CZ305257B6 - Souprava pro vyvolání imunitní odpovědi proti viru imunitní nedostatečnosti kočkovitých šelem - Google Patents
Souprava pro vyvolání imunitní odpovědi proti viru imunitní nedostatečnosti kočkovitých šelem Download PDFInfo
- Publication number
- CZ305257B6 CZ305257B6 CZ2003-3229A CZ20033229A CZ305257B6 CZ 305257 B6 CZ305257 B6 CZ 305257B6 CZ 20033229 A CZ20033229 A CZ 20033229A CZ 305257 B6 CZ305257 B6 CZ 305257B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- attenuated
- fiv
- gag
- immunogenic composition
- several
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 60
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title claims description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims description 3
- 241000282323 Felidae Species 0.000 title 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 101
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 59
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims abstract description 48
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims abstract description 44
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 44
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims abstract description 23
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims abstract description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 17
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 claims description 30
- 241000282324 Felis Species 0.000 claims description 27
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 14
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 6
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 claims description 4
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 claims description 4
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 2
- 241000287219 Serinus canaria Species 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 55
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 abstract description 21
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 abstract description 21
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 abstract description 21
- 241000178270 Canarypox virus Species 0.000 abstract description 4
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 67
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 50
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 37
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 35
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 23
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 16
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 12
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 12
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 12
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- 229940023860 canarypox virus HIV vaccine Drugs 0.000 description 10
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 5
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 5
- -1 fatty acid esters Chemical class 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 4
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCO)OCCCCCCCCCCCCCC WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 3
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 229940023147 viral vector vaccine Drugs 0.000 description 3
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 241000701925 Feline parvovirus Species 0.000 description 2
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 2
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 2
- VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N Isobutene Chemical class CC(C)=C VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 201000003740 cowpox Diseases 0.000 description 2
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-M decanoate Chemical compound CCCCCCCCCC([O-])=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 2
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M octanoate Chemical compound CCCCCCCC([O-])=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 2
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ULQISTXYYBZJSJ-UHFFFAOYSA-N 12-hydroxyoctadecanoic acid Chemical compound CCCCCCC(O)CCCCCCCCCCC(O)=O ULQISTXYYBZJSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XDOFQFKRPWOURC-UHFFFAOYSA-N 16-methylheptadecanoic acid Chemical class CC(C)CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O XDOFQFKRPWOURC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFIMISVNSAUMBU-UHFFFAOYSA-N 2-(hydroxymethyl)-2-(prop-2-enoxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(CO)(CO)COCC=C RFIMISVNSAUMBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIHBGTRZFAVZRV-UHFFFAOYSA-N 2-Hydroxyoctadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)=O KIHBGTRZFAVZRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMHYVXGZRGOICM-AUYXYSRISA-N 2-[(z)-octadec-9-enoyl]oxypropyl (z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC UMHYVXGZRGOICM-AUYXYSRISA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 230000035502 ADME Effects 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N Acrylic acid Chemical compound OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 208000004729 Feline Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 208000000666 Fowlpox Diseases 0.000 description 1
- 229920006385 Geon Polymers 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 101000887051 Homo sapiens Ubiquitin-like-conjugating enzyme ATG3 Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010028741 Nasal inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 101710150344 Protein Rev Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 241000287231 Serinus Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039930 Ubiquitin-like-conjugating enzyme ATG3 Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Chemical class 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229960001631 carbomer Drugs 0.000 description 1
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 229920006037 cross link polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 208000005098 feline infectious peritonitis Diseases 0.000 description 1
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- AFFLGGQVNFXPEV-UHFFFAOYSA-N n-decene Chemical class CCCCCCCCC=C AFFLGGQVNFXPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001281 polyalkylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000223 polyglycerol Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 229940010310 propylene glycol dioleate Drugs 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Souprava pro vyvolání imunitní odpovědi směřované proti FIV u kočky, která obsahuje odděleně zabalenou první imunogenní kompozici obsahující ve farmaceuticky přijatelném nosiči nebo excipientu jeden plasmid exprimující in vivo FIV env a gag/pro nebo několik takových plasmidů, a druhou imunogenní kompozici obsahující ve farmaceuticky přijatelném nosiči nebo excipientu jeden atenuovaný virový vektor exprimujících in vivo FIV env a gag/pro nebo několik takových vektorů, přičemž jedním nebo několika atenuovanými virovými vektory je jeden atenuovaný vir kanářích neštovic nebo několik takových virů nebo jeden atenuovaný vir drůbežích neštovic nebo několik takových virů.
Description
Souprava pro vyvolání imunitní odpovědi proti viru imunitní nedostatečnosti kočkovitých šelem
Oblast techniky
Vynález se týká souprav proti viru imunitní nedostatečnosti kočkovitých šelem.
Dosavadní stav techniky
Virus imunitní nedostatečnosti kočkovitých šelem (FIV) je jednovláknový RNA retrovirus kladné polarity, pocházející z rodiny lentivirů. Je široce rozšířený po celé planetě, zasahuje hlavně kočkovité šelmy a zvláště kočky. Nemoc je charakterizována zničením a potlačením imunitního systému, což umožňuje rozvoj náhodných nemocí, které mohou vést ke smrti.
Molekula RNA FIV sestává z několika otevřených čtecích rámců (COL), které kódují strukturní proteiny, zvláště env a gag, virové enzymy, zvláště pol a pro, a transaktivátory, zvláště tat a rev. COL rev sestává ze dvou exonů.
Byly navrženy inaktivní vakcíny, které však pro chránící působení musí obsahovat velmi značná množství antigenů, což je průmyslově obtížně realizovatelné.
Další řešení vakcinace bylo vedeno snahou o využití obalového proteinu ve formě subjednotky nebo exprimované rekombinantním expresním vektorem. Tyto práce nevedly k uspokojivým výsledkům. Poukázaly však na výskyt jevu podpory („facilitation“), jenž vede k předčasné viremii u vakcinovaných zvířat ve srovnání se zvířaty kontrolními.
Cuisinierův článek (Cuisinier A. M. a kol., Vaccine 15(10), str. 1085 až 1094, 1997), uvádí, že z řady testů vakcinace za použití neaktivovaného viru vyplynulo, že pro ochranu je rozhodující povrchový glykoprotein gpl20. Nicméně uvádí, že řada pokusů s vakcinací používající rekombinantní proteiny env, nevedly k vyvolání ochrany. Autoři popisují experimenty, při nichž byly kočky vakcinovány intramuskulámím podáváním DNA kódující gpl20 a plO (nukleokapsid) FIV. Podávání DNA kódující gpl20 FIV vyvolává jen částečnou ochranu. V případě kombinace gpl20 a plO se žádná ochrana nepozoruje.
Na druhé straně v Richardsonově článku (Richardson J. a kol. J. Virol. 71(12), str. 9640 až 9649, 1997) se popisuje jev podpory při podávání plazmidů kódujících env FIV. Tento jev se také pozoruje po vakcinací za použití rekombinantních proteinů FIV (Lutz H. a kol., AIDS Research and Human Retroviruses 12(5), str. 431 až 433, 1996) a vakcíny exprimující env FIV (Osterhaus, A.D.M.E. a kol., AIDS Research and Human Retroviruses 12(5), str. 437 až 441, 1996).
Dokument WO-A 98/21 354 popisuje protokol vakcinace proti FIV, při kterém se nejprve podává rekombinantní vektor kanářích neštovic („canarypox“), mající jako insert env a gag/pro FIV, a potom neaktivovaný FIV produkovaný na lymfocytech T.
V článku Cuisinier A. M. a kol. (Vaccine 17, str. 415 až 425, 1999) se uvádí, že při podávání DNA exprimující gpl20 dochází ještě kjevu podpory.
Byly proto studovány různé přístupy vakcinace, obzvláště neaktivních vakcín, vakcín subjednotkových a vakcín rekombinantních (virové vektory a DNA). Dosud však neexistuje uspokojivé řešení, ani jasný směr pro další bádání.
Na základě důležitých výzkumů, byl přihlašovatel schopen vyvinout způsob vakcinace kočkovitých šelem proti FIV s použitím rekombinačních vakcín typu virového vektoru a DNA (plazmid). S překvapením uvedený způsob umožňuje použití exprese env, aniž vyvolá problém podpory.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je souprava pro vyvolání imunitní odpovědi směrované proti FIV u kočky, vyznačující se tím, že obsahuje odděleně zabalenou
- první imunogenní kompozici obsahující ve farmaceuticky přijatelném nosiči nebo excipientu jeden plazmid exprimující in vivo FIV env a gag/pro nebo několik takových plazmidů, a
- druhou imunogenní kompozici obsahující ve farmaceuticky přijatelném nosiči nebo excipientu jeden atenuovaný virový vektor exprimujících in vivo FIV env a gag/pro nebo několik takových vektorů, přičemž jedním nebo několika atenuovanými virovými vektory je jeden atenuovaný vir kanářích neštovic nebo několik takových virů nebo jeden atenuovaný vir drůbežích neštovic nebo několik takových virů.
Vynález se tedy týká především soupravy pro imunizaci a vakcinaci kočkovitých šelem proti FIV zahrnující alespoň jedno první podání a alespoň jedno opakované podání se zavedením alespoň jednoho společného imunogenu. Imunogenní prostředky a použité vakcíny k prvnímu podání jsou odlišné povahy oproti prostředkům použitým v opakování. Tento protokol podávání se nazývá („prime boost“). Podle vynálezu znamená protokol prime boost první podání imunogenního prostředku nebo vakcíny obsahující v nosiči nebo ve farmakologicky přijatelném excipientu plazmid obsahující a exprimující in vivo polynukleotid kódující env a/nebo gag a/nebo gag/pro FIV, následovaný opakováním s imunogenním prostředkem nebo rekombinantní vakcínou obsahující v nosiči nebo ve farmakologicky přijatelném excipientu virový vektor obsahující a exprimující in vivo polynukleotid kódující env a/nebo gag a/nebo gag/pro FIV, s podmínkou, podle které alespoň jeden z proteinů env a/nebo gag a/nebo gag/pro je kódován jak plazmidy, tak virovými vektory.
První podání může představovat jedno nebo několik podání stejných imunogenních prostředků nebo vakcín na bázi plazmidů. Opakované podání může zahrnovat jedno nebo několik podání stejných imunogenních prostředků nebo vakcín na bázi virových vektorů. Podle jednoho zvláštního způsobu vynálezu zahrnuje protokol dvě následná podání stejného imunogenního prostředku nebo vakcíny na bázi plazmidů, pak opakované podání imunogenního prostředku nebo vakcíny na bázi virového vektoru.
