ES2600612T3

ES2600612T3 - Plásmido libre de antibióticos

Info

Publication number: ES2600612T3
Application number: ES10720510.6T
Authority: ES
Inventors: Jean-Christophe Audonnet; Edmond Jolivet
Original assignee: Merial Inc
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 2009-05-22
Filing date: 2010-05-24
Publication date: 2017-02-10
Anticipated expiration: 2030-05-24
Also published as: RU2011152377A; CA2761964C; WO2010135742A1; AU2010249325B2; US9217153B2; JP5918125B2; NZ596453A; EP3124613A1; BRPI1011048B1; LT2432884T; US10487334B2; CA2761964A1; EP3124613B1; KR20120016661A; CN102482679A; HRP20161397T1; US20100298419A1; PL2432884T3; DK2432884T3; JP2012527249A

Abstract

Una cepa hospedadora bacteriana gram negativa modificada genéticamente que comprende un plásmido sin fármacos en el que dicho plásmido sin fármacos comprende un polinucleótido que codifica una proteína represora cI y que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia que se expone en la SEQ ID NO: 1, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, o 59 y en el que la bacteria hospedadora comprende una o más copias de un polinucleótido heterólogo en una región no esencial del cromosoma bacteriano, en el que el polinucleótido heterólogo codifica un producto que es tóxico para el hospedador, en el que el polinucleótido heterólogo comprende un gen sacB que codifica una proteína sacB que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia que se expone en la SEQ ID NO: 4, 60, 62, 64, 66, 68,70, 72, o 74 y en el que el polinucleótido heterólogo está unido operativamente a un promotor del fago λ que tiene la secuencia que se expone en la SEQ ID NO: 5.

Description

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porcentaje de identidad de secuencia a nivel de nucleótidos.

La Figura 31 muestra las secuencias del promotor P1; promotor nativo cI, promotor λPr, promotor λPr + 5 'UTR + gen sacB, promotor P1 + gen cI, y promotor nativo cI + gen cI. 5

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0022] Hay que señalar que en esta descripción y en particular en las reivindicaciones, términos tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado que se le atribuye en la ley de

10 patentes de Estados Unidos; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye", y similares; y que términos tales como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de Estados Unidos, por ejemplo, permiten elementos no citados explícitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica anterior, o que afectan a una característica básica o novedosa de la invención.

15 [0023] A menos que se explique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece esta descripción. Los términos en singular "un", "una", y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, la palabra "o" está previsto que incluya "y", a

20 menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0024] Por "animal" se entiende mamíferos, aves y similares. Animal u hospedador incluye mamíferos y seres humanos. El animal se puede seleccionar del grupo que consiste en equinos (por ejemplo, caballos), caninos (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felinos (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos

25 salvajes, otros grandes felinos, y otros felinos, incluyendo guepardos y linces), ovinos (por ejemplo, ovejas), bovinos (por ejemplo, ganado vacuno), porcinos (por ejemplo, cerdo), aves (por ejemplo, pollo, pato, ganso, pavo, codorniz, faisán, loros, pinzones, halcón, cuervo, avestruz, emú y casuario), primates (por ejemplo, prosimios, tarsio, mico, gibón, mono), y peces. El término "animal" también incluye un animal individual en todas las etapas de desarrollo, incluyendo las etapas embrionaria y fetal.

30 [0025] Los términos "proteína", "péptido", "polipéptido" y "fragmento de polipéptido" se usan indistintamente en este documento para referirse a polímeros de restos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, y puede estar interrumpido por restos químicos distintos de aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de

35 aminoácidos que haya sido modificado naturalmente o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje o bioactivo.

[0026] El término "ácido nucleico" o "polinucleótido" se usa indistintamente y se refiere a ARN o ADN que es

40 lineal o ramificado, monocatenario o bicatenario, o un híbrido de los mismos. El término también abarca híbridos de ARN/ADN. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: un gen o fragmento génico, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas y cebadores de ácidos nucleicos. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados

45 y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos de unión, tales como fluororribosa y tiolato, y ramificaciones de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos se puede modificar adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación, con un componente de marcaje. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definición son las caperuzas, la sustitución de uno o más nucleótidos naturales con un análogo, y la introducción de medios para unir el polinucleótido a proteínas, iones metálicos, componentes de marcaje, otros

50 polinucleótidos o un soporte sólido. Los polinucleótidos se pueden obtener por síntesis química o derivados de un microorganismo.

