JP7114477B2 - 新生抗原の特定、製造、および使用 - Google Patents

新生抗原の特定、製造、および使用 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、2015年12月16日に出願された米国特許仮出願第62/268,333号、2016年4月4日に出願された米国特許仮出願第62/317,823号、2016年8月26日に出願された米国特許仮出願第62/379,986号、2016年9月13日に出願された米国特許仮出願第62/394,074号、および2016年11月23日に出願された米国特許仮出願第62/425,995号の恩典および優先権を主張し、これらの各々は、すべての目的でその全体が参照により組み入れられる。
背景
腫瘍特異的な新生抗原に基づく治療用ワクチンは、次世代の個別化されたがん免疫療法として大きな見込みがある1～3。非小細胞肺がん（NSCLC）および黒色腫などの高い変異量（mutational burden）を有するがんは、特に、新生抗原生成の可能性が比較的大きいことを考慮すると、そのような療法の魅力的な標的である4、5。初期の証拠により、新生抗原ベースのワクチン接種がT細胞応答を惹起できること6、および新生抗原を標的とする細胞療法が、選択された患者においてある特定の状況下で腫瘍退縮を引き起こせること7が示されている。
新生抗原ワクチン設計についての1つの問題は、対象腫瘍中に存在する多くのコード変異のうちのどれが、「最良の」治療用新生抗原、例えば、抗腫瘍免疫を惹起し、腫瘍退縮を引き起こせる抗原を生成することができるかである。
当初の方法は、次世代シーケンシング、RNA遺伝子発現、および候補新生抗原ペプチドのMHC結合親和性の予測を用いた、変異ベースの解析を組み入れることが提唱されている8。しかし、これらの提唱されている方法は、遺伝子発現およびMHC結合に加えて多くの段階（例えば、TAP輸送、プロテアソーム切断、および／またはTCR認識）を含有する、エピトープ生成プロセスの全体をモデル化することができない可能性がある9。したがって、既存の方法は、低減した低い陽性的中率（PPV：positive predictive value）に悩まされる可能性が高い（図1A）。
実際に、複数のグループによって行われた、腫瘍細胞により提示されるペプチの解析は、提示されることが遺伝子発現およびMHC結合親和性を用いて予測されたペプチドのうち、腫瘍表面MHC上に見出され得るのは5％未満であることを示している10、11（図1B）。結合予測とMHC提示との間のこの低い相関は、変異数単独を上回る、チェックポイント阻害因子応答についての結合制限新生抗原の予測精度の改善の欠如という最近の観察によって、さらに強化された12。
提示を予測するための既存の方法のこの低い陽性的中率（PPV）は、新生抗原ベースのワクチン設計に対して問題を呈する。ワクチンが、低いPPVでの予測を用いて設計される場合、（すべての提示されるペプチドが免疫原性であることを仮定していても）大多数の患者は、治療用新生抗原を受ける可能性が低く、1つよりも多くを受ける可能性がある患者はさらに少ない。したがって、現在の方法での新生抗原ワクチン接種は、腫瘍を有する、実質的な数の対象において成功する可能性が低い（図1C）。
加えて、以前のアプローチは、シス作用性変異のみを用いて候補新生抗原を生成しており、複数の腫瘍タイプにおいて起こり、多くの遺伝子の異常なスプライシングをもたらす13、スプライシング因子における変異、およびプロテアーゼ切断部位を作製または除去する変異を含む、新生ORFの追加的な供給源を考慮することを、主として怠っていた。
最後に、腫瘍ゲノムおよびトランスクリプトーム解析に対する標準的なアプローチは、ライブラリー構築、エクソームおよびトランスクリプトームの捕捉、シーケンシング、またはデータ解析における最適に満たない条件のために、候補新生抗原を生じる体細胞性変異を見逃す可能性がある。同様に、標準的な腫瘍解析アプローチは、それぞれ、ワクチン能力の非効率な使用または自己免疫リスクをもたらす配列アーチファクトまたは生殖細胞系列多型を、新生抗原として意図せずに助長する可能性がある。
概要
個別化されたがんワクチンのための新生抗原を特定し、かつ選択するための最適化されたアプローチを、本明細書に開示する。第1に、次世代シーケンシング（NGS）を用いた、新生抗原候補特定のための最適化された腫瘍エクソームおよびトランスクリプトーム解析アプローチに取り組む。これらの方法は、すべての分類のゲノム変化にわたって、最高の感度および特異性の新生抗原候補を前に進めることを確実にするために、NGS腫瘍解析に対する標準的なアプローチを基にする。第2に、特異性の問題を克服し、ワクチンへの含有のために前に進めた新生抗原が抗腫瘍免疫を惹起する可能性がより高いことを確実にするための、高いPPVの新生抗原選択のための新規アプローチを提示する。これらのアプローチは、態様に依存して、訓練された統計的退縮、または、ペプチド-アレルマッピング、および様々な長さのペプチドにわたって統計学的強度を共有する複数の長さのペプチドについてのアレル毎（per-allele）モチーフを連結的にモデル化する、非線形深層学習モデルを含む。非線形深層学習モデルは、特に、同じ細胞における異なるMHCアレルを独立したものとして処理するように設計および訓練することができ、それにより、それらが互いに干渉したであろう線形モデルを用いて問題に対処する。最後に、個別化されたワクチン設計および新生抗原に基づく製造のための追加的な考察に対処する。
[本発明1001]
以下の工程を含む、腫瘍細胞表面上に提示されている可能性が高い、対象の腫瘍細胞由来の1つまたは複数の新生抗原を特定するための方法：
対象の腫瘍細胞から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシーケンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、該腫瘍ヌクレオチドシーケンシングデータが、新生抗原のセットの各々のペプチド配列を表すデータを取得するために使用され、かつ、各新生抗原のペプチド配列が、それを対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を含む、工程；
対象の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上の1つまたは複数のMHCアレルによって新生抗原の各々が提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を、1つまたは複数の提示モデルに入力する工程であって、該数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されている、工程；および
選択された新生抗原のセットを生成するために、該数値的尤度のセットに基づいて新生抗原のセットのサブセットを選択する工程。
[本発明1002]
選択された新生抗原のセットの数が20である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
提示モデルが、
MHCアレルのうちの特定の1つと、ペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
該ペアの、MHCアレルのうちの特定の1つによる、特定の位置に特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上の提示の尤度と
の間の依存性を表す、本発明1001～1002のいずれかの方法。
[本発明1004]
ペプチド配列を入力する工程が、
対応する新生抗原のペプチド配列のアミノ酸の少なくとも位置に基づいて、対応する新生抗原をMHCアレルが提示するかどうかを示す、1つまたは複数のMHCアレルの各々についての依存性スコアを生成するために、1つまたは複数の提示モデルを、対応する新生抗原のペプチド配列に適用すること
を含む、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
対応するMHCアレルが対応する新生抗原を提示するであろう尤度を示す、各MHCアレルについての対応するアレル毎（per-allele）尤度を生成するために、依存性スコアを変換する工程；および
アレル毎尤度を組み合わせて、数値的尤度を生成する工程
をさらに含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
依存性スコアを変換する工程が、対応する新生抗原のペプチド配列の提示を相互排反としてモデル化する、本発明1005の方法。
[本発明1007]
数値的尤度を生成するために、依存性スコアの組み合わせを変換する工程
をさらに含む、本発明1004～1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
依存性スコアの組み合わせを変換する工程が、対応する新生抗原のペプチド配列の提示をMHCアレル間の干渉としてモデル化する、本発明1007の方法。
[本発明1009]
数値的尤度のセットが、少なくともアレル非相互作用特性によってさらに特定され、かつ
アレル非相互作用特性に基づいて、対応する新生抗原のペプチド配列が提示されるかどうかを示す、アレル非相互作用特性についての依存性スコアを生成するために、1つまたは複数の提示モデルのうちのアレル非相互作用のモデルをアレル非相互作用特性に適用する工程
をさらに含む、本発明1004～1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
1つまたは複数のMHCアレルにおける各MHCアレルについての依存性スコアを、アレル非相互作用特性についての依存性スコアと組み合わせる工程；
対応するMHCアレルが対応する新生抗原を提示するであろう尤度を示す、MHCアレルについての対応するアレル毎尤度を生成するために、各MHCアレルについての組み合わされた依存性スコアを変換する工程；および
アレル毎尤度を組み合わせて、数値的尤度を生成する工程
をさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
数値的尤度を生成するために、MHCアレルの各々についての依存性スコアと、アレル非相互作用特性についての依存性スコアとの組み合わせを変換する工程
をさらに含む、本発明1009～1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
提示モデルについての数値的パラメータのセットが、多数の試料中に存在すると特定された訓練ペプチド配列のセット、および各訓練ペプチド配列に関連する1つまたは複数のMHCアレルを少なくとも含む訓練データセットに基づいて訓練され、該訓練ペプチド配列が、多数の試料に由来するMHCアレルから溶出された単離されたペプチドに対する質量分析を通して特定される、本発明1001～1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
訓練データセットが、腫瘍細胞のmRNA発現レベルについてのデータをさらに含む、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記試料が、単一のMHCクラスIまたはクラスIIアレルを発現するように操作された細胞株を含む、本発明1012～1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記試料が、多数のMHCクラスIまたはクラスIIアレルを発現するように操作された細胞株を含む、本発明1012～1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記試料が、多数の患者から取得されたか、または該患者に由来するヒト細胞株を含む、本発明1012～1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記試料が、多数の患者から取得された新鮮なまたは凍結された腫瘍試料を含む、本発明1012～1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記試料が、多数の患者から取得された新鮮なまたは凍結された組織試料を含む、本発明1012～1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記試料が、T細胞アッセイを用いて特定されたペプチドを含む、本発明1012～1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
訓練データセットが、
試料中に存在する訓練ペプチドのセットのペプチド存在量；
試料における訓練ペプチドのセットのペプチド長
に関連するデータをさらに含む、本発明1012～1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
訓練データセットが、公知のタンパク質配列のセットを含むデータベースに対するアラインメントを介して、訓練ペプチド配列のセットを比較することによって生成され、訓練タンパク質配列のセットが、訓練ペプチド配列よりも長く、かつそれらを含む、本発明1012～1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
訓練データセットが、細胞株からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのペプチドシーケンシングデータのうちの少なくとも1つを取得するために、細胞株に対して質量分析を行うかまたは質量分析が完了していることに基づいて生成され、該ペプチドシーケンシングデータが、変化を含む少なくとも1つのタンパク質配列を含む、本発明1012～1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
訓練データセットが、正常組織試料からエクソーム、トランスクリプトーム、および全ゲノムの正常ヌクレオチドシーケンシングデータのうちの少なくとも1つを取得することに基づいて生成される、本発明1012～1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
訓練データセットが、前記試料に関連するプロテオーム配列に関連するデータをさらに含む、本発明1012～1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
訓練データセットが、前記試料に関連するMHCペプチドーム配列に関連するデータをさらに含む、本発明1012～1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
訓練データセットが、単離されたペプチドのうちの少なくとも1つについてのペプチド-MHC結合親和性測定値に関連するデータをさらに含む、本発明1012～1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
訓練データセットが、単離されたペプチドのうちの少なくとも1つについてのペプチド-MHC結合安定性測定値に関連するデータをさらに含む、本発明1012～1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
訓練データセットが、前記試料に関連するトランスクリプトームに関連するデータをさらに含む、本発明1012～1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
訓練データセットが、前記試料に関連するゲノムに関連するデータをさらに含む、本発明1012～1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
訓練ペプチド配列が、kが8以上15以下であるkマーの範囲内の長さである、本発明1012～1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
ワン・ホット（one-hot）エンコーディングスキームを用いてペプチド配列をコード化することをさらに含む、本発明1012～1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
左パディング（left-padded）ワン・ホットエンコーディングスキームを用いて訓練ペプチド配列をコード化する工程をさらに含む、本発明1031の方法。
[本発明1033]
本発明1001～1032の工程のいずれかを行うことを含み、かつ、
選択された新生抗原のセットを含む腫瘍ワクチンを取得する工程、および
腫瘍ワクチンを対象に投与する工程
をさらに含む、腫瘍を有する対象を処置する方法。
[本発明1034]
本発明1001～1033の工程のいずれかを行うことを含み、かつ、
選択された新生抗原のセットを含む腫瘍ワクチンを生産するかまたは生産が完了している工程
をさらに含む、腫瘍ワクチンを製造する方法。
[本発明1035]
本発明1001～1032のいずれかの方法を行うことによって選択された、本発明1001～1032のいずれかの選択された新生抗原のセット
を含む、腫瘍ワクチン。
[本発明1036]
前記腫瘍ワクチンが、ヌクレオチド配列、ポリペプチド配列、RNA、DNA、細胞、プラスミド、またはベクターのうちの1つまたは複数を含む、本発明1035のワクチン。
[本発明1037]
前記腫瘍ワクチンが、腫瘍細胞表面上に提示された1つまたは複数の新生抗原を含む、本発明1035～1036のいずれかのワクチン。
[本発明1038]
前記腫瘍ワクチンが、対象において免疫原性である1つまたは複数の新生抗原を含む、本発明1035～1037のいずれかのワクチン。
[本発明1039]
前記腫瘍ワクチンが、対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導する1つまたは複数の新生抗原を含まない、本発明1035～1038のいずれかのワクチン。
[本発明1040]
前記腫瘍ワクチンが、アジュバントをさらに含む、本発明1035～1039のいずれかのワクチン。
[本発明1041]
前記腫瘍ワクチンが、賦形剤をさらに含む、本発明1035～1040のいずれかのワクチン。
[本発明1042]
選択された新生抗原のセットの選択が、
提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している新生抗原を選択すること
を含む、本発明1001～1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
選択された新生抗原のセットの選択が、
提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している新生抗原を選択すること
を含む、本発明1001～1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
選択された新生抗原のセットの選択が、
提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べてプロフェッショナル抗原提示細胞（APC）によってナイーブT細胞に対して提示されることができる尤度が増大している新生抗原を選択すること
を含み、任意で、該APCが樹状細胞（DC）である、本発明1001～1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
選択された新生抗原のセットの選択が、
提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容を介した阻害に供される尤度が減少している新生抗原を選択すること
を含む、本発明1001～1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
選択された新生抗原のセットの選択が、
提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している新生抗原を選択すること
を含む、本発明1001～1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシーケンシングデータが、腫瘍組織に対してシーケンシングを行うことによって取得される、本発明1001～1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
前記シーケンシングが、次世代シーケンシング（NGS）または任意の大規模並列処理シーケンシングアプローチである、本発明1001～1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
数値的尤度のセットが、以下のうちの少なくとも1つを含む少なくともMHCアレル相互作用特性によってさらに特定される、本発明1001～1048のいずれかの方法：
a．MHCアレルと新生抗原コード化ペプチドが結合する、予測親和性、
b．新生抗原コード化ペプチド-MHC複合体の予測安定性、
c．新生抗原コード化ペプチドの配列および長さ、
d．質量分析プロテオミクスまたは他の手段によって評価された際の、特定のMHCアレルを発現する他の個体由来の細胞における、類似した配列を有する新生抗原コード化ペプチドの提示の確率、
e．（例えば、RNA-seqまたは質量分析によって測定された際の）問題の対象における特定のMHCアレルの発現レベル、
f．特定のMHCアレルを発現する他の別個の対象における、特定のMHCアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列非依存的確率、
g．他の別個の対象における、同じファミリーの分子（例えば、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DP）におけるMHCアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列非依存的確率。
[本発明1050]
数値的尤度のセットが、以下のうちの少なくとも1つを含む少なくともMHCアレル非相互作用特性によってさらに特定される、本発明1001～1049のいずれかの方法：
a．その供給源タンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するC末端配列およびN末端配列、
b．（RNA-seqまたは質量分析によって測定された際の）任意で、腫瘍細胞における対応するプロテアーゼの発現にしたがって重み付けされる、新生抗原コード化ペプチドにおけるプロテアーゼ切断モチーフの存在、
c．適切な細胞タイプにおいて測定された際の、供給源タンパク質の代謝回転速度、
d．RNA-seqもしくはプロテオーム質量分析によって測定された際、または、DNAもしくはRNA配列データにおいて検出される生殖細胞系列もしくは体細胞性スプライシング変異のアノテーションから予測された際の、任意で、腫瘍細胞において最も高発現している特異的なスプライスバリアント（「アイソフォーム」）を考慮する、供給源タンパク質の長さ、
e．（RNA-seq、プロテオーム質量分析、または免疫組織化学によって測定され得る）腫瘍細胞におけるプロテアソーム、イムノプロテアソーム、胸腺プロテアソーム（thymoproteasome）、または他のプロテアーゼの発現のレベル、
f．（例えば、RNA-seqまたは質量分析によって測定された際の）新生抗原コード化ペプチドの供給源遺伝子の発現、
g．細胞周期の種々の段階の最中の、新生抗原コード化ペプチドの供給源遺伝子の典型的な組織特異的発現、
h．例えば、uniProtまたはPDB http://www.rcsb.org/pdb/home/home.doにおいて見出すことができるような、供給源タンパク質および／またはそのドメインの特性の総合的なカタログ、
i．ペプチドを含有する供給源タンパク質のドメインの性状を説明する特性、例えば、二次構造または三次構造（例えば、αヘリックス対βシート）；選択的スプライシング、
j．他の別個の対象における、問題の新生抗原コード化ペプチドの、供給源タンパク質由来のペプチドの提示の確率、
k．ペプチドが、技術的偏りのために質量分析によって検出されないか、または過剰に表されるであろう確率、
l．腫瘍細胞、間質、または腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の状態について情報を与える、RNASeqによって測定された際の、種々の遺伝子モジュール／経路の発現（ペプチドの供給源タンパク質を含有する必要はない）、
m．腫瘍細胞における、新生抗原コード化ペプチドの供給源遺伝子のコピー数、
n．ペプチドがTAPに結合する確率、または、測定されたかもしくは予測された、TAPに対するペプチドの結合親和性、
o．（RNA-seq、プロテオーム質量分析、免疫組織化学によって測定され得る）腫瘍細胞におけるTAPの発現レベル、
p．以下を含むがそれらに限定されない、腫瘍変異の有無：
i．EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異、
ii．抗原提示機構に関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、 CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOBHLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）におけるもの；その提示が、腫瘍において機能喪失変異の影響下にある抗原提示機構の構成要素に依拠するペプチドは、提示の確率が低減している、
q．以下を含むがそれらに限定されない、機能的な生殖細胞系列多型の有無：
i．抗原提示機構に関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOBHLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）におけるもの、
r．腫瘍タイプ（例えば、NSCLC、黒色腫）、
s．臨床的腫瘍サブタイプ（例えば、扁平上皮肺がん対非扁平上皮）、
t．喫煙歴、
u．任意で、ドライバー変異によって層別化される、関連性のある腫瘍タイプまたは臨床的サブタイプにおけるペプチドの供給源遺伝子の典型的な発現。
[本発明1051]
少なくとも1つの変異が、フレームシフトもしくは非フレームシフト挿入欠失（indel）、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ORFを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化である、本発明1001～1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
腫瘍細胞が、肺がん、黒色腫、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、胃がん、結腸がん、精巣がん、頭頸部がん、膵臓がん、脳がん、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、およびT細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺がん、および小細胞肺がんからなる群より選択される、本発明1001～1051のいずれかの方法。
[本発明1053]
選択された新生抗原のセットまたはそのサブセットを含む腫瘍ワクチンを取得する工程をさらに含み、任意で、腫瘍ワクチンを対象に投与する工程をさらに含む、本発明1001～1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
ポリペプチド形態における場合、選択された新生抗原のセットにおける新生抗原の少なくとも1つが、以下のうちの少なくとも1つを含む、本発明1001～1053のいずれかの方法：
1000nM未満のIC50値でのMHCとの結合親和性、
MHCクラス1ポリペプチドについては、8～15、8、9、10、11、12、13、14、または15アミノ酸の長さ、
プロテアソーム切断を促進する、親タンパク質配列中のポリペプチド内またはその近くの配列モチーフの存在、および、
TAP輸送を促進する配列モチーフの存在。
[本発明1055]
以下の工程を遂行することを含む、腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上に提示される可能性が高い1つまたは複数の新生抗原を特定するためのモデルを生成するための方法：
多数の試料に由来する主要組織適合性複合体（MHC）から溶出された多数の単離されたペプチドに関連するデータを含む、質量分析データを受け取る工程；
試料中に存在する訓練ペプチド配列のセット、および各訓練ペプチド配列に関連する1つまたは複数のMHCを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程；
訓練ペプチド配列を含む訓練データセットを用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、該提示モデルが、腫瘍細胞表面上の1つまたは複数のMHCアレルによって腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される多数の数値的尤度を提供する、工程。
[本発明1056]
提示モデルが、
ペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸の存在と、
特定の位置に特定のアミノ酸を含有するペプチド配列の、腫瘍細胞上のMHCアレルのうちの1つによる提示の尤度と
の間の依存性を表す、本発明1055の方法。
[本発明1057]
前記試料が、単一のMHCクラスIまたはクラスIIアレルを発現するように操作された細胞株を含む、本発明1055～1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
前記試料が、多数のMHCクラスIまたはクラスIIアレルを発現するように操作された細胞株を含む、本発明1055～1057のいずれかの方法。
[本発明1059]
前記試料が、多数の患者から取得されたか、または該患者に由来するヒト細胞株を含む、本発明1055～1058のいずれかの方法。
[本発明1060]
前記試料が、多数の患者から取得された新鮮なまたは凍結された腫瘍試料を含む、本発明1055～1059のいずれかの方法。
[本発明1061]
前記試料が、T細胞アッセイを用いて特定されたペプチドを含む、本発明1055～1060のいずれかの方法。
[本発明1062]
訓練データセットが、
試料中に存在する訓練ペプチドのセットのペプチド存在量；
試料における訓練ペプチドのセットのペプチド長
に関連するデータをさらに含む、本発明1055～1061のいずれかの方法。
[本発明1063]
訓練データセットを取得する工程が、
公知のタンパク質配列のセットを含むデータベースに対するアラインメントを介して訓練ペプチド配列のセットを比較することによって、訓練ペプチド配列に基づいて、訓練ペプチド配列よりも長くかつそれらを含む訓練タンパク質配列のセットを取得すること
を含む、本発明1055～1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
訓練データセットを取得する工程が、
細胞株からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシーケンシングデータのうちの少なくとも1つを取得するために細胞株に対して質量分析を行うかまたは質量分析が完了していること
を含み、該ヌクレオチドシーケンシングデータが、変異を含む少なくとも1つのタンパク質配列を含む、本発明1055～1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
提示モデルのパラメータのセットを訓練する工程が、
ワン・ホットエンコーディングスキームを用いて訓練ペプチド配列をコード化すること
を含む、本発明1055～1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
正常組織試料からエクソーム、トランスクリプトーム、および全ゲノムの正常ヌクレオチドシーケンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程；ならびに
該正常ヌクレオチドシーケンシングデータを用いて、提示モデルのパラメータのセットを訓練する工程
をさらに含む、本発明1055～1065のいずれかの方法。
[本発明1067]
訓練データセットが、前記試料に関連するプロテオーム配列に関連するデータをさらに含む、本発明1055～1066のいずれかの方法。
[本発明1068]
訓練データセットが、前記試料に関連するMHCペプチドーム配列に関連するデータをさらに含む、本発明1055～1067のいずれかの方法。
[本発明1069]
訓練データセットが、単離されたペプチドのうちの少なくとも1つについてのペプチド-MHC結合親和性測定値に関連するデータをさらに含む、本発明1055～1068のいずれかの方法。
[本発明1070]
訓練データセットが、単離されたペプチドのうちの少なくとも1つについてのペプチド-MHC結合安定性測定値に関連するデータをさらに含む、本発明1055～1069のいずれかの方法。
[本発明1071]
訓練データセットが、前記試料に関連するトランスクリプトームに関連するデータをさらに含む、本発明1055～1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
訓練データセットが、前記試料に関連するゲノムに関連するデータをさらに含む、本発明1055～1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
数値的パラメータのセットを訓練する工程が、
パラメータのセットのロジスティック回帰を行うこと
をさらに含む、本発明1055～1072のいずれかの方法。
[本発明1074]
訓練ペプチド配列が、kが8以上15以下であるkマーの範囲内の長さである、本発明1055～1073のいずれかの方法。
[本発明1075]
提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程が、
左パディングワン・ホットエンコーディングスキームを用いて訓練ペプチド配列をコード化すること
を含む、本発明1055～1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
数値的パラメータのセットを訓練する工程が、
深層学習アルゴリズムを用いてパラメータのセットについて値を決定すること
をさらに含む、本発明1055～1075のいずれかの方法。
[本発明1077]
以下の工程を遂行することを含む、腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上に提示される可能性が高い1つまたは複数の新生抗原を特定するためのモデルを生成するための方法：
多数の新鮮なまたは凍結された腫瘍試料に由来する主要組織適合性複合体（MHC）から溶出された多数の単離されたペプチドに関連するデータを含む、質量分析データを受け取る工程；
腫瘍試料中に存在し、かつ各訓練ペプチド配列に関連する1つまたは複数のMHCアレル上に提示される、訓練ペプチド配列のセットを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程；
訓練ペプチド配列に基づいて、訓練タンパク質配列のセットを取得する工程；ならびに
訓練タンパク質配列および訓練ペプチド配列を用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、該提示モデルが、腫瘍細胞表面上の1つまたは複数のMHCアレルによって腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される多数の数値的尤度を提供する、工程。
[本発明1078]
提示モデルが、
MHCアレルのうちの特定の1つと、ペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
該ペアの、MHCアレルのうちの特定の1つによる、特定の位置に特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上の提示の尤度と
の間の依存性を表す、本発明1077の方法。
本発明のこれらのおよび他の特性、局面、および利点は、以下の説明および添付の図面に関して、より良好に理解されるようになるであろう。