Jednotlivá podání se s výhodou provádějí v intervalu tří až šesti týdnů, obzvláště řádově čtyř týdnů. Podle výhodného způsobu se dává přednost navíc ročnímu opakování, výhodně za použití imunogenního prostředku nebo vakcíny na bázi virového vektoru. Stáří zvířat pro první podání je s výhodou šest až osm týdnů.
S výhodou exprimují použité plazmidy a virové vektory, použité podle protokolu prime/boost, jak env a gag tak env a gag/pro.
Podle vynálezu výraz protein zahrnuje fragmenty proteinů, peptidů a polypeptidů mající v podstatě stejnou imunologickou aktivitu jako celý protein. Výrazy, například env a/nebo gag a/nebo gag/pro, zahrnují fragmenty polynukleotidů kódující tyto fragmenty proteinu, peptidů a polypeptidů.
K řízení exprese jsou polynukleotidy funkčně asociovány na promotor a popřípadě na zesilovač transkripce, na stabilizační sekvence a/nebo na signální sekvence umožňující sekreci proteinu.
Jiné proteiny FIV mohou být exprimovány společně s env a/nebo gag a/nebo gag/pro při prvním podání a/nebo při opakovaném podání. Jmenovitě je možno exprimovat protein tat a/nebo protein rev, s výhodou tat a popřípadě rev. Mohou být exprimovány ve stejných plazmidech a/nebo virových vektorech jakých se využívá pro env a/nebo gag a/nebo gag/pro nebo v plazmidech a/nebo ve vlastních virových vektorech.
Podle zvláštního způsobuje v prostředcích nebo ve vakcínách podle vynálezu zastoupeno několik kmenů FIV, protokol tedy znamená podávání plazmidů a virových vektorů obsahujících a exprimujících in vivo polynukleotidy kódující env a/nebo gag a/nebo gag/pro dvou, tri nebo více kmenů FIV. Podobně polynukleotidy několika kmenů FIV mohou být neseny společným virovým vektorem nebo vlastními virovými vektory. Pro plazmidy se dává přednost vlastním plazmidům, nevylučuje se však, že jeden jednotlivý plazmid nese polynukleotidy několika kmenů FIV.
Podle ještě dalšího provedeno, jak je dále objasněno, může protokol znamenat současné podávání jednoho nebo několika cytokinů, buď ve formě proteinu, nebo začleněním jednoho polynukleotidu kódujícího jeden cytokin v plazmidech a/nebo virových vektorech, použitých k exprimování například proteinů FIV.
K realizování expresních vektorů podle vynálezu má pracovník v oboru k dispozici různé kmeny FIV, organizaci jejich geonomu a nukleotidové sekvence jejich genomu. Použitelné kmeny FIV, jako je kmen Petaluma, jsou objasněny v příkladech. Doplňující informace o těchto a ostatních kmenech, jejich nukleotidových sekvencích jsou objasněny v příkladech praktického provedení.
Podle vynálezu znamená první podání použití plazmidů exprimujících in vivo protein nebo proteiny FIV. Výraz plazmid znamená jednotku transkripce DNA obsahující jeden polynukleotid podle vynálezu a prvky potřebné k jeho expresi in vivo. Přednost se dává cyklické formě plazmidu popřípadě superobaleného. Lineární forma patří také do rámce vynálezu.
Každý plazmid obsahuje promotor schopný zaručit v hostitelských buňkách expresi polynukleotidu insertovaného podle své závislosti. Obecně jde o silný eukaryotický promotor. Silným výhodným eukaryotickým promotorem je raný promotor cytomegaloviru (CMV-IE), lidského nebo myšího původu nebo také popřípadě jiného původu, jako krysího a morčecího. Promotor CMVIE může obsahovat část promotoru asociovanou nebo neasociovanou se zesilovačem transkripce (například EP-A 260 148 a EP-A 323 597, US 5 168 062, US 5 385 839 a US 4 968 615 a WOA 87/03 905). Přednost se dává CMV-IE lidskému (Boshart M. a kol. Cell 41, str. 521 až 530, 1985) nebo myšímu.
Obecněji je promotor původu jak virového, tak buněčného. Jako silný virový promotor jiný než CMV-IE je možno uvést raný promotor nebo pozdní promotor viru SV40 nebo promotor LTR viru Sarcome de Rous. Jako silný buněčný promotor se uvádí promotor cytoskeletového genu, jako je například promotor desminu (Kwissa M. a kol., Vaccine 18(22), str. 2337 až 2344, 2000) nebo také promotor aktinu (Miyazaki J. a kol. Gene 79, str. 269 až 277, 1989). Vynález se také týká subfragmentů těchto promotorů, uchovávajících si přiměřenou promotorovou aktivitu, například promotorů CMV-IE zkomolených (WO-A 98/00 166). Výraz promotor zahrnuje tedy podle vynálezu deriváty a subfřagmenty uchovávající přiměřenou promotorovou aktivitu, s výhodou v podstatě podobnou aktivitě promotoru, z něhož pocházejí. V případě CMVE-IE tento výraz znamená promotor jako takový a/nebo zesilovač transkripce a jeho deriváty a subfřagmenty.
S výhodou obsahují plazmidy další řídicí prvky exprese. Zejména je výhodné začlenit stabilizující sekvence intronového typu, s výhodou intron II genu králičího beta-globinu (van Ooyen a kol., Science 206, str. 337 až 344, 1979).
Jako signálu polyadenylace (póly A) pro plazmidy je možno použít zejména signálu genu růstového hovězího hormonu (bGH) (US-A 5 122 458), genu králičího β-globinu nebo viru SV40.
Podle vynálezu znamená druhé podání použití virových vektorů exprimujících in vivo protein nebo proteiny FIV. Těmito virovými expresními vektory jsou s výhodou viry ptačích neštovic (avipox) (zvláště viry kanářích neštovice a drůbežích neštovic „fowlpox“) nebo zeslabené mutanty vakcínového viru.
Vir způsobující neštovice je popsán včetně patentové literatuře (například WO-A90/12 882) a zejména je popsán vakcinový vir (US 4 769 330, US 4 722 848, US 4 603 112, US 5 110 587, US 5 494 807, US 5 762 938), vir drůbežích neštovic (US 5 174 993, US 5 505 941, US 5 766 599) a vir kanářích neštovic (US 5 756 103).
Jako zeslabený mutant vakcínového viru se uvádí MVA (kmen Ankara) (Stickl H. a HochsteinMintzel V., Munch. Med. Wschr., 113, str. 1149 až 1153, 1971; Sutter G. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA 89, str. 10847 až 10851, 1992; komerční kmen ATCC VR-1508; MVA se získá po více než 570 průchodech kmene vakcíny Ankara na fibroblastech kuřecích embryí nebo NYVAC (jeho konstrukce je popsána v US 5 494 807, zvláště v příkladech 1 až 6; přičemž tento patentový spis popisuje také inserci heterologových genů do míst tohoto rekombinantu a použití adaptovaných promotorů; toho se týká také WO-A 96/40 241).
Vynález se týká také zvláště expresního vektoru viru způsobujícího neštovice a viru kanářích neštovic, popřípadě zeslabeného, například ALVAC nebo viru kanářích neštovic (například kmene Rentschler), který byl zeslaben, zvláště více než 200 průchody na buňkách fibroblastů kuřecích embryí (CEF). Vir kanářích neštovic kmene ALVAC byl uložen dne 14. listopadu 1996 do sbírky American Type Culture Collection (ATCC) pod registračním číslem VR-2547. Vir kanářích neštovic je obchodně dostupný od ATCC pod registračním číslem VR-111. Zeslabené viry kanářích neštovic jsou popsány v patentové literatuře (US 5 756 103 a WO-A 01/05 934).
Mohou se použít také jiné zeslabené viry neštovic zvláště zeslabené viry drůbežích neštovic (například TROVAC). Pracovníci v oboru získají další informace o viru TROVAC způsobujícím neštovice pracovník v patentové literatuře (například WO A 96/40 241). Z četných vakcínových kmenů viru drůbežích neštovic je dostupná například vakcína DIFTOSEC CT® (obchodní produkt společnosti MERIAL) a vakcína NOBILIS® VARIOLE (obchodovaná přes internet).
Pokud je expresním vektorem zeslabený mutant viru vakcíny, jsou místy inserce polynukleotidu nebo polynukleotidů k exprimaci hlavně gen thymidinkinázy (TK), gen hemaglutininu (HA), oblast tělesa inkluze typu A (ATI). Inserce genů do viru MVA je také popsána v různých publikacích (Caroll M. W. a kol., Vaccine 15(4), str. 387-394, 1997; Stittelaar K. J. a kol., J. Virol. 74(9), str. 4236 až 4243, 2000; Sutter G. a kol., Vaccine 1211), str. 1032 až 1040, 1994) Úplný genom MVA popsal Antoine G. (Virology 244, str. 365 až 396 1998), což umožňuje pracovníku v oboru použít jiných míst k inserci nebo jiných promotorů.
Pokud jde o kanáři neštovice, jsou místa inserce orientována do COL, C3, C5 a C6 nebo jimi tvořená. Pokud jde o drůbeží neštovice, jsou místa inserce orientována do COL F7 a F8 nebo jimi tvořená.
S výhodou, je-li expresním vektorem vir způsobující neštovice, je polynukleotid k exprimaci insertován za řízení specifickým promotorem pro vir způsobující neštovice, jmenovitě promotorem vakcíny 7,5 kDa (Cochran a kol., J. Virology 54, str. 30 až 35, 1985), promotorem vakcíny 13L (Rivieře a kol., J. Virology 66, str. 3424 až 3434, 1992), promotorem vakcíny HA (Shida, Virology 150, str. 451 až 457, 1986), promotorem hovězích neštovic („cowpox“) ATI (Funahashi a kol., J. Gen. Virol. 69, str. 35 až 47, 1988), nebo také promotorem vakcíny H6 (Taylor a kol., Vaccine 6, str. 504 až 508, 1988; Guo P. a kol., J. Virol 63, str. 4189 až 4198, 1989; Perkus M. a kol., J. Virol. 63, str. 3829 až 3836, 1989).
Vynález se týká také použití jednak části plazmidů obsahujících a exprimujících in vivo alespoň jeden polynukleotid kódující env a/nebo gag a/nebo gag/pro FIV pro výrobu prvního imunogenu nebo první vakcíny obsahující plazmidy a nosič nebo farmaceuticky přijatelný excipient, určené k druhému podání téže kočkovité šelmě za podmínky, že alespoň jeden z proteinů env a/nebo gag a/nebo gag/pro je kódován jak plazmidy, tak virovými vektory k vakcinaci kočkovitých šelem proti FIV.
