BRPI1011048B1 - plasmídeo independente de antibiótico - Google Patents

Abstract

plasmídeo independente de antibiótico a presente invenção fornece um método de manutenção de um plasmídeo de bactéria gram-negativa sem o uso de pressão de seleção de antibióticos. além disso, a invenção referese aos plasmídeos independente de fármaco produzidos, incluindo plasmídeos independente de fármaco contendo um gene heterólogo. a invenção também fornece formulações e/ou composições que compreendem os plasmídeos independente de fármaco que compreendem um gene heterólogo, formulações e/ou composições compreendendo uma proteína ou um imunógeno expresso utilizando os plasmídeos independente de fármaco, e métodos de administração de tais formulações e/ou composições a um hospedeiro. a invenção refere-se às bactérias gram-negativas contendo os plasmídeos independente de fármaco.

Description

Relatório descritivo da Patente de Invenção para "PLASMÍDEO INDEPENDENTE DE ANTIBIÓTICO" INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório americano n° de série 61/180.755, depositado no dia 22 de maio de 2009.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método de manutenção e produção de plasmídeos em uma bactéria gram- negativa sem o uso de pressão de seleção por antibióticos.

Além disso, a invenção refere-se aos plasmídeos produzidos sem fármacos, bem como formulações e/ou composições contendo os plasmídeos sem fármacos, e formulações e/ou composições contendo a proteína ou imunógeno produzido usando os plasmídeos sem fármacos, e aos métodos de administração das formulações e/ou composições a um hospedeiro. A invenção refere-se às bactérias gram- negativas contendo os plasmídeos sem fármacos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Até o momento, há uma ausência de vetores de DNA de plasmídeo que são considerados seguros, potentes e eficientes para uso medicinal. A presença de genes de resistência a antibióticos nos plasmídeos administrados é uma das desvantagens da terapia genética e aplicações de vacina de DNA modernas.

Plasmídeos são moléculas de DNA èxtrãcromossômicas que são separadas do DNA cromossômico e são capazes de se replicar de forma independente do DNA cromossômico (Lipps G. (editor). (2008). Plasmids: Current Research and Future Trends. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-35-6).

Plasmídeos geralmente ocorrem naturalmente em bactérias, mas às vezes são encontrados em organismos eucarióticos.

Eles são considerados elementos genéticos transferíveis, ou replicons, capazes de replicação autônoma dentro de um hospedeiro adequado. Plasmídeos são DNA desprotegidos e não codificam genes necessários para envolver o material genético para transferência para um novo hospedeiro. Portanto, a transferência hospedeiro-hospedeiro de plasmídeos exige a transferência direta mecânica por conjugação ou mudanças na expressão gênica do hospedeiro, permitindo a captação intencional do elemento genético por transformação (Lipps G. 2008). O uso de DNA plasmideo (pDNA) para a terapia genética e vacinação é uma nova tecnologia com potencial considerável na área da saúde humana e animal (Mairhofer, J. e cols., Biotechnol. J., 3, 83-89, 2008). Além disso, plasmídeos servem como ferramentas importantes para laboratórios de genética e biotecnologia, onde eles são comumente usados para multiplicar ou expressar genes particulares (Russell, David W.; Sambrook, Joseph (2001), Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N. Y: Cold Spring Harbor Laboratory).

Plasmídeos fornecem um mecanismo para transferência de genes horizontal dentro de uma população de micróbios e tipicamente fornecem uma vantagem seletiva em um dado estado ambiental. Por exemplo, plasmídeos podem transportar genes que conferem resistência aos antibióticos naturais.

Marcadores alternativos além de antibióticos também existem. Por exemplo, as proteínas produzidas pelo plasmídeo podem atuar como toxinas que também oferecem uma vantagem seletiva em um dado estado ambiental. Plasmídeos também podem fornecer bactérias com a capacidade de fixar nitrogênio elementar ou de degradar compostos orgânicos recalcitrantes que fornecem uma vantagem em condições de privação de nutrientes (Lipps G., 2008).

Para a seleção usando genes de resistência a antibióticos, plasmídeos são preparados em que um gene é inserido que gera uma proteína que torna as células resistentes a um antibiótico em particular. Em seguida, os plasmídeos são inseridos em bactérias por um processo chamado de transformação. Então, as bactérias são expostas aos antibióticos particulares. Apenas bactérias que absorvem cópias do plasmídeo sobrevivem ao antibiótico, uma vez que o plasmídeo as torna resistentes.

Genes de interesse podem ser administrados usando um plasmídeo contendo um marcador de resistência a antibióticos. Tal gene é tipicamente inserido em um sítio de clonagem múltiplo (MCS, ou poliligante). Os genes resistentes a antibióticos são expressos e as proteínas expressas quebram os antibióticos. Desta forma, os antibióticos atuam como um filtro para selecionar apenas as bactérias modificadas. Agora estas bactérias podem ser cultivadas em grandes quantidades, coletadas e lisadas (muitas vezes/usando o método de lise alcalina) para isolar o plasmídeo de interesse. 0 grande êxito de antibióticos na medicina tornou-se agora um problema. Muitas bactérias, incluindo patógenos de doenças infecciosas, já estão resistentes e não podem mais ser controlados com o antibiótico particular. Antibióticos têm sido usados com muita frequência na medicina humana e animal. Além disso, de significado ainda muito maior é o fato de que durante muito tempo eles foram adicionados à ração animal como um melhorador de performance. Esta prática é atualmente em grande parte ilegal, mas os antibióticos pervasivos deram uma vantagem de sobrevivência para aquelas bactérias que têm um gene de resistência correspondente. Além disso, genes de resistência em bactérias são muitas vezes localizados em unidades de DNA móveis, que podem ser trocadas entre espécies diferentes.

Contra este contexto existe a preocupação de que as bactérias poderíam absorver genes marcadores, eventualmente resultando em patógenos, em que os antibióticos atualmente prescritos seriam ineficazes. Pode haver uma transferência de genes para microrganismos ambientais, por exemplo, patógenos (Murphy, D.B., Epstein, S.L., Guidance for Industry: Guidance for human somatic cell therapy and gene therapy, Food and Drug Administration, Rockville 1998).

Outra preocupação da segurança é a possível integração do gene de resistência a antibióticos no cromossomo humano (Smíth, H.A., Klinman, D.M., Curr. Opin. Biotechnol. 12, 299-203, 2001).

Além disso, tais genes podem ter um impacto considerável sobre o processo de produção de plasmídeos, uma vez que a expressão constitutiva desses genes impõe uma carga metabólica desnecessária sobre a célula hospedeira bacteriana (Cranenburgh, R. M., e cols., Nucleic Acids Res. 2001, 29, e26; Rozkov, A., e cols., Enzyme Microb. Technol. 2006, 39, 47-50) . A redução do tamanho dos plasmídeos através da eliminação desses genes poder levar a uma estabilidade e rendimento melhorado do pDNA obtido pelo processo de fermentação (Smith, M.A., e cols., Can. J.

Microbiol. 1998, 44, 351-355).

Portanto, há uma necessidade absoluta na técnica de evitar o uso de genes de resistência a antibióticos no produto final (comercial) (vacina de DNA desprotegido), uma vez que há um risco potencial de aceitação pelo público/consumidores que seguem as recomendações atuais das autoridades reguladoras. A Food and Drug Administration (FDA) e a Organização Mundial da Saúde (OMS) regulamentam o uso de marcadores de resistência a antibióticos para garantir a qualidade de vacinas de DNA e para prevenir doenças infecciosas. Da mesma forma, a EU Deliberate Release Directive (Diretiva de Liberação Deliberada da EU), que está em vigor desde 2002, exige "a eliminação gradual do uso de marcadores de resistência a antibióticos nos organismos geneticamente modificados que podem ter um impacto nocivo sobre a saúde humana ou o ambiente".

As desvantagens dos marcadores tradicionais estão se tornando evidentes mesmo em pesquisa prática. Por exemplo, há uma necessidade de ter um sistema de administração sem antibióticos para as aplicações comerciais da tecnologia de bacteriofecção. A tecnologia de bacteriofecção é a distribuição de DNA de plasmideo em células eucarióticas utilizando bactérias invasivas. Além disso, existe uma necessidade técnica para reduzir ônus metabólicos desnecessários durante o processo de fermentação, o que irá alcançar ODs mais elevadas e maiores rendimentos no plasmídeo de DNA.

Estratégias de seleção alternativas foram projetadas para endereçar as preocupações relativas à disseminação de genes de resistência a antibióticos para uma bactéria entérica do paciente, incluindo a complementação auxotrófica, titulação repressora, esquemas de seleção de antídoto/veneno baseados em proteína e uso de marcadores selecionáveis à base de RNA (ver Williams J.A. e cols., Plasmid DNA vaccine vector design: Impact on efficacy, safety and upstream production, Biotechnol Adv (2009), doi:10.1016/j.biotechadv.1009.02.003).

Cranenburgh, R.M. e cols. relataram a construção de duas novas cepas de Escherichia coli (HAllacdapD e DH1lacP2dapD} que facilitam a seleção isenta de antibióticos e manutenção estável de plasmídeos recombinantes em meios complexos. Eles contêm o gene cromossômico essencial, dapD, sob o controle do operador/promotor lac (Cranenburgh, R.M., e cols., 2001). A não ser que seja suplementado com IPTG (que induz a expressão de dapD) ou DAP, estas células lisam, no entanto, quando as cepas são transformadas com um plasmídeo multicópia contendo o operador lac, o operador competitivamente titula o repressor LacI e permite a expressão de dapD do promotor lac . Deste modo, transformantes podem ser isolados e propagados simplesmente por suas capacidades de crescer em qualquer meio por seleção de titulação do repressor. Nenhum gene de resistência a antibióticos ou outras sequências expressando proteínas são necessários no plasmídeo, e os antibióticos não são necessários para a seleção do plasmídeo.

Mairhofer e cols. recentemente investigaram a manipulação de cepas hospedeiras bacterianas que servem para selecionar e manter plasmídeos sem o uso de qualquer marcador de seleção ou outra sequência adicional no plasmídeo. Várias cepas bacterianas foram modificadas, de modo que o inibidor de replicação de plasmídeo RNA I poderia suprimir a tradução de um gene essencial do crescimento por reação antisense de RNA-RNA (Mairhofer, J. e cols., Biotechnol. J., 3, 83-89, 2008). Um gene essencial {murA} foi modificado de tal forma que uma proteína repressora (tetR) poderia prejudicar a sua expressão (Mairhofer, J. e cols., 2008). Somente na presença de plasmídeo e, portanto, RNA I, o tetR foi desligado e murA foi expresso. Os autores relataram que diferentes plasmídeos comercíalmente disponíveis poderíam ser selecionados por várias cepas de Escherichia coli modificadas. Eles ainda manipularam um plasmideo minimalistico sem qualquer marcador de seleção.

Citação ou a identificação de qualquer documento neste pedido não é uma aceitação de que tal documento é disponível como técnica anterior à presente invenção.

RESUMO DA INVENÇÃO

Plasmídeos isentos de antibiótico, bem como bactérias gram-negativas que compreendem os plasmídeos isentos de antibióticos são fornecidos. Composições compreendendo os plasmídeos isentos de antibiótico que compreendem um gene heterólogo codificando um imunógeno ou uma proteína e composições compreendendo o imunógeno ou a proteína expressa usando os plasmídeos isentos de antibióticos também são fornecidos. As bactérias gram-negativas são manipuladas para conter um ou mais polinucleotídeos heterólogos na região não essencial do cromossomo bacteriano. Os plasmídeos isentos de antibiótico compreendem um polinucleotídeo que codifica um repressor que regula a expressão do polinucleotídeo heterólogo no cromossomo bacteriano. Os plasmídeos isentos de antibióticos podem ainda compreender um ou mais polinucleotídeos codificando um imunógeno ou uma proteína. Métodos da invenção incluem métodos de produção de plasmídeos sem antibióticos e métodos para transferência de genes estrangeiros em células de mamíferos utilizando plasmídeos isentos de antibiótico.

Estas e outras modalidades são divulgadas ou são óbvias e englobadas pela Descrição Detalhada a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A descrição detalhada a seguir, dada a título de exemplo, e que não se destina a limitar a invenção às modalidades específicas descritas, pode ser entendida em conjunto com as figuras associadas, aqui incorporadas por referência, em que: A figura 1 descreve o primeiro componente do conceito sem fármaco que é a clonagem do gene sacB que codifica a levansacarose em bactérias gram-negativas, que leva à morte rápida da bactéria transformada quando semeada em meio contendo sacarose. A figura 2 descreve o segundo e terceiro componentes do conceito sem fármaco ou sem antibiótico que é a região de imunidade do fago λ, em que cl codifica o repressor cl; cro codifica a proteína Cro; N codifica a transcrição de antiterminator; cll codifica para o ativador cl; cIII codifica para o inibidor de protease cIII; OL 1, 2 e 3 e OR 1, 2 e 3 são operadores; PL e PR são os promotores para a direita e para a esquerda; PRE é o promotor para o estabelecimento do repressor; PRM é o promotor de manutenção do repressor. A figura 3 descreve a visão geral teórica do conceito "sem fármaco", em que a atividade repressora cl, expressa a partir do plasmídeo pDLl (sigla do inglês DrugLess Plasmid ou plasmídeo sem fármaco), inibe a transcrição do produto gênico tóxico sacB colocado sob o promotor λ Pr localizado no cromossomo da célula hospedeira e em que a viabilidade das células de E. coli do hospedeiro na presença de sacarose é assegurada por um nível de expressão suficiente da proteína repressora λ cl do plasmídeo. A figura 4 descreve a "sensibilidade à sacarose" do sistema inativado, em que uma mudança para 42 °C na temperatura inibe a atividade de ligação do repressor cl ao promotor λ Pr e torna as células hospedeiras sensíveis à sacarose. A figura 5 ilustra a combinação da cepa hospedeira com o plasmídeo pDLl sem antibiótico, resultado da transformação com pDLl, e o crescimento em meio contendo sacarose levando ao rendimento do plasmídeo sem fármaco.

As figuras 6A a 6C ilustram o plano experimental. A figura 6A fornece uma visão geral; A figura 6B ilustra que a cepa de origem ApurN (ou AedA) é resistente à canamicina e expressa constitutivamente SacB*, conferindo a sua sensibilidade à sacarose quando as células são incubadas de 30° C a 37 °C. Quando as cepas de origem ApurN (ou AedA) são transformadas com os plasmídeo pPB829 ou pPB838, essas células ganham a habilidade de sobreviver e crescer na presença de sacarose, quando incubadas de 30 a 37 °C; a figura 6C ilustra que a cepa de origem ApurN (ou AedÂ) transformada com os plasmídeos pPB829 ou pPB838 (plasmídeos cl)) é capaz de crescer em meio LB contendo canamicina, sacarose ou cloranfenicol da mesma forma. A mudança de temperatura de 30 a 37 °C para 42 °C a leva à morte celular quando plaqueadas na presença de sacarose. A figura 7 descreve ambos os plasmídeos (pPB829 e pPB838) marcados com os genes que codificam a cloranfenicol acetil transferase (CatR) e que contêm o gene λ cl. pB838 é um derivado de pMCS5 em que o gene da cloranfenicol acetil transferase (cat) substitui o gene de resistência à ampicilina. Este plasmídeo contém o gene cl colocado sob o controle do promotor fraco do gene da canamicina (Pl) . pPB829 é um plasmídeo derivado de pVRlO12 contendo o gene cat. Os plasmídeos contêm o gene cl que é colocado sob o controle do promotor fraco (Pl). Quando introduzido na cepa de E. coli de origem ÁpurN (ou ÁedA) , estes plasmídeos permitirão que as células cresçam na presença de sacarose.

Cloranfenicol permite a demonstração da prova de conceito.

As figuras 8A a E ilustram a manipulação da cepa hospedeira. As figuras 8A e 8B ilustram a geração do cassete ÀPr:: sacB Qkan a ser inserida por substituição alélica do gene edA ou purN, respectivamente, no cromossomo de E. coli. A figura 8C ilustra a manipulação do cassete sacB total (ApurNfi kPr::sac B cat) por PCR e a união por PCR usada para a substituição alélica do gene edA na cepa hospedeira de E. coli ApurNíl ÁPr::sac B Km para a geração da cepa de E. coli de cassete scB duplo.

