PT1881845E

PT1881845E - Vacinas de vírus nipah

Info

Publication number: PT1881845E
Application number: PT06750224T
Authority: PT
Inventors: Jean Christophe Francis Audonnet
Original assignee: Merial Ltd
Priority date: 2005-04-25
Filing date: 2006-04-14
Publication date: 2010-05-31
Also published as: EP1881845A2; ES2343270T3; DE602006013117D1; HRP20100314T1; US20070031455A1; US8420389B2; HK1120730A1; US7803612B2; PL1881845T3; WO2006115843A2; CN101208104A; US20100278862A1; CA2605629A1; RS51324B; ATE461710T1; DK1881845T3; CN101208104B; SI1881845T1; WO2006115843A3; CA2605629C

Description

DESCRIÇÃO "VACINAS DE VÍRUS NIPAH"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a vacinas recombinantes contra o virus Nipah e à administração de tais vacinas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 virus Nipah é um membro da família Paramyxoviridae e está relacionado com o vírus Hendra (anteriormente denominado morbilivírus equino). 0 vírus Nipah foi inicialmente isolado em 1999, após exame de amostras de um surto de encefalite e doença respiratória entre homens adultos na Malásia e Singapura (ver, e. g., Chua et al., Lancet, 9 de Outubro de 1999; 354 (9186): 1257-9 e Paton et al.r Lancet. 9 de Outubro de 1999; 354(9186): 1253-6). 0 hospedeiro para o vírus Nipah é ainda desconhecido, mas suspeita-se que os morgegos frugívoros (morcegos do género Pteropus) sejam o hospedeiro natural.

Em virtude de alterações nas condições ecológicas, os morgegos frugívoros estão, cada vez mais, a entrar em contacto com humanos e animais domésticos. Por conseguinte, é concebível que os vírus nos morgegos frugívoros possam infectar animais domésticos e humanos, o que poderá resultar numa doença mais virulenta, possivelmente fatal. 0 vírus Nipah causou uma doença relativamente moderada em porcos na Malásia e Singapura e o 1 vírus foi transmitido a humanos, gatos e cães através de contacto próximo com porcos infectados.

A infecciosidade com o vírus Nipah em humanos foi associada a uma encefalite, caracterizada por febre e sonolência, e doença mais séria do sistema nervoso central, tais como coma, convulsões e incapacidade de manter a respiração (ver, e. g., Lee et al., Ann Neurol. Setembro de 1999; 46(3): 428-32). A doença com o vírus Nipah começa com 3-14 dias de febre e dor de cabeça, seguido de sonolência e desorientação caracterizada por confusão mental. Estes sinais e sintomas podem progredir para coma, no espaço de 24-48 horas. Alguns doentes têm tido uma doença respiratória durante a parte inicial das suas infecções. A doença nervosa séria com encefalite de vírus Nipah tem sido marcada por algumas sequelas, tais como convulsões persistentes e alterações de personalidade. Durante o surto da doença do vírus Nipah em 1998-1999, cerca de 40% dos doentes com doença nervosa séria que entraram nos hospitais, morreram da doença (ver, e. g. , Lam & Chua, Clin Infect Dis. 1 de Maio de 2002; 34 Supl. 2:S48-51) .

Consequentemente, um objectivo da saúde animal é o melhoramento da saúde humana por intermédio de prevenção da transmissão de doença entre animais e/ou humanos. A infecção de vírus Nipah pode ser prevenida evitando animais que se sabe estarem infectados e utilizando dispositivos de equipamento de protecção pessoal apropriados, quando é necessário entrar em contacto com animais potencialmente infectados. O fármaco ribavirina demonstrou ser eficaz contra o vírus Nipah in vitro, contudo, não foram realizadas 2 investigações de fármaco controladas e a utilidade clinica é incerta.

Se um programa eficiente para prevenir ou tratar a infecção de vírus Nipah for desenvolvido, irá ser necessário definir os antigénios virais que são importantes na indução de respostas protectoras e formular potenciais tratamentos imunoprofilácticos. As glicoproteínas de conjugação (G) e fusão (F) do vírus Nipah foram implicadas como antigénios virais (ver, e. g. , Bossart et al., J Virol. Novembro de 2002; 76 (22): 11186-98 e Guillaume et al., J Virol. Janeiro de 2004; 78(2): 834-40). Quando expressas como recombinantes do vírus vaccinia, as glicoproteínas do vírus Nipah (G e F) induziram uma resposta imunitária em hámsteres que protegeu contra uma provocação letal por vírus Nipah (ver, e. g., Guillaume et al., J Virol., Janeiro de 2004; 78(2): 834-40). Contudo, foi observado que em imunização activa e passiva, a resposta de anticorpo contra o vírus Nipah foi fortemente estimulada, sugerindo que a eficácia da imunização está relacionada com a capacidade de o vector para se replicar.

Consequentemente, existe uma necessidade na técnica para uma vacina de vírus Nipah eficaz e fiável, onde sejam expressas proteínas heterólogas com replicação limitada ou não produtiva. A referência ou identificação de qualquer documento neste pedido não é uma admissão de que tal documento consista técnica anterior para a presente invenção. 3

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção é baseada, em parte, no desenvolvimento de uma vacina recombinante eficaz que imuniza porcos contra o virus Nipah, com um vector de variola dos canários atenuado, codificando uma glicoproteina do virus Nipah, de modo a que possa existir expressão das proteínas heterólogas com replicação limitada ou não produtiva. A invenção refere-se a um vector de expressão do vírus da varíola dos canários, abrangendo um polinucleótido que codifica uma glicoproteina do vírus Nipah. Numa forma de realização, a glicoproteina do vírus Nipah pode ser a proteína de conjugação (G) . De um modo vantajoso, o polinucleótido pode compreender a sequência de bases nucleotídicas do nucleótido 8943 até aonucleótido 10751 da SEQ ID N° 1 ou o polinucleótido codifica o péptido da SEQ ID N° 8. Noutra forma de realização, a glicoproteina do vírus Nipah pode ser a proteína de fusão (F) . De um modo vantajoso, o polinucleótido pode compreender a sequência de bases nucleotídicas do nucleótido 6654 até ao nucleótido 8294 da SEQ ID N° 1 ou o polinucleótido codifica o péptido da SEQ ID N° 7. Ainda noutra forma de realização, a glicoproteina do vírus Nipah pode ser a proteína de conjugação (G) e a proteína de fusão (F). De um modo vantajoso, o polinucleótido pode compreender a sequência de bases nucleotídicas do nucleótido 6654 até ao nucleótido 8294 e a sequência de bases nucleotídicas do nucleótido 8943 até ao nucleótido 10751 da SEQ ID N° 1 ou o polinucleótido codifica o péptido da SEQ ID N° 7 e SEQ ID N° 8. 4 0 vector de expressão é um vector de varíola dos canários. De um modo vantajoso, o vector de varíola dos canários pode ser ALVAC. A invenção abrange uma formulação para distribuição e expressão de uma glicoproteína do vírus Nipah, em que a formulação pode compreender qualquer um dos vectores anteriormente descritos e um veículo, transportador ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Numa forma de realização, o transportador, veículo ou excipiente pode facilitar a infecção e/ou melhora a preservação do vector. É divulgado um método de distribuição de uma glicoproteina do vírus Nipah a um animal, compreendendo a administração de uma formulação anterior a um animal. De um modo vantajoso, o animal é um porco. É divulgado um método de dedução de uma resposta imunitária num animal que pode compreender a administração de uma composição que pode compreender qualquer um dos vectores anteriormente descritos, numa quantidade eficaz para a dedução de uma resposta imunitária. É divulgado um método de dedução de uma resposta imunitária num animal que pode compreender a administração de uma composição que pode compreender uma célula, em que a célula pode compreender qualquer um dos vectores anteriormente descritos, numa quantidade eficaz para a dedução de uma resposta imunitária. De um modo vantajoso, o animal é um porco. É divulgado um método de indução de uma resposta imunológica ou protectora num animal que pode compreender a administração de uma composição que pode compreender qualquer um dos vectores anteriormente descritos, numa quantidade eficaz 5 para a dedução de uma resposta imunitária. É divulgado um método de indução de uma resposta imunológica ou protectora num animal que pode compreender a administração de uma composição que pode compreender uma célula, em que a célula pode compreender qualquer um dos vectores anteriormente descritos, numa quantidade eficaz para a dedução de uma resposta imunitária. De um modo vantajoso, o animal é um porco. É, também, divulgado um kit para a realização de qualquer dos métodos anteriormente descritos, compreendendo qualquer das composições anteriormente descritas e, opcionalmente, instruções para a realização do método.

Importa notar que nesta divulgação e, particularmente, nas reivindicações e/ou parágrafos, os termos tais como "compreende", "compreendido", "compreendendo" e semelhantes podem significar "inclui", "incluído", "incluindo", e semelhantes; e que os termos tais como "consistindo essencialmente em" e "consiste essencialmente em" admitem elementos não explicitamente descritos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A seguinte descrição detalhada, proporcionada a título exemplificativo mas não pretendendo limitar a invenção unicamente às formas de realização específicas descritas, pode ser mais bem compreendida em conjunto com os desenhos anexos, particularmente na medida que tais desenhos pertencem à presente invenção como definida nas reivindicações: 6 A FIG. 1 ilustra as sequências nucleotídicas (FIG. IA) e de aminoácidos (FIG. 1B) do vírus Nipah. Ver, e. g., Genbank N° de Acesso NC_002728, Chua et ai., Science. 26 de Maio de 2000; 288 (5470) :1432-5; Harcourt et al., Virology. 15 de

Agosto de 2001; 287(1):192-201; Chan et ai., J Gen Virol.

Setembro de 2001; 82 (Pt 9) :2151-5 e Chua et ai., Microbes

Infect. Fevereiro de 2002; 4(2):145-51, cujas divulgações são incorporadas por referência na sua totalidade. A FIG. 2 ilustra a construção do plasmídeo pSL-6802-1-4. A FIG. 2A é um mapa das regiões codificantes do vírus Nipah. A FIG. 2B ilustra os oligonucleótidos de PCR para a amplificação do gene Nipah G. A FIG. 2C ilustra a construção de pSL-6802-1-4. A FIG. 2D é a sequência nucleotídica dos braços esquerdo e direito e da cassete de expressão com tradução do gene G do vírus Nipah. A FIG. 3 ilustra a construção do plasmídeo pSL-6802-2-5. A FIG. 3A ilustra os oligonucleótidos de PCR para a amplificação do gene Nipah G. A FIG. 3B ilustra a construção de pSL-6802-2-5. A FIG. 3C é a sequência nucleotídica dos braços esquerdo e direito e da cassete de expressão com tradução do gene G do vírus Nipah. A FIG. 4 ilustra a construção do plasmídeo pSL-6839-1. A FIG. 4A é um mapa do vírus Nipah e antigénio de vacina. A FIG. 4B ilustra os oligonucleótidos de PCR para a amplificação do gene Nipah F. A FIG. 4C ilustra a construção de pSL-6839-1. A FIG. 4D é a sequência nucleotídica dos braços esquerdo e direito e da cassete de expressão com tradução do gene F do vírus Nipah. 7 A FIG. 5 ilustra a construção do plasmídeo pSL-6851-29. A FIG. 5A ilustra os oligonucleótidos de PCR para a amplificação do gene Nipah F. A FIG. 5B é um diagrama de plasmídeo de pSL-6851-29. A FIG. 5C é a sequência nucleotídica dos braços esquerdo e direito e da cassete de expressão com tradução do gene F do vírus Nipah. A FIG. 6 ilustra uma transferência Western de Nipah G. A pista 1 era o supt de ALVAC,a pista 2 era o supt de vCP2199 (ALVAC Nipah G),a pista 3 era o supt de vCP2199 (ALVAC Nipah G) , a pista 4 era o supt da varíola das aves de capoeira,a pista 5 era o vFP2200 supt (Nipah G de varíola das aves de capoeira), a pista 6 era o supt de VFP2200 (Nipah G de varíola das aves de capoeira), a pista 7 era marcadores (177, 6, 113,9, 81,2, 60, 7, 47, 4, 36, 1, 25,3, 19,0, 14,7, 6,1 kDa,a pista 8 era o sedimento de ALVAC,a pista 9 era o sedimento de vCP2199,a pista 10 era o sedimento de vCP2199,a pista 11 era o sedimento de varíola das aves de capoeira, a pista 12 era o sedimento de VFP2200 ea pista 13 era o sedimento de vFP2200. A FIG. 7 ilustra uma imunotransferência de Nipah F. A FIG. 7A foi transferida com anti-soro de cobaio. A FIG. 7B foi transferida com anti-soro porcino. O gel N° 1 era os recombinantes Nipah F (apenas sedimentos). A pista 1 era um espaço, a pista 2 era Varíola das aves de capoeira, a pista 3 era vFP2207,a pista 4 era vFP2207,a pista 5 era um espaço, a pista 6 era ALVAC, a pista 7 era cvCP2208,a pista 8 era marcador 170, 130, 100, 72, 55, 40, 33, 24 kDa e as pistas 9 e 10 era espaços. O gel N° 2 era os recombinantes Nipah F (apenas sobrenadante) . A pista 1 era um espaço, a pista 2 era Varíola das aves de capoeira, a pista 3 era vFP2207,a pista 4 era vFP2207,a pista 5 era Marcador 170, 130, 100, 72, 55, 40, 33, 24 kDa, a pista 6 era um espaço,a pista 7 era ALVAC,a pista 8 era um espaço, a pista 9 era vCP2208 ea pista 10 era um espaço.

DESCRIÇÃO DETALHADA A invenção é baseada, em parte, no desenvolvimento de uma vacina recombinante eficaz contra o vírus Nipah. A invenção refere-se a uma vacina contra o vírus Nipah.

Um gene do vírus Nipah é codificado dentro de um vector de expressão, o gene do vírus Nipah codifica uma glicoproteína. Numa forma de realização particularmente vantajosa, o gene do vírus Nipah codifica a glicoproteína de conjugação (G) . Noutra forma de realização particularmente vantajosa, o gene do vírus Nipah codifica a glicoproteína de fusão (F). 0 vector de expressão é um vector de varíola dos canários. Numa forma de realização particularmente vantajosa, o vector é um vector de varíola dos canários atenuado. De um modo vantajoso, o vector de varíola dos canários atenuado é ALVAC. A proteína do vírus Nipah codificada pelo vector de expressão é uma glicoproteína. Numa forma de realização particularmente vantajosa, a proteína do vírus Nipah é a glicoproteína de conjugação (G) , de um modo vantajoso com a sequência da SEQ ID N° 8. Noutra forma de realização particularmente vantajosa, a proteína do vírus Nipah é a glicoproteína de fusão (F) , de um modo vantajoso com a sequência da SEQ ID N° 7. 9

Numa forma de realização particularmente vantajosa da invenção, as construções recombinantes são a construção ALVAC expressando Nipah G, designada como vCP2199, a construção ALVAC expressando Nipah F, designada como vCP2208.

As proteínas do vírus Nipah incluem, em geral, a proteína da nucleocápside (de um modo vantajoso, SEQ ID N° 2), fosfoproteína (de um modo vantajoso, SEQ ID N° 3), proteína V (de um modo vantajoso, SEQ ID N° 4), proteína C (de um modo vantajoso, SEQ ID N° 5), proteína de matriz (de um modo vantajoso, SEQ ID N° 6) ou polimerase (de um modo vantajoso, SEQ ID N° 9).

Os termos "proteína", "péptido", "polipéptido" e "fragmento polipeptídico" são aqui utilizados alternadamente para referirem polímeros de resíduos de aminoácidos de qualquer comprimento. 0 polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados ou análogos de aminoácidos e pode ser interrompido por grupos químicos com excepção de aminoácidos. Os termos abrangem, também, um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfureto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como uma conjugação com um componente de marcação ou bioactivo. 0 gene do vírus Nipah utilizado na invenção codifica uma glicoproteína. Numa forma de realização particularmente vantajosa, o gene do vírus Nipah codifica a glicoproteína de conjugação (G) , de um modo vantajoso, os nucleótidos 8943 a 10751 da SEQ ID N° 1. Noutra forma de realização particularmente 10 vantajosa, o gene do vírus Nipah codifica a glicoproteína de fusão (F) , de um modo vantajoso os nucleótidos 6654 a 8294 da SEQ ID N° 1.

Os genes do vírus Nipah incluem, em geral, a proteína de nucleocápside (de um modo vantajoso, os nucleótidos 113 a 1711 da SEQ ID N° 1), f osf oproteína (de um modo vantajoso, nucleótidos 2406 a 4535 da SEQ ID N° 1), proteína V (de um modo vantajoso, nucleótidos 2406 a 3775 da SEQ ID N° 1), proteína C (de um modo vantajoso, nucleótidos 2428 a 2928 da SEQ ID N° 1), proteína de matriz (de um modo vantajoso, nucleótidos 5108 a 6166 da SEQ ID N° 1) ou polimerase (de um modo vantajoso, nucleótidos 11259 a 18213 da SEQ ID N° 1).

Um "polinucleótido" é uma forma polimérica de nucleótidos de qualquer comprimento que contém desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos e análogos em qualquer combinação. Os polinucleótidos podem ter estrutura tridimensional e podem realizar qualquer função, conhecida ou desconhecida. O termo "polinucleótido" inclui moléculas de cadeia dupla, de cadeia simples e helicoidal tripla. Salvo especificado ou requerido em contrário, qualquer forma de realização da invenção aqui descrita que seja um polinucleótido, abrange a forma de cadeia dupla, como cada das duas formas complementares conhecidas ou ou previstas por compreenderem a forma de cadeia dupla da molécula de ADN, ARN ou híbrida.

Os seguintes são exemplos não limitativos de polinucleótidos: um gene ou fragmento génico, exões, intrões, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plasmídeos, vectores, ADN isolado de qualquer sequência, ARN isolado de 11 qualquer sequência, sondas e iniciadores de ácidos nucleicos. Um polinucleótido pode compreender nucleótidos modificados, tais como nucleótidos metilados e análogos de nucleótidos, uracilo, outros açúcares e grupos de ligação, tais como fluororribose e tiolato e ramificações nucleotidicas. A sequência de nucleótidos pode ser adicionalmente modificada após polimerização, tal como por conjugação, com um componente de marcação. Outros tipos de modificações incluídas nesta definição são caps, substituição de um ou mais dos nucleótidos de ocorrência natural com um análogo e introdução de meios para conjugação do polinucleótido a proteínas, iões metálicos, componentes de marcação, outros polinucleótidos ou suporte sólido.

Um polinucleótido ou polipéptido "isolado" é um que é substancialmente livre dos materiais com os quais está associado no seu ambiente nativo. Por substancialmente livre, significa-se pelo menos 50%, de um modo vantajoso, pelo menos 70%, de um modo mais vantajoso, pelo menos 80% e, de um modo ainda mais vantajoso, pelo menos 90% livre destes materiais. A invenção compreende adicionalmente uma cadeia complementar a um polinucleótido da glicoproteína do vírus Nipah. A cadeia complementar pode ser polimérica e de qualquer comprimento e pode conter desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos e análogos em qualquer combinação.

As reacções de hibridação podem ser realizadas sob condições de diferente "restringênciao". As condições que aumentam a restringênciao de uma reacção de hibridação são bem conhecidas. Ver, for exemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory 12

Manual", segunda edição (Sambrook et al. 1989). Exemplos de condições relevantes incluem (em ordem de restringênciao crescente) : temperaturas de incubação de 25 °C, 37 °C, 50 °C e 68 °C; concentrações de tampão de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC (onde SSC é NaCl a 0,15 M e tampão de citratos a 15 mM) e seu equivalente utilizando outros sistemas de tamponização; concentrações de formamida de 0%, 25%, 50% e 75%; tempos de incubação de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 ou mais etapas de lavagem; tempos de incubação de lavagem de 1, 2 ou 15 minutos; e soluções de lavagem de 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC ou água desionizada. A invenção também abrange polinucleótidos codificando variantes e derivados funcionalmente equivalentes de glicoproteinas do virus Nipah e os seus fragmentos funcionalmente equivalentes que podem melhorar, diminuir ou não afectar significativamente propriedades dos polipéptidos desse modo codificados. Estes variantes, derivados e fragmentos funcionalmente equivalentes exibem a capacidade para reterem a actividade de uma glicoproteina do virus Nipah. Por exemplo, as alterações numa sequência de ADN que não alteram a sequência de aminoácidos codificada, assim como aquelas que resultam em substituições conservativas de resíduos de aminoácidos, uma ou algumas deleções ou adições de aminoácidos e substituição de resíduos de aminoácidos por análogos de aminoácidos são aquelas que não irão afectar significativamente as propriedades do polipéptido codificado. As substituições conservativas de aminoácidos são glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutâmico; serina/treonina/metionina; lisina/arginina; e fenilalanina/tirosina/triptofano. 13

Para efeitos da presente invenção, a identidade ou homologia de sequência é determinada por comparação das sequências quando alinhadas, de forma a maximizar a sobreposição e identidade minimizando, simultaneamente, as lacunas de sequência. Em particular, a identidade de sequência pode ser determinada utilizando um qualquer determinado número de algoritmos matemáticos. Um exemplo não limitativo de um algoritmo matemático utilizado para comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1990;87: 2264-2268, modificado como em Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1993,-90: 5873-5877.

Outro exemplo de um algoritmo matemático utilizado para comparação de sequências é o algoritmo de Myers & Miller, CABIOS 1988,-4: 11-17. Um tal algoritmo está incorporado dentro do programa ALIGN (versão 2.0) que é parte do pacote de software de alinhamento de sequências GCG. Quando se utiliza o programa ALIGN para comparação de sequências de aminoácidos, pode ser utilizada uma tabela de ponderação de resíduos PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. Ainda outro algoritmo útil para a identificação de regiões de semelhança de sequência local e alinhamento é o algoritmo FASTA, como descrito em Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1988; 85:2444-2448. É vantajoso para utilização de acordo com a presente invenção o software WU-BLAST (Washington University BLAST), versão 2.0. Os programas executáveis WU-BLAST, versão 2.0, para diversas plataformas UNIX podem ser descarregados de ftp://blast.wustl.edu/blast/executables. Este programa é baseado no WU-BLAST, versão 1.4 que, por sua vez, é baseado no NCBI-BLAST de domínio público, versão 1.4 (Altschul & Gish, 14 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460.480; Altschul et al., Journal of Molecular

Biology 1990;215: 403-410; Gish & States, 1993; Nature Genetics 3: 266-272; Karlin & Altschul, 1993; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5873-5877; todos aqui incorporados por referência).

Em geral, a comparação de sequências de aminoácidos é realizada por alinhamento de uma sequência de aminoácidos de um polipéptido de uma estrutura conhecida com a sequência de aminoácidos de um polipéptido de estrutura desconhecida. Os aminoácidos nas sequências são, depois, comparados e os grupos de aminoácidos que são homólogos são agrupados em conjunto. Este método detecta regiões conservadas dos polipéptidos e dá conta de inserções e deleções de aminoácidos. A homologia entre sequências de aminoácidos pode ser determinada através da utilização de algoritmos comercialmente disponíveis (ver, também, a descrição de homologia anterior). Além daqueles aqui mencionados de outro modo, é feita também menção aos programas BLAST, gapped BLAST, BLASTN, BLASTP e PSI-BLAST, proporcionados pelo National Center for Biotechnology Information. Estes programas são largamente utilizados na técnica para este efeito e podem alinhar regiões homólogas de duas sequências de aminoácidos.

Em todos os programas de pesquisa, as rotinas de alinhamento com lacunas são integrais à própria pesquisa da base de dados. Se desejado, a colocação de lacunas pode ser desligada. A penalidade predefinida (Q) para uma lacuna de comprimento um é Q=9 para proteínas e BLASTP e Q=10 para BLASTN, mas pode ser alterada para qualquer número inteiro. A penalidade predefinida por resíduo por prolongamento de uma lacuna (R) é R=2 para proteínas e BLASTP e R=10 para BLASTN, mas pode ser 15 alterada para qualquer número inteiro. Pode ser utilizada qualquer combinação de valores para Q e R, para alinhar sequências, de forma a maximizar a sobreposição e identidade minimizando, simultaneamente, as lacunas de sequência. A matriz de comparação de aminoácidos predefinida é a BLOSUM62, mas podem ser utilizadas outras matrizes de comparação de aminoácidos, tal como PAM.

Alternativamente ou adicionalmente, o termo "homologia" ou "identidade", por exemplo, em relação a uma sequência nucleotidica ou de aminoácidos, pode indicar uma medida quantitativa de homologia entre duas sequências. A percentagem de homologia de sequência pode ser calculada como (Nref ~ Ndíf) *100/Nref, em que Ndlf é o número total de resíduos não idênticos nas duas sequências quando alinhadas e em que Nref é o número de resíduos numa das sequências. Por este motivo, a sequência de ADN AGTCAGTC irá ter uma identidade de sequência de 75% com a sequência AATCAATC (Nref = 8; Ndif=2) .

Alternativamente ou adicionalmente, "homologia" ou "identidade" com respeito a sequências, pode referir-se ao número de posições com nucleótidos ou aminoácidos idênticos dividido pelo número de nucleótidos ou aminoácidos na mais curta das duas sequências, em que o alinhamento das duas sequências pode ser determinado, de acordo com o algoritmo de Wilbur e Lipman (Wilbur & Lipman, Proc Natl Acad Sei USA 1983; 80 : 726, aqui incorporado por referência), por exemplo, utilizando um tamanho de janela de 20 nucleótidos, um comprimento de palavra de 4 nucleótidos e uma penalidade de lacuna de 4, e análise assistida por computador e a interpretação dos dados de sequência, incluindo alinhamento, pode ser convenientemente realizada, utilizando programas comercialmente disponíveis 16 (e. g., Intelligenetics™ Suite, da Intelligenetics Inc. CA). Quando se diz que sequências de ARN são semelhantes, ou têm um grau de identidade ou homologia de sequência com sequências de ADN, a timidina (T) na sequência de ADN é considerada igual a uracilo (U) na sequência de ARN. Deste modo, as sequências de ARN estão dentro do âmbito da invenção e podem ser derivadas de sequências de ADN, pelo facto de a timidina (T) na sequência de ADN ser considerada igual a uracilo (U) em sequências de ARN. E, sem experimentação supérfula, o especialista na técnica pode consultar com muitos outros programas ou referências para determinar a percentagem de homologia. A invenção abrange adicionalmente uma glicoproteína do vírus Nipah, contida na molécula de vector ou vector de expressão da invenção e ligada se necessário, de um modo operativo, a um elemento estimulador e/ou um promotor. Numa forma de realização vantajosa, o promotor é um promotor de citomegalovírus (CMVj. Noutra forma de realização, os estimuladores e/ou promotores incluem diversos promotores específicos de células ou tecidos, diversos promotores e estimuladores virais e diversas sequências de ADN de vírus Nipah isogenicamente específicas para cada espécie animal.

Um "vector" refere-se a um plasmídeo ou vírus de ADN ou ARN recombinante que compreende um polinucleótido heterólogo a ser distribuído a uma célula alvo, in vitro ou in vivo. 0 polinucleótido heterólogo pode compreender uma sequência de interesse para efeitos de terapia e pode, opcionalmente, ser na forma de uma cassete de expressão. Um vector não necessita de ser capaz de replicação na derradeira célula alvo ou indivíduo. 0 termo inclui vectores de clonagem para tradução de uma 17 sequência codificando polinucleótido. Sao também incluídos vectores virais. 0 termo "recombinante" significa um polinucleótido de ADNc genómico, de origem semi-sintética ou sintética que nem ocorre na natureza ou está ligado a outro polinucleótido num arranjo, nem verificado na natureza. "Heterólogo" significa derivado de uma entidade geneticamente distinta do resto da entidade à qual está a ser comparado. Por exemplo, um polinucleótido, pode ser colocado por técnicas de engenharia genética dentro de um plasmídeo ou vector derivado de uma fonte diferente e ser um polinucleótido heterólogo. Um promotor removido da sua sequência codificante nativa e operativamente ligado a uma sequência codificante com excepção da sequência nativa é um promotor heterólogo.

Os polinucleótidos da invenção podem compreender sequências adicionais, tal como sequências codificantes adicionais dentro da mesma unidade de transcrição, elementos de controlo, tais como promotores, estimulador, sítios de ligação de ribossoma, sítios de poliadenilação, terminador de transcrição, unidades de transcrição adicionais sob o controlo do mesmo ou um diferente promotor, sequências que permitem a clonagem, expressão, recombinação homóloga e transformação de uma célula hospedeira e qualquer construção, tal como pode ser desejável para proporcionar formas de realização desta invenção.