新生抗原の特定に対する現在の臨床的アプローチを示す。 予測された結合ペプチドのうち、腫瘍細胞上に提示されるのは5％未満であることを示す。 新生抗原予測の特異性の問題の影響を示す。 結合予測が、新生抗原の特定にとって十分ではないことを示す。 ペプチド長の関数としてのMHC-I提示の確率を示す。 Promegaのダイナミックレンジ標準から生成された、例示的なペプチドスペクトルを示す。 特性の追加が、いかにモデルの陽性的中率を増大させるかを示す。 1つの態様にしたがう、患者におけるペプチド提示の尤度を特定するための環境の概略である。 1つの態様にしたがう、提示情報を取得する方法を説明する。 1つの態様にしたがう、提示情報を取得する方法を説明する。 1つの態様による、提示特定システムのコンピュータ論理構成要素を説明する、ハイレベルブロック図である。 1つの態様による、訓練データの例示的なセットを説明する。 MHCアレルに関連した例示的なネットワークモデルを説明する。 MHCアレルによって共有される例示的なネットワークモデルを説明する。 MHCアレルによって共有される例示的なネットワークモデルを説明する。 例示的なネットワークモデルを用いた、MHCアレルに関連したペプチドの提示尤度の生成を説明する。 例示的なネットワークモデルを用いた、MHCアレルに関連したペプチドの提示尤度の生成を説明する。 例示的なネットワークモデルを用いた、MHCアレルに関連したペプチドの提示尤度の生成を説明する。 例示的なネットワークモデルを用いた、MHCアレルに関連したペプチドの提示尤度の生成を説明する。 例示的なネットワークモデルを用いた、MHCアレルに関連したペプチドの提示尤度の生成を説明する。 例示的なネットワークモデルを用いた、MHCアレルに関連したペプチドの提示尤度の生成を説明する。 種々の例示的な提示モデルの性能結果を説明する。 種々の例示的な提示モデルの性能結果を説明する。 種々の例示的な提示モデルの性能結果を説明する。 種々の例示的な提示モデルの性能結果を説明する。 種々の例示的な提示モデルの性能結果を説明する。 種々の例示的な提示モデルの性能結果を説明する。 種々の例示的な提示モデルの性能結果を説明する。 種々の例示的な提示モデルの性能結果を説明する。 種々の例示的な提示モデルの性能結果を説明する。 種々の例示的な提示モデルの性能結果を説明する。 図1および3に示した実体を実施するための例示的なコンピュータを説明する。
詳細な説明
I. 定義
概して、特許請求の範囲および明細書において使用される用語は、当業者によって理解される明白な意味を有すると解釈されるように意図される。ある特定の用語を、追加的な明瞭さを提供するために下記で定義する。明白な意味と提供される定義との間の矛盾の場合には、提供される定義が使用されるべきである。
本明細書において使用される場合、「抗原」という用語は、免疫応答を誘導する物質である。
本明細書において使用される場合、「新生抗原」という用語は、例えば、腫瘍細胞における変異または腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾を介して、それを対応する野生型の親抗原とは異なるものにする少なくとも1つの変化を有する抗原である。新生抗原は、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列を含むことができる。変異は、フレームシフトもしくは非フレームシフト挿入欠失（indel）、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ORFを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化を含むことができる。変異はまた、スプライスバリアントも含むことができる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾は、異常なリン酸化を含むことができる。腫瘍細胞に特異的な翻訳後修飾はまた、プロテアソーム生成スプライス抗原も含むことができる。Liepe et al., A large fraction of HLA class I ligands are proteasome- generated spliced peptides; Science. 2016 Oct 21; 354(6310):354-358を参照されたい。
本明細書において使用される場合、「腫瘍新生抗原」という用語は、対象の腫瘍細胞または組織中に存在するが、対象の対応する正常細胞または組織中には存在しない新生抗原である。
本明細書において使用される場合、「新生抗原ベースのワクチン」という用語は、1つまたは複数の新生抗原、例えば、多数の新生抗原に基づくワクチン構築物である。
本明細書において使用される場合、「候補新生抗原」という用語は、新生抗原を表し得る新たな配列を生じる、変異、または他の異常である。
本明細書において使用される場合、「コード領域」という用語は、タンパク質をコードする遺伝子の部分である。
本明細書において使用される場合、「コード変異」という用語は、コード領域において起こる変異である。
本明細書において使用される場合、「ORF」という用語は、オープンリーディングフレームを意味する。
本明細書において使用される場合、「新生ORF」という用語は、変異、またはスプライシングなどの他の異常から生じた腫瘍特異的ORFである。
本明細書において使用される場合、「ミスセンス変異」という用語は、1つのアミノ酸から別のアミノ酸への置換を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「ナンセンス変異」という用語は、アミノ酸から終止コドンへの置換を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「フレームシフト変異」という用語は、タンパク質のフレームにおいて変更を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「挿入欠失」という用語は、1つまたは複数の核酸の挿入または欠失である。
本明細書において使用される場合、2つ以上の核酸またはポリペプチドの配列の文脈におけるパーセント「同一性」という用語は、下記の配列比較アルゴリズム（例えば、BLASTPおよびBLASTN、または当業者が利用可能な他のアルゴリズム）のうちの1つを用いて、または目視検査により測定された際、最大の対応について比較して整列させた場合に、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定されたパーセンテージを有する、2つ以上の配列または部分配列を指す。適用に応じて、パーセント「同一性」は、比較される配列の領域にわたって、例えば、機能ドメインにわたって存在するか、あるいは、比較される2つの配列の完全長にわたって存在することができる。
配列比較のためには、典型的に、1つの配列が、試験配列がそれに対して比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合には部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。あるいは、配列類似性または相違性は、組み合わされた、特定のヌクレオチドの、または、翻訳された配列については選択された配列位置（例えば、配列モチーフ）でのアミノ酸の有無によって確立することができる。
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性の探索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理された実行（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.におけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）によって、または目視検査によって実施することができる（概して、下記のAusubel et al.を参照されたい）。
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適しているアルゴリズムの1つの例は、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されているBLASTアルゴリズムである。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを通して公的に利用可能である。
本明細書において使用される場合、「ノンストップまたはリードスルー」という用語は、天然の終止コドンの除去を引き起こす変異である。
本明細書において使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体またはT細胞受容体が典型的に結合する、抗原の特異的な部分である。
本明細書において使用される場合、「免疫原性」という用語は、例えば、T細胞、B細胞、またはその両方を介して、免疫応答を惹起する能力である。
本明細書において使用される場合、「HLA結合親和性」、「MHC結合親和性」という用語は、特異的な抗原と特異的なMHCアレルとの間の結合の親和性を意味する。
本明細書において使用される場合、「ベイト」という用語は、DNAまたはRNAの特異的な配列を試料から濃縮するために使用される核酸プローブである。
本明細書において使用される場合、「バリアント」という用語は、対象の核酸と、対照として使用される参照ヒトゲノムとの間の差である。
本明細書において使用される場合、「バリアントコール」という用語は、典型的にはシーケンシングからの、バリアントの存在のアルゴリズム的決定である。
本明細書において使用される場合、「多型」という用語は、生殖細胞系列バリアント、すなわち、個体のすべてのDNA保有細胞において見出されるバリアントである。
本明細書において使用される場合、「体細胞性バリアント」という用語は、個体の非生殖系列細胞において生じるバリアントである。
本明細書において使用される場合、「アレル」という用語は、遺伝子のバージョンまたは遺伝子配列のバージョンまたはタンパク質のバージョンである。
本明細書において使用される場合、「HLA型」という用語は、HLA遺伝子アレルを補完するものである。
本明細書において使用される場合、「ナンセンス変異依存分解機構」または「NMD」という用語は、未成熟終止コドンのための、細胞によるmRNAの分解である。
本明細書において使用される場合、「トランカル変異（truncal mutation）」という用語は、腫瘍の発生において初期に始まり、腫瘍の細胞の実質的な部分に存在する変異である。
本明細書において使用される場合、「サブクローナル変異（subclonal mutation）」という用語は、腫瘍の発生において後期に始まり、腫瘍の細胞のサブセットのみに存在する変異である。
本明細書において使用される場合、「エクソーム」という用語は、タンパク質をコードするゲノムのサブセットである。エクソームは、ゲノムの集合的なエクソンであることができる。
本明細書において使用される場合、「ロジスティック回帰」という用語は、従属変数が1と同等である確率のロジットが、従属変数の線形関数としてモデル化されている、統計学由来のバイナリデータのための回帰モデルである。
本明細書において使用される場合、「ニューラルネットワーク」という用語は、典型的には確率的勾配降下法および逆伝搬を介して訓練された、要素ごとの非線形性が後に続く、多層の線形変換からなる分類または回帰のための機械学習モデルである。
本明細書において使用される場合、「プロテオーム」という用語は、細胞、細胞の群、または個体によって発現される、および／または翻訳されるすべてのタンパク質のセットである。
本明細書において使用される場合、「ペプチドーム」という用語は、細胞表面上のMHC-IまたはMHC-IIによって提示されるすべてのペプチドのセットである。ペプチドームは、細胞または細胞の収集物の性状を指す場合もある（例えば、腫瘍ペプチドームは、腫瘍を含むすべての細胞のペプチドームの和集合を意味する）。
本明細書において使用される場合、「ELISPOT」という用語は、ヒトおよび動物において免疫応答をモニタリングするための一般的な方法である、酵素結合免疫吸着スポットアッセイを意味する。
本明細書において使用される場合、「デキサトラマー」という用語は、フローサイトメトリーにおいて抗原特異的T細胞染色のために使用される、デキストランベースのペプチド-MHCマルチマーである。
本明細書において使用される場合、「寛容または免疫寛容」という用語は、1つまたは複数の抗原、例えば、自己抗原に対する免疫非応答性の状態である。
本明細書において使用される場合、「中枢性寛容」という用語は、自己反応性T細胞クローンを欠失させること、または自己反応性T細胞クローンを免疫抑制性調節性T細胞（Treg）へ分化するように促進することのいずれかにより、胸腺において影響を受ける寛容である。
本明細書において使用される場合、「末梢性寛容」という用語は、中枢性寛容を生き延びた自己反応性T細胞を下方制御もしくはアネルギー化すること、またはこれらのT細胞をTregへ分化するように促進することにより、末梢において影響を受ける寛容である。
「試料」という用語は、静脈穿刺、排泄、射精、マッサージ、生検、針吸引、洗浄試料、擦過、外科的切開、もしくは介入、または当技術分野において公知の他の手段を含む手段によって対象から採取された、単一細胞、または複数の細胞、または細胞の断片、または体液のアリコートを含むことができる。
「対象」という用語は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロ、雄または雌のいずれかの、細胞、組織、または生物体、ヒトまたは非ヒトを包含する。対象という用語は、ヒトを含む哺乳動物を含める。
「哺乳動物」という用語は、ヒトおよび非ヒトの両方を包含し、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、およびブタを含むが、それらに限定されない。
「臨床的因子」という用語は、対象の状態、例えば、疾患の活性または重症度の測定を指す。「臨床的因子」は、非試料マーカーを含む、対象の健康状態のすべてのマーカー、ならびに／または、非限定的に年齢および性別などの、対象の他の特徴を包含する。臨床的因子は、対象または決定された条件下の対象由来の試料（または試料の集団）の評定から取得され得るスコア、値、または値のセットであることができる。臨床的因子はまた、マーカー、および／または遺伝子発現代替物などの他のパラメータによっても予測することができる。臨床的因子は、腫瘍タイプ、腫瘍サブタイプ、および喫煙歴を含むことができる。
略語：MHC：主要組織適合性複合体；HLA：ヒト白血球抗原、またはヒトMHC遺伝子座；NGS：次世代シーケンシング；PPV：陽性的中率；TSNA：腫瘍特異的新生抗原；FFPE：ホルマリン固定パラフィン包埋；NMD：ナンセンス変異依存分解機構；NSCLC：非小細胞肺がん；DC：樹状細胞。
明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明らかに別の方法で指図しない限り、複数の指示物を含むことに注目されるべきである。
本明細書において直接定義されていない任意の用語は、本発明の技術分野内で理解されるように、一般的にそれらと関連する意味を有するように理解されるであろう。ある特定の用語が、本発明の局面の組成物、装置、方法など、およびそれらをいかに作製または使用するかを説明する際に、実施者に対して追加的な手引きを提供するために、本明細書において議論される。同じものが、1つよりも多い方法で言われてもよいことが、認識されるであろう。したがって、代替的な言語および同義語が、本明細書において議論される用語の任意の1つまたは複数について使用されてもよい。用語が本明細書において詳述または議論されるかどうかに対して、重要性が置かれるべきではない。いくつかの同義語または置換可能な方法、材料などが、提供される。1つまたは少数の同義語または等価物の詳説は、明確に述べられない限り、他の同義語または等価物の使用を排除しない。用語の例を含む、例の使用は、説明の目的のみであり、本明細書における本発明の局面の範囲および意味を限定しない。
本明細書の本文内で引用されるすべての参照文献、発行された特許、および特許出願は、すべての目的で、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
II. 新生抗原を特定する方法
腫瘍の細胞表面上に提示される可能性が高い、および／または免疫原性である可能性が高い、対象の腫瘍由来の新生抗原を特定するための方法を、本明細書に開示する。例として、1つのそのような方法は、以下の工程を含んでもよい：対象の腫瘍細胞から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシーケンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、該腫瘍ヌクレオチドシーケンシングデータが、新生抗原のセットの各々のペプチド配列を表すデータを取得するために使用され、かつ、各新生抗原のペプチド配列が、それを対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を含む、工程；対象の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上の1つもしくは複数のMHCアレルによって、または腫瘍中に存在する細胞によって新生抗原の各々が提示されることの数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を、1つまたは複数の提示モデルに入力する工程であって、該数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されている、工程；および、選択された新生抗原のセットを生成するために、該数値的尤度のセットに基づいて新生抗原のセットのサブセットを選択する工程。
提示モデルは、対応するラベルのセットを含む参照データのセット（訓練データセットとも呼ばれる）に対して訓練された、統計学的回帰または機械学習（例えば、深層学習）モデルを含むことができ、該参照データのセットは、任意でいくらかの対象が腫瘍を有することができる多数の別個の対象の各々から取得され、かつ、以下のうちの少なくとも1つを含む：腫瘍組織由来のエクソームヌクレオチド配列を表すデータ、正常組織由来のエクソームヌクレオチド配列を表すデータ、腫瘍組織由来のトランスクリプトームヌクレオチド配列を表すデータ、腫瘍組織由来のプロテオーム配列を表すデータ、および腫瘍組織由来のMHCペプチドーム配列を表すデータ、および正常組織由来のMHCペプチドーム配列を表すデータ。参照データは、合成タンパク質、正常および腫瘍ヒト細胞株、ならびに新鮮なおよび凍結された初代試料に対してその後曝露される、あらかじめ決定されたMHCアレルを発現するように操作された単一アレル細胞株についての質量分析データ、シーケンシングデータ、RNAシーケンシングデータ、およびプロテオミクスデータ、ならびにT細胞アッセイ（例えば、ELISPOT）をさらに含むことができる。ある特定の局面において、参照データのセットは、参照データの各形態を含む。
提示モデルは、参照データのセットに少なくとも一部由来する特性のセットを含むことができ、該特性のセットは、アレル依存性特性およびアレル非依存性特性のうちの少なくとも1つを含む。ある特定の局面において、各特性が含まれる。
ナイーブT細胞に対する樹状細胞提示の特性は、以下のうちの少なくとも1つを含むことができる：上記の特性。ワクチンにおける抗原の用量およびタイプ（例えば、ペプチド、mRNA、ウイルスなど）：（1）樹状細胞（DC）がそれにより抗原タイプを取り込む経路（例えば、飲食作用、微飲作用）；ならびに／または（2）抗原がDCにより取り込まれる効力。ワクチンにおけるアジュバントの用量およびタイプ。ワクチン抗原配列の長さ。ワクチン投与の数および部位。（例えば、最近の感染症歴、血球数などによって測定される際の）ベースラインの患者の免疫機能。RNAワクチンについては：（1）樹状細胞におけるmRNAタンパク質産物の代謝回転速度；（2）インビトロまたはインビボの実験において測定される際の、樹状細胞による摂取後のmRNAの翻訳の速度；ならびに／または（3）インビボまたはインビトロの実験によって測定される際の、樹状細胞による摂取後のmRNAの翻訳の数またはラウンド。（例えば、RNA-seqまたは質量分析によって測定された際の）任意で、樹状細胞において典型的に発現しているプロテアーゼに対して追加的な重みを与える、ペプチドにおけるプロテアーゼ切断モチーフの存在。（RNA-seq、質量分析、免疫組織化学、または他の標準的な技法によって測定され得る）典型的な活性化された樹状細胞における、プロテアソームおよびイムノプロテアソームの発現のレベル。任意で、活性化された樹状細胞または他の免疫細胞において具体的に測定される、（例えば、RNA-seqまたは質量分析によって測定された際の）問題の個体における特定のMHCアレルの発現レベル。任意で、活性化された樹状細胞または他の免疫細胞において具体的に測定される、特定のMHCアレルを発現する他の個体における特定のMHCアレルによるペプチド提示の確率。任意で、活性化された樹状細胞または他の免疫細胞において具体的に測定される、他の個体における同じファミリーの分子（例えば、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DP）のMHCアレルによるペプチド提示の確率。
免疫寛容逃避特性は、以下のうちの少なくとも1つを含むことができる：1つまたはいくつかの細胞タイプに対して行われたタンパク質質量分析を介した、自己ペプチドームの直接測定。自己タンパク質のすべてのkマー（例えば、5～25）の部分列の和集合を取ることによる、自己ペプチドームの推定。任意で生殖細胞系列バリアントを占める、すべての非変異自己タンパク質に適用された上記の提示モデルに類似した提示のモデルを用いた、自己ペプチドームの推定。
ランク付けは、数値的尤度に少なくとも一部基づく少なくとも1つのモデルによって提供される、多数の新生抗原を用いて行うことができる。ランク付けの後に、選択を、ランク付けされた新生抗原のサブセットを選択基準にしたがって選択するために行うことができる。選択後に、ランク付けされたペプチドのサブセットを、出力として提供することができる。
選択された新生抗原のセットの数は、20であってもよい。
提示モデルは、MHCアレルのうちの特定の1つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、該ペアの、MHCアレルのうちの特定の1つによる、特定の位置に特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上の提示の尤度との間の依存性を表し得る。
本明細書に開示する方法はまた、対応する新生抗原のペプチド配列のアミノ酸の少なくとも位置に基づいて、対応する新生抗原をMHCアレルが提示するかどうかを示す、1つまたは複数のMHCアレルの各々についての依存性スコアを生成するために、1つまたは複数の提示モデルを、対応する新生抗原のペプチド配列に適用することも含むことができる。
本明細書に開示する方法はまた、対応するMHCアレルが対応する新生抗原を提示するであろう尤度を示す、各MHCアレルについての対応するアレル毎尤度を生成するために、依存性スコアを変換する工程；および、アレル毎尤度を組み合わせて、数値的尤度を生成する工程も含むことができる。
依存性スコアを変換する工程は、対応する新生抗原のペプチド配列の提示を相互排反としてモデル化することができる。
本明細書に開示する方法はまた、数値的尤度を生成するために、依存性スコアの組み合わせを変換する工程も含むことができる。
依存性スコアの組み合わせを変換する工程は、対応する新生抗原のペプチド配列の提示をMHCアレル間の干渉としてモデル化することができる。
数値的尤度のセットは、少なくともアレル非相互作用特性によってさらに特定されることができ、本明細書に開示する方法はまた、アレル非相互作用特性に基づいて、対応する新生抗原のペプチド配列が提示されるかどうかを示す、アレル非相互作用特性についての依存性スコアを生成するために、1つまたは複数の提示モデルのうちのアレル非相互作用のモデルをアレル非相互作用特性に適用することもできる。
本明細書に開示する方法はまた、1つまたは複数のMHCアレルにおける各MHCアレルについての依存性スコアを、アレル非相互作用特性についての依存性スコアと組み合わせる工程；対応するMHCアレルが対応する新生抗原を提示するであろう尤度を示す、MHCアレルについての対応するアレル毎尤度を生成するために、各MHCアレルについての組み合わされた依存性スコアを変換する工程；および、アレル毎尤度を組み合わせて、数値的尤度を生成する工程も含むことができる。
本明細書に開示する方法はまた、数値的尤度を生成するために、MHCアレルの各々についての依存性スコアと、アレル非相互作用特性についての依存性スコアとの組み合わせを変換する工程も含むことができる。
提示モデルについての数値的パラメータのセットは、多数の試料中に存在すると特定された訓練ペプチド配列のセット、および各訓練ペプチド配列に関連する1つまたは複数のMHCアレルを少なくとも含む訓練データセットに基づいて訓練することができ、該訓練ペプチド配列は、多数の試料に由来するMHCアレルから溶出された単離されたペプチドに対する質量分析を通して特定される。
試料はまた、単一のMHCクラスIまたはクラスIIアレルを発現するように操作された細胞株も含むことができる。
試料はまた、多数のMHCクラスIまたはクラスIIアレルを発現するように操作された細胞株も含むことができる。
試料はまた、多数の患者から取得されたか、または該患者に由来するヒト細胞株も含むことができる。
試料はまた、多数の患者から取得された新鮮なまたは凍結された腫瘍試料も含むことができる。
試料はまた、多数の患者から取得された新鮮なまたは凍結された組織試料も含むことができる。
試料はまた、T細胞アッセイを用いて特定されたペプチドも含むことができる。
訓練データセットは、試料中に存在する訓練ペプチドのセットのペプチド存在量；試料における訓練ペプチドのセットのペプチド長に関連するデータをさらに含むことができる。
訓練データセットは、公知のタンパク質配列のセットを含むデータベースに対するアラインメントを介して、訓練ペプチド配列のセットを比較することによって生成されてもよく、該訓練タンパク質配列のセットは、訓練ペプチド配列よりも長く、かつそれらを含む。
訓練データセットは、細胞株からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのシーケンシングデータのうちの少なくとも1つを取得するために、細胞株に対してヌクレオチドシーケンシングを行うか、またはヌクレオチドシーケンシングが完了していることに基づいて生成されてもよく、該シーケンシングデータは、変化を含む少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む。
訓練データセットは、正常組織試料からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの正常ヌクレオチドシーケンシングデータのうちの少なくとも1つを取得することに基づいて、生成されてもよい。
訓練データセットは、試料に関連するプロテオーム配列に関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、試料に関連するMHCペプチドーム配列に関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、単離されたペプチドのうちの少なくとも1つについてのペプチド-MHC結合親和性測定値に関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、単離されたペプチドのうちの少なくとも1つについてのペプチド-MHC結合安定性測定値に関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、試料に関連するトランスクリプトームに関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、試料に関連するゲノムに関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練ペプチド配列は、kマー（kは、MHCクラスIについては8以上15以下、または、MHCクラスIIについては9以上30以下である）の範囲内の長さであってもよい。
本明細書に開示する方法はまた、ワン・ホット（one-hot）エンコーディングスキームを用いてペプチド配列をコード化することも含むことができる。
本明細書に開示する方法はまた、左パディング（left-padded）ワン・ホットエンコーディングスキームを用いて訓練ペプチド配列をコード化することも含むことができる。
請求項1に記載の工程を行うことを含み、かつ、選択された新生抗原のセットを含む腫瘍ワクチンを取得する工程、および腫瘍ワクチンを対象に投与する工程をさらに含む、腫瘍を有する対象を処置する方法。
以下の工程を含む、腫瘍ワクチンを製造するための方法もまた、本明細書に開示する：対象の腫瘍細胞から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシーケンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、該腫瘍ヌクレオチドシーケンシングデータが、新生抗原のセットの各々のペプチド配列を表すデータを取得するために使用され、かつ、各新生抗原のペプチド配列が、それを対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変異を含む、工程；対象の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上の1つまたは複数のMHCアレルによって新生抗原の各々が提示されることの数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を、1つまたは複数の提示モデルに入力する工程であって、該数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されている、工程；および、選択された新生抗原のセットを生成するために、該数値的尤度のセットに基づいて新生抗原のセットのサブセットを選択する工程；ならびに、選択された新生抗原のセットを含む腫瘍ワクチンを生産するかまたは生産が完了している工程。
以下の工程を含む方法を行うことによって選択された、選択された新生抗原のセットを含む腫瘍ワクチンもまた、本明細書に開示する：対象の腫瘍細胞から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシーケンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、該腫瘍ヌクレオチドシーケンシングデータが、新生抗原のセットの各々のペプチド配列を表すデータを取得するために使用され、かつ、各新生抗原のペプチド配列が、それを対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変異を含む、工程；対象の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上の1つまたは複数のMHCアレルによって新生抗原の各々が提示されることの数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を、1つまたは複数の提示モデルに入力する工程であって、該数値的尤度のセットが、受け取った質量分析データに少なくとも基づいて特定されている、工程；および、選択された新生抗原のセットを生成するために、該数値的尤度のセットに基づいて新生抗原のセットのサブセットを選択する工程；ならびに、選択された新生抗原のセットを含む腫瘍ワクチンを生産するかまたは生産が完了している工程。
腫瘍ワクチンは、ヌクレオチド配列、ポリペプチド配列、RNA、DNA、細胞、プラスミド、またはベクターのうちの1つまたは複数を含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、腫瘍細胞表面上に提示された1つまたは複数の新生抗原を含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、対象において免疫原性である1つまたは複数の新生抗原を含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導する、1つまたは複数の新生抗原を含まない可能性がある。
腫瘍ワクチンは、アジュバントを含んでもよい。
腫瘍ワクチンは、賦形剤を含んでもよい。
本明細書に開示する方法はまた、提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している新生抗原を選択することを含んでもよい。
本明細書に開示する方法はまた、提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含んでもよい。
本明細書に開示する方法はまた、提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べてプロフェッショナル抗原提示細胞（APC）によってナイーブT細胞に対して提示されることができる尤度が増大している新生抗原を選択することを含んでもよく、任意で、APCは樹状細胞（DC）である。
本明細書に開示する方法はまた、提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容を介した阻害に供される尤度が減少している新生抗原の選択を含んでもよい。
本明細書に開示する方法はまた、提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している新生抗原の選択を含んでもよい。
エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシーケンシングデータは、腫瘍組織に対してシーケンシングを行うことによって取得されてもよい。
シーケンシングは、次世代シーケンシング（NGS）または任意の大規模並列処理シーケンシングアプローチであってもよい。
数値的尤度のセットは、以下のうちの少なくとも1つを含む少なくともMHCアレル相互作用特性によってさらに特定されてもよい：MHCアレルと新生抗原コード化ペプチドが結合する、予測親和性；新生抗原コード化ペプチド-MHC複合体の予測安定性；新生抗原コード化ペプチドの配列および長さ；質量分析プロテオミクスまたは他の手段によって評価された際の、特定のMHCアレルを発現する他の個体由来の細胞における、類似した配列を有する新生抗原コード化ペプチドの提示の確率；（例えば、RNA-seqまたは質量分析によって測定された際の）問題の対象における特定のMHCアレルの発現レベル；特定のMHCアレルを発現する他の別個の個体における、特定のMHCアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列非依存的確率；他の別個の対象における、同じファミリーの分子（例えば、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DP）におけるMHCアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列非依存的確率。
数値的尤度のセットは、以下のうちの少なくとも1つを含む少なくともMHCアレル非相互作用特性によってさらに特定される：その供給源タンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するC末端配列およびN末端配列；（RNA-seqまたは質量分析によって測定された際の）任意で、腫瘍細胞における対応するプロテアーゼの発現にしたがって重み付けされる、新生抗原コード化ペプチドにおけるプロテアーゼ切断モチーフの存在；適切な細胞タイプにおいて測定された際の、供給源タンパク質の代謝回転速度；RNA-seqもしくはプロテオーム質量分析によって測定された際、または、DNAもしくはRNA配列データにおいて検出される生殖細胞系列もしくは体細胞性スプライシング変異のアノテーションから予測された際の、任意で、腫瘍細胞において最も高発現している特異的なスプライスバリアント（「アイソフォーム」）を考慮する、供給源タンパク質の長さ；（RNA-seq、プロテオーム質量分析、または免疫組織化学によって測定され得る）腫瘍細胞におけるプロテアソーム、イムノプロテアソーム、胸腺プロテアソーム（thymoproteasome）、または他のプロテアーゼの発現のレベル；（例えば、RNA-seqまたは質量分析によって測定された際の）新生抗原コード化ペプチドの供給源遺伝子の発現；細胞周期の種々の段階の最中の、新生抗原コード化ペプチドの供給源遺伝子の典型的な組織特異的発現；例えば、uniProtまたはPDBhttp://www.rcsb.org/pdb/home/home.doにおいて見出すことができるような、供給源タンパク質および／またはそのドメインの特性の総合的なカタログ；ペプチドを含有する供給源タンパク質のドメインの性状を説明する特性、例えば、二次構造または三次構造（例えば、αヘリックス対βシート）；選択的スプライシング；他の別個の対象における、問題の新生抗原コード化ペプチドの供給源タンパク質由来のペプチドの提示の確率；ペプチドが、技術的偏りのために質量分析によって検出されないか、または過剰に表されるであろう確率；腫瘍細胞、間質、または腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の状態について情報を与える、RNASeqによって測定された際の、種々の遺伝子モジュール／経路の発現（ペプチドの供給源タンパク質を含有する必要はない）；腫瘍細胞における、新生抗原コード化ペプチドの供給源遺伝子のコピー数；ペプチドがTAPに結合する確率、または、測定されたかもしくは予測された、TAPに対するペプチドの結合親和性；（RNA-seq、プロテオーム質量分析、免疫組織化学によって測定され得る）腫瘍細胞におけるTAPの発現レベル；以下を含むがそれらに限定されない、腫瘍変異の有無：EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異、および抗原提示機構に関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOBHLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）におけるもの。その提示が、腫瘍において機能喪失変異の影響下にある抗原提示機構の構成要素に依拠するペプチドは、提示の確率が低減している；以下を含むがそれらに限定されない、機能的な生殖細胞系列多型の有無：抗原提示機構に関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOBHLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）におけるもの；腫瘍タイプ（例えば、NSCLC、黒色腫）；臨床的腫瘍サブタイプ（例えば、扁平上皮肺がん対非扁平上皮）；喫煙歴；任意でドライバー変異によって層別化される、関連性のある腫瘍タイプまたは臨床的サブタイプにおけるペプチドの供給源遺伝子の典型的な発現。