As figuras 9A, 9B e 9C ilustram o uso de PCR para demonstrar a manipulação da cepa hospedeira, a saber, a eliminação de edA e purN em E. coli. A figura 9A ilustra, em parte, os dois produtos de PCR (respectivamente 151 e 729 pb) , que foram purificados e usados como molde em uma segunda etapa de PCR com os iniciadores PB1186 e PB1189 e a DNA polimerase Phusion. A figura 9B ilustra a verificação de PCR mostrando que o cassete /LPr: : sacB+QKan é introduzido no cromossomo de E. coli. A figura 9C ilustra que o cassete ÁPr::scB+&Kan é corretamente inserido no lócus por substituição alélica do(s) gene(s) edA e/ou purN. A figura 9D ilustra o uso de PCR para demonstrar a manipulação do cassete sacB duplo da cepa do hospedeiro, a saber, as eliminações de edA e de purN eia E. coli por substituição alélica. A verificação de PCR mostra os dois cassetes ÂPr::sacBÍQKan e ÂPr::sacB+&Cat foram corretamente introduzidos nos locais específicos dentro do cromossomo de E. coli, como confirmado por sequenciamento. Conforme mostrado na figura 9D: faixa 1: BJ5183 wt; 2: BJ5138 ÁpurW; 3: BJ5138 AedA; 4: BJ5183 ApurN AedA não diluído 1 pL; 5: BJ5183 ApurN AedA diluído 1/10; 6: Água, 0 pb (controle); A: BJ5183 wt; B: BJ5138 ApurN; C: BJ5138 AedA; D: BJ5183 ApurN AedA não diluído 3 pL; E: BJ5183 ApurN AedA não diluído 1 μΐ; F: BJ5183 ApurN AedA diluído 1/10; G: BJ5183 ApurN AedA diluído 1/50; H: Água, 0 pb (controle) .

A figura 10A demonstra que a cepa hospedeira (ApurN ÂPr::saclfâkan) é altamente sensível (sem crescimento) à sacarose, que as células transformadas com plasmídeo pPB829 ou pPB838 cresceram bem na presença de sacarose a 30 °C, que a expressão do gene sacB era perfeitamente reprimida pelo produto do gene cl sintetizado a partir de cada plasmídeo cl e que a manutenção do plasmídeo foi 100% eficiente como claramente demonstrado pelo experimento controle realizado em paralelo com células similares crescendo na presença de cloranfenicol. A elevação da temperatura até 42 °C causou a inativação do produto do gene cl e a morte das células plaqueadas em LB ágar contendo sacarose ou cloranfenicol. A robustez destes experimentos de manutenção de plasmídeo foi realizada após duas passagens sucessivas de células crescendo na presença de sacarose ou cloranfenicol. As figuras 10B e C demonstram que a cepa de E. coli de cassetes sacB duplos (ApurN ÀPr::sacB+ £2kan AedA ÀPr::sacB+ HCat) é altamente sensível (sem crescimento) na presença de sacarose, quando incubada a 30 °C e 42 °C, enquanto alguns mutantes espontâneos aparecem com a cepa de E. coli de cassete sacB plaqueada em sacarose. A figura 10C também demonstra a menor concentração de sacarose necessária para que a cepa de E. coli com cassetes sacB duplo em comparação com a cepa de E. coli com um cassete sacB (de 10% até 2% final). A figura 11 ilustra a estabilidade dos plasmídeos pPB829 e pPB838 nas células em crescimento. A figura 12A mostra uma falta de mutação espontânea no cassete com um sacB ÁPr::sacB a 30 °C. As figuras 12B e C demonstram que a presença de cassetes com dois sacB (ao invés de um) confere uma maior robustez à sensibilidade à sacarose (ainda ótima em 2% de sacarose) em temperaturas variando de 30 °C a 37 °C. A presença de um cassete sacB no cromossomo de E. coli foi menos robusta na concentração de sacarose variando de 2% a 4% em temperaturas semelhantes.

Conforme confirmado neste ensaio de plaqueamento, a taxa de mutação para sacarose com a cepa de E. coli de cassetes com dois sacB não foi detectada na concentração mais baixa de sacarose (2%) quando incubada a 37 °C, enquanto a taxa de mutação com a cepa de E. coli com um cassete sacB variou de 3,8 x 10~6 até 5 x 10~5. Um conjunto independente de experimentos mostrou que a taxa de mutação na cepa de E. coli de cassetes com dois sacB foi de quase 5 x IO-10 quando incubada a 37 °C na presença de 2% de sacarose.

As figuras 13A a B mostram os procedimentos experimentais para permitir a varredura das células transformadas pelos plasmídeos cl marcados com cloranfenicol (Cat) sem o uso de antibiótico como pressão de seleção em placas de ágar.

As figuras 14A a C ilustram a eficácia do procedimento experimental para selecionar células transformadas apenas com o plasmideo cl (pPB829 e pPB838) sem o uso de antibiótico como pressão de seleção. AS figuras 15A a B ilustram a estabilidade e o rendimento dos plasmídeos pPB829 e pPB838 nas células de E. coli em crescimento, que contêm uma cópia do cassete sacB.

As figuras 15C a E ilustram a estabilidade e o rendimento de plasmídeo pPB885 sem cat na cepa de E. coli com um e dois cassetes sacB (ApurN ÁPr::sacB+f3kan e ApurN

ÂPr::sacB+&kan AedA kPr::sacB+&cat, respectivamente). A figura 15F ilustra a eficácia de transfecção do plasmídeo (expressão de GFP) em células CHO do plasmídeo sem antibiótico (pPB896/sacarose como pressão de seleção) e plasmídeo antibiótico (pCG105/Cat como pressão de seleção).

Nenhuma diferença óbvia é observada em termos de proteína GFP expressa entre estas duas pressões de seleção (sacarose versus Cat como antibiótico). A figura 16 mostra o mapa de plasmídeo pCRblunt + PB1184-1185. A figura 17 mostra o mapa de restrição e as características do pPB828. A figura 18 mostra o mapa de restrição e as características do pPB829. A figura 19 mostra o mapa de plasmídeo e as características de pPB838. A figura 20 mostra o mapa de plasmídeo e as características de pPB844. A figura 21 mostra o mapa de plasmídeo e as características de pPB845. A figura 22 mostra o mapa de plasmídeo e as características de pPB846. A figura 23 mostra o mapa de plasmídeo e as características de pPB847. A figura 24 mostra o mapa de plasmídeo de pPB885. 0 mapa da característica pPB885 mostra: dois CDS: repressor cl: 324-1037; AP(R): 2321-2990 (complementar), localização original (complemento 1626..2483); duas origens de replicação: origem pUC: 1500-2173 (complementar), localização original (complemento 805..1478) ; origem f 1: 2991-3301 (localização original 2615-3053).

A figura 25 mostra o mapa de plasmídeo de pPB896. O mapa da característica pPB896 mostra: três CDS: GFP: 1675-2397 (localização original 1676...2398); repressor cl: 4089-4802; Cm(R): 4828-5484 (complementar), complemento (950-1606) ; um íntron: íntron A: 805-1625 (localização original 805-1625); um promotor eucariótico: promotor CMV: 1-683. uma origem de replicação: 3133-3640 (localização original 2425..2932),- um termínador: terminador transcricional BGH/Poli A: 2405-2951 (localização original 1697..2243); uma UTR 5': UTR 5' CMV IE : 684-804 (localização original 684..804). A figura 26 mostra o alinhamento de sequência das proteínas do repressor cl e a porcentagem de identidade de sequência . A figura 27 mostra o alinhamentode sequência das proteínas sacB e a porcentagem de identidade de sequência.

A figura 28 é uma tabela mostrando a SEQ ID NO atribuída ao polinucleotídeo e proteína. A figura 29 mostra o alinhamento de sequência dos polinucleotídeos que codificam as proteínas do repressor cl e a porcentagem de identidade de sequência ao nível do nucleotídeo. A figura 30 mostra o alinhamento de sequência dos polinucleotídeos que codificam as proteínas sacB e a porcentagem de identidade de sequência ao nível de nucleotídeo. A figura 31 mostra as sequências do promotor Pl, promotor nativo cl, promotor kPr, promotor kPr + 5' UTR + gene sacB, promotor Pl + gene cl e promotor nativo cl + gene cl.

DESCRIÇÃO DETALHADA É observado que nesta divulgação e particularmente nas reivindicações, termos como "compreende", "compreendido", "compreendendo" e similares têm o significado atribuído a eles na lei de patentes americana; por exemplo, eles podem significar "inclui", "incluído", "incluindo" e similares; e que termos, tais como "consistindo essencialmente de" e "consiste essencialmente de" têm o significado que lhes é atribuído na lei de patentes americana, por exemplo,eles permitem elementos não explicitamente citados, mas excluem elementos que são encontrados na técnica anterior ou que afetam uma característica básica ou nova da invenção.

Salvo disposição em contrário explicada, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que os que são comumente entendidos por uma pessoa normalmente versada na técnica, a que pertence esta divulgação. Os termos singulares "um", "uma" e "o" incluem referências no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra "ou" é tencionada a incluir "e", a menos que o contexto indique claramente o contrário.

Por "animal" se entende mamíferos, aves e similares.

Animal ou hospedeiro inclui mamíferos e seres humanos. O animal pode ser selecionado do grupo consistindo de equinos (por exemplo, cavalo), caninos (por exemplo, cães, lobos, raposas, coiotes, chacais) , felinos (por exemplo, leões, tigres, gatos domésticos, gatos selvagens, outros grandes felinos e outros felinos, incluindo chitas e linces), ovinos (por exemplo, ovelhas), bovinos (por exemplo, gado), suínos (por exemplo, porco), aves (por exemplo, frango, pato, ganso, peru, codorna, faisão, papagaio, tentilhão, falcão, corvo, avestruz, ema e casuar), primatas (por exemplo, prossímios, társios, macacos, gibões, bugio) e peixes. 0 termo "animal" também inclui um animal individual em todos os estágios de desenvolvimento, incluindo os estágios embrionário e fetal.

Os termos "proteína", "peptídeo", "polipeptídeo" e "fragmento de polipeptídeo" são utilizados alternadamente aqui para se referir aos polímeros de resíduos de aminoácidos de qualquer comprimento. 0 polímero pode ser linear ou ramificado, ele pode compreender aminoácidos modificados ou análogos de aminoácidos, e pode ser interrompido por porções químicas diferentes de aminoácidos. Os termos também englobam um polímero de aminoácidos que tenha sido modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligações dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente marcador ou bioativo. 0 termo "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" é usado intercambiavelmente e se refere ao RNA ou DNA que é linear ou ramificado, de fita simples ou dupla, ou um híbrido do mesmo. 0 termo também abrange híbridos de RNA/DNA. Os seguintes são exemplos não limitativos de polinucleotídeos: um gene ou fragmento de gene, éxons, íntrons, RNAm, RNAt, RNAr, ribozimas, DNAc, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificado, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácidos nucleicos e iniciadores (primers). Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos, uracila, outros açúcares e grupos de ligação como fluorribose e tiolato, e ramificações de nucleotídeos. A sequência de nucleotídeos pode ser ainda modificada após a polimerização, como por conjugação, com um componente de marcação. Outros tipos de modificações incluídas nesta definição são caps, a substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente com um análogo e a introdução de meios para a fixação do polinucleotídeo às proteínas, íons metálicos, componentes de marcação, outros polinucleotídeos ou suporte sólido. Os polinucleotídeos podem ser obtidos por síntese química ou derivados de um microrganismo. 0 termo "plasmídeo sem fármaco" ou "plasmídeo sem antibiótico" é usado intercambiavelmente e se refere a um plasmídeo de DNA que não contém um gene de seleção de antibióticos. 0 termo "gene" é utilizado amplamente para se referir a qualquer segmento de polinucleotídeo associado a uma função biológica. Assim, os genes incluem íntrons e éxons como na sequência genômica, ouapenasas sequências codificantes como nos DNAcs e/ou sequências regulatórias necessárias para as suas expressões. Por exemplo, gene também se refere a um fragmento de ácido nucleico que expressa o RNAm ou RNA funcional, ou que codifica uma proteína específica, e que inclui sequências regulatórias. 0 assunto aqui divulgado refere-se a uma nova abordagem para a geração de vetores de DNA de plasmídeo bacteriano evitando o uso de genes de resistência a antibióticos para produzir vacinas e composições imunogênicas mais seguras. 0 assunto aqui divulgado demonstra um novo conceito para manter um elevado número de cópias de plasmídeo dentro de uma célula hospedeira de bactéria gram-negativa que é baseado em três componentes. 0 primeiro componente é um hospedeiro de bactéria gram negativa que expressa um produto tóxico para a bactéria sob condições de cultivo definidas em que o gene tóxico é inserido em uma região não essencial do cromossomo bacteriano. 0 segundo componente é a presença de um gene no cromossomo da bactéria gram negativa em que o gene codifica um produto tóxico sob o controle de um promotor constitutivo que pode ser fortemente regulado. 0 terceiro componente é a expressão de um repressor específico de um plasmideo que regula o promotor operativamente ligado ao gene tóxico no cromossomo hospedeiro.

As bactérias gram negativas contempladas na presente invenção incluem, mas não estão limitadas, a Avibacterium, Brucella, Escherichia coli, Haemophilus (por exemplo, Haemophilus suis), Salmonella (por exemplo, Salmonella enteridis, Salmonella typhimurium, Salmonella infantis), Shigella, Pasteurella e Rimeirella.

Em uma modalidade, o gene tóxico é um gene scB estrutural que codifica a levansacarose. Em outra modalidade, o gene tóxico é um gene sacB estrutural de Bacillus subtilis que codifica a levansacarose de Bacillus subtilis. A expressão de sacB em seu ambiente natural é inofensiva para bactérias gram positivas, mas quando expresso em bactérias gram negativas, ela leva à morte rápida da bactéria transformada quando elas são plaqueadas em meio contendo sacarose.

Em um aspecto, a presente invenção fornece uma proteína sacB (levansacarose). Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína sacB que tem uma sequência conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 ou 74, e variante ou fragmento da mesma. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína sacB que tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polipeptídeo tendo uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NOs: 4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 ou 74. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece fragmentos e variantes da proteína sacB acima identificada (SEQ ID NOs: 4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 ou 74) que pode ser prontamente preparada por uma pessoa versada na técnica utilizando técnicas de biologia molecular bem conhecidas.

Variantes são peptideos homólogos tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os polipeptídeos da invenção, particularmente com a sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 ou 74.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo, como um gene sacB, que codifica uma proteína sacB (levansacarose), por exemplo, um polinucleotídeo que codifica uma proteína sacB tendo uma sequência conforme estabelecida na SEQ ID NO: 4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 ou 74. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo que codifica uma proteína sacB tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% deidentidade dê sequência com um polipeptídeo tendo uma sequência conforme estabelecida na SEQ ID NO: 4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 ou 74, ou uma variante conservativa, uma variante alélica, um homólogo ou um fragmento que compreende pelo menos oito ou pelo menos dez aminoácidos consecutivos de um destes polipeptídeos, ou uma combinação destes polipeptídeos. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 3, 61, 63, 65, 67, 69, 71 ou 73, ou uma variante da mesma. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo que tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um de um polinucleotídeo tendo uma sequência conforme estabelecida na SEQ ID NO: 3, 61, 63, 65, 67, 69, 71 ou 73, ou uma variante da mesma.

Outros genes tóxicos que podem ser utilizados na presente invenção incluem, mas não estão limitados, aos genes Listeria ou Staphylococcus. Um gene tóxico pode ser um DNA que é expresso como um produto de gene tóxico (uma proteína ou RNA tóxico), ou pode ser tóxico em e de si mesmo. Exemplos de tais produtos de genes tóxicos são bem conhecidos na técnica, e incluem, mas não estão limitados, às endonucleases de restrição (por exemplo, Dpnl), CcdA/CcdB (Maki S. e cols. J. Mol. Biol. 256: 473-482, 1996) e genes que matam hospedeiros na ausência de uma função supressora, por exemplo, kicB. Um gene tóxico pode ser alternativamente selecionável in vitro, por exemplo, um sítio de restrição.

Como usado aqui, o termo "homólogos" inclui ortólogos, análogos e parálogos. Análogos, ortólogos e parálogos de um polipeptídeo tipo selvagem podem diferir do polipeptídeo tipo selvagem por modificações pós-traducionais, por diferenças na sequência de aminoácidos ou por ambos. Em particular, homólogos da invenção geralmente irão exibir pelo menos 80-85%, 85-90%, 90-95% ou 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência com toda ou parte das sequências de polipeptídeo ou polinucleotídeo tipo selvagem, e irão exibir uma função similar. "Variantes" é tencionado a significar sequências substancialmente similares. Para polinucleotídeos, uma variante compreende uma eliminação e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios dentro do polinucleotídeo nativo e/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios no polinucleotídeo nativo. Como usado aqui, um polinucleotídeo ou polipeptídeo "natural" ou "nativo" compreende uma sequência de nucleotídeo ou sequência de aminoácidoqueocorre naturalmente, respectivamente. Variantes de um polinucleotídeo particular da invenção (isto é, o polinucleotídeo de referência) também podem ser avaliadas através da comparação da identidade de sequência porcentual entre o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo variante e o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência. Proteína "variante" destina-se a significar uma proteína derivada da proteína natural por eliminação ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na proteína natural e/ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na proteína natural.

