＮＧＳ」という用語は、サンガー化学として知られる「コンベンショナル」シーケンシング法とは対照的に、全ゲノムを小片に切断することにより、全ゲノムに沿ってランダムに鋳型核酸を並行して読む全ての新規ハイスループットシーケンシング技術を意味する。そのようなＮＧＳ技術（大規模並行シーケンシング技術としても知られる）は全ゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム（ゲノムの全転写配列）またはメチローム（ゲノムの全メチル化配列）の核酸配列情報を非常に短い時間で、例えば、約１〜２週間以内、好ましくは約１〜７日以内、または最も好ましくは２４時間未満以内に配信することができ、及び原理的には一細胞のシーケンシング法を可能にする。商業的に利用可能である、または文献中で言及されている複数のＮＧＳプラットフォームが本開示内容で使用することができ、例えば、Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．２０１１：Ｔｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｎｅｘｔ− ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｎｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｊ．ＧｅｎｅｔＧｅｎｏｍｉｃｓ３８（３），９５−１０９、またはＶｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇｅｔａｌ．２００９：Ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｆｒｏｍｂａｓｉｃｒｅｓｅａｒｃｈｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５５，６４１−６５８に詳しく記載されている。そのようなＮＧＳテクノロジー／プラットフォームの非限定的な例には以下のものが含まれる。

１）例えば最初にＲｏｎａｇｈｉｅｔａｌ．１９９８：Ａｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｍｅｔｈｏｄｂａｓｅｄｏｎｒｅａｌ−ｔｉｍｅｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ’’．Ｓｃｉｅｎｃｅ２８１（５３７５），３６３−３６５において記載されたＲｏｃｈｅの関連会社である４５４ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ（コネチカット州ブランフォード）のＧＳ−ＦＬＸ４５４ゲノムシーケンサー（商標）において実装されたパイロシーケンシングとして知られるシーケンシング・バイ・シンセシステクノロジー。この技術は、一本鎖ＤＮＡ結合ビーズが激しいボルテックス混合により油によって周囲を覆われたＰＣＲ反応物を含有するエマルジョンＰＣＲ増幅用の水性ミセルに封入されているエマルジョンＰＣＲを用いる。パイロシーケンシング工程の時、ポリメラーゼがＤＮＡ鎖を合成するときのヌクレオチドの取り込み時にリン酸分子から発せられる光が記録される。

２）可逆的ダイターミネーターに基づき、例えばＩｌｌｕｍｉｎａＳｏｌｅｘａＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒ（商標）およびＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２０００ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒ（商標）において実施されるＳｏｌｅｘａ（現在ではカリフォルニア州サンディエゴのＩｌｌｕｍｉｎａＩｎｃ．の一部）により開発されたシーケンシング・バイ・シンセシスアプローチ。この技術では４種類全てのヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼと共にフローセルチャネル中のオリゴプライマーがアニールされたクラスター断片に同時に加えられる。ブリッジ増幅によりシーケンシング用の４種類全ての蛍光標識ヌクレオチドでクラスター鎖が伸長する。

３）例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（現在ではＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）のＳＯＬｉｄ（商標）プラットフォームにおいて実施されるシーケンシング・バイ・ライゲーションアプローチ。この技術では固定された長さの一群の全ての可能なオリゴヌクレオチドがシーケンシングされる位置に応じて標識される。オリゴヌクレオチドがアニールされ、且つ、ライゲーションされる。マッチする配列に対してのＤＮＡリガーゼによる優先的なライゲーションによりその位置のヌクレオチド情報を知らせるシグナルが生じる。シーケンシングの前にＤＮＡはエマルジョンＰＣＲにより増幅される。同一のＤＮＡ分子のコピーだけをそれぞれ含有するそれにより生じたビーズがスライドグラス上に配置される。二つ目の例として、ＤｏｖｅｒＳｙｓｔｅｍｓ（ニューハンプシャー州セイラム）のＰｏｌｏｎａｔｏｒ（商標）Ｇ．００７プラットフォームも、並行シーケンシング用にＤＮＡ断片を増幅するためにランダムアレイ化ビーズベースエマルションＰＣＲを使用することによるシーケンシング・バイ・ライゲーション法を用いている。

４）例えばＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州メンロパーク）のＰａｃＢｉｏＲＳシステムまたはＨｅｌｉｃｏｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）のＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）プラットフォームにおいて実施されるものなどの一分子シーケンシング技術。この技術のはっきりとした特徴は、一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）ＤＮＡシーケンシングとして定義される、増幅することなく単一のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子をシーケンシングするその能力である。例えば、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅは合成するときに各ヌクレオチドを直接的に検出するために非常に高感度の蛍光検出システムを使用している。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく類似アプローチがＶｉｓｉｇｅｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（テキサス州ヒューストン）により開発されている。他の蛍光ベースの一分子技術はＵ．Ｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓの技術（ＧｅｎｅＥｎｇｉｎｅ（商標））とＧｅｎｏｖｏｘｘの技術（ＡｎｙＧｅｎｅ（商標））である。

５）例えば、複製時の一本鎖上のポリメラーゼ分子の移動をモニターするためにチップ上に配置されている様々なナノ構造体を使用する一分子シーケンシング用ナノテクノロジー。ナノテクノロジーに基づくアプローチの非限定的な例はＯｘｆｏｒｄＮａｎｏｐｏｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（英国オックスフォード）のＧｒｉｄＯＮ（商標）プラットフォーム、Ｎａｂｓｙｓ（ロードアイランド州プロビデンス）により開発されたハイブリダイゼーション支援ナノポアシーケンシングプラットフォーム（ＨＡＮＳ（商標））、およびコンビナトリアル・プローブアンカーライゲーション（ｃＰＡＬ（商標））と呼ばれる特許権で保護されたＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）テクノロジーを使用するリガーゼベースＤＮＡシーケンシングプラットフォームである。

６）一分子シーケンシング向け電子顕微鏡法ベースの技術、例えばＬｉｇｈｔＳｐｅｅｄＧｅｎｏｍｉｃｓ（カリフォルニア州サニーベール）およびＨａｌｃｙｏｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ（カリフォルニア州レッドウッドシティ）により開発された一分子シーケンシング向け電子顕微鏡法ベースの技術。

７）ＤＮＡの重合時に放出される水素イオンの検出に基づくイオンセミコンダクターシーケンシング。例えば、ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔＳｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州サンフランシスコ）は．大規模並行的にこの生化学過程を実施するために微細加工ウェルの高密度アレイを使用する。各ウェルは異なる鋳型ＤＮＡを保持する。それらのウェルの下にイオン感受性層があり、その下に特許権で保護されたイオンセンサーがある。

幾つかの実施形態ではＤＮＡ調製物とＲＮＡ調製物がＮＧＳの出発物質として働く。そのような核酸は生体材料などの試料から、例えば新鮮な瞬時凍結腫瘍組織またはホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織（ＦＦＰＥ）から、または新たに単離された細胞から、または患者の末梢血液に存在するＣＴＣから容易に入手され得る。正常非変異型ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを正常な体細胞組織から抽出することができるが、しかしながら本開示内容に関しては生殖系列細胞が好ましい。生殖細胞系列ＤＮＡまたはＲＮＡは非血液系悪性腫瘍を有している患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から抽出される。ＦＦＰＥ組織または新規単離単一細胞より抽出された核酸は非常によく断片化されているが、それらはＮＧＳ用途には適切である。

エクソームシーケンシング向けの幾つかの標的化ＮＧＳ方法が文献中に記載されており（レビューには、例えばＴｅｅｒａｎｄＭｕｌｌｉｋｉｎ２０１０：ＨｕｍａｎＭｏｌＧｅｎｅｔ１９（２），Ｒ１４５−５１参照）、それらの全てを本発明と併用することができる。これらの方法（例えばゲノムキャプチャ、ゲノムパーティショニング、ゲノムエンリッチメント等として記載される）の多くがハイブリダイゼーション技術を使用し、それらにはアレイベースハイブリダイゼーションアプローチ（例えばＨｏｄｇｅｓｅｔａｌ．２００７：Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３９，１５２２−１５２７）およびリキッドベースハイブリダイゼーションアプローチ（例えばＣｈｏｉｅｔａｌ．２００９：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ１０６，１９０９６−１９１０１）が含まれる。ＤＮＡ試料調製とその後のエクソームキャプチャ用の市販のキットも利用可能であり、例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａＩｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ）はＴｒｕＳｅｑ（商標）ＤＮＡ試料調製キットとＥｘｏｍｅ濃縮キットＴｒｕＳｅｑ（商標）ＥｘｏｍｅＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔＫｉｔを提供している。

本開示内容により提示されるように、腫瘍シーケンシングの工程は、患者の生検を含み、変異の特定に２週より長くはかからない。別の実施形態において、腫瘍シーケンシングの工程は、約１〜２週かかる。別の実施形態において、腫瘍シーケンシングの工程は、約１週かかる。別の実施形態において、腫瘍シーケンシングの工程は、１週未満かかる。

本発明の関連において、「ＲＮＡ」という用語は、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全にまたは実質的にリボヌクレオチド残基から構成される分子を指す。「リボヌクレオチド」はβ−Ｄ−リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。「ＲＮＡ」という用語は二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的または完全に精製されたＲＮＡなどの単離ＲＮＡ、基本的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、および１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変化により天然ＲＮＡとは異なる改変型ＲＮＡなどの組換え技術により生成されたＲＮＡを含む。そのような変化はＲＮＡの末端または内部への非ヌクレオチド材料の付加など、非ヌクレオチド材料の付加、例えば、ＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおける非ヌクレオチド材料の付加を含み得る。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドは非天然ヌクレオチドまたは化学合成ヌクレオチド、またはデオキシヌクレオチドなどの非標準的ヌクレオチドを含むこともできる。これらの改変型ＲＮＡを類似体または天然ＲＮＡ類似体と呼ぶことができる。

本発明によると、「ＲＮＡ」という用語は「ｍＲＮＡ」を含み、及び好ましくは「ｍＲＮＡ」に関する。「ｍＲＮＡ」という用語は「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、そして鋳型ＤＮＡを使用して生成され、且つ、ペプチドまたはポリペプチドをコードする「転写物」に関する。典型的には、ｍＲＮＡは５’−ＵＴＲ、タンパク質コード領域、および３’−ＵＴＲを含む。細胞中およびインビトロではｍＲＮＡは限られた半減期しか持たない。本発明の関連において、ｍＲＮＡはＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写により生成され得る。そのインビトロ転写法は当業者に知られている。例えば、市販されている様々なインビトロ転写キットがある。

１つの実施形態ではネオエピトープを特定するために疾患担持試料と健常試料に由来する核酸配列が比較される。ネオエピトープはＯＲＦ配列内にアミノ酸変化を含む。本明細書において使用される場合、ペプチドまたはタンパク質に関しての「配列変化」という用語はアミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体、およびアミノ酸置換変異体を指し、好ましくはアミノ酸置換変異体を指す。本発明によるとこれらの全ての配列変化が新しいエピトープを作製する可能性がある。

１つの実施形態ではアミノ酸挿入変異体は特定のアミノ酸配列中に単一の、または２個、またはそれより多くのアミノ酸の挿入を含む。別の実施形態ではアミノ酸付加変異体は１個以上のアミノ酸、例えば１個、２個、３個、４個、または５個、またはそれより多くのアミノ酸のアミノ末端融合および／またはカルボキシ末端融合を含む。別の実施形態ではアミノ酸欠失変異体は配列からの１個以上のアミノ酸の除去、例えば１個、２個、３個、４個、または５個、またはそれより多くのアミノ酸の除去を特徴とする。別の実施形態ではアミノ酸置換変異体は配列中の少なくとも１つの残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されることを特徴とする。

全ての試料がＯＲＦ内の新規遺伝子シーケンシングについて分析される。前述の疾患担持生体試料と健常生体試料より抽出された核酸配列内の１つ以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を比較するための方法は、スクリーニングアッセイまたはスクリーニングツールおよび関連デジタルソフトウェアの使用を含む。バイオインフォマティクス分析を実施するための方法が当技術分野において知られており、例えば、各々が完全に本出願に援用される米国特許出願公開第２０１３／０２１０６４５号明細書、同第２０１４／００４５８８１号明細書、および国際公開ＷＯ２０１４／０５２７０７号パンフレットを参照されたい。

ヒト腫瘍は顕著な数の体細胞突然変異を保持することが典型的である。しかしそれでも腫瘍を通してどの特定の遺伝子でも同一の突然変異が見つかることはまれである（最も一般的なドライバー突然変異についても低い頻度である）。したがって、１つの実施形態では患者特異的腫瘍突然変異を包括的に特定する本発明の方法により個別免疫療法の標的が提供される。

本開示により提示されるように、配列解析されたデータから抗原を特定する工程は、２週より長くはかからない。別の実施形態において、配列解析されたデータから抗原を特定する工程は、約１〜２週かかる。別の実施形態において、配列解析されたデータから抗原を特定する工程は、約１週かかる。別の実施形態において、配列解析されたデータから抗原を特定する工程は、１週未満かかる。

１つの実施形態では疾患担持試料から特定される突然変異が主要組織適合複合体クラスＩ分子（ＭＨＣＩ）上に提示される場合があり得る。１つの実施形態ではネオエピトープ突然変異を含有するペプチドは免疫原性であり、適応免疫系により「非自己」新抗原として認識される。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列の使用により標的化免疫療法が提供され、その免疫療法は、特定の実施形態では前述の疾患または症状に対するＴ細胞性免疫応答を治療的に活性化し得る。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列の使用により標的化免疫療法が提供され、その免疫療法は特定の実施形態では疾患または症状に対する適応免疫応答を治療的に活性化し得る。

別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列を使用して治療的抗腫瘍Ｔ細胞性免疫応答または抗癌Ｔ細胞性免疫応答が提供される。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列の使用により標的化免疫療法が提供され、その免疫療法は特定の実施形態では抗腫瘍適応免疫応答または抗癌適応免疫応答を治療的に活性化し得る。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列を使用して治療的抗自己免疫疾患Ｔ細胞性免疫応答が提供される。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列の使用により標的化免疫療法が提供され、その免疫療法は特定の実施形態では抗自己免疫疾患適応免疫応答を治療的に活性化し得る。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列を使用して治療的抗感染症Ｔ細胞免疫応答が提供される。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列の使用により標的化免疫療法が提供され、その免疫療法は特定の実施形態では抗感染症適応免疫応答を治療的に活性化し得る。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列を使用して治療的抗臓器移植拒絶反応Ｔ細胞性免疫応答が提供される。別の実施形態ではペプチド、ポリペプチド、または融合ポリペプチド内に含まれる１つ以上のネオエピトープ配列の使用により標的とする免疫療法が提供され、その免疫療法はある特定の実施形態では疾患または症状に対する抗臓器移植拒絶反応適応免疫応答を治療的に活性化し得る。

別の実施形態では免疫原性応答の存在が１つ以上の免疫原性ネオエピトープの存在と相関する。別の実施形態では、組換えリステリアは、Ｔ細胞エピトープ、または適応免疫応答エピトープ、またはそれらのあらゆる組合せを含むネオエピトープをコードする核酸を含む。

１つの実施形態では本方法は１つ以上のネオエピトープを含む各アミノ酸配列を免疫原性応答についてスクリーニングすることを含み、ここで免疫原性応答の存在は、免疫原性エピトープを含む１つ以上のネオエピトープと相関する。別の実施形態では１つ以上の免疫原性ネオエピトープがペプチドに含まれる。別の実施形態では１つ以上の免疫原性ネオエピトープがポリペプチドに含まれる。別の実施形態では１つ以上の免疫原性ネオエピトープが融合ポリペプチドに含まれる。別の実施形態では１つ以上の免疫原性ネオエピトープがユビキチンポリペプチドに融合して含まれる。

別の実施形態では本方法は１つ以上のネオエピトープを含む各アミノ酸配列を免疫原性Ｔ細胞応答についてスクリーニングすることを含み、ここで免疫原性Ｔ細胞応答の存在は、Ｔ細胞エピトープを含む１つ以上のネオエピトープと相関する。別の実施形態では本方法は１つ以上のネオエピトープを含む各アミノ酸配列を適応免疫応答についてスクリーニングすることを含み、ここで適応免疫応答の存在は、適応免疫応答エピトープを含む１つ以上のネオエピトープと相関する。

１つの実施形態では、提供される個別免疫療法を作成するための前述の系または方法における免疫原性Ｔ細胞応答のスクリーニング工程は、例えばＴ細胞増殖アッセイ、前述のネオエピトープで活性化されたＴ細胞を使用し、且つ、腫瘍細胞と共培養され、^５１Ｃｒ放出アッセイまたは^３Ｈチミジンアッセイを用いる腫瘍退行アッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＥＬＩｓｐｏｔアッセイ、およびＦＡＣＳ分析をはじめとする当技術分野においてよく知られている免疫応答アッセイの使用を含む。（例えば、全体が本明細書に援用される米国特許第８，７７１，７０２号明細書、および欧州特許第１７７４３３２（Ｂ１）号明細書を参照されたい）。別の実施形態において、免疫原性応答に関しスクリーニングする工程は、非Ｔ細胞性応答を検証する。別の実施形態では提供される個別免疫療法の作成系または作成方法における非Ｔ細胞応答についてのスクリーニング工程は、サイトカイン産生の調査が異なる部分集合のサイトカイン、すなわち、ＩＬ−１０およびＩＬ−１βに焦点を当てていることを除いて上記のＴ細胞についてのアッセイと類似のアッセイをはじめとする当技術分野においてよく知られている免疫応答アッセイの使用を含む。（例えば、両方とも全体が本明細書に援用される米国特許第８９６２３１９号明細書および欧州特許第１７７４３２号明細書を参照されたい。例えば、^５１Ｃｒ放出アッセイによってＴ細胞免疫応答をアッセイしてもよく、そのアッセイは１つ以上のネオエピトープを含むワクチンを用いてマウスを免疫する工程、次いで免疫後約１０日目に脾臓を採取する工程を含み、ここで後に、フィーダー細胞として放射線照射したＴＣ−１細胞（１００：１、脾細胞：ＴＣ−１）とともに脾臓細胞を培養して確立させ、インビトロで５日間にわたって刺激し、その後で標的として１つ以上のネオエピトープを含むペプチド／ポリペプチドを使用し、標準的な^５１Ｃｒ放出アッセイにおいて使用することができる。

別の実施形態では免疫応答についてのスクリーニング工程は、例えば全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１１／０１２９４９９号明細書に開示されるようにＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスの使用を含む。

１つの実施形態では本方法は、特定されたＴ細胞ネオエピトープをコードする核酸配列、または前述の特定されたＴ細胞ネオエピトープを含むペプチドを選択し、前述の配列で組換え弱毒化リステリア株を形質転換することを含む。１つの実施形態では本方法は、特定された適応免疫応答ネオエピトープをコードする核酸配列、または前述の特定された適応免疫応答ネオエピトープを含むペプチドを選択し、前述の配列で組換え弱毒化リステリア株を形質転換することを含む。

１つの実施形態において、特定されたネオエピトープをコードする核酸は、例えばＰＣＲなどの標準的なＤＮＡ増幅法を使用して生成される。

本開示により提示されるように、特定された標的に基づくＤＮＡ生成工程は、４週より長くはかからない。別の実施形態において、特定された標的に基づくＤＮＡ生成工程は、約３〜４週かかる。別の実施形態において、特定された標的に基づくＤＮＡ生成工程は、約２〜３週かかる。別の実施形態において、特定された標的に基づくＤＮＡ生成工程は、約１〜２週かかる。別の実施形態において、特定された標的に基づくＤＮＡ生成工程は、約１週かかる。別の実施形態において、腫瘍シーケンシングの工程は、１週未満かかる。

本開示により提示されるように、タグ化プラスミドにＤＮＡをクローニングし、その後リステリアにトランスフェクションする工程は、４週より長くはかからない。別の実施形態において、タグ化プラスミドにＤＮＡをクローニングし、その後リステリアにトランスフェクションする工程は、約２〜４週かかる。別の実施形態において、タグ化プラスミドにＤＮＡをクローニングし、その後リステリアにトランスフェクションする工程は、約２〜３週かかる。別の実施形態において、タグ化プラスミドにＤＮＡをクローニングし、その後リステリアにトランスフェクションする工程は、約３週かかる別の実施形態において、タグ化プラスミドにＤＮＡをクローニングし、その後リステリアにトランスフェクションする工程は、約２週かかる別の実施形態において、タグ化プラスミドにＤＮＡをクローニングし、その後リステリアにトランスフェクションする工程は、２週未満かかる
１つの実施形態では本明細書に記載される系または方法は前述のＴ細胞ネオエピトープの発現と分泌を確認するために前述のリステリア株を培養し、その特徴を分析することを含む。１つの実施形態では本明細書に記載される系または方法は前述の適応免疫応答ネオエピトープの発現と分泌を確認するために前述のリステリア株を培養し、その特徴を分析することを含む。

本開示により提示されるように、最適産物を特定するための培養及び特徴解析の工程は、２週より長くはかからない。別の実施形態において、最適産物を特定するための培養及び特徴解析の工程は、約１〜２週かかる。別の実施形態において、最適産物を特定するための培養及び特徴解析の工程は、約１週かかる。別の実施形態において、最適産物を特定するための培養及び特徴解析の工程は、１週未満かかる。

１つの実施形態では本発明のシステムまたは方法は所定の時点で前述の対象に投与するために前述のリステリアを保存すること、または前述のリステリアを前述の対象に投与することを含み、ここで前述のリステリア株はを免疫原性組成物の一部として投与される。

ＩＩ組換え型リステリア株
１つの実施形態では本開示の組換え型リステリア株は核酸分子を含み、その核酸分子は融合ポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含み、その融合ポリペプチドは１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドに融合している短縮型リステリオリジンＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。当業者であれば、１つ以上のエピトープを含む本明細書に開示される１つ以上のペプチドがまず第一に免疫原性であり得、それらの免疫原性は例えばｔＬＬＯ、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列などの免疫原性ポリペプチドと融合されるか、または混合されることにより増強され得ることを理解するであろう。別の実施形態では本開示の組換え型リステリア株は核酸分子を含み、その核酸分子は短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列をコードする第１オープン・リーディング・フレームを含む。１つの実施形態ではその組換え型リステリア株は弱毒化されている。

１つの実施形態では本明細書に開示される１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドはそれぞれ免疫原性ポリペプチドまたはその断片に融合している。

別の実施形態では短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列は異種抗原またはその断片に融合していない。別の実施形態では短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列は本明細書において開示される１つ以上のペプチドに融合していない。

別の実施形態では本明細書に開示される１つ以上の免疫原性ネオエピトープを含む１つ以上のペプチドは、免疫原性組成物の一部として免疫原性ポリペプチドまたはその断片と混合される。

１つの実施形態では短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質は推定上のＰＥＳＴ配列を含む。１つの実施形態では短縮型ａｃｔＡタンパク質はＰＥＳＴ含有アミノ酸配列を含む。別の実施形態では短縮型ａｃｔＡタンパク質は推定上のＰＥＳＴ含有アミノ酸配列を含む。

１つの実施形態ではＰＥＳＴアミノ酸（ＡＡ）配列は短縮型ＬＬＯ配列を含む。別の実施形態ではＰＥＳＴアミノ酸配列はＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号１）である。別の実施形態ではリステリアに由来する他のＬＭＰＥＳＴＡＡ配列への抗原の融合によってもその抗原の免疫原性が増強される。

別の実施形態では、本開示の方法および組成物のＮ末端ＬＬＯタンパク質断片は配列番号３を含む。別の実施形態ではその断片はＬＬＯシグナルペプチドを含む。別の実施形態ではその断片は配列番号４を含む。別の実施形態ではその断片はほぼ配列番号４から構成される。別の実施形態ではその断片は配列番号４から本質的に構成される。別の実施形態ではその断片は配列番号４に対応する。別の実施形態ではその断片は配列番号４と相同である。別の実施形態ではその断片は配列番号４の断片と相同である。１つの実施形態では使用される短縮型ＬＬＯは前述のシグナル配列を含まない。別の実施形態ではその短縮型ＬＬＯはシグナル配列を含む。活性化ドメインを有しない、そして特にシステイン４８４を有しない任意の短縮型ＬＬＯは、本開示の方法および組成物に好適であることが当業者には明らかであろう。別の実施形態では配列番号１のＰＥＳＴＡＡ配列を含むあらゆる短縮型ＬＬＯへの異種抗原の融合によりその抗原の細胞介在性免疫および抗腫瘍免疫が増強される。

本開示のワクチンを構築するために利用されるＬＬＯタンパク質は、別の実施形態では、以下の配列を有する：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＰＥＧＮＥＩＶＱＨＫＮＷＳＥＮＮＫＳＫＬＡＨＦＴＳＳＩＹＬＰＧＮＡＲＮＩＮＶＹＡＫＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＩＤＤＲＮＬＰＬＶＫＮＲＮＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＫＹＳＮＫＶＤＮＰＩＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ１３１２８；配列番号２；核酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１５１２７（配列番号８１）で表される）。この配列に対応するプロタンパク質の最初の２５個のＡＡはシグナル配列であり、それらは細菌によってＬＬＯが分泌されるときにそれから切断される。したがって、この実施形態では全長活性型ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。別の実施形態では、上記のＬＬＯ断片は本開示ワクチンに組み込まれるＬＬＯ断片の供給源として使用される。

別の実施形態では、本開示の組成物および方法で利用されるＬＬＯタンパク質のＮ末端断片は、以下の配列を有する：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤ（配列番号３）。

別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は本明細書において利用されるＬＬＯタンパク質のおよそＡＡ２０〜４４２に対応する。

別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は以下の配列を有する：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤ（配列番号４）。

別の実施形態では、「Ｎ末端ＬＬＯ断片」、「短縮型ＬＬＯ」、「ΔＬＬＯ」またはそれらの文法的に同等な用語は、本明細書では互換的に使用され、非溶血性であるＬＬＯの断片を意味する。別の実施形態ではこれらの用語は推定上のＰＥＳＴ配列を含むＬＬＯ断片を指す。

別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は、活性化ドメインの欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は、システイン４８４を含む領域の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態ではＬＬＯは、参照により本明細書に援用される米国特許第８７７１７０２号明細書に詳細に述べられるように、コレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。

１つの実施形態では本開示はリステリオシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質を含む組換えタンパク質またはポリペプチドを提供するものであり、前述のＬＬＯタンパク質は前述のＬＬＯタンパク質のコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、Ｗ４９２、またはこれらの組み合わせの突然変異を含む。１つの実施形態では前述のＣ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２の残基は配列番号２または８０の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２であるが、別の実施形態ではそれらの残基は、当分野の当業者に知られているように配列アラインメント使用して推測され得る対応残基である。１つの実施形態では残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２に突然変異が形成されている。１つの実施形態では突然変異は置換であり、別の実施形態では欠失である。１つの実施形態ではＣＢＤ全体に突然変異が形成されており、一方で別の実施形態ではＣＢＤの部分に突然変異が形成されており、一方で別の実施形態ではＣＢＤ内の特定の残基だけに突然変異が形成されている。

１つの実施形態では本開示は変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片を含む組換えタンパク質またはポリペプチドを提供するものであり、その変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片は、変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片への非ＬＬＯペプチドの置換を含み、その突然変異領域は、Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２から選択される残基を含む。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はＮ末端ＬＬＯ断片である。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は少なくとも４９２アミノ酸（ＡＡ）長である。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は４９２〜５２８ＡＡ長である。別の実施形態では前述の非ＬＬＯペプチドは１〜５０アミノ酸長である。別の実施形態では前述の突然変異領域は１〜５０アミノ酸長である。別の実施形態ではその非ＬＬＯペプチドはその突然変異領域と同一の長さである。別の実施形態ではその非ＬＬＯペプチドはその突然変異領域と異なる長さを有する。別の実施形態では前述の置換は溶血活性に関する不活化突然変異である。別の実施形態ではその組換えタンパク質またはポリペプチドは野生型ＬＬＯに比べた溶血活性の低下を呈する。別の実施形態ではその組換え型のタンパク質またはポリペプチドは非溶血性である。

本明細書において提示されるように、ＬＬＯの残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２がアラニン残基で置換された突然変異型ＬＬＯタンパク質を作製した（実施例２５）。その変異型ＬＬＯタンパク質、すなわち、ｍｕｔＬＬＯは大腸菌発現系で発現および精製され（実施例２７）、野生型ＬＬＯと比べて実質的に低下した溶血活性を呈する（実施例２８）ことができた。

別の実施形態では、本開示は、（ａ）変異型ＬＬＯタンパク質であって、当該変異型ＬＬＯタンパク質は、内部欠失を含み、その内部欠失は当該変異型ＬＬＯタンパク質のコレステロール結合ドメインを含有する、当該変異型ＬＬＯタンパク質、及び（ｂ）対象の異種ペプチドを含む組み換えタンパク質又はポリペプチドを提供する。別の実施形態ではそのコレステロール結合ドメインの配列は配列番号６８又は６９に記載されている。別の実施形態ではその内部欠失は１１〜５０アミノ酸内部欠失である。別の実施形態ではその内部欠失はその組換えタンパク質またはポリペプチドの溶血活性を不活性化する。別の実施形態ではその組換えタンパク質またはポリペプチドは野生型ＬＬＯに比べた溶血活性の低下を呈する。

別の実施形態では本開示は、（ａ）変異型ＬＬＯタンパク質であって、その変異型ＬＬＯタンパク質は内部欠失を含み、その内部欠失は当該変異型ＬＬＯタンパク質のコレステロール結合ドメインの断片を含む、当該変異型ＬＬＯタンパク質、及び（ｂ）対象の異種ペプチドを含む組換えタンパク質またはポリペプチドを提供する。別の実施形態ではその内部欠失は１〜１１アミノ酸内部欠失である。別の実施形態ではそのコレステロール結合ドメインの配列は配列番号６８又は６９に記載されている。別の実施形態ではその内部欠失はその組換えタンパク質またはポリペプチドの溶血活性を不活性化する。別の実施形態ではその組換えタンパク質またはポリペプチドは野生型ＬＬＯに比べた溶血活性の低下を呈する。

別の実施形態では本開示の方法および組成物の突然変異領域は配列番号２または配列番号８０の残基Ｃ４８４を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は相同ＬＬＯタンパク質の対応するシステイン残基を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は配列番号２または配列番号８０の残基Ｗ４９１を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は相同ＬＬＯタンパク質の対応するトリプトファン残基を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は配列番号２又は配列番号８０の残基Ｗ４９２を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は相同ＬＬＯタンパク質の対応するトリプトファン残基を含む。相同タンパク質の対応する残基を特定するための方法は当技術分野において周知であり、例えば配列アライメントがその方法に挙げられる。

別の実施形態ではその突然変異領域は残基Ｃ４８４およびＷ４９１を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は残基Ｃ４８４およびＷ４９２を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は残基Ｗ４９１およびＷ４９２を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は残基Ｃ４８４、Ｗ４９１およびＷ４９２を含む。

別の実施形態では本開示の方法および組成物の突然変異領域は変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片のコレステロール結合ドメインを含む。例えば、配列番号２又は配列番号８０の残基４７０〜５００、４７０〜５１０、または４８０〜５００からなる突然変異領域は、そのＣＢＤ（残基４８３〜４９３）を含む。別の実施形態ではその突然変異領域は変異型ＬＬＯタンパク質のＣＢＤ断片、またはその断片である。例えば、本明細書において提示されるように、それぞれがＣＢＤの断片である残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２がアラニン残基に変異された（実施例２５）。さらに、本明細書において提示されるように、残基４８４〜４９２のＣＢＤ断片がＮＹ−ＥＳＯ−１に由来する異種配列で置き換えられた（実施例２６）。別の実施形態ではその突然変異領域は変異型ＬＬＯタンパク質のＣＢＤまたはその断片と重なる。例えば、配列番号２又は配列番号８０の残基４７０〜４９０、４８０〜４８８、４９０〜５００、または４８６〜５１０からなる突然変異領域は、そのＣＢＤを含む。別の実施形態では単一のペプチドがシグナル配列に欠失を、ＣＢＤに突然変異または置換を有してよい。

別の実施形態ではその突然変異領域の長さは１〜５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは４〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは５〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは６〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは７〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは８〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは９〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１０〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜２ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜３ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜６ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜７ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜８ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜３ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜６ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜７ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜８ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜６ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜７ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜８ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１２〜５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜１５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜２０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜３０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜１５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜２０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜３０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜１５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜３０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜１５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜１５０ＡＡである。

別の実施形態では本開示の方法および組成物の置換突然変異は、ＬＬＯタンパク質またはその断片の突然変異領域が同数の異種ＡＡで置き換えられている突然変異である。別の実施形態ではその突然変異領域のサイズよりも大きい数の異種ＡＡが導入される。別の実施形態ではその突然変異領域のサイズよりも小さい数の異種ＡＡが導入される。

別の実施形態ではその置換突然変異は単一の残基の点突然変異である。別の実施形態ではその置換突然変異は２残基の点突然変異である。別の実施形態ではその置換突然変異は３残基の点突然変異である。別の実施形態ではその置換突然変異は３残基より多くの点突然変異である。別の実施形態ではその置換突然変異は数残基の点突然変異である。別の実施形態では点突然変異に含まれる複数の残基が連続している。別の実施形態ではそれらの複数の残基は連続していない。

別の実施形態では本開示の組換えタンパク質またはポリペプチドの突然変異領域を置き換える非ＬＬＯペプチドの長さは１〜５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは４〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは５〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは６〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは７〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは８〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは９〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１０〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜２ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜３ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜６ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜７ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜８ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜３ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜６ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜７ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜８ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜６ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜７ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜８ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１２〜５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜１５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜２０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜３０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜１５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜２０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜３０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜１５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜３０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜１５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜１５０ＡＡである。

別の実施形態では本開示の方法および組成物のＬＬＯ断片の長さは少なくとも４８４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは４８４ＡＡを超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも４８９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは４８９を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも４９３ＡＡである。別の実施形態ではその長さは４９３を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも５００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは５００を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも５０５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは５０５を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも５１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは５１０を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも５１５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは５１５を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも５２０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは５２０を超える。別の実施形態ではその長さは少なくとも５２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは５２０を超える。本明細書においてＬＬＯ断片の長さに言及するとき、シグナル配列が含まれる。したがって、ＣＢＤ内の第１システインの番号は４８４であり、ＡＡ残基の総数は５２９である。

別の実施形態では本開示は、（ａ）変異型ＬＬＯタンパク質であって、その変異型ＬＬＯタンパク質は内部欠失を含み、その内部欠失は、その変異型ＬＬＯタンパク質のコレステロール結合ドメインを含む、変異型ＬＬＯタンパク質、および（ｂ）本明細書において開示される１つ以上のエピトープを含むペプチド、を含む組換えタンパク質またはポリペプチド、または同タンパク質もしくはポリペプチドを備える本明細書において開示される弱毒化リステリア株を提供する。別の実施形態ではそのコレステロール結合ドメインの配列は配列番号６８又は配列番号６９に示される。別の実施形態ではその内部欠失は１〜１１アミノ酸内部欠失、１〜５０アミノ酸内部欠失、または１１〜５０アミノ酸内部欠失である。別の実施形態ではその内部欠失はその組換えタンパク質またはポリペプチドの溶血活性を不活性化する。別の実施形態ではその組換えタンパク質またはポリペプチドは野生型ＬＬＯに比べた溶血活性の低下を呈する。

別の実施形態では、本開示ペプチドは融合ペプチドである。別の実施形態では「融合ペプチド」はペプチド結合または他の化学結合によって互いに連結した２つ以上のタンパク質を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。別の実施形態では前述のタンパク質はペプチド結合または他の化学結合によって直接的に互いに連結されている。別の実施形態では前述のタンパク質はそれらの２つ以上のタンパク質の間の１個以上のＡＡ（例えば、「スペーサー」）によって互いに連結されている。

本明細書において開示されるように、ＬＬＯの残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２が抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１由来のＣＴＬエピトープで置換された突然変異型ＬＬＯタンパク質が作製された（実施例２６）。その変異型ＬＬＯタンパク質、すなわち、ｍｕｔＬＬＯは大腸菌発現系で発現および精製され（実施例２７）、野生型ＬＬＯと比べて実質的に低下した溶血活性を呈する（実施例２８）ことができた。当業者であれば、本明細書に開示される方法または方法により特定されるあらゆるネオエピトープをＬＬＯのＣＢＤの置換または置き換えに使用することができることを理解するであろう。

別の実施形態では本開示の方法および組成物の内部欠失の長さは１〜５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは４〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは５〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは６〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは７〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは８〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは９〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１０〜１１ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜２ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜３ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜６ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜７ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜８ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１〜１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜３ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜６ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜７ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜８ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２〜１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜４ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜６ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜７ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜８ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜９ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３〜１０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１２〜５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜１５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜２０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜３０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１１〜１５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜２０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜３０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは１５〜１５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜２５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜３０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは２０〜１５０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜３５ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜４０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜６０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜７０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜８０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜９０ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜１００ＡＡである。別の実施形態ではその長さは３０〜１５０ＡＡである。

別の実施形態では内部欠失を含む本開示の変異型ＬＬＯタンパク質はその内部欠失を除けば完全長である。別の実施形態ではその変異型ＬＬＯタンパク質は追加的な内部欠失を含む。別の実施形態ではその変異型ＬＬＯタンパク質は１つより多くの追加的な内部欠失を含む。別の実施形態ではその変異型ＬＬＯタンパク質はＣ末端から短縮されている。

別の実施形態では本開示の方法および組成物の内部欠失は変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片のＣＢＤを含む。例えば、配列番号２もしくは配列番号８０の残基４７０〜５００、４７０〜５１０、または４８０〜５００からなる内部欠失はそのＣＢＤ（残基４８３〜４９３）を含む。別の実施形態ではその内部欠失は変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片のＣＢＤ断片である。例えば、残基４８４〜４９２、４８５〜４９０、および４８６〜４８８は全て配列番号２又は配列番号８０のＣＢＤの断片である。別の実施形態ではその内部欠失は変異型ＬＬＯタンパク質またはその断片のＣＢＤと重なる。例えば、配列番号２もしくは配列番号８０の残基４７０〜４９０、４８０〜４８８、４９０〜５００、または４８６〜５１０からなる内部欠失はそのＣＢＤを含む。

別の実施形態では短縮型ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質の最初の４４１ＡＡを含む。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はＬＬＯの最初の４２０ＡＡを含む。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は野生型ＬＬＯタンパク質の非溶血性形態である。

別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜５０から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜７５から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１００から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１２５から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１５０から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜１７５から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２００から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２２５から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２５０から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜２７５から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３００から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３２５から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３５０から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜３７５から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４００から構成される。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片はおよそ残基１〜４２５から構成される。

別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含有する。別の実施形態ではそれらの残基番号は上に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＬＬＯタンパク質が本明細書において利用されるＬＬＯタンパク質と比べて挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節することができる。別の実施形態ではそのＬＬＯ断片は当技術分野において知られている他のあらゆるＬＬＯ断片である。

相同タンパク質の対応する残基を特定するための方法は当技術分野において周知であり、例えば配列アライメントがその方法に挙げられる。１つの実施形態では相同ＬＬＯは、ＬＬＯ配列（例えば、配列番号２〜４又は８０のうちの１つ）に対する同一性が７０％よりも高いことを指す。別の実施形態では、相同ＬＬＯは、配列番号２〜４又は８０のうちの１つに対する同一性が７２％よりも高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号２〜４又は８０のうちの１つに対する同一性が７５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号２〜４又は８０のうちの１つに対する同一性が７８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号２〜４又は８０のうちの１つに対する同一性が８０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号２〜４又は８０のうちの１つに対する同一性が８２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号２〜４又は８０のうちの１つに対する同一性が８３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号２〜４又は８０のうちの１つに対する同一性が８５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号２〜４又は８０のうちの１つに対する同一性が８７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号２〜４又は８０のうちの１つに対する同一性が８８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号２〜４又は８０のうちの１つに対する同一性が９０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号２〜４又は８０のうちの１つに対する同一性が９２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号２〜４又は８０のうちの１つに対する同一性が９３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号２〜４又は８０のうちの１つに対する同一性が９５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号２〜４又は８０のうちの１つに対する同一性が９６％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号２〜４又は８０のうちの１つに対する同一性が９７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号２〜４又は８０のうちの１つに対する同一性が９８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号２〜４又は８０のうちの１つに対する同一性が９９％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号２〜４又は８０のうちの１つに対する同一性が１００％であることを指す。

