DE69332393T2 - Rekombinanter Katzen-Herpesvirus-Impfstoff - Google Patents
Rekombinanter Katzen-Herpesvirus-ImpfstoffInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit einer Mutante des Katzenherpesvirus (FHV), welche eine Mutation einer Region des FHV-Genoms, eine Nukleinsäuresequenz, die eine FHV-Insertionsregion umfasst, eine Nukleinsäuresequenz, die eine heterologe Nukleinsäuresequenz umfasst, die von der DNA flankiert wird, die von der Insertionsregion stammt, ein rekombinantes DNA-Molekül, das solche Nukleinsäuresequenzen umfasst, eine Zellkultur, die mit einer FHV-Mutante infiziert ist, sowie einen Impfstoff, der die FHV-Mutante umfasst, umfasst.
- Eines der wichtigsten, klinischen Probleme bei Katzenerkrankungen steht im Zusammenhang mit Infektionen des Respirationstraktes. Die grosse Mehrheit dieser Fälle wird entweder durch den Katzen-Herpesvirus 1 (FHV) oder durch den Katzencalicivirus verursacht.
- FHV ist das kausale Agenz der viralen Katzenrhinotracheitis bei Katzen. Bei jungen Katzen kann die FHV-Infektion generalisieren, wobei es zu einer Mortalitätsrate von bis zu 50% kommt. Die Erkrankung ist üblich und weltweit verbreitet und ist durch Niesen, Depression und Ausfluss aus Augen und Nase gekennzeichnet.
- Das FHV gehört zur Familie der Herpesviren und der Unterfamilie der α-Herpesviren. Das Genom ist ungefähr 126 kbp lang und besteht aus einer einzigartigen langen (UL) Region von ungefähr 99 kbp und einer kurzen Region von 27 kbp, die eine einzigartige kurze (US) Region von ungefähr 9 kbp umfasst und von invertierten Wiederholungen von ungefähr 8 kbp flankiert wird (Grail et al., Arch. Virol. 116, 209- 220, 1991).
- Aufgrund der Prävalenz und der Schwere der FHV-Infektion sind virale Katzenrhinotracheitis-Impfstoffe, die modifizierte, abgetötete und lebende FHV umfassen, entwickelt worden und haben zu einer erfolgreiche Reduktion der Erkrankungsinzidenz geführt.
- Zusätzlich zur FHV-Infektion sind Katzen auch empfindlich gegenüber Infektionen durch verschiedene andere Krankheitserreger, wie dem Katzenleukämievirus (FeLV), dem Katzencalicivirus, dem Katzenimmundefizienzvirus (FIV), dem Katzencoronavirus und den Katzenchlamydien.
- Zur Zeit können Katzen im Allgemeinen gegen Infektionen durch diese pathogenen Mikroorganismen mit lebenden oder inaktivierten Impfstoffen oder mit Impfstoffen, die von Untereinheiten der relevanten Krankheitserreger stammen, geschützt werden.
- Trotzdem können diese Arten von Impfstoffen unter einer Reihe von. Rückschlägen leiden. Die Verwendung von lebenden Impfstoffen beinhaltet immer das Risiko, Tiere mit ungenügend attenuierten, pathogenen Mikroorganismen zu impfen. Zudem können die abgeschwächten Krankheitserreger wieder in ein virulentes Stadium zurückkehren, was eine Erkrankung der geimpften Tiere nach sich zieht und eine Ausbreitung des Krankheitserregers auf andere Tiere möglich wird.
- Inaktivierte Impfstoffe induzieren im Allgemeinen nur einen geringen Immunitätsgard, wodurch wiederholte Immunisierungen nötig werden. Weiter könnte die Neutralisie rung, welche die antigenen Determinanten des Krankheitserregers induziert, durch die Inaktivierungsbehandlung verändert werden, was eine Verminderung der protektiven Wirkung des Impfstoffes bewirkt.
- Darüber hinaus ist ein Problem mit kombinierten, lebenden, viralen Impfstoffen die wechselseitige Beeinflussung der antigenen Komponenten, die eine Verminderung von einer oder mehreren enthaltenen Komponenten bewirkt.
- Ein rekombinanter oder natürlich gewonnener Untereinheiten- Impfstoff birgt auch eine Anzahl von Nachteilen. Erstens verursacht eine Polypeptid-Untereinheit, die dem Immunsystem als nicht-replizierende Struktur angeboten wurde, oft keine langwirkende Immunität, was die Anwesenheit eines Adjuvanz benötigt. Zweitens kann eine Präsentation als replizierende Struktur eine Immunität viel wirksamer verursachen als die Präsentation als Untereinheit.
- Weiter ist es mit derzeitig zu verabreichenden, lebendigen, attenuierten oder inaktivierten FHV-Impfstoffen nicht möglich zu bestimmen, ob ein spezifisches Tier ein Träger eines FHV-Feldvirus ist oder ob das Tier geimpft ist. Daher ist es wichtig, Tiere identifizieren zu können, die mit einem FHV-Impfstoff geimpft oder mit einem Feldvirus infiziert worden sind, um die geeigneten Massnahmen zur Eindämmung der Ausbreitung eines virulenten Feldvirus ergreifen zu können.
- Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine FHV- Mutante bereit zu stellen, welche nicht nur für die Herstellung eines Impfstoffes gegen die virale Katzenrhinotracheitis sondern auch gegen andere infektiöse Katzenerkrankungen verwendet werden kann, und welche jegliches, mögliches Risiko vermeidet, das mit einem lebenden, attenuierten Krankheitserreger als Impfstoff verbunden ist, welche sowohl das humorale als auch das zelluläre Immunsystem auf wirksame Weise, aber ohne den ausgesprochenen Bedarf eines Adjuvanz induziert und welche die Möglichkeit eines multivalenten Impfstoffes ohne das Risiko von möglichen unerwünschten Wechselwirkungen der verschiedenen, antigenen Komponenten bietet.
- Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, einen FHV-Impfvirus bereit zu stellen, welcher von anderen Feldstämmen oder anderen FHV-Impfviren unterscheidbar ist. Die vorliegende Erfindung stellt eine FHV-Mutante bereit, die eine Mutation im FHV-Genom in einer Region, die durch die DNA-Sequenz des offenen Leserahmens definiert wird, der das Polypeptid, wie es in SEQ ID Nr. 2 gezeigt wird, kodiert und flankierende, intergene Sequenzen davon umfasst.
- Eine Mutation wird als Änderung der genetischen Information in der oben erwähnten Region hinsichtlich der genetischen Information, die in dieser Region des natürlicherweise vorkommenden FHV-Genoms vorhanden ist, aufgefasst. Die Mutation ist zum Beispiel eine Nukleinsäuresubstitution, Deletion, Insertion oder Inversion oder eine Kombination hiervon, welche eine FHV-Mutante bewirkt, die nicht in der Lage ist, irgendein antigenes oder funktionelles Polypeptid, wie es in SEQ ID Nr. 2 dargestellt wird, herzustellen.
- Vorzugsweise ist die Mutation, die in die beschriebene Region des FHV-Genoms eingeführt wird, eine Deletion oder Insertion.
- Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine rekombinante FHV-Mutante bereit, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine heterologe Nukleinsäuresequenz, genannte Nukleinsäuresequenz, die in die Region des FHV-Genoms eingeführt ist, die durch die DNA des offenen Leserahmens (ORF) definiert ist, der ein in SEQ ID Nr. 2 gezeigtes Polypeptid kodiert, sowie flankierende, intergene Sequenzen davon umfasst.
- Die erfindungsgemässe FHV-Mutante kann aus jedem FHV-Stamm, wie z. B. der Stamm G2620 (kommerziell erhältlich bei Intervet International B. V., Niederlande), C-27 (ATCC VR- 636), FVRm (ATCC VR-814), FVRm-Impfstoff (ATCC VR-815) oder F2, gezüchtet werden.
- Die Bezeichnung "rekombinante FHV-Mutante", wie sie hierin verwendet wird, bezeichnet einen infektiösen Virus, der genetisch verändert wurde durch Inkorporation einer heterologen Nukleinsäuresequenz in das Virusgenom, d. h. DNA, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die nicht identisch mit der Nukleinsäuresequenz eines natürlicherweise in FHV vorkommenden Gens ist.
- Aufgrund der Infektion einer Zelle durch die rekombinante FHV-Mutante kann sie das heterologe Gen in Form eines heterologen Polypeptids exprimieren.
- Die Bezeichnung "Polypeptid" bezieht sich auf eine molekulare Kette von Aminosäuren und bezieht sich nicht auf eine spezifische Länge des Produkts und kann falls benötigt in vivo oder in vitro verändert werden, zum Beispiel durch Glykosylierung, Amidierung, Carboxylierung oder Phosphorylierung; das heisst, dass Peptide, Oligopeptide und Proteine in die Definition von Polypeptiden miteinbezogen sind.
- Die Vorbedingung für eine nützliche (rekombinante) FHV- Mutante ist, dass die Mutante, wie eine eingefügte, heterologe Nukleinsäuresequenz, in eine permissive Position oder Region der genomischen FHV-Sequenz inkorporiert wird, d. h. eine Position oder Region, die für die Inkorporation der Mutation verwendet werden kann, ohne dass die essentiellen Funktionen des FHV, wie sie für die Replikation oder Infektion benötigt werden, zerstören werden. Im Fall einer Insertion einer heterologen Nukleinsäuresequenz wird eine solche Region Insertionsregion genannt.
- Bis jetzt ist wenig über die Lokalisation der Gene auf dem FHV-Genom bekannt. Rota et al. (Virology 154, 168-179, 1986) und Graile et al. (Arch. Virol. 116, 209-220, 1991) offenbarten physikalische Karten des FHV-Genoms.
- Nunberg et al. (J. Virology 63, 3240-3249, 1989) und Cole et al. (J. Virology 64, 4930-4938, 1990) identifizierten das Thymidinkinase (TK)-Gen und kartografierten dieses Gen in das SalI-A Restriktionsfragment (Rota et al., siehe oben) des FHV-Genoms. Anschliessend wurden verschiedene rekombinante FHV-Stämme konstruiert, in denen FeLV-Hüllen- und gag-Gene innerhalb des FHV-TK-Gens eingefügt worden sind.
- Die (Insertions-)Region, die sich auf die vorliegende Erfindung bezieht, ist innerhalb des FHV-Genoms bis jetzt nicht identifiziert worden. Überraschenderweise ist nachgewiesen worden, dass eine Mutation, wie die Inkorporation der heterologen DNA, in dieser Region erlaubt ist, ohne dass essentielle Funktionen des FHV gestört werden.
- Sogar noch unerwarteterweise ist nachgewiesen worden, dass die Einführung einer Mutation in die oben definierte Region die Virulenz der lebenden FHV Mutante signifikant vermindert, ohne die protektiven Eigenschaften der FHV- Mutante zu beeinflussen. Dieser Nachweis hat die Möglichkeit offenbart, eine abgeschwächte FHV-Mutante herzustellen, zum Beispiel durch Einführung einer Deletion oder Insertion in die oben definierte Region, wobei diese Mutante sicher in lebender Form für die Impfung an Tieren, sogar über den oronasalen Weg, angewendet werden kann.