少なくとも1つの変異は、フレームシフトもしくは非フレームシフト挿入欠失、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ORFを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化であってもよい。
腫瘍細胞は、肺がん、黒色腫、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、胃がん、結腸がん、精巣がん、頭頸部がん、膵臓がん、脳がん、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、およびT細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺がん、および小細胞肺がんからなる群より選択されてもよい。
本明細書に開示する方法はまた、選択された新生抗原のセットまたはそのサブセットを含む腫瘍ワクチンを取得する工程も含み、任意で、腫瘍ワクチンを対象に投与する工程をさらに含む。
選択された新生抗原のセットにおける新生抗原の少なくとも1つは、ポリペプチド形態における場合、以下のうちの少なくとも1つを含んでもよい：1000nM未満のIC50値でのMHCとの結合親和性、MHCクラス1ポリペプチドについては8～15、8、9、10、11、12、13、14、または15アミノ酸の長さ、プロテアソーム切断を促進する、親タンパク質配列中のポリペプチド内またはその近くの配列モチーフの存在、および、TAP輸送を促進する配列モチーフの存在。
また、以下の工程を含む、腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上に提示される可能性が高い1つまたは複数の新生抗原を特定するためのモデルを生成するための方法も、本明細書に開示する：多数の試料に由来する主要組織適合性複合体（MHC）から溶出された多数の単離されたペプチドに関連するデータを含む、質量分析データを受け取る工程；試料中に存在する訓練ペプチド配列のセット、および各訓練ペプチド配列に関連する1つまたは複数のMHCを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程；訓練ペプチド配列を含む訓練データセットを用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、該提示モデルが、腫瘍細胞表面上の1つまたは複数のMHCアレルによって腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される多数の数値的尤度を提供する、工程。
提示モデルは、ペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸の存在と、特定の位置に特定のアミノ酸を含有するペプチド配列の、腫瘍細胞上のMHCアレルのうちの1つによる提示の尤度との間の依存性を表し得る。
試料はまた、単一のMHCクラスIまたはクラスIIアレルを発現するように操作された細胞株も含むことができる。
試料はまた、多数のMHCクラスIまたはクラスIIアレルを発現するように操作された細胞株も含むことができる。
試料はまた、多数の患者から取得されたか、または該患者に由来するヒト細胞株も含むことができる。
試料はまた、多数の患者から取得された新鮮なまたは凍結された腫瘍試料も含むことができる。
試料はまた、T細胞アッセイを用いて特定されたペプチドも含むことができる。
訓練データセットは、試料中に存在する訓練ペプチドのセットのペプチド存在量；試料における訓練ペプチドのセットのペプチド長に関連するデータをさらに含んでもよい。
本明細書に開示する方法はまた、公知のタンパク質配列のセットを含むデータベースに対するアラインメントを介して訓練ペプチド配列のセットを比較することによって、訓練ペプチド配列に基づいて、訓練ペプチド配列よりも長くかつそれらを含む訓練タンパク質配列のセットを取得することも含むことができる。
本明細書に開示する方法はまた、細胞株からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシーケンシングデータのうちの少なくとも1つを取得するために、細胞株に対して質量分析を行うかまたは質量分析が完了していることも含むことができ、該ヌクレオチドシーケンシングデータは、変異を含む少なくとも1つのタンパク質配列を含む。
本明細書に開示する方法はまた、ワン・ホットエンコーディングスキームを用いて訓練ペプチド配列をコード化することも含むことができる。
本明細書に開示する方法はまた、正常組織試料からエクソーム、トランスクリプトーム、および全ゲノムの正常ヌクレオチドシーケンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程；ならびに、該正常ヌクレオチドシーケンシングデータを用いて、提示モデルのパラメータのセットを訓練する工程も含むことができる。
訓練データセットは、試料に関連するプロテオーム配列に関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、試料に関連するMHCペプチドーム配列に関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、単離されたペプチドのうちの少なくとも1つについてのペプチド-MHC結合親和性測定値に関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、単離されたペプチドのうちの少なくとも1つについてのペプチド-MHC結合安定性測定値に関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、試料に関連するトランスクリプトームに関連するデータをさらに含んでもよい。
訓練データセットは、試料に関連するゲノムに関連するデータをさらに含んでもよい。
本明細書に開示する方法はまた、パラメータのセットのロジスティック回帰を行うことを含んでもよい。
訓練ペプチド配列は、kマー（kは、MHCクラスIについては8以上15以下、または、MHCクラスIIについては9以上30以下である）の範囲内の長さであってもよい。
本明細書に開示する方法はまた、左パディングワン・ホットエンコーディングスキームを用いて訓練ペプチド配列をコード化することを含んでもよい。
本明細書に開示する方法はまた、深層学習アルゴリズムを用いてパラメータのセットについて値を決定することを含んでもよい。
以下の工程を遂行することを含む、腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上に提示される可能性が高い1つまたは複数の新生抗原を特定するための方法を、本明細書に開示する：多数の新鮮なまたは凍結された腫瘍試料に由来する主要組織適合性複合体（MHC）から溶出された多数の単離されたペプチドに関連するデータを含む、質量分析データを受け取る工程；腫瘍試料中に存在し、かつ各訓練ペプチド配列に関連する1つまたは複数のMHCアレル上に提示される、訓練ペプチド配列のセットを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程；訓練ペプチド配列に基づいて、訓練タンパク質配列のセットを取得する工程；ならびに、訓練タンパク質配列および訓練ペプチド配列を用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、該提示モデルが、腫瘍細胞表面上の1つまたは複数のMHCアレルによって腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される多数の数値的尤度を提供する、工程。
提示モデルは、MHCアレルのうちの特定の1つとペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、該ペアのMHCアレルのうちの特定の1つによる、特定の位置に特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上の提示の尤度との間の依存性を表し得る。
本明細書に開示する方法はまた、新生抗原のサブセットを選択する工程であって、各々が、1つまたは複数の別個の腫瘍新生抗原と比べて、腫瘍の細胞表面上に提示される尤度が増大しているという理由から、該新生抗原のサブセットが選択される工程も含むことができる。
本明細書に開示する方法はまた、新生抗原のサブセットを選択する工程であって、各々が、1つまたは複数の別個の腫瘍新生抗原と比べて、対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大しているという理由から、該新生抗原のサブセットが選択される工程も含むことができる。
本明細書に開示する方法はまた、新生抗原のサブセットを選択する工程であって、各々が、1つまたは複数の別個の腫瘍新生抗原と比べて、プロフェッショナル抗原提示細胞（APC）によってナイーブT細胞に対して提示されることができる尤度が増大しているという理由から、該新生抗原のサブセットが選択され、任意で、該APCが樹状細胞（DC）である工程も含むことができる。
本明細書に開示する方法はまた、新生抗原のサブセットを選択する工程であって、各々が、1つまたは複数の別個の腫瘍新生抗原と比べて、中枢性寛容または末梢性寛容を介した阻害に供される尤度が減少しているという理由から、該新生抗原のサブセットが選択される工程も含むことができる。
本明細書に開示する方法はまた、新生抗原のサブセットを選択する工程であって、各々が、1つまたは複数の別個の腫瘍新生抗原と比べて、対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少しているという理由から、該新生抗原のサブセットが選択される工程も含むことができる。
本明細書に開示する方法はまた、新生抗原のサブセットを選択する工程であって、各々が、腫瘍細胞対APCにおいて差次的に翻訳後修飾されるであろう尤度が減少しているという理由から、該新生抗原のサブセットが選択され、任意で、該APCが樹状細胞（DC）である工程も含むことができる。
本明細書における方法の実施は、別の方法で指示されない限り、当技術分野の技能内の、タンパク質化学、生化学、組換えDNA技法、および薬理学の従来の方法を使用する。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition)；Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)；Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)；Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992)を参照されたい。
III. 新生抗原における腫瘍特異的変異の特定
また、ある特定の変異（例えば、がん細胞中に存在するバリアントまたはアレル）の特定のための方法も、本明細書に開示する。特に、これらの変異は、がんを有する対象のがん細胞のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、またはエクソーム中に存在し得るが、対象由来の正常組織には存在し得ない。
腫瘍における遺伝子変異は、それらが腫瘍において排他的にタンパク質のアミノ酸配列における変更をもたらす場合、腫瘍の免疫学的ターゲティングに有用と考えることができる。有用な変異は、以下を含む：（1）タンパク質において異なるアミノ酸をもたらす非同義変異；（2）C末端に新規の腫瘍特異的配列を有する、より長いタンパク質の翻訳をもたらす、終止コドンが修飾されているかまたは欠失しているリードスルー変異；（3）成熟mRNAにおけるイントロンの包含、したがって固有の腫瘍特異的タンパク質配列をもたらす、スプライス部位変異；（4）2種類のタンパク質の接合部に腫瘍特異的配列を有するキメラタンパク質を生じる、染色体再編成（すなわち、遺伝子融合）；（5）新規の腫瘍特異的タンパク質配列を有する新たなオープンリーディングフレームをもたらす、フレームシフト変異または欠失。変異はまた、非フレームシフト挿入欠失、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ORFを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化のうちの1つまたは複数も含むことができる。
例えば、腫瘍細胞におけるスプライス部位、フレームシフト、リードスルー、または遺伝子融合の変異から生じた、変異を有するペプチドまたは変異したポリペプチドは、腫瘍対正常細胞において、DNA、RNA、またはタンパク質をシーケンシングすることによって特定することができる。
また、変異は、以前に特定された腫瘍特異的変異を含むことができる。公知の腫瘍変異は、Catalogue of Somatic Mutations in Cancer（COSMIC）データベースで見出すことができる。
様々な方法を、個体のDNAまたはRNAにおいて特定の変異またはアレルの存在を検出するために利用可能である。この分野における進歩は、正確で、容易な、かつ安価な大規模SNP遺伝子型判定を提供している。例えば、動的アレル特異的ハイブリダイゼーション（DASH）、マイクロプレートアレイ対角線ゲル電気泳動（MADGE）、パイロシーケンシング、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、TaqManシステム、およびAffymetrix SNPチップなどの種々のDNA「チップ」技術を含むいくつかの技法が、記載されている。これらの方法は、典型的にはPCRによる、標的遺伝子領域の増幅を利用する。さらに他の方法は、侵襲性切断による小さなシグナル分子の生成およびその後の質量分析、または、固定化されたパッドロックプローブおよびローリングサークル増幅に基づく。特異的な変異を検出するための、当技術分野において公知の方法のいくつかを、下記に要約する。
PCRベースの検出手段は、多数のマーカーの多重増幅を同時に含むことができる。例えば、サイズがオーバーラップせず、同時に解析することができるPCR産物を生成するようにPCRプライマーを選択することが、当技術分野において周知である。あるいは、差次的にラベル化され、したがって、各々を差次的に検出することができるプライマーで異なるマーカーを増幅することが可能である。当然、ハイブリダイゼーションベースの検出手段により、試料における複数のPCR産物の差次的な検出が可能になる。複数のマーカーの多重解析を可能にする他の技法が、当技術分野において公知である。
いくつかの方法が、ゲノムDNAまたは細胞RNAにおける単一ヌクレオチド多型の解析を容易にするために開発されている。例えば、一塩基多型は、例えば、Mundy, C. R.（米国特許第4,656,127号）において開示されているような、特化されたエキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチドを用いることによって検出することができる。方法にしたがって、多型部位のすぐ3'のアレル配列に対して相補的なプライマーを、特定の動物またはヒトから取得された標的分子に対してハイブリダイズさせる。標的分子上の多型部位が、存在する特定のエキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチド誘導体に対して相補的であるヌクレオチドを含有する場合、その誘導体は、ハイブリダイズされたプライマーの末端上に組み込まれる。そのような組み込みのために、プライマーはエキソヌクレアーゼに対して抵抗性になり、それによりその検出が可能になる。試料のエキソヌクレアーゼ抵抗性誘導体の同一性は既知であるため、プライマーがエキソヌクレアーゼに対して抵抗性になったという知見により、標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドが、反応において使用されたヌクレオチド誘導体のものに対して相補的であることが明らかになる。この方法は、多量の外来性配列データの決定を必要としないという利点を有する。
多型部位のヌクレオチドの同一性を決定するために、溶液ベースの方法を使用することができる。Cohen, D. et al.（フランス国特許第2,650,840号；PCT出願第WO91/02087号）。米国特許第4,656,127号のMundyの方法におけるように、多型部位のすぐ3'のアレル配列に対して相補的であるプライマーを使用する。方法は、多型部位のヌクレオチドに対して相補的である場合は、プライマーの末端上に組み込まれるようになる、ラベル化ジデオキシヌクレオチド誘導体を用いて、その部位のヌクレオチドの同一性を決定する。
Genetic Bit AnalysisまたはGBAとして公知である代替的な方法が、Goelet, P. et al.（PCT出願第92/15712号）により記載されている。Goelet, P. et al.の方法は、ラベル化ターミネーターと、多型部位の3'の配列に対して相補的であるプライマーとの混合物を使用する。組み込まれるラベル化ターミネーターは、したがって、評定されている標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドによって決定され、かつそれに対して相補的である。Cohen et al.（フランス国特許第2,650,840号；PCT出願第WO91/02087号）の方法とは対照的に、Goelet, P. et al.の方法は、プライマーまたは標的分子が固相に固定化される、不均一相アッセイであることができる。
DNAにおいて多型部位をアッセイするための、いくつかのプライマーガイドヌクレオチド組み込み手順が、記載されている（Komher, J. S. et al., Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989)；Sokolov, B. P., Nucl. Acids Res. 18:3671 (1990)；Syvanen, A.-C., et al., Genomics 8:684-692 (1990)；Kuppuswamy, M. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1143-1147 (1991)；Prezant, T. R. et al., Hum. Mutat. 1:159-164 (1992)；Ugozzoli, L. et al., GATA 9:107-112 (1992)；Nyren, P. et al., Anal. Biochem. 208:171-175 (1993)）。これらの方法は、それらが、多型部位で塩基間を識別するためにラベル化デオキシヌクレオチドの組み込みを利用する点で、GBAとは異なる。そのような形式において、シグナルは、組み込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同じヌクレオチドのランにおいて起こる多型は、ランの長さに比例するシグナルを結果としてもたらすことができる（Syvanen, A.-C., et al., Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993)）。
数多くのイニシアティブは、DNAまたはRNAの何百万もの個々の分子から並行して直接、配列情報を取得する。リアルタイムの単一分子の合成によるシーケンシング技術は、シーケンシングされる鋳型に対して相補的であるDNAの新生鎖の中に組み込まれる際の、蛍光ヌクレオチドの検出に依拠する。1つの方法において、長さが30～50塩基のオリゴヌクレオチドを、ガラスのカバーガラスに、5'端で共有結合性に固着させる。これらの固着した鎖は、2つの機能を果たす。第1に、それらは、鋳型が、表面結合オリゴヌクレオチドに対して相補的な捕捉尾部を有して構成されている場合に、標的鋳型鎖の捕捉部位として作用する。それらはまた、配列読み取りの基礎を形成する、鋳型指向性プライマー伸長のためのプライマーとしても作用する。捕捉プライマーは、複数サイクルの合成、検出、および、色素を除去するための色素-リンカーの化学的切断を用いた、配列決定のための、固定された位置部位として機能する。各サイクルは、ポリメラーゼ／ラベル化ヌクレオチド混合物の添加、リンス、画像化、および色素の切断からなる。代替的な方法において、ポリメラーゼは、蛍光ドナー分子で修飾されてスライドガラス上に固定化され、他方、各ヌクレオチドは、γ-ホスファートに付着したアクセプター蛍光部分で色分けされている。ヌクレオチドが、新規の鎖の中に組み込まれるようになる際に、システムが、蛍光タグ付加されたポリメラーゼと蛍光修飾されたヌクレオチドとの間の相互作用を検出する。他の合成によるシーケンシング技術もまた、存在する。
任意の適している合成によるシーケンシングプラットフォームを、変異を特定するために使用することができる。上記のように、4種類の主要な合成によるシーケンシングプラットフォームを、現在利用可能である：Roche/454 Life Sciences由来のGenome Sequencer、Illumina/Solexa由来の1G Analyzer、Applied BioSystems由来のSOLiDシステム、およびHelicos Biosciences由来のHeliscopeシステム。合成によるシーケンシングプラットフォームはまた、Pacific BioSciencesおよびVisiGen Biotechnologiesによっても記載されている。いくつかの態様において、シーケンシングされる多数の核酸分子は、支持体（例えば、固体支持体）に結合している。核酸を支持体上に固定化するために、捕捉配列／万能プライミング部位を、鋳型の3'端および／または5'端に付加することができる。核酸は、支持体に共有結合性に付着した相補的配列に対して捕捉配列をハイブリダイズすることによって、支持体に結合させることができる。捕捉配列（万能捕捉配列とも呼ばれる）は、万能プライマーとして二重に働き得る、支持体に付着した配列に対して相補的な核酸配列である。
捕捉配列に対する代替物として、カップリングペア（例えば、抗体／抗原、受容体／リガンド、または、例えば米国特許出願第2006/0252077号に記載されているようなアビジン-ビオチンペアなど）のメンバーを、各断片に連結させて、そのカップリングペアのそれぞれの第2のメンバーでコーティングされた表面上に捕捉させることができる。
捕捉に続いて、配列を、例えば、鋳型依存性の合成によるシーケンシングを含む、例えば、実施例および米国特許第7,283,337号に記載されているような、単一分子検出／シーケンシングによって解析することができる。合成によるシーケンシングにおいて、表面に結合した分子は、ポリメラーゼの存在下で、多数のラベル化ヌクレオチド三リン酸に曝露される。鋳型の配列は、成長する鎖の3'端の中に組み込まれるラベル化ヌクレオチドの順序によって決定される。これは、リアルタイムで行うことができ、ステップ・アンド・リピートモードで行うことができる。リアルタイム解析のために、各ヌクレオチドに対して異なる光ラベルを組み込むことができ、複数のレーザーを、組み込まれたヌクレオチドの刺激のために利用することができる。
シーケンシングはまた、他の大規模並列処理シーケンシング、または次世代シーケンシング（NGS）技法およびプラットフォームも含むことができる。大規模並列処理シーケンシング技法およびプラットフォームの追加的な例は、Illumina HiSeqまたはMiSeq、Thermo PGMまたはProton、Pac Bio RS IIまたはSequel、QiagenのGene Reader、およびOxford Nanopore MinIONである。追加的な類似した現在の大規模並列処理シーケンシング技術、およびこれらの技術の将来世代を、使用することができる。
任意の細胞タイプまたは組織を利用して、本明細書に記載した方法における使用のための核酸試料を取得することができる。例えば、DNAまたはRNA試料を、腫瘍または体液、例えば、公知の技法（例えば、静脈穿刺）によって取得された血液、もしくは唾液から取得することができる。あるいは、核酸試験を、乾燥試料（例えば、髪または皮膚）に対して行うことができる。加えて、試料を、シーケンシングのために腫瘍から取得することができ、別の試料を、正常組織が腫瘍と同じ組織タイプのものである場合に、シーケンシングのために正常組織から取得することができる。試料を、シーケンシングのために腫瘍から取得することができ、別の試料を、正常試料が腫瘍とは別個の組織タイプのものである場合に、シーケンシングのために正常組織から取得することができる。
腫瘍は、肺がん、黒色腫、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、胃がん、結腸がん、精巣がん、頭頸部がん、膵臓がん、脳がん、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、およびT細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺がん、および小細胞肺がんのうちの1つまたは複数を含むことができる。
あるいは、タンパク質質量分析を使用して、腫瘍細胞上のMHCタンパク質に結合した変異したペプチドの存在を特定または実証することができる。ペプチドは、腫瘍細胞から、または腫瘍から免疫沈降させたHLA分子から酸溶出することができ、次いで、質量分析を用いて特定することができる。
IV. 新生抗原
新生抗原は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、新生抗原は、ポリペプチド配列をコードするRNA配列であることができる。ワクチンにおいて有用な新生抗原は、したがって、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を含むことができる。
本明細書に開示する方法によって特定された腫瘍特異的変異を含む単離されたペプチド、公知の腫瘍特異的変異を含むペプチド、および、本明細書に開示する方法によって特定された変異ポリペプチドまたはその断片を、本明細書に開示する。新生抗原ペプチドは、新生抗原が関連するポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、DNAまたはRNA）を含む場合に、それらのコード配列の文脈において記載することができる。
新生抗原ヌクレオチド配列によってコードされる1つまたは複数のポリペプチドは、以下のうちの少なくとも1つを含むことができる：1000nM未満のIC50値でのMHCとの結合親和性、MHCクラス1ペプチドについては8～15、8、9、10、11、12、13、14、または15アミノ酸の長さ、プロテアソーム切断を促進するペプチド内またはその近くの配列モチーフの存在、および、TAP輸送を促進する配列モチーフの存在。
1つまたは複数の新生抗原は、腫瘍の表面上に存在することができる。
1つまたは複数の新生抗原は、腫瘍を有する対象において免疫原性であることができ、例えば、対象においてT細胞応答またはB細胞応答を惹起することができ得る。
対象において自己免疫応答を誘導する1つまたは複数の新生抗原は、腫瘍を有する対象のためのワクチン生成の文脈において、考察から排除することができる。
少なくとも1つの新生抗原性ペプチド分子のサイズは、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120、またはそれよりも多いアミノ分子残基、およびそれらに由来し得る任意の範囲を含むことができるが、それらに限定されない。具体的な態様において、新生抗原性ペプチド分子は、50アミノ酸以下である。
新生抗原性ペプチドおよびポリペプチドは、MHCクラスIについては長さが15残基以下で、通常約8～約11残基の間からなり、特に9または10残基であることができ；MHCクラスIIについては、15～24残基であることができる。
望ましい場合、より長いペプチドを、いくつかのやり方において設計することができる。1つの例において、HLAアレル上のペプチドの提示尤度が予測されるかまたは公知である場合、より長いペプチドは、（1）各々の対応する遺伝子産物のN末端およびC末端に向かって2～5アミノ酸の伸長を有する個々の提示されるペプチド；（2）各々について伸長した配列を有する、提示されるペプチドのいくつかまたはすべての連鎖のいずれかからなることができる。別の例において、シーケンシングにより、腫瘍中に存在する長い（10残基より長い）新生エピトープ配列（例えば、新規のペプチド配列をもたらすフレームシフト、リードスルー、またはイントロンの包含による）が明らかになる場合、より長いペプチドは、（3）新規の腫瘍特異的アミノ酸のストレッチ全体からなることになり、したがって、最強のHLAに提示されるより短いペプチドの計算的なまたはインビトロ試験ベースの選択の必要を回避する。両方の例において、より長いペプチドの使用によって、患者細胞による内因性のプロセシングが可能になり、より有効な抗原提示およびT細胞応答の誘導がもたらされ得る。
新生抗原性ペプチドおよびポリペプチドは、HLAタンパク質上に提示されることができる。いくつかの局面において、新生抗原性ペプチドおよびポリペプチドは、野生型ペプチドよりも強い親和性でHLAタンパク質上に提示される。いくつかの局面において、新生抗原性ペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも5000 nM未満、少なくとも1000 nM未満、少なくとも500 nM未満、少なくとも250 nM未満、少なくとも200 nM未満、少なくとも150 nM未満、少なくとも100 nM未満、少なくとも50 nM未満、またはそれよりも小さいIC50を有することができる。
いくつかの局面において、新生抗原性ペプチドおよびポリペプチドは、対象に投与された場合に、自己免疫応答を誘導せず、かつ／または免疫寛容を引き起こさない。
また、少なくとも2種類以上の新生抗原性ペプチドを含む組成物も提供する。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも2種類の別個のペプチドを含有する。少なくとも2種類の別個のペプチドは、同じポリペプチドに由来することができる。別個のポリペプチドによっては、ペプチドが、長さ、アミノ酸配列、またはその両方により異なることが意味される。ペプチドは、腫瘍特異的変異を含有することが公知であるか、または見出されている任意のポリペプチドに由来する。新生抗原性ペプチドが由来することができる、適しているポリペプチドは、例えば、COSMICデータベースにおいて見出すことができる。COSMICは、ヒトがんにおける体細胞性変異についての総合的な情報の管理者を務める。ペプチドは、腫瘍特異的変異を含有する。いくつかの局面において、腫瘍特異的変異は、特定のがんタイプについてのドライバー変異である。
望ましい活性または性状を有する新生抗原性ペプチドおよびポリペプチドは、ある特定の望ましい属性、例えば、望ましいMHC分子に結合し、適切なT細胞を活性化する、無修飾ペプチドの生物学的活性の実質的にすべてを増大しながらまたは少なくとも保持しながら、改善された薬理学的特徴を提供するように修飾することができる。例として、新生抗原性ペプチドおよびポリペプチドを、保存的または非保存的のいずれかの置換などの、種々の変更に供することができ、そのような変更は、改善されたMHC結合、安定性、または提示などの、それらの使用におけるある特定の利点を提供し得る。保存的置換によっては、アミノ酸残基を、生物学的および／または化学的に類似している別のもので、例えば、1つの疎水性残基を別の疎水性残基、または1つの極性残基を別の極性残基で置き換えることが意味される。置換は、Gly、Ala；Val、Ile、Leu、Met；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；およびPhe、Tyrなどの組み合わせを含む。単一アミノ酸置換の効果はまた、D-アミノ酸を用いて探査してもよい。そのような修飾は、例えば、Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany & Merrifield, The Peptides, Gross & Meienhofer, eds. (N.Y., Academic Press), pp. 1-284 (1979)；およびStewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, Ill., Pierce), 2d Ed. (1984)に記載されているように、周知のペプチド合成手順を用いて行うことができる。
種々のアミノ酸模倣物または非天然アミノ酸でのペプチドおよびポリペプチドの修飾は、インビボでのペプチドおよびポリペプチドの安定性の増大に特に有用である場合がある。安定性は、数多くのやり方でアッセイすることができる。例として、ペプチダーゼ、ならびに、ヒト血漿および血清などの種々の生物学的媒質が、安定性を試験するために使用されている。例えば、Verhoef et al., Eur. J. Drug Metab Pharmacokin. 11:291-302 (1986)を参照されたい。ペプチドの半減期は、25％ヒト血清（v/v）アッセイを用いて好都合に決定することができる。プロトコールは、概して以下のようである。プールしたヒト血清（タイプAB、非熱不活性化）を、使用前に遠心分離によって脱脂する。次いで、血清を、RPMI組織培養培地で25％に希釈し、ペプチド安定性を試験するために使用する。あらかじめ決定された時間間隔で、少量の反応溶液を取り出して、6％水性トリクロロ酢酸またはエタノールのいずれかに添加する。濁った反応試料を15分間冷却（4℃）し、次いで、スピンして沈降血清タンパク質を沈殿させる。次いで、ペプチドの存在を、安定性特異的クロマトグラフィー条件を用いた逆相HPLCによって決定する。
ペプチドおよびポリペプチドを、改善された血清半減期以外の望ましい属性を提供するために修飾することができる。例として、CTL活性を誘導するペプチドの能力を、Tヘルパー細胞応答を誘導することができる少なくとも1つのエピトープを含有する配列への連結によって増強することができる。免疫原性ペプチド／Tヘルパーコンジュゲートは、スペーサー分子によって連結することができる。スペーサーは、典型的には、生理学的条件下で実質的に無電荷である、アミノ酸またはアミノ酸模倣物などの相対的に小さな中性分子から構成される。スペーサーは、典型的には、例えば、Ala、Gly、または、非極性アミノ酸もしくは中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意で存在するスペーサーは、同じ残基から構成される必要はなく、したがって、ヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーであり得ることが、理解されるであろう。存在する場合、スペーサーは、通常、少なくとも1または2残基、より通常は、3～6残基であろう。あるいは、ペプチドを、スペーサーなしでTヘルパーペプチドに連結することができる。
新生抗原性ペプチドは、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、直接またはスペーサーを介してのいずれかでTヘルパーペプチドに連結することができる。新生抗原性ペプチドまたはTヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端を、アシル化することができる。例示的なTヘルパーペプチドは、破傷風トキソイド830-843、インフルエンザ307-319、マラリアスポロゾイト周囲382-398および378-389を含む。
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技法を通したタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの発現、天然供給源からのタンパク質もしくはペプチドの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に公知の任意の技法によって作製することができる。種々の遺伝子に対応する、ヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの配列は、以前に開示されており、当業者に公知のコンピュータ処理されたデータベースで見出すことができる。1つのそのようなデータベースは、National Institutes of Healthのウェブサイトに位置する、National Center for Biotechnology InformationのGenbankおよびGenPeptデータベースである。公知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示する技法を用いて、または当業者に公知であるように、増幅および／または発現することができる。あるいは、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドの種々の商業的調製物が、当業者に公知である。