「ＰＥＳＴアミノ酸配列」、「ＰＥＳＴ配列」、「ＰＥＳＴ配列ペプチド」、「ＰＥＳＴペプチド」、または「ＰＥＳＴ配列含有タンパク質またはペプチド」という用語は本明細書において互換的に使用される。当業者であれば、これらの用語に短縮型ＬＬＯタンパク質が包含され得ること、１つの実施形態ではそれらはＮ末端ＬＬＯであり、または別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡタンパク質であることを理解するであろう。ＰＥＳＴ配列ペプチドは当技術分野において知られており、米国特許第７６３５４７９号明細書、および米国特許出願公開第２０１４／０１８６３８７号明細書に記載されており、これらの両方の全体が本明細書に援用される。

別の実施形態では、Ｌ．モノサイトゲネスについてＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒａｎｄＲｏｂｅｒｔｓ（ＴＢＳ２１：２６７−２７１，１９９６）によって記載されるものなどの方法に従って原核生物のＰＥＳＴ配列を日常的に特定することができる。あるいは、この方法に基づいて他の原核生物由来のＰＥＳＴアミノ酸配列を特定することもできる。ＰＥＳＴアミノ酸配列が期待される他の原核生物には他のリステリア属の種が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｌ．モノサイトゲネスのタンパク質ＡｃｔＡは４つのそのような配列を含有する。これらは、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号５）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号６）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号７）、およびＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号８）である。また、ストレプトコッカス属の種に由来するストレプトリジンＯもＰＥＳＴ配列を含有する。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスのストレプトリジンＯはアミノ酸３５〜５１にＰＥＳＴ配列ＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号９）を含み、ストレプトコッカス・エクイシミリスのストレプトリジンＯはアミノ酸３８〜５４にＰＥＳＴ様配列ＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号１０）を含む。さらに、ＰＥＳＴ配列を抗原タンパク質の中に埋め込むことができると考えられる。したがって、本開示の目的に対し、ＰＥＳＴ配列融合に関する場合、「融合」とは、抗原タンパク質が抗原の一端にリンクされるかまたは抗原の中に埋め込まれるかのいずれかで抗原とＰＥＳＴアミノ酸配列との両方を含むことを意味する。他の実施形態ではＰＥＳＴ配列またはＰＥＳＴ含有ポリペプチドは融合タンパク質の一部でもなく、そのポリペプチドが異種抗原を含むこともない。

「核酸配列」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸コンストラクト」という用語は本明細書において互換的に使用され、それらの用語はＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を指してよく、それらの分子には原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および甚だしくは合成ＤＮＡ配列も含まれるがこれらに限定されない。この用語はＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列も指す。この用語は少なくとも２つの塩基／糖／リン酸化合物からなる鎖を指す場合もある。この用語は一量体単位の核酸重合体を指す場合もある。１つの実施形態ではＲＮＡは、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびリボザイムの形態であってよい。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用が記述されている（ＣａｕｄｙＡＡｅｔａｌ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌ１６：２４９１−９６およびそれに引用された参照文献）。ＤＮＡはプラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ、もしくは染色体ＤＮＡの形態であってよく、またはこれらの群の誘導体であってよい。加えて、これらの形態のＤＮＡおよびＲＮＡは一本鎖、二本鎖、三重鎖、または四重鎖であってもよい。その用語は他の種類の骨格を含むが、同じ塩基を含む場合がある人工核酸も含み得る。１つの実施形態ではこの人工核酸はＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡはペプチド骨格およびヌクレオチド塩基を含有し、１つの実施形態ではＤＮＡ分子とＲＮＡ分子の両方に結合することができる。別の実施形態ではヌクレオチドはオキセタン修飾される。別の実施形態ではヌクレオチドは、１つ以上のホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合で置き換えることによって修飾される。別の実施形態では人工核酸は当技術分野において知られている天然核酸のリン酸骨格の他のあらゆる変異形を含有する。ホスホロチオエート核酸およびＰＮＡの使用は当業者に知られており、例えばＮｅｉｌｓｅｎＰＥ，ＣｕｒｒＯｐｉｎＳｔｒｕｃｔＢｉｏｌ９：３５３−５７、およびＲａｚＮＫｅｔａｌＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ．２９７：１０７５−８４に記載される。核酸の生産および使用が当業者に知られており、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，（２００１），ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌｌ編、およびＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓ（２００３）ＰｕｒｃｈｉｏａｎｄＧ．Ｃ．Ｆａｒｅｅｄに記載される。

別の実施形態では本明細書に開示される核酸分子はエピソームベクターまたはプラスミドベクターから発現される。別の実施形態では、抗生物質選択が無い状態で、プラスミドは組み換え型リステリアワクチン株内で安定して維持される。別の実施形態ではそのプラスミドは組換え型リステリアに対して抗生物質耐性を付与しない。

１つの実施形態では本明細書に開示される免疫原性ポリペプチドまたはその断片はＡｃｔＡタンパク質またはその断片である。１つの実施形態ではＡｃｔＡタンパク質は配列番号１１で表される配列を含む：
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧＰＮＮＮＮＮＮＧＥＱＴＧＮＶＡＩＮＥＥＡＳＧＶＤＲＰＴＬＱＶＥＲＲＨＰＧＬＳＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＡＮＫＲＫＶＡＫＥＳＶＶＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫＡＮＱＫＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＴＰＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＭＲＥＴＡＰＳＬＤＳＳＦＴＳＧＤＬＡＳＬＲＳＡＩＮＲＨＳＥＮＦＳＤＦＰＬＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲＬＡＤＬＲＤＲＧＴＧＫＨＳＲＮＡＧＦＬＰＬＮＰＦＩＳＳＰＶＰＳＬＴＰＫＶＰＫＩＳＡＰＡＬＩＳＤＩＴＫＫＡＰＦＫＮＰＳＱＰＬＮＶＦＮＫＫＴＴＴＫＴＶＴＫＫＰＴＰＶＫＴＡＰＫＬＡＥＬＰＡＴＫＰＱＥＴＶＬＲＥＮＫＴＰＦＩＥＫＱＡＥＴＮＫＱＳＩＮＭＰＳＬＰＶＩＱＫＥＡＴＥＳＤＫＥＥＭＫＰＱＴＥＥＫＭＶＥＥＳＥＳＡＮＮＡＮＧＫＮＲＳＡＧＩＥＥＧＫＬＩＡＫＳＡＥＤＥＫＡＫＥＥＰＧＮＨＴＴＬＩＬＡＭＬＡＩＧＶＦＳＬＧＡＦＩＫＩＩＱＬＲＫＮＮ（配列番号１１）。

この配列に対応するプロタンパク質の最初の２９個のＡＡはシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにＡｃｔＡタンパク質から切断される。１つの実施形態ではＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは上記配列番号１１のＡＡ１〜２９のシグナル配列を含む。別の実施形態ではＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは上記配列番号１１のＡＡ１〜２９のシグナル配列を含まない。

１つの実施形態では短縮型ＡｃｔＡタンパク質はＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片を含む。別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡタンパク質はＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片である。１つの実施形態では短縮型ＡｃｔＡタンパク質は配列番号１２で表される配列を含む：
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ（配列番号１２）。

別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番号１２に示される配列を含む。

別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡタンパク質は配列番号１３で示される配列を含むＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧ（配列番号１３）。

別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は当該技術分野で既知の任意の他のＡｃｔＡ断片である。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片は免疫原性断片である。

別の実施形態ではＡｃｔＡタンパク質は配列番号１４で示される配列を含む
ＭＧＬＮＲＦＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧＰＮＮＮＮＮＮＧＥＱＴＧＮＶＡＩＮＥＥＡＳＧＶＤＲＰＴＬＱＶＥＲＲＨＰＧＬＳＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＡＮＫＲＫＶＡＫＥＳＶＶＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫＡＮＱＫＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＴＰＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＭＲＥＴＡＰＳＬＤＳＳＦＴＳＧＤＬＡＳＬＲＳＡＩＮＲＨＳＥＮＦＳＤＦＰＬＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲＬＡＤＬＲＤＲＧＴＧＫＨＳＲＮＡＧＦＬＰＬＮＰＦＩＳＳＰＶＰＳＬＴＰＫＶＰＫＩＳＡＰＡＬＩＳＤＩＴＫＫＡＰＦＫＮＰＳＱＰＬＮＶＦＮＫＫＴＴＴＫＴＶＴＫＫＰＴＰＶＫＴＡＰＫＬＡＥＬＰＡＴＫＰＱＥＴＶＬＲＥＮＫＴＰＦＩＥＫＱＡＥＴＮＫＱＳＩＮＭＰＳＬＰＶＩＱＫＥＡＴＥＳＤＫＥＥＭＫＰＱＴＥＥＫＭＶＥＥＳＥＳＡＮＮＡＮＧＫＮＲＳＡＧＩＥＥＧＫＬＩＡＫＳＡＥＤＥＫＡＫＥＥＰＧＮＨＴＴＬＩＬＡＭＬＡＩＧＶＦＳＬＧＡＦＩＫＩＩＱＬＲＫＮＮ（配列番号１４）。この配列に対応するプロタンパク質の最初の２９個のＡＡはシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにＡｃｔＡタンパク質から切断される。１つの実施形態ではＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは、配列番号１４のＡＡ１〜２９のシグナル配列を含む。別の実施形態ではＡｃｔＡポリペプチドまたはペプチドは配列番号１４のＡＡ１〜２９のシグナル配列を含まない。

別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号１５で示される配列を含む
ＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧＰＮＮＮＮＮＮＧＥＱＴＧＮＶＡＩＮＥＥＡＳＧ（配列番号１５）。別の実施形態では配列番号１５で表される短縮型ＡｃｔＡタンパク質はＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ１と呼ばれる。別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡは全長ＡｃｔＡ配列の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸１２２までを含む。別の実施形態では配列番号１５は全長ＡｃｔＡ配列の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸１２２までを含む。別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡは配列番号１４の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸１２２までを含む。別の実施形態では配列番号１５は配列番号１４の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸１２２までを含む。

別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡタンパク質は配列番号１６で示される配列を含む
ＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧＰＮＮＮＮＮＮＧＥＱＴＧＮＶＡＩＮＥＥＡＳＧＶＤＲＰＴＬＱＶＥＲＲＨＰＧＬＳＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＡＮＫＲＫＶＡＫＥＳＶＶＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫＡＮＱＫＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫ（配列番号１６）。別の実施形態では配列番号１６で表される短縮型ＡｃｔＡはＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２と呼ばれる。別の実施形態では配列番号１６で表される短縮型ＡｃｔＡはＬＡ２２９と呼ばれる。別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡは完全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０からアミノ酸２２９までを含む。別の実施形態では配列番号１６は完全長ＡｃｔＡ配列の約アミノ酸３０から約アミノ酸２２９までを含む。別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡは配列番号１４の約アミノ酸３０からアミノ酸２２９までを含む。別の実施形態では配列番号１６は配列番号１４のアミノ酸３０からアミノ酸２２９までを含む。

別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡタンパク質は配列番号１７で示される配列を含む
ＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧＰＮＮＮＮＮＮＧＥＱＴＧＮＶＡＩＮＥＥＡＳＧＶＤＲＰＴＬＱＶＥＲＲＨＰＧＬＳＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＡＮＫＲＫＶＡＫＥＳＶＶＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫＡＮＱＫＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＴＰＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳ（配列番号１７）。別の実施形態では配列番号１７で表される短縮型ＡｃｔＡはＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ３と呼ばれる。別の実施形態ではこの短縮型ＡｃｔＡは全長ＡｃｔＡ配列の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸３３２までを含む。別の実施形態では配列番号１７は全長ＡｃｔＡ配列の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸３３２までを含む。別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡは配列番号１４の最初の約３０個目のアミノ酸からアミノ酸３３２までを含む。別の実施形態では配列番号１７は配列番号１４の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸３３２までを含む。

別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡタンパク質は配列番号１８で示される配列を含む
ＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧＰＮＮＮＮＮＮＧＥＱＴＧＮＶＡＩＮＥＥＡＳＧＶＤＲＰＴＬＱＶＥＲＲＨＰＧＬＳＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＡＮＫＲＫＶＡＫＥＳＶＶＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫＡＮＱＫＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＴＰＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＭＲＥＴＡＰＳＬＤＳＳＦＴＳＧＤＬＡＳＬＲＳＡＩＮＲＨＳＥＮＦＳＤＦＰＬＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰＴＳＥ（配列番号１８）。別の実施形態では配列番号１８で表される短縮型ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ４と呼称される。別の実施形態ではこの短縮型ＡｃｔＡは全長ＡｃｔＡ配列の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸３９９までを含む。別の実施形態では配列番号１８は全長ＡｃｔＡ配列の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸３９９までを含む。別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡは配列番号１４の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸３９９までを含む。別の実施形態では配列番号１８は配列番号１４の最初の３０個目のアミノ酸からアミノ酸３９９までを含む。

別の実施形態では「短縮型ＡｃｔＡ」または「ΔＡｃｔＡ」はＰＥＳＴドメインを含むＡｃｔＡ断片を指す。別の実施形態ではこれらの用語はＰＥＳＴ配列を含むＡｃｔＡ断片を指す。

別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡタンパク質をコードする組換え型ヌクレオチドは配列番号１９で表される配列を含む。

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別の実施形態ではその組換え型ヌクレオチドは配列番号１９で表される配列を有する。別の実施形態ではその組換え型ヌクレオチドはＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする他のあらゆる配列を含む。

別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はＡｃｔＡタンパク質の最初の約１００ＡＡから構成される。

別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜７５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜１００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜１２５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜１５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜１７５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２２５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜２７５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３２５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３３８から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜３７５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜４００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜４５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜５００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜５５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜６００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜６３９から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１２５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜１７５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２２５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜２７５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３２５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３３８から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜３７５から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜４００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜４５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜５００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜５５０から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基１〜６００から構成される。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片はおよそ残基３０〜６０４から構成される。

別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＡｃｔＡタンパク質の残基を含有する。別の実施形態ではそれらの残基番号は上に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＡｃｔＡタンパク質が本明細書において利用されるＡｃｔＡタンパク質と比べて挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節することができる。別の実施形態ではそのＡｃｔＡ断片は当技術分野において知られている他のあらゆるＡｃｔＡ断片である。

別の実施形態では相同ＡｃｔＡは、ＡｃｔＡ配列（例えば、配列番号１１〜１８のうちの１つ）に対する７０％よりも高い同一性を指す。別の実施形態では、相同ＡｃｔＡは、配列番号１１〜１８のうちの１つに対する同一性が７２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号１１〜１８のうちの１つに対する同一性が７５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号１１〜１８のうちの１つに対する同一性が７８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号１１〜１８のうちの１つに対する同一性が８０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号１１〜１８のうちの１つに対する同一性が８２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号１１〜１８のうちの１つに対する同一性が８３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号１１〜１８のうちの１つに対する同一性が８５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号１１〜１８のうちの１つに対する同一性が８７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号１１〜１８のうちの１つに対する同一性が８８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号１１〜１８のうちの１つに対する同一性が９０％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号１１〜１８のうちの１つに対する同一性が９２％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号１１〜１８のうちの１つに対する同一性が９３％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号１１〜１８のうちの１つに対する同一性が９５％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号１１〜１８のうちの１つに対する同一性が９６％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号１１〜１８のうちの１つに対する同一性が９７％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号１１〜１８のうちの１つに対する同一性が９８％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号１１〜１８のうちの１つに対する同一性が９９％より高いことを指す。別の実施形態では、相同は、配列番号１１〜１８のうちの１つに対する同一性が１００％であることを指す。

当業者には、本明細書に開示されるあらゆる核酸配列に関連する場合の「相同性」という用語は、対応する天然核酸配列のヌクレオチドと同一である一定の割合の候補配列内のヌクレオチドを包含し得ることを認識するであろう。

１つの実施形態では相同性は当技術分野において充分に記述される方法によって、配列アライメントについてのコンピューターアルゴリズムによって決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピューターアルゴリズム分析は、例えば、ＢＬＡＳＴパッケージ、ＤＯＭＡＩＮパッケージ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ増強アラインメントユーティリティ）パッケージ、ＧＥＮＰＥＰＴパッケージ、およびＴＲＥＭＢＬパッケージなどの利用可能なあらゆる数のソフトウェアパッケージの利用を含み得る。

別の実施形態では、「相同性」は本明細書に開示された配列から選択された配列との同一性が６８％より大きいことを指す。別の実施形態では、「相同性」は本明細書に開示された配列から選択された配列との同一性が７０％より大きいことを指す。別の実施形態では、「相同性」は本明細書に開示された配列から選択された配列との同一性が７２％より大きいことを指す。別の実施形態ではその同一性は７５％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は７８％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は８０％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は８２％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は８３％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は８５％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は８７％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は８８％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は９０％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は９２％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は９３％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は９５％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は９６％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は９７％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は９８％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は９９％よりも高い。別の実施形態ではその同一性は１００％である。

別の実施形態では相同性は候補配列のハイブリダイゼーションの測定を介して決定され、そのハイブリダイゼーションの方法は当技術分野において充分に記述されている（例えば、“ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ” Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄＨｉｇｇｉｎｓＳ．Ｊ．編、（１９８５）、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，２００１，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９８９，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙを参照されたい）。例えば、ハイブリダイゼーションの方法は、天然カスパーゼペプチドをコードするＤＮＡの相補物に対して中程度からストリンジェントな条件下で実行され得る。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、１０〜２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬの断片化変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中における４２℃で一晩のインキュベーションである。

一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は、抗生物質耐性遺伝子を欠いている。

一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリアは、ファゴリソソームを避ける能力を有する。

１つの実施形態ではリステリアゲノムは内因性ａｃｔＡ遺伝子の欠失を含み、１つの実施形態ではこれが病原性因子である。１つの実施形態では異種抗原または抗原性ポリペプチドがリステリア染色体中にＬＬＯとインフレームで組み込まれる。別の実施形態ではその組み込まれた核酸分子は、ＡｃｔＡとインフレームでａｃｔＡ座位に組み込まれている。別の実施形態ではＡｃｔＡをコードする染色体核酸は、抗原をコードする核酸分子によって置き換えられる。

１つの実施形態では本明細書に開示されるペプチドは１つ以上のネオエピトープを含む。１つの実施形態では本明細書に開示されるペプチドは抗原によって構成される。別の実施形態では本明細書に開示されるペプチドは抗原断片である。１つの実施形態では本明細書に開示される抗原は１つ以上のネオエピトープを含む。別の実施形態ではその抗原は異種抗原または自己抗原である。１つの実施形態では本明細書に開示される異種抗原または自己抗原は腫瘍関連抗原である。当業者は、「異種」という用語が、細菌が天然または通常では発現しない抗原またはその一部を指すことを理解する。１つの実施形態では異種抗原は、リステリア株が天然または通常では発現しない抗原を含む。別の実施形態ではその腫瘍関連抗原は天然の腫瘍関連抗原である。別の実施形態ではその腫瘍関連抗原は合成腫瘍関連抗原である。別の実施形態ではその腫瘍関連抗原はキメラ腫瘍関連抗原である。さらに別の実施形態ではその腫瘍関連抗原は１つ以上のネオエピトープを含む。さらに別の実施形態ではその腫瘍関連抗原は新抗原である。

１つの実施形態では本明細書に開示される組換え型リステリアは、１つ以上のペプチドを含む組換えポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子を含み、ここで前述の１つ以上のペプチドは１つ以上のネオエピトープを含む。別の実施形態ではその組換えポリペプチドはさらに、本明細書に開示されるペプチドに融合した短縮型ＬＬＯタンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴ配列をさらに含む。

別の実施形態では、本明細書で開示される核酸分子は、短縮型ＬＬＯタンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴ配列を含む組み換え型ポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含み、ここで短縮型ＬＬＯタンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質またはＰＥＳＴ配列ペプチドは異種抗原に融合されていない。別の実施形態ではその第１オープン・リーディング・フレームは短縮型ＬＬＯタンパク質をコードする。別の実施形態ではその第１オープン・リーディング・フレームは短縮型ＡｃｔＡタンパク質をコードする。別の実施形態ではその第１オープン・リーディング・フレームは短縮型ＬＬＯタンパク質をコードする。別の実施形態ではその第１オープン・リーディング・フレームは短縮型ＡｃｔＡタンパク質をコードする。別の実施形態ではその第１オープン・リーディング・フレームは短縮型ＬＬＯタンパク質をコードする。別の実施形態ではその第１オープン・リーディング・フレームは、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質またはその断片からなる短縮型ＡｃｔＡタンパク質をコードする。

当業者には、「抗原」、「抗原断片」、「抗原部分」、「異種タンパク質」、「異種タンパク質抗原」、「タンパク質抗原」、「抗原」、「抗原性ポリペプチド」という用語、またはそれらの文法的に同等の用語が本明細書において互換的に使用され、その用語は、宿主内に存在すると、または別の実施形態では宿主によって検出されるときに処理され、及び対象の細胞内に存在するＭＨＣクラスＩ分子および／またはクラスＩＩ分子上に提示され、それによって免疫応答の開始がもたらされる、本明細書に記載されるポリペプチド、ペプチドまたは組換えペプチドを指し得ることを認識するであろう。１つの実施形態ではその抗原は宿主に対して外来のものであり得る。別の実施形態ではその抗原は宿主内に存在してもよいが、免疫寛容のために宿主によってこの抗原に対する免疫応答が誘発されない。別の実施形態ではその抗原は１つ以上のネオエピトープを含む新抗原であり、１つ以上のネオエピトープがＴ細胞エピトープである。別の実施形態ではその抗原またはそのペプチド断片はＴ細胞エピトープである１つ以上のネオエピトープを含む。

別の実施形態では抗原は少なくとも１つのネオエピトープを含む。１つの実施形態では抗原は少なくとも１つのネオエピトープを含む新抗原である。１つの実施形態ではネオエピトープは免疫系によって以前に認識されていないエピトープである。新抗原は腫瘍抗原と関連することが多く、癌原細胞中に見出される。新抗原および、拡大すると、新抗原決定基（ネオエピトープ）は、タンパク質がグリコシル化、リン酸化、またはタンパク質分解などの生化学経路内でさらに修飾されると形成される場合がある。これはそのタンパク質の構造変化により新または「ネオ」エピトープを産生することができる。

１つの実施形態では本明細書に開示されるリステリアは、キメラタンパク質をコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを含むミニ遺伝子核酸コンストラクトを含み、ここで前述のキメラタンパク質は
細菌分泌シグナル配列、
ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、
前述の１つ以上のネオエピトープを含む１つ以上のペプチドを含み、且つ、
（ａ）〜（ｃ）の前述のシグナル配列、前述のユビキチン、および前述の１つ以上のペプチドがアミノ末端からカルボキシ末端へと直列に配置されているか、または機能的であるように連結されている前述のコンストラクトを含む。

別の実施形態では本明細書に開示される細菌性シグナル配列はリステリアのシグナル配列であり、別の実施形態ではｈｌｙシグナル配列またはａｃｔＡシグナル配列である。別の実施形態ではその細菌性シグナル配列は当技術分野において知られている他のあらゆるシグナル配列である。別の実施形態ではミニ遺伝子核酸コンストラクトを含む組換え型リステリアは、各オープン・リーディング・フレーム間のシャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２つ以上のオープン・リーディング・フレームをさらに含む。別の実施形態ではミニ遺伝子核酸コンストラクトを含む組換え型リステリアは、各オープン・リーディング・フレーム間のシャイン・ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された１〜４つのオープン・リーディング・フレームをさらに含む。別の実施形態では各オープン・リーディング・フレームが異なるペプチドをコードする。

別の実施形態では、細菌分泌シグナル配列（ＳＳ）、ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、およびペプチド配列をコードするオープン・リーディング・フレームを含む組み換え型核酸コンストラクトを含む組み換え型弱毒化リステリア株が本明細書に開示される。別の実施形態ではその核酸コンストラクトは、細菌分泌シグナル配列、ユビキチンタンパク質、およびペプチド配列を含むキメラタンパク質をコードする。１つの実施形態ではそのキメラタンパク質は次（ＳＳ−Ｕｂ−ペプチド）のように配置される。

１つの実施形態ではその核酸コンストラクトは２つの終止コドンが続くペプチド部分のカルボキシ末端に対応するコドンを含んでタンパク質合成の終了を確実にする。

１つの実施形態では本明細書に記載される組成物および方法において提供されるミニ遺伝子核酸コンストラクトは、カルボキシ末端に別個のペプチド部分を含有する多数の組換えタンパク質を促進するように設計されている発現系を含む。これは、１つの実施形態では、それらの細菌性分泌シグナル配列−ユビキチン−ペプチド（ＳＳ−Ｕｂ−ペプチド）コンストラクトのうちの１つをコードする配列をテンプレートとして利用するＰＣＲ反応により達成される。１つの実施形態では、Ｕｂ配列のカルボキシ末端領域にまで延びるプライマーを使用し、且つ、そのプライマーの３’端に所望のペプチド配列のためのコドンを導入すると、一度のＰＣＲ反応で新しいＳＳ−Ｕｂ−ペプチド配列を生成することができる（本明細書の実施例を参照のこと）。細菌プロモーターと細菌分泌シグナル配列の最初の数ヌクレオチドをコードする５’プライマーは、全てのコンストラクトに対して同一であってもよい。このコンストラクトの概略図が本明細書の図２６Ａ〜Ｃに提示されている。

１つの実施形態においては、本明細書に開示される組み換え型ポリペプチドをコードする核酸は、シグナルペプチドまたはシグナル配列も含む。１つの実施形態においては、本明細書に開示される核酸コンストラクトまたは核酸分子によってコードされる細菌性分泌シグナル配列は、リステリア分泌シグナル配列である。別の実施形態では本明細書に開示される方法および組成物の融合タンパク質はリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）由来のＬＬＯシグナル配列を含む。当業者であれば、本明細書に開示される１つ以上のネオエピトープを含む抗原またはペプチドが、例えばヘモリジン（ｈｌｙ）シグナル配列またはａｃｔＡシグナル配列などのリステリアのシグナル配列のような質なる配列の使用を介して発現し得ることを理解するであろう。あるいは、外来遺伝子は、例えば、融合タンパク質を作製することなくＬ．モノサイトゲネスプロモーターの下流で発現可能である。別の実施形態ではそのシグナルペプチドは細菌性（リステリア性または非リステリア性）である。１つの実施形態ではそのシグナルペプチドはその細菌に固有のものである。別の実施形態ではそのシグナルペプチドはその細菌にとって外来のものである。別の実施形態ではそのシグナルペプチドはリステリア・モノサイトゲネス由来のシグナルペプチド、例えばｓｅｃＡ１シグナルペプチドである。別の実施形態ではそのシグナルペプチドはラクトコッカス・ラクティス由来のＵｓｐ４５シグナルペプチド、またはバチルス・アントラシス由来の保護抗原シグナルペプチドである。別の実施形態ではそのシグナルペプチドはリステリア・モノサイトゲネス由来のｓｅｃＡ２シグナルペプチド、例えばｐ６０シグナルペプチドである。加えて、その組換え型核酸分子はｐ６０をコードする第３のポリヌクレオチド配列またはその断片を所望により含む。別の実施形態ではそのシグナルペプチドは、バチルス・サブチリスＴａｔシグナルペプチドなどのＴａｔシグナルペプチド（例えば、ＰｈｏＤ）である。１つの実施形態ではそのシグナルペプチドは前述の組換えポリペプチドをコードする同じ翻訳リーディングフレーム内にある。

別の実施形態では前述の分泌シグナル配列はリステリアタンパク質由来である。別の実施形態ではその分泌シグナルはＡｃｔＡ_３００分泌シグナルである。別の実施形態ではその分泌シグナルはＡｃｔＡ_１００分泌シグナルである。

１つの実施形態では前述の核酸コンストラクトはユビキチンタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを含む。１つの実施形態ではそのユビキチンは全長タンパク質である。本明細書に開示された発現された構築体内のユビキチン（本明細書に開示された核酸構築体から発現される）は、カルボキシ末端において、宿主細胞サイトゾルへ入る際に加水分解酵素の活性を通して核酸構築体から発現される組み換え型キメラタンパク質の残りから分割されることを当業者は理解するであろう。これによりそのペプチド部分のアミノ末端が遊離し、宿主細胞の細胞質中にペプチド（長さはその特定のペプチドに依存する）を産生する。

一実施形態では、本明細書に開示される核酸構築体によってコードされるペプチドは、長さが８〜１０アミノ酸（ＡＡ）である。別の実施形態ではそのペプチドは１０〜２０ＡＡ長である。別の実施形態ではそのペプチドは２１〜３０ＡＡ長である。別の実施形態ではそのペプチドは３１〜５０ＡＡ長である。別の実施形態ではそのペプチドは５１〜１００ＡＡ長である。

一実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は代謝酵素をコードする第２のオープン・リーディング・フレームをさらに含む。別の実施形態ではその代謝酵素は、前述の組換え型リステリア株の染色体の中で失われている内在性遺伝子を相補する。別の実施形態ではその代謝酵素は、前述の組換え型リステリア株の染色体内で突然変異が形成されている内在性遺伝子を相補する。別の実施形態ではその第２オープン・リーディング・フレームによってコードされる代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素（ｄａｌ）である。別の実施形態ではその第２オープン・リーディング・フレームによってコードされる代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素（ｄａｔ）である。別の実施形態では、本明細書に開示されたリステリア株は内因性ｄａｌ／ｄａｔ遺伝子内の突然変異を含む。別の実施形態ではそのリステリアはｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を欠いている。

別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の核酸分子は、プロモーター／調節性配列に機能可能にリンクされる。別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の第１のオープン・リーディング・フレームは、プロモーター／調節性配列に機能可能にリンクする。別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の第２のオープン・リーディング・フレームは、プロモーター／調節性配列に機能可能にリンクする。別の実施形態ではそれらのオープン・リーディング・フレームの各々が機能可能であるようにプロモーター／調節性配列に連結されている。

別の実施形態では「代謝酵素」は、宿主細菌によって要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態ではこの用語は、宿主細菌によって要求される栄養素の合成のために要求される酵素を指す。別の実施形態ではこの用語は、宿主細菌によって利用される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態ではこの用語は、宿主細菌の持続的増殖のために要求される栄養素の合成に関与する酵素を指す。別の実施形態ではこの酵素は栄養素の合成に要求される。

別の実施形態では前述の組換え型リステリアは弱毒化栄養要求性株である。別の実施形態ではその組換え型リステリアは、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第８１１４４１４号明細書に記載されるＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７株である。

１つの実施形態では、前述の弱毒化株はＬｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）である。別の実施形態ではその弱毒化株はＬｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ）である。ＬｍｄｄＡは、リステリアワクチンベクターに基づき、これは病原性遺伝子ａｃｔＡの欠失に起因して弱毒化され、かつインビボおよびインビトロでの望ましい異種抗原または切断ＬＬＯ発現のためにｄａｌ遺伝子の相補によってプラスミドを保持する。

別の実施形態では、弱毒化株はＬｍｄｄＡである。別の実施形態ではその弱毒化株はＬｍΔａｃｔＡである。別の実施形態ではその弱毒化株はＬｍΔＰｒｆＡである。別の実施形態ではその弱毒化株はＬｍΔＰｒｆＡ＊である。別の実施形態ではその弱毒化株はＬｍΔＰｌｃＢである。別の実施形態ではその弱毒化株はＬｍΔＰｌｃＡである。別の実施形態ではその株は上述の株のいずれかの二重変異体または三重変異体である。別の実施形態では、この株は、リステリアベースのワクチンの先天的な特性である強いアジュバント効果を発揮する。別の実施形態ではこの株はＥＧＤリステリアバックボーンから作られる。別の実施形態では本発明で使用される株は非溶血性ＬＬＯを発現するリステリア株である。

別の実施形態では前述のリステリア株は栄養要求性突然変異体である。別の実施形態ではそのリステリア株はビタミン合成遺伝子をコードする遺伝子が欠損している。別の実施形態ではそのリステリア株はパントテン酸シンターゼをコードする遺伝子が欠損している。

１つの実施形態ではＤ−アラニン欠損ＡＡ株を、例えば、当業者に周知の多数の方法で作製することができ、それらの方法には欠失突然変異形成、挿入突然変異形成、およびフレームシフト突然変異、タンパク質の早期終止を引き起こす突然変異、または遺伝子発現に影響する調節性配列の突然変異を生成することになる突然変異形成が含まれる。別の実施形態では、組換えＤＮＡ技術を使用して、または変異原性化学薬品もしくは放射線照射を用い、その後で突然変異体を選択する伝統的な突然変異形成技術を使用して突然変異形成を達成することができる。別の実施形態では、栄養要求性表現型の復帰に伴われる低い可能性のため、欠失変異体が好ましい。別の実施形態では、本明細書に提示されるプロトコルに従って生成されるＤ−アラニンについての変異体は、単純な実験室培養アッセイにおいてＤ−アラニンの非存在下で増殖する能力について試験される場合がある。別の実施形態では、この化合物の非存在下で増殖することができない変異体がさらなる研究のために選択される。

別の実施形態では、本明細書に開示されるとおり、リステリアの突然変異生成のための標的として上述のＤ−アラニンに関連する遺伝子に加えて、代謝酵素の合成に関与する他の遺伝子が使用されてもよい。

別の実施形態ではその代謝酵素は、前述の組換え型細菌株の染色体の残りの部分に欠けている内在性代謝遺伝子を相補する。１つの実施形態ではその内在性代謝遺伝子は染色体内で突然変異が形成される。別の実施形態ではその内在性代謝遺伝子は染色体から欠失している。別の実施形態ではその代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。別の実施形態ではその代謝酵素はその組換え型リステリア株内で細胞壁合成に使用されるアミノ酸の形成を触媒する。別の実施形態ではその代謝酵素はアラニンラセマーゼ酵素である。別の実施形態ではその代謝酵素はＤ−アミノ酸トランスフェラーゼ酵素である。各々の可能性は本明細書で開示された方法および組成物の別個の実施形態を代表する。

１つの実施形態では前述の栄養要求性リステリア株は、その栄養要求性リステリア株の栄養要求性を相補する代謝酵素を含むエピソーム性発現ベクターを含む。別の実施形態では、そのコンストラクトはエピソーム様式でそのリステリア株内に含有される。別の実施形態ではその外来抗原はその組換え型リステリア株が保持するプラスミドベクターから発現される。別の実施形態ではそのエピソーム性発現ベクターは抗生物質耐性マーカーを欠いている。１つの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の抗原は、ＰＥＳＴ配列を含むポリペプチドに融合される。

別の実施形態では前述のリステリア株はアミノ酸（ＡＡ）代謝酵素が欠損している。別の実施形態ではそのリステリア株はＤグルタミン酸シンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態ではそのリステリア株はｄａｔ遺伝子が欠損している。別の実施形態ではそのリステリア株はｄａｌ遺伝子が欠損している。別の実施形態ではそのリステリア株はｄｇａ遺伝子が欠損している。別の実施形態ではそのリステリア株はジアミノピメリン酸合成に関与する遺伝子が欠損している。ＣｙｓＫ。別の実施形態ではその遺伝子はビタミンＢ１２非依存的メチオニンシンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はｔｒｐＡである。別の実施形態ではその遺伝子はｔｒｐＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｔｒｐＥである。別の実施形態ではその遺伝子はａｓｎＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｇｌｔＤである。別の実施形態ではその遺伝子はｇｌｔＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｌｅｕＡである。別の実施形態ではその遺伝子はａｒｇＧである。別の実施形態ではその遺伝子はｔｈｒＣである。別の実施形態ではそのリステリア株は上述の遺伝子のうちの１つ以上が欠損している。

別の実施形態ではそのリステリア株はシンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態ではその遺伝子はＡＡ合成遺伝子である。別の実施形態ではその遺伝子はｆｏｌＰである。別の実施形態ではその遺伝子はジヒドロウリジンシンターゼファミリータンパク質である。別の実施形態ではその遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態ではその遺伝子はｉｓｐＦである。別の実施形態ではその遺伝子はホスホエノールピルビン酸シンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はｈｉｓＦである。別の実施形態ではその遺伝子はｈｉｓＨである。別の実施形態ではその遺伝子はｆｌｉＩである。別の実施形態ではその遺伝子はリボソームラージサブユニット・シュードウリジンシンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態ではその遺伝子は二機能性ＧＭＰシンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質である。別の実施形態ではその遺伝子はｃｏｂＳである。別の実施形態ではその遺伝子はｃｏｂＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｃｂｉＤである。別の実施形態ではその遺伝子はウロポルフィリン−ＩＩＩＣ−メチルトランスフェラーゼ／ウロポルフィリノゲン−ＩＩＩシンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はｃｏｂＱである。別の実施形態ではその遺伝子はｕｐｐＳである。別の実施形態ではその遺伝子はｔｒｕＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｄｘｓである。別の実施形態ではその遺伝子はｍｖａＳである。別の実施形態ではその遺伝子はｄａｐＡである。別の実施形態ではその遺伝子はｉｓｐＧである。別の実施形態ではその遺伝子はｆｏｌＣである。別の実施形態ではその遺伝子はクエン酸シンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はａｒｇＪである。別の実施形態ではその遺伝子は３−デオキシ−７−ホスホヘプツロン酸シンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はインドール−３−グリセロール−リン酸シンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はアントラニル酸シンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼ構成要素である。別の実施形態ではその遺伝子はｍｅｎＢである。別の実施形態ではその遺伝子はメナキノン特異的イソコリスミ酸シンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩまたはＩＩである。別の実施形態ではその遺伝子はホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はｃａｒＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｃａｒＡである。別の実施形態ではその遺伝子はｔｈｙＡである。別の実施形態ではその遺伝子はｍｇｓＡである。別の実施形態ではその遺伝子はａｒｏＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｈｅｐＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｒｌｕＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｉｌｖＢである。別の実施形態ではその遺伝子はｉｌｖＮである。別の実施形態ではその遺伝子はａｌｓＳである。別の実施形態ではその遺伝子はｆａｂＦである。別の実施形態ではその遺伝子はｆａｂＨである。別の実施形態ではその遺伝子はシュードウリジンシンターゼである。別の実施形態ではその遺伝子はｐｙｒＧである。別の実施形態ではその遺伝子はｔｒｕＡである。別の実施形態ではその遺伝子はｐａｂＢである。別の実施形態ではその遺伝子はａｔｐシンターゼ遺伝子（例えば、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ−２、ａｐｔＧ、ａｔｐＡ−２、等々）である。

別の実施形態ではその遺伝子はｐｈｏＰである。別の実施形態ではその遺伝子はａｒｏＡである。別の実施形態ではその遺伝子はａｒｏＣである。別の実施形態ではその遺伝子はａｒｏＤである。別の実施形態ではその遺伝子はｐｌｃＢである。

別の実施形態ではそのリステリア株はペプチドトランスポーターが欠損している。別の実施形態ではその遺伝子はＡＢＣトランスポーター／ＡＴＰ結合／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態ではその遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣトランスポーター／オリゴペプチド結合タンパク質である。別の実施形態ではその遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣトランスポーター／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態ではその遺伝子は亜鉛ＡＢＣトランスポーター／亜鉛結合タンパク質である。別の実施形態ではその遺伝子は糖ＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はリン酸トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はＺＩＰ亜鉛トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はＥｍｒＢ／ＱａｃＡファミリーの薬剤耐性トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子は硫酸トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はプロトン依存性オリゴペプチドトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はマグネシウムトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子は蟻酸／亜硝酸トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はスペルミジン／プトレシンＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はＮａ／Ｐｉコトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子は糖リン酸トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はグルタミンＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はメジャーファシリテイターファミリートランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はグリシンベタイン／Ｌ−プロリンＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はモリブデンＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はテイコ酸ＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はコバルトＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はアンモニウムトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はアミノ酸ＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子は細胞分裂ＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はマンガンＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子は鉄化合物ＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はマルトース／マルトデキストリンＡＢＣトランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子はＢｃｒ／ＣｆｌＡファミリーの薬剤耐性トランスポーターである。別の実施形態ではその遺伝子は上記のタンパク質のうちの１つのサブユニットである。

