JP2004535406A - ネコ免疫不全性ウイルスに対するワクチン - Google Patents
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Abstract
本発明は、薬剤として許容される媒体又は賦形剤の中に、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードするポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するプラスミドを含む第１ワクチンと、薬剤として許容される媒体又は賦形剤の中に、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードするポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するウイルスベクターを含む第２ワクチンとを含む、ＦＩＶに対してネコの予防接種を行うための、個別に包装されたキットに関する。また、ＦＩＶに対するワクチンを製造するための、プラスミド及び／又はウイルスベクターの使用方法に関する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明はネコ免疫不全性ウイルスに対する免疫化及びワクチンに関する。さらにワクチンのキットにも関する。
【０００２】
ネコ免疫不全性ウイルス（ＦＩＶ）は、レンチウイルスファミリーに属する正の極性の一重鎖ＲＮＡレトロウイルスである。ＦＩＶは、世界中に広まっており、特に、ネコ類、主に猫に感染する。病気の特徴は、痴呆、免疫系の抑制であり、日和見性の疾患の発症や死に至る可能性も引き起こす。
【０００３】
ＦＩＶのＲＮＡ分子は、特にｅｎｖ及びｇａｇの構造タンパク質、特にｐｏｌ及びｐｒｏのウイルス性酵素、特にｔａｔ及びｒｅｖのトランス活性化因子をコードする複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）で構成されている。ｒｅｖ ＯＲＦは２つのエクソンで構成されている。
【０００４】
不活性ワクチンが提案されたが、防御性を有するには、非常に多くの数の抗原が必要であるので、産業化には問題が生じる。他の予防接種、特に、サブユニット形式又は組換え型発現ベクターにより発現したエンベロープタンパク質の使用を試みた。これらの研究からは、満足のいく結果が得られなかった。しかしながら、それらの研究により増強現象が明らかになり、ウイルス血症は、コントロール動物より予防接種をした動物に、早く発症することがわかった。
【背景技術】
【０００５】
Cuisinier（Cuisinier A. M. et al., Vaccine, 1997, 15(10), 1085-1094）の文献は、不活性ウイルスを用いた予防接種の試みの結果、ｇｐ１２０表面糖タンパク質が防御性の決定因子であることを示唆した。しかし、組換え型ｅｎｖタンパク質を用いて、複数の予防接種を試みたが、防御性を導けなかったことも記載している。発明者らは、ＦＩＶｇｐ１２０及びｐ１０（ヌクレオカプシド）をコードするＤＮＡを筋肉内に注入するネコに対する予防接種の実験について記載している。ＦＩＶｇｐ１２０をコードするＤＮＡの投与は、部分的な防御性しか誘導しなかった。ｇｐ１２０及びｐ１０を組み合わせると、防御性は観察されなかった。
【０００６】
一方、Richardson （Richardon J. et al., J. Virol., 1997, 71(12), 9640-9649）の文献は、ＦＩＶｅｎｖをコードするプラスミドの投与が、増強現象を引き起こすことを報告している。この現象は、ＦＩＶの組換え型タンパク質（Lutz H. et al., AIDS Research and Human Retroviruses, 1996, 12(5), 431-433）、及びＦＩＶｅｎｖをコードするワクシニアウイルス（Osterhaus A.D.M.E. et al., AIDS Research and Human Retroviruses, 1996, 12(5), 437-441）を用いた予防接種でも観察された。
【０００７】
ＷＯ−Ａ−９８／２１３５４は、ＦＩＶに対する予防接種のプロトコールに関して記載されており、その中では、先ず挿入断片としてＦＩＶｅｎｖ及びｇａｇ／ ｐｒｏを有する組換え型カナリア痘ベクターを、続いてＴリンパ球で生成された不活性ＦＩＶを投与する。Cuisinier A.M. et al., Vaccine, 1999, 17, 415-425においても、ｇｐ１２０を発現するＤＮＡの投与が、増強現象の原因である。
【０００８】
不活性ワクチン、サブユニットワクチン及び組換え型ワクチン（ウイルスベクター及びＤＮＡ）の解明に多くの予防接種の実験が行われてきた。現在まで、満足の得られる解決法も、研究の明るい見通しも得られていない。
【０００９】
本出願人は、鋭意研究を行った結果、ウイルスベクター及びＤＮＡ（プラスミド）型の組換え型ワクチンを用いて、ＦＩＶに対するネコへの予防接種の技術を完成させた。完成した技術により、増強に関する問題を生じることなく、ｅｎｖの発現を用いることを可能にしたことは注目すべきである。
【特許文献１】
ＷＯ−Ａ−９８／２１３５４
【非特許文献１】
Cuisinier A. M. et al., Vaccine, 1997, 15(10), 1085-1094
【非特許文献２】
Richardon J. et al., J. Virol., 1997, 71(12), 9640-9649
【非特許文献３】
Lutz H. et al., AIDS Research and Human Retroviruses, 1996, 12(5), 431-433
【非特許文献４】
Osterhaus A.D.M.E. et al., AIDS Research and Human Retroviruses, 1996, 12(5), 437-441
【非特許文献５】
Cuisinier A.M. et al., Caccine, 1999, 17, 415-425
【発明の開示】
【００１０】
発明の第一の目的は、少なくとも１つの共通の免疫原性を含む、少なくとも１回の初回投与と、少なくとも１回の追加投与とを含む投与プロトコールを用いて、ＦＩＶに対するネコの免疫化、及び予防接種を行う方法である。初期投与で用いられる免疫原性の調製物及びワクチンは、追加投与に用いられるものと、本質的に異なる。この投与プロトコールは「プライム・ブースト（prime-boost）」と呼ばれる。本発明によるプライム・ブーストプロトコールは、ＦＩＶｅｎｖ、ｇａｇ又はｇａｇ／ｐｒｏタンパク質のうち少なくとも１つがプラスミド及びウイルスベクターの両方によりコードされている条件で、薬剤として許容される媒体又は賦形剤内に、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードするポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するプラスミドを含む免疫原性の調製物又はワクチンを使用する初期投与と、続いて、薬剤として許容される媒体又は賦形剤内に、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードするポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するウイルスベクターを含む免疫原性の調製物又は組換え型ワクチンを使用する追加投与とを含む。
【００１１】
初期投与は、プラスミドを基にした、同じ免疫原性の調製物又はワクチンの、１又は複数回の投与を含むことができる。同様に、追加投与も、ウイルスベクターを基にした、同じ免疫原性の調製物又はワクチンの、１又は複数回の投与を含むことができる。本発明の特別な実施態様によると、プロトコールは、プラスミドを基にした、同じ免疫原性の調製物又はワクチンの連続した２回の投与と、追加投与としてウイルスベクターを基にした免疫原性の調製物又はワクチンの投与とを含む。
【００１２】
様々な投与は、３〜６週間間隔で行われるのが好ましく、約４週間間隔で行われるのが特に好ましい。好ましい実施態様によると、さらに年に１度、好ましくはウイルスベクターを基にした免疫原性の調製物又はワクチンを用いた追加投与を予定している。動物は、初回投与の時に少なくとも、６〜８週齢であることが好ましい。
【００１３】
プライム・ブーストプロトコールで用いられるプラスミド及びウイルスベクターは、ｅｎｖとｇａｇ、又はｅｎｖとｇａｇ／ｐｒｏを同時に発現することが好ましい。
【００１４】
本発明において、タンパク質の用語は、全タンパク質と実質的に同じ免疫活性を有するペプチドとポリペプチドを含む断片を意味する。したがって、ｅｎｖ遺伝子、ｇａｇ 遺伝子、ｇａｇ／ｐｒｏ遺伝子等の発現は、このようなタンパク質断片、ペプチド及びポリペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を含む。
【００１５】
ポリヌクレオチドは、その発現を制御するために、プロモーターと機能的に関連しており、必要に応じてエンハンサーや、タンパク質の分泌を可能にする安定配列及び／又はシグナル配列と関連している。
【００１６】
他のＦＩＶタンパク質は、初期投与及び／又は追加投与において、ｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏと共に発現することができる。ｔａｔタンパク質及び／又はｒｅｖタンパク質が、特に発現することができ、好ましくはｔａｔ、状況に応じてｒｅｖが発現する。それらは、ｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏに用いたものと同じプラスミド及び／又はウイルスベクター内、又は独自のプラスミド及び／又はウイルスベクター内で発現できる。
【００１７】
特別な実施態様によると、複数のＦＩＶ株が本発明の調製物又はワクチンに示されている。つまり、プロトコールには、２つ、３つ又はそれ以上のＦＩＶ株のｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードするポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するプラスミド及びウイルスベクターの投与が含まれる。したがって、複数のＦＩＶ株のポリヌクレオチドは、単一のウイルスベクター又は複数の独自のウイルスベクターにより保持することができる。プラスミドとしては、独自のプラスミドが好ましいが、複数のＦＩＶ株からのポリヌクレオチドを保持している単一のプラスミドは、除外されていない。
【００１８】
詳細は後述するが、さらに他の態様によれば、プロトコールは、１つ又は複数のサイトカインの同時投与を含むことができ、それはタンパク質の形、又は、ＦＩＶタンパク質及び／又は他のものを発現するために用いられるプラスミド及び／又はウイルスベクターの中のサイトカインをコードするポリヌクレオチドを組み入れる形であってもよい。
【００１９】
本発明による発現ベクターを生成するために、当業者は、様々なＦＩＶ株、それらのゲノムの組織及びそれらのゲノムのヌクレオチド配列を入手することができる。Petaluma株のように使用できるＦＩＶ株を、実施例の章に記載する。これらの又は他の株に関する補足的な情報及びそのヌクレオチド配列は、実施例の章の序文として記載する。
【００２０】
本発明によれば、初期投与は、１つ又は複数のＦＩＶタンパク質をインビボで発現するプラスミドの使用を含んでいる。プラスミドの用語は、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ転写単位と、そのインビボでの発現に必要な要素を含む。スーパーコイル状であっても、そうでなくても、環状のプラスミドが好ましい。直線的な形状も本発明の範囲内である。
【００２１】
各プラスミドは、宿主細胞において、その依存性下に挿入されたポリヌクレオチドの発現を確定するための適切なプロモーターを含んでいる。概ね、それは強い真核生物プロモーターである。好ましい強い真核動物プロモーターは、ヒト若しくはマウス、又は、必要に応じてラットやモルモット等に由来する、初期サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）である。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、エンハンサーに関連している又はしていない、本来のプロモーター部分を含むことができる。ＥＰ−Ａ−２６０１４８、ＥＰ−Ａ−３２３５９７、ＵＳ−Ａ−５１６８０６２、ＵＳ−Ａ−５３８５８３９、ＵＳ−Ａ−４９６８６１５、ＷＯ−Ａ−８７／０３９０５を参照することができる。ヒトＣＭＶ−ＩＥ（Boshart M. et al., Cell., 1985, 41, 521-530)又はマウスＣＭＶ−ＩＥが好ましい。
【００２２】
より一般的な概念では、プロモーターは、ウイルス又は細胞に由来している。ＣＭＶ−ＩＥ以外の強いウイルスプロモーターとしては、ＳＶ４０ウイルスの初期若しくは後期プロモーター、又はラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーターを例示することができる。強い細胞プロモーターとしては、細胞骨格の遺伝子のプロモーター、例えばデスミンプロモーター（Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18(22), 2337-2344）又はアクチンプロモーター（Miyazaki J. et al., gene, 1989, 79(2), 269-277）を挙げることができる。
【００２３】
同様に、適切なプロモーター活性を保持するこれらのプロモーターの細断片も、本発明に含まれる。例えば、ＷＯ−Ａ−９８／００１６６に従って切断されたＣＭＶ−ＩＥプロモーターを挙げることができる。したがって、本発明には、適切なプロモーター活性、好ましくは由来する本体のプロモーターと実質的に同様のプロモーター活性を保持する、誘導体及び細断片も含まれる。ＣＭＶ−ＩＥには、本来のプロモーター部分及び／又はエンハンサー部分と、それらの誘導体並びに細断片とを含んでいる。
【００２４】
プラスミドは発現を制御する他の要素も含むことが好ましい。特に、イントロン型の安定配列、好ましくはウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIを取りこむことが、有用である （van Ooyen et al. Science, 1979, 206: 337-344) 。
【００２５】
プラスミドのポリアデニル化（polyA）シグナルとしては、特にウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）遺伝子（ＵＳ−Ａ−５１２２４５８）、ウサギβグロビン遺伝子又はＳＶ４０ウイルスのものを用いることができる。
【００２６】
本発明によると、追加投与は、１つ又は複数のＦＩＶタンパク質をインビボで発現するウイルスベクターの使用を含んでいる。これらのウイルス発現ベクターは、特にアビポックスウイルス（特に、カナリア痘、鶏痘）又はワクシニアウイルスの弱毒化した変異体である。
【００２７】
ポックスウイルスとしては、当業者は、ＷＯ−Ａ−９０／１２８８２を、さらにワクシニアウイルスに関しては、ＵＳ−Ａ−４７６９３３０；ＵＳ−Ａ−４７２２８４８；ＵＳ−Ａ−４６０３１１２；ＵＳ−Ａ−５１１０５８７；ＵＳ−Ａ−５４９４８０７；ＵＳ−Ａ−５７６２９３８；鶏痘に関してはＵＳ−Ａ−５１７４９９３；ＵＳ−Ａ−５５０５９４１；ＵＳ−Ａ−５７６６５９９；及び、カナリア痘に関してはＵＳ−Ａ−５７５６１０３を参照することができる。
【００２８】
ワクシニアウイルスの弱毒化した変異体としては、ＭＶＡ（Ankara株）（Stickl H. and Hochstein-Mintzel V., Munch, Med, Wschr., 1971, 113, 1149-1153; Sutter G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1992, 89, 10847-10851；市販株ＡＴＣＣ ＶＲ−１５０８；ＭＶＡは、Ankaraワクシニア株を、ニワトリの胚の線繊維芽細胞上を約５７０回以上通過させて入手した）又はＮＹＶＡＣ（その構築は、ＵＳ−Ａ−５４９４８０７の、特に実施例１〜６に記載されている。この特許は、異種の遺伝子の組換え部位への挿入、及び適したプロモーターの利用に関しても記載している。ＷＯ−Ａ−９６／４０２４１も同様に参照のこと）を例示することができる。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様の一つによれば、ポックスウイルスの発現ベクターは、カナリア痘であり、必要に応じて弱毒化され、例えばＡＬＶＡＣ、又はニワトリの胚の線繊維芽細胞（ＣＥＦ）上を約２００回以上通過させた弱毒化したカナリア痘ウイルス（例えばRentschler株）を挙げることができる。カナリア痘ウイルスのＡＬＶＡＣ株は、１９９６年１１月１４日にAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ) に、受託番号ＶＲ−２５４７で寄託されている。カナリア痘は、ＡＴＣＣに受託番号ＶＲ−１１１で商業化されている。弱毒化したカナリア痘ウイルスはＵＳ−Ａ−５７５６１０３及びＷＯ−Ａ−０１／０５９３４に記載されている。
【００３０】
他の弱毒化したポックスウイルス、特に弱毒化した鶏痘（例えばＴＲＯＶＡＣ）を使用することができる。ポックスウイルスＴＲＯＶＡＣに関しては、当業者はＷＯ−Ａ−９６／４０２４１の特許を参照することができる。多くの鶏痘のワクチン株が入手可能であり、例えばMERIALから市販されているワクチンDIFTOSEC CT及びIntervetから市販されているワクチンNOBILIS VARIOLE等である。
【００３１】
発現ベクターがワクシニアウイルスの弱毒化した変異体であるとき、発現する１つ又は複数のポリヌクレオチドの挿入部位は、特にチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、ヘマグルチニン（赤血球凝集素）（ＨＡ）の遺伝子、及びＡ型封入体（ＡＴＩ）の領域である。ＭＶＡウイルスの遺伝子の挿入に関しては、Carroll M. W. et al., Vaccine, 1997, 15(4), 387-394; Stittelaar K. J. et al., J. Virol., 2000, 74(9), 4236-4243; Sutter G. et al., Vaccine, 1994, 12 (11), 1032-1040等、様々な文献に記載されており、当業者が参照することができる。ＭＶＡの完全ゲノムは、Antoine G., Virology, 1998, 244, 365-396に記載されており、これにより、当業者が他の挿入部位又は他のプロモーターを用いることが可能である。
【００３２】