さらなる局面において、新生抗原は、新生抗原性ペプチドまたはその一部をコードする核酸（例えば、ポリヌクレオチド）を含む。ポリヌクレオチドは、例えば、DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA（例えば、mRNA）、例えば、ホスホロチオアートバックボーンを有するポリヌクレオチドなどの、ポリヌクレオチドの一本鎖および／もしくは二本鎖、または天然形態もしくは安定化形態のいずれか、または、それらの組み合わせであることができ、イントロンを含有してもよく、または含有しなくてもよい。またさらなる局面は、ポリペプチドまたはその一部を発現することができる発現ベクターを提供する。様々な細胞タイプ用の発現ベクターが、当技術分野において周知であり、過度の実験なしで選択することができる。概して、DNAを、プラスミドなどの発現ベクター中に、発現のための適正な方向および正確なリーディングフレームで挿入する。必要な場合は、DNAを、望ましい宿主によって認識される適切な転写および翻訳調節性制御ヌクレオチド配列に連結することができるが、そのような制御は、概して発現ベクターにおいて利用可能である。次いで、ベクターを、標準的な技法を通して宿主中に導入する。手引きは、例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.において見出すことができる。
IV. ワクチン組成物
また、特異的な免疫応答、例えば、腫瘍特異的な免疫応答を生じることができる免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物も、本明細書に開示する。ワクチン組成物は、典型的に、例えば、本明細書に記載した方法を用いて選択された多数の新生抗原を含む。ワクチン組成物はまた、ワクチンと呼ぶこともできる。
ワクチンは、1～30種類のペプチド、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30種類の異なるペプチド、6、7、8、9、10、11、12、13、もしくは14種類の異なるペプチド、または12、13、もしくは14種類の異なるペプチドを含有することができる。ペプチドは、翻訳後修飾を含むことができる。ワクチンは、1～100種類もしくはそれよりも多いヌクレオチド配列、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100種類もしくはそれよりも多い異なるヌクレオチド配列、6、7、8、9、10、11、12、13、もしくは14種類の異なるヌクレオチド配列、または12、13、もしくは14種類の異なるヌクレオチド配列を含有することができる。ワクチンは、1～30種類の新生抗原配列、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100種類もしくはそれよりも多い異なる新生抗原配列、6、7、8、9、10、11、12、13、もしくは14種類の異なる新生抗原配列、または12、13、もしくは14種類の異なる新生抗原配列を含有することができる。
1つの態様において、異なるペプチドおよび／もしくはポリペプチド、またはそれらをコードするヌクレオチド配列は、ペプチドおよび／またはポリペプチドが、異なるMHCクラスI分子などの異なるMHC分子と結合することができるように選択される。いくつかの局面において、1つのワクチン組成物は、最も頻繁に存在するMHCクラスI分子と結合することができるペプチドおよび／またはポリペプチドのコード配列を含む。したがって、ワクチン組成物は、少なくとも2種類の好ましい、少なくとも3種類の好ましい、または少なくとも4種類の好ましいMHCクラスI分子と結合することができる異なる断片を含むことができる。
ワクチン組成物は、特異的な細胞傷害性T細胞応答、および／または特異的なヘルパーT細胞応答を生じることができる。
ワクチン組成物は、アジュバントおよび／または担体をさらに含むことができる。有用なアジュバントおよび担体の例を、本明細書の下記に示す。組成物は、例えば、タンパク質などの担体、または、例えば、T細胞に対してペプチドを提示することができる樹状細胞（DC）などの抗原提示細胞と結合することができる。
アジュバントは、ワクチン組成物中へのその混合が、新生抗原に対する免疫応答を増大させるか、または別の方法で修飾する任意の物質である。担体は、新生抗原がそれに結合することができる足場構造、例えば、ポリペプチドまたは多糖であることができる。任意で、アジュバントは、共有結合性または非共有結合性にコンジュゲートされる。
抗原に対する免疫応答を増大させるアジュバントの能力は、典型的に、免疫媒介性反応の有意なもしくは実質的な増大、または疾患症候の低減によって明示される。例えば、体液性免疫の増大は、典型的に、抗原に対して生じた抗体の力価の有意な増大によって明示され、T細胞活性の増大は、典型的に、細胞増殖、または細胞性細胞傷害、またはサイトカイン分泌の増大において明示される。アジュバントはまた、例えば、主として体液性またはTh応答を、主として細胞性またはTh応答へと変更することによって、免疫応答を変化させ得る。
適しているアジュバントは、1018 ISS、アラム、アルミニウム塩、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、イミキモド、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、モノホスホリル脂質A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTelベクターシステム、PLGマイクロ粒子、レシキモド、SRL172、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、YF-17D、VEGFトラップ、R848、β-グルカン、Pam3Cys、サポニンに由来するAquila's QS21 stimulon（Aquila Biotech、Worcester、Mass.、USA）、マイコバクテリア抽出物および合成細菌細胞壁模倣物、およびRibi's Detox. QuilまたはSuperfosなどの他の専売アジュバントを含むが、それらに限定されない。不完全フロインドまたはGM-CSFなどのアジュバントが、有用である。樹状細胞に特異的ないくつかの免疫学的アジュバント（例えば、MF59）およびそれらの調製物が、以前に記載されている（Dupuis M, et al., Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27；Allison A C; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11）。また、サイトカインを使用することもできる。いくつかのサイトカインは、リンパ組織に対する樹状細胞の遊走への影響（例えば、TNF-α）、Tリンパ球に対する効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟の加速化（例えば、GM-CSF、IL-1、およびIL-4）（具体的にその全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,849,589号）、および免疫アジュバントとしての作用（例えば、IL-12）に直接結び付けられている（Gabrilovich D I, et al., J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418）。
CpG免疫刺激性オリゴヌクレオチドもまた、ワクチン設定においてアジュバントの効果を増強することが報告されている。TLR 7、TLR 8、および／またはTLR 9に結合するRNAなどの他のTLR結合分子がまた、使用されてもよい。
有用なアジュバントの他の例は、化学的に修飾されたCpG（例えば、CpR、Idera）、Poly(I:C)（例えば、polyi:CI2U）、非CpG細菌DNAまたはRNA、ならびに、治療的におよび／またはアジュバントとして作用し得る、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、celebrex、NCX-4016、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフィニブ、XL-999、CP-547632、パゾパニブ、ZD2171、AZD2171、イピリムマブ、トレメリムマブ、およびSC58175などの免疫活性小分子および抗体を含むが、それらに限定されない。アジュバントおよび添加物の量および濃度は、当業者が過度の実験なしで容易に決定することができる。追加的なアジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF、サルグラモスチム）などのコロニー刺激因子を含む。
ワクチン組成物は、1種類よりも多い異なるアジュバントを含むことができる。さらに、治療用組成物は、上記の任意またはそれらの組み合わせを含む、任意のアジュバント物質を含むことができる。ワクチンおよびアジュバントを、任意の適切な配列において、一緒にまたは別々に投与できることもまた、企図される。
担体（または賦形剤）は、アジュバントから独立して存在することができる。担体の機能は、例えば、活性または免疫原性を増大させるため、安定性を与えるため、生物学的活性を増大させるため、または血清半減期を増大させるために、特に変異体の分子量を増大させることであり得る。さらに、担体は、T細胞に対してペプチドを提示するのを助けることができる。担体は、当業者に公知の任意の適している担体、例えば、タンパク質または抗原提示細胞であることができる。担体タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、トランスフェリンなどの血清タンパク質、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、サイログロブリンもしくはオボアルブミン、免疫グロブリン、またはインスリンなどのホルモン、またはパルミチン酸であることができるが、それらに限定されない。ヒトの免疫化のためには、担体は概して、ヒトに許容されかつ安全な、生理学的に許容される担体である。しかし、破傷風トキソイドおよび／またはジフテリアトキソイドは、適している担体である。あるいは、担体は、デキストラン、例えばセファロースであることができる。
細胞傷害性T細胞（CTL）は、無傷の外来抗原自体よりも、MHC分子に結合したペプチドの形態において抗原を認識する。MHC分子自体は、抗原提示細胞の細胞表面に位置する。したがって、CTLの活性化は、ペプチド抗原、MHC分子、およびAPCの三量体複合体が存在する場合に可能である。対応して、ペプチドがCTLの活性化のために使用される場合だけではなく、追加的にそれぞれのMHC分子を有するAPCが添加される場合に、それは免疫応答を増強し得る。したがって、いくつかの態様において、ワクチン組成物は、追加的に、少なくとも1つの抗原提示細胞を含有する。
新生抗原はまた、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Tatsis et al., Adenoviruses, Molecular Therapy (2004) 10, 616-629を参照されたい）、または、第2、第3、もしくはハイブリッド第2／第3世代のレンチウイルス、および特異的な細胞タイプもしくは受容体を標的とするように設計された任意の世代の組換えレンチウイルスを含むがそれらに限定されないレンチウイルス（例えば、Hu et al., Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infectious Diseases, Immunol Rev. (2011) 239(1): 45-61、Sakuma et al., Lentiviral vectors: basic to translational, Biochem J. (2012) 443(3):603-18、Cooper et al., Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter, Nucl. Acids Res. (2015) 43 (1): 682-690、Zufferey et al., Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In Vivo Gene Delivery, J. Virol. (1998) 72 (12): 9873-9880を参照されたい）などの、ウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームに含めることもできる。上述のウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームのパッケージング能力に依存して、このアプローチは、1つまたは複数の新生抗原ペプチドをコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列を送達することができる。配列は、非変異配列が隣接していてもよく、リンカーによって分離されていてもよく、または、細胞内区画を標的とする1つもしくは複数の配列が先行していてもよい（例えば、Gros et al., Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients, Nat Med. (2016) 22 (4):433-8、Stronen et al., Targeting of cancer neoantigens with donor-derived T cell receptor repertoires, Science. (2016) 352 (6291):1337-41、Lu et al., Efficient identification of mutated cancer antigens recognized by T cells associated with durable tumor regressions, Clin Cancer Res. (2014) 20( 13):3401-10を参照されたい）。宿主中への導入時に、感染した細胞は、新生抗原を発現し、それにより、ペプチドに対する宿主免疫（例えば、CTL）応答を惹起する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば、米国特許第4,722,848号に記載されている。別のベクターは、BCG（カルメット・ゲラン桿菌）である。BCGベクターは、Stover et al. (Nature 351:456-460 (1991))に記載されている。新生抗原の治療的投与または免疫化に有用な、多種多様の他のワクチンベクター、例えば、チフス菌（Salmonella typhi）ベクターなどが、本明細書における記載から当業者に明らかであろう。
IV.A. ワクチン設計および製造についての追加的な考察
IV.A.1. すべての腫瘍サブクローンをカバーするペプチドのセットの決定
すべてのまたは大部分の腫瘍サブクローンによって提示されるものを意味するトランカルペプチド（truncal peptide）が、ワクチン中への包含について優先される53。任意で、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドがない場合、または、高い確率で提示されかつ免疫原性であることが予測されるトランカルペプチドの数が、追加的な非トランカルペプチドをワクチンに含めることができるほど少ない場合には、腫瘍サブクローンの数および同一性を推定すること、およびワクチンによってカバーされる腫瘍サブクローンの数を最大化するようにペプチドを選ぶことによって、さらなるペプチドを優先順位付けすることができる54。
IV.A.2. 新生抗原の優先順位決定
上記の新生抗原フィルターのすべてを適用した後、ワクチン技術が対応できるよりも多くの候補新生抗原が、依然としてワクチン包含に利用可能である可能性がある。追加的に、新生抗原解析の種々の局面についての不確定度が残っている可能性があり、候補ワクチン新生抗原の様々な性状の間に妥協が存在する可能性がある。したがって、選択プロセスの各段階でのあらかじめ決定されたフィルターの代わりに、少なくとも以下の軸を有する空間に候補新生抗原を置き、積分アプローチを用いて選択を最適化する、積分多次元モデルを考えることができる。
1. 自己免疫または寛容のリスク（生殖細胞系列のリスク）（より低い自己免疫のリスクが、典型的に好ましい）
2. シーケンシングアーチファクトの確率（より低いアーチファクトの確率が、典型的に好ましい）
3. 免疫原性の確率（より高い免疫原性の確率が、典型的に好ましい）
4. 提示の確率（より高い提示の確率が、典型的に好ましい）
5. 遺伝子発現（より高い発現が、典型的に好ましい）
6. HLA遺伝子のカバレッジ（新生抗原のセットの提示に関与する、より多い数のHLA分子は、腫瘍が、HLA分子の下方制御または変異を介して免疫攻撃を逃避するであろう確率を低くする可能性がある）
V. 治療法および製造法
また、本明細書に開示する方法を用いて特定された多数の新生抗原などの1つまたは複数の新生抗原を対象に投与する工程により、対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導する、腫瘍に対するワクチン接種をする、対象においてがんの症候を処置する、およびまたは緩和する方法も、提供する。
いくつかの局面において、対象は、がんと診断されているか、またはがんを発症するリスクにある。対象は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、または、腫瘍特異的な免疫応答が望ましい任意の動物であることができる。腫瘍は、乳、卵巣、前立腺、肺、腎臓、胃、結腸、精巣、頭頸部、膵臓、脳、黒色腫、および他の組織器官の腫瘍などの、任意の固形腫瘍、ならびに、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、T細胞リンパ球性白血病、およびB細胞リンパ腫を含むリンパ腫および白血病などの、血液腫瘍であることができる。
新生抗原は、CTL応答を誘導するのに十分な量で投与することができる。
新生抗原は、単独で、または他の治療用物質との組み合わせで投与することができる。治療用物質は、例えば、化学療法剤、放射線、または免疫療法である。特定のがんのための任意の適している治療的処置を、施すことができる。
加えて、対象に、チェックポイント阻害因子などの抗免疫抑制性／免疫刺激性物質をさらに投与することができる。例えば、対象に、抗CTLA抗体または抗PD-1または抗PD-L1をさらに投与することができる。抗体によるCTLA-4またはPD-L1の遮断は、患者においてがん性細胞に対する免疫応答を増強することができる。特に、CTLA-4遮断は、ワクチン接種プロトコールを採用した場合に有効であることが示されている。
ワクチン組成物に含まれるべき各新生抗原の最適量、および最適投薬レジメンを、決定することができる。例えば、新生抗原またはそのバリアントは、静脈内（i.v.）注射、皮下（s.c.）注射、皮内（i.d.）注射、腹腔内（i.p.）注射、筋肉内（i.m.）注射のために調製することができる。注射の方法は、s.c.、i.d.、i.p.、i.m.、およびi.v.を含む。DNAまたはRNA注射の方法は、i.d.、i.m.、s.c.、i.p.、およびi.v.を含む。ワクチン組成物の投与の他の方法は、当業者に公知である。
ワクチンは、組成物中に存在する新生抗原の選択、数、および／または量が、組織、がん、および／または患者に特異的であるように編集することができる。例として、ペプチドの厳密な選択は、所定の組織における親タンパク質の発現パターンによって手引きされ得る。選択は、がんの特異的なタイプ、疾患の状態、より早期の処置レジメン、患者の免疫状態、および当然、患者のHLAハロタイプに依存し得る。さらに、ワクチンは、特定の患者の個人的な必要にしたがって、個別化された構成要素を含有することができる。例は、特定の患者における新生抗原の発現にしたがって新生抗原の選択を変えること、または、処置の第1のラウンドまたはスキームの後の二次的処置についての調整を含む。
がんのためのワクチンとして使用されるべき組成物について、正常組織において多量に発現している類似した正常な自己ペプチドを有する新生抗原は、本明細書に記載した組成物において、避けられるか、または少量で存在することができる。他方で、患者の腫瘍が、多量のある特定の新生抗原を発現することが公知である場合、このがんの処置のためのそれぞれの薬学的組成物は、多量に存在することができ、かつ／または、この特定の新生抗原もしくはこの新生抗原の経路に特異的な1種類よりも多い新生抗原を含めることができる。
新生抗原を含む組成物を、既にがんを患っている個体に投与することができる。治療的適用において、組成物は、腫瘍抗原に対する有効なCTL応答を惹起し、かつ、症候および／または合併症を治癒するかまたは少なくとも部分的に停止するのに十分な量で、患者に投与される。これを達成するのに妥当な量を、「治療的有効用量」として定義する。この用途のために有効な量は、例えば、組成物、投与の様式、処置される疾患の病期および重症度、患者の体重および健康の全身状態、ならびに処方医の判断に依存するであろう。組成物は、概して、重篤な疾患状態、すなわち、命を脅かすか、または潜在的に命を脅かす状況、特にがんが転移している場合に使用できることを、心に留めるべきである。そのような例において、外来性物質の最小化、および新生抗原の相対的な非毒性の性質を考慮して、実質的過剰量のこれらの組成物を投与することが、可能であり、かつ処置する医師が望ましいと感じることができる。
治療的用途のために、投与は、腫瘍の検出または外科的除去時に始めることができる。これに、少なくとも症候が実質的に減ずるまで、およびその後ある期間にわたって、ブースト用量が続く。
治療的処置のための薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）は、非経口、局部、経鼻、経口、または局所投与について意図される。薬学的組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内に投与することができる。組成物は、腫瘍に対する局所免疫応答を誘導するために、外科的切除の部位に投与することができる。新生抗原の溶液を含む非経口投与用の組成物を、本明細書に開示し、ワクチン組成物は、許容される担体、例えば、水性担体に溶解または懸濁される。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、0.9％食塩水、0.3％グリシン、ヒアルロン酸などを使用することができる。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌することができ、または滅菌濾過することができる。結果として生じた水溶液を、そのままで使用のためにパッケージングするか、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液と組み合わされる。組成物は、pH調整剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミンオレアートなどのような、生理学的条件に近づけるために必要とされる、薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。
新生抗原はまた、それらをリンパ組織などの特定の細胞組織にターゲティングする、リポソームを介して投与することもできる。リポソームはまた、半減期を増大させるのにも有用である。リポソームは、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、ラメラ層などを含む。これらの調製物において、送達されるべき新生抗原は、単独で、または、CD45抗原に結合するモノクローナル抗体などの、例えば、リンパ系細胞の間で優性な受容体に結合する分子、または他の治療用組成物もしくは免疫原性組成物と共に、リポソームの一部として組み込まれる。したがって、所望の新生抗原で満たされたリポソームは、リンパ系細胞の部位へ方向付けられることができ、そこで、リポソームは次いで、選択された治療用／免疫原性組成物を送達する。リポソームは、概して、中性および負電荷を有するリン脂質、およびコレステロールなどのステロールを含む、標準的な小胞形成脂質から形成され得る。脂質の選択は、概して、例えば、リポソームサイズ、酸不安定性、および血流におけるリポソームの安定性の考慮により手引きされる。例えば、Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9; 467 (1980)、米国特許第4,235,871号、第4,501,728号、第4,501,728号、第4,837,028号、および第5,019,369号に記載されているように、様々な方法を、リポソームを調製するために利用可能である。
免疫細胞へのターゲティングのために、リポソーム中に組み込まれるべきリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはその断片を含むことができる。リポソーム懸濁液は、とりわけ、投与の様式、送達されるペプチド、および処置される疾患の病期にしたがって変動する用量で、静脈内、局所、局部などに投与することができる。
治療目的または免疫化目的で、本明細書に記載したペプチド、および任意でペプチドの1つまたは複数をコードする核酸をまた、患者に投与することもできる。数多くの方法が、核酸を患者に送達するために好都合に使用される。例として、核酸を、「裸のDNA」として直接送達することができる。このアプローチは、例として、Wolff et al., Science 247: 1465-1468 (1990)、ならびに米国特許第5,580,859号および第5,589,466号に記載されている。核酸はまた、例として、米国特許第5,204,253号に記載されているような弾道送達を用いて投与することもできる。単にDNAからなる粒子を、投与することができる。あるいは、DNAを、金粒子などの粒子に接着させることができる。核酸配列を送達するためのアプローチは、エレクトロポレーションを伴うかまたは伴わない、ウイルスベクター、mRNAベクター、およびDNAベクターを含むことができる。
核酸はまた、カチオン性脂質などのカチオン性化合物に複合体化させて送達することもできる。脂質媒介性遺伝子送達法は、例として、9618372WOAWO 96/18372；9324640WOAWO 93/24640；Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682-691 (1988);米国特許第5,279,833号 Rose、米国特許第5,279,833号；9106309WOAWO 91/06309；およびFelgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414 (1987)に記載されている。
新生抗原はまた、ワクシニア、鶏痘、自己複製アルファウイルス、マラバウイルス、アデノウイルス（例えば、Tatsis et al., Adenoviruses, Molecular Therapy (2004) 10, 616-629を参照されたい）、または、第2、第3、もしくはハイブリッド第2／第3世代のレンチウイルス、および特異的な細胞タイプもしくは受容体を標的とするように設計された任意の世代の組換えレンチウイルスを含むがそれらに限定されないレンチウイルス（例えば、Hu et al., Immunization Delivered by Lentiviral Vectors for Cancer and Infectious Diseases, Immunol Rev. (2011) 239(1): 45-61、Sakuma et al., Lentiviral vectors: basic to translational, Biochem J. (2012) 443(3):603-18、Cooper et al., Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter, Nucl. Acids Res. (2015) 43 (1): 682-690、Zufferey et al., Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In Vivo Gene Delivery, J. Virol. (1998) 72 (12): 9873-9880を参照されたい）などの、ウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームに含めることもできる。上述のウイルスベクターベースのワクチンプラットフォームのパッケージング能力に依存して、このアプローチは、1つまたは複数の新生抗原ペプチドをコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列を送達することができる。配列は、非変異配列が隣接していてもよく、リンカーによって分離されていてもよく、または、細胞内区画を標的とする1つもしくは複数の配列が先行していてもよい（例えば、Gros et al., Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients, Nat Med. (2016) 22 (4):433-8、Stronen et al., Targeting of cancer neoantigens with donor-derived T cell receptor repertoires, Science. (2016) 352 (6291):1337-41、Lu et al., Efficient identification of mutated cancer antigens recognized by T cells associated with durable tumor regressions, Clin Cancer Res. (2014) 20( 13):3401-10を参照されたい）。宿主中への導入時に、感染した細胞は、新生抗原を発現し、それにより、ペプチドに対する宿主免疫（例えば、CTL）応答を惹起する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば、米国特許第4,722,848号に記載されている。別のベクターは、BCG（カルメット・ゲラン桿菌）である。BCGベクターは、Stover et al. (Nature 351:456-460 (1991))に記載されている。新生抗原の治療的投与または免疫化に有用な、多種多様の他のワクチンベクター、例えば、チフス菌ベクターなどが、本明細書における記載から当業者に明らかであろう。
核酸を投与する手段は、1つまたは複数のエピトープをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。ヒト細胞における発現のための、選択されたCTLエピトープをコードするDNA配列（ミニ遺伝子）を作製するために、エピトープのアミノ酸配列を逆翻訳する。各アミノ酸に対するコドン選択を手引きするために、ヒトコドン使用頻度表を使用する。これらのエピトープをコードするDNA配列を、直接隣り合わせて、連続的なポリペプチド配列を作製する。発現および／または免疫原性を最適化するために、追加の要素を、ミニ遺伝子設計中に組み入れることができる。逆翻訳して、ミニ遺伝子配列に含めることができるアミノ酸配列の例は、ヘルパーTリンパ球エピトープ、リーダー（シグナル）配列、および小胞体保持シグナルを含む。加えて、CTLエピトープのMHC提示は、CTLエピトープに近接した合成の（例えば、ポリアラニン）または天然に存在する隣接配列を含むことによって、改善することができる。ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖およびマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドをアセンブルすることによって、DNAに変換される。オーバーラップするオリゴヌクレオチド（30～100塩基長）を、周知の技法を用いて適切な条件下で、合成し、リン酸化し、精製し、アニーリングする。オリゴヌクレオチドの端は、T4 DNAリガーゼを用いて連結する。CTLエピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子を、次いで、望ましい発現ベクター中にクローニングすることができる。
精製プラスミドDNAは、様々な製剤を用いて、注射のために調製することができる。これらのうちでもっとも単純なものは、滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）における凍結乾燥DNAの再構成である。様々な方法が記載されており、新たな技法が利用可能になり得る。上記で言及したように、核酸は、カチオン性脂質で好都合に製剤化される。加えて、糖脂質、融合性リポソーム、ペプチド、および保護的、相互作用的、非縮合性（PINC）と集合的に呼ばれる化合物もまた、精製プラスミドDNAと複合体化させて、安定性、筋肉内分散、または特異的な器官もしくは細胞タイプへの輸送などの変数に影響を及ぼすことができる。
また、本明細書に開示する方法の工程を行うこと；および、多数の新生抗原または多数の新生抗原のサブセットを含む腫瘍ワクチンを生産する工程を含む、腫瘍ワクチンを製造する方法も、本明細書に開示する。
本明細書に開示する新生抗原は、当技術分野において公知の方法を用いて製造することができる。例えば、本明細書に開示する新生抗原またはベクター（例えば、1つまたは複数の新生抗原をコードする少なくとも1つの配列を含むベクター）を生産する方法は、新生抗原またはベクターを発現するのに適している条件下で宿主細胞を培養する工程であって、該宿主細胞が、新生抗原またはベクターをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む工程、および、新生抗原またはベクターを精製する工程を含むことができる。標準的な精製法は、クロマトグラフィー技法、電気泳動技法、免疫学的技法、沈降技法、透析技法、濾過技法、濃縮技法、およびクロマトフォーカシング技法を含む。
宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、NS0細胞、酵母、またはHEK293細胞を含むことができる。宿主細胞は、本明細書に開示する新生抗原またはベクターをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む、1つまたは複数のポリヌクレオチドで形質転換することができ、任意で、単離されたポリヌクレオチドは、新生抗原またはベクターをコードする少なくとも1つの核酸配列に機能的に連結されたプロモーター配列をさらに含む。ある特定の態様において、単離されたポリヌクレオチドは、cDNAであることができる。
VI. 新生抗原の特定
VI.A. 新生抗原候補の特定
腫瘍および正常のエクソームおよびトランスクリプトームのNGS解析のための研究法を、新生抗原の特定のスペースに記載し、適用している6、14、15。下記の例は、臨床設定における新生抗原の特定について、より大きな感度および特異性のためのある特定の最適化を考慮している。これらの最適化は、実験室プロセスに関連するものおよびNGSデータ解析に関連するものの、2つの区域にグループ化することができる。
VI.A.1. 実験室プロセスの最適化
本明細書に提示したプロセスの改善は、標的とされるがんパネルにおける信頼できるがんドライバー遺伝子の評価について開発された概念16を、新生抗原の特定のために必要な全エクソーム設定および全トランスクリプトーム設定に拡大することによって、低い腫瘍含量および少ない体積の臨床標本からの高精度の新生抗原の発見における難題に対処する。具体的には、これらの改善は、以下を含む：
1．低い腫瘍含量またはサブクローン状態のいずれかにより、低い変異体アレル頻度で存在する変異を検出するための、腫瘍エクソームにわたる深い（500xよりも大きい）固有の平均カバレッジのターゲティング。
2．可能性のある新生抗原の見逃しが最も少ないように、100x未満でカバーされる塩基が5％未満である、例として、
a. 個々のプローブQCを有するDNAベースの捕捉プローブの使用17
b. 十分にカバーされていない領域についての追加的なベイトの包含
による、腫瘍エクソームにわたる均一カバレッジのターゲティング。
3．可能性のある新生抗原が体細胞性／生殖細胞系列ステータスについて分類されていないままである（したがってTSNAとして使用可能ではない）ことが最も少ないように、20x未満でカバーされる塩基が5％未満である、正常エクソームにわたる均一カバレッジのターゲティング。