Vynález se také týká použití plazmidů obsahujícího a exprimujícího in vivo alespoň jeden polynukleotid kódující env a/nebo gag a/nebo gag/pro FIV, pro výrobu vakcíny obsahující plazmidy a nosič nebo farmaceuticky přijatelný excipient, určené k vakcinaci kočkovitých šelem proti FIV v prvním podání, přičemž druhé podání se provádí pomocí vakcíny obsahující virové vektory a exprimující in vivo alespoň jeden polynukleotid kódující env a/nebo gag a/nebo gag/pro FIV a nosič nebo farmaceuticky přijatelný excipient za podmínky, že alespoň jeden z proteinů env a/nebo gag a/nebo gag/pro je kódován jak plazmidy, tak virovými vektory.
Vynález se také týká použití virových vektorů obsahujících a exprimujících in vivo alespoň jeden polynukleotid kódující env a/nebo gag a/nebo gag/pro FIV pro výrobu vakcíny obsahující virové vektory a nosič nebo farmaceuticky přijatelný excipient určené pro vakcinaci kočkovitých šelem proti FIV, k podávání kočkovitým šelmám, po podání vakcíny obsahující plazmidy a exprimující in vivo alespoň jeden polynukleotid kódující env a/nebo gag a/nebo gag/pro FIV a nosič nebo farmaceuticky přijatelný excipient za podmínky, že alespoň jeden z proteinů env a/nebo gag a/nebo gag/pro je kódován jak plazmidy, tak virovými vektory.
Vynález se týká soupravy (kitu) k imunizaci nebo vakcinaci kočkovitých šelem proti FIV, určeného zvláště k použití podle protokolu podávání podle vynálezu, přičemž obsahuje odděleně zabalenou:
- první imunogenní kompozici obsahující ve farmaceuticky přijatelném nosiči nebo excipientu jeden plazmid exprimující in vivo FIV env a gag/pro nebo několik takových plazmidů, a
- druhou imunogenní kompozici obsahující ve farmaceuticky přijatelném nosiči nebo excipientu jeden atenuovaný virový vektor exprimujících in vivo FIV env a gag/pro nebo několik takových vektorů, přičemž jedním nebo několika atenuovanými virovými vektory je jeden atenuovaný vir kanářích neštovic nebo několik takových virů nebo jeden atenuovaný vir drůbežích neštovic nebo několik takových virů.
S výhodou exprimují plazmidy a virový vektor env a/nebo gag a/nebo gag/pro.
Je zřejmé, že popsaný soubor charakteristik podle vynálezu, které se týkají například složení plazmidů a virových vektorů, složení prostředků a vakcín, souvislostí polynukleotidů FIV, protokol podávání aplikuje za stejných podmínek na různé objekty vynálezu.
Výraz imunogenní prostředek zahrnuje veškeré schopné prostředky jednou podané cílovým druhům v podmínkách vynálezu vyvolávající imunitní odezvu zaměřenou proti FIV. U vakcín se očekává prostředek schopný zavést účinnou ochranu. Cílovým druhem jsou kočkovité šelmy, s výhodou kočky.
Nosiče nebo farmaceuticky přijatelné excipienty jsou pracovníkům v oboru dokonale známy. Jako příklad se uvádí 0,9% roztok chloridu sodného nebo fosfátový pufr. Nosiče nebo farmaceuticky přijatelné excipienty zahrnují všechny sloučeniny nebo kombinace sloučenin umožňujících podávání vektoru, zvláště transfekci a/nebo zlepšenou konzervaci.
Imunogenní prostředky a vakcíny podle vynálezu obsahují s výhodou jeden nebo několik adjuvantů volených hlavně z obvyklých adjuvantů. Podle vynálezu jsou vhodné zvláště: (1) polymery kyseliny akrylové nebo metakrylové, polymery maleinanhydridu a deriváty alkenylu, (2) imunostimulační sekvence (1SS), zvláště sekvence oligodesoxyribonukleotidové mající alespoň jeden motiv nemethylového CpG (Klinman D. M. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93, str. 2870 až 2883, 1996; W0-A1 98/16 247), (3) emulze olej ve vodě, zejména emulze SPT (popsaná na stránce 147 knihy „Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach“, kterou vydali M. Powell, M. Newman, Plenům Press 1995) a emulze MF59 (popsaná na str. 183 téže publikace), (4) kationové lipidy obsahující kvartémí amoniovou sůl, (5) cytokiny nebo (6) jejich kombinace nebo směsi.
- Emulze olej ve vodě (3), která se nejlépe hodí pro virové vektory, může být zvláště na bázi: kapalného lehkého parafinového oleje (typu Pharmacopée européenne),
- isoprenoidového oleje jako skvalenového, skvalen,
- oleje jakožto produktu oligomerace alkenů zvláště isobutenu nebo decenu, esterů kyselin nebo alkoholů lineárních alkylenových, výhodněji rostlinných olejů, ethyloleátu, di(kaprylát/kaprát)propylenglykolu, tri(kaprylát/kaprát)glycerolu, dioleátu propylenglykolu,
- esterů kyselin nebo alkoholů mastných rozvětvených, zejména esterů kyseliny isostearové.
Oleje se používá ve spojení s emulgátory k vytvoření emulze. Emulgátory jsou s výhodou povrchově aktivní, neionické, zejména:
- estery jednak sorbitu, mannitu (například oleát anhydromannitu), glycerolu, polyglycerolu nebo propylenglykolu jednak kyseliny olejové, isostearové, ricinoleové, hydroxystearové, přičemž tyto estery mohou být popřípadě ethoxylované,
- blokové kopolymery polyoxypropylenpolyoxyethylenové, zejména na Pluronic® zvláště L121.
Z polymerových adjuvantů typu (1) se dává přednost zesítěným polymerům kyseliny akrylové nebo metakrylové, zvláště zesítěným polyalkylenethery cukrů nebo polyalkoholů. Tyto sloučeniny jsou známy pod jménem karbomery (Pharmeuropa sv. 8, číslo 2, červen 1996). Takové zesítěné akrylové polymery jednou polyhydroxylovanou sloučeninou mající alespoň tři hydroxylové skupiny, s výhodou méně než osm, kde jsou atomy vodíku alespoň tří hydroxylových skupin nahrazeny alifatickými nenasycenými skupinami majícími alespoň 2 atomy uhlíku, jsou popsány v literatuře (US 2 909 462). Výhodnými skupinami jsou skupiny se 2 až 4 atomy uhlíku, například skupiny vinylové, allylové a jiné ethylenicky nenasycené skupiny. Nenasycené skupiny mohou samy obsahovat další substituenty, například skupinu methylovou. Produkty prodávané pod označením Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, USA) jsou zvláště vhodné. Jsou zvláště zesítěny allysacharózou nebo allylpentaerytritolem. Příkladně se uvádí hlavně Carbopol® 974P, 934P a 971P.
Koncentrace polymeru karbomerového typu v hotovém vakcínovém prostředku může být v rozmezí 0,01 až 1,5 % (hmotnost/objem), výhodněji v rozmezí 0,05 až 1 % (hmotnost/objem) a nejvýhodněji v rozmezí 0,1 až 0,4 % (hmotnost/objem).
Kationické lipidy (4) obsahující kvartémí amoniovou sůl, které jsou zvláště avšak nikoli výlučně přizpůsobeny plazmidům, mají s výhodou následující obecný vzorec í^-O-CHj-CH-CHa-N—Rz-X
OR, CHj kde znamená
R1 lineární, nasycenou nebo nenasycenou alifatickou skupinu s 12 až 18 atomy uhlíku,
R2 jinou alifatickou skupinu se 2 až 3 atomy uhlíku a X hydroxylovou skupinu nebo aminoskupinu.
Z těchto kationických lipidů se dává přednost N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)l-propanamoniu (DMRIE, WO-A 96/34 109) s výhodou asociovanému s neutrálním lipidem, s výhodou s dioleoylfosfatidylethanolaminem (DOPE, Behr J. P., Bioconjugate Chemistry 5, str. 382 až 389, 1994) za vytvoření DMRIE-DOPE.
S výhodou se získává směs plazmidu s tímto adjuvantem podle předpisu a před podáním je výhodné ponechat takto vzniklé směsi čas na komplexaci, například 10 až 60 minut, zvláště řádově 30 minut.
Pokud je obsažen DOPE, je molový poměr DMRIE:DOPE s výhodou v rozmezí 95:5 až 5:95, obzvláště 1:1.
Hmotnostní poměr plazmid : adjuvant DMRIE nebo DMRIE-DOPE může být v rozmezí 50:1 až 1:10a obzvláště 10:1 až 1:5, s výhodou je v rozmezí 1:1 až 1:2.
Případně obsažené cytokiny (5) mohou mít formu proteinu jako prostředek nebo vakcína, nebo mohou být společně exprimovány hostitelem s jedním nebo několika proteiny FIV. Přednost se dává společné expresi cytokinu nebo cytokinů, buď stejným vektorem, který exprimuje proteiny, nebo čistým vektorem.
Cytokiny se mohou zvláště volit z cytokinů koček, zvláště domácích koček, jako je kočičí interleukin 18 (ťIL-18) (Taylor S. a kol., DNA Seq. 10(6) str. 387-394, 2000), flL-16 (Leutenegger C. M. a kol., DNA Seq. 9(1), str. 59 až 63, 1998), fIL-12 (Fehr D. a kol., DNA Seq. 8(1-2), str. 77 až 82, 1997; Imamura T. a kol., J. Vet. Med. Sci. 62(10), str. 1079 až 1087, 2000) a GM-CSF kočičí („Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulation Factor“, faktor stimulace tvoření granulo-makrofágových kolonií) (GenBank AF053007).
Podle vynálezu může být vakcinace proti FIV spojena s vakcinací proti jiným patogenům kočkovitých šelem. Jinými patogeny kočkovitých šelem jsou zvláště vir zánětu nosní sliznice kočkovitých šelem nebo vir oparu kočkovitých šelem (FHV), vir kočičí leukemie (FeLV typu A a typu B) kočičí parvovir (FPV), vir kočičího nakažlivého zánětu pobřišnice (FIPV), vir kočičí calicivirózy (FCV), vir vztekliny, Chlamydia.
Vakcinační prostředky podle vynálezu se mohou podávat zvláště parenterálně, například subkutánně, intradermálně, intramuskulámě nebo orálně a/nebo nasálně.
Různé prostředky a vakcíny se mohou injektovat injekční stříkačkou bez jehly.
