CN113905756A

CN113905756A - 使用编码新表位的构建体进行核酸疫苗接种

Info

Publication number: CN113905756A
Application number: CN202080020168.2A
Authority: CN
Inventors: B·罗诺; J·克里格鲁姆; A·B·索伦森; T·特罗勒
Original assignee: Evonson Biotechnology Co ltd
Current assignee: Evonson Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-03-11
Filing date: 2020-03-11
Publication date: 2022-01-07
Also published as: JP2022525111A; WO2020182901A1; US20220184191A1; EP3937973A1; CA3131824A1; AU2020234003A1

Abstract

本公开提供了靶向癌症的DNA疫苗接种的手段和方法。具体而言，提供了一种使用基于质粒的疫苗进行抗癌疫苗接种的方法，该疫苗包含编码新表位的区域，并包含两亲性嵌段共聚物，例如泊洛沙姆和泊洛沙胺试剂。

Description

使用编码新表位的构建体进行核酸疫苗接种

发明领域

本发明涉及癌症治疗，特别是癌症免疫疗法。具体而言，本发明涉及通过核酸疫苗接种治疗癌症的方法和产品。

发明背景

患者恶性肿瘤的治疗传统上集中于通过手术、放射治疗和/或化疗使用细胞毒性药物根除/去除恶性组织，其剂量方案旨在优先杀死恶性细胞而不是杀死非恶性细胞。

除了使用细胞毒性药物之外，最近的方法集中于靶向癌细胞中的特定生物标记物，以减少传统化疗产生的全身性副作用。针对癌症相关抗原的单克隆抗体疗法已被证明在延长许多恶性肿瘤的预期寿命方面相当有效。尽管作为成功的药物，靶向癌症相关抗原或抗原的单克隆抗体本质上只能被开发成靶向已知并出现在多个患者中的表达产物，这意味着绝大多数癌症特异性抗原不能通过这种类型的治疗来解决，因为大量癌症特异性抗原仅出现在来自单个患者的肿瘤中，参见下文。

早在20世纪50年代末，布尔内特和托马斯提出的免疫监视理论就提出，淋巴细胞识别并消除表现出抗原决定簇改变的自体细胞——包括癌细胞，今天人们普遍认为免疫系统在很大程度上有助于控制原发性肿瘤的生长和消除转移。然而，免疫监测并不是100％有效的，在寻求提高/刺激免疫系统根除癌细胞的能力的情况下，设计癌症疗法是一项持续的任务。

一种方法是诱导针对癌症相关抗原的免疫，但尽管这种方法有潜力，但它与抗体疗法有相同的缺点，即只能处理有限数量的抗原。

即使不是全部，也有很多肿瘤表达突变。这些突变可能产生新的可靶向抗原(新抗原)，如果有可能在临床相关的时间框架内识别新抗原及其抗原决定簇，则这些抗原可能在特异性T细胞免疫疗法中有用。由于目前的技术有可能对细胞基因组进行全测序，并分析改变的或新的表达基因产物的存在，因此有可能设计基于新抗原的个性化疫苗。然而，迄今为止，提供满意临床终点的尝试基本上失败了，或者仍处于早期非结论性阶段。

自20世纪90年代初以来已经详细研究的一种疫苗接种方式是核酸疫苗接种(也称为DNA疫苗接种)，其中DNA以非病毒质粒的形式给予哺乳动物的体细胞，导致质粒中包含的插入片段的表达；在DNA疫苗接种中，编码的物质是免疫原性多肽，一旦由体细胞产生，它将能够诱导免疫反应。这种方法很有吸引力，因为它避免了使用昂贵的重组表达系统生产临床级纯度的蛋白质免疫原的需要。然而，已经证明很难从施用的DNA中获得足够高的表达水平，以在人类中产生令人满意的免疫反应。

因此，目前需要提供抗癌疫苗，特别是核酸疫苗，其能够有效地靶向新抗原，并在接种疫苗的人中诱导临床上显著的免疫反应。

发明目的

本发明实施方案的一个目的是提供用于核酸疫苗接种的方法和产品，以治疗或改善较大哺乳动物如人类的癌症。

发明内容

本发明人已经发现，用编码已鉴定的癌症新表位的DNA疫苗的剂量免疫接种小鼠能够提供针对癌症的保护性免疫；剂量进一步转化为临床可接受的人体剂量。

因此，在第一方面，本发明涉及在患者中诱导针对恶性肿瘤的治疗性或改善性免疫反应的方法，其中恶性肿瘤的细胞表达编码含有新表位的多肽的遗传物质，该方法包括给患者施用至少一种有效剂量的组合物，该组合物包含：

1)至少一种表达载体，该表达载体包含编码至少一种多肽的核酸，其显示恶性肿瘤的一个或多个新表位，和

2)包含聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)嵌段的两亲嵌段共聚物，和

3)药学上可接受的载体或稀释剂，

由此使患者的体细胞表达编码所述至少一种多肽的核酸。

在第二方面，本发明涉及一种组合物，该组合物包含

1)至少一种表达载体，该载体包含编码至少一种多肽的核酸，该多肽显示恶性肿瘤的一个或多个新表位，和

2)两亲性嵌段共聚物，该共聚物包含聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)的嵌段，和

3)药学上可接受的载体或稀释剂，

即与本发明第一方面的方法中施用的组合物相同的组合物。

在第三和第四方面，本发明分别涉及第二方面的组合物1)用作药物的，和2)用于第一方面的方法中。

附图说明

图1:pVAX1的质粒图谱。详情见实施例和SEQ ID NO:1.

图2:pVAX1 S16A的质粒图谱。详情见实施例。

图3:pVAX1 S16B的质粒图谱。详情见实施例。

图4:图示为检测C22 MHC I型多聚体。该图显示了在用实验性DNA疫苗接种小鼠时，对C22肽有反应性的小鼠CD8+T细胞的频率。

图5:显示ISS在pTVG4中的优选位置的质粒图谱。

图6:用

和疫苗质粒接种的小鼠的肿瘤体积(曲线下面积，AUC)。详情见实施例1。

图7:接种试验疫苗的小鼠的肿瘤体积(曲线下面积，AUC)。详情见实施例2。

图8:从接种疫苗的小鼠分离的CD8+T细胞的C22四聚体染色。详情见实施例2。

图9:接种试验疫苗的小鼠的肿瘤大小(曲线下面积，AUC)。详情见实施例3。

图10:从接种疫苗的小鼠分离的CD8+T细胞的C22四聚体染色。详情见实施例3。

图11:接种试验疫苗的小鼠的肿瘤大小(曲线下面积，AUC)。详情见实施例4。

*:p<0.05(Kruskal-Wallis检验)；

**:p<0.01(Kruskal-Wallis检验)；

***:p<0.001(Kruskal-Wallis检验)；

****:p＜＜0.001(Kruskal-Wallis检验)。

图12:从接种疫苗的小鼠分离的CD8+T细胞的C22四聚体染色。详情见实施例4。

图13:显示能够产生多种细胞因子(TNFα和IFNγ)的反应性T细胞的图表。

A:CD8+细胞的数据。

B:CD4+细胞的数据。

发明详述

定义

“PEO-PPO”两亲嵌段共聚物是包含聚(环氧乙烷)(“PEO”)嵌段和聚(环氧丙烷)(“PPO”)嵌段或由其组成的线性或分支共聚物。有用的PEO-PPO两亲嵌段共聚物的典型实例具有通式结构PEO-PPO-PEO(“泊洛沙姆”(poloxamers))、PPO-PEO-PPO、(PEO-PPO-)₄ED(“泊洛沙胺”(poloxamers))、和(PPO-PEO-)₄ED(“反向泊洛沙胺”(reverse poloxamine))，其中“ED”是亚乙二胺基。

“泊洛沙姆”是一种线性两亲性嵌段共聚物，由一个聚环氧乙烷(“PEO”)嵌段偶联到一个聚环氧丙烷(“PPO”)嵌段偶联到一个PEO嵌段上构成，即式EO_a-PO_b-EO_a的结构，其中EO是环氧乙烷，PO是环氧丙烷，a是2-130的整数，b是15-67的整数。泊洛沙姆通常使用3位标识符命名，其中前2位乘以100表示PPO含量的近似分子量，最后一位乘以10表示PEO含量的近似百分比。例如，“泊洛沙姆188”是指包含分子量≈1800(对应于b≈31PPO)的PPO嵌段和大约80％(w/w)的PEO(对应于a≈82)的聚合物。然而，已知这些值在一定程度上有所不同，根据生产商数据表，研究级

F68和临床级

P188等商业产品都是Poloxamer 188，但它们的分子量变化很大(在7，680和9，510之间)，为这些特定产品提供的a和b值分别约为79和28。这反映了嵌段共聚物的异质性，意味着a和b的值是最终配方中的平均值。

“泊洛沙胺”或“顺序泊洛沙胺”(以商品名为

市售)是X形嵌段共聚物，其带有四个PEO-PPO臂，通过PEO-PPO-基团中的游离OH基团和乙二胺中的伯胺基团之间的键连接到中心乙二胺，而“反向泊洛沙胺”同样是X形嵌段共聚物，其带有四个PPO-PEO臂，通过PPO-PEO-基团中的游离OH基团和乙二胺中的伯胺基团之间的键连接到中心乙二胺。

“癌症特异性”抗原是这样的抗原，它在个体的非恶性体细胞中不作为表达产物出现，但在个体的癌细胞中作为表达产物出现。这与“癌症相关”抗原形成对比，后者也出现在正常体细胞中——尽管丰度较低，但至少在某些肿瘤细胞中含量较高。