一実施形態では、組み換え型リステリアに到達するために、リステリアを形質転換するために使用される核酸分子が本明細書に開示されている。別の実施形態では、リステリアを形質転換するために使用される本明細書に開示される核酸は病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態ではその核酸分子はリステリアゲノムの中に組み込まれ、非機能性病原性遺伝子を担持する。別の実施形態ではその病原性遺伝子はその組換え型リステリア内で突然変異が形成される。さらに別の実施形態ではその核酸分子はリステリアゲノム内に存在する内在性遺伝子を不活性化するために使用される。さらに別の実施形態ではその病原性遺伝子はａｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌＡ遺伝子、ならびにｉｎｌＢ遺伝子、ｉｎｌＣ遺伝子、ｉｎｌＪ遺伝子、ｐｌｂＣ遺伝子、ｂｓｈ遺伝子、またはｐｒｆＡ遺伝子である。当業者は、病原性遺伝子は組換え型リステリア内の病原性と関連付けられる当技術分野において知られているあらゆる遺伝子であり得ることを理解すべきである。

さらに別の実施形態において、リステリア株はｉｎｌＡ突然変異体、ｉｎｌＢ突然変異体、ｉｎｌＣ突然変異体、ｉｎｌＪ突然変異体、ｐｒｆＡ突然変異体、ａｃｔＡ突然変異体、ｄａｌ／ｄａｔ突然変異体、ｐｒｆＡ突然変異体、ｐｌｃＢ欠失突然変異体、またはｐｌｃＡとｐｌｃＢの両方を欠いている二重変異体、またはａｃｔＡとｉｎｌＢの両方を欠いている二重変異体である。別の実施形態ではそのリステリアはこれらの遺伝子の欠失または突然変異を個別に、または組み合わせて含む。別の実施形態では、本明細書に開示されたリステリアは、各々遺伝子のうちの１つを欠いている。別の実施形態では、本明細書に開示されたリステリアは、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、およびｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を含む本明細書に開示されたいずれかの遺伝子のうちの少なくとも１個かつ最高１０個を欠いている。別の実施形態ではｐｒｆＡ突然変異体はＤ１３３ＶＰｒｆＡ突然変異体である。

１つの実施形態では前述の弱毒化リステリアは組換え型リステリアである。別の実施形態ではその組換え型リステリアは、ゲノムインターナリンＣ（ｉｎｌＣ）遺伝子の突然変異または欠失を含む。別の実施形態ではその組換え型リステリアは、ゲノムａｃｔＡ遺伝子およびゲノムインターナリンＣ遺伝子の突然変異または欠失を含む。一実施形態では、リステリアの隣接するＴ細胞への転座は、プロセス中に関与するａｃｔＡ遺伝子および／またはｉｎｌＣ遺伝子の欠失によって阻害され、これはプロセスに関与するので、それによって、免疫原性の増加およびワクチンバックボーンとしての有用性によって結果として予想外に高いレベルの弱毒化が得られる。

１つの実施形態ではその代謝遺伝子、病原性遺伝子などはそのリステリア株の染色体内で欠けている。別の実施形態ではその代謝遺伝子、病原性遺伝子などはそのリステリア株の染色体内および何らかのエピソーム性遺伝要素内で欠けている。別の実施形態ではその代謝遺伝子、病原性遺伝子などはその病原性株のゲノム内で欠けている。１つの実施形態ではその病原性遺伝子は染色体内で突然変異が形成される。別の実施形態ではその病原性遺伝子は染色体から欠失している。

一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は弱毒化されている。別の実施形態ではその組換え型リステリアはａｃｔＡ病原性遺伝子を欠いている。別の実施形態ではその組換え型リステリアはｐｒｆＡ病原性遺伝子を欠いている。別の実施形態ではその組換え型リステリアはｉｎｌＢ遺伝子を欠いている。別の実施形態ではその組換え型リステリアはａｃｔＡ遺伝子とｉｎｌＢ遺伝子の両方を欠いている。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ａｃｔＡ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ｉｎｌＢ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡ、ｉｎｌＢおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡ、ｉｎｌＢおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は内因性ＡｃｔＡ、ｉｎｌＢおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は以下の遺伝子：ａｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｐｒｆＡ、ｐｌｃＡ、ｐｌｃＢのうちの任意の単一遺伝子または遺伝子の組み合わせの不活性化突然変異を含む。

当業者であれば、「突然変異」という用語およびその文法的に同等の用語が、配列（核酸配列またはアミノ酸配列）に対するあらゆるタイプの突然変異または修飾を含み、及びそれらは欠失突然変異、短縮化、不活性化、切断、または転座を含むことを認識するであろう。これらのタイプの突然変異は当技術分野においてよく知られている。

一実施形態では、本明細書に開示された代謝酵素または相補する遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌を選択するために、形質転換した栄養要求性細菌をアミノ酸代謝遺伝子または相補遺伝子の発現を選択する培地上で成長させる。別の実施形態ではＤ−グルタミン酸合成について栄養要求性の細菌がＤ−グルタミン酸合成遺伝子を含むプラスミドで形質転換され、Ｄ−グルタミン酸が無い状態でその栄養要求性細菌が増殖し、一方でそのプラスミドで形質転換されなかった栄養要求性細菌、またはＤ−グルタミン酸合成のためのタンパク質をコードするプラスミドを発現していない栄養要求性細菌は増殖しない。別の実施形態では、Ｄ−アラニン合成に関し栄養要求性の細菌は、プラスミドがＤ−アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素をコードする単離核酸を含む場合、本明細書に開示されるプラスミドが形質転換され、および発現するときにＤ−アラニンの非存在下で増殖する。必要な増殖因子、添加物、アミノ酸、ビタミン、抗生物質などを含んでいる、または欠いている適切な培地を作製するためのそのような方法は当技術分野においてよく知られており、また市販されている（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリン・レイクス）。各方法は、本明細書で開示される別個の実施形態を表す。

別の実施形態では、本明細書に開示されるプラスミドを含む栄養要求性細菌が適切な培地上で選択されると、この細菌は選択圧力の存在下で増殖する。そのような繁殖は栄養要求性因子を有しない培地でのその細菌の増殖を含む。その栄養要求性細菌内にアミノ酸代謝酵素を発現するそのプラスミドが存在することにより、そのプラスミドがその細菌と共に複製し、そうしてそのプラスミドを保持する細菌が継続的に選択されることが確実になる。本開示および本明細書の方法を備えるとき、プラスミドを含む栄養要求性細菌が増殖する培地の体積を調節することによって、当業者は、リステリアワクチンベクターの生産を容易にスケールアップすることができる。

当業者は、別の実施形態では他の栄養要求性株および相補系を本発明に関して使用するためにそれらが適合されることを理解する。

１つの実施形態ではＮ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原は相互に直接融合している。別の実施形態ではＮ末端ＬＬＯタンパク質断片をコードする遺伝子および異種抗原をコードする遺伝子は相互に直接融合している。別の実施形態ではＮ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原は機能可能であるようにリンカーペプチドを介して接続されている。別の実施形態ではＮ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原は異種ペプチドを介して接続されている。別の実施形態ではＮ末端ＬＬＯタンパク質断片は異種抗原に対してＮ末端側にある。別の実施形態ではＮ末端ＬＬＯタンパク質断片は単独で、すなわち融合されていない形態で発現および使用される。別の実施形態ではＮ末端ＬＬＯタンパク質断片は融合タンパク質の最Ｎ末端部分である。別の実施形態では短縮型ＬＬＯは、Ｎ末端ＬＬＯを得るためにＣ末端側において切断される。別の実施形態では短縮型ＬＬＯは非溶血性ＬＬＯである。

１つの実施形態ではＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および異種抗原は相互に直接融合している。別の実施形態ではＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片をコードする遺伝子および異種抗原をコードする遺伝子は相互に直接融合している。別の実施形態ではＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および異種抗原は機能可能であるようにリンカーペプチドを介して接続されている。別の実施形態ではＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および異種抗原は異種ペプチドを介して接続されている。別の実施形態ではＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は異種抗原に対してＮ末端側にある。別の実施形態ではＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は単独で、すなわち融合されていない形態で発現および使用される。別の実施形態ではＮ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は融合タンパク質の最Ｎ末端部分である。別の実施形態では短縮型ＡｃｔＡは、Ｎ末端ＡｃｔＡを得るためにＣ末端側において切断される。

別の実施形態では、本明細書で開示された組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態ではその組換え型リステリア株はその組換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。別の実施形態では、本明細書に開示された組み換え型核酸は、本明細書に開示された組み換え型リステリア株のプラスミド中にある。別の実施形態ではそのプラスミドはその組換え型リステリア株の染色体中に組み込まれないエピソーム性プラスミドである。別の実施形態ではそのプラスミドはそのリステリア株の染色体中に組み込まれる組み込みプラスミドである。別の実施形態ではそのプラスミドはマルチコピープラスミドである。

１つの実施形態では前述の異種抗原は腫瘍関連抗原である。一実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法の組み換え型リステリア株は腫瘍細胞によって発現される異種抗原性ポリペプチドを発現する。１つの実施形態では腫瘍関連抗原は前立腺特異抗原（ＰＳＡ）である。別の実施形態では腫瘍関連抗原はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原である。さらに別の実施形態において、腫瘍関連抗原は、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１１／０１４２７９号明細書に記載されるＨｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原である。さらに別の実施形態では腫瘍関連抗原は血管新生抗原である。

１つの実施形態において、本明細書に開示されるペプチドは抗原性ペプチドである。別の実施形態において、本明細書に開示されるペプチドは腫瘍抗原に由来する。別の実施形態において、本明細書に開示されるペプチドは感染性疾患の抗原に由来する。別の実施形態において、本明細書に開示されるペプチドは自己抗原に由来する。別の実施形態において、本明細書に開示されるペプチドは血管新生抗原に由来する。

一実施形態では、本明細書に開示されたペプチドが由来する抗原は、真菌病原体、細菌、寄生生物、蠕虫、またはウイルスに由来する。他の実施形態では本明細書のペプチドが由来する抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶｇｐ１２０、ＨＩＶｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インスリンペプチドＢ、ばれいしょ粉状そうか病菌抗原、ビブリオース抗原、サルモネラ抗原、ニューモコッカス抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、インフルエンザ菌外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、黒色腫関連抗原（ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ）、タイプＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５または−４５ヒトパピローマウイルス由来のヒトパピローマウイルス抗原Ｅ１およびＥ２、腫瘍抗原ＣＥＡ、変異型かそうではないｒａｓタンパク質、変異型かそうではないｐ５３タンパク質、Ｍｕｃ１、メソテリン、ＥＧＦＲＶＩＩＩまたはｐＳＡから選択される。

他の実施形態ではそのペプチドは、以下の疾患、すなわち、コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳、黄熱病、アジソン病由来の免疫原および抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルートン症候群、固形腫瘍および血液担持腫瘍を含む癌、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓移植、心臓移植、膵臓移植、肺移植、骨移植、および肝臓移植などの移植拒絶反応、グレーブス病、多腺性自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ性関節炎、血清反応陰性脊椎関節症、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ウェゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、尋常性白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、強膜、上強膜、ぶどう膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じん麻疹、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、アミロイドーシス、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアスポロゾイト周囲タンパク質、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、およびリステリア症のうちの１つに関連する抗原に由来する。

別の実施形態では、本明細書に開示されたペプチドが由来する抗原は腫瘍関連抗原であり、これは、一実施形態では、ＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）タンパク質、例えば、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、チロシナーゼ；突然変異ｒａｓタンパク質；突然変異ｐ５３タンパク質；進行癌と関連付けられたｐ９７メラノーマ抗原、ｒａｓペプチドもしくはｐ５３ペプチド；子宮頸癌と関連付けられたＨＰＶ１６／１８抗原、乳癌と関連付けられたＫＬＨ抗原、大腸癌と関連付けられたＣＥＡ（癌胎児抗原）、ｇｐ１００、メラノーマと関連付けられたＭＡＲＴ１抗原、または前立腺癌と関連付けられたＰＳＡ抗原といった腫瘍抗原のうちの１つである。別の実施形態では、本明細書に開示された組成物および方法のための抗原はメラノーマ−関連抗原であり、これは、一実施形態では、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはこれらの組み合わせである。当分野において公知の他の腫瘍関連抗原もまた本開示において予期される。

１つの実施形態において、ペプチドは、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願番号１２／９４５，３８６号明細書に記載されるキメラＨｅｒ２抗原に由来する。

別の実施形態において、ペプチドは、ＨＰＶ−Ｅ７（ＨＰＶ１６株またはＨＰＶ１８株のいずれかに由来）、ＨＰＶ−Ｅ６（ＨＰＶ１６株またはＨＰＶ１８株のいずれかに由来）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ、ＳＣＣＥ、ＣＥＡ、ＬＭＰ−１、ｐ５３、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＰＳＭＡ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＷＴ−１、ＨＩＶ−１Ｇａｇ、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＥＧＦＲ−ＩＩＩ、サバイビン、ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ５（ＢＩＲＣ５）、ＬＭＰ−１、ｐ５３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｍｕｃ１、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、またはこれらの組み合せから選択される抗原に由来する。

１つの実施形態において、本開示のリステリアによって発現されるポリペプチドは、神経ペプチド成長因子拮抗薬であってもよく、１つの実施形態では、［Ｄ−Ａｒｇ１、Ｄ−Ｐｈｅ５、Ｄ−Ｔｒｐ７，９、Ｌｅｕ１１］サブスタンスＰ、［Ａｒｇ６、Ｄ−Ｔｒｐ７，９、ＮｍｅＰｈｅ８］サブスタンスＰ（６−１１）である。これらの実施形態および関連する実施形態は当業者に理解される。

一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は、腫瘍関連抗原をコードする核酸分子を含むが、ここで抗原はＨＰＶ−Ｅ７タンパク質を含む。一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は、ＨＰＶ−Ｅ７タンパク質をコードする核酸分子を含む。

一実施形態では、Ｅ７タンパク質全体またはその断片のいずれかが、ＬＬＯタンパク質またはその切断部またはペプチド、ＡｃｔＡタンパク質またはその切断部またはペプチド、またはＰＥＳＴ様配列を含むペプチドに融合され、本開示の組成物および方法の組み換え型ポリペプチドまたはペプチドを生成する。別の実施形態では、（全体で、または断片の供与源としてのどちらかで）利用されるＥ７タンパク質は、次の配列
ＭＨＧＤＴＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＣＹＥＱＬＮＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴＬＧＩＶＣＰＩＣＳＱＫＰ（配列番号２０）を有する。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号２０の相同体である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号２０の変異体である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号２０の異性体である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号２０の断片である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号２０の相同体の断片である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号２０の変異体の断片である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は配列番号２０の異性体の断片である。

別の実施形態ではそのＥ７タンパク質の配列は、
ＭＨＧＰＫＡＴＬＱＤＩＶＬＨＬＥＰＱＮＥＩＰＶＤＬＬＣＨＥＱＬＳＤＳＥＥＥＮＤＥＩＤＧＶＮＨＱＨＬＰＡＲＲＡＥＰＱＲＨＴＭＬＣＭＣＣＫＣＥＡＲＩＥＬＶＶＥＳＳＡＤＤＬＲＡＦＱＱＬＦＬＮＴＬＳＦＶＣＰＷＣＡＳＱＱ（配列番号２１）である。別の実施形態ではそのＥ６タンパク質は配列番号２１の相同体である。別の実施形態ではそのＥ６タンパク質は配列番号２１の変異体である。別の実施形態ではそのＥ６タンパク質は配列番号２１の異性体である。別の実施形態ではそのＥ６タンパク質は配列番号２１の断片である。別の実施形態ではそのＥ６タンパク質は配列番号２１の相同体の断片である。別の実施形態ではそのＥ６タンパク質は配列番号２１の変異体の断片である。別の実施形態ではそのＥ６タンパク質は配列番号２１の異性体の断片である。

別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は以下のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つ、すなわち、Ｍ２４２１５（配列番号８３）、ＮＣ＿００４５００（配列番号８４）、Ｖ０１１１６（配列番号８５）、Ｘ６２８４３（配列番号８６）、またはＭ１４１１９（配列番号８７）に示される配列を有する。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の相同体である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の変異体である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の異性体である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の断片である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の相同体の断片である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の変異体の断片である。別の実施形態ではそのＥ７タンパク質は上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つの配列の異性体の断片である。

１つの実施形態において、ＨＰＶ抗原はＨＰＶ１６である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−１８である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８から選択される。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−３１である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−３５である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−３９である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−４５である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−５１である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−５２である。別の実施形態ではＨＰＶはＨＰＶ−５８である。別の実施形態ではＨＰＶは高リスクＨＰＶタイプである。別の実施形態ではＨＰＶは粘膜ＨＰＶタイプである。

１つの実施形態ではＨＰＶＥ６はＨＰＶ−１６由来である。別の実施形態では、ＨＰＶＥ７はＨＰＶ−１６由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ−Ｅ６はＨＰＶ−１８由来である。別の実施形態では、ＨＰＶ−Ｅ７はＨＰＶ−１８由来である。別の実施形態では、ＨＰＶＥ６抗原が、本開示の組成物または方法でのＥ７抗原の代わりにまたはＥ７抗原に加えて、ＨＰＶ媒介性疾患、障害、または症状を治療もしくは軽快するために利用される。別の実施形態ではＨＰＶ−１６Ｅ６およびＥ７は、ＨＰＶ−１８Ｅ６およびＥ７の代わりに、またはこれと組み合せて利用される。そのような実施形態ではその組換え型リステリアはＨＰＶ−１６Ｅ６およびＥ７を染色体から発現し、且つ、ＨＰＶ−１８Ｅ６およびＥ７をプラスミドから発現してよく、またはその逆で発現してもよい。別の実施形態では、ＨＰＶ−１６Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８Ｅ６およびＥ７抗原は、本明細書に開示された組み換え型リステリア内に存在するプラスミドから発現される。別の実施形態では、ＨＰＶ−１６Ｅ６およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８Ｅ６およびＥ７抗原は、本明細書に開示された組み換え型リステリアの染色体から発現される。別の実施形態ではＨＰＶ−１６Ｅ６抗原およびＥ７抗原ならびにＨＰＶ−１８Ｅ６抗原およびＥ７抗原は、各ＨＰＶ株のＥ６抗原とＥ７抗原のそれぞれがプラスミドまたは染色体のどちらかより発現される実施形態をはじめとする上記の実施形態のあらゆる組合せで発現する。

一実施形態では、本明細書に開示された組み換え型リステリア株は、腫瘍関連抗原をコードする核酸分子を含むが、ここで腫瘍関連抗原はＨｅｒ−２／ｎｅｕペプチドを含む。一実施形態では、腫瘍関連抗原はＨｅｒ−２／ｎｅｕ抗原を含む。一実施形態では、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕペプチドはキメラＨｅｒ−２／ｎｅｕ抗原（ｃＨｅｒ−２）を含む。

１つの実施形態では、弱毒化栄養要求性リステリアワクチン株は、リステリアワクチンベクターが基となっており、これは病毒性遺伝子のＡｃｔＡの欠失に起因して弱毒化されており、ｄａｌ遺伝子の補完によるｉｎｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｔｒｏでのＨＥＲ２／ｎｅｕ発現のためにプラスミドを保持している。一実施形態では、リステリア株はリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の最初の４４１のアミノ酸を融合したキメラ型Ｈｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を発現および分泌する。別の実施形態では、リステリアは、ｄａｌ、ｄａｔおよびＡｃｔＡ内因性遺伝子内に突然変異を有するｄａｌ／ｄａｔ／ＡｃｔＡリステリアである。別の実施形態ではその突然変異はそれらの変異形成された遺伝子の欠失、短縮化、または不活性化である。別の実施形態では、リステリア株は、耐性を破壊する能力を有する強くかつ抗原特異的な抗腫瘍応答をトランスジェニック動物内のＨＥＲ２／ｎｅｕに対して行使する。別の実施形態では、免疫化したマウスの脾臓からより迅速に除去されるので、ｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ株は高度に弱毒化され、以前のリステリアワクチン世代より良好な安全性プロファイルを有する。別の実施形態において、リステリア株は、トランスジェニック動物において、このワクチンの抗生物質耐性であり、より強い毒性株のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２よりも腫瘍発現のさらなる遅延を生じさせる（ＵＳＳＮ１２／９４５，３８６；米国公開番号２０１１／０１４２７９１を参照のこと。それらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、リステリア株は、腫瘍内の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の著しい減少を生じる。別の実施形態では、ＬｍｄｄＡワクチンで処理した腫瘍内のＴｒｅｇのより低い頻度は、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加をもたらし、ＬｍｄｄＡワクチンを用いた免疫化後により好ましい腫瘍の微小環境を得ることができることを示唆する。一実施形態では、本開示は、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質に融合したまたはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを提供する。一実施形態では、本開示は、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質に融合したまたはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片から成る組み換え型ポリペプチドを提供する。その実施形態では前述の異種抗原はＨｅｒ−２キメラタンパク質またはその断片である。

別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物のＨｅｒ−２キメラタンパク質はヒトＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態ではそのＨｅｒ−２タンパク質はマウスＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態ではそのＨｅｒ−２タンパク質はラットＨｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態ではそのＨｅｒ−２タンパク質は霊長類Ｈｅｒ−２キメラタンパク質である。別の実施形態ではそのＨｅｒ−２タンパク質はヒトまたは他のあらゆる動物種のＨｅｒ−２キメラタンパク質または当技術分野において知られているその組合せである。

別の実施形態ではそのＨｅｒ−２タンパク質は「ＨＥＲ−２／ｎｅｕ」、「Ｅｒｂｂ２」、「ｖ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｃ−ｅｒｂ−ｂ２」、「ｎｅｕ」、または「ｃＮｅｕ」と称されるタンパク質である。

１つの実施形態では前述のＨｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は、癌遺伝子のＭＨＣクラスＩエピトープのクラスターを示すＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原の２つの細胞外断片と１つの細胞内断片を保持し、別の実施形態ではそのキメラタンパク質は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の３つのＨ２ＤｑおよびマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも１７エピトープ（断片ＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１）を保持する（図２０Ａ）。別の実施形態ではそのキメラタンパク質はマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも１３エピトープ（断片ＥＣ２およびＩＣ１）を保持する。別の実施形態ではそのキメラタンパク質はマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも１４エピトープ（断片ＥＣ１およびＩＣ１）を保持する。別の実施形態ではそのキメラタンパク質はマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも９エピトープ（断片ＥＣ１およびＩＣ２）を保持する。別の実施形態ではそのＨｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質は非溶血性リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）に融合している。別の実施形態ではそのＨｅｒ２−ｎｅｕキメラタンパク質はリステリア・モノサイトゲネスのリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質の最初の４４１アミノ酸に融合しており、リステリア・モノサイトゲネス弱毒化栄養要求性株ＬｍｄｄＡによって発現および分泌される。別の実施形態では、キメラ型ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原／ＬＬＯ融合タンパク質を発現する本明細書に開示される弱毒化栄養要求性株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌は、ｉｎｖｉｔｒｏで８時間増殖した後にＴＣＡ沈殿させた細胞培養上清内のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２のものと同等である（図２０Ｂ参照）。

一実施形態では、未感作動物、または無関係のリステリアワクチンを注射したマウスではＣＴＬ活性は検出されなかった（図２１Ａ）。一方で別の実施形態では、本明細書に開示される弱毒化栄養要求性株は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスからの脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌を刺激することができる（図２１Ｂ及び２１Ｃ）。

別の実施形態において、Ｈｅｒ−２キメラタンパク質は配列番号２２に示される以下の核酸配列によってコードされる：
ｇａｇａｃｃｃａｃｃｔｇｇａｃａｔｇｃｔｃｃｇｃｃａｃｃｔｃｔａｃｃａｇｇｇｃｔｇｃｃａｇｇｔｇｇｔｇｃａｇｇｇａａａｃｃｔｇｇａａｃｔｃａｃｃｔａｃｃｔｇｃｃｃａｃｃａａｔｇｃｃａｇｃｃｔｇｔｃｃｔｔｃｃｔｇｃａｇｇａｔａｔｃｃａｇｇａｇｇｔｇｃａｇｇｇｃｔａｃｇｔｇｃｔｃａｔｃｇｃｔｃａｃａａｃｃａａｇｔｇａｇｇｃａｇｇｔｃｃｃａｃｔｇｃａｇａｇｇｃｔｇｃｇｇａｔｔｇｔｇｃｇａｇｇｃａｃｃｃａｇｃｔｃｔｔｔｇａｇｇａｃａａｃｔａｔｇｃｃｃｔｇｇｃｃｇｔｇｃｔａｇａｃａａｔｇｇａｇａｃｃｃｇｃｔｇａａｃａａｔａｃｃａｃｃｃｃｔｇｔｃａｃａｇｇｇｇｃｃｔｃｃｃｃａｇｇａｇｇｃｃｔｇｃｇｇｇａｇｃｔｇｃａｇｃｔｔｃｇａａｇｃｃｔｃａｃａｇａｇａｔｃｔｔｇａａａｇｇａｇｇｇｇｔｃｔｔｇａｔｃｃａｇｃｇｇａａｃｃｃｃｃａｇｃｔｃｔｇｃｔａｃｃａｇｇａｃａｃｇａｔｔｔｔｇｔｇｇａａｇａａｔａｔｃｃａｇｇａｇｔｔｔｇｃｔｇｇｃｔｇｃａａｇａａｇａｔｃｔｔｔｇｇｇａｇｃｃｔｇｇｃａｔｔｔｃｔｇｃｃｇｇａｇａｇｃｔｔｔｇａｔｇｇｇｇａｃｃｃａｇｃｃｔｃｃａａｃａｃｔｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃａｇｃｃａｇａｇｃａｇｃｔｃｃａａｇｔｇｔｔｔｇａｇａｃｔｃｔｇｇａａｇａｇａｔｃａｃａｇｇｔｔａｃｃｔａｔａｃａｔｃｔｃａｇｃａｔｇｇｃｃｇｇａｃａｇｃｃｔｇｃｃｔｇａｃｃｔｃａｇｃｇｔｃｔｔｃｃａｇａａｃｃｔｇｃａａｇｔａａｔｃｃｇｇｇｇａｃｇａａｔｔｃｔｇｃａｃａａｔｇｇｃｇｃｃｔａｃｔｃｇｃｔｇａｃｃｃｔｇｃａａｇｇｇｃｔｇｇｇｃａｔｃａｇｃｔｇｇｃｔｇｇｇｇｃｔｇｃｇｃｔｃａｃｔｇａｇｇｇａａｃｔｇｇｇｃａｇｔｇｇａｃｔｇｇｃｃｃｔｃａｔｃｃａｃｃａｔａａｃａｃｃｃａｃｃｔｃｔｇｃｔｔｃｇｔｇｃａｃａｃｇｇｔｇｃｃｃｔｇｇｇａｃｃａｇｃｔｃｔｔｔｃｇｇａａｃｃｃｇｃａｃｃａａｇｃｔｃｔｇｃｔｃｃａｃａｃｔｇｃｃａａｃｃｇｇｃｃａｇａｇｇａｃｇａｇｔｇｔｇｔｇｇｇｃｇａｇｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｇｃｃａｃｃａｇｃｔｇｔｇｃｇｃｃｃｇａｇｇｇｃａｇｃａｇａａｇａｔｃｃｇｇａａｇｔａｃａｃｇａｔｇｃｇｇａｇａｃｔｇｃｔｇｃａｇｇａａａｃｇｇａｇｃｔｇｇｔｇｇａｇｃｃｇｃｔｇａｃａｃｃｔａｇｃｇｇａｇｃｇａｔｇｃｃｃａａｃｃａｇｇｃｇｃａｇａｔｇｃｇｇａｔｃｃｔｇａａａｇａｇａｃｇｇａｇｃｔｇａｇｇａａｇｇｔｇａａｇｇｔｇｃｔｔｇｇａｔｃｔｇｇｃｇｃｔｔｔｔｇｇｃａｃａｇｔｃｔａｃａａｇｇｇｃａｔｃｔｇｇａｔｃｃｃｔｇａｔｇｇｇｇａｇａａｔｇｔｇａａａａｔｔｃｃａｇｔｇｇｃｃａｔｃａａａｇｔｇｔｔｇａｇｇｇａａａａｃａｃａｔｃｃｃｃｃａａａｇｃｃａａｃａａａｇａａａｔｃｔｔａｇａｃｇａａｇｃａｔａｃｇｔｇａｔｇｇｃｔｇｇｔｇｔｇｇｇｃｔｃｃｃｃａｔａｔｇｔｃｔｃｃｃｇｃｃｔｔｃｔｇｇｇｃａｔｃｔｇｃｃｔｇａｃａｔｃｃａｃｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇａｃａｃａｇｃｔｔａｔｇｃｃｃｔａｔｇｇｃｔｇｃｃｔｃｔｔａｇａｃｔａａ（配列番号２２）。

別の実施形態ではそのＨｅｒ−２キメラタンパク質は以下の配列を持つ：
ＥＴＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶＱＧＮＬＥＬＴＹＬＰＴＮＡＳＬＳＦＬＱＤＩＱＥＶＱＧＹＶＬＩＡＨＮＱＶＲＱＶＰＬＱＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬＡＶＬＤＮＧＤＰＬＮＮＴＴＰＶＴＧＡＳＰＧＧＬＲＥＬＱＬＲＳＬＴＥＩＬＫＧＧＶＬＩＱＲＮＰＱＬＣＹＱＤＴＩＬＷＫＮＩＱＥＦＡＧＣＫＫＩＦＧＳＬＡＦＬＰＥＳＦＤＧＤＰＡＳＮＴＡＰＬＱＰＥＱＬＱＶＦＥＴＬＥＥＩＴＧＹＬＹＩＳＡＷＰＤＳＬＰＤＬＳＶＦＱＮＬＱＶＩＲＧＲＩＬＨＮＧＡＹＳＬＴＬＱＧＬＧＩＳＷＬＧＬＲＳＬＲＥＬＧＳＧＬＡＬＩＨＨＮＴＨＬＣＦＶＨＴＶＰＷＤＱＬＦＲＮＰＨＱＡＬＬＨＴＡＮＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡＣＨＱＬＣＡＲＧＱＱＫＩＲＫＹＴＭＲＲＬＬＱＥＴＥＬＶＥＰＬＴＰＳＧＡＭＰＮＱＡＱＭＲＩＬＫＥＴＥＬＲＫＶＫＶＬＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫＧＩＷＩＰＤＧＥＮＶＫＩＰＶＡＩＫＶＬＲＥＮＴＳＰＫＡＮＫＥＩＬＤＥＡＹＶＭＡＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬＴＳＴＶＱＬＶＴＱＬＭＰＹＧＣＬＬＤ（配列番号２３）。

一実施形態では、本明細書に開示された方法および組成物のＨＥＲ２キメラタンパク質またはその断片はそのシグナル配列を含まない。別の実施形態では、そのシグナル配列の疎水性が高いため、そのシグナル配列の削除によりそのＨｅｒ２断片がリステリア内で順調に発現できるようになる。

別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物のＨＥＲ２キメラタンパク質の断片はその膜貫通領域（ＴＭ）を含まない。１つの実施形態では、そのＴＭの疎水性が高いため、そのＴＭの削除によりそのＨｅｒ−２断片がリステリア内で順調に発現できるようになる。

小さい断片リステリアベースのワクチンまたはトラスツズマブ（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の細胞外領域に位置するエピトープに対するモノクローナル抗体）によってこれらの腫瘍が標的化されたとき、癌遺伝子タンパク質Ｈｅｒ２／ｎｅｕ内での点突然変異またはアミノ酸欠失が耐性腫瘍細胞の処置を媒介することが報告されている。その癌遺伝子のＭＨＣクラスＩエピトープのクラスターを示すＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原の２つの細胞外断片と１つの細胞内断片を保持するキメラ型Ｈｅｒ２／ｎｅｕベースの組成物が本明細書に記載される。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原の３つのＨ２ＤｑおよびマッピングされたヒトＭＨＣクラスＩエピトープのうちの少なくとも１７エピトープを保持するこのキメラタンパク質は、リステリア・モノサイトゲネスのリステリオリシンＯタンパク質の最初の４４１アミノ酸に融合され、リステリア・モノサイトゲネス弱毒化株ＬｍｄｄＡによって発現および分泌された。

別の実施形態では前述の腫瘍関連抗原は血管新生抗原である。別の実施形態ではその血管新生抗原は活性化周皮細胞と腫瘍新生血管内の周皮細胞との両方の上に発現し、別の実施形態ではその抗原はインビボでの新血管形成と関連する。別の実施形態ではその血管新生抗原はＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態ではその血管新生抗原は当技術分野において知られているものであり、参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ２０１０／１０２１４０号パンフレット内において提供される。

１つの実施形態では本明細書において列挙されるあらゆるアミノ酸配列に対するタンパク質および／またはペプチドの相同性は、免疫ブロット分析を含む当技術分野において充分に記述される方法によって、または確立された方法を介する利用可能な多数のソフトウェアパッケージのうちのどれかを利用するアミノ酸配列のコンピューターアルゴリズム分析を介して決定される。これらのパッケージのうちのいくつかにはＦＡＳＴＡパッケージ、ＢＬＡＳＴパッケージ、ＭＰｓｒｃｈパッケージ、またはＳｃａｎｐｓパッケージが含まれてよく、それらは例えばスミス−ウォーターマンアルゴリズムの使用、および／または分析のための広範囲／局所的もしくはＢＬＯＣＫＳアラインメントを採用してもよい。

１つの実施形態において、本明細書に記載されるミニ遺伝子核酸コンストラクトを備えるプラスミド、または本明細書に記載される１つ以上のペプチドに融合している免疫原性ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸分子を備えるプラスミドが、相同組換えを使用してリステリアの染色体に組み込まれる。相同組換えの技術は当技術分野において周知であり、例えばＢａｌｏｇｌｕＳ、ＢｏｙｌｅＳＭらの著作（ＩｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆｍｉｃｅｔｏｖａｃｃｉｎｉａｖｉｒｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｅｉｔｈｅｒＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｐａｒｔｉａｌｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎｏｒＢｒｕｃｅｌｌａａｂｏｒｔｕｓｒｉｂｏｓｏｍａｌＬ７／Ｌ１２ｐｒｏｔｅｉｎ．ＶｅｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ２００５，１０９（１−２）：１１−７）、およびＪｉａｎｇＬＬ，ＳｏｎｇＨＨ，ｅｔａｌ．，（ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｍｕｔａｎｔＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｓｔｒａｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ．ＡｃｔａＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＳｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）２００５，３７（１）：１９−２４）に記載されている。別の実施形態では相同組換えは米国特許第６８５５３２０号に記載されるように実施される。この場合、Ｅ７を発現する組換え型Ｌｍ株は、ｈｌｙプロモーターの制御下にあり、且つ、遺伝子産物の分泌を確実にするためにｈｌｙシグナル配列を含むＥ７遺伝子の染色体への組み込みによって作製され、Ｌｍ−ＡＺ／Ｅ７と称される組換え体を得た。別の実施形態では温度感受性プラスミドが組換え体を選択するために使用される。

別の実施形態では前述のコンストラクトまたは核酸分子は、トランスポゾン挿入を用いてリステリア染色体に組み込まれる。トランスポゾン挿入の技術は当技術分野において周知であり、とりわけＤＰ−Ｌ９６７の構築についてのＳｕｎらの著作（ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ１９９０，５８：３７７０−３７７８）に記載される。別の実施形態ではトランスポゾン突然変異形成は安定なゲノム挿入変異体を形成することができるという利点を有するが、外来遺伝子が挿入されるゲノム内の位置がわからないという欠点を有する。

１つの実施形態において、本明細書に開示されるベクターは、プラスミドベクターまたはファージベクターを含む、当技術分野において公知のベクターである。別の実施形態では前述のコンストラクトまたは核酸分子は、ファージ組込み部位を含むファージベクターを用いてリステリア染色体に組み込まれる（ＬａｕｅｒＰ，ＣｈｏｗＭＹｅｔａｌ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄｕｓｅｏｆｔｗｏＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｈａｇｅｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ２００２；１８４（１５）：４１７７−８６）。この方法のある特定の実施形態ではバクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）のインテグレース遺伝子と付着部位を使用してゲノム内のあらゆる適切な部位（例えば、ｃｏｍＫまたはａｒｇｔＲＮＡ遺伝子の３’端）であり得るその対応する付着部位にその異種遺伝子が挿入される。別の実施形態ではそのコンストラクトまたは異種遺伝子の組込みの前に利用される付着部位から内在性プロファージが除去される。別の実施形態ではこの方法により一コピー組込み体が生じる。別の実施形態では、本開示は、臨床用途のためのファージベースの染色体組み込み系をさらに含み、ここでｄ−アラニン・ラセマーゼを含むがこれに限定されない必須酵素のための栄養要求性である宿主株を使用することができ、例えば、Ｌｍｄａｌ（−）ｄａｔ（−）である。別の実施形態では「ファージ除去工程」を避けるためにＰＳＡに基づくファージ組込み系を使用する。別の実施形態ではこれは組み込まれた遺伝子を維持するために抗生物質による継続的な選択を必要とする。したがって、別の実施形態では本発明は、抗生物質を用いた選択を必要としないファージベースの染色体組込み系の確立を可能にする。代わりに、栄養要求性宿主株を相補することができる。

別の実施形態において、本明細書に記載されるベクターは、細菌性送達ベクター、ウイルスベクター送達ベクター、ペプチドワクチンベクター、およびＤＮＡワクチン送達ベクターを含む、当技術分野において公知の送達ベクターである。当業者は、「送達ベクター」という用語が１つ以上のネオエピトープまたは１つ以上のネオエピトープを含むペプチドを宿主細胞内に送達することができ、ある特定の実施形態ではそれを宿主細胞内で発現することができるコンストラクトを指すことを理解する。そのようなベクターの代表例にはウイルスベクター、核酸発現ベクター、裸ＤＮＡ、およびある特定の真核細胞（例えば、プロデューサー細胞）が含まれる。１つの実施形態では送達ベクターはプラスミドベクターまたはファージベクターと異なる。別の実施形態では本発明の送達ベクターと本発明のプラスミドベクターまたはファージベクターは同じである。

本明細書で開示される方法および組成物の一実施形態では、「組み換え部位」または「部位特異的な組み換え部位」という用語は、組み換え部位に隣接する核酸区分の交換または切除を媒介するリコンビナーゼによって（いくつかの事例では、関連するタンパク質とともに）識別される核酸分子内の塩基の配列を指す。それらのリコンビナーゼと関連タンパク質は「組換えタンパク質」と総称される（例えば、Ｌａｎｄｙ，Ａ．，（ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）３：６９９−７０７；１９９３）を参照のこと）。

「ファージ発現ベクター」、「ファージベクター」、または「ファージミド」は、本明細書に開示される方法および組成物の核酸配列を、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで、原核生物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞を含むあらゆる細胞の中で構成的または誘導的に発現させることを目的としたあらゆるファージベースの組換え発現系を指す。典型的にはファージ発現ベクターは細菌細胞内で複製することも適切な条件下でファージ粒子を生成することも可能である。この用語は直鎖状または環状の発現系を含み、且つ、エピソームのままであるか、または宿主細胞ゲノムに組み込まれる両方のファージベースの発現ベクターを包含する。

１つの実施形態では本明細書において使用される「機能可能であるように連結される」という用語は、転写が開始されるように転写および翻訳の調節性核酸があらゆるコード配列に対して配置されることを意味する。一般的に、これはプロモーターおよび転写開始または始動配列がコ−ド領域の５’側に配置されることを意味する。