Elementos para a expressão de glicoproteína do vírus Nipah estão, de um modo vantajoso, presentes num vector inventivo. De um modo mínimo, estes compreendem, consistem essencialmente ou consistem em um codão de iniciação (ATG), um codão de terminação 18 e um promotor e, opcionalmente, também uma sequência de poliadenilação para determinados vectores, tais como plasmideos e determinados vectores virais, e. g. , vectores virais com excepção de poxvírus e um terminador de transcrição para poxvirus. Quando o polinucleótido codifica um fragmento poliproteico, e. g. , uma proteína do vírus Nipah, de um modo vantajoso, num vector, um ATG é colocado em 5' da fase de leitura e um codão de terminação é colocado em 3'. Podem estar presentes outros elementos para o controlo da expressão, tais como sequências estimuladoras, sequências estabilizadoras e sequências sinal, permitindo a secreção da proteína.

Os métodos para a preparação e/ou administração de um vector ou recombinantes ou plasmideos para expressão de produtos génicos de genes da invenção, in vivo ou in vitro, podem ser quaisquer métodos desejados, e. g., um método que é análogo aos métodos divulgados em, ou divulgados em documentos citados em:

Patentes U.S. N° 4603112; 4769330; 4394448; 4722848; 4745051; 4769331; 4945050; 5494807; 5514375; 5744140; 5744141; 5756103; 5762938; 5766599; 5990091; 5174993; 5505941; 5338683; 5494807; 5591639; 5589466; 5677178; 5591439; 5552143; 5580859; 6130066; 6004777; 6130066; 6497883; 6464984; 6451770; 6391314; 6387376; 6376473; 6368603; 6348196; 6306 400; 6228846; 6221362; 6217883; 6207166; 6207165; 6159477; 6153199; 6090393; 6074649; 6045803; 6033670; 6485729; 6103526 ; 6224882 ; 6312682 !; 6348450 e 6; 312683; pedido de Patente U.S. N° de Série 920197, apresentado em 16 de Outubro de 1986; documentos WO 90/01543; W091/11525; WO 94/16716; WO 96/39491; WO 98/33510; EP 265785; EP 0370573; Andreansky et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996; 93:11313-11318; Ballay et ai., EMBO J. 1993; 4:3861-65; Felgner et al. , J. Biol. Chem. 1994; 269:2550-2561; Frolov et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996; 93:11371-11377; Graham, Tibtech 1990; 19 8: 85-87; Grunhaus et al., Sem. Virol. 1992; 3:237-52; Ju et al., Diabetologia 1998; 41:736-739; Kitson et al., J. Virol. 1991;

65:3068-3075; McClements et al., Proc. Natl. Acad. Sei . USA 1996; 93:11414-11420; Moss, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996; 93:11341-11348; Paoletti, Proc. Natl Acad. Sei . USA 1996; 93:11349-11353; Pennock et al. , Mol. Cell. Biol. 1984; 4:399-406; Richardson (Ed), Methods in Molecular Biology 1995; 39, "Baculovirus Expression Protocols" Humana Press Inc.; Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 1983; 3:2156-2165; Robertson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996; 93:11334-11340;

Robinson et al., Sem. Immunol. 1997;9:271; e Roizman, Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 1996; 93:11307-11312. O vector na invenção é um vector do vírus da varíola dos canários. As proteínas de não vírus Nipah ou os seus fragmentos, citocinas, etc., podem ser expressos por vector ou vectores, em ou incluídos em, composições da invenção. A citocina ou citocinas pode(m) ser na forma de proteína na composição imunogénica ou de vacina, ou podem ser co-expressas no hospedeiro com o imunogénio ou imunogénios ou seu(s) epitopo(s). É dada preferência à co-expressão da citocina ou citocinas, pelo mesmo vector que aquele expressando o imunogénio ou imunogénios ou os seu(s) epitopo(s), ou por um respectivo vector. A(s) citocina(s) pode(m) ser escolhida(s) de: interleucina 18 (IL-18), interleucina 12 (IL-12), interleucina 15 (IL-15), MIP-lcx (proteína inflamatória de macrófago la; Marshall E. et ai., Br. J. Câncer, 1997, 75 (12), 1715-1720), GM-CSF (Factor Estimulador de Colónias de Macrófagos Granulocíticos) . De um modo preferido, é feita utilização de citocinas da espécie a ser vacinada; isto é, de um modo vantajoso, a citocina é 20 correspondida com a espécie alvo ou hospedeira e notar, por exemplo, GM-CSF porcino (S. Inumaru et al. Immunol. Cell Biol. 1995, 73(5), 474-476), GM-CSF canino (exemplo 8 do documento WO00/77043), GM-CSF felino (exemplo 9 do documento WO00/77043). 0 documento WO00/77210 proporciona a sequência nucleotidica e a sequência de aminoácidos correspondendo ao GM-CSF equino, a produção de GM-CSF in vitro e a construção de vectores (e. g., vectores plasmidicos e virais) permitindo a expressão in vivo de GM-CSF equino. A presente invenção refere-se, igualmente, a preparações dos vectores da invenção. As preparações podem compreender, consistir essencialmente em, ou consistir em um ou mais vectores, e. g., vectores de expressão, tal como vectores de expressão in vivo, compreendendo, consistindo essencialmente ou consistindo em (e, de um modo vantajoso, expressando) um ou mais de polinucleótidos do vírus Nipah e, de um modo vantajoso, o vector contém e expressa um polinucleótido que inclui, consiste essencialmente em, ou consiste em uma região codificante codificando uma proteína do vírus Nipah, de um modo vantajoso uma glicoproteína do vírus Nipah, num veículo, excipiente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Deste modo, de acordo com uma forma de realização da invenção, o outro vector ou vectores na preparação compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um polinucleótido que codifica e, sob circunstâncias apropriadas, o vector expressa uma ou mais outras proteínas de uma glicoproteína do vírus Nipah ou um seu fragmento.

De acordo com outra forma de realização, o vector ou vectores na preparação compreende, ou consiste essencialmente 21 em, ou consiste em polinucleótido(s) codificando uma ou mais proteínas ou seus fragmentos de uma proteína do vírus Nipah, de um modo vantajoso, uma glicoproteína do vírus Nipah. A preparação inventiva, de um modo vantajoso, compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em, pelo menos, dois vectores compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em e, de um modo vantajoso, também expressando, de um modo vantajoso, in vivo sob condições apropriadas ou condições adequadas ou numa célula hospedeira adequada, polinucleótidos de diferentes isolados do vírus Nipah codificando as mesmas proteínas e/ou para proteínas diferentes mas, de um modo vantajoso, para as mesmas proteínas. Quanto a preparações contendo um ou mais vectores contendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em polinucleótidos codificando e, de um modo vantajoso, expressando, de um modo vantajoso, in vivo, uma proteína do vírus Nipah, de um modo vantajoso, uma glicoproteína do vírus Nipah, ou um seu epitopo, é vantajoso que os produtos de expressão sejam de dois, três ou mais isolados diferentes do vírus Nipah, de um modo vantajoso, estirpes. A invenção é também dirigida a misturas de vectores que contêm, consistem essencialmente em, ou consistem em codificação para, e expressam, diferentes proteínas do vírus Nipah. 0 vector da invenção é um vector de varíola aviária contendo uma glicoproteína do gene do vírus Nipah, o vector de varíola aviária sendo um vector de varíola dos canários, de um modo vantajoso, um vector de varíola dos canários atenuado, tal como ALVAC. Os vírus da varíola dos canários atenuados são descritos nas Patentes U.S. N° 5756103 (ALVAC) e W001/05934.

De acordo com a invenção, o vector poxvírus é um vector do vírus da varíola dos canários, de um modo vantajoso, um vírus da 22 varíola dos canários atenuado. A este respeito, é feito para a varíola dos canários, disponível a partir do ATCC com o número de acesso VR-111. Os vírus da varíola dos canários atenuados são descritos nas Patentes U.S. N° 5756103 (ALVAC) e W001/05934.

Para informação sobre o método de produzir recombinantes dos mesmos e de que modo administrar recombinantes dos mesmos, o especialista na técnica pode reportar-se aos documentos WO90/12882 e Patente U.S. N° 5756103, inter alia.

No caso da varíola dos canários, de um modo vantajoso o sítio ou sítios de inserção são as ORF(s) C3, C5 e/ou C6; ver também os documentos aqui citados.

De um modo vantajoso, o polinucleótido a ser expresso é inserido sob o controlo de um promotor específico de poxvírus; este pode incluir o promotor de vaccinia de 7,5 kDa (Cochran et al. , J. Virology, 1985, 54, 30-35), o promotor I3L de vaccinia (Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434), o promotor HA de vaccinia (Shida, Virology, 1986, 150, 451-457), o promotor ATI de varíola bovina (Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47), o promotor H6 de vaccinia (Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. et al. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. et al., J. Virol., 1989, 63, 3829-3836), inter alia.

Para a vacinação de mamíferos, o vector de expressão é um da varíola dos canários. Desta forma, pode existir expressão das proteínas heterólogas com replicação limitada ou não produtiva.

Em termos mais gerais, o promotor tem uma origem virai ou celular. Um forte promotor virai, com excepção de CMV-IE que 23 pode ser empregue de um modo útil na prática da invenção é o promotor precoce/tardio do virus SV40 ou o promotor LTR do virus do sarcoma de Rous. Um forte promotor celular que pode ser empregue, de um modo útil, na prática da invenção é o promotor de um gene do citosqueleto, tal como, e. g., o promotor da desmina (Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344) ou o promotor da actina (Miyazaki J. et ai., Gene, 1989, 79, 269-277) .

Fragmentos subfuncionais destes promotores, i. e., porções destes promotores que mantêm uma actividade promotora adequada, e. g., promotores truncados de CMV-IE de acordo com o Pedido PCT N° W098/00166 ou Patente U.S. N° 6156567, podem ser utilizados na prática da invenção. Um promotor utilizado na prática da invenção inclui, consequentemente, derivados e subfragmentos de um promotor de comprimento completo que mantém uma actividade promotora adequada e, por este motivo, funciona como um promotor, de um modo preferido, promovendo actividade substancialmente semelhante àquela do promotor verdadeiro ou de comprimento completo, a partir do qual, o derivado ou subfragmento é derivado, e. g., correspondente à actividade dos promotores truncados de CMV-IE da Patente U.S. N° 6156567 para a actividade de promotores CMV-IE de comprimento completo. Deste modo, um promotor de CMV-IE utilizado na prática da invenção pode compreender ou consistir essencialmente em ou consiste na porção do promotor do promotor de comprimento completo e/ou a porção do estimulador do promotor de comprimento completo, assim como derivados e subfragmentos.

De acordo com outra forma de realização da invenção, os vectores de expressão são vectores de expressão utilizados para a expressão in vitro de proteínas num sistema celular 24 apropriado. A produção de proteína pode realizar-se pela transfecção de células de mamífero por replicação ou expressão sem replicação produtiva de vectores virais em células de mamífero ou células aviárias, ou por replicação de baculovírus (ver, e. g. , a Patente U.S. N° 4745051; Vialard J. et al. , J. Virol. , 1990 64 (1), 37-50; Verne A., Virology, 1988, 167,56-71), e. g. , Vírus da Poliedrose Nuclear de Autographa californica AcNPV, em células de insecto (e. g., células Sf9 de Spodoptera frugiperda, ATCC CRL 1711; ver, igualmente, as

Patentes U.S. N° 6228846, 6103526) . As células de mamífero que podem ser utilizadas são, de um modo vantajoso, células de hámster (e. g., CHO ou BHK-21) ou células de macaco (e. g., COS ou VERO). As proteínas expressas podem ser recolhidas em ou a partir do sobrenadante de cultura após ou não secreção (se não existir secreção, ocorre tipicamente ou é realizada uma lise celular), opcionalmente concentradas por métodos de concentração, tais como ultrafiltração e/ou purificadas por meios de purificação, tais como métodos de cromatografia do tipo de afinidade, permuta iónica ou filtração em gel. É compreendido por um especialista na técnica, que as condições para o cultivo de uma célula hospedeira variam de acordo com o gene particular e que é necessária rotina de experimentação, por vezes, para determinar as condições óptimas para o cultivo de uma glicoproteína do vírus Nipah, dependendo da célula hospedeira. Uma "célula hospedeira" denota uma célula procariótica ou eucariótica que foi geneticamente alterada ou é capaz de ser geneticamente alterada por meio de administração de um polinucleótido exógeno, tal como um vector recombinante. Quando se faz referência a células geneticamente alteradas, o termo refere-se à célula originalmente alterada e à sua descendência. 25

Os polinucleótidos compreendendo uma sequência desejada podem ser inseridos dentro de um vector de clonagem ou expressão adequado e o vector pode, por sua vez, ser introduzido dentro de uma célula hospedeira adequada para replicação e amplificação. Os polinucleótidos podem, em geral, ser introduzidos dentro de células hospedeiras por qualquer meio conhecido na técnica. Os vectores contendo polinucleótidos de interesse podem ser introduzidos dentro da célula hospedeira por qualquer um de um certo número de meios apropriados, incluindo absorção directa, endocitose, transacção, cruzamento f, electroporação, transfecção empregando cloreto de cálcio, cloreto de rubidio, fosfato de cálcio, DEAR-dextrano ou outras substâncias; bombardeamento de microprojéctil; lipofecção; e infecção (se o vector for infeccioso, por exemplo, um vector retroviral). A escolha da introdução de vectores ou polinucleótidos irá, frequentemente, depender de caracteristicas da célula hospedeira. A administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação da invenção, para a distribuição e expressão de uma glicoproteína do vírus Nipah a uma célula alvo, é para ser efectuada. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz é a experimentação de um especialista na técnica. A formulação compreende um vector de expressão, compreendendo um polinucleótido que expressa uma glicoproteína do vírus Nipah e um veículo, transportador ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Numa forma de realização vantajosa, o transportador, veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável facilita a transfecção e/ou melhora a preservação do vector ou proteína. 26

Os veículos ou transportadores ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis são bem conhecidos do especialista na técnica. Por exemplo, um veículo ou transportador ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser uma solução de NaCl a 0,9% (e. g. , solução salina) ou tampão de fosfatos. Outros veículos ou transportadores ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis que podem ser utilizados para métodos desta invenção incluem mas não estão limitados a poli-(L-glutamato) ou polivinilpirrolidona. Os veículos ou transportadores ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis podem ser qualquer composto facilitando a administração do vector (ou proteína expressa a partir de um vector inventivo in vitro) ; de um modo vantajoso, o veículo, transportador ou excipiente pode facilitar a transfecção e/ou melhorar a preservação do vector (ou proteína). As doses e volumes de doses são aqui discutidos na descrição geral e podem ser, também, determinados pelo especialista na técnica a partir desta divulgação, lida em conjunto com o conhecimento na técnica, sem qualquer experimentação supérfula.

Os lípidos catiónicos contendo um sal de amónio quaternário que são, de um modo vantajoso, mas não exclusivo, adequados para utilização com plasmídeos são, de um modo vantajoso, aqueles tendo a seguinte fórmula: CH, l+3

I OR

R—O—CHr-CH-CH=-N—R—X CH, na qual Ri é um radical alifático de cadeia linear, saturado ou insaturado, tendo 12 a 18 átomos de carbono, R2 é outro radical 27 alifático contendo 2 ou 3 átomos de carbono e X é um grupo amina ou hidroxilo, e. g., o DMRIE. Noutra forma de realização, o lípido catiónico pode estar associado a um lípido neutro, e. g., o DOPE.

De entre estes lípidos catiónicos, é dada preferência a DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1 propano amónio; documento WO96/34109), de um modo vantajoso, associado a um lípido neutro, de um modo vantajoso, DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina; Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389), de modo a formar DMRIE-DOPE.

Quando o DOPE está presente, a razão molar DMRIE:DOPE é, de um modo vantajoso, cerca de 95: cerca de 5 para cerca de 5: cerca de 95, de um modo mais vantajoso, cerca de 1: cerca de 1, e. g., 1:1. A razão ponderai de adjuvante de DMRIE ou DMRIE- -DOPE:plasmídeo pode ser entre cerca de 50: cerca de 1 e cerca de 1: cerca de 10, tal como cerca de 10: cerca de 1 e cerca de 1: cerca de 5 e, de um modo vantajoso, cerca de 1: cerca de 1 e cerca de 1 : cerca de 2, e. g., 1:1 e 1:2.

As composições farmacêuticas podem ser directamente administradas in vivo e o produto codificado, expresso pelo vector no hospedeiro. Os métodos de distribuição in vivo de vector codificando a glicoproteína do vírus Nipah (ver, e. g., Patente U.S. N° 6423693; publicações das patentes EP 1052286, EP 1205551, publicação das patentes U.S. 20040057941, WO 9905300 e Draghia-Akli et al., Mol Ther. Dezembro de 2002; 6 (6) :830-6) podem ser modificados para distribuição de uma glicoproteína do vírus Nipah da presente invenção. A distribuição in vivo de um 28 vector codificando uma glicoproteína do virus Nipah, aqui descrita, pode ser realizada pelo especialista na técnica.

De um modo vantajoso, as composições e/ou formulações farmacêuticas e/ou terapêuticas de acordo com a invenção compreendem ou consistem essencialmente em, ou consistem em, uma quantidade eficaz para deduzir uma resposta terapêutica de um ou mais dos vectores de expressão da invenção; uma quantidade eficaz pode ser determinada a partir desta divulgação e do conhecimento na técnica, sem qualquer experimentação supérfula.

As composições imunogénicas e vacinas, de acordo com a invenção, podem compreender um ou mais adjuvantes. São adjuvantes particularmente adequados para utilização na prática da presente invenção (1) polímeros de ácido acrílico ou metacrílico, polímeros derivados de anidrido maleico e alcenilo, (2) sequências de imunoestimulação (ISS), tal como sequências oligodesoxirribonucleotídicas tendo uma ou mais unidades CpG não metiladas (Klinman D. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sei., EUA, 1996, 93, 2879-2883; documento W098/16247), (3) uma emulsão de óleo em água, tal como a emulsão SPT, descrita na p. 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995 e a emulsão MF59 descrita na p. 183 do mesmo trabalho, (4) lípidos catiónicos contendo um sal de amónio quaternário, (5) citocinas, (6) hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio ou (7) outros adjuvantes discutidos em qualquer documento citado e incorporado por referência no presente pedido ou (8) quaisquer combinações ou suas misturas. A emulsão de óleo em água (3) que é especialmente apropriada para vectores virais, pode ser baseada em: 29 - óleo de parafina líquida leve (tipo farmacopeia

Europeia). - óleo isoprenóide, tais como esqualano, esqualeno, - óleo resultante da oliqomerização de alcenos, e. g., isobuteno ou deceno, - ésteres de ácidos ou álcoois tendo um grupo alquilo de cadeia linear, tais como óleos vegetais, oleato de etilo, propilenoglicol, di(caprilato/caprato), glicerol tri(caprilato/caprato) e dioleato de propilenoglicol ou - ésteres de álcoois ou ácidos gordos ramificados, em especial ésteres de ácido isoesteárico. 0 óleo é utilizado em combinação com emulsionantes, de modo a formar uma emulsão. Os emulsionantes podem ser tensioactivos não iónicos, tais como: - ésteres de, por um lado, sorbitano, manido (e. g., oleato de anidromanitol), glicerol, poliglicerol ou propilenoglicol e, por outro lado, ácidos oleico, isosteárico, ricinoleico ou hidroxisteárico, os referidos ésteres sendo opcionalmente etoxilados, - copolímeros em bloco de polioxipropileno-polioxietileno, tal como Pluronic, e. g., L121.

De entre os polímeros adjuvantes de tipo (1), é dada preferência a polímeros de ácido acrílico ou metacrílico reticulados, especialmente reticulados por éteres de polialcenilo de açúcares ou poliálcoois. Estes compostos são conhecidos sob o nome carbómero (Pharmeuropa, vol. 8, n° 2, 30

Junho de 1996). Um especialista na técnica pode, também, referir-se à Patente U.S. N° 2909462 que proporciona tais polímeros acrílicos, reticulados por um composto poli-hidroxilo tendo, pelo menos, três grupos hidroxilo, de um modo preferido não mais do que oito desses grupos, os átomos de hidrogénio de, pelo menos, três grupos hidroxilo sendo substituídos por radicais insaturados alifáticos tendo, pelo menos, dois átomos de carbono. Os radicais preferidos são aqueles contendo 2 a 4 átomos de carbono, e. g. , vinilos, alilos e outros grupos etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados podem conter, também outros substituintes, tal como metilo. Os produtos comercializados sob o nome Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EUA) são especialmente adequados. São reticulados por sacarose alílica ou por pentaeritritol alílico. Destes, é feita referência a Carbopol 974P, 934P e 971 P.

Quanto aos copolímeros derivados de anidrido-alcenilo maleico, é dada preferência a EMA (Monsanto) que são copolímeros de anidrido etileno-maleico de cadeia linear ou reticulados e são, por exemplo, reticulados por éter divinílico. É também feita referência a J. Fields et al., Nature 186: 778-780, 4 de Junho de 1960.

COOH COOH

Em relação à estrutura, os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico e EMA são, de um modo preferido, formados por unidades básicas tendo a seguinte fórmula: 31 na qual: - Ri e R2, os quais podem ser iguais ou diferentes, representam H ou CH3 - x = 0 ou 1, de um modo preferido x = 1 - y = 1 ou 2, com x + y = 2.

Para EMA, x=0ey=2e para os carbómeros x = y = 1.

Estes polímeros sao solúveis em água ou solução salina fisiológica (NaCl a 20 g/L) e 0 pH pode ser ajustado para 7,3 para 7, 4, e. g., com soda (NaOH), de modo a proporcionar a solução adjuvante na qual o(s) vector(es) de expressão pode(m) ser incorporado(s). A concentração de polímero na composição de vacina final pode variar entre 0,01 e 1,5%, p/v, de um modo vantajoso, 0,05 a 1%, p/v, e, de um modo preferido, 0,1 a 0,4%, p/v.

Numa forma de realização vantajosa, as composições e/ou formulações farmacêuticas e/ou terapêuticas de acordo com a invenção são administradas por injecção, tais como, mas não limitada a injecção intramuscular (IM), intradérmica (ID) ou subcutânea (SC).

Também em relação a uma tal composição terapêutica, a partir desta divulgação e do conhecimento na técnica, o especialista na técnica pode determinar o número de administrações, via de administração e doses a serem utilizadas para cada protocolo de injecção, sem qualquer experimentação supéfula. 32

Numa forma de realização vantajosa, a vacina recombinante pode ser administrada a um porco ou infectada ou transfectada para dentro de células, numa quantidade de cerca de, pelo menos, 103 pfu; de um modo mais preferido, cerca de 104 pfu a cerca de IO10 pfu, e. g., cerca de 105 pfu a cerca de 109 pfu, por exemplo, cerca de 106 pfu a cerca de 10s pfu, por dose, por exemplo, por dose de 2 mL. Numa forma de realização particularmente vantajosa, a dose é cerca de 10 pfu por dose. O método inclui, pelo menos, uma administração a um animal de uma quantidade eficiente da composição terapêutica da invenção. O animal pode ser macho, fêmea, fêmea prenhe e recém-nascido. A administração pode ser realizada, de um modo notável, por injecção intramuscular (IM), intradérmica (ID) ou subcutânea (SC) ou por meio de administração intranasal ou oral. Numa forma de realização vantajosa, a composição terapêutica de acordo com a invenção pode ser administrada por uma seringa ou aparelho sem agulha (como, por exemplo, Pigjet, Biojector ou Vitajet (Bioject, Oregon, EUA)).Outra abordagem para administrar plasmideo é utilizar a electroporação, ver, e. g., S. Tollefsen et al. Vaccine, 2002, 20, 3370-3378; S. Tollefsen et al. Scand. J. Immunol., 2003, 57, 229-238; S. Babiuk et al., Vaccine, 2002, 20, 3399-3408; Pedido PCT N° WO99/01158. A invenção refere-se a composições farmacêuticas para utilização na vacinação de animais contra infecção de virus Nipah. Numa particular forma de realização, as composições farmacêuticas compreendendo Nipah F e Nipah G de acordo com a presente invenção são utilizadas para vacinação em animais contra infecções causadas por virus Nipah. Numa forma de 33 realização vantajosa, o animal é um porco. Noutras formas de realização vantajosas, o animal é um gato, cavalo ou humano. É, também, divulgado um método para a prevenção da transmissão do vírus Nipah entre um primeiro animal e um segundo animal, compreendendo a imunização ou dedução de uma resposta imunitária num primeiro animal utilizando quaisquer dos métodos aqui descritos, de modo a prevenir a transmissão de doença ao segundo animal. Numa particular forma de realização, as composições farmacêuticas compreendendo Nipah F e Nipah G de acordo com a presente invenção são utilizadas para vacinação dos referidos primeiros animais contra infecções causadas por vírus Nipah. Numa forma de realização vantajosa, o primeiro animal é um porco. 0 segundo animal é um gato, um cão ou um cavalo, de um modo vantajoso, um humano. É, também, proporcionado um kit para a realização de qualquer dos métodos anteriormente descritos, compreendendo qualquer das composições da invenção e, opcionalmente, instruções para a realização do método. A invenção será agora adicionalmente descrita por meio de exemplos. Na medida em que pertencendo a vectores de vírus da varíola dos canários codificando uma glicoproteína do vírus Nipah, tal pode ser tomado como ilustrativo da presente invenção. Outro objecto dos exemplos é proporcionado apenas para informação. 34

EXEMPLOS

Exemplo 1: Construções

Construção do plasmídeo pSL-6802-1-4. 0 pSL-6802-1-4 compreende as sequências flanqueantes do lócus C5, promotor H6 de vaccinia e gene G do vírus Nipah, de modo a gerar o VCP2199. 0 vírus Nipah foi isolado a partir de CSF humano. 0 gene Nipah G foi amplificado por PCR e inserido dentro do plasmídeo pTMl, gerando pTMl Nipah G. A finalidade foi a de construir um plasmídeo dador pC5 H6p Nipah G para a geração de um recombinante de vírus da varíola dos canários ALVAC expressando Nipah G. 0 nome do plasmídeo era pC5 H6p Nipah G, pSL-6802-1-4. A estrutura do plasmídeo era pCXL-148-2, pC5 H6p compreendendo o promotor H6 de vaccinia, os braços esquerdo e direito correspondendo ao lócus C5 de inserção. 0 plasmídeo pCXL-148-2 é derivado do plasmídeo pNVQH6C5LSP-l8 por uma única mutação de base de T para C no braço direito de C5. 0 plasmídeo pNVQH6C5LSP-l8 é descrito em S. Loosmore et al., documento US 2005/0031641. O gene Nipah G foi amplificado por PCR utilizando pTMl Nipah G como molde e os iniciadores 11470 . SL e 11471. SL (FIG. 2B). O fragmento de PCR de -1,8 kb foi clonado dentro de pCR2.1, produzindo o clone pSL-6771-1-1 (pCR2.1 H6p Nipah G), o qual foi confirmado por análise de sequência (FIG. 2C) . O fragmento Nru I-Xho I H6p Nipah G, de -1,8 kb, de pSL-6771-1-1 foi clonado dentro de pCXL-148-2 (pC5 H6p), produzindo o pSL-6802-1-4 (pC5 H6p Nipah G) , o qual foi confirmado por análise de sequência (FIGS. 2C e 2D). 35

Construção do plasmídeo pSL-6802-2-5. 0 pSL-6802-2-5 compreende as sequências flanqueantes do lócus F8, promotor H6 de vaccinia e gene G do vírus Nipah, de modo a produzir o VFP2200. 0 vírus Nipah foi isolado a partir de CSF humano. 0 gene Nipah G foi amplificado por PCR e inserido dentro do plasmídeo pTMl, gerando pTMl Nipah G. A finalidade foi a de construir um plasmídeo dador pF8 H6p Nipah G para a produção de um recombinante de varíola das aves de capoeira, expressando Nipah G. 0 nome do plasmídeo era pF8 H6p Nipah G, pSL-6802-2-5. A estrutura do plasmídeo era pSL-6427-2-1, pF8 H6p compreendendo o promotor H6, os braços esquerdo e direito do lócus F8 de inserção. 0 plasmídeo pSL-6427-2-1 é derivado do plasmídeo pSL-5440-5-1 por uma única mutação de base de C para T no braço esquerdo de F8. 0 plasmídeo pSL-5440-5-1 é descrito em S. Loosmore et al., documento US 2005/0031641. O gene Nipah G foi amplificado por PCR utilizando pTMl Nipah G como molde e os iniciadores 11470.SL e 11471.SL (FIG. 3A) . O fragmento de PCR de ~1,8 kb foi clonado dentro de pCR2.1, produzindo o clone pSL-6771-1-1 (pCR2.1 H6p Nipah G) , o qual foi confirmado por análise de sequência (FIG. 3 B) . O fragmento Nru I-Xho I H6p Nipah G, de ~1,8 kb, de pSL-6771-1-1 foi clonado dentro de pSL-6427-2-1 (pF8 H6p), produzindo o pSL-6802-2-5 (pF8 H6p Nipah G) , que foi confirmado por análise de sequência (FIGS. 3B e 3C).