- Die (Insertions-)Region, die für die Durchführung einer Mutation, wie die Insertion einer heterologen DNA-Sequenz zur Herstellung einer erfindungsgemässen FHV-Mutante, gebraucht wird, ist innerhalb eines 10,9 kb Restriktionsfragments lokalisiert, das durch teilweise Digestion der genomischen FHV-DNA mit dem Enzym Sau3A generiert wurde.
- Das genannte Fragment wird im Detail durch Restriktionsenzym-Kartierung analysiert und korrespondiert im Wesentlichen mit einer Region innerhalb des UL-Segments des viralen Genoms zwischen der Karteneinheit 0,08 und 0,17 auf der Karte von Grail et al. (1991, siehe oben).
- Die hierin offenbarte (Insertions-)Region ist innerhalb eines SalI-Fragments lokalisiert und umfasst die DNA- Sequenz, die ein Polypeptid mit 193 Aminosäuren kodiert, wie es in SEQ ID Nr. 2 dargestellt wird, sowie seine flussaufwärts und flussabwärts flankierenden, intergenen Sequenzen. Diese flussaufwärts und flussabwärts flankierenden, intergenen Sequenzen bilden nicht einen Teil eines ORF oder eines DNA-kodierenden Proteins und umfasst keine Sequenzen, die die Replikation des Virus regulieren. Die genannten flankierenden Sequenzen reichen flussaufwärts und flussabwärts bis zum Anfang oder Ende des nächsten offenen Leserahmens.
- Vorzugsweise haben die flussaufwärts und flussabwärts flankierenden intergenen Sequenzen eine Länge von ungefähr 252 bzw. 173 bp.
- Es ist ein bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung, eine (rekombinante) FHV-Mutante bereit zu stellen, die eine Mutation beinhaltet, wie zum Beispiel eine heterologe Nukleinsäuresequenz in der (Insertions-)Region, die grundsätzlich so definiert ist, wie sie in der SEQ ID Nr. 1 dargestellt
- Insbesondere wird eine Mutation, wie eine heterologe Nukleinsäuresequenz, in die FHV-DNA Sequenz inkorporiert, die das 193 Aminosäuren lange Polypeptid kodiert, das durch die Aminosäuresequenz definiert ist, die in SEQ ID Nr. 2 dargestellt wird, und noch spezifischer durch seine DNA- Sequenz, die mit der Nukleotidposition 253-834 korrespondiert, wie sie in SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird, wobei die einzigartige Restriktionsstelle BglII an der Nukleotidposition 576 die bevorzugteste Stelle für die Insertion der heterologen DNA darstellt.
- Es ist selbstverständlich, dass für die DNA-Sequenz des FHV- Genoms natürliche Varianten zwischen den individuellen FHV- Viren existieren können. Diese Variationen können Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Zufügung von einem oder mehreren Nukleotiden ergeben. Diese FHV-Varianten können einen korrespondierenden ORF kodieren, der sich von dem hierin offenbarten ORF unterscheidet. Die DNA-Sequenz, die solche ORF-Varianten kodiert, kann mit verschiedenen Verfahren, einschliesslich einer Hybridisierung mit der DNA-Sequenz, die in SEQ ID Nr. 1 bereitgestellt ist, oder durch einen Vergleich der physikalischen Karten zur Lokalisierung der analogen Regionen, die den genannten ORF kodieren, lokalisiert werden.
- Daher stellt die vorliegende Erfindung eine (Insertions-) Region bereit, die von jeglichen FHV-Stämmen gewonnen werden kann.
- Darüber hinaus existiert die Möglichkeit, Gentechnologieverfahren anzuwenden, um die oben genannten Variationen herbeizuführen, was eine DNA-Sequenz ergibt, die in bezug zu der DNA-Sequenz der (Insertions-)Region steht, die oben definiert wurde. Es ist klar, dass eine (rekombinante) FHV-Mutante, die eine Mutante beinhaltet, wie zum Beispiel ein insertiertes, heterologes Gen, das in einer (Insertions-)Region inkorporiert ist, die innerhalb des FHV- Genoms lokalisiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass eine verwandte DNA-Sequenz auch in den Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung fällt.
- Da die identifizierte (Insertions-)Region gemäss der vorliegenden Erfindung keine essentiellen Funktionen übernimmt, kann die genannte Region teilweise oder ganz deletiert werden, wonach ein heterologes Gen in die genannte Deletion eingeführt wird, wenn dieses gewünscht ist.
- Zusammengefasst kennzeichnet die oben im Wesentlichen definierte (Insertions-)Region die Lokalisierung einer Region innerhalb des FHV-Genoms, welches für die Inkorporation einer heterologen Nukleinsäuresequenz verwendet werden kann, wenn es gewünscht wird nach der Deletion der DNA-Sequenzen von dieser Region, oder es kann für die Einführung anderer Mutationen, insbesondere eine Deletion in der genannten Region, verwendet werden.
- Die heterologe Nukleinsäuresequenz, die in das erfindungsgemässe FHV-Genom inkorporiert werden soll, kann von jeglicher Quelle stammen, z. B. viral, prokaryotisch, eukaryotisch oder synthetisch sein. Die genannte Nukleinsäuresequenz kann von einem Krankheitserreger, vorzugsweise einem Katzenpathogen, stammen, welches nach der Insertion in das FHV-Genom für die Immunitätsinduktion gegen Erkrankungen angewendet werden kann.
