PL210450B1 - Zestaw do szczepienia kotowatych przeciwko wirusowi nabytego niedoboru immunologicznego kotów (FIV) oraz zastosowanie plazmidów i wektorów wirusowych zawierających i eksprymujących in vivo polinukleotydy do wytwarzania szczepionki - Google Patents
Zestaw do szczepienia kotowatych przeciwko wirusowi nabytego niedoboru immunologicznego kotów (FIV) oraz zastosowanie plazmidów i wektorów wirusowych zawierających i eksprymujących in vivo polinukleotydy do wytwarzania szczepionkiInfo
- Publication number
- PL210450B1 PL210450B1 PL365742A PL36574202A PL210450B1 PL 210450 B1 PL210450 B1 PL 210450B1 PL 365742 A PL365742 A PL 365742A PL 36574202 A PL36574202 A PL 36574202A PL 210450 B1 PL210450 B1 PL 210450B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- gag
- fiv
- vaccine
- env
- pro
- Prior art date
Links
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 title claims description 101
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 title claims description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 119
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 76
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims abstract description 58
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims abstract description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims abstract description 19
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 28
- 241000178270 Canarypox virus Species 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 241000282324 Felis Species 0.000 claims description 17
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 13
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 13
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 13
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 12
- 229940023147 viral vector vaccine Drugs 0.000 claims description 10
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 claims description 9
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 claims description 8
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 7
- 241000700663 Avipoxvirus Species 0.000 claims description 5
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 claims description 3
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 claims description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 71
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 49
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 36
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 30
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 25
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 22
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 18
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 10
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 10
- 229940023860 canarypox virus HIV vaccine Drugs 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 7
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 6
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 6
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCO)OCCCCCCCCCCCCCC WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 4
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 4
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 description 4
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 4
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 4
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 3
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 3
- 101710150344 Protein Rev Proteins 0.000 description 3
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 3
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N squalane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- XDOFQFKRPWOURC-UHFFFAOYSA-N 16-methylheptadecanoic acid Chemical compound CC(C)CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O XDOFQFKRPWOURC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1h-2-benzofuran-1-yl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N Acrylic acid Chemical compound OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701087 Felid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000711475 Feline infectious peritonitis virus Species 0.000 description 2
- 241000701925 Feline parvovirus Species 0.000 description 2
- 208000000666 Fowlpox Diseases 0.000 description 2
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N Isobutene Chemical compound CC(C)=C VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 229960001631 carbomer Drugs 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- -1 e.g. Chemical group 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M octanoate Chemical compound CCCCCCCC([O-])=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JNYAEWCLZODPBN-KVTDHHQDSA-N (2r,3r,4r)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ULQISTXYYBZJSJ-UHFFFAOYSA-N 12-hydroxyoctadecanoic acid Chemical compound CCCCCCC(O)CCCCCCCCCCC(O)=O ULQISTXYYBZJSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFIMISVNSAUMBU-UHFFFAOYSA-N 2-(hydroxymethyl)-2-(prop-2-enoxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(CO)(CO)COCC=C RFIMISVNSAUMBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIHBGTRZFAVZRV-UHFFFAOYSA-N 2-Hydroxyoctadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)=O KIHBGTRZFAVZRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 230000035502 ADME Effects 0.000 description 1
- 208000029483 Acquired immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000282323 Felidae Species 0.000 description 1
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 1
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 206010051497 Rhinotracheitis Diseases 0.000 description 1
- 240000005578 Rivina humilis Species 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 101710110895 Uncharacterized 7.3 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101900340951 Vaccinia virus Protein I3 Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940086737 allyl sucrose Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 229940090046 jet injector Drugs 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N n-Triacontane Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFFLGGQVNFXPEV-UHFFFAOYSA-N n-decene Natural products CCCCCCCCC=C AFFLGGQVNFXPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000223 polyglycerol Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 101150059999 pro gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229940032094 squalane Drugs 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest zestaw do szczepienia kotowatych przeciwko wirusowi nabytego niedoboru immunologicznego kotów (FIV) oraz zastosowania plazmidów i wektorów wirusowych zawierających i eksprymujących in vivo polinukleotydy kodujące env i/lub gag i/lub gag/pro FIV do wytwarzania szczepionki.
Wirus nabytego niedoboru immunologicznego kotów (FIV) (wirus nabytego niedoboru odporności kotów) jest retrowirusem z jednoniciowym RNA o dodatniej polarności należącym do rodziny lentiwirusów.
Szeroko rozprzestrzeniony na całym świecie, FIV zakaża zasadniczo kotowate, a zwłaszcza koty.
Choroba charakteryzuje się osłabieniem i supresją układu odpornościowego co umożliwia rozwój chorób oportunistycznych i może prowadzić do śmierci.
Cząsteczka RNA FIV złożona jest z kilku otwartych ramek odczytu (ORF) kodujących białka strukturalne, w szczególności env i gag, enzymy wirusowe, w szczególności pol i pro, transaktywatory, w szczególnoś ci tat i rev. ORF rev zł o ż ony jest z dwóch eksonów.
Proponowane były inaktywowane szczepionki, ale w celu zapewnienia przez nie ochrony wymagały one użycia bardzo znacznych ilości antygenów, co jest problemem przy produkcji przemysłowej.
Próbowano innych podejść do szczepień, w szczególności stosowania białka otoczki w postaci podjednostkowej lub eksprymowanej przez zrekombinowany wektor ekspresyjny. Te prace nie doprowadziły jednak do zadawalających efektów. Ponadto powodowały one zjawisko wzmocnienia uwidocznione przez wcześniejszą wiremię u zwierząt szczepionych niż u zwierząt kontrolnych.
Artykuł Cuisinier (Cuisinier A.M. i wsp., Vaccine, 1997, 15(10), 1085-1094) przypomina, że w wyniku prób szczepienia za pomocą inaktywowanego wirusa okazało się, ż e glikoproteina powierzchniowa gp120 jest determinująca dla ochrony. Wskazuje on jednak, że kilka prób szczepienia stosujących zrekombinowane białko env nie pozwoliło na indukcję ochrony. Autorzy opisują doświadczenia ze szczepieniem kotów przez domięśniowe podawanie DNA kodującego gp120 i p10 (nukleokapsyd) FIV. Podawanie DNA kodującego gp120 FIV indukuje zaledwie częściową ochronę. W przypadku kombinacji gp120 i p10 nie obserwuje się ochrony.
Ze swojej strony artykuł Richardson (Richardson J. i wsp., J. Virol., 1997, 71(12), 9640-9649) donosi o zjawisku wzmocnienia przy podawaniu plazmidów kodujących env FIV. To zjawisko obserwowano także przy szczepieniu przy pomocy białek rekombinowanych FIV (Lutz H. i wsp., AIDS Research and Human Retroviruses, 1996, 12(5), 431-433) i wirusem krowianki wyrażającym env FIV (Osterhaus A.D.M.E. i wsp., AIDS Research and Human Retroviruses 1996, 12(5), 437-441).
WO-A-98/21354 opisuje protokół szczepienia przeciwko FIV, w którym najpierw podaje się rekombinowany wektor wirusa ospy kanarka mający jako wstawkę env i gag/pro FIV, a następnie inaktywowany FIV produkowany na limfocytach T.
W Cuisnier A.M. i wsp., Vaccine, 1999, 17, 415-425 podanie DNA eksprymują cego gp120 znowu jest przyczyną zjawiska wzmocnienia.
Badano więc różne podejścia do szczepienia, a mianowicie inaktywowane szczepionki, szczepionki z podjednostek i szczepionki rekombinowane (wektory wirusowe i DNA). Dotychczas jednak nie istnieje zadowalające rozwiązanie, ani nie jest jasny kierunek dla dalszych badań.
Po istotnych nakładach badawczych, twórcom udało się opracować technikę szczepienia kotów przeciwko FIV stosując szczepionki rekombinowane typu wektor wirusowy i DNA (plazmid). Zadziwiająco, opracowana technika pozwalała na stosowanie ekspresji env bez generowania zjawiska wzmocnienia wiremii.
Wynalazek dotyczy zestawu do szczepienia kotowatych przeciwko wirusowi nabytego niedoboru immunologicznego kotów (FIV) obejmującego oddzielnie kondycjonowane:
- pierwszą szczepionkę zawierając ą w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku lub zaróbce, plazmid zawierający i wyrażający in vivo polinukleotyd kodujący env i/lub gag i/lub gag/pro z FIV,
- drugą szczepionkę zawierającą w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku lub zaróbce, wektor wirusowy zawierający i wyrażający in vivo polinukleotyd kodujący env i/lub gag i/lub gag/pro z FIV, przy czym, co najmniej jedno z tych białek env lub gag lub gag/pro kodowane jest zarówno przez plazmidy jak i wektory wirusowe.
W korzystnym zestawie pierwsza szczepionka i/lub druga szczepionka wyraż ają in vivo polinukleotyd kodujący tat.
PL 210 450 B1
W korzystnym wykonaniu zestawu wektory wirusowe wybrane są z wirusów ospy ptasiej, korzystnie wirusa ospy kanarków lub wirusa ospy drobiu, i atenuowanych mutantów wirusa krowianki.
Zestaw korzystnie zawiera dwie dawki szczepionki na bazie plazmidu na dawkę szczepionki na bazie wektora wirusowego.
Ponadto w korzystnym zestawie szczepionka na bazie plazmidu i/lub szczepionka na bazie wektora wirusowego zawiera adiuwant, korzystniej adiuwant jest cytokiną, korzystnie GM-CSF kota.
W korzystnym zestawie szczepionka zawierają ca wektory wirusowe przeznaczona jest do podania jako przypomnienie szczepionki zawierającej plazmidy.
Wynalazek ponadto dotyczy zastosowania plazmidów zawierających i eksprymujących in vivo polinukleotyd(y) kodujący(kodujące) env i/lub gag i/lub gag/pro FIV do wytwarzania pierwszej szczepionki zawierającej plazmidy i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę, w celu podania jako pierwsze szczepienie kotowatym, oraz zastosowania wektorów wirusowych zawierających i eksprymujących in vivo polinukleotyd(y) kodujący(kodujące) env i/lub gag i/lub gag/pro FIV, do wytwarzania drugiej szczepionki zawierającej wektory wirusowe i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę, w celu podania jako przypomnienie tym samym kotowatym, przy czym, co najmniej jedno z białek env lub gag lub gag/pro kodowane jest zarówno przez plazmidy jak i wektory wirusowe dla szczepienia kotowatych przeciw FIV.
Wynalazek również dotyczy zastosowania plazmidów zawierających i eksprymujących in vivo polinukleotyd(y) kodujący(e) env i/lub gag i/lub gag/pro FIV, do wytwarzania szczepionki zawierającej plazmidy i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę, w celu szczepienia kotowatych przeciwko FIV, do podania kotowatym jako pierwsze podanie, przy czym podanie przypominające przeprowadza się za pomocą szczepionki zawierającej wektory wirusowe zawierające i eksprymujące in vivo polinukleotyd(y) kodujący(e) env i/lub gag i/lub gag/pro FIV i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę, przy czym, co najmniej jedno z białek env lub gag lub gag/pro kodowane jest zarówno przez plazmidy jak i wektory wirusowe.