[0027] El término "plásmido sin fármacos" o "plásmido libre de antibióticos" se usa de manera intercambiable y se refiere a un plásmido de ADN que no contiene un gen de selección de antibióticos.

55 [0028] El término "gen" se utiliza ampliamente para referirse a cualquier segmento de polinucleótidos asociado a una función biológica. Por lo tanto, los genes incluyen intrones y exones como en la secuencia genómica,

o solo las secuencias de codificación como en ADNc y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Por ejemplo, el gen también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o

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codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.

[0029] El objeto que se describe en el presente documento se refiere a un nuevo enfoque para la generación de vectores de plásmidos de ADN bacteriano eludiendo el uso de genes de resistencia a antibióticos para producir 5 vacunas más seguras y composiciones inmunogénicas.

[0030] El objeto que se describe en el presente documento demuestra un nuevo concepto para el mantenimiento de un alto número de copias de plásmidos dentro de una célula hospedadora de una bacteria gram negativa que se basa en tres componentes. El primer componente es una bacteria hospedadora gram negativa que

10 expresa un producto tóxico para la bacteria en condiciones de cultivo definidas en los que el gen tóxico se inserta en una región no esencial del cromosoma de la bacteria. El segundo componente es la presencia de un gen en el cromosoma de la bacteria gram negativa en el que el gen codifica un producto tóxico bajo el control de un promotor constitutivo que se puede regular estrictamente. El tercer componente es la expresión de un represor específico de un plásmido que regula el promotor unido operativamente al gen tóxico en el cromosoma del hospedador.

15 [0031] Las bacterias gram negativas contempladas en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Avibacterium, Brucella, Escherichia coli, Haemophilus (por ejemplo, Haemophilus suis), Salmonella (por ejemplo, Salmonella enteridis, Salmonella typhimurium, Salmonella infantis), Shigella, Pasteurella, y Rimeirella.

20 [0032] El gen tóxico es un gen sacB estructural que codifica la levansucrasa. El gen tóxico es un gen sacB estructural de Bacillus subtilis que codifica la levansucrasa de Bacillus subtilis. La expresión de sacB en su entorno natural es inofensiva para bacterias gram positiva, pero cuando se expresa en bacterias gram negativa, conduce a una muerte rápida de la bacteria transformada cuando se siembran en un medio que contiene sacarosa.

25 [0033] La presente invención utiliza una proteína sacB que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 o 74, y una de sus variantes o fragmentos. En otro aspecto más, la presente invención utiliza una proteína sacB que tiene al menos el 90%, al menos el 95%, 96%, 97%, 98%o 99%de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 o 74. En otro aspecto, la presente invención utiliza variantes de la proteína sacB identificada

30 anteriormente (SEQ ID NO: 4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 o 74), que se pueden preparar fácilmente por un experto en la materia usando técnicas de biología molecular muy conocidas. Las variantes son polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos al menos el 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idénticas a los polipéptidos de la invención, en particular a la secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 o 74.

35 [0034] En otro aspecto, la presente invención usa un polinucleótido, es decir, un gen sacB, que codifica una proteína sacB (levansucrasa), es decir, un polinucleótido que codifica una proteína sacB que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 o 74. En otro aspecto, la presente invención utiliza un polinucleótido que codifica una proteína sacB que tiene al menos el 90 %, al menos el 95%, 96%, 97%, 98% o

40 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 4, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 o 74 o una combinación de estos polipéptidos. En otro aspecto, la presente invención utiliza un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 3, 61, 63, 65, 67, 69, 71, o 73, o una de sus variantes. En otro aspecto más, la presente invención proporciona un polinucleótido que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con uno de un

45 polinucleótido que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 3, 61, 63, 65, 67, 69, 71, o 73, o una de sus variantes.

[0035] Un gen tóxico puede ser un ADN que se expresa como producto de un gen tóxico (una proteína o ARN tóxicos), o puede ser tóxico por sí mismo. Ejemplos de dichos productos génicos tóxicos son muy conocidos en

50 la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, endonucleasas de restricción (por ejemplo, DpnI), CcdA/CcdB (Maki S. et al., J. Mol. Biol. 256: 473-482, 1996) y los genes que matan a los hospedadores en ausencia de una función de supresión, por ejemplo kicB. Un gen tóxico como alternativa puede ser seleccionable in vitro, por ejemplo, un sitio de restricción.