カナリア痘の場合は、挿入部位は、特にＯＲＦ Ｃ３、Ｃ５及びＣ６内に局在しているか、またはそれにより構成されている。鶏痘の場合には、挿入部位は、特にＯＲＦ Ｆ７及びＦ８内に局在するか、それによって構成されている。
【００３３】
発現ベクターがポックスウイルスである場合、好ましくは、発現するポリヌクレオチドは、ポックスウイルスに特異的なプロモーター、特に、ワクシニアプロモーター７．５ｋＤａ(Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35)、ワクシニアプロモーターＩ３Ｌ（Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434）、ワクシニアプロモーターＨＡ(Shida, Virology, 1986, 150, 451-457)、牛痘プロモーターＡＴＩ（Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47）、又はワクシニアプロモーターＨ６（Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508；Guo P. et al. J. Virol, 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. et al., J. Virol, 1989, 63, 3829-3836）、の制御下に挿入される。
【００３４】
また、本発明は、ネコにＦＩＶの予防接種を行うために、ＦＩＶｅｎｖ、ｇａｇ又はｇａｇ／ｐｒｏのタンパク質のうち少なくとも１つがプラスミド及びウイルスベクターの両方によりコードされている条件で、第一に、ネコに初期投与する予定の、プラスミド及び薬剤として許容される媒体又は賦形剤を含む第１の免疫原性の調製物又は第１ワクチンを製造するために、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するプラスミドを使用し、第二に、同じネコへの追加投与として投与する予定の、ウイルスベクター及び薬剤として許容される媒体又は賦形剤を含む第２の免疫原性の調製物又は第２ワクチンを製造するために、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するウイルスベクターを使用するという使用方法に関する。
【００３５】
また、本発明は、ネコにＦＩＶの予防接種を行うために、ＦＩＶｅｎｖ、ｇａｇ又はｇａｇ／ｐｒｏのタンパク質のうち少なくとも１つが、プラスミド及びウイルスベクターの両方によりコードされている条件で、ネコに初期投与する予定の、プラスミド及び薬剤として許容される媒体又は賦形剤を含むワクチンを製造するために、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するプラスミドを使用する方法で、その追加投与は、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するウイルスベクターを含むワクチンを用いて行われる。
【００３６】
さらに、本発明は、ネコにＦＩＶの予防接種を行うために、ＦＩＶｅｎｖ、ｇａｇ又はｇａｇ／ｐｒｏのタンパク質のうち少なくとも１つがプラスミド及びウイルスベクターの両方によりコードされている条件で、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するプラスミド及び薬剤として許容される媒体又は賦形剤を含むワクチンの追加投与として、ネコに投与するウイルスベクター及び薬剤として許容される媒体又は賦形剤を含むワクチンを製造するために、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するウイルスベクターを使用する方法に関する。
【００３７】
さらに、本発明は、ＦＩＶに対してネコ科を免疫化し、ｅｎｖ、ｇａｇ又はｇａｇ／ｐｒｏのタンパク質のうち少なくとも１つがプラスミド及びウイルスベクターの両方によりコードされている条件下で、特に本発明による投与プロトコールにしたがって用いられ、
−薬剤として許容される媒体又は賦形剤内に、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードするポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するプラスミドを含む免疫原性の調製物又はワクチン；
−薬剤として許容される媒体又は賦形剤内に、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードするポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するウイルスベクターを含む免疫原性の調製物又は組換え型ワクチン
を含む、個別に包装されたキットに関する。
【００３８】
プラスミド及びウイルスベクターは、ｅｎｖ及びｇａｇ、又はｅｎｖ及びｇａｇ／ｐｒｏを発現することが望ましい。
【００３９】
本出願記載の、例えばプラスミド及びウイルスベクターの組成物、調製物及びワクチンの組成物、ＦＩＶポリヌクレオチドの組合せ及び投与プロトコール、など全ての特徴は、本発明の他の目的に同じ条件で適用できるは言うまでもない。
【００４０】
免疫原性の組成物の概念は、本発明の条件下で、標的とした種に１度投与してＦＩＶに対する免疫反応を誘導することができる、全ての組成物を含んでいる。ワクチンの用語は、効果的な予防を誘導することができる組成物を意味する。標的とする種は、ネコ類、特に猫である。
【００４１】
薬剤として許容される媒体又は賦形剤は、当業者によく知られている。例えば、０．９％の生理食塩水又はリン酸緩衝液であってもよい。薬剤として許容される媒体又は賦形剤は、ベクターの投与、特にトランスフェクション、及び／又は保存状態の改善を容易にするような全ての化合物、又は化合物の組合せを含む。
【００４２】
本発明の免疫原性の組成物及びワクチンは、好ましくは特に従来のアジュバントから選択される、１つ又は複数のアジュバントを含む。本発明の範囲で特に適しているものは、（１）アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体ポリマー、（２）免疫刺激配列（ＩＳＳ）、特に１つ又は複数の非メチルＣｐＧユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（Klinman D.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1966, 93, 2879-2883; ＷＯ−A１−９８／１６２４７）、（３）水中油型エマルジョン、特に、M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995の“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”１４７ページに記載のＳＰＴエマルジョンと、同文献の１８３ページに記載のエマルジョンＭＦ５９、（４）四級アンモニウム塩を含む陽イオン性脂質、（５）サイトカイン、又は（６）それらの組合せ又は混合物、である。
【００４３】
（３）の水中油型エマルジョンは、ウイルスベクターに特に適しているが、特に次のものをベースとしてもよい。
−軽質流動パラフィン油（ヨーロッパ薬局方型）；
−スクアラン、スクアレン等のイソプレノイド油；
−アルケン、特にイソブテン又はデセンのオリゴマー形成から生じる油
−酸又は直鎖アルキル基を有するアルコールのエステル
−特に、植物性油脂、オレイン酸エチル、プロピレングリコール、ジ（カプリル酸／カプリン酸）、グリセロールトリ（カプリル酸／カプリン酸）及びプロピレングリコールジオレイン酸；
−分枝の脂肪性アルコール又は酸のエステル、特にイソステアリン酸エステル。
【００４４】
油脂を、乳化剤と組み合わせて用いてエマルジョンを形成する。乳化剤は、好ましくは、非イオン性の界面活性剤であり、特に以下のものである。
−ソルビタン、マンナイド（mannide）（例:アンヒドロマンニトールオレイン酸)、グリセロール、ポリグリセロール、又はプロピレングリコ−ルと、オレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸又はヒドロキシステアリン酸とのエステルであり、必要に応じてエトキシレートされたエステル。
−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンのコポリマーブロック、特にプルロニック（Pluronic）、中でもＬ１２１。
【００４５】
タイプ（１）のアジュバントポリマーの中で、架橋したアクリル酸又はメタクリル酸のポリマーが好ましく、特に、糖又はポリアルコールのポリアルケニルエーテルによって架橋されているものが好ましい。これらの化合物は、カルボマー （carbomer）（Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996）の名で知られている。当業者は、少なくとも３つ、好ましくは８つ以下のヒドロキシル基を含み、少なくとも３つのヒドロキシルの水素原子が少なくとも２個のカーボン原子を有する不飽和の、脂肪族のラジカルで置換された、ポリヒドロキシル化合物により架橋されたアクリルポリマーに関して記載したＵＳ−Ａ−２９０９４６２を参照することができる。例えば、ビニール、アリル、及び他のエチレン化した不飽和基等の２〜４個のカーボン原子を含むラジカルが好ましい。不飽和ラジカルも、メチル等他の基質を含むことができる。Carbopol（BF Goodrich社製）の商品名で販売されている製品が特に適切である。その製品は、特にアリルサッカロース又はアリルペンタエリスリトールで架橋されている。その中で、Carbopol ９７４Ｐ、９３４Ｐ及び９７１Ｐを特に例示することができる。
【００４６】
最終的なワクチンの組成物のポリマー濃度は、０．０１〜１．５％Ｗ／Ｖの範囲内であってもよく、特に０．０５〜１％Ｗ／Ｖであり、好ましくは０．１〜０．４％Ｗ／Ｖである。
【００４７】
四級アンモニウム塩を含み、特に、但し排他的ではないがプラスミドに適切である陽イオン性脂質（４）は、好ましくは、以下の化学式を有するものである。
【００４８】
【化１】
式中、Ｒ1は、１２〜１８個のカーボン原子を有する飽和又は不飽和の直鎖の脂肪族ラジカルであり、Ｒ2は、２〜３個のカーボン原子を含む他の脂肪族ラジカルであり、Ｘはヒドロキシル基又はアミン基である。
【００４９】
これらの陽イオン性脂質のなかで、ＤＭＲＩＥ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２、３−ビス（テトラデシロキシ）−１−プロパンアンモニウム；ＷＯ−Ａ−９６／３４０１９）が好ましく、好ましくはＤＯＰＥ（dioleoyo-phosphatidyl-ethanol amine; Behr J.P., 1994, Bioconjugate Chemistry , 5, 382-389）と会合し、ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥを形成する中性脂質が好ましい。
【００５０】
このアジュバントとプラスミドの混合物は、短時間で形成されることが好ましく、投与する前に、このように形成された混合物に、例えば１０分〜６０分、好ましくは約３０分、複合体となる時間をおくことが好ましい。
【００５１】
ＤＯＰＥが存在するとき、ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥの分子比率は、好ましくは９５：５〜５：９５であり、特に１：１である。
【００５２】
プラスミド：ＤＭＲＩＥ又はＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥアジュバントの重量比は、特に５０：１〜１：１０であり、中でも１０：１〜１：５、好ましくは１：１〜１：２である。
【００５３】
１つ又は複数のサイトカイン（５）は、タンパク質の形で、組成物又はワクチンに供給されるか、１つ又は複数のＦＩＶタンパク質と共に宿主で共発現される。タンパク質を発現するベクターと同じベクター、又は独自のベクターによる、１つ又は複数のサイトカインの共発現が好ましい。
【００５４】
サイトカインは、特にネコのサイトカイン、特に猫のものから選択することができ、例えばネコインターロイキン１８（ｆＩＬ−１８）（Taylor S. et al., DNA Seq., 2000, 10(6), 387-394）、ｆＩＬ−１６ （Leutenegger C. M. et al., DNA Seq., 1998, 9(1), 59-63）、ｆＩＬ−１２（Fehr D. et al., DNA Seq., 1997, 8(1-2), 77-82; Imamura T. et al., J. Vet. Med. Sci., 2000, 62(10), 1079-1087）及びネコＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）（GenBank ＡＦ０５３００７) から選択することができる。
【００５５】
本発明によるＦＩＶに対する予防接種は、他のネコの病原性物質に対する予防接種と組み合わせることができる。他のネコの病原性物質は、特にネコ鼻気管炎又はネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、ネコ白血病ウイルス（Ａ型及びＢ型のＦｅＬＶ）、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコカリチウイルス（ＦＣＶ）、ネコ狂犬病ウイルス及びクラミジアである。
【００５６】
本発明による調製物及びワクチンの投与は、例えば皮下投与、皮内投与、筋肉内投与等の非経口ルート、又は経口及び／鼻腔ルートで行ってもよい。
【００５７】
他の調製物及びワクチンは注射針のない液体ジェット式注射器で注入してもよい。
【００５８】
本発明による免疫原性の組成物及びワクチンは、プラスミド又はウイルスベクターの有効量を含み、その量の決定は、当業者が行うことができる。出願人は以下を推奨している。
−プラスミドを基にした免疫原性の組成物又はワクチンの場合、用量は概ね、約１μｇ〜約２０００μｇ、特に約５０μｇ〜約１０００μｇである。用量体積は、０．１〜２ｍｌであってもよく、好ましくは０．２〜１ｍｌである。
−ポックスウイルスを基にした免疫原性の組成物又はワクチンの場合、用量は概ね、約１０3ｐｆｕ〜約１０9ｐｆｕである。ベクターがカナリア痘ウイルスである場合、用量は具体的には約１０5ｐｆｕ〜約１０9ｐｆｕであり、好ましくは約１０6ｐｆｕ〜約１０8ｐｆｕである。ウイルスベクターを基にしたネコの免疫原性の組成物又はワクチンの場合、用量体積は０．１〜２．０ｍｌであり、好ましくは０．２〜１．０ｍｌである。
【００５９】
キットは、１匹の動物又は複数の動物に予防接種を行う用量を含むことができる。特別な実施態様によると、キットは、ウイルスベクターを基にしたワクチンの１用量毎に、プラスミドを基にしたワクチンの２つの用量を含むことができる。
【００６０】
本発明は、以下に実施例を用いてさらに詳細に記載されるが、これらの実施例は何の制限もないものとする
【００６１】
全ての構築は、Sambrook J. et al. （Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York, 1989） が開示した分子生物学の標準技術（クローニング、制限酵素による処理、相補一本鎖ＤＮＡ、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡポリメラーゼによるオリゴヌレオチドの伸張等）を用いて行われる。本発明で用いる全ての制限断片及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の様々な増幅断片は、“Geneclean”キット （La Jolla社製）を用いて単離、精製した。
【００６２】
実施例はＦＩＶ Villefranche ＩＦＦＡ １／８８（Steffan A. M. et al., J. Gen. Virol., 1994, 75, 3647-3653）株を使用する。言うまでもなく、本発明は他のＦＩＶ株にも適用できる。例えば、Petaluma株（American Type Culture Collection （ＡＴＣＣ）からＶＲ−１３１２の番号で、又はGenBankのヌクレオチド配列からＭ２５３８１の番号で入手可能；ｅｎｖ遺伝子：ヌクレオチド６２６６〜８８３６；ｇａｇ遺伝子：ヌクレオチド６２８〜１９８０；ｇａｇ／ｐｒｏ：ヌクレオチド６２８〜２３３６）を挙げることができる。また、参照番号ＶＲ２３３３でＡＴＣＣから入手できるＮＣＳＵ１株も挙げることができる。さらに、Sodora と Bachman （Sodora D. L. et al., J. Virol., 1994, 68(4), 2230-2238; Bachman M. H. et al., J. Virol., 1997, 71(6), 4241-4253）の文献も参照でき、いくつかのＦＩＶ株が記載され、GenBankでの配列のアクセス方法を示している。ＦＩＶ１４株は、GenBankではＮＣ_００１４８２（ｅｎｖ遺伝子：ヌクレオチド６２６６〜８８３６；ｇａｇ遺伝子：ヌクレオチド６２８〜１９８０；ｇａｇ／ｐｒｏ： ヌクレオチド６２８〜２３３６）として参照でき、ＢＭ３０７０は、GenBankではＡＦ４７４２４６（ｅｎｖ遺伝子：ヌクレオチド６２７２〜８８３3；ｇａｇ遺伝子：ヌクレオチド６２８〜１９８０；ｇａｇ／ｐｒｏ: ヌクレオチド６３４〜１９８６）；ＯＭＡ株はGenBankではＵ５６９２８として参照することができる（ｅｎｖ遺伝子：ヌクレオチド６５０６〜９０９７；ｇａｇ遺伝子：ヌクレオチド６７９〜２１７９）等。
【００６３】
当業者は、使用したＦＩＶ株から遺伝子をクローニングするＰＣＲプローブを決定することができる。Villefranche 株のｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｒｏ、ｒｅｖ及びｔａｔをクローニングする下記の実施例において用いられるＰＣＲプローブは、Petaluma等の他の株で用いることができ、さらに、適切な時期に適用することができる。
【実施例１】
【００６４】
［ＦＩＶウイルスの培養］
ネコ免疫不全性ウイルスVillefranche ＩＦＦＡ １／８８株は、Ｑ２０１細胞（ネコヘルパーＴリンパ球; Willet B. et al., J. Gen. Virol., 1997, 78, 611-618）上で培養し、増幅した。
【００６５】
Ｑ２０１細胞を、２５ｃｍ2のFalcon内で、１ｍｌ当たり約１００，０００細胞を含み、２ｍＭのグルタミン、１０％の子ウシ血清、１００Ｕｌ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１００Ｕｌ／ｍｌのヒト組換え型インターロイキン−２を補充したＥａｇｌｅ−ＭＥＭ培地で培養した。細胞を３７℃で培養した。３日後、細胞層がコンフルエントとなる。培養培地を置き換え、ＦＩＶウイルスを５ｐｆu／細胞の割合で添加した。
