DE69535125T2 - Impfstoff gegen felines immunodefizienz-virus - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Gebiete der Immunologie und Gentechnologie. Insbesondere betrifft die Erfindung einen rekombinaten Impfstoff, der die beiden DNA-Sequenzen mit Codierung für das virale Hüll- und gag-Protein des felinen Immunschwächevirus umfasst, und Verfahren der Verwendung von Impfstoffen auf der Basis dieser codierten DNA-Sequenzen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Felines Immunschwächevirus (FIV), das früher als felines T-lymphotrophes Lentivirus bezeichnet wurde, wurde zum ersten Mal 1986 in einem großen Haushalt mit mehreren Katzen in Petaluma, Kalifornien, isoliert (Pederson et al, Science (1987) 235: 790). FIV wurde als Mitglied der Unterfamilie der Lentiviridae in der Familie der Retrovirlidae klassifiziert. Dies ist die Familie, die humane und Affen-Immunschwächeviren, infektiöse Anämie bei Pferden, Maedi-visna von Schafen und Arthritis-Encephalitis-Viren von Ziegen (CAEV) umfasst. Das Genom von FIV ist ähnlich anderen Lentiviren mit drei langen offenen Leserastern, die gag, pol und env entsprechen, organisiert (Talbott et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86: 5743; Olmsted et al, Proc. Natl. Acad. Sci (1989) 86: 2448). Das gag-Gen codiert für die Hauptstrukturkomponenten des Virus, das env-Gen codiert für das Hüllglykoprotein und das pol-Gen codiert für das Polymeraseprotein.
  • Das gag-Gen wird als 50-kD-Polyprotein exprimiert, das zu drei Untereinheiten: ein p15-Matrixprotein, ein p24-Capsid protein und ein p10-Nucleocapsidprotein prozessiert wird. Das pol-Gen codiert drei Proteine: die Protease, reverse Transkriptase und ein p14.6-Protein unbekannter Funktion. Die Rutoprozessierung durch den Proteaseteil des Gens ergibt alle drei Proteine der pol-Region. Ferner ist die Protease für die Prozessierung der gag-Vorstufe verantwortlich. Das pol-Gen wird als gag-pol-Fusionsprotein exprimiert. Das Hüllgen wird als 160-kD-Glykoprotein gp160 exprimiert. Die Antigenität der FIV-Kernproteine ist ähnlich anderen Lentiviren.
  • Übersichten zeigen, dass mittlere Alter von FIV-infizierten Katzen in der allgemeinen Population etwa 3 Jahre beträgt, während das mittlere Alter von klinisch erkrankten FIV-infizierten Katzen etwa ein Alter von 10 Jahren beträgt (Shelton et al, J. Am. Anim. Hosp. Assoc. (1989) 25: 7). Die klinischen Folgeerscheinungen einer FIV-Infektion bei Katzen wurden in fünf Stadien unterteilt. Das Stadium I, die Primärphase, ist ziemlich variabel, wobei einige Tiere Grade von Fieber, Neutropenie, generalisierter Lymphadenopathie, Diarrhoe und Depression zeigen. Bei Tieren in diesem Stadium wird von den Besitzern normalerweise nicht erkannt, dass sie krank sind, und die oben aufgelisteten Zeichen wurden variabel bei experimentellen Infektionen erkannt. Die Mortalität ist niedrig und trotz der Erholung von dieser Phase werden tatsächlich alle Katzen zu lebenslangen Trägern. Virämie ist bei weitem das beständigste Zeichen, das mit dieser Phase verbunden ist.
  • Während des Stadium II kann das Virus immer noch im Blut von Katzen gefunden werden und nun entwickeln sich die Hauptanomalitäten in den zirkulierenden Zahlen der CD4+- und CD8+-T-Zellen. Während des Stadiums III werden viele Katzen zum ersten Mal Tierärzten vorgestellt mit Zeichen, die von vagen klinischen Symptomen, wie Rückfallfieber, Gewichtsabnahme und Anorexie, bis zu Tieren, die offensichtliche Anzeichen von chronischen sekundären oder opportunistischen Infektionen, die chronische Mundhöhleinfektionen, chronische Enteritis, chronische Atemwegeinfektionen, chronische Konjunktivitis und bakterielle Infektionen des Harntrakts und der Haut umfassen können, zeigen, reichen. Das Stadium IV ist durch die in Stadium III beschriebenen chronischen sekundären Infektionen mit weiterer Gewichtsabnahme und hämatologischen Anomalitäten dominiert. Schließlich nimmt im Stadium V die Gesundheit von Katzen über einen Zeitraum von Monaten bis Jahren weiter ab und wenige überlebende Tiere können einen Zustand entwickeln, der analog dem humanen erworbenen Immunschwächesyndrom (AIDS) mit opportunistischen Infektionen an mehreren Körperstellen ist.
  • Der Virus repliziert sich optimal in mononukleären Blutzellen und weist Tropismus für T-Lymphozyten, peritoneale Makrophagen, Hirnmakrophagen und Astrozyten auf. Gleich anderen Retroviren besteht das genetische Material von FIV aus RNA und die Produktion einer DNA-Kopie der viralen RNA ist eine wesentliche Stufe bei der Replikation von FIV im Wirt. Diese Stufe erfordert das Enzym reverse Transkriptase, die durch das eindringende Virus in den Wirt getragen wird. Die DNA-Version des viralen Genoms wird in das genetische Material infizierter Wirtszellen insertiert, in dem es als Provirus verbleibt. Dieses Provirus wird jedes Mal, wenn sich die Zelle teilt, repliziert und kann für die Produktion neuer Virusteilchen codieren. Mit FIV infizierte Zellen bleiben für die Dauer ihrer Lebenszeit infiziert.
  • Das Virus scheint durch horizontale Übertragung verbreitet zu werden, vorwiegend durch Bisswunden von einer infizierten Katze, da diese Tiere deutliche Virusmengen im Speichel verbreiten (Yamamoto et al, Am. J. Vet. Res. (1988) 8: 1246). Vertikale Übertragung wurde berichtet, ist jedoch selten. Bei dieser Übertragungsweise ist es theoretisch möglich, eine Schutzmaßnahme mit einem Antikörper zu liefern.
  • Derzeit gibt es keine im Handel erhältlichen Impfstoffe, die Schutz gegenüber einer Infektion mit FIV ergeben. Jüngere Arbeiten legen nahe, dass Katzen, die mit ganzen infizierten Zellen oder zellfreiem Virus immunisiert wurden, gegen eine Infektion geschützt sind und dieser Schutz in hohem Grade mit dem Vorhandensein von neutralisierenden Antikörpern im Serum korrelierte (Yamamoto et al, J. Virol. (1993) 670: 601; Yamamoto et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses (1991) 7: 911). Ein Nachteil dieser Systeme ist jedoch, dass die Verwendung inaktivierter Impfstoffe eine iatrogene Übertragung von FIV nicht vollständig ausschließt. Ein weiterer Nachteil der Verwendung inaktivierter Zubereitungen besteht darin, dass sie allgemein keine richtige FIV-Antigenpräsentation zur Entwicklung zytotoxischer T-Zellen ergeben. Andere Forscher konzentrierten sich auf rekombinante Ansätze zur Entwicklung eines FIV-Impfstoffs, entweder in einer Form von Untereinheiten- oder von einem Virusvektor getragenen Impfstoffen. Die WO92/15684 steht für eine derartige Arbeit.
  • Die WO92/15684 berichtet die Klonierung und Expression von Glykoprotein (gp)160-Hüllprotein, gp120-Hüllprotein und p24-gag-Protein von FIV und sie schlägt vor, dass diese Proteine bei der Diagnose, Behandlung und Prävention von FIV verwendbar sind. Speziell schlägt sie die Verwendung rekombinanter Proteine von dem gp160-Hüllprotein oder dem gag-Protein zur Entwicklung von Impfstoffen zur Prävention einer FIV-Infektion bei Katzen vor. Zusammenfassungen von Präsentationen, die durch die Erfinder der WO92/15684 oder deren Mitarbeiter beim International Symposium on Feline Retrovirus Research, Research Triangle Park, North Carolina, USA, 6.-9. Oktober 1993, erfolgten, zeigen, dass zwar deren rekombinantes FIV-env-Genprodukt hohe ELISA-Antikörpertiter induziert, diese hohen Titer jedoch nicht mit Virusneutralisation oder mit Schutz vor FIV-Infektion korrelieren.