一実施形態では、「オープン・リーディング・フレーム」または「ＯＲＦ」は、潜在的にタンパク質をコードする可能性がある塩基の配列を含有する生命体のゲノムの部分である。別の実施形態では、ＯＲＦの開始端および停止端はｍＲＮＡの端部と同等でないが、通常のｍＲＮＡ中に含まれる。一実施形態では、ＯＲＦは、遺伝子の開始コード配列（開始コドン）と停止コドン配列（終止コドン）との間に位置する。したがって、１つの実施形態では内在性ポリペプチドとのオープン・リーディング・フレームとして機能可能であるようにゲノムに組み込まれた核酸分子は、内在性ポリペプチドと同一のオープン・リーディング・フレームとしてゲノムに組み込まれた核酸分子である。

一実施形態では、本開示はリンカー配列を含む融合ポリペプチドを提供する。１つの実施形態では「リンカー配列」は２つの異種ポリペプチドまたはそれらの断片もしくはドメインを接続するアミノ酸配列を指す。一般的に、本明細書において使用される場合、リンカーはポリペプチドを共有結合で連結して融合ポリペプチドを形成するアミノ酸配列である。典型的には、リンカーは、オープン・リーディング・フレームがコードするアミノ酸配列およびディスプレイタンパク質を含む融合タンパク質を作製するためのディスプレイプラスミドベクターからレポーター遺伝子を除去した後に残る組換えシグナルから翻訳されるアミノ酸を含む。当業者によって理解されるように、そのリンカーはグリシンおよび他の小さい中性アミノ酸などの追加的なアミノ酸を含むことができる。

一実施形態では、本明細書で使用される場合、「内因性」は、参照生命体内で発生もしくは創出された、または参照生命体の中生じたものから発生してきた物品を記述する。別の実施形態では内在性は天然であることを指す。

別の実施形態では「安定的に維持される」は、選択（例えば、抗生物質選択）が無い状態での検出可能な損失を伴わない核酸分子またはプラスミドの１０世代にわたる維持を指す。別の実施形態ではその期間は１５世代である。別の実施形態ではその期間は２０世代である。別の実施形態ではその期間は２５世代である。別の実施形態ではその期間は３０世代である。別の実施形態ではその期間は４０世代である。別の実施形態ではその期間は５０世代である。別の実施形態ではその期間は６０世代である。別の実施形態ではその期間は８０世代である。別の実施形態ではその期間は１００世代である。別の実施形態ではその期間は１５０世代である。別の実施形態ではその期間は２００世代である。別の実施形態ではその期間は３００世代である。別の実施形態ではその期間は５００世代である。別の実施形態ではその期間はより多くの世代である。別の実施形態ではその核酸分子またはプラスミドは、インビトロで（例えば、培養されて）安定的に維持される。別の実施形態ではその核酸分子またはプラスミドは、インビボで安定的に維持される。別の実施形態ではその核酸分子またはプラスミドは、インビトロおよびインビトロの両方で安定的に維持される。

別の実施形態において、内在性ＡｃｔＡ配列を有するオープン・リーディング・フレームとして、リステリアゲノムに機能可能に組み込まれた核酸分子を含む組換え型リステリア株が本明細書において開示される。別の実施形態において、本明細書に開示される方法および組成物の組み換え型リステリア株は、ＡｃｔＡまたは短縮型ＡｃｔＡに融合される抗原を含む融合タンパク質をコードする核酸分子を含むエピソーム性の発現プラスミドベクターを含む。１つの実施形態ではその抗原の発現と分泌は、ａｃｔＡプロモーターおよびａｃｔＡシグナル配列の制御下にあり、その抗原はＡｃｔＡの１〜２３３アミノ酸（短縮型ＡｃｔＡまたはｔＡｃｔＡ）への融合として発現される。別の実施形態ではその短縮型ＡｃｔＡは、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第７６５５２３８号明細書に記載されるように、野生型ＡｃｔＡタンパク質の最初の３９０のアミノ酸から成る。別の実施形態ではその短縮型ＡｃｔＡは、米国特許出願公開第２０１４／０１８６３８７号明細書に記載されるように、ＰＥＳＴモチーフが欠失しており、非保存的ＱＤＮＫＲ置換を含有するＡｃｔＡ−Ｎ１００またはその修正版（ＡｃｔＡ−Ｎ１００＊と称される）である。

１つの実施形態において、本明細書に開示される断片は機能的断片である。別の実施形態において、「機能的断片」は、単独で、または本明細書に開示されるワクチン組成物において、対象に投与された場合に、免疫応答を惹起することができる免疫原性断片である。別の実施形態では、当業者は理解するであろうように、また本明細書にさらに開示されるように、機能的断片は生物活性を有する。

１つの実施形態において、本明細書に開示される組換え型リステリア株は弱毒化株である。別の実施形態において、本明細書に開示されるリステリア株は組換え株である。別の実施形態において、本明細書に開示されるリステリア株は生きた弱毒化組換え型リステリア株である。

本明細書に開示される方法および組成物の組み換え型リステリア株は、別の実施形態において、組み換え型リステリア・モノサイトゲネス株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組換え型リステリア・シーリゲリ｝株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組換え型リステリア・グレイ株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組換え型リステリア・イバノビ株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組換え型リステリア・ムライ株である。別の実施形態ではそのリステリア株は組換え型リステリア・ウェルシメリ株である。別の実施形態ではそのリステリア株は、当技術分野において知られている他のあらゆるリステリア種の組換え株である。

別の実施形態において、本明細書に開示される組み換え型リステリア株は、動物宿主を通して継代されている。別の実施形態では、継代は株のワクチンベクターとしての有効性を最大化する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の病原性を安定化する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の免疫原性を増加する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の病原性を増加する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の不安定な亜系を除去する。別の実施形態ではその継代はそのリステリア株の不安定な亜系の普及を低下させる。別の実施形態ではそのリステリア株は抗原含有組換えペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入物を含む。別の実施形態ではそのリステリア株は抗原含有組換えペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを担持する。別の実施形態ではその継代は本明細書に記載されるように実施される。別の実施形態では当技術分野において知られている他のあらゆる方法によってその継代が実施される。

別の実施形態において、本明細書に開示される組み換え型核酸は、リステリア株内でコードされるペプチドの発現を誘導するプロモーター／調節性配列に機能可能にリンクされている。遺伝子の構成的発現を引き起こすために有用なプロモーター／調節性配列は当技術分野において周知であり、これらには、例えば、リステリアのＰ_ｈｌｙＡプロモーター、Ｐ_ＡｃｔＡプロモーター、およびｐ６０プロモーター、ストレプトコッカスｂａｃプロモーター、ストレプトマイセス・グリセウスｓｇｉＡプロモーター、およびバチルス・チューリンゲンシスｐｈａＺプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

別の実施形態では、本明細書に開示されるペプチドをコードする核酸の誘導性及び組織特異的な発現は、ペプチドをコードする核酸を誘導性または組織特異的なプロモーター／調節性配列の制御下に置くことによって遂行される。この目的のために有用な組織特異的または誘導性プロモーター／調節性配列の実施例としては、ＭＭＴＶＬＴＲ誘導性プロモーター、およびＳＶ４０後期エンハンサー／プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では金属、グルココルチコイドなどのような誘導剤に応答して誘導されるプロモーターが利用される。したがって、本発明は、既知または未知のどちらかであるプロモーター／調節性配列であって、その配列に機能可能であるように連結されている所望のタンパク質の発現を引き起こすことができるあらゆるプロモーター／調節性配列の使用を含むことが理解される。当業者は、「異種」という用語が基準種とは異なる種に由来する核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を包含することを理解する。したがって、例えば、異種ポリペプチドを発現するリステリア株は１つの実施形態ではそのリステリア株にとって固有または内在性のものではないペプチドを発現することになり、または別の実施形態ではそのリステリア株によって通常発現されないポリペプチドを発現することになり、または別の実施形態ではそのリステリア株以外の供給源に由来するポリペプチドを発現することになる。別の実施形態では異種という用語は同一の種の中の異なる生物に由来するものを説明するために使用される。別の実施形態では前述の異種抗原は、リステリアの組換え株によって発現され、その組換え株が哺乳類細胞に感染するとプロセッシングを受け、且つ、細胞傷害性Ｔ細胞に提示される。別の実施形態ではリステリア種によって発現されるその異種抗原は、その哺乳類内で自然に発現する対応する未修飾の抗原またはタンパク質を認識するＴ細胞応答が生じる限り、腫瘍細胞または感染性因子の中のその未修飾の抗原またはタンパク質と厳密に一致する必要がない。「異種抗原」という用語は本明細書において「抗原性ポリペプチド」、「異種タンパク質」、「異種タンパク質抗原」、「タンパク質抗原」、「抗原」などと呼ばれる場合がある。

当業者は、「エピソーム性発現ベクター」という用語が、直鎖状または環状であり得、且つ、通常二本鎖の形態であり、細菌または細胞のゲノムに組み込まれるのと反対に宿主細菌または宿主細胞の細胞質内に存在するという点で染色体外にある核酸プラスミドベクターを包含することを理解する。１つの実施形態ではエピソーム性発現ベクターは目的の遺伝子を含む。別の実施形態ではエピソーム性ベクターは細菌の細胞質中において複数コピーで存続し、それにより目的の遺伝子の増幅をもたらし、別の実施形態では必要なときにウイルス性トランス作用因子が供給される。別の実施形態ではそのエピソーム性発現ベクターは本明細書においてプラスミドと称される場合がある。別の実施形態では「組込み型プラスミド」は宿主ゲノムへのそのプラスミドの挿入または担持される目的の遺伝子の挿入を目的とする配列を含む。別の実施形態では目的の挿入遺伝子は分断されず、または細胞ＤＮＡへの組込みによりしばしば生じる調節上の制約を受けない。別の実施形態ではその挿入異種遺伝子の存在は、その細胞自身の重要な領域の再構成または分断につながらない。別の実施形態において、安定な形質移入法ではエピソーム性ベクターを使用することで染色体組込み型プラスミドを使用するよりも高い形質移入効率が生じることが多い（Ｂｅｌｔ，Ｐ．Ｂ．Ｇ．Ｍ．，ｅｔａｌ（１９９１）ＥｆｆｉｃｉｅｎｔｃＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇｂｙｄｉｒｅｃｔｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎｏｆａｍｕｔａｎｔｈｕｍａｎｃｅｌｌｌｉｎｅ（ＨＰＲＴ２）ｕｓｉｎｇａｎＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒｖｉｒｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄｃＤＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９，４８６１−４８６６；Ｍａｚｄａ，Ｏ．，ｅｔａｌ．（１９９７）Ｅｘｔｒｅｍｅｌｙｅｆｆｉｃｉｅｎｔｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｉｎｔｏｌｙｍｐｈｏ−ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｃｅｌｌｌｉｎｅｓｂｙＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０４，１４３−１５１）。一実施形態では、本明細書で開示される方法および組成物のエピソーム性の発現ベクターは、ＤＮＡ分子を細胞に送達するために採用される様々な方法のいずれかによってインビボ、エクスビボ、またはインビトロで細胞に送達される場合がある。また、それらのベクターは単独でも対象の細胞への送達を強化する医薬組成物の形態でも送達され得る。

一実施形態では、「融合される」という用語は共有結合による機能可能な連鎖を指す。１つの実施形態ではこの用語は（核酸配列またはそのオープン・リーディング・フレームの）組換え技術による融合を含む。別の実施形態ではこの用語は化学的結合を含む。

一実施形態では「形質転換」という用語は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子を取り上げるために細菌細胞を改変することを指す。別の実施形態では「形質転換」は、プラスミドまたは他の異種ＤＮＡ分子の遺伝子を発現させるために細菌細胞を操作することを指す。

別の実施形態では遺伝物質および／またはプラスミドを細菌の中へ導入するために接合が用いられる。接合の方法は当技術分野において周知であり、例えば、ＮｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃＪ．ら（Ａｓｅｃｏｎｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｎｐ−ｄｅｒｉｖｅｄＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｈｕｔｔｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｔｈａｔｉｓｇｅｎｅｒａｌｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅｂｙｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｐｌａｓｍｉｄ．２００６Ｎｏｖ；５６（３）：２２３−７）およびＡｕｃｈｔｕｎｇＪＭら（ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｍｏｂｉｌｅｇｅｎｅｔｉｃｅｌｅｍｅｎｔｂｙｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｉｎｇａｎｄｔｈｅｇｌｏｂａｌＤＮＡｄａｍａｇｅｒｅｓｐｏｎｓｅ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２００５Ａｕｇ３０；１０２（３５）：１２５５４−９）に記載されている。

１つの実施形態では「弱毒化」という用語は細菌が動物において疾患の原因となる能力の減退を意味する。つまり、その弱毒化リステリアは培養状態で増殖し、且つ、維持され得るが、その弱毒化リステリア株の病原特性は野生型リステリアと比較すると減少している。例として弱毒化リステリアを用いるＢａｌｂ／ｃマウスの静脈内接種を用いると、接種された動物の５０％が生存する致死量（ＬＤ_５０）が野生型リステリアのＬＤ_５０より少なくとも約１０倍増加するのが好ましく、少なくとも約１００倍増加するのがより好ましく、少なくとも約１，０００倍増加するのがより好ましく、少なくとも約１０，０００倍増加するのがなおより好ましく、および少なくとも約１００，０００倍増加するのが最も好ましい。したがって、リステリアの弱毒化株は、それが投与された動物を殺さない株であるか、または投与された細菌の数が同じ動物を殺すのに必要な野生型の弱毒化されていない細菌の数より非常に多いときのみ動物を殺す株である。弱毒化細菌は、一般的な環境中ではその細菌の成長のために必要な栄養素が中に存在しないために複製する能力を有しない細菌を意味するとも解釈されるべきである。したがって、その細菌の複製は必要な栄養素が提供される制御環境中での複製に限定される。したがって、本明細書に開示される弱毒化株は、脱制御複製の能力がないという点で、環境的に安全である。

組成物
１つの実施形態において、本明細書に開示される組成物は免疫原性組成物である。１つの実施形態において、本明細書に開示される組成物はインターフェロンガンマの固有で強力な刺激を誘導し、１つの実施形態において、これは抗血管新生特性を有している。一実施形態では、本明細書に開示されるリステリアはインターフェロンガンマの強い先天的な刺激を誘導し、一実施形態では、これは抗血管新生特性を有する（Ｄｏｍｉｎｉｅｃｋｉｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５Ｍａｙ；５４（５）：４７７−８８．Ｅｐｕｂ２００４Ｏｃｔ６、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＢｅａｔｔｙａｎｄＰａｔｅｒｓｏｎ，ＪＩｍｍｕｎｏｌ．２００１Ｆｅｂ１５；１６６（４）：２２７６−８２、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。１つの実施形態ではリステリアの抗血管新生特性はＣＤ４^＋Ｔ細胞によって媒介される（ＢｅａｔｔｙａｎｄＰａｔｅｒｓｏｎ，２００１）。別の実施形態では、リステリアの抗血管新生特性は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞によって媒介される。別の実施形態では、リステリアワクチン接種の結果としてのＩＦＮ−γ分泌は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔｈ１ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＣ１ＣＤ８^＋Ｔ細胞、またはこれらの組み合せによって媒介される。

別の実施形態において、本明細書に開示される組成物の投与は、１つ以上の抗血管新生タンパク質または因子の産生を誘導する。１つの実施形態ではその抗血管新生タンパク質はＩＦＮ−γである。別の実施形態ではその抗血管新生タンパク質は色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、アンジオスタチン、エンドスタチン、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ｓＦｌｔ）−１、または可溶性エンドグリン（ｓＥｎｇ）である。１つの実施形態において、本明細書に開示されるリステリアは、抗血管新生因子の放出に関与し、したがって１つの実施形態では、抗原を対象に導入するためのベクターとしての役割に加えて、治療的な役割を有する。

本明細書に開示された方法および組成物によって誘発される免疫応答は、別の実施形態ではＴ細胞応答である。別の実施形態ではその免疫応答はＴ細胞応答を含む。別の実施形態ではその応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態ではその応答はＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を含む。各々の可能性は本明細書で開示した別個の実施形態を表す。

別の実施形態では本明細書に開示される組成物の投与は、抗原特異的Ｔ細胞の数を増加させる。別の実施形態では組成物の投与によりＴ細胞上の共刺激受容体が活性化される。別の実施形態では組成物の投与によりメモリーＴ細胞および／またはエフェクターＴ細胞の増殖が誘導される。別の実施形態では組成物の投与によりＴ細胞の増殖が増加する。各々の可能性は本明細書で開示した別個の実施形態を表す。

全体を通して使用される場合、「組成物」および「免疫原性組成物」という用語は交換可能であり、すべて同一の意味と質を有する。１つの実施形態において、組み換え型リステリア株を含み、さらに各構成要素の同時投与または連続投与のための抗体を含む、本明細書に開示される免疫原性組成物も、「併用療法」と呼称される。当業者は、併用療法が追加的な構成要素、抗体、療法などを含んでもよいことを理解する。幾つかの実施形態では「医薬組成物」という用語は医療用途に適切な組成物、例えば、必要な対象に投与するための組成物を指す。１つの実施形態において、本開示は、本明細書に開示される弱毒化リステリア株と薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。別の実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるＤＮＡワクチンと薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。別の実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるワクシニアウイルス株またはウイルス様粒子と薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。別の実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるペプチドワクチンと薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。

別の実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるヌクレオチド分子を含む組み換えワクチンベクターを提供する。別の実施形態ではそのベクターは発現ベクターである。別の実施形態ではその発現ベクターはプラスミドである。別の実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるヌクレオチド分子を細胞に導入するための方法を提供する。組換えベクターを構築および利用するための方法は当技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの著作（２００１，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ）およびＢｒｅｎｔらの著作（２００３，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ）に記載されている。別の実施形態ではそのベクターは細菌ベクターである。別の実施形態ではそのベクターはサルモネラ属の種、シゲラ属の種、ＢＣＧ、Ｌ．モノサイトゲネス、大腸菌、およびＳ．ゴルドニから選択される。別の実施形態において、１つ以上のペプチドは、ファゴリソソーム融合を回避し、細胞の細胞質内で生きるように改変された組換え細菌ベクターによって送達される。別の実施形態ではそのベクターはウイルスベクターである。他の実施形態ではそのベクターはワクシニア、アビポックス、アデノウイルス、ＡＡＶ、ワクシニアウイルスＮＹＶＡＣ、変異ワクシニア株アンカラ（ＭＶＡ）、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレトロウイルスから選択される。別の実施形態ではそのベクターは裸ＤＮＡベクターである。別の実施形態ではそのベクターは当技術分野において知られている他のあらゆるベクターである。

対象において増強抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発するため、対象において腫瘍介在性免疫抑制を阻害するため、または対象の脾臓および腫瘍におけるＴエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比率を増加させるため、またはこれらのあらゆる組合せの目的で本発明の組成物が本発明の方法で使用され得る。

別の実施形態では、本明細書で開示されたリステリア株を含む組成物はアジュバントをさらに含む。１つの実施形態において、本明細書に開示される組成物はアジュバントをさらに含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物で使用されるアジュバントは顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質である。別の実施形態ではそのアジュバントはＧＭ−ＣＳＦタンパク質を含む。別の実施形態ではそのアジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態ではそのアジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態ではそのアジュバントはサポニンＱＳ２１である。別の実施形態ではそのアジュバントはサポニンＱＳ２１を含む。別の実施形態ではそのアジュバントはモノホスホリルリピドＡである。別の実施形態ではそのアジュバントはモノホスホリルリピドＡを含む。別の実施形態ではそのアジュバントはＳＢＡＳ２である。別の実施形態ではそのアジュバントはＳＢＡＳ２を含む。別の実施形態ではそのアジュバントは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。別の実施形態ではそのアジュバントは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは免疫刺激サイトカインである。別の実施形態ではそのアジュバントは免疫刺激サイトカインを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態ではそのアジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態ではそのアジュバントはクイルグリコシドであるか、またはこれを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは細菌マイトジェンであるか、またはこれを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは細菌毒素であるか、またはこれを含む。別の実施形態ではそのアジュバントは当技術分野において知られている他のあらゆるアジュバントであるか、またはこれを含む。

１つの実施形態では本発明の免疫原性組成物は、核酸分子を含む組換え型リステリア株であって、前述の核酸分子が融合ポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含み、前述の融合ポリペプチドが異種抗原またはその断片に融合された短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む前述の組換え型リステリア株を含む。別の実施形態では本発明の免疫原性組成物は、核酸分子を含む組換え型リステリア株であって、前述の核酸分子が短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列コードする第１オープン・リーディング・フレームを含む前述の組換え型リステリア株を含む。

１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、核酸分子を含む組換え型リステリア株を含み、前述の核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含み、前述の融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された、短縮型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、前述の組成物は、抗体またはその断片をさらに含む。別の実施形態において、前述の抗体またはその断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、またはそれらのあらゆる組合せを含む。

１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、本明細書に開示される組換え型リステリア株を含み、前述の組成物は抗体またはその断片をさらに含む。別の実施形態において、前述の抗体またはその断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、またはそれらのあらゆる組合せを含む。

別の実施形態では本発明の免疫原性組成物は組換え型リステリア株を含み、前述の組成物は抗体またはその断片をさらに含む。別の実施形態において、前述の抗体またはその断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、またはそれらのあらゆる組合せを含む。

幾つかの実施形態では「抗体」という用語は、所望の標的と特異的に相互作用可能であり、例えば、チェックポイント阻害薬の結合を妨害することができる完全な分子ならびに「抗原結合断片」とも呼ばれるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖなどのその機能性断片を指す。別の実施形態では抗体またはその機能性断片は免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストを含む。別の実施形態では抗体またはその機能性断片は抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体またはその断片を含む。別の実施形態では抗体またはその機能性断片は抗ＰＤ−１抗体またはその断片を含む。別の実施形態では抗体またはその機能性断片は抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその断片を含む。別の実施形態では抗体またはその機能性断片は抗Ｂ７−Ｈ４抗体またはその断片を含む。

幾つかの実施形態ではそれらの抗体断片は（１）抗体分子の一価抗原結合断片を含有する断片であり、完全抗体をパパイン酵素で消化し、完全な軽鎖と１重鎖の一部を生成させることにより作製され得る断片であるＦａｂ。（２）完全抗体をペプシンで処置し、次いで還元することで完全な軽鎖と重鎖の一部を生成することにより取得され得る抗体分子の断片であって、抗体１つ当たり２本の断片が得られるＦａｂ’。（３）ペプシンで完全抗体を処置し、後続の還元を行わないことにより取得され得る抗体の断片である（Ｆａｂ’）_２。Ｆ（ａｂ’）_２は、２つのジスルフィド結合により共に保持されている２つのＦａｂ’断片の二量体である。（４）２本の鎖として発現される軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含む、遺伝的に改変された断片であるＦｖ。または（５）適切なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を、遺伝的に融合された一本鎖分子として含む遺伝的に改変された分子である一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）を含む。

これらの断片の作製方法は当技術分野において知られている。（例えば、参照により本明細書に援用されるＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８８を参照されたい）。

幾つかの実施形態では前述の抗体断片は、抗体のタンパク質加水分解、またはその断片をコードするＤＮＡの大腸菌もしくは哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現系）内での発現によって調製され得る。

幾つかの実施形態では抗体断片は従来の方法による抗体全体のペプシン消化またはパパイン消化によって獲得され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）_２で表される５Ｓ断片を提供するためにペプシンを用いる抗体の酵素的切断によって抗体断片を作製することができる。チオール還元剤を使用し、ジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基の保護基を所望により使用してこの断片をさらに切断して３．５ＳのＦａｂ’一価断片を作製することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素的切断により２本の一価Ｆａｂ’断片と１本のＦｃ断片が直接的に作製される。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４０３６９４５号明細書および同第４３３１６４７号明細書、およびその中に含有される参照文献によって説明されており、それらの特許の全体を参照により本明細書に援用する。Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７３：１１９〜１２６，１９５９も参照されたい。一価軽鎖重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる切断、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝的技術などの抗体を切断する他の方法は、完全抗体によって認識される抗原にそれらの断片が結合する限り、用いられてもよい。

Ｆｖ断片はＶＨ鎖およびＶＬ鎖の結合を含む。この結合は、Ｉｎｂａｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６９：２６５９〜６２，１９７２に記載されるように非共有結合性である場合がある。あるいは、それらの可変鎖を分子間ジスルフィド結合によって連結する、またはグルタルアルデヒドなどの化学薬品によって架橋することができる。Ｆｖ断片はペプチドリンカーによって接続されたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含むことが好ましい。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって接続されるＶＨドメインとＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。その構造的遺伝子は発現ベクターに挿入され、これはその後大腸菌などの宿主細胞の中に導入される。その組換え型宿主細胞はそれらの２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを作製するための方法は、例えば、ＷｈｉｔｌｏｗａｎｄＦｉｌｐｕｌａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：９７−１０５，１９９１、Ｂｉｒｄｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６，１９８８、Ｐａｃｋｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：１２７１−７７，１９９３、および全体が参照により本明細書に援用されるＬａｄｎｅｒらの米国特許第４９４６７７８号明細書によって説明されている。

抗体断片の別の形態は単一相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって、ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）を得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して抗体生成細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。例えば、ＬａｒｒｉｃｋａｎｄＦｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：１０６−１０，１９９１を参照のこと。

幾つかの実施形態では本明細書に記載される抗体または断片は「ヒト化形態」の抗体を含む場合がある。幾つかの実施形態では「ヒト化形態の抗体」という用語は、非ヒト（例えば、マウスの）抗体であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、または抗体の他の抗原結合部分配列など）のキメラ分子である前述の非ヒト抗体を指す。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成する残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体でも移入したＣＤＲまたはフレームワーク配列でも見られない残基を含む場合もある。一般的に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン共通配列のものである少なくとも１つの、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。最適にはヒト化抗体は免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分も含むことになる［Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）］。

非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野において周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトの供給源からその中に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は移入残基と呼ばれることが多く、これらは典型的には移入可変ドメインから取られる。ヒト化は、ウィンターおよびその協力者の方法［Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］に従って、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応配列に置き換えることによって基本的実施可能である。したがって、こうしたヒト化抗体はキメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）であり、完全なヒト可変ドメインよりも実質的に少ない部分が非ヒト種の対応する配列によって置き換えられている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかのＣＤＲ残基および場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類の抗体の類似部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体である。

ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む当技術分野において知られている様々な技法を使用しても生産され得る［ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍａｎｄＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）］。Ｃｏｌｅらの技法およびＢｏｅｒｎｅｒらの技法もヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である（Ｃｏｌｅｅｔａｌ．，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、およびＢｏｅｒｎｅｒｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）］。同様に、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているトランスジェニック動物、例えば、マウスの中にヒト免疫グロブリン座位を導入することによってヒトを作製することができる。それを挑戦すると、遺伝子再構成、組立、および抗体レパートリーを含む全ての点に関してヒトの中で見られるものと非常に似ているヒト抗体の生産が観察される。この取り組みは、例えば、米国特許第５５４５８０７号明細書、同第５５４５８０６号明細書、同第５５６９８２５号明細書、同第５６２５１２６号明細書、同第５６３３４２５号明細書、同第５６６１０１６号明細書、および以下の科学出版物、すなわち、Ｍａｒｋｓｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０，７７９−７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６８８５６−８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ３６８８１２−１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４，８４５−５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４，８２６（１９９６）、ＬｏｎｂｅｒｇａｎｄＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６５−９３（１９９５）に記載されている。

１つの実施形態において、本明細書に開示される疾患は癌または腫瘍である。１つの実施形態において、本明細書に開示される方法で治療される癌は、乳癌である。別の実施形態ではこの癌は子宮頚部癌である。別の実施形態ではこの癌はＨｅｒ２含有性癌である。別の実施形態ではこの癌は黒色腫である。別の実施形態ではこの癌は膵臓癌である。別の実施形態ではこの癌は卵巣癌である。別の実施形態ではこの癌は胃癌である。別の実施形態ではこの癌は膵臓の癌病巣である。別の実施形態ではこの癌は肺腺癌である。別の実施形態ではこの癌は肺腺癌である。別の実施形態では、これは多形神経膠芽腫である。別の実施形態ではこの癌は大腸腺癌である。別の実施形態ではこの癌は肺扁平腺癌である。別の実施形態ではこの癌は胃腺癌である。別の実施形態ではこの癌は卵巣表面上皮性新生物（例えば、その良性の、増殖性の、または悪性の変種）である。別の実施形態ではこの癌は口腔扁平上皮癌である。別の実施形態ではこの癌は肺非小細胞癌である。別の実施形態ではこの癌は子宮内膜癌である。別の実施形態ではこの癌は膀胱癌である。別の実施形態ではこの癌は頭頸部癌である。別の実施形態ではこの癌は前立腺癌である。別の実施形態ではこの癌は口腔咽頭癌である。別の実施形態ではこの癌は肺癌である。別の実施形態ではこの癌は肛門癌である。別の実施形態ではこの癌は大腸癌である。別の実施形態ではこの癌は食道癌である。別の実施形態ではこの癌は中皮腫である。

一実施形態では、本明細書で開示されている異種抗原はＨＰＶ−Ｅ７である。別の実施形態ではその抗原はＨＰＶ−Ｅ６である。別の実施形態ではそのＨＰＶ−Ｅ７はＨＰＶ株１６由来である。別の実施形態ではそのＨＰＶ−Ｅ７はＨＰＶ株１８由来である。別の実施形態ではそのＨＰＶ−Ｅ６はＨＰＶ株１６由来である。別の実施形態ではそのＨＰＶ−Ｅ７はＨＰＶ株１８由来である。別の実施形態において、本明細書に開示される異種抗原の断片もまた本開示に包含される。

別の実施形態ではその抗原はＨｅｒ−２／ｎｅｕである。別の実施形態ではその抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１である。別の実施形態ではその抗原はテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）である。別の実施形態ではその抗原はＳＣＣＥである。別の実施形態ではその抗原はＣＥＡである。別の実施形態ではその抗原はＬＭＰ−１である。別の実施形態ではその抗原はｐ５３である。別の実施形態ではその抗原は炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）である。別の実施形態ではその抗原はＰＳＭＡである。別の実施形態ではその抗原は前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）である。別の実施形態ではその抗原はＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態ではその抗原はＷＴ−１である。別の実施形態ではその抗原はＨＩＶ−１Ｇａｇである。別の実施形態ではその抗原はプロテイナーゼ３である。別の実施形態ではその抗原はチロシナーゼ関連タンパク質２である。別の実施形態ではその抗原はＰＳＡ（前立腺特異抗原）である。別の実施形態ではその抗原は二価ＰＳＡである。別の実施形態ではその抗原はＥＲＧである。別の実施形態ではその抗原はＥＲＧコンストラクトＩＩＩ型である。別の実施形態ではその抗原はＥＲＧコンストラクトＶＩ型である。別の実施形態ではその抗原はアンドロゲン受容体（ＡＲ）である。別の実施形態ではその抗原はＰＡＫ６である。別の実施形態ではその抗原はＰＡＫ６の高エピトープ領域を含む。別の実施形態ではその抗原は、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、Ｈｅｒ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）、ＳＣＣＥ、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＥＧＦＲ−ＩＩＩ、サバイビン、バキュロウイルスアポトーシス阻害性反復配列含有タンパク質５（ＢＩＲＣ５）、ＷＴ−１、ＨＩＶ−１Ｇａｇ、ＣＥＡ、ＬＭＰ−１、ｐ５３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２、Ｍｕｃ１、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、またはこれらの組合せから選択される。別の実施形態では抗原はその抗原の野生型を含む。別の実施形態では抗原はその抗原の突然変異型を含む。

１つの実施形態において、ＰＡＫ６の核酸配列は配列番号７８に示されている。別の実施形態において、ＰＡＫ６のアミノ酸配列は配列番号７９に示されている。（全体が本明細書に援用される、２０１２年９月５日にオンライン出版されたＫｗｅｋｅｔａｌ．（２０１２）ＪＩｍｍｕｎｏｌを参照されたい。）

別の実施形態では、「免疫原性断片」は、単独でまたは本明細書に開示されたワクチン組成物内で対象に投与されるとき、免疫応答を引き出す免疫原性断片である。別の実施形態ではそのような断片は、液性免疫応答および／または適応免疫応答のどちらかを誘発するために必要なエピトープを含有する。

１つの実施形態では本発明の組成物は抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では本発明の組成物は少なくとも１つの抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では組成物は２つの抗体、３つの抗体、４つの抗体、または４つを超える抗体を含みうる。別の実施形態では本発明の組成物はＬｍ株および抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では本発明の組成物はＬｍ株および少なくとも１つの抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では本明細書の組成物はＬｍ株および２つの抗体、３つの抗体、４つの抗体、または４つを超える抗体を含む。別の実施形態において、本発明の組成物は、抗体またはその機能性断片を含み、当該組成物は本明細書に開示されるリステリア株を含まない。同じ組成物または異なる組成物に存在する様々な抗体は同一の形態を有する必要はなく、例えば、１つの抗体はモノクローナル抗体であってよく、別の抗体はＦＡｂ断片であってよい。本発明の異なる実施形態により各可能性が表される。

１つの実施形態では本発明の組成物は、特異的にＧＩＴＲまたはその部分に結合する抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では本発明の組成物は、特異的にＯＸ４０またはその部分に結合する抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では組成物は、ＧＩＴＲまたはその部分に特異的に結合する抗体とＯＸ４０に特異的に結合する抗体を含む。別の実施形態では本発明の組成物はＬｍ株、およびＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では本発明の組成物はＬｍ株、およびＯＸ４０に特異的に結合する抗体またはその機能性断片を含む。別の実施形態では本発明の組成物はＬｍ株、およびＧＩＴＲまたはその部分に特異的に結合する抗体、およびＯＸ４０またはその部分に特異的に結合する抗体を含む。別の実施形態では、本発明の組成物は、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその機能的断片を含み、ここで、組成物は本明細書で開示されているリステリア株を含まない。別の実施形態では、本発明の組成物は、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体またはその機能的断片を含み、ここで、組成物は本明細書で開示されているリステリア株を含まない。別の実施形態では、本発明の組成物は、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその機能的断片、およびＧＩＴＲに特異的に結合する抗体を含み、ここで、組成物は本明細書で開示されているリステリア株を含まない。同じ組成物または異なる組成物に存在する様々な抗体は同一の形態を有する必要はなく、例えば、１つの抗体はモノクローナル抗体であってよく、別の抗体はＦＡｂ断片であってよい。本発明の異なる実施形態により各可能性が表される。

「抗体機能性断片」という用語は、特異的に抗原に結合し、本明細書の開示内容に意図されている生物学的効果を引き起こすことが可能な完全抗体の部分を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、およびＦｖ断片、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ抗体、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書において使用される場合、「抗体重鎖」は全ての抗体分子の天然の立体構造でそれらの分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうち長い方を指す。

本明細書において使用される場合、「抗体軽鎖」は全ての抗体分子の天然の立体構造でそれらの分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうち短い方を指し、κ軽鎖およびλ軽鎖は２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。

本明細書において使用される「合成抗体」という用語は、例えば、本明細書において記載されるバクテリオファージによる抗体発現など、組換えＤＮＡ技術を使用して作製された抗体を意味する。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子を合成し、そのＤＮＡ分子が抗体タンパク質を発現することにより生成されたその抗体、またはその抗体を特定するアミノ酸配列を意味すると解釈されるべきであり、そのＤＮＡまたはアミノ酸配列は当技術分野において利用可能であり、且つ、よく知られている合成ＤＮＡ技術またはアミノ酸配列技術用いて獲得されている。

１つの実施形態では抗体またはその機能性断片は抗原結合領域を含む。１つの実施形態では抗原結合領域は抗体またはその抗原結合ドメインである。１つの実施形態ではその抗原結合ドメインはＦａｂまたはｓｃＦｖである。

当業者は、抗体に関する「結合する」または「特異的に結合する」という用語が特異的な抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識または結合することがない抗体またはその機能性断片を包含することを理解する。例えば、１つの種の抗原に特異的に結合する抗体は、１つ以上の種のその抗原にも結合する場合があるが、そのような種間交差反応性はそれ自体で特異的なものとしての抗体の分類を変更することはない。別の実施例では抗原に特異的に結合する抗体は、その抗原の異なるアレル型に結合する場合もある。しかしながら、そのような交差反応はそれ自体で特異的なものとしての抗体の分類を変更することはない。幾つかの事例では、第２化学種と抗体、タンパク質、またはペプチドの相互作用に関連して、その相互作用がその化学種上での特定の構造（例えば抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存すること、例えば、抗体は特定のアミノ酸配列というよりも特定のタンパク質構造を認識して結合することを意味するために「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語を使用することができる。

１つの実施形態では本発明の組成物は、組換え型リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｍ）株を含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるように、本発明の組成物は抗体またはその機能性断片を含む。

一実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で開示されている抗体またはその機能的断片、および本明細書で開示されている組み換え型弱毒化リステリアを含む。別の実施形態では、本明細書に開示された免疫原性組成物の各々の構成成分を、本明細書に開示された免疫原性組成物の別の構成成分の前に、別の構成成分と同時に、または別の構成成分の後に投与する。１つの実施形態では、同時に投与されるときでさえも、Ｌｍ組成物と抗体またはその機能性断片は２つの別個の組成物として投与されてよい。あるいは、別の実施形態ではＬｍ組成物は抗体またはその機能性断片を含んでよい。

別の実施形態では本発明の組成物は、非経口的に、癌近傍に、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、静脈内に、皮内に、皮下に、腹腔内に、脳室内に、頭蓋内に、腟内に、または腫瘍内に投与されるなど、当業者に知られているあらゆる方法によって対象に投与される。

別の実施形態では前述の組成物は経口投与され、したがってこれは経口投与に好適な形態、すなわち固形調製物または液状調製物として製剤される。好適な固形経口製剤としては錠剤、カプセル、丸薬、顆粒剤、ペレット剤などが挙げられる。好適な液状経口製剤としては液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤、オイルなどが挙げられる。別の実施形態において、活性成分はカプセルにおいて処方される。この実施形態によると、本明細書に開示される組成物は、活性化合物および不活性担体または不活性希釈剤に加えて、硬ゼラチンカプセルを含む。

別の実施形態では組成物は液状調製物の静脈内注射、動脈内注射、または筋肉内注射によって投与される。好適な液体製剤としては液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤、オイルなどが挙げられる。１つの実施形態ではそれらの医薬組成物は静脈内投与され、したがって静脈内投与に好適な形態で製剤される。別の実施形態ではそれらの医薬組成物は動脈内投与され、したがって動脈内投与に好適な形態で製剤される。別の実施形態ではそれらの医薬組成物は筋肉内投与され、したがって筋肉内投与に好適な形態で製剤される。

幾つかの実施形態では、抗体またはその機能性断片が組換え型Ｌｍ株を含む組成物と別個に投与されるとき、その抗体は静脈内に、皮下に、または腫瘍もしくは腫瘍床の中へと直接的に注射されてよい。１つの実施形態では抗体を含む組成物は、腫瘍を外科手術的に除去した後に残された空間、例えば、前立腺腫瘍の除去後の前立腺内の空間の中へと注射される。

一実施形態では、「免疫原性組成物」という用語は本明細書で開示されている組み換え型リステリア、ならびにアジュバントおよび抗体もしくはその機能的断片、またはこれらの任意の組合せを包含する場合がある。別の実施形態では、免疫原性組成物は本明細書に開示された組み換え型リステリアを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は当該技術分野で既知のまたは本明細書に開示されたアジュバントを含む。本明細書にさらに開示されているとおり、かかる組成物の投与が免疫応答を強化する、またはＴエフェクター細胞に対する制御性Ｔ細胞の比を増加するもしくは抗腫瘍免疫応答を引き出すことも理解されるべきである。

１つの実施形態では本発明は、前述のリステリア株を含み、且つ、抗体またはその機能性断片をさらに含む組成物の投与を含む使用方法を提供する。別の実施形態において、使用方法は、同じまたは異なる組成物内に存在しうる、及び同じ組成物内にリステリアとして存在するか、または別個の組成物内に存在しうる、本明細書に開示される２個以上の抗体の投与を含む。本発明の異なる実施形態により各可能性が表される。