Imunogenní prostředky a vakcíny podle vynálezu obsahují účinné množství plazmidu nebo virového vektoru, přičemž množství určí pracovník v oboru. Podle vynálezu se doporučuje:
- v případě imunogenních prostředků nebo vakcín na bázi plazmidu dávka v rozmezí přibližně 1 až 2000 pg, zvláště v rozmezí 50 až 1000 pg při objemu dávky v rozmezí 0,1 až 2 ml, s výhodou v rozmezí 0,2 až 1 ml,
- v případě imunogenních prostředků nebo vakcín na bázi viru způsobujícího neštovice dávka v rozmezí přibližně 103 až 109 pfu. Je-li vektorem vir kanářích neštovic dávka v rozmezí 105 až 109 s výhodou v rozmezí 106 až 108 pfu. Objem dávky imunogenních prostředků a kočičích vakcín na bázi virového vektoru může být rovněž v rozmezí 0,1 až 2,0 ml, s výhodou v rozmezí 0,2 až 1,0 ml.
Souprava (kit) může obsahovat dávky vakcíny k vakcinaci jednoho zvířete nebo několika zvířat. Podle zvláštního provedení vynálezu obsahuje kit dvě dávky vakcíny na bázi plazmidu na jednu dávku vakcíny na bázi virového vektoru.
Vynález blíže objasňují, nijak však neomezují, následující příklady praktického provedení. Procenta jsou míněna vždy hmotnostně, pokud není uvedeno jinak.
Příklady uskutečnění vynálezu
Veškeré konstrukce se provádějí za použití standardních způsobů molekulární biologie (klonování, digesce restrikčními enzymy, syntéza DNA doplňkového jednoduchého vlákna, zesílení řetězce polymerázou, prodloužení oligonukleotidů polymerázou DNA), které popsal Sambrook J. a kol. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Všechny použité restrikční fragmenty pro tento vynález, stejně jako různé zesilují fragmenty řetězce polymerázou (PCR) jsou izolovány a čištěny za použití kitu „Geneclean®“ (BIO101 lne. La Jolla, CA).
Příklady uvádějí kmen FIV Villefranche IFFA 1/88 (Stefan A. M. a kol., J. Gen. Virol. 75, str. 3647 až 3653, 1994). Je zřejmé, že vynález může být aplikován na jiné kmeny FIV. Je například možno citovat kmen Petaluma (dostupný ve sbírce American Type Culture Collection (ATCC) pod číslem VR-1312 a nukleotidová sekvence od GenBank pod číslem M25381; gen env: nukleotidy 6266 až 8836; gen gag: nukleotidy 628 až 1980; gag/pro: nukleotidy 628 až 2336). Uvádí se také kmen NCSU1 od ATCC pod označením VR2333. Sodora a Bachmanna (Sodora D. L. a kol., J. Virol. 68(4), str. 2230 až 2238, 1994; Bachmann Μ. H. a kol., J. Virol 71(6), str. 4241 až 4253, 1997), popisují určitý počet kmenů FIV a přístup k sekvencím v genové bance GenBank. Například kmen FIV14 je označen NC 001482 v genové bance GenBank (gen env: nukleotidy 6266 až 8836, gen gag: nukleotidy 628 až 2336) kmen BM3070 je v genové bance GenBank pod označením AF474246 (gen env: nukleotidy 6272 až 8833, gen gag: nukleotidy 634 až 1986), gen OMA je v genové bance GenBank pod označením U56928 (gen env: nukleotidy 6506 až 9097, gen gag: nukleotidy 679 až 2179).
Pracovník v oboru je schopen určit sondy PCR ke klonování genů z žádaného kmene FIV. Sondy PCR použité v následujících příkladech ke klonování env, gag/pro, rev a tat z kmene Villefranche je možno použít spolu s jinými kmeny, jako Petaluma, nebo přizpůsobit, pokud je to užitečné.
Příklad 1: Kultura viru FIV
K zesílení se viry imunitní nedostatečnosti kočkovitých šelem kmene Villefranche IFFA 1/88 kultivují na buňkách Q201 (pomocné lymfocyty T kočkovitých šelem, Villet B. a kol., J. Gen. Virol. 78, str. 611 až 618, 1997).
Buňky Q201 se kultivují v misce 25 cm2 v prostředí Eagle-MEM, doplněném 2 mM glutaminu, 10 % hovězího séra, 100 Ul/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu a 100 Ul/ml lidského rekombinantního interleukinu-2, obsahujícího přibližně 100 000 buněk na ml. Buňky se kultivují při teplotě 37 °C.
Po třech dnech buněčná vrstva sline. Kultivační prostředí se tedy nahradí a virus FIV se přidá v dávce 5 pfu/buňka.
Jakmile se cytopatogenní jev (CPE) ukončí, (obvykle 48 až 72 hodin po začátku zavedení do kultury) virové suspenze se shromáždí, pak se vyčeří odstředěním a zmrazí se na teplotu -80 °C. Obvykle jsou nutné 3 až 4 postupné průchody k produkci virové partie. Partie virů se uloží při teplotě -80 °C.
Příklad 2: Extrakce virové RNA FIV
Virová RNA, obsažená ve 100 ml virové suspenze kmene FIV Villefranche, se extrahuje po rozmražení roztoky kitu „High Pure™ Viral RNA Kit“ (Cat # 1 858 882, Roche Molecular Biochemicals) podle instrukcí dodavatele pro etapu extrakce. Získaná sraženina RNA na konci extrakce se znovu suspenduje v 1 až 2 ml destilované sterilní vody bez RNázy.
Příklad 3: Konstrukce plazmidu pPB371
DNA komplementární (DNAc) pro FIV se syntetizuje za použití kitu „Gene Amp RNA PCR Kit“ (Cat # N 808 0017, Perkin/Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) za podmínek stanovených dodavatelem.
Reakce inversní transkripce následovaná zesílením řetězce (Reakce „RT-PCR“) se provede s 50 μΐ suspenze virové RNA FIV (příklad 2) a s následujícími oligonukleotidy:
FC116 (36 mer) (SEQ ID NO:1) 'TTTTTTCTGCAGCAATAAGAATGGCAGAAGGATTTG3' a FC117 (36 mer)(SEQ ID NO:2)
TCGCACCTGAAACATCTCGAGTGTTTCCACATGTAT3
Dvojice oligonukleotidů umožňuje začlenění restrikčního místa Pstl, restrikčního místa Xhol a počátečního kodónu ATG v insertu 5'.
Syntéza prvního vlákna DNA se provede prodloužením oligonukleotidu FC117 po jeho hybridizaci na matrici RNA.
Podmínky syntézy prvního vlákna DNA jsou 15 minut na teplotě 42 °C, pak 5 minut na teplotě 99 °C a nakonec 5 minut na teplotě 4 °C. Podmínky reakce PCR v přítomnosti dvojice oligonukleotidů FC116 a FC117 jsou 2 minuty na teplotě 95 °C, pak 40 cyklů (30 sekund na teplotě 95 °C, pak 45 sekund na teplotě 50 °C a 3 minuty na teplotě 72 °C) a nakonec 7 minut na teplotě 72 °C k získání fragmentu 1476 pb. Tento fragment se digeruje s restrikčním enzymem Pstl pak s restrikčním enzymem Xhol k izolaci, po elektroforéze na agarovém gelu, fragmentu Pstl Xhol přibližně 1450 pb. Tento fragment se označuje A.
- o CZ 305257 B6
Druhá reakce inversní transkripce následovaná zesilovací reakcí řetězce (Reakce „RT-PCR“) se provede s 50 μΐ suspenze virové RNA FIV (příklad 2) a s následujícími oligonukleotidy:
FC118 (36 mer) (SEQ ID NO:3) 'ATACATGTGGAAACACTCGAGATGTTTCAGGTGCGA3' a FC119 (54 mer) (SEQ ID NO:4)
5'TTTTTTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCTGAGATACTTCATCATTCCT
CCTC3'
Tato dvojice oligonukleotidů umožňuje začlenění restrikčního místa Xhol, restrikčního místa BamHI a koncového kodónu v insertu 3'.
Syntéza prvního vlákna cDNA se provádí prodloužením oligonukleotidu FC118 po jeho hybridiio zaci na matrici RNA.
Podmínky syntézy prvního vlákna cDNA jsou 15 minut na teplotě 42 °C, pak 5 minut na teplotě 99 °C a nakonec 5 minut na teplotě 4 °C. Podmínky reakce PCR v přítomnosti dvojice oligonukleotidů FC118 a FC119 jsou 2 minuty na teplotě 95 °C, pak 40 cyklů 130 sekund na teplotě
95 °C, pak 45 sekund na teplotě 50 °C a 3 minuty na teplotě 72 °C) a nakonec 7 minut na teplotě °C k získání fragmentu 1193 pb.
Tento fragment se digeruje s restrikčním enzymem Xhol pak s restrikčním enzymem BamHI k izolaci, po elektroforéze na agarovém gelu, fragmentu Xhol-BamHI přibližně 1170 pb. Tento fragment se označuje B.
Fragmenty A a B se ligují s expresním plazmidem eukaryotu pVR1012 (obr. 1 a příklad 7 dokumentu WO-A 98/03 199; Hartikka J. a kol., Human Gene Therapy 7, str. 1205 až 1217, 1997) předběžně digerovaným Xbal a EcoRI k získání plazmidu pPB371 (7467 pb). Tento plazmid obsahuje za řízení raného promotoru lidského cytomegaloviru nebo hCMV-IE (lidský Cytomegalovirus Immediate Early), insert kódující protein env FIV.
Příklad 4: Konstrukce plazmidu pPB374
DNA komplementární (cDNA) pro FIV se syntetizuje za použití kitu „Gene Amp RNA PCR Kit“ (Cat # N 808 0017, Perkin/Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) za podmínek stanovených dodavatelem.
Reakce inversní transkripce následovaná zesílením řetězce (Reakce „RT-PCR“) se provede s 50 μΐ suspenze virové ARV FIV (příklad 2) a s následujícími oligonukleotidy:
PB670 (37 mer) (SEQ ID NO:5)
TTTGTCGAC AAGGTAGGAGAGAGATTCTAC AGC AAC ATG3'
PB674 (40 mer)(SEQ ID NO:6) 'TTTGCGGCCGCGTTATTGAGCCAFTACTAACCTAATATTG3'
Tato dvojice oligonukleotidů umožňuje začlenění restrikčního místa Sall, restrikčního místa Notl a počátečního kodónu ATG v insertu 5' a ukončení kodónu v insertu 3'.