  • Daher besteht fortgesetzter Bedarf an einem rekombinanten Impfstoff, der ein nicht-infektiöses FIV-Produkt ergibt und die Notwendigkeit der Inaktivierung von Impfstoffen von FIV-infizierten ganzen Zellen beseitigt, während gute Schutzgrade bereitgestellt werden. Zusätzlich zu dieser prophylaktischen Verwendung können Impfstoffe auch zur Immuntherapie nach einer Exposition verwendbar sein. Beispielsweise werden derzeitige Tollwutimpfstoffe Individuen nach einer potentiellen Exposition von Tollwutviren gegeben. Da FIV eine lange Latenzzeit zwischen Infektion und Krankheitsprogression aufweist, könnte eine Immuntherapie auch von Nutzen beim Stoppen der Progression einer FIV-Erkrankung bei infizierten Katzen sein.
  • GE Cole et al, J. Virol. (1990) 64: 4930, berichten die Expression von Hüll- und gag-Proteinen des felinen Leukämievirus in rekombinanten felinen Herpesviren.
  • Olmsted et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86: 2448, berichten die molekulare Klonierung von felinem Immunschwächevirus.
  • Olmsted et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 8088, berichten eine Nucleotidsequenzanalyse des felinen Immunschwächevirus und sie diskutieren die Genomorganisation und Verwandtschaft von FIV mit anderen Lentiviren.
  • Pederson et al, Science (1987) 235: 700, berichten die Isolierung eines T-lymphotrophischen Virus von Hauskatzen mit Immunschwäche-ähnlichem Syndrom.
  • Shelton et al, J. Am. Anim. Hosp. Assoc. (1989) 25: 7, berichten die Prävalenz von Infektionen des felinen Immunschwächevirus und felinen Leukämievirus bei Hauskatzen.
  • Talbott et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86: 5743, berichten die Nucleotidsequenz und Genomorganisation von felinem Immunschwächevirus.
  • Yamamoto et al, J. Virol. (1993) 67: 601, berichten den experimentellen Schutz gegenüber homologen und heterologen Stämmen des felinen Immunschwächevirus.
  • Yamamoto et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses (1991) 7: 911, berichten den experimentellen Impfstoffschutz gegenüber felinem Immunschwächevirus.
  • Nunberg et al, J. Virol. (1989) 63: 3240, berichten die Erzeugung eines Vektors des felinen Herpesvirus (FHV) mit deletierter Thymidinkinase.
  • Hu et al, Science (1992) 255: 456, berichten den Schutz von Makaken gegenüber einer SIV-Infektion durch Untereinheitenimpfstoffe von SIV-Hüllglykoprotein gp160.
  • Lutz et al, "Vaccination of Cats with Recombinant FIV env-gene products", International Symposium on Feline Retrovirus Research, Research Triangle Park, North Carolina, USA, 6.-9. Oktober 1993, berichten, dass es zwar relative einfach ist, hohe ELISA-Antikörpertiter unter Verwendung rekombinanter env-Genprodukte (Baculovirus und E. coli) zu induzieren, ELISA-Antikörpertiter jedoch nicht mit Virusneutralisation und mit Schutz korrelieren.
  • Morikawa et al, Virology (1991) 183: 288, berichten die Expression von FIV-gag-Protein in einem Baculovirus-Expressionssystem.
  • Die WO93/08836 beschreibt ein Verfahren zur Verstärkung der Immunogenität eines Hüllglykoproteins des felinen Immunschwächevirus (FIV) in einem Wirt, das die Verabreichung eines rekombinanten lebenden Impfstoffs, der einen rekombinanten Mikroorganismus, wie ein Virus oder Bakterium umfasst, der so modifiziert ist, dass er das Hüllglykoprotein und ein Peptid, das aus env-, pol-, gag-, nef- und vif-Antigenen ausgewählt ist, exprimiert, umfasst, an den Wirt umfasst.
  • Die WO94/06921 offenbart Verfahren zur Behandlung oder Prävention von FIV-Infektionen, die das Verabreichen eines Vektorkonstrukts, das die Expression von mindestens einem immunogenen Bereich eines FIV-Antigens, das aus der Gruppe von p15gag, p24gag, p10gag, p13pol, p62pol, p15pol, p36pol oder gp68env und gp27env ausgewählt ist, dirigiert, an eine Katze derart, dass eine zelluläre Immunantwort erzeugt wird, umfassen. Die Konstrukte wurden durch rekombinante Retroviren oder durch ein rekombinantes Virus, das aus der Gruppe von Pockenviren, Adenoviren, Herpesviren und dgl. ausgewählt ist, getragen.
  • Die WO94/06471 beschreibt FIV-Impfstoffe, die eine Nucleotidsequenz umfassen, die das gesamte FIV-env-Gen mit Codierung für Reste des FIV-Hüllproteins oder einen Teil desselben umfasst. Die DNA-Sequenzen mit Codierung für das FIV-env-Protein können zur Herstellung von Impfstoffzusammensetzungen zur Stimulierung einer Immunantwort in einer Katze gegen FIV durch Verabreichen eines Expressions vektors, der zur Expression der fraglichen Polypeptide fähig ist, an das Tier derart, dass die immunogenen Polypeptide in situ im Tier exprimiert werden, verwendet werden.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ein rekombinanter Impfstoff gegen felines Immunschwächevirus (FIV) ein Baculovirus-Expressionssystem zur Expression des FIV-gag-Proteins und FIV-env-Proteins.
  • Der Impfstoff kann einen Replikationsvektor zur Expression der Proteine ausgehend von den DNA-Sequenzen mit Codierung für FIV-gag- und -env-Proteine umfassen. Zu den verfügbaren Replikationsvektoren gehören die Herpes-, Pocken-, Adeno-, Retro- und Paramyxoviren, wobei das feline Herpesvirus als Replikationsvirus bevorzugt ist. Weitere verfügbare Replikationsvektoren sind die Salmonella-Bakterien.
  • Der Impfstoff ist vorzugsweise zur parenteralen oder mukosalen Verabreichung angepasst.
  • Der Impfstoff kann zur Impfung einer Katze gegen HIV verwendet werden. Er kann in Verbindung mit jedem anderen rekombinanten Impfstoff gegen felines Immunschwächevirus (FIV), der eine DNA-Sequenz mit Codierung für FIV-gag-Protein und eine DNA-Sequenz mit Codierung für FIV-env-Protein umfasst, verwendet werden.
  • Eine bevorzugte Rekombinante umfasst ein mukosales/parenterales Impfverfahren mit einer ersten Impfung durch mukosale Verabreichung eines FHVFIenv- und FHVFIgag-Impfstoffs und einer anschließenden zweiten Impfung durch parenterale Verabreichung des rekombinanten Baculovirusimpfstoffs.
  • Insbesondere stellt die Erfindung die mukosale Verabreichung von gag- und env-Protein über den FHV-Vektor an eine Katze und anschließend die subkutane Verabreichung von gag- und env-Protein, die durch rekombinantes Baculovirus erzeugt wurden, bereit.
  • Immunisierungskits, die zur Verwendung im Verfahren der Erfindung geeignet sind, werden ebenfalls bereitgestellt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Sowohl die FIVgag- als auch die -env-Sequenzen, die bei der Konstruktion von rekombinantem Baculovirus verwendet wurden, wurden von einem infektiösen proviralen Klon des felinen Immunschwächevirus FIV-14 erhalten. Dieser Klon stammte ursprünglich von dem Wildtyp-Petaluma-Stamm. Der Ort und die Sequenzen der Gene mit Codierung für gag und env von FIV sowie die dadurch codierten Proteinsequenzen sind bekannt und können nach einschlägig bekannten Techniken isoliert werden (siehe beispielsweise Talbott et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86: 5743; Olmsted et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86: 2448). Die Nummerierung der Sequenz ist wie bei RA Olmsted et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 8088 beschrieben (GenBank-Hinterlegungsnummer M25381).