术语“佐剂”在疫苗技术领域中具有其通常的含义，即这样的物质或物质组合物：1)本身不能引发针对疫苗的免疫原的特异性免疫反应，但是2)仍然能够增强针对免疫原的免疫反应。或者，换句话说，仅用佐剂接种不能提供针对免疫原的免疫应答，用免疫原接种可以产生或不产生针对免疫原的免疫应答，但是用免疫原和佐剂联合接种诱导的针对免疫原的免疫应答强于仅由免疫原诱导的免疫应答。

“CAF09”(阳离子佐剂制剂09)是一种免疫原性佐剂脂质体制剂，其包含季铵表面活性剂N，N-二甲基-N,N-二十八烷基铵(DDA)，合成的3-羟基-2-十四烷基-十八烷酸-2,3-二羟基丙酯(monomycolyl glycerol，“MMG”)，其充当C型凝集素受体(CLRs)的配体，和聚肌苷酸-聚胞苷酸(钠盐)(“聚-IC”或“聚(I:C)”)，其充当toll样受体("TLRs")的配体。在US2014/0112979和US 2016/0228528中详细公开了许多CAF家族佐剂，包括CAF09。DDA:MMG:聚(I:C)的相对量(w:w:w)为5:1:1。

“CAF09b”是CAF09的一个版本，其中聚(I:C)的相对量减少到了US 2014/0112979中公开的量的大约1/4:在CAF09中，DDA:MMG:聚(I:C)的相对量(w:w:w)因此是20:4:1，典型的人体剂量分别含有625μg DDA、125μg DDA和31.25μg聚(I:C)。

“新表位”是一种抗原决定簇(通常是MHC I类或II类限制性表位)，由于缺乏编码新表位的基因，它在个体中不作为正常体细胞的表达产物存在，但在同一个体的突变细胞(如癌细胞)中作为表达产物存在。因此，从免疫学的观点来看，新表位真正是非自身的，尽管它来自自身，因此它可以被表征为个体中的肿瘤特异性抗原，其中它构成表达产物。由于是非自身的，新表位具有能够在个体中引发特异性适应性免疫反应的潜力，其中所引发的免疫反应对含有所述新表位的抗原和细胞是特异性的。另一方面，新表位对个体具有特异性，因为相同的新表位在其他个体中成为表达产物的可能性极小。因此，几个特征使新表位与例如肿瘤特异性抗原的表位形成对比：后者通常在相同类型的多种癌症中发现(因为它们可以是活化癌基因的表达产物)和/或它们将存在于非恶性细胞中，尽管数量很少，因为相关基因在癌细胞中过度表达。

“新肽”是这样的肽(即最多约50个氨基酸残基的聚氨基酸)，其在序列中包含本文定义的新表位。新肽通常是“天然的”，即新肽的整个氨基酸序列构成可以从个体中分离的表达产物的片段，但是新肽也可以是“人工的”，这意味着它由新表位的序列和1或2个附加的氨基酸序列构成，其中至少一个氨基酸序列不是天然与所述新表位相关联的。在后一种情况下，附接的氨基酸序列可以简单地作为新表位的载体，或者甚至可以提高新表位的免疫原性(例如，通过促进抗原呈递细胞对新肽的加工，提高新肽的生物半衰期，或者改变溶解度)。

“新抗原”是包含新表位的任何抗原。典型地，新抗原将由蛋白质构成，但是取决于其长度，新抗原也可以与新表位或新肽相同。

术语“氨基酸序列”是由肽键连接的氨基酸残基在肽和蛋白质链中的顺序。序列通常以N到C末端方向列出。

“接头”是这样一种氨基酸序列，它被引入到另外两个氨基酸序列之间，以便在空间上将它们分开。接头可以是“刚性的”，这意味着它基本上不允许它所连接的两个氨基酸序列相对于彼此自由移动。同样，“柔性”接头允许通过接头连接的两个序列相对于彼此基本自由移动。在含有一个以上新表位的编码表达产物中，两种类型的接头都是有用的。然而，在本发明中有用的一个特别有趣的接头具有12个氨基酸残基序列AEAAAKEAAAKA(SEQID NO:9)。

下表列出了可由本发明中使用的表达载体编码的其它感兴趣的接头:

“免疫原性载体”是可以偶联免疫原或半抗原、以便增强或能够引发针对所述免疫原/半抗原的免疫反应的分子或部分。免疫原性载体在经典情况下是相对大的分子(如破伤风类毒素、KLH、白喉类毒素等。)，其可以与免疫原/半抗原融合或缀合，该免疫原/半抗原本身没有足够的免疫原性-通常，免疫原性载体能够引发针对由免疫原和免疫原性载体构成的组合物质的更强T辅助淋巴细胞反应，这反过来提供了B淋巴细胞和细胞毒性淋巴细胞针对免疫原的改善的响应。最近，大的载体分子在一定程度上被所谓的混杂的T-辅助表位所取代，即被群体中的大部分人类HLA单倍型识别、引发T-辅助淋巴细胞响应的短肽。

“T辅助淋巴细胞反应”是基于肽引发的免疫反应，该肽能够结合抗原呈递细胞中的MHC II类分子(例如HLA II类分子)，并且由于肽和呈递肽的MHC II类分子之间的复合物的T细胞受体识别，该肽刺激动物物种中的T辅助淋巴细胞。

“免疫原”是一种能够在其免疫系统遭遇免疫原的宿主体内诱导适应性免疫反应的物质。因此，免疫原是更大组“抗原”的一个子集，抗原是可以被免疫系统特异性识别的物质(例如，当被抗体结合时，或者，当结合到MHC分子的抗原片段被T细胞受体识别时)，但是不一定能够诱导免疫-然而，抗原总是能够引发免疫，这意味着已经建立了针对所述抗原的记忆免疫的宿主将产生针对所述抗原的特异性免疫反应。

“半抗原”是一种小分子，其既不能诱导也不能引发免疫反应，但是如果与免疫原性载体结合，在免疫系统遭遇半抗原载体缀合物时能诱导识别所述半抗原的抗体或T细胞受体(TCRs)。

“适应性免疫反应”是对遭遇抗原或免疫原产生响应的免疫反应，其中免疫反应对所述抗原/免疫原的抗原性决定簇是特异性的——适应性免疫反应的例子是诱导抗原特异性抗体产生或抗原特异性诱导/激活T辅助淋巴细胞或细胞毒性淋巴细胞。

“保护性、适应性免疫应答”是在受试者中诱导的抗原特异性免疫应答，作为对用抗原免疫(人工或天然)的反应，其中免疫应答能够保护受试者免受随后用所述抗原或包括所述抗原的病理学相关因子的攻击。通常，预防性疫苗接种旨在建立针对一种或多种病原体的保护性适应性免疫反应。

“免疫系统刺激”是指物质或物质组合物表现出普遍的、非特异性的免疫刺激作用。许多佐剂和推定的佐剂(如某些细胞因子)享有刺激免疫系统的能力。使用免疫刺激剂的结果是免疫系统的“警觉性”增加，这意味着与单独使用免疫原相比，同时或随后用免疫原进行免疫接种会诱导显著更有效的免疫反应。

术语“多肽”在本文中是指2-50个氨基酸残基的短肽、50-100个氨基酸残基的寡肽和超过100个氨基酸残基的多肽。此外，该术语还旨在包括蛋白质，即包含至少一种多肽的功能性生物分子；当包含至少两种多肽时，它们可以形成复合物、共价连接或非共价连接。蛋白质中的多肽可以是糖基化的和/或脂质化的和/或包含辅基。

本发明第一方面的实施方式

在本文公开的方法中，在患者(优选人)中诱导针对恶性肿瘤的治疗性或改善性免疫反应，其中恶性肿瘤的细胞表达编码含有新表位的多肽的遗传物质。该方法包括给患者施用至少一种有效剂量的组合物，该组合物包含：

1)至少一种表达载体，该表达载体包含编码至少一种多肽的核酸，该多肽显示恶性肿瘤的一个或多个新表位，和

3)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，

由此使患者的体细胞表达编码所述至少一种多肽的核酸。

表达载体通常并且优选包含在质粒中或由质粒构成，但是也可以使用其他表达载体。本发明的组合物及其两亲嵌段共聚物的含量旨在确保将“裸”DNA递送至细胞，即DNA表达载体，其不是能够将表达载体导入靶细胞的细菌或病毒的一部分。因此，可用于本发明组合物和方法的载体可以是环状或线形、单链或双链的，并且除了质粒之外，还可以是例如粘粒、微型染色体或附加体。

每个编码(和可表达)区域可以存在于同一载体或分开的载体上；然而，应当理解，一个或多个编码区可以存在于单个载体上，并且这些编码区可以在单个或多个启动子的控制下。这意味着表达载体可以为每个编码的新表位编码单独的肽表达产物，或者表达载体可以编码多个肽表达产物，其中至少一些表现出几个编码的新表位，其中至少一些任选被肽接头分开。

换句话说，在某些情况下，仅施用和表达一种表达载体，并且该表达载体可以编码多个分开的蛋白质性表达产物，或者编码少至2个或者甚至一个表达产物——在这种情况下，仅仅编码的新表位是否令人满意地呈现给免疫系统是相关的，因此选择将它们分开存在于组合表达产物中是无关紧要的。在优选实施方案中，表达载体表达至少或约5种，例如至少或约10种、至少或约15种、至少或约20种、至少或约25种、至少或约30种蛋白质性表达产物。涵盖更高的数量，限制主要由可以从特定肿瘤中识别的新表位的数量确定。不言而喻，表达载体中编码的新表位的数量不能超过在相关恶性组织中发现的新表位的数量。

使用肽接头分开编码的新表位表达产物能够在空间上隔开表达产物中的各表位。这可能带来几个优点:接头可以确保每个新表位以优化的构型呈现给免疫系统，而使用合适的接头也可以使包含多表位的表达产物中针对由一个新表位的C末端和下一个新表位的相邻N末端构成的区域中出现的“连接表位”的不相关免疫应答的问题最小化。