4．必要とされるシーケンシングの総量を最小化するために、配列捕捉プローブは、非コードRNAは新生抗原を生じることができないことから、遺伝子のコード領域のみについて設計される。追加的な最適化は、以下を含む：
a．GCリッチであり、標準的なエクソームシーケンシングでは十分に捕捉されないHLA遺伝子についての補充的プローブ18。
b．不十分な発現、プロテアソームによる最適に満たない消化、または異例の配列特性などの要因により、候補新生抗原を少ししかまたは全く生成しないと予測される遺伝子の排除。
5．バリアント検出、遺伝子およびスプライスバリアント（「アイソフォーム」）発現の定量、ならびに融合物検出を可能にするために、腫瘍RNAが同様に、高深度（100Mリードよりも大きい）でシーケンシングされる。FFPE試料由来のRNAは、DNAにおいてエクソームを捕捉するために使用されるのと同じまたは類似したプローブで、プローブベース濃縮19を用いて抽出される。
VI.A.2. NGSデータ解析の最適化
解析法の改善は、一般的な研究変異コーリングアプローチの最適に満たない感度および特異性に対処し、具体的には、臨床設定における新生抗原の特定のために関連するカスタマイズ化を考慮する。これらは、以下を含む：
1．アラインメントのための、HG38参照ヒトゲノムまたはより後のバージョンの使用（それが、以前のゲノムリリースとは対照的に、集団多型をより良好に反映する複数のMHC領域アセンブリーを含有するため）。
2．様々なプログラム5からの結果をマージすることによる、単一バリアントコーラー20の限界の克服。
a．単一ヌクレオチドバリアントおよび挿入欠失は、以下を含む一連のツールで、腫瘍DNA、腫瘍RNA、および正常DNAから検出される：Strelka21およびMutect22などの、腫瘍および正常DNAの比較に基づくプログラム；ならびに、低純度の試料において特に有利である23、UNCeqRなどの、腫瘍DNA、腫瘍RNA、および正常DNAを組み入れるプログラム。
b．挿入欠失は、StrelkaおよびABRA24などの、局所リアセンブリーを行うプログラムで決定される。
c．構造的再編成は、Pindel25またはBreakseq26などの専用のツールを用いて決定される。
3． 試料スワップを検出して阻止するために、同じ患者についての試料由来のバリアントコールが、選ばれた数の多型部位で比較される。
4．例として、以下による、人工的コールの広範囲のフィルタリングが行われる：
a．潜在的に、低いカバレッジの例においては緩やかな検出パラメータで、および挿入欠失の例においては許容的な近接基準での、正常DNAにおいて見出されるバリアントの除去。
b．低いマッピング品質または低い塩基品質によるバリアントの除去27。
c．たとえ対応する正常において観察されないとしても、再出現するシーケンシングアーチファクトから生じるバリアントの除去27。例は、主として1本の鎖上に検出されるバリアントを含む。
d．無関連の対照のセットにおいて検出されるバリアントの除去27。
5．seq2HLA28、ATHLATES29、またはOptitypeのうちの1つを使用する、かつまた、エクソームおよびRNAシーケンシングデータを組み合わせる28、正常エクソームからの正確なHLAコーリング。追加的な潜在的最適化は、ロングリードDNAシーケンシングなどの、HLAタイピングのための専用アッセイの採用30、または、RNA断片を連結して連続性を保持するための方法の適応31を含む。
6． 腫瘍特異的スプライスバリアントから生じた新生ORFの堅牢な検出は、CLASS32、Bayesembler33、StringTie34、またはそのリファレンスガイドモードにおける類似したプログラム（すなわち、各実験からそれらの全体の転写産物を再作製するように試みるよりもむしろ、公知の転写産物構造を用いる）を用いて、RNA-seqデータから転写産物をアセンブルすることによって、行われる。Cufflinks35が、この目的で一般的に使用されるが、それは頻繁に、信じ難いほど多数のスプライスバリアントを産生し、それらの多くは、完全長遺伝子よりもはるかに短く、単純な陽性対照をリカバーすることができない場合がある。コード配列および潜在的なナンセンス変異依存分解機構は、変異体配列を再導入した、SpliceR36およびMAMBA37などのツールで決定される。遺伝子発現は、Cufflinks35またはExpress（Roberts and Pachter, 2013）などのツールで決定される。野生型および変異体特異的な発現カウントおよび／または相対レベルは、ASE38またはHTSeq39などの、これらの目的で開発されたツールで決定される。潜在的なフィルタリング段階は、以下を含む：
a．不十分に発現されていると考えられる候補新生ORFの除去。
b．ナンセンス変異依存分解機構（NMD）を引き起こすと予測される候補新生ORFの除去。
7．腫瘍特異的と直接検証することができない、RNAにおいてのみ観察される候補新生抗原（例えば、新生ORF）は、例として以下を考慮することにより、追加的なパラメータにしたがって、腫瘍特異的である可能性が高いとして分類される：
a．腫瘍DNAのみのシス作用性フレームシフトまたはスプライス部位変異の支持の存在。
b．スプライシング因子における腫瘍DNAのみのトランス作用性変異の確証の存在。例として、R625変異体SF3B1での3つの独立して公開された実験において、最も差次的にスプライシングを呈する遺伝子は、1つの実験がブドウ膜黒色腫患者を検討し40、第2の実験がブドウ膜黒色腫細胞株を検討し41、および第3の実験が乳がん患者を検討した42にもかかわらず、一致していた。
c．新規のスプライシングアイソフォームについては、RNASeqデータにおける「新規の」スプライス-ジャンクションリードの確証の存在。
d．新規の再編成については、正常DNAには存在しない腫瘍DNAにおけるエクソン近傍リードの確証の存在。
e．GTEx43などの遺伝子発現大要からの欠如（すなわち、生殖細胞系列起源の可能性をより低くする）。
8．アラインメントおよびアノテーションベースのエラーおよびアーチファクトを直接避けるために、アセンブルされたDNAの腫瘍および正常リード（またはそのようなリード由来のkマー）を比較することによる、参照ゲノムアラインメントベースの解析の補完（例えば、生殖細胞系列バリアントまたはリピートコンテクスト挿入欠失の近くに生じる体細胞性バリアントについて）。
ポリアデニル化RNAを有する試料において、RNA-seqデータにおけるウイルスRNAおよび微生物RNAの存在は、患者の応答を予測し得る追加的因子の特定に向かって、RNA CoMPASS44または類似した方法を用いて評価される。
VI.B. HLAペプチドの単離および検出
HLAペプチド分子の単離は、組織試料の溶解および可溶化後に、古典的な免疫沈降（IP）法を用いて行った（55～58）。清澄化した溶解物を、HLA特異的IPに使用した。
免疫沈降は、抗体がHLA分子に特異的である、ビーズにカップリングした抗体を用いて行った。汎クラスI HLA免疫沈降のためには、汎クラスI CR抗体を使用し、クラスII HLA-DRのためには、HLA-DR抗体を使用する。抗体を、一晩インキュベーション中に、NHS-セファロースビーズに共有結合で付着させる。共有結合性の付着後、ビーズを洗浄して、IPのために等分した（59、60）。
清澄化した組織溶解物を、免疫沈降のために抗体ビーズに添加する。免疫沈降後、ビーズを溶解物から除去し、追加的なIPを含む追加的な実験のために、溶解物を保存する。標準的な技法を用いて、IPビーズを洗浄して非特異的結合を除去し、HLA／ペプチド複合体をビーズから溶出する。分子量スピンカラムまたはC18分画を用いて、タンパク質構成要素をペプチドから除去する。結果として生じたペプチドを、SpeedVac蒸発によって乾燥させ、いくつかの場合には、MS解析の前に-20℃で保存する。
乾燥したペプチドを、逆相クロマトグラフィーに適しているHPLC緩衝液において再構成し、Fusion Lumos質量分析計（Thermo）における勾配溶出のために、C-18マイクロキャピラリーHPLCカラム上にロードする。ペプチド質量／電荷（m/z）のMS1スペクトルを、Orbitrap検出器において高解像度で収集し、その後、MS2低解像度スキャンを、選択イオンのHCDフラグメンテーション後にイオントラップ検出器において収集した。追加的に、MS2スペクトルは、CIDもしくはETDフラグメンテーション法、または、ペプチドのより大きなアミノ酸カバレッジを獲得するための3つの技法の任意の組み合わせのいずれかを用いて、取得することができる。MS2スペクトルはまた、Orbitrap検出器において高解像度質量精度で測定することもできる。
各解析由来のMS2スペクトルを、Comet（61、62）を用いてタンパク質データベースに対して検索し、ペプチド特定を、Percolator（63～65）を用いてスコア化する。
VI.B.1. 総合的HLAペプチドシーケンシングのためのMS検出限界の研究
ペプチドYVYVADVAAKを用いて、何が検出の限界かを、LCカラム上にロードした様々な量のペプチドを用いて決定した。試験したペプチドの量は、1 pmol、100 fmol、10 fmol、1 fmol、および100 amolであった。（表1）結果を図1Fに示す。これらの結果は、検出の最低限界（LoD）がアトモルの範囲（10-18）にあること、ダイナミックレンジが5桁に及ぶこと、および、シグナル対ノイズが、低いフェムトモル範囲（10-15）でシーケンシングに十分であるように見えることを示す。
Figure 0007114477000001
VII. 提示モデル
VII.A. システムの概略
図2Aは、1つの態様にしたがう、患者におけるペプチド提示の尤度を特定するための環境100の概略である。環境100は、それ自体が提示情報記憶装置165を含む提示特定システム160を導入するコンテクストを提供する。
提示特定システム160は、図14に関して下記で議論されるようなコンピュータ計算システムにおいて具現化された、1つまたはコンピュータモデルであり、MHCアレルのセットに関連するペプチド配列を受け取り、ペプチド配列が、関連するMHCアレルのセットの1つまたは複数によって提示されるであろう尤度を決定する。これは、様々なコンテクストにおいて有用である。提示特定システム160の1つの具体的な用途の例は、患者110の腫瘍細胞由来のMHCアレルのセットに関連する候補新生抗原のヌクレオチド配列を受け取り、候補新生抗原が、腫瘍の関連するMHCアレルの1つまたは複数によって提示され、かつ／または患者110の免疫系において免疫原性応答を誘導するであろう尤度を決定することができることである。システム160によって決定された際に高い尤度を有するそれらの候補新生抗原を、ワクチン118における包含のために選択することができ、そのような抗腫瘍免疫応答が、腫瘍細胞を提供する患者110の免疫系から惹起され得る。
提示特定システム160は、1つまたは複数の提示モデルを通して提示尤度を決定する。具体的には、提示モデルは、所定のペプチド配列が、関連するMHCアレルのセットについて提示されるかどうかの尤度を生成し、尤度は、記憶装置165に保存された提示情報に基づいて生成される。例えば、提示モデルは、ペプチド配列
Figure 0007114477000002
が、試料の細胞表面上のアレルのセットHLA-A*02:01、HLA-B*07:02、HLA-B*08:03、HLA-C*01:04、HLA-A*06:03、HLA-B*01:04について提示されるかどうかの尤度を生成し得る。提示情報165は、MHCアレルによってペプチドが提示されるようにこれらのペプチドが様々なタイプのMHCアレルに結合するかどうかについての情報を含有し、これは、モデルにおいて、ペプチド配列中のアミノ酸の位置に応じて決定される。提示モデルは、提示情報165に基づいて、認識されていないペプチド配列が、MHCアレルの関連するセットと結合して提示されるかどうかを予測することができる。
VII.B. 提示情報
図2は、1つの態様にしたがう、提示情報を取得する方法を説明する。提示情報165は、2つの一般的部類の情報：アレル相互作用情報およびアレル非相互作用情報を含む。アレル相互作用情報は、MHCアレルのタイプに依存する、ペプチド配列の提示に影響を及ぼす情報を含む。アレル非相互作用情報は、MHCアレルのタイプに非依存的な、ペプチド配列の提示に影響を及ぼす情報を含む。
VII.B.1. アレル相互作用情報
アレル相互作用情報は、主として、ヒト、マウスなど由来の1つまたは複数の特定されたMHC分子によって提示されていることが公知である、特定されたペプチド配列を含む。注目すべきことに、これは、腫瘍試料から取得されたデータを含んでもよく、または含まなくてもよい。提示されたペプチド配列は、単一のMHCアレルを発現する細胞から特定されてもよい。この例において、提示されたペプチド配列は、概して、あらかじめ決定されたMHCアレルを発現するように操作されてその後合成タンパク質に曝露された単一アレル細胞株から収集される。MHCアレル上に提示されたペプチドは、酸溶出などの技法によって単離され、質量分析を通して特定される。図2Bは、あらかじめ決定されたMHCアレルHLA-A*01:01上に提示された例示的なペプチド
Figure 0007114477000003
が単離され、質量分析を通して特定される、この例を示す。この状況においては、ペプチドが、単一のあらかじめ決定されたMHCタンパク質を発現するように操作された細胞を通して特定されるため、提示されたペプチドとそれが結合したMHCタンパク質との間の直接の関連が、決定的に既知である。
提示されたペプチド配列はまた、複数のMHCアレルを発現する細胞から収集されてもよい。典型的にヒトにおいては、6種類の異なるタイプのMHC分子が、細胞について発現している。そのような提示されたペプチド配列は、複数のあらかじめ決定されたMHCアレルを発現するように操作されている複数アレル細胞株から特定されてもよい。そのような提示されたペプチド配列はまた、正常組織試料または腫瘍組織試料のいずれかの、組織試料から特定されてもよい。この例において特に、MHC分子は、正常組織または腫瘍組織から免疫沈降させることができる。複数のMHCアレル上に提示されたペプチドは、同様に、酸溶出などの技法によって単離され、質量分析を通して特定されることができる。図2Cは、6種類の例示的なペプチド
Figure 0007114477000004
が、特定されたMHCアレルHLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01、HLA-C*01:03、およびHLA-C*01:04上に提示されており、単離され、質量分析を通して特定される、この例を示す。単一アレル細胞株とは対照的に、結合したペプチドが、特定される前のMHC分子から単離されるため、提示されたペプチドとそれが結合したMHCタンパク質との間の直接の関連は、未知である可能性がある。
アレル相互作用情報はまた、ペプチド-MHC分子複合体の濃度、およびペプチドのイオン化効率の両方に依存する、質量分析イオン電流も含むことができる。イオン化効率は、配列依存性様式で、ペプチドごとに変動する。概して、イオン効率は、およそ2桁にわたってペプチドごとに変動し、他方、ペプチド-MHC複合体の濃度は、それよりも大きい範囲にわたって変動する。
アレル相互作用情報はまた、所定のMHCアレルと所定のペプチドとの間の結合親和性の測定値または予測値も含むことができる。1つまたは複数の親和性モデルが、そのような予測値を生成することができる。例えば、図1Dに示した例に戻ると、提示情報165は、ペプチド
Figure 0007114477000005
とアレルHLA-A*01:01との間の1000nMの結合親和性予測値を含み得る。1000nmよりも大きいIC50を有するペプチドはわずかしか、MHCによって提示されず、より低いIC50値が、提示の確率を増大させる。
アレル相互作用情報はまた、MHC複合体の安定性の測定値または予測値も含むことができる。1つまたは複数の安定性モデルが、そのような予測値を生成することができる。より安定なペプチド-MHC複合体（すなわち、より長い半減期を有する複合体）は、腫瘍細胞上、およびワクチン抗原に遭遇する抗原提示細胞上に高コピー数で提示される可能性がより高い。例えば、図2Cに示した例に戻ると、提示情報165は、分子HLA-A*01:01について1時間の半減期の安定性予測値を含み得る。
アレル相互作用情報はまた、ペプチド-MHC複合体の形成反応の、測定されたかまたは予測された速度も含むことができる。より速い速度で形成する複合体は、高濃度で細胞表面上に提示される可能性がより高い。
アレル相互作用情報はまた、ペプチドの配列および長さも含むことができる。MHCクラスI分子は典型的に、8～15ペプチドの長さを有するペプチドを提示することを好む。提示されたペプチドの60～80％は、長さ9を有する。いくつかの細胞株由来の提示されたペプチドの長さのヒストグラムを、図5に示す。
アレル相互作用情報はまた、新生抗原コード化ペプチド上のキナーゼ配列モチーフの存在、および新生抗原コード化ペプチド上の特異的な翻訳後修飾の有無も含むことができる。キナーゼモチーフの存在は、MHC結合を増強または干渉し得る、翻訳後修飾の確率に影響を及ぼす。
アレル相互作用情報はまた、（RNA seq、質量分析、または他の方法によって測定されたかまたは予測された際の）翻訳後修飾のプロセスに関与するタンパク質、例えば、キナーゼの発現または活性レベルも含むことができる。
アレル相互作用情報はまた、質量分析プロテオミクスまたは他の手段によって評価された際の、特定のMHCアレルを発現する他の個体由来の細胞における、類似した配列を有するペプチドの提示の確率も含むことができる。
アレル相互作用情報はまた、（例えば、RNA-seqまたは質量分析によって測定された際の）問題の個体における特定のMHCアレルの発現レベルも含むことができる。高レベルで発現しているMHCアレルに最も強く結合するペプチドは、低レベルで発現しているMHCアレルに最も強く結合するペプチドよりも、提示される可能性がより高い。
アレル相互作用情報はまた、特定のMHCアレルを発現する他の個体における、特定のMHCアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列非依存的確率も含むことができる。
アレル相互作用情報はまた、他の個体における同じファミリーの分子（例えば、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DP）のMHCアレルによる提示の、全体的なペプチド配列に非依存的な確率も含むことができる。例えば、HLA-C分子は典型的に、HLA-AまたはHLA-B分子よりも低いレベルで発現しており、したがって、HLA-Cによるペプチドの提示は、HLA-AまたはHLA-Bによる提示よりも先験的に確率が低い11。
アレル相互作用情報はまた、特定のMHCアレルのタンパク質配列も含むことができる。
下記の節に列挙される任意のMHCアレル非相互作用情報もまた、MHCアレル相互作用情報としてモデル化することができる。
VII.B.2. アレル非相互作用情報
アレル非相互作用情報は、その供給源タンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するC末端配列を含むことができる。C末端隣接配列は、ペプチドのプロテアソームプロセシングに影響を及ぼし得る。しかし、C末端隣接配列は、ペプチドが小胞体に輸送され、細胞の表面上のMHCアレルと遭遇する前に、プロテアソームによってペプチドから切断される。その結果、MHC分子は、C末端隣接配列についてのいかなる情報も受け取らず、したがって、C末端隣接配列の効果は、MHCアレルタイプに応じて変動することができない。例えば、図2Cに示した例に戻ると、提示情報165は、ペプチドの供給源タンパク質から特定された、提示されたペプチドFJIEJFOESSのC末端隣接配列FOEIFNDKSLDKFJIを含み得る。
アレル非相互作用情報はまた、mRNA定量測定値も含むことができる。例えば、mRNA定量データは、質量分析訓練データを提供する同じ試料について取得することができる。図13Hに関して後に記載するように、RNA発現は、ペプチド提示の強い予測因子であると特定された。1つの態様において、mRNA定量測定値は、ソフトウェアツールRSEMから特定される。RSEMソフトウェアツールの詳細な実行は、Bo Li and Colin N. Dewey. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics, 12:323, August 2011で見出すことができる。1つの態様において、mRNA定量は、100万個のマップされたリードあたりの転写産物のキロ塩基あたりの断片の単位（FPKM）で測定される。
アレル非相互作用情報はまた、その供給源タンパク質配列内の、ペプチドに隣接するN末端配列も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、（RNA-seqまたは質量分析によって測定された際の）任意で、腫瘍細胞における対応するプロテアーゼの発現にしたがって重み付けされる、ペプチドにおけるプロテアーゼ切断モチーフの存在も含むことができる。プロテアーゼ切断モチーフを含有するペプチドは、プロテアーゼによってより容易に分解され、したがって細胞内で安定性がより低いことになるため、提示される可能性がより低い。
アレル非相互作用情報はまた、適切な細胞タイプにおいて測定された際の、供給源タンパク質の代謝回転速度も含むことができる。より速い代謝回転速度（すなわち、より低い半減期）は、提示の確率を増大させる；しかし、類似していない細胞タイプにおいて測定された場合、この特性の予測力は低い。
アレル非相互作用情報はまた、RNA-seqもしくはプロテオーム質量分析によって測定された際、または、DNAもしくはRNA配列データにおいて検出される生殖細胞系列もしくは体細胞性スプライシング変異のアノテーションから予測された際の、任意で、腫瘍細胞において最も高発現している特異的なスプライスバリアント（「アイソフォーム」）を考慮する、供給源タンパク質の長さも含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、（RNA-seq、プロテオーム質量分析、または免疫組織化学によって測定され得る）腫瘍細胞におけるプロテアソーム、イムノプロテアソーム、胸腺プロテアソーム、または他のプロテアーゼの発現のレベルも含むことができる。異なるプロテアソームは、異なる切断部位の好みを有する。より大きい重みが、その発現レベルに比例して、プロテアソームの各タイプの切断の好みに与えられる。
アレル非相互作用情報はまた、（例えば、RNA-seqまたは質量分析によって測定された際の）ペプチドの供給源遺伝子の発現も含むことができる。可能な最適化は、腫瘍試料内の間質細胞および腫瘍浸潤リンパ球の存在を説明する、測定された発現を調整することを含む。より高発現している遺伝子由来のペプチドは、提示される可能性がより高い。検出不可能なレベルの発現を有する遺伝子由来のペプチドは、考察から排除することができる。
アレル非相互作用情報はまた、新生抗原コード化ペプチドの供給源mRNAが、ナンセンス変異依存分解機構のモデル、例えば、Rivas et al, Science 2015由来のモデルによって予測されるようなナンセンス変異依存分解機構に供されるであろう確率も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、細胞周期の種々の段階の最中の、ペプチドの供給源遺伝子の典型的な組織特異的発現も含むことができる。（RNA-seqまたは試料分析プロテオミクスによって測定された際に）全体的に低いレベルで発現しているが、細胞周期の特異的な段階の最中に高レベルで発現していることが公知である遺伝子は、非常に低いレベルで安定に発現している遺伝子よりも、より提示されるペプチドを産生する可能性が高い。
アレル非相互作用情報はまた、例えば、uniProtまたはPDB http://www.rcsb.org/pdb/home/home.doにおいて与えられるような、供給源タンパク質の特性の総合的なカタログも含むことができる。これらの特性は、とりわけ、タンパク質の二次構造および三次構造、細胞内局在化11、遺伝子オントロジー（GO）用語を含み得る。具体的には、この情報は、タンパク質のレベルで作用するアノテーション、例えば、5'UTR長、および特異的残基のレベルで作用するアノテーション、例えば、残基300～310のヘリックスモチーフを含有し得る。これらの特性はまた、ターンモチーフ、シートモチーフ、および無秩序残基も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、ペプチドを含有する供給源タンパク質のドメインの性状を説明する特性、例えば、二次構造または三次構造（例えば、αヘリックス対βシート）；選択的スプライシングも含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、ペプチドの供給源タンパク質におけるペプチドの位置での提示ホットスポットの有無を説明する特性も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、他の個体における問題のペプチドの供給源タンパク質由来のペプチドの提示の確率（それらの個体における供給源タンパク質の発現レベル、およびそれらの個体の様々なHLAタイプの影響を調整した後）も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、ペプチドが、技術的偏りのために質量分析によって検出されないか、または過剰に表されるであろう確率も含むことができる。
腫瘍細胞、間質、または腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の状態について情報を与える、RNASeq、マイクロアレイ、Nanostringなどの標的化パネルなどの、遺伝子発現アッセイ、または、RT-PCRなどのアッセイによって測定される遺伝子モジュールを代表する単一／複数遺伝子によって測定された際の、種々の遺伝子モジュール／経路の発現（ペプチドの供給源タンパク質を含有する必要はない）。
アレル非相互作用情報はまた、腫瘍細胞におけるペプチドの供給源遺伝子のコピー数も含むことができる。例えば、腫瘍細胞においてホモ接合性欠失に供される遺伝子由来のペプチドは、ゼロの提示確率を割り当てることができる。
アレル非相互作用情報はまた、ペプチドがTAPに結合する確率、または、測定されたかもしくは予測された、TAPに対するペプチドの結合親和性も含むことができる。TAPに結合する可能性がより高いペプチド、またはより高い親和性でTAPに結合するペプチドは、提示される可能性がより高い。
アレル非相互作用情報はまた、（RNA-seq、プロテオーム質量分析、免疫組織化学によって測定され得る）腫瘍細胞におけるTAPの発現レベルも含むことができる。より高いTAP発現レベルは、すべてのペプチドの提示の確率を増大させる。
アレル非相互作用情報はまた、以下を含むがそれらに限定されない、腫瘍変異の有無も含むことができる：
i. EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異。
ii. 抗原提示機構に関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOBHLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）におけるもの。その提示が、腫瘍において機能喪失変異の影響下にある抗原提示機構の構成要素に依拠するペプチドは、提示の確率が低減している。
以下を含むがそれらに限定されない、機能的な生殖細胞系列多型の有無：
i. 抗原提示機構に関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOBHLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、または、プロテアソームもしくはイムノプロテアソームの構成要素をコードする遺伝子のいずれか）におけるもの。
アレル非相互作用情報はまた、腫瘍タイプ（例えば、NSCLC、黒色腫）も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、例としてHLAアレル接尾辞によって反映されるような、HLAアレルの公知の機能性も含むことができる。例えば、アレル名HLA-A*24:09NにおけるNの接尾辞は、発現せず、したがってエピトープを提示する可能性が低いヌルアレルを示し；完全なHLAアレル接尾辞の命名法は、https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/nomenclature/suffixes.htmlに記載されている。
アレル非相互作用情報はまた、臨床的腫瘍サブタイプ（例えば、扁平上皮肺がん対非扁平上皮）も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、喫煙歴も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、日焼け、日光曝露、または他の変異原に対する曝露の経歴も含むことができる。
アレル非相互作用情報はまた、任意でドライバー変異によって層別化される、関連性のある腫瘍タイプまたは臨床的サブタイプにおけるペプチドの供給源遺伝子の局部的発現も含むことができる。関連性のある腫瘍タイプにおいて典型的に高レベルで発現している遺伝子は、提示される可能性がより高い。
アレル非相互作用情報はまた、すべての腫瘍における、または同じタイプの腫瘍における、または少なくとも1つの共有されたMHCアレルを有する個体由来の腫瘍における、または少なくとも1つの共有されたMHCアレルを有する個体中の同じタイプの腫瘍における、変異の頻度も含むことができる。
変異した腫瘍特異的ペプチドの例において、提示の確率を予測するために使用される特性の一覧はまた、変異のアノテーション（例えば、ミスセンス、リードスルー、フレームシフト、融合など）、または、変異がナンセンス変異依存分解機構（NMD）を結果としてもたらすと予測されるかどうかも含み得る。例えば、ホモ接合性早期終止変異のために腫瘍細胞において翻訳されないタンパク質セグメント由来のペプチドは、ゼロの提示確率を割り当てることができる。NMDは、提示の確率を減少させる、mRNA翻訳の減少を結果としてもたらす。
VII.C. 提示特定システム
図3は、1つの態様による、提示特定システム160のコンピュータ論理構成要素を説明する、ハイレベルブロック図である。この例示的態様において、提示特定システム160は、データ管理モジュール312、コード化モジュール314、訓練モジュール316、および予測モジュール320を含む。提示特定システム160はまた、訓練データ記憶装置170および提示モデル記憶装置175から構成される。モデル管理システム160のいくつかの態様は、本明細書に記載したものとは異なるモジュールを有する。同様に、機能は、本明細書に記載したものは異なる様式で、モジュールの間に分配され得る。
VII.C.1. データ管理モジュール
データ管理モジュール312は、提示情報165から訓練データ170のセットを生成する。各々の訓練データのセットは、多数のデータ例を含有し、各データ例iは、少なくとも、提示されるかまたは提示されないペプチド配列piと、ペプチド配列piと結合した1つまたは複数の関連するMHCアレルaiと、提示特定システム160が、独立変数の新たな値を予測することに関心があるという情報を表す従属変数yiとを含む、独立変数ziのセットを含有する。
本明細書の残りの部分を通して言及される1つの特定の実施形態において、従属変数yiは、ペプチドpiが、1つまたは複数の関連するMHCアレルaiによって提示されたかどうかを示す、バイナリーラベルである。しかし、他の実施形態において、従属変数yiは、提示特定システム160が、独立変数ziに依存して予測することに関心があるという任意の他の種類の情報を表し得ることが、認識される。例えば、別の実施形態において、従属変数yiはまた、データ例について特定された質量分析イオン電流を示す数値であってもよい。
データ例iについてのペプチド配列piは、kiアミノ酸の配列であり、kiは、データ例iの間で、ある範囲内で変動し得る。例えば、その範囲は、MHCクラスIについては8～15、またはMHCクラスIIについては9～30であり得る。システム160の1つの具体的な実施形態において、訓練データセット中のすべてのペプチド配列piは、同じ長さ、例えば9を有し得る。ペプチド配列中のアミノ酸の数は、MHCアレルのタイプ（例えば、ヒトにおけるMHCアレルなど）に応じて変動し得る。データ例iについてのMHCアレルaiは、どのMHCアレルが対応するペプチド配列piと結合して存在したかを示す。
データ管理モジュール312はまた、訓練データ170に含有されるペプチド配列piおよび結合したMHCアレルaiと共に、結合親和性biおよび安定性siの予測値などの追加的なアレル相互作用変数も含み得る。例えば、訓練データ170は、ペプチドpiと、aiにおいて示される結合したMHC分子の各々との間の結合親和性予測値biを含有し得る。別の例として、訓練データ170は、aiにおいて示されるMHCアレルの各々についての安定性予測値siを含有し得る。
データ管理モジュール312はまた、ペプチド配列piと共に、C末端隣接配列およびmRNA定量測定値などのアレル非相互作用変数wiも含み得る。
データ管理モジュール312はまた、MHCアレルによって提示されないペプチド配列も特定して、訓練データ170を生成する。概して、これは、提示の前に、提示されるペプチド配列を含む供給源タンパク質の「より長い」配列を特定することを含む。提示情報が、操作された細胞株を含有する場合、データ管理モジュール312は、細胞のMHCアレル上に提示されなかった、細胞がそれに対して曝露された合成タンパク質における一連のペプチド配列を特定する。提示情報が、組織試料を含有する場合、データ管理モジュール312は、提示されたペプチド配列の起源である供給源タンパク質を特定して、組織試料細胞のMHCアレル上に提示されなかった、該供給源タンパク質における一連のペプチド配列を特定する。
データ管理モジュール312はまた、ランダム配列のアミノ酸を有するペプチドを人工的に生成し、生成された配列を、MHCアレル上に提示されないペプチドとして特定する。これは、ペプチド配列をランダムに生成することによって達成することができ、MHCアレル上に提示されないペプチドについての多量の合成データをデータ管理モジュール312が容易に生成することを可能にする。実際には、小さなパーセンテージのペプチド配列がMHCアレルによって提示されるため、合成で生成されたペプチド配列は、たとえそれらが細胞によってプロセシングされたタンパク質に含まれたとしても、MHCアレルによって提示されていない可能性が非常に高い。
図4は、1つの態様による、訓練データ170Aの例示的なセットを説明する。具体的には、訓練データ170A中の最初の3つのデータ例は、アレルHLA-C*01:03を含む単一アレル細胞株、ならびに3種類のペプチド配列
Figure 0007114477000006
からのペプチド提示情報を示す。訓練データ170A中の4番目のデータ例は、アレルHLA-B*07:02、HLA-C*01:03、HLA-A*01:01を含む複数アレル細胞株、およびペプチド配列
Figure 0007114477000007
からのペプチド情報を示す。最初のデータ例は、ペプチド配列
Figure 0007114477000008
が、アレルHLA-C*01:03によって提示されなかったことを示す。前の2つの段落において議論したように、ペプチド配列は、データ管理モジュール312によってランダムに生成されてもよく、または提示されるペプチドの供給源タンパク質から特定されてもよい。訓練データ170Aはまた、ペプチド配列-アレルペアについて、1000nMの結合親和性予測値および1時間の半減期の安定性予測値も含む。訓練データ170Aはまた、ペプチド
Figure 0007114477000009
のC末端隣接配列、および102 FPKMのmRNA定量測定値などの、アレル非相互作用変数も含む。4番目のデータ例は、ペプチド配列
Figure 0007114477000010
が、アレルHLA-B*07:02、HLA-C*01:03、またはHLA-A*01:01のうちの1つによって提示されたことを示す。訓練データ170Aはまた、アレルの各々についての結合親和性予測値および安定性予測値、ならびに、ペプチドのC隣接配列およびペプチドについてのmRNA定量測定値も含む。
VII.C.2. コード化モジュール
コード化モジュール314は、訓練データ170に含有される情報を、1つまたは複数の提示モデルを生成するために使用することができる数値的表示へとコード化する。1つの実施形態において、コード化モジュール314は、配列（例えば、ペプチド配列またはC末端隣接配列）を、あらかじめ決定された20文字のアミノ酸アルファベットについて、ワン・ホットでコード化する。具体的には、kiアミノ酸を有するペプチド配列piは、20・ki要素の行ベクトルとして表され、ペプチド配列のj番目の位置のアミノ酸のアルファベットに対応するpi 20・(j-1)+1, pi 20・(j-1)+2, ..., pi 20・jの中の単一要素は、1の値を有する。その以外の、残りの要素は、0の値を有する。例として、所定のアルファベット{A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y}について、データ例iの3アミノ酸のペプチド配列EAFは、60要素の行ベクトル