- Vorzugsweise werden Nukleinsäuresequenzen, die ein Polypeptid des Katzenleukämievirus, des Katzenimmundefizienzvirus, des Katzencalicivirus, des Katzenparvovirus, des Katzencoronavirus und der Katzenchlamydien kodieren, für die Inkorporation in die Insertionsregion des FHV-Genoms in Betracht gezogen.
- Weiter können Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide für pharmazeutische oder diagnostische Anwendungen, insbesondere Immunmodulatoren, wie Lymphokine, Interferone oder Zytokine, kodieren, in die genante Insertionsregion inkorporiert werden.
- Eine wesentliche Erfordernis für die Expression der heterologen Nukleinsäuresequenz in einer rekombinanten FHV- Mutante ist ein entsprechender Promotor, der operativ an die heterologe Nukleinsäuresequenz gebunden ist. Es ist den im Stand der Technik Erfahrenen offensichtlich, dass die Wahl des Promotors von jeglichen eukaryotischen, prokaryotischen bis zu viralen Promotoren reicht, die in der Lage sind, Gentranskription in Zellen, die durch ein rekombinantes FHV infiziert sind, zu lenken, z. B. Promotoren des retroviralen, long terminal Repeat (Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777-6781, 1982), der SV40-Promotor (Mulligan and berg, Science 209, 1422-1427, 1980) oder der frühe Zytomegalievirus-Sofortpromotor (Schaffner et al., Cell 41, 521-530, 1985).
- Im Falle, dass eine Deletionsmutante gemäss der Erfindung gewünscht wird, können entweder teilweise oder vollständige Deletionen der Region von dem oben identifizierten, viralen Genom durch in vivo-Techniken der homologen Rekombination erreicht werden.
- Erstens kann ein DNA-Fragment, das einen Teil der einzigartigen langen Sequenz umfasst, wie sie in SEQ ID Nr. 1 definiert ist und durch wenigstens 100 Nukleotide auf jeder Seite flankiert wird, in ein passendes Plasmidvehikel subkloniert werden.
- Die Deletion, die in die beschriebene Region eingeführt wird, kann durch eine Restriktionsdigestion mit einem oder mehreren Enzymen, von denen die Stellen korrekt in oder nahe dem offenen Leserahmen positioniert sind, in diesem Plasmid durchgeführt werden. Die Rezirkularisierung des verbleibenden Plasmidmoleküls würde in einem Derivat resultieren, dem wenigstens ein Teil der kodierenden Sequenz fehlt, das innerhalb der neu identifizierten Region vorhanden ist. Alternativ können progressive Deletionen entweder in einer oder zwei Richtungen, beginnend innerhalb einer Restriktionsstelle, die innerhalb der Sequenz des offenen Leserahmens vorhanden ist, eingeführt werden. Enzyme, wie BalI oder Endonuklease III können für diesen Zweck verwendet werden. Rezirkularisierte Plasmidmoleküle werden in E.coli-Zellen transformiert und individuelle Kolonien werden durch Restriktionskartierung analysiert, um die Grösse der Deletion, die in die spezifische Region eingeführt wurde, zu bestimmen. Eine genaue Positionierung dieser Deletion kann durch Sequenzanalyse erreicht werden. Das Plasmid mit einer definierten Deletion kann zusammen mit viraler FHV-DNA in kultivierten Katzenzellen kotransfiziert werden. Nachdem die in vivo-Rekombination stattgefunden hat, wird die Deletion an der richtigen Position innerhalb der beschriebenen Region im viralen Genom eingeführt werden. Rekombinanten unter den viralen Abkömmlingen können identifiziert werden, zum Beispiel mit Hilfe eines 15 bis 20 Basen langen, synthetischen Oligomers, welches spezifisch zu der Nukleotidsequenz hybridisiert, die an dem Knotenpunkt generiert wird, wo die Deletion ursprünglich eingeführt wurde.
- Die Technik der homologen Rekombination in vivo kann für die Einführung von einer heterologen Nukleinsäuresequenz in das FHV-Genom verwendet werden. Dies wird erreicht, indem zuerst ein rekombinantes DNA-Molekül für die Rekombination mit genomischer FHV-DNA konstruiert wird. Solch ein Molekül kann von jedem geeigneten Plasmid, Cosmid oder Phage, wobei Plasmide bevorzugt werden, erreicht werden und beinhaltet eine heterologe Nukleinsäuresequenz, die, wenn gewünscht, operativ mit einem Promotor verbunden ist. Die genannte Nukleinsäuresequenz und der Promotor werden in ein Fragment der genomischen FHV-DNA eingeführt, die die hierin definierten Insertionsregionsequenzen, die in dem rekombinanten DNA-Molekül subkloniert werden, beinhaltet. Die Insertionsregionsequenzen, die die heterologe Nukleinsäuresequenz flankieren, sollten von geeigneter Länge sein, z. B. 50-3000 bp, um die homologe, in vivo- Rekombination mit dem viralen FHV-Genom ablaufen zu lassen. Falls gewünscht, kann ein Konstrukt hergestellt werden, das zwei oder mehrere, verschiedene, heterologe Nukleinsäuresequenzen beinhaltet, die von den gleichen oder unterschiedlichen Krankheitserregern stammen, wobei die genannten Sequenzen von Insertionsregionsequenzen des FHV, wie hierin definiert, flankiert sind. Solch ein rekombinantes DNA-Molekül kann verwendet werden, um ein rekombinantes FHV zu produzieren, das zwei oder mehr verschiedene, antigene Polypeptide exprimiert, um einen multivalenten Impfstoff bereit zu stellen.