编码的肽接头可以是“柔性的”或“刚性的”，参见上面的定义，其中列出了优选的编码接头。此外，设想在一些实施方案中用于本发明的接头可以是可切割的，即包括(a)内肽酶的识别位点，例如内肽酶，如弗林蛋白酶、胱天蛋白酶、组织蛋白酶等。

表达载体编码的新表位可以以本身已知的方式鉴定:对同一个体中恶性细胞的基因组和健康细胞的基因组或标准健康基因组的“深度测序”可以鉴定表达的DNA片段，其提供恶性细胞特有的潜在免疫原性表达产物。鉴定的DNA序列随后可以被密码子优化(通常用于人类细胞的表达)并包含在表达载体中——或者作为单独的表达区，或者作为更大的嵌合构建体的一部分。

为了优化待由载体表达的新表位的鉴定和选择，任何可用于此目的的预测方法在实践中都是有用的。本领域中预测算法的一个例子是NetMHCpan-4.0(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/；Jurtz V等人，J Immunol(2017)，ji1700893DOI:10.4049/jimmunol.1700893)。该方法基于经典质谱衍生配体和pMHC亲和数据的组合进行训练。另一个例子是netmhcstabban-1.0(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCstabpan/；RasmussenMet等人，2016年6月被J of Immunol接受)。这种方法是在体外pMHC稳定性测量的数据集上训练的，该数据集使用一种分析，其中每个肽在体外合成并与MHC分子复合。该分析不涉及细胞处理，测量pMHC稳定性的环境有些人为。该方法总体上不如NetMHCpan-4.0准确。美国专利10,055,540描述了一种使用经典质谱检测配体鉴定新表位的方法。使用类似技术的其他专利申请公开是WO2019/104203、WO2019/075112、WO2018/195357(MHC II类特异性)和WO2017106638。最后，MHCflurry:www-science direct-com.proxy.find it.dtu.dk/science/article/pii/s 2405471218302321就像是在MS检测的配体数据和pMHC亲和力上训练的NetMHCpan。肽-MHC II类相互作用预测方法也在最近的出版物Garde C et al.,Immunogenetics,DOI:doi.org/10.1007/s00251-019-01122-z中公开。在该出版物中，从MHC II类洗脱的天然加工肽被用作训练集的一部分，并且如果被验证为配体，则指定结合目标值为1，如果为阴性，则为0。

通常，这些预测系统采用人工神经网络(artificial neural networks,ANNs):ANN可以识别非线性相关性:非线性相关性的量化不是一项容易的任务，因为很难通过简单的计算来计算。这主要是由于非线性相关比线性相关用需要更多的参数描述，并且可能在所有特征被综合考虑时首先出现。因此，需要考虑所有特征，以便捕捉特征之间的依赖性。

为了进一步提高所选的编码的新表位提供有效免疫应答的可能性，可以优选使用欧洲专利申请19197295.9和19197306.4(均于2019年9月13日提交)中公开的技术。这些申请公开了能够确定肽和MHC分子之间结合的稳定性，以及能够确定新表位的MHC结合的稳定性作为新表位检测和选择的一部分的技术。简而言之，从稳定性测定中获得的数据可以例如被用作人工神经网络的训练集的一部分，并且人工神经网络随后可以根据识别的肽对相关MHC分子的预测结合稳定性对其进行排序。

当对患者施用核酸疫苗时，患者体内会产生相应的基因产物(如所需的抗原)。在一些实施方案中，包含优化的重组多核苷酸的核酸疫苗载体可被递送至人以诱导治疗性或预防性免疫反应。

质粒和其他裸DNA载体通常更有效地将基因转移到肌肉组织。还报道了通过口服给药将DNA载体递送到粘膜表面的可能性，并且DNA质粒已被用于将基因直接导入肌肉以外的其他组织。DNA疫苗主要通过肌肉注射、基因枪输送、喷射注射(使用PharmaJet的

装置等装置)或电穿孔引入动物体内；这些给药模式中的每一种都适用于本公开的方法。导入后，质粒通常保持游离体状态，没有复制。编码蛋白的表达已被证明能持续较长时间，提供对B细胞和T细胞的刺激作用。

在确定在本文公开的治疗方法中施用的载体的有效量时，医生评估载体毒性、疫苗诱导的不良事件、待治疗癌症的进展以及抗载体抗体的产生(如果有的话)。给药可以通过单次或分次给药来完成，通常是一系列的时间间隔给药。在本文公开的方法中，在时间隔开的系列中，每次免疫的有效人剂量在10μg和500mg之间，优选表达载体的剂量在100μg和25mg之间。也就是说，在本文公开的方法的实践中，通常在人体中使用1至20毫克的剂量，并且剂量通常在0.5至15毫克、1至10毫克和2至8毫克之间，并且特别感兴趣的剂量是大约0.5、大约1、大约2、大约3、大约4、大约5、大约6、大约7和大约8毫克。

采用有效剂量的一系列免疫通常构成一系列2、3、4、5、6或更多个剂量。例如，多个(例如>6个)剂量可能是相关的，以便长时间控制恶性肿瘤，并且在这种情况下，疫苗载体中编码的新表位的确切选择可以随着时间的推移而改变，以响应恶性细胞的基因组和蛋白质组的变化。如果或者当恶性细胞产生新的表位时，这些表位可以方便地作为疫苗的靶标。

本文公开的方法中使用的疫苗包含一种或多种表达载体；例如，疫苗可以包含多个表达载体，每个表达载体能够在哺乳动物细胞中自主表达核苷酸编码区以产生至少一种免疫原性多肽。表达载体通常包括真核启动子序列，例如强真核启动子的核苷酸序列，可操作地连接到一个或多个编码区。本文的组合物和方法可以包括使用任何特定的真核启动子，并且多种多样是已知的；例如CMV或RSV启动子。启动子相对于宿主细胞可以是异源的。所用的启动子可以是组成型启动子。所用的启动子可以包括增强子区域和内含子区域，以提高表达水平，例如使用CMV启动子时的情况。

本领域已知的许多质粒可用于生产核酸疫苗。核酸疫苗的合适实施方案采用使用质粒VR1012(Vical Inc.,San Diego Calif.)、pCMVI.UBF3/2(S.Johnston,University ofTexas)、pTVG4(Johnson et al.,2006,Vaccine 24(3)；293-303)、pVAX1(Thermo FisherScientific,残基上文以及下面的实施例)或pcDNA3.1(InVitrogen Corporation,Carlsbad,Calif.)作为载体的构建体。

此外，根据本发明，载体构建体可以有利地包含免疫刺激序列(ISS)。在疫苗载体中使用这种序列的目的是增强对编码的新表位的T细胞反应，特别是Th1细胞反应，这种反应是由掺入toll样受体TLR3、TLR7-TLR8和TLR9和/或胞质RNA受体(例如但不限于RIG-1、MDA5和LGP 2)的激动剂的佐剂引发的(Desmet et al.2012.Nat.Rev.Imm.12(7),479–491)。

使用ISS的一种可能性是模拟细菌感染激活TLR9，方法是用非甲基化的富含CG的基序(所谓的CpG基序)刺激，该基序由6个碱基组成，一般序列为NNCGNN(其在细菌DNA中的频率比在哺乳动物DNA中高20倍)，或者作为直接给药的小合成DNA寡核苷酸(ODNs)，其包含部分或全部硫代磷酸主链，或者通过将CpG基序掺入DNA载体主链。免疫刺激性CpG可以是DNA主链的一部分，也可以集中在ISS中，其中CpG序列通常位于新表位编码序列的终止密码子和多聚腺苷酸尾编码序列之间(即ISS位于终止密码子和多聚腺苷酸信号之间)。然而，由于在较长的DNA分子中CpG序列发挥作用与它们的位置无关，因此它们的位置原则上可以在疫苗载体中的任何地方，只要CpG基序的存在不干扰载体表达疫苗抗原编码区的能力即可。

如果在疫苗中作为单独的ODN存在，其中ODN起免疫佐剂的作用，则含有CpG基序的寡核苷酸通常通过选择的递送技术与DNA疫苗一起共同给药/配制，并且通常构成包含序列NNCGNN或反向互补序列的DNA的六聚体或更长的多聚体。适用于此目的的有用ODN可以从InvivoGen,5 Rue Jean Rodier,F-31400,Toulouse,France购得，该公司销售一系列A类、B类和C类ODN。其实例有:

ODN1585(5'-ggGGTCAACGTTGAgggggg-3'),SEQ ID NO:27

ODN2216(5’-ggGGGACGATCGTCgggggg-3’),SEQ ID NO:28

ODN2336(5’-gggGACGACGTCGTGgggggg-3’),SEQ ID NO:29

ODN1668(5’-tccatgacgttcctgatgct-3’),SEQ ID NO:30

ODN1826(5’-tccatgacgttcctgacgtt-3’),SEQ ID NO:31

ODN2006(5’-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’),SEQ ID NO:32

ODN2007(5’-tcgtcgttgtcgttttgtcgtt-3’),SEQ ID NO:33

ODNBW006(5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’),SEQ ID NO:34

ODN D-SL01(5’-tcgcgacgttcgcccgacgttcggta-3’),SEQ ID NO:35

ODN2395(5’-tcgtcgttttcggcgcgcgccg-3’),SEQ ID NO:36

ODN M362(5’-tcgtcgtcgttcgaacgacgttgat-3’),SEQ ID NO:37

ODN D-SL03(5’-tcgcgaacgttcgccgcgttcgaacgcgg-3’),SEQ ID NO:38。

在这12种ODN中，大写的核苷酸是磷酸二酯，小写的核苷酸是硫代磷酸酯，下划线表示回文序列。

当CpG序列存在于质粒骨架中时(从而成为“自我佐剂化的”)，根据本发明，可以存在任何数量的可能的NNGCNN序列，其或者是相同的序列，或者是CpG基序的非相同序列，或者是可以形成茎环结构的回文序列。例如，以下CpG基序是令人感兴趣的:AACGAC和GTCGTT，但也有CTCGTT和GCTGTT。使用这种CpG编码序列的一个例子是从商业上可获得的pTVG4疫苗载体骨架中摘录的以下序列(其完整示意于图5和SEQ ID NO:40):

