ES2348226T3 - Inducción de respuesta inmunitaria contra el virus de la inmunodeficiencia felina. - Google Patents
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Abstract
Kit para la inducción de una respuesta inmunitaria dirigida contra VIF en un gato, que comprende, acondicionadas por separado: farmacéuticamente aceptable, uno o varios plásmido(s) que expresan in vivo env y gag/pro de VIF, - una segunda composición inmunógena que comprende, en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, uno o varios vector(es) vírico(s) atenuado(s) que expresan in vivo env y gag/pro de VIF, en la que el o los vector(es) vírico(s) atenuado(s) son uno o varios virus de la viruela del canario atenuado(s) o uno o varios virus de la viruela aviar atenuado(s);
Description
[001] La presente invención tiene por objeto la inmunización por inducción de una respuesta inmunitaria contra el virus de la inmunodeficiencia felina. Tiene igualmente por objeto kits de inmunización.
[002] El virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) es un retrovirus de ARN monocatenario de polaridad positiva que pertenece a la familia de los lentivirus.
[003] Muy extendido en todo el planeta, el VIF afecta principalmente a los felinos, en particular los gatos.
[004] La enfermedad se caracteriza por un deterioro y supresión del sistema inmunitario, lo que permite el desarrollo de enfermedades oportunistas y que pueden producir la muerte.
[005] La molécula de ARN del VIF está compuesta por varios marcos de lectura abiertos (MLA) que codifican las proteínas estructurales, concretamente env y gag, las enzimas víricas, concretamente pol y pro, los transactivadores, concretamente tat y rev. El MLA rev está compuesto por dos exones.
[006] Se han propuesto vacunas inactivadas, pero para que sean protectoras requieren cantidades muy elevadas de antígenos, lo que representa problemas de industrialización.
[007] Se han intentado otros enfoques basados en vacunas, en particular el uso de la proteína de la envoltura en forma de subunidad o expresada mediante un vector de expresión recombinante. Estos trabajos no han conseguido resultados satisfactorios. Tampoco han puesto en evidencia fenómenos de facilitación que pudieran traducirse por una viremia más precoz entre los animales vacunados que entre los animales placebos.
[008] El artículo de Cuisinier (Cuisinier A. M. y col., Vaccine, 1997, 15(10), 1085-1094) recuerda que tras los ensayos de vacunación mediante virus inactivados se encontró que la glicoproteína superficial gp120 sería determinante para la protección. Recuerda igualmente que varios ensayos de vacunación que usaron la proteína env recombinada no permitieron inducir una protección. Los autores describen experiencias de vacunación de gatos mediante administración intramuscular de ADN que codificaba gp120 y p10 (nucleocápsida) del VIF. La administración de ADN que codificaba gp120 de VIF sólo indujo una protección parcial. En el caso de combinar gp120 y p10 no se observó protección.
[009] Por su parte, el artículo de Richardson (Richardson J. y col., J. Virol.,
1997, 71(12), 9640-9649) informa de la administración de plásmidos que codificaban env de [0010] VIF un fenómeno de facilitación. Este fenómeno también ha sido observado en la vacunación mediante proteínas recombinadas del VIF (Lutz H. y col., AIDS Research and Human Retroviruses, 1996, 12(5), 431-433) y de virus vaccinia que expresaba env de VIF (Osterhaus A. D. M. E. y col., AIDS Research and Human Retroviruses, 1996, 12(5), 437-441). [0011] El documento WO-A-98/21354 describe un protocolo de vacunación contra VIF en el que se administra previamente un virus de la viruela del canario vector recombinado teniendo como inserción env y gag/pro de VIF, y a continuación el producto VIF inactivado en linfocitos T. [0012] En Cuisinier A. M. y col., Vaccine, 1999, 17, 415-425, la administración de ADN que expresaba gp120 sigue siendo el origen de los fenómenos de facilitación. [0013] La solicitud de patente WO-A-9530019 describe un protocolo de vacunación contra el VIF que utiliza la expresión de varias proteínas de VIF mediante vectores de tipo virus del herpes felino o baculovirus en una estrategia primera de administración / refuerzo. [0014] La solicitud de patente EP-A-1074625 describe un protocolo de vacunación polinucleotídica de los gatos contra el VIF. La estrategia utiliza tanto en la primera administración como en la de refuerzo, plásmidos que expresaban concretamente proteínas env y gag-pro de VIF en administración intramuscular a gatos con un intervalo de 4 semanas. [0015] El artículo de I. RAMSHAW Y COL., "The prime-boost strategy: exciting prospects for improved vaccination" IMMUNOLOGY TODAY, vol. 21, nº 4, 2000, páginas 163-165, realiza una revisión de los ensayos con estrategias de inmunización mediante primera administración con un ADN que codificaba las proteínas víricas y refuerzos con vectores del virus de la viruela en caso de infección lentivírica. Rawshaw y col. Destacan que los resultados varían, pero que la secuencia de ADN en primera administración / vector del virus de la viruela en refuerzo, así como la elección del vector del virus de la viruela resultan cruciales para obtener una buena respuesta inmunitaria. [0016] De este modo, se han estudiado diferentes enfoques de vacunación, es decir, vacunas inactivadas, vacunas de subunidades, y vacunas recombinantes (vectores víricos y ADN). No existe en la actualidad una solución satisfactoria, ni una orientación clara para la investigación.
[0017] Tras un importante esfuerzo de investigación, el solicitante ha podido poner a punto una técnica de inducción de una respuesta inmunitaria en gatos contra el VIF que utiliza composiciones inmunogénicas recombinantes tipo vector vírico y ADN (plásmido). De forma notable, la técnica puesta a punto permite utilizar la expresión de env sin generar problemas de facilitación. [0018] Así, la invención queda definida por las reivindicaciones, y tiene como primer objeto un procedimiento de inducción de una respuesta inmunitaria en gatos contra el VIF mediante un protocolo de administración que comprende al menos una primera administración y al menos una administración de refuerzo que utilice al menos los inmunógenos conocidos gag/pro y env. Las composiciones inmunógenas utilizadas en la primera administración son de naturaleza distinta a las de las utilizadas en refuerzo. Este protocolo de administración se denomina "prime-boost". El protocolo prime-boost según la invención comprende una primera administración intramuscular con una composición inmunógena que comprende, en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, un plásmido que contiene y que expresa in vivo un polinucleótido que codifica env y gag/pro de VIF, seguida por un refuerzo con un intervalo de 3 a 6 semanas con una composición inmunógena que comprende, en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, un vector vírico atenuado que contiene y que expresa in vivo un polinucleótido que codifica env y gag/pro de VIF, siendo el vector vírico un virus de la viruela del canario o de la viruela aviar atenuado. [0019] La primera administración puede comprender una o varias administraciones de las mismas composiciones inmunógenas basadas en plásmidos. Igualmente, la administración de refuerzo puede comprender una o varias administraciones de las mismas composiciones inmunógenas basadas en vectores del virus de la viruela aviar atenuados. Según una realización particular de la invención, el protocolo comprende dos administraciones sucesivas de una misma composición inmunógena basada en plásmidos, seguida por una administración de una composición inmunógena basada en vectores del virus de la viruela aviar atenuados como refuerzo. [0020] Las distintas administraciones se realizan en intervalos de 3 a 6 semanas y más concretamente de aproximadamente 4 semanas. Según una realización preferida, se prevé además un refuerzo anual, preferentemente mediante la composición inmunógena basada en vectores víricos. Preferentemente los animales tienen al menos de 6 a 8 semanas en el momento de la primera administración. [0021] Los plásmidos y les vectores víricos utilizados en el protocolo prime/boost expresan a la vez env y gag/pro.