Proteínas variantes englobadas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, elas têm a capacidade de induzir uma resposta imune.

Variantes incluem variantes alélicas. 0 termo "variante alélica" refere-se a um polinucleotídeo ou um polipeptídeo contendo polimorfismos que levam a mudanças nas sequências de aminoácidos de uma proteína e que existem dentro de uma população natural (por exemplo, uma espécie ou variedade de vírus). Tais variações alélicas naturais geralmente podem resultar em 1 a 5% de variação em um polinucleotídeo ou um polipeptídeo. Variantes alélicas podem ser identificadas por sequenciamento da sequência de ácido nucleico de interesse em uma variedade de espécies diferentes, que podem ser prontamente realizadas utilizando sondas de hibridização para identificar o mesmo lócus gênico naquelas espécies. Todas e quaisquer tais variações de ácido nucléico e polimorfismos de aminoácidos resultantes ou variações que são o resultado de variação alélica natural e que não alteram a atividade funcional do gene de interesse destinam-se a estar dentro do escopo da invenção. 0 termo "variação conservadora" ou "variação conservativa" denota a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo biologicamente similar, ou a substituição de um nucleotídeo em uma sequência de ácido nucléico de modo que o resíduo de aminoácido codificado não muda ou é outro resíduo biologicamente similar. Sob este aspecto, substituições particularmente preferidas serão geralmente de natureza conservadora, como descrito acima.

Os polinucleotídeos da divulgação incluem sequências que são degeneradas como resultado do código genético, por exemplo, o uso de códon otimizado para um hospedeiro específico. Como usado aqui, "otimizado" refere-se a um polinucleotídeo que é geneticamente manipulado para aumentar sua expressão em uma dada espécie. Para fornecer polinucleotídeos otimizados que codificam os polipeptídeos da presente invenção, a sequência de DNAdo polipeptídeo pode ser modificada para 1) compreender códons preferidos pelos genes altamente expressos em uma espécie particular; 2) compreender um conteúdo de A + T ou G + C na composição de bases de nucleotídeo com aquela substancialmente encontrada na dita espécie; 3) formar uma sequência de iniciação das ditas espécies; ou 4) eliminar sequências que causam desestabilização, poliadenilação inapropriada, degradação e término do RNA, ou que formam grampos de estrutura secundária ou sítios de união de RNA. A expressão aumentada do polipeptídeo da presente invenção, tal como uma proteína sacB ou uma proteína repressora cl na dita espécie pode ser conseguida utilizando a frequência de distribuição do uso de códon em eucariontes e procariontes, ou em uma espécie particular. 0 termo "frequência de uso de códon preferido" refere-se à preferência exibida por uma célula hospedeira específica no uso dos códons de nucleotídeo para especificar um dado aminoácido. Existem 20 aminoácidos naturais, a maioria dos quais são especificados por mais de um códon. Portanto, todas as sequências de nucleotídeos degeneradas estão incluídas na divulgação, desde que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos seja funcionalmente inalterada. A "identidade" em relação às sequências pode se referir ao número de posições com nucleotídeos ou aminoácidos idênticos dividido pelo número de nucleotídeos ou aminoácidos na mais curta das duas sequências em que o alinhamento das duas sequências pode ser determinado de acordo com o algoritmo de Wilbur e Lipman (Wilbur e Lipman). Quando sequências de RNA são consideradas como sendo similares, ou tendo um grau de identidade de sequência ou de homologia com sequências de DNA, timidina (T) na sequência de DNA é considerada igual à uracila (U) na sequência de RNA. Assim, sequências de RNA estão dentro do escopo da invenção e podem ser derivadas de sequências de DNA pela timidina (T) na sequência de DNA sendo considerada igual à uracila (U) nas sequências de RNA. A identidade de sequência ou similaridade de sequência de duas sequências de aminoácidos, ou a identidade de sequência entre duas sequências de nucleotídeos pode ser determinada usando o pacote de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).

Em outra modalidade, o promotor que é operativamente ligado ao gene tóxico da presente invenção é um promotor do fago λ. O fago λ é um fago temperado que vive em E. coli. Uma vez que o fago está dentro de seu hospedeiro, ele pode integrar-se no DNA do hospedeiro. Neste estado, λ é chamado de pró-fago e permanece residente dentro do genoma do hospedeiro, sem causar muitos danos ao hospedeiro. Desta forma, o pró-fago se duplica com cada divisão celular do hospedeiro. 0 DNA do pró-fago que se expressa neste estado codifica proteínas que procuram por sinais de estresse na célula hospedeira. 0 estresse pode ser um resultado da fome, venenos (como antibióticos) e outros fatores que podem danificar ou destruir o hospedeiro. Quando a condição de estresse é detectada, o pró-fago torna-se ativo novamente, extirpa-se do DNA da célula hospedeira e entra seu ciclo lítico. 0 fago reativado desmonta o DNA do hospedeiro e reprograma sua fábrica de proteína para produzir novos fagos em várias cópias. Quando todos os recursos do hospedeiro estão esgotados da construção de novos fagos, a célula é lisada (a membrana celular é quebrada), e os novos fagos são liberados. 0 sistema de gene repressor lambda consiste do (da esquerda para a direita no cromossomo) : gene cl, 0R3, 0R2, 0R1, gene cro. 0 gene cl codifica o repressor λ ("a proteína repressora cl"). A região do genoma que codifica a proteína repressora cl é conhecida como a região de imunidade. A proteína repressora cl é uma reguladora tanto positiva quanto negativa da transcrição de genes. Ela permite que o fago λ fique "latente" no cromossomo de sua bactéria hospedeira. 0 estado lisogênico do bacteriófago λ é mantido pela ligação da proteína reguladora cl aos operadores OR (operador da direita) e OL (operador da esquerda) dos promotores λ PI e λ Pr, respectivamente, evitando a transcrição das proteínas necessárias para o estágio lítico. Células bacterianas abrigando um fago λ lisogênico são imunes a infecções adicionais pelo fago λ. A proteína repressora cl inibe o desenvolvimento lítico de quaisquer partículas de fago infectantes adicionais.

Em um aspecto da modalidade, o promotor compreende um polinucleotídeo tendo uma sequência conforme estabelecida na SEQ ID NO: 5. Em outro aspecto, o promotor compreende um polinucleotídeo tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polinucleotídeo tendo uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 5.

Em uma modalidade, a proteína repressora da presente invenção é uma proteína repressora cl, como o repressor cI857 que é sensível à temperatura. Um fago λ que carrega cI857 como lisógeno vai crescer em temperaturas abaixo de 39 °C, mas ele irá, em seguida, induzir o crescimento lítico por um aumento na temperatura. A’30 °C, a proteína repressora cl está ativa e se liga aos operadores da direita e esquerda do fago infectante. Isso evita a transcrição de quaisquer proteínas do fago e, deste modo, previne a lise. No entanto, a 42 °C, o repressor cl é inativado e não pode se ligar aos operadores do promotor.

Em um aspecto, a presente invenção fornece uma proteína repressora cl. Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína repressora cl tendo uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 ou 58, e uma variante ou fragmento da mesma. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteína repressora cl tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo que tem uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 ou 58. Em outro aspecto, a presente invenção fornece fragmentos e variantes da proteína repressora cl acima identificada (SEQ ID NO: 2, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 ou 58) que pode ser prontamente preparada por uma pessoa versada na técnica utilizando técnicas bem conhecidas de biologia molecular. Variantes são polipeptídeos homólogos tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os polipeptídeos da invenção, particularmente com a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 ou 58.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo, como um gene cl, que codifica uma proteína repressora cl, como um polinucleotídeo que codifica uma proteína repressora cl tendo uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 ou 58.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo codificando uma proteína repressora cl tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polipeptídeo tendo uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 ou 58, ou uma variante conservativa, um variante alélica, um homólogo ou um fragmento que compreende pelo menos oito ou pelo menos dez aminoácidos consecutivos de um destes polipeptídeos, ou uma combinação destes polipeptídeos. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo que tem uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 ou 59, ou uma variante da mesma. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo que tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polinucleotídeo que tem uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 ou 59, ou uma variante da mesma.

Em uma modalidade, o promotor que direciona o gene cl é o promotor do gene cl nativo. Em outra modalidade, o promotor que direciona o gene cl é o promotor fraco do gene da canamicina (Pl) . Em outra modalidade, o promotor compreende um polinucleotídeo que tem uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 29, 83 ou 30. Em ainda outra modalidade, o promotor compreende um polinucleotídeo que tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polinucleotídeo que tem uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 29, 83 ou 30.

Outros pares promotor/repressor que podem ser utilizados nos métodos da presente invenção incluem, mas não estão limitados, a um promotor carB controlado pelo par repressor-antirrepressor CarA-CarS, promotores do gene do hormônio do crescimento e repressores e repressor Lac (laci) e o promotor Ptrc-2. 0 par promotor/repressor mutante para servir como substrato para a mutagênese pode ser selecionado dentre os tais mutantes presentemente disponíveis e descritos na técnica. Estudos sobre a ligação dos repressores mutantes aos seus operadores [Ver, por exemplo, Nelson e Sauer, Cell, 42: 549 (1985); Nelson e Sauer, J. Mol. Biol. 192:27 (1986); e Gussin, e cols, Lambda LI, (Hendrix, Roberts, Stahl e Weisberg, eds) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., p. 93-123 (1983)] permitem a seleção de sequências repressoras do promotor mutante e/ou repressor mutante conhecidas que podem proporcionar taxas de transcrição reduzidas, porém não abolidas. Esta região promotora selecionada é incorporada em um plasmideo de expressão heterólogo e, a seguir, é alterada técnicas convencionais de mutagênese direcionada ao sítio (ver, por exemplo, Morinaga, e cols., Bíotechnology, 2: 636, 1984).

Alternativamente, a sequência que codifica o repressor é alterada de forma análoga. 0 par repressor/promotor mutante resultante é analisado por sua capacidade de promover a secreção da proteína heteróloga por comparação da expressão com o plasmideo tipo selvagem que não foi submetido à mutagênese direcionada ao sítio. 0 assunto aqui divulgado fornece um conceito sem fármaco ou sem antibiótico em que a atividade do repressor (como o repressor cl) , expressa a partir do plasmídeo, inibe a transcrição de um produto de gene tóxico (como o produto do gene sacB) colocado sob um promotor de fago λ localizado no cromossomo da célula hospedeira e em que a viabilidade das células hospedeiras na presença de um substrato, como a sacarose, é assegurada por um nível de expressão suficiente do plasmídeo de uma proteína repressora do plasmídeo (como a proteína repressora λ cl. O crescimento da cepa hospedeira contendo o plasmídeo sem antibiótico na presença de sacarose garante um sistema eficiente para manter e produzir plasmídeos de DNA. 0 termo plasmídeo abrange qualquer unidade de transcrição de DNA compreendendo um polinucleotídeo de acordo com a invenção e os elementos necessários para a sua expressão in vivo em uma célula ou células do hospedeiro ou alvo desejado; e, sob este respeito, verifica-se que um plasmídeo circular superenovelado ou não superenovelado, bem como uma forma linear, é tencionado a estar dentro do escopo da invenção.

Uma modalidade da presente invenção se refere a um plasmídeo sem fármaco compreendendo um ou mais genes repressores operativamente ligados a um ou mais promotores.

Em um aspecto, o plasmídeo semfármaco compreende um - polinucleotídeo que codifica uma proteína repressora cl. Em outro aspecto, o plasmídeo sem fármaco compreende um promotor operativamente ligado ao polinucleotídeo que codifica a proteína repressora cl. 0 promotor pode ser o promotor do gene cl nativo ou o promotor fraco do gene da canamicina. Em outro aspecto, o plasmídeo sem fármaco compreende ainda um polinucleotídeo heterólogo codificando um imunógeno ou uma proteína. Qualquer promotor adequado conhecido na técnica pode ser utilizado nos plasmídeos sem fármaco de acordo com a presente invenção, incluindo promotores de bactérias, fungos, insetos, mamíferos e plantas. O promotor pode ser, mas não está limitado, ao promotor do citomegalovírus inicial imediato (CMV-IE) de origem humana ou murina, ou opcionalmente tendo outra origem, como rato ou porquinho-da-índia, o promotor Super (Ni, M. e cols., Plant J. 7, 661-676, 1995). 0 promotor CMV-IE pode compreender a parte promotora efetiva, que pode ou não estar associada com a parte intensificadora. Pode ser feita referência ao EP-A-260 148, EP-A-323 597, Patentes Americanas Nos. 5.168.062, 5.385.839 e 4.968.615, bem como ao Pedido PCT No. W087/03905. Outros promotores de bactérias gram-negativas também são adequados, incluindo, mas sem se limitar, aos promotores isolados de Avibãcterium, Brucella, Escherichia coli, Haemophilus (por exemplo, Haemophilus suis), Salmonella (por exemplo, Salmonella enteridis, Salmonella typhimurium, Salmonella infantis), Shigella, Pasteurella e Rimeirella.

Os plasmídeos podem compreender outros elementos de controle de expressão. É particularmente vantajoso incorporar a sequência estabilizadora, por exemplo, a sequência de íntron, por exemplo, o primeiro íntron do hCMV-IE (Pedido PCT No. W01989/01036), o íntron II do gene da β-globina de coelho (van Ooyen e cols., 1979). Em outra modalidade, os plasmídeos podem compreender 3'UTR. 0 3'UTR pode ser, mas não está limitado, à nopalina sintase de Agrobacterium (Nos) 3' UTR.

Quanto ao sinal de poliadenilação (poliA) para os plasmídeos e vetores virais diferentes de poxvírus, uso pode ser feito do sinal poli (A) do gene do hormônio de crescimento bovino (BGH) (ver U.S. 5.122.458), ou o sinal poli(A) do gene da β-globina de coelho ou o sinal poli(A) do vírus SV40.

Uma "célula hospedeira" denota uma célula procariótica ou eucariótica que foi geneticamente alterada, ou que é capaz de ser geneticamente alterada pela administração de um polinucleotídeo exógeno, como um plasmídeo ou vetor recombinante. Ao se referir às células geneticamente alteradas, o termo se refere tanto à célula originalmente — alterada e à progenia da mesma.

Outra modalidade da presente invenção refere-se a uma cepa hospedeira bacteriana gram-negativa que compreende um plasmideo sem fármaco. Um aspecto da modalidade se refere a uma cepa hospedeira bacteriana gram-negativa que compreende o plasmideo sem fármaco e um polinucleotídeo heterólogo inserido em uma ou mais regiões não essenciais do cromossomo hospedeiro, e em que o polinucleotídeo heterólogo é operativamente ligado a um promotor que pode ser estritamente regulado por um repressor. Em outro aspecto da modalidade, o polinucleotídeo heterólogo inserido no cromossomo hospedeiro é um gene sacB. Em outro aspecto da modalidade, o gene sacB é operativamente ligado a um promotor, como o promotor da direita do fago λ. É reconhecido que o gene sacB e o promotor podem ser inseridos em múltiplas cópias, por exemplo, em duas ou três cópias, no cromossomo hospedeiro. A região não essencial da cepa hospedeira pode ser o gene deA ou purN no cromossomo de E. coli. Os genes deA e purN não são essenciais e a eliminação destes genes não afeta a taxa de crescimento das bactérias (Kim, J. e cols., Biochemistry. 46, 44: 12501- 12511) . Em um aspecto, uma cópia do gene sacB e do cassete promotor é inserida nos lócus deA ou purN por substituição alélica. Em outro aspecto, duas cópias do gene sacB e do cassete promotor são inseridas no lócus deA ou no lócus purN. Em ainda outro aspecto, duas cópias do gene sacB e do cassete promotor são inseridas no cromossomo hospedeiro, em que uma cópia do gene sacB e do cassete promotor é inserida no lócus deA e a outra cópia é inserida no lócus purN. 0 gene sacB e o cassete promotor referem-se ao polinucleotídeo compreendendo o gene sacB operativamente ligado a um promotor. Em um aspecto, o gene sacB e o cassete promotor compreendem um gene sacB e o promotor direito do fago λ. Em outro aspecto, o gene sacB e o cassete promotor compreendem um polinucleotídeo tendo a sequência conforme estabelecida na SEQ ID NO: 75. 0 assunto aqui divulgado ainda diz respeito a uma vacina ou composição que compreende os plasmídeos sem fármaco compreendendo um gene heterólogo que codifica um imunógeno ou uma proteína, ou uma vacina ou composição que compreende o imunógeno ou proteína expressa usando os plasmídeos sem fármaco. A vacina ou composição pode ainda compreender um veículo farmaceutícamente aceitável.

Em uma modalidade, o imunógeno é selecionado a partir de um patógeno felino, tal como, mas sem se limitar, ao herpesvírus felino (FHV), calicivírus felino (FCV), vírus da leucemia felina (FeLV), vírus da imunodeficiência felina (FIV), vírus da raiva e similares, esuas combinações.