Construção do plasmídeo pSL-6839-1. O pSL-6839-1 compreende as sequências flanqueantes do lócus F8, promotor H6 de vaccinia e gene F do vírus Nipah, de modo a produzir o VFP2207. O vírus Nipah foi isolado a partir de CSF humano. O gene F de Nipah foi amplificado por PCR e inserido dentro do plasmídeo pTMl, produzindo pTMl Nipah F. A finalidade foi a de construir um 36 plasmídeo dador pF8 H6p Nipah F para a produção de um recombinante de varíola das aves de capoeira expressando Nipah F. 0 nome do plasmídeo: pF8 H6p Nipah F, pSL-6839-1. A estrutura do plasmídeo era pSL-6427-2-1, pF8 H6p compreendendo o promotor H6 de vaccinia, os braços esquerdo e direito do lócus F8 de inserção.

Havia uma sequência T5NT interna em Nipah F que foi removida por mutagénese dirigida pontual. Um fragmento codificando a extremidade 3' do promotor H6 e a extremidade 5' do gene Nipah F, foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores 11457.SL e 11458.SL. No fragmento amplificado, a sequência T5NT foi removida e um sitio Apa I foi introduzido para efeitos de clonagem (FIG. 4B) . 0 fragmento foi clonado dentro de pCR2.1, produzindo pSL-6797-3-1 (pCR2.1 Ηβρ 5'-Nipah F, sem T5NT) que foi confirmado por análise de sequência (FIG. 4C) . 0 fragmento 3'-Nipah F foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores 11456.SL e 11459.SL. No fragmento amplificado, a sequência T5NT foi removida e um sitio Apa I foi introduzido para efeitos de clonagem (FIG. 4B) . 0 fragmento foi clonado dentro de pCR2.1, produzindo pSL-6797-4-1 (pCR2.1 3'-Nipah F,

sem T5NT) que foi confirmado por análise de sequência (FIGS. 4C) . 0 fragmento Nru I-BamH I H6p 5'-Nipah F, de ~0,7 kb, de pSL-6797-3-1 foi inserido dentro de pSL-6427-2-1 (pF8 Ηβρ), gerando pSL-6830-1 (pF8 H6p 5'-Nipah F) . 0 fragmento Apa I-BamH I 3'-Nipah F, de ~1,0 kb, de pSL-6797-4-1 foi inserido entre Apa I e Bam Η I de pSL-6830-1, produzindo pSL-6839-1 (pF8 H6p Nipah F), que foi confirmado por análise de sequência (FIGS. 4C e 4D).

Construção do plasmídeo pSL-6851-29. 0 pSL-6851-29 compreende as sequências flanqueantes do lócus C5, promotor H6 de vaccinia e gene F do vírus Nipah, de modo a produzir o 37 VCP2208. 0 vírus Nipah foi isolado a partir de CSF humano. 0 gene F de Nipah foi amplificado por PCR e inserido dentro do plasmídeo pTMl, produzindo pTMl Nipah F. A finalidade foi a de construir um plasmídeo dador pC5 H6p Nipah F para a produção de um vírus recombinante da varíola dos canários ALVAC expressando Nipah F. 0 nome do plasmídeo era pSL-6851-29, pC5 H6p Nipah F. A estrutura do plasmídeo era pCXL-148-2, pC5 H6p compreendendo o promotor H6 de vaccinia, o braço esquerdo e direito do lócus C5 de inserção.

Havia uma sequência T5NT interna em Nipah F que foi removida por mutagénese dirigida pontual. Um fragmento codificando a extremidade 3' do promotor H6 e a extremidade 5' do gene Nipah F foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores 11457.SL e 11458.SL. No fragmento amplificado, a sequência T5NT foi removida e um sítio Apa I foi introduzido para efeitos de clonagem (FIG. 5A) . 0 fragmento foi clonado

dentro de pCR2.1, produzindo pSL-6797-3-1 (pCR2.1 H6p 5'-Nipah F, sem T5NT) que foi confirmado por análise de sequência (FIG. 5B). 0 fragmento 3'-Nipah F foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores 11456.SL e 11459.SL. No fragmento amplificado, a sequência T5NT foi removida e um sítio Apa I foi introduzido para efeitos de clonagem (FIG. 5A).0 fragmento foi clonado dentro de pCR2.1, produzindo pSL-6797-4-1 (pCR2.1 3'-Nipah F, sem T5NT) que foi confirmado por análise de sequência (FIG. 5B). 0 fragmento Nru I-BamH I H6p 5'-Nipah F, de ~0,7 kb, de pSL-6797-3-1 foi inserido dentro de pSL-6427-2-1 (pF8 H6p), produzindo pSL-6830-1 (pF8 H6p 5'-Nipah F). 0 fragmento Apa I-BamH I 3'-Nipah F, de ~1,0 kb, de pSL-6797-4-1 foi inserido entre Apa I e Bam Η I de pSL-6830-1, produzindo pSL-6839-1 (pF8 H6p Nipah F) , que foi confirmado por análise de sequência. 0 fragmento Nru I-Xma I H6p Nipah F, de ~1,7 kb, de 38 pSL-6839-1 foi clonado dentro de pCXL-148-2 (pC5 H6p), de modo a produzir o pSL-6851-29 (pC5 H6p Nipah F) que foi confirmado por análise de sequência (FIGS. 5B e 5C).

Construção do recombinante da Varíola das Aves de Capoeira expressando Nipah F. vFP2207. 0 gene era Nipah F. 0 plasmídeo dador era pSL-6839-1. 0 sítio de inserção era o lócus F8 da

Varíola das Aves de Capoeira. Os promotores eram o promotor H6 do vírus vaccinia. As células para recombinação in vitro eram células de fibroblastos primários de embrião de galinha (1°CEF) cultivadas em FBS a 10%, DMEM. A recombinação in vitro foi realizada por transfecção de células 10 CEF com o plasmídeo dador pSL-6839-1 (20 pg) linearizado com Not I. As células transfectadas foram subsequentemente infectadas com Varíola das Aves de Capoeira como vírus de resgate a MOI de 10. Após 48 h, as células infectadas transfectadas foram recolhidas, sonicadas e utilizadas para rastreio de vírus recombinante. As placas recombinantes foram rastreadas com base no método de hibridação de transferência de placa, utilizando uma sonda específica de Nipah F que foi marcada com peroxidase de rábano. Após quatro séries sequenciais de purificação de placa, o recombinante, designado como VFP2207, foi produzido e confirmado por hibridação, como 100% positivo para a inserção e 100% negativo para a F8 ORF.

Construção do recombinante da Varíola dos Canários expressando Nipah G, vCP2199. O gene era Nipah G. O plasmídeo dador era pSL-6802-1-4. O sítio de inserção era C5. O promotor era o promotor H6. As células para recombinação in vitro eram 39 células de fibroblastos primários de embrião de galinha (1°CEF) cultivadas em FBS a 10%, DMEM. A recombinação in vitro foi realizada por transfecção de células 1°CEF com o plasmídeo dador pSL-6802-1-4 (15 pg) linearizado com Not I. As células transfectadas foram subsequentemente infectadas com ALVAC como vírus de resgate a MOI de 10. Após 24 h, as células infectadas transfectadas foram recolhidas, sonicadas e utilizadas para rastreio de vírus recombinante. As placas recombinantes foram rastreadas com base no método de hibridação de transferência de placa, utilizando uma sonda específica de Nipah G que foi marcada com peroxidase de rábano. Após cinco séries sequenciais de purificação de placa, o recombinante, designado como vCP2199, foi produzido e confirmado por hibridação, como 100% positivo para a inserção Nipah G e 100% negativo para a C5 ORF.

Construção do recombinante da Varíola das Aves de Capoeira expressando Nipah G, VFP2200. Os genes eram Nipah G. O plasmídeo dador era pSL6802-2-5. O sítio de inserção era F8. O promotor era o promotor H6. As células para recombinação in vitro eram as células de fibroblastos primários de embrião de galinha (1°CEF) cultivadas em FBS a 10%, DMEM. A recombinação in vitro foi realizada por transfecção de células 1°CEF com o plasmídeo dador pSL6802-2-5 (15 pg) linearizado com Not I. As células transfectadas foram subsequentemente infectadas com Varíola das Aves de Capoeira como vírus de resgate a MOI de 8. Após 48 h, as células infectadas transfectadas foram recolhidas, sonicadas e utilizadas para rastreio de vírus recombinante. As placas recombinantes foram rastreadas com base no método de hibridação de transferência de placa, utilizando uma sonda específica de 40

Nipah G que foi marcada com peroxidase de rábano. Após quatro séries sequenciais de purificação de placa, o recombinante, designado como vFP2200, foi produzido. Foram confirmados por hibridação, como 100% positivo para a inserção Nipah G e 100% negativo para a F8 ORF.

Construção do recombinante da Varíola dos Canários expressando Nipah F, vCP2208. O gene era Nipah F. O plasmídeo dador era pSL6851.29 (pC5 H6p Nipah F) . O sítio de inserção era C5. O promotor era o promotor H6 de vaccinia. As células para recombinação in vitro eram as células de fibroblastos primários de embrião de galinha (1°CEF) cultivadas em FBS a 10%, DMEM. A recombinação in vitro foi realizada por transfecção de células 10 CEF com o plasmídeo dador pSL6851.29 (10 pg) linearizado com Not I. As células transfectadas foram subsequentemente infectadas com ALVAC como vírus de resgate a MOI de 10. Após 24 h, as células infectadas transfectadas foram recolhidas, sonicadas e utilizadas para rastreio de vírus recombinante. As placas recombinantes foram rastreadas com base no método de hibridação de transferência de placa, utilizando uma sonda específica de Nipah F que foi marcada com peroxidase de rábano. Após quatro séries sequenciais de purificação de placa, o recombinante, designado como vCP2208, foi produzido e confirmado por hibridação, como 100% positivo para a inserção Nipah F e 100% negativo para a C5 ORF. 41

Exemplo 2: Expressão

Transferência de Western de Varíola das Aves de Capoeira Nipah G, VFP2200 (FIG. 6) . Células CEF primárias foram infectadas com vCP2199 (ALVAC C5 H6p Nipah G) e vFP2200 (Varíola das Aves de Capoeira F8 H6p Nipah G) a MOI de 10 e incubadas, a 37 °C, durante 24 hrs. As células e sobrenadante de cultura foram, depois, recolhidos. As proteínas de amostra foram separadas num gel SDS-PAGE, a 10%, transferidas para membrana de nylon Immobilon. O anti-soro de cobaio e sistema de quimioluminescência foram utilizados. O Nipah G foi expresso em sedimentos celulares para vCP2199 e vFP2200. Não surgiu no sobrenadante.

Transferência de Western de ALVAC Nipah F, vCP2208 (FIGS. 7A e 7B). As células CEF primárias foram infectadas com VCP2208. (ALVAC C5 H6p Nipah F) a MOI de 10 e incubadas durante 24 horas. O sobrenadante foi recolhido e clarificado. As células foram recolhidas e suspensas em água para lise. O lisado e sobrenadante foram separados por SDS-PAGE a 10%. A proteína foi transferida para membrana de nylon e bloqueada com tampão de bloqueio de Western. Utilizando anti-soro de cobaio e sistema de desenvolvimento de quimioluminescência foram mostradas expressões de proteína F a partir de vCP2208 (ALVAC C5 H6p Nipah F) . Utilizando anti-soro porcino e sistema de peroxidase de rábano foi, também, mostrada expressão da proteína F a partir de vCP2208 mas com uma intensidade inferior.

Transferência de Western de ALVAC Nipah G, vCP2199 (FIG. 6). Células CEF primárias foram infectadas com VCP2199 (ALVAC C5 H6p Nipah G) e vFP2200 (Varíola das Aves de Capoeira F8 H6p Nipah G) a MOI de 10 e incubadas, a 37 °C, durante 24 h. 42

As células e sobrenadante de cultura foram, depois, recolhidos. As proteínas de amostra foram separadas num gel SDS-PAGE, a 10%, transferidas para membrana de nylon Immobilon. O anti-soro de cobaio e sistema de quimioluminescência foram utilizados. O Nipah G foi expresso em sedimentos celulares para vCP2199 e vFP2200. Não surgiu no sobrenadante.

Transferência de Western de Varíola das Aves de Capoeira Nipah F, vFP2207 (FIGS. 7A e 7B) . Células CEF primárias foram infectadas com vFP2207 (Varíola das Aves de Capoeira F8 Ηβρ Nipah F) a MOI de 10 e incubadas durante 24 hrs. O sobrenadante foi recolhido e clarificado. As células foram recolhidas e suspendidas em água para lise. O lisado e sobrenadante foram separados por SDS-PAGE a 10%. A proteína foi transferida para membrana de nylon e bloqueada com tampão de bloqueio de Western. Utilizando anti-soro de cobaio e sistema de desenvolvimento de quimioluminescência foram mostradas expressões de proteína F a partir de VFP2207 (Varíola das Aves de Capoeira F8 Ηβρ Nipah F). Utilizando anti-soro porcino e sistema de peroxidase de rábano foi, também, mostrada expressão da proteína F a partir de vFP2207 mas com uma intensidade inferior.

Exemplo 3: Serologia e Protecçao

Dezasseis porcos foram alocados aleatoriamente em quatro grupos. Os animais do grupo F foram imunizados com 108 pfu/dose de VCP2208 expressando proteína F do vírus Nipah. Os animais do grupo G foram imunizados com 108 pfu/dose de VCP2199 expressando proteína G do vírus Nipah. Os animais do grupo G+F foram imunizados com uma mistura contendo 108 pfu/dose de VCP2199 e 108 pfu/dose de VCP2208 expressando, respectivamente, as 43 proteínas G e F do vírus Nipah. Os animais do grupo de provocação eram animais de controlo não vacinados.

Os porcos foram injectados por via intramuscular no Dia 0 e Dia 14. Os porcos foram provocados por inoculação intranasal de 2,5xl05 pfu de vírus Nipah no Dia 28. Sete dias após provocação, a presença de vírus é identificada por RT-PCR ou isolamento de virus em diversos órgãos e em esfregaços nasais. As amostras sanguíneas são recolhidas em DO, D7, D14, D21, D28, D29, D30, D31, D32, D34 e D35 após a primeira injecção e os títulos de anticorpos são medidos por ensaio de ELISA indirecto de IgG ou seroneutralização. Os anticorpos de neutralizante foram determinados em ensaio de neutralização de redução de placa de microtitulação (mPRNT) , como anteriormente descrito (H. Weingartl et al. Can. J. Vet. Rrs. 2003, 67, 128-132), utilizando células Vero V-76 e revestimento de carboximetilcelulose a 1%. Poços com redução de placa de 90% foram considerados positivos para a presença de anticorpos neutralizantes de vírus Nipah. Os dados de ELISA e títulos neutralizantes (NT) são apresentados na Tabela 1. O combinado Nipah F/G induziu o título neutralizante mais elevado antes de provocação, seguido de perto pela vacina G. A vacina F induziu anticorpos neutralizantes inferiores.

Ensaio de Placa de Vírus: O ensaio de placa de vírus foi realizado em placas de 12 poços (Costar, Corning, NI) com monocamadas confluentes Vero 76 ou PT-K75. O inoculo de vírus (400 pL/poço) foi incubado em células durante 1 h, a 33 °C, C02 a 5% e, depois, substituído com 2 mL de carboximetilcelulose a 2%, sal de sódio, viscosidade média/DMEM (Sigma química, St. Louis, MO)/revestimento de FBS a 2% e incubado a 33 °C, C02 a 5%. As células foram fixadas após 5 dias com formaldeído a 4% e coradas 44 com 0,5% de violeta de cristal/metanol a 80%/PBS. O RT-PCR em tempo real foi realizado em amostras de soro/plasma e apenas PMBC, de acordo com V. Guillaume et al. J. Virol. Method. 2004, 120, 229-237, utilizando um SmartCycler (Cepheid), Quantitech kit (Qiagen) e iniciadores e sonda (Applied Biosystems International) localizados dentro do gene N. O iniciador directo GCA CTT GAT GTG ATT AGA (SEQ ID N° 29) e iniciador inverso GGC AGT GTC GGG AGC TGT AA (SEQ ID N° 30), localizados dentro do gene N, produzindo um produto de amplificação de 395 pb. O RT-PCR em tempo real foi estandardizado utilizando o gene N do virus Nipah clonado dentro do plasmídeo pSHAME2a, com sensibilidade de 300 cópias/reacção em amostra de 100 pL. As amostras tornando-se positivas a 35 ciclos foram consideradas negativas. O virus Nipah foi isolado a titulo muito baixo em gânglio trigeminal de porco N° 33 (uma placa), N° 35 (uma placa) e #36. Em animais de controlo, o vírus Nipah poderia ser reisolado de um certo número de tecidos até 10e3 pfu/mL: porco N° 39 positivo em cornetos, traqueia, bolbos olfactivos, gânglio trigeminal, nódulo linfático bronquiolar e nódulos linfáticos submandibulares (LN); porco N° 40 positivo em cornetos, traqueia, bolbo olfactivo, meninges, gânglio trigeminal, LN bronquiolar, LN submandibular e cérebro. Os resultados de RT-PCR são proporcionados nas Tabelas 2 e 3. As figuras são números de ciclos limiares. Não é detectado ARN em plasma, soro ou PBMC de porcos imunizados dos porcos imunizados com a vacina F/G.

Estes resultados mostram uma clara protecção, com o recombinante expressando as proteínas F ou G do vírus Nipah e uma protecção total com a combinação de proteínas F+G do vírus Nipah. 45

Exemplo 4: Neutralização cruzada

Dezoito porcos foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos. 0 grupo F de 4 animais foi imunizado com 108 pfu/dose de vCP2208 expressando proteína F do vírus Nipah. 0 grupo G de 4 animais foi imunizado com 108 pfu/dose de VCP2199 expressando proteína G do vírus Nipah. 0 grupo G+F de 4 animais foi imunizado com uma mistura contendo 108 pfu/dose de VCP2199 e 108 pfu/dose de VCP2208 expressando, respectivamente, as proteínas G e F do vírus Nipah. Como grupo de controlo não vacinado, 6 animais foram naturalmente infectados com vírus Nipah e conduzidos até 28 dias após infecção (dpi) . Este grupo foi denominado "infecção de longo prazo".

Os porcos dos grupos F, G e G+F foram injectados por via intramuscular no Dia 0 e Dia 14. As amostras de sangue são recolhidas em D27 após a vacinação (dpv ou dia após vacinação) e os títulos de anticorpos são medidos por ensaio de seroneutralização. Os anticorpos neutralizantes foram determinados em ensaio de neutralização de redução de placa de microtitulação (mPRNT) como anteriormente descrito (H. Weingartl et ai. Can. J. Vet. Rrs. 2003, 67, 128-132), utilizando células Vero V-76 semeadas em placa de 96 poços a l,2xl05 células/cm2 (40000 células por poço) incubadas em C02 a 5%, 37 °c, com meio DMEM suplementado com FBS a 10%. 100 pL de diluições séricas seriais duplas (1/10 - 1/1280) foram incubados durante 1 hora, C02 a 5%, 37 °C, com 100 pL de vírus Hendra ou Nipah ajustados para conter 1000 PFU por 100 pL. Todas as diluições foram preparadas em DMEM.

Após incubação, 100 pL da mistura anterior foram transferidos para monocamada de células V76. A placa com inoculo foi incubada, durante 1 hora, a C02 a 5%, 37 °C.

Após 1 hora, o inoculo foi removido e substituído com 100 pL de solução de carboximetilcelulose a 2% em DMEM suplementado com FBS a 2%. As placas foram incubadas a C02 a 5%, 37 °C, durante 72 horas. A titulação inversa para o vírus Nipah proporcionou o resultado de que a diluição de trabalho foi 500 PFU/poço e para o vírus Hendra: 625 PFU/poço.

Nota: Os soros dos porcos vacinados com proteína F foram diluídos duas vezes de 1/50 para 1/2400.

Poços com redução de placa de 90% foram considerados positivos para a presença de anticorpos neutralizantes de vírus Nipah ou para a presença de anticorpos neutralizantes de vírus Hendra. Os dados de títulos neutralizantes são apresentados na Tabela 4. O combinado Nipah F/G induziu um efeito sinérgico para a produção de anticorpos contra o vírus Hendra que não são produzidos durante uma infecção natural por vírus Nipah (ver os resultados do grupo de infecção de longo prazo). A vacina G ou a vacina F isoladas não induziram anticorpos neutralizantes, ou induziram inferiores, contra os vírus Hendra do que a vacina F+G. Não existe correlação entre os níveis de título de anticorpo contra vírus Nipah e aqueles contra os vírus Hendra. 47

Tabela 1: Dados de ELISA e NT (dpv = dias após vacinacão, dpi = dias após infeccão)

Dados de ELISA

N4F

N4G

Provocação N4

144 G+F

Porco Ν’ 31 32 33 34 35 36 37 311 39 40 41 42 43 44 45 46 prevac 7 dpv 21 dpv

Dados de NT prevac 7 dpv 21 dpv ço 1600 3200 1600 (An 1600

Pie 1600 31 31 31 1600 31 3200 100 1600 ϋφ

Porco Ν’

Refor ço b.

N4F N4

Provocação N4

N4G+F 31 <20 <20 32 33 34 35 36 37 30 39 40 41 42 43 44 45 46 <20 <20 <20 <20 <20 20 <320 <20 <20 <20 <20 <20 <20 <20 20 <20 <20 40 JL <320 <20 Ví 1280 320 JL 640 48

Tabela 2: RT-PCR em tempo real em tecidos (CSF = fluido cerebrospinal, LN = nódulo linfático) amostra 31 32 33 34 35 36 37 38 39 RT 40 RT 41 RT 42 RT 43 44 45 46 F G provocação FKi cérebro 28 24 24,3 posterior 31 24.8 24,8 CSF nd 0 29.3 30.5 „ _ 29.6 28.9 bolbo 25 18 23.5 nd olfativo /3 30 19 23.8 2 gânglio . m 28. 30 32 . 26 18 25.1 18.8 trigeminal 3 19 25 23.8 cornetos 19 18 27.6 25.6 m . m 20 30,8 29 traqueia - . . 29 • • 31 31 18 19 29 0- 9 m . 19.7 28.2 pulmão - 0 • • - - - • LN submand i bular 23 23 -?nd «M e 49

Tabela 3: RT-PCR em tempo real, esfregaços faríngeos

39 40 41 42 43 44 45 46 RT RT RT RT 50

Tabela 4: Títulos de neutralização

Grupos Infecção de longo prazo Vacinado com F Vacinado com G Vacinado com G+F dpi 23 11 29 21 24 28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 dpv - - - - - - 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 Titulação de vírus 320 320 640 640 640 1280 200 200 200 400 640 1280 2560 1280 1280 1280 640 1280 Nipah Titulação de vírus 0 0 0 0 0 0 0 0 20 0 0 20 0 0 80 80 80 80 Hendra A invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes parágrafos numerados: 1. Vector de expressão de varíola aviária compreendendo um polinucleótido que codifica uma glicoproteína do vírus Nipah, onde o vector de expressão de varíola aviária é um vector de varíola dos canários. 2. Vector de expressão de varíola aviária do parágrafo 1, em que a glicoproteína do vírus Nipah é a proteína de conjugação (G) . 3 . Vector de expressão de varíola aviária do parágrafo 1, em que a glicoproteína do vírus Nipah é a proteína de fusão (F) • 4 . Vector de expressão de varíola aviária do parágrafo 1, em que a glicoproteína do vírus Nipah é a proteína de conjugação (G) e a proteína de fusãc • (F) . 5. Vector de expressão de varíola aviária do parágrafo 2, em que o polinucleótido compreende a sequência de bases nucleotídicas do nucleótido 8943 ao nucleótido 10751 da SEQ ID N° 1. 6. Vector de expressão de varíola aviária do parágrafo 3, em que o polinucleótido compreende a sequência de bases nucleotídicas do nucleótido 6654 ao nucleótido 8294 da SEQ ID N° 1. 7. Vector de expressão de varíola aviária do parágrafo 4, em que o polinucleótido codifica o péptido da SEQ ID N° 8. 52 8. Vector de expressão de varíola aviária do parágrafo 2, em que o polinucleótido codifica o péptido da SEQ ID N° 7. 9. Vector de expressão de varíola aviária do parágrafo 3, em que o polinucleót ido compreende o péptido da SEQ ID N° 7 e o péptido da SEQ ID N° 8. 10. Vector de expressão de varíola aviária do parágrafo 5, em que o polinucleótido compreende a sequência de bases nucleotidicas do nucleótido 6654 ao nucleótido 10751 da SEQ ID N° 1. 11. Vector de expressão de varíola aviária dos parágrafos 1 a 10, em que o vector de expressão de varíola aviária é um vector de expressão de varíola aviária atenuado. 12. Vector de varíola dos canários do parágrafo 1, em que o vector de varíola dos canários é ALVAC. 13. Vector de expressão, em que o vector de expressão é VCP2199. 14. Vector de expressão, em que o vector de expressão é VCP2208. 15. Formulação para distribuição e expressão de uma glicoproteína do vírus Nipah, em que a formulação compreende o vector de qualquer um dos parágrafos 1 a 16 e um transportador, veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. 53 16. Formulação do parágrafo 15, em que o veículo, transportador ou excipiente facilita a transfecção e/ou melhora a preservação do vector. 17. Composição para utilização na dedução de uma resposta imunitária num animal, a composição compreendendo o vector de qualquer um dos parágrafos 1 a 14 numa quantidade eficaz para a dedução de uma resposta imunitária. 18. Composição para utilização na dedução de uma resposta imunitária num animal, a composição compreendendo uma célula, em que a célula compreende o vector de qualquer um dos parágrafos 1 a 14 numa quantidade eficaz para a dedução de uma resposta imunitária. 19. Composição para utilização na dedução de uma resposta imunológica ou protectora num animal, a composição compreendendo o vector de qualquer um dos parágrafos 1 a 14 numa quantidade eficaz para a dedução de uma resposta imunitária. 20. Composição para utilização na dedução de uma resposta imunológica ou protectora num animal compreendendo uma célula, em que a célula compreende o vector de qualquer um dos parágrafos 1 a 14 numa quantidade eficaz para a dedução de uma resposta imunitária. 21. Composição de qualquer um dos parágrafos 17 a 20, em que o animal é um porco. 22. Composição para utilização na prevenção da transmissão do vírus Nipah entre um primeiro animal e um segundo 54 animal, compreendendo a composição de qualquer um dos parágrafos 17 a 20, em que o animal de qualquer um dos parágrafos 17 a 20 é o primeiro animal. 23. Composição do parágrafo 22, em que o primeiro animal é um porco. 24. Composição do parágrafo 22 ou 23, em que o segundo animal é um humano. 25. Composição do parágrafo 22 ou 23, em que o segundo animal é um gato ou um cão. 33. Kit compreendendo os vectores de qualquer um dos parágrafos 1 a 14 ou as formulações de qualquer um dos parágrafos 15 ou 16 e instruções para utilização do kit nas utilizações referidas para qualquer um dos parágrafos 17-25.