W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie wektorów wirusowych zawierających i eksprymujących in vivo polinukleotyd(y) kodujący(e) env i/lub gag i/lub gag/pro FIV, do wytwarzania szczepionki zawierającej wektory wirusowe i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę, w celu szczepienia kotowatych przeciwko FIV, do podania kotowatym jako przypomnienie szczepionki zawierającej plazmidy zawierające i eksprymujące in vivo polinukleotyd(y) kodujące env i/lub gag i/lub gag/pro FIV i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę, przy czym, co najmniej jedno z białek env lub gag lub gag/pro kodowane jest zarówno przez plazmidy jak i wektory wirusowe.
W korzystnym zastosowaniu plazmidy i/lub wektory wirusowe zawierają polinukleotyd kodujący tat.
W korzystnym zastosowaniu wektory wirusowe wybrane są z wirusów ospy ptasiej, korzystnie wirusa ospy kanarków lub wirusa ospy drobiu, i atenuowanych mutantów wirusa krowianki.
W korzystnym zastosowaniu dwie szczepionki przeznaczone są do podawania w odstę pie od 3 do 6 tygodni, korzystnie w odstępie rzędu 4 tygodni.
W innym korzystnym zastosowaniu szczepionka na bazie plazmidu i/lub szczepionka na bazie wektora wirusowego zawiera adiuwant, korzystniej adiuwant jest cytokiną, korzystnie GM-CSF kota.
Tak więc, rozwiązania według wynalazku umożliwiają prowadzenie sposobu immunizacji i szczepienia kotowatych przeciwko FIV przez protokół stosowania obejmują cy co najmniej jedno pierwsze podanie i co najmniej jedno podanie przypominające używające wspólny immunogen. Stosowane preparaty immunogenne i szczepionki do pierwszego podania mają inny charakter niż stosowane przy szczepieniu przypominającym. Ten protokół podawania określany jest jako „prime-boost (szczepienie-przypomnienie lub szczepienie podstawowe i szczepienie wzmacniające przypominające).
Protokół prime-boost opisany w wynalazku obejmuje pierwsze podanie preparatu immunogennego lub szczepionki zawierającej, w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku lub zaróbce, plazmid zawierający i wyrażający in vivo polinukleotyd kodujący env i/lub gag i/lub gag/pro FIV, po czym następuje przypomnienie preparatem immunogennym lub szczepionką zrekombinowaną zawierającą, w farmaceutycznie dopuszczalnym no śniku lub zaróbce, wektor wirusowy zawierają cy i wyraż ają cy in vivo polinukleotyd kodujący env i/lub gag i/lub gag/pro FIV, pod warunkiem, że co najmniej jedno z tych biał ek env lub gag lub gag/pro jest kodowane naraz przez plazmidy i wektory wirusowe.
Pierwsze podanie może obejmować jedno lub więcej podań tych samych preparatów immunogennych lub szczepionek na bazie plazmidów. Tak samo podanie przypominające może obejmować jedno lub kilka podań tych samych preparatów immunogennych lub szczepionek na bazie wektorów wirusowych. Według jednego sposobu wykonania, protokół obejmuje dwa kolejne podania tego sa4
PL 210 450 B1 mego preparatu immunogennego lub szczepionki na bazie plazmidów, a następnie podanie preparatu immunogennego lub szczepionki na bazie wektorów wirusowych w celu przypomnienia.
Różne podania są korzystnie przeprowadzane w odstępie od 3 do 6 tygodni, a zwłaszcza w odstępie rzędu 4 tygodni. Według korzystnego wykonania przewiduje się dodatkowe przypominanie co rok, korzystnie za pomocą preparatu immunogennego lub szczepionki na bazie wektorów wirusowych. Korzystnie zwierzęta są w wieku co najmniej od 6 do 8 tygodni podczas pierwszego podania.
Plazmidy i wektory wirusowe stosowane w protokole prime-boost korzystnie wyrażają zarówno env i gag lub env i gag/pro.
W znaczeniu stosowanym w wynalazku, określenie białko obejmuje fragmenty, w tym peptydy i polipeptydy mają ce zasadniczo tę samą aktywność immunologiczną jak cał e biał ko. Wyraż enia gen env, gen gag, gen gag/pro itd. obejmują więc fragmenty polinukleotydów kodujące te fragmenty białka, peptydy i polipeptydy.
Aby kontrolować ich ekspresję, polinukleotydy są funkcjonalnie połączone z promotorem i ewentualnie z sekwencjami aktywującymi (ang. enhancer), sekwencjami stabilizującymi, i/lub sekwencjami sygnalnymi pozwalającymi na sekrecję białka.
Inne białka FIV mogą być wyrażane razem z env i/lub gag i/lub gag/pro przy pierwszym podaniu i/lub przypomnieniu. Można mianowicie eksprymować białko tat i/lub białko rev, korzystnie tat i ewentualnie rev. Mogą być eksprymowane w tych samych plazmidach i/lub wektorach wirusowych jak tych stosowanych do env i/lub gag i/lub gag/pro lub w plazmidach i/lub właściwych wektorach wirusowych. Według szczególnego wykonania kilka szczepów FIV jest reprezentowanych w preparatach lub szczepionkach opisanych w wynalazku, to znaczy, że protokół obejmuje podanie plazmidów i wektorów wirusowych zawierających i wyrażających in vivo polinukleotydy kodujące env i/lub gag i/lub gag/pro dwóch, trzech lub więcej szczepów FIV. Tak więc polinukleotydy kilku szczepów FIV mogą być niesione przez pojedynczy wektor wirusowy lub przez oddzielne wektory wirusowe.
Dla plazmidów korzystne są oddzielne plazmidy, ale nie wyklucza się jednak pojedynczego plazmidu niosącego polinukleotydy kilku szczepów FIV.
Według jeszcze innego wykonania, i jak będzie omówione dalej bardziej szczegółowo, protokół może obejmować podanie równoczesne jednej lub kilku cytokin, albo w formie białka albo przez włączenie polinukleotydu kodującego cytokinę do plazmidów i/lub wektorów wirusowych stosowanych do ekspresji białek FIV i/lub innych.
Aby wytworzyć wektory ekspresyjne używane w rozwiązaniach według wynalazku specjalista dysponuje różnymi szczepami FIV, organizacją ich genomu i sekwencją nukleotydów ich genomu. Możliwe do stosowania szczepy FIV, takie jak szczep Petaluma, podane są w części Przykłady. Informacje uzupełniające o tych szczepach, jak i ich sekwencje nukleotydowe podane są na początku części Przykłady.
Zgodnie z ujawnieniem wynalazku, pierwsze podanie obejmuje stosowanie plazmidów eksprymujących in vivo białko lub białka FIV. Określenie plazmid dotyczy jednostki transkrypcji DNA zawierającej polinukleotyd i elementy potrzebne do jego ekspresji in vivo. Korzystny jest plazmid kolisty, superskręcony lub nie. Forma liniowa także wchodzi w zakres rozwiązań według wynalazku.
Każdy plazmid zawiera promotor mogący zapewnić, w komórkach gospodarza, ekspresję wstawionego polinukleotydu pod jego kontrolą. Na ogół chodzi o silny promotor eukariotyczny. Korzystny silny promotor eukariotyczny to wczesny promotor wirusa cytomegalii (CMV-IE), pochodzenia ludzkiego lub mysiego, lub też ewentualnie innego pochodzenia takiego jak szczur, świnka morska. Promotor CMV-IE może zawierać właściwą część promotora połączoną lub nie z częścią aktywującą (enhancer). Można odnieść się do EP-A-260 148, EP-A-323 597, US-A-5 168 062, US-A-5 385 839, US-A-4 968 615, WO-A-87/03905. Korzystny jest CMV-IE ludzki (Boshart M, i wsp., Cell, 1985, 41, 521-530) lub mysi.
Bardziej ogólnie, promotor ma pochodzenie albo wirusowe albo komórkowe. Jako promotor silny inny niż CMV-IE, można podać promotor wczesny i promotor późny wirusa SV40 lub promotor LTR wirusa mięsaka Rousa. Jako silny promotor komórkowy można podać promotor genu cytoszkieletu, taki jak, na przykład, promotor desminy (Kwissa M. i wsp., Vaccine, 2000, 18(22), 2337-2344) lub też promotor aktyny (Miyazaki J. i wsp., Gene, 1989, 79(2), 269-277).
Jako ekwiwalent, subfragmenty tych promotorów, zachowujące odpowiednie aktywności promotora mogą być również wykorzystane w rozwiązaniach według wynalazku; na przykład, skrócone promotory CMV-IE według WO-A-98/00166. Pojęcie promotora zgodnie z wynalazkiem obejmuje więc pochodne i subfragmenty zachowujące odpowiednią aktywność promotora, korzystnie zasadniczo
PL 210 450 B1 podobną do właściwego promotora, z którego pochodzą. Dla CMV-IE to pojęcie obejmuje właściwą część promotora i/lub część aktywatora i ich pochodne oraz subfragmenty.
Korzystnie plazmidy zawierają inne elementy dla kontroli ekspresji. W szczególności korzystna jest inkorporacja sekwencji stabilizujących typu intron, korzystnie intronu II genu β-globiny królika (van
Ooyen i wsp., Science, 1979, 206: 337-344).
Jako sygnał poliadenylacji (poliA) dla plazmidów można stosować w szczególności ten z genu bydlęcego hormonu wzrostu (bGH) (US-A-5,122,458), ten z genu β-globiny królika lub ten z wirusa SV40.
Podanie przypominające będzie obejmowało zastosowanie wektorów wirusowych wyrażających in vivo białko lub białka FIV. Te wirusowe wektory ekspresyjne korzystnie są wirusami ospy ptasiej (w szczególności wirusem ospy kanarka, wirusem ospy drobiu) lub atenuowanymi mutantami wirusa krowianki.
Dla wirusów ospy specjalista może odnieść się do WO-A-90/12882, a szczególnie dla wirusa krowianki do US-A-4,769,330; US-A-4,722,848; US-A-4,603,112; US-A-5,110,587; US-A-5,494,807; US-A-5,762,938; dla wirusa ospy drobiu US-A-5,174,993; US-A-5,505,941; US-5,766,599; dla wirusa ospy kanarka US-A-5,756,103.
Jako atenuowany mutant wirusa krowianki można podać MVA (szczep Ankara) (Stickl H. i Hochstein-Mintzel V., Munch. Med. Wschr., 1971, 113, 1149-1153: Sutter G. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992, 89, 10847-10851; szczep handlowy ATCC VR-1508; MVA otrzymuje się po ponad 570 pasażach szczepu krowianki Ankara na fibroblastach zarodków kurzych) lub NYVAC (jego konstrukcja opisana jest w US-A-5 494 807, w szczególności w przykładach od 1 do 6; ten patent opisuje także wstawianie genów heterologicznych do miejsc insercyjnych tych rekombinantów i stosowanie odpowiednich promotorów; jak również w publikacji WO-A-96/40241).
Według jednego z korzystnych sposobów wykonania wektor ekspresyjny wirusa ospy jest wirusem ospy kanarka, ewentualnie atenuowanym, na przykład, ALVAC lub wirusem ospy kanarka (na przykład, szczep Rentschler), który był atenuowany w szczególności przez ponad 200 pasaży na komórkach fibroblastów zarodków kurcząt (CEF). Wirus ospy kanarka szczepu ALVAC został zdeponowany 14 listopada 1996 roku w American Type Culture Collection (ATCC) pod numerem dostępu VR-2547. Wirus ospy kanarka jest handlowo dostępny od ATCC pod numerem dostępu VR-111. Atenuowane wirusy ospy kanarka opisano w US-A-5,756,103 i w WO-A-01/05934.