別の実施形態では、「医薬組成物」という用語は、リステリア株および少なくとも１つの抗体またはその機能的断片を医薬的に許容される担体または希釈剤とともに含む治療的に有効な量の活性成分（複数可）を包含する。「治療的有効量」という用語が所与の病状および投与レジメンに対して治療効果をもたらす量を指すことが理解されるべきである。

当業者であれば、「投与する」という用語が、本明細書に開示される組成物を対象に接触させることを包含することが理解されるであろう。１つの実施形態ではインビトロで、すなわち試験管内で、またはインビボで、すなわち生物、例えば、ヒトの細胞または組織の中で投与を行うことができる。一実施形態では、本開示は、本開示のリステリア株およびその組成物を対象に投与することを包含する。

本明細書において使用される「約」という用語は、定量的な用語で、プラスマイナス５％を意味し、または別の実施形態においてはプラスマイナス１０％を意味し、または別の実施形態においてはプラスマイナス１５％を意味し、または別の実施形態においてはプラスマイナス２０％を意味する。当業者は、「対象」という用語が、病気またはその後遺症に対する治療を必要とする、またはその病気もしくはその後遺症になりやすい成人または子供のヒト、ティーンエージャーまたは青年のヒトを含む哺乳類を包含することができ、その用語がイヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウスなどのヒト以外の哺乳類も含み得ることを理解するべきである。この用語が家畜を包含してもよいことも理解される。「対象」という用語はあらゆる点で正常な個体を除外しない。

本明細書に開示された免疫原性組成物の投与に続いて、本明細書に開示された方法は末梢リンパ器官内でのＴエフェクター細胞の増殖を誘発し、腫瘍部位におけるＴエフェクター細胞の存在の強化をもたらす。別の実施形態では、本明細書に開示された方法は末梢リンパ器官におけるＴエフェクター細胞の増殖を誘発し、Ｔエフェクター細胞の末梢における存在の強化をもたらす。Ｔエフェクター細胞のそのような増殖は、Ｔｒｅｇ数に影響を与えずに末梢内および腫瘍部位における制御性Ｔ細胞に対するＴエフェクター細胞の比率の増加をもたらす。当業者は、末梢リンパ器官には脾臓、パイエル板、リンパ節、アデノイド等が挙げられるがこれに限定されないことを理解する。１つの実施形態では制御性Ｔ細胞に対するＴエフェクター細胞の比率の増加がＴｒｅｇの数に影響を与えずに末梢で起こる。別の実施形態では、制御性Ｔ細胞に対するＴエフェクター細胞の比率の増加が末梢内、リンパ器官内、および腫瘍部位においてこれらの部位でのＴｒｅｇ数に影響を与えずに起こる。別の実施形態ではＴエフェクター細胞の比率の増加によりＴｒｅｇの頻度が低下するが、これらの部位におけるＴｒｅｇの総数は減少しない。

併用療法およびその使用方法
１つの実施形態において、本発明は、対象において抗腫瘍Ｔ細胞応答の増強を誘導する方法を提供するものであり、当該方法は、核酸分子を含有する組み換え型リステリア株を含有する免疫原性組成物の有効量を対象に投与する工程を含み、当該核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含み、当該融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含み、ここで当該方法はさらに、免疫チェックポイント阻害性アンタゴニストを含む組成物の有効量を投与する工程を含む。

１つの実施形態では免疫チェックポイント阻害薬アンタゴニストは抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体またはその断片、抗ＰＤ−１抗体またはその断片、抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその断片、または抗Ｂ７−Ｈ４抗体もしくはその断片である。

別の実施形態では本発明は、対象において増強抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発する方法であって、短縮型リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列をコードする第１オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子を含む組換え型リステリア株を含む免疫原性組成物の有効量を前述の対象に投与する工程を含む方法であり、抗体またはその断片を含む組成物の有効量を前述の対象に投与する工程をさらに含む前述の方法を提供する。別の実施形態ではその抗体はアゴニスト抗体またはその抗原結合断片である。別の実施形態ではその抗体は抗ＴＮＦ受容体抗体またはその抗原結合断片である。別の実施形態ではその抗体は抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合断片である。別の実施形態ではその抗体は抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片である。別の実施形態では前述の方法は、前述の組換え型リステリア株を含む組成物内に含まれ得るか、または別個の組成物内に含まれ得る追加的な抗体の投与をさらに含む。

１つの実施形態では本明細書において記載されるリステリア株を含むあらゆる組成物が本発明の方法の中で使用され得る。１つの実施形態では、本明細書に記載されるように、リステリア株と抗体またはその断片を含むあらゆる組成物、例えばＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーに結合する抗体、またはＴ細胞受容体共刺激分子に結合する抗体、または共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体に結合する抗体を含む組成物が本発明の方法の中で使用され得る。１つの実施形態では本明細書に記載される抗体またはその機能性断片を含むあらゆる組成物が本発明の方法の中で使用され得る。リステリア株を含む組成物であって、抗体を含むものと含まないものをこれまでに詳細に説明してきた。抗体を含む組成物についてもこれまでに詳細に説明してきた。一部の実施形態では本発明の方法において、抗体またはその断片、例えばＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーに結合する抗体、またはＴ細胞受容体共刺激分子に結合する抗体、または共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体に結合する抗体を含む組成物が、リステリア株を含む組成物の投与の前に、その投与と同時に、またはその投与の後に投与され得る。

１つの実施形態では腫瘍の退行を達成するため、初回の治療過程にすぐ引き続いて、または数日、数週間、もしくは数か月の間隔の後、本発明の組成物の反復投与（投薬）を行ってよい。別の実施形態では腫瘍増殖の抑制を達成するため、初回の治療過程にすぐ引き続いて、または数日、数週間、または数か月の間隔の後、反復投薬を行ってよい。撮像技法、血清腫瘍マーカーの分析、生検、または腫瘍に伴う症状の存在、その不在、またはその寛解などの診断方法を含む当技術分野において知られているあらゆる技法のいずれかによって評価を決定してよい。

一実施形態では、本明細書には、異種抗原を発現する腫瘍の予防、治療およびそれに対するワクチン接種のための、および異種抗原の準優占エピトープに対する免疫応答を誘発しつつ、腫瘍のエスケープ変異を防止するための方法および組成物が開示されている。

１つの実施形態では異種抗原を発現する腫瘍の予防、治療、およびそれに対するワクチン接種のための方法および組成物は、短縮型リステリオリシン（ｔＬＬＯ）タンパク質の使用を含む。別の実施形態では、本明細書で開示した方法および組成物は、ＬＬＯを過剰発現する組み換え型リステリア過剰発現ｔＬＬＯを含む。別の実施形態ではそのｔＬＬＯはリステリア内のプラスミドから発現する。

別の実施形態において、対象における腫瘍増殖または癌を予防または治療するための方法が本明細書に開示され、当該方法は本明細書に記載されるように、抗体またはその機能的断片と、核酸分子を含む組み換え型リステリアワクチン株とを含む免疫原性組成物を対象に投与する工程を含み、当該核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープン・リーディング・フレームを含み、ここで当該融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、対象での腫瘍増殖または癌を予防または治療するための方法が本明細書に開示され、当該方法は本明細書に記載されるように、抗体またはその機能的断片と、核酸分子を含む組み換え型リステリアワクチン株とを含む免疫原性組成物を対象に投与する工程を含み、当該核酸分子は、短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列をコードする第１のオープン・リーディング・フレームを含む。

１つの実施形態では「治療する」という用語は疾患を治癒することを指す。別の実施形態では「治療する」とは疾患を防止することを指す。別の実施形態では「治療する」とは疾患の発生率を減少させることを指す。別の実施形態では「治療する」とは疾患の症状を改善することを指す。別の実施形態では「治療する」とは患者の無成績生存率または全体的生存率を増加させることを指す。別の実施形態では「治療する」とは疾患の進行を安定させることを指す。別の実施形態では「治療する」とは寛解を誘導することを指す。別の実施形態では「治療する」とは疾患の進行を減速させることを指す。別の実施形態では「減少させる」、「抑制する」、および「阻害する」という用語は、より少なくすること、または減らすことを指す。

一実施形態では、対象の脾臓および腫瘍微小環境内で、Ｔエフェクター細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加する方法が本明細書に提供され、方法は本明細書に開示された免疫原性組成物を投与することを含む。別の実施形態では対象内の脾臓および腫瘍微小環境内で調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＴエフェクター細胞の比率を増加させることにより、対象内でのより顕著な抗腫瘍応答が可能になる。

別の実施形態ではＴエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３− Ｔ細胞を含む。別の実施形態ではＴエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３− Ｔ細胞である。別の実施形態ではＴエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３− Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。別の実施形態ではＴエフェクター細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３− Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態では制御性Ｔ細胞はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞である。

一実施形態では、本開示は、腫瘍または癌を治療する、腫瘍または癌から保護する、および腫瘍または癌に対する免疫応答を誘発する方法を提供し、これには本明細書に開示された免疫原性組成物を対象に投与する工程を含む。

一実施形態では、本開示はヒト対象内の腫瘍または癌を予防または治療する方法を提供し、これには対象に本明細書に開示された免疫原性組成物の株を投与する工程を含み、この組み換え型リステリア株はＬＬＯタンパク質のＮ末端断片および腫瘍関連抗原を含む組み換え型ポリペプチドを含み、それによってこの組み換え型リステリア株が腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘発し、これによってヒト対象内の腫瘍または癌を治療する。別の実施形態ではその免疫応答はＴ細胞応答である。別の実施形態ではそのＴ細胞応答はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３− Ｔ細胞応答である。別の実施形態ではそのＴ細胞応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態ではそのＴ細胞応答はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、本開示は腫瘍または癌から対象を保護する方法を提供し、これには本明細書に開示された免疫原性組成物を対象に投与する工程を含む。別の実施形態では、本開示は対象内の腫瘍の退行を誘発する方法を提供し、これには本明細書に開示された免疫原性組成物を対象に投与する工程を含む。別の実施形態では、本開示は腫瘍または癌の発生または再発を減少させる方法を提供し、これには本明細書に開示された免疫原性組成物を対象に投与する工程を含む。別の実施形態では、本明細書において、対象内の腫瘍の形成を抑制する方法が提供され、当該方法は、本明細書に開示される免疫原性組成物を対象に投与する工程を含む。別の実施形態では、本開示は対象内の癌の寛解を誘発する方法を提供し、これには本明細書に開示された免疫原性組成物を対象に投与する工程を含む。１つの実施形態では融合ポリペプチドをコードする第１オープン・リーディング・フレームを含む核酸分子がリステリアゲノムに組み込まれる。別の実施形態では、核酸分子は組み換え型リステリアワクチン株内のプラスミドの中にある。別の実施形態では、核酸分子は組み換え型リステリアワクチン株内の細菌人工染色体の中にある。

１つの実施形態では本方法は組換え型リステリアを追加的な療法と共に同時投与する工程を含む。別の実施形態ではその追加的な療法は外科手術、化学療法、免疫療法、放射線療法、抗体ベースの免疫療法、またはこれらの組合せである。別の実施形態ではその追加的な療法はその組換え型リステリアの投与に先行する。別の実施形態ではその追加的な療法はその組換え型リステリアの投与の後に続く。別の実施形態ではその追加的療法は抗体療法である。別の実施形態では、Ｔエフェクター細胞に対する制御性Ｔ細胞の比率を増加させ、且つ、より強力な抗腫瘍免疫応答を生成するため、その組換え型リステリアが漸増用量で投与される。当業者は、細胞の免疫応答を強化するために腫瘍を有する対象に、限定されないが、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、および当技術分野において知られている他のサイトカインをはじめとするサイトカインであって、それらのうちの幾つかが参照により本明細書に援用される米国特許第６９９１７８５号明細書に記載されているサイトカインを提供することによって抗腫瘍免疫応答をさらに強化することができることを理解する。

一実施形態では、本明細書に開示された方法は、本明細書に提供される免疫原性組成物を前述の対象内で抗腫瘍免疫応答を強化する抗体またはその機能的断片と同時投与する工程をさらに含む。

一実施形態では、本明細書に開示された方法は、本明細書に開示された免疫原性組成物をインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）経路阻害剤と同時投与する工程をさらに含む。本明細書の開示内容において使用するためのＩＤＯ経路阻害剤としては、当分野に公知の任意のＩＤＯ経路阻害剤が挙げられ、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、ネクロスタチン−１、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラゾン、エブセレン、５−メチルインドール−３−カルボキサルデヒド、ＣＡＹ１０５８１、抗ＩＤＯ抗体、または小分子ＩＤＯ阻害剤が挙げられるがこれらに限定されない。別の実施形態では、本明細書に開示された組成物および方法は、化学療法または放射線療法レジメンと併せて、その前に、またはそれに続いても使用される。別の実施形態ではＩＤＯ阻害は化学療法剤の効率を強化する。

別の実施形態では、癌に罹患しているかまたは腫瘍を有する対象の生存率を増加させる方法が本明細書に開示され、当該方法は本明細書に記載されるように、抗体またはその機能的断片と、核酸分子を含む組み換え型リステリアワクチン株とを含む免疫原性組成物を対象に投与する工程を含み、当該核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープン・リーディング・フレームを含み、当該融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。

別の実施形態では、癌に罹患しているかまたは腫瘍を有する対象の抗原特異的Ｔ細胞を増加させる方法が本明細書に開示され、当該方法は本明細書に記載されるように、抗体またはその機能的断片と、核酸分子を含む組み換え型リステリアワクチン株とを含む免疫原性組成物を対象に投与する工程を含み、当該核酸分子は、融合ポリペプチドをコードする第１のオープン・リーディング・フレームを含み、当該融合ポリペプチドは、異種抗原またはその断片に融合された短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、癌に罹患しているかまたは腫瘍を有する対象のＴ細胞を増加させる方法が本明細書に開示され、当該方法は本明細書に記載されるように、抗体またはその機能的断片と、核酸分子を含む組み換え型リステリアワクチン株とを含む免疫原性組成物を対象に投与する工程を含み、当該核酸分子は、短縮型リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列をコードする第１のオープン・リーディング・フレームを含む。

別の実施形態では、本発明の方法は、本明細書で開示した通り、組み換え型リステリア株または抗体またはその機能的断片を用いて対象をブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では、追加免疫接種で使用される組み換え型リステリア株は初期の「プライミング」接種で使用される株と同一である。別の実施形態ではその追加免疫株は準備刺激株と異なる。別の実施形態ではその追加免疫接種で使用される抗体は、最初の「準備刺激」接種で使用される抗体と同じ抗原に結合する。別の実施形態ではその追加免疫抗体は準備刺激抗体と異なる。別の実施形態では準備刺激接種と追加免疫接種において同一の用量が使用される。別の実施形態ではより大きい用量が追加免疫に使用される。別の実施形態ではより小さい用量が追加免疫に使用される。別の実施形態において、本明細書に開示される方法は、対象に追加免疫ワクチンを投与する工程をさらに含む。１つの実施形態ではその追加免疫ワクチン接種は一回の準備刺激ワクチン接種に続いて行われる。別の実施形態では準備刺激ワクチン接種の後に一回の追加免疫ワクチン接種が実施される。別の実施形態では準備刺激ワクチン接種の後に２回の追加免疫ワクチン接種が実施される。別の実施形態では準備刺激ワクチン接種の後に３回の追加免疫ワクチン接種が実施される。１つの実施形態では準備刺激株と追加免疫株との間の期間は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では準備刺激株と追加免疫株との間の期間は１週間であり、別の実施形態ではそれは２週間であり、別の実施形態ではそれは３週間であり、別の実施形態ではそれは４週間であり、別の実施形態ではそれは５週間であり、別の実施形態ではそれは６〜８週間であり、さらに別の実施形態では追加免疫株は準備刺激株の８〜１０週間後に投与される。

別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物を用いて対象を追加免疫することをさらに含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される弱毒化リステリア株を含む免疫原性組成物の追加免疫用量を投与する工程を含む。別の実施形態ではその追加免疫用量は前述の免疫原性組成物の代替的形態である。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、対象に追加免疫用の免疫原性組成物を投与する工程をさらに含む。１つの実施形態ではその追加免疫用量は前述の免疫原性組成物の単回準備刺激用量の後に続く。別の実施形態では準備刺激用量の後に単回追加免疫用量が投与される。別の実施形態では準備刺激用量の後に２回の追加免疫用量が投与される。別の実施形態では準備刺激用量の後に３回の追加免疫用量が投与される。一実施形態では、本明細書に開示された弱毒化リステリアを含む免疫原性組成物のプライム用量とブースト用量との間の期間は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態ではこの用量は当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では準備刺激投与と追加免疫投与との間の期間は１週間であり、別の実施形態ではそれは２週間であり、別の実施形態ではそれは３週間であり、別の実施形態ではそれは４週間であり、別の実施形態ではそれは５週間であり、別の実施形態ではそれは６〜８週間であり、さらに別の実施形態ではその追加免疫投与は免疫原性組成物の準備刺激投与の８〜１０週間後に投与される。

多数の病原体に対する免疫応答とそれらに対する保護の強化にとって非相同的「準備刺激追加免疫」戦略が有効であった。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７０：２９−３８（１９９９）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９−５０（２００２）、Ｇｏｎｚａｌｏ，Ｒ．Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｓｔｒａｉｎ２０：１２２６−３１（２００２）、Ｔａｎｇｈｅ，Ａ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：３０４１−７（２００１）。準備刺激注射と追加免疫注射において異なる形態の抗原を提供することがその抗原に対する免疫応答を最大化するようである。ＤＮＡ株での準備刺激とそれに続くアジュバント中のタンパク質を用いた追加免疫、または抗原をコードするＤＮＡのウイルスベクター送達による追加免疫が、抗原特異的抗体およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答をそれぞれ改善する最も効果的な方法のようである。ＳｈｉｖｅｒＪ．Ｗ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４１５：３３１−５（２００２）、Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｃ．ｅｔａｌ．，Ｓｔｒａｉｎ２０：１０３９−４５（２００２）、Ｂｉｌｌａｕｔ−Ｍｕｌｏｔ，Ｏ．ｅｔａｌ．，Ｓｔｒａｉｎ１９：９５−１０２（２０００）、Ｓｉｎ，Ｊ．Ｉ．ｅｔａｌ．，ＤＮＡＣｅｌｌＢｉｏｌ．１８：７７１−９（１９９９）。サルのワクチン接種研究の最近のデータより、サルがＨＩＶｇａｇＤＮＡで準備刺激ワクチン接種され、続いてＨＩＶｇａｇを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ５−ｇａｇ）で追加免疫ワクチン接種されるときにＨＩＶｇａｇ抗原をコードするＤＮＡにＣＲＬ１００５ポロキサマー（１２ｋＤａ、５％ＰＯＥ）を添加することでＴ細胞応答が増強されることが示唆されている。ＤＮＡ／ポロキサマーでの準備刺激とそれに続くＡｄ５−ｇａｇ追加免疫についての細胞免疫応答は、（ポロキサマーを含まない）ＤＮＡ準備刺激とそれに続くＡｄ５−ｇａｇ追加免疫についての細胞免疫応答、またはＡｄ５−ｇａｇのみについての細胞免疫応答よりも大きかった。Ｓｈｉｖｅｒ，Ｊ．Ｗ．ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ４１５：３３１−５（２００２）。米国特許出願公開第２００２／０１６５１７２Ａ１号は、免疫応答が生成されるような、抗原の免疫原性の部分をコードするベクター構築体と抗原の免疫原性の部分を含むタンパク質との同時投与を記述している。その文書はＢ型肝炎抗原およびＨＩＶ抗原に限られている。さらに、米国特許第６，５００，４３２号は対象となるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同時投与によって核酸ワクチン接種の免疫応答を強化する方法を対象としている。この特許によると、同時投与は同一の免疫応答時の、好ましくは互いに０〜１０日以内、または３〜７日間以内のそのポリヌクレオチドとそのポリペプチドの投与を意味する。この特許によって意図される抗原としては、数ある中でも、肝炎（全ての形態）、ＨＳＶ、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＲＳＶ、ＶＺＶ、ＨＰＶ、ポリオ、インフルエンザ、寄生虫（例えば、プラスモジウム属のもの）、および病原性細菌（結核菌、ライ菌、クラミジア、シゲラ、ライム病ボレリア、腸内毒素原性大腸菌、サルモネラ・ティフォサ、ピロリ菌、コレラ菌、百日咳菌等々が挙げられるがこれに限定されない）が挙げられる。上記の参照文献の全ては全体が参照により本明細書に援用される。

１つの実施形態において、本明細書に開示される治療プロトコルは治療的である。別の実施形態ではそのプロトコルは予防的である。別の実施形態において、当業者に理解されるように、家族性遺伝を理由として、またはこれらのタイプの病気にかかりやすくなる他の状況を理由として、乳癌または他のタイプの腫瘍などの癌のリスクがある人々が本明細書に開示されるの組成物を使用して保護される。別の実施形態では、ワクチンは、外科手術による腫瘍増殖の減量術、従来の化学療法、または放射線治療の後の癌免疫療法として使用される。かかる治療に続いて、本明細書に開示されるワクチンを投与することで、腫瘍抗原に対するワクチンのＣＴＬ応答が、残留転移を破壊し、癌からの寛解を延長させる。別の実施形態において、本明細書に開示されるワクチンを使用して、以前に定着した腫瘍の成長に作用し、既存の腫瘍細胞を死滅させる。

幾つかの実施形態では「含む」という用語またはその文法的な形態は、表示された活性薬剤、例えば、本発明のＬｍ菌株を含むと共に他の活性薬剤、例えば、抗体またはその機能性断片、および製薬業界で知られているような医薬的に許容される担体、賦形剤、軟化薬、安定剤などを含むことを指す。幾つかの実施形態では「基本的に〜から成る」という用語は、唯一の活性成分が示された活性成分である組成物を意味するが、製剤の安定、保存などのためであって、指示された活性成分の治療効果には直接的に関与しないその他の化合物も含まれることがある。幾つかの実施形態では「基本的に〜から成る」という用語は、指示された活性成分の機序とは別個の機序によって治療効果を発揮する構成要素を意味することがある。一部の実施形態では、「本質的に〜から成る」という用語は、治療的効果を発揮し、かつ指示された活性成分のとは別個の化合物クラスに属する構成要素を意味することがある。幾つかの実施形態では「基本的に〜から成る」という用語は、例えば、異なる作用機序により作用することにより治療効果を発揮し、表示された活性成分の治療効果とは異なり得る構成要素に関連し得る。幾つかの実施形態では「基本的に〜から成る」という用語は活性成分の放出を促進する構成要素に関連し得る。幾つかの実施形態では「から成る」という用語は、活性成分および医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物に関連する。

本明細書において使用される時、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」で表される単数形は、文脈から明確に別段の指示が無い限り、複数の参照物を含む。例えば、「１つの化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、これらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。

本出願全体を通して本発明の様々な実施形態が範囲形式で提示される場合がある。範囲形式の記載は単に利便性および簡潔性のためにすぎず、本発明の範囲の一定不動の限定として解釈されるべきではないことを理解するべきである。したがって、範囲の記載はその範囲内の全ての可能な部分的範囲ならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと考えられるべきである。例えば、１〜６までなどのような範囲の記載は、１〜３まで、１〜４まで、１〜５まで、２〜４まで、２〜６まで、３〜６まで、等々などの部分的範囲、ならびにこの範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、および６を具体的に開示したと考えられるべきである。これは範囲の程度と無関係に適用される。

本明細書において数値的範囲が示されるときはいつも、表示された範囲内のあらゆる引用される数値（分数または整数）を含むことを意味する。第１表示数と第２表示数と「の間にわたる／の間の範囲」という句、および第１表示数「から」第２表示数「までにわたる／までの範囲」という句は本明細書において互換的に使用され、第１表示数および第２表示数ならびにそれらの間の全ての分数および整数を含むことを意味する。

本明細書において使用される場合、「方法」という用語は、限定されないが、化学技術分野、薬理学技術分野、生物学技術分野、生化学技術分野、および医学技術分野などの専門家によって知られているか、またはそれらの専門家によって既知の方式、手段、技術、および手法から容易に開発される方式、手段、技術、および手法をはじめとする、所与の課題を実線するための方式、手段、技術、および手法を指す。

以下の実施例では、本発明の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示される。しかしながら、本開示はこれらの具体的な詳細を含まずに実施されうることが当業者には理解されるであろう。他の事例では、本開示を不明瞭にしないために周知の方法、手順、および構成成分は詳細には記述されていない。

材料および実験方法（実施例１〜２）
細胞株
Ｃ５７ＢＬ／６同系ＴＣ−１腫瘍をＨＰＶ−１６Ｅ６およびＥ７で不死化し、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子で形質転換した。Ｔ．Ｃ．Ｗｕ（ジョンズ・ホプキンズ大学医学部、米国メリーランド州ボルチモア）によって提供されたＴＣ−１は、低レベルのＨＰＶ−１６Ｅ６およびＥ７を発現し、且つ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子で形質転換された腫瘍形成性の高い肺上皮細胞である。ＴＣ−１を、ＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００μＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０マイクロモル（ｍｃＭ）の２−ＭＥ、４００マイクログラム（ｍｃｇ）／ｍＬのＧ４１８、および１０％のナショナルコレクションタイプカルチャー−１０９培地中、３７°で１０％のＣＯ_２を用いて培養した。Ｃ３は、ＨＰＶ１６の完全ゲノムで不死化され、且つ、ｐＥＪ−ｒａｓで形質転換されたＣ５７ＢＬ／６マウス由来のマウス胚細胞である。ＥＬ−４／Ｅ７は、レトロウイルスによってＥ７を形質導入された胸腺腫ＥＬ−４である。

Ｌ．モノサイトゲネス株および増殖
使用されたリステリア株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（エピソーム発現系内のｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子、図１Ａ）、Ｌｍ−Ｅ７（ＡＤＸＳ１１−００１とも呼ばれる）（リステリアゲノムへと組込まれる単一コピーＥ７遺伝子カセット）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（「ＤＰ−Ｌ２０２８」、エピソーム発現系内のｈｌｙ−ＮＰ融合遺伝子）、およびＬｍ−Ｇａｇ（「ＺＹ−１８」、染色体へと組込まれる単一コピーＨＩＶ−１Ｇａｇ遺伝子カセット）であった。プライマー
（配列番号２４、ＸｈｏＩ部位は下線付き）および
（配列番号２５、ＳｐｅＩ部位は下線付き）を使用してＰＣＲによってＥ７を増幅し、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）にライゲーションした。ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ消化によってＥ７をｐＣＲ２．１から切り出し、ｐＧＧ−５５にライゲーションした。このｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子および多能性転写因子ｐｒｆＡをマルチコピーシャトルプラスミド（ＷｉｒｔｈＲｅｔａｌ、ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ、１６５：８３１，１９８６）であるｐＡＭ４０１にクローニングし、ｐＧＧ−５５を作製した。ｈｌｙプロモーターはｈｌｙ遺伝子産物の最初の４４１個のＡＡの発現を引き起こし（溶血性Ｃ末端を欠いており、以下では「ΔＬＬＯ」と呼ばれ、配列番号３に示す配列を有する）、これはＸｈｏＩ部位によってＥ７遺伝子に結合されてｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子を生じ、それはＬＬＯ−Ｅ７として転写され、分泌される。リステリアのｐｒｆＡ陰性株、ＸＦＬ−７（ペンシルバニア大学のＤｒ．ＨａｏＳｈｅｎによって提供された）のｐＧＧ−５５を用いた形質転換が、インビボでのプラスミドの保持に対して選択された（図１Ａ〜図１Ｂ）。プライマー
（配列番号２６、ＮｈｅＩ部位は下線付き）、および
（配列番号２７、ＸｈｏＩ部位は下線付き）を用いてｈｌｙプロモーターおよび遺伝子断片を作成した。プライマー
（配列番号２８、ＸｂａＩ部位は下線付き）、および
（配列番号２９、ＳａｌＩ部位は下線付き）を用いてｐｒｆＡ遺伝子をＰＣＲ増幅した。ｈｌｙプロモーターとＥ７の発現と分泌を引き起こすシグナル配列とを含有する発現カセットをＬＭゲノムのｏｒｆＺドメインへと導入することによってＬｍ−Ｅ７を作製した。プライマー
（配列番号３０、ＢａｍＨＩ部位は下線付き）および
（配列番号３１、ＸｂａＩ部位は下線付き）を使用してＥ７をＰＣＲ増幅した。次いでＥ７をｐＺＹ−２１シャトルベクターにライゲーションした。結果として得られるプラスミドｐＺＹ−２１−Ｅ７でＬＭ株１０４０３Ｓを形質転換したが、このプラスミドはＬＭゲノムのｏｒｆＸ、Ｙ、Ｚドメインに対応する１．６ｋｂ配列の中央に挿入された発現カセットを含む。その相同性ドメインが相同組換えによるＥ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの挿入を可能にする。Ｅ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの組込みについてクローンをスクリーニングした。クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）を含むブレインハートインフュージョン培地中で細菌を培養し（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ）、またはクロラムフェニコールを含まない同培地中で細菌を培養した（Ｌｍ−Ｅ７およびＺＹ−１８）。細菌をアリコットにして−８０℃で凍結した。ウエスタンブロット法によって発現を検証した（図２）。

ウエスタンブロット法
リステリア株をルリア−ベルターニ培地内で３７℃にて増殖させ、６００ｎｍで測定された同一の光学濃度にて採取した。上清をＴＣＡ沈殿し、０．１ＮのＮａＯＨを補充した１×サンプルバッファー中に再懸濁した。同一量の各細胞ペレットまたは各ＴＣＡ沈殿上清を４〜２０％のトリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮＯＶＥＸ、カリフォルニア州サンディエゴ）上に負荷した。それらのゲルを二フッ化ポリビニリデンに転写し、抗Ｅ７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州サウス・サンフランシスコ）で調査し、次いでＨＲＰ−結合抗マウス二次Ａｂ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、英国リトル・チャルフォント）とインキュベートし、ＡｍｅｒｓｈａｍＥＣＬ検出試薬で発色させ、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）に露光させた。

腫瘍増殖の測定
１日おきに表面の最短径及び最長径にキャリパーをわたして腫瘍を測定した。これら２つの測定値の平均を平均腫瘍径としてミリメートルの単位で様々な時点に対してプロットした。腫瘍径が２０ｍｍに達したとき、マウスを殺処理した。各時点に対する腫瘍の測定値は生きているマウスに対してのみ示されている。

定着した腫瘍増殖に対するリステリア組換え体の効果
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）が左脇腹の皮下に２×１０^５ＴＣ−１細胞を受容した。腫瘍接種の一週間後、腫瘍は直径４〜５ｍｍの触知可能なサイズに達した。次いで８匹のマウスからなる群を７日目および１４日目に０．１ＬＤ_５０のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０^７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１０^６ＣＦＵ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（１０^７ＣＦＵ）、またはＬｍ−Ｇａｇ（５×１０^５ＣＦＵ）で腹腔内処置した。

^５１Ｃｒリリースアッセイ
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを０．１ＬＤ_５０のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇで腹腔内免疫した。免疫の１０日後に脾臓を採取した。脾細胞をフィーダー細胞としての放射線照射ＴＣ−１細胞と培養して（１００：１、脾細胞：ＴＣ−１）確立し、インビトロで５日間刺激し、次いで以下の標的を使用して標準的^５１Ｃｒリリースアッセイに使用した。ＥＬ−４、ＥＬ−４／Ｅ７、またはＥ７Ｈ−２ｂペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）でパルスしたＥＬ−４。Ｅ：Ｔ細胞比は、３回繰り返して、８０：１、４０：１、２０：１、１０：１、５：１、および２．５：１であった。３７℃で４時間のインキュベーション後、細胞をペレット化し、５０μｌの上清を各ウェルから取り出した。Ｗａｌｌａｃ１４５０シンチレーションカウンター（米国メリーランド州ゲイザースバーグ）を用いてサンプルをアッセイした。特異的溶解率は、［（実験による一分当たりのカウント（ｃｐｍ）−自然発生ｃｐｍ）／（総ｃｐｍ−自然発生ｃｐｍ）］×１００として決定された。

ＴＣ−１特異的増殖
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇを用いてＣ５７ＢＬ／６マウスを０．１ＬＤ_５０で免疫し、２０日後に１ＬＤ_５０で腹腔内注射により追加免疫した。追加免疫の６日後、免疫したマウスおよび未感作マウスから脾臓を採取した。Ｅ７Ａｇ源としてのウェル当たり２．５×１０^４細胞、１．２５×１０^４細胞、６×１０^３細胞、または３×１０^３細胞の放射線照射ＴＣ−１細胞と共に、またはＴＣ−１細胞を含まずに、または１０μｇ／ｍｌのＣｏｎＡと共に平底９６ウェルプレート中に５×１０^５細胞／ウェルの密度で培養して脾細胞を確立した。４５時間後に０．５μＣｉ［^３Ｈ］チミジン／ウェルを用いて細胞をパルスした。プレートはＴｏｍｔｅｃハーベスター９６（米国コネチカット州オレンジ）を使用して１８時間後に回収され、Ｗａｌｌａｃ１４５０シンチレーションカウンターを用いて増殖が評価された。ｃｐｍの変化は、実験的ｃｐｍ−Ａｇを含まないｃｐｍとして計算された。

フローサイトメトリー分析
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０．１ＬＤ_５０のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−Ｅ７を用いて静脈内（ｉ．ｖ．）免疫し、３０日後に追加免疫した。ＣＤ８（５３−６．７、ＰＥ結合）、ＣＤ６２リ癌ド（ＣＤ６２Ｌ、ＭＥＬ−１４、ＡＰＣ結合）、およびＥ７Ｈ−２Ｄｂ四量体に対する３色フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーターとＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州マウンテンビュー）を使用して実施した。追加免疫の５日後に採取した脾細胞を、Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）または対照（ＨＩＶ−Ｇａｇ）ペプチドを負荷したＨ−２Ｄｂ四量体を用いて、室温（ｒｔ）で染色した。四量体を１／２００に希釈して使用した。これらの四量体は、Ｄｒ．ＬａｒｒｙＲ．Ｐｅａｓｅ（ＭａｙｏＣｌｉｎｉｃ、米国ミネソタ州ロチェスター）およびＮＩＡＩＤＴｅｔｒａｍｅｒＣｏｒｅＦａｃｉｌｉｔｙおよびＮＩＨＡＩＤＳＲｅｓｅａｒｃｈならびに標準試薬プログラムによって提供された。四量体^＋、ＣＤ８^＋、ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ細胞を分析した。

Ｂ１６Ｆ０−Ｏｖａ実験
２４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに５×１０^５細胞のＢ１６Ｆ０−Ｏｖａ細胞を接種した。３日目、１０日目、および１７日目に０．１ＬＤ_５０のＬｍ−ＯＶＡ（１０^６ｃｆｕ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡ（１０^８ｃｆｕ）を用いて８匹のマウスの群を免疫し、８匹のマウスを処置しないままにした。

統計
腫瘍径の比較のため、各群の腫瘍サイズの平均値とＳＤを決定し、スチューデントのｔ−検定によって統計的有意性を決定した。ｐ≦０．０５を有意と見なした。

実施例１：ＬＬＯ−抗原融合体は抗腫瘍免疫性を誘導する
結果
Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７をＴＣ−１の増殖に影響を与える能力に関して比較した。皮下腫瘍をＣ５７ＢＬ／６マウスの左の脇腹に確立した。７日後、腫瘍は触診可能なサイズ（４〜５ｍｍ）に達した。７日目および１４日目に０．１ＬＤ_５０のＬｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、または対照としてのＬｍ−ＧａｇおよびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰをマウスにワクチン接種した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、定着したＴＣ−１腫瘍の７５％の完全な退行を誘発し、一方でこの群の中の他の２匹のマウスでは腫瘍増殖が制御された（図３）。対照的に、Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−Ｇａｇを用いた免疫は腫瘍退行を誘導しなかった。この実験は複数回繰返され、常に非常に類似した結果であった。加えて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７については異なる免疫プロトコル下でも類似の結果が達成された。別の実験では、定着した５ｍｍのＴＣ−１腫瘍を有するマウスを単回の免疫で治癒することができた。

他の実験では、２つの他のＥ７発現腫瘍細胞株であるＣ３とＥＬ−４／Ｅ７を使用して類似の結果が得られた。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いたワクチン接種の有効性を確認するため、腫瘍を除去した動物にＴＣ−１腫瘍細胞またはＥＬ−４／Ｅ７腫瘍細胞をそれぞれ６０日目または４０日目に再負荷した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で免疫された動物は実験終了まで腫瘍が無いままであった（ＴＣ−１の場合１２４日目、ＥＬ−４／Ｅ７については５４日目）。

したがってΔＬＬＯとの融合タンパク質としての抗原の発現によりその抗原の免疫原性が強化される。

実施例２：ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７処理によりＴＣ−１特異的脾細胞増殖が誘発される
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を有するＬｍ−Ｅ７によるＴ細胞の誘導を測定するため、抗原特異的免疫能の尺度であるＴＣ−１特異的増殖性応答を免疫されたマウスにおいて測定した。脾細胞においてＥ７の供給源として照射したＴＣ−１細胞に曝露したとき、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で免疫化したマウスからの脾細胞を増殖した。ＴＣ−１比は２０：１、４０：１、８０：１、および１６０：１である（図４）。反対に、Ｌｍ−Ｅ７およびｒＬｍ対照で免疫されたマウスに由来する脾細胞はバックグラウンドレベルの増殖を示しただけであった。

実施例３：ＡｃｔＡ−Ｅ７融合およびＰＥＳＴ−Ｅ７融合体は抗腫瘍免疫性を付与する
材料および方法
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の構築
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７は、短縮型のａｃｔＡタンパク質に融合されたＥ７タンパク質を発現するプラスミドを含むＬＭの組換え株である。Ｌｍ−ａｃｔＡ−Ｅ７は、ｐＤＰ−２０２８を改変することにより構築されたプラスミドベクターｐＤＤ−１をリステリアに導入することにより作製された。ｐＤＤ−１は、ＡｃｔＡ−Ｅ７の発現と分泌を誘導する、１コピーの３１０ｂｐのｈｌｙプロモーターとｈｌｙシグナル配列（ｓｓ）を発現する発現カセット、４つのＰＥＳＴ配列（配列番号１９）を含む１１７０ｂｐのａｃｔＡ遺伝子（短縮型ＡｃｔＡポリペプチドはその分子の最初の３９０個のＡＡから成る。配列番号１１）、３００ｂｐのＨＰＶＥ７遺伝子、１０１９ｂｐのｐｒｆＡ遺伝子（病原性遺伝子の発現を制御）、および形質転換細菌クローンの選択のためのＣＡＴ遺伝子（クロラムフェニコール耐性遺伝子）を含む（Ｓｅｗｅｌｌｅｔａｌ．（２００４）、Ａｒｃｈ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．ＨｅａｄＮｅｃｋＳｕｒｇ．，１３０：９２−９７）。

ｈｌｙプロモーター（ｐＨｌｙ）および遺伝子断片は、ｐＧＧ５５（実施例１）からプライマー
（ＸｂａＩ部位は下線付き；配列番号３２）およびプライマー
（ＮｏｔＩ部位は下線付き。最初の１８ヌクレオチドはＡｃｔＡ遺伝子と重複；配列番号３３）を使用してＰＣＲ増幅された。ａｃｔＡ遺伝子は、Ｌｍ１０４０３Ｓ野生型ゲノムからプライマーの
（ＮｏｔＩ部位は下線付き；配列番号３４）およびプライマーの
（ＸｈｏＩ部位は下線付き；配列番号３５）を使用してＰＣＲ増幅された。Ｅ７遺伝子は、ｐＧＧ５５（ｐＬＬＯ−Ｅ７）からプライマー
（ＸｈｏＩ部位は下線付き；配列番号３６）およびプライマー
（ＸｍａＩ部位は下線付き；配列番号３７）を使用してＰＣＲ増幅された。ｐｒｆＡ遺伝子は、Ｌｍ１０４０３Ｓ野生型ゲノムからプライマー
（ＸｍａＩ部位は下線付き；配列番号３８）およびプライマー
（ＳａｌＩ部位は下線付き；配列番号３９）を使用してＰＣＲ増幅された。ｈｌｙプロモーター−ａｃｔＡ遺伝子融合（ｐＨｌｙ−ａｃｔＡ）は、精製したｐＨｌｙＤＮＡおよび精製したａｃｔＡＤＮＡから、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号３２）および下流ａｃｔＡプライマー（配列番号３５）を使用してＰＣＲ生成および増幅された。