Em outra modalidade, o imunógeno é selecionado a partir de um patógeno canino incluindo, mas sem se limitar, ao vírus da raiva, herpesvírus canino (CHV), parvovírus canino (CPV) , coronavírus canino, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorragiae, Leptospira grippotyphosa, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica e similares, e suas combinações.

Em ainda outra modalidade, o imunógeno é selecionado a partir de um patógeno equino, tal como herpesvírus equino (tipo 1 ou tipo 4), vírus da influenza equina, tétano, vírus do Nilo Ocidental (west nile virus), Streptococcus equi, Rhodococcus equi e similares ou suas combinações.

Em ainda outra modalidade, o imunógeno é selecionado a partir de um patógeno bovino, tal como o vírus da raiva, rotavírus bovino, vírus parainfluenza bovino tipo 3 (bPIV-3), coronavírus bovino, vírus da diarréia viral bovina (BVDV), vírus da febre aftosa (FMDV), vírus sincicial respiratório bovino (BRSV), vírus da Rinotraqueíte Bovina Infecciosa (IBR), Escherichia coli, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, salmonella, Cryptosporidium e similares, e suas combinações.

Em ainda outra modalidade, o imunógeno é selecionado a partir de um patógeno suínos, tal como, mas sem se limitar, ao vírus da influenza suína (SIV), circovírus suíno tipo 2 (PCV-2), vírus da síndrome respiratória reprodutiva suína (PRRS), vírus da pseudorraiva (PRV), parvovírus suíno (PPV) , FMDV, Mycoplasma hyopneuiaoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli, vírus da febre catarral (Bluetongue vírus), vírus da doença de cavalo africano, febre do vale Rift, vírus Nipah e similares, e suas combinações. 0 termo "antígeno" ou "imunógeno" é usado indistintamente e significa uma substância que induz uma resposta imune específica em um animal hospedeiro. 0 antígeno pode compreender um vetor recombinante contendo uma inserção com propriedades imunogênicas; um pedaço ou fragmento de DNA capaz de induzir uma resposta imune contra a apresentação a um animal hospedeiro; uma proteína, um polipeptídeo, um peptídeo, um epítopo, um hapteno ou qualquer combinação destes. Alternadamente, o imunógeno ou antígeno pode compreender uma toxina ou antitoxina.

Como usado aqui, os termos "carreador farmaceuticamente aceitável" "veículo farmaceuticamente aceitável" são intercambiáveis e referem-se a um veículo fluido contendo antígenos para vacina que podem ser injetados em um hospedeiro sem efeitos adversos. Veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados conhecidos na técnica incluem, mas não estão limitados a água estéril, salina, glicose, dextrose ou soluções tampão. Os veículos podem incluir agentes auxiliares incluindo, mas sem se limitar, aos diluentes, estabilizadores (isto é, açúcares e aminoácidos), conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, agentes de tamponamento de pH, aditivos intensificadores da viscosidade, corantes e similares.

Os lipídeos catiônicos contendo um sal de amônio quaternário que são vantajosamente, mas não exclusivamente adequados para plasmídeos, são vantajosamente aqueles que têm a seguinte fórmula: em que RI é um radical alifático de cadeia simples saturado ou insaturado que tem de 12 a 18 átomos de carbono, R2 é outro radical alifático contendo 2 ou 3 átomos de carbono e X é um grupo amina ou hidroxila, por exemplo, DMRIE. Em outra modalidade, o lipídeo catiônico pode estar associado com um lipídeo neutro, por exemplo, DOPE.

Entre esses lipídios catiônicos, preferência é dada ao DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dímetil-2,3- bis(tetradecilóxi)-1-propanoamônio; WO96/34109), vantajosamente associado com um lipídeo neutro, vantajosamente DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina; Behr, 1994), para formar DMRIE-DOPE.

Vantajosamente, a mistura de plasmídeo com o adjuvante é formada extemporaneamente e vantajosamente contemporaneamente com a administração da preparação ou logo antes da administração da preparação; por exemplo, logo antes ou anteriormente à administração, a mistura plasmídeo-adjuvante é formada, vantajosamente de modo a fornecer tempo suficiente antes da administração para a mistura formar um complexo, por exemplo, entre cerca de 10 e cerca de 60 minutos antes da administração, como aproximadamente 30 minutos antes da administração.

Quando DOPE estiver presente, a razão molar DMRIE:DOPE é vantajosamente de cerca de 95:cerca de 5 até cerca de 5:cerca de 95, mais vantajosamente de cerca de 1:cerca de 1, por exemplo, 1:1. A razão em peso de DMRIE ou adjuvante DMRIE-DOPE : plasmídeo pode ser entre cerca de 50: cerca de 1 e cerca de 1:cerca de 10, como cerca de 10:cerca de 1 e cerca de 1: cerca de 5, e vantajosamente cerca de 1: cerca de 1 e cerca de 1:cerca de 2, por exemplo, 1:1 e 1:2.

Em outra modalidade, carreador, excipiente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser uma emulsão água em óleo. Exemplos de emulsões água em óleo adequadas incluem emulsões de vacina água em óleo de base oleosa que são estáveis e fluidas a 4 °C contendo: de 6 a 50% v/v de uma fase aquosa contendo antígeno, de preferência de 12 a 25% v/v, de 50 a 94% v/v de uma fase oleosa contendo no total ou em parte um óleo não metabolizável (por exemplo, óleo mineral, tal como óleo de parafina) e/ou óleo metabolizável (por exemplo, óleo vegetal, ou ácidos graxos, poliol ou ésteres de álcool), de 0,2 a 20% p/v de tensoativos, preferencialmente de 3 a 8% p/v, o último sendo, no total ou em parte, ou em uma mistura de ésteres de poliglicerol, os ditos ésteres de poliglicerol sendo preferencialmente poliglicerol (poli)ricinoleatos, ou óleos de ricina de polioxietileno ou ainda óleos de ricina de polioxietileno hidrogenados.

Exemplos de tensoativos que podem ser usados em uma emulsão de água em óleo incluem os ésteres de sorbitano etoxilados (por exemplo, monoleato de polioxietileno (20) sorbitano (Tween 80®), disponível junto à AppliChem, Inc., Cheshire, CT) e ésteres de sorbitano (por exemplo, monoleato de sorbitano (Span 80®), disponível junto à Sigma Aldrich, St. Louis, MO) . Além disso, com relação a uma emulsão de água em óleo, ver também a Patente Americana No. 6.919.084, por exemplo, em seu exemplo 8, aqui incorporada por referência.

Em algumas modalidades, a fase aquosa contendo antígeno compreende uma solução salina que compreende um ou mais agentes tamponantes. Um exemplo de uma solução tampão adequada é salina tamponada com fosfato. Em uma modalidade vantajosa, a emulsão água-em-óleo pode ser uma emulsão tripla água/óleo/água (W/O/W) (ver, por exemplo, a Patente Americana No. 6.358.500, aqui incorporada por referência).

Exemplos de outras emulsões adequadas estão descritas na Patente Americana No. 7.371.395, aqui incorporadas por referência. A vacina ou composição pode ser administrada em doses e por técnicas bem conhecidas pelas pessoas versadas nas técnicas médicas ou veterinárias, levando em consideração tais fatores como a idade, sexo, peso, espécie e condição do animal receptor, e a via de administração. A via de administração pode ser percutânea, via administração pela mucosa (por exemplo, oral, nasal, anal, vaginal) ou através de uma via parenteral (via intradérmica, intramuscular, subcutânea, intravenosa ou intraperitoneal). A vacina ou composição pode ser administrada sozinha ou pode ser coadministrada ou sequencialmente administrada com outros tratamentos ou terapias. Formas de administração podem incluir suspensões, xaropes ou elixires, e preparações para administração parenteral, subcutânea, intradérmica, intramuscular ou intravenosa (por exemplo, administração injetável), tais como suspensões ou emulsões estéreis. A vacina ou composição pode ser administrada como um spray ou misturada em alimentos e/ou água ou distribuída misturada com um veículo, diluente ou excipiente adequado, tal como água estéril, salina fisiológica, glicose ou similares. As composições podem conter substâncias adjuvantes, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH, adjuvantes, aditivos intensificadores de gelificação ou viscosidade, conservantes, agentes flavorizantes, corantes e similares, dependendo da via de administração e da preparação desejada. Textos farmacêuticos padrão, tais como "Remington's Pharmaceutical Sciences," 1990, podem ser consultados para preparar as preparações adequadas, sem experimentação demasiada. O assunto aqui divulgado ainda se refere a um método de produção de um plasmídeo sem fármaco compreendendo as etapas de 1) manipular uma cepa hospedeira bacteriana gram negativa compreendendo um polinucleotídeo heterólogo inserido por substituição alélica em uma ou mais regiões não essenciais do cromossomo hospedeiro; 2) construção de um plasmídeo de DNA compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína repressora cl; 3) transformação da cepa hospedeira bacteriana com o plasmideo de DNA que compreende o gene que codifica a proteína repressora cl; 4) crescimento da cepa hospedeira bacteriana transformada na presença de sacarose a uma temperatura que varia de 30 °C a 42 °C; e 5) recuperação do plasmideo de DNA.

Em um aspecto da modalidade, o plasmideo de DNA compreende ainda um polinucleotídeo heterólogo que codifica um imunógeno ou uma proteína, em que o polinucleotídeo heterólogo é operativamente ligado a um promotor. O promotor pode ser um promotor funcional na célula procariótica ou eucariótica, como um promotor CMV. 0 assunto aqui divulgado ainda se refere a um método de produção de uma proteína ou um imunógeno usando os plasmídeos sem fármaco compreendendo as etapas de 1) manipular uma cepa hospedeira bacteriana gram negativa compreendendo um polinucleotídeo heterólogo inserido por substituição alélica em uma ou mais regiões não essenciais do cromossomo hospedeiro; 2) construção de um plasmideo de DNA que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína repressora cl e um gene que codifica um imunógeno ou uma proteína; 3) transformar a cepa hospedeira bacteriana com o plasmideo de DNA que compreende o polinucleotídeo que codifica a proteína repressora cl e o gene que codifica o imunógeno ou proteína; 4) crescimento da cepa hospedeira bacteriana transformada na presença de sacarose a uma temperatura que varia de 30 °C até 42 °C; e 5) recuperação do imunógeno ou proteína.

Em um aspecto da modalidade, o gene que codifica um imunógeno ou uma proteína é operativamente ligado a um promotor funcional em células procarióticas. O promotor pode ser promotor de bactérias gram-negativas incluindo, mas sem se limitar, aos promotores isolados de Avibãcterium, Brucella, Escherichia coli, Haemophilus (por exemplo, Haemophilus suis), Salmonella (por exemplo, Salmonella enteridis, Salmonella typhimurium, Salmonella infantis), Shigella, Pasteurella, e Rimeirella.

Em um aspecto da modalidade, o polinucleotídeo heterólogo inserido no cromossomo hospedeiro codifica uma proteína sacB. Em outro aspecto, a concentração de sacarose pode variar de 0% a cerca de 20%, de cerca de 1% a cerca de 20%, de cerca de 1% a cerca de 15%, de cerca de 1% a cerca de 10%. Em ainda outro aspecto, a contração de sacarose pode variar de cerca de 1% a cerca de 10%, de cerca de 1% a cerca de 2%, de cerca de 2% a cerca de 3%, de cerca de 3% a cerca de 4%, de cerca de 4% a cerca de 5%, de cerca de 5% a cerca de 6%, de cerca de 6% a cerca de 7%, de cerca de 7% a cerca de 8%, de cerca de 8% a cerca de 9% ou de cerca de 9% a cerca de 10%. Em ainda outro aspecto, a concentração de sacarose pode ser de cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9% ou cerca de 10%.

Em um aspecto da modalidade, a temperatura pode variar de cerca de 30 °C a cerca de 42 °C. Em outro aspecto, a temperatura pode variar de cerca de 30 °C a cerca de 41 °C, de cerca de 30 °C a cerca de 39 °C, de cerca de 30 °C a cerca de 38 °C, de cerca de 30 °C a cerca de 37 °C. Em ainda outro aspecto, a temperatura pode ser de cerdâ^S^r 3-0’·-°C, de cerca de 31 °C, de cerca de 32 °C, de cerca défes®*. °C, de cerca de 34 °C, de cerca de 35 °C, de cerca de 36 °C, de cerca de 37 °C, de cerca de 38 °C, de cerca de 39 °C, de cerca de 40 °C ou de cerca de 41 °C. O termo recuperação inclui, mas não se limita, à coleta, extração, colheita ou purificação a partir do meio de cultura.

Um componente biológico "isolado" (como um polinucleotídeo, plasmídeo de DNA, proteína ou organela) refere-se a um componente que foi substancialmente separado ou removido por purificação de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente ocorre naturalmente, por exemplo, outro DNA cromossomal e extracromossomal e RNA, proteínas e organelas. Polinucleotídeos (incluindo plasmídeos de DNA) e proteínas que foram "isoladas" incluem polinucleotídeos e proteínas purificadas por métodos de purificação padrão, por exemplo, ver Russell, David W. ; Sambrook, Joseph (2001), Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory. O termo também engloba polinucleotídeos e proteínas preparadas por tecnologia recombinante, bem como por síntese química. O termo "purificado", como aqui utilizado, não requer pureza absoluta; ao invés disso, ele é tencionado como um termo relativo. Deste modo, por exemplo, uma preparação de polipeptídeo ou polinucleotídeo purificada é uma em que o polipeptídeo ou polinucleotídeo é mais enriquecido do que o polipeptídeo ou polinucleotídeo em seu ambiente natural. Isto é, o polipeptídeo ou polinucleotídeo é separado dos componentes celulares. Por "substancialmente purificado" se entende que pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% ou mais dos componentes celulares ou materiais foram removidos. Da mesma forma, o polipeptídeo ou polinucleotídeo pode ser parcialmente purificado. Por "parcialmente purificado" se entende que menos de 60% dos componentes celulares ou material é removido. A presente invenção compreende ainda métodos para induzir uma resposta imune ou protetora em um animal, compreendendo a administração ao animal de uma composição imunológica, uma vacina ou uma composição de acordo com a invenção. As respostas imunes eliciadas são notavelmente respostas imunes de anticorpo e/ou celulares e, em particular, uma resposta de gama-interferon.

Em particular, a presente invenção fornece métodos para imunizar contra, ou para prevenir ou reduzir os sintomas causados por infecção de um animal com um organismo patogênico (por exemplo, infecção por um vírus, bactéria, fungo ou parasita protozoário). 0 método da presente invenção é útil em animais vertebrados incluindo, mas sem se limitar, aos seres humanos, caninos (por exemplo, cães), felinos (por exemplo, gatos); equinos (por exemplo, cavalos), bovinos (por exemplo, gado) e suínos (por exemplo, porcos), bem como em aves incluindo, mas sem se limitar, a galinhas, perus, patos, gansos, uma codorna, um faisão, papagaios, passarinhos, gaviões, corvos e ratitas (avestruz, ema, casuar e similares) . 0 método da presente invenção também é útil para fornecer vacinas de DNA de peixe.

Em um aspecto particular da invenção, estes métodos consistem na vacinação de fêmeas grávidas antes do parto através da administração de uma composição de vacina feita de acordo com a invenção. Estes métodos incluem ainda a indução de anticorpos protetores eliciados pelo protocolo de vacinação e a transferência desses anticorpos protetores das fêmeas grávidas vacinadas para sua prole. A transferência de tais anticorpos maternos posteriormente protege a descendência de doenças. A dosagem da composição da vacina feita de acordo com a presente invenção dependerá da espécie, raça, idade, tamanho, histórico de vacinação e estado de saúde do animal a ser vacinado. Outros fatores como concentração de antígeno, componentes de vacina adicionais e via de administração (isto é, administração subcutânea, intradérmica, oral, intramuscular ou intravenosa) também terão impacto na dose eficaz. A dose de vacina a administrar é facilmente determinável com base na concentração de antígeno da vacina, via de administração, e idade e condição do animal a ser vacinado. Cada lote de antígeno pode ser calibrado individualmente.