Figure 0007114477000011
によって表され得る。C末端隣接配列ci、ならびに、MHCアレルについてのタンパク質配列dh、および提示情報における他の配列データは、同様に、上記のようにコード化することができる。
訓練データ170が、異なる長さのアミノ酸の配列を含有する場合、コード化モジュール314は、さらに、あらかじめ決定されたアルファベットを拡張するようにPAD文字を追加することによって、ペプチドを同等の長さのベクトルへとコード化し得る。例えば、これは、ペプチド配列の長さが、訓練データ170において最大の長さを有するペプチド配列に達するまで、ペプチド配列をPAD文字で左パディングすることによって行われ得る。したがって、最大の長さを有するペプチド配列がk最大アミノ酸を有する場合、コード化モジュール314は、各配列を、(20+1)・k最大要素の行ベクトルとして数値的に表す。例として、拡張されたアルファベット{PAD, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y}およびk最大=5の最大アミノ酸長について、3アミノ酸の同じ例示的なペプチド配列EAFは、105要素の行ベクトル
Figure 0007114477000012
によって表され得る。C末端隣接配列ciまたは他の配列データは、同様に、上記のようにコード化することができる。したがって、ペプチド配列piまたはciにおける各々の独立変数または列は、配列の特定の位置の特定のアミノ酸の存在を表す。
配列データをコード化する上記の方法は、アミノ酸配列を有する配列に関して記載したが、方法を、同様に、例えば、DNAまたはRNAの配列データなどの、他のタイプの配列データに拡張することができる。
コード化モジュール314はまた、データ例iについての1つまたは複数のMHCアレルaiを、m要素の行ベクトルへとコード化し、各要素h=1, 2, ..., mは、固有の特定されたMHCアレルに対応する。データ例iについて特定されたMHCアレルに対応する要素は、1の値を有する。その以外の、残りの要素は、0の値を有する。例として、m=4の固有の特定されたMHCアレルタイプ{HLA-A*01:01, HLA-C*01:08, HLA-B*07:02, HLA-C*01:03}の中の、複数アレル細胞株に対応するデータ例iについてのアレルHLA-B*07:02およびHLA-C*01:03は、4要素の行ベクトルai=[0 0 1 1]によって表され得、a3 i=1およびa4 i=1である。4種類の特定されたMHCアレルタイプでの例を、本明細書に記載するが、MHCアレルタイプの数は、実施において数百または数千であることができる。以前に議論したように、各データ例iは、典型的に、ペプチド配列piに関連した最大で6種類の異なるMHCアレルタイプを含有する。
コード化モジュール314はまた、各データ例iについてのラベルyiを、{0, 1}のセット由来の値を有するバイナリー変数としてコード化し、1の値は、ペプチドxiが、関連するMHCアレルaiのうちの1つによって提示されたことを示し、0の値は、ペプチドxiが、関連するMHCアレルaiのいずれによっても提示されなかったことを示す。従属変数yiが、質量分析イオン電流を表す場合、コード化モジュール314は、[0, ∞]の間のイオン電流値について[-∞, ∞]の範囲を有するlog関数などの種々の関数を用いて、値を追加的にスケール調整し得る。
コード化モジュール314は、ペプチドpiおよび関連するMHCアレルhについてのアレル相互作用変数xh iのペアを、アレル相互作用変数の数値的表示が次々に連鎖している行ベクトルとして表し得る。例えば、コード化モジュール314は、xh iを、[pi]、[pi bh i]、[pi sh i]、または[pi bh i sh i]と同等の行ベクトルとして表し得、bh iは、ペプチドpiおよび関連するMHCアレルhについての結合親和性予測値であり、同様に、sh iは、安定性についてのものである。あるいは、アレル相互作用変数の1つまたは複数の組み合わせは、個々に（例えば、個々のベクトルまたはマトリックスとして）保存されてもよい。
1つの例において、コード化モジュール314は、結合親和性について測定されたかまたは予測された値をアレル相互作用変数xh iに組み入れることによって、結合親和性情報を表す。
1つの例において、コード化モジュール314は、結合安定性について測定されたかまたは予測された値をアレル相互作用変数xh iに組み入れることによって、結合安定性情報を表す。
1つの例において、コード化モジュール314は、結合オンレートについて測定されたかまたは予測された値をアレル相互作用変数xh iに組み入れることによって、結合オンレート情報を表す。
1つの例において、コード化モジュール314は、ペプチド長を、ベクトル
Figure 0007114477000013
（式中、
Figure 0007114477000014
は指標関数であり、Lkはペプチドpkの長さを意味する）として表す。ベクトルTkを、アレル相互作用変数xh iに含めることができる。
1つの例において、コード化モジュール314は、MHCアレルのRNA-seqベースの発現レベルをアレル相互作用変数xh iに組み入れることによって、MHCアレルのRNA発現情報を表す。
同様に、コード化モジュール314は、アレル非相互作用変数wiを、アレル非相互作用変数の数値的表示が次々に連鎖している行ベクトルとして表し得る。例えば、wiは、[ci]または[ci mi wi]と同等の行ベクトルであってもよく、wiは、ペプチドpiのC末端隣接配列およびペプチドに関連するmRNA定量測定値miに加えて任意の他のアレル非相互作用変数を表す、行ベクトルである。あるいは、アレル非相互作用変数の1つまたは複数の組み合わせは、個々に（例えば、個々のベクトルまたはマトリックスとして）保存されてもよい。
1つの例において、コード化モジュール314は、代謝回転速度または半減期をアレル非相互作用変数wiに組み入れることによって、ペプチド配列についての供給源タンパク質の代謝回転速度を表す。
1つの例において、コード化モジュール314は、タンパク質長をアレル非相互作用変数wiに組み入れることによって、供給源タンパク質またはアイソフォームの長さを表す。
1つの例において、コード化モジュール314は、β1i、β2i、β5iサブユニットを含むイムノプロテアソーム特異的プロテアソームサブユニットの平均発現を、アレル非相互作用変数wiに組み入れることによって、イムノプロテアソームの活性化を表す。
1つの例において、コード化モジュール314は、（RSEMなどの技法によってFPKM、TPMの単位で定量された）ペプチド、またはペプチドの遺伝子もしくは転写産物の供給源タンパク質のRNA-seq存在量を、供給源タンパク質の存在量をアレル非相互作用変数wiに組み入れることによって表す。
1つの例において、コード化モジュール314は、例えば、Rivas et. al. Science, 2015におけるモデルによって推定されるような、ペプチドの起源の転写産物がナンセンス変異依存分解機構（NMD）を受けるであろう確率を、この確率をアレル非相互作用変数wiに組み入れることによって表す。
1つの例において、コード化モジュール314は、RNA-seqを介して評価された遺伝子モジュールまたは経路の活性化状況を、例えば、経路における遺伝子の各々について、例えばRSEMを用いてTPMの単位で、経路における遺伝子の発現を定量すること、次いで、経路における遺伝子にわたる要約統計量、例えば平均値をコンピュータ計算することによって表す。平均を、アレル非相互作用変数wiに組み入れることができる。
1つの例において、コード化モジュール314は、供給源遺伝子のコピー数を、コピー数をアレル非相互作用変数wiに組み入れることによって表す。
1つの例において、コード化モジュール314は、（例えば、ナノモル単位での）測定されたかまたは予測されたTAP結合親和性をアレル非相互作用変数wiに含むことによって、TAP結合親和性を表す。
1つの例において、コード化モジュール314は、RNA-seqによって測定され（かつ、例えばRSEMによってTPMの単位で定量された）TAP発現レベルをアレル非相互作用変数wiに含むことによって、TAP発現レベルを表す。
1つの例において、コード化モジュール314は、腫瘍変異を、アレル非相互作用変数wiにおける指標変数のベクトル（すなわち、ペプチドpkがKRAS G12D変異を有する試料に由来するならばdk = 1、それ以外は0）として表す。
1つの例において、コード化モジュール314は、抗原提示遺伝子における生殖細胞系列多型を、指標変数のベクトル（すなわち、ペプチドpkがTAPにおいて特異的な生殖細胞系列多型を有する試料に由来するならばdk = 1）として表す。これらの指標変数を、アレル非相互作用変数wiに含めることができる。
1つの例において、コード化モジュール314は、腫瘍タイプを、腫瘍タイプ（例えば、NSCLC、黒色腫、大腸がんなど）のアルファベットについての長さ1のワン・ホットコード化ベクトルとして表す。これらのワン・ホットコード化変数を、アレル非相互作用変数wiに含めることができる。
1つの例において、コード化モジュール314は、MHCアレル接尾辞を、4桁のHLAアレルを様々な接尾辞で処理することによって表す。例えば、HLA-A*24:09Nは、モデルの目的で、HLA-A*24:09とは異なるアレルと考えられる。あるいは、N接尾辞で終わるHLAアレルは発現しないため、N接尾辞のMHCアレルによる提示の確率は、すべてのペプチドについてゼロに設定することができる。
1つの例において、コード化モジュール314は、腫瘍サブタイプを、腫瘍サブタイプ（例えば、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌など）のアルファベットについての長さ1のワン・ホットコード化ベクトルとして表す。これらのワン・ホットコード化変数を、アレル非相互作用変数wiに含めることができる。
1つの例において、コード化モジュール314は、喫煙歴を、アレル非相互作用変数wiに含めることができる、バイナリー指標変数（患者が喫煙歴を有するならばdk = 1、それ以外は0）として表す。あるいは、喫煙歴を、喫煙の重症度のアルファベットについての長さ1のワン・ホットコード化変数としてコード化することができる。例えば、喫煙状況を、1が非喫煙者を示し、5が現在の大量喫煙者を示す、1～5のスケールに査定することができる。喫煙歴は、主として肺腫瘍と関連性があるため、複数の腫瘍タイプに対するモデルを訓練する場合、この変数は、患者が喫煙の経歴を有し、かつ腫瘍タイプが肺腫瘍であるならば1と同等であり、それ以外はゼロであると定義することもできる。
1つの例において、コード化モジュール314は、日焼け歴を、アレル非相互作用変数wiに含めることができる、バイナリー指標変数（患者が重症の日焼けの経歴を有するならばdk = 1、それ以外は0）として表す。重症の日焼けは、主として黒色腫と関連性があるため、複数の腫瘍タイプに対するモデルを訓練する場合、この変数は、患者が重症の日焼けの経歴を有し、かつ腫瘍タイプが黒色腫であるならば1と同等であり、それ以外はゼロであると定義することもできる。
1つの例において、コード化モジュール314は、ヒトゲノムにおける各遺伝子または転写産物についての特定の遺伝子または転写産物の発現レベルの分布を、TCGAなどの参照データベースを用いることによって、発現レベルの分布の要約統計量（例えば、平均値、中央値）として表す。具体的には、腫瘍タイプ黒色腫を有する試料におけるペプチドpkについて、ペプチドpkの起源の遺伝子または転写産物の、測定された遺伝子または転写産物の発現レベルをアレル非相互作用変数wiに含むことができるだけでなく、TCGAによって測定された際の、黒色腫におけるペプチドpkの起源の遺伝子または転写産物の、平均値および／または中央値の遺伝子または転写産物発現も含むことができる。
1つの例において、コード化モジュール314は、変異タイプを、変異タイプ（例えば、ミスセンス、フレームシフト、NMD誘導性など）のアルファベットについての長さ1のワン・ホットコード化変数として表す。これらのワン・ホットコード化変数を、アレル非相互作用変数wiに含めることができる。
1つの例において、コード化モジュール314は、タンパク質のタンパク質レベルの特性を、供給源タンパク質のアノテーション（例えば、5' UTR長）の値として、アレル非相互作用変数wiにおいて表す。別の例において、コード化モジュール314は、ペプチドpkについての供給源タンパク質の残基レベルのアノテーションを、ペプチドpkがヘリックスモチーフとオーバーラップするならば1と同等であり、それ以外は0であるか、または、ペプチドpkがヘリックスモチーフ内に完全に含有されるならば1と同等である指標変数を、アレル非相互作用変数wiに含むことによって表す。別の例において、ヘリックスモチーフアノテーション内に含有されるペプチドpkにおける残基の割合を表す特性を、アレル非相互作用変数wiに含めることができる。
1つの例において、コード化モジュール314は、ヒトプロテオームにおけるタンパク質またはアイソフォームのタイプを、ヒトプロテオームにおけるタンパク質またはアイソフォームの数と同等の長さを有する指標ベクトルokとして表し、対応する要素ok iは、ペプチドpkがタンパク質iに由来するならば1であり、それ以外は0である。
コード化モジュール314はまた、ペプチドpiおよび関連するMHCアレルhについての変数ziの全体的なセットを、アレル相互作用変数xiおよびアレル非相互作用変数wiの数値的表示が次々に連鎖している行ベクトルとしても表し得る。例えば、コード化モジュール314は、zh iを、[xh i wi]または[wi xh i]と同等の行ベクトルとして表し得る。
VIII. 訓練モジュール
訓練モジュール316は、ペプチド配列に関連するMHCアレルによってペプチド配列が提示されるかどうかの尤度を生成する、1つまたは複数の提示モデルを構築する。具体的には、ペプチド配列pkおよびペプチド配列pkに関連するMHCアレルakのセットを与えられ、各提示モデルは、ペプチド配列pkが、関連するMHCアレルakのうちの1つまたは複数によって提示されるであろう尤度を示す、推定値ukを生成する。
VIII.A. 概略
訓練モジュール316は、165に保存された提示情報から生成された、記憶装置170に保存された訓練データセットに基づいて、1つまたは複数の提示モデルを構築する。概して、提示モデルの具体的なタイプに関わらず、提示モデルのすべては、損失関数が最小化されるように、訓練データ170における独立変数と従属変数との間の依存性を捕捉する。具体的には、損失関数
Figure 0007114477000015
は、訓練データ170における1つまたは複数のデータ例Sについての従属変数yi∈Sの値と、提示モデルによって生成されたデータ例Sについての推定された尤度ui∈Sとの間の矛盾を表す。本明細書の残りの部分を通して言及される1つの特定の実施形態において、損失関数(yi∈S, ui∈S; θ)は、以下のような方程式（1a）によって与えられる負のlog尤度関数である。
Figure 0007114477000016
しかし、実際には、別の損失関数が使用されてもよい。例えば、質量分析イオン電流について予測がなされる場合、損失関数は、以下のような方程式1bによって与えられる平均二乗損失である。
Figure 0007114477000017
提示モデルは、1つまたは複数のパラメータθが、独立変数と従属変数との間の依存性を数学的に明記する、パラメトリックモデルであり得る。典型的に、損失関数(yi∈S, ui∈S; θ)を最小化するパラメトリックタイプの提示モデルの種々のパラメータは、例えば、バッチ勾配アルゴリズム、確率的勾配アルゴリズムなどの、勾配ベースの数値的最適化アルゴリズムを通して決定される。あるいは、提示モデルは、モデル構造が、訓練データ170から決定され、固定されたパラメータのセットに厳密には基づかない、ノンパラメトリックモデルであり得る。
VIII.B. アレル毎モデル
訓練モジュール316は、アレル毎ベースでペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルを構築し得る。この例において、訓練モジュール316は、単一のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170におけるデータ例Sに基づいて、提示モデルを訓練し得る。
1つの実施形態において、訓練モジュール316は、
Figure 0007114477000018
によって、特定のアレルhについてのペプチドpkの推定提示尤度ukをモデル化し、式中、ペプチド配列xh kは、ペプチドpkおよび対応するMHCアレルhについてのコード化されたアレル相互作用変数を意味し、f(・)は、任意の関数であり、記載の便宜上、本明細書中を通して変換関数と呼ばれる。さらに、gh(・)は、任意の関数であり、記載の便宜上、本明細書中を通して依存性関数と呼ばれ、MHCアレルhについて決定されたパラメータθhのセットに基づいて、アレル相互作用変数xh kについての依存性スコアを生成する。各MHCアレルhについてのパラメータθhのセットの値は、θhに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルhを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。
依存性関数gh(xh k;θh)の出力は、MHCアレルhが、少なくともアレル相互作用特性xh kに基づいて、および特に、ペプチドpkのペプチド配列のアミノ酸の位置に基づいて、対応する新生抗原を提示するかどうかを示す、MHCアレルhについての依存性スコアを表す。例えば、MHCアレルhについての依存性スコアは、MHCアレルhが、ペプチドpkを提示する可能性が高い場合に、高い値を有し得、提示の可能性が高くない場合に、低い値を有し得る。変換関数f(・)は、入力を変換し、より具体的には、この例においてgh(xh k;θh)によって生成された依存性スコアを、ペプチドpkがMHCアレルによって提示されるであろう尤度を示す適切な値に変換する。
本明細書の残りの部分を通して言及される1つの特定の実施形態において、f(・)は、適切なドメイン範囲について[0, 1]内の範囲を有する関数である。1つの例において、f(・)は、
Figure 0007114477000019
によって与えられるexpit関数である。別の例として、f(・)はまた、ドメインzの値が0以上である場合、
Figure 0007114477000020
によって与えられる双曲線正接関数であることもできる。あるいは、予測が、範囲[0, 1]の外側の値を有する質量分析イオン電流についてなされる場合、f(・)は、例えば、恒等関数、指数関数、log関数などの任意の関数であることができる。
したがって、ペプチド配列pkがMHCアレルhによって提示されるであろうアレル毎尤度は、MHCアレルhについての依存性関数gh(・)をペプチド配列pkのコード化されたバージョンに適用して、対応する依存性スコアを生成することによって、生成することができる。依存性スコアは、ペプチド配列pkがMHCアレルhによって提示されるであろうアレル毎尤度を生成するように、変換関数f(・)によって変換されてもよい。
VIII.B.1 アレル相互作用変数についての依存性関数
本明細書を通して言及される1つの特定の実施形態において、依存性関数gh(・)は、xh kにおける各アレル相互作用変数を、関連するMHCアレルhについて決定されたパラメータθhのセットにおける対応するパラメータと線形結合する、
Figure 0007114477000021
によって与えられるアフィン関数である。
本明細書を通して言及される別の特定の実施形態において、依存性関数gh(・)は、1つまたは複数の層において配置された一連のノードを有するネットワークモデルNNh(・)によって表される、
Figure 0007114477000022
によって与えられるネットワーク関数である。ノードは、パラメータθhのセットにおける関連するパラメータを各々有する接続を通して、他のノードに接続され得る。1つの特定のノードでの値は、特定のノードに関連する活性化関数によってマッピングされた関連するパラメータによって重み付けられた、特定のノードに接続されたノードの値の和として表され得る。アフィン関数と対照的に、ネットワークモデルは、提示モデルが非線形性、および異なる長さのアミノ酸配列を有するプロセスデータを組み入れることができるため、有利である。具体的には、非線形モデリングを通して、ネットワークモデルは、ペプチド配列中の異なる位置のアミノ酸間の相互作用、およびこの相互作用がペプチド提示にいかに影響を及ぼすかを捕捉することができる。
概して、ネットワークモデルNNh(・)は、人工ニューラルネットワーク（ANN）、畳み込みニューラルネットワーク（CNN）、深層ニューラルネットワーク（DNN）などのフィードフォワードネットワーク、および／または、長・短期記憶ネットワーク（LSTM）、双方向再帰型ネットワーク、深層双方向再帰型ネットワークなどの再帰型ネットワークなどとして、構造化され得る。
本明細書の残りの部分を通して言及される1つの例において、h=1,2, ..., mにおける各MHCアレルは、別々のネットワークモデルに関連し、NNh(・)は、MHCアレルhに関連するネットワークモデルからの出力を意味する。
図5は、任意のMHCアレルh=3に関連した例示的なネットワークモデルNN3(・)を説明する。図5に示すように、MHCアレルh=3についてのネットワークモデルNN3(・)は、層l=1での3種類の入力ノード、層l=2での4種類のノード、層l=3での2種類のノード、および層l=4での1種類の出力ノードを含む。ネットワークモデルNN3(・)は、10種類のパラメータθ3(1), θ3(2), ..., θ3(10)のセットに関連している。ネットワークモデルNN3(・)は、MHCアレルh=3についての3種類のアレル相互作用変数x3 k(1)、x3 k(2)、およびx3 k(3)についての入力値（コード化されたポリペプチド配列データおよび使用される任意の他の訓練データを含む、個々のデータ例）を受け取り、値NN3(x3 k)を出力する。
別の例において、特定されたMHCアレルh=1,2, ..., mは、単一ネットワークモデルNNH(・)に関連しており、NNh(・)は、MHCアレルhに関連する単一ネットワークモデルの1つまたは複数の出力を意味する。そのような例において、パラメータθhのセットは、単一ネットワークモデルについてのパラメータのセットに対応し得、したがって、パラメータθhのセットは、すべてのMHCアレルによって共有され得る。
図6Aは、MHCアレルh=1,2, ..., mによって共有される例示的なネットワークモデルNNH(・)を説明する。図6Aに示すように、ネットワークモデルNNH(・)は、MHCアレルに各々対応する、m個の出力ノードを含む。ネットワークモデルNN3(・)は、MHCアレルh=3についてのアレル相互作用変数x3 kを受け取り、MHCアレルh=3に対応する値NN3(x3 k)を含む、m個の値を出力する。
さらに別の例において、単一ネットワークモデルNNH(・)は、MHCアレルhのアレル相互作用変数xh kおよびコード化されたタンパク質配列dhを与えられて依存性スコアを出力する、ネットワークモデルであり得る。そのような例において、パラメータθhのセットは、再び、単一ネットワークモデルについてのパラメータのセットに対応し得、したがって、パラメータθhのセットは、すべてのMHCアレルによって共有され得る。したがって、そのような例において、NNh(・)は、単一ネットワークモデルに対して入力[xh k dh]を与えられた、単一ネットワークモデルNNH(・)の出力を意味する。そのようなネットワークモデルは、訓練データにおいて未知であったMHCアレルについてのペプチド提示確率を、単にそれらのタンパク質配列を特定することによって正しく予測することができるため、有利である。
図6Bは、MHCアレルによって共有される例示的なネットワークモデルNNH(・)を説明する。図6Bに示すように、ネットワークモデルNNH(・)は、MHCアレルh=3のアレル相互作用変数およびタンパク質配列を入力として受け取り、MHCアレルh=3に対応する依存性スコアNN3(x3 k)を出力する。
さらに別の例において、依存性関数gh(・)は、
Figure 0007114477000023
として表すことができ、式中、g'h(xh k;θ'h)は、パラメータθ'hのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、MHCアレルhについての提示のベースライン確率を表す、MHCアレルのアレル相互作用変数についてのパラメータのセットにおけるバイアスパラメータθh 0を伴う。
別の実施形態において、バイアスパラメータθh 0は、MHCアレルhの遺伝子ファミリーにしたがって共有されてもよい。すなわち、MHCアレルhについてのバイアスパラメータθh 0はθ遺伝子(h) 0と同等であり得、遺伝子(h)は、MHCアレルhの遺伝子ファミリーである。例えば、MHCアレルHLA-A*02:01、HLA-A*02:02、およびHLA-A*02:03は、「HLA-A」の遺伝子ファミリーに割り当てられてもよく、これらのMHCアレルの各々についてのバイアスパラメータθh 0が共有されてもよい。
例として、方程式（2）に戻ると、アフィン依存性関数gh(・)を用いた、m=4の異なる特定されたMHCアレルの中でMHCアレルh=3によってペプチドpkが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007114477000024
によって生成することができ、式中、x3 kは、MHCアレルh=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ3は、損失関数最小化を通してMHCアレルh=3について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、別々のネットワーク変換関数gh(・)を用いた、m=4の異なる特定されたMHCアレルの中でMHCアレルh=3によってペプチドpkが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007114477000025
によって生成することができ、式中、x3 kは、MHCアレルh=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ3は、MHCアレルh=3に関連するネットワークモデルNN3(・)について決定されたパラメータのセットである。
図7は、例示的なネットワークモデルNN3(・)を用いた、MHCアレルh=3に関連したペプチドpkの提示尤度の生成を説明する。図7に示すように、ネットワークモデルNN3(・)は、MHCアレルh=3についてのアレル相互作用変数x3 kを受け取り、出力NN3(x3 k)を生成する。出力は、関数f(・)によってマッピングされて、推定提示尤度ukを生成する。
VIII.B.2.アレル非相互作用変数を伴うアレル毎
1つの実施形態において、訓練モジュール316は、アレル非相互作用変数を組み入れて、
Figure 0007114477000026
によって、ペプチドpkの推定提示尤度ukをモデル化し、式中、wkは、ペプチドpkについてのコード化されたアレル非相互作用変数を意味し、gw(・)は、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータθwのセットに基づく、アレル非相互作用変数wkについての関数である。具体的には、各MHCアレルhについてのパラメータθhのセットおよびアレル非相互作用変数についてのパラメータθwのセットの値を、θhおよびθwに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。
依存性関数gw(wk;θw)の出力は、アレル非相互作用変数の影響に基づいて、1つまたは複数のMHCアレルによってペプチドpkが提示されるかどうかを示す、アレル非相互作用変数についての依存性スコアを表す。例えば、アレル非相互作用変数についての依存性スコアは、ペプチドpkの提示に正の影響を及ぼすことが公知であるC末端隣接配列とペプチドpkが結合している場合は、高い値を有し得、ペプチドpkの提示に負の影響を及ぼすことが公知であるC末端隣接配列とペプチドpkが結合している場合は、低い値を有し得る。
方程式（8）によると、ペプチド配列pkがMHCアレルhによって提示されるであろうアレル毎尤度は、MHCアレルhについての関数gh(・)を、ペプチド配列pkのコード化されたバージョンに適用して、アレル相互作用変数について対応する依存性スコアを生成することによって、生成することができる。アレル非相互作用変数についての関数gw(・)もまた、アレル非相互作用変数についての依存性スコアを生成するように、アレル非相互作用変数のコード化されたバージョンに適用される。両方のスコアが組み合わされ、組み合わされたスコアが、MHCアレルhによってペプチド配列pkが提示されるであろうアレル毎尤度を生成するように、変換関数f(・)によって変換される。
あるいは、訓練モジュール316は、方程式（2）においてアレル非相互作用変数wkをアレル相互作用変数xh kに付加することにより、予測におけるアレル非相互作用変数wkを含んでもよい。したがって、提示尤度は、
Figure 0007114477000027
によって与えられ得る。
VIII.B.3 アレル非相互作用変数についての依存性関数
アレル相互作用変数についての依存性関数gh(・)と同様に、アレル非相互作用変数についての依存性関数gw(・)は、アフィン関数、または別々のネットワークモデルがアレル非相互作用変数wkに関連しているネットワーク関数であり得る。
具体的には、依存性関数gw(・)は、wkにおけるアレル非相互作用変数を、パラメータθwのセットにおける対応するパラメータと線形結合する、
Figure 0007114477000028
によって与えられるアフィン関数である。
依存性関数gw(・)はまた、パラメータθwのセットにおける関連するパラメータを有するネットワークモデルNNw(・)によって表される、
Figure 0007114477000029
によって与えられるネットワーク関数である。
別の例において、アレル非相互作用変数についての依存性関数gw(・)は、
Figure 0007114477000030
によって与えられ得、式中、g'w(wk;θ'w)は、アレル非相互作用パラメータθ'wのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、mkは、ペプチドpkについてのmRNA定量測定値であり、h(・)は、定量測定値を変換する関数であり、かつθw mは、mRNA定量測定値についての依存性スコアを生成するようにmRNA定量測定値と組み合わされる、アレル非相互作用変数についてのパラメータのセットにおけるパラメータである。本明細書の残りの部分を通して言及される1つの特定の態様において、h(・)はlog関数であるが、実際には、h(・)は、様々な異なる関数のうちのいずれか1つであり得る。
さらに別の例において、アレル非相互作用変数についての依存性関数gw(・)は、
Figure 0007114477000031
によって与えられ、式中、g'w(wk;θ'w)は、アレル非相互作用パラメータθ'wのセットを伴うアフィン関数、ネットワーク関数などであり、okは、ペプチドpkについてヒトプロテオームにおけるタンパク質およびアイソフォームを表す上記の指標ベクトルであり、かつθw oは、指標ベクトルと組み合わされるアレル非相互作用変数についてのパラメータのセットにおける、パラメータのセットである。1つのバリエーションにおいて、okおよびパラメータθw oのセットの次元が有意に高い場合、
Figure 0007114477000032
（||・||は、L1ノルム、L2ノルム、組み合わせなどを表す）などのパラメータ正則化項を、パラメータの値を決定する時に損失関数に付加することができる。ハイパーパラメータλの最適値を、適切な方法を通して決定することができる。
例として、方程式（8）に戻ると、アフィン変換関数gh(・)、gw(・)を用いた、m=4の異なる特定されたMHCアレルの中でMHCアレルh=3によってペプチドpkが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007114477000033
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、ネットワーク変換関数gh(・)、gw(・)を用いた、m=4の異なる特定されたMHCアレルの中でMHCアレルh=3によってペプチドpkが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007114477000034
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
図8は、例示的なネットワークモデルNN3(・)およびNNw(・)を用いた、MHCアレルh=3に関連したペプチドpkの提示尤度の生成を説明する。図8に示すように、ネットワークモデルNN3(・)は、MHCアレルh=3についてのアレル相互作用変数x3 kを受け取り、出力NN3(x3 k)を生成する。ネットワークモデルNNw(・)は、ペプチドpkについてのアレル非相互作用変数wkを受け取り、出力NNw(wk)を生成する。出力は、組み合わされ、関数f(・)によってマッピングされて、推定提示尤度ukを生成する。
VIII.C. 複数アレルモデル
訓練モジュール316はまた、2つ以上のMHCアレルが存在する複数アレル設定においてペプチドの提示尤度を予測するための提示モデルを構築し得る。この例において、訓練モジュール316は、単一のMHCアレルを発現する細胞、複数のMHCアレルを発現する細胞、またはそれらの組み合わせから生成された訓練データ170におけるデータ例Sに基づいて、提示モデルを訓練し得る。
VIII.C.1. 実施例1：アレル毎モデルの最大値
1つの実施形態において、訓練モジュール316は、複数のMHCアレルHのセットに関連したペプチドpkの推定提示尤度ukを、方程式（2）～（11）と共に上記で説明したような、単一アレルを発現する細胞に基づいて決定されたセットHにおけるMHCアレルhの各々について決定された提示尤度
Figure 0007114477000035
の関数としてモデル化する。具体的には、提示尤度ukは、
Figure 0007114477000036
の任意の関数であることができる。1つの実施形態において、方程式（12）に示すように、関数は最大値関数であり、提示尤度ukは、セットHにおける各MHCアレルhについての提示尤度の最大値として決定することができる。
Figure 0007114477000037
VIII.C.2. 実施例2.1：和の関数モデル
1つの実施形態において、訓練モジュール316は、ペプチドpkの推定提示尤度ukを、
Figure 0007114477000038
によってモデル化し、式中、要素ah kは、ペプチド配列pkに関連する複数のMHCアレルHについて1であり、xh kは、ペプチドpkおよび対応するMHCアレルについてのコード化されたアレル相互作用変数を意味する。各MHCアレルhについてのパラメータθhのセットの値は、θhに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞および／または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。依存性関数ghは、節VIII.B.1.において上記で導入された依存性関数ghのいずれかの形態であり得る。
方程式（13）によると、ペプチド配列pkが1つまたは複数のMHCアレルhによって提示されるであろう提示尤度は、依存性関数gh(・)を、MHCアレルHの各々についてペプチド配列pkのコード化されたバージョンに適用して、アレル相互作用変数についての対応するスコアを生成することによって、生成することができる。各MHCアレルhについてのスコアが組み合わされて、ペプチド配列pkがMHCアレルHのセットによって提示されるであろう提示尤度を生成するように変換関数f(・)によって変換される。
方程式（13）の提示モデルは、各ペプチドpkについての関連するアレルの数が1よりも大きいことができる点で、方程式（2）のアレル毎モデルとは異なる。換言すると、ah kにおける1つよりも多い要素が、ペプチド配列pkに関連する複数のMHCアレルHについて1の値を有することができる。
例として、アフィン変換関数gh(・)を用いた、m=4の異なる特定されたMHCアレルの中でMHCアレルh=2、h=3によってペプチドpkが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007114477000039
によって生成することができ、式中、x2 k、x3 kは、MHCアレルh=2、h=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、ネットワーク変換関数gh(・)、gw(・)を用いた、m=4の異なる特定されたMHCアレルの中でMHCアレルh=2、h=3によってペプチドpkが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007114477000040