Syntéza prvního vlákna DNA se provede prodloužením oligonukleotidu PB674 po jeho hybridizaci na matrici RNA.
Podmínky syntézy prvního vlákna DNA jsou 15 minut na teplotě 42 °C, pak 5 minut na teplotě
99 °C a nakonec 5 minut na teplotě 4 °C. Podmínky reakce PCR v přítomnosti dvojice oligonukleotidů PB670 a PB674 jsou 2 minuty na teplotě 95 °C, pak 40 cyklů (30 sekund na teplotě 95 °C, pak 45 sekund na teplotě 50 °C a 3 minuty na teplotě 72 °C) a nakonec 7 minut na teplotě 72 °C k získání fragmentu 1758 pb.
ío Tento fragment se digeruje s restrikčním enzymem Sall pak s restrikčním enzymem Notl k izolaci, po elektroforéze na agarovém gelu, fragmentu Call-Notl přibližně 1750 pb. Tento fragment je vázán na expresní plazmid pVR1012 (příklad 3) předběžně digerovaný Sall a Notl k získání plazmidů pPB374 (6633 pb). Tento plazmid obsahuje za řízení raného promotoru hCMV-IE insert kódující protein gag/pro FIV.
Příklad 5: Konstrukce plazmidů pPB375
DNA komplementární (DNAc) s FIV se syntetizuje za použití kitu „Gene Amp RNA PCR Kit“ (Cat # N 808 0017, Perkin/Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) za podmínek stanovených dodavatelem.
Reakce inversní transkripce následovaná zesílením řetězce (Reakce „RT-PCR“) se provede s 50 μΐ suspenze virové RNA FIV (příklad 2) a s následujícími oligonukleotidy:
FC116 (36 mer) (SEQ ID NO:1) a FC120 (48 mer)(SEQ ID NO:7) 'TTTTTACCTGCATTTCCTTCTTCCCAGTTTTACCTCTTGAATTTCGTTC3'
Tato dvojice oligonukleotidů umožňuje začlenění restrikčního místa Pstl, restrikčního místa BspMI a počátečního kodónu ATG v insertu 5'.
Syntéza prvního vlákna DNA se provede prodloužením oligonukleotidu FC120 po jeho hybridizaci na matrici RNA.
Podmínky syntézy prvního vlákna cDNA jsou 15 minut na teplotě 42 °C, pak 5 minut na teplotě
99 °C a nakonec 5 minut na teplotě 4 °C. Podmínky reakce PCR v přítomnosti dvojice oligonukleotidů FC116 a FC120 jsou 2 minuty na teplotě 95 °C, pak 40 cyklů (30 sekund na teplotě 95 °C, pak 45 sekund na teplotě 50 °C a 3 minuty na teplotě 72 °C) a nakonec 7 minut na teplotě 72 °C k získání fragmentu 265 pb.
Tento fragment se digeruje s restrikčním enzymem Pstl pak s restrikčním enzymem BspMI k izolaci, po elektroforéze na agarovém gelu, fragmentu Pstl-BspMI přibližně 240 pb. Tento fragment se označuje C.
Druhá reakce inversní transkripce následovaná zesílením řetězce (Reakce „RT-PCR“) se provede s 50 μΐ suspenze virové RNA FIV (příklad 2) a s následujícími oligonukleotidy:
PB672 (48 mer) (SEQ ID NO:8)
5'TTTACTGGA AGAAGG A AAT
GCAGGTAAAAGGAAAAGACAAAGAAGAAG3' a PB673 (36 mer)(SEQ ID NO:9) 5 'TTTAGATCTTTAGTCCATAAGCATTCTTTCTATTTC3'
Tato dvojice oligonukleotidů umožňuje začlenění restrikčního místa BspMI, restrikčního místa BglII a ukončení kodónu v insertu 3'.
Syntéza prvního vlákna cDNA se provede prodloužením oligonukleotidu PB673 po jeho hybridizaci na matrici RNA.
Podmínky syntézy prvního vlákna cDNA jsou 15 minut na teplotě 42 °C, pak 5 minut na teplotě 99 °C a nakonec 5 minut na teplotě 4 °C. Podmínky reakce PCR v přítomnosti dvojice oligonukleotidů PB672 a PB674 jsou 2 minuty na teplotě 95 °C, pak 40 cyklů (30 sekund na teplotě 95 °C, pak 45 sekund na teplotě 50 °C a 3 minuty na teplotě 72 °C) a nakonec 7 minut na teplotě 72 °C k získání fragmentu 246 pb.
Tento fragment se digeruje s restrikčním enzymem BspMI pak s restrikčním enzymem BglII k izolaci, po elektroforéze na agarovém gelu, fragmentu BspMI-BglII přibližně 230 pb. Tento fragment se označuje D.
Fragmenty C a D se ligují s expresním plazmidem pVR1012 (příklad 3) předběžně digerovaném s restrikčními enzymy Pstl a BglII k získání plazmidu pB375 (5316 pb). Tento plazmid obsahuje za řízení raného promotoru hCMV-IE insert kódující protein rev FIV.
Příklad 6; Konstrukce plazmidu pPB383
DNA komplementární (cDNA) s FIV se syntetizuje za použití kitu „Gene Amp RNA PCR Kit“ (Cat # N 808 0017, Perkin/Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) za podmínek stanovených dodavatelem.
Reakce inversní transkripce následovaná zesílením řetězce (Reakce „RT-PCR“) se provede s 50 μΐ suspenze virové RNA FIV (příklad 2) a s následujícími oligonukleotidy:
PB680 (29 mer) (SEQ ID NO; 10)
5'TTTCTGCAGATGGAAGACATAATAGTATT3' a PB681 (32 mer) (SEQ ID NO: 11) 'TTTAGATCTCTAAGCAGTAGTTATTGATAATG3
Tato dvojice oligonukleotidů umožňuje začlenění restrikčního místa BglII, restrikčního místa Pstl a počátečního kodónu ATG v insertu 5' a v koncovém kodónu insertu 3'.
Syntéza prvního vlákna DNAc se provede prodloužením oligonukleotidu PB681 po jeho hybridizaci na matrici RNA.
Podmínky syntézy prvního vlákna cDNA jsou 15 minut na teplotě 42 °C, pak 5 minut na teplotě 99 °C a nakonec 5 minut na teplotě 4 °C. Podmínky reakce PCR v přítomnosti dvojice oligonukleotidů PB680 a PB681 jsou 2 minuty na teplotě 95 °C, pak 40 cyklů (30 sekund na teplotě °C, pak 45 sekund na teplotě 50 °C a 1 minuty na teplotě 72 °C) a nakonec 7 minut na teplotě 72 °C k získání fragmentu 254 pb.
Tento fragment se digeruje s restrikčním enzymem Pstl pak s restrikčním enzymem BglII k izolování, po elektroforéze na agarovém gelu, fragmentu Pstl—BglII přibližně 240 pb. Tento fragment (fragment E) se liguje s expresním plazmidem pVR102 (příklad 3) předběžně digerovaný s restrikčními enzymy Pstl a BglII k získání plazmidu pPB383 (5089 pb). Tento plazmid obsahuje za řízení raným promotorem hCMV-IE insert kódující protein tat FIV.
Příklad 7: Konstrukce rekombinantních virů vCP242, vCP253 a vCP255
V dokumentu WO-A 98/21 354 je podrobně popsán způsob získávání rekombinantních virů vCP242, vCP253 a vCP255 v příkladech 1, 2 a 4.
Rekombinovaný vir v CP242 obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující protein env kmene Villefranche FIV za řízení promotoru H6 viru vakcíny a insertovanou do místa C6 viru kanářích neštovic ALVAC.
Rekombinantní vir vCP253 obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující protein gag/pro kmene Villefranche FIV za řízení promotoru 13L viru vakcíny a insertovanou do místa C6 viru kanářích neštovic ALVAC.
Rekombinantní vir vCP255 obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující protein env kmene Villefranche FIV za řízení promotoru H6 viru vakcíny a nukleotidové sekvence kódující proteiny gag/pro kmene Villefranche FIV za řízení promotoru 13L viru vakcíny, oba insertované za řízení promotoru 13L viru vakcíny do místa C6 viru kanářích neštovic ALVAC.
Příklad 8: Konstrukce donorového plazmidu kinserci do místa C5 viru kanářích neštovic ALVAC
Obr. 16 v US 5 756 103 objasňuje sekvenci fragmentu 3199 pb genomové DNA viru kanářích neštovic. Analýzou této sekvence se zjistil otevřený čtecí rámec (COL), nazvaný C5L, který začíná v poloze 1538 a končí v poloze 1859. Konstrukce insertního plazmidu, končící na deleci COL C5L a na jeho náhradě místem násobného klonování sousedící s ukončujícími signály transkripce a transdukce se provádí dále popsaným způsobem:
Reakce PCR se realizuje z matrice tvořené genomovou DNA viru kanářích neštovic a s následujícími oligonukleotidy: C5A1 (42 mer) (SEQ ID NO 12)
5' ATCATCGAGCTCCAGCTGTAATTCATGGTCGAAAAGAAGTGC3'. a FC121 (79 mer)(SEQ ID NO:13)
5'GAATTCCTCGAGAGATCTCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCA TTTTTTGAG AGTACCACTTCAGCTACCTC3' k izolování fragmentu PCR 229 pb (fragmentu B).
Reakce PCR se realizuje z matrice tvořené genomovou DNA viru kanářích neštovic a s následujícími oligonukleotidy:
Ί
FC122 (78 mer) (SEQ ID NO: 14)
5'CCCGGGCTGCAGAGATCTCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTC ATTATAAA GATCTAAAATGCATAATTTC3' a C5D1 (45 mer) (SEQ ID NO: 15)
GATGATGGTACCGTAAACAAATATAATGAAAAGTATTCTAAACTA3 k izolování fragmentu PCR 488 pb (fragmentu C).
Fragmenty B a C se hybridizují společně, aby sloužily jako matrice pro reakci PCR realizovanou s oligonukleotidy C5A1 (SEQ ID NO:12) a C5D1 (SEQ ID NO:15) k vytvoření fragmentu 693 pb. Tento fragment se digeruje s restrikčním enzymem Sací a Kpnl k izolaci, po elektroforéze na agarovém gelu, fragmentu Sack-Kpnl 676 pb. Tento fragment se liguje s vektorem pBlueScript®II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA Cat # 212205), předběžně digerovaným s restrikčními enzymy Sací a Kpnl k získání plazmidů pFC115. Sekvence tohoto plazmidů se ověřuje sekvenací. Tento plazmid obsahuje 166 pb sekvencí umístěných nad COL C5L („rameno sousedící vlevo od C5“), vakcinový signál raného ukončení transkripce koncových kodónů v šesti fázích čtení, místa násobného klonování obsahující restrikční místa Smál, Pstl, BglII, Xhol a EcoRI a 425 pb sekvencí umístěných pod COL C5L („rameno sousedící vpravo od C5“).