Lisboa, 24 de Maio de 2010 55

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Vector de expressão de varíola aviária compreendendo um polinucleótido que codifica uma glicoproteína do vírus Nipah, em que o vector de expressão de varíola aviária é um vector de varíola dos canários.
2. Vector de expressão de varíola aviária da reivindicação 1, em que a glicoproteína do vírus Nipah é a proteína de conjugação (G).
3. Vector de expressão de varíola aviária da reivindicação 1, em que a glicoproteína do vírus Nipah é a proteína de fusão (F) .
4. Vector de expressão de varíola aviária da reivindicação 1, em que a glicoproteína do vírus Nipah é a proteína de conjugação (G) e a proteína de fusão (F).
5. Vector de expressão de varíola aviária de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o vector de expressão de varíola aviária é um vector de expressão de varíola aviária atenuado.
6. Vector de varíola dos canários de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o vector de varíola dos canários é ALVAC.
7. Vector de expressão da reivindicação 1, em que o vector de expressão é vCP2199. 1
8. Vector de expressão da reivindicação 1, em que o vector de expressão é VCP2208.
9. Formulação para distribuição e expressão de uma glicoproteina do vírus Nipah, em que a formulação compreende o vector de qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e um veículo, transportador ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.
10. Formulação da reivindicação 9, em que oveículo, transportador ou excipiente facilita a transfecção e/ou melhora a preservação do vector. Lisboa, 24 de Maio de 2010 2 1/39 Vírus Nipah, qenoma completo: 1 accaaacaag ggagaatatg gatacgttaa aatatataac gtatttttaa aacttaggaa 61 ccaagacaaa cacttttggt cttggtattg gatcctcaag aaatatatca tcatgagtga 121 tatctttgaa gaggcggcta gttttaggag ttatcaatct aagttaggga gagatgggag 181 ggctagtgca gcaactgcta ctttgacaac caagataagg atatttgtac cagctactaa 241 tagtccagag ctcagatggg aactaacatt gtttgcactt gatgtgatta gatctccgag 301 tgctgccgag tcaatgaaag ttggagctgc tttcacactc atctctatgt attcagagag 361 acccggggct ctcattagaa gtctcctcaa tgacccagac attgaagctg taataataga 421 tgttggatca atggtcaacg gaataccagt aatggagagg agaggagaca aggctcagga 481 ggagatggaa ggcttgatga gaatcctcaa aactgctcga gacagcagca agggaaaaac 541 accttttgtt gacagccgag cttacggcct acggataaca gacatgagca ccctggtctc 601 tgcagttatc accatcgagg cccagatctg gatactgatc gctaaagcag ttacagctcc 661 cgacactgcc gaggaaagtg aaactagaag atgggctaaa tacgtccaac aaaagagagt 721 caatccgttc tttgctctaa ctcagcaatg gctaacagaa atgaggaatc tgctctccca 781 gagtctatca gtaaggaagt tcatggttga gatcctcata gaagtcaaga aaggaggatc 841 tgctaaaggc agagcagtag aaataatctc agacatcgga aactatgtcg aggaaactgg 901 tatggcagga ttcttcgcaa ccatcagatt cgggttggag acaaggtatc cagcacttgc 961 actcaacgaa ttccagagtg acctcaacac catcaaaagc ttgatgctac tctacagaga 1021 aattggccca agagcccctt atatggtgct tcttgaagaa tcaattcaga ctaaatttgc 1081 ccctggaggt tacccattat tgtggagctt tgccatgggt gtggctacta ctattgacag 1141 gtctatgggg gcattgaata tcaatcgtgg ttatcttgag cctatgtatt tcagactagg 1201 ccaaaaatca gcacgtcacc atgctggagg aattgatcag aacatggcaa atagactggg 1261 actaagttca gatcaagttg cagaactcgc tgctgcagtt caggaaacat cagcaggaag 1321 gcaagagagt aatgttcagg ctagagaggc aaaatttgct gcaggaggtg tgctcattgg 1381 aggcagtgat caagatatcg atgaagggga agaacctata gaacagagtg gcagacagtc 1441 agttaccttc aaaagggaga tgagtatttc atcccttgct aacagtgtgo cgagcagttc 1501 tgtgagcaca tccggtggga ccagattgac taattcatta ctaaacctca gatcaagact 1561 ggctgcaaaa gcagcaaaag aagccgcctc atccaatgca acagatgatc cagcaatcag 1621 caacagaact caaggggaat cagagaagaa gaataatcaa gacctcaaac ctgctcaaaa 1681 tgaccttgat ttcgtcagag ctgatgtgtg acgtctattt ccaatattct acagtatcca 1741 aaaatctttc tatagtacac tatcataata cgacactaag ggatcaacca tatcaaagtt 1801 acgaatcgtt ttaattatat taatcaaatg atactctttt atgggcaaac cgaagaacca 1861 atgtctacat gtaaattgag ctttggtatt gcaatctaat acttgctcaa aatcttgaac 1921 tattagtgta atttctatca tcatagagtt atcaagattt tattatataa gttggtgcag 1981 atctttggac atgaattaca cactacactc taatgaagac aaaatttaca ttacatattt 2041 aaggactatt tcctatcctt tcaatggtac ttggttatga aggtttctta atttaactaa 2101 gctactgtct ttgcactgga atatacaata cctcttacct catttcttac tttaatatca 2161 tgttattttt ttgataagtc acttaacttg accaaggtct accaggtaat gctcgcacaa 2221 gtgaactgca atctcaactt agattaaaca taatcatgca aaatcactat tttgtactac 2281 taactcatta agaaaaactt aggatccaag agatttactc taggatctcc tattaagctt 2341 agcagtcatt agttgagagt tcaacttgca aaactctaac cttcactcta ataacaattc 2401 atccaatgga taaattggaa ctagtcaatg atggcctcaa tattattgac tttattcaga 2461 agaaccaaaa agaaatacag aagacatacg gacgatcaag tattcaacaa cccagcatca 2521 aagatcaaac aaaagcctgg gaagattttc tgcagtgcac cagtggagaa tctgaacaag 2581 ttgagggggg aatgtctaag gatgatggag atgttgaaag aagaaacttg gaggatctat 2641 ccagtacttc tcccacagat ggaactattg gaaagagagt gtcgaacacc cgtgactggg 2701 cagaaggttc agatgacata caactggacc cagtggttac agacgttgta taccatgatc 2761 atggaggaga atgtaccgga tatggattta cttcaagccc tgagagaggg tggagtgatt 2821 acacatcagg agcaaacaat gggaatgtat gtcttgtatc tgatgcaaag atgctgtcct 2881 atgctcccga aattgcagtt tctaaagaag atcgggaaac tgatctagtt catcttgaga 2941 ataaactatc tactacagga ctgaatccca cagcagtacc gttcactctg agaaacctgt 3001 ctgatcctgc aaaagactct cctgtgattg ctgaacacta ctacggacta ggagttaaag 3061 agcaaaacgt tggccctcag actagcagaa atgtcaattt ggacagcatc aaattgtaca 3121 catcagatga cgaagaggca gatcagcttg aattcgaaga tgagtttgca ggaagctcaa FIG. 1A (FOLHA 1 de 39) 2/39 3181 gtgaagtgat agtcggcatt tctcctgaag atgaagagcc ttcaagtgtt ggcggaaaac 3241 ccaatgaatc cattggacgt acaatcgaag gccaatcaat ccgagacaac cttcaagcca 3301 aggacaacaa atcaacagat gtaccaggag caggaccgaa agattcagca gtgaaggaag 3361 aaccacccca gaagaggcta cctatgttag ctgaagaatt tgagtgctct ggatcggaag 3421 acccaatcat tcgggagctg ctgaaggaga actcactcat aaattgtcag caagggaaag 3481 atgctcagcc tccatatcat tggagcatcg agaggtcaat aagcccggat aaaactgaga 3541 tcgtcaacgg tgctgtgcaa actgctgaca ggcaaagacc aggaactccg atgccaaagt 3601 cccgaggtat tcccattaaa aagggcacag acgcgaaata tccatctgct gggacggaaa 3661 acgtgcctgg gtcgaagagt ggtgcaaccc ggcatgttcg aggatcaccc ccctaccaag 3721 aaggcaagag tgtcaatgcg gagaatgtcc aactgaatgc ttccactgcg gttaaggaaa 3781 ctgataagtc agaagtaaac cccgtagacg acaacgactc acttgatgat aaatacatca 3841 tgccttcaga tgatttctca aacactttct tcocgcacga cactgatcgc ttgaattatc 3901 acgcagatca tttaggtgat tatgaccttg aaaccctgtg tgaagagtcg gttctaatgg 3961 gagtgatcaa ctctataaaa ttaattaatc tggatatgcg cttaaatcac attgaagaac 4021 aagttaaaga gatcccaaag atcatcaata agcttgagtc cattgacaga gttctggcca 4081 agactaacac cgcactctca accattgaag gacacctggt ttccatgatg ataatgatac 4141 cagggaaagg gaaaggagaa agaaagggga aaaataatcc tgagcttaaa ccagtgatag 4201 gaagagacat tctagagcag caatctcttt tttcttttga caatgtcaag aatttcagag 4261 atggatcgtt gacaaacgaa ccgtatgggg cagctgtaca gttgagagaa gatcttattc 4321 ttcctgaact taattttgag gagacaaatg catctcaatt tgttcctatg gcagatgatt 4381 catccagaga tgttatcaag acattgataa ggactcacat taaagataga gagttgagat 4441 cagaactgat tggttacctg aataaagcgg aaaatgatga ggaaattcag gagatagcga 4501 acactgtcaa tgacatcatt gacggtaata tttgatcact gaattgtcag cagaaataca 4561 atgatctaac aacaatctcc cacaagtaga caatggtttc aggtcaataa taacaacctc 4621 aatactaatc tttcacataa gcattactca ttccagccct cagacgataa cacaatactt 4681 gatacatgtt tattgaagtg tatgtagcat gattgaacta ttcaataact gtatttctca 4741 ctcttgctct tagttagtca ttgtgtctaa taattattat tacagtacaa ggtattatga 4801 attcaaagat aegcaataaa tctgatatca gcatagagta gaaaattgtt gtttttgtca 4861 tgatcattcg aagatttaac aatgatgtca actttcatac ctaaacataa taacataaaa 4921 tggtcgattt gtattgtaga tctctcacgc attttagtgt catgaattag tgtttcaaat 4981 cagttgcata tcaattaaga aaaacttagg agacaggtat agaacctctc tttcagataa 5041 ctggtcaatt aaggacagaa attctgtttc tcaaatccgc tagcctttgt caaagaggac 5101 acaagcaatg gagccggaca tcaagagtat ttcaagtgag tcaatggaag gagtatctga 5161 tttcagccct agttcttggg agcatggtgg gtatcttgat aaggttgaac cagaaattga 5221 tgaaaatggc agtatgattc caaaatacaa gatctatacc ccaggagcta acgagaggaa 5281 atacaacaac tacatgtacc ttatatgtta cggctttgtt gaagatgttg agagaacccc 5341 agagacaggg aaacgcaaga agatcaggac aattgctgcc taccctctgg gtgttggtaa 5401 gagtgcctct catccccaag atcttctgga ggaactctgt tccctcaaag ttactgtgag 5461 aagaacagct ggatcaactg agaaaattgt gtttggatca tctggccctc taaatcacct 5521 cgttccgtgg aagaaagtac tgactagtgg ttcaattttt aatgcagtca aggtttgtcg 5581 gaacgttgat cagatacagc ttgacaagca tcaagctctg agaatatttt ttctcagtat 5641 cacaaagctc aatgattctg gaatctacat gattccacga accatgcttg agttcaggag 5701 aaacaatgcc attgccttca atcttctagt gtacttgaag attgatgctg atttatccaa 5761 aatggggatc cagggaagcc tcgataaaga tggcttcaag gttgcctcct tcatgctaca 5821 cttggggaac tttgtccgtc gtgcagggaa gtattactct gttgattatt gtaggaggaa 5881 gattgatagg atgaaattgc agttttcact gggttccata ggcggactaa gtctccacat 5941 taagatcaat ggtgtaatca gcaaacggct gtttgctcaa atgggattcc aaaaaaacct 6001 ttgtttctct ttgatggaca tcaatccttg gctcaacaga ttgacctgga acaacagttg 6061 tgagatcagc cgagtagcag ctgtgttgca gccttctatt ccaagagagt tcatgatcta 6121 tgatgatgtc ttcattgaca atacagggag aattctaaag ggctaaacag aattcttcta 6181 aaatttaatc agtcatgagt ttagtaatca tacctagtca taatacatca cacaggacta 6241 ttfcacaaaag acagttaaaa aatggaataa tcatgtagta gtaattgaga acattattag 6301 aatagtataa ctaaaatgta gtttttttga gtatttgatt taaaattaga taactattac 6361 aaaaaactta ggagccaagc tcttgcctcg ttcagaaggt taaacaagca ttcttaccat FIG. 1A (FOLHA 2 de 39) 3/39 6_1 tggatcaaca aaaggattgg ttttatcgtc taagaaattt attgaaaggc aaagaaattc 6481 ctggttttat gttgaatgag gtgtatcaaa ctaaggagac cttctaacag ccaggtcata 6541 ggaatataaa taaaaataag aataaaattg attccatcgg aagattcatt tcaagaagtg 6601 atcaaatcaa agcggttggc agacctacca atcatatacc acaagactcg acaatggtag 6661 ttatacttga caagagatgt tattgtaatc ttttaatatt gattttgatg atctcggagt 6721 gtagtgttgg gattctacat tatgagaaat tgagtaaaat tggacttgtc aaaggagtaa 6781 caagaaaata caagattaaa agcaatcctc tcacaaaaga cattgttata aaaatgattc 6841 cgaatgtgtc gaacatgtct cagtgcacag ggagtgtcat ggaaaattat aaaacacgat 6901 taaacggtat cttaacacct ataaagggag cgttagagat ctacaaaaac aacactcatg 6961 accttgtcgg tgatgtgaga ttagccggag ttataatggc aggagttgct attgggattg 7021 caaccgcagc tcaaatcact gcaggtgtag cactatatga ggcaatgaag aatgctgaca 7081 acatcaacaa actcaaaagc agcattgaat caactaatga agctgtcgtt aaacttcaag 7141 agactgcaga aaagacagtc tatgtgctga ctgctctaca ggattacatt aatactaatt 7201 tagtaccgac aattgacaag ataagctgca aacagacaga actctcacta gatctggcat 7261 tatcaaagta cctctctgat ttgctttttg tatttggccc caaccttcaa gacccagttt 7321 ctaattcaat gactatacag gctatatctc aggcattcgg tggaaattat gaaacactgc 7381 taagaacatt gggttacgct acagaagact ttgatgatct tctagaaagt gacagcataa 7441 caggtcaaat catctatgtt gatctaagta gctactatat aattgtcagg gtttattttc 7501 ctattctgac tgaaattcaa caggcctata tccaagagtt gttaccagtg agcttcaaca 7561 atgataattc agaatggatc agtattgtcc caaatttcat attggtaagg aatacattaa 7621 tatcaaatat agagattgga ttttgcctaa ttacaaagag gagcgtgatc tgcaaccaag 7681 attatgccac acctatgacc aacaacatga gagaatgttt aacgggatcg actgagaagt 7741 gtcctcgaga gctggttgtt tcatcacatg ttcccagatt tgcactatct aacggggttc 7801 tgtttgccaa ttgcataagt gttacatgtc agtgtcaaac aacaggcagg gcaatctcac 7861 aatcaggaga acaaaetctg ctgatgattg acaacaccac ctgtcctaca gccgtactcg 7921 gtaatgtgat tatcagctta gggaaatatc tggggtcagt aaattataat tctgaaggca 7981 ttgctatcgg tcctccagtc tttacagata aagttgatat atcaagtcag atatccagca 8041 tgaatcagtc cttacaacag tctaaggact atatcaaaga ggctcaacga ctccttgata 8101 ctgttaatcc atcattaata agcatgttgt ctatgatcat actgtatgta ttatcgatcg 8161 catcgttgtg tatagggttg attacattta tcagttttat cattgttgag aaaaagagaa 8221 acacctacag cagattagag gataggagag tcagacctac aagcagtggg gatctctact 8281 acattgggac atagtgtatt cagattgatg aaattatgtt agagaaatca gaaaacttct 8341 gactttcaga aatggattgt atacaattag ttagatcatc ctgaataatc gaggtgagaa 8401 cattgcaact ataaaatcag atcatgtaaa tagttgtaaa aaattaaaag cttcttttaa 8461 ttcttttgaa caataattta attaatatat aacatattct ctcacacgag cgctaaccta 8521 tacactctct actaatattt tatactcata attaatgata taatgacaaa taaggattca 8581 aattggatta tgatatagtt tcatactaca atagcatttc gaccaagaaa atatccttac 8641 aattatacaa tgtacttaac cgtgaatatg taattgataa tttcccttta gaaatttaat 8701 aaaaaactta ggacccaggt ccataactca ttggatactt aactgtatct ttctaagcta 8761 tcacatatca aaggagagat tgaatgcttt tttggagatc tagatcatta ctatatgtgt 8821 ctcctataat cacatcatag gagtgaacca taatacacat ctttgggtag gggaaggaaa 8881 gtattgttga cgtactgatt gatctgcttg agtcaaataa tcagtcataa caattcaaga 8941 aaatgccggc agaaaacaag aaagttagat tcgaaaatac tacttcagac aaagggaaaa 9001 ttcctagtaa agttattaag agctactacg gaaccatgga cattaagaaa ataaatgaag 9061 gattattgga cagcaaaata ttaagtgctt tcaacacagt aatagcattg cttggatcta 9121 tcgtgatcat agtgatgaat ataatgatca tccaaaatta cacaagatca acagacaatc 9181 aggccgtgat caaagatgcg ttgcagggta tccaacagca gatcaaaggg cttgctgaca 9241 aaatcggcac agagataggg cccaaagtat cactgattga cacatccagt accattacta 9301 tcccagctaa cattgggctg ttaggttcaa agatcagcca gtcgactgca agtataaatg 9361 agaatgtgaa tgaaaaatgc aaattcacac tgcctccctt gaaaatccac gaatgtaaca 9_1 tttcttgtcc taacccactc ccttttagag agtataggcc acagacagaa ggggtgagca 9481 atctagtagg attacctaat aatatttgcc tgcaaaagac atctaatcag atattgaagc 9541 caaagctgat ttcatacact ttacccgtag tcggtcaaag tggtacctgt atcacagacc 9601 cattgctggc tatggacgag ggctattttg catatagcca cctggaaaga atcggatcat FIG.1A (FOLHA 3 de 39) 4/39 9661 gttcaagagg ggtctccaaa caaagaataa taggagttgg agaggtacta gacagaggtg 9721 atgaagttcc ttctttattt atgaccaatg tctggacccc accaaatcca aacaccgttt 9781 accactgtag tgctgtatac aacaatgaat tctattatgt actttgtgca gtgtcaactg 9841 ttggagaccc tattctgaat agcacctact ggtccggatc tctaatgatg acccgtctag 9901 ctgtgaaacc caagagtaat ggtgggggtt acaatcaaca tcaacttgcc ctacgaagta 9961 tcgagaaagg gaggtatçat aaagttatgc cgtatggacc ttcaggcatc aaacagggtg 10021 acaccctgta ttttcctgct gtaggatttt tggtcaggac agagtttaaa tacaatgatt 10081 caaattgtcc catcacgaag tgtcaataca gtaaacctga aaattgcagg ctatctatgg 10141 ggattagacc aaacagccat tatatccttc gatctggact attaaaatac aatctatcag 10201 atggggagaa ccccaaagtt gtattcattg aaatatctga tcaaagatta tctattggat 10261 ctcctagcaa aatctafcgat tctttgggtc aacctgtttt ctaccaagcg tcattttcat 10321 gggatactat gattaaattt ggagatgttc taacagtcaa ccctctggtt gtcaattggc 10381 gtaataacac ggtaatatca agacccgggc aatcacaatg ccctagattc aatacatgtc 10441 cagagatctg ctgggaagga gtttataatg atgcattcct aattgacaga atcaattgga 10501 taagcgcggg tgtattcctt gacagcaatc agaccgcaga aaatcctgtt tttactgtat 10561 tcaaagataa tgaaatactt tatagggcac aactggcttc tgaggacacc aatgcacaaa 10621 aaacaataac taattgtttt ctcttgaaga ataagatttg gtgcatatca ttggttgaga 10681 tatatgacac aggagacaat gtcataagac ccaaactatt cgcggttaag ataccagagc 10741 aatgtacafca aaaatcaacc tcataattta atggattgat ctaatataat gataataatc 10801 gtacaaagac atgtgatgta aacaaaattg ttgtaattaa ataagtcctc agctgaatac 10861 ttttttaaga ttagcaatag catgtttttc cagttattgg atagttgata atataattct 10921 gaaactgggt taataaataa tcttgatcgg tgatctttga gaacaatgat atcatatagt 10981 tcatcaagtg ataatcaatt ctttatatgt acactttaga gtatattttg agacttagta 11041 ttttcggocc gaatgttaaa tttaatagtt catacataac ctaaactcaa gttctaagca 11101 taatgataac aattaatgcg aacttgtctt gatgtaagga agatttgata ttaactgaga 11161 ctccacttga tatagtagag ctgaatcttg taaataaatt ataatgaata gtttattcaa 11221 agattatcat tcatattagt gtaaattaag aaaaacttag gacccaggtc cttgattatg 11281 ccaattttct cgagaaatca ttcaattgac catagactga aagcgttgtt acctagttct 11341 tcagaagaga tcttattaga attaatttat atgatctaat tcccttaaaa actgaatacc 11401 aaaaaacaaa aatggccgat gaattatcaa tatccgacat catttaccct gaatgtcatt 11461 tggatagtcc tatagtctct ggtaaactaa tatcagctat tgaatatgct caattgagac 11521 acaatcagcc cagtgatgat aaaagactgt ctgagaatat taggttaaac cttcacggga 11581 aaagaaagag tctatacata ttaagacaat ccaaacaggg tgattacatt agaaacaaca 11641 taaaaaacct aaaggaattc atgcatattg cgtaccctga atgcaataac attctattct 11701 ccatcacatc ccaaggcatg actagcaaao ttgataacat catgaaaaag tcattcaaag 11761 catacaatat cattagtaag aaagtaattg ggatgctgca aaatatcact agaaatctca 11821 taactcaaga tagaagagat gaaataatta atatacatga gtgtaggcga ttaggggatt 11881 tagggaagaa tatgagtcaa tctaaatggt atgagtgttt tttgttttgg tttactatca 11941 aaacagagat gcgagcagtg atcaagaatt cgcaaaagcc gaaattccgt tcagattcat 12001 gcataataca catgcgagac aaaagtactg aaataatcct aaatccgaat cttatctgca 12061 ttttcaaatc agacaaaact ggaaagaagt gttattatct tacacccgaa atggttctaa 12121 tgtattgtga tgtcctagag ggaaggatga tgatggagac aacagtcaaa tcggatatca 12181 agtaccaacc tctaatctcg agatccaatg ccctctgggg gctaattgat cccttgttcc 12241 ctgtcatggg aaacagaatt tacaatatag tgtctatgat agagccttta gttcttgcac 12301 tactccaact caaggatgag gctaggatcc tgaggggtgc atttctgcat cactgcataa 12361 aggaaatgca tcaagaattg agtgagtgtg gttttacaga tcagaagatt cggtctatgt 12_1 ttattgatga tcttttatcc attctaaata tcgataatat acatctgttg gcagagttct 12481 tttctttctt tcgtacgttt ggccatccta ttcttgaggc taaagttgct gcagaaaaag 12541 tgagagaaca tatgttggca gataaagttc ttgaatatgc ccctataatg aaagcacatg 12601 ctatattctg cgggactata ataaatgggt atagggatag acacggagga gcctggcctc 12661 ctctttacct ccccgcacat gcatctaaac atataatccg tttgaaaaat tctggggaat 12721 ctttgaccat tgatgactgt gtcaagaatt gggaatcatt ctgtgggatt caatttgatt 12781 gtttcatgga gctgaaattg gacagtgatc tgagtatgta tatgaaagat aaagctttat 12841 ctccaatcaa agacgaatgg gacagtgtat acccacgtga agtgttgagc tataccccac FIG. 1A (FOLHA 4 de 39) 5/39 12901 cgaagtcaac cgagccaaga agattggttg acgtttttgt aaatgatgaa aactttgatc 12961 catacaacat gctggaatat gtcttatccg gtgcttatct cgaggatgaa caattcaatg 13021 tttcttatag cttgaaggag aaagagacga agcaagctgg acgattgttc gcaaagatga 13081 cctacaaaat gcgtgcatgt caagtcatag cagaggccct gatagcctca ggtgtcggta 13141 aatattttaa ggagaacggg atggttaagg atgagcacga actttrtgaag acactcttcc 13201 aattgtctat ttcctcagtt cctcgaggga acagtcaggg taatgatcct caatccatca 13261 ataatataga aagagatttc caatacttta aaggggtcac taccaatgtg aaagacaaaa 13321 agaataactc ttttaataag gttaaatctg ctctcaataa tccgtgccaa gctgacggag 13381 tccatcataa catgtcaccc aatacacgaa atcgttataa gtgtagtaat acaagtaagt 13441 cttttctcga ttatcatacc gagtttaatc ctcacaatca ctataaatca gacaatacag 13501 aggcggccgt actgtccagg tatgaggaca acactgggac aaaatttgat acagtaagtg 13561 catttcttac aactgatctt aagaaattct gtctcaattg gagatacgaa tcaatggcta 13621 tatttgctga acgtctggat gagatatacg gtttacctgg attttttaat tggatgcaca 13681 aacgactaga aagatctgtt atctatgttg cagaccctaa ttgcccccct aatattgaca 13741 aacatatgga actagaaaaa actcctgaag atgatatatt cattcattat cctaaaggcg 13801 gtattgaagg atatagccaa aaaacatgga ctatagcaac tatccccttt ttattcttga 13861 gtgcctatga gacaaacacg aggattgctg caattgtcca aggagacaat gaatcaattg 13921 ctatcactca aaaagttcat cctaatcttc cctacaaggt aaagaaagag atctgtgcaa 13981 agcaagctca gctttatttt gaaaggttaa ggatgaactt aagagccctc ggccacaatc 14041 ttaaagctac agaaactatc atcagtacac atctttttat ttattcgaag aaaattcatt 14101 atgatggtgc tgtgctgtct caggcactca aatcaatgtc aagatgttgc ttttggtcag 14161 agactctggt ggatgaaact agatcagctt gtagtaacat cagcactaca atagctaaag 1_21 ctatagaaaa tgggttgtca agaaatgtcg gctattgcat caatattttg aaagtaattc 1_81 agcagcttct catatcaact gagtttagta ttaacgagac attgacactg gatgtgacat 14341 ctcccatttc aaataattta gattggctta taacagctgc attaatcccg gcacctattg 14401 gaggattcaa ttaccttaat ttgtctagaa tttttgttag aaatataggt gatccggtta 14461 cagcatcttt ggctgatctt aagagaatga ttgatcacag tattatgact gaaagcgtat 14521 tacaaaaagt tatgaatcaa gaacctggtg atgcgagttt cttggactgg gccagtgatc 14581 catactcggg caacttgcct gactcacaaa gcatcactaa aacaattaaa aatatcacag 14641 caaggactat actgaggaac tcaccgaacc caatgctaaa aggtttattt catgacaaat 14701 cttttgatga agatcttgaa ctagctagct tcttaatgga caggagggtt atattaccta 14761 gagccgctca tgagatactg gataattcat tgacaggtgc cagagaggaa attgctggtt 14821 tattagatac aactaaaggc ttgatcagat cagggctaag aaagagtgga cttcagccaa 14881 agttagtttc tagattatct catcatgatt ataatcaatt tttaatactg aacaaacttc 14941 tatcaaacag aagacaaaat gacttgatat catcaaatac ttgctcagtt gacttggcac 15001 gagcattgag atctcacatg tggagggaat tagcgttagg tagagtaata tacggtcttg 15061 aggtaccaga tgcacttgag gctatggtgg gaaggtatat aacagggagc ttagagtgcc 15121 aaatttgtga gcagggaaac acgatgtatg ggtggttctt tgtacctagg gattcccaat 15181 tggatcaggt agatagagag cactcatcaa taagagtacc ttatgtagga tcaagtacgg 15241 atgaaagatc ggatatcaaa ctagggaatg tcaaaagacc aactaaggcc ttgcgttctg 15301 ctatcagaat tgcgacagta tatacttggg cctatgggga caatgaagag tgttggtatg 15361 aagcttggta cctagcgtct cagagggtaa acatagactt agatgtattg aaagctataa 15_1 ccccagtttc cacttcaaac aatttatccc atagattgag agataaatcc acacaattta 15481 agtttgcagg gagtgtactc aacagagttt ctagatatgt taacataagc aatgacaatc 15541 tagatttcag aattgaggga gaaaaggtag atacgaatct tatttatcaa caagcaatgc 15601 tattagggtt atcggtattg gaaggtaaat tcagattgag attagaaact gatgattaca 15661 acgggatata tcacttacac gtaaaggata attgttgtgt caaagaagtg gctgatgtag 15721 gccaagtaga cgctgagttg cctatcccag aatatactga agtggataac aatcatctta 15781 tatatgatcc agaccccgtt tcagaaatag attgcagccg tctttctaat caggagtcca 15841 aatcaagaga attagacttt cctttatggt caactgagga acttcatgat gtcctagcta 15901 agactgttgc tcagaccgtt cttgagatta taacaaaggc tgacaaggat gttttaaagc 15961 aacaccttgc aatagactct gacgataaca tcaacagctt aatcacagaa tttctaatag 16021 ttgatcctga actgtttgca ctttatctag gacaatctat atcaataaaa tgggcctttg 16081 aaattcatca taggcgtcct agaggaagac atactatggt cgacctattg tcagatcttg FIG. 1A (FOLHA 5 de 39) 6/39 16141 tatcaaatac atcaaagcac acttacaaag tgttgtcaaa tgccttgtca catcctagag 16201 tattcaagag atttgtaaac tgtggcttgc tattgcctac acagggtcct taccttcatc 16261 aacaagattt tgaaaagttg tctcaaaacc ttcttgtaac atcttatatg atttatctaa 16321 tgaactggtg tgacttcaag aaatccccct ttttaatcgc cgaacaggat gaaactgtga 16381 taagtctacg agaggatata ataacatcca aacatctctg tgttataatt gacttatatg 16441. caaatcacca taaacctcct tggataatag atctaaaccc acaagaaaaa atatgtgtac 16501 tgcgtgactt tatttctaaa tctaggcatg tggacacgtc ctccagatca tggaatactt 16561 ctgacctgga ttttgtaata ttctatgcat ctttgactta tttgagaaga ggtataataa 16621 aacaattaag gataagacaa gttactgagg ttatagatac cacaacaatg ttaagggaca 16681 atataattgt agagaatcct cctattaaaa caggagtgtt agacatcaga ggttgtataa 16741 tatacaattt agaggaaatc ctgtctatga acacaaaatc agcatcaaaa aagatcttta 16801 atcttaatag taggccgtca gtggagaatc ataaatatag aaggataggt ctcaactcat 16861 catcttgtta caaggcatta aatctatcac ctctgattca aaggtatttg ccgtcgggag 16921 ctcaaaggtt gtttatagga gaaggttctg ggagcatgat gttattatat cagtctacat 16981 tggggcaatc aatttctttt tacaattcag gtatagatgg agattatata ccaggtcaaa 17041 gagaactgaa actatttccc tctgaatact caattgctga ggaagaccca tctctgacgg 17101 ggaaattgaa aggactagtg gtgcccctat tcaatggaag accagaaaca acatggatcg 17161 ggaatttaga ctcctacgag tatatcataa ataggacagc ggggcgaagt ataggtcttg 17221 tccattctga catggagtct gggattgaca aaaatgtaga ggagatacta gtagaacatt 17281 cccatctaat atctatcgcg ataaatgtta tgatggagga cggactatta gtatccaaga 17341 tagcatacac ccctggattc ccaatctcaa gattatttaa catgtacaga tcatatttcg 17401 gactagtact ggtgtgtttc ccagtatata gtaatccaga ttctactgaa gtatatcttc 17461 tttgcttaca gaagacggtc aagactattg ttcccccgca aaaagtcctt gagcactcta 17521 atttgcacga tgaagtcaat gaccagggaa taacatcagt gatttttaaa atcaagaatt 17581 cacagtctaa gcagttccac gatgatctaa agaagtacta tcagattgac caaccttttt 17641 ttgtaccaac taaaatcact agtgatgaac aagtacttct ccaagcaggg ctgaaactca 17701 atgggccaga aattcttaag agtgaaatca gttatgatat cggttcagat atcaatacat 17761 taagagacac catcataatt atgttaaatg aggctatgaa ttattttgat gacaacagat 17821 caccttcaca ccacctagaa ccctatccag ttttggagag aactagaatt aaaacaataa 17881 tgaattgtgt gactaaaaaa gtgattgtct actcacttat caagttcaag gacaccaaaa 17941 gctcagaact ttatcacatc aaaaataaca tcagaagaaa agttctaatc ttagatttca 18001 gatcgaagct catgacaaag actctaccta aagggatgca agagagaaga gaaaaaaacg 18061 gtttcaaaga agtttggata gtagatttat cgaatcgaga agttaaaatc tggtggaaga 18121 taatcggata catatctatt atctgattta accttccaaa tccaagacca actgataact 18181 tatgttgatc taaggttcag ttattaagaa aaacttaata acgattcttc tttacccttg 18241 ttcggt (SEQ ID Na: 1) FIG. 1A (FOLHA 6 de 39) 7/39 Proteína de nucleocápside: MSDIFEEAASFRSYQSKLGRDGRASAATATLTTKIRIFVPATNSPELRWELTLFALDVIRSPSAAESMKVGAAFTLI SMYSERPGALIRSLLNDPDIEAVIIDVGSMVNGIPVMERRGDKAQEEMEGLMRILKTARDSSKGKTPFVDSRAYGLR ITDMSTLVSAVITIEAQIWILIAKAVTAPDTAEESETRRWAKYVQQKRVNPFFALTQQWLTEMRNLLSQSLSVRKFM VEILIEVKKGGSAKGRAVEIISDIGNYVEETGMAGFFATIRFGLETRYPALALNEFQSDLNTIKSLMLLYREIGPRA PYMVLLEESIQTKFAPGGYPLLWSFAMGVATTIDRSMGALNINRGYLEPMYFRLGQKSARHHAGGIDQNMANRLGLS SDQVAELAAAVQETSAGRQESNVQAREAKFAAGGVLIGGSDQDIDEGEEPIEQSGRQSVTFKREMSISSLANSVPSS SVSTSGGTRLTNSLLNLRSRLAAKAAKEAASSNATDDPAISNRTQGESEKKNNQDLKPAQNDLDFVRADV (SEQ ID N2: 2) MDKLELVNDGLNIIDFIQKNQKEIQKT YGRSSIQQPSIKDQTKAWEDFLQCTSGESEQVEGGMSKDDGDVERRNLED LSSTSPTDGTIGKRVSNTRDWAEGSDDIQLDPWTDWYHDHGGECTGYGFTSSPERGWSDYTSGANNGNVCLVSDA KMLSYAPEIAVSKEDRETDLVHLENKLSTTGI.NPTAVPFTI.RNLSDPAKDSPVIAEHYYGLGVKEQNVGPQTSRNVN LDSIKLYTSDDEEADQLEFEDEFAGSSSEVIVGISPEDEEPSSVGGKPNESIGRTIEGQSIRDNLQAKDNKSTDVPG AGPKDSAVKEEPPQKRLPMLAEEFECSGSEDPIIRELLKENSLINCQQGKDAQPPYHWSIERSISPDKTEIVNGAVQ TADRQRPGTPMPKSRGIPIKKGTDAKYPSAGTENVPGSKSGATRHVRGSPPYQEGKSVNAENVQLNASTAVKETDKS EVNPVDDNDSLDDKYIMPSDDFSNTFFPHDTDRLNYHADHLGDYDLETLCEESVLMGVINSIK1INLDMRLNHIEEQ VKEIPKIINKLESIDRVLAKTNTALSTIEGHLVSMMIMIPGKGKGERKGKNNPELKPVIGRDILEQQSLFSFDNVKN FRDGSLTNEPYGAAVQLREDLILPELNFEETNASQFVPMADDSSRDVIKTLXRTHIKDRELRSELIGYLNKAENDEE IQEIANTVNDIIDGNI (SEQ ID N2: 3) Proteína V: MDKLELVNDGLNIIDFIQKNQKEIQKTYGRSSIQQPSIKDQTKAWEDFLQCTSGESEQVEGGMSKDDGDVERRNIiED lsstsptdgtigkrvsntrdwaegsddiqldpwtdwyhdhggectgygftsspergwsdytsganngnvclvsda kmlsyapeiavskedretdlvhlenklsttglnptavpftlrnlsdpakdspviaehyyglgvkeqnvgpqtsrnvn ldsiklytsddeeadqlefedefagsssevivgispedeepssvggkpnesigrtiegqsirdnlqakdnkstdvpg agpkdsavkeeppqkrlpmlaeefecsgsedpiirellkenslincqqgkdaqppyhwsxersispdkteivngavq tadrqrpgtpmpksrgipikkghrreisicwdgkrawveewcnpacsritplprrqecqcgecptecfhcg (SEQ ID N2: 4) Proteína C: MMASUjLTLFRRTKKKYRRHTDDQVFNNPASKIKQKPGKIFCSAPVENLNKLRGECLRMMEMLKEETWRIYPVLLPQ MEIiLERECRTPVTGQKVQMTYNWTQWLQTLYTMIMEENVPDMDLLQALREGGVITHQEQTMGMYVLYLMQRCCPMLP KLQFLKKIGKLI <SEQ ID N®: 5> Proteína de matriz: MEPDIKSISSESMEGVSDFSPSSWEHGGYLDKVEPEIDENGSMIPKYKIYTPGANERKYNNYMYLICYGFVEDVERT PETGKRKKIRTIAAYPLGVGKSASHPQDLLEELCSLKVTVRRTAGSTEKIVFGSSGPLNHLVPWKKVLTSGSIFNAV KVCRNVDQIQLDKHQALRIFFLSITKLNDSGIYMIPRTMLEFRRNNAIAFNLLVYLKIDADLSKMGIQGSLDKDGFK VASFMLHLGNFVRRAGKYYSVDYCRRKIDRMKLQFSLGSIGGLSLHIKINGVISKRLFAQMGFQKNLCFSLMDINPW LNRLTWNNSCEISRVAAVLQPSIPREFMIYDDVFIDNTGRILKG (SEQ ID N2: 6) Proteína de fusão: MWILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVME NYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIEST NEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDI.I.FVFGPNLQDPVSNSMTIQAI SQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEW ISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFA ncisvtcqcqttgraisqsgeqtllmidnttcptavlgnviislgkylgsvnynsegiaigppvftdkvdissqiss MNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNTYSRLEDRRVRPTSSG DLYYIGT (SEQ ID N2: 7) FIG.1B (FOLHA 7 de 39) 8/39 Glicoproteína de conjucragão: MPAENKKVRFENTTSDKGKIPSKVIKSYYGTMDIKKINEGLLDSKILSAFNTVIALLGSIVIIVMNIMIIQNYTRST dnqavikdalqgiqqqikgladkigteigpkvslidtsstitipanigllgskisqstasinenvnekckftlpplk IHECNISCPNPLPFREYRPQTEGVSNLVGLPNNICLQKTSNQIIjKPKLISYTLPVVGQSGTCITDPLLAMDEGYFAY SHLERIGSCSRGVSKQRIIGVGEVLDRGDEVPSLFMTNVWTPPNPNTVYHCSAVYNNEFYYVLCAVSTVGDPXLNST YWSGSLMMTRXAVKPKSNGGGYNQHQLALRSIEKGRYDKVMPYGPSGIKQGDTLYFPAVGFLVRTEFKYNDSNCPIT KCQYSKPENCRLSMGIRPNSHYILRSGLLKYNLSDGENPKWFIEISDQRLSIGSPSKIYDSLGQPVFYQASFSWDT MIKFGDVLTVNPLWNWRNNTVISRPGQSQCPRFNTCPEICWEGVYNDAFLIDRINWISAGVFLDSNQTAENPVFTV FKDNEILYRAQL·ASEDΓNAQKTITNCFL·L·KNKIWCISL·VEIYDTGDNVIRPKLFAVKIPEQCT (SEQ ID N2; 8) Polimerase: MADELSISDIIYPECHLDSPIVSGKIiISAIEYAQIjRHNQPSDDKRLSENIRLNLHGKRKSLYILRQSKQGDYIRNNI KNLKEFMHIAYPECNNILFSITSQGMTSKLDNIMKKSFKAYNIXSKKVIGMLQNITRNLITQDRRDEIINIHECRRL· GDLGKNMSQSKWYECFLFWFTIKTEMRAVIKNSQKPKFRSDSCIIHMRDKSTEIILNPNLICIFKSDKTGKKCYYLT PEMVLMYCDVLEGRMMMETTVKSDIKYQPLISRSNALWGLIDPLFPVMGNRIYNIVSMIEPLVLALLQLKDEARILR GAFLHHCIKEMHQELSECGFTDQKIRSMFIDDLLSILNrDNIHLLAEFFSFFRTFGHPILEAKVAAEKVREHMLADK VLEYAPIMKAHAIFCGTIINGYRDRHGGAWPPLYLPAHASKHIIRLKNSGESLTIDDCVKNWESFCGIQFDCFMELK LDSDLSMYMKDKALSPIKDEWDSVYPREVLSYTPPKSTEPRRLVDVFVNDENFDPYNMLEYVLSGAYLEDEQFNVSY SLKEKETKQAGRLFAKMTYKMRACQVIAEALIASGVGKYFKENGMVKDEHELLKTLFQLSrSSVPRGNSQGNDPQSI NNIERDFQYFKGVTTNVKDKKNNSFNKVKSALNNPCQADGVHHNMSPNTRNRYKCSNTSKSFLDYHTEFNPHNHYKS DNTEAAVLSRYEDNTGTKFDTVSAFLTTDLKKFCLNWRYESMAIFAERLDEIYGLPGFFNWMHKRLERSVIYVADPN CPPNIDKHMELEKTPEDDIFIHYPKGGIEGYSQKTWTIATIPFLFLSAYETNTRIAAIVQGDNESIAITQKVHPNLP YKVKKEICAKQAQLYFERLRMNLRALGHNLKATETIISTHLFIYSKKIHYDGAVLSQALKSMSRCCFWSETLVDETR SACSNISTTIAKAIENGLSRNVGYCINILKVIQQLLISTEFSINETLTLDVTSPISNNLDWLITAALIPAPIGGFNY LNLSRXFVRNIGDPVTASLADLKRMIDHSIMTESVLQKVMNQEPGDASFLDWASDPYSGNLPDSQSITKTIKNITAR TILRNSPNPMLKGLFHDKSFDEDLELASFLMDRRVIXiPRAAHEILDNSLTGAREEIAGLLDTTKGLIRSGLRKSGLQ PKLVSRLSHHDYNQFLILNKLLSNRRQNDLISSNTCSVDLARALRSHMWRELALGRVIYGIiEVPDALEAMVGRYITG SLECQICEQGNTMYGWFFVPRDSQLDQVDREHSSIRVPYVGSSTDERSDIKIiGNVKRPTKALRSAIRIATVYTWAYG DNEECWYEAWYLASQRVNIDLDVLKAITPVSTSNNLSHRLRDKSTQFKFAGSVLNRVSRYVNISNDNLDFRIEGEKV DTNLIYQQAMLLGLSVLEGKFRLRLETDDYNGIYHLHVKDKCCVKEVADVGQVDAELPIPEYTEVDNNHLIYDPDPV SEIDCSRLSNQESKSRELDFPLWSTEELHDVLAKTVAQTVLEIITKADKDVLKQHLAIDSDDNINSLITEFLIVDPE LFALYX.GQSISIKWAFEIHHRRPRGRHTMVDIíLSDLVSNTSKHTYKVLSNAIjSHPRVFKRFVNCGLLLPTQGPYLHQ QDFEKLSQNLLVTSYMIYLMNWCDFKKSPFLIAEQDETVISLREDIITSKHLCVIIDLYANHHKPPWIIDLNPQEKI CVIiRDFISKSRHVDTSSRSWNTSDLDFVIFYASIjTYLRRGIIKQLRIRQVTEVIDTTTMLRDNIIVENPPIKTGVIiD IRGCIIYNLEEILSMNTKSASKKIFNLNSRPSVENHKYRRIGLNSSSCYKALNLSPLIQRYLPSGAQRLFIGEGSGS MMLLYQSTLGQSISFYNSGIDGDYIPGQRELKLFPSEYSIAEEDPSLTGKLKGLWPLFNGRPETTWIGNLDSYEYI INRTAGRSIGLVHSDMESGIDKNVEEILVEHSHLISIAINVMMEDGLLVSKIAYTPGFPISRLFNMYRSYFGLVLVC FPVYSNPDSTEVYLLCLQKTVKTIVPPQKVLEHSNLHDEVNDQGITSVIFKIKNSQSKQFHDDLKKYYQIDQPFFVP TKITSDEQVLLQAGLKLNGPEILKSEISYDIGSDINTLRDTIIIMLNEAMNYFDDNRSPSHHLEPYPVLERTRIKTI MNCVTKKVIVYSLIKFKDTKSSELYHIKNNIRRKVLILDFRSKLMTKTLPKGMQERREKNGFKEVWIVDLSNREVKI WWKIIGYISIX (SEQ ID Na: 9) FIG. 1B (FOLHA 8 de 39) 9/39 lidér 5