  • Alternativ können diese veröffentlichten Sequenzen für gag und env zur chemischen Synthese der Gene unter Verwendung einer für diesen Zweck gestalteten Vorrichtung nach einschlägig bekannten Techniken verwendet werden. Unter Verwendung von Gentechnik wurden die Gene mit Codierung für gag und env von FIV oder immunogene Bereiche derselben in Plasmide transformiert und die Gene können daher günstigerweise und bei den Transfervektoren der Erfindung vor zugsweise von einer derartigen Quelle erhalten werden. Beispiele für Plasmide sind pVLFIgag* (mit Codierung für das gag-Gen) und pVLFIenv (mit Codierung für das Hüllgen). Allgemeine Subklonierungsverfahren wurden gemäß der Beschreibung in Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage, 1989), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, verfolgt.
  • Das Baculovirus-Expressionsvektorsystem (BEVS) ist einschlägig als günstiges rekombinantes Genexpressionssystem bekannt, für das in einigen Fällen gezeigt wurde, dass es große Mengen eines heterologen Proteins produzieren kann. Kurz gesagt verwendet BEVS Expressionsvektoren zur Insertion heterologer Gene in das Baculovirusgenom an einem Ort derart, dass das Gen unter der Kontrolle der regulatorischen Elemente des Baculovirus exprimiert wird. Das rekombinante Baculovirus kann eine kultivierte Insektenzelllinie infizieren, wo das heterologe Protein exprimiert wird.
  • Mehrere Gruppen, die BEVS verwenden, exprimierten die Oberflächenglykoproteine von zwei Retroviren. Ferner berichten Morikawa et al, Virology (1991) 183: 288-297 die Expression von FIV-gag in dem Baculovirussystem. BEVS ist in der Übersicht detailliert angegeben bei V.A. Luckow, Cloning and expression of heterologous genes in insect cells with baculorvirus vectors, in "Recombinant DNA Technology and Applications", Hrsg. C. Ho, A. Prokop und R. Bajpai (1990) McGraw-Hill, New York, und V.A. Luckow & M.D. Summers, Bio/Technology 6: 47-55 (1988). Zur Konstruktion des rekombinanten Baculovirus gemäß der Erfindung verwenden wir die detailliert in der letzteren Veröffentlichung beschriebene Methode.
  • Zwar sind eine große Zahl von Baculovirusarten bekannt, doch ist das bevorzugte Virion zur Verwendung in BEVS das Autographa californica Nuclear Polyhydrosis Virus, das auch als AcNPV oder AcMNPV bekannt ist. AcNPV infiziert über 30 Arten von Lepidoptera-Zellen, wobei der bevorzugte Wirt die Spodoptera frugiperda-Zellline Sf9 ist.
  • Die in Baculoviren zu insertierenden Fremdgene verwenden Plasmide, die eine von Baculovirus-DNA flankierte Klonierungsstelle enthalten. Die kultivierte Wirtszelle wird mit diesem Plasmid und genomischer Wildtyp-Baculovirus-DNA cotransfiziert, wobei eine Rekombination unter Bildung eines das heterologe Gen tragenden viralen Genoms erfolgt. Die Verfahren und Bedingungen, durch die eine Cotransfektion erfolgt, sind einschlägig bekannt. Beispiele umfassen Calciumphosphat-Copräzipitation (F.L. Graham und A.J. van der Eb, Virology, 52: 456-467 (1973)), Protamin (U. Wienhues et al, DNA (NY) 6: 81-89 (1987)), Lipofectin (Biotechniques 11: 310-312) und Elektroporation (S.G. Mann und L.A. King, J. Gen. Virology 70: 3501-3505 (1989)). Wir verwenden das Calciumphosphatverfahren, das im folgenden genauer angegeben ist, das das bevorzugte Transfektionsverfahren zur Produktion des rekombinanten Baculovirus der Erfindung ist.
  • Typischerweise wird das heterologe Gen zur Insertion in das Polyhedrongen, ein Gen, das zur Replikation oder Produktion extrazellulärer Viren nicht wesentlich ist, zielgesteuert. Dies wird allgemein durch Einarbeitn der Baculovirus-DNA mit Codierung für den Polyhedronpromotor und Sequenzen von 3'- und 5'-DNA, die den Polyhedronpromotor flankieren, in den Plasmidtransfervektor erreicht. Fremdgene werden dann in den Transfervektor strangabwärts des Promotors unter Verwendung von einschlägig bekannter Gentechnik insertiert. Eine breite Vielzahl geeigneter Transfervektoren ist bekannt und zur Verwendung in Ausführungsformen der Erfindung geeignet. Zu diesen gehören pACYMI, pEV55, pAC373, pACRP, pEVIV, PEV51 und pVL941; wobei der bevorzugte Vektor pVL941 ist. Ferner könnten sowohl das gag- als auch das env-Gen in ein einziges Virus unter Verwendung von mehreren der Vektoren der multiplen Klonierungsstelle, die verfügbar sind, insertiert werden. Beispiele für geeignete für Vektoren der multiplen Stelle umfassen p2XIVVI–X3, pXIVVI–, pSyn nWTVI– (gemäß der Beschreibung in Gene 100: 131-137 (1991)); oder pACVC2 gemäß der Beschreibung in Protein Engineering 1: 359-366 (1987).
  • Das rekombinante Baculovirus der Erfindung kann durch optisches Screening und anschließend DNA-Dot-Blot-Hybridisierung, Zellaffinitätstechniken, Plaquehybridisierung oder andere einschlägig bekannte Techniken identifiziert werden. Das rekombinante Baculovirus der Erfindung kann auch Proteine umfassen, für die es chromogene und/oder enzymatische Substrate zur leichten Identifizierung und Reinigung gibt. Das bevorzugte Verfahren ist optisches Screening von Rekombinanten, da Rekombinanten die für Wildtyp-Baculovirus charakteristischen Okklusionskörper fehlen; optisches Screening ist eine Technik, die einschlägig bekannt ist. Die Morpholyte mit fehlender Okklusion werden dann aufgenommen und in eine 96-Vertiefungen-Platte zur DNA-Dot-Blot-Hybridisierung gegeben. Diese Hybridisierungstechnik ist auf dem Gebiet der Gentechnik bekannt und erfordert keine spezielle Angabe. Vorzugsweise werden mehrere der Viren, die den stärksten Hybridisierungssignalen entsprechen, gereinigt und vollständiger charakterisiert.
  • Die rekombinanten Baculoviren der Erfindung können in einer beliebigen Zahl kontinuierlich kultivierter Insektenzelllinien vermehrt werden, zu denen am typischsten Anticarsa gemmitalis (soybean caterpillar), Bombyx mori (Seidenspinner), Estigmene acrea (Salzmarschmotte), Heliothis virescens (Baumwollrüssler), Leucania separata, Lymantria dispar (gypsy moth), Malacasoma disstria (forest tent caterpillar), Mammestra brassicae (Kohleule), Manduca sexta (Tabakschwärmer), Plutella zylostella (Kohlmotte), Spodoptera exigua (Zuckerrübeneule) und Spodoptera littorlis gehören. Die bevorzugte Insektenzelllinie zur Vermehrung des rekombinanten Baculovirus der Erfindung ist Spodoptera frugiperda Sf-9. Zusätzlich zu dem Baculovirus-Expressionssystem umfassen andere Genexpressionssysteme, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, E. coli-, Hefe- und CHO-Expressionssyteme.
  • Ein alternatives System zur Einführung von Immunogenen in Wirte sind bekannte Replikationsvektoren, wie das feline Herpesvirus. In einem felinen Herpesvirusvektor zu exprimierende Gene werden unter die Kontrolle eines heterologen Promotors gestellt und in das Herpesvirusgenom insertiert. Typischerweise wird das zu exprimierende Gen in den Thymidinkinase-Locus insertiert, was eine Selektion von rekombinanten Viren durch den Verlust der Thymidinkinasefunktion ermöglicht. Das rekombinante feline Herpesvirus wird dann zur direkten Infektion des Tiers verwendet, wo die Replikation die Expression der insertierten Gene ermöglicht. Andere Replikationsviren, die verwendet werden können, umfassen Pocken-, Adeno-, Paramyxo- und Retroviren. Ferner können Salmonella-Bakterien als Replikationsvektoren verwendet werden.
  • Das Immunogen kann durch bekannte Verfahren, die die direkte Impfung von Plasmiden, die DNA mit Codierung für das Immunogen enthalten ("nackte DNA-Impfstoffe"), umfassen, in Impfstoffdosisform hergestellt werden.