…agatctaacgacaaaacgacaaaacgacaaggcgccagatctggcgtttcgttttgtcgttttgtc gttagatct…(SEQ ID NO:41)，其中带下划线的核苷酸构成了存在于pTVG4质粒载体序列中的CpG。

另一种可能性是模拟RNA病毒感染，通过添加双链RNA来激活TLR3，这种双链RNA可以是合成的RNA寡核苷酸，如聚I:C(聚肌苷酸-聚胞苷酸)、Poly I:CU12(尿苷取代的聚I:C)，或者是合成的RNA寡核苷酸(ORN)；与ODN方法中一样，将这些RNA分子添加到疫苗中是获得佐剂效果的一种方式。或者，dsRNA可以在DNA载体骨架中编码，在接种疫苗后，它将被转录成RNA——在这种情况下，DNA疫苗因此编码免疫原性佐剂。这种方法可以包括编码长度高达100个碱基对的发夹RNA的DNA序列，其中该序列是非特异性的。此外，所述DNA可以同时包括ODNs和编码已知序列的ORNs。因此，该DNA既可以转录成能够激活TLR3和/或胞质RNA受体如RIG-1、MDA5和LGP2的双链RNA，同时包含激活TLR9的ODN。包括/编码免疫刺激性CpG和dsRNA的特定DNA序列的例子是例如5'-GGTGCATCGATGCAGGGGGG-3'(SEQ ID NO:41)和5'-GGTGCATCGATGCAGGGGGG TATATATATA TTGAGGACAG GTTAAGCTCC CCCCAGCTTA ACCTGTCCTTCAATATATA TATA-3'(SEQ ID NO:42)(参考Wu et al.2011,Vaccine 29(44):7624-30)。

当ISS存在于DNA疫苗载体中时，将使用CpG基序激活TLR9的方法与免疫刺激RNA的编码序列的存在相结合来激活TLR3和/或胞质RNA受体(如RIG-1、MDA5和LGP2)是可能的，也是有利的；参见Grossmann C et al.2009,BMC.Immunology 10:43和Desmet etal.2012.Nat.Rev.Imm.12(7),479–491。同样地，在疫苗中作为分开佐剂(单独或组合)掺入ORNs和ODNs可以与在DNA疫苗载体中掺入两种类型的ISS相结合。

与CpG基序的情况一样，编码免疫刺激性RNA ISS的DNA将优选存在于终止密码子和多聚腺苷酸化信号之间，但可以存在于载体的任何部分，只要这不损害预期多肽表达产物的产生。

在特别重要的实施方案中，ISS包含在疫苗组合物中，并且在特别重要的实施方案中，这通过掺入免疫活性和药学上可接受量的聚I:C和/或聚IC:U12来实现。聚I:C由错配的双链RNA(dsRNA)组成，一条链是肌苷酸的聚合物，另一条链是胞苷酸的聚合物。聚IC:U12是聚I:C的变体，其中尿苷被引入聚I:C链。在这种情况下，这两种物质将起免疫佐剂的作用，即本身不引起特异性适应性免疫反应，但增强针对疫苗抗原(或在本例中，编码抗原)的特异性适应性免疫反应的物质。

聚I:C或聚IC:U12(如

)将优选存在于组合物中，从而每次施用有效剂量的表达载体达到0.1-20毫克的施用剂量；也就是说，调节组合物中存在的量，以达到每次给药的这种剂量。优选地，聚I:C或聚IC:U12的给药剂量为表达载体有效剂量的每次给药0.2至15mg，例如0.3至12、0.4至10和0.5至8mg，优选约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9和4.0mg。特别优选每次给药在0.5至2.0mg的范围内。

核酸疫苗还可以编码包含含有新表位的一种或多种免疫原性多肽的融合产物。质粒DNA也可以使用减毒细菌作为递送系统来递送，这种方法适用于口服给药的DNA疫苗。细菌用独立复制的质粒转化，该质粒在减毒细菌在宿主细胞中死亡后释放到宿主细胞细胞质中。

包括编码所需抗原的DNA在内的DNA疫苗可以以任何合适的形式引入宿主细胞，包括单独的片段、线性化质粒、环状质粒、能够复制的质粒、附加体、RNA等。优选地，所述基因包含在质粒中。在某些实施方案中，质粒是表达载体。能够表达遗传物质的单个表达载体可以使用标准重组技术产生。

给药途径包括但不限于肌内、鼻内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服，以及局部、经皮给药，通过吸入或栓剂给药，或粘膜组织给药，例如通过灌洗阴道、直肠、尿道、口腔和舌下组织。换句话说，给药途径可以选自肠胃外途径中的任何一种，例如通过肌内途径、皮内途径、经皮途径、皮下途径、静脉内途径、动脉内途径、鞘内途径、髓内途径、鞘内途径、脑室内途径、腹膜内途径、鼻内途径、阴道途径、眼内途径或肺部途径；通过口服途径、舌下途径、口腔途径或肛门途径给药；或者局部给药。

典型的给药途径包括肌内、腹膜内、皮内和皮下注射。基因构建体可以通过包括但不限于传统注射器、无针注射装置、“微喷射轰击基因枪”或其他物理方法如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声波的方式给药。DNA疫苗可以通过任何可用于递送DNA的方法来递送，只要DNA被表达并且所需的抗原在细胞中被制造。

在一些实施方案中，本文公开的DNA疫苗组合物通过已知的转染试剂递送或与已知的转染试剂组合递送，所述转染试剂例如阳离子脂质体、碳氟化合物乳液、cochleate、小管、金颗粒、可生物降解的微球或阳离子聚合物。cochleate运输载体是稳定的磷脂钙沉淀剂，由磷脂酰丝氨酸、胆固醇和钙组成；这种无毒且非炎性的转染试剂可以存在于消化系统中。生物可降解微球包含聚合物，如聚(丙交-共-乙交酯)，一种可用于生产转染用的DNA微胶囊的聚酯。基于脂质的微管通常由螺旋缠绕的两层脂质组成，它们的边缘相互连接。当使用细管时，核酸可以布置在其中心中空部分，用于递送和控制释放到动物体内。

DNA疫苗也可以通过微球输送到粘膜表面。生物粘附微球可以使用不同的技术制备，并且可以被定制以粘附到任何粘膜组织，包括在眼睛、鼻腔、泌尿道、结肠和胃肠道中发现的粘膜组织，提供了疫苗的局部和全身控制释放的可能性。将生物粘附微球应用于特定的粘膜组织也可用于局部疫苗作用。在一些实施方案中，粘膜疫苗递送的替代方法是将编码特定蛋白抗原基因的质粒表达载体直接施用到粘膜表面。

公开的DNA质粒疫苗是根据使用的给药方式配制的。通常，DNA质粒疫苗是可注射的组合物，它们是无菌的，和/或无热原和/或无颗粒的。在一些实施方案中，优选使用等渗制剂。通常，等渗性添加剂可以包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些实施方案中，等渗溶液如磷酸盐缓冲盐水是优选的；一种优选的溶液是台氏缓冲液。在一些实施方案中，稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，将允许制剂在室温或环境温度下长时间稳定的稳定剂，例如LGS或其他多阳离子或多阴离子加入制剂中。

本文公开的DNA疫苗组合物包含药理学上可接受的亲水嵌段共聚物，该共聚物包含聚(环氧乙烷)和聚环氧丙烷嵌段，其详细描述如下:

所述两亲嵌段共聚物在定义标题下被更一般地描述，但是优选地两亲嵌段共聚物是泊洛沙姆或泊洛沙胺。泊洛沙姆的性质仅略有不同，但优选泊洛沙姆407和188，尤其是泊洛沙姆188。

当两亲嵌段共聚物是泊洛沙胺时，优选的类型是式(PEO-PPO)₄-ED的顺序泊洛沙胺，其中PEO是聚(环氧乙烷)，PPO是聚(环氧丙烷)，ED是亚乙二胺基。这些分子获得了类似于X的形状，其中PEO-PPO基团从中心亚乙二胺基突出出来。特别优选的泊洛沙胺是分别以注册商标

904、704和304销售的那些泊洛沙胺。这些泊洛沙胺的特征如下:

904的总平均分子量为6700，PPO单元的总平均重量为4020，PEO百分比约为40％。

704的总平均分子量为5500，PPO单元的总平均重量为3300，PEO百分比约为40％；而

304的总平均分子量为1650，PPO单元的总平均重量为990，PEO百分比约为40％。

当用于本文公开的方法中时，所述两亲嵌段共聚物在疫苗组合物中的浓度为2-5％w/v，例如约3％w/v。

本文公开的组合物中的第三种成分是药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其优选为缓冲溶液的形式。胃肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或固定油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂如基于林格氏葡萄糖的补充剂等。防腐剂和抗菌剂包括抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。优选的防腐剂包括福尔马林、硫柳汞、新霉素、多粘菌素B和两性霉素B。

在优选的实施方案中，缓冲溶液是被称为“台氏缓冲液”的溶液，在优选的实施方案中，台氏缓冲液的组成为140mM氯化钠、6mM氯化钾、3mM氯化钙、2mM氯化镁、10mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基乙烷磺酸(Hepes)(优选pH 7.4)和10mM葡萄糖，或者140mM氯化钠、6mM氯化钾、3mM氯化钙、2mM氯化镁、10mM 2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇(TRIS)(优选pH 7.4)和10mM葡萄糖。台氏缓冲液(或替代品)的浓度通常约为35％v/v，但根据悬浮质粒的水含量，浓度可能会有很大差异——因为缓冲液是生理上可接受的，所以它可以占组合物水相的任何百分比。