- Zweitens können Zellen, z. B. Nierenzellen von Katzen (CRFK) oder Katzenembryonalzellen, mit FHV-DNA in Gegenwart von dem rekombinanten DNA-Molekül transfiziert werden, welches die heterologe Nukleinsäuresequenz beinhaltet, die durch geeignete FHV-Sequenzen flankiert sind, wobei die Rekombination zwischen den Insertionsregionsequenzen in dem rekombinanten DNA-Molekül und den Insertionsregionsequenzen in dem FHV-Genom stattfindet.
- Die Rekombination kann auch durchgeführt werden, indem die infizierten Zellen mit einer Nukleinsäuresequenz transfiziert werden, die die heterologe Nukleinsäuresequenz beinhaltet, die durch geeignete flankierende Insertionsregionsequenzen ohne Plasmid-sequenzen flankiert werden. Der rekombinante, virale Abkömmling wird demnach in der Zellkultur hergestellt und kann zum Beispiel genotypisch oder phänotypisch, z. B. durch Hybridisierung, selektioniert werden, wobei die Enzymaktivität aufgezeichnet wird, die durch ein Gen kodiert wird, welches mit der heterologen Nukleinsäuresequenz zusammen eingeführt wurde oder wobei das antigene, heterologe Polypeptid nachgewiesen wird, das von dem rekombinanten FHV immunologisch exprimiert würde. Der rekombinante Virus kann auch auf der Basis von Resistenzen gegenüber Verbindungen, wie Neomyzin, Gentamyzin oder Mykophenolsäure, positiv selektioniert werden. Der selektionierte, rekombinante FHV kann in grossem Massstab in Zellkulturen kultiviert werden, wonach Material mit dem rekombinanten FHV oder heterologe Polypeptide, die durch den genannten FHV exprimiert werden, hiervon gesammelt werden können.
- Eine lebende FHV-Mutante gemäss der vorliegenden Erfindung und insbesondere ein lebender, rekombinanter FHV, der eine oder mehrere, verschiedene, heterologe Polypeptide der spezifischen Krankheitserreger exprimiert, kann für die Impfung von Tieren, insbesondere von Haus- und Wildkatzen oder Hunderassen, verwendet werden. Der Impfung mit solch einem Lebendvektorimpfstoff folgt vorzugsweise die Replikation des rekombinanten FHV in dem inokulierten Wirt, der in vivo das heterologe Polypeptid zusammen mit den FHV- Polypeptiden exprimiert. Die Polypeptide, die in dem inokulierten Wirt exprimiert werden, werden dann eine Immunantwort gegen FHV sowie die spezifischen Pathogene auslösen. Wenn das heterologe Polypeptid, welches von dem spezifischen Pathogen stammt, eine schützende Immunantwort auslösen kann, wird das mit einer rekombinanten, erfindungsgemässen FHV-Mutante inokulierte Tier immun gegenüber einer nachfolgenden Infektion durch diesen Krankheitserreger sein, genauso wie gegenüber einer Infektion mit FHV. Somit könnte eine heterologe Nukleinsäuresequenz, die in die Insertionsregion des FHV- Genoms gemäss der Erfindung inkorporiert wird, in vivo kontinuierlich exprimiert werden, wobei eine solide, sichere und langlebige Immunität gegenüber einem Krankheitserreger erreicht wird.
- Eine erfindungsgemässe, rekombinante FHV-Mutante, die eine oder mehrere, verschiedene, heterologe Polypeptide beinhaltet und exprimiert, kann als monovalenter oder polyvalenter Impfstoff dienen.
- Für die Herstellung eines Lebendimpfstoffes kann die erfindungsgemässe, rekombinante FHV-Mutante auf einer von Katzen stammenden Zellkultur gezüchtet werden. Die so gewachsenen Viren können durch Sammeln der Flüssigkeiten der Gewebezellkultur und/oder Zellen eingebracht werden. Der Lebendimpfstoff kann in Form einer Suspension hergestellt werden oder er könnte lyophilisiert werden.
- Zusätzlich zu einer immunogen wirksamen Menge des rekombinanten FHV kann der Impfstoff einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff oder ein Verdünnungsmittel beinhalten.
- Beispiele von pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln, die nützlich für die vorliegende Erfindung sind, beinhalten Stabilisatoren, wie SPGA, Kohlenhydrate (z. B. Sorbitol, Mannit, Stärke, Zucker, Glukose, Dextran), Proteine wie Albumin oder Kasein, Protein-enthaltende Stoffe wie Rinderserum oder Magermilch und Puffer (z. B. Phosphatpuffer).
- Gegebenenfalls können eine oder mehrere Verbindungen mit adjuvanter Aktivität dem Impfstoff zugefügt werden. Geeignete Adjuvantien sind zum Beispiel Aluminiumhydroxid, Phosphat oder Oxid, Ölemulsionen (z. B. Bayol F® oder Marcol 52®, Seifen oder Vitamin E-Aufschlussmittel.
- Die geeignete, zu verabreichende Dosis wird sich abhängig vom Alter, Gewicht und Administrationsweg unterscheiden. Eine geeignete Dosis kann zum Beispiel ungefähr 104,5 pfu/Tier sein.
- Eine erfindungsgemässe FHV-Mutante kann auch für die Herstellung von einem inaktivierten Impfstoff verwendet werden.
- Für die Verabreichung an Tiere kann die erfindungsgemässe FHV-Mutante unter anderem intranasal, intradermal, subkutan oder intramuskulär verabreicht werden.
- Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von Impfstoffen mit Untereinheiten, pharmazeutischen und diagnostischen Zubereitungen, die ein heterologes Polypetid beinhalten, das durch eine rekombinante, erfindungsgemässe FHV-Mutante exprimiert wird. Dies kann erreicht werden durch Kultivierung von Zellen, die mit dem genannten, rekombinanten FHV unter Bedingungen infiziert wurden, die eine Expression von heterologen Polypeptiden erlaubt. Das heterologe Polypeptid kann dann mit konventionellen Verfahren bis zu einem gewissen Grade gereinigt werden, abhängig von dem beabsichtigten Gebrauch und dann weiter in eine Zubereitung mit immunisierender, therapeutischer oder diagnostischer Aktivität verarbeitet werden.
- Die oben beschriebene aktive Immunisierung gegen spezifische Pathogene wird als protektive Behandlung bei gesunden Tieren angewendet. Ohne es weiter erwähnen zu müssen, können Tiere, die bereits mit einem spezifischen Krankheitserreger infiziert sind, mit einem Antiserum behandelt werden, das Antikörper umfasst, die durch eine rekombinante FHV-Mutante gemäss der Erfindung ausgelöst wurden, die ein heterologes Gen umfasst, das von dem spezifischen Krankheitserreger stammt und ein antigenes Polypeptid kodiert. Ein Antiserum, das gegen einen erfindungsgemässen, rekombinanten FHV gerichtet ist, kann durch Immunisierung von Tieren, zum Beispiel Katzen, mit einer wirksamen Menge des genannten, heterologen FHV zur Auslösung einer entsprechenden Immunantwort, hergestellt werden. Danach werden die Tiere zu Ader gelassen und das Antiserum kann hergestellt werden.
- Der Impfstamm von FHV-1 (im Handel erhältlich als Katzen- Rhinotracheitisvirus, Stamm G2620, von Intervet International B. V.; Holland) wurde auf Crandell-Rees Katzennieren (CRFK)-Zellen (Crandell, R. A. et al., In Vitro 9, 176-185, 1973) in Glasgows modifizierten Minimalmedium, das mit 2, 0 g/l Tryptose, 2, 5 g/l Lactalbuminhydrolysat und 5% fötalem Kälberserum angereichert ist, wachsen gelassen. Die Kulturüberstände wurden geerntet, nachdem sich die volle zytopathische Wirkung entwickelt hat, und der Virus wurde durch Präzipitation mit Polyethylenglykol konzentriert (Yamamoto, K. R. et al., Virology 40, 734-744, 1970). Die DNA wurde aus Virusteilen durch Digestion bei 37ºC über 2 Stunden mit 100 ug/ml Proteinase K (Promega, Wisconsin, USA) in einem Puffer, der 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA und 0,5% SDS enthielt, herausgelöst. Nach wiederholten Extraktionen mit einer 1 : 1-Mischung aus Phenol/Chloroform wurden die Nukleinsäuren mit zwei Volumen Ethanol präzipitiert und in TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) gelöst. Die virale DNA wurde teilweise mit dem Restriktionsenzym Sau3A (Promega, Wisconsin, USA) gemäss den Bedingungen, die von dem Enzymhersteller empfohlen werden, verdaut und die Reaktionsprodukte wurden auf präparatives 0,8% Agarosegel getrennt.
- Fragmente der Grössenfraktion zwischen 10 und 15 kb wurden isoliert und 2 Stunden bei 15ºC mit DNA ligiert, die von Bakteriophagen Lambda EMBL4 mit BamHI und SalI verdaut wurde (Kaiser, K. und Murray, N. in "DNA Cloning", Volume 1, Kapitel 1, IRL Press, 1985). Die Reaktionsprodukte wurden in vitro gesammelt (Promega, Wisconsin, USA) und die rekombinante Phage wurde auf dem E.coli-Wirtsstamm LE392 plattiert. Die Bibliothek in Lambda EMBL4 wurde für die Rekombinanten, die Insertionen besitzen, mit Sequenzen angereichert, die in spezifischer Weise in relativ grossen SalI-Restriktionsfragmenten des viralen Genoms vorhanden sind, indem Nitrozellulosereplikafilter mit einer 32P- markierten DNA-Probe, die aus 10-15 kb-Restriktionsfragmente besteht, die durch präparative Agarosegelelektrophorese der FHV-genomischen DNA, die mit SalI verdaut, isoliert und gescreent wurden (für technische Details siehe Sambrook, J. et al., in "Molecular Cloning: A laboratory Manual", Kapital 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Individuelle Rekombinanten, die über dieses Screeningverfahren gewonnen wurden, wurden amplifiziert und die Restriktionsmuster der Lambda Insertions-DNA wurden mit den veröffentlichten Karte des FHV-Genoms verglichen (Grail, A. et al., Arch. Virol., 116; 209-220, 1991). Eins der Isolate, als λFHV02 bezeichnet, wurde für weitere Studien selektioniert und das 10,9 kb-Einsatz dieses Klons (siehe Abb. 1) wurde nahe dem linken Ende des einzigartigen, langen Segments des viralen Genoms zwischen Einheit 0,08 und 0,17 auf der Karte von Grail et al., siehe oben, positioniert.