  • Ein Impfstoff, der unter Verwendung der Glykoproteine der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, kann aus fixierten Wirtszellen, einem Wirtszellextrakt oder einer partiell oder vollständig gereinigten FIV-Glykoproteinzubereitung aus den Wirtszellen oder durch chemische Synthese produziert bestehen. Das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte FIV-Glykoprotein-Immunogen ist vorzugsweise frei von intaktem FIV-Virus. Daher besteht das Impfstoffimmunogen der Erfindung im wesentlichen vollständig aus den gewünschten immunogenen FIV-Polypeptiden, die FIV-Antigenität zeigen.
  • Der Impfstoff kann dann parenteral oder mukosal verabreicht werden. Zur parenteralen Verabreichung, wie intramuskuläre oder subkutane Injektion, kann das Immunogen mit einem geeigneten Träger kombiniert werden, beispielsweise kann es in Wasser, Kochsalzlösung oder gepufferten Vehikeln mit oder ohne verschiedene(n) Adjuvanzien oder Immummodulationsmitteln verabreicht werden, wobei diese Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumkaliumsulfat (Alaun), Berylliumsulfat, Siliciumdioxid, Kaolin, Kohle, Wasser-in-Öl-Emulsionen, Öl-in-Wasser-Emulsionen, Muramyldipeptid, Bakterienendotoxin, Lipid X, Corynebacterium parvum (Propionnibacterium acnes), Bordetella pertussis, Polyribonucleotide, Natriumalginat, Lanolin, Lysolecithin, Vitamin A, Saponin, Liposome, Levamisol, DEAE-Dextran, geblockte Copolymere oder andere synthetische Adjuvanzien umfassen. Derartige Adjuvanzien sind im Handel von verschiedenen Quellen, beispielsweise Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc. Rahway, N.J.) erhältlich. Ein weiteres geeignetes Adjuvans ist Freund's Incomplete Adjuvant (Difco Laboratories, Detroit, Michigan). Andere Impfstoffe können nach dem Fachmann einschlägig bekannten Verfahren, die beispielsweise in I. Tizard, An Introduction to Veterinary Immunology, 2. Auflage (1982), das hier als Bezug aufgenommen ist, angegeben sind, hergestellt werden.
  • Zur parenteralen Verabreichung kann der Anteil von Immunogen und Adjuvans über einen breiten Bereich variiert werden, sofern beide in wirksamen Mengen vorhanden sind. Beispielsweise kann Aluminiumhydroxid in einer Menge von 0,5 % des Impfstoffgemischs (Al2O3-Basis) vorhanden sein. Auf einer Basis pro Dosis und in Abhängigkeit von der Reinheit und Immunogenität des Antigens kann die Konzentration des Immunogens von etwa 1,0 mg bis etwa 100 mg pro Katze reichen. Die bevorzugte Konzentration des Immunogens und das Volumen, die zu verabreichen sind, variieren in Abhängigkeit vom Alter und Gewicht des Wirts sowie anderen Faktoren, die dem Fachmann mit Kenntnissen auf dem Gebiet von Impfungstechniken bekannt sind. Beispielsweise ist in Katzen ein bevorzugter Bereich etwa 10 μg bis etwas 1,0 mg, eine geeignete Dosisgröße etwa 0,5-5 ml, vorzugsweise etwa 1,0 ml. Entsprechend umfasst eine Injektionsdosis beispielsweise 1 ml, der 1,0 mg Immunogen in einem Gemisch mit 0,5 % Aluminiumhydroxid enthält. Vergleichbare Dosisformen können auch zur parenteralen Verabreichung an nicht ausgereifte Säuger hergestellt werden, doch kann die Immunogenmenge pro Dosis kleiner sein, bei Kätzchen beispielsweise etwa 0,25 bis etwa 1,0 ml pro Dosis betragen.
  • Zur mukosalen Verabreichung kann das Immunogen mit einem geeigneten Träger, beispielsweise Wasser, Kochsalzlösung oder gepufferten Vehikeln, kombiniert werden. Zusätzlich können verschiedene einschlägig bekannte Immunmodulationsmittel zur spezifischen Verstärkung einer mukosalen Immunantwort zugegeben werden. Derartige Mittel umfassen Choleratoxin oder Teile desselben, DEAE-Dextran, Interleukine (beispielsweise IL-5), LT-Toxin von E. coli, Shiga-Toxin und andere Toxine von gramnegativen Organismen. Wenn sie formuliert sind, können derartige Impfstoffe an jeder mukosalen Oberfläche, typischerweise und am günstigsten in die Nares und/oder den Oro-Pharynx unter Verwendung von für diesen Zweck geeigneten Vorrichtungen, beispielsweise tropfenweise mit einer kleinen Nasenkanüle, durch Aerosolbildung und dgl. eingeführt werden. Die Konzentration eines Immunogens sowie die Dosisgröße zur mukosalen Verabreichung ist ähnlich der zur parenteralen Verabreichung verwendeten.
  • Eine Impfung kann nach einem Zwei-Dosis-Protokoll gemäß der Offenbarung in WO9208427 erreicht werden; in einer ersten Ausführungsform umfasst das Zwei-Dosis-Protokoll eine erste Dosis, die einer mukosalen Membran, wie oben angegeben, verabreicht wird, und anschließend eine zweite Dosis, die parenteral verabreicht wird. Nach diesem Aspekt der Erfindung wird die zweite Dosis eine gewisse Zeit nach der ersten mukosalen Impfung verabreicht. Der Zeitraum, der zwischen der ersten mukosalen Impfung und der zweiten späteren parenteralen Impfung verstreichen sollte, hängt vom Alter, Gewicht, der Gesundheit und dgl. des Wirts, dem Virus, gegen das Schutz gesucht wird, der Immunogenität der jeweiligen Impfstoffe und dgl. ab. Es ist bekannt, dass unter normalen Bedingungen die mukosale Verabreichung normalerweise, jedoch nicht immer ein Replikationsmittel, d.h. ein lebendes rekombinantes Virus oder Bakterium, umfasst, das ermöglicht, dass Antigene zum Immunsystem Zugang erhalten. Ferner kann die zweite parenterale Impfung aus entweder einem replizierenden oder nicht-replizierenden Mittel bestehen. Jedoch ist dieses Protokoll nicht die ausschließliche Weise der Zufuhr eines Antigens, da nicht-replizierende Antigene dem mukosalen Immunsystem, beispielsweise durch Mikrokügelchenverkapselung von Antigenen, zugeführt werden können. Diese und andere Faktoren sind einschlägig bekannt und die Bestimmung des Gewichts und der relativen Bedeutung von jedem dieser Faktoren gehört zu den routinemäßigen Überlegungen eines Fachmanns.
  • Das duale Verfahren ist gegen Viren wirksam, die eine kompartimentalisierte Immunogenantwort zeigen, d.h. Viren, die durch eine mukosale Stelle Zutritt zum Wirt erlangen, die jedoch auch systemisch replizieren. Das duale Verfahren ist auch wirksam gegen Organismen, wie das feline Immunschwächevirus, die überwiegend an entweder der mukosalen Stelle oder der parenteralen Stelle replizieren.
  • Dieses duale Dosisprotokoll der Erfindung kann auch durch Verabreichen der zwei Impfstoffkomponenten gleichzeitig an ihren entsprechenden Stellen erreicht werden. Dem Fachmann ist klar, dass eine Verabreichung an beiden Stellen zu genau der gleichen Zeit unwahrscheinlich ist, und daher umfasst der Zeitraum für eine gleichzeitige Verabreichung die Verzögerung, die erreicht werden kann, wenn beispielsweise der Wirt für die zweite Dosis vorbereitet wird, die zweite Dosis zur Verabreichung vorbereitet wird, der Wirt bezüglich Zeichen einer negativen Belastung nach Verabreichung der ersten Dosis beobachtet wird und dgl. Daher erhält, wenn dem gleichzeitigen Verabreichungsverfahren der Erfindung gefolgt wird, eine Katze beispielsweise eine geeignete Dosis einer passenden Impfstoffformulierung intranasal und/oder oral und eine gleichzeitige intramuskuläre Impfung mit einem passen Impfstoff.