Inne atenuowane wirusy ospy też mogą być stosowane, w szczególności atenuowane wirusy ospy drobiu (na przykład, TROVAC). Dla wirusów ospy TROVAC, specjalista może odnieść się do patentu WO-A-96/40241. Liczne szczepy szczepionkowe wirusa ospy drobiu są dostępne, na przykład, szczepionka DIFTOSEC CT® sprzedawana przez MERIAL oraz szczepionka NOBILIS® sprzedawana przez Intervet.
Gdy wektor ekspresyjny jest atenuowanym mutantem wirusa krowianki, miejscami wstawienia polinukleotydu (polinukleotydów) do ekspresji są w szczególności gen kinazy tymidynowej (TK), gen hemaglutyniny (HA), i/lub region ciałka inkluzyjnego typu A (ATI). Insercja genów w wirusie MVA opisana jest też w różnych publikacjach w tym Carroll M.W. i wsp., Vaccine, 1997, 15(4), 387-394; Stittelaar K.J. i wsp., J. Virol, 2000, 74(9), 4236-4243; Sutter G. i wsp., Vaccine 1994, 12(11), 1032-1040, do których może odnieść się specjalista. Całkowity genom MVA opisany jest w pracy Antoine G., Virology, 1998, 244, 365-396, co pozwala specjaliście na stosowanie innych miejsc insercji lub innych promotorów.
Gdy chodzi o wirus ospy kanarka, miejsca insercji są w szczególności zlokalizowane w lub składają się z ORF C3, C5 i C6. Gdy chodzi o wirus ospy drobiu, miejsca insercji są w szczególności zlokalizowane w lub stanowione przez ORF7 i F8.
Korzystnie gdy wektor ekspresyjny jest wirusem ospy, polinukleotyd, który ma ulec ekspresji wstawiany jest pod kontrolą promotora specyficznego dla wirusa ospy, w szczególności promotora krowianki 7,5 kDa (Cochran J. i wsp., J. Virology, 1985, 54, 30-35), promotora krowianki I3L (Riyiere i wsp., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434), promotora krowianki HA (Shida, Virology, 1988, 150, 451-457), promotora wirusa ospy bydlęcej ATI (Funahashi i wsp., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47) lub też promotora krowianki H6 (Taylor J. i wsp., Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. i wsp., J. Virol., 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. i wsp., J. Virol., 1989, 63, 3829-3836).
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają również zastosowanie części plazmidów zawierających i wyrażających in vivo polinukleotyd(y) kodujący(kodujące) env i/lub gag i/lub gag/pro FIV, do wytwarzania pierwszego preparatu immunogennego lub pierwszej szczepionki zawierającej plazmidy i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę z celem podania kotowatym jako pierwsza szczepionka, a z drugiej strony, wektorów wirusowych zawierających i eksprymujących in vivo ten polinu6
PL 210 450 B1 kleotyd/te polinukleotydy kodujące env i/lub gag i/lub gag/pro FIV, do produkcji drugiego preparatu immunogennego lub drugiej szczepionki zawierającej wektory wirusowe i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę z celem podania jako przypomnienie tym samym kotowatym pod warunkiem, że jedno z białek env i/lub gag i lub gag/pro kodowane jest równocześnie przez plazmidy i wektory wirusowe dla szczepienia kotowatych przeciw FIV.
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają również zastosowanie plazmidów zawierających i eksprymujących in vivo polinukleotyd lub polinukleotydy kodujące env i/lub gag i/lub gag/pro FIV do produkcji szczepionki zawierającej plazmidy i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę przeznaczonej do szczepienia kotowatych przeciwko FIV do podania kotowatym jako pierwsze szczepienie, przypomnienie przeprowadza się za pomocą szczepionki zawierającej wektory wirusowe zawierające i eksprymujące in vivo polinukleotyd(y) kodujące env i/lub gag i/lub gag/pro FIV i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę pod warunkiem, że jedno z białek env i/lub gag i/lub gag/pro kodowane jest równocześnie przez plazmidy i wektory wirusowe.
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają również zastosowanie wektorów wirusowych zawierających i eksprymujących in vivo polinukleotyd lub polinukleotydy kodujące env i/lub gag i/lub gag/pro FIV do produkcji szczepionki zawierającej wektory wirusowe i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę w celu szczepienia kotowatych przeciwko FIV do podania kotowatym jako przypomnienie szczepionki zawierającej plazmidy zawierające i eksprymujące in vivo polinukleotyd(y) kodujące env i/lub gag i/lub gag/pro FIV i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę pod warunkiem, że jedno z białek env i/lub gag i/lub gag/pro kodowane jest równocześnie przez plazmidy i wektory wirusowe.
Opisany w wynalazku zestaw do immunizacji lub szczepienia kotowatych przeciwko FIV w szczególności przeznaczony jest do stosowania według przedstawionego protokołu podawania i obejmuje oddzielnie kondycjonowane:
- preparat immunogenny lub szczepionkę zawierającą, w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku lub zaróbce, plazmid zawierający i wyrażający in vivo polinukleotyd kodujący env i/lub gag i/lub gag/pro FIV,
- preparat immunogenny lub szczepionkę zrekombinowaną zawierając ą w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku lub zaróbce, wektor wirusowy zawierający i wyrażający in vivo polinukleotyd kodujący env i/lub gag i/lub gag/pro FIV pod warunkiem, że co najmniej jedno z białek env i/lub gag i/lub gag/pro kodowane jest równocześnie przez plazmidy i wektory wirusowe.
Korzystnie plazmidy i wektory wirusowe wyrażają env i gag lub env i gag/pro.
Jest oczywiste, że zestaw cech opisanych w tym zgłoszeniu, które dotyczą na przykład, kompozycji plazmidów i wektorów wirusowych, kompozycji preparatów i szczepionek, kombinacji polinukleotydów FIV, protokołów podania dotyczą w tych samych warunkach różnych przedmiotów wynalazku.
Pojęcie kompozycji immunogennej obejmuje każdą kompozycję mogącą, po podaniu docelowemu gatunkowi w warunkach przedstawionych w opisie wynalazku, indukować odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciw FIV. Przez szczepionkę rozumie się kompozycję zdolną do indukcji skutecznej ochrony. Docelowe gatunki to kotowate, a korzystnie koty.
Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki lub zaróbki są dobrze znane specjaliście z tej dziedziny. Jako przykład można podać roztwór soli NaCl 0,9% lub bufor fosforanowy. Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki lub zaróbki obejmują też każdy związek lub kombinację związków pozwalających na ułatwienie podawania wektora, w szczególności transfekcję, i/lub poprawę konserwowania.
Kompozycje immunogenne i szczepionki według wynalazku zawierają korzystnie jeden lub więcej zwykłych adiuwantów. Szczególnie odpowiednie są: (1) polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego, polimery bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylowej (2) sekwencje immunostymulujące (ISS), w szczególności sekwencje oligodeoksyrybonukleotydowe zawierające jeden lub więcej nie metylowanych motywów CpG (Klinman D.M. i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996, 93, 2879-2883; WO-A1-98/16247), (3) emulsja olej-w-wodzie, w szczególności emulsja SPT opisana na stronie 147 Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach red. M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, oraz emulsja MF59 opisana na stronie 183 tej samej publikacji, (4) lipidy kationowe zawierające czwartorzędowe sole amonowe, (5) cytokiny lub (6) ich kombinacje lub mieszanki.
Emulsja olej-w-wodzie (3), która jest szczególnie odpowiednia dla wektorów wirusowych może być w szczególności na bazie:
- oleju parafinowego pł ynnego lekkiego (typ Farmakopea europejska),
- oleju izoprenoidowego takiego jak skwalan, skwalen,
- oleju będącego wynikiem oligomeryzacji alkenów, zwłaszcza izobutenu lub decenu,
PL 210 450 B1
- estrów kwasów lub alkoholi zawierają cych liniowe grupy alkilowe,
- zwłaszcza olejów roślinnych, oleinianu etylu, di(kaprylanu/kapranu) glikolu propylenowego, tri(kaprylanu/kapranu) glicerolu, dioleinianu glikolu polipropylowego,
- estrów kwasów lub alkoholi tłuszczowych rozgałęzionych, w szczególności estrów kwasu izostearynowego.
Olej stosowany jest w połączeniu z emulgantami, aby wytworzyć emulsję. Emulganty korzystnie są niejonowymi środkami powierzchniowo czynnymi, a w szczególności:
- estrami sorbitanu, mannitu (na przykład, oleinian anhydromannitolu), glicerolu, poliglicerolu, glikolu polipropylenowego i kwasu olejowego, izostearynowego, rycynoolejowego, hydroksystearynowego, ewentualnie etoksylowane,
- kopolimerami blokowymi polioksypropylen-polioksyetylen, w szczególno ści Pluronic®, a zwł aszcza L121.
Wśród adiuwantowych polimerów typu (1) korzystne są polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego usieciowane, za pomocą eterów polialkenylowych cukrów lub polialkoholi. Te związki znane są jako karbomer (Pharmeuropa tom 8. nr 2. czerwiec 1996). Specjalista w dziedzinie znajdzie również odniesienia w opisie patentowym US-A-2,909,462 (włączonym jako odnośnik), w którym opisano takie polimery akrylowe usieciowane związkiem polihydroksylowanym zawierającym co najmniej 3 grupy hydroksylowe, korzystnie nie wi ę cej niż 8, przy czym atomy wodoru co najmniej trzech grup hydroksylowych są zastąpione przez nienasycone rodniki alifatyczne o przynajmniej 2 atomach węgla. Korzystne rodniki zawierają od 2 do 4 atomów węgla, np. grup winylowych, allilowych i innych nienasyconych grup etylenowych. Rodniki nienasycone mogą same zawierać inne podstawniki takie jak metyl. Produkty sprzedawane pod nazwą Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, USA) są tu szczególnie odpowiednie. Są one usieciowane allilo-sacharozą albo za pomocą allilo-pentaerytritolu. Wśród nich można wymienić Carbopol® 974P, 934P i 971P.
Stężenie polimeru typu karbomeru w końcowej kompozycji szczepionki może wynosić od 0,01% do 1,5% wag./obj., w szczególności od 0,05% do 1% mas/obj., a korzystniej od 0,1 do 0,4% wag./obj.
Lipidy kationowe (4) zawierające czwartorzędowe sole amonu, które są szczególnie, ale nie wyłącznie odpowiednie do plazmidów odpowiadają wzorowi:
ch3
R1 - O - CH2 - CH - CH2 - N+- R2 - X
OR1 CH3 w którym R1 jest liniow ą resztą alifatyczną nasyconą lub nienasyconą , mają c ą od 12 do 18 atomów węgla, R2 jest inną resztą alifatyczną zawierającą od 2 do 3 atomów węgla a X grupą hydroksylową lub aminową.
Wśród tych lipidów kationowych korzystny jest DMRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradekoiloksy)-1-propanamon; WO-A-96/34109), korzystnie zasocjowany z lipidem obojętnym, w szczególnoś ci DOPE (dioleilofosfatydyloetanoloaminą ); Behr J.P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389)), aby utworzyć DMRIE-DOPE.
Korzystnie, mieszaninę plazmidu z tym adiuwantem przyrządza się bezpośrednio przed użyciem i jest korzystne, przed jego podaniem zwierzęciu, aby była ona pozostawiona w celu wytworzenia kompleksów, na przykład, na okres od 10 do 60 minut, w szczególności na 30 minut.