Plazmid pMP528HRH (Perkus M. a kol., J. Virol. 63, str. 3829 až 3836, 1989) se použije jako matrice k zesílení úplné sekvence promotoru vakcíny H6 (registrační číslo GenBank M28351) s následujícími oligonukleotidy:
JCA291 (34 mer) (SEQ ID NO: 16)
5' AAACCCGGGTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG3' a JCA292 (43 mer) SEQ ID NO: 17)
5' AAAAGAATTCGTCGACTACGATACAAACTTAACGGATATCGCG3' k zesílení fragmentu PCR 149 pb. Tento fragment se digeruje s restrikčními enzymy Smál a EcoRI k izolaci, po elektroforéze na agarovém gelu, restrikčního fragmentu SmalEcoRI 138 pb. Tento fragment se váže na plazmid pFC115, předběžně digerovaný se Smál a s EcoRI, k získání plazmidů pFCl 16.
Příklad 9: Konstrukce donorového plazmidů k inserci do místa C6 viru kanářích neštovic ALVAC
Obr. 4 v dokumentu WO-A 01/05 934 objasňuje sekvenci fragmentu 3700 pb genomové DNA viru kanářích neštovic. Analýzou této sekvence se zjistil otevřený čtecí rámec (COL), nazvaný C6L, který začíná v poloze 377 a končí v poloze 2254. Konstrukce insertního plazmidů vedoucí k deleci COL C6L a na jeho náhradě místem násobného klonování sousedící s ukončujícími signály transkripce a transdukce se provádí dále popsaným způsobem:
Reakce PCR se realizuje z matrice tvořené genomovou DNA viru kanářích neštovic a s následujícími oligonukleotidy:
- 14 CZ 305257 B6
C6A1 (42 mer) (SEQ ID NO: 18)
5'ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT3' a FC123 (79 mer) (SEQ ID NO:19)
5'GAATTCCTCGAGAGATCTCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTA GTCATTTTTTCGTA AGTAAGTATTTTTATTTAA3' k izolování fragmentu PCR 438 pb (fragment D).
Reakce PCR se realizuje z matrice tvořené genomovou DNA viru kanářích neštovic a s následujícími oligonukleotidy:
FC124 (78 mer) (SEQ ID NO:20)
5'CCCGGGCTGCAGAGATCTCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACT AGTC AAATGA GTATATATAATTGAAAAAGTAA3' a C6D1 (45 mer) (SEQ ID NO:21)
5'GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG3 k izolování fragmentu PCR 1216 pb (fragment E).
Fragmenty D a E se hybridizují společně, aby sloužily jako matrice pro reakci PCR realizovanou s oligonukleotidy C6A1 (SEQ ID NO: 18) a C6D1 (SEQ ID NO:21) k vytvoření fragmentu PCR 1642 pb. Tento fragment se digeruje s restrikčním enzymem Sací a s Kpnl k izolaci, po elektroforéze na agarovém gelu, fragmentu Sacl-Kpnl 1625 pb. Tento fragment se váže s vektorem pBlueScript®II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA Cat # 212205), předběžně digerovaným s restrikčními enzymy Sací a Kpnl, k získání plazmidů pFCl 17. Sekvence tohoto plazmidů se ověřuje sekvenací. Tento plazmid obsahuje 370 pb sekvencí umístěných nad COL C6L („rameno sousedící vlevo od C6“), vakcinový signál zastavení transkripce koncových kodónů v šesti fázích čtení, místa násobného klonování obsahující restrikční místa Smál, Pstl, BglII, Xhol a EcoRI a nakonec 1156 pb sekvencí umístěných pod COL C6L („rameno sousedící vpravo od C6“).
Plazmidů pMPIVC (Schmidt J. F. C a kol., J. Virol. 62, str. 1889 až 1897, 1988; Saiki R. K. a kol., Science 239, str. 487 až 491, 1988) se použije jako matrice k zesílení úplné sekvence promotoru vakcíny 13L s následujícími oligonukleotidy:
FC112 (33 mer) (SEQ ID NO:22) 5'AAACCCGGGCGGTGGTTTGCGATTCCGAAATCT3' a FC113 (43 mer) (SEQ ID NO:23) 'AAAAGAATTCGGATCCGATTAAACCTAAATAATTGTACTTTGT3' k zesílení fragmentu PCR 151 pb. Tento fragment se digeruje s restrikčními enzymy Smál a EcoRI k izolaci, po elektroforéze na agarovém gelu, restrikčního fragmentu SmalEcoRI 136 pb. Tento fragment se liguje na plazmid pFC117, předběžně digerovaný se Smál a EcoRI, k získání plazmidů pFCl 18.
- 15 CZ 305257 B6
Příklad 10: Konstrukce rekombinantního viru vCP1719
Fragmenty C a D (příklad 5) se ligují na plazmid pFClló (příklad 8) předběžně digerovaný s restrikčními enzymy Pstl a Bglll k získání plazmidu pFCl 19.
Fragment E (příklad 6) se liguje na plazmid pFCl 18 (příklad 9) předběžně digerovaný s restrikčními enzymy Pstl a Bglll k získání plazmidu pFCl20.
Plazmid pFCl20 se linearizuje prostřednictvím Notl, pak se transfekuje do embryonálních primárních buněk kuřat očkovaných virem kanářích neštovic (kmen ALVAC) dříve popsanou technikou vysrážení na fosforečnanu vápenatém (Panicali a Paoletti, Proč. Nat. Aad. Sci, 79, str. 4927 až 4931, 1982; Piccini a kol., Methods of Enzymology 153, str. 545 až 563 1987. Vydavatelé Wu R. a Grossman L. Academie Press.) Pozitivní úseky se selektují na bázi hybridizace specifickou značkovací radiosondou nukleotidové sekvence proteinu tat. Tyto úseky se podrobí čtyřem následným cyklům selekce/čištění až do izolování čisté populace buněk. Jeden reprezentativní úsek rekombinace in vitro mezi donorovým plazmidem pFCl20 a genomem viru kanářích neštovic ALVAC se pak zesílí a získaná zásoba rekombinantního viru se označí v CPI719.
Případně se získané rekombinantní viry využijí pro druhou transfekci v primárních buňkách kuřecích embryí v přítomnosti plazmidu pFCl 19 linearizovaného Notl technikou vysrážení na fosforečnanu vápenatém. Pozitivní úseky se rozdělí na bázi hybridizace specifickou značkovací radiosondou nukleotidové sekvence proteinu rev. Tyto úseky se podrobí čtyřem následným cyklům selekce/čištění až do izolování čisté populace buněk. Jeden reprezentativní úsek rekombinace in vitro mezi donorovým plazmidem pFCl 19, pFCl20 a genomem viru kanářích neštovic ALVAC se pak zesílí a získaná zásoba rekombinantního viru se označí vCP1720.
Příklad 11: Konstrukce plazmidu pJP090
Kočičí krev se shromáždí ve zkumavce obsahující EDTA jedním odběrem z krční tepny. Mononukleové buňky se shromáždí odstředěním na gradientu Ficoll, pak se vnesou do kultury v Petriho misce o průměru 60 mm. Mononukleové kočičí buňky v kultuře se stimulují buď concanavalinem A(conA) (konečná koncentrace přibližně 5 pg/ml), nebo fyto-hemaglutininem (PHA) (konečná koncentrace přibližně 10 pg/ml). Po stimulaci se lymfoblasty „ConA“ a „PHA“ shromáždí odškrabáním z kultivačních misek a celková RNA těchto buněk se extrahuje za použití kitu „mRNA isolatin kit for White Bllood Cells“ (Boehringer Mannheim/Roche Cat # 1 934 325).
Celková RNA extrahovaná z kočičích lymfocytů stimulovaných ConA nebo PHA slouží jako matrice pro syntézu prvního vlákna doplňkové AND. Tato první doplňková větev RNA se získá prodloužením oligonukleotidu p(dT)15 (Boehringer Mannheim/Roche Cat # 814 270). Získaná jednoduchá větev doplňkové DNA se pak použije jako matrice pro reakci PCR s následujícími oligonukleotidy:
FC125 (48 mer)(SEQ ID NO:24)
5'TTTTTTGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTGCTTTTCCTGGGC3' a FC126(5O mer)(SEQ ID NO:25)
TTTTTTGCGGCCGCTACGTATCACTTCTTGACTGGTTTCCAGCAGTCAAA 3' k zesílení fragmentu PCR přibližně 473 párů bází (pb). Tento fragment se čistí elektroforézou a na agarovém gelu. Tento fragment se digeruje s Notl a takto získaný fragment Notl-Notl přiCZ 305257 B6 bližně 453 pb se liguje na plazmid pVR1012 (příklad 3), předběžně digerovaný s Notl, k získání plazmidu pJP090 (5365 pb). Ověří se orientace insertu v pJP090. Fragment Notl-Notl, klonovaný na tomto plazmidu, se úplně rozdělí na sekvence. Tato sekvence (SEQ ID NO 26), která kóduje protein 144 aminokyselin (SEQ ID NO 27) je kočičí cytokin GM-CFS.
Příklad 12: Produkce vakcíny DNA
Roztok DNA obsahující plazmid pPB371 (příklad 3), se koncentruje ethanolovým vysrážením, jak popsal Sambrook a kol. (1989). Sraženina DNA se vyjme 1,8% roztokem chloridu sodného k získání koncentrace 1 mg/ml. Roztok DMRIE-DOPE 0,75 mM se připraví vyjmutím lyofilizátu DMRIE-D0PE na objem doplněný sterilní vodou.
Vytvoření komplexu plazmidové-lipidové DNA se provede zředěním stejných podílů roztoku 0,75 mM DMRIE-DOPE (1:1) roztokem DNA na 1 mg/ml v 1,8% roztoku chloridu sodného. Roztok DNA se zavádí postupně sterilní injekční jehlou 26G po stěně baňky obsahující roztok kationtového lipidu, k zabránění pěnění. Mírným mícháním se dosáhne smísení obou roztoků. Získá se konečný prostředek obsahující 0,375 mM DMRIE-DOPE a 500 pg/ml plazmidu.
Je žádoucí, aby soubor užitých roztoků zůstával na teplotě okolí pro dále popsané operace. Komplex DNA/DMRIE-DOPE se nechá vychladnout na teplotu okolí 30 minut před postupem imunizace zvířat.