[0022] En la invención, el término proteína engloba los fragmentos, incluyendo péptidos y polipéptidos que tengan sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína completa. La expresiones gen env, gen gag, gen gag/pro, etc. Incluyen por tanto los fragmentos polinucleotídicos que codifican estos fragmentos de proteína, péptidos y polipéptidos. [0023] Para controlar su expresión, los polinucleótidos están funcionalmente asociados a un promotor, y eventualmente, a secuencias potenciadoras (en inglés «enhancer»), a secuencias estabilizadoras y/o a secuencias señal que permitan la secreción de la proteína. [0024] Otras proteínas de VIF se pueden expresar junto a env y gag/pro, en primera administración y/o en refuerzo. Se puede expresar concretamente la proteína tat y/o la proteína rev, preferentemente tat y opcionalmente rev. Pueden expresarse en los mismos plásmidos y/o vectores víricos que los utilizados para env y gag/pro o en los plásmidos y/o vectores víricos apropiados. [0025] Según una realización particular, varias cepas de VIF están representadas en las composiciones de la invención, es decir, que el protocolo comprende la administración de plásmidos y de vectores víricos que contienen y expresan in vivo polinucleótidos que codifican env y gag/pro procedentes de dos, tres o más, cepas de VIF. Así, polinucleótidos procedentes de varias cepas de VIF pueden estar contenidos en un vector vírico único o por vectores víricos apropiados. Para plásmidos, se prefieren plásmidos apropiados, pero no se excluye por tanto que un plásmido único contenga polinucleótidos procedentes de varias cepas de VIF. [0026] Según otra realización, y como se describirá con más detalle más adelante, el protocolo puede comprender la administración concomitante de una o varias citocinas, bien en forma proteica, bien mediante la incorporación de un polinucleótido que codifica une citocina en los plásmidos y/o vectores víricos, las utilizadas para expresar las proteínas VIF y/u otras. [0027] Para preparar los vectores de expresión según la invención la persona experta tiene a su disposición diferentes cepas de VIF, la organización de sus genomas y la secuencia de nucleótidos de sus genomas. Las cepas de VIF útiles, como la cepa Petaluma, se han citado en la sección de Ejemplos. En la introducción de la sección de Ejemplos se proporcionan informaciones complementarias sobre estas cepas, así como de otras, sus secuencias de nucleótidos. [0028] Según la invención, la primera administración comprende el uso de plásmidos que expresan in vivo las proteínas env y gag de VIF. El término plásmido se refiere a una unidad de transcripción de ADN que comprende un polinucleótido según la invención y los elementos necesarios para su expresión in vivo. Se prefiera la forma de plásmido circular, superenrollado o no. La forma lineal queda igualmente incluida en el marco de esta invención. [0029] Cada plásmido comprende un promotor apto para asegurar, en las células hospedadoras, la expresión del polinucleótido insertado bajo su dependencia. Se trata en general de un promotor eucariota fuerte. El promotor eucariota fuerte preferido es el promotor precoz del citomegalovirus (CMV-IE), de origen humano o murino, o incluso eventualmente de otro origen como de rata o cobaya. El promotor CMV-IE puede comprender la parte de promotor propiamente dicha, asociada o no a la parte potenciadora (enhancer). Se puede hacer referencia a los documentos EP-A-260.148, EP-A-323.597, US-A-5.168.062, US-A-5.385.839, US-A-4.968.615, WO-A-87/03905. Se prefiere el CMV-IE humano (Boshart M. y col., Cell., 1985, 41, 521-530) o murino. [0030] De forma más general, el promotor es bien de origen vírico o de origen celular. Como promotor vírico fuerte distinto de CMV-IE, se puede citar el promotor precoz o el promotor tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del Sarcoma de Rous. Como promotor celular fuerte, se puede citar el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como por ejemplo el promotor de la y col., Vaccine, 2000, 18(22), 2337-2344), o incluso el promotor de la actinia (Miyazaki J. y col., Gene, 1989, 79(2), 269-277). [0031] Por equivalencia, los subfragmentos de estos promotores que conservan una actividad promotora adecuada quedan comprendidos en la presente invención: por ejemplo, los promotores CMV-IE truncados según el documento WO-A-98/00166. El concepto de promotor según la invención incluye por tanto los derivados y subfragmentos que conservan una actividad promotora adecuada, preferentemente sustancialmente similar a la del propio promotor del que se han obtenido. Para el CMV-IE, esta noción comprende la parte del promotor propiamente dicho y/o la parte potenciadora y los derivados y subfragmentos. [0032] Preferentemente, los plásmidos comprenden otros elementos de control de la expresión. En particular, es ventajoso incorporar secuencias estabilizadoras del tipo intrón, preferentemente el intrón Il del gen de la B-globina de conejo (van Ooyen y col. Science, 1979, 206:337-344). [0033] Como señal de poliadenilación (poliA) para los plásmidos, se puede utilizar concretamente la del gen de la hormona de crecimiento bovina (bGH) (Documento US-A-5.122.458), la del gen de la β-globina de conejo o la del virus SV40. [0034] Según la invención, la administración de refuerzo comprende la utilización de vectores víricos que expresan in vivo la o las proteínas de VIF. Estos vectores de expresión víricos son virus de la viruela del canario o de la viruela aviar. [0035] Para la viruela aviar, la persona experta puede consultar los documentos US-A-5.174 US-5.766.599; para el virus de la viruela del canario el documento US-A
5.756.103. [0036] Según una de las realizaciones preferidas de la invención, el vector de expresión del virus de la viruela es un virus de la viruela del canario, atenuado, por ejemplo un ALVAC o un virus de la viruela del canario (por ejemplo de la cepa Rentschler) que ha sido atenuado, concretamente por más de 200 pasos por células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF). Un virus de la viruela del canario de cepa ALVAC fue depositado el 14 de noviembre 1996 en la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso VR-2547. Un virus de la viruela del canario está comercialmente disponible desde la ATCC con el número de acceso VR
111. Virus de la viruela del canario atenuados se han descrito en los documentos USA-5.756.103 y WO-A-01/05934. [0037] Se pueden utilizar virus de la viruela aviar atenuados (por ejemplo TROVAC). Respecto al virus de la viruela TROVAC, la persona experta puede consultar la patente WO-A-96/40241. Se tiene acceso a numerosas cepas para vacuna del virus de la viruela aviar, por ejemplo, la vacuna DIFTOSEC CT® comercializada por MERIAL y la vacuna NOBILIS® VARIOLE comercializada por Intervet. [0038] Si se trata de un virus de la viruela del canario, los sitios de inserción están concretamente situados en, o constituidos por, los MLA C3, C5 y C6. Si se trata de un virus de la viruela aviar, los sitios de inserción están concretamente situados en, o constituidos por, los MLA F7 y F8. [0039] Preferentemente, si el vector de expresión es un virus de la viruela, el polinucleótido a expresar se inserta bajo el control de un promotor específico de los virus de la viruela, concretamente el promotor vaccinia de 7,5 kDa (Cochran y col., J. Virology, 1985, 54, 30-35), el promotor vaccinia I3L (Riviere y col., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434), el promotor vaccinia HA (Shida, Virology, 1986, 150, 451457), le promotor de la viruela bobina ATI (Funahashi y col., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47), o incluso el promotor vaccinia H6 (Taylor J. y a/. Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. y col. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. y col. J. Virol., 1989, 63, 3829-3836).
[0040] La invención tiene igualmente por objeto la utilización por una parte de plásmidos que contienen y expresan in vivo el o los polinucleótido(s) que codifican env y gag/pro de VIF, para la producción de una primera preparación inmunógena que comprende el o los plásmido(s) y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, para una primera administración a un gato, y por otra parte uno o varios vector(es) vírico(s) atenuado(s) que expresan in vivo env y gag/pro de VIF, para la producción de una segunda composición inmunógena que comprende el o los vector(es) vírico(s) atenuado(s) y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, para una administración en refuerzo a intervalos de 3 a 6 semanas al mismo gato, en la que la administración de la primera y la segunda composición inmunógena se realiza por vía intramuscular, y el o los vector(es) vírico(s) atenuado(s) son uno o varios virus de la viruela del canario atenuado(s) o uno o varios virus de la viruela aviar atenuado(s). [0041] La invención tiene igualmente por objeto la utilización de uno o varios plásmido(s) que expresan in vivo env y gag/pro de VIF, en la producción de una composición inmunógena que comprende el o los plásmido(s) y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para la inducción de una respuesta inmunitaria dirigida contra VIF en un gato, destinada a ser administrada por vía intramuscular al gato en primera administración, realizándose el refuerzo tras 3 a 6 semanas mediante una composición inmunógena que comprende uno o varios vector(es) vírico(s) atenuado(s) que expresan in vivo env y gag/pro de VIF y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, en la que el o los vector(es) vírico(s) atenuado(s) son uno o varios virus de la viruela del canario atenuado(s) o uno o varios virus de la viruela aviar atenuado(s). [0042] [0042] La invención tiene igualmente por objeto la utilización de uno o varios vector(es) vírico(s) atenuado(s)que expresan in vivo env y gag/pro de VIF, para la producción de una composición inmunógena que comprende el o los vector(es) vírico(s) atenuado(s) y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, para la inducción de una respuesta inmunitaria dirigida contra VIF en un gato, destinado a ser administrado por vía intramuscular al gato en refuerzo a un intervalo de 3 a 6 semanas de una composición inmunógena que comprende uno o varios plásmido(s) que expresan in vivo env y gag/pro de VIF y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, en la que el o los vector(es) vírico(s) atenuado(s) son uno o varios virus de la viruela del canario atenuado(s) o un virus de la viruela aviar atenuado(s).