O ile DOPE jest obecny, stosunek molarny DMRIE : DOPE korzystnie wynosi od 95 : 5 do 5 : 95, a korzystniej 1 : 1.
Stosunek wagowy plazmid : adiuwant DMRIE lub DMRIE-DOPE może w szczególności wynosić od 50 : 1 do 1 : 10, szczególnie od 10 : 1 do 1 : 5, a korzystnie od 1 : 1 do 1 : 2.
Cytokina lub cytokiny (5) ewentualnie obecne mogą być włączone do kompozycji lub szczepionki w postaci białka lub być koeksprymowane u gospodarza z białkiem lub białkami FIV. Korzystna jest koekspresja cytokiny lub cytokin, albo przez ten sam wektor, który eksprymuje białka, albo przez osobny wektor.
PL 210 450 B1
Cytokiny mogą być w szczególności wybrane z cytokin kotowatych, w szczególności cytokin kota, takich jak interleukina 18 kota (fIL-18) (Taylor S. i sp., DNA Seq., 2000, 10(6), 387-394), fIL-16 (Leutenegger CM. i wsp., DNA Seq., 1998, 9(1), 59-63); flL-12 (Fehr D. i wsp., DNA Seq., 1997, 8(1-2), 77-82 Imamura T. i wsp., J. Vet. Med. Sci., 2000 62(10), 1079-1087) i GM-CSF kota (czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów, ang. Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor) (GenBank AF053007).
Szczepionka przeciwko FIV może zostać połączona ze szczepieniami przeciwko innym patogenom kotów. Inne patogeny kotów to w szczególności wirus zapalenia nosa i tchawicy kota lub wirus opryszczki kota (FHV), wirus białaczki kota (FeLV typu A i typu B), parwowirusy kota (FPV), wirus zakaźnego zapalenia otrzewnej kota (FIPV), wirus kalciwirozy kota (FCV), wirus wścieklizny, Chlamydia.
Podanie preparatów i szczepionek przedstawionych w wynalazku może być dokonane w szczególności na drodze pozajelitowej, na przykład, przez podanie podskórne, doskórne, domięśniowe lub przez drogę doustną i/lub donosową.
Różne preparaty i szczepionki mogą być wstrzykiwane za pomocą bezigłowego iniektora strumieniowego.
Kompozycje immunogenne lub szczepionki według wynalazku zawierają skuteczną ilość plazmidu lub wektora wirusowego, określenie tych ilości jest możliwe dla specjalisty. Zgłaszający zaleca:
- w przypadku kompozycji immunogennych lub szczepionek na bazie plazmidu, dawka może zawierać od około 1 μg do około 2000 μg, w szczególności od około 50 μg do około 1000 μg. Objętości tych dawek mogą być zawarte między 0,1 a 2 ml, a korzystnie między 0,2 i 1 ml;
- w przypadku kompozycji immunogennych lub szczepionek na bazie wirusa ospy dawka może zawierać od około 103 pfu do około 109 pfu.
Gdy wektorem jest wirus ospy kanarka, dawka zwłaszcza zawiera się między około 103 pfu a około 109 pfu, korzystnie między około 106 pfu a około 108 pfu. Objętości dawek kompozycji immunogennych i szczepionek dla kotów mogą być zawarte między 0,1 a 2,0 ml, a korzystnie między 0,2 a 1,0 ml.
Zestaw może zawierać dawki szczepionki do szczepienia zwierzęcia lub kilku zwierząt.
Według szczególnego wykonania, zestaw zawiera dwie dawki szczepionki na bazie plazmidu na dawkę szczepionki na bazie wektora wirusowego.
Wynalazek będzie opisany obecnie bardziej szczegółowo za pomocą sposobów realizacji użytych jako nie ograniczające przykłady.
P r z y k ł a d y
Wszystkie konstrukty przygotowano stosując standardowe techniki biologii molekularnej (klonowanie, trawienie enzymami restrykcyjnymi, synteza komplementarnego DNA jednoniciowego, amplifkacja łańcuchowa z polimerazą, wydłużanie oligonukleotydu przez polimerazę DNA itd.) opisane przez Sambrook J. i wsp. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nowy Jork, 1989). Wszystkie fragmenty restrykcyjne używane w tym wynalazku, jak i różne fragmenty amplifikowane za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (amplifikacji łańcuchowej polimerazy) (PCR) wyizolowano i oczyszczono za pomocą zestawu Geneclean® (BIO 101 Inc. La Jolla, CA).
Przykłady dotyczą szczepu FIV Villefranche IFFA 1/88 (Steffan A.M. i wsp. J. Gen. Virol. 1994, 75, 3647-3653). Oczywiście rozwiązania według wynalazku można stosować dla innych szczepów FIV. Można na przykład podać szczep Petaluma (dostępny od American Type Culture Collection (ATCC) pod numerem VR-1312 i sekwencją nukleotydową w Gen-Bank pod numerem M25381; gen env: nukleotydy 6266 do 8836; gen gag: nukleotydy 628 do 1980; gag/pro: nukleotydy 628 do 2336). Można też podać szczep NCUSl dostępny od ATCC pod numerem VR2333. Można też odnieść się do publikacji Sodora i Bachmann (Sodora D.L. i wsp., J. Virol 1994, 68(4), 2230-2238; Bachmann M.H. i wsp., J. Virol., 1997, 71(6), 4241-4253), które opisują pewną liczbę szczepów FIV i wskazują numery dostępu do sekwencji w Gen-Bank. Szczep FIV14 występuje pod nr NC_001482 w Gen-Bank (gen env: nukleotydy 6266-8836; gen gag: nukleotydy 628-1980; gag/pro: nukleotydy 628-2336), szczep BM3070 zdeponowano w Gen-Bank pod nr AF474246 (gen env: nukleotydy 6272-8833; gen gag : nukleotydy 634-1986), a szczep OMA ma w Gen-Bank nr dostępu U56928 (gen env: nukleotydy 6506-9097; gen gag nukleotydy 679-2179), itd.
Specjalista z tej dziedziny jest w stanie zaprojektować startery PCR dla klonowania genów wychodząc z omawianego szczepu FIV. Startery PCR wykorzystywane w poniższych przykładach do klonowania env, gag/pro, rev i tat szczepu Villefranche, mogą być użyte z innymi szczepami, takimi jak Petaluma; lub odpowiednio przystosowane, gdy jest taka potrzeba.
PL 210 450 B1
P r z y k ł a d 1: Hodowle wirusa FIV
W celu ich amplifikacji wirusy nabytego niedoboru immunologicznego kotów szczepu Villefranche IFFA 1/88 hodowano na komórkach Q201 (limfocyty T pomocnicze kota: Wille B. i wsp., J. Gen. Virol., 1997, 78, 611-618).
Komórki Q201 hodowano w butelkach Falcon 25 cm2 z podłożem EagleMEM uzupełnionym mM glutaminą, 10% surowicą cielęcą z 100 lU/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 100 lU/ml zrekombinowanej interleukiny-2 ludzkiej zawierającej około 100000 komórek na ml. Komórki hodowano w +37°C.
Po 3 dniach warstwa komórek doszła do konfluencji. Podłoże hodowlane jest następnie zastępowane i dodaje się wirus FIV w ilości 5 pfu/komórkę.
Gdy efekt cytopatogenny (CPE) jest kompletny (na ogół 48-72 godzin po rozpoczęciu hodowli) zbiera się zawiesiny wirusów, następnie klaruje się je przez wirowanie i zamraża w -80°C. Na ogół konieczne są 3 do 4 kolejnych pasaży do wyprodukowania partii wirusa. Partia wirusa jest przechowywana w -80°C.
P r z y k ł a d 2: Ekstrakcja wirusowego RNA FIV
RNA wirusa zawarty w 100 ml zawiesiny wirusa szczepu FIV Villefranche ekstrahowano po rozmrożeniu roztworami zestawu „High PureTM Viral RNA kit Kat nr 1 858 882, Roche Molecular Biochemicals) według instrukcji producenta dla etapów ekstrakcji. Otrzymany osad RNA pod koniec ekstrakcji zawieszono w 1 do 2 ml sterylnej wody destylowanej wolnej od RNAzy.
P r z y k ł a d 3: Konstrukcja plazmidu pPB371
Komplementarny DNA (cDNA) FIV jest syntetyzowany za pomocą zestawu Gene Amp RNA PCR Kit (Nr Kat N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859. USA) stosując warunki podane przez producenta.
Przeprowadzono reakcję odwrotnej transkrypcji po czym reakcję łańcuchową polimerazy (reakcja RT-PCR) przeprowadzono z 50 μl zawiesiny wirusowego RNA FIV (przykład 2) i z następującymi oligonukleotydami:
FC116 (36 mer) (SEQ ID NO: 1)
5' TTTTTTCTGCAGCAATAAGAATGGCAGAAGGATTTG 3' i FC117 (36 mer) (SEQ ID NO: 2)
5'-TCGCACCTGAAACATCTCGAGTGTTTCCACATGTAT 3'
Ta para oligonukleotydów pozwala na włączenie miejsca restrykcyjnego Pstl, miejsca restrykcyjnego Xhol i kodonu inicjacyjnego ATG na końcu 5' wstawki.
Syntezę pierwszej nici cDNA przeprowadza się przez elongację oligonukleotydu FC117 po hybrydyzacji tego ostatniego do matrycy RNA.
Warunki syntezy pierwszej nici cDNA to temperatura 42°C przez 15 min., następnie 99°C przez 5 min., a potem 4°C przez 5 min. Warunki reakcji PCR w obecności pary oligonukleotydów FC116 i FC117 to temperatura 95°C przez 2 min., następnie 40 cykli (95°C przez 30 sek., następnie 50°C przez 45 sek. i 72°C przez 3 min.), a następnie 72°C przez 7 min., aby wyprodukować fragment 1476 bp.
Ten fragment trawiono enzymem restrykcyjnym Pstl, a następnie enzymem restrykcyjnym Xhol, aby wyizolować, po elektroforezie w żelu agarozowym fragment Pstl-Xhol o wielkości około 1450 bp. Ten fragment nazwano fragmentem A.
Druga reakcja odwrotnej transkrypcji, po której nastąpiła reakcja łańcuchowa polimerazy (reakcja „RT-PCR) przeprowadzana jest z 50 μl zawiesiny RNA wirusowego FIV (przykład 2) i z następującymi oligonukleotydami:
FC118 (36 mer) (SEQ ID NO: 3)
5' ATACATGTGGAAACACTCGAGATGTTTCAGGTGCGA 3' i FC119 (54 mer) (SEQ ID NO: 4)
5' TTTTTTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCTGAGATACTTCATCATTCCTCCTC 3'
Ta para oligonukleotydów pozwala na włączenie miejsca restrykcyjnego XhoI, miejsca restrykcyjnego BamHI i kodonu stop na 3' wstawki.
Syntezę pierwszej nici cDNA przeprowadza się przez elongację oligonukleotydu FC118 po hybrydyzacji tego ostatniego do matrycy RNA.
Warunki syntezy pierwszej nici cDNA to temperatura 42°C przez 15 min., następnie 99°C przez 5 min. i następnie 4°C przez 5 min. Warunki reakcji PCR w obecności pary oligonukleotydów FC118 i FC119 to temperatura 95°C przez 2 min., następnie 40 cykli (95°C przez 130 sek., następnie 50°C przez 45 sek. i 72°C przez 3 min.), a następnie 72°C przez 7 min, aby wyprodukować fragment 1193 bp.