55 [0036] Tal como se usa en el presente documento, el término "homólogos" incluye ortólogos, análogos y parálogos. Los análogos, ortólogos, y parálogos de un polipéptido de tipo silvestre pueden diferir de un polipéptido de tipo silvestre por modificaciones posteriores a la traducción, por diferencias en la secuencia de aminoácidos, o por ambas. En particular, los homólogos de la invención generalmente presentarán al menos el 80-85 %, 85-90 %, 90-95 %, o 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia, con la totalidad o parte de las secuencias del

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polipéptido o del polinucleótido de tipo silvestre, y presentarán una función similar.

[0037] "Variantes" está previsto que signifique secuencias sustancialmente similares. Para polinucleótidos, una variante comprende una supresión y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios dentro del 5 polinucleótido nativo y/o una sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en el polinucleótido nativo. En la presente memoria, un polinucleótido o polipéptido "nativo" comprende una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos de origen natural, respectivamente. Las variantes de un polinucleótido particular de la invención (es decir, el polinucleótido de referencia) también se pueden evaluar por comparación del porcentaje de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por una variante del polinucleótido y el polipéptido codificado

10 por el polinucleótido de referencia. La "variante" de una proteína está previsto que signifique una proteína derivada de la proteína nativa por supresión o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína y/o la sustitución de uno o más aminoácidos nativos en uno o más sitios en la proteína nativa. Las proteínas variantes englobadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir, tienen la capacidad de provocar una respuesta inmunológica.

15 [0038] Las variantes incluyen variantes alélicas. El término "variante alélica" se refiere a un polinucleótido o un polipéptido que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de una proteína y que existen dentro de una población natural (por ejemplo, una especie o una variedad de virus). Dichas variaciones alélicas naturales normalmente pueden dar lugar a una varianza del 1-5 % en un polinucleótido o un

20 polipéptido. Las variantes alélicas pueden identificarse por secuenciación de la secuencia del ácido nucleico de interés en diferentes especies, que se puede llevar a cabo fácilmente utilizando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético en esas especies. Todas y cada una de dichas variaciones del ácido nucleico y los polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes que son el resultado de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional del gen de interés está previsto que estén dentro del alcance de la invención.

25 [0039] El término "variación conservativa" se refiere a la sustitución de un resto de aminoácido por otro resto biológicamente similar, o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de tal manera que el resto de aminoácido codificado no cambia o es otro resto biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas generalmente serán de naturaleza conservativa, como se describe anteriormente.

30 [0040] Los polinucleótidos de la descripción incluyen secuencias que están degeneradas como resultado del código genético, por ejemplo, el uso de codones optimizados para un hospedador específico. En la presente memoria, "optimizado" se refiere a un polinucleótido que se manipula genéticamente para aumentar su expresión en una especie dada. Para proporcionar polinucleótidos optimizados que codifican para los polipéptidos de la presente

35 invención, la secuencia de ADN del polipéptido se puede modificar para 1) comprender codones preferidos por genes altamente expresados en una especie en particular; 2) comprender un contenido de A + T o G + C en la composición de bases de nucleótidos para que sustancialmente se encuentre en dicha especie; 3) formar una secuencia de iniciación de dicha especie; o 4) eliminar las secuencias que provocan la desestabilización, poliadenilación inapropiada, degradación y terminación de ARN, o que forman las horquillas de la estructura

40 secundaria o sitios de empalme de ARN. El aumento de expresión del polipéptido de la presente invención, tal como una proteína sacB o una proteína represora cI, en dichas especies se puede conseguir mediante la utilización de la frecuencia de distribución del uso de codones en células eucariotas y procariotas, o en una especie en particular. El término "frecuencia de uso de codón preferido" se refiere a la preferencia exhibida por una célula hospedadora específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Hay 20 aminoácidos naturales,

45 la mayoría de los cuales están especificados por más de un codón. Por lo tanto, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas están incluidas en la descripción, siempre que la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos quede funcionalmente inalterada.