FIG. 2A Nru I H6p MPAENKKV 11470.SL 5' ATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCCGGCAGAAAACAAGAAAGTT 11471.SL VKIPEQCT* XhO I (SEQ ID N=: 10) GTTAAGATACCAGAGCAATGTACATAACTCGAGCG (SEQ ID : 11) 3' CAATTCTATGGTCTCGTTACATGTATTGAGCTCGC (SEQ ID N“: 12) FIG. 2B 10/39

FIG. 2C (FOLHA 10 de 39) 11/39 => C5R GCGGCCGCAT TCTGAATGTT AAATGTTATA CTTTGGATGA AGCTATAAAT ATGCATTGGA CGCCGGCGTA AGACTTACAA TTTACAATAT GAAÃCCTACT TCGATÃTTTA TACGTAACCT AAAATAATCC ATTTAAAGAA AGGATTCAAA TACTACAAAA CCTAAGCGAT AATATGTTAA TTTTATTAGG TAAATTTCTT TCCTAAGTTT ATGATGTTTT GGATTCGCTA TTATACAATT CTAAGCTTAT TCTTAACGAC GCTTTAAATA TACACAAATA AÃCATAATTT TTGTATAACC GATTCGAATA AGAATTGCTG CGAAATTTAT ATGTGTTTAT TTGTATTAAA AACATATTGG TAACAAATAA CTAAAACATA ΑΑΑΑΤΑΑΤΑΆ AAGGAAATGT AATATCGTAA TTATTTTACT ATTGTTTATT GATTTTGTAT TTTTATTATT TTCCTTTACA TTATAGCATT AATAAAATGA CAGGAATGGG GTTAAATATT TATATCACGT GTATATCTAT ACTGTTATCG TATACTCTTT GTCCTTACCC CAATTTATAA ATATAGTGCA CATATAGATA TGACAATAGC ATATGAGAAA ACAATTACTA TTACGAATAT GCAAGAGATA ATAAGATTAC GTATTTAAGA GAATCTTGTC TGTTAATGAT AATGCTTATA CGTTCTCTAT TATTCTAATG CATAAATTCT CTTAGAACAG «- 7927.DC ATGATAATTG GGTACGACAT AGTGATAAAT GCTATTTCGC ATCGTTACAT AAAGTCAGTT TACTATTAAC CCATGCTGTA TCACTATTTA CGATAAAGCG TAGCAATGTA TTTCAGTCAA GGAAAGATGG ATTTGACAGA TGTAACTTAA TAGGTGCAAA AATGTTAAAT AACAGCATTC CCTTTCTACC TAAACTGTCT ACATTGAATT ATCCACGTTT TTACAATTTA TTGTCGTAAG 7696.CXL -» TATCGGAAGA TAGGATACCA GTTATATTAT ACAAAAATCA CTGGTTGGÃT AAAACAGATT ATAGCCTTCT ATCCTATGGT CAATATAATA TGTTTTTAGT GACCAACCTA TTTTGTCTAA CTGCAATATT CGTAAAAGAT GAAGATTACT GCGAATT7GT AAACTATGAC AATAAAAAGC GACGTTATAA GCATTTTCTA CTTCTAATGA CGCTTAAACA TTTGATACTG TTATTTTTCG CATTTATCTC AACGACATCG TGTAATTCTT CCATGTTTTA TGTATGTGTT TCAGATATTA GTAAATAGAG TTGCTGTAGC ACATTAAGAA GGTACAAAAT ACATACACAA AGTCTATAAT TGAGATTACT ATAAACTTTT TGTATACTTA TATTCCGTAA ACTATATTAA TCATGAAGAA ACTCTAATGA TATTTGAAAA ACATATGAAT ATAAGGCATT TGATATAATT AGTACTTCTT AATGAAAAAG TATAGAAGCT GTTCACGAGC GGTTGTTGAA AACAACAAAA TTATACATTC 77ACTT77TC ATATCTTCGA CAAGTGCTCG CCAACAACTT TTGTTGTTTT AATATGTAAG 4- 7926.DC AAGATGGCT1' ACATATACGT CTGTGAGGCT ATCATGGATA ATGACAATGC A7C7C7AAA7 TTCTACCGAA TGTATATGCA GACACTCCGA TAGTACCTAT TACTGTTACG TAGAGATTTA AGGTTTTTGG ACAATGGATT CGACCCTAAC ACGGAATATG GTACTCTACA ATCTCCTCTT TCCAAAAACC TGTTACCTAA GCTGGGATTG TGCCTTATAC CATGAGATGT TAGAGGAGAA GAAATGGCTG TAATGTTCAA GAATACCGAG GCTATAAAAA TCTTGATGAG GTATGGAGCT CTTTACCGAC ATTACAAGTT CTTATGGCTC CGATATTTTT AGAACTACTC CATACCTCGA FIG.2C (FOLHA 11 de 39) 12/39 7697.CXL -> AAACCTGTAG TTACTGAATG CACAACTTCT TGTCTGCATG ATGCGGTGTT GAGAGACGAC TTTGGACATC AATGACTTAC GTGTTGAAGA ACAGACGTAC TACGCCACAA CTCTCTGCTG TACAAAATAG TGAAAGATCT GTTGAAGAAT AACTATGTAA ACAATGTTCT TTACAGCGGA ATGTTTTATC ACTTTCTAGA CAACTTCTTA TTGATACATT TGTTACAAGA AATGTCGCCT GGCTTTACTC CTTTGTGTTT GGCAGCTTAC CTTAÃCAAAG TTAATTTGGT TAAACTTCTA CCGAAATGAG GAAACACAAA CCGTCGAATG GAATTGTTTC AATTAAACCA ATTTGAAGAT TTGGCTCATT CGGCGGATGT AGATATTTCA AACACGGATC GGTTAACTCC TCTACATATA AhCCGAGTAA GCCGCCTAC.A TCTATAAAGT TTGTGCCTAG CCAATTGAGG AGATGTATAT <- 7925. DC GCCGTATCAA ATAAAAATTT AACAATGGTT AAACTTCTAT TGAACAAAGG TGCTGATACT CGGCATAGTT TATTTTTAAA TTGTTACCAA TTTGAAGATA ACTTGTTTCC ACGACTATGA GACTTGCTGG ATAACATGGG ACGTACTCCT TTAATGATCG CTGTACAATC TGGAAATATT CTGAACGACC TATTGTACCC TGCATGAGGA AATTACTAGC GACATGTTAG ACCTTTATAA GAAATATGTA GCACACTACT TAAAAAAAAT AAAATGTCCA GAACTGGGAA AAATTGATCT CTTTATACAT CGTGTGATGA ATTTTTITTA TTTTACAGGT CTTGACCCTT TTTAACTAGA TGCCAGCTGT AATTCATGGT AGA-AAGAAG TGCTCAGGCT ACTTTTCAAC ÃAAGGAGCAG ACGGTCGACA TTAAGTACCA TCTTTTCTTC ACGAGTCCGA TGAAÃAGTTG TTTCCTCGTC ATGTAAACTA CATCTTTGAA AGAAATGGAA AATCATATAC TGTTTTGGAÃ TTGATTAAAG TACATTTGAT GTAGAAACTT TCTTTACCTT ITAGTATATG ACAAAACCTT AACTAATTTC 7792.SL -> AAAGTTACTC TGAGACACAA AAGAGGTAGC TGAAGTGGTA CTCTCAAAGG TACGTGACTA TTTCAATGAG ACTCTGTCTT TTCTCCATCG ACTTCACCAT GAGAGTTTCC ATGCACTGAT ATTAGCTATA AAAAGGATCC GGGTTAATTA AT.TAGTCATC AGGCAGGGCG AGAACGAGAC TAATCGATAT TTTTCCTAGG CCCAATTAAT TAATCAGTAG TCCGTCCCGC TCTTGCTCTG => H6p TATCTGCTCG TTAATTAATT AGAGCTTCTT TATTCTATAC TTAAAAAGTG AAAATAAATA ATAGACGAGC AATTAATTAA TCTCGAAGAA ATAAGATATG AATTTTTCAC TTTTATTTAT CAAAGGTTCT TGAGGGTTGT GTTAAATTGA AAGCGAGAAA TAATCATAAA TTATTTCATT GTTTCCAAGA ACTCCCAACA CAATTTAACT TTCGCTCTTT ATTAGTATTT AATAAAGTAA =ΐ> Nipah G Met ProAlaGlu AsnLysLys ValArgPheGlu ATCGCGATAT CCGTTAAGTT TGTATCGTAA TGCCGGCAGA AAACAAGAAA GTTAGATTCG TAGCGCTATA GGCAATTCAA ACATAGCATT ACGGCCGTCT TTTGTTCTTT CAATCTAAGC ..AsnThrThr SerAspLys GlyLysIlePro SerLysVal IleLysSer TyrTyrGlyThr AAAATACTAC TTCAGACAAA GGGAAAATTC CTAGTAAAGT TATTAAGAGC TACTACGGAA TTTTATGATG AAGTCTGTTT CCCTTTTAAG GATCATTTCA ATAATTCTCG ATGATGCCTT í- 11472.SL FIG. 20 (FOLHA 12 de 39) 13/39 ..MetAspIle LysLysIle AsnGluGlyLeu LeuAspSer LysIleLeu SerAlaPheAsn-CCATGGACAT TAAGAAAATA AATGAAGGAT TATTGGACAG CAAAATATTA AGTGCTTTCA GGTACCTGTA ATTCTTTTAT TTACTTCCTA ATAACCTGTC GTTTTATAAT TCACGAAAGT ..ThrValIle AlaLeuLeu GlySerlleVal lieileVal' MetAsnlle MetllelleGln· ACACAGTAAT AGCATTGCTT GGATCTATCG TGATCATAGT GATGAATATA ATGATCATCC TGTGTCATTA TCGTAACGAA CCTAGATAGC ACTAGTATCA CTACTTATAT TACTAGTAGG ..AsnTyrThr ArgSerThr AspAsnGlnAla VallleLys AspAlaLeu GlnGlylleGln· AAAATTACAC AAGATCAACA GACAATCAGG CCGTGATCAA AGATGCGTTG CAGGGTATCC TTTTAATGTG TTCTAGTTGT CTGTTAGTCC GGCACTAGTT TCTACGCAAC GTCCCATAGG ..GlnGlnlle LysGlyLeu AlaAspLysIle GlyThrGlu IleGlyPro LysValSerLeu AACAGCAGAT CAAAGGGCTT GCTGACAAAA TCGGCACAGA GATAGGGCCC AAAGTATCAC TTGTCGTCTA GTTTCCCGAA CGACTGTTTT AGCCGTGTCT CTATCCCGGG TTTCATAGTG ..IleAspThr SerSerThr IleThrllePro AlaAsnXle GlyLeuLeu GlySerLysIle* TGATTGACAC ATCCAGTACC ATTACTATCC CAGCTAACAT TGGGCTGTTA GGTTCAAAGA ACTAACTGTG TAGGTCATGG TAATGATAGG GTCGATTGTA ACCCGACAAT CCAAGTTTCT 11473.SL ..SerGlnSer ThrAlaSer IleAsnGluAsn ValAsnGlu LysCysLys PheThrLeuPro· TCAGCCAGTC GACTGCAAGT ATAAATGAGA ATGTGAATGA AAAATGCAAA TTCACACTGC AGTCGGTCAG CTGACGTTCA TATTTACTCT TACACTTACT TTTTACGTTT AAGTGTGACG ..ProLeuLys IleHisGlu CysAsnlleSer CysProAsn ProLeuPro PheArgGluTyr· CTCCCTTGAA AATCCACGAA TGTAACATTT CTTGTCCTAA CCCACTCCCT TTTAGAGAGT GAGGGAACTT TTAGGTGCTT ACATTGTAAA GAACAGGATT GGGTGAGGGA AAATCTCTCA <- 11474.SL ..ArgProGln ThrGluGly ValSerAsnLeu ValGlyLeu ProAsnAsn IleCysLeuGln· ATAGGCCACA GACAGAAGGG GTGAGCAATC TAGTAGGATT ACCTAATAAT ATTTGCCTGC TATCCGGTGT CTGTCTTCCC CACTCGTTAG ATCATCCTAA TGGATTATTA TAAACGGACG ..LysThrSer AsnGlnlle LeuLysProLys LeuIleSer TyrThrLeu ProValValGly· AAAAGACATC TAATCAGATA TTGAAGCCAA AGCTGATTTC ATACACTTTA CCCGTAGTCG TTTTCTGTAG ATTAGTCTAT AACTTCGGTX TCGACTAAAG TATGTGAAAT GGGCATCAGC ..GlnSerGly ThrCysIle ThrAspProLeu LeuAlaMet AspGluGly TyrPheAlaTyr· GTCAAAGTGG TACCTGTATC ACAGACCCAT TGCTGGCTAT GGACGAGGGC TATTTTGCAT CAGTTTCACC ATGGACATAG TGTCTGGGTA ACGACCGATA CCTGCTCCCG ATAAAACGTA ..SerHisLeu GluArglle GlySerCysSer ArgGlyVal SerLysGln ArgllelleGly· ATAGCCACCT GGAAAGAATC GGATCATGTT CAAGAGGGGT CTCCAAACAA AGAATAATAG TATCGGTGGA CCTTTCTTAG CCTAGTACAA GTTCTCCCCA GAGGTTTGTT TCTTATTATC 11475.SL -> ..ValGlyGlu ValLeuAsp ArgGlyAspGlu ValProSer LeaPheMet ThrAsnValTrp· GAGTTGGAGA GGTACTAGAC AGAGGTGATG AAGTTCCTTC TTTATTTATG ACCAATGTCT CTCAACCTCT CCATGATCTG TCTCCACTAC TTCAAGGAAG AAATAAATAC TGGTTACAGA ..ThrProPro AsnProAsn ThrValTyrHis CysSerAla ValTyrAsn AsnGluPheTyr· GGACCCCACC AAATCCAAAC ACCGTTTACC ACTGTAGTGC TGTATACAAC AATGAATTCT CCTGGGGTGG TTTAGGTTTG TGGCAAATGG TGACATCACG ACATATGTTG TTACTTAAGA FIG.2C (FOLHA 13 de 39) 14/39 ..TyrValLeu CysAlaVal SerThrValGly AspProIle LeuAsnSer ThrTyrTrpSer· ATTATGTACT TTGTGCAGTG TCAACTGTTG GAGACCCTAT TCTGAATAGC ACCTACTGGT TAATACATGA AACACGTCAC AGTTGACAAC CTCTGGGATA AGACTTATCG TGGATGACCA <- 11476.SL ..GlySerLeu MetMetThr ArgLeuAlaVal LysProLys SerAsnGly GlyGlyTyrAsn· CCGGATCTCT AATGATGACC CGTCTAGCTG TGAAACCCAA GAGTAATGGT GGGGGTTACA GGCCTAGAGA TTACTACTGG GCAGATCGAC ACTTTGGGTT CTCATTACCA CCCCCAATGT ..GlnHisGln LeuAlaLeu ArgSerlleGlu LysGlyArg TyrAapLys ValMetProTyr· ATCAACATCA ACTTGCCCTA CGAAGTATCG AGAAAGGGAG GTATGATAAA GTTATGCCGT TAGTTGTAGT TGAACGGGAT GCTTCATAGC TCTTTCCCTC CATACTATTT CAATACGGCA ..GlyProSer GlylleLys GlnGlyAspThr LeuTyrPhe ProAlaVal GlyPheLeuVal· ATGGACCTTC AGGCATCAAA CAGGGTGACA CCCTGTATTT TCCTGCTGTA GGATTTTTGG TACCTGGAAG TCCGTAGTTT GTCCCACTGT GGGACATAAA AGGACGACAT CCTAAAAACC ..ArgThrGlu PheLysTyr AsnAspSerAsn CysProIle ThrLysCys GlnTyrSerLys· TCAGGACAGA GTTTAAATAC AATGATTCAA ATTGTCCCAT CACGAAGTGT CAATACAGTA AGTCCTGTCT CAAATTTATG TTACTAAGTT TAACAGGGTA GTGCTTCACA GTTATGTCAT 11477.SL -> ..ProGluAsn CysArgLeu SerMetGlylle ArgProAsn SerHisTyr IleLeuArgSer· AACCTGAAAA TTGCAGGCTA TCTATGGGGA TTAGACCAAA CAGCCATTAT ATCCTTCGAT TTGGACTTTT AACGTCCGAT AGATACCCCT AATCTGGTTT GTCGGTAATA TAGGAAGCTA ..GlyLeuLeu LysTyrAsn LeuSerAspGly GluAsnPro LysValVal PhelleGluIle· CTGGACTATT AAAATACAAX CTATCAGATG GGGAGAACCC CAAAGTTGTA TTCATTGAAA GACCTGATAA TTTTATGTTA GATAGTCTAC CCCTCTTGGG GTTTCAACAT AAGTAACTTT <- 11478.SL ..SerAspGln ArgLeuSer IleGlySerPro SerLysIle TyrAspSer LeuGlyGlnPro* TATCTGATCA AAGATTATCT ATTGGATCTC CTAGCAAAAT CTATGATTCT TTGGGTCAAC ATAGACTAGT TTCTAATAGA TAACCTAGAG GATCGTTTTA GATACTAAGA AACCCAGTTG ..ValPheTyr GlnAlaSer PheSerTrpAsp ThrMetlle LysPheGly AspValLeuThr· CTGTTTTCTA CCAAGCGTCA TTTTCATGGG ATACTATGAT TAAATTTGGA GATGTTCTAA GACAAAAGAT GGTTCGCAGT AAAAGTACCC TATGATACTA ATTTAAACCT CTACAAGATT ..ValAsnPro LeuValVal AsnTrpArgAsn AsnThrVal IleSerArg ProGlyGlnSer· CAGTCAACCC TCTGGTTGTC AATTGGCGTA ATAACACGGT AATATCAAGA CCCGGGCAAT GTCAGTTGGG AGACCAACAG TTAACCGCAT TATTGTGCCA TTATAGTTCT GGGCCCGTTA ..GlnCysPro ArgPheAsn ThrCysProGlu IleCysTrp GluGlyVal TyrAsnAspAla· CACAATGCCC TAGATTCAAT ACATGTCCAG AGATCTGCTG GGAAGGAGTT TATAATGATG GTGTTACGGG ATCTAAGTTA TGTACAGGTC TCTAGACGAC CCTTCCTCAA ATATTACTAC 11479.SL -» ..PheLeuIle AspArglle AsnTrpIleSer AlaGlyVal PheLeuAsp SerAsnGlnThr· CATTCCTAAT TGACAGAATC AATTGGATAA GCGCGGGTGT ATTCCTTGAC AGCAATCAGA GTAAGGATTA ACTGTCTTAG TTAACCTATT CGCGCCCACA TAAGGAACTG TCGTTAGTCT ..AlaGluAsn ProValPhe ThrValPheLys AspAsnGlu IleLeuTyr ArgAlaGlnLeu* CCGCAGAAAA TCCTGTTTTT ACTGTATTCA AAGATAATGA AATACTTTAT AGGGCACAAC GGCGTCTTTT AGGACAAAAA TGACATAAGT TTCTATTACT TTATGAAATA TCCCGTGTTG FIG.2C (FOLHA 14 de 39) 15/39 --AlaSerGlu AspThrAsn AlaGlnLysThr IleThrAsn CysPheLeu LeuLysAsnliys TGGCTTCTGA GGACACCAAT GCACAAAAAA CAATAACTAA TTGTTTTCTC TTGAAGAATA ACCGAAGACT CCTGTGGTTA CGTGTTTTTT GTTATTGATT AACAAAAGAG AACTTCTTAT <- 11480.SL ..IleTrpCys IleSerLeu ValGluIleTyr AspThrGly AspAsnVal IleArgProLys AGATTTGGTG CATATCATTG GTTGAGATAT ATGACACAGG AGACAATGTC ATAAGACCCA TCTAAACCAC GTATAGTAAC CAACTCTATA TACTGTGTCC TCTGTTACAG TATTCTGGGT ..LeuPheAla ValLysIle ProGluGlnCys Thr (SEQ ID N2: 14) i AACTATTCGC GGTTAAGATA CCAGAGCAAT TTGATAAGCG CCAATTCTAT GGTCTCGTTA GGTTTTTATG ACTAGTTAAT CACGGCCGCr CCAAAAATAC TGATCAATTA GTGCCGGCGA 7928.DC TAATGAAAAA AAGTACATCA TCAGCAACGC ATTACTTTTT TTCATGTAGT ACTCGTTGCG TCTATACCGT TCTATGTTTA TTGATTCAGA AGATATGGCA AGATACAAAT AACTAAGTCT 7793.SL TGAAAACTTT aatgaagatg aagatgacga ACTTTTGAAA TTACTTCTAC TTCTACTGCT TGAAGAAGAT gacgcgctaa AGTATACTAT ACTTCTTCTA CTGCGCGATT TCATATGATA GGCGACTTGT GCAAGAAGGT ATAGTATAGT CCGCTGAACA CGTTCTTCCA TATCATATCA ACCAAATAAA TCAGATCCAT ÃTCTAAAGGT TGGTTTATTT AGTCTAGGTA TAGATTTCCA TAGTTTAGAA TACCTGCAGC CAAGCTTGGC ATCAAATCTT ATGGACGTCG GTTCGAACCG GTACATAACT CGAGTCTAGA ATCGATCCCG CATGTATTGA GCTCAGATCT TAGCTAGGGC C5L TATAAAGATC TAAAA1GCAT AATTTCTAAA ATATTTCTAG ATTTTACGTA TTAAAGATTT GTTÀGTATAT TTTACAATGG AGATTAACGC CAATCATATA AAATGTTACC TCTAATTGCG TGATGTTTTA GAAAAGAAAG TTATTGAATA ACTACAAAAT CTTTTCTTTC AATAACTTAT CGATGATTAT TGTTGTAAAT CTGTTTTAGA GCTACTAATA ACAACATTTA GACAAAATCT GGTTACAAAG TATAAGTCTA TACTACTAAT CCAATGTTTC ATATTCAGAT ATGATGATTA GAAAATGTTG TTAGATTATG ATTATGAAAA CTTTTACAAC AATCTAATAC TAATACTTTT ATCTCCTTTG CACATAATTT CATCTATTCC TAGAGGAAAC GTGTATTAAA GTAGATAAGG ACTGGCCGTC GTTTTAC (SEQ ID N2: 15) . TGACCGGCAG CAAAATG (SEQ ID N2: 16) <- M13F FIG.2C (FOLHA 15 de 39) 16/39 Nru I H6p MPAENKKV 11470.SL 5' ATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCCGGCAGAAAACAAGAAAGTT 11471.SL VKIPEQCT* Xho I (SEQ ID NO: 10) GTTAAGATACCAGAGCAATGTACATAACTCGAGCG (SEQ ID NO: 11) 3' CAATTCTATGGTCTCGTTACATGTATTGAGCTCGC (SEQ ID NO: 13) FIG. 3A