【００６６】
細胞変性効果（ＣＰＥ）が完了すると（概ね、培養開始４８〜７２時間後）、ウイルス懸濁液を回収し、遠心分離法により清澄化し、−８０℃で凍結した。ウイルスバッチを作製するには、概ね３〜４の連続した継代が必要である。ウイルスバッチは、−８０℃で保存する。
【実施例２】
【００６７】
［ＦＩＶからウイルスＲＮＡの抽出］
１００ｍｌのＦＩＶVillefranche株のウイルス懸濁液に含まれるウイルスＲＮＡを、High Pure Viral RNA Kit（Roche Molecular Biochemical社製）の溶液で溶解した後に、製造者の指示に従い、抽出した。最終的に抽出したＲＮＡ沈殿物を、ＲＮａｓｅを含まない、滅菌した蒸留水１〜２ｍｌで再懸濁した。
【実施例３】
【００６８】
［プラスミドpPB371の構築］
ＦＩＶの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Gene Amp RNA PCR Kit（Perkin-Elmer社製）を用いて、製造者からの条件に従い、合成した。
【００６９】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ＦＩＶのウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１１６（３６ｍｅｒ）（配列番号１）
5' ttttttctgc agcaataaga atggcagaag gatttg 3'
ＦＣ１１７（３６ｍｅｒ）（配列番号２）
5' tcgcacctga aacatctcga gtgtttccac atgtat 3'
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位PstI及びXhoIと挿入物の ５’におけるＡＴＧ開始コドンとの取込みを可能にする。
【００７０】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＦＣ１１７をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＦＣ１１７の伸張によって起こる。
【００７１】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次いで９９℃で５分、最後に４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１１６及びＦＣ１１７の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に４０サイクル（９５℃で３０秒、その後５０℃で４５秒、さらに７２℃で３分）であり、最後に７２℃で７分行い、１４７６ｂｐの断片を作製する。
【００７２】
この断片を制限酵素PstI、さらに制限酵素XhoIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約１４５０ｂｐのPstI - XhoI断片を単離した。この断片は、断片Ａと呼ばれる。
【００７３】
第２の逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ＦＩＶのウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１１８（３６ｍｅｒ）（配列番号３）
5' atacatgtgg aaacactcga gatgtttcag gtgcga 3'
ＦＣ１１９（５４ｍｅｒ）（配列番号４）
5' ttttttggat cccccgggct gcaggaattc tgagatactt catcattcc 3'
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位XhoI及びBamHIと挿入物の３’における停止コドンとの取込みを可能にする。
【００７４】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＦＣ１１８をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＦＣ１１８の伸張によって起こる。
【００７５】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次いで９９℃で５分、最後に４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１１８及びＦＣ１１９の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に４０サイクル（９５℃で１３０秒、その後５０℃で４５秒、さらに７２℃で３分）であり、最後に７２℃で７分行い、１１９３ｂｐの断片を作製する。
【００７６】
この断片を制限酵素XhoI、さらに制限酵素BamHIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約１１７０ｂｐのXhoI - BamHI断片を単離した。この断片は、断片Ｂと呼ばれる。
【００７７】
断片Ａ及びＢは、あらかじめXbal及びEcoRIで処理した真核生物の発現プラスミドpVR1012（ＷＯ−Ａ−９８／０３１９９の図１及び実施例７; Hartikka J. et al., 1997, Human Gene Therapy, 7, 1205-12）と結紮し、プラスミドpPB371（７４６７ｂｐ）を作製した。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス又はｈＣＭＶ−ＩＥ（最初期ヒトサイトメガロウイルス）の初期プロモーターの制御下で、ＦＩＶｅｎｖタンパク質をコードする挿入物を含む。
【実施例４】
【００７８】
［プラスミドpPB374の構築］
ＦＩＶの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Gene Amp RNA PCR Kit（Perkin-Elmer社製）を用いて、製造者からの条件に従い、合成した。
【００７９】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ＦＩＶのウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＰＢ６７０（３７ｍｅｒ）（配列番号５）
5' tttgtcgaca aggtaggaga gattctacag caacatg 3'
ＰＢ６７４（４０ｍｅｒ）（配列番号６）
5' tttgcggccg cgttattgag ccattactaa cctaatattg 3'
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位SalI及びNotIと、挿入物の５’におけるＡＴＧ開始コドン及び３’における停止コドンとの取込みを可能にする。
【００８０】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＰＢ６７４をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＰＢ６７４の伸張によって起こる。
【００８１】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次に９９℃で５分、さらに４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＰＢ６７０及びＰＢ６７４の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に４０サイクル（９５℃で３０秒、その後５０℃で４５秒、さらに７２℃で３分）であり、最後に７２℃で７分行い、１７５８ｐｂの断片を作製した。
【００８２】
この断片を制限酵素SalI、さらに制限酵素NotIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約１７５０ｂｐのSalI - NotI断片を単離した。この断片は、あらかじめSalI及びNotIで処理した発現プラスミドpVR1012（実施例３）と結紮し、プラスミドpPB374（６６３３ｂｐ）を作製した。このプラスミドは、ｈＣＭＶ−ＩＥの初期プロモーターの制御下で、ＦＩＶｒｅｖタンパク質をコードする挿入物を含む。
【実施例５】
【００８３】
［プラスミドpPB375の構築］
ＦＩＶの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Gene Amp RNA PCR Kit（Perkin - Elmer社製）を用いて、製造者からの条件に従い、合成した。
【００８４】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ＦＩＶのウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１１６（３６ｍｅｒ）（配列番号１）
及びＦＣ１２０（４８ｍｅｒ）（配列番号７）
5' tttttacctg catttccttc ttccagtttt acctcttgaa tttcgttc 3'
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位PstI及びBspMI、挿入物の５’におけるＡＴＧ開始コドンとの取込みを可能にする。
【００８５】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＦＣ１２０をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＦＣ１２０の伸張によって起こる。
【００８６】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次に９９℃で５分、さらに４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１１６及びＦＣ１２０の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に４０サイクル（９５℃で３０秒、その後５０℃で４５秒、さらに７２℃で３分）であり、最後に７２℃で７分行い、２６５ｂｐの断片を作製した。
【００８７】
この断片を制限酵素PstI、さらに制限酵素BspMIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２４０ｂｐのPstI - BspMI断片を単離した。この断片は、断片Ｃと呼ばれる。
【００８８】
第２の逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ＦＩＶのウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＰＢ６７２（４８ｍｅｒ）（配列番号８）
5' tttactggaa gaaggaaatg caggtaaaag gaaaagacaa agaagaag 3'
ＰＢ６７３（３６ｍｅｒ）（配列番号９）
5' tttagatctt tagtccataa gcattctttc tatttc 3'
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位BspMI及びBglIIと挿入物の３’における停止コドンとの取込みを可能にする。
【００８９】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＰＢ６７３をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＰＢ６７３の伸張によって起こる。
【００９０】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次いで９９℃で５分、最後に４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＰＢ６７２及びＰＢ６７３の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に４０サイクル（９５℃で３０秒、その後５０℃で４５秒、さらに７２℃で３分）であり、最後に７２℃で７分行い、２４６ｂｐの断片を作製した。
【００９１】
この断片を制限酵素BspMI、さらに制限酵素BglIIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２３０ｂｐのBspMI - BglII断片を単離した。この断片は、断片Ｄと呼ばれる。
【００９２】
断片Ｃ及びＤは、あらかじめPstI及びBglIIで処理した発現プラスミドpVR1012（実施例３）と結紮し、プラスミドpPB375（５３１６ｂｐ）を作製した。このプラスミドは、ｈＣＭＶ−ＩＥの初期プロモーターの制御下で、ＦＩＶｒｅｖタンパク質をコードする挿入物を含む。
【実施例６】
【００９３】
［プラスミドpPB383の構築］
ＦＩＶの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Gene Amp RNA PCR Kit（Perkin-Elmer社製）を用いて、製造者からの条件に従い、合成した。
【００９４】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ＦＩＶのウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＰＢ６８０（２９ｍｅｒ）（配列番号１０）
5' tttctgcaga tggaagacat aatagtatt 3'
及びＰＢ６８１（３２ｍｅｒ）（配列番号１１）
5' tttagatctc taagcagtag ttattgataa tg 3'
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位BglII及びPstIと、挿入物の５’におけるＡＴＧ開始コドンと３’における停止コドンとの取込みを可能にする。
【００９５】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＰＢ６８１をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＰＢ６８１の伸張によって起こる。
【００９６】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次に９９℃で５分、さらに４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＰＢ６８０及びＰＢ６８１の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に４０サイクル（９５℃で３０秒、その後５０℃で４５秒、さらに７２℃で１分）であり、最後に７２℃で７分行い、２５４ｂｐの断片を作製した。
【００９７】
この断片を、制限酵素PstI及びBglIIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２４０ｂｐのPstI - BglII断片を単離した。この断片（断片Ｅ）をあらかじめPstI及びBglIIで処理された発現プラスミドｐＶＲ1012（実施例３）と結紮し、プラスミドpPB383（５０８９ｂｐ）を作製した。このプラスミドは、ｈＣＭＶ−ＩＥの初期プロモーターの制御下で、ＦＩＶｔａｔタンパク質をコードする挿入物を含む。
【実施例７】
【００９８】
［組換え型ウイルスｖＣＰ２４２、ｖＣＰ２５３及びｖＣＰ２５５の構築］
ＷＯ−Ａ−９８／２１３５４の特許は、組換え型ウイルスｖＣＰ２４２、ｖＣＰ２５３及びｖＣＰ２５５の構築を詳細に、実施例１、２及び４でそれぞれ記載している。
【００９９】
組換え型ウイルスｖＣＰ２４２は、ＦＩＶVillefranche株のｅｎｖタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、ワクシニアウイルスのプロモーターＨ６の制御下で含み、カナリア痘ウイルスＡＬＶＡＣのＣ６部位に挿入されている。
【０１００】
組換え型ウイルスｖＣＰ２５３は、ＦＩＶVillefranche株のｇａｇ／ｐｒｏタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、ワクシニアウイルスのプロモーターＩ３Ｌの制御下で含み、カナリア痘ウイルスＡＬＶＡＣのＣ６部位に挿入されている。
【０１０１】
組換え型ウイルスｖＣＰ２５５は、ＦＩＶVillefranche株のｅｎｖタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、ＦＩＶVillefranche株のｇａｇ／ｐｒｏタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを、ワクシニアウイルスのプロモーターＩ３Ｌの制御下で含み、両方ともカナリア痘ウイルスＡＬＶＡＣのＣ６部位に挿入されている。
【実施例８】
【０１０２】
［カナリア痘ウイルスＡＬＶＡＣのＣ５部位に挿入するためのドナープラスミドの構築］
ＵＳ−Ａ−５７５６１０３の図１６は、３１９９ｂｐのカナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡの断片の配列を示している。この配列を分析したところ、Ｃ５Ｌと呼ばれ、１５３８番目の位置で開始し、１８５９番目の位置で停止するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が明らかになった。ＯＲＦ Ｃ５Ｌの欠失と置換とを導く、転写及び翻訳の停止シグナルが隣接する多重クローニング部位を有する挿入プラスミドの構築を下記の方法で行った。
【０１０３】
ＰＣＲ反応は、カナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡで構成されたマトリックスを基にして、下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、２２９ｂｐのＰＣＲ断片（断片Ｂ）を単離した。
Ｃ５Ａ１（４２ｍｅｒ）（配列番号１２）
5' atcatcgagc tccagctgta attcatggtc gaaaagaagt gc 3'
及びＦＣ１２１（７９ｍｅｒ）（配列番号１３）
5' gaattcctcg agagatctct gcagcccggg tttttatagc taattagtc 3'
ＰＣＴ反応は、カナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡで構成されたマトリックスを基にして、下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、４８８ｂｐのＰＣＲ断片（断片Ｃ）を単離した。
ＦＣ１２２（７８ｍｅｒ）（配列番号１４）
5' cccgggctgc agagatctct cgaggaattc tttttattga ttaactagt 3'
Ｃ５Ｄ１（４５ｍｅｒ）（配列番号１５）
5' gatgatggta ccgtaaacaa atataatgaa aagtattcta aacta 3'