[0041] La "identidad" con respecto a secuencias puede referirse al número de posiciones con nucleótidos o

50 aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias en el que la alineación de las dos secuencias se puede determinar de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman). Cuando se dice que las secuencias de ARN son similares o tienen un grado de identidad de secuencia u homología con secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual al uracilo

(U) en la secuencia de ARN. Por lo tanto, las secuencias de ARN están dentro del alcance de la invención y pueden

55 derivarse de secuencias de ADN, con la timidina (T) en la secuencia de ADN que se considera igual al uracilo (U) en las secuencias de ARN. La identidad de secuencia o similitud de secuencia de dos secuencias de aminoácidos, o la identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar utilizando el paquete de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).

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otro aspecto, la concentración de sacarosa puede variar de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 20 %, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 15 %, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 10 %. En otro aspecto más, la concentración de sacarosa puede variar de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 10 %, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 2 %, de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 5 3 %, de aproximadamente el 3 % a aproximadamente el 4 %, de aproximadamente el 4 % a aproximadamente el 5 %, de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 6 %, de aproximadamente el 6 % a aproximadamente el 7 %, de aproximadamente el 7 % a aproximadamente el 8 %, de aproximadamente el 8 % a aproximadamente el 9 %, o de aproximadamente el 9 % a aproximadamente el 10 %. En otro aspecto más, la concentración de sacarosa puede ser de aproximadamente el 1 %, de aproximadamente el 2 %, de aproximadamente el 3 %, de

10 aproximadamente el 4 %, de aproximadamente el 5 %, de aproximadamente el 6 %, de aproximadamente el 7 %, de aproximadamente el 8 %, de aproximadamente el 9 %, o de aproximadamente el 10 %.

[0079] En un aspecto de la realización, la temperatura puede oscilar de aproximadamente 30 ºC a aproximadamente 42 ºC. En otro aspecto, la temperatura puede oscilar de aproximadamente 30 ºC a 15 aproximadamente 41 ºC, de aproximadamente 30 ºC a aproximadamente 39 ºC, de aproximadamente 30 ºC a aproximadamente 38 ºC, de aproximadamente 30 ºC a aproximadamente 37 ºC. En otro aspecto más, la temperatura puede ser de aproximadamente 30 ºC, de aproximadamente 31 ºC, de aproximadamente 32 ºC, de aproximadamente 33 ºC, de aproximadamente 34 ºC, de aproximadamente 35 ºC, de aproximadamente 36 ºC, de aproximadamente 37 ºC, de aproximadamente 38 ºC, de aproximadamente 39 ºC, de aproximadamente 40 ºC, o de

20 aproximadamente 41 ºC.

[0080] El término recuperación incluye pero no se limita a la recogida, extracción, recolección, o purificación del medio de cultivo.

25 [0081] Un componente biológico "aislado" (tal como un polinucleótido, plásmido de ADN, proteína u orgánulo) se refiere a un componente que se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el que se produce naturalmente el componente, por ejemplo, otros ADN y ARN, proteínas y orgánulos cromosómicos y extra-cromosómicos. Los polinucleótidos (incluyendo plásmidos de ADN) y proteínas que se han "aislado" incluyen polinucleótidos y proteínas purificadas mediante procedimientos de purificación

30 convencionales, por ejemplo, véase Russell, David W.; Sambrook, Joseph (2001), Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory. El término también abarca polinucleótidos y proteínas preparados por tecnología recombinante, así como síntesis química.

[0082] El término "purificado" tal como se usa en el presente documento no requiere una pureza absoluta;

35 más bien, está previsto como término relativo. Así, por ejemplo, una preparación de polipéptido o polinucleótido purificado es una en la que el polipéptido o polinucleótido está más enriquecido que el polipéptido o polinucleótido que se encuentra en su entorno natural. Es decir, el polipéptido o polinucleótido está separado de los componentes celulares. Por "sustancialmente purificado" está previsto que al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o al menos el 98 %, o más de los componentes o materiales celulares se hayan

40 eliminado. Del mismo modo, el polipéptido o polinucleótido pueden estar parcialmente purificados. Por "parcialmente purificado" está previsto que se elimine menos del 60 % de los componentes o materiales celulares.