[0043] La presente invención tiene adicionalmente por objeto un kit para la inducción de una respuesta inmunitaria dirigida contra VIF en un gato, concretamente destinado a utilizarse según el protocolo de administración según la invención, que comprende, acondicionadas por separado:
⎯ una primera composición inmunógena que comprende, en un vehículo o
excipiente farmacéuticamente aceptable, uno o varios plásmido(s) que expresan
in vivo env y gag/pro de VIF,
⎯ una segunda composición inmunógena que comprende, en un vehículo o
excipiente farmacéuticamente aceptable, uno o varios vector(es) vírico(s)
atenuado(s) que expresan in vivo env y gag/pro de VIF, en la que el o los
vector(es) vírico(s) atenuado(s) son uno o varios virus de la viruela del canario
atenuado(s) o uno o varios virus de la viruela aviar atenuado(s). [0044] Es evidente que el conjunto de propiedades descritas en esta solicitud, en lo que se refiere por ejemplo a la composición de los plásmidos y vectores víricos, la composición de las preparaciones, las asociaciones de polinucleótidos de VIF, el protocolo de administración se aplican en las mismas condiciones a los diferentes objetos de la invención. [0045] El concepto de composición inmunógena abarca cualquier composición susceptible, una vez administrada a la especia diana en las condiciones de la invención, de inducir une respuesta inmunitaria dirigida contra VIF. La especie diana es el gato. [0046] Los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos de la persona experta. Como ejemplo, puede tratarse de disolución salina de NaCl al 0,9% o bien de tampón fosfato. Los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen igualmente cualquier compuesto o combinación de compuestos que permitan conseguir la administración del vector, concretamente la transfección, y/o la mejora de la conservación. [0047] Las composiciones inmunógenas según la invención comprenden preferentemente uno o varios adyuvantes, elegidos concretamente entre los adyuvantes usuales. Son particularmente adecuados en el marco de la presente invención: (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, polímeros de anhídrido maleico y derivados de alquenilo, (2) secuencias immunopotenciadoras (ISS), concretamente secuencias de oligodesoxirribonucleótidos que tienen uno o varios motivos CpG no metilados (Klinman D. M. y col., Prcc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 2879-2883 ; documento WO-A1-98/16247), (3) una emulsión de aceite-en-agua, en particular la emulsión SPT descrita en la página 147 de «Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach» editado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 de la misma publicación, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, (5) citocinas, o (6) sus combinaciones o mezclas. [0048] La emulsión de aceite-en-agua (3), que está particularmente adaptada a los vectores víricos, puede estar compuesta concretamente por:
-Aceite de parafina líquida ligera (tipo farmacopea europea) ;
-aceite isoprenoide como escualano o escualeno ;
-aceite resultante de la oligomerización de alquenos, en particular de
isobuteno o deceno; -ésteres de ácidos o de alcoholes con grupos alquilo lineales; -más particularmente aceites vegetales, oleato de etilo, di(caprilato /
caprato) de propilenglicol, tri(caprilato /caprato) de glicerol, dioleato de propilenglicol; -ésteres de ácidos o de alcoholes grasos ramificados, en particular ésteres
del ácido isoesteárico. [0049] El aceite se utiliza asociado a emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes son preferentemente tensioactivos no iónicos, en particular:
-Los ésteres de una parte de sorbitán, de mannide (por ejemplo oleato de anhidromanitol), de glicerol, de poliglicerol, o de propilenglicol y por otra parte ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico, hidroxiesteárico, estos ésteres pueden estar eventualmente etoxilados,
-los copolímeros en bloque polioxipropileno-polioxietileno, en particular
los Pluronic®, concretamente L121. [0050] Entre los polímeros adyuvantes de tipo (1), se prefieren los polímeros de ácido acrílico o metacrílico reticulados, concretamente reticulados mediante éteres polialquenílicos de azúcares o de polialcoholes. Estos compuestos son bien conocidos con el término carbómero (Pharmeuropa vol. 8, n° 2, junio 1996). La persona experta también puede consultar el documento US-A-2.909.462 que describe dichos polímeros acrílicos reticulados por un compuesto polihidroxilado con al menos 3 grupos hidroxilo, preferentemente no más de 8, siendo sustituidos los átomos de hidrógeno de al menos 3 hidroxilos por radicales alifáticos insaturados que tengan al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son los que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los propios radicales insaturados pueden contener otros sustituyentes, como metilo. Los productos comercializados con la denominación Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, USA) son particularmente adecuados. Concretamente, están reticulados mediante una alilsacarosa o mediante alilpentaeritritol. Entre estos, se pueden citar concretamente Carbopol® 974P, 934P y 971 P. [0051] La concentración del polímero de tipo carbómero en la composición de
5 vacuna final puede estar comprendida concretamente entre 0,01 % y 1,5 % PN, más concretamente entre 0,05 y 1 % P/V, preferentemente de 0,1 a 0,4 % PN. [0052] Los lípidos catiónicos (4) que contienen una sal de amonio cuaternario, que están particular pero no exclusivamente adaptadas a plásmidos, son preferentemente las que responden a la siguiente fórmula:
en la que R1 es un radical alifático lineal, saturado o insaturado, que tiene de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro un radical alifático que contiene 2 ó 3 átomos de
15 carbono, y X un grupo hidroxilo o amina. [0053] Entre estos lípidos catiónicos, se prefiere el DMRIE (N-(2-hidroxietil)N,N-dimetil-2,3-bis(tetraddeciloxi)-1-propanamonio ; documento WO-A-96/34109), preferentemente asociado a un lípido neutro, preferentemente DOPE (dioleoilfosfatidil-etanolamina; Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389),
20 para formar un DMRIE-DOPE. [0054] Preferentemente, la mezcla de plásmido con este adyuvante se realiza de forma extemporánea y se prefiere, antes de su administración, dejar un lapso de tiempo para que la mezcla así constituida se compleje, por ejemplo, durante un periodo comprendido entre 10 y 60 minutos, concretamente aproximadamente 30 minutos.
25 [0055] Si está presente DOPE, la relación molar DMRIE:DOPE está comprendida preferentemente de 95:5 a 5:95, más particularmente 1:1. [0056] La relación ponderal plásmido:adyuvante DMRIE o DMRIE-DOPE puede estar comprendida concretamente de 50:1 a 1:10, en particular de 10:1 a 1:5, y preferentemente de 1:1 a 1:2.
30 [0057] La o las citocinas (5) eventualmente presentes pueden aportarse a la composición en forma de proteína, o expresarse simultáneamente en el hospedador con la o las proteínas del VIF. La preferencia es la expresión simultánea de la o las citocinas, bien mediante el mismo vector que el que expresa las proteínas, bien mediante un vector apropiado. [0058] Las citocinas pueden concretamente seleccionarse entre las citocinas felinas, concretamente las de gato, tales como la interleucina 18 felina (fIL-18) (Taylor
S. y col., DNA Seq., 2000, 10(6), 387-394), fIL-16 (Leutenegger C. M. y col., DNA Seq., 1998, 9(1), 59-63), flL-12 (Fehr D. y col., DNA Seq., 1997, 8(1-2), 77-82 ; Imamura T. y col., J. Vet. Med. Sci., 2000, 62(10), 1079-1087) y GM-CSF felina (factor de estimulación de la formación de colonias granulo-macrofágicas, o en inglés Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor) (GenBank AF053007). [0059] Según la invención, la inducción de una respuesta inmune dirigida contra VIF puede asociarse a vacunaciones contra otros agentes patógenos felinos. Los otros patógenos felinos son concretamente el virus de la rinotraqueítis felina o el virus del herpes felino (VHF), los virus de la leucemia felina (VLFe de tipo A y de tipo B), los parvovirus felinos (VPF), el virus de la peritonitis infecciosa felina (VPIF), el virus de la calcivirosis felina (VCF), el virus de la rabia, Chlamydia. [0060] La administración de las composiciones según la invención se realiza por vía intramuscular, [0061] Las distintas composiciones se pueden inyectar mediante un inyector de chorro líquido sin aguja. [0062] Las composiciones inmunógenas según la invención comprenden una cantidad eficaz de plásmido o de vector vírico, la determinación de estas cantidades está entre las capacidades de la persona experta. El solicitante recomienda:
-en el caso de composiciones inmunógenas a base de plásmido, una dosis puede contener de aproximadamente 1 g a aproximadamente 2000 g, concretamente aproximadamente de 50 g a aproximadamente 1000 g. Los volúmenes de dosis pueden estar comprendidos entre 0,1 y 2 ml, preferentemente entre 0,2 y 1 ml.
- en el caso de composiciones inmunógenas a base de virus de la viruela, una dosis puede contener de aproximadamente 103 ufp y aproximadamente 109 ufp. Si el vector es el virus de la viruela del canario, la dosis está más concretamente comprendida entre aproximadamente 105 ufp y aproximadamente 109 ufp, preferentemente entre aproximadamente 106 y aproximadamente 108 ufp. Los volúmenes de dosis de las composiciones
inmunógenas basada en vectores víricos están compuestas en general por entre
0,1 y 2,0 ml, preferentemente entre 0,2 y 1,0 ml. [0063] El kit puede comprender las dosis de composición inmunógena para inducción de una respuesta inmunitaria bien en un animal, bien en varios animales. [0064] Según una realización particular, el kit comprende dos dosis de composición inmunógena a base de plásmido por una dosis de composición inmunógena a base de vector vírico. [0065] A continuación, la invención se va a describir con más detalle en referencia a realizaciones a modo de ejemplos no limitantes. EJEMPLOS: [0066] Todas las construcciones se realizan mediante técnicas estandarizadas de biología molecular (clonación, digestión mediante enzimas de restricción, síntesis de un ADN complementario monocatenario, amplificación en cadena mediante polimerasa, alargamiento de un oligonucleótido mediante una ADN polimerasa...) descritos por Sambrook J. y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª Edición. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. Nueva York. 1989). Todos los fragmentos de restricción utilizados en la presente invención, así como los diversos fragmentos de amplificación en cadena mediante polimerasa (PCR), fueron aislados y purificados mediante el kit "Geneclean®" (BIO101 Inc. La Jolla, CA). [0067] Los ejemplos emplean la cepa de VIF Villefranche IFFA 1/88 (Steffan A.