Alternativamente, os testes de imunogenicidade metódicos de diferentes dosagens, bem como estudos MPD (dose de proteção mínima) e outros procedimentos de triagem podem ser usados para determinar a dosagem eficaz para uma composição de vacina de acordo com a presente invenção sem experimentação demasiada. A partir dos exemplos apresentados abaixo, será prontamente evidente que dosagem aproximada e que volume aproximado seriam apropriados para o uso da composição da vacina aqui descrita. 0 fator crítico é que a dosagem fornece pelo menos um efeito protetor parcial contra a infecção natural, como evidenciado por uma redução na mortalidade e morbidade associadas com a infecção natural. 0 volume apropriado é também facilmente verificado por uma pessoa normalmente versada na técnica. Por exemplo, em espécies de aves o volume de uma dose pode ser de cerca de 0,1 mL até cerca de 0,5 mL e, vantajosamente, de cerca de 0,3 mL até cerca de 0,5 mL. Para as espécies de felinos, caninos e equinos, o volume de uma dose pode ser de cerca de 0,2 mL até cerca de 3,0 mL, vantajosamente de cerca de 0,3 mL até cerca de 2,0 mL, e mais vantajosamente de cerca de 0,5 mL até cerca de 1,0 mL. Para as espécies bovina e suína, o volume da dose pode ser de cerca de 0,2 mL até cerca de 5,0 mL, vantajosamente de cerca de 0,3 mL até cerca de 3,0 mL, e mais vantajosamente de 0,5 mL até cerca de 2,0 mL.

Vacinações repetidas podem ser preferíveis em intervalos de tempo periódicos para aumentar a resposta imune inicíalmente ou quando um longo período de tempo se passou desde a última dose. Em uma modalidade da presente invenção, a composição da vacina é administrada como uma injeção parenteral (isto é, por via subcutânea, intradérmica ou intramuscular). A composição pode ser administrada como uma dose ou, em modalidades alternativas, administrada em doses repetidas de cerca de dois a cerca de cinco doses administradas em intervalos de cerca de duas a cerca de seis semanas, de preferência de cerca de duas a cerca de cinco semanas. No entanto, uma pessoa versada na técnica vai reconhecer que o número de doses e o intervalo de tempo entre as vacinações depende de uma série de fatores, incluindo, mas sem se limitar, à idade do animal vacinado; condição do animal; via de imunização; quantidade de antígeno disponível por dose; e similares. Para a vacinação inicial, o período será geraimente mais longo do que uma semana e de preferência será entre cerca de duas a cerca de cinco semanas. Para animais previamente vacinados, uma vacinação de reforço, antes ou durante a gravidez, aproximadamente em um intervalo anual pode ser realizada. A presente invenção também contempla a administração de uma composição de vacina usando um injetor sem agulha como Pigjet®, Avijet®, Dermojet® ou Biojector® (Bioject, Oregon, EUA) . Uma pessoa normalmente versada na técnica é capaz de ajustar as especificações do injetor, conforme necessário em relação aos fatores como a espécie do animal a ser vacinado; a idade e o peso do animal, e similares, sem experimentação excessiva. A presente invenção se refere ainda a um kit compreendendo um primeiro frasco contendo um ingrediente ativo, como um imunógeno ou composição farmacêutica e, em um segundo frasco, um diluente feito de acordo com a presente invenção. 0 imunógeno pode estar em uma forma liofilizada, uma forma em pó ou em solução aquosa, conforme descrito neste documento. A invenção será agora descrita por meio dos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1: 0 Conceito de Manutenção de Plasmídeo Sem Antibiótico 0 exemplo a seguir demonstra um novo conceito para a manutenção de um elevado número de cópias de plasmídeo em uma célula hospedeira gram negativa que se baseia em três componentes: 1. um hospedeiro bacteriano gram negativo que expressa um produto tóxico para a bactéria gram negativa em condições de cultura definidas, em que o gene tóxico é inserido em uma ou mais regiões não essenciais do cromossomo hospedeiro bacteriano. 2. A presença no cromossomo bacteriano de um gene que codifica o produto tóxico sob o controle de um promotor constitutivo que pode ser estritamente regulado; e 3. Expressão de um repressor específico do plasmídeo que regula o promotor operativamente ligado ao gene tóxico no cromossomo hospedeiro.

Neste desenho, é a presença do plasmídeo que controla a multiplicação do hospedeiro de bactéria gram negativa quando está sob condições de cultura definidas (por exemplo, na presença de sacarose).

No primeiro componente, a bactéria gram negativa é transformada para expressar o gene sacB que codifica a levansacarose (ver FIG. 1) . 0 segundo e terceiro componentes se referem ao produto do gene repressor cl e o promotor λ direito. 0 gene cl dos bacteriófagos λ codifica para o repressor λ. A região do genoma que codifica a proteína repressora cl é conhecida como a região de imunidade. A região de imunidade é ilustrada na figura 2. Um sistema de plasmídeo expressando o produto do gene cl deve inibir a transcrição do gene sacB colocado sob o controle do promotor λ. Tal repressão deve conferir resistência à sacarose e permitir tanto a manutenção do plasmídeo quanto a propagação nas células hospedeiras (ver figura 1). A figura 3 descreve a visão geral do conceito "sem fármaco", em que a atividade do repressor cl, expressa a partir do plasmideo, inibe a transcrição do produto do gene ■sacB tóxico colocado sob o promotor λ Pr localizado no cromossomo da célula hospedeira e em que a viabilidade das células de E. coli hospedeiras na presença de sacarose é assegurada por um nível de expressão suficiente da proteína repressora λ cl do plasmideo. A ligação do repressor cl ao seu promotor específico é ótima em temperaturas entre 30 °C e 37 °C (ver figura 3) .

No caso específico (como ao utilizar o repressor cI857 sensível à temperatura), o repressor cl irá ligar o promotor em temperaturas superiores a 40 °C. Portanto, uma mudança para 42 °C inibe a atividade de ligação do repressor cl para o promotor λ Pr e deve tornar as células hospedeiras sensíveis à sacarose (mais particularmente os subprodutos levano) como consequência. A incubação em temperatura de 42 °C na presença de sacarose é uma condição ad hoc para validar a funcionalidade de todo o sistema e constitui uma "prova negativa" em apoio a toda a funcionalidade do sistema (ver figura 4 e figura 6C) . Na verdade, as células originais kPr::sacB purNQ.kan transformadas com o plasmideo pPB829 ou pPB838 crescendo na presença de Cat ou sacarose não foram viáveis quando plaqueadas em ágar sacarose LB em incubação a 42 °C. Isso demonstra que a viabilidade das células de origem depende da manutenção do plasmídeo que compreende o gene cl.

Exemplo 2: Geração da Cepa Hospedeira de E. coli Abrigando o Promotor λ/Gene da Levansacarose Duas cepas hospedeiras manipuladas contendo o cassete ÁPr::sacBQkan foram preparadas em que o cassete, contendo o gene sacB sob o controle do promotor lambda (XPr), é marcado com canamicina e a seguir introduzido no cromossomo de E. coli por substituição alélica do gene edA ou purN.

Esses genes não são essenciais e suas eliminações não afetam a taxa de crescimento. As células transformadas tornaram-se altamente sensíveis à sacarose.

As figuras 8A-B mostram que o cassete kPr:: sacB Qkan a ser inserido por substituição alélica do gene edA ou purN, respectivamente, no cromossomo de E. coli é composto de seis componentes independentes que foram amplificados por PCR antes de ser fusionados por PCR de união. A figura 8D mostra que o cassete ÀPr::sacB foi inserido no cromossomo de E. coli por substituição alélica do gene edA ou purN. Esta inserção de cassete foi realizada através da transformação de E. coli com um molde de DNA linear, contendo um gene eliminado flanqueado por regiões homólogas à montante e à jusante do lócus de cromossomo, e transferido em uma cepa de E. coli de recombinação- proficiente, como mutantes sbcA recD, recB, recC. A cepa de E. coli para a manipulação da cepa parental foi a cepa BJ5183 da Stratagene (ref# 200154), em que o genótipo foi endAl sbcBC recBC galK met thi-1 biol hsdR (Strr) . Conforme mostrado, o fenótipo inicial do tipo selvagem de E. coli foi Kans, Cats e ScaroseR. Após a transformação da cepa, o fenótipo tornou-se KanR, Cats e Sacaroses. Este último fenótipo foi um da cepa parental utilizada para os experimentos adicionais que lidam com a demonstração da funcionalidade do plasmídeo sem antibiótico. A figura 8C mostra que o cassete ÂPr::sacB Qcat a ser inserido por substituição alélica do gene edA no cromossomo PrÂ:: sacBQkan de E. coli foi composto por seis componentes independentes que foram amplificados por PCR antes de serem fusionados por PCR de união. O objetivo do novo cassete ÂPr::sacB Qcat que objetiva a eliminação do gene edA por troca alélica era manipular um mutante de eliminação dupla AedA ApurN expressando dois cassetes sacB. A figura 8E mostra que quando a cepa parental foi transformada com o plasmídeo cl (pPB829 ou pPB838), as células (linhagem parental + plasmídeo cl [pPB829 ou pPB838]) tornaram-se resistentes à canamicina (KanR) , cloranfenicol (CatR) e sacarose (Sacarose3). A figura ilustra a coexistência da cepa hospedeira manipulada (ApurN kPr::sacB+ Dkan) ou (AedA kPr::sacB+ Ckan) e plasmideo fármaco para demonstrar prova de conceito quando o gene sacB foi colocado sob o controle do promotor lambda e o constructo foi introduzido no cromossomo de E. coli por substituição alélica do gene edA ou purN. As células transformadas tornaram-se altamente sensíveis à sacarose.

Quando os plasmídeos marcados com cloranfenicol (pPB838 ou pPB829) compreendendo o repressor cl foram introduzidos nas cepas ApurN kPr: : sacB+Qkan ou AedA kPr: : sacB+Qkan, as células transformadas tornaram-se resistentes à canamicina, cloranfenicol e sacarose. 0 promotor λ (ÀPr) foi amplificado com os iniciadores (primers) PB1232 e PB1233 para a eliminação de purN.

Iniciador PB1232 (SEQ ID NO: 6): (CCGAACAACGCGTGGTTATCGACACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCG) e Iniciador PB1233 (SEQ ID NO: 7): (CAAACTTTTTGATGTTCATATCCATCTGATCCTCTTCAAAAGGCCACCTG) 0 promotor λ (λ-Pr) foi amplificado com os iniciadores PB1234 e PB1233 para exclusão de edA. PB1234 (SEQ ID NO: 8): (GACGACAAATTTGTAATCAGGCGAGAGCACCGCAAGGGATAAATATCTAACAC CG). A amplificação do promotor λ (ÀPr) (SEQ ID NO: 5) foi realizada utilizando o plasmídeo pLDR8 (ATCC #77357), como molde de DNA. O gene sacB (SEQ ID NO: 3) foi amplificado com os iniciadores PB1192 (SEQ ID NO: 9) (ATGGATATGAACATCAAAAAGTTTGC) e PB1193 (SEQ ID NO: 10) (AAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCTTG) usando o pNB350 (bens de propriedade exclusiva da Merial) como molde de DNA quando o PCR de união foi utilizado para a manipulação do cassete  Pr::sacBQkan (ver figuras 8A-B).

Para a manipulação do cassete kPr::sacB Qcat, o iniciador reverso PB1320 (SEQ ID NO: 80) (GCCGATCAACGTCTCATTTTCGCCGTTAACAGATCTTTATTTGTTAACTGTTAATTGT CCTTG) foi usado no lugar de PB1193. O promotor bla foi amplificado com os iniciadores PBL1194 (SEQ ID NO: 11) (ATGTGCGCGGAACCCCTATTTG) e PB1195 (SEQ ID NO: 12) (GACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGC) utilizando ο ρΟΜνβ como molde de DNA. O gene de resistência à canamicina foi amplificado com os iniciadores PB1196 (SEQ ID NO: 13) (ATGAGCCATATTCAACGGGAAACG) e PB1197 (SEQ ID NO: 14) (GAAAAACGCCAGCGGCAGAGCTGGCGCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG) usando o plasmídeo pLL14 (contendo o promotor fraco para o gene da canamicina, bem de propriedade exclusiva da Merial) como molde de DNA. 0 gene de resistência ao cloranfenicol (cat) colocado sob o controle de seu promotor cat natural foi amplificado com os iniciadores PB1321 (SEQ ID NO: 81) (AGATCTGTTAACGGCGAAAATGAG) e PB1322 (SEQ ID NO: 82) (AAAACGCTACAAAAATGCCCGATCCTTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGC) utilizando o pPB829 como molde de DNA. A região flanqueadora 5' do gene purN foi amplificada com PB1237 (SEQ ID NO: 15) (TTTGCGGCCGCTGGTGGTGGTCGCCATGTGCGTTAATGACC) e PB1199 (SEQ ID NO: 16) (TATTCGATAACCACGCGTTGTTCGG) utilizando DNA genômico da cepa de E. coli SCSI como molde de DNA. A região flanqueadora 3' do gene purN foi amplificada com os iniciadores PB1200 (SEQ ID NO: 17) (GCGCCAGCTCTGCCGCTGGCGTTTTTC) e PB 1238 (SEQ ID NO: 18) (TTTGGATCCGCTGGTGGATATCATCAAGGCAGTAACGCAGAATG) utilizando o DNA genômico da cepa de E. coli SCSI como molde de DNA . A região flanqueadora 5' do gene edA foi amplificada com os iniciadores PB1235 (SEQ ID NO: 19) (TTTGCGGCCGCTGGTGGTTGAGAACCAGGTGATTGAAGCGCC) e PB1209 (SEQ ID NO: 20) (CTCTCGCCTGATTACAAATTTGTCGTC) usando DNA genômico de SCSI como molde de DNA. A região flanqueadora 3' do gene edA foi amplificada com os seguintes iniciadores PB1210 (SEQ ID NO: 21) (AGGATCGGGCATTTTTGTAGCGT) e PB1236 (SEQ ID NO: 22) (TTTCTAGAGCTGGTGGCGACTACCGTGAATCCTGGCAACC) usando plasmídeo pLDR8 como DNA molde.

Esses seis produtos de PCR individuais do cassete ÂPr::sacB &kan ou o kPr::sacB Qcat a ser transferido para o cromossomo de E. coli foram fundidos após um PCR de união (figuras 8A-B-C). Esses seis fragmentos amplificados individuais foram purificados com um kit de limpeza de PCR (Geneclean turbo kit; MP Biomedicals, CA, EUA) e um segundo ciclo de PCR foi estabelecido com todos os 6 fragmentos e sem iniciadores. A condição de PCR foi a seguinte: Mistura de PCR (final de 25 μΣ) , 1 μΣ de cada fragmento de PCR, 2 μΣ de dNTP (2,5 mM cada, 5 μΣ de 5 x tampão de PCR, 11,5 μΣ de água destilada estéril, 0,5 μΣ de DNA polimerase Phusion (Finenzymes, Finlândia); Ciclos de PCR: 98 °C 30 s, (98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 5 min)*15 ciclos e 72 °C durante 10 min. O terceiro ciclo de amplificação por PCR foi realizado com 1 μΣ do produto purificado do segundo ciclo com o uso dos iniciadores PB1235 e PB1236 para purN (substituição alélica) e os iniciadores PB1237 e PB1238 para edA (substituição alélica). A condição de PCR foi a seguinte: Mistura de PCR (final de 50μΣ), 1 μΣ do segundo fragmento de PCR, 1 μΣ de dNTP (2,5 mM cada, 10 μΣ de 5x tampão PCR, 37 μΣ de água destilada estéril, 0,25 μΣ de iniciador adiante, 0,25 μΣ de iniciador reverso, 0,5 μΣ de DNA polimerase Phusion (Finenzymes, Finlândia); Ciclos de PCR: 98 °C durante 30 s, (98 °C 15 s, 60 °C 30 s, 72 °C 4 min)*35 ciclos e 72 °C durante 10 min. Os amplicons unidos por PCR finais (4007 pb para a substituição alélica purN e 3407 pb para a substituição alélica edA) foram verificados em gel de agarose e purificados antes da transformação em E. coli. Cada amplicon unido por PCR foi verificado quanto à análise de restrição. 0 fragmento de DNA linear (ÁPr::sacB &kan) que codifica um gene sacB colocado sob o controle do promotor λPr (SEQ ID NO: 75) e o gene de resistência Kan colocado sob o controle do promotor bla flanqueado por duas regiões longas homólogas às sequências de DNA que margeiam o lócus alvo (edA ou purN) foi integrado no cromossomo de E. coli por eletroporação. Aproximadamente 300 candidatos transformantes (ApurN kPr::sacB Ckan ou mutante único AedA ÁPr::sacB Qkan) foram obtidos em placa de agar LB contendo canamicina como pressão de seleção. 20 colônias foram aleatoriamente escolhidas e purificadas por esfriamento em placas contendo canamicina e a inserção do cassete kPr::sacB Qkan nos loci edA ou purN foi verificada por PCR (ver a Figura 9B) . Um PCR usando PB1196 e PB1197 foi realizado para verificar a inserção de canamicina no cromossomo. Um PCR usando PB1192 e PB1193 foi realizado para verificar a presença do gene sacB no cromossomo. Um PCR usando os iniciadores PB1204 (SEQ ID NO: 23) (GTGGTGCTTATTTCCGGCAACGG) e PB1205 (SEQ ID NO: 24) (CCAGCCACGCGGCGTTTTCGTGC) foi realizado para verificar a ausência do gene purN no cromossomo. Um PCR usando PB1214 (SEQ ID NO: 25) (GACCACCGGCCCGGTTGTACCGG) e PB1215 (SEQ ID NO: 26) (CGGACCCGCGATCGCCTGCAGG) foi realizado para verificar a ausência do gene edA) (ver figura 9B) . Um PCR usando os iniciadores PB1213 (SEQ ID NO: 27) (GGTGGATGGCGTCCATTTCTGTGC) e PB1196 foi realizado para verificar a inserção direita e correta do cassete no lócus edA. Um PCR usando os iniciadores PB1212 (SEQ ID NO: 28) (CAAAAGTGTTAAGCGGTAACCTG) e PB1233 foi realizado para verificar a inserção esquerda e correta do cassete no lócus edA. Um PCR usando os iniciadores PB1203 e PB1196 foi realizado para verificar a inserção direita e correta do cassete no lócus purN. Um PCR usando os iniciadores PB1202 e PB1233 foi realizado para verificar a inserção esquerda e correta do cassete no lócus purN (ver figura 9C). Todas as verificações de PCR confirmaram a integração nos loci corretos. Além disso, a funcionalidade do gene sacB também foi confirmada, como mostrado na figura 10. A cepa parental manipulada ApurN kPr::sacB Qkan foi incapaz de crescer em placa de ágar LB contendo sacarose (figura 10). 0 fragmento de DNA linear (ÂPr::sacB Qcat) que codifica um gene sacB (colocado sob o controle do promotor ÀPr) e o gene de resistência Cat (colocado sob o controle de seu promotor cat natural) flanqueado por duas regiões longas homólogas às sequências de DNA margeando o lócus alvo (edA) foi integrado no cromossomo da cepa de E. coli ApurN ÂPr::sacB Qkan por eletroporação. Cerca de 200 candidatos transformantes (mutante duplo ApurN ÂPr::sacB &kan AedA ÂPr::sacB &cat) foram obtidos em placa de agar LB contendo cloranfenicol como pressão de seleção. 20 colônias foram aleatoriamente escolhidas e purificadas por esfriamento em cloranfenicol e a inserção do cassete ÂPr:: sacB Qcat no lócus edA foi verificada por PCR (ver figura 9C) utilizando o conjunto de iniciador PB1212 e PB1213 (ver figura 9C). O produto de PCR foi verificado por sequenciamento para validar a identidade de ÂPr::sacB

Qca t.