[0083] Se describen procedimientos para inducir una respuesta inmunológica o de protección en un animal, que comprende administrar al animal una composición inmunológica, una vacuna o una composición de acuerdo con

45 la invención. Las respuestas inmunitarias producidas son en particular una respuesta inmunológica de anticuerpos y/o celular y, en particular, una respuesta de interferón gamma.

[0084] En particular, se describen procedimientos para inmunizar, o prevenir o reducir los síntomas causados por la infección de un animal por un organismo patógeno (por ejemplo, la infección por un virus, bacteria, hongo o 50 parásito protozoario). El procedimiento de la presente invención es útil en animales vertebrados, incluyendo, pero no limitado a, seres humanos, animales de la especie canina (por ejemplo, perros), felina (por ejemplo, gatos); equina (por ejemplo, caballos), bovina (por ejemplo, ganado vacuno) y porcina (por ejemplo, cerdos), así como aves incluyendo, pero no limitado a, pollos, pavos, patos, gansos, codorniz, faisán, loros, pinzones, halcones, cuervos y aves corredoras (avestruz, emú, casuario, y similares). El procedimiento descrito también es útil para proporcionar

55 vacunas de ADN de peces.

[0085] Estos procedimientos descritos consisten en la vacunación de hembras preñadas antes del parto mediante la administración de una composición de vacuna fabricada de acuerdo con la invención. Estos procedimientos incluyen además la inducción de anticuerpos protectores provocados por el protocolo de vacunación

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y la transferencia de estos anticuerpos protectores de las hembras preñadas vacunadas a su descendencia. La transferencia de dichos anticuerpos maternos protege posteriormente a la descendencia de la enfermedad.

[0086] La dosificación de la composición de la vacuna descrita dependerá de la especie, la raza, la edad, el

5 tamaño, el historial de vacunación, y el estado de salud del animal a vacunar. Otros factores como la concentración de antígeno, componentes adicionales de la vacuna, y la vía de administración (es decir, subcutánea, intradérmica, oral, intramuscular o intravenosa) también afectarán a una dosificación eficaz. La dosificación de la vacuna a administrar se puede determinar fácilmente en base a la concentración de antígeno de la vacuna, la vía de administración, y la edad y condición del animal a vacunar. Cada lote de antígeno se puede calibrar individualmente.

10 Como alternativa, se pueden utilizar ensayos metódicos de inmunogenicidad de dosificaciones diferentes, así como estudios de MDP (mínima dosis de protección) y otros procedimientos de selección para determinar las dosificaciones eficaces para una composición de vacuna de acuerdo con la presente invención sin experimentación indebida. A partir de los ejemplos presentados a continuación, será fácilmente evidente qué dosis aproximada y qué volumen aproximado serían apropiados para el uso de la composición de vacuna descrita en este documento. El

15 factor crítico es que la dosificación proporcione por lo menos un efecto protector parcial contra la infección natural, como se pone en evidencia por una reducción en la mortalidad y la morbilidad asociada a la infección natural. Asimismo, el volumen apropiado se determina fácilmente por alguien experto en la materia. Por ejemplo, en especies de aves el volumen de una dosis puede ser de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 0,5 ml y, de forma ventajosa, de aproximadamente 0,3 ml a aproximadamente 0,5 ml. Para felinos, caninos y equinos, el volumen

20 de una dosis puede ser de aproximadamente 0,2 ml a aproximadamente 3,0 ml, de forma ventajosa de aproximadamente 0,3 ml a aproximadamente 2,0 ml, y de forma más ventajosa, de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 1,0 ml. Para bovinos y porcinos, el volumen de dosis puede ser de aproximadamente 0,2 ml a aproximadamente 5,0 ml, de forma ventajosa de aproximadamente 0,3 ml a aproximadamente 3,0 ml, y de forma más ventajosa de 0,5 ml a aproximadamente 2,0 ml.

25 [0087] Pueden ser preferibles vacunaciones repetidas a intervalos de tiempo periódicos para aumentar la respuesta inmunológica inicial o cuando haya transcurrido un largo período de tiempo desde la última dosis.