M. y col., J. Gen. Virol., 1994, 75, 3647-3653). Es evidente que la invención puede aplicarse a otras cepas de VIF. Por ejemplo, se puede citar la cepa Petaluma (disponible de la American Type Culture Collection (ATCC) con el número VR-1312, y de la secuencia de nucleótidos del GenBank con el número M25381; gen env: nucleótidos 6266 a 8836; gen gag: nucleótidos 628 a 1980; gag/pro: nucleótidos 628 a 2336). También se puede citar la cepa NCSU1 disponible de la ATCC con la referencia VR2333. También se puede hacer referencia a los artículos de Sodora y de Bachmann (Sodora D. L. y col., J. Virol., 1994, 68(4), 2230-2238; Bachmann M. H. y col., J. Vírico., 1997, 71(6), 4241-4253) que describen varias cepas de VIF e indican las referencias de acceso a las secuencias en GenBank. La cepa FIV14 tiene la referencia NC_001482 en Genbank (gen env: nucleótidos 6266-8836; gen gag: nucleótidos 628-1980; gag/pro: nucleótidos 628-2336), la cepa BM3070 se ha referenciado en GenBank como AF474246 (gen env: nucleótidos 6272-8833; gen gag: nucleótidos 634-1986); la cepa OMA se ha referenciado en GenBank como U56928 (gen env: nucleótidos 6506-9097; gen gag: nucleótidos 679-2179), etc.
[0068] La persona experta puede determinar las sondas de PCR para clonar los genes a partir de la cepa VIF en cuestión. Las sondas de PCR utilizadas en los ejemplos siguientes para clonar env, gag/pro, rev y tat de la cepa Villefranche, pueden usarse con otras cepas, como la Petaluma; o adaptarse si ello resulta de utilidad.
EJEMPLO 1: CULTIVO DEL VIRUS VIF [0069] Para su amplificación, se cultivaron virus de la inmunodeficiencia felina de cepa Villefranche IFFA 1/88 en células Q201 (linfocitos T auxiliares de felino; Willet
B. y col., J. Gen. Virol., 1997, 78, 611-618). [0070] Las células Q201 se cultivaron en Falcon 25 cm2 con medio Eagle-MEM suplementado con glutamina 2 mM, suero bovino al 10%, 100 UI/ml de penicilina, 100
g/ml de estreptomicina y 100 UI/ml de interleucina-2 humana recombinante, que contenían aproximadamente 100.000 células por ml. Las células se cultivaron a +37°C. [0071] 3 días después, la capa celular llegó a la confluencia. Entonces, se sustituyó el medio de cultivo y se agregó el virus VIF a razón de 5 ufp/célula. [0072] Cuando se completó el efecto citopatógeno (ECP) (generalmente 48-72 horas tras el inicio del cultivo, se cosecharon las suspensiones víricas, a continuación se clarificaron por centrifugación y se congelaron a -80°C. Se necesitan por lo general de 3 a 4 pasos sucesivos para la producción de de un lote vírico. El lote vírico se almacenó a -80°C.
EJEMPLO 2: EXTRACCIÓN DEL ARN VÍRICO DE VIF [0073] EL ARN vírico contenido en 100 ml de suspensión vírica de la cepa VIF Villefranche se extrajo tras descongelación con las disoluciones del kit «High Pure™ Viral RNA Kit» Nº de cat. 1.858.882, Roche Molecular Biochemicals), según las instrucciones del proveedor para las etapas de extracción. El residuo de ARN obtenido al finalizar la extracción se volvió a suspender en de 1 a 2 ml de agua destilada estéril exenta de RNasa.
EJEMPLO 3: CONSTRUCTION DEL PLÁSMIDO PPB371 [0074] El ADN complementario (ADNc) de VIF se sintetizó mediante el kit “Gene Amp RNA PCR Kit” (Nº de cat. N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) en las condiciones proporcionadas por el proveedor. [0075] Se realizó una reacción de transcripción inversa seguida por una reacción de amplificación en cadena (Reacción “RT-PCR”) con 50 l de la suspensión de ARN vírico de VIF (ejemplo 2) y con los oligonucleótidos siguientes: FC116 (36 mer) (SEC. DE ID. Nº: 1) 5’ TTTTTTCTGCAGCAATAAGAATGGCAGAAGGATTTG 3’ y FC117 (36 mer) (SEC. DE ID. Nº: 2) 5’-TCGCACCTGAAACATCTCGAGTGTTTCCACATGTAT 3’. [0076] Esta pareja de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción Pstl, de un sitio de restricción Xhol y de un codón ATG iniciador en 5’ de la inserción. [0077] La síntesis de la primera hebra de ADNc se realiza por alargamiento del oligonucleótido FC117, tras hibridación de éste último a la matriz de ARN. [0078] Las condiciones de síntesis de la primera hebra de ADNc son una temperatura de 42°C durante 15 min, después de 99°C durante 5 min, y finalmente de 4°C durante 5 min. Las condiciones de la reacción de la PCR en presencia de la pareja de oligonucleótidos FC116 y FC117 son una temperatura de 95°C durante 2 min, después 40 ciclos (95°C durante 30 s, después 50°C durante 45 s, y 72°C durante 3 min), y finalmente 72°C durante 7 min para producir un fragmento de 1476 pb. [0079] Este fragmento se digiere mediante la enzima de restricción Pstl, después mediante la enzima de restricción Xhol para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa el fragmento Pstl-Xhol de aproximadamente 1450 pb. Este fragmento se denomina fragmento A. [0080] Se realizó una segunda reacción de transcripción inversa, seguida por una reacción de amplificación en cadena (Reacción “RTPCR”) con 50 l de la suspensión de ARN vírico de VIF (ejemplo 2) y con los oligonucleótidos siguientes: FC118 (36 mer) (SEC. DE ID. Nº: 3) 5’ ATACATGTGGAAACACTCGAGATGTTTCAGGTGCGA 3’ y FC119 (54 mer) (SEC. DE ID. Nº: 4) 5’TTTTTTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCTGAGATACTTCATCATTCC TCCTC 3’. [0081] Esta pareja de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción Xhol, de un sitio de restricción BamHI y de un codón de detención en 3’ de la inserción. [0082] La síntesis de la primera hebra de ADNc se realiza por alargamiento del oligonucleótido FC118, tras hibridación de éste último a la matriz de ARN. [0083] Las condiciones de síntesis de la primera hebra de ADNc son una temperatura de 42°C durante 15 min, después de 99°C durante 5 min, y finalmente de 4°C durante 5 min. Las condiciones de la reacción de la PCR en presencia de la pareja de oligonucleótidos FC118 y FC119 son una temperatura de 95°C durante 2 min, después 40 ciclos (95°C durante 130 s, después 50°C durante 45 s, y 72°C durante 3 min), y finalmente 72°C durante 7 min para producir un fragmento de 1193 pb. [0084] Este fragmento se digiere mediante la enzima de restricción Xhol después mediante la enzima de restricción BamHI para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa el fragmento XhoI-BamHI de aproximadamente 1170 pb. Este fragmento se denomina fragmento B. [0085] Los fragmentos A y B se enlazaron mediante el plásmido de expresión eucariota pVR1012 (figura 1 y ejemplo 7 del documento WO-A-98/03199; Hartikka J. y col., 1997, Human Gene Therapy, 7, 1205-1217) previamente digerido mediante Xbal y EcoRI, para dar el plásmido pPB371 (7467 pb). Este plásmido contiene, bajo el control del promotor precoz del citomegalovirus humano o hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), una inserción que codifica la proteína env de VIF.