断片Ｂ及びＣを共にハイブリダイゼーションし、オリゴヌクレオチドＣ５Ａ１（配列番号１２）及びＣ５Ｄ１（配列番号１５）で行ったＰＣＲ反応のマトリックスとして使用し、６９３ｂｐのＰＣＲ断片を作製した。この断片を、制限酵素SacI及びKpnIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、６７６ｂｐのSacI - KpnI断片を単離した。この断片を、あらかじめ制限酵素SacI及びKpnIで処理したpBlueScript II SK＋ ベクター（Stratagene社製）と結紮し、プラスミドpFC115を作製した。このプラスミドの配列を、シークエンシングにより確認した。このプラスミドは、ＯＲＦ Ｃ５Ｌ（左側面アームＣ５）の上流に局在する１６６ｂｐの配列と、ワクシニア転写初期停止シグナル、６つのリーディングフレーム内の停止コドン、及び制限部位SmaI、PstI、BglII、XhoI及びEcoRI を含む多重クローニング部位と、並びにＯＲＦ Ｃ５Ｌ（右側面アームＣ５）の下流に局在する４２５ｂｐとの配列を含む。
【０１０４】
プラスミドpMP528HRH（Perkus M. et al. J. Virol. 1989. 63. 3829-3836) は、下記オリゴヌクレオチドと共に、ワクチンプロモーターＨ６（GenBankアクセス番号Ｍ２８３５１)の完全な配列を増幅するマトリックスとして使用し、１４９ｂｐのＰＣＲ断片を増幅した。
ＪＣＡ２９１（３４ｍｅｒ）（配列番号１６）
5' aaacccgggt tctttattct atacttaaaa agtg 3'
ＪＣＡ２９２（４３ｍｅｒ）（配列番号１７）
5' aaaagaattc gtcgactacg atacaaactt aacggatatc gcg 3'
この断片を、制限酵素SmaI及びEcoRIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約１３８ｂｐの制限酵素SmaI - EcoRI断片を単離した。この断片を、あらかじめSmaI及びEcoRIで処理したプラスミドpFC115と結紮し、プラスミドpFC116を作製した。
【実施例９】
【０１０５】
［カナリア痘ウイルスＡＬＶＡＣのＣ５部位に挿入するためのドナープラスミドの構築］
ＵＳ−Ａ−０４／２０５９３４の図４は、３７００ｂｐのカナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡ断片の配列を示している。この配列の分析により、Ｃ６Ｌと呼ばれ、３７７番目の位置で開始し、２２５４番目の位置で停止するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が明らかになった。ＯＲＦ Ｃ６Ｌの欠失と置換とを導く、転写及び翻訳停止位置シグナルが隣接した多重クローニング部位を有する挿入プラスミドの構築は、下記の方法で行われた。
【０１０６】
ＰＣＲ反応を、カナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡで構成されたマトリックスを基にして、下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、約４３８ｂｐのＰＣＲ断片（断片Ｄ）を単離した。
Ｃ６Ａ１（４２ｍｅｒ）（配列番号１８）
5' atcatcgagc tcgcggccgc ctatcaaaag tcttaatgag tt 3'
ＦＣ１２３（７９ｍｅｒ）（配列番号１９）
5' gaattcctcg agagatctct gcagcccggg tttttatagc taattagtc 3'
ＰＣＲ反応は、カナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡで構成されたマトリックスを基にして、下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、１２１６ｂｐのＰＣＲ断片を単離した（断片Ｅ）。
ＦＣ１２４（７８ｍｅｒ）（配列番号２０）
5' cccgggctgc agagatctct cgaggaattc tttttattga ttaactagt 3'
Ｃ６Ｄ１（４５ｍｅｒ）（配列番号２１）
5' gatgatggta ccttcataaa tacaagtttg attaaactta agttg 3'
断片Ｄ及びＥは、オリゴヌクレオチドＣ６Ａ１（配列番号１８）及びＣ６Ｄ１（配列番号２１）とのＰＣＲ反応のマトリックスにできるように、共にハイブリダイゼーションを行い、１６４２ｂｐのＰＣＲ断片を作製した。この断片を、制限酵素SacI及びKpnIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、１６２５ｂｐのSacI - KpnI断片を単離した。この断片を、あらかじめ制限酵素SacI及びKpnIで処理して直線化したpBlueScript II SK＋ ベクター（Stratagene社製）に挿入して、プラスミドpFC117を作製した。このプラスミドの配列はシークエンシングによって確認した。このプラスミドは、ＯＲＦ Ｃ6Ｌ（左側面アームＣ６）の上流に局在する３７０ｂｐの配列と、ワクシニア初期転写停止シグナル、６つのリーディングフレーム内の停止コドン、制限部位SmaI、PstI、BglII、XhoI及びEcoRIを含む多重クローニング部位と、並びにＯＲＦ Ｃ６Ｌ（右側面アームＣ６）の下流に局在する１１５６ｂｐの配列を含む。
【０１０７】
プラスミドpMVIC（Schmitt J. F. C. et al., J. Viro., 1988, 62, 1889-1897; Saiki R. K. et al., Science, 1988, 239, 487-491）は、下記オリゴヌクレオチドと共に、ワクシニアプロモーターＩ３Ｌの完全配列を増幅するマトリックスとして用いて、１５１ｂｐのＰＣＲ断片を増幅した。
ＦＣ１１２（３３ｍｅｒ）（配列番号２２）
5' aaacccgggc ggtggtttgc gattccgaaa tct 3'
ＦＣ１１３（４３ｍｅｒ）（配列番号２３）
5' aaaagaattc ggatccgatt aaacctaaat aattgtactt tgt 3'
この断片を、制限酵素SmaI及びEcoRIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約１３６ｂｐの制限酵素SmaI - EcoRI断片を単離した。この断片を、あらかじめSmaI及びEcoRIで処理したプラスミドpFC117と結紮し、プラスミドpFC1１8を作製した。
【実施例１０】
【０１０８】
［組換え型ウイルスｖＣＰ１７１９の構築］
断片Ｄ及びＥ（実施例５）を、あらかじめ制限酵素PstI及びBglIIで処理したプラスミドpFC116（実施例８）で結紮し、プラスミドpFC119を作製した。
【０１０９】
断片Ｅ（実施例６）を、あらかじめ制限酵素PstI及びBglIIで処理したプラスミドpFC118（実施例９）で結紮し、プラスミドpFC120を作製した。
【０１１０】
プラスミドpFC120を、NotIで直線化し、カナリア痘ウイルス（ＡＬＶＡＣ株）に感染した初期ニワトリ胚細胞に、文献（Panicali et Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci. 1982, 79, 4927-4931; Piccini et al., In Methods in Enzymology. 1987, 153, 545-563, Eds. Wu R. Grossman L. Academic Press）記載のリン酸カルシウム沈殿法に従って、トランスフェクトした。陽性プラークを、ｔａｔタンパク質のヌクレオチド配列特異的な、放射活性がある標識化したプローブとのハイブリダイゼーションを基に選択した。これらのプラークは、４回の連続したプラークの選択／浄化サイクルを経て、純粋な個体群を単離した。次に、ドナープラスミドpFC120とカナリア痘ウイルスＡＬＶＡＣのゲノムとのインビトロでの組換えの代表的なプラークを増幅し、その結果得た組換え型ウイルスストックを、ｖＣＰ１７１9と名付けた。
【０１１１】
入手した組換え型ウイルスを任意に用いて、NotIで直線化したプラスミドpFC119の存在下で、初期ニワトリ胚細胞に、リン酸カルシウム沈殿法に従って、２回目のトランスフェクションを行った。陽性プラークを、ｒｅｖタンパク質のヌクレオチド配列特異的な、放射活性がある標識化したプローブとのハイブリダイゼーションを基に選択した。これらのプラークは、４回の連続したプラークの選択／浄化サイクルを経て、純粋な個体群を単離した。次に、ドナープラスミドpFC119、pFC120とＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのゲノムとのインビトロでの組換えの代表的なプラークを増幅し、その結果得た組換え型ウイルスストックを、ｖＣＰ１７２０と名付けた。
【実施例１１】
【０１１２】
［プラスミドpJP090の構築］
猫の頚静脈からＥＤＴＡを含むチューブに採血した。単核細胞を、Ficoll勾配による遠心分離法によって回収し、直径６０ｍｍのペトリ皿で培養した。培養中の猫の単核細胞は、コンカナバリンA（ｃｏｎＡ）（最終濃度、約５μｇ／ｍｌ）又はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（最終濃度、約１０μ／ｍｌ）のいずれかで刺激した。刺激後、「ｃｏｎＡ」 及び「ＰＨＡ」リンパ芽球を、培養皿を掻爬して回収し、これらの細胞の全ＲＮＡを「白血球用ｍＲＮＡ単離キット」（Boehringer Mannheim社製）を用いて抽出した。
【０１１３】
ｃｏｎＡ又はＰＨＡによって刺激した猫のリンパ球から抽出した全ＲＮＡは、相補一本鎖ＤＮＡを合成するためのマトリックスとして用いた。相補一本鎖ＤＮＡは、オリゴヌクレオチドｐ（ｄＴ）１５（Boehringer Mannheim 社製）の伸張によって作製した。入手した相補一本鎖ＤＮＡは、その後、下記ヌクレオチドと共にマトリックスとしてＰＣＲ反応を行い、約４７３塩基対（ｂｐ）のＰＣＲ断片を増幅した。
ＦＣ１２５（４８ｍｅｒ）（配列番号２４）
5' ttttttgcgg ccgccaccat gtggctgcag aacctgcttt tcctgggc 3'
ＦＣ１２６（５０ｍｅｒ）（配列番号２５）
5' ttttttgcgg ccgctacgta tcacttcttg actggtttcc agcagtcaaa 3'
この断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した。この断片をNotIで処理し、このように入手した４５３ｂｐのNotI - NotI断片を、あらかじめNotIで処理したプラスミドpVR1012（実施例３）を直線化し、プラスミドpJP090（５３６５ｂｐ）を作製した。pJP090への挿入方向を確認した。このプラスミドにクローニングしたNotI - NotI断片は、完全に配列決定した。この配列（配列番号２６）は１４４アミノ酸のタンパク質（配列番号２７）をコードし、ネコサイトカインＧＭ−ＣＳＦである。
【実施例１２】
【０１１４】
［ＤＮＡワクチンの製造］
プラスミドpPB371（実施例３）を含むＤＮＡ溶液を、Sambrook et al (1989)に記載の方法で、エタノール沈殿法で濃縮した。ＤＮＡ沈殿物を、１．８％のＮａＣｌ溶液で回収し、１ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。０．７５ｍＭのＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ溶液を、適切な体積の無菌Ｈ2ＯによってＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ凍結乾燥物を回収して、調製した。
【０１１５】
プラスミドＤＮＡ−脂質複合体は、１．８％のＮａＣｌ溶液内に、１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液を、同量の０．７５ｍＭのＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ溶液（１：１）を希釈することにより作製する。ＤＮＡ溶液を、気泡を形成しないように、陽イオン性の脂質溶液を含むフラスコの壁沿いに、２６Ｇの針で徐々に注入した。２種類の溶液の混合後直ちに、ゆっくりと攪拌する。最終的に、０．３７５ｍＭのＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ及び５００μｌ／ｍｌのプラスドを含む組成物を得た。
【０１１６】
上記記載の全ての工程に使用する全ての溶液が、外界温度であることが望ましい。ＤＮＡ／ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥの複合体は、動物を免疫化する３０分間に、外界温度に放置する。
【０１１７】
ＤＮＡワクチンを、本実施例に記載の方法で、プラスミドpPB374（実施例４）、pPB375（実施例５）、pPB383（実施例６）、pJP090（実施例１１）含むＤＮＡ溶液、又はこれら５つのプラスミドの内少なくとも２つの混合物で製造することができる。
【実施例１３】
【０１１８】
［インビトロでの発現検査］
各構築におけるＦＩＶタンパク質の発現を、従来の間接免疫蛍光法及びウェスタンブロット法で検査した。これらの検査は、単層で培養し、プラスミドをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、又は単層で培養し、組換え型ウイルスを感染したＣＥＦ細胞を含む、ペトリ皿で行った。ＦＩＶタンパク質は、感染したネコの血清及び標識化した抗血清を用いて検出された。アガロースゲルに移した後に入手した断片のサイズを、想定していたものと比較した。
【実施例１４】
【０１１９】
［動物への効果］
約１２週齢の抗ＦＩＶ抗体のないＳＰＦHillgroveの猫（Biological Laboratories Europe 社製）を、６匹ずつの３つのグループに無作為に分けた。
【０１２０】
第１グループの猫（グループＡ）に、０日目及び２８日目にワクチンとして、プラスミドpPB371（実施例３）及びpPB374（実施例４）を混合して、筋肉内に注入し、５６日目に追加免疫として、組換え型ウイルスｖＣＰ２５５（実施例７）を、１０8.0ＴＣＩＤ50／ｍｌの力価で筋肉内に注入した。
【０１２１】
第２グループの猫（グループＢ）に、０日目及び２８日目にワクチンとして、ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥで調製したプラスミドpPB371及びpPB374（実施例１２）を混合して、筋肉内に注入し、５６日目の追加免疫として、組換え型ウイルスｖＣＰ２５５（実施例７）を、１０8.0ＴＣＩＤ50／ｍｌの力価で筋肉内に注入した。
【０１２２】
ＤＮＡワクチン内の全ＤＮＡ濃度は２００μｇ／ｍｌであり、混合物に含まれる各プラスミドは１００μｇ／ｍｌである。
【０１２３】
ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥで調製したＤＮＡワクチンの脂質／ＤＮＡ分子比率は、０．２５である。
【０１２４】
第３グループの猫（コントロール）は、コントロール群である（ワクチンなし、８４日目に検証）。
【０１２５】
全ての猫に８４日目に、１ｍｌの病原性ＦＩＶウイルス（Petaluma株）を、２５ＣＩＤ50／ｍｌの力価で腹腔内に注入し、検査した（ＣＩＤは猫における５０％感染量）。
【０１２６】
先ず、抗体に対する応答としてウイルス再単離及びＰＣＲによるウイルス血症を観察した。
【０１２７】
検証後４週間から１６週目までのウイルス再単離（ウイルス血症陽性を示す動物の数）
【０１２８】
【表１】
ウイルスの再単離は、約５×１０6の末梢血管単核細胞（ＰＢＣＭ）と、約１０6ＭＹＡ−１細胞内とを、ＲＰＭＩ１６４０培地で２１日間、共培養して行われる。
【０１２９】
ＰＢＭＣ細胞内に存在するＦＩＶプロウイルスＤＮＡを、ＰＣＲにより同定した。
【０１３０】
ウイルス血症の発現は、グループＡの動物の６７％と、グループＢの動物の５０％で観察されなかった。
【０１３１】
【表２】
皮膚繊維芽細胞は、バイオプシーにより各猫から入手した。繊維芽細胞を51Ｃｒでラベル化し、各猫に由来するＰＢＭＣの存在下で、ｅｎｖ又はｇａｇのいずれかを発現する組換え型ワクシニアを感染させた。51Ｃｒの放出により、細胞障害性（ＣＴＬ）応答を測定した。
【０１３２】
ワクチンが、予防接種を行った動物のグループの、特にｇａｇに対する細胞障害性応答を刺激（初回刺激効果）することを観察した。
【０１３３】
【表３】
前駆（ＴＭ）タンパク質の主要エピトープに対応するペプチドを用いて、抗体を定量するためのＥＬＩＳＡである。
【０１３４】
ワクチンは、体液性免疫応答を刺激（初回刺激効果）する。
【０１３５】
後述のクレームにより定義されている本発明は、上記記載の実施例に制限されるものではなく、文脈又は本発明の主旨のいずれから派生する変異体をも含むことは言うまでもない。
【０００１】
本発明はネコ免疫不全性ウイルスに対する免疫化及びワクチンに関する。さらにワクチンのキットにも関する。
【０００２】
ネコ免疫不全性ウイルス（ＦＩＶ）は、レンチウイルスファミリーに属する正の極性の一重鎖ＲＮＡレトロウイルスである。ＦＩＶは、世界中に広まっており、特に、ネコ類、主に猫に感染する。病気の特徴は、痴呆、免疫系の抑制であり、日和見性の疾患の発症や死に至る可能性も引き起こす。
【０００３】
ＦＩＶのＲＮＡ分子は、特にｅｎｖ及びｇａｇの構造タンパク質、特にｐｏｌ及びｐｒｏのウイルス性酵素、特にｔａｔ及びｒｅｖのトランス活性化因子をコードする複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）で構成されている。ｒｅｖ ＯＲＦは２つのエクソンで構成されている。
【０００４】
不活性ワクチンが提案されたが、防御性を有するには、非常に多くの数の抗原が必要であるので、産業化には問題が生じる。他の予防接種、特に、サブユニット形式又は組換え型発現ベクターにより発現したエンベロープタンパク質の使用を試みた。これらの研究からは、満足のいく結果が得られなかった。しかしながら、それらの研究により増強現象が明らかになり、ウイルス血症は、コントロール動物より予防接種をした動物に、早く発症することがわかった。
【背景技術】
【０００５】
Cuisinier（Cuisinier A. M. et al., Vaccine, 1997, 15(10), 1085-1094）の文献は、不活性ウイルスを用いた予防接種の試みの結果、ｇｐ１２０表面糖タンパク質が防御性の決定因子であることを示唆した。しかし、組換え型ｅｎｖタンパク質を用いて、複数の予防接種を試みたが、防御性を導けなかったことも記載している。発明者らは、ＦＩＶｇｐ１２０及びｐ１０（ヌクレオカプシド）をコードするＤＮＡを筋肉内に注入するネコに対する予防接種の実験について記載している。ＦＩＶｇｐ１２０をコードするＤＮＡの投与は、部分的な防御性しか誘導しなかった。ｇｐ１２０及びｐ１０を組み合わせると、防御性は観察されなかった。