  • Wenn Impfstoffe nach den dualen Verfahren der Erfindung verabreicht werden, können die Impfstoffe die gleiche immunogene Komponente, die in dem gleichen oder einem unterschiedlichen Vektor hergestellt oder präsentiert wurde oder in dem gleichen oder einem unterschiedlichen Vehikel formuliert wurde, enthalten. Es wird angenommen, dass eine gleichzeitige duale Verabreichung, die unmittelbar vorher beschrieben wurde, eine Stimulation beider immunogener Kompartimente ergibt und daher die Notwendigkeit der zweiten späteren Dosis verringert.
  • In einer zweiten Ausführungsform kann eine Impfung mit den FIV-Impfstoffen der Erfindung auch nach herkömmlichen Protokollen durchgeführt werden. Typischerweise wird eine erste Dosis an einer parenteralen Stelle oder, im Falle von Impfstoffen seltener, an einer mukosalen Stelle verabreicht. Die Wahl des Ortes einer ersten Impfung hängt von dem zu behandelnden Tier sowie der Verfügbarkeit und Eignung des Impfstoffs für diese Stelle ab. Nach einem geeigneten Zeitraum wird eine zweite Dosis verabreicht. Herkömmlicherweise wird die zweite Dosis an der gleichen Stelle wie die erste verabreicht, d.h. wenn die erste Impfung mukosal ist, ist die zweite mukosal. Die Entscheidung im Hinblick darauf, welche Stelle zur ersten Verabreichung geeignet ist, die Notwendigkeit einer zweiten Dosis und der Zeitraum vor einer zweiten Dosis, die zu verabreichende Dosis und dgl. sind Faktoren, die dem Fachmann der Impfung von Säugern bekannt und geläufig sind.
  • Beispielsweise kann, wenn Katzen geimpft werden, die erste Dosis im Alter von 6-10 Wochen gegeben werden. Die zweite Dosis des Impfstoffs sollte dann einige Wochen nach der ersten Dosis, beispielsweise etwa 2 bis 4 Wochen später, verabreicht werden. Alternativ kann der Impfstoff als einzige 1-ml-Dosis, beispielsweise im Alter von 6-10 Wochen, verabreicht werden. Jedoch wird ein 2-Dosis-Protokoll als bevorzugt für eine sehr wirksame Immunisierung der Katze betrachtet. Eine jährliche Auffrischimpfung wird empfohlen. Erwachsene können zu einem beliebigen Zeitpunkt eine Auffrischimpfung erhalten. Kätzchen, die nicht-geimpften Erwachsenen geboren werden, können mit etwa 3-10 Tagen, erneut mit 4-6 Monaten und danach jährlich geimpft werden.
  • Die FIV-Impfstoffe der Erfindung sowie bekannte Impfstoffe können, wenn sie nach herkömmlichen Techniken verabreicht werden oder wenn sie nach dem dualen Verfahren der WO9208427 verabreicht werden, mit anderen Impfstoffen gegen andere Erkrankungen zur Bildung mehrwertiger Impfstoffe kombiniert werden. Ferner können die Impfstoffe der Erfindung sowie bekannte Impfstoffe, wenn sie nach herkömmlichen Techniken verabreicht werden oder wenn sie nach dem dualen Verfahren der Erfindung verabreicht werden, auch mit anderen Medikamenten, beispielsweise Antibiotika, kombiniert werden.
  • Ein "virusähnliches Teilchen" ist ein Teilchen, das durch Baculovirus-infizierte Insektenzellen produziert wurde, das einem unreifen FIV-Teilchen im Hinblick auf Dichte (bei Chromatographie) und Größe, Form und Ringstruktur (bei EM-Analyse) ähnelt.
  • Die molekularbiologischen, virologischen und Zellkulturtechniken, die bei der Konstruktion von sowohl den rekombinanten Baculoviren als auch den rekombinanten felinen Herpesviren, die feline Immunschwächeantigene exprimieren, beschrieben wurden, sind dem Fachmann geläufig. Literatur, die diese Techniken beschreibt, umfasst Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (2. Auflage, 1989); Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (1987); O'Reilly et al, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (1992); Practical Molecular Virology (Collins, Hrsg., 1991); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (Freshney, Hrsg., 2. Auflage, 1989); J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1972); D.A. Morrison, Transformation and Preservation of Competent Bacterial Cells by Freezing, Methods Enzymol. 68: 326-331 (1979); J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons (1984), und M.D. Summers und G.E. Smitz, Texas Agricultural Experimental Bulletin Nr. 1555 (1987), die hier alle als Bezug aufgenommen sind. Außer wenn dies angegeben ist, sind alle Restriktionsenzyme, Chemikalien und Materialien oder deren Äquivalente von Handelslieferanten ohne weiteres erhältlich. Endonukleaserestriktion folgt den Empfehlungen des Herstellers.
  • Es wird angenommen, dass ein Fachmann ohne weiteren Aufwand unter Verwendung der vorhergehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung in vollstem Umfang ausführen kann. Die folgenden detaillierten Beispiele beschreiben, wie die verschiedenen rekombinanten Impfstoffe der Erfindung zu konstruieren sind und/oder die verschiedenen Prozesse der Erfindung durchzuführen sind und sollen als lediglich erläuternd und nicht als Beschränkung der vorhergehenden Offenbarung in irgendeiner Weise betrachtet werden. Dem Fachmann sind passende Variationen der Verfahren sowohl im Hinblick auf die Reaktionsteilnehmer als auch die Reaktionsbedingungen und -techniken unmmittelbar geläufig.
  • Materialien und Verfahren
  • Zellen, Viren und Plasmide
  • Das Stammbaculovirus Autographica californica Nuclear Polyhedrosis Virus (AcNPV), E2-Stamm, wurde von Max Summers (Texas A & M University) erhalten. Die Spodoptera frugiperda-Zelllinie Sf-9 wurde von der American Type Culture Collection erhalten (CRL 1711). Das Plasmid pSP72 wurde von Promega Biotec erhalten. Das Plasmid p3CL-DHFR wurde von Fred Homa (The Upjohn Company) erhalten. Das Plasmid pGC113 wurde von Jack Nunberg erhalten und ist bei Nunberg et al, J. Virol. (1989) 63: 3240 beschrieben.
  • Das Plasmid p3CL-DHFR ist ein Vektor auf der Basis von pUC18, der zur Expression heterologer Gene in eukaryotischen Zellen konstruiert wurde. Es verwendet den Immediate Promotor und Leader des humanen Cytomegalovirus (CMV) (die Sequenzen –1140 bis +74, bezogen auf die Transkriptionsstartstelle) zum Antreiben der Transkription. Ein BamHI-BglII-Fragment von 550 Basenpaaren, das Rinderwachstumshormonsequenzen enthält, wird zur Zufuhr der Polyadenylierungsfunktionen verwendet. Der Vektor enthält singuläre HindIII und SalI-Stellen zwischen den CMV-Promotor- und bGH-Polyadenylierungssequenzen zur Insertion fremder Gene.
  • Die Zelllinie FIV-14 wurde von dem Wildtyp-Petaluma-Stamm abgeleitet (Olmsted et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 8088 (1989)). Die Zellen, Stammviren und rekombinanten Viren werden durch Verfahren vermehrt, die detailliert in Texas Agricultural Experimental Bulletin Nr. 1555 (1987) beschrieben sind.
  • Das Plasmid pVL941 wurde bei V.E. Luckow und M.D. Summers, Virology 170: 31-39 (1989) beschrieben.
  • Tiere
  • Achtzehn spezifische pathogenfreie Katzen eines Alters von etwa 12 Wochen wurden in allen Experimenten verwendet. Tiere werden in einer Behältnisanlage in drei Gruppen von jeweils sechs Tieren gehalten und mit Katzenfutter und Wasser nach Belieben gefüttert.
  • Western-Blot-Analyse
  • Zur Western-Blot-Analyse werden Aliquots von jeder Fraktion der Gradienten unter Verwendung von Standard-SDS-PAGE aufgetrennt. Nach der Elektrophorese werden Proteine nach dem Verfahren von H. Towbin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354 (1979) auf 0,22-μm-Nitrocellulose elektrogeblottet. Nichtbelegte Stellen auf der Nitrocellulose werden durch anschließende Inkubation in PBS, die 5 fettfreie Trockenmilch (NFDM) enthält, blockiert. Blots werden mit dem primären Antikörper inkubiert und eine Farbentwicklung wurde gemäß der Beschreibung bei W.F. Hink et al, Biotechnology Progress 7: 9-14 (1991) durchgeführt. Seren konvaleszierender Katzen von experimentell FIV-infizierten Katzen wurden zur Detektion von gag- und env-Proteinen auf Wester-Blots verwendet.