EJEMPLO 4: CONSTRUCCIÓN DEL PLÁSMIDO PPB374 [0086] Se sintetizó el ADN complementario (ADNc) de VIF mediante el kit “Gene Amp RNA PCR Kit” (Nº de cat. N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) en las condiciones proporcionadas por el proveedor. [0087] Se realizó una reacción de transcripción inversa, seguida por una reacción de amplificación en cadena (Reacción “RT-PCR”) con 50 l de la suspensión de ARN vírico de VIF (ejemplo 2) y con los oligonucleótidos siguientes: PB670 (37 mer) (SEC. DE ID. Nº: 5) 5’ TTTGTCGACAAGGTAGGAGAGATTCTACAGCAACATG 3’ y PB674 (40 mer) (SEC. DE ID. Nº: 6) 5’ TTTGCGGCCGCGTTATTGAGCCATTACTAACCTAATATTG 3’. [0088] Esta pareja de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción Sall, de un sitio de restricción Notl, de un codón ATG iniciador en 5’ y de un codón de detención en 3’ de la inserción. [0089] La síntesis de la primera hebra de ADNc se realiza por alargamiento del oligonucleótido PB674, tras hibridación de éste último a la matriz de ARN. [0090] Las condiciones de síntesis de la primera hebra de ADNc son una temperatura de 42°C durante 15 min, después de 99°C durante 5 min, y finalmente de 4°C durante 5 min. Las condiciones de la reacción de la PCR en presencia de la pareja de oligonucleótidos PB670 y PB674 son una temperatura de 95°C durante 2 min, después 40 ciclos (95°C durante 30 s, después 50°C durante 45 s, y 72°C durante 3 min), y finalmente 72°C durante 7 min para producir un fragmento de 1758 pb. [0091] Este fragmento se digiere mediante la enzima de restricción Sall después mediante la enzima de restricción Notl para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa el fragmento Sall-Notl de aproximadamente 1750 pb. Este fragmento se enlazó con el plásmido de expresión pVR1012 (ejemplo 3) previamente digerido mediante Sall y Notl, para dar el plásmido pPB374 (6633 pb). Este plásmido contiene, bajo el control del promotor precoz hCMV-IE una inserción que codificaba las proteínas gag/pro de VIF.
EJEMPLO 5: CONSTRUCCIÓN DEL PLÁSMIDO PPB375 [0092] El ADN complementario (ADNc) de VIF se sintetizó mediante el kit “Gene Amp RNA PCR Kit” (Nº de cat. N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) en las condiciones proporcionadas por el proveedor. [0093] Se llevó a cabo una reacción de transcripción inversa, seguida por una reacción de amplificación en cadena (Reacción “RT-PCR”) con 50 l de la suspensión de ARN vírico de VIF (ejemplo 2) y con los oligonucleótidos siguientes: FC116 (36 mer) (SEC. DE ID. Nº: 1) y FC120 (48 mer) (SEC. DE ID. Nº: 7) 5’ TTTTTACCTGCATTTCCTTCTTCCAGTTTTACCTCTTGAATTTCGTTC 3’. [0094] Esta pareja de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción Pstl, de un sitio de restricción BspMI y de un codón ATG iniciador en 5’ de la inserción. [0095] La síntesis de la primera hebra de ADNc se realiza por alargamiento del oligonucleótido FC120, tras hibridación de éste último a la matriz de ARN. [0096] Las condiciones de síntesis de la primera hebra de ADNc son una temperatura de 42°C durante 15 min, después de 99°C durante 5 min, y finalmente de 4°C durante 5 min. Las condiciones de la reacción de la PCR en presencia de la pareja de oligonucleótidos FC116 y FC120 son una temperatura de 95°C durante 2 min, después 40 ciclos (95°C durante 30 s, después 50°C durante 45 s, y 72°C durante 3 min), y finalmente 72°C durante 7 min para producir un fragmento de 265 pb. [0097] Este fragmento se digiere mediante la enzima de restricción PstI después mediante la enzima de restricción BspMI para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa el fragmento PstI-BspMI de aproximadamente 240 pb. Este fragmento se denomina fragmento C. [0098] Se llevó a cabo una segunda reacción de transcripción inversa, seguida por una reacción de amplificación en cadena (Reacción “RTPCR”) con 50 l de la suspensión de ARN vírico de VIF (ejemplo 2) y con los oligonucleótidos siguientes: PB672 (48 mer) (SEC. DE ID. Nº: 8) 5’ TTTACTGGAAGAAGGAAATGCAGGTAAAAGGAAAAGACAAAGAAGAAG 3’ y PB673 (36 mer) (SEC. DE ID. Nº: 9) 5’TTTAGATCTTTAGTCCATAAGCATTCTTTCTATTTC 3’. [0099] Esta pareja de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción BspMI, de un sitio de restricción Bglll y de un codón de detención en 3’ de la inserción. [00100] La síntesis de la primera hebra de ADNc se realiza por alargamiento del oligonucleótido PB673, tras hibridación de éste último a la matriz de ARN. [00101] Las condiciones de síntesis de la primera hebra de ADNc son una temperatura de 42°C durante 15 min, después de 99°C durante 5 min, y finalmente de 4°C durante 5 min. Las condiciones de la reacción de la PCR en presencia de la pareja de oligonucleótidos PB672 y PB673 son una temperatura de 95°C durante 2 min, después 40 ciclos (95°C durante 30 s, después 50°C durante 45 s, y 72°C durante 3 min), y finalmente 72°C durante 7 min para producir un fragmento de 246 pb. [00102] Este fragmento se digiere mediante la enzima de restricción BspMI después mediante la enzima de restricción Bglll para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa el fragmento BspMI-Bglll de aproximadamente 230 pb. Este fragmento se denomina fragmento D. [00103] Los fragmentos C y D se enlazaron mediante el plásmido de expresión pVR1012 (ejemplo 3) previamente digerido mediante las enzimas de restricción PstI y Bglll, para dar el plásmido pPB375 (5316 pb). Este plásmido contiene, bajo el control del promotor precoz hCMV-IE una inserción que codifica la proteína rev de VIF.
EJEMPLO 6: CONSTRUCCIÓN DEL PLÁSMIDO PPB383 [00104] El ADN complementario (ADNc) de VIF se sintetizó mediante el kit “Gene Amp RNA PCR Kit” (Nº de cat. N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) en las condiciones proporcionadas por el proveedor. [00105] Se llevó a cabo la reacción de transcripción inversa, seguida por una reacción de amplificación en cadena (Reacción “RT-PCR”) con 50 l de la suspensión de ARN vírico de VIF (ejemplo 2) y con los oligonucleótidos siguientes: PB680 (29 mer) (SEC. DE ID. Nº: 10) 5’ TTTCTGCAGATGGAAGACATAATAGTATT 3’, y PB681 (32 mer) (SEC. DE ID. Nº: 11) 5’ TTTAGATCTCTAAGCAGTAGTTATTGATAATG 3’. [00106] Esta pareja de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción Bglll, de un sitio de restricción Pstl, de un codón ATG iniciador en 5’ y de un codón de detención en 3’ de la inserción. [00107] La síntesis de la primera hebra de ADNc se realiza por alargamiento del oligonucleótido PB681, tras hibridación de éste último a la matriz de ARN. [00108] Las condiciones de síntesis de la primera hebra de ADNc son una temperatura de 42°C durante 15 min, después de 99°C durante 5 min, y finalmente de 4°C durante 5 min. Las condiciones de la reacción PCR en presencia de la pareja de oligonucleótidos PB680 y PB681 son una temperatura de 95°C durante 2 min, después 40 ciclos (95°C durante 30 s, después 50°C durante 45 s, y 72°C durante 1 min), y finalmente 72°C durante 7 min para producir un fragmento de 254 pb. [00109] Este fragmento se digiere mediante la enzima de restricción PstI después mediante la enzima de restricción Bglll para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa el fragmento Pstl-Bglll de aproximadamente 240 pb. Este fragmento (fragmento E) se enlazó con el plásmido de expresión pVR1012 (ejemplo 3) previamente digerido mediante PstI y Bglll, para dar el plásmido pPB383 (5089 pb). Este plásmido contiene, bajo el control del promotor precoz hCMV-IE, una inserción que codifica la proteína tat de VIF.
EJEMPLO 7: CONSTRUCCIÓN DE LOS VIRUS RECOMBINANTES VCP242, VCP253 Y VCP255 [00110] La patente WO-A-98/21354 describe en detalle la obtención de los virus recombinantes vCP242, vCP253 y vCP255, respectivamente en los ejemplos 1, 2 y 4. [00111] El virus recombinante vCP242 comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína env de la cepa Villefranche de VIF bajo el control de un promotor H6 del virus vaccinia e insertada en el sitio C6 del virus de la viruela del canario ALVAC. [00112] El virus recombinante vCP253 comprende la secuencia de nucleótidos que codificaba las proteínas gag/pro de la cepa Villefranche de VIF bajo el control de un promotor I3L del virus vaccinia e insertada en el sitio C6 del virus de la viruela del canario ALVAC. [00113] El virus recombinante vCP255 comprende la secuencia de nucleótidos que codificaba la proteína env de la cepa Villefranche de VIF bajo el control de un promotor H6 del virus vaccinia y la secuencia de nucleótidos que codificaba las proteínas gag/pro de la cepa Villefranche de VIF bajo el control de un promotor I3L del virus vaccinia, ambas insertadas en el sitio C6 del virus de la viruela del canario ALVAC.