PL 210 450 B1
Ten fragment trawiono enzymem restrykcyjnym Xhol, a następnie enzymem restrykcyjnym BamHI, aby wyizolować, po elektroforezie w żelu agarozowym fragment XhoI-BamHI około 1170 bp. Ten fragment nazwano fragmentem B.
Fragmenty A i B zligowano z eukariotycznym plazmidem ekspresyjnym pVR1012 (fig. 1 i przykład 7 z WO-A-98/03199: Hartikka J. i wsp., 1997, Human Gene Therapy, 7, 1205-1217) uprzednio strawionym Xbal i EcoRI, aby uzyskać plazmid pPB371 (7467 bp). Plazmid ten zawiera, pod kontrolą promotora wczesnego wirusa cytomegalii ludzkiego lub hCMV-IE (human cytomegalovirus immediate early) wstawkę kodującą białko env FIV.
P r z y k ł a d 4: Konstrukcja plazmidu pPB374
DNA komplementarny (cDNA) FIV syntetyzowano z zestawem Gene Amp RNA PCR Kit (Nr Kat N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) stosując warunki podane przez producenta.
Przeprowadzono reakcję odwrotnej transkrypcji, po czym reakcję łańcuchową polimerazy (reakcja „RT-PCR) przeprowadzono z 50 μΐ zawiesiny wirusowego RNA FIV (przykład 2) i z następującymi oligonukleotydami:
PB670 (37 mer) (SEQ ID NO: 5)
5' TTTGTCGACAAGGTAGGAGAGATTCTACAGCAACATG 3' i PB674 (40 mer) (SEQ ID NO: 6)
5' TTTGCGGCCGCGTTATTGAGCCATTACTAACCTAATATTG 3'.
Ta para oligonukleotydów pozwala na włączenie miejsca restrykcyjnego SalI, miejsca restrykcyjnego Notl i kodonu inicjacyjnego ATG na końcu 5' wstawki i kodonu stop na końcu 3' wstawki.
Syntezę pierwszej nici cDNA przeprowadza się przez elongację oligonukleotydu PB674 po hybrydyzacji tego ostatniego do matrycy RNA.
Warunki syntezy pierwszej nici cDNA to temperatura 42°C przez 15 min., następnie 99°C przez 5 min., a potem 4°C przez 5 min. Warunki reakcji PCR w obecności pary oligonukleotydów PB670 i PB674 to temperatura 95°C przez 2 min., następnie 40 cykli (95°C przez 30 sek., następnie 50°C przez 45 sek. i 72°C przez 3 min.), a następnie 72°C przez 7 min., aby wyprodukować fragment 1758 bp.
Ten fragment trawiono enzymem restrykcyjnym SaII, a następnie enzymem restrykcyjnym Notl, aby wyizolować, po elektroforezie w żelu agarozowym, fragment Sall-Notl około 1750 bp. Ten fragment zligowano z plazmidem ekspresyjnym pVR1012 (przykład 3) uprzednio strawionym SalI i Notl aby uzyskać plazmid pPB374 (6633 bp). Ten plazmid zawiera pod kontrolą wczesnego promotora hCMV-IE wstawkę kodującą białka gag/pro FIV.
P r z y k ł a d 5: Konstrukcja plazmidu pPB37S
DNA komplementarny (cDNA) FIV syntetyzowano z zestawem Gene Amp RNA PCR Kit (Nr Kat N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) stosując warunki podane przez producenta.
Przeprowadzono reakcję odwrotnej transkrypcji, po czym reakcję łańcuchową polimerazy (reakcja RT-PCR) przeprowadzono z 50 μl zawiesiny wirusowego RNA FIV (przykład 2) i z następującymi oligonukleotydami:
FC116 (36 mer) (SEQ ID NO: 1) i FC120 (48 mer) (SEQ ID NO: 7)
5' TTTTTACCTGCATTTCCTTCTTCCAGTTTTACCTCTTGAATTTCGTTC 3'.
Ta para oligonukleotydów pozwala na włączenie miejsca restrykcyjnego Pstl, miejsca restrykcyjnego BspMI i kodonu inicjacyjnego ATG na końcu 5' wstawki.
Syntezę pierwszej nici cDNA przeprowadza się przez elongację oligonukleotydu FC120 po hybrydyzacji tego ostatniego do matrycy RNA.
Warunki syntezy pierwszej nici cDNA to temperatura 42°C przez 15 min., następnie 99°C przez 5 min., a potem 4°C przez 5 min. Warunki reakcji PCR w obecności pary oligonukleotydów FC116 i FC120 to temperatura 95°C przez 2 min., następnie 40 cykli (95°C przez 30 sek., następnie 50°C przez 45 sek. i 72°C przez 3 min.), a następnie 72°C przez 7 min., aby wyprodukować fragment 265 bp.
Ten fragment trawiono enzymem restrykcyjnym Pstl, a następnie enzymem restrykcyjnym BspMI, aby wyizolować, po elektroforezie w żelu agarozowym, fragment Pstl-BspMI około 240 bp. Ten fragment nazwano fragmentem C.
Druga reakcja odwrotnej transkrypcji, po której nastąpiła reakcja łańcuchowa polimerazy (reakcja „RT-PCR) przeprowadzana jest z 50 μl zawiesiny RNA wirusowego FIV (przykład 2) i z następującymi oligonukleotydami:
PB672 (48 mer) (SEQ ID NO: 8)
5' TTTACTGGAAGAAGGAAATGCAGGTAAAAGGAAAAGACAAAGAAGAAG 3'
PL 210 450 B1 i PB673 (36 mer) (SEQ ID NO: 9)
5' TTTAGATCTTTAGTCCATAAGCATTCTTTCTATTTC 3'.
Ta para oligonukleotydów pozwala na włączenie miejsca restrykcyjnego BspMI, miejsca restrykcyjnego Bglll i kodonu stop na 3' wstawki.
Syntezę pierwszej nici cDNA przeprowadza się przez elongację oligonukleotydu PB673 po hybrydyzacji tego ostatniego do matrycy RNA.
Warunki syntezy pierwszej nici cDNA to temperatura 42°C przez 15 min., następnie 99°C przez 5 min., a potem 4°C przez 5 min. Warunki reakcji PCR w obecności pary oligonukleotydów PB672 i PB673 to temperatura 95 C przez 2 min., następnie 40 cykli (95°C przez 30 sek., następnie 50°C przez 45 sek. i 72°C przez 3 min.), a następnie 72°C przez 7 min., aby wyprodukować fragment 246 bp.
Ten fragment trawiono enzymem restrykcyjnym BspMI, a następnie enzymem restrykcyjnym Bglll, aby wyizolować, po elektroforezie w żelu agarozowym, fragment BspMI-Bglll o wielkości około 230 bp. Ten fragment nazwano fragmentem D.
Fragmenty C i D zligowano z eukariotycznym plazmidem ekspresyjnym pVR1012 (przykład 3) uprzednio strawionym enzymami restrykcyjnymi Pstl i Bglll, aby uzyskać plazmid pPB375 (5316 bp). Plazmid ten zawiera, pod kontrolą promotora wczesnego hCMV-IE wstawkę kodującą białko rev FIV.
P r z y k ł a d 6: Konstrukcja plazmidu pPB383
DNA komplementarny (cDNA) FIV syntetyzowano z zestawem Gene Amp RNA PCR Kit (Nr Kat N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) stosując warunki podane przez producenta.
Przeprowadzono reakcję odwrotnej transkrypcji, po czym reakcję łańcuchową polimerazy (reakcja „RT-PCR) przeprowadzono z 50 μΐ zawiesiny wirusowej RNA FIV (przykład 2) i z następującymi oligonukleotydami:
PB680 (29 mer) (SEQ ID NO: 10)
5' TTTCTGCAGATGGAAGACATAATAGTATT 3', i PB681 (32 mer) (SEQ ID NO: 11)
5' TTTAGATCTCTAAGCAGTAGTTATTGATAATG 3'.
Ta para oligonukleotydów pozwala na włączenie miejsca restrykcyjnego BgIII, miejsca restrykcyjnego Pstl, kodonu inicjacyjnego ATG na końcu 5' wstawki i kodonu stop na końcu 3' wstawki.
Syntezę pierwszej nici cDNA przeprowadza się przez elongację oligonukleotydu PB681 po hybrydyzacji tego ostatniego do matrycy RNA.
Warunki syntezy pierwszej nici cDNA to temperatura 42°C przez 15 min., następnie 99°C przez 5 min., a potem 4°C przez 5 min. Warunki reakcji PCR w obecności pary oligonukleotydów PB680 i PB681 to temperatura 95°C przez 2 min., następnie 40 cykli (95°C przez 30 sek., następnie 50°C przez 45 sek. i 72°C przez 1 min.), a następnie 72°C przez 7 min., aby wyprodukować fragment 254 bp.
Ten fragment trawiono enzymem restrykcyjnym Pstl, a następnie enzymem restrykcyjnym Bglll, aby wyizolować, po elektroforezie w żelu agarozowym, fragment Pstl-Bglll około 240 bp. Ten fragment (fragment E) zligowano z plazmidem ekspresyjnym pVR1012 (przykład 3) uprzednio strawionym Pstl i Bglll, aby uzyskać plazmid pPB383 (5089 bp). Ten plazmid zawiera pod kontrolą wczesnego promotora hCMV-IE wstawkę kodującą białko tat FIV.
P r z y k ł a d 7: Konstrukcja zrekombinowanych wirusów vCP242, vCP253 i vCP255
Patent WO-A-98/21354 opisuje szczegółowo uzyskanie wirusów zrekombinowanych vCP242, vCP253 i vCP255. Odpowiednio, w przykładach 1, 2 i 4.
Wirus zrekombinowany vCP242 zawiera sekwencję nukleotydów kodującą białko env szczepu Villefranche FIV pod kontrolą promotora H6 wirusa krowianki wstawionego w miejsce C6 wirusa ospy kanarka ALVAC.
Wirus zrekombinowany vCP253 zawiera sekwencję nukleotydów kodującą białka gag/pro szczepu Villefranche FIV pod kontrolą promotora I3L wirusa ospy krowianki wstawionego w miejsce C6 wirusa ospy kanarka ALVAC.
Wirus zrekombinowany vCP255 zawiera sekwencję nukleotydów kodującą białko env szczepu Villefranche FIV pod kontrolą promotora H6 wirusa ospy krowianki i sekwencję nukleotydów kodującą białka gag/pro szczepu Villefranche FIV pod kontrolą promotora I3L wirusa ospy krowianki w miejscu C6 wirusa ospy kanarka ALVAC.
P r z y k ł a d 8: Konstrukcja plazmidu dawcy do wstawiania w miejsce C5 wirusa ospy kanarka ALVAC
Fig. 16 patentu US-A-5,756,103 pokazuje sekwencję fragmentu 3199 bp DNA genomowego wirusa ospy kanarka. Analiza tej sekwencji wykazała otwartą ramkę odczytu (ORF), którą nazwano C5L,
PL 210 450 B1 która rozpoczyna się w pozycji 1538 i kończy się w pozycji 1859. Konstrukcja plazmidu insercyjnego dającego delecję ORF C5L i jej zastąpienie przez wielokrotne miejsce klonowania flankowane przez sygnały zatrzymania transkrypcji i translacji zostały przeprowadzone jak opisano dalej.