[0088] La composición de vacuna se puede administrar como inyección parenteral (es decir, subcutánea,

30 intradérmica, o intramuscular). La composición se puede administrar como una sola dosis o, en realizaciones alternativas, se puede administrar en dosis repetidas de aproximadamente dos a aproximadamente cinco dosis administradas a intervalos de aproximadamente dos a aproximadamente seis semanas, preferentemente de aproximadamente dos a aproximadamente cinco semanas. Sin embargo, un experto en la materia reconocerá que el número de dosis y el intervalo de tiempo entre las vacunas depende de una serie de factores que incluyen, pero no

35 están limitados a, la edad del animal vacunado; la condición del animal; la vía de inmunización; la cantidad de antígeno disponible por dosis; y similares. Para la vacunación inicial, el periodo generalmente será más largo que una semana y preferentemente estará entre aproximadamente dos a aproximadamente cinco semanas. Para animales vacunados previamente, se podrá realizar una vacuna de refuerzo, antes o durante el embarazo, a intervalos de un año aproximadamente.

40 [0089] También se contempla la administración de una composición de vacuna usando un inyector sin aguja tal como Pigjet®, Avijet®, Dermojet® o Biojector® (Bioject, Oregon, EE.UU.). Un experto en la materia es capaz de ajustar las especificaciones del inyector según sea necesario con respecto a factores tales como la especie del animal a vacunar; la edad y el peso del animal, y similares, sin experimentación indebida.

45 [0090] La presente invención describe además un kit que comprende un primer vial que contiene un ingrediente activo tal como un inmunógeno o una composición farmacéutica y, en un segundo vial, un diluyente preparado de acuerdo con la presente invención. El inmunógeno puede estar en forma liofilizada, en forma seca o en solución acuosa tal como se describe en el presente documento.

50 [0091] La invención se describirá ahora con mayor detalle por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS

55 Ejemplo 1: Concepto de mantenimiento del plásmido libre de antibióticos

[0092] El siguiente ejemplo demuestra un nuevo concepto para el mantenimiento de un alto número de copias de plásmidos dentro de una célula hospedadora gram negativa que se basa en tres componentes:

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Biomedicals, CA, EE.UU.) y se preparó una segunda ronda de PCR con los 6 fragmentos y sin cebadores. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: mezcla de PCR (final de 25 µl), 1 µl de cada fragmento de PCR, 2 µl de dNTP (2,5 mM cada uno, 5 µl de tampón de 5xPCR, 11,5 µl de agua destilada estéril, 0,5 µl de polimerasa ADN Phusion (Finenzymes, Finlandia); ciclos de PCR: 98 ºC 30 s, (98 ºC 10 s, 60 ºC 30 s, 72 ºC 5 min) * 15 ciclos y 72 ºC 5 10 min. La tercera ronda de amplificación por PCR se realizó con 1 µl del producto purificado de la segunda ronda mediante el uso de los cebadores PB1235 y PB1236 para purN (sustitución alélica) y los cebadores PB1237 y PB1238 para edA (sustitución alélica). Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: mezcla de PCR (final de 50 µl), 1 µl de fragmento de la segunda PCR, 1 µl de dNTP (2,5 mM cada uno, 10 µl de tampón 5xPCR, 37 µl de agua destilada estéril, 0,25 µl de cebador directo, 0,25 µl de cebador inverso, 0,5 µl de polimerasa ADN Phusion

10 (Finenzymes, Finlandia); ciclos de PCR: 98 ºC 30 s, (98 ºC 15 s, 60 ºC 30 s, 72 ºC 4 min) * 35 ciclos y 72 ºC 10 min. Los amplicones unidos en la PCR final (4007 pb para la sustitución alélica purN y 3407 pb para la sustitución alélica edA) se verificaron sobre gel de agarosa y se purificaron antes de la transformación en E. coli. Cada amplicón unido en la PCR se verificó mediante análisis de restricción.