によって生成することができ、式中、NN2(・)、NN3(・)は、MHCアレルh=2、h=3について特定されたネットワークモデルであり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
図9は、例示的なネットワークモデルNN2(・)およびNN3(・)を用いた、MHCアレルh=2、h=3に関連したペプチドpkの提示尤度の生成を説明する。図9に示すように、ネットワークモデルNN2(・)は、MHCアレルh=2についてのアレル相互作用変数x2 kを受け取り、出力NN2(x2 k)を生成し、ネットワークモデルNN3(・)は、MHCアレルh=3についてのアレル相互作用変数x3 kを受け取り、出力NN3(x3 k)を生成する。出力は、組み合わされ、関数f(・)によってマッピングされて、推定提示尤度ukを生成する。
VIII.C.3. 実施例2.2：アレル非相互作用変数を伴う和の関数モデル
1つの実施形態において、訓練モジュール316は、アレル非相互作用変数を組み入れて、
Figure 0007114477000041
によって、ペプチドpkの推定提示尤度ukをモデル化し、式中、wkは、ペプチドpkについてのコード化されたアレル非相互作用変数を意味する。具体的には、各MHCアレルhについてのパラメータθhのセットおよびアレル非相互作用変数についてのパラメータθwのセットの値を、θhおよびθwに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞および／または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。依存性関数gwは、節VIII.B.3.において上記で導入された依存性関数gwのいずれかの形態であり得る。
したがって、方程式（14）によると、1つまたは複数のMHCアレルHによってペプチド配列pkが提示されるであろう提示尤度は、関数gh(・)を、MHCアレルHの各々についてペプチド配列pkのコード化されたバージョンに適用して、各MHCアレルhのアレル相互作用変数について対応する依存性スコアを生成することによって、生成することができる。アレル非相互作用変数についての関数gw(・)もまた、アレル非相互作用変数についての依存性スコアを生成するように、アレル非相互作用変数のコード化されたバージョンに適用される。スコアが組み合わされ、組み合わされたスコアが、MHCアレルHによってペプチド配列pkが提示されるであろう提示尤度を生成するように、変換関数f(・)によって変換される。
方程式（14）の提示モデルにおいて、各ペプチドpkについての関連するアレルの数は、1よりも大きいことができる。換言すると、ah kにおける1つよりも多い要素が、ペプチド配列pkに関連する複数のMHCアレルHについて1の値を有することができる。
例として、アフィン変換関数gh(・)、gw(・)を用いた、m=4の異なる特定されたMHCアレルの中でMHCアレルh=2、h=3によってペプチドpkが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007114477000042
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、ネットワーク変換関数gh(・)、gw(・)を用いた、m=4の異なる特定されたMHCアレルの中でMHCアレルh=2、h=3によってペプチドpkが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007114477000043
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
図10は、例示的なネットワークモデルNN2(・)、NN3(・)、およびNNw(・)を用いた、MHCアレルh=2、h=3に関連したペプチドpkの提示尤度の生成を説明する。図10に示すように、ネットワークモデルNN2(・)は、MHCアレルh=2についてのアレル相互作用変数x2 kを受け取り、出力NN2(x2 k)を生成する。ネットワークモデルNN3(・)は、MHCアレルh=3についてのアレル相互作用変数x3 kを受け取り、出力NN3(x3 k)を生成する。ネットワークモデルNNw(・)は、ペプチドpkについてのアレル非相互作用変数wkを受け取り、出力NNw(wk)を生成する。出力は、組み合わされ、関数f(・)によってマッピングされて、推定提示尤度ukを生成する。
あるいは、訓練モジュール316は、方程式（15）においてアレル非相互作用変数wkをアレル相互作用変数xh kに付加することにより、予測におけるアレル非相互作用変数wkを含んでもよい。したがって、提示尤度は、
Figure 0007114477000044
によって与えられ得る。
VIII.C.4. 実施例3.1：暗黙のアレル毎尤度を用いたモデル
別の実施形態において、訓練モジュール316は、ペプチドpkの推定提示尤度ukを、
Figure 0007114477000045
によってモデル化し、式中、要素ah kは、ペプチド配列pkに関連する複数のMHCアレルh∈Hについて1であり、u'k h は、MHCアレルhについての暗黙のアレル毎提示尤度であり、ベクトルvは、要素vhがah k・u'k hに対応するベクトルであり、s(・)は、vの要素をマッピングする関数であり、かつr(・)は、入力の値を所定の範囲中にクリップするクリッピング関数である。より詳細に下記に記載するように、s(・)は、総和関数または二次関数であってもよいが、他の態様において、s(・)は、最大値関数などの任意の関数であり得ることが認識される。暗黙のアレル毎尤度についてのパラメータθのセットの値は、θに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞および／または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。
方程式（17）の提示モデルにおける提示尤度は、各々が、個々のMHCアレルhによってペプチドpkが提示されるであろう尤度に対応する、暗黙のアレル毎提示尤度u'k hの関数としてモデル化される。暗黙のアレル毎尤度は、暗黙のアレル毎尤度についてのパラメータが、単一アレル設定に加えて、提示されるペプチドと対応するMHCアレルとの間の直接の関連が未知である複数アレル設定から学習され得る点で、節VIII.Bのアレル毎提示尤度とは異なる。したがって、複数アレル設定において、提示モデルは、ペプチドpkが全体としてMHCアレルHのセットによって提示されるかどうかを推定できるだけではなく、どのMHCアレルhがペプチドpkを提示した可能性が最も高いかを示す個々の尤度
Figure 0007114477000046
も提供することもできる。これの利点は、提示モデルが、単一のMHCアレルを発現する細胞についての訓練データを伴わずに暗黙の尤度を生成できることである。
本明細書の残りの部分を通して言及される1つの特定の実施形態において、r(・)は、範囲[0, 1]を有する関数である。例えば、r(・)は、クリップ関数：
r(z)＝min(max(z,0), 1)
であってもよく、zと1の間の最小値が、提示尤度ukとして選ばれる。別の実施形態において、r(・)は、
r(z)＝tanh(z)
として与えられる双曲線正接関数であり、ドメインzの値は、0以上である。
VIII.C.5. 実施例3.2：関数の和モデル
1つの特定の実施形態において、s(・)は、総和関数であり、提示尤度は、暗黙のアレル毎提示尤度を総和することによって与えられる。
Figure 0007114477000047
1つの実施形態では、MHCアレルhについての暗黙のパーアレル提示尤度を、
Figure 0007114477000048
によって生成して、提示尤度が、
Figure 0007114477000049
によって推定されるようにする。
方程式（19）によると、1つまたは複数のMHCアレルHによってペプチド配列pkが提示されるであろう提示尤度は、関数gh(・)を、MHCアレルHの各々についてペプチド配列pkのコード化されたバージョンに適用して、アレル相互作用変数についての対応する依存性スコアを生成することによって、生成することができる。各依存性スコアは、最初に、暗黙のアレル毎提示尤度u'k hを生成するように、関数f(・)によって変換される。アレル毎尤度u'k hが組み合わされ、組み合わされた尤度にクリッピング関数が、値を範囲[0, 1]中にクリップするために適用されて、ペプチド配列pkがMHCアレルHのセットによって提示されるであろう提示尤度が生成され得る。依存性関数ghは、節VIII.B.1.において上記で導入された依存性関数ghのいずれかの形態であり得る。
例として、アフィン変換関数gh(・)を用いた、m=4の異なる特定されたMHCアレルの中でMHCアレルh=2、h=3によってペプチドpkが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007114477000050
によって生成することができ、式中、x2 k、x3 kは、MHCアレルh=2、h=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、ネットワーク変換関数gh(・)、gw(・)を用いた、m=4の異なる特定されたMHCアレルの中でMHCアレルh=2、h=3によってペプチドpkが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007114477000051
によって生成することができ、式中、NN2(・)、NN3(・)は、MHCアレルh=2、h=3について特定されたネットワークモデルであり、θ2、θ3は、MHCアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
図11は、例示的なネットワークモデルNN2(・)およびNN3(・)を用いた、MHCアレルh=2、h=3に関連したペプチドpkの提示尤度の生成を説明する。図9に示すように、ネットワークモデルNN2(・)は、MHCアレルh=2についてのアレル相互作用変数x2 kを受け取り、出力NN2(x2 k)を生成し、ネットワークモデルNN3(・)は、MHCアレルh=3についてのアレル相互作用変数x3 kを受け取り、出力NN3(x3 k)を生成する。各出力は、関数f(・)によってマッピングされ、組み合わされて、推定提示尤度ukを生成する。
別の実施形態において、予測が、質量分析イオン電流のlogについてなされる場合、r(・)はlog関数であり、f(・)は指数関数である。
VIII.C.6. 実施例3.3：アレル非相互作用変数を伴う関数の和モデル
1つの実施形態では、MHCアレルhについての暗黙のアレル毎提示尤度を、
Figure 0007114477000052
によって生成して、提示尤度が、
Figure 0007114477000053
によって生成されるようにして、ペプチド提示に、アレル非相互作用変数の影響を組み入れる。
方程式（21）によると、1つまたは複数のMHCアレルHによってペプチド配列pkが提示されるであろう提示尤度は、関数gh(・)を、MHCアレルHの各々についてペプチド配列pkのコード化されたバージョンに適用して、各MHCアレルhのアレル相互作用変数について対応する依存性スコアを生成することによって、生成することができる。アレル非相互作用変数についての関数gw(・)もまた、アレル非相互作用変数についての依存性スコアを生成するように、アレル非相互作用変数のコード化されたバージョンに適用される。アレル非相互作用変数のスコアが、アレル相互作用変数の依存性スコアの各々に組み合わされる。組み合わされたスコアの各々が、暗黙のアレル毎提示尤度を生成するように、関数f(・)によって変換される。暗黙の尤度が組み合わされ、組み合わされた出力にクリッピング関数が、値を範囲[0,1]中にクリップするために適用されて、MHCアレルHによってペプチド配列pkが提示されるであろう提示尤度が生成され得る。依存性関数gwは、節VIII.B.3.において上記で導入された依存性関数gwのいずれかの形態であり得る。
例として、アフィン変換関数gh(・)、gw(・)を用いた、m=4の異なる特定されたMHCアレルの中でMHCアレルh=2、h=3によってペプチドpkが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007114477000054
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル非相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、ネットワーク変換関数gh(・)、gw(・)を用いた、m=4の異なる特定されたMHCアレルの中でMHCアレルh=2、h=3によってペプチドpkが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007114477000055
によって生成することができ、式中、wkは、ペプチドpkについて特定されたアレル相互作用変数であり、θwは、アレル非相互作用変数について決定されたパラメータのセットである。
図12は、例示的なネットワークモデルNN2(・)、NN3(・)、およびNNw(・)を用いた、MHCアレルh=2、h=3に関連したペプチドpkの提示尤度の生成を説明する。図12に示すように、ネットワークモデルNN2(・)は、MHCアレルh=2についてのアレル相互作用変数x2 kを受け取り、出力NN2(x2 k)を生成する。ネットワークモデルNNw(・)は、ペプチドpkについてのアレル非相互作用変数wkを受け取り、出力NNw(wk)を生成する。出力は、組み合わされ、関数f(・)によってマッピングされる。ネットワークモデルNN3(・)は、MHCアレルh=3についてのアレル相互作用変数x3 kを受け取り、出力NN3(x3 k)を生成し、これも、同じネットワークモデルNNw(・)の出力NNw(wk)と組み合わされ、関数f(・)によってマッピングされる。両方の出力が組み合わされて、推定提示尤度ukを生成する。
別の実施形態では、MHCアレルhについての暗黙のアレル毎提示尤度を、
Figure 0007114477000056
によって生成して、提示尤度が、
Figure 0007114477000057
によって生成されるようにする。
VIII.C.7. 実施例4：二次モデル
1つの実施形態において、s(・)は、二次関数であり、ペプチドpkの推定提示尤度ukは、
Figure 0007114477000058
によって与えられ、式中、要素u'k hは、MHCアレルhについての暗黙のアレル毎提示尤度である。暗黙のアレル毎尤度についてのパラメータθのセットの値は、θに関する損失関数を最小化することによって決定することができ、iは、単一のMHCアレルを発現する細胞および／または複数のMHCアレルを発現する細胞から生成された訓練データ170のサブセットSにおける各例である。暗黙のアレル毎提示尤度は、上記の方程式（18）、（20）、および（22）において示すいずれかの形態であり得る。
1つの局面において、方程式（23）のモデルは、ペプチド配列pkが、2つのMHCアレルによって同時に提示されるであろう可能性が存在し、2つのHLAアレルによる該提示は統計学的に独立していることを含意し得る。
方程式（23）によると、1つまたは複数のMHCアレルHによってペプチド配列pkが提示されるであろう提示尤度は、暗黙のアレル毎提示尤度を組み合わせること、および、MHCアレルHによってペプチド配列pkが提示されるであろう提示尤度を生成するように、MHCアレルの各ペアがペプチドpkを同時に提示するであろう尤度を総和から差し引くことによって、生成することができる。
例として、アフィン変換関数gh(・)を用いた、m=4の異なる特定されたHLAアレルの中でHLAアレルh=2、h=3によってペプチドpkが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007114477000059
によって生成することができ、式中、x2 k、x3 kは、HLAアレルh=2、h=3について特定されたアレル相互作用変数であり、θ2、θ3は、HLAアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
別の例として、ネットワーク変換関数gh(・)、gw(・)を用いた、m=4の異なる特定されたHLAアレルの中でHLAアレルh=2、h=3によってペプチドpkが提示されるであろう尤度は、
Figure 0007114477000060
によって生成することができ、式中、NN2(・)、NN3(・)は、HLAアレルh=2、h=3について特定されたネットワークモデルであり、θ2、θ3は、HLAアレルh=2、h=3について決定されたパラメータのセットである。
IX. 実施例5：予測モジュール
予測モジュール320は、配列データを受け取り、提示モデルを用いて配列データにおける候補新生抗原を選択する。具体的には、配列データは、患者の腫瘍組織細胞から抽出されたDNA配列、RNA配列、および／またはタンパク質配列であり得る。予測モジュール320は、配列データを、8～15アミノ酸を有する多数のペプチド配列pkへとプロセシングする。例えば、予測モジュール320は、所定の配列
Figure 0007114477000061
を、9アミノ酸を有する3種類のペプチド配列
Figure 0007114477000062
へとプロセシングし得る。1つの態様において、予測モジュール320は、患者の正常組織細胞から抽出された配列データを、患者の腫瘍組織細胞から抽出された配列データと比較して、1つまたは複数の変異を含有する部分を特定することによって、変異したペプチド配列である候補新生抗原を特定し得る。
提示モジュール320は、ペプチド配列の提示尤度を推定するために、提示モデルの1つまたは複数を、プロセシングされたペプチド配列に適用する。具体的には、予測モジュール320は、提示モデルを候補新生抗原に適用することによって、腫瘍HLA分子上に提示される可能性が高い1つまたは複数の候補新生抗原ペプチド配列を選択し得る。1つの実施形態において、提示モジュール320は、あらかじめ決定された閾値よりも上の推定提示尤度を有する候補新生抗原配列を選択する。別の実施形態において、提示モデルは、最も高い推定提示尤度を有するN個の候補新生抗原配列を選択する（Nは、概して、ワクチンにおいて送達することができるエピトープの最大数である）。所定の患者のために選択された候補新生抗原を含むワクチンを、免疫応答を誘導するために患者中に注射することができる。
X. 実施例6：例示的な提示モデルの性能を示す実験結果
上記の種々の提示モデルの妥当性を、提示モデルを訓練するために使用されなかった訓練データ170のサブセット、または、訓練データ170と類似した変数およびデータ構造を有する訓練データ170とは別々のデータセットであった、試験データTに対して試験した。
提示モデルの性能を示す関連性のある測定基準は、
Figure 0007114477000063
であり、これは、HLAアレル上に提示されると予測されたペプチド例の数に対する、関連するHLAアレル上に提示されると正確に予測されたペプチド例の数の比を示す。1つの実施形態において、試験データTにおけるペプチドpiは、対応する尤度推定値uiが、所定の閾値t以上である場合に、1つまたは複数の関連するHLAアレル上に提示されると予測された。提示モデルの性能を示す別の関連性のある測定基準は、
Figure 0007114477000064
であり、これは、HLAアレル上に提示されることが公知であったペプチド例の数に対する、関連するHLAアレル上に提示されると正確に予測されたペプチド例の数の比を示す。提示モデルの性能を示す別の関連性のある測定基準は、受信者動作特性（ROC）の曲線下面積（AUC）である。ROCは、
Figure 0007114477000065
によって与えられる、偽陽性率（FPR）に対するリコールをプロットする。
X.A. 従来の最高技術水準（state-of-the-art）モデルに対する、質量分析データに基づく提示モデルの性能の比較
図13Aは、複数アレル質量分析データに基づいて、ペプチド提示予測について、本明細書において提示するような例示的な提示モデル、および従来の最高技術水準モデルの性能結果を比較する。結果は、例示的な提示モデルが、親和性および安定性の予測に基づく従来の最高技術水準モデルよりも有意に良好に、ペプチド提示の予測において機能したことを示した。
具体的には、図13Aに「MS」として示す例示的な提示モデルは、アフィン依存性関数gh(・)およびexpit関数f(・)を用いた、方程式（12）に示すアレル毎提示モデルの最大値であった。例示的な提示モデルは、IEDBデータセット由来の単一アレルHLA-A*02:01質量分析データ（データセット「D1」）（データは、http://www.iedb.org/doc/mhc_ligand_full.zipで見出すことができる）のサブセット、およびIEDBデータセット由来の単一アレルHLA-B*07:02質量分析（データセット「D2」）（データは、http://www.iedb.org/doc/mhc_ligand_full.zipで見出すことができる）のサブセットに基づいて訓練した。例示的な提示モデルが、提示された抗原の配列を単に記憶できないように、試験セットにおける提示されたペプチドを含有する供給源タンパク質由来のすべてのペプチドを、訓練データから削除した。
図13Aに「親和性」として示すモデルは、親和性予測NETMHCpanに基づいてペプチド提示を予測する、現在用いられている従来の最高技術水準モデルに類似したモデルであった。NETMHCpanの実施形態は、http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/に詳細に提供される。図13Aに「安定性」として示すモデルは、安定性予測NETMHCstabに基づいてペプチド提示を予測する、現在用いられている従来の最高技術水準モデルに類似したモデルであった。NETMHCstabの実施形態は、http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCstab-1.0/に詳細に提供される。試験データは、Bassani-Sternbergデータセット由来の複数アレルJY細胞株HLA-A*02:01およびHLA-B*07:02質量分析データ（データセット「D3」）（データは、www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD000394で見出すことができる）のサブセットである。エラーバー（実線で示す）は、95％信頼区間を示す。
図13Aの結果に示すように、質量分析データに基づいて訓練された例示的な提示モデルは、MHC結合親和性予測またはMHC結合安定性予測に基づいてペプチド提示を予測する従来の最高技術水準モデルに比べて有意により高い、10％リコール率でのPPV値を有していた。具体的には、例示的な提示モデルは、親和性予測に基づくモデルよりもおよそ14％高いPPVを有し、安定性予測に基づくモデルよりもおよそ12％高いPPVを有していた。
これらの結果により、例示的な提示モデルは、たとえ提示されたペプチドを含有したタンパク質配列に基づいて訓練されなかったとしても、MHC結合親和性またはMHC結合安定性の予測に基づいてペプチド提示を予測する従来の最高技術水準モデルよりも、有意により良好な性能を有していたことが証明される。
X.B. 従来の最高技術水準モデルに対する、T細胞エピトープデータに基づく提示モデルの性能の比較
図13Bは、T細胞エピトープデータに基づいて、ペプチド提示予測について、本明細書において提示するような別の例示的な提示モデル、および従来の最高技術水準モデルの性能結果を比較する。T細胞エピトープデータは、細胞表面上のMHCアレルによって提示されT細胞によって認識されたペプチド配列を含有する。結果は、例示的な提示モデルが、たとえ質量分析データに基づいて訓練されているとしても、親和性および安定性の予測に基づく従来の最高技術水準モデルよりも有意に良好に、T細胞エピトープの予測において機能したことを示した。換言すると、図13Bの結果は、例示的な提示モデルが、質量分析試験データに基づくペプチド提示の予測において従来の最高技術水準モデルよりも良好に機能しただけではなく、T細胞によって実際に認識されたエピトープの予測においても、従来の最高技術水準モデルよりも有意に良好に機能したことを示した。これは、本明細書において提示するような様々な提示モデルが、免疫系において免疫原性応答を誘導する可能性が高い抗原の、改善された特定を提供できることのしるしである。
具体的には、図13Bに「MS」として示す例示的な提示モデルは、データセットD1のサブセットに基づいて訓練された、アフィン変換関数gh(・)およびexpit関数f(・)を用いた、方程式（2）に示すアレル毎提示モデルであった。提示モデルが、提示された抗原の配列を単に記憶できないように、試験セットにおける提示されたペプチドを含有する供給源タンパク質由来のすべてのペプチドを、訓練データから削除した。
モデルの各々を、HLA-A*02:01T細胞エピトープデータに関する質量分析データ（データセット「D4」）（データは、www.iedb.org/doc/tcell full v3.zipで見出すことができる）のサブセットである試験データに適用した。図13Bに「親和性」として示すモデルは、親和性予測NETMHCpanに基づいてペプチド提示を予測する、現在用いられている従来の最高技術水準モデルに類似したモデルであり、図13Bに「安定性」として示すモデルは、安定性予測NETMHCstabに基づいてペプチド提示を予測する、現在用いられている従来の最高技術水準モデルに類似したモデルであった。エラーバー（実線で示す）は、95％信頼区間を示す。
図13Aの結果に示すように、質量分析データに基づいて訓練されたアレル毎提示モデルは、たとえ提示モデルが、提示されたペプチドを含有したタンパク質配列に基づいて訓練されなかったとしても、MHC結合親和性またはMHC結合安定性の予測に基づいてペプチド提示を予測する従来の最高技術水準モデルよりも有意に高い、10％リコール率でのPPV値を有していた。具体的には、アレル毎提示モデルは、親和性予測に基づくモデルよりもおよそ9％高いPPVを有し、安定性予測に基づくモデルよりもおよそ8％高いPPVを有していた。
これらの結果により、質量分析データに基づいて訓練された例示的な提示モデルは、T細胞によって認識されたエピトープの予測に対して、従来の最高技術水準モデルよりも有意に良好に機能したことが証明された。
X.C. 質量分析データに基づく様々な提示モデルの性能の比較
図13Cは、複数アレル質量分析データに基づいて、ペプチド提示予測について、例示的な和の関数モデル（方程式（13））、例示的な関数の和モデル（方程式（19））、および例示的な二次モデル（方程式（23））の性能結果を比較する。結果は、関数の和モデルおよび二次モデルが、和の関数モデルよりも良好に機能したことを示した。これは、和の関数モデルが、実際にはペプチドの提示が有効に独立している場合、複数アレル設定におけるアレルが、ペプチド提示について互いに干渉し得ることを含意するためである。
具体的には、図13Cにおいて「和のシグモイド」とラベルした例示的な提示モデルは、ネットワーク依存性関数gh(・)、恒等関数f(・)、およびexpit関数r(・)を用いた、和の関数モデルであった。「シグモイドの和」とラベルした例示的なモデルは、ネットワーク依存性関数gh(・)、expit関数f(・)、および恒等関数r(・)を伴う方程式（19）における関数の和モデルであった。「双曲線正接」とラベルした例示的なモデルは、ネットワーク依存性関数gh(・)、expit関数f(・)、および双曲線正接関数r(・)を伴う方程式（19）における関数の和モデルであった。「二次」とラベルした例示的なモデルは、ネットワーク依存性関数gh(・)およびexpit関数f(・)を伴う方程式（18）において示す暗黙のアレル毎提示尤度形態を用いる、方程式（23）における二次モデルであった。各モデルを、データセットD1、D2、およびD3のサブセットに基づいて訓練した。例示的な提示モデルを、訓練データとオーバーラップしなかったデータセットD3のランダムサブセットである試験データに適用した。
図13Cに示すように、第1列は、各提示モデルを試験セットに適用した時のROCのAUCを指し、第2列は、負のlog尤度損失の値を指し、第3列は、10％リコール率でのPPVを指す。図13Cに示すように、提示モデル「シグモイドの和」、「双曲線正接」、および「二次」の性能は、およそ15～16％の10％リコールでのPPVでほぼ引き分けであり、他方、モデル「和のシグモイド」の性能は、およそ11％でわずかにより低かった。
節VIII.C.4.において以前に議論したように、結果は、提示モデル「シグモイドの和」、「双曲線正接」、および「二次」が、「和のシグモイド」モデルと比較して高いPPVの値を有することを示し、これは、いかにペプチドが複数アレル設定において各MHCアレルによって独立して提示されるかを、モデルが正確に説明するためである。
X.D. 単一アレル質量分析データに基づく訓練を伴うおよび伴わない提示モデルの性能の比較
図13Dは、複数アレル質量分析データについて、ペプチド提示予測に関して、単一アレル質量分析データを伴っておよび伴わずに訓練される2つの例示的な提示モデルの性能結果を比較する。結果は、単一アレルデータを伴わずに訓練される例示的な提示モデルが、単一アレルデータを伴って訓練される例示的な提示モデルのものに匹敵する性能を達成することを示した。
「A2/B7単一アレルデータを伴う」例示的なモデルは、ネットワーク依存性関数gh(・)、expit関数f(・)、および同一性関数r(・)を伴う、方程式（19）における「シグモイドの和」提示モデルであった。モデルを、データセットD3のサブセット、およびIEDBデータベース由来の様々なMHCアレルについての単一アレル質量分析データ（データは、http://www.iedb.org/doc/mhc_ligand_full.zipで見出すことができる）に基づいて訓練した。「A2/B7単一アレルデータを伴わない」例示的なモデルは、同じモデルであったが、アレルHLA-A*02:01およびHLA-B*07:02についての単一アレル質量分析データを伴わないものの、他のアレルについての単一アレル質量分析データを伴う、複数アレルD3データセットのサブセットに基づいて訓練した。複数アレル訓練データ内で、細胞株HCC1937は、HLA-B*07:02を発現していたがHLA-A*02:01を発現しておらず、細胞株HCT116は、HLA-A*02:01を発現していたがHLA-B*07:02を発現していなかった。例示的な提示モデルを、データセットD3のランダムサブセットであったが訓練データとオーバーラップしなかった、試験データに適用した。
列「相関」は、ペプチドが、試験データにおける対応するアレル上に提示されたかどうかを示す実際のラベルと、予測のラベルとの間の相関を指す。図13Dに示すように、MHCアレルHLA-A*02:01についての暗黙のアレル毎提示尤度に基づく予測は、MHCアレルHLA-B*07:02についてよりもむしろMHCアレルHLA-A*02:01についての単一アレル試験データに対して、有意により良好に機能した。類似した結果が、MHCアレルHLA-B*07:02について示される。
これらの結果は、たとえペプチドと各個々のMHCアレルとの間の直接の関連が、訓練データにおいて既知でなかったとしても、提示モデルの暗黙のアレル毎提示尤度は、個々のMHCアレルに対する結合モチーフを正確に予測して識別できることを示す。
X.E. 単一アレル質量分析データに基づく訓練を伴わないアレル毎予測の性能の比較
図13Eは、図13Dに示す解析において提供されたアレルHLA-A*02:01およびHLA-B*07:02についての単一アレル質量分析データに基づく、図13Dに示す「A2/B7単一アレルデータを伴わない」および「A2/B7単一アレルデータを伴う」例示的なモデルの性能を示す。結果は、たとえ例示的な提示モデルがこれらの2つのアレルについての単一アレル質量分析データを伴わずに訓練されるとしても、モデルが各MHCアレルについての結合モチーフを学習できることを示す。
図13Eに示すように、「B7を予測するA2モデル」は、ペプチド提示が、MHCアレルHLA-A*02:01についての暗黙のアレル毎提示尤度推定値に基づいて、単一アレルHLA-B*07:02について予測される場合のモデルの性能を示す。同様に、「A2を予測するA2モデル」は、ペプチド提示が、MHCアレルHLA-A*02:01についての暗黙のアレル毎提示尤度推定値に基づいて、単一アレルHLA-A*02:01について予測される場合のモデルの性能を示す。「B7を予測するB7モデル」は、ペプチド提示が、MHCアレルHLA-B*07:02についての暗黙のアレル毎提示尤度推定値に基づいて、単一アレルHLA-B*07:02データについて予測される場合のモデルの性能を示す。「A2を予測するB7モデル」は、ペプチド提示が、MHCアレルHLA-B*07:02についての暗黙のアレル毎提示尤度推定値に基づいて、単一アレルHLA-A*02:01について予測される場合のモデルの性能を示す。
図13Eに示すように、HLAアレルについての暗黙のアレル毎尤度の予測能力は、意図されるアレルについて有意により高く、他のHLAアレルについて有意により低い。図13Dに示す結果と同様に、たとえペプチド提示とこれらのアレルとの間の直接の関連が、複数アレル訓練データ中に存在しなかったとしても、例示的な提示モデルは、個々のアレルHLA-A*02:01およびHLA-B*07:02のペプチド提示を差別化するように正確に学習した。
X.F. アレル毎予測において頻繁に起こるアンカー残基は、公知の標準的なアンカーモチーフと一致する
図13Fは、図13Dに示す「A2/B7単一アレルデータを伴わない」例示的なモデルによって予測される、九量体の中で一般的な2位および9位のアンカー残基を示す。ペプチドは、推定尤度が5％よりも上であった場合に、提示されることが予測された。結果は、MHCアレルHLA-A*02:01およびHLA-B*07:02上での提示について特定されたペプチドにおける最も一般的なアンカー残基が、これらのMHCアレルについて既知のアンカーモチーフと一致したことを示す。これは、例示的な提示モデルが、期待されたように、ペプチド配列のアミノ酸の特定の位置に基づいて、ペプチド結合を正確に学習したことを示す。
図13Fに示すように、2位のアミノ酸L/Mおよび9位のアミノ酸V/Lは、HLA-A*02:01について（https://link.springer.com/article/10.1186/1745-7580-4-2の表4に示されるような）標準的なアンカー残基モチーフであることが公知であり、2位のアミノ酸Pおよび9位のアミノ酸L/Vは、HLA-B*07:02について標準的なアンカー残基モチーフであることが公知であった。モデルによって特定されたペプチドについての2位および9位の最も一般的なアンカー残基モチーフは、両方のHLAアレルについて公知の標準的なアンカー残基モチーフと一致した。
X.G. アレル非相互作用変数を伴うおよび伴わない提示モデルの性能の比較
図13Gは、C末端隣接配列およびN末端隣接配列をアレル相互作用変数として組み入れた例示的な提示モデルと、C末端隣接配列およびN末端隣接配列をアレル非相互作用変数として組み入れた例示的な提示モデルとの間の性能結果を比較する。結果は、C末端隣接配列およびN末端隣接配列のアレル非相互作用変数としての組み入れが、モデル性能を有意に改善したことを示した。より具体的には、様々なMHCアレルにわたって共通である、ペプチド提示に適切な特性を特定し、これらのアレル非相互作用変数についての統計学的強度が、提示モデルの性能を改善するためにMHCアレルにわたって共有されるように、それらをモデル化することが、価値を有する。
例示的な「アレル相互作用」モデルは、ネットワーク依存性関数gh(・)およびexpit関数f(・)を伴う、C末端隣接配列およびN末端隣接配列をアレル相互作用変数として組み入れた方程式（22）における暗黙のアレル毎提示尤度の形態を用いた、関数の和モデルであった。例示的な「アレル非相互作用」モデルは、ネットワーク依存性関数gh(・)およびexpit関数f(・)を伴う、C末端隣接配列およびN末端隣接配列をアレル非相互作用変数として組み入れた方程式（21）に示す、関数の和モデルであった。アレル非相互作用変数は、別々のネットワーク依存性関数gw(・)を通してモデル化した。両方のモデルを、データセットD3のサブセット、およびIEDBデータベース由来の様々なMHCアレルについての単一アレル質量分析データ（データは、http://www.iedb.org/doc/mhc_ligand_full.zipで見出すことができる）に基づいて訓練した。提示モデルの各々を、訓練データとオーバーラップしなかったデータセットD3のランダムサブセットである試験データセットに適用した。
図13Gに示すように、例示的な提示モデルにおけるC末端隣接配列およびN末端隣接配列のアレル非相互作用変数としての組み入れは、それらのアレル相互作用変数としてのモデル化と比べて、PPV値においておよそ3％の改善を達成した。これは、概して、「アレル非相互作用」の例示的な提示モデルが、別々のネットワーク依存性関数での効果を、コンピュータ計算力における非常に少ない付加しか伴わずにモデル化することによって、MHCアレルにわたるアレル非相互作用変数の統計学的強度を共有できたためである。
X.H. 提示されるペプチドとmRNA定量との間の依存性