  • Herstellung eines Antigens zur Verwendung als Impfstoff
  • Spodoptera frugiperda (Sf-9)-Zellen in Spinnerkolben werden mit einer Zelldichte von 1 × 106 Zellen/ml wurden mit einer Infektionsmenge von 5 plaquebildenden Einheiten (pfu)/Zelle infiziert. Die Zellen werden mit den folgenden rekombinanten Viren infiziert: entweder AcNPVFIgag* oder AcNPVFIenv oder mit AcNPVFIgag* und AcNPVFIenv coinfiziert. Jede Kultur wird 66 h nach der Infektion geerntet. Infizierte Zellen werden von dem Kulturmedium durch Zentrifugation mit langsamer Geschwindigkeit abgetrennt und bis zur Verwendung gefroren aufbewahrt.
  • FHV-Rekombinanten, die entweder FIV-gag- oder -env-Gene exprimieren, werden in CRFK-Zellen wachsengelassen und 3 Tage nach der Infektion geerntet. Nach einer Klärung zur Entfernung von Zellresten wird die Überstandsflüssigkeit getitert und bei –70 °C vor der Verwendung aufbewahrt. Der Impfstoff wird so formuliert, dass er 105-107 pfu/ml enthält.
  • Labortests
  • p24-Konzentrationen bei Katzen werden unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits (IDEXX, Portland, ME) ermittelt. p24, ein gruppenspezifisches Antigen von FIV, wird im Blut von bleibend infizierten Tieren gefunden und kann daher als Test auf Virämie verwendet werden. Eine Standardisierung in unserem Labor zeigte, dass im Kontext bekannter positiver und negativer Seren OD-Werte von ≥ 0,25 positiv für Virämie sind.
  • PCR-Analyse von Katzen-PBMCs wurde unter Verwendung von zwei Paaren geknäuelter Primer während zwei Amplifikationsrunden auf dem Thermal Cycler (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Conn.) durchgeführt. Die Sequenzen der Oligonucleotidprimer, die bei der PCR und als Sonden für Southern-Blots verwendet wurden, wurden aus FIV-Sequenzdaten gewählt (Talbott et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86: 5743, und Olmsted et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86: 2448). Jede Amplifikationsrunde bestand aus 30 Zyklen (Runde 1: 94 °C während 1 min, 55 °C während 1,5 min, 72 °C während 2 min, Zyklusendvolumen 0,1 ml; Runde 2: 94 °C während 1 min, 55 °C während 1,5 min, 72 °C während 1 min, Zyklusendvolumen 0,05 ml), wobei Runde 1 mit genomischer DNA beginnt und die Runde 2 eine 0,01-ml-Probe von jedem der Reaktionsgemische der ersten Runde amplifiziert.
  • Die Proben wurden dann auf ein 0,9 % Agarosegel in TBE-Puffer unter Beladen mit 0,05 ml des Produkts der Runde 2 der PCR analysiert. Das 804-bp-DNA-Produkt wurde durch Ethidiumbromid-Anfärbung sichtbar gemacht und durch Southern-Blot bestätigt.
  • Nach der Elektrophorese erfolgte die Übertragung von DNA auf Nitrocellulose nach Standardverfahren (J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatis (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Die Filterhybridisierung wurde unter Verwendung des 3'-Oligolabeling-Systems von Amersham mit nicht-radioaktiver Detektion unter Verwendung von verstärkter Chemilumineszenz (ECL) durchgeführt. Bei der ECL-Reaktion katalysiert Meerrettichperoxidase die Oxidation von Luminol zur Detektion von Sonden, die mit Fluoreszein-dUTP 3'-geschwänzt und an Zielsequenzen auf Filtern hybridisiert sind. Unter Verwendung der Sonde PJD 83: 5'-ACA TCC CCC TGA TGC TCC CAG ACC ATT ACC-3' (Talbott et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86: 5743) [SEQ ID No: 3] mit einer Konzentration von 10 ng/ml wurde die Membran 2 h bei 55 °C hybridisiert.
  • Beispiel 1 Expression von FIV-gag- und -env-Genen
  • A. Klonierung eines gag-Gens in rekombinanten Baculovirus-Expressionsvektor
  • Zur Konstruktion eines rekombinanten Baculovirus, das das FIV-gag-Genprodukt exprimiert, wird der infektiöse provirale Klon pFIV14 mit HincII und EcoRV zur Freisetzung eines 1450-Basenfragments (Basen 599-2049), das das gag-Gen enthält, verdaut. Dieses Fragment wird in den Vektor pSP72 subkloniert, mit SmaI verdaut und mit Kälberdarmphosphatase (calf intestinal phosphatase, CIP) dephosphoryliert. Das erhaltene Plasmidzwischenprodukt (der Bezeichnung D4) wird dann mit BglII und BamHI zur Freisetzung des gag enthaltenden 1450-Basen-Fragments verdaut, das dann in den Baculovirus-Expressionsvektor pVL941 (Talbott et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86: 5743), der mit BamHI verdaut und mit Kälberdarmphosphatase phosphoryliert wurde, ligiert wird. Der gebildete Vektor wird als pVLFIgag bezeichnet (siehe 1).
  • Die Gestaltung des pVLFIgag führt zu einer Anordnung, die es ermöglicht, dass die natürlich vorkommende FIV-gag-pol-Rasterverschiebung ein Fusionsprotein produziert, das aus dem an das Baculovirus-Polyhedron-Genprodukt gebundenen FIV-gag besteht. Zur Beseitigung dieses Rasterverschiebungsprodukts werden Stoppcodons in allen drei Leserastern unmittelbar nach dem gag-Leseraster insertiert. PCR wird zur Produktion eines "Substitutions"-3'-Endes für das gag-Gen, das die gewünschten Stoppcodons enthält, verwendet. PCR-Primer (DAD-1: 5'-CCATTGGAATTCTACCTATTTATAAATCCAATAGTTCTCCTC-3' [SEQ ID Nr: 1], DAD-2: 5'-GCAATGGCCACCTTAAGCCAGAAAG-3' [SEQ ID Nr: 2]) werden zur Amplifikation eines 389-Basen-Teils von FIV-14, der die technisch veränderten Stoppcodons enthält, verwendet. Das PCR-Fragment wird mit EcoRI verdaut und das 125-Basen-Fragment, das das "Substitutions"-gag-3'-Ende enthält, wird isoliert. Dieses Fragment wird dann in das gag enthaltende D4-Plasmid, das zur Entfernung des das natürliche 3'-Ende enthaltenden Fragments mit EcoRI verdaut (und dephosphoryliert) wurde, ligiert. Das erhaltene Plasmid der Bezeichnung D4* wird dann in der gleichen Weise wie oben für D4 beschrieben in pVL941 platziert, wobei der Baculovirusvektor pVLFIgag* erhalten wird. Der Abschnitt des Gens, der PCR-amplifizert wurde, wird sequenziert, um das Vorhandensein der gewünschten Stoppcodons festzustellen.
  • B. Clonierung des env-Gens in rekombinantem Baculovirus-Expressionsvektor
  • Ein Vektor zur Expression von FIV-env in Baculovirus wird konstruiert, indem zunächst pFIV-14 mit AseI und NdeI zur Entfernung eines 2649-Basen-Fragments (Basen 6257-8906), das das FIV-env-Gen enthält, verdaut wird. Nach der Behandlung mit Klenow zum Auffüllen der Enden, wird das Fragment in pSP72, das mit SmaI verdaut und dephosphoryliert wurde, subkloniert. Dieses Plasmidzwischenprodukt der Bezeichnung B1 wird mit BamHI und BglII verdaut (partieller Verdau), um ein Fragment von ~2660 Basen zu entfernen, das in pVL941, das mit BamHI verdaut und dephosphoryliert wurde, ligiert wird. Das gebildete Plasmid wird als pVLFIenv bezeichnet.