ｐｒｆＡ遺伝子（Ｅ７−ｐｒｆＡ）に融合されたＥ７遺伝子は、精製したＥ７ＤＮＡおよび精製したｐｒｆＡＤＮＡから、上流Ｅ７プライマー（配列番号３６）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号３９）を使用してＰＣＲ生成および増幅された。

Ｅ７−ｐｒｆＡ融合生成物に融合されたｐＨｌｙ−ａｃｔＡ融合生成物は、精製した融合ｐＨｌｙ−ａｃｔＡＤＮＡ生成物および精製した融合Ｅ７−ｐｒｆＡＤＮＡ生成物から、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号３２）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号３９）を使用してＰＣＲで生成および増幅され、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州ラホヤ）にライゲーションされた。コンピテント大腸菌（ＴＯＰ１０’Ｆ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州ラホヤ）をｐＣＲＩＩ−ＡｃｔＡＥ７で形質転換した。溶解および分離の後、ＢａｍＨＩを使用する制限分析（７７０ｂｐと６４００ｂｐの期待断片サイズ（または挿入断片をベクターに転じると：２５００ｂｐと４１００ｂｐ））およびＢｓｔＸＩを使用する制限分析（２８００ｂｐと３９００ｂｐの期待断片サイズ）によりプラスミドをスクリーニングし、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号３２）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号３９）を使用するＰＣＲ分析でもプラスミドをスクリーニングした。

ｐＨｌｙ−ａｃｔＡ−Ｅ７−ｐｒｆＡＤＮＡインサートはＸｂａＩおよびＳａｌＩを用いた二重消化によってｐＣＲＩＩから切り離され、またこれもＸｂａＩおよびＳａｌＩを用いて消化されたｐＤＰ−２０２８へと連結される。発現系のｐＡｃｔＡＥ７でＴＯＰ１０’Ｆコンピテント大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州ＬａＪｏｌｌａ）を形質転換した後、クロラムフェニコール抵抗性クローンを、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号３２）と下流ＰｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号３９）を使用したＰＣＲ解析によりスクリーニングした。ｐＡｃｔＡＥ７を含むクローンをブレインハートインフュージョン培地（クロラムフェニコール（２０ｍｃｇ（マイクログラム）／ｍｌ（ミリリットル）、Ｄｉｆｃｏ、ミシガン州デトロイトを含む）中に培養し、ミディプレップＤＮＡ精製システムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を使用してｐＡｃｔＡＥ７を細菌細胞から単離した。ペニシリン処置したリステリア（株ＸＦＬ−７）のｐｒｆＡ陰性株は発現系ｐＡｃｔＡＥ７を用いて形質転換され（Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓｅｔａｌ．（１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２２０９−２２１８）、クローンはプラスミドの保持のためにインビボで選択された。クローンをクロラムフェニコール（２０ｍｃｇ／ｍＬ）入りのブレインハートインフュージョン中に３７℃で培養した。細菌をアリコットにして−８０℃で凍結した。

抗原発現のイムノブロット検証
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７がＡｃｔＡ−Ｅ７（約６４ｋＤ）を分泌することを検証するため、リステリア株をルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地中に３７℃で培養した。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて培養上清からタンパク質を沈殿させ、０．１Ｎの水酸化ナトリウムを含む１×サンプルバッファー中にそれを再懸濁した。同一の量の各ＴＣＡ沈殿上清を４％〜２０％のトリスグリシンドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＮＯＶＥＸ、カリフォルニア州サンディエゴ）に負荷した。ゲルを二フッ化ポリビニリデン膜に転写し、１：２５００の抗Ｅ７モノクローナル抗体（ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州サウス・サンフランシスコ）で調査し、次いで１：５０００のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、英国、リトル・チャルフォント）で調査した。ブロットはＡｍｅｒｓｈａｍ強化化学発光検出試薬を用いて発色させ、オートラジオグラフィーフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に曝露した（図５Ａ）。

Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉの構築（図６Ａ）
Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、それがプロモーターおよびｈｌｙ遺伝子のＰＥＳＴ配列のみ、特にＬＬＯの最初の５０個のＡＡを含有すること以外はＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同一である。Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を構築するため、ＳＯＥ（ジーンスプライシング・バイ・オーバーラップエクステンション）ＰＣＲ技法を使用して、ｈｌｙプロモーターおよびＰＥＳＴ領域を全長のＥ７遺伝子に融合した。従来のＰＣＲ技法によってＥ７遺伝子およびｈｌｙ−ＰＥＳＴ遺伝子断片をＬＬＯの最初の４４１個のＡＡを含有するプラスミドｐＧＧ−５５から増幅し、まとめてスプライシングした。最終的なプラスミドｐＶＳ１６．５を作製するため、インビトロ選択用のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミドｐＡＭ４０１にｈｌｙ−ＰＥＳＴ−Ｅ７断片およびｐｒｆＡ遺伝子をサブクローニングし、得られたプラスミドを使用してＸＦＬ−７を形質転換した。

Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７は、それがＰＥＳＴ配列を欠いていること以外は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同一である組み換え型リステリア株である。これは、ＰＥＳＴ含有領域（３３３〜３８７ｂｐ）をｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子から除去するために設計されたプライマーを使用してエピソーム発現系を構築したこと以外は、基本的にＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７について記載されたように作製された。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、ＰＥＳＴ領域またはＬＬＯを含まないＥ７を分泌する組換え株である。この株を形質転換するのに用いるプラスミドはＥ７遺伝子に融合したｈｌｙプロモーターの遺伝子断片およびシグナル配列を含有する。このコンストラクトは、染色体の中へと組み込まれた単一コピーのＥ７遺伝子を発現した大元のＬｍ−Ｅ７とは異なる。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、発現されるＥ７抗原の形態を除いて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７と完全に同系である。

結果
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７によって誘導される抗腫瘍免疫をＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７によって誘導される抗腫瘍免疫性に対して比較するため、２×１０^５細胞のＴＣ−１腫瘍細胞をマウスに皮下移植し、触知可能サイズ（およそ５ミリメートル［ｍｍ］）まで増殖させた。７日目および１４日目に１ＬＤ_５０のＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（５×１０^８ＣＦＵ）（十字）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０^８ＣＦＵ）（四角）、またはＬｍ−Ｅ７（１０^６ＣＦＵ）（丸）のいずれかでマウスを腹腔内免疫した。２６日目までに、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７でのすべての動物は腫瘍がなく、そのままであったが、一方ですべての無処置の動物（三角）およびＬｍ−Ｅ７で免疫化した動物は大きい腫瘍を成長させた（図５Ｂ）。したがって、ＡｃｔＡ−Ｅ７融合体でのワクチン接種は腫瘍退行を生じさせる。

加えて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを、Ｅ７発現腫瘍の退行を生じさせるそれらの能力について比較した。ｓ．ｃ．ＴＣ−１腫瘍は４０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹に定着した。腫瘍が４〜５ｍｍに達した後、８匹のマウスからなる５つの群にマウスを分けた。各々の群を４つの組み換え型ＬＭワクチンのうちの１つで処置し、１つの群は未処置のまま放置した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７はそれぞれ５／８事例および３／８の事例で定着した腫瘍の退行を誘導した。いずれの時点においてもＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７またはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で処置されたマウスの平均腫瘍サイズの間に統計的な差はなかった。しかしながら、ＰＥＳＴ配列、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを含まないＥ７を発現したワクチンは、１つを除いて全てのマウスで腫瘍退行を生じなかった（図６Ｂ、上のパネル）。これは２つの実験の代表であり、２８日目における平均腫瘍サイズの統計的に有意な差がＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７で処置した腫瘍とＬｍ−Ｅ７ｅｐｉまたはＬｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７で処置した腫瘍との間で観察された（Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定；図６Ｂ、下のパネル）。加えて、四量体陽性脾細胞のパーセンテージの増大は、ＰＥＳＴ含有ワクチンをワクチン接種したマウスの脾臓における３つの実験にわたって再現性が見られた（図６Ｃ）。したがって、ＰＥＳＴ−Ｅ７融合体を用いたワクチン接種は腫瘍退行を生じさせる。

実施例４：ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ様配列へのＥ７の融合はＥ７特異的な免疫性を強化し、腫瘍浸潤Ｅ７特異的ＣＤ８^＋細胞を発生させる
材料および実験方法
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００ｍｃｌ（マイクロリットル）の２×１０^５細胞のＴＣ−１腫瘍細胞に加えて４００ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州フランクリン・レイクス）を含む５００ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）を１２匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹に皮下移植した（ｎ＝３）。マウスを７日目、１４日目、および２１日目に腹腔内免疫し、脾臓および腫瘍を２８日目に採取した。腫瘍ＭＡＴＲＩＧＥＬをマウスから取り出し、氷上で、２ミリリットル（ｍＬ）のＲＰ１０培地を含有する試験管内において４℃で一晩インキュベートした。鉗子を用いて腫瘍を細かく切り刻み、２ｍｍのブロックに切断し、３ｍｌの酵素混合物（ＰＢＳ中の０．２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＰ、１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅ−１）と共に３７℃で１時間インキュベートした。四量体およびＩＦＮ−γ染色のため、組織懸濁液をナイロンメッシュに通して濾過し、ＰＢＳ中の５％胎児ウシ血清＋０．０５％ＮａＮ_３で洗浄した。

ブレフェルジンＡの存在下で１０^７細胞／ｍＬの脾細胞および腫瘍細胞を１マイクロモル（ｍｃｍ）のＥ７ペプチドと共に５時間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、５０ｍｃｌの抗マウスＦｃ受容体上清（２．４Ｇ２）中、４℃で１時間または一晩インキュベートした。細胞を表面分子ＣＤ８およびＣＤ６２Ｌについて染色し、透過処理し、透過処理キットＧｏｌｇｉ−ｓｔｏｐ（登録商標）またはＧｏｌｇｉ−Ｐｌｕｇ（登録商標）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して固定し、ＩＦＮ−γについて染色した。２レーザーフローサイトメーター、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して５００，０００イベントを取得し、ＣｅｌｌｑｕｅｓｔＳｏｆｔｗａｒｅ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリン・レイクス）を使用して分析した。活性化（ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞内のＩＦＮ−γ分泌細胞のパーセンテージを計算した。

四量体染色のため、Ｈ−２Ｄ^ｂ四量体にフィコエリスリン（ＰＥ）結合Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号４０）を負荷し、室温で１時間染色し、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合抗ＭＥＬ−１４（ＣＤ６２Ｌ）およびＦＩＴＣ−結合抗ＣＤ８^＋で４℃において３０分間染色した。脾臓および腫瘍内の四量体^＋ＣＤ８^＋ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ細胞を比較して細胞を分析した。

結果
抗原特異的免疫を強化するＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の能力を分析するため、マウスにＴＣ−１腫瘍細胞を移植し、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０^７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０^６ＣＦＵ）、またはＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（２×１０^８ＣＦＵ）のいずれかで免疫するか、または無処置（未感作）とした。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７群からのマウスの腫瘍は、Ｌｍ−Ｅ７または無処置マウスにおけるよりも、より高いパーセンテージのＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８^＋Ｔ細胞（図７Ａ）および四量体特異的なＣＤ８^＋細胞（図７Ｂ）を含有した。

別の実験では、腫瘍担持マウスにＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、またはＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを投与し、腫瘍中のＥ７特異的リンパ球のレベルを測定した。０．１ＬＤ_５０の４つのワクチンを用いて、７日目および１４日目にマウスを処置した。腫瘍を２１日目に採取し、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８に対する抗体を用いて、およびＥ７／Ｄｂ四量体を用いて染色した。腫瘍内の四量体陽性リンパ球のパーセンテージの増大が、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を用いてワクチン接種したマウスで見られた（図８Ａ）。この結果は３つの実験にわたって再現性があった（図８Ｂ）。

したがって、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７、およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、腫瘍浸潤ＣＤ８^＋Ｔ細胞の誘導および腫瘍退行において各々有効である。

実施例５：ＬＬＯおよびＡｃｔＡの融合体はＥ６／Ｅ７トランスジェニックマウスにおいて自発性（自然発生）腫瘍を減少させる
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７ワクチンの、Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスにおける自己由来腫瘍に対する影響を判断するために、生後６〜８週のマウスを１×１０^８Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７または２．５×１０^８Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７で毎月１回、８か月にわたり免疫化した。最後の免疫から２０日後にマウスを殺処理し、甲状腺を摘出し、重量測定した。この実験を二回実施した（表１）。

表１．８か月齢のワクチン未接種のトランスジェニックマウスとワクチン接種済みのトランスジェニックマウスにおける甲状腺重量（ｍｇ）＊。

Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７処置マウスと無処置マウスの間の甲状腺重量の差、およびＬｍ−ＬＬＯ−ＡｃｔＡ処置マウスと無処置マウスの間の甲状腺重量の差は両方の実験において有意（それぞれｐ＜０．００１およびｐ＜０．０５）であったが、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ処置マウス（無関係の抗原対照）と無処置マウスの間の差は有意ではなく（スチューデントのｔ−検定）、このことはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７が自然発生腫瘍増殖を抑制したことを示している。ゆえに、本明細書に開示されるワクチンは、新たなＥ７発現腫瘍の形成を阻害した。

上記実施例における所見を要約すると、ＬＬＯ抗原およびＡｃｔＡ抗原の融合体は、（ａ）腫瘍浸潤性抗原特異的Ｔ細胞を含み、及び腫瘍退行を誘導して通常の腫瘍および特に侵襲性の強い腫瘍の両方の腫瘍増殖を制御することが可能である腫瘍特異的免疫応答を誘導し、（ｂ）自己抗原に対する寛容を克服し、そして（ｃ）自然発生腫瘍増殖を防止する。これらの所見は、多種多様な抗原、ＰＥＳＴ様配列、および腫瘍タイプについて首尾よく実施されたことによって証明されるように、大多数の抗原、ＰＥＳＴ様配列、および腫瘍タイプに一般化される。

実施例６：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンは安全であり子宮頸癌患者の臨床指標を改善する
材料および実験方法
選択基準。治験の全ての患者は「進展子宮頸部癌、進行性子宮頸部癌、または再発性子宮頚部癌」と診断されており、登録時の評価で全員がステージＩＶＢの疾患を有する段階であることが示された。全ての患者がカンジジン、おたふく風邪、破傷風、またはツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）から選択される３つのメモリー抗原を含むアネルギーパネルに対して陽性の免疫応答を示し、妊娠中でもＨＩＶ陽性でもなく、４週間以内に治験薬を服用しておらず、ステロイドを受容していなかった。

プロトコル：患者は、入院患者への２５０ｍｌの通常生理食塩水の３０分間にわたる静脈内（ＩＶ）注入として３週間の間隔で２回のワクチン接種を実施された。５日後、患者は単回のＩＶアンピシリンコースを受け、さらに１０日間の経口アンピシリンを受けた上で解放された。食欲、日常的作業を完了する能力、安らかな睡眠など、全般的な生命力および生活の質の尺度であるカルノフスキーパフォーマンス指標を使用して全般的な健康状態を判断した。さらに、安全性および全体的な健康状態についての以下の指標、すなわち、アルカリホスファターゼ、直接ビリルビンと総ビリルビンの両方、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ｇｇｔ）、コレステロール、収縮期、拡張期、および心拍数、カルノフスキー様の生活の質の指標である疾患進行評価用の米国東海岸がん臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）基準、ヘマトクリット、ヘモグロビン、血小板レベル、リンパ球レベル、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、およびＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）が決定された。患者は２回目の投与後の３週間目および３か月目に追跡調査を受け、その時点でそれらの患者の固形腫瘍治療効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）スコアを決定し、スキャンを実施して腫瘍サイズを決定し、治験終了時に免疫学的分析用に血液標本を採取し、その免疫学的分析にはＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＣＤ４^＋細胞集団、およびＣＤ８^＋細胞母集団の評価が含まれた。

リステリア株：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の作製は実施例１に説明されている。
結果
治験の前に、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の静脈内（ｉ．ｖ．）投与と腹腔内（ｉ．ｐ．）投与の間で抗腫瘍有効性を判断するために前臨床実験を実施した。１×１０^４細胞のＴＣ−１細胞を含む腫瘍を皮下に確立した。７日目および１４日目に１０^８単位のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の腹腔内投与か、または１０^８単位、１０^７単位、１０^６単位、もしくは１０^５単位の用量でのＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の静脈内投与のいずれかでマウスを免疫した。３５日目に、いずれかの経路で１０^８単位のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を投与されたマウス、または１０^７単位のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の静脈内投与を受けたマウスの５／８、および１０^６単位のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の静脈内投与を受けたマウスの４／８が治癒した。それに対して、１０^７単位未満の用量、または幾つかの事例では腹腔内投与された１０^８単位のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は腫瘍増殖の抑制に効果的ではなかった。よって、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の静脈内投与は腹腔内投与よりも効果的である。

治験
進行、進行性、または再発性の子宮頸癌患者におけるＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンの安全性および有効性を評価するために、段階Ｉ／ＩＩの治験が実施された。それぞれ５人の患者をコホート１〜２に割り当て、それぞれ１×１０^９ＣＦＵまたは３．３×１０^９ＣＦＵを受けた。さらに５人の患者をそれぞれコホート３〜４に割り当て、それぞれ１×１０^１０ＣＦＵまたは３．３１×１０^１０ＣＦＵを受ける。

安全性データ
第１コホート
第１コホートの患者全員が注入の開始後１〜２時間以内に軽度から中程度の発熱および悪寒の発症を報告した。一部の患者には吐き気を伴う嘔吐、または伴わない嘔吐があった。１例を除いて（後述）パラセタモールなどの非ステロイド系薬剤の単回投与がこれらの症状の解消に充分であった。発熱と呼応して、その時間経過に合わせて幾分かの一時的な心血管系の効果が観察された。その他の有害効果は報告されなかった。

子宮頚部癌のこの後期段階では１年生存率は患者の１０〜１５％であることが典型的であり、有効であった腫瘍療法はこれまでに無い。実際に、患者２は非常に侵襲性の強い疾患を有する若年の患者であり、治験完了後まもなくに亡くなった。

投与後２日目、３日目、および５日目に定量的血液培養物を評価した。このコホートで評価可能な５人の患者のうち、４人はどの時点でも血清中リステリアを示さず、１人は２日目に非常に少量（３５ＣＦＵ）の循環リステリアを有したが、３日目または５日目には検出可能なリステリアはなかった。

患者５は最初のワクチン接種に反応し、投与後４８時間にわたって軽度の発熱があり、抗炎症剤で治療を受けた。１例で発熱が中程度の重篤度になる（どの時点でも３８．４℃を超えない）まで上昇したが、その後その患者にはアンピシリンコースが提供され、これによって発熱が解消した。抗生物質投与中、この患者は軽度のじんましんを発症し、これは抗生物質投与後に解消した。血液培養はすべて無菌であり、心血管データはその他の患者で観察された範囲内にあり、血清化学値は正常で、この患者にはリステリア疾患がないことが示された。さらに、アネルギーパネルは、１／３のメモリー抗原に対する強い反応を示し、（他の患者と類似する）機能性免疫の存在を示した。患者５はその後、追加免疫を受けると他の全員の患者と類似した反応を示した。

第２コホートおよび全般的安全性の観察
両方のコホートで注入後に肝臓機能試験において軽度で一時的な変化が観察された。これらの変化は治験をモニタリングする主治医によって臨床的有意性を持たないと判断され、体循環から肝臓および脾臓まで急速に除去される細菌の短命の感染であると予期された。概して、上記の方法の節に記載された全ての安全性指標が正味の変化をほとんど、または全く示さず、優れた安全性プロフィールを示した。このコホートにおける副作用プロファイルは、最初のコホートで見られたプロファイルと実質的に同一であり、それは医原性感染の誘導の結果として発生するサイトカインおよび類似の因子の結果に関連する用量依存性の一連の症状であるように思われた。どの時点でも血清中リステリアが観察されず、どちらのコホートでも用量制限毒性が観察されなかった。

有効性−第１コホート
治験を終了した第１コホートの３人の患者で以下の有効性指標を観察した：（図９）。

患者１はそれぞれ２０ｍｍの２個の腫瘍がある状態で治験に登録したが、これらの腫瘍は治験期間にわたり１８ｍｍおよび１４ｍｍに縮小し、ワクチンの治療的有効性を示した。さらに、患者１はカルノフスキーパフォーマンス指標が７０で治験登録し、その指標は投与後には９０に上昇した。安全性審査パネルの会合で、セルビア国ベオグラード市の腫瘍学および放射線学研究所腫瘍学部門の部門長であるＳｉｎｉｓａＲａｄｕｌｏｖｉｃが、それらの治験の実施機関の代表者、その機関のコンサルタントとして働く独立癌医であるＭｉｃｈａｅｌＫｕｒｍａｎ、Ｍｅｒｃｋ社のためにガーダシルの第ＩＩＩ相治験を実施し、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅ社のためにサーバリックスの治験を実施したエモリー大学の婦人科腫瘍学者であるＫｅｖｉｎＡｕｌｔ、およびＮＣＩの婦人科腫瘍学グループの創設者であり、ミシシッピ大学の婦人科腫瘍学の教授であるＴａｔｅＴｈｉｇｐｅｎに結果を発表した。Ｒａｄｕｌｏｖｉｃ博士の意見では、患者１はワクチンの治療によって臨床的利益を示した。

亡くなる前の患者２は混在した反応を示しており、１／２の腫瘍が縮小した。

患者３は腫瘍随伴性疾患（患者の全体的な衰弱状態によって癌にとって二次的な他の続発症が生じるその癌の付帯現象）がある状態で登録したが、それには血小板数の９３６×１０^９／ｍｌまでの上昇が含まれた。最初の投与の後、この数値はほぼ正常なレベルである４０５×１０^９／ｍｌに減少した。

患者４はそれぞれ２０ｍｍの２個の腫瘍がある状態で治験に登録したが、これらの腫瘍は治験期間にわたり１８ｍｍおよび１４ｍｍに縮小し、ワクチンの治療的有効性を示した。患者４は１．６Ｋｇの体重増加を示し、１回目と２回目の投与の間でおよそ１０％のヘモグロビン数増加を示した。

有効性 − 第２コホートおよび一般的観察
最低用量のコホートでは２人の患者で腫瘍の縮小が見られた。この効果のタイミングは、その効果が免疫応答の経時的発生に従っていたという点で免疫学的応答に関して観察された内容と一致した。これまでに腫瘍細胞量が評価された第２コホートの２人の患者のうち１人がワクチン接種後の時点で劇的な腫瘍細胞量の減少を示した。治験開始時、この患者には１３ｍｍ、１３ｍｍ、および１４ｍｍの３個の腫瘍があった。２回のワクチン投与後、２個の腫瘍は９．４ｍｍおよび１２ｍｍに縮小し、３個目の腫瘍はもはや検出できなかった。

２つのコホートの腫瘍細胞量を図１３Ｂに示す。要約すると、準備刺激注入と単回の追加免疫を含む治療レジメンで投与された比較的に低用量のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７によっても、データが収集された６人の患者のうち３人で客観的奏功が達成された。

考察
子宮頚部癌のこの後期段階では１年生存率は患者の１０〜１５％であることが典型的であり、有効であった腫瘍療法はこれまでに無い。ステージＩＶＢの子宮頚部癌を回復に向かわせることに有効であることを示した治療は無かった。この段階での子宮頚部癌の治療の困難さにもかかわらず、２／６の患者において抗腫瘍効果が観察された。さらに、本明細書において上述したようにその他の有効性指標が治験を終了した患者で観察された。

よって、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７はヒト対象において安全であり、比較的低い用量で投与されても子宮頚部癌患者の臨床的指標を向上させる。追加免疫ワクチン接種の用量と回数を増やすと、および／または抗生物質を少量の用量で、もしくは注入後の後期の時点で投与すると、追加の肯定的な結果が観察される可能性がある。前臨床研究により、一桁台の倍率での用量の増加が奏効率に劇的な変化（例えば、０％の奏効率から５０〜１００％の完全寛解率）を起こし得ることが示された。また、追加的な追加免疫投与によって得られる免疫応答がさらに増強される高い可能性がある。さらに、観察された治療的免疫応答の肯定的効果は、免疫系が引き続き癌を攻撃することから、追加の時間経過にわたり継続する可能性がある。

実施例７：弱毒化リステリア株ＬｍｄｄΔａｃｔＡの構築、およびＬｍｄｄ株およびＬｍｄｄａ株内のｈｌｙ遺伝子へのフレーム内でのヒトｋｌｋ３遺伝子の挿入。

材料および方法
前立腺癌のマウスモデルにおいて腫瘍の退行に関連する強力なＰＳＡ特異的免疫応答を誘発するｔＬＬＯに融合されたＰＳＡを分泌する組換え型Ｌｍであって、ｔＬＬＯ−ＰＳＡの発現がそのベクターに抗生物質耐性を付与するｐＧＧ５５ベースのプラスミド（表２）に由来する前述の組換え型Ｌｍ（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）を開発した。我々は、最近、ｐＡｄｖ１４２プラスミドに基づき、ＰＳＡワクチン用の新株を開発したが、これは、抗生物質抵抗性マーカーを持たず、ＬｍｄｄＡ−１４２（表３）と呼ぶ。この新株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡよりも１０倍弱毒化されている。加えて、ＬｍｄｄＡ−１４２はＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡよりも免疫原性がわずかに高く、且つ、ＰＳＡを発現する腫瘍の退行に関して著しく有効であった。

表２．プラスミドおよび株

プラスミドｐＡｄｖ１４２（６５２３ｂｐ）の配列は次のとおりであった：
（配列番号４１）。このプラスミドは２００８年２月２０日にＧｅｎｅｗｉｚ試験施設にて大腸株から配列決定された。

Ｌｍｄａｌｄａｔ（Ｌｍｄｄ）株は、病毒性因子、ＡｃｔＡの不可逆的な欠失によって弱毒化された。下流遺伝子の発現に対するあらゆる極性効果を回避するよう、Ｌｍｄａｌ／ｄａｔ（Ｌｍｄｄ）バックグラウンドでａｃｔＡのインフレーム欠失を構築した。そのＬｍｄａｌｄａｔ ΔａｃｔＡはＡｃｔＡの５９１アミノ酸の欠失によってＮ末端の最初の１９アミノ酸とＣ末端の２８アミノ酸残基を含有する。

そのａｃｔＡ欠失突然変異体は、ＰＣＲによってａｃｔＡの上流部分（６５７ｂｐ、オリゴＡｄｖ２７１／２７２）および下流部分（６２５ｂｐ、オリゴＡｄｖ２７３／２７４）に対応する染色体領域を増幅し、且つ、結合することにより作製された。この増幅に使用されたプライマーの配列が表３に提示されている。ａｃｔＡの上流ＤＮＡ領域と下流ＤＮＡ領域をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ制限部位においてｐＮＥＢ１９３内にクローニングし、このプラスミドからＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩを温度感受性プラスミドｐＫＳＶ７内にさらにクローニングしてΔａｃｔＡ／ｐＫＳＶ７（ｐＡｄｖ１２０）を得た。

表３：ａｃｔＡの上流および下流のＤＮＡ配列の増幅に使用されたプライマーの配列

遺伝子の染色体上のその位置からの欠失を、ａｃｔＡ欠失領域の外側に結合するプライマーを使用して確認した。当該プライマーは、プライマー３（Ａｄｖ３０５−ｔｇｇｇａｔｇｇｃｃａａｇａａａｔｔｃ、配列番号４６）およびプライマー４（Ａｄｖ３０４−ｃｔａｃｃａｔｇｔｃｔｔｃｃｇｔｔｇｃｔｔｇ、配列番号４７）として図１０Ａおよび図１０Ｂに示されている。ＬｍｄｄおよびＬｍｄｄΔａｃｔＡから単離された染色体ＤＮＡに対してＰＣＲ分析を実施した。Ｌｍｄｄの染色体ＤＮＡ内でのプライマー対１／２および３／４の２つの異なるセットによる増幅後のＤＮＡ断片のサイズは３．０Ｋｂおよび３．４Ｋｂであると予期された。一方で、ＬｍｄｄΔａｃｔＡ用のプライマー対１／２および３／４を使用するＰＣＲの期待サイズは１．２Ｋｂおよび１．６Ｋｂであった。したがって、図１０Ａおよび図１０ＢのＰＣＲ解析により、ａｃｔＡの１．８ｋｂ領域がＬｍｄｄΔａｃｔＡ株内で欠失したことが確認される。ＬｍｄｄΔａｃｔＡ株内のａｃｔＡ含有領域の欠失を確認するためにＰＣＲ産物に対してＤＮＡシーケンシングも実施した。

実施例８：Ｌｍベクターによる抗原送達のための抗生物質非依存的エピソーム発現系の構築。
Ｌｍベクター（ｐＡｄｖ１４２）による抗原送達のための抗生物質非依存的なエピソーム発現系は、次世代の抗生物質を含まないプラスミドｐＴＶ３である（Ｖｅｒｃｈｅｔａｌ．，ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ、２００４．７２（１１）：６４１８−２５、参照により本明細書に援用される）。リステリア株Ｌｍｄｄは染色体中に病原性遺伝子転写活性化因子の遺伝子である１コピーのｐｒｆＡ遺伝子を含むため、ｐｒｆＡをｐＴＶ３から欠失した。さらに、ＮｈｅＩ／ＰａｃＩ制限部位でのｐ６０−リステリアｄａｌ用のカセットは、ｐ６０−枯草菌ｄａｌにより置換され、その結果としてプラスミドｐＡｄｖ１３４が得られた（図１１Ａ）。リステリアとバチルスのｄａｌ遺伝子の類似性は約３０％であり、Ｌｍｄｄ染色体内のｄａｌ遺伝子の残りの断片とそのプラスミドとの間で組換えが起こる可能性が実質的に排除される。プラスミドｐＡｄｖ１３４は抗原発現カセットｔＬＬＯ−Ｅ７を含んだ。ＬｍｄｄＡ株は、ｐＡｄｖ１３４プラスミドで形質転換し、選択したクローンからのＬＬＯ−Ｅ７タンパク質の発現がウエスタンブロットによって確認された（図１１Ｂ）。１０４０３Ｓ野生型株に由来するＬｍｄｄ系は、Ｌｍｄｄストレプトマイシン耐性を除き、抗生物質耐性マーカーを持っていない。

さらに、ｐＡｄｖ１３４をＸｈｏＩ／ＸｍａＩで制限処理してヒトＰＳＡであるｋｌｋ３をクローニングしてプラスミドｐＡｄｖ１４２を得た。新しいプラスミド、ｐＡｄｖ１４２（図１１Ｃ、表２）は、リステリアｐ６０プロモーターの制御下でバシラスｄａｌ（Ｂ−Ｄａｌ）を含む。そのシャトルプラスミドｐＡｄｖ１４２は外因性Ｄ−アラニンの非存在下で大腸菌ａｌａｄｒｘＭＢ２１５９ならびにリステリア・モノサイトゲネス株Ｌｍｄｄの両方の増殖を相補した。プラスミドｐＡｄｖ１４２内の抗原発現カセットは、ｈｌｙプロモータープロモーターおよびＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質から構成される（図１１Ｃ）。

プラスミドｐＡｄｖ１４２でリステリアのバックグラウンド株であるＬｍｄｄａｃｔＡ株を形質転換してＬｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡを得た。株Ｌｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡによるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現および分泌は、抗ＬＬＯおよび抗ＰＳＡ抗体を使用したウエスタンブロットにより確認された（図１１Ｄ）。インビボでの２継代後にＬｍ−ｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株によるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の安定した発現および分泌が存在した。

実施例９：ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株のインビトロおよびインビボでの安定性
ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡリステリア株を選択圧の存在下または非存在下で８日間にわたり培養することによりプラスミドのインビトロでの安定性を検査した。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株用の選択圧はＤ−アラニンである。したがって、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地およびＢＨＩ＋１００μｇ／ｍｌＤ−アラニン培地中でＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株を継代培養した。選択培地（ＢＨＩ）および非選択培地（ＢＨＩ＋Ｄ−アラニン）培地上にプレーティングした後に毎日ＣＦＵを決定した。プラスミドの喪失が非選択培地（ＢＨＩ＋Ｄ−アラニン）上へのプレーティング後のより高いＣＦＵにつながることが予期された。図１２Ａに示すとおり、選択的および非選択的な培地でのＣＦＵ数には差異がなかった。このことは、実験が終了するときである少なくとも５０世代にわたってプラスミドｐＡｄｖ１４２が安定であったことを示唆する。

インビボでのプラスミド維持が、５×１０^７ＣＦＵのＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡをＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈内注入することにより決定された。２４時間および４８時間の時点でＰＢＳ中に均質化した脾臓から生存可能な細菌を分離した。ＢＨＩプレートおよびＢＨＩ＋１００ｍｇ／ｍｌＤ−アラニン上で各時点について各試料のＣＦＵを決定した。選択培地および非選択培地への脾細胞のプレーティングの後、２４時間後にコロニーを回収した。この株は非常に弱毒化されているため、インビボにおいて２４時間で細菌負荷量が除去された。選択的および非選択的なプレートで有意なＣＦＵの差異は検出されず、これは分離されたすべての細菌内での組み換え型プラスミドの安定した存在を示している（図１２Ｂ）。

実施例１０：ＬｍｄｄＡ−１４２（ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）株のインビボでの継代、病毒性およびクリアランス
ＬｍｄｄＡ−１４２は、エピソーム的に発現されたｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質を分泌する組み換え型リステリア株である。安全な用量を決定するために様々な用量のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡでマウスを免疫化し、毒性効果を決定した。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、最小限の毒性効果しか引き起こさなかった（データ非表示）。それらの結果より、１０^８ＣＦＵの用量のＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡはマウスによって充分に忍容されることが示唆された。病毒性研究によりＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株が非常に弱毒化されたことが示されている。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスに安全な投与量１０^８ＣＦＵを腹腔内投与した後での、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡのインビボでのクリアランスが決定された。２日後、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫されたマウスの肝臓および脾臓内には検出可能なコロニーが存在しなかった。この株は高度に弱毒化されているため、インビボで４８時間の時点で完全にクリアされた（図１３Ａ）。

マクロファージに感染して細胞内で成長するＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株の能力がＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの弱毒化により低下するか決定するため、細胞感染アッセイを実施した。Ｊ７７４Ａ．１などのマウスのマクロファージ様細胞株にリステリア構成体をインビトロで感染させ、細胞内増殖を定量した。陽性対照株である野生型リステリア株１０４０３Ｓは細胞内で増殖し、ｐｒｆＡ変異体である陰性対照ＸＦＬ７は、ファゴリソソームを回避することができず、したがってＪ７７４細胞内で増殖しない。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡの細胞質内での増殖は、この株の細胞から細胞へと蔓延する能力の損失のため、１０４０３Ｓよりも遅かった（図１３Ｂ）。それらの結果は、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡがマクロファージに感染し、細胞質内で増殖する能力を持っていることを示す。

実施例１１：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株の免疫原性
Ｃ５７ＢＬ／６マウス内で構築体ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡにより誘発されたＰＳＡ特異的な免疫応答がＰＳＡ四量体染色を使用して決定された。１週間の間隔でマウスをＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで２回免疫し、追加免疫から６日後にＰＳＡ四量体について脾細胞を染色した。ＰＳＡ特異的な四量体での脾細胞の染色によって、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、ＰＳＡ四量体^＋ＣＤ８^＋ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ細胞の２３％の誘発が示された（図１４Ａ）。ＰＳＡペプチドでの５時間にわたる刺激後にＩＦＮ−γを分泌するＰＳＡ特異的Ｔ細胞の機能的能力を、細胞内サイトカイン染色を使用して検査した。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ群でＰＳＡペプチドで刺激したＣＤ８^＋ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＩＦＮ−γを分泌する細胞で、無処置マウスと比較して２００倍の増加があり（図１４Ｂ）、これは、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ株は非常に免疫原性が高く、また脾臓内のＰＳＡに対して高いレベルの機能的に活性のＰＳＡＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を初期刺激することを示している。

マウスをＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化した後でＰＳＡに対して生成された細胞毒性Ｔ細胞の機能性活性を決定するために、ＰＳＡ特異的なＣＴＬの持つインビトロアッセイでＨ−２Ｄ^ｂペプチドによりパルスしたＥＬ４細胞を溶解する能力を試験した。ＦＡＣＳベースのカスパーゼアッセイ（図１４Ｃ）およびユーロピウム放出（図１４Ｄ）が、細胞溶解を測定するために使用された。ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫されたマウスの脾細胞は、ＰＳＡペプチドを標的抗原として提示する細胞に対して高い細胞溶解活性を持つＣＴＬを含んだ。

抗原で２４ｈ刺激した後、エフェクターＴ細胞の持つＩＦＮ−γを分泌する機能性能力を決定するためにＥＬＩＳｐｏｔが実施された。ＥＬＩＳｐｏｔを使用して、特異的ペプチドで刺激したＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスからの脾細胞内で、無処置マウスの脾細胞と比較した時に、ＩＦＮ−γのスポット数に２０倍の増加があったことが観察された（図１４Ｅ）。

実施例１２：ＬｍｄｄＡ−１４２株での免疫によりＰＳＡを発現する腫瘍の退行およびＰＳＡ特異的ＣＴＬによる腫瘍の浸潤が誘導される。
ＰＳＡを発現するように改変された前立腺腺癌細胞株（Ｔｒａｍｐ−Ｃ１−ＰＳＡ（ＴＰＳＡ）；Ｓｈａｈａｂｉｅｔａｌ．，２００８）を使用してＬｍｄｄＡ−１４２（ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡ）コンストラクトの治療効力を決定した。マウスに２×１０^６のＴＰＳＡ細胞を皮下移植した。腫瘍接種後６日目に腫瘍が４〜６ｍｍの触知可能なサイズに達したとき、１週間の間隔でマウスを３回にわたって１０^８ＣＦＵのＬｍｄｄＡ−１４２で免疫するか、１０^７ＣＦＵのＬｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡ（陽性対照）で免疫するか、または未処置のままとした。無処置マウスは腫瘍を徐々に成長させた（図１５Ａ）。ＬｍｄｄＡ−１４２で免疫化したマウスは、すべて３５日目まで腫瘍がなく、８匹のうち３匹のマウスが腫瘍を徐々に成長させたが、無処置マウスと比較してずっと遅い速度で成長した（図１５Ｂ）。８匹のうち５匹のマウスが７０日目まで腫瘍が無いままであった。予想されたとおり、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＰＳＡワクチン接種したマウスは、無処置の対照よりも腫瘍が少なく、腫瘍の成長は対照よりもさらに遅かった（図１５Ｃ）。したがって、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡコンストラクトは、ＴＰＳＡ細胞株によって確立された腫瘍の６０％を退行させ、且つ、他のマウスでは腫瘍の増殖を遅らせることができた。腫瘍が無いまま治癒したマウスは６８日目にＴＰＳＡ腫瘍に再曝露された。

ＬｍｄｄＡ−１４２によるマウスの免疫化は、増殖を制御でき、また無処置群（図１５Ａ）で無かったのと比較して、６０％を越える実験動物（図１５Ｂ）でＰＳＡを発現するよう改変された、確定されたＴｒａｍｐ−Ｃ１腫瘍の７日目の退行を誘発できる。非常に弱毒化されたベクター（ＬｍｄｄＡ）およびｐＡＤＶ１４２プラスミド（表２）を使用してＬｍｄｄＡ−１４２を構築した。

さらに、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡコンストラクトによって生成されたＰＳＡ特異的ＣＤ８リンパ球の腫瘍浸潤能力を調査した。マウスに腫瘍およびマトリゲルの混合物を皮下移植した後、７日間の間隔でマウスを未感作にするか、または対照（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）リステリアもしくはＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで２回免疫した。２１日目に腫瘍を切除し、それらの腫瘍に浸潤しているＣＤ８^＋ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＰＳＡ四量体^＋とＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋の制御性Ｔ細胞集団についてそれらの腫瘍を分析した。