15 [0106] El fragmento de ADN lineal (λ Pr::sacB Ω kan) que codifica un gen sacB puesto bajo el control del promotor λPr (SEQ ID NO: 75) y el gen de resistencia a Kan puesto bajo el control del promotor bla flanqueado por dos regiones largas homólogas a las secuencias de ADN que bordean el locus diana (edA o purN) se integró en el cromosoma de E. coli por electroporación. Se obtuvieron aproximadamente 300 transformantes candidatos (mutante único ΔpurN λPr::sacB Ωkan o ΔedA λPr::sacB Ωkan) en la placa de agar LB que contenía kanamicina como presión

20 selectiva. Se recogieron 20 colonias al azar y se purificaron mediante extensión en placas que contenían kanamicina y la inserción del casete λPr::sacB Ωkan en el locus edA o purN se verificó mediante PCR (véase Figura 9B). Se realizó una PCR utilizando PB1196 y PB1197 para verificar la inserción de la kanamicina en el cromosoma. Se realizó una PCR usando PB1192 y PB1193 para verificar la presencia del gen sacB en el cromosoma. Se realizó una PCR usando los cebadores PB1204 (SEQ ID NO: 23) (GTGGTGCTTATTTCCGGCAACGG) y PB1205 (SEQ ID

25 NO: 24) (CCAGCCACGCGGCGTTTTCGTGC) para verificar la ausencia de gen purN en el cromosoma. Se realizó una PCR usando PB1214 (SEQ ID NO: 25) (GACCACCGGCCCGGTTGTACCGG) y PB1215 (SEQ ID NO: 26) (CGGACCCGCGATCGCCTGCAGG) para verificar la ausencia de gen edA) (véase Figura 9B). Se realizó una PCR usando los cebadores PB1213 (SEQ ID NO: 27) (GGTGGATGGCGTCCATTTCTGTGC) y PB1196 para verificar la inserción derecha y correcta del casete en el locus edA. Se realizó una PCR usando los cebadores PB1212 (SEQ ID

30 NO: 28) (CAAAAGTGTTAAGCGGTAACCTG) y PB1233 para verificar la inserción izquierda y correcta del casete en el locus edA. Se realizó una PCR usando los cebadores PB1203 y PB 1196 para verificar la inserción derecha y correcta del casete en el locus purN. Se realizó una PCR usando los cebadores PB1202 y PB1233 para verificar la inserción izquierda y correcta del casete en el locus purN (véase Figura 9C). Todos los controles de la PCR confirmaron la integración en los loci correctos. Además, también se ha confirmado la funcionalidad del gen sacB,

35 como se muestra en la Figura 10. La cepa parental manipulada genéticamente ΔpurN λPr::sacB Ωkan era incapaz de crecer en la placa de agar LB que contenía sacarosa (Figura 10).

[0107] El fragmento de ADN lineal (λ Pr::sacB Ωcat) que codifica un gen sacB (puesto bajo el control del promotor λPr) y un gen de resistencia a Cat (puesto bajo el control de su promotor cat natural) flanqueado por dos 40 regiones largas homólogas a las secuencias de ADN que bordean el locus diana (edA) se integra en el cromosoma de la cepa de E. coli ΔpurN λPr::sacB Ωkan mediante electroporación. Se obtuvieron aproximadamente 200 candidatos transformantes (mutante doble ΔpurN λPr::sacB Ωkan ΔedA λPr::sacB Ω cat) en la placa de agar LB que contiene cloranfenicol como presión selectiva. Se recogieron 20 colonias y se purificaron al azar por extensión en cloranfenicol y la inserción del casete λPr::sacB Ω cat en el locus edA se verificó por PCR (véase Figura 9C) usando

45 el juego de cebadores PB1212 y PB1213 (véase Figura 9C). El producto de la PCR se verificó por secuenciación para validar la identidad del λPr::sacB Ωcat.

[0108] La modificación genética de la cepa hospedadoraa se ilustra en la Figura 8D. La Figura 8E ilustra la coexistencia de la cepa hospedadora (un casete sacB [λ Pr::sacB Ωkan]) y el plásmido sin fármacos. La genotipo

50 inicial de E. coli es KanS, CatS, SacarosaR. La integración del casete en el cromosoma de E. coli ΔpurN Prλ::sacBΩKan generó un nuevo genotipo, KanR, CatS, SacarosaS. La introducción del plásmido que alberga el represor cI genera el genotipo final, KanR, CatR, SacarosaR.

Ejemplo 3: Generación de plásmidos que albergan el casete de expresión del represor cI (plásmidos pPB83855 pPB844 a pPB847-pPB885-pPB896)

Resumen de la construcción de plásmidos

[0109] Se generaron los plásmidos derivados de pPB828 como pPB829 y pPB844-pPB847 que contienen el

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Claims

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