Przeprowadzono reakcję PCR na podstawie matrycy złożonej z genomowego DNA wirusa ospy kanarka z następującymi oligonukleotydami:
C5A1 (42 mer) (SEQ ID NO: 12):
5' ATCATCGAGCTCCAGCTGTAATTCATGGTCGAAAAGAAGTGC 3' i FC121 (79 mer) (SEQ ID NO: 13):
5' GAATTCCTCGAGAGATCTCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTC
ATTTTTTGAGAGTACCACTTCAGCTACCTC 3' aby wyizolować fragment PCR o wielkości 229 bp (fragment B).
Reakcję PCR przeprowadzono wychodząc z matrycy złożonej z genomowego DNA wirusa ospy kanarka i z następującymi oligonukleotydami:
FC122 (78 mer) (SEQ ID NO: 14):
5'CCCGGGCTGCAGAGATCTCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGT
CATTATAAAGATCTAAAATGCATAATTTC 3' i C5D1 (45 mer) (SEQ ID NO: 15):
5' GATGATGGTACCGTAAACAAATATAATGAAAAGTATTCTAAACTA 3' aby wyizolować fragment PCR 488 bp (fragment C).
Fragmenty B i C hybrydyzowano razem, aby służyły jako matryca dla reakcji PCR przeprowadzonej z oligonukleotydami C5A1 (SEQ ID NO: 12) i C5D1 (SEQ ID NO: 15), aby wygenerować fragment PCR 693 bp. Ten fragment strawiono enzymami restrykcyjnymi SacI i KpnI, aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment SacI-KpnI 676 bp. Ten fragment zligowano z wektorem pBluescript® II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, nr Kat 212205), uprzednio strawionym enzymami restrykcyjnymi SacI i KpnI, aby uzyskać plazmid pFC115. Sekwencję tego plazmidu sprawdzono za pomocą sekwencjonowania. Ten plazmid zawiera 166 bp sekwencji zlokalizowanych powyżej ORF C5L (flankujące lewe ramię C5), sygnał przedwczesnego zatrzymania transkrypcji z krowianki, kodony stop w 6 ramkach odczytu, wielokrotne miejsce klonowania zawierające miejsca restrykcyjne Smal, Pstl, Bglll, Xhol i EcoRI, i na końcu 425 bp sekwencji umieszczonych poniżej ORF C5L („prawe ramię flankujące C5).
Plazmid pMP528HRH (Perkus M. i wsp. J Virol. 1989, 63. 3829-3836) stosowany był jako matryca do amplifikacji całkowitej sekwencji promotora krowianki H6 (GenBank numer dostępu M28351) z nastę pują cymi oligonukleotydami:
JCA291 (34 mer) (SEQ ID NO: 16)
5' AAACCCGGGTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG 3' i JCA292 (43 mer) (SEQ ID NO: 17)
5' AAAAGAATTCGTCGACTACGATACAAACTTAACGGATATCGCG 3' aby zamplifikować fragment PCR 149 bp. Ten fragment strawiono enzymami restrykcyjnymi
Smal i EcoRI, aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym, fragment restrykcyjny Smal-EcoRI 138 bp. Ten fragment następnie zligowano z plazmidem pFC115, uprzednio strawionym Smal i EcoRI, aby uzyskać plazmid pFC116.
P r z y k ł a d 9: Konstrukcja plazmidu dawcy do wstawiania w miejsce C6 wirusa ospy kanarka ALVAC
Fig. 4 patentu WO-A-01/05934 pokazuje sekwencję fragmentu 3700 bp DNA genomowego wirusa ospy kanarka. Analiza tej sekwencji wykazała otwartą ramkę odczytu (ORF), którą nazwano C6L, która rozpoczyna się w pozycji 377 i kończy się w pozycji 2254. Konstrukcja plazmidu insercyjnego dającego delecję ORF C6L i jej zastąpienie przez wielokrotne miejsce klonowania flankowane przez sygnały zatrzymania transkrypcji i translacji zostały przeprowadzone jak opisano dalej.
Przeprowadzono reakcję PCR na podstawie matrycy złożonej z genomowego DNA wirusa ospy kanarka z następującymi oligonukleotydami:
C6A1 (42 mer) (SEQ ID NO: 18):
5' ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT 3' i FC123 (79 mer) (SEQ ID NO: 19):
5' GAATTCCTCGAGAG ATCTCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCA
TTTTTTCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAA 3' aby wyizolować fragment PCR o wielkości 438 bp (fragment D).
PL 210 450 B1
Reakcję PCR przeprowadzono wychodząc z matrycy złożonej z genomowego DNA wirusa ospy kanarka i z następującymi oligonukleotydami:
FC124 (78 mer) (SEQ ID NO: 20):
5' CCCGGGCTGCAGAGATCTCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTC
AAATGAGTATATATAATTGAAAAAGTAA 3' i C6D1 (45 mer) (SEQ ID NO: 21):
5' GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG 3' aby wyizolować fragment PCR 1216 bp (fragment E).
Fragmenty D i E hybrydyzowano razem, aby służyły jako matryca dla reakcji PCR przeprowadzonej z oligonukleotydami C6A1 (SEQ ID NO: 18) i C6D1 (SEQ ID NO: 21), aby wygenerować fragment PCR 1642 bp. Ten fragment strawiono enzymami restrykcyjnymi SacI i KpnI, aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym fragment SacI-KpnI 1625 bp. Ten fragment zligowano z wektorem pBluescript® II SK+ (Stratagene, La Jolla. CA, USA, Nr Kat 212205), uprzednio strawionym enzymami restrykcyjnymi SacI i KpnI, aby uzyskać plazmid pFC117. Sekwencję plazmidu sprawdzono za pomocą sekwencjonowania. Ten plazmid zawiera 370 bp sekwencji zlokalizowanych powyżej ORF C6L (flankujące lewe ramię C6), sygnał przedwczesnego zatrzymania transkrypcji z krowianki, kodony stop w 6 ramkach odczytu, wielokrotne miejsce klonowania zawierające miejsca restrykcyjne Smal, Pstl, Bglll, Xhol i EcoRI i na końcu 1156 bp sekwencji umieszczonych poniżej ORF C6L („prawe ramię flankujące C6).
Plazmid pMPIVC (Schmitt J.F.C. i wsp., J. Virol., 1988, 62, 1889-1897; Saiki R.K. i wsp., Science, 1988, 239, 487-491) stosowany był jako matryca do amplifikacji całkowitej sekwencji promotora krowianki I3L z następującymi oligonukleotydami:
FC112 (33 mer) (SEQ ID NO: 22):
5' AAACCCGGGCGGTGGTTTGCGATTCCGAAATCT 3' i FC113 (43 mer) (SEQ ID NO: 23):
5' AAAAGAATTCGGATCCGATTAAACCTAAATAATTGTACTTTGT 3' aby zamplifikować fragment PCR 151 bp. Ten fragment strawiono enzymami restrykcyjnymi Smal i EcoRI, aby wyizolować po elektroforezie w żelu agarozowym, fragment restrykcyjny Smal-EcoRI o 136 bp. Uzyskany fragment następnie zligowano z plazmidem pFC117, uprzednio strawionym Smal i EcoRI, aby uzyskać plazmid pFC118.
P r z y k ł a d 10: Konstrukcja zrekombinowanego wirusa vCP1719
Fragmenty C i D (przykład 5) ligowano z plazmidem pFC116 (przykład 8) uprzednio strawionym enzymami restrykcyjnymi Pstl i Bglll, aby uzyskać plazmid pFC119.
Fragment E (przykład 6) ligowano z plazmidem pFC118 (przykład 9) uprzednio strawionym enzymami restrykcyjnymi Pstl i Bglll, aby uzyskać plazmid pFC120.
Plazmid pFC120 linearyzowano Notl, następnie transfekowano do komórek pierwotnych zarodków kurczęcia zakażonych wirusem ospy kanarka (szczep ALVAC) według techniki strącania fosforanem wapnia opisanej uprzednio (Panicalli i Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci. 1982, 79, 4927-4931; Piccini i wsp., w Methods in Enzmology, 1987, 153, 545-563, red. Wu R. i Grossman L. Academic Press). Dodatnie płytki wybrano na podstawie hybrydyzacji z sondą znakowaną radioaktywnie specyficzną dla sekwencji nukleotydów białka tat. Te fagi poddano 4 kolejnym cyklom selekcji/oczyszczania fagów, aż do wyizolowania czystej populacji. Łysinka reprezentatywna dla rekombinacji in vitro pomiędzy plazmidem dawcą pFC120 i genomem wirusa ospy kanarka ALVAC została następnie zamplifikowana i uzyskany wyjściowy zrekombinowany wirus określono jako vCP1719.
Dowolnie uzyskane wirusy zrekombinowane stosowano do drugiej transfekcji do pierwotnych komórek zarodków kurczęcia w obecności plazmidu pFC119 linearyzowanego przez Notl według techniki precypitacji fosforanem wapnia. Wybrano dodatnie łysinki na podstawie hybrydyzacji ze znakowaną radioaktywną sondą specyficzną dla sekwencji nukleotydów białka rev. Te fagi poddano 4 kolejnym cyklom selekcji/oczyszczania fagów, aż do wyizolowania czystej populacji. Łysinka reprezentatywna dla rekombinacji in vitro pomiędzy plazmidem dawcą pFC119, pFC120 i genomem wirusa ospy kanarka ALVAC została następnie zamplifikowana i uzyskany wyjściowy zrekombinowany wirus określono jako vCP1720.
P r z y k ł a d 11: Konstrukcja plazmidu pJP090
Krew kota zebrano w probówce zawierającej EDTA za pomocą pobrania krwi z żyły szyjnej. Komórki jednojądrowe zebrano za pomocą wirowania na gradiencie Ficollu, a następnie umieszczono je w hodowli na szalce Petriego o średnicy 60 mm. Komórki jednojądrowe kota następnie stymulowa14
PL 210 450 B1 no konkanawaliną A (conA) (stężenie końcowe około 5 μg/ml) i fitohemaglutyniną (PHA) (stężenie końcowe około 10 μg/ml). Po stymulacji limfocyty ConA i PHA zebrano przez zdrapanie szalek hodowlanych i całkowity RNA tych komórek ekstrahowano stosując zestaw mRNA isolation kit for White Blood Cells (Boehringer Mannheim/Roche Kat Nr 1 934 325).
Całkowity RNA wyekstrahowany z limfoblastów kota stymulowanych ConA i PHA posłużył jako matryca do syntezy pierwszej nici komplementarnego DNA. Tę pierwszą nić komplementarnego DNA zsyntetyzowano przez elongację oligonukleotydu p(dT)15 (Boehringer Mannheim Kat Nr 814 270). DNA komplementarny jednoniciowy następnie stosowano jako matrycę do reakcji PCR z następującymi oligonukleotydami:
FC125 (48 mer) (SEQ ID N° 24):
5' TTTTTTGCGGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAACCTGCTTTTCCTGGGC 3' i FC126 (50 mer) (SEQ ID N°25):
5' TTTTTTGCGGCCGCTACGTATCACTTCTTGACTGGTTTCCAGCAGTCAAA 3' aby zamplifikować fragment PCR o wielkości około 473 par zasad (bp). Ten fragment oczyszczono przez elektroforezę w żelu agarozowym. Fragment strawiono Notl i fragment Notl-Notl 453 bp uzyskany w ten sposób zligowano z plazmidem pVR1012 (przykład 3) uprzednio strawionym Notl, aby uzyskać plazmid pJP090 (5365 bp). Orientacja wstawki w pJP090 została sprawdzona. Fragment Notl-Notl sklonowany w tym plazmidzie poddano sekwencjonowaniu w całości. Uzyskana sekwencja (SEQ ID NO: 26), która koduje białko zbudowane z 144 aminokwasów (SEQ ID NO: 27) odpowiada cytokinie GM-CSF kota.