A manipulação da cepa hospedeira é ilustrada na figura 8D. A figura 8E ilustra a cepa hospedeira (uma cassete sacB

[ÂPr::sacB Qkan]) e a coexistência do plasmídeo sem fármaco. O genótipo de E. coli inicial é Kans, Cats, SacaroseR. A integração do cassete no cromossomo de E. coli ApurN PrÂ:: sacBQKan gerou um novo genótipo, KanR, Cats, Sacaroses. A introdução do plasmideo que abriga o repressor cl gerou o genótipo final, KanR, CatR, Sacarose3.

Exemplo 3: Geração de Plasmídeos Abrigando o Cassete de Expressão do Repressor cl (plasmídeos pPB838-pPB844 para pPB847-pPB885-pPB896) Resumo da Construção do Plasmideo Os plasmídeos derivados de pPB828 como pPB829 e pPB844-pPB847 foram gerados contendo o ORF cl do fago λ, sob o controle do seu próprio promotor ou do promotor fraco do gene da canamicina (Pl). 0 plasmideo pPB838 contendo o gene cl colocado sob o controle do promotor fraco do gene de canamicina (Pl) foi gerado utilizando um vetor comercial de plasmideo intermediário pMCS5 em que o gene da acetil transferase de cloranfenicol (cat) substituiu o gene de resistência à ampicilina. (Figura 19).

Os plasmídeos pPB844 e pPB845 contêm o gene cl (colocado sob o controle do promotor Pl) clonado no vetor pPB828 que é um derivado pVR1012 (plasmideo pVRlO2O ou 1012, VICAL Inc.; Luke e cols., 1997; Hartikka e cols., 1996, ver, por exemplo, as Patentes Americanas Nos. 5.846.946 e 6.451.769), contendo o gene cat. Os plasmídeos diferem na orientação do gene cl no plasmideo (Figuras 20- 21) .

Os plasmídeos pPB846 e pPB847 contêm o gene cl (colocado sob o controle de seu próprio promotor (nativo) SEQ ID NO: 30) clonados no vetor pPB828 que é um derivado pVRlO12 contendo o gene cat. Os plasmídeos diferem na orientação do gene cl no plasmídeo (Figuras 22-23) . 0 pPB885 foi preparado a partir do plasmídeo pPB838 [gene cl colocado sob o controle do promotor fraco do gene da canamicina (Pl)] em que o gene da acetil transferase de cloranfenicol (cat) foi removido por digestão com enzima de restrição Avrll (Figura 24).

Os plasmídeos derivados de pPB829, como pPB896, contém o gene cl colocado sob o controle do promotor fraco do gene de canamicina (Pl). 0 plasmídeo pPB896 contém o gene marcador GFP colocado sob o controle do promotor CMV eucariótico (Figura 25).

Estes plasmídeos foram usados como vetores para clonagem de um polinucleotídeo heterólogo, um gene de interesse (transgene) no sistema sem fármaco. Cada plasmídeo abriga o gene de resistência a antibiótico (cat) que pode ser cortado e removido por uma única enzima de restrição para permitir a propagação do plasmídeo na cepa de E. coli sacB+ apropriada na presença de sacarose sem pressão por seleção de antibiótico (como cloranfenicol). O gene de resistência a antibióticos (cat) nestes plasmídeos foi usado apenas para prova de conceito. 0 gene cat é finalmente removido nos plasmídeos sem fármaco finais (ver as figuras 13 a 15 e exemplo 4). A sequência do gene cl do plasmídeo pLDR8 (Número ATCC # 77357) produz um mutante cI857 da proteína repressora (NCBI: AB248924, vetor de clonagem pND707, Love, C.A. e cols., Gene. 17; 176 (1-2): 49-53; 1996).

A. Construção do plasmídeo pPB829 contendo o ORF

Repressor Ci colocado sob o controle do promotor fraco Pl Plasmídeo pPB828: (plasmídeo à base de pVRlO12 + gene Cat) (Figura 17) Os plasmídeos derivados de pPB828 como pPB829 foram gerados contendo o ORF cl do fago λ, sob o promotor fraco do gene da canamicina (Pl) e o gene Cat que é cortável por um único sítio de digestão EcoRI. Um vetor de expressão à base de pVR1012 foi gerado contendo o gene da cloranfenicol acetil transferase (cat) que gera o plasmídeo pPB828. O gene cat de pPB627 (bem de propriedade exclusiva da Merial) foi um derivado do pNB335 (bem de propriedade exclusiva da Merial) que é em si um derivado do plasmídeo inicial pSW23T (plasmídeo de clonagem para o No. de Acesso GenBank AY733066) . 0 fragmento de DNA correspondente ao gene cat (798 pb) (SEQ ID NO: 31 para DNA, SEQ ID NO: 32 para proteína) foi obtido por PCR usando os iniciadores PB1184 (SEQ ID NO: 33) (GAATTCCGGTCCGGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGCS) [Contendo um sítio EcorI (sublinhado)] e PB1185 (SEQ ID NO: 34) (CCTAGGCTGTGTTAATTAAGGCGCGCCGAATTCCGGTCCGTTACGCCCCGCCCTGCCA CTCATCGC) [contendo um sítio EcoRI (sublinhado)] usando pNB350 como um molde e DNA polimerase de alta fidelidade Phusion™ (Finnzymes, 02150 Espoo, Finlândia). O produto de PCR resultante (832 pb) foi ligado no vetor pCR blunt Topo vector (Invitrogen, CA, EUA) para obter o plasmideo pCRjblunt/PB1184-1185 (4351 pb) (Figura 16) . A identidade do pCRhlunt/PB1184-1185 foi confirmada por análise de restrição (digestão PvuII). O fragmento de DNA correspondente ao gene Cat foi obtido por digestão enzimática do plasmideo pCRjblunt/PB1184-1185 com Ecll36ll e EcoRV. O fragmento de 897 pb foi ligado no plasmideo à base de pVR1012 previamente digerido com Mscl e StuI (3303 pb) para gerar o plasmideo pPB828 (Figura 17). A identidade do pPB828 foi confirmada por análise de restrição (digestão com PvuII e Ncol para determinar o tamanho da inserção e EcoRI para verificar que o gene cat está bem removido). Plasmideo pPB829: (plasmideo pPB828 + Pl::gene cl) (Figura 18) 0 constructo contendo o gene cl sob o promotor Pl (promotor fraco do gene de resistência à canamicina) foi obtido com um PCR de fusão. 0 fragmento de DNA

correspondendo ao promotor fraco Pl foi obtido por PCR usando os iniciadores PB1186 (SEQ ID NO: 35) (TCATACCAGGCCTAGGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATG) e PB1187 (SEQ ID NO: 36) (AACACCCCTTGTATTACTGTTTATG), usando pLLl4 (ver o pedido de patente da Merial US2005/0164946) como um molde e DNA polimerase Phusion. 0 fragmento de DNA correspondente ao gene cl (SEQ ID NO: 1) foi obtido por PCR usando os iniciadores PB1188 (SEQ ID NO: 37) (AATACAAGGGGTGTTATGAGCACAAAAAAGAAACCATTAACAC) [contendo uma região complementar da sequência Pl na extremidade 5' (sublinhada)] e PB1189 (SEQ ID NO: 38) (CCGGAATTCGGCGCGTCAGCCAAACGTCTCTTCAGGCCACTG) usando pLDR8 (ATCC #77357) como um molde e DNA polimerase Phusion. Os dois produtos de PCR (respectivamente com 151 e 729 pb) foram purificados e usados como molde em uma segunda etapa de PCR com os iniciadores PB1186 e PB1189 e a DNA polimerase Phusion (Finnzymes, Finlândia) (ver figura 24). Os dois produtos de PCR (respectivamente com 151 e 729 pb) foram purificados e ligados com plasmídeo pPB828 digerido com Asei e Avrll para gerar o plasmídeo pPB829 (4970 pb) (Figura 9A) . A ligação foi estabelecida com o "Kit de Clonagem de PCR In-Fusion" (N° cat. 740590,250) da Clontech (Takara Bio Europe, St-Germain-en-Laye, França). Clones pPB829 foram selecionados após uma análise de digestão de HindII. A integridade da sequência do gene cl e do promotor Pl foi confirmada por sequenciamento do plasmídeo pPB829.

Plasmídeo pPB896: (plasmídeo pPB829 + Pl::gene cl + GFP) (Figura 25) 0 gene marcador GFP foi colocado sob o controle do promotor CMV eucariótico (SEQ ID NO: 43) . 0 gene GFP foi preparado a partir da digestão de restrição do plasmídeo pCGlO5 (plasmídeo derivado de pPB828 tendo o gene GFP colocado sob o controle do promotor CMV eucariótico, bem de propriedade exclusiva da Merial) com ambos NotI/BglII. Este gene GFP digerido foi clonado no plasmídeo pPB829 previamente cortado por NotI/BglII, dando origem ao plasmídeo pPB896. B. Construção do plasmídeo intermediário, pPB838, e dos plasmídeos pPB844-pPB845 contendo o gene cl sob o promotor Pl (promotor fraco do gene da canamicina) Plasmídeo pPB837.1: (plasmídeo pMCS5 + gene Cat) 0 fragmento de DNA correspondente ao gene Cat foi obtido por PCR usando os iniciadores PB1182 (SEQ ID NO: 39)(AGATCTGTTAACGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGC) [contendo um sítio BglII (sublinhado) na extremidade 5'] e PB1183 (SEQ ID NO: 40) (GTCGACGTTAACTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGC) [contém um sítio Sall (sublinhado) na extremidade 5'] usando pPB791 [derivado do plasmídeo pNB350] como um molde e DNA polimerase Phusion.

Iniciadores de PCR foram projetados com base na sequência cat de pNB350. Três produtos de PCR independentes (779 pb) foram agrupados e ligados no vetor pCRII para obter o plasmídeo pCRII + PB1182-1183 (4734 pb) . Clones de pCRII + PB1182-1183 foram selecionados após uma digestão Sall/BglII. 0 plasmídeo pMCS5 (MoBiTec,. Alemanha) foi digerido com Sall e BglII a fim de obter o fragmento de DNA A (2950 pb). pCRII + PB1182-1183 foi digerido por Sall e BglII e o fragmento SalI-BglII foi isolado do gel de agarose (7 97 pb: fragmento B) . Os fragmentos A e B foram ligados para gerar os plasmídeos pPB837.1 (3747 pb) . pPB837.2: (pMCS5 + Cat) sem o promotor bla.

0 plasmídeo pPB837.1 foi gerado que não contém a região promotora bla. 0 plasmídeo pPB837.1 foi digerido com Nael e Xmnl e o fragmento Nael-Xmnl de 3300 pb foi isolado e purificado do gel de agarose (fragmento A). O fragmento A foi ligado para obter o plasmídeo pPB837.2 (3300 pb) . O clone pPB837.2 foi selecionado após a digestão de BglI. Plasmídeo pPB838 (pMCS5 + Cat sem promotor bla) + Pl::cl (Figura 22) O constructo contendo o gene cl sob o promotor Pl (promotor fraco do gene de resistência à canamicina) foi obtido com um PCR de fusão. 0 fragmento de DNA

correspondente ao promotor fraco Pl foi obtido por PCR usando os iniciadores PB1186 e PB1187, o pLL14 como um molde e a DNA polimerase Phusion. O fragmento de DNA correspondente ao gene cl foi obtido por PCR usando os iniciadores PB1188 e PB1189, o pLDR8 (ATCC # 77357) como um molde e a DNA polimerase Phusion (Finnzymes, Finlândia). Os dois produtos de PCR (respectivamente com 151 e 729 pb) foram purificados e usados como moldes em uma segunda etapa de PCR com os iniciadores PB1186 e PB1189 e a DNA polimerase Phusion. Dois produtos de PCR independentes (880 pb) foram agrupados e ligados no vetor pCRII blunt para obter o plasmídeo pCRblunt + PB1186-1189 (4400 pb) . Clones de pCRII blunt + PB1186-1189 foram selecionados após uma digestão EcoRV/Spel. pCRII blunt + PB1186-1189 foi digerido com EcoRV e Spel a fim de obter o fragmento A de EcoRV-Spel (936 pb). pPB837.2 foi digerido com EcoRV e Spel e o fragmento EcoRV-Spel foi isolado do gel de agarose (3464 pb: fragmento B) . Os fragmentos A e B foram ligados para gerar plasmídeos pPB838 (4216 pb) . O clone pPB838 foi selecionado após uma digestão com HindIII. A integridade da sequência do gene cl e do promotor Pl foi confirmada por sequenciamento. Plasmídeo pPB885 (pMCS5 + Cat sem promotor bla) + Pl::cl (Figura 24) Este plasmideo foi privado do plasmideo pPB838 onde o gene da cloranfenicol acetil transferase (CAT) foi removido por digestão da restrição Avrll (Figura 24). 0 plasmideo pPB885 contém o gene cl sob o controle do promotor fraco do gene da canamicina (Pl) . 0 plasmideo pPB885 foi isolado como descrito no exemplo 4 (ver abaixo) após a transformação da cepa hospedeira de E. coli ApurN ÀPr::sacB &kan por seleção direta na placa de ágar LB suplementado com sacarose 10%.

Plasmídeos pPB844-pPB845 (Figuras 23-24) O fragmento de DNA correspondente ao gene cl sob o promotor Pl foi obtido por PCR usando os iniciadores PB1186 e PB1263 (SEQ ID NO: 41) (TCAGCCAAACGTCTCTTCAGGCCAC), o plasmideo pPB838 como um molde e DNA polimerase Phusion. Quatro produtos de PCR independentes PB1186-PB1263 (864 pb) foram agrupados e ligados no vetor pCRblunt para obter o plasmideo pCRblunt + PB1186-1263 (4383 pb). Clones de pCRblunt + PB1186-1263 foram selecionados após uma digestão HindIII. O plasmideo pCRblunt + PB1186-1263 plasmideo foi digerido com EcoRI e as extremidades foram preenchidas com Klenow polimerase para gerar um fragmento blunt (929 pb: fragmento de A). 0 plasmídeo pPB828 foi digerido com Xmnl e o fragmento XmnI-Xmnl resultante foi purificado (fragmento B: 4135 pb) . Os fragmentos A e B foram ligados para gerar plasmídeos pPB844 ou pPB845. Os candidatos foram testados por uma digestão BamHI/HindIII. No plasmídeo pPB844 (ver figura 20), o gene cl está na mesma direção que o transgene de interesse a ser clonado no MCS (sítio de clonagem múltiplo) do vetor sob o controle do promotor CMV (SEQ ID NO: 43) . No plasmídeo pPB845 (ver figura 21) , o cl é orientado na direção oposta. C. Obtenção do gene cl com seu promotor nativo plasmídeos pPB846-pPB847 0 fragmento de DNA correspondente ao gene cl sob o seu próprio promotor (promotor nativo cl: SEQ ID NO: 30) foi obtido por PCR usando os iniciadores PB1266 (SEQ ID NO: 42) (GCTGACTCATACCAGGCACGCACGGTGTTAGATATTTATCCC) e PB1263, usando o plasmídeo pLDR8 como um molde e a DNA polimerase Phusion.