INSERCIÓN EN EL SITIO C5 DEL VIRUS DE LA VIRUELA DEL CANARIO ALVAC [00114] La figura 16 de la patente US-A-5.756.103 muestra la secuencia de un fragmento de 3199 pb del ADN genómico del virus de la viruela del canario. El análisis de esta secuencia ha revelado un marco de lectura abierto (MLA) que se ha denominado C5L, que se inicia en la posición 1538 y finaliza en la posición 1859. Se ha realizado como se indica a continuación la construcción de un plásmido de inserción que consiga la delección del MLA C5L y su sustitución por un sitio de clonación múltiple flanqueado de señales de detención de la transcripción y de traducción. [00115] Se ha llevado a cabo una reacción de la PCR a partir de la matriz constituida por el ADN genómico del virus de la viruela del canario y con los oligonucleótidos siguientes: C5A1 (42 mer) (SEC. DE ID. Nº: 12): 5’ ATCATCGAGCTCCAGCTGTAATTCATGGTCGAAAAGAAGTGC 3’ y FC121 (79 mer) (SEC. DE ID. Nº: 13): 5’GAATTCCTCGAGAGATCTCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTC ATTTTTTGAGAGTACCACTTCAGCTACCTC 3’ para aislar un fragmento de la PCR de 229 pb (fragmento B). [00116] Se ha llevado a cabo una reacción de la PCR a partir de la matriz constituida por el ADN genómico del virus de la viruela del canario y con los oligonucleótidos siguientes: FC122 (78 mer) (SEC. DE ID. Nº: 14): 5’CCCGGGCTGCAGAGATCTCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGT CATTATAAAGATCTAAAATGCATAATTTC 3’ y C5D1 (45 mer) (SEC. DE ID. Nº: 15): 5’ GATGATGGTACCGTAAACAAATATAATGAAAAGTATTCTAAACTA 3’ para aislar un fragmento de la PCR de 488 pb (fragmento C). [00117] Los fragmentos B y C fueron hibridados a la vez para servir como matriz para una reacción de la PCR llevada a cabo con los oligonucleótidos C5A1 (SEC. DE ID. Nº: 12) y C5D1 (SEC. DE ID. Nº: 15) para generar un fragmento de la PCR de 693 pb. Este fragmento fue digerido por las enzimas de restricción SacI y KpnI, para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa un fragmento SacI-KpnI de 676 pb. Este fragmento se enlazó al vector pBlueScript® II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA, Nº de cat. 212205), previamente digerido mediante las enzimas de restricción SacI y KpnI, para dar el plásmido pFC115. La secuencia de este plásmido fue verificada por secuenciación. Este plásmido contiene 166 pb de secuencias situadas en la dirección del MLA C5L (“brazo flanqueante izquierdo C5”), una señal de vaccinia de detención precoz de la transcripción, codones de detención en las 6 fases de lectura, un sitio de clonación múltiple que contenía los sitios de restricción SmaI, PstI, Bglll, XhoI y EcoRI, y finalmente 425 pb de secuencias situadas en la dirección del MLA C5L (“brazo flanqueante derecho C5”). [00118] EL plásmido pMP528HRH (Perkus M. y col. J. Virol. 1989. 63. 38293836) fue utilizado como matriz para amplificar la secuencia completa del promotor de vaccinia H6 (N° de acceso a GenBank M28351) con los oligonucleótidos siguientes: JCA291 (34 mer) (SEC. DE ID. Nº: 16) 5’ AAACCCGGGTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG 3’ y JCA292 (43 mer) (SEC. DE ID. Nº: 17) 5’ AAAAGAATTCGTCGACTACGATACAAACTTAACGGATATCGCG 3’ para amplificar un fragmento de la PCR de 149 pb. Este fragmento fue digerido por las enzimas de restricción Smal y EcoRI para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa un fragmento de restricción Smal-EcoRI de 138 pb. Este fragmento se enlazó a continuación con el plásmido pFC115, previamente digerido mediante Smal y EcoRI, para dar el plásmido pFC116.
EJEMPLO 9: CONSTRUCCIÓN DEL PLÁSMIDO DONANTE PARA LA INSERCIÓN EN EL SITIO C6 DEL VIRUS DE LA VIRUELA DEL CANARIO ALVAC [00119] La figura 4 de la patente WO-A-01/05934 muestra la secuencia de un fragmento de 3700 pb del ADN genómico del virus de la viruela del canario. El análisis de esta secuencia reveló un marco de lectura abierto (MLA) que fue denominado C6L, que se inicia en la posición 377 y finaliza en la posición 2254. Se ha realizado como se describe a continuación la construcción de un plásmido de inserción que consiga la delección del MLA C6L y su sustitución por un sitio de clonación múltiple flanqueado por señales de detención de la transcripción y de traducción. [00120] Se ha llevado a cabo una reacción de la PCR a partir de la matriz constituida por el ADN genómico del virus de la viruela del canario y con los oligonucleótidos siguientes: C6A1 (42 mer) (SEC. DE ID. Nº: 18): 5’ ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT 3’ y FC123 (79 mer) (SEC. DE ID. Nº: 19):
para aislar un fragmento de la PCR de 438 pb (fragmento D).
[00121] Se ha llevado a cabo una reacción de la PCR a partir de la matriz
constituida por el ADN genómico del virus de la viruela del canario y con los
oligonucleótidos siguientes:
FC124 (78 mer) (SEC. DE ID. Nº: 20):
y C6D1 (45 mer) (SEC. DE ID. Nº: 21): 5’ GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG 3’ para aislar un fragmento de la PCR de 1216 pb (fragmento E). [00122] Los fragmentos D y E fueron hibridados a la vez para servir como matriz para una reacción de la PCR llevada a cabo con los oligonucleótidos C6A1 (SEC. DE ID. Nº: 18) y C6D1 (SEC. DE ID. Nº: 21) para generar un fragmento de la PCR de 1642 pb. Este fragmento fue digerido por las enzimas de restricción Sacl y Kpnl, para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa un fragmento SacI-KpnI de 1625 pb. Este fragmento se enlazó al vector pBlueScript® II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA, Nº de cat. 212205), previamente digerido mediante las enzimas de restricción SacI y KpnI, para dar el plásmido pFC117. La secuencia de este plásmido fue verificada por secuenciación. Este plásmido contiene 370 pb de secuencias situadas en la dirección del MLA C6L (“brazo flanqueante izquierdo C6”), una señal de vaccinia de detención precoz de la transcripción, codones de detención en las 6 fases de lectura, un sitio de clonación múltiple que contenía los sitios de restricción Smal, Pstl, Bglll, XhoI y EcoRI, y finalmente 1156 pb de secuencias situadas en la dirección del MLA C6L (“brazo flanqueante derecho C6”). [00123] El plásmido pMPIVC (Schmitt J. F. C. y col., J. Virol., 1988, 62, 18891897 ; Saiki R. K. y col., Science, 1988, 239, 487-491) fue utilizado como matriz para amplificar la secuencia completa del promotor de vaccinia I3L con los oligonucleótidos siguientes: FC112 (33 mer) (SEC. DE ID. Nº: 22):
5’ AAACCCGGGCGGTGGTTTGCGATTCCGAAATCT 3’
y FC113 (43 mer) (SEC. DE ID. Nº: 23):
5’ AAAAGAATTCGGATCCGATTAAACCTAAATAATTGTACTTTGT 3’
para amplificar un fragmento de la PCR de 151 pb. Este fragmento fue digerido por las
enzimas de restricción Smal y EcoRI para aislar, tras electroforesis en gel de agarosa
un fragmento de restricción Smal-EcoRI de aproximadamente 136 pb. Este fragmento
se enlazó a continuación con el plásmido pFC117, previamente digerido mediante
Smal y EcoRI, para dar el plásmido pFC118.
EJEMPLO 10: CONSTRUCCIÓN DEL VIRUS RECOMBINANTE VCP1719
[00124] Los fragmentos C y D (ejemplo 5) fueron enlazados al plásmido pFC116
(ejemplo 8) previamente digerido mediante las enzimas de restricción Pstl y Bglll para
dar el plásmido pFC119.
[00125] El fragmento E (ejemplo 6) fue enlazado al plásmido pFC118 (ejemplo 9)
previamente digerido mediante las enzimas de restricción PstI y Bglll para dar el
plásmido pFC120.
[00126] El plásmido pFC120 fue linealizado mediante Notl, después transfectado a
células primarias de embrión de pollito infectadas con el virus de la viruela del canario
(cepa ALVAC) según la técnica de precipitación con fosfato de calcio descrita
anteriormente (Panicali y Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci. 1982. 79. 4927-4931; Piccini y
col. En Methods in Enzymology. 1987. 153. 545-563. Eds. Wu R. y Grossman L.
Academic Press). Se seleccionaron las placas positivas sobre la base de la hibridación
con una sonda marcada radiológicamente específica de la secuencia de nucleótidos de
la proteína tat. Estas placas se habían sometido a 4 ciclos sucesivos de
selección/purificación de placas hasta aislar una población pura. Una placa
representativa de la recombinación in vitro entre el plásmido donante pFC120 y el
genoma del virus de la viruela del canario ALVAC se amplificó a continuación, y el
depósito de virus recombinante obtenido se denominó vCP1719.
[00127] Opcionalmente, los virus recombinantes se utilizaron en una segunda
transfección en células primarias de embrión de pollito el presencia del plásmido
pFC119 linealizado mediante Notl, según la técnica de precipitación con fosfato de
calcio. Se seleccionaron placas positivas sobre la base de una hibridación con una
sonda radiomarcada específica de la secuencia de nucleótidos de la proteína rev. Estas
placas se habían sometido a 4 ciclos sucesivos de selección/purificación de placas
hasta aislar una población pura. Una placa representativa de la recombinación in vitro
entre los plásmidos donantes pFC119, pFC120 y el genoma del virus de la viruela del
canario ALVAC se amplificó a continuación, y el depósito de virus recombinante obtenido se denominó vCP1720.