- Das 5,1 kb BamHI-Fragment von λFHV02, welches in pGEM3Z subgeklont wurde und pFHV01 ergab (siehe Abb. 2A), enthüllte eine einzigartige BglII-Restriktionsstelle in einer geeigneten Position zur Integration eines Markergens. Das für die Insertion verwendete Gen wurde aus pCH110 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) entwickelt durch Ersetzen eines 72 bp SphI-Fragment nahe dem SV40-Ursprung der Replikation, wie er auf pCH110 vorhanden ist, durch ein doppelsträngiges, synthetisches Oligonukleotid mit der folgenden Struktur (SEQ ID Nr. 3 und 4):
- 5'-GGATCCGTCGACCATG-3'
- 3'-GTACCCTAGGCAGCTG-5'
- Die Insertion des Linker zwischen den zwei SphI- Restriktionsstellen von pCH110 stellt nicht die Erkennungssequenz für SphI auf beiden Seiten her und bildet eine SalI- sowie eine BamHI-Stelle flussaufwärts des SV40- Frühpromotors. Die anschliessende Digestion mit BamHI bildete eine 4,0 kb β-Galaktosidase-Expressionskassette, die an der BglII-Stelle von pFHV01 eingefügt wurde, was pFHV04 ergab (siehe Abb. 2B). Linearisierte DNA des Plasmid pFHV04 wurde zusammen mit viraler DNA in CRFK-Zellen durch Kalziumphosphat-vermittelte DNA-Präzipitation eingeführt (Graham, F. L. und v. d. Eb, A. J., Virology 52, 456-467, 1973). Ein Mikrogramm DNA von pFHV04 wurde mit 15 Mikrogramm DNA von FHV-infizierten Zellen mit einem Endvolumen von 376 ul H&sub2;O gemischt und 500 ul von 2 · HBSP (10 mM KCl, 280 mM NaCl, 12 mM Glukose, 1,5 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 50 mM HEPES, pH 7,0) beigegeben. Die Präzipitate wurden durch schrittweise Zugabe von 124 ul 1 M CaCl&sub2;-Lösung gebildet und dann die Mischung bei Zimmertemperatur für 30 Minuten inkubiert. Die Lösung der präzipitierten DNA wurde vorsichtig in zwei, 6 cm im Durchmesser grosse Behältnisse gegeben, die jeweils eine semikonfluente, einschichtige Schicht aus CRFK-Zellen in 5 ml Kulturmedium enthält. Nach 5 Stunden wurde das Medium entfernt und 5 ml HBSP mit 15% Glyzerol auf die Zellen geschichtet. Nach einer ein- bis zwei-minütigen Inkubation wurde die Lösung entfernt, die Zellen wurden mit dem Medium gewaschen und die Behältnisse mit Deckschichten aus 0,75% Agarose im Kulturmedium inkubiert. Nach 3 bis 4 Tagen, wenn die zytopathische Wirkung sich zu entwickeln beginnt, wurde eine zweite Agarose-Deckschicht mit dem Substrat Bluogal (Gibco-BRL, Maryland, USA) mit der Endkonzentration von 0,2 mg/ml hinzugefügt und die Platten solange inkubiert, bis sich blaue Plaques entwickelt haben. Positive Plaques wurden makroskopisch herausgenommen und in Kolben mit frischen CRFK-Zellen transferiert, um den Virus zu amplifizieren. Die Plattierung und Plaque-Isolierung wurde fortgeführt bis homogene Ansätze von rekombinanten Viren erstellt worden sind. Das Virusmaterial von den letzten Zubereitungen wurde für die detaillierte Analyse des viralen Genoms mittels Southern-Blot und für Tierimpfexperimente verwendet. Es wurde gezeigt, dass der rekombinante FHV, der das β- Galaktosidase-Markergen beinhaltet, das an der BglII-Stelle in pFHV01 insertiert wurde, über die serielle Passage in Kulturgewebe auf CRFK-Zellen stabil ist.
- Die Nukleotidsequenzanalyse wurde an relevanten Teilen des 5,1 kb grossen BamHI-Fragments, das im pFHV01 vorhanden ist, durchgeführt. Das gleiche Fragment wurde daraufhin in beiden Richtungen in die BglII-Stelle von pSP72 (Promega, Wisconsin, USA) subgeklont, was pFHV02 bzw. p FHV03 ergab. Progressive Deletionen wurden nach doppelter Digestion der plasmidischen DNA mit den zugehörigen Restriktionsenzymen eingeführt, indem das Enzym Exonuklease III (Henikoff, S., Gene 28, 351-359, 1984) verwendet wurde. Es wurden ein 5' und 3'-überhängendes Extrem gebildet. Die Gegenwart eines überhängenden 3'-Einzelstrangextrems verhinderte eine Zerkleinerung der DNA des Plasmidvektors durch die Exonuklease III. Proben des Reaktionsgemisches wurden in 30- Sekunden-Intervallen entnommen und gemäss Henikoff, s. o., behandelt, wobei rezirkulierende DNA-Moleküle hergstellt wurden, die in kompetente E.coli-Zellen transformiert wurden. Die Plasmid-DNA aus den Mini-Zubereitungen der individuellen Kolonien wurden durch Restriktions-Kartierung auf die Grösse der Deletion, die in das originäre 5,1 kb- Fragment eingeführt wurde, hin untersucht. Serien von Bewerbern mit progressiven Deletionen wurden durch Nukleotidsequenzierung auf doppelsträngige DNA in einer Kettenterminierungsreaktion unter Verwendung von T7- Polymerase (Pharmacia, Uppsala, Schweden) analysiert. Inkomplette oder unklare Ablesung innerhalb der Nukleotidsequenz wurden durch spezifisches Priming der Kettenelongationsreaktion auf der eingefügten DNA des Plasmid pFHV01, pFHV02 und pFHV03 gelöst. Sequenzierungsdaten wurden gesammelt und mit dem Gen-Master (Bio-Rad, California, USA) oder gleichwertiger Software analysiert. Durch das Zusammenstellen aller Daten ergab sich eine ungefähr 1,0 kb Region (SEQ ID Nr. 1) innerhalb des einzigartigen langen Segments des FHV-Genoms, das einen offen Leserahmen von 579 Nukleotiden, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz kodiert, wie sie in SEQ ID Nr. 2 dargestellt wird und die tatsächliche BglII- Restriktionsstelle beinhaltet, die wiederum für die Insertion eines Markergens verwendet wird, sowie ungefähr 0,4 kb einer nicht-translatierten, flankierenden DNA-Sequenz beinhaltet. Die Region von 1,0 kb kann für die Insertion fremder Gene in das FHV-Genom angewendet werden, ohne dass essentielle virale Funktionen, die für die Infektion und Replikation notwendig sind, verloren gehen.