【０００６】
一方、Richardson （Richardon J. et al., J. Virol., 1997, 71(12), 9640-9649）の文献は、ＦＩＶｅｎｖをコードするプラスミドの投与が、増強現象を引き起こすことを報告している。この現象は、ＦＩＶの組換え型タンパク質（Lutz H. et al., AIDS Research and Human Retroviruses, 1996, 12(5), 431-433）、及びＦＩＶｅｎｖをコードするワクシニアウイルス（Osterhaus A.D.M.E. et al., AIDS Research and Human Retroviruses, 1996, 12(5), 437-441）を用いた予防接種でも観察された。
【０００７】
ＷＯ−Ａ−９８／２１３５４は、ＦＩＶに対する予防接種のプロトコールに関して記載されており、その中では、先ず挿入断片としてＦＩＶｅｎｖ及びｇａｇ／ ｐｒｏを有する組換え型カナリア痘ベクターを、続いてＴリンパ球で生成された不活性ＦＩＶを投与する。Cuisinier A.M. et al., Vaccine, 1999, 17, 415-425においても、ｇｐ１２０を発現するＤＮＡの投与が、増強現象の原因である。
【０００８】
不活性ワクチン、サブユニットワクチン及び組換え型ワクチン（ウイルスベクター及びＤＮＡ）の解明に多くの予防接種の実験が行われてきた。現在まで、満足の得られる解決法も、研究の明るい見通しも得られていない。
【０００９】
本出願人は、鋭意研究を行った結果、ウイルスベクター及びＤＮＡ（プラスミド）型の組換え型ワクチンを用いて、ＦＩＶに対するネコへの予防接種の技術を完成させた。完成した技術により、増強に関する問題を生じることなく、ｅｎｖの発現を用いることを可能にしたことは注目すべきである。
【特許文献１】
ＷＯ−Ａ−９８／２１３５４
【非特許文献１】
Cuisinier A. M. et al., Vaccine, 1997, 15(10), 1085-1094
【非特許文献２】
Richardon J. et al., J. Virol., 1997, 71(12), 9640-9649
【非特許文献３】
Lutz H. et al., AIDS Research and Human Retroviruses, 1996, 12(5), 431-433
【非特許文献４】
Osterhaus A.D.M.E. et al., AIDS Research and Human Retroviruses, 1996, 12(5), 437-441
【非特許文献５】
Cuisinier A.M. et al., Caccine, 1999, 17, 415-425
【発明の開示】
【００１０】
発明の第一の目的は、少なくとも１つの共通の免疫原性を含む、少なくとも１回の初回投与と、少なくとも１回の追加投与とを含む投与プロトコールを用いて、ＦＩＶに対するネコの免疫化、及び予防接種を行う方法である。初期投与で用いられる免疫原性の調製物及びワクチンは、追加投与に用いられるものと、本質的に異なる。この投与プロトコールは「プライム・ブースト（prime-boost）」と呼ばれる。本発明によるプライム・ブーストプロトコールは、ＦＩＶｅｎｖ、ｇａｇ又はｇａｇ／ｐｒｏタンパク質のうち少なくとも１つがプラスミド及びウイルスベクターの両方によりコードされている条件で、薬剤として許容される媒体又は賦形剤内に、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードするポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するプラスミドを含む免疫原性の調製物又はワクチンを使用する初期投与と、続いて、薬剤として許容される媒体又は賦形剤内に、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードするポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するウイルスベクターを含む免疫原性の調製物又は組換え型ワクチンを使用する追加投与とを含む。
【００１１】
初期投与は、プラスミドを基にした、同じ免疫原性の調製物又はワクチンの、１又は複数回の投与を含むことができる。同様に、追加投与も、ウイルスベクターを基にした、同じ免疫原性の調製物又はワクチンの、１又は複数回の投与を含むことができる。本発明の特別な実施態様によると、プロトコールは、プラスミドを基にした、同じ免疫原性の調製物又はワクチンの連続した２回の投与と、追加投与としてウイルスベクターを基にした免疫原性の調製物又はワクチンの投与とを含む。
【００１２】
様々な投与は、３〜６週間間隔で行われるのが好ましく、約４週間間隔で行われるのが特に好ましい。好ましい実施態様によると、さらに年に１度、好ましくはウイルスベクターを基にした免疫原性の調製物又はワクチンを用いた追加投与を予定している。動物は、初回投与の時に少なくとも、６〜８週齢であることが好ましい。
【００１３】
プライム・ブーストプロトコールで用いられるプラスミド及びウイルスベクターは、ｅｎｖとｇａｇ、又はｅｎｖとｇａｇ／ｐｒｏを同時に発現することが好ましい。
【００１４】
本発明において、タンパク質の用語は、全タンパク質と実質的に同じ免疫活性を有するペプチドとポリペプチドを含む断片を意味する。したがって、ｅｎｖ遺伝子、ｇａｇ 遺伝子、ｇａｇ／ｐｒｏ遺伝子等の発現は、このようなタンパク質断片、ペプチド及びポリペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を含む。
【００１５】
ポリヌクレオチドは、その発現を制御するために、プロモーターと機能的に関連しており、必要に応じてエンハンサーや、タンパク質の分泌を可能にする安定配列及び／又はシグナル配列と関連している。
【００１６】
他のＦＩＶタンパク質は、初期投与及び／又は追加投与において、ｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏと共に発現することができる。ｔａｔタンパク質及び／又はｒｅｖタンパク質が、特に発現することができ、好ましくはｔａｔ、状況に応じてｒｅｖが発現する。それらは、ｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏに用いたものと同じプラスミド及び／又はウイルスベクター内、又は独自のプラスミド及び／又はウイルスベクター内で発現できる。
【００１７】
特別な実施態様によると、複数のＦＩＶ株が本発明の調製物又はワクチンに示されている。つまり、プロトコールには、２つ、３つ又はそれ以上のＦＩＶ株のｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードするポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するプラスミド及びウイルスベクターの投与が含まれる。したがって、複数のＦＩＶ株のポリヌクレオチドは、単一のウイルスベクター又は複数の独自のウイルスベクターにより保持することができる。プラスミドとしては、独自のプラスミドが好ましいが、複数のＦＩＶ株からのポリヌクレオチドを保持している単一のプラスミドは、除外されていない。
【００１８】
詳細は後述するが、さらに他の態様によれば、プロトコールは、１つ又は複数のサイトカインの同時投与を含むことができ、それはタンパク質の形、又は、ＦＩＶタンパク質及び／又は他のものを発現するために用いられるプラスミド及び／又はウイルスベクターの中のサイトカインをコードするポリヌクレオチドを組み入れる形であってもよい。
【００１９】
本発明による発現ベクターを生成するために、当業者は、様々なＦＩＶ株、それらのゲノムの組織及びそれらのゲノムのヌクレオチド配列を入手することができる。Petaluma株のように使用できるＦＩＶ株を、実施例の章に記載する。これらの又は他の株に関する補足的な情報及びそのヌクレオチド配列は、実施例の章の序文として記載する。
【００２０】
本発明によれば、初期投与は、１つ又は複数のＦＩＶタンパク質をインビボで発現するプラスミドの使用を含んでいる。プラスミドの用語は、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ転写単位と、そのインビボでの発現に必要な要素を含む。スーパーコイル状であっても、そうでなくても、環状のプラスミドが好ましい。直線的な形状も本発明の範囲内である。
【００２１】
各プラスミドは、宿主細胞において、その依存性下に挿入されたポリヌクレオチドの発現を確定するための適切なプロモーターを含んでいる。概ね、それは強い真核生物プロモーターである。好ましい強い真核動物プロモーターは、ヒト若しくはマウス、又は、必要に応じてラットやモルモット等に由来する、初期サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）である。ＣＭＶ−ＩＥプロモーターは、エンハンサーに関連している又はしていない、本来のプロモーター部分を含むことができる。ＥＰ−Ａ−２６０１４８、ＥＰ−Ａ−３２３５９７、ＵＳ−Ａ−５１６８０６２、ＵＳ−Ａ−５３８５８３９、ＵＳ−Ａ−４９６８６１５、ＷＯ−Ａ−８７／０３９０５を参照することができる。ヒトＣＭＶ−ＩＥ（Boshart M. et al., Cell., 1985, 41, 521-530)又はマウスＣＭＶ−ＩＥが好ましい。
【００２２】
より一般的な概念では、プロモーターは、ウイルス又は細胞に由来している。ＣＭＶ−ＩＥ以外の強いウイルスプロモーターとしては、ＳＶ４０ウイルスの初期若しくは後期プロモーター、又はラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーターを例示することができる。強い細胞プロモーターとしては、細胞骨格の遺伝子のプロモーター、例えばデスミンプロモーター（Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18(22), 2337-2344）又はアクチンプロモーター（Miyazaki J. et al., gene, 1989, 79(2), 269-277）を挙げることができる。
【００２３】
同様に、適切なプロモーター活性を保持するこれらのプロモーターの細断片も、本発明に含まれる。例えば、ＷＯ−Ａ−９８／００１６６に従って切断されたＣＭＶ−ＩＥプロモーターを挙げることができる。したがって、本発明には、適切なプロモーター活性、好ましくは由来する本体のプロモーターと実質的に同様のプロモーター活性を保持する、誘導体及び細断片も含まれる。ＣＭＶ−ＩＥには、本来のプロモーター部分及び／又はエンハンサー部分と、それらの誘導体並びに細断片とを含んでいる。
【００２４】
プラスミドは発現を制御する他の要素も含むことが好ましい。特に、イントロン型の安定配列、好ましくはウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンIIを取りこむことが、有用である （van Ooyen et al. Science, 1979, 206: 337-344) 。
【００２５】
プラスミドのポリアデニル化（polyA）シグナルとしては、特にウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）遺伝子（ＵＳ−Ａ−５１２２４５８）、ウサギβグロビン遺伝子又はＳＶ４０ウイルスのものを用いることができる。
【００２６】
本発明によると、追加投与は、１つ又は複数のＦＩＶタンパク質をインビボで発現するウイルスベクターの使用を含んでいる。これらのウイルス発現ベクターは、特にアビポックスウイルス（特に、カナリア痘、鶏痘）又はワクシニアウイルスの弱毒化した変異体である。
【００２７】
ポックスウイルスとしては、当業者は、ＷＯ−Ａ−９０／１２８８２を、さらにワクシニアウイルスに関しては、ＵＳ−Ａ−４７６９３３０；ＵＳ−Ａ−４７２２８４８；ＵＳ−Ａ−４６０３１１２；ＵＳ−Ａ−５１１０５８７；ＵＳ−Ａ−５４９４８０７；ＵＳ−Ａ−５７６２９３８；鶏痘に関してはＵＳ−Ａ−５１７４９９３；ＵＳ−Ａ−５５０５９４１；ＵＳ−Ａ−５７６６５９９；及び、カナリア痘に関してはＵＳ−Ａ−５７５６１０３を参照することができる。
【００２８】
ワクシニアウイルスの弱毒化した変異体としては、ＭＶＡ（Ankara株）（Stickl H. and Hochstein-Mintzel V., Munch, Med, Wschr., 1971, 113, 1149-1153; Sutter G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1992, 89, 10847-10851；市販株ＡＴＣＣ ＶＲ−１５０８；ＭＶＡは、Ankaraワクシニア株を、ニワトリの胚の線繊維芽細胞上を約５７０回以上通過させて入手した）又はＮＹＶＡＣ（その構築は、ＵＳ−Ａ−５４９４８０７の、特に実施例１〜６に記載されている。この特許は、異種の遺伝子の組換え部位への挿入、及び適したプロモーターの利用に関しても記載している。ＷＯ−Ａ−９６／４０２４１も同様に参照のこと）を例示することができる。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様の一つによれば、ポックスウイルスの発現ベクターは、カナリア痘であり、必要に応じて弱毒化され、例えばＡＬＶＡＣ、又はニワトリの胚の線繊維芽細胞（ＣＥＦ）上を約２００回以上通過させた弱毒化したカナリア痘ウイルス（例えばRentschler株）を挙げることができる。カナリア痘ウイルスのＡＬＶＡＣ株は、１９９６年１１月１４日にAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ) に、受託番号ＶＲ−２５４７で寄託されている。カナリア痘は、ＡＴＣＣに受託番号ＶＲ−１１１で商業化されている。弱毒化したカナリア痘ウイルスはＵＳ−Ａ−５７５６１０３及びＷＯ−Ａ−０１／０５９３４に記載されている。
【００３０】
他の弱毒化したポックスウイルス、特に弱毒化した鶏痘（例えばＴＲＯＶＡＣ）を使用することができる。ポックスウイルスＴＲＯＶＡＣに関しては、当業者はＷＯ−Ａ−９６／４０２４１の特許を参照することができる。多くの鶏痘のワクチン株が入手可能であり、例えばMERIALから市販されているワクチンDIFTOSEC CT及びIntervetから市販されているワクチンNOBILIS VARIOLE等である。
【００３１】
発現ベクターがワクシニアウイルスの弱毒化した変異体であるとき、発現する１つ又は複数のポリヌクレオチドの挿入部位は、特にチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、ヘマグルチニン（赤血球凝集素）（ＨＡ）の遺伝子、及びＡ型封入体（ＡＴＩ）の領域である。ＭＶＡウイルスの遺伝子の挿入に関しては、Carroll M. W. et al., Vaccine, 1997, 15(4), 387-394; Stittelaar K. J. et al., J. Virol., 2000, 74(9), 4236-4243; Sutter G. et al., Vaccine, 1994, 12 (11), 1032-1040等、様々な文献に記載されており、当業者が参照することができる。ＭＶＡの完全ゲノムは、Antoine G., Virology, 1998, 244, 365-396に記載されており、これにより、当業者が他の挿入部位又は他のプロモーターを用いることが可能である。
【００３２】
カナリア痘の場合は、挿入部位は、特にＯＲＦ Ｃ３、Ｃ５及びＣ６内に局在しているか、またはそれにより構成されている。鶏痘の場合には、挿入部位は、特にＯＲＦ Ｆ７及びＦ８内に局在するか、それによって構成されている。
【００３３】
発現ベクターがポックスウイルスである場合、好ましくは、発現するポリヌクレオチドは、ポックスウイルスに特異的なプロモーター、特に、ワクシニアプロモーター７．５ｋＤａ(Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35)、ワクシニアプロモーターＩ３Ｌ（Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434）、ワクシニアプロモーターＨＡ(Shida, Virology, 1986, 150, 451-457)、牛痘プロモーターＡＴＩ（Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47）、又はワクシニアプロモーターＨ６（Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508；Guo P. et al. J. Virol, 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. et al., J. Virol, 1989, 63, 3829-3836）、の制御下に挿入される。
【００３４】
また、本発明は、ネコにＦＩＶの予防接種を行うために、ＦＩＶｅｎｖ、ｇａｇ又はｇａｇ／ｐｒｏのタンパク質のうち少なくとも１つがプラスミド及びウイルスベクターの両方によりコードされている条件で、第一に、ネコに初期投与する予定の、プラスミド及び薬剤として許容される媒体又は賦形剤を含む第１の免疫原性の調製物又は第１ワクチンを製造するために、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するプラスミドを使用し、第二に、同じネコへの追加投与として投与する予定の、ウイルスベクター及び薬剤として許容される媒体又は賦形剤を含む第２の免疫原性の調製物又は第２ワクチンを製造するために、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するウイルスベクターを使用するという使用方法に関する。
【００３５】
また、本発明は、ネコにＦＩＶの予防接種を行うために、ＦＩＶｅｎｖ、ｇａｇ又はｇａｇ／ｐｒｏのタンパク質のうち少なくとも１つが、プラスミド及びウイルスベクターの両方によりコードされている条件で、ネコに初期投与する予定の、プラスミド及び薬剤として許容される媒体又は賦形剤を含むワクチンを製造するために、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するプラスミドを使用する方法で、その追加投与は、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するウイルスベクターを含むワクチンを用いて行われる。
【００３６】