Vakcíny DNA se mohou také připravovat z roztoků DNA obsahujících plazmidy pPB374 (příklad 4), pPB375 (příklad 5), pPB383 (příklad 6), pJP090 (příklad 11) nebo směsí alespoň dvou těchto pěti plazmidů technikou popsanou v tomto příkladu.
Příklad 13: Test exprese in vitro
Exprese proteinů FIV se testuje pro každou konstrukci klasickými způsoby nepřímé imunofluorescence a Western Blot.
Testy se provádějí na Petriho miskách obsahujících buňky CHO kultivované na monovrstvách a transfektovaných plazmidy nebo obsahujících buňky CEF kultivované v monovrstvě a infikované rekombinantními viry.
Detekce proteinů FIV se provádí použitím séra infikovaných koček a značených antisér.
Forma získaných fragmentů po migraci na agarovém gelu se porovnává s očekávanou.
Příklad 14: Účinnost na zvířatech
Kočky Elillgrove (Biological Laboratories Europe Ltd.) EOPS a bez protilátek anti-FIV ve stáří přibližně 12 měsíců se nahodile rozdělí do skupin po 6 zvířatech.
Kočky první skupiny (skupiny A) se vakcinují dne 0 a dne 28 intramuskulámím podáním 1 ml směsi plazmidů pPB371 (příklad 3) a pPB374 (příklad 4) pak opakovaným podáním dne 56 intramuskulámě 1 ml rekombinantního viru vCP255 (příklad 7) 108,° TCID5o/ml.
Kočky druhé skupiny (skupiny B) se vakcinují dne 0 a dne 28 intramuskulámím podáním 1 ml směsi plazmidů pPB371 a pPB374, formulované DMRIE-DOPE (příklad 12), pak opakovaným podáním dne 56 intramuskulámě 1 ml rekombinantního vím vCP 255 (příklad 7) 108° TCIDjo/ml.
Koncentrace celkové DNA ve vakcínách DNA je 200 pg/ml a 100 pg/ml pro každý plazmid obsažený ve směsi. Molový poměr lipid/DNA pro vakcíny DNA formulované s DMRIE-DOPE je 0,25.
Třetí skupina (kontrolní) je ověřovací skupina (bez vakcinace zkouška dne 84).
Všechny kočky se testují dne 84 intra-peritoneálním podáním 1 ml pathogenního viru FIV (kmen Pataluma) 25 CID50/ml (CID je infekční dávka 50 % na kočku).
Pozoruje se jednak viremie vyhodnocená izolací viru a PCR odezva na protilátky.
Virový rozbor 4 týdny po zkoušce až 16 týdnů (počet zvířat znamená pozitivní viremii):
| skupiny | virový rozbor | PCR |
| skupina A | 2/6 | 2/6 |
| skupina B | 3/6 | 2/6 |
| kontrola | 6/6 | 5/6 |
Virový rozbor se provádí ko-kulturou přibližně 5x106 mononukleových buněk periferní krve (PBMC) s přibližně 106 buněk MYA-1 v prostředí RPMI 1640 během 21 dní. Přítomnost DNA protivirové FIV obsažené v buňkách PBMC se identifikují PCR.
Pozoruje se absence viremie u 67 % zvířat skupiny A a 50 % skupiny B.
Buněčná odezva v den zkoušky a 4 týdny po zkoušce (počet zvířat vykazujících pozitivní odezvu CTL):
| Zjištěný antigen | Gag | Gag | Env | Env |
| týden 0 | týden 4 | týden 0 | týden 4 | |
| skupina A | 1/6 | 4/6 | 0/6 | 2/6 |
| skupina B | 2/6 | 6/6 | 2/6 | 0/6 |
| kontrola | 0/5* | 2/6 | 0/5* | 0/6 |
*: zkoušku nebylo možno realizovat u jednoho zvířete
Kožní fibroblasty se odeberou biopsií u každé kočky. Fibroblasty jsou označeny 51Cr a pak infikovány rekombinantní vakcínou exprimující buď env, nebo gag v přítomnosti PBMC pocházející od každé kočky. Cytokinová odezva (CTL) se měří uvolněním 5lCr.
Pozoruje se, že vakcinace stimuluje („effekt priming“) cytotoxickou odezvu pro skupiny vakcinovaných, zvířat obzvláště pro gag.
Humorální odezva po zkoušce (počet zvířat majících pozitivní serologickou odezvu v ELISA anti-TM):
| týden | 0 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 |
| skupina A | 0/6 | 3/6 | 4/6 | 3/6 | 3/6 | 5/6 |
| skupina B | 0/6 | 3/6 | 5/6 | 5/6 | 4/6 | 6/6 |
| kontrola | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 3/6 | 5/6 | 5/6 |
Jde o zkoušku ELISA ke kvantifikování protilátek s využitím peptidu odpovídajícího hlavnímu epitopu transmembrálního proteinu (TM).
Vakcinace stimuluje („effect priming“) imunitní humorální odezvu.
Připomíná se, že není záměrem omezovat vynález na uvedená zvláštní a příkladná provedení, která ho toliko objasňují. Jiné varianty v rámci a v duchu vynálezu jsou možné.
Průmyslová využitelnost
Složky soupravy pro vakcinaci proti viru imunitní nedostatečnosti kočkovitých šelem.
Seznam sekvencí <110>Merial <120> Očkování proti viru imunitní nedostatečnosti kočkovitých šelem <130> FIV prime/boost t<160> 25 <170> Patentln verze 3.1 <210> 1<211> 36<212> DNA<213> Artifícial<400> 1 ttttttctgc agcaataaga atggcagaag gatttg 36 <210> 2<211> 36<212> DNA<213> Artificial<400> 2 tcgcacctga aacatctcga gtgtttccac atgtat 36 <210 3<211> 36<212> DNA<213> Artificial<400> 3 atacatgtgg aaacactcga gatgtttcag gtgcga 36 <210 4<211> 54<212> DNA<213> Artificial<400> 4 ttttttggat cccccgggct gcaggaattc tgagatactt catcattcct cctc 54 <210> 5<211> 37<212> DNA<213> Artificial<400> 5 tttgtcgaca aggtaggaga gattctacag caacatg 37 <210 6<211> 40<212> DNA<213> Artifícial<400> 6 tttgcggccg cgttattgag ccattactaa cctaatattg 40 <210> 7<211> 48<212> DNA<213> Artificial<400> 7 tttttacctg catttccttc ttccagtttt acctcttgaa tttcgttc 48 <210> 8<211> 48<212> DNA<213> Artificial<400> 8 tttactggaa gaaggaaatg caggtaaaag gaaaagacaa agaagaag 48 <210> 9<211> 36<212> DNA<213> Artificial<400> 9 tttagatctt tagtccataa gcattctttc tatttc 36 <210> 10<211> 29<212> DNA<213> Artificial<400> 10 tttctgcaga tggaagacat aatagtatt 29 <210> 11<211> 32<212> DNA<213> Artifícial<400> 11 tttagatctc taagcagtag ttattgataa tg 32 <210> 12<211> 42<212> DNA<213> Artifícial<400> 12 atcatcgagc tccagctgta attcatggtc gaaaagaagt gc 42 <210> 13<211> 79<212> DNA<213> Artificial<400> 13 gaattcctcg agagatctct gcagcccggg tttttatagc taattagtca ttttttgaga 60 gtaccacttc agctacctc 79 <210 14<211> 78<212> DNA<213> Artíficial<400> 14 cccgggctgc agagatctct cgaggaattc tttttattga ttaactagtc attataaga 60 tctaaaatgc ataatttc 78 <210> 15<211> 45<212> DNA<213> Artificial<400> 15 gatgatggta ccgtaaacaa atataatgaa aagtattcta aacta 45 <210> 16<211> 34<212> DNA<213> Artificial<400 16 aaacccgggt tctttattct atacttaaaa agtg 34 <210 17<211> 43<212> DNA<213> Artificial<400> 17 aaaagaattc gtcgactacg atacaaactt aacggatatc gcg 43 <210> 18<211> 42<212> DNA<213> Artificial<400> 18 atcalcgagc tcgcggccgc ctatcaaaag tcttaatgag tt 42 <210> 19<211> 79<212> DNA<213> Artificial<400> 19 gaaltcctcg agagatctct gcagcccggg tttttatagc taattagtca ttttttcgta 69 agtaagtatt tttatttaa 70 <210> 20<211> 78<212> DNA<213> Artificial<400> 20 cccgggctgc agagatctct cgaggaattc tttttattga ttaactagtc aaatgagtat 60 atataattga aaaagtaa 78 <210> 21<211> 45<212> DNA<213> Artificial<400> 21 gatgatggta ccttcataaa tacaagtttg attaaactta agttg 45 <210> 22<211> 33<212> DNA<213> Artificial<400> 22 aaacccgggc ggtggtttgc gattccgaaa tet 33 <210> 23<211> 43<212> DNA<213> Artificial<400 23 aaaagaattc ggatccgatt aaacctaaat aattgtactt tgt 43 <210> 24<211> 48<212> DNA<213> Artificial<400> 24 ttttttgcgg ccgccaccat gtggctgcag aacctgcttt tcctgggc 48 <210> 25<211 > 50<212> DNA<213> Artifícial<400> 25 ttttttgcgg ccgctacgta tcacttcttg actggtttcc agcagtcaaa
Claims (19)
1. Souprava pro vyvolání imunitní odpovědi směrované proti FIV u kočky, vyznačující se tím, že obsahuje odděleně zabalenou
- první imunogenní kompozici obsahující ve farmaceuticky přijatelném nosiči nebo excipientů jeden plazmid exprimující in vivo FIV env a gag/pro nebo několik takových plazmidů, a
- druhou imunogenní kompozici obsahující ve farmaceuticky přijatelném nosiči nebo excipientů jeden atenuovaný virový vektor exprimujících in vivo FIV env a gag/pro nebo několik takových vektorů, přičemž jedním nebo několika atenuovanými virovými vektory je jeden atenuovaný vir kanářích neštovic nebo několik takových virů nebo jeden atenuovaný vir drůbežích neštovic nebo několik takových virů.
2. Souprava podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že první imunogenní kompozice a/nebo druhá imunogenní kompozice exprimuje nebo exprimují in vivo FIV tat.
3. Souprava podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že ateunovaný virový vektor je jedním atenuovaným virem kanářích neštovic nebo několika takovými viry.
4. Souprava podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 3, vyznačující se tím, že souprava obsahuje dávky imunogenních kompozic pro vyvolání imunitní odpovědi směřované proti FIV u jedné kočky nebo u několika koček.