P r z y k ł a d 12: Wytwarzanie szczepionek DNA
Roztwór DNA zawierający plazmid pPB371 (przykład 3) zatężano za pomocą strącania etanolem, jak opisano w publikacji Sambrook i wsp. (1989). Osad DNA zawieszano w roztworze 1,8% NaCl, aby uzyskać stężenie 1 mg/ml.
Roztwór 0,75 mM DMRIE-DOPE przygotowano przez zawieszenie liofilizatu DMRIE-DOPE w odpowiedniej objętości sterylnej H2O.
Tworzenie kompleksów DNA plazmidowy-lipid przeprowadza się przez rozcieńczenie w równych częściach 0,75 mM roztworu DMRIE-DOPE (1:1) roztworem DNA 1 mg/ml w 1,8% NaCl. Roztwór DNA wprowadza się stopniowo za pomocą sterylnej igły 26G wzdłuż ściany butelki zawierającej roztwór kationowego lipidu, aby uniknąć wytwarzania piany. Następnie miesza się łagodnie od momentu, gdy dwa roztwory zmieszają się. Otrzymuje się w końcu kompozycję zawierającą 0,375 mM DMRIE-DOPE i 500 μg/ml plazmidu.
Jest korzystne, aby wszystkie stosowane dla operacji opisanych powyżej roztwory miały temperaturę pokojową. Pozwala się na zachodzenie kompleksowania DNA z DMRIE-DOPE w temperaturze otoczenia przez czas 30 minut przed przejściem do immunizacji zwierząt.
Szczepionki DNA mogą być też produkowane z roztworami DNA zawierającymi plazmidy pPB374 (przykład 4), pPB375 (przykład 5), pPB383 (przykład 6), pJP090 (przykład 11) lub mieszanek co najmniej dwóch z tych 5 plazmidów według techniki opisanej w tym przykładzie.
P r z y k ł a d 13: Testy ekspresji in vitro
Ekspresję białek FIV badano dla każdego konstruktu metodami klasycznymi immunofluorescencji pośredniej i Western Blot. Te testy przeprowadzono na szalkach Petriego zawierających komórki CHO hodowane w pojedynczych warstwach i transfekowane plazmidami lub zawierających komórki CEF hodowane w pojedynczych warstwach i zakażone przez zrekombinowane wirusy.
Białka FIV wykrywano przez stosowanie znakowanych surowic od kotów zakażonych i anty-surowic.
Wielkość fragmentów otrzymanych po migracji w żelu agarozowym porównywana jest z wielkością oczekiwaną.
P r z y k ł a d 14: Skuteczność u zwierząt
Koty Hillgrove SPF - wolne od specyficznych patogenów (Biological Laboratories Europe Ltd.) i bez przeciwciał anty-FIV, w wieku około 12 tygodni randomizowano do trzech grup po 6 zwierząt.
Koty pierwszej grupy (grupa A) szczepiono w dniu 0 i 28 przez podanie domięśniowe 1 ml mieszaniny plazmidu pPB371 (przykład 3) i pPB374 (przykład 4), a następnie podanie przypominające w dniu 56 drogą domięśniową 1 ml zrekombinowanego wirusa vCP255 (przykład 7) z mianem 108,0 TCID50/ml.
Koty drugiej grupy (grupa B) szczepiono w dniu 0 i 28 przez podanie domięśniowe 1 ml mieszaniny plazmidu pPB371 i pPB374, formułowanych z DMPIE-DOPE (przykład 12), a następnie
PL 210 450 B1 podanie przypominające w dniu 56 drogą domięśniową 1 ml zrekombinowanego wirusa vCP255 (przykład 7) z mianem 108,0 TCID50/ml.
Całkowite stężenie DNA w szczepionkach DNA wynosi 200 μg/ml lub 100 μg/ml dla każdego plazmidu zawartego w mieszaninie.
Stosunek molowy lipid/DNA dla szczepionek DNA formułowanych z DMRIE/DOPE wynosi 0,25. Trzecia grupa (kontrole) jest grupą kontrolną (brak szczepienia, testowane w dniu 84 (D84)). Wszystkie koty testowano w dniu 84 przez podanie dootrzewnowe 1 ml wirusa patogennego
FIV (szczep Petaluma) z mianem 25 CID50/ml) (CID jest zakaźną dawką 50% u kota).
Obserwowano z jednej strony wiremię ocenianą przez reizolację wirusa i PCR, i odpowiedź przeciwciał.
Reizolacja wirusa po teście prowokacji w 4 tygodniu do tygodnia 16 (liczba zwierząt wykazujących dodatnią wiremię):
| Grupy | Reizolacja wirusa | PCR |
| Grupa A | 2/6 | 2/6 |
| Grupa B | 3/6 | 2/6 |
| Kontrole | 6/6 | 5/6 |
Reizolację wirusa przeprowadza się przez wspólną hodowlę około 5x106 komórek jednojądrowych krwi obwodowej (PBMC) z około 106 komórek MYA-1 w podłożu RPMI 1640 przez 21 dni. Obecność prowirusowego DNA FIV obecnego w komórkach PBMC identyfikuje się za pomocą PCR.
Obserwowano brak wiremii u 67% zwierząt grupy A i 50% grupy B.
Odpowiedzi komórkowe w dniu testu i w 4 tygodnie po teście (liczba zwierząt wykazujących odpowiedź CTL dodatnią).
| Wykryty antygen | Gag | Gag | Env | Env |
| Tydzień 0 | Tydzień 4 | Tydzień 0 | Tydzień 4 | |
| Grupa A | 1/6 | 4/6 | 0/6 | 2/6 |
| Grupa B | 2/6 | 6/6 | 2/6 | 0/6 |
| Kontrole | 0/5* | 2/6 | 0/5* | 0/6 |
*- dla jednego zwierzęcia nie było możliwe pobranie próbek
Fibroblasty skóry pobrano u każdego kota. Fibroblasty znakowano 51Cr i następnie infekowano rekombinowanym wirusem krowianki wyrażającym, albo env, albo gag w obecności PBMC pochodzących od każdego z kotów. Odpowiedź cytotoksyczną mierzono przez uwalnianie 51Cr.
Zaobserwowano, że szczepienie stymuluje (efekt priming) odpowiedź cytotoksyczną dla szczepionych grup zwierząt, szczególnie dla gag.
Odpowiedź humoralna po teście (liczba zwierząt mających dodatnią odpowiedź serologiczną w ELISA anty-TM:
| Tydzień | 0 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 |
| Grupa A | 0/6 | 3/6 | 4/6 | 3/6 | 3/6 | 5/6 |
| Grupa B | 0/6 | 3/6 | 5/6 | 5/6 | 4/6 | 6/6 |
| Tydzień | 0 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 |
| Kontrole | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 3/6 | 5/6 | 5/6 |
Jest to test ELISA dla oznaczenia ilościowego przeciwciał stosując peptyd odpowiadający głównemu epitopowi białka transbłonowego (TM).
Szczepienie stymuluje (efekt priming) humoralną odpowiedź immunologiczną (odpornościową). Należy mieć na uwadze, że wynalazek określony przez załączone zastrzeżenia nie jest ograniczony do poszczególnych sposobów wykonania wskazanych w powyższym opisie, ale obejmuje warianty, które nie wykraczają poza zakres ani zamysł niniejszego wynalazku.
PL 210 450 B1
WYKAZ SEKWENCJI <110> Merial <120> Szczepienie przeciw wirusowi nabytego niedoboru immunologicznego kotów <130>PIV szczepienie/przypomnienie <160>25 <170> Patentln wersja 3.1 <210> 1<211> 36<212> DNA<213> syntetyczna<400> 1 ttttttctgc agcaataaga atggcagaag gatttg 36 <210> 2<211> 36<212> DNA<213> syntetyczna<400> 2 tcgcacctga aacatctcga gtgtttccac atgtat 36 <210> 3<211> 36<212> DNA<213> syntetyczna<400> 3 atacatgtgg aaacactcga gatgtttcag gtgcga 36 <210> 4<211> 54<212> DNA<213> syntetyczna<400> 4 ttttttggat cccccgggct gcaggaattc tgagatactt catcattcct cctc 54 <210> 5<211> 37<212> DNA<213> syntetyczna<400> 5 tttgtcgaca aggtaggaga gattctacag caacatg 37 <210> 6<211> 40<212> DNA<213> syntetyczna<400> 6 tttgcggccg cgttattgag ccattactaa cctaatattg 40 <210> 7<211> 48<212> DNA<213> syntetyczna<400> 7 tttttacctg catttccttc ttccagtttt acctcttgaa tttcgttc 48 <210> 8<211> 48<212> DNA<213> syntetyczna<400> 8 tttactggaa gaaggaaatg caggtaaaag gaaaagacaa agaagaag 48 <210> 9<211> 36<212> DNA<213> syntetyczna<400> 9 tttagatctt tagtccataa gcattctttc tatttc 36 <210> 10<211> 29<212> DNA<213> syntetyczna<400> 10 tttctgcaga tggaagacat aatagtatt 29 <210> 11<211> 32<212> DNA<213> syntetyczna<400> 11 tttagatctc taagcagtag ttattgataa tg 32 <210> 12<211> 42<212> DNA<213> syntetyczna<400> 12 atcatcgagc tccagctgta attcatggtc gaaaagaagt gc 42 <210> 13<211> 79<212> DNA<213> syntetyczna<400> 13 gaattcctcg agagatctct gcagcccggg tttttatagc taattagtca ttttttgaga 60 gtaccacttc agctacctc 79 <210> 14<211> 78<212> DNA<213> syntetyczna<400> 14 cccgggctgc agagatctct cgaggaattc tttttattga ttaactagtc attataaaga 60 tctaaaatgc ataatttc 78
PL 210 450 B1 <210> 15<211> 45<212> DNA<213> syntetyczna<400> 15 gatgatggta ccgtaaacaa atataatgaa aagtattcta aacta 45 <210> 16<211> 34<212> DNA<213> syntetyczna<400> 16 aaacccgggt tctttattct atacttaaaa agtg 34 <210> 17<211> 43<212> DNA<213> syntetyczna<400> 17 aaaagaattc gtcgactacg atacaaactt aacggatatc gcg 43 <210> 18<211> 42<212> DNA<213> syntetyczna<400> 18 atcatcgagc tcgcggccgc ctatcaaaag tcttaatgag tt 42 <210> 19<211> 79<212> DNA<213> syntetyczna<400> 19 gaattcctcg agagatctct gcagcccggg tttttatagc taattagtca ttttttcgta 60 agtaagtatt tttatttaa 79 <210> 20<211> 78<212> DNA<213> syntetyczna<400> 20 cccgggctgc agagatctct cgaggaattc tttttattga ttaactagtc aaatgagtat 60 atataattga aaaagtaa 78 <210> 21<211> 45<212> DNA<213> syntetyczna<400> 21 gatgatggta ccttcataaa tacaagtttg attaaactta agttg 45 <210> 22<211> 33<212> DNA<213> syntetyczna<400> 22 aaacccgggc ggtggtttgc gattccgaaa tet 33 <210> 23<211> 43<212> DNA<213> syntetyczna<400> 23 aaaagaattc ggatccgatt aaacctaaat aattgtactt tgt 43 <210> 24<211> 48<212> DNA<213> syntetyczna<400> 24 ttttttgcgg ccgccaccat gtggctgcag aacctgcttt tcctgggc 48 <210> 25<211> 50<212> DNA<213> syntetyczna<400> 25 ttttttgcgg ccgctacgta tcacttcttg actggtttcc agcagtcaaa 50
Claims (15)
1. Zestaw do szczepienia kotowatych przeciwko wirusowi nabytego niedoboru immunologicznego kotów (FIV) obejmujący oddzielnie kondycjonowane:
- pierwszą szczepionkę zawierającą w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku lub zaróbce, plazmid zawierający i wyrażający in vivo polinukleotyd kodujący env i/lub gag i/lub gag/pro z FIV,
- drugą szczepionkę zawierającą w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku lub zaróbce, wektor wirusowy zawierający i wyrażający in vivo polinukleotyd kodujący env i/lub gag i/lub gag/pro z FIV, przy czym, co najmniej jedno z tych białek env lub gag lub gag/pro kodowane jest zarówno przez plazmidy jak i wektory wirusowe.