Plasmídeos pPB846-pPB847 Quatro produtos de PCR independentes PB1266-PB1263 (777 pb) foram agrupados e ligados no vetor pCRblunt para obter o plasmídeo pCRblunt + PB1266-1263 (4296 pb) . Clones do pCRblunt + PB1266-1263 foram selecionados após uma digestão HindIII. 0 plasmideo pCRblunt + PB1266-1263 foi digerido com EcoRI e as extremidades foram preenchidas com Klenow polimerase para gerar um fragmento blunt (842 pb: fragmento A). 0 plasmideo pPB828 foi digerido com Xmnl e o fragmento XmnI-Xmnl foi purificado (fragmento B: 4135 pb) . Os fragmentos A e B foram ligados para gerar os plasmídeos pPB846 (4999 pb) ou pPB847. Os candidatos foram testados por uma digestão BamHI/HindIII. No plasmideo pPB846 (ver figura 22), o gene cl está na mesma direção que o gene de interesse a ser clonado no sítio MCS do vetor sob o controle do promotor CMV. No plasmideo pPB847 (ver a figura 23), o gene cl é orientado na direção oposta.

D. RESULTADOS DO CONSTRUCTO A figura 7 mostra os construtos do pPB838 e pPB829 abrigando o repressor cl que foi usado para preparar o plasmideo sem fármaco. Ambos os plasmídeos foram marcados com o gene do cloranfenicol (CatR) . 0 gene Cat nesses plasmídeos foram necessários apenas para determinar prova de conceito, mas podem ser finalmente removidos (ver as Figuras 13 a 15 e o Exemplo 4).

Exemplo 4: Transformação da cepa hospedeira de E. coli com o(s) plasmideo(s) cl e seleção direta em uma placa de ágar sacarose Um procedimento experimental que permite a varredura das células transformadas pelo(s) plasmídeo(s) marcado(s) com cloranfenicol (Cat) sem o uso de antibióticos como a pressão de seleção em placa (s) de ágar tem sido eficientemente demonstrado (ver figuras 13 a 15). As células competentes de E. coli ÂPr::sacB+ ApurNQKan foram transformadas com 1 μς de plasmídeo pPB838 ou pPB829 e incubadas durante 3 horas a 30 °C em meio LB líquido.

Alíquota contendo 100 μΕ de células transformadas diluídas (IO-3 e 10'4) (com plasmídeos pPB838 e pPB829) foram espalhados na placa de ágar LB contendo sacarose 10%. Estas diluições que variam de 10“3 a 10-4 parecem adequadas para selecionar verdadeiras células transformantes (por exemplo, tendo plasmídeo cl) uma vez que de 98 a 100% das células resistentes à sacarose crescendo em placa de ágar LB contendo sacarose foram CatR. Isso sugere que essas células transformadas têm o plasmídeo cl (pPB829 ou pPB838). A figura 13A mostra que as células competentes de E. coli ÂPr::sacB+ ApurNQKan foram transformadas com 1 μρ de plasmídeo pPB838 ou pPB829 e incubadas por 3 horas a 30 °C em meio líquido LB antes da coloração com pontos (dot-spotting) (4 μΕ para cada ponto) . A figura mostra as diluições em Log (que variam desde não diluído até 6 diluições em Log) em placas de ágar LB contendo cloranfenicol (15 pig/mL) ou sacarose (10%). As células da cepa parental competente não transformada de E. coli /Pr::sacB+ foram usadas como células padrão cultivadas em condições semelhantes. Como esperado, as células padrão não cresceram em placas seletivas, como cat e sacarose. No entanto, devido ao longo período de incubação (3 dias), alguns mutantes espontâneos resistentes à sacarose apareceram sob essa condição. Este nível de mutante espontâneo define uma linha de base a ser considerada para a triagem das células transformantes verdadeiras.

Diferenças de dois log foram observadas com células transformadas crescendo em cat e sacarose sob esta condição experimental. Células competentes, por definição, apresentam uma temporalidade de fraqueza da parede celular. A incubação pós eletroporação de células transformadas em meio líquido LB permite a regeneração de ambas as fraquezas da parede celular anteriormente mencionadas e os poros induzidos da parede celular e membrana celular após a eletroporação. Uma vez que as células competentes foram geneticamente sensíveis à sacarose devido à inserção do cassete /Pr::sacB+ Apur^Kan, a recuperação de células transformadas na presença de sacarose foi reduzida em dois logs em comparação com a recuperação das células em Cat.

Essas observações foram confirmadas pelo espalhamento de 100 piL de células transformadas em placas seletivas (ver figura 13B). A figura 13B mostra que 100 pL de células padrão transformadas (com plasmídeos pPB838 e pPB829) e não transformadas foram espalhadas em placa de ágar LB de seleção contendo cat ou sacarose utilizando diluição Log apropriada para determinar a taxa de eficácia da transformação em cat e sacarose e o espalhamento padrão na sacarose para melhor definir a linha de base da taxa mutante espontânea a ser considerada para a varredura bem sucedida das células transformantes verdadeiras capazes de crescer em placa de agar LB sacarose. De acordo com o experimento das células de coloração em ponto anterior (ver figura 13A), mutantes espontâneos resistentes à sacarose não foram detectados quando a diluição 10~3 das células transformantes foi espalhada em placas de ágar LB contendo sacarose. Como foi mostrado anteriormente (ver figura 13A), houve diferença de 2 log na eficácia de transformação entre a seleção em cat e sacarose sob esta condição. As diluições variando de 10~3 até 10-4 quando espalhadas em ágar LB contendo sacarose pareceram adequadas para selecionar células transformantes verdadeiras (por exemplo, tendo plasmídeo cl).

As figuras 14A-C ilustram a eficácia do procedimento experimental para selecionar células transformadas apenas com o plasmídeo cl (pPB829 e pPB838) sem o uso de antibióticos como a pressão de seleção. A figura 14A mostra uma visão geral experimental utilizando ensaio de placas em replicata para validar a varredura das células transformantes verdadeiras tendo o plasmídeo cl. Semelhante ao que é mostrado na figura 13B, células competentes parentais ÂPr::sacB+ ApurNQKan foram transformadas com o plasmídeo cl (pPB829 e pPB838) e diluições em Log apropriadas foram espalhadas em placas de ágar LB seletivo (Cat ou sacarose) antes da incubação durante 3 dias a 30 °C. Posteriormente, as placas apresentando títulos de UFCs (unidades formadoras de colônias) variando de 20 a 150 foram replicadas em novas placas de ágar LB fresco contendo Cat ou sacarose ou uma combinação de ambos antes da incubação por mais 3 dias a 30 °C. Em teoria, colônias resistentes à Cat devem corresponder às células propagando o(s) plasmídeo(s) cl. A figura 14B mostra que os resultados experimentais confirmaram que as UFCs de CatR eram idênticas entre o número obtido em placas de ágar LB com sacarose e em placas com ágar LB com Cat/sacarose após o ensaio de plaqueamento em replicata. Conforme demonstrado na figura 14B (painel B), as UFCs CatR são: i) todas resistentes à sacarose e ii) todas resistentes à combinação de Cat e sacarose, o que significa que todas as células parentais após a transformação abrigam os plasmídeos cl. 0 painel C mostra que diluições de IO-3 e 10~4 das células transformantes selecionadas diretamente em sacarose também foram resistentes à sacarose e à combinação de sacarose e Cat, também significando que estas UFCs resistentes à sacarose correspondem a verdadeiras células transformadas contendo o plasmideo cl. De fato, quando células parentais não transformadas foram espalhadas em placa de ágar LB contendo sacarose, as UFCs resistentes à sacarose quando replicadas em uma combinação de sacarose e Cat não cresceram conforme esperado, pois a resistência ao cloranfenicol é uma característica fenotípica conferida pelo plasmideo pPB829 ou pPB838. A figura 14C representa os dados estatísticos obtidos a partir do ensaio de placa de replicata (ver figura 14B) e, mais particularmente, a porcentagem de colônias com o plasmideo cl que foram selecionadas sem o uso de antibiótico. Sob esta condição experimental, a porcentagem de colônias com o plasmideo cl varia de 98% a 100%.

Exemplo 5:______Diferentes condições de cultivo com e sem sacarose mostrando que o plasmídeo cl pode ser mantido Células de E. coli expressando sacB, ApurN /Pr::sacB+Qkan foram cultivadas na presença ou ausência de sacarose a fim de verificar a funcionalidade do cassete /Pr::sacB+ inserido no cromossomo de E. coli. A figura 4 descreve a "sensibilidade à sacarose" do sistema inativado em que uma mudança para 42 °C na temperatura inibe a atividade de ligação do repressor cl ao promotor λ Pr e torna as células hospedeiras sensíveis à sacarose. A proteína repressora cl expressa do plasmídeo inibe a transcrição do produto gênico sacB tóxico colocado sob o promotor λ Pr que está localizado no cromossomo da célula hospedeira. A viabilidade das células E. coli hospedeiras na presença de sacarose é assegurada por um nível de expressão suficiente do plasmídeo da proteína repressora λ cl. A figura 5 descreve a combinação da cepa hospedeira com o plasmídeo pDLl sem antibiótico na presença de sacarose para produzir plasmídeos sem fármaco (pDL: sigla do inglês DrugLess Plasmid ou plasmídeo sem fármaco). 0 plano experimental para a prova de conceito é ilustrado nas figuras 6A, 6B e 6C.

As características fisiológicas das células hospedeiras expressando sacB, ApurN Ω /Pr: : sacB+Qkan quando cultivadas na presença ou ausência de sacarose estão descritas na Tabela 1.

Tabela 1. As características fisiológicas das células hospedeiras sacB'1', ApurNQÀPr::sacB+, quando cultivadas com sacarose e sem sacarose.

As características fisiológicas das células hospedeiras expressando sacB (ÂPr:: sacB+) com e sem plasmídeo pDLl quando cultivadas na presença ou ausência de sacarose são descritas na Tabela 2.

Tabela 2. As características fisiológicas de (células hospedeiras ÀPr::sacB+ com e sem plasmídeo pDLl ao crescer ________________com sacarose e sem sacarose.__________________ As figuras 10-11 fornecem resultados confirmando que as cepas hospedeiras geneticamente modificadas eram altamente resistentes à sacarose a 30-37 °C, enquanto que nenhum crescimento foi observado a 42 °C. A figura 10 mostra que a segunda passagem com as cepas hospedeiras de E. coli, ApurN ÂPr: : sacB+Qkan, abrigando tanto o plasmídeo pPB829 quanto o plasmídeo pPB838, cresceram bem na presença de sacarose a 32 °C. A expressão do gene sacB foi perfeitamente reprimida pelo produto do gene cl sintetizado a partir dos plasmídeos cl. A manutenção do plasmideo foi 100% eficiente (versus controle em CATR) e as células foram capazes de sobreviver na presença de sacarose. A 42 °C, o produto do gene cl foi inativado. O plasmideo não pôde ser mantido e as células morreram na presença de sacarose. Isso demonstra que a viabilidade das células na presença de sacarose foi devido à presença de um plasmideo cl funcional.

Exemplo 6:_____Condições de cultivo mostrando que os plasmídeos cl são estáveis durante 5 passagens, sem pressão de seleção de antibiótico e falta de mutantes espontâneos para resistência à sacarose Uma vez que os plasmídeos sem fármaco foram produzidos, eles foram testados quanto à estabilidade e sua robustez em várias passagens no meio de caldo fresco contendo sacarose ou Cat. A figura 11 ilustra a estabilidade dos plasmídeos pPB829 e pPB838 em células em crescimento, incluindo a falta de rearranjo genético óbvio durante a seleção de cloranfenicol ou sacarose. Rendimentos de plasmideo comparáveis e manutenção em culturas crescendo na presença de sacarose e cloranfenicol foram observadas mesmo após cinco passagens sucessivas. Os sistemas de antibiótico e sem antibiótico foram pelo menos equivalentes em termos de manutenção do plasmídeo e seleção a partir de células de crescimento. A figura 12 ilustra a falta de mutações espontâneas no cassete /Pr::sacB inserido na cepa de E. coli parental quando as células cresceram a 30 °C. Esta observação demonstra claramente a estabilidade do plasmídeo cl em tal fundo genético de E. coli quando as células cresceram na presença de sacarose (ver figura 10). Este experimento de taxa de mutação foi realizado com a cepa de origem {purN excluído expressando o gene sacB). Foi demonstrado que nenhuma mutação ocorreu a 30 °C após 18h de incubação.

Culturas clonais de células de origem abrigando o cassete sacB+ em seus cromossomos foram cultivadas em LB contendo sacarose. As células foram coletadas em uma OD de 1,0 e alíquotas de 100 pL foram espalhadas em placas de ágar LB

contendo sacarose. Uma vez que a presença do gene sacB causa a morte das células, a taxa de mutação espontânea foi avaliada pela pontuação das colônias resistentes à sacarose após incubação de um dia para o outro a 30 °C. Células padrão abrigando o cassete sacB+, porém transformadas com o plasmídeo cl (pPB829 ou pPB838) tornaram-se resistentes à sacarose e a cultura de DO 1,0 precisou ser diluída por 5 Log antes de serem espalhadas (100 pL) em placas de ágar LB suplementadas com sacarose para pontuação. Após a cultura de um dia para o outro (18 horas de incubação) , nenhuma colônia resistente à sacarose foi detectada com as culturas de células parentais (ApurNÀPr::sacBQkan), enquanto que culturas diluídas em 5 Log de ApurNÀPr::sacBQkan transformadas com o(s) plasmideo(s) pPB829 ou pPB838 cresceram. Trinta e seis horas foram necessárias para detectar algumas colônias resistentes à sacarose (ApurNÀPr::sacBQkan) quando as células foram incubadas a 37 °C.

Mutação espontânea ocorreu a uma taxa de 1 mutação/1,3 X 105 células após 36 horas quando incubada a 37 °C. A manutenção do plasmideo cl nas células crescendo na presença de sacarose foi eficaz após a incubação de um dia para o outro a 30 °C, enquanto nenhum crescimento da cepa de origem foi detectado.

Exemplo 7:_____Melhoria da cepa hospedeira de E. coli parental para reduzir a taxa de mutação espontânea para sacarose pela adição de um segundo cassete sacB (AedAÁPr:: sacBQcat) no cassete sacB anteriormente mencionado da cepa hospedeira de E. coli (ApurN kPr:: sacBQkan) .

As figuras 8C e 9D ilustram como a nova cepa hospedeira parental de E. coli abrigando dois cassetes sacB (ApurN ÂPr: : sacBf2kan Aeda ÂPr:: sacBflcat) foi manipulada.

As figuras 10B-C demonstram que a cepa de E. coli de cassetes sacB duplos (ApurN ÂPr:: sacB+Qkan AedA ÂPr::sacB+QCat) foi altamente sensível (sem crescimento) na presença de sacarose quando incubadas a 30 °C e 42 °C, enquanto alguns mutantes espontâneos aparecem com a cepa de E. coli contendo um cassete sacB plaqueada em 10% de sacarose uniformemente (ApurN ÂPr::sacBQkan). A figura 10C também ilustra a menor concentração de sacarose necessária (2% final) para a cepa de E. coli de cassetes sacB dupla em comparação com a cepa de E. coli de um cassete sacB (10% final) . Além disso, parece que a cepa de E. coli com dois cassetes sacB foi muito mais sensível à sacarose, como mostrado na baixa % de sacarose na temperatura mais alta, como 42 °C. Isto sugere que a temperatura em cerca de 37 °C e a concentração de sacarose em cerca de 2% (ou ligeiramente inferior) podem corresponder à condição ótima para manter o(s) plasmídeo(s) abrigando o repressor do gene cl em células em crescimento.