EJEMPLO 11: CONSTRUCCIÓN DEL PLÁSMIDO PJP090 [00128] Se recogió sangre de gato en un tubo que contenía EDTA mediante una vía en la vena yugular. Las células mononucleadas se cosecharon por centrifugación en gradiente de Ficoll, después se cultivaron en una placa Petri de 60 mm de diámetro. Las células mononucleadas de gato en cultivo se estimularon seguidamente mediante concanavalina A (conA) (concentración final de aproximadamente 5 g/ml) bien con fitohemaglutinina (PHA) (concentración final de aproximadamente 10 g/ml). Tras estímulo, los linfoblastos “ConA” y “PHA” se cosecharon por rascado de las placas de cultivo, y el ARN total de estas células fue extraído mediante el kit “mRNA isolation kit for White Blood Cells” (Boehringer Mannheim/Roche Nº de cat. 1.934.325). [00129] EL ARN total extraído de los linfocitos de gato estimulados mediante ConA o PHA sirvió de matriz para la síntesis de la primera hebra de ADN complementario. Esta primera hebra de ADN complementario fue producida por alargamiento del oligonucleótido p(dT)15 (Boehringer Mannheim/Roche Nº de cat. 814 270). El ADN complementario monocatenario obtenido se utilizó a continuación como matriz en una reacción de la PCR con los oligonucleótidos siguientes: FC125 (48 mer) (SEC. DE ID. Nº 24): 5’ TTTTTTGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTGCTTTTCCTGGGC 3’ y FC126 (50 mer) (SEC. DE ID. Nº25): 5’ TTTTTTGCGGCCGCTACGTATCACTTCTTGACTGGTTTCCAGCAGTCAAA 3’ para amplificar un fragmento de la PCR de aproximadamente 473 pares de bases (pb). Este fragmento se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa. Este fragmento fue digerido por Notl y el fragmento Notl-Notl de aproximadamente 453 pb asó obtenido fue enlazado al plásmido pVR1012 (ejemplo 3), previamente digerido con Notl, para dar el plásmido pJP090 (5365 pb). La orientación de la inserción en pJP090 fue verificada. El fragmento Notl-Notl clonado en dicho plásmido fue secuenciado en su totalidad. Esta secuencia (SEC. DE ID. Nº 26), que codifica una proteína de 144 aminoácidos (SEC. DE ID. Nº 27) es la citocina GM-CSF felina.
EJEMPLO 12: PRODUCCION DE VACUNAS DE ADN [00130] Una disolución de ADN que contenía el plásmido pPB371 (ejemplo 3) se concentró por precipitación etanólica según describen Sambrook y col (1989). El residuo de ADN se capturó en una disolución de NaCl 1,8% de forma que se obtuviera una concentración de 1 mg/ml. Se preparó una disolución de DMRIE-DOPE 0,75 mM por captura de un liofilizado de DMRIE-DOPE mediante un volumen adaptado de H2O estéril. [00131] La formación de complejos de ADN plasmídico-lípido se realizó por dilución a partes iguales de la disolución 0,75 mM de DMRIE-DOPE (1:1) mediante la disolución de ADN 1 mg/ml en NaCl al 1,8%. La disolución de ADN se introdujo progresivamente mediante una aguja calibre 26G a lo largo de la pared del frasco que contenía la disolución de lípido catiónico de forma que se evitara la formación de espuma. Se procedió a una agitación suave de ambas disoluciones hasta que se mezclaron. Se obtuvo una composición que al final comprendía 0,375 mM de DMRIEDOPE y 500 g/ml de plásmido. [00132] Es deseable que todas las disoluciones utilizadas estén a temperatura ambiente en todas las operaciones descritas anteriormente. Se deja que la complejación ADN/DMRIE-DOPE transcurra a temperatura ambiente durante 30 minutes antes de proceder a la inmunización de los animales. [00133] Las vacunas de ADN pueden igualmente producirse con disoluciones de ADN que contienen los plásmidos pPB374 (ejemplo 4), pPB375 (ejemplo 5), pPB383 (ejemplo 6), pJP090 (ejemplo 11) o mezclas de al menos dos de dichos 5 plásmidos según la técnica descrita en el presenta ejemplo.
EJEMPLO 13: ENSAYOS DE EXPRESIÓN IN VITRO [00134] Se ensayó la expresión de las proteínas de VIF para cada una de las construcciones por los procedimientos clásicos de inmunofluorescencia indirecta y transferencia Western. [00135] Estos ensayos se efectuaron en placas Petri que contenían células CHO cultivadas en monocapas y transfectadas con los plásmidos o que contenían células CEF cultivadas en monocapas e infectadas con los virus recombinantes. [00136] Las proteínas de VIF se detectaron mediante el uso de sueros de gatos infectados y antisueros marcados. [00137] El tamaño de los fragmentos obtenidos según migración sobre gel de agarosa se comparó con el esperado.
EJEMPLO 14: EFICACIA EN ANIMALES. [00138] Se aleatorizaron en tres grupos de 6 animales gatos Hillgrove (Biological Laboratories Europe Ltd.) EOPS y sin anticuerpos dirigidos contra VIF, con edades aproximadas de 12 semanas. [00139] Los gatos del primer grupo (grupo A) se vacunaron en J0 y J28 mediante administración intramuscular de 1 ml de mezcla de plásmidos pPB371 (ejemplo 3) y pPB374 (ejemplo 4), después administración de refuerzo en J56 por vía intramuscular de 1 ml de virus recombinante vCP255 (ejemplo 7) con un título de 108,0 TCID50/ml. [00140] Los gatos del segundo grupo (grupo B) se vacunaron en J0 y J28 mediante
5 administración intramuscular de 1 ml de mezcla de los plásmidos pPB371 y pPB374, formulada con DMRIE-DOPE (ejemplo 12), después administración de refuerzo a J56 por vía intramuscular de 1 ml de virus recombinante vCP255 (ejemplo 7) con un título de 108,0 TCID50/ml. [00141] La concentración de ADN total en las vacunas de ADN es de 200 g/ml,
10 es decir 100 g/ml de cada plásmido contenido en la mezcla. [00142] La relación molar lípido/ADN en las vacunas de ADN formuladas con DMRIE-DOPE es 0,25.
- [00143]
- El tercer grupo (controles) es el grupo placebo (sin vacunación, prueba en
- J84).
- [00144] 15
- Todos los gatos se ensayaron en J84 por administración intraperitoneal de
1 ml de virus VIF patógeno (cepa Petaluma) con un título de 25 CID50/ml (siendo
CID dosis infecciosa del 50% en gatos).
[00145] Se observaron por una parte la viremia apreciada por reaislamiento vírico y
PCR, la respuesta en anticuerpos.
20 [00146] Reaislamiento vírico a partir de la semana 4 tras prueba en la semana 16 (número de animales que presentan viremia positiva):
- Grupos
- reaislamiento vírico PCR
- Grupo A
- 2/6 2/6
- Grupo B
- 3/6 2/6
- Controles
- 6/6 5/6
[00147] El reaislamiento vírico se realizó por cultivo simultáneo de
25 aproximadamente 5 10° células mononucleadas de sangre periférica (PBMC) con aproximadamente 106 células MYA-1 en medio RPMI 1640 durante 21 días. La presencia de ADN provírico de VIF presente en las células PBMC se identificó mediante la PCR. [00148] Se observó una ausencia de viremia en el 67% de los animales del grupo A
30 y en el 50% del grupo B. [00149] Respuesta celular del día de la prueba y 4 semanas después de la prueba
(número de animales que muestran una respuesta CTL positiva):
- Antígeno
- Gag Gag Env Env
- detectado
- Semana 0 Semana 4 Semana 0 Semana 4
- Grupo A
- 1/6 4/6 0/6 2/6
- Grupo B
- 2/6 6/6 2/6 0/6
- Controles
- 0/5* 2/6 0/5* 0/6
*: no se pudo realizar la toma de muestra en un animal.
5 [00150] Se tomaron fibroblastos cutáneos mediante biopsia en cada uno de los gatos. Los fibroblastos se marcaron con 51Cr y posteriormente se infectaron con una vacuna recombinante que expresaba bien env bien gag en presencia de PBMC procedente de cada uno de los gatos. La respuesta citotóxica (CTL) se midió por liberación de 51Cr.