さらに、本発明は、ネコにＦＩＶの予防接種を行うために、ＦＩＶｅｎｖ、ｇａｇ又はｇａｇ／ｐｒｏのタンパク質のうち少なくとも１つがプラスミド及びウイルスベクターの両方によりコードされている条件で、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するプラスミド及び薬剤として許容される媒体又は賦形剤を含むワクチンの追加投与として、ネコに投与するウイルスベクター及び薬剤として許容される媒体又は賦形剤を含むワクチンを製造するために、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するウイルスベクターを使用する方法に関する。
【００３７】
さらに、本発明は、ＦＩＶに対してネコ科を免疫化し、ｅｎｖ、ｇａｇ又はｇａｇ／ｐｒｏのタンパク質のうち少なくとも１つがプラスミド及びウイルスベクターの両方によりコードされている条件下で、特に本発明による投与プロトコールにしたがって用いられ、
−薬剤として許容される媒体又は賦形剤内に、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードするポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するプラスミドを含む免疫原性の調製物又はワクチン；
−薬剤として許容される媒体又は賦形剤内に、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードするポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するウイルスベクターを含む免疫原性の調製物又は組換え型ワクチン
を含む、個別に包装されたキットに関する。
【００３８】
プラスミド及びウイルスベクターは、ｅｎｖ及びｇａｇ、又はｅｎｖ及びｇａｇ／ｐｒｏを発現することが望ましい。
【００３９】
本出願記載の、例えばプラスミド及びウイルスベクターの組成物、調製物及びワクチンの組成物、ＦＩＶポリヌクレオチドの組合せ及び投与プロトコール、など全ての特徴は、本発明の他の目的に同じ条件で適用できるは言うまでもない。
【００４０】
免疫原性の組成物の概念は、本発明の条件下で、標的とした種に１度投与してＦＩＶに対する免疫反応を誘導することができる、全ての組成物を含んでいる。ワクチンの用語は、効果的な予防を誘導することができる組成物を意味する。標的とする種は、ネコ類、特に猫である。
【００４１】
薬剤として許容される媒体又は賦形剤は、当業者によく知られている。例えば、０．９％の生理食塩水又はリン酸緩衝液であってもよい。薬剤として許容される媒体又は賦形剤は、ベクターの投与、特にトランスフェクション、及び／又は保存状態の改善を容易にするような全ての化合物、又は化合物の組合せを含む。
【００４２】
本発明の免疫原性の組成物及びワクチンは、好ましくは特に従来のアジュバントから選択される、１つ又は複数のアジュバントを含む。本発明の範囲で特に適しているものは、（１）アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体ポリマー、（２）免疫刺激配列（ＩＳＳ）、特に１つ又は複数の非メチルＣｐＧユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（Klinman D.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1966, 93, 2879-2883; ＷＯ−A１−９８／１６２４７）、（３）水中油型エマルジョン、特に、M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995の“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”１４７ページに記載のＳＰＴエマルジョンと、同文献の１８３ページに記載のエマルジョンＭＦ５９、（４）四級アンモニウム塩を含む陽イオン性脂質、（５）サイトカイン、又は（６）それらの組合せ又は混合物、である。
【００４３】
（３）の水中油型エマルジョンは、ウイルスベクターに特に適しているが、特に次のものをベースとしてもよい。
−軽質流動パラフィン油（ヨーロッパ薬局方型）；
−スクアラン、スクアレン等のイソプレノイド油；
−アルケン、特にイソブテン又はデセンのオリゴマー形成から生じる油
−酸又は直鎖アルキル基を有するアルコールのエステル
−特に、植物性油脂、オレイン酸エチル、プロピレングリコール、ジ（カプリル酸／カプリン酸）、グリセロールトリ（カプリル酸／カプリン酸）及びプロピレングリコールジオレイン酸；
−分枝の脂肪性アルコール又は酸のエステル、特にイソステアリン酸エステル。
【００４４】
油脂を、乳化剤と組み合わせて用いてエマルジョンを形成する。乳化剤は、好ましくは、非イオン性の界面活性剤であり、特に以下のものである。
−ソルビタン、マンナイド（mannide）（例:アンヒドロマンニトールオレイン酸)、グリセロール、ポリグリセロール、又はプロピレングリコ−ルと、オレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸又はヒドロキシステアリン酸とのエステルであり、必要に応じてエトキシレートされたエステル。
−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンのコポリマーブロック、特にプルロニック（Pluronic）、中でもＬ１２１。
【００４５】
タイプ（１）のアジュバントポリマーの中で、架橋したアクリル酸又はメタクリル酸のポリマーが好ましく、特に、糖又はポリアルコールのポリアルケニルエーテルによって架橋されているものが好ましい。これらの化合物は、カルボマー （carbomer）（Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996）の名で知られている。当業者は、少なくとも３つ、好ましくは８つ以下のヒドロキシル基を含み、少なくとも３つのヒドロキシルの水素原子が少なくとも２個のカーボン原子を有する不飽和の、脂肪族のラジカルで置換された、ポリヒドロキシル化合物により架橋されたアクリルポリマーに関して記載したＵＳ−Ａ−２９０９４６２を参照することができる。例えば、ビニール、アリル、及び他のエチレン化した不飽和基等の２〜４個のカーボン原子を含むラジカルが好ましい。不飽和ラジカルも、メチル等他の基質を含むことができる。Carbopol（BF Goodrich社製）の商品名で販売されている製品が特に適切である。その製品は、特にアリルサッカロース又はアリルペンタエリスリトールで架橋されている。その中で、Carbopol ９７４Ｐ、９３４Ｐ及び９７１Ｐを特に例示することができる。
【００４６】
最終的なワクチンの組成物のポリマー濃度は、０．０１〜１．５％Ｗ／Ｖの範囲内であってもよく、特に０．０５〜１％Ｗ／Ｖであり、好ましくは０．１〜０．４％Ｗ／Ｖである。
【００４７】
四級アンモニウム塩を含み、特に、但し排他的ではないがプラスミドに適切である陽イオン性脂質（４）は、好ましくは、以下の化学式を有するものである。
【００４８】
【化１】
【００４９】
これらの陽イオン性脂質のなかで、ＤＭＲＩＥ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２、３−ビス（テトラデシロキシ）−１−プロパンアンモニウム；ＷＯ−Ａ−９６／３４０１９）が好ましく、好ましくはＤＯＰＥ（dioleoyo-phosphatidyl-ethanol amine; Behr J.P., 1994, Bioconjugate Chemistry , 5, 382-389）と会合し、ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥを形成する中性脂質が好ましい。
【００５０】
このアジュバントとプラスミドの混合物は、短時間で形成されることが好ましく、投与する前に、このように形成された混合物に、例えば１０分〜６０分、好ましくは約３０分、複合体となる時間をおくことが好ましい。
【００５１】
ＤＯＰＥが存在するとき、ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥの分子比率は、好ましくは９５：５〜５：９５であり、特に１：１である。
【００５２】
プラスミド：ＤＭＲＩＥ又はＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥアジュバントの重量比は、特に５０：１〜１：１０であり、中でも１０：１〜１：５、好ましくは１：１〜１：２である。
【００５３】
１つ又は複数のサイトカイン（５）は、タンパク質の形で、組成物又はワクチンに供給されるか、１つ又は複数のＦＩＶタンパク質と共に宿主で共発現される。タンパク質を発現するベクターと同じベクター、又は独自のベクターによる、１つ又は複数のサイトカインの共発現が好ましい。
【００５４】
サイトカインは、特にネコのサイトカイン、特に猫のものから選択することができ、例えばネコインターロイキン１８（ｆＩＬ−１８）（Taylor S. et al., DNA Seq., 2000, 10(6), 387-394）、ｆＩＬ−１６ （Leutenegger C. M. et al., DNA Seq., 1998, 9(1), 59-63）、ｆＩＬ−１２（Fehr D. et al., DNA Seq., 1997, 8(1-2), 77-82; Imamura T. et al., J. Vet. Med. Sci., 2000, 62(10), 1079-1087）及びネコＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）（GenBank ＡＦ０５３００７) から選択することができる。
【００５５】
本発明によるＦＩＶに対する予防接種は、他のネコの病原性物質に対する予防接種と組み合わせることができる。他のネコの病原性物質は、特にネコ鼻気管炎又はネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、ネコ白血病ウイルス（Ａ型及びＢ型のＦｅＬＶ）、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコカリチウイルス（ＦＣＶ）、ネコ狂犬病ウイルス及びクラミジアである。
【００５６】
本発明による調製物及びワクチンの投与は、例えば皮下投与、皮内投与、筋肉内投与等の非経口ルート、又は経口及び／鼻腔ルートで行ってもよい。
【００５７】
他の調製物及びワクチンは注射針のない液体ジェット式注射器で注入してもよい。
【００５８】
本発明による免疫原性の組成物及びワクチンは、プラスミド又はウイルスベクターの有効量を含み、その量の決定は、当業者が行うことができる。出願人は以下を推奨している。
−プラスミドを基にした免疫原性の組成物又はワクチンの場合、用量は概ね、約１μｇ〜約２０００μｇ、特に約５０μｇ〜約１０００μｇである。用量体積は、０．１〜２ｍｌであってもよく、好ましくは０．２〜１ｍｌである。
−ポックスウイルスを基にした免疫原性の組成物又はワクチンの場合、用量は概ね、約１０3ｐｆｕ〜約１０9ｐｆｕである。ベクターがカナリア痘ウイルスである場合、用量は具体的には約１０5ｐｆｕ〜約１０9ｐｆｕであり、好ましくは約１０6ｐｆｕ〜約１０8ｐｆｕである。ウイルスベクターを基にしたネコの免疫原性の組成物又はワクチンの場合、用量体積は０．１〜２．０ｍｌであり、好ましくは０．２〜１．０ｍｌである。
【００５９】
キットは、１匹の動物又は複数の動物に予防接種を行う用量を含むことができる。特別な実施態様によると、キットは、ウイルスベクターを基にしたワクチンの１用量毎に、プラスミドを基にしたワクチンの２つの用量を含むことができる。
【００６０】
本発明は、以下に実施例を用いてさらに詳細に記載されるが、これらの実施例は何の制限もないものとする
【００６１】
全ての構築は、Sambrook J. et al. （Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York, 1989） が開示した分子生物学の標準技術（クローニング、制限酵素による処理、相補一本鎖ＤＮＡ、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡポリメラーゼによるオリゴヌレオチドの伸張等）を用いて行われる。本発明で用いる全ての制限断片及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の様々な増幅断片は、“Geneclean”キット （La Jolla社製）を用いて単離、精製した。
【００６２】
実施例はＦＩＶ Villefranche ＩＦＦＡ １／８８（Steffan A. M. et al., J. Gen. Virol., 1994, 75, 3647-3653）株を使用する。言うまでもなく、本発明は他のＦＩＶ株にも適用できる。例えば、Petaluma株（American Type Culture Collection （ＡＴＣＣ）からＶＲ−１３１２の番号で、又はGenBankのヌクレオチド配列からＭ２５３８１の番号で入手可能；ｅｎｖ遺伝子：ヌクレオチド６２６６〜８８３６；ｇａｇ遺伝子：ヌクレオチド６２８〜１９８０；ｇａｇ／ｐｒｏ：ヌクレオチド６２８〜２３３６）を挙げることができる。また、参照番号ＶＲ２３３３でＡＴＣＣから入手できるＮＣＳＵ１株も挙げることができる。さらに、Sodora と Bachman （Sodora D. L. et al., J. Virol., 1994, 68(4), 2230-2238; Bachman M. H. et al., J. Virol., 1997, 71(6), 4241-4253）の文献も参照でき、いくつかのＦＩＶ株が記載され、GenBankでの配列のアクセス方法を示している。ＦＩＶ１４株は、GenBankではＮＣ_００１４８２（ｅｎｖ遺伝子：ヌクレオチド６２６６〜８８３６；ｇａｇ遺伝子：ヌクレオチド６２８〜１９８０；ｇａｇ／ｐｒｏ： ヌクレオチド６２８〜２３３６）として参照でき、ＢＭ３０７０は、GenBankではＡＦ４７４２４６（ｅｎｖ遺伝子：ヌクレオチド６２７２〜８８３3；ｇａｇ遺伝子：ヌクレオチド６２８〜１９８０；ｇａｇ／ｐｒｏ: ヌクレオチド６３４〜１９８６）；ＯＭＡ株はGenBankではＵ５６９２８として参照することができる（ｅｎｖ遺伝子：ヌクレオチド６５０６〜９０９７；ｇａｇ遺伝子：ヌクレオチド６７９〜２１７９）等。
【００６３】
当業者は、使用したＦＩＶ株から遺伝子をクローニングするＰＣＲプローブを決定することができる。Villefranche 株のｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｒｏ、ｒｅｖ及びｔａｔをクローニングする下記の実施例において用いられるＰＣＲプローブは、Petaluma等の他の株で用いることができ、さらに、適切な時期に適用することができる。
【実施例１】
【００６４】
［ＦＩＶウイルスの培養］
ネコ免疫不全性ウイルスVillefranche ＩＦＦＡ １／８８株は、Ｑ２０１細胞（ネコヘルパーＴリンパ球; Willet B. et al., J. Gen. Virol., 1997, 78, 611-618）上で培養し、増幅した。
【００６５】
Ｑ２０１細胞を、２５ｃｍ2のFalcon内で、１ｍｌ当たり約１００，０００細胞を含み、２ｍＭのグルタミン、１０％の子ウシ血清、１００Ｕｌ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１００Ｕｌ／ｍｌのヒト組換え型インターロイキン−２を補充したＥａｇｌｅ−ＭＥＭ培地で培養した。細胞を３７℃で培養した。３日後、細胞層がコンフルエントとなる。培養培地を置き換え、ＦＩＶウイルスを５ｐｆu／細胞の割合で添加した。
【００６６】
細胞変性効果（ＣＰＥ）が完了すると（概ね、培養開始４８〜７２時間後）、ウイルス懸濁液を回収し、遠心分離法により清澄化し、−８０℃で凍結した。ウイルスバッチを作製するには、概ね３〜４の連続した継代が必要である。ウイルスバッチは、−８０℃で保存する。
【実施例２】
【００６７】
［ＦＩＶからウイルスＲＮＡの抽出］
１００ｍｌのＦＩＶVillefranche株のウイルス懸濁液に含まれるウイルスＲＮＡを、High Pure Viral RNA Kit（Roche Molecular Biochemical社製）の溶液で溶解した後に、製造者の指示に従い、抽出した。最終的に抽出したＲＮＡ沈殿物を、ＲＮａｓｅを含まない、滅菌した蒸留水１〜２ｍｌで再懸濁した。
【実施例３】
【００６８】
［プラスミドpPB371の構築］
ＦＩＶの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Gene Amp RNA PCR Kit（Perkin-Elmer社製）を用いて、製造者からの条件に従い、合成した。
【００６９】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ＦＩＶのウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１１６（３６ｍｅｒ）（配列番号１）
5' ttttttctgc agcaataaga atggcagaag gatttg 3'
ＦＣ１１７（３６ｍｅｒ）（配列番号２）
5' tcgcacctga aacatctcga gtgtttccac atgtat 3'
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位PstI及びXhoIと挿入物の ５’におけるＡＴＧ開始コドンとの取込みを可能にする。
【００７０】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＦＣ１１７をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＦＣ１１７の伸張によって起こる。
【００７１】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次いで９９℃で５分、最後に４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１１６及びＦＣ１１７の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に４０サイクル（９５℃で３０秒、その後５０℃で４５秒、さらに７２℃で３分）であり、最後に７２℃で７分行い、１４７６ｂｐの断片を作製する。
【００７２】
この断片を制限酵素PstI、さらに制限酵素XhoIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約１４５０ｂｐのPstI - XhoI断片を単離した。この断片は、断片Ａと呼ばれる。
【００７３】
第２の逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ＦＩＶのウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１１８（３６ｍｅｒ）（配列番号３）
5' atacatgtgg aaacactcga gatgtttcag gtgcga 3'