\ r««JC24a VNbah6 Km) (943 usai ÇSPUl MUiUC)

FIG. 3B (FOLHA 16 de 39) 17/39 M13F —> =? F3R GTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTGTAATACG ACTCACTATA GGGCGAATTG GGTGACCCTT CATTTTGCTG CCGGTCACTT AACATTATGC TGAGTGATAT CCCGCTTAAC CCACTGGGAA TACAAGAATA AAAGAAGAAA CAACTGTGAA ATAGTTTATA AATGTAATTC GTATGCAGAA ÃTGTTCTTAT TTTCTTCTTT GTTGACACTT TATCAAATAT TTACATTAAG CATACGTCTT AACGATAATA TATTTTGGTA TGAGAAATCT AAAGGAGACA TAGTTTGTAT AGACATGCGC TTGCTATTAT ATAAAACCAT ACTCTTTAGA TTTCCTCTGT ATCAAACATA TCTGTACGCG TCTTCCGATG AGATATTCGA TGCTTTTCTA ATGTATCATA TAGCTACAAG ATATGCCTAT AGÃAGGCTAC TCTATAAGCT ACGAAAAGAT TACATAGTAT ATCGATGTTC TATACGGATA CATGATGATG ATATATATCT ACAAATAGTG TTATATTATT CTAATAATCA AAATGTTATA GTACTACTAC TATATATAGA TGTTTATCAC ΑΛΤΑΤΑΑΤΑΑ GATTATTAGT TTTACAATAT TCTTATATTA CGAAAAATAA ATACGTTAAG l'ATATAAGAA ATAAAACTAG AGACGATATT AGAATATAAT GCTTTTTATT TATGCAATTC ATATATTCTT TATTTTGATC TCTGCTATAA CATAAAGTAA AAATATTAGC TCTAGAAGAC TTTACAACGG AAGAAATATA TTGTTGGATT GTATTTCATT TTTATAATCG AGATCTTCTG AAATGTTGCC TTCTTTATAT AACAACCTAA AGTAATATAT AACAGCGTAG CTGCACGGTT TTGATCATTT TCCAACAATA TAAACCAATG TCATTATATA TTGTCGCATC GACGTGCCAA AACTAGTAAA AGGTTGTTAT ATTTGGTTAC 7864.SB ->· AAGGAGGACG ACTCATCAAA CATAAATAAC ATTCACGGAA AATATTCAGT ATCAGATTTA TTCCTCCTGC TGAGTAGTTT GTATTTATTG TAAGTGCCTT TTATAAGTCA TAGTCTAÃAT <- 7876.SL TCACAAGATG ATTATGTTAT TGAATGTATA GACGGATCTT TTGATTCGAT CAAGTATAGA AGTGTTCTAC TAATACAATA ACTTACATAT CTGCCTAGAA AACTAAGCTA GTTCATATCT GATATAAAGG TTATAATAAT GAAGAATAAC GGTTACGTTA ATTGTAGTAA ATTATGTAAA CTATATTTCC AATATTATTA CTTCTTATTG CCAATGCAAT TAACATCATT TAATACATTT ATGCGGAATA AATACTTTTC TAGATGGTTG CGTCTTTCTA CTTCTAAAGC ATTATTAGAC TACGCCTTAT TTATGAAAAG ATCTACCAAC GCAGAAAGAT GAAGATTTCG TAATAATCTG ATTTACAATA ATAAGTCAGT AGATAATGCT ATTGTTAAAG TCTATGGTAA AGGTAAGAAA TAAATGTTAT TATTCAGTCA TCTATTACGA TAACAATTTC AGATACCATT TCCATTCTTT CTTATTATAA CAGGATTTTA TCTCAAACAA AATATGATAC GTTATGTTAT TGAGTGGATA GAATAATATT GTCCTAAAAT AGAGTTTGTT TTATACTATG CAATACAATA ACTCACCTAT GGGGATGATT TTACAAACGA TATATACAAA ATGATTAATT TCTATAATGC GTTATTCGGT CCCCTACTAA AATGTTTGCT ATATATGTTT TACTAATTAA AGATATTACG CAATAAGCCA 7865.SL -> AACGATGAAT TÃÃAAATAGT ATCCTGTGAA AACACTCTAT GCCCGTTTAT AGAACTTGGT TTGCTACTTA ATTTTTATCA TAGGACACTT TTGTGAGATA CGGGCAAATA TCTTGAACCA <- 7875.SL AGATGCTATT ATGGTAAAAA ATGTAAGWAT ATACACGGAG ATCAATGTGA TATCTGTGGT TCTACGATAA TACCATTTTT TACATTCATA TATGTGCCTC TAGTTACACT ATAGACACCA FIG.3C (FOLHA 17 de 39) 18/39 1021 CTATATATAC TACACCCTAC CGATATTAAC CAACGAGTTT CTCACAAGAA AACTTGTTTA GATATATATG ATGTGGGATG GCTATAATTG GTTGCTCAAA GAGTGTTCTT TTGAACAAAT 1081 GTAGATAGAG ATTCTTTGAT TOTGTTTAAA AGAAGTACCA GTAAAAAGTG TGGCATATGC CATCTATCTC TAAGAAACTA ACACAAATTT TCTTCATGGT CATTTTTCAC ACCGTATACG 1141 ATAGAAGAAA TAAACAAAAA ACATATTTCC GAACAGTATT TTGGAATTCT CCCAAGTTGT TATCTTCTTT ATTTGTTTTT TGTATAAAGG CTTGTCATAA AACCTTAAGA GGGTTCAACA 1201 AAACATÃTTT TTTGCCTATC ATGTATAAGA CGTTGGGCAG ATACTACCAG AAATACAGAT TTTGTATAAA AAACGGATAG TACATATTCT GCAACCCGTC TATGATGGTC TTTATGTCTA 1261 ACTGAAAATA CGTGTCCTGA ATGTAGAATA GTTTTTCCTT TCATAATACC CAGTAGGTAT TGACTTTTAT GCACAGGACT TACATCTTAT CAAAAAGGAA AGTATTATGG GTCATCCATA 1321 TGGATAGATA ATAAATATGA TAAAAAAATA TTATATAATA GATATAAGAA AATGATTTTT ACCTÃTCTAT TATTTATACT ATTTTTTTAT AATATATTAT CTATATTCTT TTACTAAAAA 1381 ACAAAAATAC CTATAAGAAC AATAAAAATA TAATTACATT TACGGAAAAT AGCTGGTTTT TGTTTTTATG GATATTCTTG TTATTTTTAT ATTAATGTAA ATGCCTTTTA TCGACCAAAA 7866.SL -> 1441 AGTTTAÇCAA CTTAGAGTAA TTATCATATT GAATCTATAT TGCTAATTAG CTAATAAAAA TCAAATGGTT GAATCTCATT AATAGTATAA CTTAGATATA ACGATTAATC GATTATTTTT 4- 7874.SL 1501 CCCGGGTTAA TTAATTAGTC ATCAGGCAGG GCGAGAACGA GACTATCTGC TCGTTAATTA GGGCCCAATT AATTAATCAG TAGTCCGTCC CGCTCTTGCT CTGATAGACG AGCAATTAAT => H6p 1561 ATTAGAGCTT CTTTATTCTA TACTTAAAAA GTGAAAATAA ATACAAAGGT TCTTGAGGGT TAATCTCGAA GAAATAAGAT ATGAATTTTT CACTTTTATT TATGTTTCCA AGAACTCCCA 1621 TGTGTTAAAT TGAAAGCGAG AAATAATCAT AAATTATTTC ATTATCGCGA TATCCGTTAA ACACAATTTA ACTTTCGCTC TTTATTAGTA TTTAATAAAG TAATAGCGCT ATAGGCAATT ^ Nipah G MetProAla GluAsnLys LysValArgPhe GluAsnThr ThrSerAsp 1681 GTTTGTATCG TAATGCCGGC AGAAAACAAG AAAGTTAGAT TCGAAAATAC TACTTCAGAC CAAACATAGC ATTACGGCCG TCTTTTGTTC TTTCAATCTA AGCTTTTATG ATGAAGTCTG LysGlyLysIle ProSerLys VallleLys SerTyrTyrGly ThrMetAsp IleLysLys 1741 AAAGGGAAAA TTCCTAGTAA AGTTATTAAG AGCTACTACG GAACCATGGA CATTAAGAAA TTTCCCTTTT AAGGATCATT TCAATAATTC TCGATGATGC CTTGGTACCT GTAATTCTTT 11472.SL IleAsnGluGly LeuLeuAsp SerLysIle LeuSerAlaPhe AsnThrVal IleAlaLeu 1801 ATAAATGAAG GATTATTGGA CAGCAAAATA TTAAGTGCTT TCAACACAGT AATAGCATTG TATTTACTTC CTAATAACCT GTCGTTTTAT AATTCACGAA AGTTGTGTCA TTATCGTAAC LeuGlySerlle Valllelle ValMetAsn IleMetllelle GlnAsnTyr ThrArgSer 1861 CTTGGATCTA TCGTGATCAT AGTGATGAAT ATAATGATCA TCCAAAATTA CACAAGATCA GAACCTAGAT AGCACTAGTA TCACTACTTA TATTACTAGT AGGTTTTAAT GTGTTCTAGT FIG. 3C (FOLHA 18 de 39) 19/39 ThrAspAsnGln AlaValIle LysAspAla ACAGACAATC AGGCCGTGAT CAAAGATGCG TGTCTGTTAG TCCGGCACTA GTTTCTACGC LeuAlaAspLys IleGlyThr GluIleGly CTTGCTGACA AAATCGGCAC AGAGATAGGG GAACGACTGT TTTAGCCGTG TCTCTATCCC ThrlleThrlle ProAlaAsn IleGlyLeu ACCATTACTA TCCCAGCTAA CATTGGGCTG TGGTAATGAT AGGGTCGATT GTAACCCGAC SerlleAsnGlu AsnValAsn GluLysCys AGTATAAATG AGAATGTGAA TGAAAAATGC TCATATTTAC TCTTACACTT ACTTTTTACG GluCysAsnlle SerCysPro AsnProLeu GAATGTAACA TTTCTTGTCC TAACCCACTC CTTACATTGT AAAGAACAGG ATTGGGTGAG GlyValSerAsn LeuValGly LeuProAsn GGGGTGAGCA ATCTAGTAGG ATTACCTAAT CCCCACTCGT TAGATCATCC TAATGGATTA IleLeuLysPro LysLeuXle SerTyrThr ATATTGAAGC CAAAGCTGAT TTCATACACT TATAACTTCG GTTTCGACTA AAGTATGTGA IleThrAspPro LeuLeuAla MetAspGlu ATCACAGACC CATTGCTGGC TATGGACGAG TAGTGTCTGG GTAACGACCG ATACCTGCTC IleGlySerCys SerArgGly ValSerLys ATCGGATCAT GTTCAAGAGG GGTCTCCAAA TAGCCTAGTA CAAGTTCTCC CCAGAGGTTT AspArgGlyAsp GluValPro SerLeuPhe GACAGAGGTG ATGAAGTTCC TTCTTTATTT CTGTCTCCAC TACTTCAAGG AAGAAATAAA AsnThrValTyr HisCysSer AlaValTyr AACACCGTTT ACCACTGTAG TGCTGTATAC TTGTGGCAAA TGGTGACATC ACGACATATG ValSerThrVal GlyAspPro IleLeuAsn GTGTCAACTG TTGGAGACCC TATTCTGAAT CACAGTTGAC AACCTCTGGG ATAAGACTTA 4- 11476.SL LeuGlnGlylle GlnGlnGln IleLysGly TTGCAGGGTA TCCAACAGCA GATCAAAGGG AACGTCCCAT AGGTTGTCGT CTAGTTTCCC ProLysValSer LeuIleAsp ThrSerSer CCCAAAGTAT CACTGATTGA CACATCCAGT GGGTTTCATA GTGACTAACT GTGTAGGTCA 11473.SL -* LeuGlySerLys IleSerGln SerThrAla TTAGGTTCAA AGATCAGCCA GTCGACTGCA AATCCAAGTT TCTAGTCGGT CAGCTGACGT LysPheThrLeu ProProLeu LysIleHis AAATTCACAC TGCCTCCCTT GAAAATCCAC TTTAAGTGTG ACGGAGGGAA CTTTTAGGTG <- 11474.SL ProPheArgGlu TyrArgPro GlnThrGlu CCTTTTAGAG AGTATAGGCC ACAGACAGAA GGAAAATCTC TCATATCCGG TGTCTGTCTT AsnlleCysLeu GlnLysThr SerAsnGln AATATTTGCC TGCAAAAGAC ATCTAATCAG TTATAAACGG ACGTTTTCTG TAGATTAGTC LeuProValVal GlyGlnSer GlyThrCys TTACCCGTAG TCGGTCAAAG TGGTACCTGT AATGGGCATC AGCCAGTTTC ACCATGGACA GlyTyrPheAla TyrSerHis LeuGluArg GGCTATTTTG CATATAGCCA CCTGGAAAGA CCGATAAAAC GTATATCGGT GGACCTTTCT GlnArgllelle GlyValGly GluValLeu CAAAGAATAA TAGGAGTTGG AGAGGTACTA GTTTCTTATT ATCCTCAACC TCTCCAXGAT 11475.SL -» MetThrAsnVal TrpThrPro ProAsnPro ATGACCAATG TCTGGACCCC ACCAAATCCA TACTGGTTAC AGACCTGGGG TGGTTTAGGT AsnAsnGluPhe TyrTyrVal LeuCysAla AACAATGAAT TCTATTATGT ACTTTGTGCA TTGTTACTTA AGATAATACA TGAAAÇAÇGT SerThrTyrTrp SerGlySer LeuMetMet AGCACCTACT GGTCCGGATC TCTAATGATG TCGTGGATGA CCAGGCCTAG AGATTACTAC FIG. 3C (FOLHA. 19 de 39) 20/39 ThrArgLeuAla ValLysPro LysSerAsn GlyGlyGlyTyr AsnGlnHis GlnLeuAla ACCCGTCTAG CTGTGAAACC CAAGAGTAAT GGTGGGGGTT ACAATCAACA TCAACTTGCC TGGGCAGATC GACACTTTGG GTTCTCATTA CCACCCCCAA TGTTAGTTGT AGTTGAACGG LeuArgSerlle GluLysGly ArgTyrAsp LysValMetPro TyrGlyPro SerGlylle CTACGAAGTA TCGAGAAAGG GAGGTATGAT AAAGTTATGC CGTATGGACC TTCAGGCATC GATGCTTCAT AGCTCTTTCC CTCCATACTA TTTCAATACG GCATACCTGG AAGTCCGTAG LysGlnGlyAsp ThrLeuTyr PheProAla ValGlyPheLeu ValArgThr GluPheLys AAACAGGGTG ACACCCTGTA TTTTCCTGCT GTAGGATTTT TGGTCAGGAC AGAGTTTAAA TTTGTCCCAC TGTGGGACAT AAAAGGACGA CATCCTAAAA ACCAGTCCTG TCTCAAATTT TyrAsnAspSer AsnCysPro IleThrLys CysGlnTyrSer LysProGlu AsnCysArg TACAATGATT CAAATTGTCC CATCACGAAG TGTCAATACA GTAAACCTGA AAATTGCAGG ATGTTACTAA GTTTAACAGG GTAGTGCTTC ACAGTTATGT CATTTGGACT TTTAACGTCC 11477.SL LeuSerMetGly IleArgPro AsnSerHis TyrlleLeuArg SerGlyLeu LeuLysTyr CTATCTATGG GGATTAGACC AAACAGCCAT TATATCCTTC GATCTGGACT ATTAAAATAC GATAGATACC CCTAATCTGG TTTGTCGGTA ATATAGGAAG CTAGACCTGA TAATTTTATG AsnLeuSerAsp GlyGluAsn ProLysVal ValPhelleGlu IleSerAsp GlnArgLeu AATCTATCAG ATGGGGAGAA CCCCAAAGTT GTATTCATTG AAATATCTGA TCAAAGATTA TTAGATAGTC TACCCCTCTT GGGGTTTCAA CATAAGTAAC TTTATAGACT AGTTTCTAAT 11478.SL SerlleGlySer ProSerLys IleTyrAsp SerLeuGlyGln ProValPhe TyrGlnAla TCTATTGGAT CTCCTAGCAA AKTCTATGAT TCTTTGGGTC AACCTGTTTT CTACCAAGCG AGATAACCTA GAGGATCGTT TTAGATACTA AGAAACCCAG TTGGACAAAA GATGGTTCGC SerPheSerTrp AapThrMet IleLysPhe GlyAspValLeu ThrValAsn ProLeuVal TCATTTTCAT GGGATACTAT GATTAAATTT GGAGATGTTC TAACAGTCAA CCCTCTGGTT AGTAAAAGTA CCCTATGATA CTAATTTAAA CCTCTACAAG ATTGTCAGTT GGGAGACCAA ValAsnTrpArg AsnAsnThr VallleSer ArgProGlyGln SerGInCys ProArgPhe GTCAATTGGC GTAATAACAC GGTAATATCA AGACCCGGGC AATCACAATG CCCTAGATTC CAGTTAACCG CATTATTGTG CCATTATAGT TCTGGGCCCG TTAGTGTTAC GGGATCTAAG AsnThrCysPro GluIleCys TrpGluGly ValTyrAsnAsp AlaPheLeu IleAspArg AATACATGTC CAGAGATCTG CTGGGAAGGA GTTTATAATG ATGCATTCCT AATTGACAGA TTATGTACAG GTCTCTAGAC GACCCTTCCT CAAATATTAC TACGTAAGGA TTAACTGTCT 11479.SL IleAsnTrpIle SerAlaGly ValPheLeu AspSerAsnGln ThrAlaGlu AsnProVal ATCAATTGGA TAAGCGCGGG TGTATTCCTT GACAGCAATC AGACCGCAGA AAATCCTGTT TAGTTAACCT ATTCGCGCCC ACATAAGGAA CTGTCGTTAG TCTGGCGTCT TTTAGGACAA PheThrValPhe LysAspAsn GluIleLeu TyrArgAlaGln LeuAlaSer GluAspThr TTTACTGTAT TCAAAGATAA TGAAATACTT TATAGGGCAC AACTGGCTTC TGAGGACACC AAATGACATA AGTTTCTATT ACTTTATGAA ATATCCCGTG TTGACCGAAG ACTCCTGTGG <- 11480.SL FIG. 3C (FOLHA 20 de 39) 3361 3_1 3481 3541 3601 3661 3721 3781 3841 3901 3961 4021 4081 4141 AsnAlaGlnLys ThrlleThr AsnCysPhe AATGCACAAA AAACAATAAC TAATTGTTTT TTACGTGTTT TTTGTTATTG ATTAACAAAA 21/39 LeuLeuLysAsn LysIleTrp CysIleSer CTCTTGAAGA ATAAGATTTG GTGCATATCA GAGAACTTCT TATTCTAAAC CACGTATAGT LeuValGluIle TyrAspThr GlyAspAsn VallleArgPro LysLeuPhe AlaValLys TTGGTTGAGA TATATGACAC AGGAGACAAT GTCATAAGAC CCAAACTATT CGCGGTTAAG AACCAACTCT ATATACTGTG TCCTCTGTTA CAGTATTCTG GGTTTGATAA GCGCCAATTC => F3L IleProGluGln CysThr (SEQ ID Na: 17) ATACCAGAGC AATGTACATA ACTCGAGTTT TTATTGACTA GTTAATCAM AGATAAATAÀ TATGGTCTCG TTACATGTAT TGAGCTCAAA AATAACTGAT CAATTAGTAT TCTATTTATT 7867.SL -> TATACAGCAT TGTAACCATC GTCATCCGTT ATACGGGGAA TAATATTACC ATACAGTATT ATATGTCGTA ACATTGGTAG CAGTAGGCAA TATGCCCCTT ATTATAATGG TATGTCATAA 4- 7873.SL ATTAAATTTT CTTACGAAGA ATATAGATCG GTATTTATCG TTAGTTTATT TTACATTTAT TAATTTAAAA GAATGCTTCT TATATCTAGC CATÃAATAGC AATCAAATAA AATGTAAATA TAATTAAACA TGTCTACTAT TACCTGTTAT GGAAATGACA AATTTAGTTA TATAATTTAT ATTAATTTGT ACAGATGATA ATGGACAATA CCTTTACTGT TTAÃATCAAT ATATTAAATA GATAAAATTA AGATAATAAT AATGAAATCA AATAATTATG TAAATGCTAC TAGATTATGT C.TATTTTAAT TCTATTATTA TTACTTTAGT TTATTAATAC ATTTACGATG ATCTAATÃCA GAATTACGAG GAA.GAAAGTT TACGAACTGG ΑΑΑΑΑΛΤΤΑΑ GTGAATCTAA AATATTAGTC CTTAATGCTC CTTCTTTCAA ATGCTTGACC TTTTTTAATT CACTTAGATT TTATAATCAG GATAATGTAA AAAAAATAAA TGATAAAACT AACCAGTTAA AAACGGATAT GATTATATAC CTATTACATT TTTTTTATTT ACTATTTTGA TTGGTCAATT TTTGCCTATA CTAATATATG GTTAAGGATA TTGATCATAA AGGAAGAGAT ACTTGCGGTT ACTATGTACA CCAAGATCTG CAATTCCTAT AACTAGTATT TCCTTCTCTA TGAACGCCAA TGATACATGT GGTTCTAGAC 7868.SL GTATCTTCTA TATCAAATTG GATATCTCCG TTATTCGCCG TTAAGGTAAA TAAAATTATT CATAGAAGAT ATAGTTTAAC CTATAGAGGC AATAAGCGGC AATTCCATTT ATTTTAATAA <- 7872.SL AACTATTATA TATGTAATGA ATATGATATA CGACTTAGCG AAATGGAATC TGATATGACA TTGATAATAT ATACATTACT TATACTATAT GCTGAATCGC TTTACCTTAG ACTATACTGT GAÃGTAÃTAG ATGTAGTTGA TAAATTAGTA GGAGGATACA ATGATGAAAT AGCAGAAATA CTTCATTATC TACATCAACT ATTTAATCAT CCTCCTATGT TACTACTTTA TCGTCTTTAT ATATATTTGT TTAATAAATT TATAGAAAAÃ TATATTGCTA ACATATCGTT ATCAACTGAA TATATAAACA AATTATTTAA ATATCTTTTT ATATAACGAT TGTATAGCAA TAGTTGACTT TTATCTAGTA TATTAAATAA TTTTATAAAT TTTAATAAAA AATACAATAA CGACATAAAA AATAGATCAT ATAATTTATT AAAATATTTA AAATTATTTT TTATGTTATT GCTGTATTTT FIG.3C (FOLHA 21 de 39) 01 22/39 GATATTAAAT CTTTAATTCT TGATCTGAAA AACACATCTA TAAAACTAGA TAAAAAGTTA CTATAATTTA GAAATTAAGA ACTAGACTTT TTGTGTAGAT ATTTTGATCT ATTTTTCAAT TTCGATAAAG ATAATAATGA ATCGAACGAT GAAAAATTGG AAACAGAAGT TGATAAGCTA AAGCTATTTC TATTATTACT TAGCTTGCTA CTTTTTAACC TTTGTCTTCA ACTATTCGAT ATTTTTTTCA TCTAAATAGT ATTATTTTAT TGAAGTACGA AGTTTTACGT TAGATAAATA TAAAAAAAGT AGATTTATCA TAATAAAATA ACTTCATGCT TCAAAATGCA ATCTATTTAT ATAAAGGTCG ATTTTTATTT TGTTAAATAT CAAATATGTC ATTATCTGAT AAAGATACAA TATTTCCAGC TAAAAATAAA ACAATTTATA GTTTATACAG TAATAGACTA TTTCTATGTT 7869.SL -¥ AAACACACGG TGATTATCAA CCATCTAACG AACAGATATT ACAAAAAATA CGTCGGACTA TTTGTGTGCC ACTAATAGTT GGTAGATTGC TTGTCTATAA TGTTTTTTAT GCAGCCTGAT 4- 7871.SL TGGAAAACGA AGCTGATAGC CTCAATAGAA GAAGCATTAA AGAAATTGTT GTAGATGTTA ACCTTITGCT TCGACTATCG GAGTTATCTT CTTCGTAATT TCTTTAACAA CATCTACAAT TGAAGAATTG GGATCATCCT CTCAACGAAG AAATAGATAA AGTTCTAAAC TGGAAAAATG ACTTCTTAAC CCTAGTA.GGA GAGTTGCTTC TTTATCTATT TCAAGATTTG ACCTTTTTAC ATACATTAAA CGATTTAGAT CATCTAAATA CAGATGATAA TATTAAGGAA ATCATACAAT TATGTAATTT GCTAAATCTA GTAGATTTAT GTCTACTATT ATAATTCCTT TAGTATGTTA GTCTGA.TTAG AGAATTTGCG TTTAAAAAGA TCAATTCTAT TATGTATAGT TATGCTATGG CAGACTAATC TCTTAAACGC AAATTTTTCT AGTTAAGATA ATACATATCA ATA.CGATACC TAAAACTCAA TTCAGATAAC GAAACATTGA AAGATAAAAT TAAGGATTAT TTTATAGAAA ATTTTGAGTT AAGTCTATTG CTTTGTAA.CT TTCTATTTTA ATTCCTAA.TA AAATATCTTT CTATTCTTAA AGACAAACGT GGTTATAAAC AAAAGCCATT ACCCTAGAGC GGCCGCCACC GATAAGAATT TCTGTTTGCA CCAATATTTG TTTTCGGTAA TGGGATCTCG CCGGCGGTGG GCGGTGGAGC TCCAGCTTTT GTTCCCTTTA GTGAGGGTTA ATTTCGAGCT TGGCGTAATC CGCCACCTCG AGGTCGAAAA CAAGGGAAAT CACTCCCAAT TAAAGCTCGA ACCGCATTAG ATGGTCATAG CTGTTTCC (SEQ ID N“: 18> TACCAGTATC GACAAAGG (SEQ ID Ν=: 19) 4- M13R FIG.3C (FOLHA 22 de 39) 23/39