10 [00151] Se observa que la vacuna estimula (efecto de estímulo) la respuesta citotóxica en los grupos de animales vacunados, especialmente para gag. [00152] Respuesta humoral tras la prueba (número de animales con una respuesta serológica positiva en ELISA anti-TM):
- Semana
- 0 2 4 8 12 16
- Grupo A
- 0/6 3/6 4/6 3/6 3/6 5/6
- Grupo B
- 0/6 3/6 5/6 5/6 4/6 6/6
- Controles
- 0/6 0/6 0/6 3/6 5/6 5/6
15 [00153] Se trata de un ELISA para cuantificar los anticuerpos empleando un péptido correspondiente al epítopo principal de la proteína transmembrana (TM). [00154] La vacunación estimula (efecto cebado) la respuesta inmunitaria humoral. LISTADO DE SECUENCIAS [00155]
20 <110> Merial<120> Vacunación contra el virus de la inmunodeficiencia felina<130> VIF prime/boost<160>25<170> PatentIn versión 3.1<210> 1<211> 36<212> ADN<213> Artificial<400> 1 ttttttctgc agcaataaga atggcagaag gatttg 36
<210> 2<211> 36<212> ADN<213> Artificial<400> 2 25 tcgcacctga aacatctcga gtgtttccac atgtat 36
- 27
- <210> 3<211> 36<212> ADN<213> Artificial<400> 3
- atacatgtgg aaacactcga gatgtttcag gtgcga
- 36
- (suite)
- 210> 4<211> 54<212> ADN<213> Artificial<400> 4
- ttttttggat cccccgggct gcaggaattc tgagatactt catcattcct cctc
- 54
- <210> 5<211> 37<212> ADN<213> Artificial<400> 5
- tttgtcgaca aggtaggaga gattctacag caacatg
- 37
- <210> 6<211> 40<212> ADN<213> Artificial<400> 6
- tttgcggccg cgttattgag ccattactaa cctaatattg
- 40
- <210> 7<211> 48<212> ADN<213> Artificial<400> 7
- tttttacctg catttccttc ttccagtttt acctcttgaa tttcgttc
- 48
- <210> 8<211> 48<212> ADN<213> Artificial<400> 8
- tttactggaa gaaggaaatg caggtaaaag gaaaagacaa agaagaag
- 48
- <210> 9<211> 36<212> ADN<213> Artificial<400> 9
- tttagatctt tagtccataa gcattctttc tatttc
- 36
- <210> 10<211> 29<212> ADN<213> Artificial<400> 10
- tttctgcaga tggaagacat aatagtatt
- 29
- <210> 11<211> 32<212> ADN<213> Artificial<400> 11
- tttagatctc taagcagtag ttattgataa tg
- 32
- <210> 12<211> 42<212> ADN<213> Artificial<400> 12
- atcatcgagc tccagctgta attcatggtc gaaaagaagt gc
- 42
- <210> 13<211> 79<212> ADN<213> Artificial<400> 13
- <210>
- 14<211> 78<212> ADN<213> Artificial<400> 14
- <210>
- 20<211> 78<212> ADN<213> Artificial<400> 20
- <210> 15<211> 45<212> ADN<213> Artificial<400> 15
- gatgatggta ccgtaaacaa atataatgaa aagtattcta aacta
- 45
- <210> 16<211> 34<212> ADN<213> Artificial<400> 16
- aaacccgggt tctttattct atacttaaaa agtg
- 34
- 28
- <210> 17<211> 43<212> ADN<213> Artificial<400> 17 aaaagaattc gtcgactacg atacaaactt aacggatatc gcg <210> 18<211> 42<212> ADN<213> Artificial<400> 18 atcatcgagc tcgcggccgc ctatcaaaag tcttaatgag tt 5 <210> 19<211> 79<212> ADN<213> Artificial<400> 19
- 43 42
- <210> 21<211> 45<212> ADN<213> Artificial<400> 21
- gatgatggta ccttcataaa tacaagtttg attaaactta agttg
- 45
- 15 <210> 22<211> 33<212> ADN<213> Artificial<400> 22
- aaacccgggc ggtggtttgc gattccgaaa tct
- 33
- <210> 23<211> 43<212> ADN<213> Artificial<400> 23
- aaaagaattc ggatccgatt aaacctaaat aattgtactt tgt
- 43
- <210> 24<211> 48<212> ADN<213> Artificial<400> 24
- ttttttgcgg ccgccaccat gtggctgcag aacctgcttt tcctgggc 20
- 48
- <210> 25<211> 50<212> ADN<213> Artificial<400> 25
- ttttttgcgg ccgctacgta tcacttcttg actggtttcc agcagtcaaa
- 50
Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.
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Claims (19)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Kit para la inducción de una respuesta inmunitaria dirigida contra VIF en un gato, que comprende, acondicionadas por separado: -una primera composición inmunógena que comprende, en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, uno o varios plásmido(s) que expresan in vivo env y gag/pro de VIF, -una segunda composición inmunógena que comprende, en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, uno o varios vector(es) vírico(s) atenuado(s) que expresan in vivo env y gag/pro de VIF, en la que el o los vector(es) vírico(s) atenuado(s) son uno o varios virus de la viruela del canario atenuado(s) o uno o varios virus de la viruela aviar atenuado(s);
-
- 2.
- Kit según la reivindicación 1, en el que la primera composición inmunógena y/o la segunda composición inmunógena expresa in vivo tat de VIF.
-
- 3.
- Kit según la reivindicación 1 ó 2, en el que el o los vector(es) vírico(s) atenuado(s) son uno o varios virus de la viruela del canario atenuado(s).
-
- 4.
- Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende composiciones inmunógenas para inducir una respuesta inmunitaria dirigida contra VIF en un gato o en varios gatos.
-
- 5.
- Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende dos dosis de composición inmunógena basada en plásmidos por una dosis de composición inmunógena basada en vectores víricos atenuados.
-
- 6.
- Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la composición inmunógena basada en plásmidos y/o la composición inmunógena basada en vectores víricos atenuados contiene un adyuvante.
-
- 7.
- Kit según la reivindicación 6, en el que el adyuvante es una citocina.
-
- 8.
- Kit según la reivindicación 7, en el que la citocina es un GM-CSF de felino.
-
- 9.
- Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la segunda composición inmunógena es para una administración en refuerzo de la primera composición inmunógena.
-
- 10.
- Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la primera y la segunda composición inmunógena son para administración por vía intramuscular.
-
- 11.
- Utilización de una parte de uno o varios plásmido(s) que expresan in vivo env y gag/pro de VIF, para la producción de una primera composición inmunógena que comprende el o los plásmido(s) y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, para una primera administración a un gato, y por otra parte de uno o varios vector(es) vírico(s) atenuado(s) que expresan in vivo env y gag/pro de VIF, para la producción de una segunda composición inmunógena que comprende el o los vector(es) vírico(s) atenuado(s) y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, para una administración de refuerzo a un intervalo de 3 a 6 semanas al mismo gato, en la que la administración de la primera y la segunda composición inmunógena se realiza por vía intramuscular, y el o los vector(es) vírico(s) atenuado(s) son uno o varios virus de la viruela del canario atenuado(s) o uno o varios virus de la viruela aviar atenuado(s).
-
- 12.
- Utilización de uno o varios plásmido(s) que expresan in vivo env y gag/pro de VIF, para la producción de una composición inmunógena que comprende el o los plásmido(s) y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para la inducción de una respuesta inmunitaria dirigida contra VIF en un gato, destinada a ser administrada por vía intramuscular al gato en una primera administración, realizándose el refuerzo tras de 3 a 6 semanas mediante una composición inmunógena que comprende uno o varios vector(es) vírico(s) atenuado(s) que expresan in vivo env y gag/pro de VIF y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, en la que el o los vector(es) vírico(s) atenuado(s) son uno o varios virus de la viruela del canario atenuado(s) o uno o varios virus de la viruela aviar atenuado(s).
-
- 13.
- Utilización de uno o varios vector(es) vírico(s) atenuado(s)que expresaba in vivo env y gag/pro de VIF, para la producción de una composición inmunógena que
comprende el o los vector(es) vírico(s) atenuado(s) y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, para la inducción de una respuesta inmunitaria dirigida contra VIF en un gato, destinada a ser administrada por vía intramuscular al gato en refuerzo a un intervalo de 3 a 6 semanas de una composición inmunógena que comprende uno o varios plásmido(s) que expresan in vivo env y gag/pro de VIF y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, en la que el o los vector(es) vírico(s) atenuado(s) son uno o varios virus de la viruela del canario atenuado(s) o un virus de la viruela aviar atenuado(s). -
- 14.
- Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en la que el o los plásmido(s) y/o el o los vector(es) vírico(s) atenuado(s) comprenden y expresan in vivo un polinucleótido que codifica tat de VIF.
-
- 15.
- Utilización según la reivindicación 14, en la que el o los vector(es) vírico(s) atenuado(s) son uno o varios virus de la viruela del canario atenuado(s).
-
- 16.
- Utilización según la reivindicación 15, en la que las dos composiciones inmunógenas son para una administración con un intervalo aproximado de 4 semanas.
-
- 17.
- Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en la que la composición inmunógena basada en plásmidos y/o la composición inmunógena basada en vectores víricos atenuados contiene un adyuvante.
-
- 18.
- Utilización según la reivindicación 17, en la que el adyuvante es una citocina.
-
- 19.
- Utilización según la reivindicación 18, en la que la citocina es un GM-CSF de felino.
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