2. Zestaw według zastrz. 1, znamienny tym, że pierwsza szczepionka i/lub druga szczepionka wyrażają in vivo polinukleotyd kodujący tat.
3. Zestaw według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wektory wirusowe wybrane są z wirusów ospy ptasiej, korzystnie wirusa ospy kanarków lub wirusa ospy drobiu, i atenuowanych mutantów wirusa krowianki.
4. Zestaw według zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że zawiera dwie dawki szczepionki na bazie plazmidu na dawkę szczepionki na bazie wektora wirusowego.
5. Zestaw według zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że szczepionka na bazie plazmidu i/lub szczepionka na bazie wektora wirusowego zawiera adiuwant.
6. Zestaw według zastrz. 5, znamienny tym, że adiuwant jest cytokiną, korzystnie GM-CSF kota.
7. Zestaw według zastrz. 1 do 5, znamienny tym, że szczepionka zawierająca wektory wirusowe przeznaczona jest do podania jako przypomnienie szczepionki zawierającej plazmidy.
8. Zastosowanie plazmidów zawierających i eksprymujących in vivo polinukleotd(y) kodujący(kodujące) env i/lub gag i/lub gag/pro FIV do wytwarzania pierwszej szczepionki zawierającej plazmidy i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę, w celu podania jako pierwsze szczepienie kotowatym, oraz zastosowania wektorów wirusowych zawierających i eksprymujących in vivo polinukleotyd(y) kodujący(kodujące) env i/lub gag i/lub gag/pro FIV, do wytwarzania drugiej szczepionki zawierającej wektory wirusowe i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę, w celu podania jako przypomnienie tym samym kotowatym, przy czym, co najmniej jedno z białek env lub gag lub gag/pro kodowane jest zarówno przez plazmidy jak i wektory wirusowe dla szczepienia kotowatych przeciw FIV.
9. Zastosowanie plazmidów zawierających i eksprymujących in vivo polinukleotyd(y) kodujący(e) env i/lub gag i/lub gag/pro FIV, do wytwarzania szczepionki zawierającej plazmidy i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę, w celu szczepienia kotowatych przeciwko FIV, do podania kotowatym jako pierwsze podanie, przy czym podanie przypominające przeprowadza się za pomocą szczepionki zawierającej wektory wirusowe zawierające i eksprymujące in vivo polinukleotyd(y) kodujący(e) env i/lub gag i/lub gag/pro FIV i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę, przy czym, co najmniej jedno z białek env lub gag lub gag/pro kodowane jest zarówno przez plazmidy jak i wektory wirusowe.
10. Zastosowanie wektorów wirusowych zawierających i eksprymujących in vivo polinukleotyd(y) kodujący(e) env i/lub gag i/lub gag/pro FIV, do wytwarzania szczepionki zawierającej wektory wirusowe i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę, w celu szczepienia kotowatych przeciwko FIV, do podania kotowatym jako przypomnienie szczepionki zawierającej plazmidy zawierające i eksprymujące in vivo polinukleotyd(y) kodujące env i/lub gag i/lub gag/pro FIV i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę, przy czym, co najmniej jedno z białek env lub gag lub gag/pro kodowane jest zarówno przez plazmidy jak i wektory wirusowe.
11. Zastosowanie według zastrz. 8 do 10, znamienne tym, że plazmidy i/lub wektory wirusowe zawierają polinukleotyd kodujący tat.
12. Zastosowanie według zastrz. 8 do 11, znamienne tym, że wektory wirusowe wybrane są z wirusów ospy ptasiej, korzystnie wirusa ospy kanarków lub wirusa ospy drobiu, i atenuowanych mutantów wirusa krowianki.
13. Zastosowanie według zastrz. 8 do 12, znamienne tym, że dwie szczepionki przeznaczone są do podawania w odstępie od 3 do 6 tygodni, korzystnie w odstępie rzędu 4 tygodni.
14. Zastosowanie według zastrz. 8 do 13, znamienne tym, że szczepionka na bazie plazmidu i/lub szczepionka na bazie wektora wirusowego zawiera adiuwant.
15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że adiuwant jest cytokiną, korzystnie GM-CSF kota.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0107275A FR2825280B1 (fr) | 2001-06-01 | 2001-06-01 | Vaccination contre le virus de l'immunodeficience feline |
| PCT/FR2002/001809 WO2002096349A2 (fr) | 2001-06-01 | 2002-05-29 | Vaccination contre le virus de l'immunodeficience feline |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL365742A1 PL365742A1 (pl) | 2005-01-10 |
| PL210450B1 true PL210450B1 (pl) | 2012-01-31 |
Family
ID=8863923
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL365742A PL210450B1 (pl) | 2001-06-01 | 2002-05-29 | Zestaw do szczepienia kotowatych przeciwko wirusowi nabytego niedoboru immunologicznego kotów (FIV) oraz zastosowanie plazmidów i wektorów wirusowych zawierających i eksprymujących in vivo polinukleotydy do wytwarzania szczepionki |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1418941B9 (pl) |
| JP (1) | JP2004535406A (pl) |
| AT (1) | ATE473013T1 (pl) |
| AU (1) | AU2002314274B2 (pl) |
| BR (1) | BRPI0210229B1 (pl) |
| CA (1) | CA2448620C (pl) |
| CZ (1) | CZ305257B6 (pl) |
| DE (1) | DE60236943D1 (pl) |
| DK (1) | DK1418941T3 (pl) |
| ES (1) | ES2348226T3 (pl) |
| FR (1) | FR2825280B1 (pl) |
| PL (1) | PL210450B1 (pl) |
| PT (1) | PT1418941E (pl) |
| WO (1) | WO2002096349A2 (pl) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2545886A1 (en) | 2003-11-13 | 2005-06-02 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Methods of characterizing infectious bursal disease virus |
| US7862821B2 (en) | 2006-06-01 | 2011-01-04 | Merial Limited | Recombinant vaccine against bluetongue virus |
| EP3038661B1 (en) | 2013-08-29 | 2023-12-27 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | Methods and compositions for rna-guided treatment of hiv infection |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69535125T2 (de) * | 1994-04-29 | 2007-08-30 | Pharmacia & Upjohn Co. Llc, Kalamazoo | Impfstoff gegen felines immunodefizienz-virus |
| US7255862B1 (en) * | 1996-11-14 | 2007-08-14 | Connaught Technology Corporation | ALVAC/FIV constructs |
| EP1185662B1 (fr) * | 1999-06-10 | 2011-03-02 | Merial | Vaccins adn pour les chiens |
| EP1074625A3 (en) * | 1999-06-14 | 2002-01-02 | Pfizer Products Inc. | DNA vaccine against feline immunodeficiency virus |
-
2001
- 2001-06-01 FR FR0107275A patent/FR2825280B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-05-29 CZ CZ2003-3229A patent/CZ305257B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2002-05-29 CA CA2448620A patent/CA2448620C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-29 PT PT02740841T patent/PT1418941E/pt unknown
- 2002-05-29 EP EP02740841A patent/EP1418941B9/fr not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-29 PL PL365742A patent/PL210450B1/pl unknown
- 2002-05-29 BR BRPI0210229A patent/BRPI0210229B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-05-29 AU AU2002314274A patent/AU2002314274B2/en not_active Expired
- 2002-05-29 DE DE60236943T patent/DE60236943D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-29 ES ES02740841T patent/ES2348226T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-29 DK DK02740841.8T patent/DK1418941T3/da active
- 2002-05-29 JP JP2002592862A patent/JP2004535406A/ja active Pending
- 2002-05-29 WO PCT/FR2002/001809 patent/WO2002096349A2/fr active Application Filing
- 2002-05-29 AT AT02740841T patent/ATE473013T1/de active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2825280B1 (fr) | 2005-04-15 |
| PT1418941E (pt) | 2010-10-12 |
| PL365742A1 (pl) | 2005-01-10 |
| CA2448620A1 (en) | 2002-12-05 |
| WO2002096349A2 (fr) | 2002-12-05 |
| EP1418941A2 (fr) | 2004-05-19 |
| EP1418941B9 (fr) | 2010-10-20 |
| DK1418941T3 (da) | 2010-11-01 |
| CA2448620C (en) | 2013-05-28 |
| BRPI0210229B1 (pt) | 2016-11-22 |
| WO2002096349A3 (fr) | 2004-03-11 |
| DE60236943D1 (de) | 2010-08-19 |
| EP1418941B1 (fr) | 2010-07-07 |
| ES2348226T3 (es) | 2010-12-01 |
| CZ20033229A3 (cs) | 2004-03-17 |
| CZ305257B6 (cs) | 2015-07-08 |
| ATE473013T1 (de) | 2010-07-15 |
| AU2002314274B2 (en) | 2008-03-20 |
| FR2825280A1 (fr) | 2002-12-06 |
| JP2004535406A (ja) | 2004-11-25 |
| BR0210229A (pt) | 2004-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2605629C (en) | Nipah virus vaccines | |
| CA2379539C (en) | Feline calicivirus genes and vaccines, in particular recombinant vaccines | |
| US20040241191A1 (en) | Recombinant vaccine against West Nile virus | |
| AU2009308331C1 (en) | Vaccine against African Horse Sickness Virus | |
| AU2002307971B2 (en) | Vaccine against the nile fever virus | |
| EP1425305B1 (en) | Igf-1 as feline vaccine adjuvant, in particular against feline retroviruses | |
| US20030096417A1 (en) | Vaccination against feline immunodeficiency virus | |
| US6541458B1 (en) | Feline calicivirus genes and vaccines in particular recombinant vaccines | |
| AU2012284558B2 (en) | Recombinant feline leukemia virus vaccine containing optimized feline leukemia virus envelope gene | |
| CA2448620C (en) | Vaccination against the feline immunodeficiency virus | |
| US20050031641A1 (en) | Recombinant vaccine against West Nile Virus | |
| AU2014218358B2 (en) | Vaccine against african horse sickness virus | |
| AU2008201425A1 (en) | Vaccination against the feline immunodeficiency virus | |
| US7326417B2 (en) | IGF-1 as feline vaccine adjuvant, in particular against feline retroviruses | |
| ZA200201233B (en) | Feline calicivirus genes and vaccines, in particular recombined vaccines. |