図13Hは、腫瘍細胞に対する質量分析データについて、mRNA定量に基づく遺伝子と提示されるペプチドの画分との間の依存性を説明する。結果は、mRNA発現とペプチド提示との間に強い依存性があることを示す。
具体的には、図13Gにおける横軸は、100万あたりの転写産物（TPM：transcripts per million）四分位に換算したmRNA発現を示す。図13Gにおける縦軸は、対応するmRNA発現四分位における、遺伝子由来の提示されるエピトープの画分を示す。各実線は、対応する質量分析データおよびmRNA発現測定値に関連する、腫瘍試料由来の2つの測定値に関するプロットである。図13Gに示すように、mRNA発現と、対応する遺伝子におけるペプチドの画分との間には、強い正の相関がある。具体的には、RNA発現の最上位の四分位点における遺伝子由来のペプチドは、最下位の四分位点よりも、提示される可能性が20倍を超えて高い。さらに、本質的に0個のペプチドが、RNAを通して検出されない遺伝子から提示される。
結果は、mRNA定量測定値がペプチド提示を強く予測するため、これらの測定値を組み入れることによって提示モデルの性能を大きく改善できることを示す。
X.I. RNA定量データの組み入れを伴う提示モデルの性能の比較
図13Iは、2つの例示的な提示モデルの性能を示し、そのうち1つは、質量分析腫瘍細胞データに基づいて訓練されており、もう1つは、mRNA定量データおよび質量分析腫瘍細胞データを組み入れている。図13Hから期待されるように、mRNA発現はペプチド提示の強い指標であるため、結果は、mRNA定量測定値を例示的な提示モデルに組み入れることによって、性能の有意な改善があることを示した。
「MHCflurry＋RNAフィルター」は、親和性予測に基づいてペプチド提示を予測する、現在用いられている従来の最高技術水準モデルに類似したモデルであった。それは、3.2 FPKM未満であったmRNA定量測定値を有するタンパク質由来のすべてのペプチドを除去した標準的な遺伝子発現フィルターと共にMHCflurryを用いて、実施した。MHCflurryの実施形態は、https://github.com/hammerlab/mhcflurry/およびhttp://biorxiv.org/content/early/2016/05/22/054775に詳細に提供されている。「例示的なモデル、RNAなし」モデルは、ネットワーク依存性関数gh(・)、ネットワーク依存性関数gw(・)、およびexpit関数f(・)を伴う、方程式（21）に示す「シグモイドの和」の例示的な提示モデルであった。「例示的なモデル、RNAなし」モデルは、ネットワーク依存性関数gw(・)を通して、C末端隣接配列をアレル非相互作用変数として組み入れた。
「例示的なモデル、RNAあり」モデルは、ネットワーク依存性関数gh(・)、log関数を通してmRNA定量データを組み入れる方程式（10）におけるネットワーク依存性関数gw(・)、およびexpit関数f(・)を伴う、方程式（19）に示す「シグモイドの和」提示モデルであった。「例示的なモデル、RNAあり」モデルは、ネットワーク依存性関数gw(・)を通してC末端隣接配列をアレル非相互作用変数として組み入れ、log関数を通してmRNA定量測定値を組み入れた。
各モデルを、IEDBデータセット由来の単一アレル質量分析データ、Bassani-Sternbergデータセット由来の複数アレル質量分析データからの7細胞株、および20種類の質量分析腫瘍試料の組み合わせに基づいて訓練した。各モデルを、合計52,156,840種類のペプチド由来の9,830種類の提示されたペプチドを構成した、7腫瘍試料由来の5,000種類の提供されたタンパク質を含む試験セットに適用した。
図13Iの最初の2つの棒グラフに示すように、「例示的なモデル、RNAなし」モデルは、21％の、20％リコールでのPPV値を有するが、従来の最高技術水準モデルのものはおよそ3％である。これは、mRNA定量測定値の組み入れを伴わないにもかかわらず、PPV値における18％の最初の性能の改善を示す。図13Iの3番目の棒グラフに示すように、mRNA定量データを提示モデル中に組み入れる「例示的なモデル、RNAあり」モデルは、およそ30％のPPV値を示し、これは、mRNA定量測定値を伴わない例示的な提示モデルと比較して、ほぼ10％の性能の増大である。
したがって、結果は、図13Hにおける知見から期待されるように、mRNA発現は、実際にペプチド予測の強い予測因子であり、それにより、計算的複雑性の非常に少ない付加しか伴わずに提示モデルの性能の有意な改善が可能になることを示す。
X.J. MHCアレルHLA-C * 16:04について決定されたパラメータの例
図13Jは、図13Iに関して説明した「例示的なモデル、RNAあり」提示モデルによって生成された結果と、ペプチド提示を予測する時にペプチド長を計上しない従来の最高技術水準モデルによって予測された結果との間で、様々なペプチド長についてのペプチド提示の確率を比較する。結果は、図13I由来の「例示的なモデル、RNAあり」の例示的な提示モデルが、異なる長さのペプチドにわたって尤度の変動を捕捉したことを示した。
横軸は、長さ8、9、10、および11を有するペプチドの試料を意味した。縦軸は、ペプチドの長さに条件付けられたペプチド提示の確率を意味した。「実際の試験データの確率」のプロットは、試料試験データセットにおけるペプチドの長さに応じた、提示されるペプチドの割合を示した。提示尤度は、ペプチドの長さと共に変動した。例えば、図13Jに示すように、標準的なHLA-A2 L/Vアンカーモチーフを有する10マーペプチドは、同じアンカー残基を有する9マーよりも、提示される可能性がおよそ3倍低かった。「長さを無視するモデル」のプロットは、ペプチド長を無視する従来の最高技術水準モデルが、提示予測のために同じ試験データセットに適用された場合の、予測された測定値を示した。これらのモデルは、ペプチド長に応じたペプチド提示における変動を考慮に入れない、バージョン4.0の前のNetMHCバージョン、バージョン3.0の前のNetMHCpanバージョン、およびMHCflurryであってもよい。図13Jに示すように、提示されるペプチドの割合は、ペプチド長の異なる値にわたって一定であることになり、これらのモデルは、長さに応じたペプチド提示における変動を捕捉できないであろうことが示される。「Gritstone、RNAあり」のプロットは、「Gritstone、RNAあり」提示モデルから生成された測定値を示した。図13Jに示すように、「Gritstone、RNAあり」モデルによって生成された測定値は、「実際の試験データの確率」に示すものに密接に追従し、長さ8、9、10、および11についてのペプチド提示の異なる程度を正確に説明した。
したがって、結果は、本明細書に提示したような例示的な提示モデルが、9マーペプチドについてだけではなく、HLAクラスIアレルにおいて提示されるペプチドの最大40％を占める、8～15の他の長さのペプチドについても、改善された予測を生成したことを示した。
X.K. MHCアレルHLA-C*16:04について決定されたパラメータの例
以下は、hによって意味されるMHCアレルHLA-C*16:04について、アレル毎提示モデル（方程式（2））のバリエーションについて決定されたパラメータのセットを示し：
Figure 0007114477000066
式中、relu(・)は、正規化線形ユニット（RELU：rectified linear unit）関数であり、Wh 1、bh 1、Wh 2、およびbh 2は、モデルについて決定されたパラメータθのセットである。アレル相互作用変数xh kは、ペプチド配列からなる。Wh 1の次元は(231 x 256)であり、bh 1の次元は(1 x 256)であり、Wh 2 の次元は (256 x 1)であり、かつbh 2はスカラーである。証明の目的で、bh 1、bh 2、Wh 1、およびWh 2の値を下記に列挙する。
Figure 0007114477000067
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XI．例示的なコンピュータ
図14は、図1および図3に示した実体を実施するための例示的なコンピュータ1400を説明する。コンピュータ1400は、チップセット1404に連結された少なくとも1つのプロセッサ1402を含む。チップセット1404は、メモリコントローラハブ1420および入力／出力（I/O）コントローラハブ1422を含む。メモリ1406およびグラフィックスアダプタ1412は、メモリコントローラハブ1420に連結されており、ディスプレイ1418は、グラフィックスアダプタ1412に連結されている。記憶デバイス1408、入力装置1414、およびネットワークアダプタ1416は、I/Oコントローラハブ1422に連結されている。コンピュータ1400の他の態様は、異なるアーキテクチャを有する。
記憶デバイス1408は、ハードドライブ、コンパクトディスク読み出し専用メモリ（CD-ROM）、DVD、またはソリッドステートメモリ装置などの、非一時的なコンピュータ可読の記憶媒体である。メモリ1406は、プロセッサ1402によって使用される命令およびデータを保持する。入力インターフェイス1414は、タッチスクリーンインターフェイス、マウス、トラックボール、もしくは他のタイプのポインティングデバイス、キーボード、またはそれらのいくつかの組み合わせであり、データをコンピュータ1400中に入力するために使用される。いくつかの態様において、コンピュータ1400は、ユーザーからのジェスチャーを介して、入力インターフェイス1414からの入力（例えば、コマンド）を受け取るように構成されていてもよい。グラフィックスアダプタ1412は、ディスプレイ1418上に画像および他の情報を表示する。ネットワークアダプタ1416は、コンピュータ1400を、1つまたは複数のコンピュータネットワークに連結する。
コンピュータ1400は、本明細書に記載した機能性を提供するためのコンピュータプログラムモジュールを遂行するように適合している。本明細書において使用される場合、「モジュール」という用語は、特定の機能性を提供するために使用されるコンピュータプログラム論理を指す。したがって、モジュールは、ハードウェア、ファームウェア、および／またはソフトウェアにおいて実行されることができる。1つの態様において、プログラムモジュールは、記憶デバイス1408に保存され、メモリ1406中にロードされ、プロセッサ1402によって遂行される。
図1の実体によって使用されるコンピュータ1400のタイプは、実体によって必要とされる態様およびプロセシングパワーに応じて変動することができる。例えば、提示特定システム160は、単一のコンピュータ1400、または、例えばサーバーファームにおいてネットワークを通して互いに通信する複数のコンピュータ1400において、起動することができる。コンピュータ1400は、グラフィックスアダプタ1412およびディスプレイ1418などの、上記の構成要素のうちのいくつかが無いことができる。
参照文献
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Claims (70)

  1. 以下の工程を含む、腫瘍細胞表面上に提示されている、対象の腫瘍細胞由来の1つまたは複数の新生抗原を特定するための方法：
    対象の腫瘍細胞から、エクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムの腫瘍ヌクレオチドシーケンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程であって、該腫瘍ヌクレオチドシーケンシングデータが、新生抗原のセットの各々のペプチド配列を表すデータを取得するために使用され、かつ、各新生抗原のペプチド配列が、それを対応する野生型の親ペプチド配列とは異なるものにする少なくとも1つの変化を含む、工程；
    対象の腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上の1つまたは複数のMHCアレルによって新生抗原の各々が提示される数値的尤度のセットを生成するために、各新生抗原のペプチド配列を、1つまたは複数の提示モデルに入力する工程であって、該1つまたは複数の提示モデルが、
    訓練ペプチド配列、
    少なくとも一つのMHCアレル、および
    1つまたは複数の訓練ペプチド配列が該少なくとも1つのMHCアレルによって提示されたかどうかを示す質量分析データに由来するラベル、
    を含む訓練データセットを用いて訓練される、工程；および
    選択された新生抗原のセットを生成するために、該数値的尤度のセットに基づいて新生抗原のセットのサブセットを選択する工程。
  2. 選択された新生抗原のセットの数が20である、請求項1に記載の方法。
  3. 提示モデルが、
    MHCアレルのうちの特定の1つと、ペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
    該ペアの、MHCアレルのうちの特定の1つによる、特定の位置に特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上の提示の尤度と
    の間の依存性を表す、請求項1～2のいずれか一項に記載の方法。
  4. ペプチド配列を入力する工程が、
    対応する新生抗原のペプチド配列のアミノ酸の少なくとも位置に基づいて、対応する新生抗原をMHCアレルが提示するかどうかを示す、1つまたは複数のMHCアレルの各々についての依存性スコアを生成するために、1つまたは複数の提示モデルを、対応する新生抗原のペプチド配列に適用すること
    を含む、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 対応するMHCアレルが対応する新生抗原を提示するであろう尤度を示す、各MHCアレルについての対応するアレル毎（per-allele）尤度を生成するために、依存性スコアを変換する工程；および
    アレル毎尤度を組み合わせて、数値的尤度を生成する工程
    をさらに含む、請求項4に記載の方法。
  6. 依存性スコアを変換する工程が、対応する新生抗原のペプチド配列の提示を相互排反としてモデル化する、請求項5に記載の方法。
  7. 数値的尤度を生成するために、依存性スコアの組み合わせを変換する工程
    をさらに含む、請求項4～6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 依存性スコアの組み合わせを変換する工程が、対応する新生抗原のペプチド配列の提示をMHCアレル間の干渉としてモデル化する、請求項7に記載の方法。
  9. 数値的尤度のセットが、少なくともアレル非相互作用特性によってさらに特定され、かつ
    アレル非相互作用特性に基づいて、対応する新生抗原のペプチド配列が提示されるかどうかを示す、アレル非相互作用特性についての依存性スコアを生成するために、1つまたは複数の提示モデルのうちのアレル非相互作用のモデルをアレル非相互作用特性に適用する工程
    をさらに含む、請求項4～8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 1つまたは複数のMHCアレルにおける各MHCアレルについての依存性スコアを、アレル非相互作用特性についての依存性スコアと組み合わせる工程；
    対応するMHCアレルが対応する新生抗原を提示するであろう尤度を示す、MHCアレルについての対応するアレル毎尤度を生成するために、各MHCアレルについての組み合わされた依存性スコアを変換する工程；および
    アレル毎尤度を組み合わせて、数値的尤度を生成する工程
    をさらに含む、請求項9に記載の方法。
  11. 数値的尤度を生成するために、MHCアレルの各々についての依存性スコアと、アレル非相互作用特性についての依存性スコアとの組み合わせを変換する工程
    をさらに含む、請求項9～10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 提示モデルについての数値的パラメータのセットが、多数の試料中に存在すると特定された訓練ペプチド配列のセット、および1つまたは複数のMHCアレルを少なくとも含む訓練データセットに基づいて訓練され、該訓練ペプチド配列が、多数の試料に由来するMHCアレルから溶出された単離されたペプチドに対する質量分析を通して特定される、請求項1～11のいずれか一項に記載の方法。
  13. 訓練データセットが、腫瘍細胞のmRNA発現レベルについてのデータをさらに含む、請求項12に記載の方法。
  14. 前記試料が、単一のMHCクラスIまたはクラスIIアレルを発現するように操作された細胞株を含む、請求項12～13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記試料が、多数のMHCクラスIまたはクラスIIアレルを発現するように操作された細胞株を含む、請求項12～14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記試料が、多数の患者から取得されたか、または該患者に由来するヒト細胞株を含む、請求項12～15のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記試料が、多数の患者から取得された新鮮なまたは凍結された腫瘍試料を含む、請求項12～16のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記試料が、多数の患者から取得された新鮮なまたは凍結された組織試料を含む、請求項12～17のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記試料が、T細胞アッセイを用いて特定されたペプチドを含む、請求項12～18のいずれか一項に記載の方法。
  20. 訓練データセットが、
    試料中に存在する訓練ペプチドのセットのペプチド存在量；
    試料における訓練ペプチドのセットのペプチド長
    についてのデータをさらに含む、請求項12～19のいずれか一項に記載の方法。
  21. 訓練データセットが、公知のタンパク質配列のセットを含むデータベースに対するアラインメントを介して、訓練ペプチド配列のセットを比較することによって生成され、訓練タンパク質配列のセットが、訓練ペプチド配列よりも長く、かつそれらを含む、請求項12～20のいずれか一項に記載の方法。
  22. 訓練データセットが、細胞株からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのペプチドシーケンシングデータのうちの少なくとも1つを取得するために、細胞株に対して質量分析を行うかまたは質量分析が完了していることに基づいて生成され、該ペプチドシーケンシングデータが、変化を含む少なくとも1つのタンパク質配列を含む、請求項12～21のいずれか一項に記載の方法。
  23. 訓練データセットが、正常組織試料からエクソーム、トランスクリプトーム、および全ゲノムの正常ヌクレオチドシーケンシングデータのうちの少なくとも1つを取得することに基づいて生成される、請求項12～22のいずれか一項に記載の方法。
  24. 訓練データセットが、前記試料由来のプロテオーム配列を表すデータをさらに含む、請求項12～23のいずれか一項に記載の方法。
  25. 訓練データセットが、前記試料由来のMHCペプチドーム配列を表すデータをさらに含む、請求項12～24のいずれか一項に記載の方法。
  26. 訓練データセットが、単離されたペプチドのうちの少なくとも1つについてのペプチド-MHC結合親和性測定値についてのデータをさらに含む、請求項12～25のいずれか一項に記載の方法。
  27. 訓練データセットが、単離されたペプチドのうちの少なくとも1つについてのペプチド-MHC結合安定性測定値についてのデータをさらに含む、請求項12～26のいずれか一項に記載の方法。
  28. 訓練データセットが、前記試料由来のトランスクリプトームを表すデータをさらに含む、請求項12～27のいずれか一項に記載の方法。
  29. 訓練データセットが、前記試料由来のゲノムについてのデータをさらに含む、請求項12～28のいずれか一項に記載の方法。
  30. 訓練ペプチド配列が、kが8以上15以下であるkマーの範囲内の長さである、請求項12～29のいずれか一項に記載の方法。
  31. ワン・ホット（one-hot）エンコーディングスキームを用いてペプチド配列をコード化する工程をさらに含む、請求項12～30のいずれか一項に記載の方法。
  32. 左パディング（left-padded）ワン・ホットエンコーディングスキームを用いて訓練ペプチド配列をコード化する工程をさらに含む、請求項31に記載の方法。
  33. 請求項1～32に記載の工程のいずれかを行うことを含み、かつ、
    選択された新生抗原のセットを含む腫瘍ワクチンを生産するかまたは生産が完了している工程
    をさらに含む、腫瘍ワクチンを製造する方法。
  34. 選択された新生抗原のセットの選択が、
    提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて腫瘍細胞表面上に提示される尤度が増大している新生抗原を選択すること
    を含む、請求項1～33のいずれか一項に記載の方法。
  35. 選択された新生抗原のセットの選択が、
    提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導することができる尤度が増大している新生抗原を選択すること
    を含む、請求項1～34のいずれか一項に記載の方法。
  36. 選択された新生抗原のセットの選択が、
    提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べてプロフェッショナル抗原提示細胞（APC）によってナイーブT細胞に対して提示されることができる尤度が増大している新生抗原を選択すること
    を含み、任意で、該APCが樹状細胞（DC）である、請求項1～35のいずれか一項に記載の方法。
  37. 選択された新生抗原のセットの選択が、
    提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて中枢性寛容または末梢性寛容を介した阻害に供される尤度が減少している新生抗原を選択すること
    を含む、請求項1～36のいずれか一項に記載の方法。
  38. 選択された新生抗原のセットの選択が、
    提示モデルに基づいて選択されない新生抗原と比べて対象において正常組織に対する自己免疫応答を誘導することができる尤度が減少している新生抗原を選択すること
    を含む、請求項1～37のいずれか一項に記載の方法。
  39. エクソームまたはトランスクリプトームのヌクレオチドシーケンシングデータが、腫瘍組織に対してシーケンシングを行うことによって取得される、請求項1～38のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記シーケンシングが、次世代シーケンシング（NGS）または任意の大規模並列処理シーケンシングアプローチである、請求項1～39のいずれか一項に記載の方法。
  41. 数値的尤度のセットが、以下のうちの少なくとも1つを含む少なくともMHCアレル相互作用特性によってさらに特定される、請求項1～40のいずれか一項に記載の方法：
    a．MHCアレルと新生抗原コード化ペプチドが結合する、予測親和性、
    b．新生抗原コード化ペプチド-MHC複合体の予測安定性、
    c．新生抗原コード化ペプチドの配列および長さ、
    d．質量分析プロテオミクスまたは他の手段によって評価された際の、特定のMHCアレルを発現する他の個体由来の細胞における、類似した配列を有する新生抗原コード化ペプチドの提示の確率、
    e．問題の対象における特定のMHCアレルの発現レベル、
    f．特定のMHCアレルを発現する他の別個の対象における、特定のMHCアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列非依存的確率、
    g．他の別個の対象における、同じファミリーの分子におけるMHCアレルによる提示の、全体的な新生抗原コード化ペプチド配列非依存的確率。
  42. 数値的尤度のセットが、以下のうちの少なくとも1つを含む少なくともMHCアレル非相互作用特性によってさらに特定される、請求項1～41のいずれか一項に記載の方法：
    a．その供給源タンパク質配列内の、新生抗原コード化ペプチドに隣接するC末端配列およびN末端配列、
    b．（RNA-seqまたは質量分析によって測定された際の）任意で、腫瘍細胞における対応するプロテアーゼの発現にしたがって重み付けされる、新生抗原コード化ペプチドにおけるプロテアーゼ切断モチーフの存在、
    c．適切な細胞タイプにおいて測定された際の、供給源タンパク質の代謝回転速度、
    d．RNA-seqもしくはプロテオーム質量分析によって測定された際、または、DNAもしくはRNA配列データにおいて検出される生殖細胞系列もしくは体細胞性スプライシング変異のアノテーションから予測された際の、任意で、腫瘍細胞において最も高発現している特異的なスプライスバリアント（「アイソフォーム」）を考慮する、供給源タンパク質の長さ、
    e．（RNA-seq、プロテオーム質量分析、または免疫組織化学によって測定され得る）腫瘍細胞におけるプロテアソーム、イムノプロテアソーム、胸腺プロテアソーム（thymoproteasome）、または他のプロテアーゼの発現のレベル、
    f．新生抗原コード化ペプチドの供給源遺伝子の発現、
    g．細胞周期の種々の段階の最中の、新生抗原コード化ペプチドの供給源遺伝子の典型的な組織特異的発現、
    h．uniProtまたはPDBにおいて見出すことができるような、供給源タンパク質および／またはそのドメインの特性の総合的なカタログ、
    i．ペプチドを含有する供給源タンパク質のドメインの性状を説明する特性、
    j．他の別個の対象における、問題の新生抗原コード化ペプチドの、供給源タンパク質由来のペプチドの提示の確率、
    k．ペプチドが、技術的偏りのために質量分析によって検出されないか、または過剰に表されるであろう確率、
    l．腫瘍細胞、間質、または腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の状態について情報を与える、RNASeqによって測定された際の、種々の遺伝子モジュール／経路の発現（ペプチドの供給源タンパク質を含有する必要はない）、
    m．腫瘍細胞における、新生抗原コード化ペプチドの供給源遺伝子のコピー数、
    n．ペプチドがTAPに結合する確率、または、測定されたかもしくは予測された、TAPに対するペプチドの結合親和性、
    o．（RNA-seq、プロテオーム質量分析、免疫組織化学によって測定され得る）腫瘍細胞におけるTAPの発現レベル、
    p．以下を含むがそれらに限定されない、腫瘍変異の有無：
    i．EGFR、KRAS、ALK、RET、ROS1、TP53、CDKN2A、CDKN2B、NTRK1、NTRK2、NTRK3などの公知のがんドライバー遺伝子におけるドライバー変異、
    ii．抗原提示機構に関与するタンパク質をコードする遺伝子におけるもの；その提示が、腫瘍において機能喪失変異の影響下にある抗原提示機構の構成要素に依拠するペプチドは、提示の確率が低減している、
    q．以下を含むがそれらに限定されない、機能的な生殖細胞系列多型の有無：
    i．抗原提示機構に関与するタンパク質をコードする遺伝子におけるもの、
    r．腫瘍タイプ、
    s．臨床的腫瘍サブタイプ、
    t．喫煙歴、
    u．任意で、ドライバー変異によって層別化される、関連性のある腫瘍タイプまたは臨床的サブタイプにおけるペプチドの供給源遺伝子の典型的な発現。
  43. 少なくとも1つの変異が、フレームシフトもしくは非フレームシフト挿入欠失（indel）、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、または、新生ORFを生じる任意のゲノム変化もしくは発現変化である、請求項1～42のいずれか一項に記載の方法。
  44. 腫瘍細胞が、肺がん、黒色腫、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん、胃がん、結腸がん、精巣がん、頭頸部がん、膵臓がん、脳がん、B細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、およびT細胞リンパ球性白血病、非小細胞肺がん、および小細胞肺がんからなる群より選択される、請求項1～43のいずれか一項に記載の方法。
  45. 選択された新生抗原のセットまたはそのサブセットを含む腫瘍ワクチンを取得する工程をさらに含む、請求項1～44のいずれか一項に記載の方法。
  46. ポリペプチド形態における場合、選択された新生抗原のセットにおける新生抗原の少なくとも1つが、以下のうちの少なくとも1つを含む、請求項1～45のいずれか一項に記載の方法：
    1000nM未満のIC50値でのMHCとの結合親和性、
    MHCクラス1ポリペプチドについては、8～15、8、9、10、11、12、13、14、または15アミノ酸の長さ、
    プロテアソーム切断を促進する、親タンパク質配列中のポリペプチド内またはその近くの配列モチーフの存在、および、
    TAP輸送を促進する配列モチーフの存在。
  47. 以下の工程を遂行することを含む、腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上に提示される1つまたは複数の新生抗原を特定するためのモデルを生成するための方法：
    多数の試料に由来する主要組織適合性複合体（MHC）から溶出された多数の単離されたペプチドについてのデータを含む、質量分析データを受け取る工程；
    試料中に存在する訓練ペプチド配列のセット、および1つまたは複数のMHCを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程であって、該訓練データセットが、1つまたは複数の該訓練ペプチド配列が該1つまたは複数のMHCによって提示されたかどうかを示す質量分析データに由来するラベルを含む、工程；
    訓練ペプチド配列を含む訓練データセットを用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、該提示モデルが、腫瘍細胞表面上の1つまたは複数のMHCアレルによって腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される多数の数値的尤度を提供する、工程。
  48. 提示モデルが、
    ペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸の存在と、
    特定の位置に特定のアミノ酸を含有するペプチド配列の、腫瘍細胞上のMHCアレルのうちの1つによる提示の尤度と
    の間の依存性を表す、請求項47に記載の方法。
  49. 前記試料が、単一のMHCクラスIまたはクラスIIアレルを発現するように操作された細胞株を含む、請求項47～48のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記試料が、多数のMHCクラスIまたはクラスIIアレルを発現するように操作された細胞株を含む、請求項47～49のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記試料が、多数の患者から取得されたか、または該患者に由来するヒト細胞株を含む、請求項47～50のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記試料が、多数の患者から取得された新鮮なまたは凍結された腫瘍試料を含む、請求項47～51のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記試料が、T細胞アッセイを用いて特定されたペプチドを含む、請求項47～52のいずれか一項に記載の方法。
  54. 訓練データセットが、
    試料中に存在する訓練ペプチドのセットのペプチド存在量；
    試料における訓練ペプチドのセットのペプチド長
    に関連するデータをさらに含む、請求項47～53のいずれか一項に記載の方法。
  55. 訓練データセットを取得する工程が、
    公知のタンパク質配列のセットを含むデータベースに対するアラインメントを介して訓練ペプチド配列のセットを比較することによって、訓練ペプチド配列に基づいて、訓練ペプチド配列よりも長くかつそれらを含む訓練タンパク質配列のセットを取得すること
    を含む、請求項47～54のいずれか一項に記載の方法。
  56. 訓練データセットを取得する工程が、
    細胞株からエクソーム、トランスクリプトーム、または全ゲノムのヌクレオチドシーケンシングデータのうちの少なくとも1つを取得するために細胞株に対して質量分析を行うかまたは質量分析が完了していること
    を含み、該ヌクレオチドシーケンシングデータが、変異を含む少なくとも1つのタンパク質配列を含む、請求項47～55のいずれか一項に記載の方法。
  57. 提示モデルのパラメータのセットを訓練する工程が、
    ワン・ホットエンコーディングスキームを用いて訓練ペプチド配列をコード化する工程
    を含む、請求項47～56のいずれか一項に記載の方法。
  58. 正常組織試料からエクソーム、トランスクリプトーム、および全ゲノムの正常ヌクレオチドシーケンシングデータのうちの少なくとも1つを取得する工程；ならびに
    該正常ヌクレオチドシーケンシングデータを用いて、提示モデルのパラメータのセットを訓練する工程
    をさらに含む、請求項47～57のいずれか一項に記載の方法。
  59. 訓練データセットが、前記試料由来のプロテオーム配列を表すデータをさらに含む、請求項47～58のいずれか一項に記載の方法。
  60. 訓練データセットが、前記試料由来のMHCペプチドーム配列を表すデータをさらに含む、請求項47～59のいずれか一項に記載の方法。
  61. 訓練データセットが、単離されたペプチドのうちの少なくとも1つについてのペプチド-MHC結合親和性測定値についてのデータをさらに含む、請求項47～60のいずれか一項に記載の方法。
  62. 訓練データセットが、単離されたペプチドのうちの少なくとも1つについてのペプチド-MHC結合安定性測定値についてのデータをさらに含む、請求項47～61のいずれか一項に記載の方法。
  63. 訓練データセットが、前記試料由来のトランスクリプトームを表すデータをさらに含む、請求項47～62のいずれか一項に記載の方法。
  64. 訓練データセットが、前記試料由来のゲノムについてのデータをさらに含む、請求項47～63のいずれか一項に記載の方法。
  65. 数値的パラメータのセットを訓練する工程が、
    パラメータのセットのロジスティック回帰を行うこと
    をさらに含む、請求項47～64のいずれか一項に記載の方法。
  66. 訓練ペプチド配列が、kが8以上15以下であるkマーの範囲内の長さである、請求項47～65のいずれか一項に記載の方法。
  67. 提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程が、
    左パディングワン・ホットエンコーディングスキームを用いて訓練ペプチド配列をコード化する工程
    を含む、請求項47～66のいずれか一項に記載の方法。
  68. 数値的パラメータのセットを訓練する工程が、
    深層学習アルゴリズムを用いてパラメータのセットについて値を決定する工程
    をさらに含む、請求項47～67のいずれか一項に記載の方法。
  69. 以下の工程を遂行することを含む、腫瘍細胞の腫瘍細胞表面上に提示される1つまたは複数の新生抗原を特定するためのモデルを生成するための方法：
    多数の新鮮なまたは凍結された腫瘍試料に由来する主要組織適合性複合体（MHC）から溶出された多数の単離されたペプチドについてのデータを含む、質量分析データを受け取る工程；
    腫瘍試料中に存在し、かつ1つまたは複数のMHCアレル上に提示される、訓練ペプチド配列のセットを少なくとも特定することにより、訓練データセットを取得する工程であって、該訓練データセットが、1つまたは複数の該訓練ペプチド配列が該1つまたは複数のMHCによって提示されたかどうかを示す質量分析データに由来するラベルを含む、工程；
    訓練ペプチド配列に基づいて、訓練タンパク質配列のセットを取得する工程；ならびに
    訓練タンパク質配列および訓練ペプチド配列を用いて、提示モデルの数値的パラメータのセットを訓練する工程であって、該提示モデルが、腫瘍細胞表面上の1つまたは複数のMHCアレルによって腫瘍細胞由来のペプチド配列が提示される多数の数値的尤度を提供する、工程。
  70. 提示モデルが、
    MHCアレルのうちの特定の1つと、ペプチド配列の特定の位置の特定のアミノ酸とのペアの存在と、
    該ペアの、MHCアレルのうちの特定の1つによる、特定の位置に特定のアミノ酸を含むそのようなペプチド配列の腫瘍細胞表面上の提示の尤度と
    の間の依存性を表す、請求項69に記載の方法。
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