FIG. 4A Nru I H6p MVVILDKR 11458. SL 5' TA(TCGC^raTCCGrTAAGTTrGTArCGT/lATGGTAGTTATACTTGACAAGAGA DLLFVFGPNL GATTTGCTTTTTGTATTTGGCCCCAACCTT 4- 11456.SL 5' GATTTGCTATTCGTATTTGGGCCCAACCTT 11457. SL 3' CTAAACGATAAGCATAAA|CCCGGG|TTGGAA Apa I GDLYYIGT* (SEQ ID NO: 20) GGGGATCTCTACTACATTGGGACATAG (SEQ ID NO: 21) 11459.SL 3' CCCCTAGAGATGATGTAACCCTGTATdGGGCCClTAGGCG (SEQ ID NO: 22) Xmal BamH I FIG. 4B (FOLHA 23 de 39) 24/39

FIG. 4C (FOLHA 24 de 39) 25/39 M13F-» =>F8R GTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTGTAATACG ACTCACTATA GGGCGAATTG GGTGACCCTT CATTTTGCTG CCGGTCACTT AACATTATGC TGAGTGATAT CCCGCTTAAC CCACTGGGAA TACAAGAATA AAAGAAGAAA CAACTGTGAA ATAGTTTATA AATGTAATTC GTATGCAGAA ATGTTCTTAT TTTCTTCTTT GTTGACACTT TATCAAATAT TTACATTAAG CATACGTCIT AACGATAATA TATTTTGGTA TGAGAAATCT AAAGGAGACÃ TAGTTTGTAT AGACATGCGC TTGCTATTAT ATAAAACCAT ACTCTTTÂGA TTTCCTCTGT ATCAAACATA TCTGTACGCG TCTTCCGATG AGATATTCGA TGCTTTTCTA ATGTATCATA TAGCTACAAG ATATGCCTAT AGAAGGCTAC TCTATAAGCT ACGAAAAGAT TACATAGTAT ATCGATGTTC TATACGGATA CATGATGATG ATATATATCT ACAAATAGTG TTATATTATT CTAATAATCA AAATGTTATA GTACTACTAC TATATATAGA TGTTTATCAC AATATÂATAA GATTATTAGT TTTACAATAT TCTTATATTA CGAAAAATAA ATACGTTÃAG TATATAAGAA ATAAAACTAG AGACGATATT AGAATATAAT GCTTTTTATT TATGCAATTC ATATATTCTT TATTTTGATC TCTGCTATAA CATAAAGTAA AAATATTAGC TCTAGAAGAC TTTACAACGG AAGAAATATA TTGTTGGATT GTATTTCATT TTTATAATCG AGATCTTCTG AAATGTTGCC TTCTTTATAT AACAACCTAA AGTAAIÂTAT AACAGCGTAG CTGCACGGTT TTGATCATTT TCCAACAATA TAAACCAATG TCATTATATA TTGTCGCATC GACGTGCCAA AACTAGTAAA AGGTTGTTAT ATTTGGTTAC 7864.SL -+ AAGGAGGACG ACTCATCAAA CATAAATÃÃC ATTCACGGAA AATATTCAGT ATCAGATTTA TTCCTCCTGC TGAGTAGTTT GTATTTATTG TAAGTGCCTT TTATAAGTCA TAGTCTAAAT <- 7876.SL TCACAAGATG ATTATGTTAT TGAATGTATA GACGGATCTT TTGATTCGAT CAAGTATAGA AGTGTTCTAC TAATACAATA ACTTACATAT CTGCCTAGÃA AACTAAGCTA GTTCATATCT GATATAAAGG TTATAATAAT GAAGAATAAC GGTTACGTTA ATTGTAGTAA ATTATGTAAA CTATATTTCC AATATTATTA CTTCTTATTG CCAATGCAAT TAACATCATT TAATACATTT ATGCGGAATA AATACTTTTC TAGATGGTTG CGTCTTTCTA CTTCTAAAGC ÀTTATTAGAC TACGCCTTAT TTATGAAAAG ATCTACCAAC GCAGAAAGAT GAAGATTTCG TAATAATCTG ATTTACAATA ATAAGTCAGT AGATAATGCT ATTGTTAAAG TCTATGGTAA AGGTAAGAAA TAAATGTTAT TATTCAGTCA TCTATTACGA TAACAATTTC AGATACCATT TCCATTCTTT CTTATTATÃA CAGGATTTTA TCTCAAACAA AATATGATAC GTTATGTTAT TGAGTGGATA GAATAATATT GTCCTAAAAT AGAGTTTGTT TTATACTATG CAATACAATA ACTCACCTAT GGGGATGATT TTACAAACGA TATATACAÃA ATGATTAATT TCTATAATGC GTTATTCGGT CCCCTACTAA AATGTTTGCT ATATATGTTT TACTAATTAA AGATATTACG CAATAAGCCA 7865.SL -» AACGATGAAT TAAAAATAGT ATCCTGTGAA AACACTCTAT GCCCGTTTAT AGAACTTGGT TTGCTACTTA ATTTTTATCA TAGGACACTT TTGTGAGATA CGGGCAAATA TCTTGAACCA <—7875.SL FIG.4D (FOLHA 25 de 39) 26/39 961 AGATGCTATT ATGGTAAAAA ATGTAAGTAT ATACACGGAG ATCAATGTGA TATCTGTGGT TCTACGATAA TACCATTTTT TACATTCATA TATGTGCCTC TAGTTACACT ATAGACACCA 1021 CTATATATAC TACACCCTAC CGATATTAAC CAACGAGTTT CTCACAAGAA AACTTGTTTA GATATATATG ATGTGGGATG GCTATAATTG GTTGCTCAAA GAGTGTTCTT TTGAACAAAT 1081 GTAGATAGAG ATTCTTTGAT TGTGTTTAAA AGAAGTACCA GTAAAAAGTG TGGCATATGC CATCTATCTC TAAGAAACTA ACACAAATTT TCTTCATGGT CATTTTTCAC ACCGTATACG 1141 ATAGAAGAAA TAAACAAAAA ACATATTTCC GAACAGTATT TTGGAATTCT CCCAAGTTGT TATCTTCTTT ATTTGTTTTT TGTATAAAGG CTTGTCATAA AACCTTAAGA GGGTTCAACA 1201 AÃACATATTT TTTGCCTATC ATGTATAAGA CGTTGGGCAG ATACTACCAG AAÃTACAGAT TTTGTATAAA AAACGGATAG TACATATTCT GCAACCCGTC TATGATGGTC TTTATGTCTA 1261 ACTGAAAATA CGTGTCCTGA ATGTAGAATA GTTTTTCCTT TCATAATACC CAGTAGGTAT TGACTTTTAT gcacaggact tacatcttat caaaaaggaa agtattatgg gtcatccata 1321 TGGATAGATA ATAAATATGA ΤΑΑΑΑΑΑΑΤΑ TTATATAATA GATATAAGAA AATGATTTTT ACCTATCTAT TATTTATACT ATTTTTTTAT AATATATTAT CTATATTCTT TTÃCTAAAAA 1381 ACAAAAATAC CTATAAGAAC AATAAAAATA TAATTACATT TACGGAAAAT AGCTGGTTTT TGTTTTTATG gatattcttg ttatttttat ATTâATGTAA ATGCCTTTTA TCGACCAAAA 7866.SL 1441 AGTTTACCAA CTTAGAGTAA TTATCATATT GAATCTATAT TGCTAATTAG CTAATAAAAA TCAAATGGTT GAATCTCATT AATAGTATAA CTTAGATATA ACGATTAATC GATTATTTTT <- 7874.SL 1501 CCCGGGTTAA TTAATTAGTC ATCAGGCAGG GCGAGAACGA GACTATCTGC TCGTTAATTA GGGCCCAATT AATTAATCAG TAGTCCGTCC CGCTCTTGCT CTGATAGACG AGCAATTAAT => H6p 1561 ATTAGAGCTT CTTTATTCTA TACTTAAAAA GTGAAAATAA ATACAAAGGT TCTTGAGGGT TAATCTCGAA GAAATAAGAT ATGAATTTTT CACTTTTATT TATGTTTCCA AGAACTCCCA NruI 1621 TGTGTTAAAT TGAAAGCGAG AAATAATCAT AAATTATTTC ATTAfTCGCGA TjATCCGTTAA ACACAATTTA ACTTTCGCTC TTTATTAGTA TTTAATAAAG TAATAGCGCT ATAGGCAATT =>Nipah F MetValVal IleLeuAsp LysArgCysTyr CysAsnLeu LeuIleLeu 1681 GTTTGTATCG TAATGGTAGT TATACTTGAC AAGAGATGTT ATTGTAATCT TTTAATATTG CAAACATAGC ATTACCATCA ATATGAACTG TTCTCTACAA TAACATTAGA AAATTATAAC IleLeuMetlle SerGluCys SerValGly IleLeuHisTyr GluLysLeu SerLysIle 1741 ATTTTGATGA TCTCGGAGTG TAGTGTTGGG ATTCTACATT ATGAGAAATT GAGTAAAATT TAAAACTACT AGAGCCTCAC ATCACAACCC TAAGATGTAA TACTCTTTAA CTCATTTTAA <- 11468.SL GlyLeuValLys GlyValThr ArgLysTyr LysIleLysSer AsnProLeu ThrLysAsp 1801 GGACTTGTCA AAGGAGTAAC AAGAAAATAC AAGATTAAAA GCAATCCTCT CACAAAAGAC CCTGAACAGT TTCCTCATTG TTCTTTTATG TTCTAATTTT CGTTAGGAGA GTGTTTTCTG FIG.4D (FOLHA 26 de 39) 27/39 IleValIleLys MetllePro AsnValSer AsnMetSerGln CysThrGly SerValMet ATTGTTATAA AAATGATTCC GAATGTGTCG AACATGTCTC AGTGCACAGG GAGTGTCATG TAACAATATT TTTACTAAGG CTTACACAGC TTGTACAGAG TCACGTGTCC CTCACAGTAC GluAsnTyrLys ThrArgLeu AsnGlylle LeuThrProIle LysGlyAla LeuGluIle GAAAATTATA AAACACGATT AAACGGTATC TTAACACCTA TAAAGGGAGC GTTAGAGATC CTTTTAATAT TTTGTGCTAA TTTGCCATAG AATTGTGGAT ATTTCCCTCG CAATCTCTAG TyrLysAsnAsn ThrHisAsp LeuValGly AspValArgLeu AlaGlyVal IleMetAla TACAAAAACA ACACTCATGA CCTTGTCGGT GATGTGAGAT TAGCCGGAGT TATAATGGCA ATGTTTTTGT TGTGAGTACT GGAACAGCCA CTACACTCTA ATCGGCCTCA ATATTACCGT 11460.SL -> GlyValAlalle GlylleAla ThrAlaAla GlnlleThrAla GlyValAla LeuTyrGlu GGAGTTGCTA TTGGGATTGC AACCGCAGCT CAAATCACTG CAGGTGTAGC ACTATATGAG CCTCAACGAT AACCCTAACG TTGGCGTCGA GTTTAGTGAC GTCCACATCG TGATATACTC AlaMetLysAsn AlaAspAsn IleAsnLys LeuLysSerSer IleGluSer ThrAsnGlu GCAATGAAGA ATGCTGACAA CATCAACAAA CTCAAAAGCA GCATTGAATC AACTAATGAA CGTTACTTCT TACGACTGTT GTAGTTGTTT GAGTTTTCGT CGTAACTTAG TTGATTACTT <- 11465.SL AlaValValLys LeuGlnGlu ThrAlaGlu LysThrValTyr ValLeuThr AlaLeuGln GCTGTCGTTA AACTTCAAGA GACTGCAGAA AAGACAGTCT ATGTGCTGAC TGCTCTACAG CGACAGCAAT TTGAAGTTCT CTGACGTCTT TTCTGTCAGA TACACGACTG ACGAGATGTC AspTyrlleAsn ThrAsnLeu ValProThr IleAspLysIle SerCysLys GlnThrGlu GATTACATTA ATACTAATTT AGTACCGACA ATTGACAAGA TAAGCTGCAA ACAGACAGAA CTAATGTAAT TATGATTAAA TCATGGCTGT TÁACTGTTCT ATTCGACGTT TGTCTGTCTT 11456.SL -► Apal LeuSerLeuAsp LeuAlaLeu SerLysTyr LeuSerAspLeu LeuPheVal PheGlyPro CTCTCACTAG ATCTGGCATT ATCAAAGTAC CTCTCTGATT TGCTATTCGT ATTT|GGGCCC| GAGAGTGATC TAGACCGTAA TAGTTTCATG GAGAGACTAA ACGATAAGCA TAAACCCGGG <- 11457.SL AsnLeuGlnAsp ProValSer AsnSerMet ThxIleGlnAla IleSerGln AlaPheGly AACCTTCAAG ACCCAGTTTC TAATTCAATG ACTATACAGG CTATATCTCA GGCATTCGGT TTGGAAGTTC TGGGTCAAAG ATTAAGTTAC TGATATGTCC GATATAGAGT CCGTAAGCCA GlyAsnTyrGlu ThrLeuLeu ArgThrLeu GlyTyrAlaThr GluAspPhe AspAspLeu GGAAATTATG AAACACTGCT AAGAACATTG GGTTACGCTA CAGAAGACTT TGATGATCTT CCTTTAATAC TTTGTGACGA TTCTTGTAAC CCAATGCGAT GTCTTCTGAA ACTACTAGAA 11461.SL LeuGluSerAsp SerlleThr GlyGlnlle IleTyrValAsp LeuSerSer TyrTyrlle CTAGAAAGTG ACAGCATAAC AGGTGAAATC ATCTATGTTG ATCTAAGTAG CTACTATATA GATCTTTCAC TGTCGTATTG TCCAGTTTAG TAGATACAAC TAGATTCATC GATGATATAT HeValArgVal TyrPhePro IleLeuThr GluXleGlnGln AlaTyrlle GlnGluLeu ATTGTCAGGG TTTATTTTCC TATTCTGACT GAAATTCAAC AGGCCTATAT CCAAGAGTTG TAACAGTCCC AAATAAAAGG ATAAGACTGA CTTTAAGTTG TCCGGATATA GGTTCTCAAC •e- 11464.SL FIG.4D (FOLHA 27 de 39) 28/39 LeuProValSer PheAsnAsn AspAsnSer TTACCAGTGA GCTTCAACAA TGATAATTCA AATGGTCACT CGAAGTTGTT ACTATTAAGT LeuValArgAsn ThrLeuIle SerAsnlle TTGGTAAGGA ATACATTAAT ATCAAATATA AACCATTCCT TATGTAATTA TAGTTTATAT SerValIleCys AsnGlnAsp TyrAlaThr AGCGTGATCT GCAACCAAGA TTATGCCACA TCGCACTAGA CGTTGGTTCT AATACGGTGT ThrGlySerThr GluLysCys ProArgGlu ACGGGATCGA CTGAGAAGTG TCCTCGAGAG TGCCCTAGCT GACTCTTCAC AGGAGCTCTC AlaLeuSerAsn GlyValLeu PheAlaAsn GCACTATCTA ACGGGGTTCT GTTTGCCAAT CGTGATAGAT TGCCCCAAGA CAAACGGTTA 11462.SL -> ThrGlyArgAla IleSerGln SerGlyGlu ACAGGCAGGG CAATCTCACA ATCAGGAGAA TGTCCGTCCC GTTAGAGTGT TAGTCCTCTT CysProThrAla ValLeuGly AsnValIle TGTCCTACAG CCGTACTCGG TAATGTGATT ACAGGATGTC GGCATGAGCC ATTACACTAA <- 11463.SL AsnTyrAsnSer GluGlylle AlalleGly AATTATAATT CTGAAGGCAT TGCTATCGGT TTAATATTAA GACTTCCGTA ACGATAGCCA SerSerGlnlle SerSerMet AsnGlnSer TCAAGTCAGA TATCCAGCAT GAATCAGTCC AGTTCAGTCT ATAGGTCGTA CTTAGTCAGG AlaGlnArgLeu LeuAspThr ValAsnPro GCTCAACGAC TCCTTGATAC TGTTAATCCA CGAGTTGCTG AGGAACTATG ACAATTAGGT LeuTyrValLeu SerlleAla SerLeuCys CTGTATGTAT TATCGATCGC ATCGTTGTGT GACATACATA ATAGCTAGCG TAGCAACACA IleValGluLys LysArgAsn ThrTyrSer ATTGTTGAGA AAAAGAGAAA CACCTACAGC TAACAACTCT TTTTCTCTTT GTGGATGTCG SerSerGlyAsp LeuTyrTyr IleGlyThr AGCAGTGGGG ATCTCTACTA CATTGGGACA TCGTCACCCC TAGAGATGAT GTAACCCTGT GluTrpIleSer IleValPro AsnPhelle GAATGGATCA GTATTGTCCC AAATTTCATA CTTACCTAGT CATAACAGGG TTTAAAGTAT GluIleGlyPhe CysLeuIle ThrLysArg GAGATTGGAT TTTGCCTAAT TACAAAGAGG CTCTAACCTA AAACGGATTA ATGTTTCTCC ProMetThrAsn AsnMetArg GluCysLeu CCTATGACCA ACAACATGAG AGAATGTTTA GGATACTGGT TGTTGTACTC TCTTACAAAT LeuValValSer SerHisVal ProArgPhe CTGGTTGTTT CATCACATGT TCCCAGATTT GACCAACAAA GTAGTGTACA AGGGTCTAAA CysIleSerVal ThrCysGln CysGlnThr TGCATAAGTG TTACATGTCA GTGTCAAACA ACGTATTCAC AATGTACAGT CACAGTTTGT GlnThrLeuLeu MetlleAsp AsnThrThr CAAACTCTGC TGATGATTGA CAACACCACC GTTTGAGACG ACTACTAACT GTTGTGGTGG IleSerLeuGly LysTyrLeu GlySerVal ATCAGCTTAG GGAAATATCT GGGGTCAGTA TAGTCGAATC CCTTTATAGA CCCCAGTCAT ProProValPhe ThrAspLys ValAspIle CCTCCAGTCT TTACAGATAA AGTTGATATA GGAGGTCAGA AATGTCTATT TCAACTATAT LeuGlnGlnSer LysAspTyr IleLysGlu TTACAACAGT CTAAGGACTA TATCAAAGAG AATGTTGTCA GATTCCTGAT ATAGTTTCTC SerLeuIleSer MetLeuSer Metllelle TCATTAATAA GCATGTTGTC TATGATCATA AGTAATTATT CGTACAACAG ATACTAGTAT IleGlyLeulle ThrPhelle SerPhelle ATAGGGTTGA TTACATTTAT CAGTTTTATC TATCCCAACT AATGTAAATA GTCAAAATAG ArgLeuGluAsp ArgArgVal ArgProThr AGATTAGAGG ATAGGAGAGT CAGACCTACA TCTAATCTCC TATCCTCTCA GTCTGGATGT BamHI ID Ν“: 23> TAGCCCCjGGA TCC|CTCGAGT TTTTATTGAC ATCGGGCCCT AGGGAGCTCA AAAATAACTG FIG.4D (FOLHA 28 de 39) 29/39 =? FSL TAGTTAATCA TAAGATAAAT AATATACAGC ATCAATTAGT ATTCTATTTA TTATATGTCG AATAATATTA CCATACAGTA TTATTAAATT TTATTATAAT GGTATGTCAT AATAÂTTTAA CGTTAGTTTA TTTTACATTT ΑΤΤΑΑΤΤΆΑΑ GCAATCAAAT AAAATGTAAA TAATTAATTT CAAATTTAGT TATATAATTT ATGATAAAAT GTTTAAATCA ATATATTAAA TACTATTTTA TGTAAATGCT ACTAGATTAT GTGAATTACG ACATTTACGA TGATCTAATA CACTTAATGC AAGTGAATCT AAAATATTAG TCGATAATGT TTCACTTAGA TTTTATAATC AGCTATTACA AAAAACGGAT ATGATTATAT ACGTTAAGGA TTTTTGCCTA TACTAATATA TGCAATTCCT TTACTATGTA CACCAAGATC TGGTATCTTC-AATGATACAT GTGGTTCTAG ACCATAGAAG CGTTAAGGTA AATAAAATTA TTAACTATTA GCAATTCCAT TTATTTTAAT AATTGATAAT CGAAATGGAA TCTGATATGA CAGAAGTAAT GCTTTACCTT AGACTATACT GTCTTCATTA CAATGATGAA ATAGCAGAAA TAATATATTT GTTACTACTT TATCGTCTTT ATTATATAAA TAACATATCG TTATCAACTG AATTATCTAG ATTGTATAGC AATAGTTGAC TTAATAGATC AAAATACAAT AACGACATAA AAGATATTAA TTTTATGTTA TTGCTGTATT TTCTATAATT TATAAAACTA GATAAAAAGT TATTCGATAA ATATTTTGAT CTATTTTTCA ATAAGCTATT GGAAACAGAA GTTGATAAGC TAATTTTTTT CCTTTGTCTT CAACTATTCG ATTAAAAAAA GAAGTTTTAC GTTAGATAAA TAATAAAGGT CTTCAAÃATG CAATCTATTT ATTATTTCCA 7867.SL ATTGTAACCA TCGTCATCCG TTATACGGGG TAACATTGGT AGCAGTAGGC AATATGCCCC 7873.SL TTCTTACGAA GAATATAGAT CGGTATTTAT AAGAATGCTT CTTATATCTA GCCATAAATA CATGTCTACT ATTACCTGTT ATGGAAATGA GTACAGATGA TAATGGACAA TACCTTTACT TAAGATAATA ATAATGAAAT CAAATAATTA ATTCTATTAT TATTACTTTA GTTTATTAAT AGGAAGAAAG TTTACGAACT GGAAAAAATT TCCTTCTTTC AAÃTGCTTGA CCTTTTTTAA AÃAAAAAATA AATGATAAAA CTAACCAGTT TTTTTTTTAT TTACTATTTT GATTGGTCAA TATTGATCAT AAAGGAAGAG ATACTTGCGG ATAACTAGTA TTTCCTTCTC TATGAACGCC 7868. SL -»· TATATCAAAT TGGATATCTC CGTTATTCGC ATATAGTTTA ACCTATAGAG GCAATAAGCG <- 7872.SL TATATGTAAT GAATATGA.TA TACGACTTAG ATATACATTA CTTATACTAT ATGCTGAATC AGATGTAGTT GATAPJiTTAG TAGGAGGATA TCTACATCAA CTATTTAATC ATCCTCCTAT GTTTAATAAA TTTATAGAAA AATATATTGC. CAAATTATTT AAATATCTTT TTATATAACG TATATTAAAT AATTTTATAA ΆΤΤΤΤΑΆΤΑΑ ATATAATTTA TTAAAATATT TAAAATTATT ATCTTTAATT CTTGATCTGA ΑΑΆACACATC TAGAAATTAA GAACTAGACT TTTTGTGTAG AGATAATAAT GAATCGAACG ATGAAAAATT TCTATTATTA CTTAGCTTGC TACTTTTTAA CATCTAAATA GTATTATTTT ATTGAAGTAC GTAGATTTAT CATAATAAAA TAACTTCATG CGATTTTTAT TTTGTTAAAT ATCAAATATG GCTAAAAATA AAACAATTTA TAGTTTATAC FIG. 4D (FOLHA 29 de 39) 30/39 7869.SL -» 4321 TCATTATCTG ATAAAGÃTAC AAAAACACAC GGTGATTATC AACCATCTAA CGAACAGATA AGTAATAGAC TATTTCTATG TTTTTGTGTG CCACTAATAG TTGGTAGATT GCTTGTCTAT 4- 7871.SL 4381 TTACAAAAAA TACGTCGGAC TATGGAAAAC GAAGCTGATA GCCTCAATAG AAGAAGCATT AATGTTTTTT ATGCAGCCTG ATACCTTTTG CTTCGACtAT CGGAGTTATC TTCTTCGTAA 44 41 AAAGAAATTG TTGTA.GATGT TATGAAGAAT TGGGATCATC CTCTCAACGA AGAAATAGAT TTTCTTTAAC AACATCTACA ATACTTCTTA ACCCTAGTAG GAGAGTTGCT TCTTTATCTA 4501 AAAGTTCTAA ACTGGAAAAA TGATACATTA AACGATTTAG ATCATCTAÃA TACAGATGAT TTTCAAGATT TGACCTTTTT ACTATGTAAT TTGCTAAATC TAGTAGATTT ATGTCTACTA 4561 AATATTAAGG AAATCATACA ATGTCTGATT AGAGAATTTG CGTTTAAAAA GATCAATTCT TTATAATTCC TTTAGTATGT TACAGACTAA TCTCTTAÃAC GCAAATTTTT CTAGTTAAGA 4621 ATTATGTATA GTTATGCTAT GGTAAAACTC AATTCAGATA ACGAAACATT GAAAGATAAA TAATACATAT CAATACGATA CCATTTTGAG TTAAGTCTAT TGCTTTGTAA CTTTCTATTT 4681 ATTAAGGATT ATTTTATAGA AACTATTCTT AAAGACAAAC GTGGTTATAA ACAAAAGCCA TAATTCCTAA TAAAATATCT TTGATAAGAA TTTCTGTTTG CACCAATATT TGTTTTCGGT 4741 TTACCCIAGA GCGGCCGCCA CCGCGGTGGA GCTCCAGCTT TTGTTCCCTT TAGTGAGGGT AATGGGATCT CGCCGGCGGT GGCGCCACCT CGAGGTCGAA AACAAGGGAA ATCACTCCCA 4801 TAATTTCGAG CTTGGCGTAA TCATGGTCAT AGCTGTTTCC (SEQ ID N2: 24) ATTAAAGCTC GAACCGCATT AGTACCAGTA TCGACAAAGG (SEQ ID N2: 25) +- M13R FIG. 4D (FOLHA 30 de 39) 11458 11456 11457 11459 31/39 Nru I H6p MVVILDKR SL 5' T/jTCGCG^TATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGTAGTTATACTTGACAAGAGh DLLFVFGPNL GATTTGCTTTTTGTATTTGGCCCCAACCTT SL 5' GATTTGCTATTÇGTATTTGGGCCCAACCTT SL 3' ctaaacgataagcataaa|cccggg|ttggaa Apa I GDLYYIGT* (SEQ ID NO: 20) GGGGATCTCTACTACATTGGGACATAG (SEQ ID NO: 21) SL 3' CCCCTAGAGATGATGTAACCCTGTATC|GGGCCdTAGGCG (SEQ ID NO: 22) Xmal BamH I FIG.5A (FOLHA 31 de 39) 32/39