未感作マウスおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７対照で免疫されたマウスの両方に存在する非常に少数のＰＳＡ特異的ＣＤ８^＋ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＰＳＡ四量体^＋腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）が観察された。ところが、ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡで免疫化したマウスでは、ＰＳＡ特異的なＣＤ８^＋ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＰＳＡ^四量体＋ＴＩＬの割合に１０〜３０倍の増加があった（図７Ａ）。興味深いことに、脾臓内のＣＤ８^＋ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＰＳＡ^四量体＋細胞の母集団は、腫瘍内よりも７．５倍少なかった（図１６Ａ）。

加えて、無処置マウスおよびリステリアで免疫されたマウスの腫瘍内でのＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋／ＦｏｘＰ３^＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の存在が決定された。興味深いことに、リステリアでの免疫化によって、結果として、腫瘍内のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ−ｒｅｇｓの数がかなり減少したが、脾臓内では減少しなかった（図１６Ｂ）。ところが、構築体ＬｍｄｄＡ−ＬＬＯ−ＰＳＡは、無処置およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７免疫化群と比較した時に、腫瘍内でのＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔ−ｒｅｇｓの頻度の減少に強力な影響を及ぼした（図１６Ｂ）。

よって、ＬｍｄｄＡ−１４２ワクチンは、腫瘍部位を浸潤することができるＰＳＡ特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞を誘発できる（図１６Ａ）。興味深いことに、ＬｍｄｄＡ−１４２での免疫化は、腫瘍内での制御性Ｔ細胞数の減少に関連し（図１６Ｂ）、おそらく、効率的な抗腫瘍ＣＴＬ活性について、より好ましい環境が創出される。

実施例１３：Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３は、ＰＳＡ融合にもかかわらず機能的なＬＬＯを分泌する。
Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３は、相同組換えにより染色体中のｈｌｙ遺伝子の下流にインフレームで挿入されたＰＳＡタンパク質をコードする全長型ヒトｋｌｋ３遺伝子を含む。これらのコンストラクトは、温度感受性レプリコンを有し、ｈｌｙ−ｋｌｋ３−ｍｐｌ組換えカセットを保有するｐＫＳＶ７プラスミド（ＳｍｉｔｈａｎｄＹｏｕｎｇｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．１９９２；７４（７−８）ｐ７０５−７１１）を使用する相同組換えにより作製された。その第２の組換え事象後のプラスミドの切除のため、組込みの選択に使用される抗生物質耐性マーカーが失われている。さらに、ＡｃｔＡ遺伝子は、ＬｍｄｄＡ−１４３株内で除去される（図１７Ａ）。ｈｌｙとインフレームのｋｌｋ３の染色体への挿入が、ＰＣＲにより確認され（図１７Ｂ）、両方の構築体で配列決定がなされた（データ非表示）。

これらの染色体コンストラクトの一つの重要な面は、ＬＬＯ−ＰＳＡが生成されてもファゴソームからのリステリアの回避、細胞質侵入、およびＬ．モノサイトゲネスによって生じる効率的な免疫に必要とされるＬＬＯの機能が完全には消滅しないことである。Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３培養上清からの分泌タンパク質のウエスタンブロットにより、ＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質に対応する〜８１ｋＤａ帯域および予想されたＬＬＯのサイズである〜６０ｋＤａ帯域（図１８Ａ）が明らかにされるが、これは染色体内の融合遺伝子にもかかわらず、ＬＬＯがＬ．モノサイトゲネスによってＬＬＯ−ＰＳＡ融合から切断されたか、またはなおも単一のタンパク質から生成されたかのいずれかであることを示す。Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３によるＬＬＯ分泌により、野生型Ｌ．モノサイトゲネス１０４０３Ｓと比較して、５０％の溶血活性が保持された（図１８Ｂ）。これらの結果と一致して、Ｌｍｄｄ−１４３およびＬｍｄｄＡ−１４３のどちらも、マクロファージ様のＪ７７４細胞株内で、細胞内での複製ができた（図１８Ｃ）。

実施例１４：Ｌｍｄｄ−１４３とＬｍｄｄＡ−１４３の両方がＰＳＡ抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘発する。
Ｌｍｄｄ−１４３とＬｍｄｄＡ−１４３の両方がＬＬＯに融合されたＰＳＡを分泌できることを示した後、これらの株がＰＳＡ特異的免疫応答をインビボで誘導できるかという問題を調査した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを未処置のままにするか、またはＬｍｄｄ−１４３、ＬｍｄｄＡ−１４３、もしくはＬｍｄｄＡ−１４２で２回免疫したＰＳＡ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答をＰＳＡ_{６５〜７４}ペプチドでの脾細胞の刺激、およびＩＦＮ−γについての細胞内染色により測定した。図１９に示すとおり、染色体およびプラスミドをベースにしたベクターにより誘発された免疫応答は同様であった。

材料および方法（実施例１５〜２０）
オリゴヌクレオチドはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）によって合成され、ＤＮＡ配列決定はＧｅｎｅｗｉｚＩｎｃ（米国ニュージャージー州サウスプレインフィールド）によって行われた。フローサイトメトリー試薬をＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＤ、カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。細胞培養培地、添加物、および他の全ての試薬は、表示されない限り、Ｓｉｇｍａ（米国ミズーリ州セントルイス）のものである。Ｈｅｒ２／ｎｅｕＨＬＡ−Ａ２ペプチドはＥＺｂｉｏｌａｂｓ（米国インディアナ州ウェストフィールド）によって合成された。完全ＲＰＭＩ１６４０（Ｃ−ＲＰＭＩ）培地は２ｍＭのグルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％のウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｈｅｐｅｓ（２５ｍＭ）を含有した。ポリクローナル抗ＬＬＯ抗体は以前に記載があるものであり、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体はＳｉｇｍａから購入されたものである。

マウスおよび細胞株
全ての動物実験はペンシルバニア大学またはラトガース大学のＩＡＣＵＣによって認可されたプロトコルに従って実施された。ＦＶＢ／ＮマウスはＪａｃｋｓｏｎｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国メーン州バーハーバー）から購入された。ラットＨｅｒ２／ｎｅｕ癌タンパク質を過剰発現するＦＶＢ／ＮＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスはペンシルバニア大学の実験動物コア施設で収容および飼育された。ＮＴ−２腫瘍細胞株は高レベルのラットＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質を発現し、これはこれらのマウスの自然発生的な乳腺腫瘍に由来し、前述されたように培養された。ＤＨＦＲ−Ｇ８（３Ｔ３／ｎｅｕ）細胞はＡＴＣＣから入手され、ＡＴＣＣの推奨に従って培養された。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞株はＪｏｈｎＯｈｌｆｅｓｔ博士（ミネソタ大学、ミネソタ州）からの寛大な供与物であり、完全Ｃ−ＲＰＭＩ培地中で培養された。生物発光作業はペンシルバニア大学（米国ペンシルバニア州フィラデルフィア）の小動物撮像施設（ＳＡＩＦ）による指導の下で実行された。

リステリア構築体および抗原発現
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ−ｐＧＥＭ７Ｚは親切にもペンシルバニア大学のＭａｒｋＧｒｅｅｎｅ博士によって供与され、これはｐＧＥＭ７Ｚプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）にクローニングされた全長のヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ（ｈＨｅｒ２）遺伝子を含んだ。ｐｆｘＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および表４に示されるオリゴを使用するＰＣＲによってｈＨｅｒ−２／ｎｅｕの３つの部分、すなわちＥＣ１、ＥＣ２、およびＩＣ１を増幅するためのテンプレートとしてこのプラスミドを使用した。

表４：ヒトＨｅｒ−２−キメラのクローニング用のプライマー

Ｈｅｒ−２／ｎｅｕキメラ構築体はＳＯＥｉｎｇＰＣＲ法およびテンプレートとしての各々の別個のｈＨｅｒ−２／ｎｅｕ区分による直接融合によって生成された。プライマーが表５に示されている。

表５
異なる部分のヒトＨｅｒ２領域の増幅のためのプライマーの配列

ＣｈＨｅｒ２遺伝子を、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限酵素を使用してｐＡｄｖ１３８から切り出し、ＬｍｄｄシャトルベクターであるｐＡｄｖ１３４中にＬＬＯの短縮型非溶血性断片とインフレームでクローニングした。挿入断片、ＬＬＯ、およびｈｌｙプロモーターの配列をＤＮＡシークエンシング分析によって確認した。エレクトロコンピテントａｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ突然変異体リステリア・モノサイトゲネス株、すなわちＬｍｄｄＡにこのプラスミドを電気穿孔により導入し、ストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍＬ）を含有するブレインハートインフージョン（ＢＨＩ）寒天プレート上で陽性クローンを選択した。幾つかの実験ではｈＨｅｒ２／ｎｅｕ（Ｌｍ−ｈＨｅｒ２）断片を発現する類似のリステリア株を比較目的で使用した。全ての試験研究において、免疫系に対するリステリアの抗原非依存的効果を説明するために無関連のリステリア構成体（Ｌｍ対照）を含めた。Ｌｍ対照はＡＤＸＳ３１−１６４（ＬｍｄｄＡ−ＣｈＨｅｒ２）と同一のリステリアプラットフォームに基づいているが、ＨＰＶ１６−Ｅ７またはＮＹ−ＥＳＯ−１などの異なる抗原を発現した。融合タンパク質のリステリアからの発現と分泌を試験した。各構成体をインビボで２回継代した。

細胞傷害性アッセイ
３〜５匹のＦＶＢ／Ｎマウスからなる群を、１×１０^８コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、Ｌｍ−ｈＨｅｒ２ＩＣＩ、またはＬｍ対照（無関連抗原を発現する）を用いて１週間の間隔で３回免疫するか、または未感作のままとした。ＮＴ−２細胞をインビトロで培養し、トリプシンにより剥離し、マイトマイシンＣ（無血清Ｃ−ＲＰＭＩ培地中に２５０μｇ／ｍＬ）で３７℃において４５分間にわたって処置した。これらの細胞を５回洗浄した後、免疫した動物または未感作動物から採取された脾細胞と１：５の比率（スティミュレーター：レスポンダー）で５日間にわたり３７℃および５％ＣＯ_２で共培養した。以前に記載された方法に従い、標的としてのユーロピウム標識３Ｔ３／ｎｅｕ（ＤＨＦＲ−Ｇ８）細胞を使用して標準的な細胞傷害性アッセイを実施した。分光光度計（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｖｉｃｔｏｒ^２）を５９０ｎｍにて使用して、４時間の培養の後に死滅した標的細胞から放出されたユーロピウムを測定した。比溶解率を（実験群での溶解−自然発生的溶解）／（最大溶解−自然発生的溶解）として定義した。

免疫されたマウスに由来する脾細胞によるインターフェロン−γの分泌
３〜５匹のＦＶＢ／ＮまたはＨＬＡ−Ａ２のトランスジェニックマウスの群を、１×１０^８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４、陰性リステリア対照（無関連抗原を発現する）を用いて１週間の間隔で３回免疫するか、または未感作のままとした。最後の免疫の１週間後、ＦＶＢ／Ｎマウスに由来する脾細胞を単離し、Ｃ−ＲＰＭＩ培地中にマイトマイシンＣで処置されたＮＴ−２細胞が存在する状態で５×１０^６細胞／ウェルの割合で２４ウェルプレートにおいて共培養した。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスに由来する脾細胞は、１μＭのＨＬＡ−Ａ２特異的なペプチド、または大腸菌内で生産され、ニッケルベースのアフィニティークロマトグラフィーシステムによって精製された１μｇ／ｍＬの組換え型Ｈｉｓタグ付きＣｈＨｅｒ２タンパク質が存在する状態で培養された。上清のサンプルを２４時間後または７２時間後に取得し、製造業者の推奨に従ってマウスＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用してインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の存在について試験した。

Ｈｅｒ２トランスジェニック動物での腫瘍研究
６週齢のＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウス（９〜１４匹／群）を５×１０^８ＣＦＵのＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２、ＡＤＸＳ３１−１６４、またはＬｍ対照で６回免疫した。これらのマウスを自然発生的乳腺腫瘍の出現について週に２回観察し、最高５２週間まで電子カリパスを使用してそれらの腫瘍を測定した。平均直径が１ｃｍ^２のサイズに達したとき、エスケープした腫瘍を摘出し、ＲＮＡｌａｔｅｒ中に−２０℃で保存した。これらの腫瘍のエスケープに対するＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質内の突然変異の効果を決定するため、ゲノムＤＮＡ単離キットを使用してゲノムＤＮＡを抽出し、配列決定した。

脾臓および腫瘍内の制御性Ｔ細胞に対するＡＤＸＳ３１−１６４の効果
マウスに１×１０^６細胞のＮＴ−２細胞を皮下（ｓ．ｃ．）移植した。７日目、１４日目、および２１日目にこれらのマウスを１×１０^８ＣＦＵのＡＤＸＳ３１−１６４またはＬｍｄｄＡ対照で免疫するか、または未感作のままにした。２８日目に腫瘍および脾臓を摘出し、ＦＡＣＳ分析によってＣＤ３^＋／ＣＤ４^＋／ＦｏｘＰ３^＋Ｔｒｅｇの存在について検査した。簡潔に述べると、Ｃ−ＲＰＭＩ培地中で２枚のスライドグラスの間で脾臓を均質化することによって脾細胞を単離した。滅菌したカミソリの刃を使用して腫瘍を細かく刻み、ＰＢＳ中にＤＮａｓｅ（１２Ｕ／ｍＬ）およびコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍＬ）を含有するバッファーを用いてそれらを消化した。室温にて撹拌しながら６０分間インキュベーションした後、細胞を激しいピペッティングによって分離した。赤血球をＲＢＣ溶解バッファーによって溶解し、続いて１０％ＦＢＳを含有する完全ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて数回洗浄した。ナイロンメッシュを通す濾過の後、腫瘍細胞および脾細胞をＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ）中に再懸濁し、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗体、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体、抗ＣＤ２５−ＡＰＣ抗体で染色し、続いて透過処理し、そして抗Ｆｏｘｐ３−ＰＥで染色した。４カラーＦＡＣＳキャリバー（ＢＤ）を使用してフローサイトメトリー分析を実施し、ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ）を使用してデータを分析した。

統計分析
生存データについてログランクχ二乗検定を使用し、三回行われたＣＴＬアッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイについてスチューデントのｔ検定を使用した。これらの分析では０．０５未満のｐ値（＊印をつけた）を統計的に有意であると考えた。Ｐｒｉｓｍソフトウェア、Ｖ．４．０ａ（２００６）またはＳＰＳＳソフトウェア、Ｖ．１５．０（２００６）のどちらかを用いて全ての統計分析を行った。別段の記載がない限り、我々は全てのＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック試験研究のために群あたり８〜１４匹のマウスを使用し、全ての野生型ＦＶＢ／Ｎ研究のために群あたり少なくとも８匹のマウスを使用した。Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスモデルの長期腫瘍試験研究を除き、全ての研究を少なくとも１回は繰り返した。

実施例１５：Ｈｅｒ−２断片に融合されたＬＬＯ断片を分泌するＬ．モノサイトゲネス株の生成：ＡＤＸＳ３１−１６４の構築
キメラＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子（ＣｈＨｅｒ２）の構築については以下の通りであった。簡潔に述べると、ＣｈＨｅｒ２遺伝子は、ＳＯＥｉｎｇＰＣＲ法によるＨｅｒ２／ｎｅｕタンパク質の２つの細胞外断片（ａａ４０〜１７０およびａａ３５９〜４３３）と１つの細胞内断片（ａａ６７８〜８０８）の直接融合によって作製された。そのキメラタンパク質はそのタンパク質の既知のヒトＭＨＣクラスＩエピトープの大半を有する。ＣｈＨｅｒ２遺伝子が、プラスミドのｐＡｄｖ１３８（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２を構築するために使用された）から切り離され、ＬｍｄｄＡシャトルプラスミドへとクローニングされ、プラスミドｐＡｄｖ１６４が得られた（図２０Ａ）。これらの２つのプラスミド骨格の間には２つの大きい違いがある。１）ｐＡｄｖ１３８が組換え型細菌のインビトロ選別のためにクロラムフェニコール耐性マーカー（ｃａｔ）を使用するのに対し、ｐＡｄｖ１６４は枯草菌由来のＤ−アラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）を保持し、その遺伝子がｄａｌ−ｄａｔ遺伝子を持たないＬｍｄｄＡ株でのインビトロ選別とインビボプラスミド保持のために代謝経路の相補を利用する。このワクチンプラットフォームは、ＦＤＡによる改変リステリアワクチン株の抗生物質抵抗性についての憂慮に対処するために設計および開発された。２）ｐＡｄｖ１３８とは異なり、ｐＡｄｖ１６４は、プラスミド中にｐｒｆＡ遺伝子のコピーを有しておらず（以下の配列及び図２０Ａを参照のこと）、そのため、Ｌｍｄｄ株のｉｎｖｉｖｏ補完に必要とされない。ＬｍｄｄＡワクチン株も、ａｃｔＡ遺伝子（リステリア細胞内移動、および細胞から細胞への拡散を担当する）を欠いているので、このバックボーンに由来する組み換え型ワクチン株は、その親株であるＬｍｄｄに由来するものより病毒性が１００倍少ない。ＬｍｄｄＡベースのワクチンは、免疫化マウスの脾臓からのＬｍｄｄベースのワクチンよりもずっと速く（４８時間未満の間に）除去される。この株からの融合タンパク質ｔＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の発現および分泌は、ｉｎｖｉｔｒｏで８時間増殖した後にＴＣＡ沈殿された細胞培養上清の中のＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２（図２０Ｂ）と同等であり、ウエスタンブロット解析を使用し、約１０４ＫＤのバンドとして抗ＬＬＯ抗体により検出された。陰性対照としてｔＬＬＯのみを発現するリステリアバックボーン株を使用した。

ｐＡｄｖ１６４配列（７０７５塩基対）（図２０Ａおよび２０Ｂを参照）：
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実施例１６：ＡＤＸＳ３１−１６４はＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２と同じく免疫原性である
抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的な細胞毒性Ｔ細胞を発生するうえでのＡＤＸＳ３１−１６４の免疫原性の特性が、標準的なＣＴＬアッセイでＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２ワクチンのものと比較された。両方のワクチンは、３Ｔ３／ｎｅｕ標的細胞によって発現されるＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原に対して強いが同等の細胞毒性Ｔ細胞応答を引き出す。したがって、ＬＬＯに融合されたＨｅｒ２細胞内断片のみを発現するリステリアで免疫されたマウスは、より多くのＭＨＣクラスＩエピトープを含有するキメラよりも低い溶解活性を示した。未感作動物、または無関係なリステリアワクチンが注射されたマウスではＣＴＬ活性は検出されなかった（図２１Ａ）。ＡＤＸＳ３１−１６４は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウス由来脾細胞によるＩＦＮ−γの分泌を刺激することもできた（図２１Ｂ）。高レベルのＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原を発現する、マイトマイシンＣで処置されたＮＴ−２細胞と共培養されたこれらの細胞の培養上清中で、これが検出された（図２１Ｃ）。

ＡＤＸＳ３１−１６４での免疫後のヒトＭＨＣクラスＩエピトープの適切なプロセッシングと提示をＨＬＡ−Ａ２マウスで検査した。免疫されたＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入体に由来する脾細胞を、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ分子の細胞外ドメイン（配列番号５９のＨＬＹＱＧＣＱＶＶまたは配列番号６０のＫＩＦＧＳＬＡＦＬ）または細胞内ドメイン（配列番号６１のＲＬＬＱＥＴＥＬＶ）に位置する、マップ化ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープに対応するペプチドと共に７２時間にわたって共培養した（図２１Ｃ）。組換え型ＣｈＨｅｒ２タンパク質を陽性対照として使用し、無関連のペプチドまたはペプチド無しを陰性対照として使用した。この実験のデータは、標的とされた抗原の異なるドメインに位置するヒトエピトープに対する抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ特異的免疫応答がＡＤＸＳ３１−１６４により誘発され得ることを示している。

実施例１７：ＡＤＸＳ３１−１６４は、自然発生的な乳腺腫瘍の発症の防止には、ＬＭ−ＬＬＯ−ＣｈＨＥＲ２より有効である
２０〜２５週齢でゆっくりと増殖する自然発生的乳腺腫瘍を発生するＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物においてＡＤＸＳ３１−１６４の抗腫瘍効果をＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２の抗腫瘍効果と比較した。無関連リステリア対照ワクチンを用いて免疫化されたすべての動物は、２１〜２５週の間に乳房の腫瘍を発生し、３３週の前に犠牲にされた。対照的に、リステリア−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ組み換え型ワクチンは、乳腺腫瘍の形成の著しい遅延を生じた。４５週目では、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２で免疫されたマウスの２５％と対照的に、ＡＤＸＳ３１−１６４ワクチン接種マウスの５０％超（９匹のうち５匹）に未だに腫瘍が無かった。５２週には、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いて免疫化した８匹のうち２匹のマウスは、まだ腫瘍が無いままであったが、一方で他の実験群のマウスはすべて、すでに腫瘍を発症していた（図２２）。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４は、より弱毒化されているにもかかわらず、Ｈｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニック動物の自然発生的乳腺腫瘍の発症の防止に関してＬｍ−ＬＬＯ−ＣｈＨｅｒ２よりも有効であることを示している。

実施例１８：ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化の際のＨＥＲ２／ＮＥＵ遺伝子での突然変異
Ｈｅｒ２／ｎｅｕのＭＨＣクラスＩエピトープ内の突然変異は、小さい分量のワクチンまたはトラスツズマブ（ハーセプチン）（Ｈｅｒ２／ｎｅｕの細胞外ドメインでエピトープを標的化するモノクローナル抗体）を用いた免疫化の際にエスケープした腫瘍を担当すると考えられてきた。これを評価するために、トランスジェニック動物内のエスケープした腫瘍からゲノム材料が抽出され、キメラワクチンまたは対照ワクチンを用いて免疫化した腫瘍内のｎｅｕ遺伝子の対応する断片を配列決定した。どのワクチン接種されたた腫瘍試料のＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子内にも突然変異が観察されなかった。これは代替的なエスケープ機構を示唆している（データを示さず）。

実施例１９：ＡＤＸＳ３１−１６４は腫瘍内制御性Ｔ細胞の著しい減少を引き起こす
脾臓および腫瘍内での調節性Ｔ細胞の頻度に対するＡＤＸＳ３１−１６４の効果を解明するために、マウスにＮＴ−２腫瘍細胞を移植した。３回の免疫の後、脾細胞および腫瘍内リンパ球を単離し、Ｔｒｅｇを染色し、これらがＣＤ３^＋／ＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋／ＦｏｘＰ３^＋細胞として明らかにされたが、別々に分析したときにＦｏｘＰ３マーカーまたはＣＤ２５マーカーのどちらかを用いて同等の結果が得られた。この結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた免疫化は、無関係なリステリアワクチンまたは未感作動物と比較して、脾臓内のＴｒｅｇの頻度に対しては効果が無かったことを示した（図２３）。対照的に、リステリアワクチンを用いた免疫化は、腫瘍内のＴｒｅｇの存在に少なからぬ影響を与えた（図２４Ａ）。処理されていない腫瘍ではすべてのＣＤ３^＋Ｔ細胞の平均で１９．０％がＴｒｅｇであったが、この頻度は無関連ワクチンについては４．２％に減少し、ＡＤＸＳ３１−１６４ついては３．４％と、腫瘍内のＴｒｅｇの頻度が５分の１に減少した（図２４Ｂ）。いずれかのＬｍｄｄＡワクチンで処置したマウスでの腫瘍内のＴｒｅｇの頻度の減少は、腫瘍のサイズの差異には貢献しなかった。代表的実験では、ＡＤＸＳ３１−１６４を用いて免疫化したマウスからの腫瘍（平均直径（ｍｍ）±ＳＤ：６．７１±０．４３、ｎ＝５）は、未処置マウス（８．６９±０．９８、ｎ＝５、ｐ＜０．０１）、または無関連ワクチン（８．４１±１．４７、ｎ＝５、ｐ＝０．０４）で処置されたマウスからの腫瘍より著しくより小さかったが、一方で後者のこれら２つの群の比較は腫瘍サイズでは統計的な有意さを示さなかった（ｐ＝０．７３）。ＬｍｄｄＡワクチンで処置した腫瘍内のＴｒｅｇのより低い頻度は、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の増加をもたらし、ＬｍｄｄＡワクチンを用いた免疫化後により好ましい腫瘍の微小環境を得ることができることを示唆する。しかしながら、標的抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＡＤＸＳ３１−１６４）を発現するワクチンのみが腫瘍増殖を減少することができ、Ｔｒｅｇの減少は腫瘍内で抗原特異的な応答が存在するときのみ効果を有することを示す。

実施例２０：ＡＤＸＳ３１−１６４を用いた末梢の免疫化は転移性乳癌細胞株の脳内での増殖を遅延することができる
ＡＤＸＳ３１−１６４または無関連Ｌｍ対照ワクチンを用いてマウスに腹腔内で免疫化し、次いでルシフェラーゼおよび低いレベルのＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するＥＭＴ６−Ｌｕｃ腫瘍細胞５０００個を頭蓋内に移植した（図２５Ａ）。麻酔されたマウスの生体外撮像によって接種後の様々な時点で腫瘍をモニターした。腫瘍接種後８日目に、すべての対照動物で腫瘍が検出されたが、ＡＤＸＳ３１−１６４群のマウスでは検出可能な腫瘍はまったく現れなかった（図２５Ａおよび図２５Ｂ）。腫瘍接種後１１日目には陰性対照群の全てのマウスが既に腫瘍のために死んでいたが、ＡＤＸＳ３１−１６４群の全てのマウスがまだ生存しており、腫瘍増殖の小さい兆候を示すのみであったので、ＡＤＸＳ３１−１６４はこれらの腫瘍の発症を明らかに遅延させることができた。これらの結果は、ＡＤＸＳ３１−１６４の末梢投与を用いて得られた免疫応答が中枢神経系に到達することができる可能性があり、かつＬｍｄｄＡベースのワクチンがＣＮＳ腫瘍の治療のための使用の可能性を有する場合があることを強く示唆する。

実施例２１：ペプチド「ミニ遺伝子」発現系
材料および方法
この発現系は、カルボキシ末端において独特のペプチド部分を含有する組換えタンパク質群のクローニングを促進するように設計されている。これは、テンプレートとしてＳＳ−Ｕｂ−ペプチドコンストラクトのうちの１つをコードする配列を利用する単純なＰＣＲ反応によって達成される。Ｕｂ配列のカルボキシ末端領域にまで延びるプライマーを使用し、且つ、そのプライマーの３’端に所望のペプチド配列のためのコドンを導入することにより、一回のＰＣＲ反応で新しいＳＳ−Ｕｂ−ペプチド配列を生成することができる。細菌プロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列の最初の数ヌクレオチドをコードする５’プライマーは、全てのコンストラクトに対して同一である。この戦略を使用して作製されたコンストラクトを図２６Ａ〜２６Ｃに概略的に示す。この実施例では２つのコンストラクトを説明する。１つのコンストラクトはマウスＭＨＣクラスＩ上に提示されるモデルペプチド抗原を含有し、第２のコンストラクトは、ヒト膠芽腫（ＧＢＭ）ＴＡＡに由来するものなどの治療的に適切なペプチドが置換されることになる場所を示している。明確性を目的として、図２６Ａ〜Ｃで図示されているコンストラクトをＡｃｔＡ_{１〜１００}分泌シグナルを含有するものとして指定した。しかしながら、同等の効果によってＬＬＯベースの分泌シグナルが置き換わってもよい。

提案されている系の利点のうちの１つは、単一のリステリアベクター構築体を使用して細胞にマルチプルペプチドを負荷することができることになる点である。マルチプルペプチドは、上述の単一のペプチド発現系の修正を使用して組み換え型弱毒化リステリア（例えば、ＰｒｆＡ突然変異リステリアまたはｄａｌ／ｄａｔ／ＡｃｔＡ突然変異リステリア）の中へと導入されることになる。１つの挿入断片の中にコードされる連続的なＳＳ−Ｕｂ−ペプチド配列に由来する複数の別個のペプチドをコードするキメラタンパク質。シャイン・ダルガノリボソーム結合部位は、各ＳＳ−Ｕｂ−ペプチドコード配列の前に導入され、それによって各ペプチドコンストラクトの個別の翻訳が可能になる。図２６Ｃは、組み換え型リステリアの１つの株から４つの別個のペプチド抗原を発現するように設計されたコンストラクトの概略図を示す。これは厳密には一般的な発現戦略を表したものであるので、公知のマウスまたはヒトの腫瘍関連抗原または感染症抗原に由来する４つの独特のＭＨＣクラスＩ結合ペプチドが含まれている。

材料および方法（実施例２２〜２４）
実施例７にｐＡｄｖ１４２プラスミドおよびＬｍｄｄＡ１４２株のことが記載されている。その他の詳細を以下に提供する。

ｐＡｄｖ１４２プラスミドおよびＬｍｄｄＡ１４２株の構築
このプラスミドはＶｅｒｃｈらによって以前に構築された次世代の抗生物質を含まないプラスミドであるｐＴＶ３である。Ｌｍ−ｄｄＡは染色体中に１コピーのｐｒｆＡ遺伝子を含むので、病原性遺伝子転写活性化因子ｐｒｆＡの不必要なコピーをｐＴＶ３プラスミドから欠失した。したがって、そのｄａｌ含有プラスミド中にｐｒｆＡ遺伝子が存在することは必須ではなかった。さらに、ＮｈｅＩ／ＰａｃＩ制限部位でのｐ６０−リステリアｄａｌのカセットをｐ６０−枯草菌ｄａｌ（ｄａｌ_Ｂｓ）により置換してプラスミドｐＡｄｖ１３４を得た。さらに、ｐＡｄｖ１３４をＸｈｏＩ／ＸｍａＩで制限処理してヒトＰＳＡであるｋｌｋ３をクローニングしてプラスミドｐＡｄｖ１４２を得た。その新しいプラスミドであるｐＡｄｖ１４２（図１１Ｃ）はｄａｌ_Ｂｓを含んでおり、その発現はＬｍｐ６０プロモーターの制御下にあった。そのシャトルプラスミドｐＡｄｖ１４２は外因性Ｄ−アラニンの非存在下で大腸菌ａｌａｄｒｘＭＢ２１５９とＬｍｄｄの両方の増殖を相補することができた。プラスミドｐＡｄｖ１４２内の抗原発現カセットは、ｈｌｙプロモーターおよびｔＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質からなる（図２７）。

プラスミドｐＡｄｖ１４２でリステリアのバックグラウンド株であるＬｍｄｄＡ株を形質転換してＬｍｄｄＡ１４２またはＡＤＸＳ３１−１４２を得た。ＡＤＸＳ３１−１４２株によるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の発現と分泌を、抗ＬＬＯ抗体および抗ＰＳＡ抗体を使用するウエスタン解析により確認し、図１１Ｄに示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスのインビボでの２継代後にＡＤＸＳ３１−１４２株によるＬＬＯ−ＰＳＡ融合タンパク質の安定した発現および分泌が存在した。

ＬｍｄｄＡ２１１株、ＬｍｄｄＡ２２３株、およびＬｍｄｄＡ２２４株の構築
ＡｃｔＡタンパク質の異なる短縮断片を含む３種類の異なるプラスミドｐＡｄｖ２１１、ｐＡｄｖ２２３、およびｐＡｄｖ２２４を作製するために異なるＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ領域をプラスミドｐＡｄｖ１４２中にクローニングした。

ＬＬＯシグナル配列（ＬＬＯｓｓ）−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２（ｐＡｄｖ２１１）／ＬｍｄｄＡ２１１
２５塩基の重複を用いるＳＯＥｉｎｇＰＣＲ法を用いて最初に２つの断片であるＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−ＸｂａＩ（８１７ｂｐのサイズ）とＬＬＯｓｓ−ＸｂａＩ−ＡｃｔＡ−ＰＥＳＴ２（６０２ｂｐのサイズ）を増幅し、次に一つに融合した。このＰＣＲ産物はこの時点で７６２ｂｐのサイズの断片であるＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２−ＸｈｏＩを含んでいる。その新しいＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２−ＸｈｏＩＰＣＲ産物およびｐＡｄｖ１４２（ＬｍｄｄＡ−ＰＳＡ）プラスミドをＰｓｉＩ／ＸｈｏＩ制限酵素で消化し、そして精製した。ライゲーションを行い、ＭＢ２１５９エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、そしてＬＢ寒天プレート上に播種した。ＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２／ｐＡｄｖ１４２（ＰＳＡ）クローンを挿入断片特異的ＰＣＲ反応により選択およびスクリーニングし、ＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２／ｐＡｄｖ１４２（ＰＳＡ）クローンの９番、１０番が陽性であり、そのプラスミドをミニプレップ精製した。ＰＣＲスクリーニングによるそれらのクローンのスクリーニングの後、陽性クローンの挿入断片を配列決定した。ｐＡｄｖ２１１．１０と呼ばれるプラスミドＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２／ｐＡｄｖ１４２（ＰＳＡ）でリステリアＬｍｄｄＡ突然変異体エレクトロコンピテント細胞を形質転換し、ＢＨＩ／ストレプトマイシン寒天プレート上に播種した。生じたＬｍｄｄＡ２１１株をコロニーＰＣＲによりスクリーニングした。幾つかのリステリアコロニーを内在性ＬＬＯタンパク質とＡｃｔＡＰＥＳＴ２−ＰＳＡ（ＬＡ２２９−ＰＳＡ）タンパク質の発現と分泌について選択およびスクリーニングした。マウスのインビボでの２継代後にＡｃｔＡＰＥＳＴ２−ＰＳＡ融合タンパク質の安定した発現が存在した。

ＬＬＯｓｓ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ３およびＰＥＳＴ４：
ＡｃｔＡＰＥＳＴ３断片とＡｃｔＡＰＥＳＴ４断片をＰＣＲ法により作製した。ＬＬＯｓｓ−ＸｂａＩ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ３−ＸｈｏＩ断片（８３９ｂｐのサイズ）とＬＬＯｓｓ−ＸｂａＩ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ４−ＸｈｏＩ断片（１１４６ｂｐのサイズ）を含むＰＣＲ産物をｐＡｄｖ１４２中にクローニングした。生じたプラスミドｐＡｄｖ２２３（ＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ３−ＸｈｏＩ／ｐＡｄｖ１４２）クローンおよびｐＡｄｖ２２４（ＰｓｉＩ−ＬＬＯｓｓ−Ｘｂａｌ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ４／ｐＡｄｖ１４２）クローンを挿入断片特異的ＰＣＲ反応により選択およびスクリーニングした。それらのｐＡｄｖ２２３およびｐＡｄｖ２２４プラスミドでＬｍｄｄＡバックボーンを形質転換してそれぞれＬｍｄｄＡ２２３およびＬｍｄｄＡ２２４が生じた。幾つかのリステリアコロニーを内在性ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡＰＥＳＴ３−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ２２３）タンパク質、またはＡｃｔＡＰＥＳＴ４−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ２２４）タンパク質の発現と分泌について選択およびスクリーニングした。マウスのインビボでの２継代後に融合タンパク質ＡｃｔＡＰＥＳＴ３−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ２２３）またはＡｃｔＡＰＥＳＴ４−ＰＳＡ（ＬｍｄｄＡ２２４）の安定した発現と分泌が存在した。

実験プラン１
ＴＰＳＡ２３（ＰＳＡ発現性腫瘍モデル）を使用するＡｃｔＡ−ＰＥＳＴ−ＰＳＡ（ＰＥＳＴ３配列、ＰＥＳＴ２配列、およびＰＥＳＴ４配列）およびｔＬＬＯ−ＰＳＡの治療効力を評価および比較した。無処置マウスを対照群として使用した。インターフェロンγの細胞内サイトカイン染色およびＰＳＡ四量体染色も用いて免疫応答を並行して評価した。

腫瘍退行試験。８匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（７週齢のオス）の１０群に１×１０^６個のＴＰＳＡ２３細胞を０日目に皮下移植した。６日目にそれらのマウスは免疫を受け、それに続いて１週間離れている２回の追加用量を受けた。腫瘍が平均直径で１．２ｃｍのサイズに到達するまで毎週腫瘍増殖をモニターした。

免疫原性試験。
２群のＣ５７ＢＬ／６マウス（７週齢のオス）を、以下の表に列記されるワクチンを用いて、１週間の間隔で３回にわたり免疫した。最後の追加免疫注射から６日後、マウスを殺処理し、脾臓を採取し、四量体染色および細胞内サイトカイン染色によるＩＦＮ−γ分泌に関して免疫応答を検査した。

実験プラン２
この実験は実験プラン１の繰返しであるが、未感作群、ｔＬＬＯ群、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２−ＰＳＡ群、およびｔＬＬＯ−ＰＳＡ群だけが含まれた。実験プラン１と同様に、ＴＰＳＡ２３（ＰＳＡ発現性腫瘍モデル）を使用して治療効力を評価した。群当たり５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに１×１０^６細胞のＴＰＳＡ２３細胞を０日目に皮下移植した。６日目にそれらのマウスは免疫（１×１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）を受け、それに続いて１週間後に追加免疫を受けた。最後の処置から６日目に脾臓と腫瘍を採取した。脾臓と腫瘍の両方においてＰＳＡ五量体染色を用いて免疫応答をモニターした。

材料および方法：
ＴＰＳＡ２３細胞を完全培地中で培養する。マウスに腫瘍細胞を移植する２日前にＴＰＳＡ２３細胞を完全培地中に継代培養した。実験当日（０日目）に細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで二回洗浄した。細胞を計数し、注射用にマウス当たり２００ｕｌのＰＢＳ中に１×１０^６細胞の濃度で再懸濁した。各マウスの脇腹に腫瘍細胞を皮下注射した。

ＴＰＳＡ２３細胞用の完全培地
４３０ｍｌのグルコース含有ＤＭＥＭ、４５ｍｌのウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２５ｍｌのヌー・セラムＩＶ、５ｍｌの１００×Ｌ−グルタミン、５ｍｌの１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍｌの１０，０００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを混合することによりＴＰＳＡ２３細胞用の完全培地を調製した。細胞を分割する間に０．００５ｍｇ／ｍｌのウシインスリンおよび１０ｎＭのデヒドロイソアンドロステロンをフラスコに添加した。

脾細胞用の完全培地（ｃ−ＲＰＭＩ）
４５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０、５０ｍｌのウシ胎児血清（ＦＣＳ）、５ｍｌの１ＭＨＥＰＥＳ、５ｍｌの１００×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、５ｍｌの１００×Ｌ−グルタミン、５ｍｌの１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍｌの１０，０００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンおよび１２９ｕｌの１４．６Ｍの２−メルカプトエタノールを混合することにより完全培地を調製した。

単離された脾細胞の調製
生物安全フード内で作業を行った。滅菌したピンセットとハサミを使用して実験マウス群と対照マウス群から脾臓を採取した。１０ｍｌのＰＢＳを含む１５ｍｌのチューブに入れてそれらの脾臓を実験室に運んだ。各マウスの脾臓を別々に処理した。脾臓を無菌ペトリ皿に取り、３ｍＬの注射筒のピストン棒の後端を使用してすりつぶした。１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０を含む１５ｍｌのチューブに脾臓細胞を移した。４℃で５分間にわたる１，０００ＲＰＭでの遠心分離により細胞を沈殿させた。１０％の漂白剤中に上清を捨てた。タッピングで細胞ペレットを穏やかに壊した。脾臓当たり２ｍｌのＲＢＣ溶解緩衝液をその細胞ペレットに添加することによりＲＢＣを溶解した。ＲＢＣは２分間で溶解された。すぐに１０ｍｌのｃ−ＲＰＭＩ培地をその細胞懸濁液に添加してＲＢＣ溶解緩衝液を不活化した。４℃で５分間にわたる１，０００ＲＰＭでの遠心分離により細胞を沈殿させた。上清を捨て、細胞ペレットを１０ｍｌのｃ−ＲＰＭＩ中に再懸濁し、セルストレーナーに通した。血球計算盤を使用して細胞を計数し、１０μｌの細胞懸濁液を９０μｌのトリパンブルー染色液と混合して生存度をチェックした。約２×１０^６細胞を五量体染色に使用した。（注記：各脾臓は１〜２×１０^８細胞を産するはずである）。