5. Souprava podle kteréhokoliv z nároků laž4, vyznačující se tím, že souprava obsahuje dvě dávky imunogenní kompozice na bázi plazmidu na jednu dávku imunogenní kompozice na bázi atenuovaného virového vektoru.
6. Souprava podle kteréhokoliv z nároků laž5, vyznačující se tím, že imunogenní kompozice na bázi plazmidu a/nebo imunogenní kompozice na bázi atenuovaného virového vektoru obsahují adjuvant.
7. Souprava podle nároku 6, v y z n a č u j í c í se t í m , že adjuvantem je cytokin.
8. Souprava podle nároku 7, vyznačující se tím, že cytokinem je kočičí GM-CSF.
9. Souprava podle kteréhokoliv z nároků laž8, vyznačující se tím, že druhá imunogenní kompozice je určena k podávání jako posilovači dávka první imunogenní kompozice.
10. Souprava podle kteréhokoliv z nároků laž9, vyznačující se tím, že první a druhá imunogenní kompozice je určena k intramuskulámímu podávání.
11. Použití za prvé jednoho nebo několika plazmidů exprimujících in vivo FIV env a gag/pro, pro výrobu první imunogenní kompozice, která obsahuje jeden nebo několik takových plazmidů a farmaceuticky přijatelný nosič nebo excipient, pro primární podání kočce a za druhé jednoho atenuovaného virového vektoru exprimujícího in vivo FIV env a gag/pro nebo několika takových vektorů pro výrobu druhé imunogenní kompozice obsahující atenuovaný virový vektor nebo takové vektory a farmaceuticky přijatelný nosič nebo excipient, pro podání jako posilovači dávka stejné kočce v intervalu tří až šesti týdnů, přičemž první a druhá imunogenní kompozice se podá intramuskulámě a jedním atenuovaným virovým vektorem nebo několika takovými vektory je jeden nebo několik atenuovaných virů kanářích neštovic nebo jeden nebo několik atenuovaných virů drůbežích neštovic.
12. Použití jednoho plazmidů exprimujícího in vivo FIV env a gag/pro nebo několika plazmidů pro výrobu imunogenní kompozice obsahující jeden nebo několik takových plazmidů a farmaceuticky přijatelný nosič nebo excipient, pro vyvolání imunitní odpovědi směřované proti FIV u kočky, určené pro intramuskulámí podání kočce jako primární podání, a imunogenní kompozice obsahující jeden atenuovaný virový vektor exprimující in vivo FIV env a gag/pro nebo několik takových vektorů a farmaceuticky přijatelný nosič nebo excipient, která se podá po 3 až 6 týdnech jako posilovači dávka, kde jedním atenuovaným virovým vektorem nebo několika takovými vektory je jeden nebo několik atenuovaných virů kanářích neštovic nebo jeden nebo několik atenuovaných virů drůbežích neštovic.
13. Použití jednoho atenuovaného virového vektoru exprimujícího in vivo FIV env a gag/pro nebo několika takových vektorů pro výrobu druhé imunogenní kompozice obsahující jeden nebo několik atenuovaných virových vektorů a farmaceuticky přijatelný nosič nebo excipient, pro vyvolání imunitní odpovědi směřované proti FIV u kočky, určené pro intramuskulámí podání kočce jako posilovači dávka 3 nebo 6 týdnů po použití imunogenní kompozice obsahující jeden plazmid exprimující in vivo FIV env a gag/pro nebo několik takových plazmidů a farmaceuticky přijatelný nosič nebo excipient, kde jedním atenuovaným virovým vektorem nebo několika takovými vektory je jeden nebo několik atenuovaných virů kanářích neštovic nebo jeden nebo několik atenuovaných virů drůbežích neštovic.
14. Použití podle kteréhokoliv z nároků 11 až 13, při kterém plazmidem nebo plazmidy a a/nebo atenuovaný virový vektor nebo takové vektory exprimují in vivo FIV tat.
15. Použití podle nároku 14, při kterém atenuovaný virový vektor nebo takové vektory je jedním atenuovaným virem kanářích neštovic nebo několika takovými viry.
16. Použití podle nároku 15, při kterém dvě uvedené imunogenní kompozice jsou určeny pro podání v intervalu přibližně čtyř týdnů.
17. Použití podle kteréhokoliv z nároků 11 až 16, při kterém imunogenní kompozice na bázi plazmidů a/nebo imunogenní kompozice na bázi atenuovaného virového vektoru obsahuje adjuvant.
18. Použití podle nároku 17, při kterém adjuvantem je cytokin.
19. Použití podle nároku 18, při kterém cytokinem je kočičí GM-CSF.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0107275A FR2825280B1 (fr) | 2001-06-01 | 2001-06-01 | Vaccination contre le virus de l'immunodeficience feline |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20033229A3 CZ20033229A3 (cs) | 2004-03-17 |
| CZ305257B6 true CZ305257B6 (cs) | 2015-07-08 |
Family
ID=8863923
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2003-3229A CZ305257B6 (cs) | 2001-06-01 | 2002-05-29 | Souprava pro vyvolání imunitní odpovědi proti viru imunitní nedostatečnosti kočkovitých šelem |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1418941B9 (cs) |
| JP (1) | JP2004535406A (cs) |
| AT (1) | ATE473013T1 (cs) |
| AU (1) | AU2002314274B2 (cs) |
| BR (1) | BRPI0210229B1 (cs) |
| CA (1) | CA2448620C (cs) |
| CZ (1) | CZ305257B6 (cs) |
| DE (1) | DE60236943D1 (cs) |
| DK (1) | DK1418941T3 (cs) |
| ES (1) | ES2348226T3 (cs) |
| FR (1) | FR2825280B1 (cs) |
| PL (1) | PL210450B1 (cs) |
| PT (1) | PT1418941E (cs) |
| WO (1) | WO2002096349A2 (cs) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2545886A1 (en) | 2003-11-13 | 2005-06-02 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Methods of characterizing infectious bursal disease virus |
| US7862821B2 (en) | 2006-06-01 | 2011-01-04 | Merial Limited | Recombinant vaccine against bluetongue virus |
| WO2015031775A1 (en) | 2013-08-29 | 2015-03-05 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | Methods and compositions for rna-guided treatment of hiv infection |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995030019A1 (en) * | 1994-04-29 | 1995-11-09 | Pharmacia & Upjohn Company | Feline immunodeficiency virus vaccine |
| EP1074625A2 (en) * | 1999-06-14 | 2001-02-07 | Pfizer Products Inc. | DNA vaccine against feline immunodeficiency virus |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7255862B1 (en) * | 1996-11-14 | 2007-08-14 | Connaught Technology Corporation | ALVAC/FIV constructs |
| KR100768114B1 (ko) * | 1999-06-10 | 2007-10-17 | 메리알 | 애완 동물 및 스포츠용 동물을 위한 ｄｎａ 백신 |
-
2001
- 2001-06-01 FR FR0107275A patent/FR2825280B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-05-29 AT AT02740841T patent/ATE473013T1/de active
- 2002-05-29 DE DE60236943T patent/DE60236943D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-29 JP JP2002592862A patent/JP2004535406A/ja active Pending
- 2002-05-29 WO PCT/FR2002/001809 patent/WO2002096349A2/fr active Application Filing
- 2002-05-29 CA CA2448620A patent/CA2448620C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-29 PT PT02740841T patent/PT1418941E/pt unknown
- 2002-05-29 DK DK02740841.8T patent/DK1418941T3/da active
- 2002-05-29 ES ES02740841T patent/ES2348226T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-29 EP EP02740841A patent/EP1418941B9/fr not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-29 BR BRPI0210229A patent/BRPI0210229B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-05-29 PL PL365742A patent/PL210450B1/pl unknown
- 2002-05-29 CZ CZ2003-3229A patent/CZ305257B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2002-05-29 AU AU2002314274A patent/AU2002314274B2/en not_active Expired
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995030019A1 (en) * | 1994-04-29 | 1995-11-09 | Pharmacia & Upjohn Company | Feline immunodeficiency virus vaccine |
| EP1074625A2 (en) * | 1999-06-14 | 2001-02-07 | Pfizer Products Inc. | DNA vaccine against feline immunodeficiency virus |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Immunology today, Vol. 21, No. 4 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2825280B1 (fr) | 2005-04-15 |
| JP2004535406A (ja) | 2004-11-25 |
| PT1418941E (pt) | 2010-10-12 |
| CA2448620C (en) | 2013-05-28 |
| PL210450B1 (pl) | 2012-01-31 |
| EP1418941B9 (fr) | 2010-10-20 |
| CZ20033229A3 (cs) | 2004-03-17 |
| FR2825280A1 (fr) | 2002-12-06 |
| WO2002096349A3 (fr) | 2004-03-11 |
| BRPI0210229B1 (pt) | 2016-11-22 |
| EP1418941B1 (fr) | 2010-07-07 |
| ATE473013T1 (de) | 2010-07-15 |
| DE60236943D1 (de) | 2010-08-19 |
| BR0210229A (pt) | 2004-07-20 |
| WO2002096349A2 (fr) | 2002-12-05 |
| AU2002314274B2 (en) | 2008-03-20 |
| PL365742A1 (en) | 2005-01-10 |
| EP1418941A2 (fr) | 2004-05-19 |
| DK1418941T3 (da) | 2010-11-01 |
| CA2448620A1 (en) | 2002-12-05 |
| ES2348226T3 (es) | 2010-12-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7803612B2 (en) | Nipah virus vaccines | |
| EP1765387B1 (en) | NEEDLE-FREE ADMINISTRATION OF FeLV VACCINES | |
| KR100805807B1 (ko) | 고양이 칼리시바이러스 유전자 및 백신, 특히 재조합 백신 | |
| US20040241191A1 (en) | Recombinant vaccine against West Nile virus | |
| DK1377660T3 (en) | Vaccine against nilfeb ervirus | |
| EP1425305B1 (en) | Igf-1 as feline vaccine adjuvant, in particular against feline retroviruses | |
| US20030096417A1 (en) | Vaccination against feline immunodeficiency virus | |
| CZ305257B6 (cs) | Souprava pro vyvolání imunitní odpovědi proti viru imunitní nedostatečnosti kočkovitých šelem | |
| US20030109033A1 (en) | Feline calicivirus genes and vaccines in particular recombinant vaccines | |
| AU2008201425A1 (en) | Vaccination against the feline immunodeficiency virus | |
| US7326417B2 (en) | IGF-1 as feline vaccine adjuvant, in particular against feline retroviruses |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20220529 |