Amplificar por PGl 11457.SL/11458.SL· num σι» /c/ «ri pCR21 ff-NipahF (sem x5nt)

pF8 Hdp 5*-Nlpah F Amplificar por PQl can 11456.SL/11459.SL· w _ S\íw c»mi I câL-em-M I ti'uu mt» I 4 392 bp IV.------ n**» itati) «ri«M)

1 £ ii Apa t/BamH I pC6 HBpNIpahF pFS tttp Nlpah F FIG. 5B (FOLHA 32 de 39) 33/39 M13R -* GGAAACAGCT ATGACCATGA TTACGAATTG CCTTTGTCGA TACTGGTACT AATGCTTAAC CTTTGGATGA AGCTATAAAT ATGCATTGGA GAAACCTACT TCGATATTTA TACGTAACCT TACTACAAAA CCTAAGCGAT AATATGTTAA ATGATGTTTT GGATTCGCTA TTATACAATT TACACAAATA AACATAATTT TTGTATAACC ATGTGTTTAT TTGTATTAAA AACATATTGG AAGGAAATGT AATATCGTAA TTATXTTACT TTCCTTTACA TTATAGCATT AATAAAATGA GTATATCTAT ACTGTTATCG TATACTCTTT CATATAGATA TGACAATAGC ATATGAGAAA ATAAfíATTAC GTATTTAÃGA GAATCTTGTC TATTCTAATG CATAAATTCT CTTAGAACAG GCTATTTCGC ATCGTTACAT AAAGTCAGTT CGATAAAGCG TAGCAATGTA TTTCAGTCAA TAGGTGCAAA AATGTTAAAT AACAGCATTC ATCCACGTTT TTACAATTTA TTGTCGTAAG ACAAAAATCA CTGGTTGGAT AAAACAGATT TGTTTTTAGT GACCAACCTA TTTTGTCTAA GCGAATTTGT AAACTATGAC AATAAAAAGC CGCTTAAACA TTTGATACTG TTATTTTTCG CCATGTTTTA TGTATGTGTT TCAGATATTA GGTACAAAAT ACATACACAA AGTCTATAAT TATTCCGTAA ACTATATTAA TCATGAAGAA ATAAGGCATT TGATATAATT AGTACTTCTT GGTTGTTGAA AACAACAÃAA TTATACATTC CCAACAACTT TTGTTGTTTT AATATGTAAG ATCATGGATA ATGACAATGC ATCTCTAAAT TAGTACCTAT TACTGTTACG TAGAGATTTA ACGGAATATG GTACTCTACA ATCTCCTCTT TGCCTTATAC CATGAGATGT TAGAGGAGAA => C5R CGGCCGCAAT TC TGAATGTT AAATGTTATA GCCGGCGTTA AGACTTACAA TTTACAATAT AAAATAATCC ATTTAAAGAA AGGATTCAAA TTTTATTAGG TAAATTTCTT TCCTAAGTTT CTAAGCTTAT TCTTAACGAC GCTTTAAATA GATTCGAATA AGAATTGCTG CGAAATTTAT TAACAAATAA CTAAAACATA AAAATAATAA ATTGTTTATT GATTTTGTAT TTTTATTATT CAGGAATGGG GTTAAATATT TATATCACGT GTCCTTACCC CAATTTATAA ATATAGTGCA ACAATTACTA TTACGAATAT GCAAGAGATA TGTTAATGAT AATGCTTATA CGTTCTCTAT <- 7927.DC ATGATAATTG GGTACGACAT AGTGATAAAT TACTATTAAC CCATGCTGTA TCACTATTTA GGAAAGATGG ATTTGACAGA TGTAACTTAA CCTTTCTACC TAAACTGTCT ACATTGAATT 7696.CXL -* TATCGGAAGA TAGGÃTACCA GTTATATTAT ATAGCCTTCT ATCCTATGGT CAATATAATA CTGCAATATT CGTAAAAGAT GAAGATTACT GACGTTATAA GCATTTTCTA CTTCTAATGA CATXTATCTC AACGACATCG TGTAATTCTT GTAAATAGAG TTGCTGTAGC ACATTAAGAA TGAGATTACT ATAAACTTTT TGTATÂCTTA ACTCTAATGA TATTTGAAAA ACATATGAAT AATGAAAAAG TATAGAAGCT GTTCACGAGC TTACTTTTTC ATATCTTCGA CAAGTGCTCG 7926.DC AAGATGGCTT ACATATACGT CTGTGAGGCT TTCTACCGAA TGTATATGCA GACACTCCGA AGGTTTTTGG ACAAXGGATT CGACCCTAAC TCCAAAAÃCC TGTTACCTAA GCTGGGATTG GAAATGGCTG TAATGTTCAA GAATACCGAG CTTTACCGAC ATTACAAGTT CTTATGGCTC FIG. 5C (FOLHA 33 de 39) 34/39 7697.CXL -* GCTATAAAAA TCTTGATGAG GTATGGAGCT AAACCTGTAG TTACTGAATG CACAACTTCT CGATATTTTT AGAACTACTC CATACCTCGA TTTGGACATC AATGACTTAC GTGTTGAAGA TGTCTGCATG ÃTGCGGTGTT GAGAGACGAC TACAAAATAG TGAAAGATCT GTTGAAGAAT ACAGACGTÃC TACGCCACAA CTCTCTGCTG ATGTTTTATC ACTTTCTA.GA CAACTTCTTA AACTATGTAA ACAATGTTCT TTACÃGCGGA GGCTTTACTC CTTTGTGTTT GGCAGCTTAC TTGATACATT TGTTACAAGA ÃATGTCGCCT CCJAAATGAG GAAACACAAA CCGTCGAATG CTTAACAAAG TTAATTTGGT TAAACTTCTA TTGGCTCATT CGGCGGATGT AGATATTTCA GAATTGTTTC AATTAAACCA ATTTGAAGAT AACCGAGTAA GCCGCCTACA TCTATÂAAGT AACACGGATC GGTTAACTCC TCTACATATA GCCGTATCAA ATAAAAATTT AACAATGGTT TTGTGCCTAG CCAATTGAGG AGATGTATAT CGGCATAGTT TATTTTTAAA TTGTTACCAA <- 7925.DC AAACTTCTAT TGAACAAAGG TGCTGA.TACT GACTTGCTGG ATAA.CATGGG ACGTACTCCT TTTGAAGATA ACTTGTTTCC ACGACTATGA CTGAACGACC. TATTGTACCC TGCATGAGGA TTAATGATCG CTGTACAATC TGGAAATATT GAAATATGTA GCACACTACT TAAAAAAAAT AATTACTAGC GACATGTTAG ACCTTTATAA CTTTÃTACAT CGTGTGATGA ATTTTTTTTA AAAATGTCCh GAACTGGGAA AAATTGATCT TGCCAGCTGT AATTCATGGT AGAAAAGAAG TTTTACAGGT CTTGACCCTT TTTAACTAGA ACGGTCGACA TTAAGTACCA TCTTTTCTTC TGCTCAGGCT ACTTTTCAAC ÃAAGGAGCAG ATGTAAACTA CATCTTTGAA AGAAATGGAA ACGAGTCCGA TGAAAAGTTG TTTCCTCGTC TACATTTGAT GTAGAAACTT TCTTTACCTT 7792.SL AATCATATAC TGTTTTGGAA TTGATTAAAG AAAGTTACTC TGAGACACAA AAGAGGTAGC TTAGTATATG ACAAAACCTT AACTAATTTC TTTCAATGAG ACTCTGTGTT TTCTCCATCG TGAAGTGGTA CTCTCAAAGG TACGTGACTA ATTAGCTATA AAAAGGATCC GGGTTAATTA ACTTCACCAT GAGAGTTTCC ATGCACTGAT TAATCGATAT TTTTCCTAGG CCCAATTAAT => H6p ATTAGTCATC AGGCAGGGCG AGAACGAGAC TATCTGCTCG TTAATTAATT AGAGCTTCTT TAATCAGTAG TCCGTCCCGC TCTTGCTCTG ATAGACGAGC AATTAATTAA TCTCGAAGAA TATTCTATAC TTAAAAAGTG AAAATAAATA CAAAGGTTCT TGAGGGTTGT GTTAAATTGA ATAAGATATG AATTTTTCAC TTTTATTTAT GTTTCCAAGA ACTCCCAACA CAATTTAACT Nipah F => Met AAGCGAGAAA TAATCATAAA TTATTTCATT ATCGCGATAT CCGTTAAGTT TGTATCGTAA TTCGCTCTTT ATTAGTATTT AATAAAGTAA TAGCGCTATA GGCAATTCAA ACATAGCATT ..ValValIle LeuAspLys ArgCysTyrCya AsnLeuLeu IleLeuIle LeuMetlleSer TGGTAGTTAT ACTTGACAAG AGATGTTATT GTAATCTTTT AATATTGATT TTGATGATCT ACCATCAATA TGAACTGTTC TCTACAATAA CATTAGAAAA TTATAACTAA AACTACTAGA FIG.5C (FOLHA 34 de 39) 35/39 ..GluCysSer ValGlylle LeuHisTyrGlu LysLeuSer LysIleGly LeuValLysGly· 1861 CGGAGTGTAG TGTTGGGATT CTACATTATG AGAAATTGAG TAAAATTGGA CTTGTCAAAG GCCTCACATC ACAACCCTAA GATGTAATAC TCTTTAACTC ATTTTAACCT GAACAGTTTC «- 11468.SL ..ValThrArg LysTyrLys IleLysSerAsn ProLeuThr LysAspIle VallleLysMet · 1921 GAGTAACAAG AAAATACAAG ATTAAAAGCA ATCCTCTCAC AAAAGACATT GTTATAAAAA CTCATTGTTC TTTTATGTTC TAATTTTCGT TAGGAGAGTG TTTTCTGTAA CAATATTTTT ..IleProAsn ValSerAsn MetSerGlnCys ThrGlySer ValMetGlu AsnTyrLysThr· 1981 TGATTCCGAA TGTGTCGAAC ATGTCTCAGT GCACAGGGAG TGTCATGGAA AATTATAAAA ACTAAGGCTT ACACAGCTTG TACAGAGTCA CGTGTCCCTC ACAGTACCTT TTAATATTTT ..ArgLeuAsn GlylleLeu ThrProIleLys GlyAlaLeu GluIleTyr LysAsnAsnThr· 2041 CACGATTAAA CGGTATCTTA ACACCTATAA AGGGAGCGTT AGAGATCTAC AAAAACAACA GTGCTAATTT GCCATAGAAT TGTGGATATT TCCCTCGCAA TCTCTAGATG TTTTTGTTGT ..HisAspLeu ValGlyAsp ValArgLeuAla GlyValIle MetAlaGly ValAlalleGly· 2101 CTCATGACCT TGTCGGTGAT GTGAGATTAG CCGGAGTTAT AATGGCAGGA GTTGCTATTG GAGTACTGGA ACAGCCACTA CACTCTAATC GGCCTCAATA TTACCGTCCT CAACGATAAC 11460.SL -*· ..IleAlaThr AlaAlaGln IleThrAlaGly ValAlaLeu TyrGluAla MetLysAsnAla· 2161 GGATTGCAAC CGCAGCTCAA ATCACTGCAG GTGTAGCACT ATATGAGGCA ATGAAGAATG CCTAACGTTG GCGTCGAGTT TAGTGACGTC CACATCGTGA TATACTCCGT TACTTCTTAC ..AspAsnlle AsnLysLeu LysSerSerlle GluSerThr AsnGluAla ValValLysLeu· 2221 CTGACAACAT CAACAAACTC AAAAGCAGCA TTGAATCAAC TAATGAAGCT GTCGTTAAAC GACTGTTGTA GTTGTTTGAG TTTTCGTCGT AACTTAGTTG ATTACTTCGA CAGCAATTTG <- 11465.SL ..GlnGluThr AlaGluLys ThrValTyrVal LeuThrAla LeuGlnAsp TyrlleAsnThr· 2281 TTCAAGAGAC TGCAGAAAAG ACAGTCTATG TGCTGACTGC TCTACAGGAT TACATTAATA AAGTTCTCTG ACGTCTTTTC TGTCAGATAC ACGACTGACG AGATGTCCTA ATGTAATTAT .-AsnLeuVal ProThrlle AspLysIleSer CysLysGln ThrGluLeu SerLeuAspLeu· 2341 CTAATTTAGT ACCGACAATT GACAAGATAA GCTGCAAACA GACAGAACTC TCACTAGATC GATTAAATCA TGGCTGTTAA CTGTTCTATT CGACGTTTGT CTGTCTTGAG AGTGATCTAG 11456.SL -> Apal ..AlaLeuSer LysTyrLeu SerAspLeuLeu PheValPhe GlyProAsn LeuGlnAspPro· 2401 TGGCATTATC AAAGTACCTC TCTGATTTGC TATTCGTATT T|GGGCCC|AAC CTTCAAGACC ACCGTAATAG TTTCATGGAG AGACTAAACG ATAAGCATAA ACCCGGGTTG GAAGTTCTGG 4- 11457.SL ..ValSerAsn SerMetThr IleGlnAlalle SerGlnAla PheGlyGly AsnTyrGluThr· 2461 CAGTTTCTAA TTCAATGACT ATACAGGCTA TATCTCAGGC ATTCGGTGGA AATTATGAAA GTCAAAGATT AAGTTACTGA TATGTCCGAT ATAGAGTCCG TAAGCCACCT TTAATACTTT ..LeuLeuArg ThrLeuGly TyrAlaThrGlu AspPheAsp AspLeuLeu GluSerAspSer· 2521 CACTGCTAAG AACATTGGGT TACGCTACAG AAGACTTTGA TGATCTTCTA GAAAGTGACA GTGACGATTC TTGTAACCCA ATGCGATGTC TTCTGAAACT ACTAGAAGAT CTTTCACTGT FIG. 5C (FOLHA 35 de 39) 36/39 11461.SL -> ..IleThrGly Glnllelle TyrValAspLeu SerSerTyr Tyrllelle ValArgValTyr· GCATAACAGG TCAAATCATC TATGTTGATC TAAGTAGCTA CTATATAATT GTCAGGGTTT CGTATTGTCC AGTTTAGTAG ATACAACTAG ATTCATCGAT GATATATTAA CAGTCCCAAA ..PheProIle LeuThrGlu IleGlnGlnAla TyrlleGln GluLeuLeu ProValSerPhe· ATTTTCCTAT TCTGACTGAA ATTCAACAGG CCTATATCCA AGAGTTGTTA CCAGTGAGCT TAAAAGGATA AGACTGACTT TAAGTTGTCC GGATATAGGT TCTCAACAAT GGTCACTCGA *- 11464.SL ..AsnAsnAsp AsnSerGlu TrpIleSerlle ValProAsn PhelleLeu ValArgAsnThr TCAACAATGA TAATTCAGAA TGGATCAGTA TTGTCCCAAA TTTCATATTG GTAAGGAATA AGTTGTTACT ATTAAGTCTT ACCTAGTCAT AACAGGGTTT AAAGTATAAC CATTCCTTAT ..LeuIleSer AsnlleGlu IleGlyPheCys LeuIleThr LysArgSer VallleCysAsn· CATTAATATC AAATATAGAG ATTGGATTTT GCCTAATTAC AAAGAGGAGC GTGATCTGCA GTAATTATAG TTTATATCTC TAACCTAAAA CGGATTAATG TTTCTCCTCG CACTAGACGT ..GlnAspTyr AlaThrPro MetThrAsnAsn MetArgGlu CysLeuThr GlySerThrGlu· ACCAAGATTA TGCCACACCT ATGACCAACA ACATGAGAGA ATGTTTAACG GGATCGACTG TGGTTCTAAT ACGGTGTGGA TACTGGTTGT TGTACTCTCT TACAAATTGC CCTAGCTGAC ..LysCysPro ArgGluLeu ValValSerSer HisValPro ArgPheAla LeuSerAsnGly AGAAGTGTCC TCGAGAGCTG GTTGTTTCAT CACATGTTCC CAGATTTGCA CTATCTAACG TCTTCACAGG AGCTCTCGAC CAACAAAGTA GTGTACAAGG GTCTAAACGT GATAGATTGC ..ValLeuPhe AlaAsnCys GGGTTCTGTT TGCCAATTGC CCCAAGACAA ACGGTTAACG IleSerValThr CysGlnCys GlnThrThr GlyArgAlalle-ATAAGTGTTA CATGTCAGTG TCAAACAACA GGCAGGGCAA TATTCACAAT GTACAGTCAC AGTTTGTTGT CCGTCCCGTT 11462.SL -► ..SerGlnSer GlyGluGln ThrLeuLeuMet IleAspAsn ThrThrCys ProThrAlaVal· TCTCACAATC AGGAGAACAA ACTCTGCTGA TGATTGACAA CACCACCTGT CCTACAGCCG AGAGTGTTAG TCCTCTTGTT TGAGACGACT ACTAACTGTT GTGGTGGACA GGATGTCGGC <- 11463.SL ..LeuGlyAsn Valllelle SerLeuGlyLys TyrLeuGly SerValAsn TyrAsnSerGlu· TACTCGGTAA TGTGATTATC AGCTTAGGGA AATATCTGGG GTCAGTAAAT TATAATTCTG ATGAGCCATT ACACTAATAG TCGAATCCCT TTATAGACCC CAGTCATTTA ATATTAAGAC ..GlylleAla IleGlyPro ProValPheThr AspLysVal AspIleSer SerGlnlleSer· AAGGCATTGC TATCGGTCCT CCAGTCTTTA CAGATAAAGT TGATATATCA AGTCAGATAT TTCCGTAACG ATAGCCAGGA GGTCAGAAAT GTCTATTTCA ACTATATAGT TCAGTCTATA ..SerMetAsn GlnSerLeu GlnGlnSerLys AspTyrlle LysGluAla GlnArgLeuLeu· CCAGCATGAA TCAGTCCTTA CAACAGTCTA AGGACTATAT CAAAGAGGCT CAACGACTCC GGTCGTACTT AGTCAGGAAT GTTGTCAGAT TCCTGATATA GTTTCTCCGA GTTGCTGAGG ..AspThrVal AsnProSer LeuIleSerMet LeuSerMet IlelleLeu TyrValLeuSer· TTGATACTGT TAATCCATCA TTAATAAGCA TGTTGTCTAT GATCATACTG TATGTATTAT AACTATGACA ATTAGGTAGT AATTATTCGT ACAACAGATA CTAGTATGAC ATACATAATA FIG. 5C (FOLHA 36 de 39) 37/39 ..IleAlaSer LeuCysIle GlyLeuIleThr PhelleSer Phellelle ValGluLysLys CGATCGCATC GTTGTGTATA GGGTTGATTA CATTTATCAG TTTTATCATT GTTGAGAAAA GCTAGCGTAG CAACACATAT CCCAACTAAT GTAAATAGTC AAAATAGTAA CAACTCTTTT ..ArgAsnThr TyrSerArg LeuGluAspArg ArgValArg ProThrSer SerGlyAspLeu AGAGAAACAC CTACAGCAGA TTAGAGGATA GGAGAGTCAG ACCTACAAGC AGTGGGGATC TCTCTTTGTG GATGTCGTCT AATCTCCTAT CCTCTCAGXC TGGATGTTCG TCACCCCTAG =? C5L ..TyrTyrlle GlyThr (SEQ ID NO: 26) TCTACTACAT TGGGACATAG CCCGGGTTTT TATGACTAGT TAATCACGGC CGCTTATAAA AGATGATGTA ACCCTGTATC GGGCCCAAAA ATACTGATCA ATTAGTGCCG GCGAATATTT 7928.DC GATCTAAAAT GCATAATTTC TAAATAATGA ÃAAAAAGTAC ATCATGAGCA ACGCGTTAGT CTAGATTTTA CGTATTAAAG ATTTATTACT TTTTTTCATG TAGTACTCGT TGCGCAATCA ATATTTTACA ATGGAGATTA ACGCTCTATA CCGTTCTATG TTTATTGATT CAGATGATGT TATAAAATGT TACCTCTAAT TGCGAGATAT GGCAAGATAC AAATAACTAA GTCTACTACA <- 7793.SL TTTAGAAAAG AAAGTTATTG ÃATATGAAAA CTTTAATGAA GATGAAGATG ACGACGATGA AAATCTTTTC TTTCAATAAC TTATACTTTT GAÃÀTTACTT CTACTTCTAC TGCTGCTACT TTATTGTTGT AAATCTGTTT TAGATGAAGA agatgacgcg ctaaagtata ctatggttac AATAACAACA TTTAGACAAA ATCTACTTCT TCTACTGCGC GATTTCATAT GATACCAATG AAAGTATAAG TCTATACTAC TAATGGCGAC TTGTGCAAGA AGGTATAGTA TAGTGAAAAT TTTCATATTC AGATATGATG ATTACCGCTG AACACGTTCT TCCATATCAT ATCACTTTTA GTTGTTAGAT TATGATTATG AAAAACCAAA TAAATCAGAT CCATATCTAA AGGTATCTCC CAACAATCTA ATACTAATAC TTTTTGGTTT ATTTAGTCTA GGTATAGATT TCCATAGAGG TTTGCACATA ATTTCATCTA TTCCTAGTTT AGAATACCTG CAGCCAAGCT TGGCACTGGC AAACGTGTAT TAAAGTAGAT AAGGATCAAA TCTTATGGAC GTCGGTTCGA ACCGTGACCG CGTCGTTTTA C (SEQ ID N2: 27) GCAGCAAAAT G (SEQ ID N2: 28) <- M13F FIG. 5C (FOLHA 37 de 39) 38/39 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

FIG. 6 (FOLHA 38 de 39) 39/39

FIG. 7A

FIG. 7B (FOLHA 39 de 39)