  • C. Baculovirustransformation
  • Die Plasmide pVLFIgag* und pVLFIenv werden mit der Wildtyp-Baculovirus-DNA in Sf9-Zellen unter Verwendung von Standard-Baculovirus-Expressionsvektortechniken (Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Nr. 1555 (1987)) cotransfiziert. Rekombinante Viren werden auf der Basis ihres okklusionsnegativen Phänotyps selektiert. Fünf individuelle Plaques werden für jedes Konstrukt aufgenommen und fünfmal plaquegereinigt. Die Virusstammmaterialien werden auf die Expression des heterologen FIV-Gens getestet, indem zunächst eine 60-mm-Schale von Sf9-Zellen mit einer geschätzten Infektionsmenge bzw. -mulitplizität von 10 infiziert wird. 60 h nach der Infektion werden das konditionierte Medium und die Zellen geerntet und auf Expression von FIV-Proteinen durch Western-Blot-Analyse getestet. Serum von einer Katze, die experimentell mit FIV infiziert wurde, wird zur Sondierung des Western-Blots verwendet. Positive Klone, die die höchsten Proteinmengen produzieren, werden zur Bildung von Virusstammmaterialien selektiert.
  • D. FIV-env- und -gag-Expression (Baculovirus)
  • In Suspensionskultur wachsende Sf9-Zellen werden zur Produktion größerer Proteinmengen für Tierexperimente verwendet. Suspensionszellen werden in Spinnerkolben in Medium, das aus ergänztem Grace-Medium (Gibco BRL), das 10 fetales Kälberserum enthält, besteht, wachsengelassen. Das Medium wird auch mit Amphoterin B (2,5 μg/ml), Penicillin (10 U/ml) und Streptomycin (10 μg/ml) ergänzt. Zellen werden mit einer Dichte von 1 × 106 Zellen/ml mit einer Infektionsmultiplizität von 10 infiziert. 66 h nach der Infektion werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet. Die Expression wird vor der Verwendung durch Western-Blot-Analyse festgestellt. Der Blot wird mit FIV-reaktiven Antiseren von einer experimentell infizierten Katze sondiert. Infizierte Zellen werden bei –20 °C gefroren aufbewahrt.
  • E. Klonierung von gag- und env-Genen in rekombinantes felines Herpesvirus
  • Die gleichen FIV-Sequenzen, die zur Expression von FIG-gag- und -env-Genen in Baculovirus verwendet wurden, werden zur Konstruktion rekombinanter feliner Herpesviren, die FIV-gag- und -env-Genprodukte exprimieren, verwendet.
  • Das Gen, das FIV-gag codierende Sequenzen enthält, wird von dem FIV-proviralen Klon FIV-14 durch Verdau mit HindII und EcoRV entfernt. Dieses 1450-Basen-Fragment wird in den Vektor p3CL-DHFR, der mit HindIII verdaut, mit Klenow an den Enden aufgefüllt und dephosphoryliert wurde, subkloniert. Das gebildete Plasmid p3CLFIgag wird dann mit EcoRI (partiell) und BglII zur Freisetzung eines Fragments, das die gesamte Transkriptionseinheit enthält, die aus dem CMV Immediate Early Promoter, dem FIV-gag-Gen und dem Rinderwachstumshormon-Polyadenylierungssignal besteht, verdaut. Dieses Fragment wird in das Plasmid pGC113 (JH.
  • Nunberg et al, J. Virol. (1989) 63: 3240) an der HindIII-Stelle subkloniert (sowohl Insert als auch Vektor mit Klenow glattendig gemacht), wobei das Plasmid pGCFIgag erhalten wird. Die Transkriptionseinheit ist von FHV-Thymidinkinase-Gensequenzen flankiert, um eine homologe Rekombination in das FHV-Genom zu ermöglichen, und ihr fehlen 450 Basen aus der Mitte des Thymidinkinasegens, um das Virus abzuschwächen (nicht vorhanden in pGC113 gemäß der Beschreibung in JH Nunberg et al, J. Virol. (1989) 63: 3240).
  • Eine ähnliche Strategie wird zur Produktion eines Transferplasmids zur Expression von FIV-env verwendet. Die codierende Sequenz für FIV-env wird von FIV-14 durch Verdau mit AseI und NdeI entfernt und in pSP72, das mit PvuI verdaut und dephosphoryliert wurde, subkloniert, wobei das Plasmid der Bezeichnung F5 produziert wird. Das env-Gen wird von dem Plasmid F5 mit HindIII und XhoI entfernt und in p3CL-DHFR, das mit HindIII und SalI verdaut wurde, subkloniert, wobei das Plasmid p3CLFIenv erhalten wird. Das Fragment, das die CMV-Promotor-, FIV-env-Gen- und bGH-Polyadenylierungssequenzen enthält, wird durch Verdau mit EcoRI und PvuII entfernt, mit Klenow glattendig gemacht und in die HindIII-Stelle von pGC113 (das mit Klenow aufgefüllt ist) subkloniert, wobei das Plasmid pGCFIenv erhalten wird.
  • F. FIV-env- und -gag-Expression (FHV)
  • Rekombinante FHVs, die FIV-gag oder -env exprimieren, werden im wesentlichen gemäß der Beschreibung in JH Nunberg et al, J. Virol. (1989) 63: 3240, produziert. Dies umfasst die Verwendung homologer Rekombination zum Austausch des nativen Thymidinkinasegens durch das deletierte Thymidinkinasegen, das die FIV-Gentranskriptionseinheit enthält. CRFK-Zellen werden unter Verwendung eines Standard- Calciumphosphatpräzipitat-Transfektionsprotokolls mit gleichen Mengen von entweder pGCFIgag oder PGCFIenv und gereinigter FHV (UT88)-DNA cotransfiziert. Nach Erreichen von 100 % CPE (3-5 Tage) wird der erhaltene Viruspool seriell verdünnt und auf CRFK-Zellen in Gegenwart von 100 μg/ml Thymidinarabinosid (araT) zur Selektion auf Thymidinkinase-negative Viren erneut ausplattiert. Acht Plaques werden von jeder Transfektion aufgenommen, auf CRFK-Zellen amplifiziert und virale DNA wird präpariert. Die virale DNA wird durch Restriktionsverdau mit EcoRI und anschließende Southern-Blot-Analyse unter Verwendung von sowohl FIV-spezifischen als auch tk-spezifischen DNA-Sonden analysiert. DNA-positive Klone werden auf die Expression von FIV-Proteinen durch Western-Blot-Analyse von Lysaten infizierter Zellen analysiert.
  • CRFK-Zellen werden mit drei verschiedenen FHVFIgag-Klonen (Bahnen 1, 2, 3), vier verschiedenen FHVFIenv-Klonen (Bahnen 5, 6, 7, 8) oder dem Stamm UT88-Virus als negative Kontrolle (Bahnen 4, 9) infiziert. Zelllysate werden durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines FIV-reaktiven Antiserums einer experimentell infizierten Katze analysiert. Rekombinante FHVs, die FIV-gag oder -env exprimieren, werden auf der Basis maximaler Proteinexpression selektiert, weitere zwei Male plaquegereinigt und zur Produktion von Virusstammmaterialien verwendet.
  • Beispiel 2 Impfungs- und Infektionsexperimente
  • Achtzehn spezifische pathogenfreie Katzen eines Alters von etwa 12 Wochen werden in diesem Experiment verwendet. Die Tiere werden in Behältnisanlagen in drei Gruppen von jeweils sechs Tieren gehalten und mit Katzentrockenfutter und Wasser nach Belieben gefüttert.
  • A. Impfgruppen
  • 1. Kombinierte mukosale/parenterale Impfung
  • Nach einem Akklimatisationszeitraum werden Tiere in Gruppe I (n = 6) intranasal mit 0,5 ml FHVFIgag und 0,5 ml FHVFIenv (insgesamt 1 ml) geimpft. Dies wird durch Verwendung einer Spritze, an der eine kleine Nasenkanüle befestigt wurde, durchgeführt. Die Tiere werden sanft festgehalten und etwa 0,25 ml werden in jedes Nasenloch getropft und 0,5 ml werden im hinteren Oropharynx platziert. Jede getrennte Zubereitung enthält 106'5 TCID50 pro ml. Etwa drei Wochen später werden Tiere subkutan mit 106,5 Sf9-Zellen, die in Kochsalzlösung suspendiert sind, die 72 h zuvor mit einer Infektionsmultiplizität von 1 mit rekombinanten Baculoviren mit FIV-gag- und -env-Insertionen infiziert worden waren, einer Auffrischimpfung unterzogen.