也可以使用其他缓冲液，如2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇(TRIS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

可以包括额外的载体物质，并且可以包含蛋白质、糖等。这种载体可以是水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性载体的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水。

第二个方面-疫苗组合物

构成本发明第二方面的疫苗组合物是本发明第一方面和权利要求中所述的组合物。因此，与在此公开的方法中使用的组合物有关的每一个特征和考虑，在细节上作必要的修改后，适用于本发明第二方面的组合物。

本发明的第三和第四以及相关方面

这两个方面是相关的，因为它们涉及第二方面的组合物用于治疗用途，即分别用作药物或用于根据本发明第一方面的方法中。

同样，本发明的第四方面还包括第二方面的组合物在第一方面的方法中的用途，以及第二方面的组合物的组分在制备用于治疗恶性肿瘤的药物组合物中的用途。

实施例1

实验疫苗研究

本项研究的目的最初是测试本发明的DNA疫苗诱导新肽特异性T细胞的能力，并监测疫苗对接种小鼠健康的影响。

用于DNA疫苗接种的质粒基于可从ThermoFisher Scientific/Invitrogen获得的市售pVax1^TM载体。

根据制造商的文件，pVAX1^TM是一种3.0kb的质粒载体，可在大肠杆菌中进行高拷贝数复制，并在大多数哺乳动物细胞中高水平瞬时表达感兴趣的编码蛋白。该载体(见图1)包含以下元件:

1)用于在广泛哺乳动物细胞中高水平表达的人巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子，

2)用于mRNA有效转录终止和多聚腺苷酸化的牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸化信号，和

3)用于在大肠杆菌中选择的卡那霉素抗性基因。

pVAX1^TM质粒的全部序列示于SEQ ID NO:1。为了用作所选细胞系中转染和表达的阳性对照，可以使用对照质粒pVAX1^TM/lacZ，其序列示于SEQ ID NO:2。

构建了两个表达载体pVAX1 S16A和pVAX1 S16B。

新肽/新表位首先通过对小鼠结肠癌细胞系CT26和来自BALB/c小鼠的正常组织样品的全外显子组测序以及通过选择仅在癌细胞中发现的肽进行鉴定，如通过测量RNA表达水平所证明的。在实验中，评估了小鼠产生针对所鉴定的新表位的免疫应答的能力。

pVAX1 S16A通过将密码子优化的(用于在小鼠中表达)编码肽的DNA连接到pVax1表达盒中来构建，该肽包含顺序偶联的5个新表位C22、C23、C25、C30和C38(SEQ ID NO:11-15)。pVax1 S16B类似地通过将编码顺序偶联的新表位C29、C37、C39、C40和C41(SEQ ID NO:16-20)的密码子优化的DNA连接到pVax1表达盒中来构建。作为对照，使用在上述CAF09佐剂中配制的C22、C23、C25、C26(SEQ ID NO:21)和C38的肽混合物。在pVAX1 S16A和S16B载体中，插入片段还包括一个Kozak共有序列，以有效启动翻译。下表列出了实验中(也在以下实施例中)使用的11个氨基酸序列:

肽	氨基酸序列	SEQ ID NO:
			C22	QIETQQRKFKASRASILSEMKMLKEKR	11
C23	VILPQAPSGPSYATYLQPAQAQMLTPP	12
			C25	DTLSAMSNPRAMQVLLQIQQGLQTLAT	13
C30	DGQLELLAQGALDNALSSMGALHALPR	14
			C38	RLHVVKLLASALSTNAAALTQELLVLD	15
C29	LHSGQNHLKEMAISVLEARACAAAGQS	16
			C37	GEVPPQKLQALQRALQSEFCNAVREVY	17
C39	KKFMERDPDELRFNTIALSA	18
			C40	VTGTHKMSLGFTKARLLRLRNPWGRVE	19
C41	LWTFSIYLESVAIMPQLFMVSKTGEAE	20
			C21/C26	GDVKIHAHKVVLANISPYFKAMFTGNL	21
EV85	KKFMERDPDELRFNTIALSAA	43
			EV22	GSLFGSSRVQYVVNPAVKIVFLNIDPS	44
EV105	PPPGLAAYTAKMATANGSKKAERQKFS	45
			AA427	VCNVKLLHRVLVADVNALQGMAAIGQR	46

溶解在无菌水中的质粒pVAX1 S16A、pVAX1 S16B和(空的)pVAX1分别与泊洛沙姆188(来自Sigma Aldrich的

F68)和台氏缓冲液混合，以获得3％v/v泊洛沙姆188和1μg/μl质粒在台氏缓冲液中的组合物。还制备了水、台氏缓冲液(水∶缓冲液和泊洛沙姆188的比例为3％v/v)的载体溶液。

平行地，通过混合二甲基亚砜溶解的肽、Tris缓冲液和CAF09来制备上述肽混合物，以提供在Tris缓冲液中包含5％w/v每种肽(即总肽25％w/v)、5％二甲基亚砜和66.67％v/v CAF09的组合物。

一组5只小鼠在第0、1、2、3、9和16天以每种肽50μg的剂量用肽组合物免疫。平行地，4组5只小鼠在第2、9和16天接受了100μl DNA疫苗(或模拟对照)的注射，形式为每个胫骨50μl。四组分别用泊洛沙姆188、泊洛沙姆188和模拟质粒、泊洛沙姆188和pVAX1 S16A、泊洛沙姆188和pVAX1 S16B免疫。

为了测量T细胞活化，进行了以下再刺激实验:

用含新肽的疫苗刺激脾细胞。在脾细胞样本中，抗原呈递细胞加工新肽，随后将其呈递至T细胞，导致同源CD4+和CD8+T细胞的激活。活化的T细胞增加细胞因子的合成，包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)和干扰素γ(IFN-γ)。用细胞因子和细胞表面标记特异性的荧光染料标记的抗体染色来检测多功能性T细胞。

结果

首次免疫后第13天收集所有小鼠的全血，并用荧光团标记的C22MHC I四聚体染色。

用编码pVAX1 S16A的C22疫苗免疫第0天和第7天以高频率(平均0.6频率)诱导了C22新肽特异性CD8+T细胞。见图4。效果明显好于由在CAF09中配制的五种肽(包括C22)组成的阳性对照(平均0.1频率)。用S16A质粒接种诱导的CD8+T细胞能够响应于新肽的后续刺激而产生干扰素γ和肿瘤坏死因子α，而来自未用S16A免疫的动物的样品在用新肽刺激时没有显示细胞因子信号。此外，用S16A和S16B接种诱导了反应性CD4+T细胞，其能够响应随后用新肽的刺激而产生干扰素γ和肿瘤坏死因子α，而来自未用S16A免疫的动物的样品在用新肽刺激时没有显示细胞因子信号。两个实验的数据如图13A和13B所示。

在其余组的任何小鼠中都没有检测到C22新肽特异性CD8+T细胞。

在一个附加试验中，用上述质粒疫苗免疫小鼠。第一次免疫后4周(即在免疫4和5之间)，接种肿瘤细胞(CT26)。43天后，处死小鼠并测定肿瘤大小。在接受质粒疫苗的组中，该试点实验显示大多数小鼠的移植肿瘤被完全根除。见图6。该研究没有获得统计学上有意义的数据，因为每组只有5只小鼠被免疫。因此，100μg DNA的剂量太高，无法区分由DNA介导的TLR9接合和新表位特异性T细胞诱导的效应，因此需要进行减少DNA质粒剂量和/或免疫接种次数的实验。此外，小鼠对DNA疫苗耐受性良好；在整个研究过程中，没有观察到不利影响的迹象，小鼠的体重持续增加，表明小鼠健康且未受影响。

结论

在来自质粒载体S16A接种小鼠的全血中，C22新肽特异性CD8+T细胞以高频率存在。基于这些数据，决定用CT26肿瘤细胞接种小鼠，并继续7天免疫接种程序。在肿瘤细胞接种前4周开始的间隔7天的免疫接种导致在大多数接种了DNA质粒的小鼠中完全根除了移植的肿瘤。100μg DNA质粒的免疫接种安排过于密集，无法区分由DNA介导的TLR9接合和新表位特异性T细胞诱导的效果，因此需要减少免疫接种的次数。质粒载体S16A疫苗产生CD8+T细胞新肽反应性，通过刺激时细胞因子的产生来测量，而质粒载体pVAX1 S16B疫苗主要诱导CD4+T细胞反应，而不是CD8+T细胞反应。这些疫苗被小鼠很好地耐受；没有观察到不利影响的迹象，在整个研究过程中，小鼠的体重持续增加，表明小鼠健康且未受影响。

实施例2

CT26肿瘤研究中质粒载体+/-不同聚合物的评估

该研究的目的是调查S16A质粒载体作为裸DNA疫苗或与不同嵌段共聚物的选择结合递送的免疫原性和抗肿瘤效果。

研究计划

相对于第0天的CT26肿瘤接种，小鼠在第-13天、第-6天、第1天、第7天和第14天接受了测试疫苗的免疫接种。每次免疫包括分别在左胫骨和右胫骨注射50μl疫苗。在接种后的第1天，从试验动物获得用于四聚体试验中C22 MHC I试验的血样。

四聚体分析如下进行:

产生MHC类分子，并装载稳定肽，通过将分子暴露于紫外光，该稳定肽与C22表位交换。通过与荧光标记的链霉亲和素偶联，MHC I类分子被多聚体化。为了鉴定新肽阳性的CD8+T细胞，用多聚体和荧光团缀合的抗CD3、抗CD4和抗CD8抗体对细胞进行共染色。然后通过流式细胞术分析样品，并计算MHC:C22阳性CD8+的分数。