ＦＣ１１９（５４ｍｅｒ）（配列番号４）
5' ttttttggat cccccgggct gcaggaattc tgagatactt catcattcc 3'
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位XhoI及びBamHIと挿入物の３’における停止コドンとの取込みを可能にする。
【００７４】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＦＣ１１８をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＦＣ１１８の伸張によって起こる。
【００７５】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次いで９９℃で５分、最後に４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１１８及びＦＣ１１９の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に４０サイクル（９５℃で１３０秒、その後５０℃で４５秒、さらに７２℃で３分）であり、最後に７２℃で７分行い、１１９３ｂｐの断片を作製する。
【００７６】
この断片を制限酵素XhoI、さらに制限酵素BamHIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約１１７０ｂｐのXhoI - BamHI断片を単離した。この断片は、断片Ｂと呼ばれる。
【００７７】
断片Ａ及びＢは、あらかじめXbal及びEcoRIで処理した真核生物の発現プラスミドpVR1012（ＷＯ−Ａ−９８／０３１９９の図１及び実施例７; Hartikka J. et al., 1997, Human Gene Therapy, 7, 1205-12）と結紮し、プラスミドpPB371（７４６７ｂｐ）を作製した。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス又はｈＣＭＶ−ＩＥ（最初期ヒトサイトメガロウイルス）の初期プロモーターの制御下で、ＦＩＶｅｎｖタンパク質をコードする挿入物を含む。
【実施例４】
【００７８】
［プラスミドpPB374の構築］
ＦＩＶの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Gene Amp RNA PCR Kit（Perkin-Elmer社製）を用いて、製造者からの条件に従い、合成した。
【００７９】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ＦＩＶのウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＰＢ６７０（３７ｍｅｒ）（配列番号５）
5' tttgtcgaca aggtaggaga gattctacag caacatg 3'
ＰＢ６７４（４０ｍｅｒ）（配列番号６）
5' tttgcggccg cgttattgag ccattactaa cctaatattg 3'
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位SalI及びNotIと、挿入物の５’におけるＡＴＧ開始コドン及び３’における停止コドンとの取込みを可能にする。
【００８０】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＰＢ６７４をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＰＢ６７４の伸張によって起こる。
【００８１】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次に９９℃で５分、さらに４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＰＢ６７０及びＰＢ６７４の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に４０サイクル（９５℃で３０秒、その後５０℃で４５秒、さらに７２℃で３分）であり、最後に７２℃で７分行い、１７５８ｐｂの断片を作製した。
【００８２】
この断片を制限酵素SalI、さらに制限酵素NotIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約１７５０ｂｐのSalI - NotI断片を単離した。この断片は、あらかじめSalI及びNotIで処理した発現プラスミドpVR1012（実施例３）と結紮し、プラスミドpPB374（６６３３ｂｐ）を作製した。このプラスミドは、ｈＣＭＶ−ＩＥの初期プロモーターの制御下で、ＦＩＶｒｅｖタンパク質をコードする挿入物を含む。
【実施例５】
【００８３】
［プラスミドpPB375の構築］
ＦＩＶの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Gene Amp RNA PCR Kit（Perkin - Elmer社製）を用いて、製造者からの条件に従い、合成した。
【００８４】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ＦＩＶのウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１１６（３６ｍｅｒ）（配列番号１）
及びＦＣ１２０（４８ｍｅｒ）（配列番号７）
5' tttttacctg catttccttc ttccagtttt acctcttgaa tttcgttc 3'
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位PstI及びBspMI、挿入物の５’におけるＡＴＧ開始コドンとの取込みを可能にする。
【００８５】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＦＣ１２０をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＦＣ１２０の伸張によって起こる。
【００８６】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次に９９℃で５分、さらに４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１１６及びＦＣ１２０の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に４０サイクル（９５℃で３０秒、その後５０℃で４５秒、さらに７２℃で３分）であり、最後に７２℃で７分行い、２６５ｂｐの断片を作製した。
【００８７】
この断片を制限酵素PstI、さらに制限酵素BspMIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２４０ｂｐのPstI - BspMI断片を単離した。この断片は、断片Ｃと呼ばれる。
【００８８】
第２の逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ＦＩＶのウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＰＢ６７２（４８ｍｅｒ）（配列番号８）
5' tttactggaa gaaggaaatg caggtaaaag gaaaagacaa agaagaag 3'
ＰＢ６７３（３６ｍｅｒ）（配列番号９）
5' tttagatctt tagtccataa gcattctttc tatttc 3'
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位BspMI及びBglIIと挿入物の３’における停止コドンとの取込みを可能にする。
【００８９】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＰＢ６７３をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＰＢ６７３の伸張によって起こる。
【００９０】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次いで９９℃で５分、最後に４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＰＢ６７２及びＰＢ６７３の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に４０サイクル（９５℃で３０秒、その後５０℃で４５秒、さらに７２℃で３分）であり、最後に７２℃で７分行い、２４６ｂｐの断片を作製した。
【００９１】
この断片を制限酵素BspMI、さらに制限酵素BglIIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２３０ｂｐのBspMI - BglII断片を単離した。この断片は、断片Ｄと呼ばれる。
【００９２】
断片Ｃ及びＤは、あらかじめPstI及びBglIIで処理した発現プラスミドpVR1012（実施例３）と結紮し、プラスミドpPB375（５３１６ｂｐ）を作製した。このプラスミドは、ｈＣＭＶ−ＩＥの初期プロモーターの制御下で、ＦＩＶｒｅｖタンパク質をコードする挿入物を含む。
【実施例６】
【００９３】
［プラスミドpPB383の構築］
ＦＩＶの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Gene Amp RNA PCR Kit（Perkin-Elmer社製）を用いて、製造者からの条件に従い、合成した。
【００９４】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ＦＩＶのウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＰＢ６８０（２９ｍｅｒ）（配列番号１０）
5' tttctgcaga tggaagacat aatagtatt 3'
及びＰＢ６８１（３２ｍｅｒ）（配列番号１１）
5' tttagatctc taagcagtag ttattgataa tg 3'
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位BglII及びPstIと、挿入物の５’におけるＡＴＧ開始コドンと３’における停止コドンとの取込みを可能にする。
【００９５】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＰＢ６８１をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＰＢ６８１の伸張によって起こる。
【００９６】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次に９９℃で５分、さらに４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＰＢ６８０及びＰＢ６８１の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に４０サイクル（９５℃で３０秒、その後５０℃で４５秒、さらに７２℃で１分）であり、最後に７２℃で７分行い、２５４ｂｐの断片を作製した。
【００９７】
この断片を、制限酵素PstI及びBglIIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２４０ｂｐのPstI - BglII断片を単離した。この断片（断片Ｅ）をあらかじめPstI及びBglIIで処理された発現プラスミドｐＶＲ1012（実施例３）と結紮し、プラスミドpPB383（５０８９ｂｐ）を作製した。このプラスミドは、ｈＣＭＶ−ＩＥの初期プロモーターの制御下で、ＦＩＶｔａｔタンパク質をコードする挿入物を含む。
【実施例７】
【００９８】
［組換え型ウイルスｖＣＰ２４２、ｖＣＰ２５３及びｖＣＰ２５５の構築］
ＷＯ−Ａ−９８／２１３５４の特許は、組換え型ウイルスｖＣＰ２４２、ｖＣＰ２５３及びｖＣＰ２５５の構築を詳細に、実施例１、２及び４でそれぞれ記載している。
【００９９】
組換え型ウイルスｖＣＰ２４２は、ＦＩＶVillefranche株のｅｎｖタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、ワクシニアウイルスのプロモーターＨ６の制御下で含み、カナリア痘ウイルスＡＬＶＡＣのＣ６部位に挿入されている。
【０１００】
組換え型ウイルスｖＣＰ２５３は、ＦＩＶVillefranche株のｇａｇ／ｐｒｏタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、ワクシニアウイルスのプロモーターＩ３Ｌの制御下で含み、カナリア痘ウイルスＡＬＶＡＣのＣ６部位に挿入されている。
【０１０１】
組換え型ウイルスｖＣＰ２５５は、ＦＩＶVillefranche株のｅｎｖタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、ＦＩＶVillefranche株のｇａｇ／ｐｒｏタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを、ワクシニアウイルスのプロモーターＩ３Ｌの制御下で含み、両方ともカナリア痘ウイルスＡＬＶＡＣのＣ６部位に挿入されている。
【実施例８】
【０１０２】
［カナリア痘ウイルスＡＬＶＡＣのＣ５部位に挿入するためのドナープラスミドの構築］
ＵＳ−Ａ−５７５６１０３の図１６は、３１９９ｂｐのカナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡの断片の配列を示している。この配列を分析したところ、Ｃ５Ｌと呼ばれ、１５３８番目の位置で開始し、１８５９番目の位置で停止するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が明らかになった。ＯＲＦ Ｃ５Ｌの欠失と置換とを導く、転写及び翻訳の停止シグナルが隣接する多重クローニング部位を有する挿入プラスミドの構築を下記の方法で行った。
【０１０３】
ＰＣＲ反応は、カナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡで構成されたマトリックスを基にして、下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、２２９ｂｐのＰＣＲ断片（断片Ｂ）を単離した。
Ｃ５Ａ１（４２ｍｅｒ）（配列番号１２）
5' atcatcgagc tccagctgta attcatggtc gaaaagaagt gc 3'
及びＦＣ１２１（７９ｍｅｒ）（配列番号１３）
5' gaattcctcg agagatctct gcagcccggg tttttatagc taattagtc 3'
ＰＣＴ反応は、カナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡで構成されたマトリックスを基にして、下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、４８８ｂｐのＰＣＲ断片（断片Ｃ）を単離した。
ＦＣ１２２（７８ｍｅｒ）（配列番号１４）
5' cccgggctgc agagatctct cgaggaattc tttttattga ttaactagt 3'
Ｃ５Ｄ１（４５ｍｅｒ）（配列番号１５）
5' gatgatggta ccgtaaacaa atataatgaa aagtattcta aacta 3'
断片Ｂ及びＣを共にハイブリダイゼーションし、オリゴヌクレオチドＣ５Ａ１（配列番号１２）及びＣ５Ｄ１（配列番号１５）で行ったＰＣＲ反応のマトリックスとして使用し、６９３ｂｐのＰＣＲ断片を作製した。この断片を、制限酵素SacI及びKpnIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、６７６ｂｐのSacI - KpnI断片を単離した。この断片を、あらかじめ制限酵素SacI及びKpnIで処理したpBlueScript II SK＋ ベクター（Stratagene社製）と結紮し、プラスミドpFC115を作製した。このプラスミドの配列を、シークエンシングにより確認した。このプラスミドは、ＯＲＦ Ｃ５Ｌ（左側面アームＣ５）の上流に局在する１６６ｂｐの配列と、ワクシニア転写初期停止シグナル、６つのリーディングフレーム内の停止コドン、及び制限部位SmaI、PstI、BglII、XhoI及びEcoRI を含む多重クローニング部位と、並びにＯＲＦ Ｃ５Ｌ（右側面アームＣ５）の下流に局在する４２５ｂｐとの配列を含む。
【０１０４】
プラスミドpMP528HRH（Perkus M. et al. J. Virol. 1989. 63. 3829-3836) は、下記オリゴヌクレオチドと共に、ワクチンプロモーターＨ６（GenBankアクセス番号Ｍ２８３５１)の完全な配列を増幅するマトリックスとして使用し、１４９ｂｐのＰＣＲ断片を増幅した。
ＪＣＡ２９１（３４ｍｅｒ）（配列番号１６）
5' aaacccgggt tctttattct atacttaaaa agtg 3'
ＪＣＡ２９２（４３ｍｅｒ）（配列番号１７）
5' aaaagaattc gtcgactacg atacaaactt aacggatatc gcg 3'
この断片を、制限酵素SmaI及びEcoRIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約１３８ｂｐの制限酵素SmaI - EcoRI断片を単離した。この断片を、あらかじめSmaI及びEcoRIで処理したプラスミドpFC115と結紮し、プラスミドpFC116を作製した。
【実施例９】
【０１０５】
［カナリア痘ウイルスＡＬＶＡＣのＣ５部位に挿入するためのドナープラスミドの構築］
ＵＳ−Ａ−０４／２０５９３４の図４は、３７００ｂｐのカナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡ断片の配列を示している。この配列の分析により、Ｃ６Ｌと呼ばれ、３７７番目の位置で開始し、２２５４番目の位置で停止するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が明らかになった。ＯＲＦ Ｃ６Ｌの欠失と置換とを導く、転写及び翻訳停止位置シグナルが隣接した多重クローニング部位を有する挿入プラスミドの構築は、下記の方法で行われた。
【０１０６】
ＰＣＲ反応を、カナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡで構成されたマトリックスを基にして、下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、約４３８ｂｐのＰＣＲ断片（断片Ｄ）を単離した。
Ｃ６Ａ１（４２ｍｅｒ）（配列番号１８）
5' atcatcgagc tcgcggccgc ctatcaaaag tcttaatgag tt 3'
ＦＣ１２３（７９ｍｅｒ）（配列番号１９）