Figuras 12B-C demonstram que a presença de dois cassetes sacB (ao invés de um) confere uma melhor robustez de sensibilidade à sacarose (ainda ótima em 2% de sacarose) em temperaturas variando de 30 °C até 37 °C. As células de E. coli transformadas com plasmídeos contendo dois cassetes do clone #1 sacB BJ5183 ApurNQ/Pr::sacB Km AedaQ /Pr::sacB

Cat e do clone #2 BJ5183 ApurNQ/Pr::sacB Km AedaQ /Pr::sacB

Cat, e as células de E. coli transformadas com plasmídeos contendo um cassete sacB do clone #16 BJ5183 ApurNfi/Pr::sacB Km e clone #11 BJ5183 AedAQ/Pr::sacB foram cultivadas até a OD600 de cerca de 1,0. Cerca de 100 pL de cada cultura foi espalhada em placas LB/ágar contendo 0%, 2% e 4% de sacarose (diluição de 10-5) para pontuação de UFC. As placas foram incubadas a 30 °C até 37 °C. A incubação a 37 °C foi utilizada para avaliar a robustez da cepa parental expressando os cassetes sacB duplos na presença de 2% e 4% de sacarose. As figuras 12B-C e as Tabelas 3 a 7 abaixo mostram que a presença de um cassete sacB no cromossomo de E. coli foi menos robusta na concentração de sacarose variando de 2 a 4% em temperaturas similares, tais como 30 °C e 37 °C. Como confirmado neste ensaio de plaqueamento, a taxa de mutação de sacarose com a cepa de E. coli com dois cassetes sacB não foi detectada na concentração mais baixa de sacarose (2%) quando incubada a 37 °C, enquanto a taxa de mutação com uma cepa de E. coli de um cassete sacB variou de 3,8 10~6 até 5 10“5. Um conjunto independente de experimentos mostrou que a taxa de mutação na cepa de E. coli com dois cassetes sacB foi quase 5.1O”10 quando incubada a 37 °C na presença de 2% de sacarose.

Tabela 3 1*: Clone #1 BJ5183 ΔριίΓΝΩλΡε: : sacB Km AedaHÂPr: : sacB Cat 2*: Clone #1 BJ5183 JpurN/2ÂPr; : sacB Km AedafiÂPr: : sacB Cat 3*: Clone #16 BJ5183 ÂpurNQÂPr::sacB Km 4*: Clone #11 BJ5183 AedAfiÂPr::sacB Km Exemplo 8: Manutenção e rendimentos do plasmídeo obtidos na ausência da pressão de seleção de antibiótico (o plasmídeo cl é mantido em um número elevado de cópias na cepa hospedeira) Células hospedeiras de E. coli expressando sacB e abrigando o plasmídeo cl (pPB829 ou pPB838) foram cultivadas na ausência de pressão de seleção de antibióticos (por exemplo, na presença de sacarose) ou na presença de Cat como controle.

Na figura 11, o rendimento do plasmídeo foi determinado nas passagens 2 e 5. Os plasmídeos foram extraídos de culturas mantidas a 30 °C e submetidas à eletroforese em gel. A digestão de restrição com HindII indica que nenhum rearranjo genético óbvio ocorreu em pPB829 ou pPB838 durante a propagação e seleção com Cat ou Sacarose. Além disso, a manutenção de plasmídeos Cl similares foi observada durante a seleção dos plasmídeos cl sob pressão de seleção de Cat ou sacarose.

As figuras 15A-B ilustram a estabilidade e a eficácia da manutenção dos plasmídeos cl (pPB829 e pPB838 contendo uma cópia do cassete sacB) nas culturas, incluindo a falta de rearranjo genético após a seleção em cloranfenicol ou sacarose. A manutenção de plasmideo eficiente e a estabilidade dos plasmídeos cl cultivados na presença de sacarose ou cloranfenicol foram observadas. Além disso, o rendimento de plasmideo (número de cópias) foi muito maior (de cerca de 700 por célula) quando as cepas hospedeiras parentais transformadas com pPB838 ou pPB829 foram cultivadas a 30 °C na presença de sacarose como pressão de seleção do que quando cultivadas na presença de Cat como a pressão de seleção. A manutenção e o rendimento do plasmideo foram altamente eficientes e o número de cópias foi duas vezes maior em comparação com as células cultivadas na presença de Cat. Esse melhor rendimento de plasmideo cl quando as células hospedeiras foram cultivadas na presença de sacarose foi devido ao promotor fraco (Pl) que controla a expressão cl. Na verdade, a expressão do repressor cl sob o controle do promotor fraco do gene de canamicina (Pl) teve um efeito positivo sobre o rendimento de plasmídeo para melhor contrabalançar a toxicidade do gene sacB colocado sob o controle do promotor ÀPr.

Como já foi demonstrado anteriormente (ver figura 11A) , os sistemas de antibiótico e não antibiótico são equivalentes em termos de manutenção do plasmídeo e seleção de células em crescimento que abrigam o plasmídeo cl. A figura 15B demonstra que o rendimento de plasmídeo (número de cópias) foi muito maior (aproximadamente 700 por célula) quando a cepa hospedeira parental transformada com pPB838 ou pPB829 foi cultivada na presença de sacarose como pressão de seleção, em vez de cultivada na presença de Cat como a pressão de seleção. A manutenção e o rendimento do plasmídeo foram altamente eficientes e o número de cópias foi duas vezes maior em comparação com as células cultivadas na presença de uma seleção de antibiótico, como Cat.

Exemplo 9:_____Manutenção e rendimentos do plasmídeo na ausência do gene antibiótico no plasmídeo cl: análise comparativa entre cepas de E. coli com um e dois cassetes sacB.

As figuras 15C-E ilustram a estabilidade e rendimento do plasmideo pPB885 sem cat nas cepas de E. coli com um e dois cassetes sacB (ApurN kPr::sacB+Qkan e ApurN ÀPr:: sacB+Qkan Aeda kPr: : sacB+Qcat, respectivamente). Ambas as cepas parentais ApurNfikPr: : sacB km (um cassete sacB) e ApurN&A.Pr::sacB km AedaQkPr:: sacB cat (dois cassetes sacB) foram transformadas com os plasmídeos pPB885 isentos de cat e incubadas durante 3 horas em LB antes do plaqueamento em placa de sacarose e subsequente cultivo (3 passagens) em meio de crescimento liquido LB suplementado com sacarose. 0 rendimento de plasmideo foi determinado em 3 passagens em LB suplementado com 5% e 10% de sacarose para as cepas de E. coli de dois e um cassete sacB, respectivamente. Os plasmídeos pPB885 foram extraídos de culturas mantidas a 37 °C e submetidas à eletroforese em gel. A digestão com restrição PvuII indica que nenhum rearranjo genético óbvio ocorreu em ambos os pPB885 durante a propagação e seleção com sacarose (ver figura 15D) . Como demonstrado neste gel, nenhum rearranjo genético óbvio ocorreu após a seleção com sacarose nas cepas hospedeiras de E. coli a 10% e 5% de um e dois cassetes sacB, respectivamente. A figura 15E ilustra o rendimento do plasmideo pPB885 sem cat em cepas de E. coli com um e dois cassetes sacB {ApurN /Pr: : sacB+Qkan e ApurN /Pr: : sacB+Qkan Aeda /Pr::sacB+Qcat, respectivamente). Interessantemente, o rendimento do plasmídeo (número de cópias) foi muito maior (cerca de 278 por célula) nos cassetes com dois sacB em comparação com o rendimento de plasmídeo (aproximadamente 142 por célula) obtido a partir da cepa de E. coli com um cassete sacB. 0 rendimento do plasmídeo obtido neste experimento parece menor do que o rendimento do plasmídeo obtido no estudo comparativo anterior (ver figura 15B) .

Isto é principalmente devido ao fato de que i) mais clones precisam ser avaliados após a transformação com pPB885 para identificar aquele que é o melhor e ii) além disso, a condição de crescimento da cepa de E. coli com dois cassetes sacB transformada com o plasmídeo pPB885 sem cat não foi otimamente cultivada. De fato, foi demonstrado que a condição de crescimento ótima para esta última cepa foi de cerca de 37 °C e cerca de 2% de sacarose (ou um pouco menos). No entanto, este resultado sugere que, sob condições de robustez ótima, o rendimento de plasmídeo poderia ser melhor em uma cepa de E. coli com dois cassetes sacB em comparação com a cepa de E. coli tendo um cassete sacB.

Exemplo 10:____Transfecção com plasmídeo cl sem antibiótico em células CHO A figura 15F e a Tabela 8 abaixo ilustram a eficácia de transfecção do plasmídeo (expressão GFP) em células CHO do plasmídeo sem antibiótico (pPB896/sacarose como pressão de seleção) e plasmídeo antibiótico (pCG105/Cat como pressão de seleção). Nenhuma diferença óbvia é observada em termos de proteína GFP expressa entre essas duas pressões de seleção (sacarose versus Cat como antibiótico). 0 plasmídeo pCG105 (plasmídeo derivado de pPB828 tendo o gene GFP colocado sob o controle do promotor CMV [propriedade da Merial]) e os plasmídeos pPB896 (plasmídeo pPB829 + Pl::gene cl + GFP) foram utilizados na transfecção de células CHO para avaliar a funcionalidade do conceito de plasmídeo sem antibiótico contra o plasmídeo antibiótico atual. Este experimento foi realizado utilizando os plasmídeos isolados da cultura da cepa hospedeira de E. coli tendo um cassete sacB. 0 pCG105 foi propagado em E. coli utilizando canamicina como pressão de seleção, enquanto o pPB896 foi propagado em E. coli utilizando sacarose a 10% como pressão de seleção. Os plasmídeos de DNA foram extraídos e dosados na mesma concentração. A figura 15F ilustra a expressão in vitro da proteína GFP codificada por pCG105 e pPB896 após transfecção transiente de células CHO-K1 usando Lipofectamina 2000. Células CH0-K1 em 90% de confluência em placas com 6 cm de diâmetro foram transfectadas com 5 μς de plasmídeo e 10 pL de lipofectamina cada, de acordo com instruções do fabricante. Após a transfecção, as células foram cultivadas em meio MEM-Glutamax contendo 1% de SVF por 24 horas. As culturas foram coletadas e analisadas usando microscopia de fluorescência (figura 15G) e citometria de fluxo (FACS

Calibur [Becton Dickinson]) (Tabela 8). A figura 15F mostra que a epifiuorescência de GFP foi visualizada em ambas as células CHO-K1 transfectadas. Os plasmídeos pCG105 e pPB96 sob a pressão de seleção do cloranfenicol e sacarose foram capazes de transfectar as células CHO-K1 com eficiência comparável. A Tabela 8 mostra a eficácia de transfecção de CHO com os plasmídeos pCG105 e pPB896. Conforme indicado nesta tabela, a % comparável de células CHO expressando a proteína GFP foi determinada quando CHO foi transfectada com pCG105 (59% de GFP expressa) e pPB896 (48% de GFP expressa). Estes resultados validaram o uso do sistema plasmídeo sem antibiótico à base de sacarose para aplicação na transfecção de CHO e, por último, em fins de vacina de DNA.

Estes exemplos demonstram que o controle de um gene tóxico localizado no cromossomo pode ser alcançado com um repressor localizado em um plasmideo. 0 sistema é totalmente funcional na ausência de pressão seletiva de antibióticos. 0 sistema é estável durante cinco (5) passagens das células hospedeiras. 0 sistema permite que as células hospedeiras alcancem um alto número de cópias de plasmídeos por célula. O sistema é totalmente compatível com o uso de um meio de cultura sintético mínimo. k ·*· Tendo deste modo descrito em detalhes as modalidades preferidas da presente invenção, é preciso entender que a invenção definida pelos parágrafos acima não deve ser limitada aos detalhes particulares definidos na descrição acima, uma vez que muitas variações aparentes das mesmas são possíveis sem se afastar do espírito ou do escopo da presente invenção.

Todos os documentos citados ou mencionados neste documento ("documentos aqui citados") , e todos os documentos citados ou referenciados em documentos aqui citados, juntamente com quaisquer instruções do fabricante, descrições, especificações de produtos e fichas técnicas para quaisquer produtos do fabricante mencionados neste documento ou em qualquer documento incorporado por referência neste documento, ficam aqui incorporados por referência, e podem ser empregados na prática da invenção.

REIVINDICAÇÕES

Claims (14)

1. Cepa de hospedeiro bacteriano gram-negativo modificada caracterizada pelo fato de que compreende um plasmideo isento de genes de resistência à antibióticos, em que o referido plasmideo isento de genes de resistência à antibióticos compreende uma sequência de polinucleotídeos conforme estabelecida nas SEQ ID NOs.: 1, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, ou 59, e degeneradas das mesmas, que codifica uma proteína repressora de cl que possui uma sequência de polipeptídeos conforme estabelecida nas SEQ ID NOs.: 2, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 ou 58; e em que o hospedeiro bacteriano compreende um ou mais polinucleotídeos heterólogos em uma região não essencial do cromossomo bacteriano, em que o polinucleotídeo heterólogo codifica um produto que é tóxico ao hospedeiro, em que o polinucleotídeo heterólogo compreende um gene sacB que possui uma sequência de polinucleotídeos conforme estabelecida nas SEQ ID NOs.: 3, 61, 63, 65, 67, 69, 71 ou 73, que codifica uma proteína sacB que possui uma sequência de polipeptídeos conforme estabelecida nas SEQ ID NOs.: 4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 ou 74; e em que o polinucleotídeo heterólogo é operativamente ligado a um promotor do fago λ que possui uma sequência conforme estabelecida nas SEQ ID NO.: 5.

2. Cepa de hospedeiro bacteriano, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o hospedeiro bacteriano compreende duas ou mais cópias do polinucleotídeo heterólogo em uma região não essencial do cromossomo bacteriano.

3. Cepa de hospedeiro bacteriano, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o hospedeiro bacteriano é selecionado do grupo que consiste em Avibãcterium, Brucella, Escherichia coli, Haemophilus (por exemplo Haemophilus suis), Salmonella (por exemplo Salmonella enteridis, Salmonella typhimurium, Salmonella infantis), Shigella, Pasteurella e Rimeirella.

4. Cepa de hospedeiro bacteriano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a região não essencial compreende o gene deA ou um gene purN.

5. Cepa de hospedeiro bacteriano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o gene sacB que possui uma sequência de polinucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID NO.: 3 codifica uma proteína SacB que possui uma sequência polipeptídeos conforme estabelecida na SEQ ID NO.: 4.

6. Cepa de hospedeiro bacteriano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a cepa bacteriana compreende uma ou mais cópias de um polinucleotídeo tendo a sequência conforme estabelecida na SEQ ID NO.: 75.

7. Cepa de hospedeiro bacteriano, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a cepa bacteriana compreende duas cópias do polinucleotídeo da SEQ ID NO.: 75, em que uma cópia está inserida no gene deA e a outra cópia está inserida no gene purN do cromossomo hospedeiro.

8. Cepa de hospedeiro bacteriano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é operativamente ligado a um promotor.

9. Cepa de hospedeiro bacteriano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor PI ou um promotor cl nativo.

10. Cepa de hospedeiro bacteriano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o plasmídeo compreende ainda um polinucleotídeo heterólogo que codifica um imunógeno ou uma proteína.

11. Cepa de hospedeiro bacteriano, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo heterólogo é operativamente ligado a um promotor funcional em células eucarióticas ou procarióticas.

12. Cepa de hospedeiro bacteriano, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor CMV ou um promotor isolado de uma bactéria gram-negativa.

13. Método de produção de uma proteína ou um imunógeno caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: manipular uma cepa hospedeira de bactéria gram negativa que compreende um polinucleotídeo heterólogo inserido por substituição alélica em uma ou mais regiões não essenciais do cromossomo hospedeiro, em que o referido polinucleotídeo heterólogo codifica um produto que é toxico ao hospedeiro, em que o polinucleotídeo heterólogo compreende um gene sacB que possui uma sequência de polinucleotídeos conforme estabelecida nas SEQ ID NOs.: 3, 61, 63, 65, 67, 69, 71 ou 73, que codifica uma proteína sacB que possui uma sequência de polipeptídeos conforme estabelecida nas SEQ ID Nos.: 4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 ou 74; e em que o polinucleotídeo heterólogo é operativamente ligado a um promotor do fago λ que possui uma sequência conforme estabelecida nas SEQ ID NO.: 5; construir um plasmídeo de DNA que compreende uma sequência de polinucleotídeo conforme estabelecida nas SEQ ID Nos.: 1, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, ou 59, e degeneradas das mesmas, que codifica uma proteína repressora cl que possui uma sequência de polipeptídeos conforme estabelecida nas SEQ ID Nos.: 2, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 ou 58; e um gene que codifica um imunógeno ou uma proteína; transformar a cepa hospedeira bacteriana com o plasmídeo de DNA que compreende o polinucleotídeo que codifica a proteína repressora cl e o gene que codifica o imunógeno ou proteína; cultivar a cepa hospedeira bacteriana transformada na presença de sacarose a uma temperatura que varia de 30 °C a 42 °C; e recuperar o imunógeno ou proteína.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo heterólogo é inserido por substituição alélica em duas ou mais regiões não essenciais do cromossomo.