8组13只小鼠分别接受了以下疫苗组合物:

1.Lutrol+S16A质粒载体(100μg)

2.koliphor+S16A质粒载体(100μg)

3.PE6400+S16A质粒载体(100μg)

4.kolliphor+模拟质粒载体(100μg)

5.裸S16A质粒载体(100μg)

6.Lutrol

7.Kolliphor

8.未处理的对照

第九组未接触抗原的小鼠包括5只动物。

因此，与S16A结合测试的两亲性嵌段共聚物是

F 68和

P188，它们都具有以下通式:

还测试了具有下式的

(BASF):

质粒载体疫苗是由上述聚合物与PVAX1、S16A和模拟质粒形式的100μg质粒DNA一起配制构成的:

实验的读数是相对于第一次免疫时体重的体重变化、肿瘤体积、肽再刺激后T细胞活化的评估，以及循环中新表位特异性CD8+T细胞的测量。

结果

免疫接种对肿瘤生长的影响如图7所示：与仅递送100μg模拟质粒载体和共聚物相比，预防性免疫接种导致接受100μg S16A质粒载体和共聚物Kolliphor、Lutrol和PE6400以及裸露的S16A质粒DNA的小鼠的肿瘤体积显着降低。

与裸S16A质粒载体相比，共聚物促进S16A质粒载体的递送不会导致显著降低的肿瘤体积。在仅Lutrol和未处理的对照组中观察到的肿瘤体积略低于预期，尽管肿瘤体积明显大于100μg S16A裸质粒递送。对肿瘤体积的影响也在长期随访的小鼠中得到证实，其中未经治疗的对照组均发生肿瘤，而接种疫苗的动物中有60％至80％。

此外(见图8)，包含共聚物的疫苗提供了更早的免疫反应。这是在C22四聚体染色试验中检测CD8+细胞的出现时观察到的：从研究第1天(第三次免疫后一天)开始，在用含有和不含共聚物的S16A质粒载体进行免疫的小鼠尾静脉血中观察到对新肽C22具有特异性的CD8+T细胞，但在此时间点观察到接受共聚物配制疫苗的组明显更高的CD8+T细胞频率。在促进S16A免疫原性方面，Lutrol、Kolliphor和PE6400共聚物之间没有可观察到的差异。

在对照样品中未检测到四聚体信号。

结论

带有和不带有不同嵌段共聚物的S16A质粒载体递送导致CT26抗肿瘤作用。00μgS16A载体(带有Lutrol、Kolliphor、PE6400和裸DNA)导致与对照组相比显着降低的肿瘤体积AUC，证明了临床级聚合物Kolliphor与研究级版本(Lutrol)一样有效。100μg模拟质粒免疫没有抗肿瘤作用。在治疗早期，共聚物促进的质粒载体递送比裸质粒载体DNA更具免疫原性。S16A新肽再刺激在接受含或不含共聚物的S16A质粒载体的各组的脾细胞中显示出相似的T细胞免疫原性特征。

实施例3

候选疫苗的测试

本实施例的主要目的是测试载体pTVG4作为递送由质粒编码的新表位的骨架。对包含预测CT26小鼠肿瘤模型(详见上文)的S16A五表位的pTVG4载体进行了测试，并对比S16A五表位的pVAX1骨架进行基准测试。

此外，次要目标是测试TLR3激动剂聚I:C与DNA疫苗的组合，以确定该组合是否导致更高的新表位特异性T细胞数量。

实验

相对于第0天的CT26肿瘤接种，小鼠在第-13、-6、1、7和14天接受了测试疫苗的免疫接种。每次免疫接种包括分别在左胫骨和右胫骨注射50μl疫苗。在接种后第1天从测试动物获得用于四聚体测定中C22 MHC I测试的血样。

7组13-15只小鼠分别接受以下疫苗组合物：

1.Kolliphor+Poly I:C

2.Kolliphor+模拟pTVG4

3.Kolliphor+pTVG4 S16A

4.裸pTVG4 S16A

5.Kolliphor+pTVG4 S16A+poly I:C

6.Kolliphor+pVAX1 S16A

7.Kolliphor+pVAX1 S16A+poly I:C

还测试了第8组4只未接触抗原的小鼠。

读数是肿瘤体积、肽再刺激后的脾T细胞活化和循环中的新表位特异性CD8+T细胞。

结果

对肿瘤大小的影响如图9所示。用50μg pTVG4a S16A+Kolliphor和50μg pVAX1S16A+Kolliphorboth进行免疫接种对于大多数小鼠导致CT26肿瘤生长延迟。裸pTVG4aS16A载体具有类似的效果。有点令人惊讶的是，poly I:C与pTVG4a S16A和pVAX1 S16A的复合制剂抵消了两种DNA免疫疗法的抗肿瘤作用。

图10显示了类似的模式，显示了接种后第6天获得的血液的C22四聚体染色：在研究第6天，在用pTVG4a S16A+/-Kolliphor和pVAX1 S16A+Kolliphor免疫的小鼠的尾静脉血中观察到了对CT26新肽C22具有特异性的CD8+T细胞，但在接受poly I:C和DNA免疫治疗的组中观察到的C22特异性CD8+T细胞频率较低。正如预期的那样，在对照样品(Kolliphor+poly I:C免疫的或未接触抗原的对照小鼠)中未检测到四聚体信号。

结论

pTVG4载体成功递送编码的新表位并诱导特异性T细胞应答，并将肿瘤体积减少到至少与先前测试的pVAX1 S16质粒相似的程度。本实验中与poly I:C的组合似乎抵消了所测试疫苗的抗肿瘤作用。

实施例4

测试优化的DNA插入序列

目的是确定不同新表位的表达是否受到它们在疫苗载体中插入片段内的位置的影响，以及这是否会转化为抗肿瘤效果的差异(位置偏差测试)。

此外，目的是测试包含13个新表位的临床相关DNA构建体，并与上面测试的五表位进行比较。

实验

7组14只小鼠用于实验，其中5组接受测试疫苗(50μg DNA与

组合)，一组接受空载体，一组仅接受佐剂。此外，实验中还包括一组5只未接触抗原的小鼠。相对于第0天用CT26肿瘤细胞接种而言，在第-15、-8、-1、6和13天进行免疫接种。在第-2天，采集血液样本。

分组和疫苗分配如下：

“OPTIM”名称表示插入DNA序列是用密码子优化的载体序列生成的。对于位置偏差测试，将一个特定的新表位C22从13个新表位编码插入物的第一、中间位置移动到末端位置，命名为S16T13 F/OPTIM、S16T13 M/OPTIM和R/OPTIM——这种方法是用于确定整个DNA插入片段是否确实表达以及表位的相对位置是否对表达效率有影响。选择C22作为移动表位的基本原理与在已建立的C22特异性CD8+T细胞检测中使用MHC I四聚体检测的易检测性有关。

S16T13多表位包括13个表位C22、C23、C38、C25、C30、C37、EV85、C40、C41、C29、EV22、EV105和AA427。

与之前的实验一样，读数是肿瘤体积(第19天)、肽重新刺激后的脾T细胞活化和循环中的新表位特异性CD8+T细胞。

结果

疫苗对肿瘤体积(第19天)和C22特异性CD8+T细胞(第-2天)的影响分别如图11和图1 2所示。

对于肿瘤体积，Kruskal-Wallis检验证明所有13种新表位构建体完全减少了肿瘤生长(p＜＜0.001)，而5种新表位构建体也显着减少了肿瘤生长。对于识别C22的CD8+T细胞，所有构建体都诱导了相似程度的CD8+T细胞识别，从而证实了整个DNA插入片段在体内转录和翻译。

结论

所有测试的核苷酸序列都有效地诱导了新表位特异性T细胞反应，从而转化为抗肿瘤免疫。DNA插入物中新表位的位置不影响免疫原性：无论测量的新表位(C22)的位置如何，所有构建体都诱导相似频率的新表位特异性CD8+T细胞。

最后，重要的是，包含的新表位的数量影响了DNA构建体的抗肿瘤效果。包含更多的新表位(5种对比13种)显著改善了临床反应。

序列表

<110> Evaxion Biotech ApS

<120> 使用编码新表位的构建体进行核酸疫苗接种

<130> 21961EP01

<160> 46

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2999

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pVAX1 DNA疫苗载体

<400> 1

gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240

ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600

ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660

aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720

accgagctcg gatccactag tccagtgtgg tggaattctg cagatatcca gcacagtggc 780

ggccgctcga gtctagaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta 840

gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 900

ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 960

attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 1020

gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctac tgggcggttt tatggacagc 1080

aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc cctgcaaagt 1140

aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa gctctgatca 1200

agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc 1260

ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc 1320

tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga 1380

cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac 1440

gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct 1500

gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa 1560

agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc 1620

attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct 1680

tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc 1740

caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg 1800

cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct 1860

gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct 1920

tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca 1980

gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attattaacg cttacaattt 2040

cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tacaggtggc 2100

acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat 2160

atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatagca cgtgctaaaa 2220

cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 2280

atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 2340

tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 2400

ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 2460

ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 2520

cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 2580

gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 2640

gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 2700

acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 2760

gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 2820

agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 2880

tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 2940

agcaacgcgg cctttttacg gttcctgggc ttttgctggc cttttgctca catgttctt 2999

<210> 2

<211> 6050

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pVAX1/LacZ DNA疫苗载体

<400> 2

gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240

ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600

ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660

aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt 720

accgagctcg gatccactag tccagtgtgg tggaattctg cagatcgaaa cgatgataga 780

tcccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct 840

tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc 900

ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcttt gcctggtttc cggtaccaga 960