5' gaattcctcg agagatctct gcagcccggg tttttatagc taattagtc 3'
ＰＣＲ反応は、カナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡで構成されたマトリックスを基にして、下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、１２１６ｂｐのＰＣＲ断片を単離した（断片Ｅ）。
ＦＣ１２４（７８ｍｅｒ）（配列番号２０）
5' cccgggctgc agagatctct cgaggaattc tttttattga ttaactagt 3'
Ｃ６Ｄ１（４５ｍｅｒ）（配列番号２１）
5' gatgatggta ccttcataaa tacaagtttg attaaactta agttg 3'
断片Ｄ及びＥは、オリゴヌクレオチドＣ６Ａ１（配列番号１８）及びＣ６Ｄ１（配列番号２１）とのＰＣＲ反応のマトリックスにできるように、共にハイブリダイゼーションを行い、１６４２ｂｐのＰＣＲ断片を作製した。この断片を、制限酵素SacI及びKpnIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、１６２５ｂｐのSacI - KpnI断片を単離した。この断片を、あらかじめ制限酵素SacI及びKpnIで処理して直線化したpBlueScript II SK＋ ベクター（Stratagene社製）に挿入して、プラスミドpFC117を作製した。このプラスミドの配列はシークエンシングによって確認した。このプラスミドは、ＯＲＦ Ｃ6Ｌ（左側面アームＣ６）の上流に局在する３７０ｂｐの配列と、ワクシニア初期転写停止シグナル、６つのリーディングフレーム内の停止コドン、制限部位SmaI、PstI、BglII、XhoI及びEcoRIを含む多重クローニング部位と、並びにＯＲＦ Ｃ６Ｌ（右側面アームＣ６）の下流に局在する１１５６ｂｐの配列を含む。
【０１０７】
プラスミドpMVIC（Schmitt J. F. C. et al., J. Viro., 1988, 62, 1889-1897; Saiki R. K. et al., Science, 1988, 239, 487-491）は、下記オリゴヌクレオチドと共に、ワクシニアプロモーターＩ３Ｌの完全配列を増幅するマトリックスとして用いて、１５１ｂｐのＰＣＲ断片を増幅した。
ＦＣ１１２（３３ｍｅｒ）（配列番号２２）
5' aaacccgggc ggtggtttgc gattccgaaa tct 3'
ＦＣ１１３（４３ｍｅｒ）（配列番号２３）
5' aaaagaattc ggatccgatt aaacctaaat aattgtactt tgt 3'
この断片を、制限酵素SmaI及びEcoRIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約１３６ｂｐの制限酵素SmaI - EcoRI断片を単離した。この断片を、あらかじめSmaI及びEcoRIで処理したプラスミドpFC117と結紮し、プラスミドpFC1１8を作製した。
【実施例１０】
【０１０８】
［組換え型ウイルスｖＣＰ１７１９の構築］
断片Ｄ及びＥ（実施例５）を、あらかじめ制限酵素PstI及びBglIIで処理したプラスミドpFC116（実施例８）で結紮し、プラスミドpFC119を作製した。
【０１０９】
断片Ｅ（実施例６）を、あらかじめ制限酵素PstI及びBglIIで処理したプラスミドpFC118（実施例９）で結紮し、プラスミドpFC120を作製した。
【０１１０】
プラスミドpFC120を、NotIで直線化し、カナリア痘ウイルス（ＡＬＶＡＣ株）に感染した初期ニワトリ胚細胞に、文献（Panicali et Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci. 1982, 79, 4927-4931; Piccini et al., In Methods in Enzymology. 1987, 153, 545-563, Eds. Wu R. Grossman L. Academic Press）記載のリン酸カルシウム沈殿法に従って、トランスフェクトした。陽性プラークを、ｔａｔタンパク質のヌクレオチド配列特異的な、放射活性がある標識化したプローブとのハイブリダイゼーションを基に選択した。これらのプラークは、４回の連続したプラークの選択／浄化サイクルを経て、純粋な個体群を単離した。次に、ドナープラスミドpFC120とカナリア痘ウイルスＡＬＶＡＣのゲノムとのインビトロでの組換えの代表的なプラークを増幅し、その結果得た組換え型ウイルスストックを、ｖＣＰ１７１9と名付けた。
【０１１１】
入手した組換え型ウイルスを任意に用いて、NotIで直線化したプラスミドpFC119の存在下で、初期ニワトリ胚細胞に、リン酸カルシウム沈殿法に従って、２回目のトランスフェクションを行った。陽性プラークを、ｒｅｖタンパク質のヌクレオチド配列特異的な、放射活性がある標識化したプローブとのハイブリダイゼーションを基に選択した。これらのプラークは、４回の連続したプラークの選択／浄化サイクルを経て、純粋な個体群を単離した。次に、ドナープラスミドpFC119、pFC120とＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのゲノムとのインビトロでの組換えの代表的なプラークを増幅し、その結果得た組換え型ウイルスストックを、ｖＣＰ１７２０と名付けた。
【実施例１１】
【０１１２】
［プラスミドpJP090の構築］
猫の頚静脈からＥＤＴＡを含むチューブに採血した。単核細胞を、Ficoll勾配による遠心分離法によって回収し、直径６０ｍｍのペトリ皿で培養した。培養中の猫の単核細胞は、コンカナバリンA（ｃｏｎＡ）（最終濃度、約５μｇ／ｍｌ）又はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（最終濃度、約１０μ／ｍｌ）のいずれかで刺激した。刺激後、「ｃｏｎＡ」 及び「ＰＨＡ」リンパ芽球を、培養皿を掻爬して回収し、これらの細胞の全ＲＮＡを「白血球用ｍＲＮＡ単離キット」（Boehringer Mannheim社製）を用いて抽出した。
【０１１３】
ｃｏｎＡ又はＰＨＡによって刺激した猫のリンパ球から抽出した全ＲＮＡは、相補一本鎖ＤＮＡを合成するためのマトリックスとして用いた。相補一本鎖ＤＮＡは、オリゴヌクレオチドｐ（ｄＴ）１５（Boehringer Mannheim 社製）の伸張によって作製した。入手した相補一本鎖ＤＮＡは、その後、下記ヌクレオチドと共にマトリックスとしてＰＣＲ反応を行い、約４７３塩基対（ｂｐ）のＰＣＲ断片を増幅した。
ＦＣ１２５（４８ｍｅｒ）（配列番号２４）
5' ttttttgcgg ccgccaccat gtggctgcag aacctgcttt tcctgggc 3'
ＦＣ１２６（５０ｍｅｒ）（配列番号２５）
5' ttttttgcgg ccgctacgta tcacttcttg actggtttcc agcagtcaaa 3'
この断片をアガロースゲル電気泳動によって精製した。この断片をNotIで処理し、このように入手した４５３ｂｐのNotI - NotI断片を、あらかじめNotIで処理したプラスミドpVR1012（実施例３）を直線化し、プラスミドpJP090（５３６５ｂｐ）を作製した。pJP090への挿入方向を確認した。このプラスミドにクローニングしたNotI - NotI断片は、完全に配列決定した。この配列（配列番号２６）は１４４アミノ酸のタンパク質（配列番号２７）をコードし、ネコサイトカインＧＭ−ＣＳＦである。
【実施例１２】
【０１１４】
［ＤＮＡワクチンの製造］
プラスミドpPB371（実施例３）を含むＤＮＡ溶液を、Sambrook et al (1989)に記載の方法で、エタノール沈殿法で濃縮した。ＤＮＡ沈殿物を、１．８％のＮａＣｌ溶液で回収し、１ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。０．７５ｍＭのＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ溶液を、適切な体積の無菌Ｈ2ＯによってＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ凍結乾燥物を回収して、調製した。
【０１１５】
プラスミドＤＮＡ−脂質複合体は、１．８％のＮａＣｌ溶液内に、１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液を、同量の０．７５ｍＭのＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ溶液（１：１）を希釈することにより作製する。ＤＮＡ溶液を、気泡を形成しないように、陽イオン性の脂質溶液を含むフラスコの壁沿いに、２６Ｇの針で徐々に注入した。２種類の溶液の混合後直ちに、ゆっくりと攪拌する。最終的に、０．３７５ｍＭのＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ及び５００μｌ／ｍｌのプラスドを含む組成物を得た。
【０１１６】
上記記載の全ての工程に使用する全ての溶液が、外界温度であることが望ましい。ＤＮＡ／ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥの複合体は、動物を免疫化する３０分間に、外界温度に放置する。
【０１１７】
ＤＮＡワクチンを、本実施例に記載の方法で、プラスミドpPB374（実施例４）、pPB375（実施例５）、pPB383（実施例６）、pJP090（実施例１１）含むＤＮＡ溶液、又はこれら５つのプラスミドの内少なくとも２つの混合物で製造することができる。
【実施例１３】
【０１１８】
［インビトロでの発現検査］
各構築におけるＦＩＶタンパク質の発現を、従来の間接免疫蛍光法及びウェスタンブロット法で検査した。これらの検査は、単層で培養し、プラスミドをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、又は単層で培養し、組換え型ウイルスを感染したＣＥＦ細胞を含む、ペトリ皿で行った。ＦＩＶタンパク質は、感染したネコの血清及び標識化した抗血清を用いて検出された。アガロースゲルに移した後に入手した断片のサイズを、想定していたものと比較した。
【実施例１４】
【０１１９】
［動物への効果］
約１２週齢の抗ＦＩＶ抗体のないＳＰＦHillgroveの猫（Biological Laboratories Europe 社製）を、６匹ずつの３つのグループに無作為に分けた。
【０１２０】
第１グループの猫（グループＡ）に、０日目及び２８日目にワクチンとして、プラスミドpPB371（実施例３）及びpPB374（実施例４）を混合して、筋肉内に注入し、５６日目に追加免疫として、組換え型ウイルスｖＣＰ２５５（実施例７）を、１０8.0ＴＣＩＤ50／ｍｌの力価で筋肉内に注入した。
【０１２１】
第２グループの猫（グループＢ）に、０日目及び２８日目にワクチンとして、ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥで調製したプラスミドpPB371及びpPB374（実施例１２）を混合して、筋肉内に注入し、５６日目の追加免疫として、組換え型ウイルスｖＣＰ２５５（実施例７）を、１０8.0ＴＣＩＤ50／ｍｌの力価で筋肉内に注入した。
【０１２２】
ＤＮＡワクチン内の全ＤＮＡ濃度は２００μｇ／ｍｌであり、混合物に含まれる各プラスミドは１００μｇ／ｍｌである。
【０１２３】
ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥで調製したＤＮＡワクチンの脂質／ＤＮＡ分子比率は、０．２５である。
【０１２４】
第３グループの猫（コントロール）は、コントロール群である（ワクチンなし、８４日目に検証）。
【０１２５】
全ての猫に８４日目に、１ｍｌの病原性ＦＩＶウイルス（Petaluma株）を、２５ＣＩＤ50／ｍｌの力価で腹腔内に注入し、検査した（ＣＩＤは猫における５０％感染量）。
【０１２６】
先ず、抗体に対する応答としてウイルス再単離及びＰＣＲによるウイルス血症を観察した。
【０１２７】
検証後４週間から１６週目までのウイルス再単離（ウイルス血症陽性を示す動物の数）
【０１２８】
【表１】
【０１２９】
ＰＢＭＣ細胞内に存在するＦＩＶプロウイルスＤＮＡを、ＰＣＲにより同定した。
【０１３０】
ウイルス血症の発現は、グループＡの動物の６７％と、グループＢの動物の５０％で観察されなかった。
【０１３１】
【表２】
【０１３２】
ワクチンが、予防接種を行った動物のグループの、特にｇａｇに対する細胞障害性応答を刺激（初回刺激効果）することを観察した。
【０１３３】
【表３】
【０１３４】
ワクチンは、体液性免疫応答を刺激（初回刺激効果）する。
【０１３５】
後述のクレームにより定義されている本発明は、上記記載の実施例に制限されるものではなく、文脈又は本発明の主旨のいずれから派生する変異体をも含むことは言うまでもない。
Claims (18)
- ｅｎｖ、ｇａｇ又はｇａｇ／ｐｒｏタンパク質のうち少なくとも１つが、プラスミド及びウイルスベクターの両方によりコードされている条件で、
−薬剤として許容される媒体又は賦形剤の中に、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードするポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するプラスミドを含む第１ワクチン；及び
−薬剤として許容される媒体又は賦形剤の中に、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードするポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するウイルスベクターを含む第２ワクチン
を含む、個別に包装されたネコ科にＦＩＶに対する予防接種を行うためのキット。 - プラスミド及びウイルスベクターが、ｅｎｖ及びｇａｇ、又はｅｎｖ及びｇａｇ／ｐｒｏをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１記載のキット。
- 第１ワクチン及び／又は第２ワクチンが、ｔａｔをコードするポリヌクレオチドをインビボで発現することを特徴とする、請求項１又は２記載のキット。
- ウイルスベクターが、アビポックス、好ましくはカナリア痘又は鶏痘、並びにワクシニアウイルスの弱毒化した変異体から選択されることを特徴とする、請求項１、２又は３記載のキット。
- １匹又は複数の動物に予防接種を行うためのワクチン用量を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか記載のキット。
- ウイルスベクターを基にしたワクチンの１用量毎に、プラスミドを基としたワクチンの２用量を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか記載のキット。
- プラスミドを基にしたワクチン及び／又はウイルスベクターを基にしたワクチンが、アジュバントを含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか記載のキット。
- アジュバントがサイトカイン、好ましくはネコＧＭ−ＣＳＦであることを特徴とする、請求項７記載のキット。
- ウイルスベクターを含むワクチンが、プラスミドを含むワクチンの追加投与として投与されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか記載のキット。
- ネコにＦＩＶの予防接種を行うために、ｅｎｖ、ｇａｇ又はｇａｇ／ｐｒｏのタンパク質のうち少なくとも１つが、プラスミド及びウイルスベクターの両方によりコードされている条件で、第一に、ネコに初期投与する予定の、プラスミド及び薬剤として許容される媒体又は賦形剤を含む第１ワクチンを製造するために、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するプラスミドを使用し、第二に、同じネコへの追加投与として投与する予定の、ウイルスベクター及び薬剤として許容される媒体又は賦形剤を含む第２ワクチンを製造するために、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するウイルスベクターを使用するという使用方法。
- ネコにＦＩＶの予防接種を行うために、ネコに初期投与する予定の、ｅｎｖ、ｇａｇ又はｇａｇ／ｐｒｏのタンパク質のうち少なくとも１つが、プラスミド及びウイルスベクターの両方によりコードされている条件で、プラスミド及び薬剤として許容される媒体又は賦形剤を含むワクチンを製造するために、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するプラスミドを使用する方法で、その追加投与は、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するウイルスベクターを含むワクチンを用いて行われる使用方法。
- ネコにＦＩＶの予防接種を行うために、ｅｎｖ、ｇａｇ又はｇａｇ／ｐｒｏのタンパク質のうち少なくとも１つがプラスミド及びウイルスベクターの両方によりコードされている条件で、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するプラスミド及び薬剤として許容される媒体又は賦形剤を含むワクチンの追加投与として、ネコに投与するウイルスベクター及び薬剤として許容される媒体又は賦形剤を含むワクチンを製造するために、ＦＩＶｅｎｖ及び／又はｇａｇ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含有し、インビボで発現するウイルスベクターを使用する方法。
- プラスミド及びウイルスベクターが、ｅｎｖ及びｇａｇ、又はｅｎｖ及びｇａｇ／ｐｒｏをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１０、１１又は１２記載の使用方法。
- プラスミド及び／又はウイルスベクターが、ｔａｔをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１０〜１３いずれか記載の使用方法。
- ウイルスベクターがアビポックス、好ましくはカナリア痘又は鶏痘、並びにワクシニアウイルスの弱毒化した変異体から選択されることを特徴とする、請求項１０〜１４のいずれか記載の使用方法。
- ２つのワクチンが３〜６週間、好ましくは約４週間程度の間隔で投与する予定であることを特徴とする、請求項１０〜１５いずれか記載の使用方法。
- プラスミドを基にしたワクチン及び／又はウイスルベクターを基にしたワクチンが、アジュバントを含むことを特徴とする、請求項１０〜１６のいずれか記載の使用方法。
- アジュバントが、サイトカイン、好ましくはネコＧＭ−ＣＳＦであることを特徴とする、請求項１７記載の使用方法。
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