ミルテニー・マウス腫瘍解離キットを使用する腫瘍からの単細胞懸濁液の調製
２．３５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０、１００μＬの酵素Ｄ、５０μＬの酵素Ｒ、および１２．５μＬの酵素ＡをｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳＣチューブに加えることにより酵素ミックスを調製した。腫瘍（０．０４〜１ｇ）を２〜４ｍｍの小片に切断し、酵素ミックスを含むｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳＣチューブに移した。そのチューブの上端を下にしてｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳディソシエーターのスリーブ上に取り付け、プログラムｍ＿ｉｍｐＴｕｍｏｒ＿０２を実行した。プログラムの終了後、ＣチューブをｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳディソシエーターから取り外した。ＭＡＣＳｍｉｘチューブローテーターを使用して連続的に回転させながら試料を３７℃で４０分間にわたってインキュベートした。インキュベーションの完了後に再びＣチューブの上端を下にしてｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳディソシエーターのスリーブに取り付け、プログラムｍ＿ｉｍｐＴｕｍｏｒ＿０３を２回実行した。１５ｍＬのチューブ上に置かれた７０μｍフィルターにその細胞懸濁液を通した。そのフィルターも１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０で洗浄した。細胞を３００×ｇで７分間にわたって遠心分離した。上清を捨て、細胞を１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁した。この時点でそれらの細胞を五量体染色のために分割することができる。

脾細胞の五量体染色
ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ社の市販のＰＳＡ−Ｈ−２Ｄ^ｂ五量体を使用して製造業者が推奨するプロトコルを用いてＰＳＡ特異的Ｔ細胞を検出した。ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ３、および五量体について脾細胞を染色した。一方でＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５、および五量体について腫瘍細胞を染色した。ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ細胞をゲーティングで絞り込んでＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＰＳＡ五量体^＋細胞の頻度を決定した。Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを使用してＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ上で染色細胞を取得および分析した。

五量体染色に必要な材料
脾細胞（上記の調製物）、Ｐｒｏ５（登録商標）ＰＥ結合組換えＭＨＣＰＳＡ五量体（注記：蓋をきつく締め、暗所に４℃で一貫して五量体ストックが保存されることを確実にされたい）、ＰｅｒＣＰＣｙ５．５結合抗ＣＤ３抗体、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ８抗体およびＡＰＣ結合抗ＣＤ６２Ｌ抗体、洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡ）および固定溶液（ＰＢＳ中の１％熱不活化ウシ胎児血清（ＨＩ−ＦＣＢＳ）、２．５％ホルムアルデヒド）

標準的染色プロトコル
Ｐｒｏ５（登録商標）ＰＳＡ五量体を冷却済みマイクロ遠心分離機中で５〜１０分間にわたって１４，０００×ｇで遠心分離してその溶液中に存在するあらゆるタンパク質凝集物を除去した。これらの凝集物は、検査容量中に含まれていると非特異的染色の原因となる場合がある。染色条件当たり２×１０^６脾細胞を割り当て、チューブ当たり１ｍｌの洗浄緩衝液を加えた。細胞を４℃の冷却済み遠心分離機中で５分間にわたって５００×ｇで遠心分離した。細胞ペレットを残留量（約５０μｌ）中に再懸濁した。別段の表示がある場合を除き、その後の全ての工程について全てのチューブを氷上で冷やした。１０μＬの標識済み五量体を細胞に添加し、ピペット操作により混合した。それらの細胞を光から遮断して室温（２２℃）で１０分間にわたってインキュベートした。細胞をチューブ当たり２ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄し、残留液（約５０μｌ）中に再懸濁した。最適量の抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、および抗ＣＤ６２Ｌ抗体（１：１００希釈）を添加し、ピペット操作により混合した。単染色対照試料もこの時点で作製した。試料を光から遮断して２０分間にわたって氷上に放置した。細胞をチューブ当たり２ｍｌの洗浄緩衝液で二回洗浄した。細胞ペレットを残留量（約５０μｌ）中に再懸濁した。２００μＬの固定溶液を各チューブに添加し、ボルテックス混合した。データ取得の準備ができるまでそれらのチューブを冷蔵庫内に暗くして保存した。（注記：細胞の形態が固定後に変化するので、データ取得に進む前に３時間にわたって試料を放置することが得策である。試料は最大で２日間にわたって保存可能である）。

細胞内サイトカイン染色（ＩＦＮ−γ）プロトコル：
２×１０^７細胞／ｍｌ脾細胞をＦＡＣＳチューブ中に取り、１００μＬのブレフェルジンＡ（ＢＤＧｏｌｇｉＰｌｕｇ）をそのチューブに添加した。刺激のために２μＭのペプチドをそのチューブに添加し、細胞を室温で１０〜１５分間にわたってインキュベートした。陽性対照試料についてはＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）（２×）とイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）（２×）を対応するチューブに添加した。各処理に由来する１００μＬの培地をＵ字底９６ウェルプレートの対応するウェルに添加した。１００μＬの細胞を対応するウェルに添加した（培地＋細胞で２００μｌの終体積）。そのプレートを２分間にわたって６００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃、５％ＣＯ_２で５時間にわたってインキュベートした。そのプレートの内容物をＦＡＣＳチューブに移した。１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液を各チューブに添加し、５分間にわたって１２００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨てた。２００μＬの２．４Ｇ２上清および１０μＬのウサギ血清をそれらの細胞に添加し、室温で１０分間にわたってインキュベートした。それらの細胞を１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。それらの細胞を１２００ｒｐｍで５分間にわたる遠心分離により収集した。フルオロクローム結合モノクローナル抗体（ＣＤ８ＦＩＴＣ、ＣＤ３ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ６２ＬＡＰＣ）を含む５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に細胞を懸濁し、暗所で３０分間にわたって４℃でインキュベートした。細胞を１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、２００μＬの４％ホルマリン溶液中に再懸濁し、２０分間にわたって４℃でインキュベートした。それらの細胞を１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄し、ＢＤＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ（０．２５ｍｌ／チューブ）中に１５分間にわたって再懸濁した。細胞を遠心分離により収集し、目的のサイトカインに対するフルオロクローム結合モノクローナル抗体（ＩＦＮｇ−ＰＥ）を含む５０μＬのＢＤＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液中に再懸濁した。それらの細胞を暗所で３０分間にわたって４℃でインキュベートした。ＢＤＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ（チューブ当たり１ｍｌ）を使用して細胞を二回洗浄し、分析前に２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。

結果
実施例２２：組換え型リステリア構成体を用いるワクチン接種により腫瘍退行が生じる
１週目までに全ての群が２〜３ｍｍの平均サイズを有する腫瘍を発生させたことがデータにより示された。３週目（２０日目）にＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２（「ＬＡ２２９」としても知られる）−ＰＳＡ、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ３−ＰＳＡおよびＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ３−ＰＳＡ、およびＰＳＡに融合されたｔＬＬＯを発現するＬｍｄｄＡ−１４２（ＡＤＸＳ３１−１４２）で免疫されたマウスが腫瘍退行および腫瘍増殖の遅延を示した。６週目までに未感作群の全てのマウスとＡｃｔＡＰＥＳＴ４−ＰＳＡ処置群の大半が大きな腫瘍を有し、安楽死させねばならなかった（図２８Ａ）。ところが、ＬｍｄｄＡ−１４２マウス群、ＡｃｔＡ−ＰＥＳＴ２マウス群、およびＡｃｔＡ−ＰＥＳＴ３マウス群は、より良好な腫瘍退行と生存率を示した（図２８Ａおよび図２８Ｂ）。

実施例２３：組換え型リステリアを用いるワクチン接種により高レベルの抗原特異的Ｔ細胞が生じる
ＬｍｄｄＡ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２−ＰＳＡワクチンにより、ＬｍｄｄＡ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ（３または４）−ＰＳＡまたはＬｍｄｄＡ−１４２と比較して高レベルのＰＳＡ特異的Ｔ細胞応答が生じた（図２９Ａ）。ＰＳＡ特異的ワクチンにおけるＰＳＡ四量体特異的Ｔ細胞の規模は、未感作マウスよりも３０倍大きかった。同様に、ＰＳＡ特異的抗原での刺激に応答した高レベルのＩＦＮ−γ分泌が、ＬｍｄｄＡ−ＡｃｔＡＰＥＳＴ２−ＰＳＡワクチンについて観察された（図２９Ｂ）。

実施例２４：ＡＣＴＡ／ＰＥＳＴ２（ＬＡ２２９）を用いるワクチン接種により脾臓に多数の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が生じる
ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２融合ＰＳＡを発現するＬｍは、ｔＬＬＯ融合ＰＳＡを発現するＬｍ、またはｔＬＬＯ処置群と比較して、より多数のＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を脾臓中に生成することができた。腫瘍に浸潤するＰＳＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、Ｌｍ−ｔＬＬＯ−ＰＳＡ免疫マウスとＬｍ−ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２−ＰＳＡ免疫マウスの両方について同様であった（図３０Ｂおよび３０Ｃ）。また、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２−ＰＳＡを発現するＬｍの腫瘍退行能力は、ｔＬＬＯ−ＰＳＡを発現するＬｍｄｄＡ−１４２について見られるものと同様であった（図３０Ａ）。

実施例２５：ＬＬＯコレステロール結合ドメインの部位特異的突然変異形成
ＣＢＤ内に不活性化点突然変異を導入するため、以下の戦略を使用して部位特異的突然変異形成をＬＬＯに対して実施した。結果として得られるタンパク質は、「ｍｕｔＬＬＯ」と称される。

ＬＬＯのｐＥＴ２９ｂへのサブクローニング
野生型ＬＬＯのアミノ酸配列は、
（配列番号８０）である。シグナルペプチドおよびコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）は下線付きであり、ＣＢＤ内の３つの重要な残基（Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２）は太字の斜字体である。

６×Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号８２））をＬＬＯのＣ末端領域に付加した。Ｈｉｓタグ付きＬＬＯのアミノ酸配列は、
（配列番号６２）である。

Ｈｉｓタグ付きＬＬＯタンパク質をコードする遺伝子を、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで消化し、そのＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩをＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間で発現ベクターｐＥＴ２９ｂにサブクローニングした。ＬＬＯタンパク質をコードする遺伝子の配列は、
（配列番号６３）である。下線付き配列は、配列の最初から順に、ＮｄｅＩ部位、ＮｈｅＩ部位、ＣＢＧコード領域、６×Ｈｉｓタグ、およびＢａｍＨＩ部位である。次の工程において突然変異形成されるＣＢＤ残基は、太字の斜字体である。

スプライシング・バイ・オーバーラップエクステンション（ＳＯＥ）ＰＣＲ
工程１：第１と第２のＰＣＲ反応をｐＥＴ２９ｂ−ＬＬＯテンプレートに対して実施した。第１プライマーと第２プライマーを利用する第１ＰＣＲ反応はＮｈｅＩ部位とＣＢＤとの間の断片を増幅し、ＣＢＤへの突然変異の導入を含んだ。プライマー＃３および＃４を利用するＰＣＲ反応＃２は、ＣＢＤとＢａｍＨＩ部位の間の断片を増幅し、ＣＢＤへ同じ突然変異を導入した（図３１Ａ）。

ＰＣＲ反応第１サイクル：Ａ）９４℃で２分３０秒、Ｂ）９４℃で３０秒、Ｃ）５５℃で３０秒、Ｄ）７２℃で１分、工程Ｂ〜Ｄを２９回繰り返す（合計３０サイクル）、Ｅ）７２℃で１０分。

ＰＣＲ反応第２サイクル：Ａ）９４℃で２分３０秒、Ｂ）９４℃で３０秒、Ｃ）６０℃で３０秒、Ｄ）７２℃で１分、工程Ｂ〜Ｄを２９回繰り返す（合計３０サイクル）、Ｅ）７２℃で１０分。

工程２：ＰＣＲ反応第１および第２の産物を混合し、アニールさせ（突然変異したＣＢＤをコードする領域において）、プライマー＃１および＃４を用いてＰＣＲをさらに２５サイクル実施した（図３１Ｂ）。ＰＣＲ反応サイクル：Ａ）９４℃で２分３０秒、Ｂ）９４℃で３０秒、Ｃ）７２℃で１分、工程Ｂ〜Ｃを９回繰り返す（合計１０サイクル）、第１プライマーと第４プライマーを添加する、Ｄ）９４℃で３０秒、Ｅ）５５℃で３０秒、Ｆ）７２℃で１分、工程Ｄ〜Ｆを２４回繰り返す（合計２５サイクル）、Ｇ）７２℃で１０分。

プライマー配列：
プライマー１：
（配列番号６４；ＮｈｅＩ配列は下線付き）。

プライマー２：
（配列番号６５；ＣＢＤコード配列は下線付き、突然変異形成されたコドンは太字の斜字体）。

プライマー３：
（配列番号６６；ＣＢＤコード配列は下線付き、突然変異形成されたコドンは太字の斜字体）。

プライマー４：
（配列番号６７；ＢａｍＨＩ配列は下線付き）。

野生型ＣＢＤ配列は
（配列番号６８）である
突然変異形成されたＣＢＤ配列は
（配列番号６９）である
突然変異形成されたＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ断片の配列は、
（配列番号７０）である。

実施例２６：ＬＬＯＣＢＤの一部のＣＴＬエピトープとの置換
ＣＢＤの９アミノ酸（ＡＡ）をＮＹ−ＥＳＯ−１抗原由来のＣＴＬエピトープで置換するため、部位特異的突然変異形成をＬＬＯに対して実施した。ＮＹ−ＥＳＯ−１に由来する「ｃｔＬＬＯ」という名称のＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープ１５７〜１６５を含む配列
（配列番号７１；突然変異形成された残基は下線付き）でＣＢＤの配列（配列番号６８）を置き換えた。

使用されるサブクローニング戦略は前出の実施例と同様であった。

使用されるプライマーは以下のとおりであった。

プライマー１：
（配列番号６４；ＮｈｅＩ配列は下線付き）。

プライマー２：
（配列番号７２；ＣＢＤコード配列は下線付き、突然変異形成された（ＮＹ−ＥＳＯ−１）コドンは太字の斜字体）。

プライマー３：
（配列番号７３；ＣＢＤコード配列は下線付き、突然変異形成された（ＮＹ−ＥＳＯ−１）コドンは太字の斜字体）。

結果として得られるＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ断片の配列は以下のとおりである：
（配列番号７４）。

実施例２７：ｍｕｔＬＬＯとｃｔＬＬＯは大腸菌発現系において発現および精製可能である
ｍｕｔＬＬＯとｃｔＬＬＯは大腸菌中で発現し得ることを示すため、ｐＥＴ２９ｂで大腸菌を形質転換し、０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、次いで４時間後に細胞溶菌液を回収し、総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で分離し、そしてクマシー染色（図３２Ａ）とモノクローナル抗体Ｂ３−１９を使用する抗ＬＬＯウエスタンブロットに供した（図３２Ｂ）。このように、ＣＢＤ内に点突然変異または置換を含むＬＬＯタンパク質が大腸菌発現系において発現および精製可能である。

実施例２８：ｍｕｔＬＬＯとｃｔＬＬＯは溶血活性の著しい低下を示す
材料および実験方法
溶血アッセイ
１．野生型および変異型のＬＬＯを図３３Ａ〜Ｂに表示される希釈度まで、９００μＬの１×ＰＢＳ−システイン（ＰＢＳを０．５Ｍシステイン塩酸でｐＨ５．５に調節するか、または７．４に調節した）中に希釈した。２．ＬＬＯを３７℃で３０分間にわたってインキュベートすることにより活性化した。３．ヒツジ赤血球（２００μｌ／試料）をＰＢＳ−システインで二回洗浄し、上清が比較的に明るくなるまで１×ＰＢＳで３〜５回洗浄した。４．ヒツジ赤血球の最終ペレットをＰＢＳ−システインに再懸濁し、１００μＬのその細胞懸濁液を９００μＬのＬＬＯ溶液に添加した（１０％の終濃度）。５．５０μＬのヒツジ赤血球を、９５０μＬの水＋１０％ツイーン２０に添加した（溶解についての陽性対照。他のチューブに加えられる細胞の総量としての溶解細胞の５０％の量を含むことになるので「５０％対照」）。６．全てのチューブを穏やかに混合し、３７℃で４５分間にわたってインキュベートした。７．赤血球をマイクロ遠心分離機中で１０分間にわたって１５００ｒｐｍで遠心分離した。８．その上清の２００μｌのアリコットを９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに移し、５７０ｎｍで読んで溶血後に放出されたヘモグロビンの濃度を測定し、そして５０％対照に対して試料を用量決定した。

結果
ヒツジ赤血球アッセイを用いてｍｕｔＬＬＯとｃｔＬＬＯの溶血活性を決定した。ｍｕｔＬＬＯはｐＨ５．５において著しく減少した（１００倍と１０００倍の間）溶血力価を示し、ｐＨ７．４では検出不可能な溶血活性を示した。ｃｔＬＬＯはどちらのｐＨでも検出不可能な溶血活性を示した（図３３Ａ〜Ｂ）。

したがって、Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２を含むＬＬＯＣＢＤ残基、の点突然変異（ｍｕｔＬＬＯ）または置換突然変異（ｃｔＬＬＯ）により溶血活性が消失するか、または大きく低下する。さらに、異種抗原ペプチドでのＣＢＤの置換は、野生型ＬＬＯと比べて著しく低下した溶血活性を持つ異種エピトープの免疫原性担体を作製する効果的な手段である。

本発明のある特定の特徴が本明細書に例示され記述されてきたが、今では当業者には数多くの修正、置換、変更、および均等物が生じるであろう。したがって、本発明の真の趣旨内に含まれるかかるすべての改変および変更が添付の特許請求の範囲により網羅されるものされることを理解すべきである。

実施例２９：完全閉鎖単回使用細胞増殖システム
その革新的システムは、独特な構成で配置されている容易に利用可能なバイオプロセッシング構成要素および技術を活用しており、それによって、単一完全閉鎖型システムを使用して、改変型Ｌｍ細菌を増殖させ、その発酵ブロスを濃縮し、それらの細胞を洗浄および精製し、発酵培地を製剤緩衝液に交換し、そして患者特有の用量を、即時使用可能なＩＶバッグに分注することができる。このタイプのシステムはそれぞれの患者の免疫療法の隔離と管理を提供する。このシステムは、個別化ネオエピトープを標的とする免疫療法剤の特定と臨床使用についての全体的なワークストリームの統合に特によく適している（図３７Ａ〜Ｂ）。

そのカスタム設計のシステムは、単回使用バイオプロセッシングバッグ、患者ＩＶバッグ、サンプリングバッグ、チューブ類、フィルター、クイックコネクター、およびセンサーを使用して組み立てられる。そのシステムが省スペースであることで個々の患者向けに製造することが可能になるが、それを複製し、複数の患者向けの製品を並行して製造することもできる（図３８）。その組立品全体は４つのセクション、すなわち、１）接種と発酵、２）濃縮、３）透析ろ過、および４）医薬品充填から構成される。そのシステムは完全閉鎖型の液体流路を有し、使用前に滅菌されるため、最終製剤化免疫療法剤は直接的にＩＶバッグに分注され、凍結され、そして医療センターに輸送される。したがって、バイアル瓶または事前充填注射筒に分注するときに伴う、典型的な充填／仕上げおよび包装の必要性がこれにより排除される。このことは、期待される患者への短時間での納品と送達に対処する。

その組立品の接種および発酵セクション（図３９）は、増殖培地で満たされ、指定温度まで加温される。次に細胞バンクを単回使用／ディスポーザブルの揺動式バッグ型発酵器、または単回使用／ディスポーザブルの撹拌式バイオリアクター容器のいずれかに接種する。細菌が特定の密度まで増殖したところで、その組立品の濃縮セクション（図４０）を使用して、発酵培地を取り除き、中空糸フィルターを使用してバッチを濃縮する洗浄／製剤緩衝液バッグが、その組立品の透析濾過セクションに接続され（図４１）、細菌細胞が洗浄／精製され、残留培地が中空糸フィルター中でのクロスフロー濾過を介して製剤緩衝液と交換され、そして製品が最終濃度まで希釈される。最後に、組立品の医薬品充填セクションを使用して、バッチが無菌単回使用ＩＶバッグおよびＱＣ検査用のサンプリングバッグに分割される（図４２）。患者特異的免疫療法は、生きた弱毒化改変型Ｌｍ細菌の純粋な培養株を指定の濃度で含む少量非経口用ＩＶバッグの中で凍結されて供給される。患者へ投与する前に、ＩＶバッグが溶解され、細胞が再懸濁され、そして必要な用量が注射筒を用いて取り出され、より大きな注入用ＩＶバッグへ添加される。

いくつかの完全閉鎖型組立品を並行して使用して、数人の患者、又は一人の患者のいずれかのための個別化免疫療法組成物を製造する（図４３）。スループットを増大させるために、必要に応じて追加の揺動型又は攪拌型の容器バイオリアクターシステムを処理列に加える（例えば図３８を参照のこと）。

完全閉鎖設計の増殖システムにより、製造過程中の免疫療法組成物の完全な品質管理の実行が可能となり、追加的な時間節約となる。完全分析管理行動計画をリステリア送達ベクターの増殖と並行して実施する（表６）。したがって、分注された製品は、追加の検査を必要とせず、患者へ即時送達される状態となっている。

表６．分析管理行動計画

実施例３０：弱毒化リステリア・モノサイトゲネス細胞バンクの製造方法
製造方法は図５０に示されており、以下の工程により実行される：
１．培地／緩衝液調製
この工程で、発酵培地（トリプシン大豆ブロス）と洗浄緩衝液（ＰＢＳ／スクロース）が、図４４〜４６の工程に従い、表７に示される材料を使用して調製される。ｐＨ調節用の塩基性溶液も調製される（２ＭＮａＯＨ−図４５）。

表７．

さらに、以下の製造過程対照を行う：１）洗浄緩衝液の前後の汚染微生物数、２）洗浄緩衝液のフィルター完全性試験、３）発酵培地の前後の汚染微生物数、および４）発酵培地のフィルター完全性試験。

２．０培養前工程ｎｏ．１
培養前１（ＰＣ１）を調製するために、１つのリステリア・モノサイトゲネスコロニーを単離し、ＴＳＢの１０ｍＬ管中で増殖させ、３７℃、１８０〜２２０ｒｐｍで６〜８時間培養する。

３．０培養前工程ｎｏ．２
前培養２（ＰＣ２）を調製するために、ＰＣ１とともに１９０ｍｌのＴＢＳを接種し、３７℃、１８０〜２２０ｒｐｍで１６〜１８時間培養する。

接種バッグの調製
２５ｍｌのアリコートをＰＣ２から取得し、２５０ｍｌバッグへ注入し、１００ｍｌの適量（ｑｓ）とし、接種バッグを作製する。総数で４個のバッグを得る（２５０ｍｌ中、１００ｍｌ×４個のバッグ１個のバッグ（「ワーキング細胞バンク」と名付ける）を、その後の発酵プロセスに使用する。内部製造対照として、外観、生細胞数計数（ＶＣＣ）、ａｃｔＡ遺伝子の不在、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドタグの存在、コロニーＰＣＲ、及びモノセプシス（純度）のために接種バッグを３０分毎に（サンプリングバッグマニホールドを使用。図５３Ａ参照）サンプリングし、これを最終ＯＤサンプリングまで行う。残りのバッグは、ＴＳＢ中、−７０℃〜−８０℃に凍結する。この時点から、本方法は閉鎖型システム中で行われる。

装置のセットアップ
この工程で、ウェーブバイオリアクターがセットアップされ、接線流ろ過（ＴＦＦ）システム（図５１Ａ）がセットアップされ、そして製品バンクマニホールドがセットアップされる（図５３）。

発酵プロセス
その組立品の接種および発酵セクション（図３９）は、増殖培地で満たされ、指定温度まで加温される。次に細胞バンクを単回使用／ディスポーザブルの揺動式バッグ型発酵器、または単回使用／ディスポーザブルの撹拌式バイオリアクター容器のいずれかに接種する。この工程は、ウェーブバイオリアクターセットアップの一部として、ＧＥウェーブバッグを使用する。この工程において、接種前に培地が馴化され、培地が馴化された時点で、バイオリアクターに１００ｍｌの接種バッグが接種される。次いで、３７℃、２０ｒｐｍの揺動率、１２°の揺動角で２〜４時間、発酵が行われる。製造過程対照として、ＯＤ_６００、ｐＨ、および溶存酸素（ｄＯ_２）に対し、発酵プロセスをサンプリングする。反応／プロセスは、ＯＤ_６００が０．６５±０．０５に到達した時点で終了する。

接線流ろ過（濃縮／透析ろ過）
細菌が特定の密度まで増殖したら、組立品の濃縮および透析ろ過セクション（図５１Ａ、Ｃ）を使用して、発酵培地を取り除き、発酵培地とコンストラクトを含有する流体混合物を、管５、中空糸フィルター２３および保持物バッグ２を含むループを通して再循環することによってバッチを濃縮する。２倍濃縮を行う。製品がその最終の２倍濃縮に達するまで循環を継続してもよい。

透析ろ過の間、洗浄／製剤緩衝液バッグ（例えば、洗浄／製剤緩衝液を保持するバッグ２９）を、連結器１１、接線流ろ過組立品（発酵培地の濃縮／透析ろ過に使用される）（図５１Ａ〜Ｃ）の保持物バッグ１に接続し、ポンプ４０に残りの混合物を循環させ続け、フィルター２３に混合物から培地を除去させ続けながら、細菌細胞を洗浄／精製（透析ろ過：≧８透析量≧ ４Ｌ）する。残留培地を、中空糸フィルター中のクロスフローろ過を介して製剤緩衝液と置き換え、製品を最終濃度まで希釈する。一部の実施形態において、フィルター２３により透過物バッグ２に流体が取り出される速度と同じ速度で製剤緩衝液が加えられ、それによって、実質的に一定濃度のコンストラクトが維持され、一方で古い培地が製剤緩衝液と置き換えられる。濃度に到達した後に透析ろ過が開始される。保持物バッグ１は、透析ろ過の間、バッグ中に一定量が測定され、維持される量で維持されてもよい。

患者に分配される前に、医薬品は、ｐＨ、外観、浸透圧、コロニーＰＣＲ、ａｃｔＡ遺伝子の存在、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドタグ（抗原提示）、モノセプシス、生細胞計数、生／死の％、およびエンドトキシンのためにサンプリングされてもよい。

充填／凍結および保存
最後に、図５２〜５３に示されるように、組立品のマニホールド３９を使用して、無菌単回使用ＩＶバッグおよびＱＣ検査用のサンプリングバッグにバッチが分割される（４０×１０ｍＬ量）。そのシステムは完全閉鎖型の液体流路を有し、使用前に滅菌されるため、最終製剤化免疫療法剤は直接的にＩＶバッグに分注され、凍結され、そして医療センターに輸送される。したがって、バイアル瓶または事前充填注射筒に分注するときに伴う、典型的な充填／仕上げおよび包装の必要性がこれにより排除される。このことは、期待される患者への短時間での納品と送達に対処する。

患者特異的免疫療法剤は、生きた弱毒化改変型Ｌｍ細菌の純粋な培養株を指定の濃度で含む少量非経口用ＩＶバッグの中で凍結されて供給されてもよい。患者へ投与する前に、ＩＶバッグが溶解され、細胞が再懸濁され、そして必要な用量が注射筒を用いて取り出され、より大きな注入用ＩＶバッグへ添加される。

完全閉鎖設計の増殖システムにより、製造過程に中の免疫療法組成物の完全な品質管理の実行が可能となり、それによって追加的な時間節約となり得る。完全分析管理行動計画をリステリア送達ベクターの増殖と並行して実施する（表６）。したがって、分注された製品は、追加の検査を必要とせず、患者へ即時送達される状態となっている。

Claims

疾患又は症状を有する対象に投与するための個別化免疫療法組成物の製造方法であって、前記個別化免疫療法組成物は、組換え型弱毒化リステリア株を含有し、前記リステリア株は、１つ以上のネオエピトープを含有する１つ以上のペプチドをコードする１つ以上のオープン・リーディング・フレームを備えた核酸配列を含有し、以下を含む前記方法：
ａ．疾患又は症状を有する対象由来の病変サンプルにおいて、１つ以上のネオエピトープを含有する１つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を取得及び特定する工程、
ｂ．前記１つ以上のネオエピトープを含有する前記１つ以上のペプチドをコードする前記核酸配列を備える発現ベクターで、弱毒化リステリア株を安定的にトランスフェクトする工程、
ｃ．前記１つ以上のネオエピトープを含有する前記１つ以上のペプチドを発現するリステリアクローンを取得する工程、
ｄ．前記リステリアクローンを、所定の規模まで増殖させる工程、
ｅ．その増殖リステリアクローンを精製する工程、
ｆ．増殖培地を、製剤緩衝液と置き換える工程、
ｇ．前記リステリアクローンを集菌する工程、
ｈ．前記集菌されたリステリアクローンを、所定の濃度を有する溶液に希釈させる工程、及び
ｉ．前記集菌されたリステリアクローン溶液を、その後の保管又は対象への投与のために単回用量容器へと分注する工程であって、
工程ｄ〜ｉは、完全閉鎖型単回使用細胞増殖システム中で行われる。
前記完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムは、接種セクション、発酵セクション、濃縮セクション、透析ろ過セクション、及び製品分注セクションを備える、請求項１に記載の方法。
前記完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムは、バイオプロセスバッグ、患者ＩＶバッグ、サンプリングバッグ、管類、ポンプ、バルブ、フィルター、クイックコネクター、及びセンサーを備えている、請求項２に記載の方法。
前記完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムのすべての構成要素が、ディスポーザブルである、請求項２〜３のいずれかに記載の方法。
前記完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムは、統合完全閉鎖型流体経路を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記統合完全閉鎖型流体経路が、使用前に滅菌される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
前記完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムの前記接種セクションが、１つ以上の接種バッグを備える、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムの前記接種セクションの各接種バッグが、前記発酵セクションに機能可能に接続されている、請求項７に記載の方法。
前記発酵セクションへの前記接続が、滅菌溶接またはディスポーザブルの無菌コネクターにより固定されている、請求項８に記載の方法。
各接種バッグは、約２５ｍｌ〜約１００ｍｌの体積を有する、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
前記完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムの前記発酵セクションが、１つ以上の単回使用攪拌型バイオリアクターを備える、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記バイオリアクターが、ディスポーザブルのウェーブ混合型バッグバイオリアクターである、請求項１１に記載の方法。
前記バイオリアクターが、ディスポーザブルの攪拌型タンクバイオリアクターである、請求項１１に記載の方法。
前記バイオリアクターが、ディスポーザブルの機械的振とうバイオリアクターである、請求項１１に記載の方法。
前記完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムの前記発酵セクションが、１つ以上の培養バッグを備える、請求項２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
各培養バッグの体積が、５００ｍｌを超えない、請求項１５に記載の方法。
各培養バッグが、前記完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムの接種セクションに、及び濃縮セクションに機能可能に接続されている、請求項１６に記載の方法。
前記接続が、滅菌溶接またはディスポーザブルの無菌コネクターにより固定されている、請求項１７に記載の方法。
前記完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムの接種セクション及び発酵セクションが、特定温度にまで加温された増殖培地で満たされている、請求項２〜１８に記載の方法。
前記完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムの前記濃縮セクションが、以下のうちの１つ以上を備える、請求項２〜１９に記載の方法：フィルター、ポンプ、透過物容器又はバッグ、及び濃縮された保持物容器又はバッグ。
前記１つ以上のフィルターが、単回使用中空糸フィルターである、請求項２０に記載の方法。
前記１つ以上のフィルターが、直列に機能可能に接続されている、請求項２１に記載の方法。
前記１つ以上のフィルターが、並列に機能可能に接続されている、請求項２１に記載の方法。
前記完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムの前記濃縮セクションの保持物容器が、発酵セクションの培養バッグ及びフィルターに機能可能に接続されており、前記保持物容器とフィルターの間の接続が再循環ループを形成する、請求項２０〜２３に記載の方法。
前記フィルターがさらに、透過物容器に機能可能に接続されている、請求項２０〜２４に記載の方法。
前記濃縮セクション内の流体の流れが、前記１つ以上のポンプにより駆動される、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の方法。
前記増殖したリステリアクローンの前記精製が、前記増殖したリステリアクローンを濃縮、および膜間圧透析ろ過することにより達成され、前記濃縮および透析ろ過が、前記リステリアクローンを、前記完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムの前記濃縮セクションの前記単回使用中空糸フィルターを通過させることにより達成される、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の方法。
前記完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムの前記製品分注セクションが、以下のうちの１つ以上を備える、請求項２〜２７のいずれか１項に記載の方法：ポンプ、バルクバッグ、パージバッグ、サンプリングバッグ、及び製品バッグ。
前記１つ以上の製品バッグは、単回投与バッグである、請求項２８に記載の方法。
前記単回投与製品バッグは、ＩＶバッグである、請求項２９に記載の方法。
前記単回投与製品ＩＶバッグが、約２５ｍｌ〜約１００ｍｌの体積を有する、請求項３０に記載の方法。
前記完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムの前記製品分注セクションの前記バルクバッグが、透析ろ過セクションの保持物バッグに機能可能に接続され、ならびに前記１つ以上のサンプリングバッグ、パージバッグ、及び製品バッグに機能可能に接続されている、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
前記濃縮セクション内の流体の流れが、前記１つ以上のポンプにより駆動される、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の方法。
前記製品バッグのうちの１つ以上が、所定の濃度の生弱毒化改変リステリアの精製培養株で満たされている、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の方法。
前記製品バッグのうちの１つ以上が、充填された直後に、密封され、治療のために患者に直接送達される、請求項３４に記載の方法。
前記製品バッグが、充填された直後に密封され、その後の保存又は輸送のために凍結される、請求項３４に記載の方法。
前記凍結製品バッグが溶解され、前記リステリアは、患者への投与の直前に再懸濁される、請求項３６に記載の方法。
前記完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムが、中央集中型構造を有しており、前記発酵セクションの前記発酵バッグが、濃縮及び透析ろ過セクションの保持物容器ならびに透過物容器として、ならびに製品分注セクションのバルクバッグとして独立して機能する、請求項２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
前記発酵バッグが、前記システムの他のセグメントの各々に機能可能に接続されており、およびかかる接続は密封可能である、請求項３８に記載の前記中央集中型完全閉鎖型単回使用細胞増殖システム。
前記完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムが、バイオフードベースである、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
前記単回使用細胞増殖システムが、一人の患者の規模の細胞増殖システムである、請求項１〜４０に記載の方法。
複数の対象のための個別化療法組成物を製造するために、複数の前記完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムが同時に使用される、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
１つの対象のための複数の個別化療法組成物を製造するために、複数の前記完全閉鎖型単回使用細胞増殖システムが同時に使用される、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
免疫療法組成物の安全性、純度、有効性、質、及び安定性の特徴解析をさらに含む、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
前記特徴解析が、集菌されたリステリアクローン溶液を単回投与容器へと分注する工程の前のいずれかの時点で行われる、請求項４４に記載の方法。
前記特徴解析が、集菌されたリステリアクローン溶液を単回投与容器へと分注する工程の後に行われる、請求項４４に記載の方法。
前記疾患または症状が、感染性疾患、または腫瘍もしくは癌を含む、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
以下を備える、接線流ろ過デバイス：
保持物バッグであって、前記保持物バッグは、以下を備える：
再循環出口；
再循環入口；および
透析ろ過入口；
透過物バッグ；
フィルター；ならびに
循環ポンプ；
第１の管は、再循環出口から再循環入口への第１の流体経路を規定し、前記第１の管は保持物バッグ、循環ポンプ、及びフィルターを流れるように接続し、それによって、循環ポンプは、保持物バッグからフィルターへ混合物を押し出し、そして保持物バッグへと押し戻し；
第２の管は、フィルターから透過物バッグへの第２の流体経路を規定し、前記フィルターは、混合物の少なくとも一部が透過物バッグへと入るように構成され；および
再循環出口は、保持物出口に近接して規定され、それによって、保持物出口は、保持物出口に近接する保持物バッグの混合物を混合するよう構成される。
第１の管上にバルブをさらに備え、前記バルブは、第１の管の圧力を選択的に制御するよう構成される、請求項４８に記載のデバイス。
前記圧力が、３ｐｓｉである、請求項４９に記載のデバイス。
前記再循環出口、再循環入口、または透析ろ過入口の少なくとも１つが、操作可能な位置で、保持物バッグの底に配置され、または保持物バッグの底に近接して配置される、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載のデバイス。
前記再循環出口、および透析ろ過入口が、保持物バッグの底に配置され、または保持物バッグの底に近接して配置される、請求項５１に記載のデバイス。
混合物の光学密度を検出するように構成された光学密度センサーを少なくとも１つさらに備える、請求項４８〜５２のいずれか１項に記載のデバイス。
前記少なくとも１つの光学密度センサーが、保持物バッグに光学的に接続される、、請求項５３に記載のデバイス。
前記少なくとも１つの光学密度センサーが、透過物バッグに光学的に接続される、、請求項５３に記載のデバイス。
前記少なくとも１つの光学密度センサーが、第１の管に光学的に接続される、、請求項５３に記載のデバイス。
第１の管に連結された圧力センサーを少なくとも１つさらに備える、請求項４８〜５６のいずれか１項に記載のデバイス。
コンストラクトを製造する方法であって、以下を含む前記方法：
第一の管およびコンストラクトを有する保持物バッグを提供すること；
以下により、コンストラクトを濃縮すること：
混合物をフィルターへと循環させることであって、
ここで前記フィルターは透過物バッグへ流れるように接続され、それによって、前記フィルターは、第一の流体の少なくとも一部が膜を通過して透過物バッグへと入り、混合物の残りの部分が保持物バッグへと戻るように構成されること、
以下により、透析ろ過を行うこと：
第２の流体を、混合物の残りの部分に加え、第２の混合物を形成させること；および
第２の混合物をフィルターへと循環させることであって；
ここで少なくとも前記第２の混合物は、流速で循環され、
ここで前記流速は、第２の混合物の少なくとも部分的な乱流を生じさせ、
ここで、コンストラクトのせん断がほとんど発生しないか、またはまったく発生しない流速が規定される。
前記コンストラクトは２倍濃縮される、請求項５８に記載の方法。
前記流速は、０．４５０Ｌ／分〜０．８５０Ｌ／分である、請求項５８〜５９のいずれかに記載の方法。
前記流速は、０．６５０Ｌ／分である、請求項６０に記載の方法。
フィルターで所定の圧力を維持することをさらに含む、請求項５８〜６２のいずれか１項に記載の方法。
所定の圧力が、第１の混合物または第２の混合物の流れを抑制するバルブを制御することにより維持される、請求項６２に記載の方法。
前記少なくとも部分的な乱流が、流体管のフィルターの前後に置かれた圧力センサーで検出される、請求項５８〜６３のいずれか１項に記載の方法。
前記圧力センサーが、バイオフィルム形成を示唆する、高い圧力差を検出するよう構成される、請求項６４に記載の方法。
高い圧力差に応答し、流速を上げることをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
せん断は、１つ以上の光学密度センサーを用いて検出される、請求項５８〜６６のいずれか１項に記載の方法。
前記１つ以上の光学密度センサーが、第１の混合物または第２の混合物の光学密度の変化を検出する、請求項６７に記載の方法。
前記１つ以上の光学密度センサーは、透過物バッグに配置される、請求項６７に記載の方法。
前記変化は、基準光学密度を比較して検出される、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
循環ポンプに電気的に接続され、流速を制御するよう構成されたフローコントローラーをさらに含む、請求項５８〜７０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも１つの流速センサーをさらに含み、ここで前記少なくとも１つの流速センサーが、フィルターの上流に配置された第１の圧力センサーと、フィルターの下流に配置された第２の圧力センサーを含み、そして最小閾値は、第１の圧力センサーにより検出された第１の圧力と、第２の圧力センサーにより検出された第２の圧力の間の差が、所定の閾値に達したときに規定される、請求項５８〜７１のいずれか１項に記載の方法。