agcggtgccg gaaagctggc tggagtgcga tcttcctgag gccgatactg tcgtcgtccc 1020

ctcaaactgg cagatgcacg gttacgatgc gcccatctac accaacgtaa cctatcccat 1080

tacggtcaat ccgccgtttg ttcccacgga gaatccgacg ggttgttact cgctcacatt 1140

taatgttgat gaaagctggc tacaggaagg ccagacgcga attatttttg atggcgttaa 1200

ctcggcgttt catctgtggt gcaacgggcg ctgggtcggt tacggccagg acagtcgttt 1260

gccgtctgaa tttgacctga gcgcattttt acgcgccgga gaaaaccgcc tcgcggtgat 1320

ggtgctgcgt tggagtgacg gcagttatct ggaagatcag gatatgtggc ggatgagcgg 1380

cattttccgt gacgtctcgt tgctgcataa accgactaca caaatcagcg atttccatgt 1440

tgccactcgc tttaatgatg atttcagccg cgctgtactg gaggctgaag ttcagatgtg 1500

cggcgagttg cgtgactacc tacgggtaac agtttcttta tggcagggtg aaacgcaggt 1560

cgccagcggc accgcgcctt tcggcggtga aattatcgat gagcgtggtg gttatgccga 1620

tcgcgtcaca ctacgtctga acgtcgaaaa cccgaaactg tggagcgccg aaatcccgaa 1680

tctctatcgt gcggtggttg aactgcacac cgccgacggc acgctgattg aagcagaagc 1740

ctgcgatgtc ggtttccgcg aggtgcggat tgaaaatggt ctgctgctgc tgaacggcaa 1800

gccgttgctg attcgaggcg ttaaccgtca cgagcatcat cctctgcatg gtcaggtcat 1860

ggatgagcag acgatggtgc aggatatcct gctgatgaag cagaacaact ttaacgccgt 1920

gcgctgttcg cattatccga accatccgct gtggtacacg ctgtgcgacc gctacggcct 1980

gtatgtggtg gatgaagcca atattgaaac ccacggcatg gtgccaatga atcgtctgac 2040

cgatgatccg cgctggctac cggcgatgag cgaacgcgta acgcgaatgg tgcagcgcga 2100

tcgtaatcac ccgagtgtga tcatctggtc gctggggaat gaatcaggcc acggcgctaa 2160

tcacgacgcg ctgtatcgct ggatcaaatc tgtcgatcct tcccgcccgg tgcagtatga 2220

aggcggcgga gccgacacca cggccaccga tattatttgc ccgatgtacg cgcgcgtgga 2280

tgaagaccag cccttcccgg ctgtgccgaa atggtccatc aaaaaatggc tttcgctacc 2340

tggagagacg cgcccgctga tcctttgcga atacgcccac gcgatgggta acagtcttgg 2400

cggtttcgct aaatactggc aggcgtttcg tcagtatccc cgtttacagg gcggcttcgt 2460

ctgggactgg gtggatcagt cgctgattaa atatgatgaa aacggcaacc cgtggtcggc 2520

ttacggcggt gattttggcg atacgccgaa cgatcgccag ttctgtatga acggtctggt 2580

ctttgccgac cgcacgccgc atccagcgct gacggaagca aaacaccagc agcagttttt 2640

ccagttccgt ttatccgggc aaaccatcga agtgaccagc gaatacctgt tccgtcatag 2700

cgataacgag ctcctgcact ggatggtggc gctggatggt aagccgctgg caagcggtga 2760

agtgcctctg gatgtcgctc cacaaggtaa acagttgatt gaactgcctg aactaccgca 2820

gccggagagc gccgggcaac tctggctcac agtacgcgta gtgcaaccga acgcgaccgc 2880

atggtcagaa gccgggcaca tcagcgcctg gcagcagtgg cgtctggcgg aaaacctcag 2940

tgtgacgctc cccgccgcgt cccacgccat cccgcatctg accaccagcg aaatggattt 3000

ttgcatcgag ctgggtaata agcgttggca atttaaccgc cagtcaggct ttctttcaca 3060

gatgtggatt ggcgataaaa aacaactgct gacgccgctg cgcgatcagt tcacccgtgc 3120

accgctggat aacgacattg gcgtaagtga agcgacccgc attgacccta acgcctgggt 3180

cgaacgctgg aaggcggcgg gccattacca ggccgaagca gcgttgttgc agtgcacggc 3240

agatacactt gctgatgcgg tgctgattac gaccgctcac gcgtggcagc atcaggggaa 3300

aaccttattt atcagccgga aaacctaccg gattgatggt agtggtcaaa tggcgattac 3360

cgttgatgtt gaagtggcga gcgatacacc gcatccggcg cggattggcc tgaactgcca 3420

gctggcgcag gtagcagagc gggtaaactg gctcggatta gggccgcaag aaaactatcc 3480

cgaccgcctt actgccgcct gttttgaccg ctgggatctg ccattgtcag acatgtatac 3540

cccgtacgtc ttcccgagcg aaaacggtct gcgctgcggg acgcgcgaat tgaattatgg 3600

cccacaccag tggcgcggcg acttccagtt caacatcagc cgctacagtc aacagcaact 3660

gatggaaacc agccatcgcc atctgctgca cgcggaagaa ggcacatggc tgaatatcga 3720

cggtttccat atggggattg gtggcgacga ctcctggagc ccgtcagtat cggcggaatt 3780

ccagctgagc gccggtcgct accattacca gttggtctgg tgtcaaaaag cggccgctcg 3840

agtctagagg gcccgtttaa acccgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc 3900

catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg 3960

tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc 4020

tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg 4080

ctggggatgc ggtgggctct atggcttcta ctgggcggtt ttatggacag caagcgaacc 4140

ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag ccctgcaaag taaactggat 4200

ggctttctcg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca agctctgatc aagagacagg 4260

atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg 4320

ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc 4380

cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg 4440

tgccctgaat gaactgcaag acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt 4500

tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg 4560

cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat 4620

catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca 4680

ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca 4740

ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa 4800

ggcgagcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa 4860

tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc 4920

ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga 4980

atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc 5040

cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg aattattaac gcttacaatt tcctgatgcg 5100

gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atacaggtgg cacttttcgg 5160

ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 5220

ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatagc acgtgctaaa acttcatttt 5280

taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa 5340

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 5400

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 5460

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 5520

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 5580

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 5640

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 5700

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 5760

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 5820

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 5880

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 5940

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 6000

gcctttttac ggttcctggg cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt 6050

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性接头序列

<400> 3

Gly Ser Gly Gly Gly Ala

1 5

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性接头序列

<400> 4

Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性接头序列

<400> 5

Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ala

<210> 6

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性接头序列

<400> 6

Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ala

20

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性接头序列

<400> 7

Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Gly

1 5 10

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 刚性接头序列

<400> 8

Lys Pro Glu Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro

1 5 10

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 刚性接头序列

<400> 9

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala

1 5 10

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 刚性接头序列

<400> 10

Ser Ala Cys Tyr Cys Glu Leu Ser

1 5

<210> 11

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新表位

<400> 11

Gln Ile Glu Thr Gln Gln Arg Lys Phe Lys Ala Ser Arg Ala Ser Ile

1 5 10 15

Leu Ser Glu Met Lys Met Leu Lys Glu Lys Arg

20 25

<210> 12

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新表位

<400> 12

Val Ile Leu Pro Gln Ala Pro Ser Gly Pro Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu

1 5 10 15

Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met Leu Thr Pro Pro

20 25

<210> 13

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新表位

<400> 13

Asp Thr Leu Ser Ala Met Ser Asn Pro Arg Ala Met Gln Val Leu Leu

1 5 10 15

Gln Ile Gln Gln Gly Leu Gln Thr Leu Ala Thr

20 25

<210> 14

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新表位

<400> 14

Asp Gly Gln Leu Glu Leu Leu Ala Gln Gly Ala Leu Asp Asn Ala Leu

1 5 10 15

Ser Ser Met Gly Ala Leu His Ala Leu Pro Arg

20 25

<210> 15

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新表位

<400> 15

Arg Leu His Val Val Lys Leu Leu Ala Ser Ala Leu Ser Thr Asn Ala

1 5 10 15

Ala Ala Leu Thr Gln Glu Leu Leu Val Leu Asp

20 25

<210> 16

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新表位

<400> 16

Leu His Ser Gly Gln Asn His Leu Lys Glu Met Ala Ile Ser Val Leu

1 5 10 15

Glu Ala Arg Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gln Ser

20 25

<210> 17

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新表位

<400> 17

Gly Glu Val Pro Pro Gln Lys Leu Gln Ala Leu Gln Arg Ala Leu Gln

1 5 10 15

Ser Glu Phe Cys Asn Ala Val Arg Glu Val Tyr

20 25

<210> 18

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新表位

<400> 18

Lys Lys Phe Met Glu Arg Asp Pro Asp Glu Leu Arg Phe Asn Thr Ile

1 5 10 15

Ala Leu Ser Ala

20

<210> 19

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新表位

<400> 19

Val Thr Gly Thr His Lys Met Ser Leu Gly Phe Thr Lys Ala Arg Leu

1 5 10 15

Leu Arg Leu Arg Asn Pro Trp Gly Arg Val Glu

20 25

<210> 20

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新表位

<400> 20

Leu Trp Thr Phe Ser Ile Tyr Leu Glu Ser Val Ala Ile Met Pro Gln

1 5 10 15

Leu Phe Met Val Ser Lys Thr Gly Glu Ala Glu

20 25

<210> 21

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新表位

<400> 21

Gly Asp Val Lys Ile His Ala His Lys Val Val Leu Ala Asn Ile Ser

1 5 10 15

Pro Tyr Phe Lys Ala Met Phe Thr Gly Asn Leu

20 25

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 22

Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 23

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 24

Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 25

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 26

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 基序

<400> 27

ggggtcaacg ttgagggggg 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 基序

<400> 28

gggggacgat cgtcgggggg 20

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 基序

<400> 29

ggggacgacg tcgtgggggg g 21

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 基序

<400> 30

tccatgacgt tcctgatgct 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 基序

<400> 31

tccatgacgt tcctgacgtt 20

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 基序

<400> 32

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 基序

<400> 33

tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 基序

<400> 34

tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23

<210> 35

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 基序

<400> 35

tcgcgacgtt cgcccgacgt tcggta 26

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 基序

<400> 36

tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 基序

<400> 37

tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25

<210> 38

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG 基序

<400> 38

tcgcgaacgt tcgccgcgtt cgaacgcgg 29

<210> 39

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pTVG4疫苗载体的片段

<400> 39

agatctaacg acaaaacgac aaaacgacaa ggcgccagat ctggcgtttc gttttgtcgt 60

tttgtcgtta gatct 75

<210> 40

<211> 4099

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pTVG4疫苗载体

<400> 40

tggccattgc atacgttgta tccatatcat aatatgtaca tttatattgg ctcatgtcca 60

acattaccgc catgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg 120

tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg 180

cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 240

gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 300

cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac 360

ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg 420

cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc 480

aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc 540

aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc 600

gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct 660

cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga 720

agacaccggg accgatccag cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc 780