  • 2. Kombinierte parenterale/parenterale Impfung
  • Tiere in Gruppe II (n = 6) werden subkutan mit 106,5 Sf9-Zellen, die in Kochsalzlösung suspendiert sind, die 72 h zuvor mit einer Infektionsmultiplizität von 1 mit rekombinanten Baculoviren mit FIV-gag- und -env-Insertionen geimpft worden waren, geimpft. Etwa drei Wochen später werden diese Tiere mit einer ähnlichen rekombinanten Baculoviruszubereitung einer Auffrischimpfung unterzogen.
  • 3. Kombinierte mukosale/mukosale Impfung
  • Nach einem Akklimatisationszeitraum werden Tiere intranasal mit 0,5 ml FHVFIgag und 0,5 ml FHVFIenv (insgesamt 1 ml) geimpft. Dies wird unter Verwendung einer Spritze, an der eine kleine Nasenkanüle befestigt wurde, durchgeführt. Die Tiere werden sanft festgehalten und etwa 0,25 ml werden in jedes Nasenloch getropft und 0,5 ml werden am rückwärtigen Oropharynx platziert. Jede getrennte Zubereitung enthält 106,5 TCID50 pro ml. Etwa drei Wochen später werden die Tiere auf ähnliche Weise mit der identischen Dosis einer Auffrischimpfung unterzogen.
  • 4. Kontrolle
  • Die Tiere in Gruppe III (n = 6) verbleiben als ungeimpfte Kontrollen.
  • B. Infektion
  • Etwa zwei Wochen nach der letzten Impfung werden die Tiere in jeder der drei Gruppen intravenös mit einer 1-ml-Dosis einer 10–3-Verdünnung eines klonierten Virusstammmaterials des Petaluma-Isolats von FIV infiziert. Es gibt keine Anzeichen einer Immunsuppression. Die Titration dieses Stammmaterials in empfindlichen Katzen unter Verwendung eines ähnlichen Wegs und einer ähnlichen Impfmenge zeigte, dass es einen Titer von 10000 ID50s hat.
  • Blut, das diesen Katzen 24 Wochen nach der Infektion entnommen wurde, wird auf Ficol-Gradienten zur Anreicherung mononukleärer Zellen aufgetrennt. Diese Zellen werden mit 105 pro ml in RPMI 1640 mit 10 % fetalem Kälberserum in Gegenwart von 2 μg Con A und 100 IU von rekombinantem humanem IL-2 pro ml kultiviert. Nach drei Tagen werden die Zellen durch Zentrifugation abgeschieden und in RPMI 1640 mit 10 % fetalem Kälberserum und 100 IU von rekombinantem humanem IL-2 pro ml resuspendiert. Nach 21 Tagen in Kultur werden die Zellen zur PCR-Analyse präpariert.
  • Mononukleäre Zellen von peripherem Blut (PBMCs) von Katzen werden am 21. Tag der Kultur durch Zentrifugation mit 1500 × g geerntet. Die Zellen werden dann mit Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) gewaschen. Genomische DNA wird von etwa 107 Zellen unter Verwendung des Turbogen Kit (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) isoliert. Kurz gesagt werden die Zellen unter Verwendung eines denaturierenden kationischen Detergens lysiert. Dann werden Detergens und denaturiertes Protein durch Chloroformextraktion entfernt. Genomische DNA wird aus der wässrigen Phase mit einem niedrigen Salzpuffer und Ethanol ausgefällt und dann in TBE-Puffer gelöst und bei 4 °C bis zur Analyse durch PCR (Beschreibung in Labortests) aufbewahrt.
  • C. Ergebnisse
  • Die Tabelle 1 zeigt, dass vier von sechs Tieren in der Kontrollgruppe nach 24 Wochen virämisch sind, während keines der Tiere, die parenteral/parenteral oder mukosal/parenteral geimpft wurden, bei entweder dem ELISA-Antigentest oder PCR positiv sind. Dies zeigt, dass diese Impfprogramme erfolgreich eine beständige Virämie mit FIV verhindern. Es wird angenommen, dass eine mukosale/mukosale Impfung ähnliche Ergebnisse erreicht.
  • Beispiel 4 Impfkit
  • Ein Kit, das die Impfstoffe zur Verabreichung und eine Anleitung zur dualen mukosalen/parenteralen Verabreichung von Impfstoffen, parenteralen/parenteralen oder mukosalen/mukosalen Verabreichung von Impfstoffen, die hier beschrieben sind, enthält, kann als sicheres und kosteneffizientes Mittel zur Zufuhr eines Impfstoffs produziert werden. Das Impfkit enthält Impfstoffe in Phiolen, Ampullen oder anderen geeigneten Behältern zur einmaligen oder mehrmaligen Verwendung. Zur mukosalen Verabreichung kann der formulierte Impfstoff in Behältern oder in Aerosolform sein. Zur parenteralen Verwendung stellen Einzeldosisspritzen, die eine geeignete wirksame Dosis für den Wirtssäuger enthalten, einen einfachen und schnellen Weg dar, auf dem die Verabreichung durchgeführt werden kann. Alternativ kann das Kit die mukosalen und parenteralen Impfstoffe in Phiolen oder anderen geeigneten Behältern zur Mehrfachverwendung enthalten und es kann gebrauchsfertig geliefert werden oder eine zusätzliche Vorbereitung oder Einmischen vor der Verwendung erfordern. Ein Anleitungszettel ist enthalten, der den zu verabreichenden enthaltenen Impfstoff bzw. die zu verabreichenden enthaltenen Impfstoffe und deren Formulierung, die Reihenfolge und den Zeitplan der Impfung sowie weitere Faktoren, die für den Nutzer wichtig sind, beschreibt.
  • Für Katzen kann ein derartiges Impfkit beispielsweise eine mukosale Formulierung von 1 ml als Einzeldosis, die FHVFIenv und FHVFIgag (2 × 105 pfu/Impfstoff) enthält, wobei 0,5 ml jedem Nasenloch zu verabreichen sind, enthalten. Die parenterale Formulierung umfasst 1 ml von AcNPVenv und AcNPVgag (2 × 105 pfu/Impfstoff) zur intramuskulären Verabreichung. Tabelle 1: FIV-Antigen- und PCR-Ergebnisse an 24-Wochen-Proben
    Figure 00340001
    • *Antigenpräsenz an IDEXX ELISA und PCR-Analyse, die gemäß dem Text durchgeführt wurden, getestet.
    • + kennzeichnet ein positives Ergebnis
    • – kennzeichnet ein negatives Ergebnis
    • ND = nicht durchgeführt (Kultivierte Zellen gingen aufgrund von mangelndem Wachstum verloren und standen am Ende des Experiments zum Testen nicht zur Verfügung.)

Claims (10)

  1. Rekombinanter Impfstoff gegen felines Immunschwächevirus (FIV), der ein FIV-gag-Protein und FIV-env-Protein exprimierendes Baculovirus-Expressionssystem umfasst.
  2. Impfstoff nach Anspruch 1, der ferner einen Replikationsvektor zur Expression der Proteine umfasst.
  3. Impfstoff nach Anspruch 2, wobei der Replikationsvektor aus Herpes-, Pocken-, Adeno-, Retro- und Paramyxoviren und Salmonellenbakterien ausgewählt ist.
  4. Impfstoff nach Anspruch 2, wobei der Replikationsvektor felines Herpesvirus ist.
  5. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, der zur parenteralen Verabreichung angepasst ist.
  6. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, der zur mukosalen Verabreichung angepasst ist.
  7. Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystems gemäß der Definition in einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung eines Medikaments zur Impfung einer Katze gegen FIV.
  8. Kit, das (a) eine erste Dosis eines Impfstoffs, der eine DNA-Sequenz mit Codierung für FIV-gag-Protein und eine DNA-Sequenz mit Codierung für FIV-env-Protein umfasst, und (b) eine zweite Dosis eines Impfstoffs gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
  9. Kit nach Anspruch 8, wobei die erste und die zweite Dosis jeweils zur entweder parenteralen oder mukosalen Verabreichung angepasst sind.
  10. Kit nach Anspruch 8, wobei die erste Dosis mukosal zu verabreichen ist und DNA-Sequenzen mit Codierung für FIV-gag- und -env-Proteine, die durch FHVFI-env und FHVFI-gag exprimiert werden, umfasst und die zweite Dosis parenteral zu verabreichen ist.
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