cgtgccaaga gtgacgtaag taccgcctat agactctata ggcacacccc tttggctctt 840

atgcatgcta tactgttttt ggcttggggc ctatacaccc ccgcttcctt atgctatagg 900

tgatggtata gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctccaacggt 960

ggagggcagt gtagtctgag cagtactcgt tgctgccgcg cgcgccacca gacataatag 1020

ctgacagact aacagactgt tcctttccat gggtcttttc tgcagtcacc gtcgtcgacg 1080

gtatcgataa gcttgatatc gaattcacgt gggcccggta ccgtatactc tagagcggcc 1140

gcggatccag atctaacgac aaaacgacaa aacgacaagg cgccagatct ggcgtttcgt 1200

tttgtcgttt tgtcgttaga tctttttccc tctgccaaaa attatgggga catcatgaag 1260

ccccttgagc atctgacttc tggctaataa aggaaattta ttttcattgc aatagtgtgt 1320

tggaattttt tgtgtctctc actcggaagg acatatggga gggcaaatca tttaaaacat 1380

cagaatgagt atttggttta gagtttggca acatatgccc attcttccgc ttcctcgctc 1440

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 1500

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 1560

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 1620

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 1680

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 1740

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 1800

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 1860

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 1920

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 1980

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 2040

agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 2100

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 2160

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 2220

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 2280

aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 2340

tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 2400

atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactcgggg ggggggggcg ctgaggtctg 2460

cctcgtgaag aaggtgttgc tgactcatac caggcctgaa tcgccccatc atccagccag 2520

aaagtgaggg agccacggtt gatgagagct ttgttgtagg tggaccagtt ggtgattttg 2580

aacttttgct ttgccacgga acggtctgcg ttgtcgggaa gatgcgtgat ctgatccttc 2640

aactcagcaa aagttcgatt tattcaacaa agccgccgtc ccgtcaagtc agcgtaatgc 2700

tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg agcatcaaat 2760

gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa agccgtttct 2820

gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc tggtatcggt 2880

ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa 2940

ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagct 3000

tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac 3060

tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga aatacgcgat 3120

cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg aacactgcca 3180

gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg aatgctgttt 3240

tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata aaatgcttga 3300

tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca tctgtaacat 3360

cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat 3420

acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat ttatacccat 3480

ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt tcccgttgaa 3540

tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacagtttt attgttcatg 3600

atgatatatt tttatcttgt gcaatgtaac atcagagatt ttgagacaca acgtggcttt 3660

cccccccccc ccattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 3720

ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 3780

cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca 3840

cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc 3900

tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg 3960

gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga 4020

ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat 4080

accgcatcag attggctat 4099

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CPG

<400> 41

ggtgcatcga tgcagggggg 20

<210> 42

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CPG 编码序列

<400> 42

ggtgcatcga tgcagggggg tatatatata ttgaggacag gttaagctcc ccccagctta 60

acctgtcctt caatatatat ata 83

<210> 43

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新表位

<400> 43

Lys Lys Phe Met Glu Arg Asp Pro Asp Glu Leu Arg Phe Asn Thr Ile

1 5 10 15

Ala Leu Ser Ala Ala

20

<210> 44

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新表位

<400> 44

Gly Ser Leu Phe Gly Ser Ser Arg Val Gln Tyr Val Val Asn Pro Ala

1 5 10 15

Val Lys Ile Val Phe Leu Asn Ile Asp Pro Ser

20 25

<210> 45

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新表位

<400> 45

Pro Pro Pro Gly Leu Ala Ala Tyr Thr Ala Lys Met Ala Thr Ala Asn

1 5 10 15

Gly Ser Lys Lys Ala Glu Arg Gln Lys Phe Ser

20 25

<210> 46

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新表位

<400> 46

Val Cys Asn Val Lys Leu Leu His Arg Val Leu Val Ala Asp Val Asn

1 5 10 15

Ala Leu Gln Gly Met Ala Ala Ile Gly Gln Arg

20 25

Claims

1.一种在患者中诱导针对恶性肿瘤的治疗性或改善性免疫应答的方法，其中所述恶性肿瘤的细胞表达编码含有新表位的多肽的遗传物质，所述方法包括向所述患者施用至少一个有效剂量的组合物，所述组合物包括：

1)至少一种表达载体，其包含编码至少一种多肽的核酸，该多肽表现出所述恶性肿瘤的一个或多个新表位，和

2)包含聚(环氧乙烷)和聚环氧丙烷嵌段的两亲嵌段共聚物，和

3)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，

从而使患者的体细胞表达编码所述至少一种多肽的所述核酸。

2.根据权利要求1的方法，其中所述两亲嵌段共聚物是泊洛沙姆或泊洛沙胺。

3.根据权利要求1的方法，其中所述两亲嵌段共聚物是选自泊洛沙姆407和188的泊洛沙姆，优选泊洛沙姆188。

4.根据权利要求1的方法，其中所述两亲嵌段共聚物是式(PEO-PPO)₄-ED的顺序泊洛沙胺，其中PEO是聚(环氧乙烷)，PPO是聚(环氧丙烷)，并且ED是亚乙二胺基团。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂是水性缓冲溶液。

6.根据权利要求5的方法，其中所述水性缓冲溶液是台氏缓冲液或2-氨基-2-(羟甲基)-1，3-丙二醇(TRIS)缓冲液或PBS。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述台氏缓冲液的组成为140mM NaCl、6mM KCl、3mM CaCl₂、2mM MgCl₂、10mM 4-(2-羟乙基)-l-哌嗪乙磺酸(Hepes)和10mM葡萄糖，或组成为140mM NaCl、6mM KCl、3mM CaCl₂、2mM MgCl₂、10mM 2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇(TRIS)和10mM葡萄糖。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中台氏缓冲液的浓度为约35％v/v。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述两亲嵌段共聚物的浓度在2至5％w/v之间，例如约3％w/v。

10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述组合物进一步包含至少一种免疫刺激序列(ISS)。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述ISS是包含至少一个CpG基序的寡脱氧核糖核苷酸(ODN)，并且其中所述ODN优选地包括硫代磷酸酯基团。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述ISS是或包含寡核苷酸。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述有效剂量包含10μg和25mg之间的表达载体，例如100μg和20mg之间、0.5和15mg之间、1mg和10mg之间、以及在2和8mg之间，特别是约0.5、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7和约8mg。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表达载体表达至少或约5个，例如至少或约10个，至少或约15个，至少或约20个，至少或约25个，和至少或约30个新表位。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表达载体为每个编码的新表位编码单独的肽。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表达载体编码多种肽，其中至少一种表现出几个编码的新表位，其中至少一些任选地被肽接头分开。

17.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述表达载体进一步包含或编码至少一种免疫刺激序列(ISS)。

18.根据权利要求17的方法，其中所述至少一种ISS或ISS编码序列位于新表位编码序列的终止密码子和聚腺苷酸化信号之间。

19.根据权利要求17-18中任一项所述的方法，其中所述至少一种ISS包含在所述表达载体中。

20.根据权利要求17-18中任一项所述的方法，其中所述至少一个ISS编码序列由所述表达载体编码。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述ISS是或包含激活Toll样受体9(TLR-9)的序列，例如CpG基序。

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述ISS编码激活Toll样受体3(TLR-3)和/或胞质RNA受体例如RIG-1、MDA5和LGP2的RNA序列，例如形成RNA发夹或构成免疫刺激性RNA序列的RNA序列。

23.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述表达载体包含在质粒中或构成质粒。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一个有效剂量是一系列剂量，例如一系列2、3、4、5、6或更多个剂量。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者是人类。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述有效剂量经肠胃外施用，例如经由肌肉内途径、皮内途径、经皮途径、皮下途径、静脉内途径、动脉内途径、鞘内途径、髓内途径、鞘内途径、脑室内途径、腹膜内、鼻内途径、阴道途径、眼内途径或肺途径；通过口服途径、舌下途径、口腔途径或肛门途径给药；或局部给药。

27.一种组合物，其中包含：

1)至少一种表达载体，其包含编码至少一种多肽的核酸，该多肽表现出恶性肿瘤的一个或多个新表位，和

2)包含聚(环氧乙烷)和聚环氧丙烷的嵌段的两亲嵌段共聚物，和

3)台氏缓冲液。

28.根据权利要求27的组合物，其是如权利要求2-23中任一项所定义的组合物。

29.如权利要求1-23中任一项所定义的组合物用作药物。

30.如权利要求1-23任一项所定义的组合物，用于根据权利要求1-14任一项的方法中。