- Basierend auf der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Sequenz wurde ein Fragment aus pFHV02 durch Trimmen leider Enden des 5,1 kb BamHI-Einsatzes mit dem Enzym Endonnuklease III und durch Verfolgen der gleichen Verfahren, wie sie für die Nukleotidsequenzanalyse beschrieben werden, entwickelt. Dies ergab pFHV24, welches einen 0,9 kb-Einsatz in pGEM7Zf(+) (Promega, Wisconsin, USA) beinhaltet mit der einzigen BglII- Restriktionsstelle, die vorher in pFHV01 definiert wurde und für die Integration fremder DNA richtig positioniert ist und danach in vivo mit dem viralen Genom rekombiniert wird (siehe Abb. 3A). Ein starker Promotor, der die Expression fremder Gene nach ihrer Insertion in das FHV- Genom lenken könnte, wurde aus der LTR-Sequenz des Rous Sarkomvirus (RSV) ausgewählt.
- Der Promotor wurde auf einem 580 bp NdeI/HindIII- Restriktionsfragment von pRSVcat (Gorman, C. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777-6781, 1982) kartiert und wurde zwischen den HindIII- und PstI-Stellen des pGEM3Z durch doppelsträngige, synthetische Linker auf beiden Seiten des Fragments eingefügt. Die Verbindung zwischen der HindIII- Stelle vom Vektor pGEM3Z und die NdeI-Stelle vom RSV- Fragment, der den LTR-Promotor trägt, wurde mit einem 30 bp Linker hergestellt, der kohäsive Enden besitzt, die mit HindIII auf der einen und NdeI auf der anderen Seite kompatibel ist. Trotzdem sind beide Restriktionsstellen nach der Ligation aufgrund erwägter Modifikationen in den äusseren Nukleotiden der sechs Basenpaar-Erkennungsstelle nicht wiederhergestellt. Zusätzlich zur Entfernung dieser zwei Stellen wurde eine neue Restriktionsstelle (BamHI) innerhalb des Linkers selber an der korrespondierenden Position gebildet. Ein zweiter 20 bp Linker wurde synthetisiert, was die HindIII-Stelle von dem LTR-Fragment an die PstI-Stelle von pGEM3Z bindet, in diesem Fall ohne Zerstörung der Erkennungssequenz auf beiden Enden und durch Zufügen der geeigneten, einzigartigen Restriktionsstellen BglII und XhoI zu den schon im Polylinker des pGEM3Z vorhandenen, z. B. PstI, XbaI und BamHI. Die sich ergebenden Derivate von pGEM3Z, als pVEC01 bezeichnet, beinhalten daher ein 650 bp Restriktionsfragment, das die LTR-Promotorsequenz trägt, die sofort von mehreren Restriktionsstellen gefolgt ist, die für die Insertion fremder Gene bereit stehen. Das 650 bp Fragment ist an dem jeweiligen Ende durch eine BamHI- Restriktionsstelle flankiert und ist zu der einzigartigen BglII-Stelle, die auf pFHV24 liegt, transferiert worden. Die kohäsiven Enden, die durch diese zwei Restriktionsenzyme erzeugt wurden, sind kompatibel, aber die Ligation stellt keine der originalen Erkennungssequenzen für BglII oder BamHI wieder her. Eines der sich ergebenden Konstrukte wurde als pFHV28 bezeichnet und mit der Restriktionskartierung geprüft (Abb. 3B). Die Struktur dieses FHV- Rekombinationsvektors erlaubt die Insertion fremder Gene unmittelbar flussabwärts des LTR-Promotors und die anschliessende Integration der vollständigen Expressionskassette in das FHV-Genom durch in vivo Rekombination.
- Die Positionen der verschiedenen Restriktionsstellen flussabwärts der LTR, insbesondere für die Enzyme BglII und XhoI, werden auf eine Art konstruiert, dass sogar multiple Geninsertion in betracht gezogen werden können. Eine erste Anwendungsform dieses Vektors beinhaltete das Gen, das das Hüllenprotein von der FeLV/Untergruppe A kodiert, und wurde auf einem 2,0 kb Pstl-Fragment von pFGA-5 isoliert (Stewart, M. A. et al., J. Virol. 58, 825-834, 1986) und mit dem kodierenden Strang in der T7-Orientation des pGEM3Z subgeklont. Die einzigartige SphI-Stelle, die im Polylinker des Vektors vorhanden ist, wurde durch BamHI durch Zugabe eines synthetischen Linkers auf gleiche Weise wie die Modifikation, die in pCH110 eingeführt wurde (siehe Beispiel 1), ersetzt.
- Das vollständige Gen, das nun auf einem 2,0 kb BamHI- Fragment isoliert werden konnte, wurde an der BglII-Stelle des pFHV28 eingefügt, was pFHV29 ergab. Die richtige Orientierung des FeLV-Hüllengens in Bezug auf den LTR- Promotor wurde durch Restriktionsanalyse bestätigt (siehe Abb. 4).
- Ein Mikrogramm der linearisierten DNA des Plasmid pFHV29 wurde zusammen mit 15 Mikrogramm der viralen DNA in CRFK- Zell en transfiziert, wie es vorgängig in Beispiel 1 für die Insertion des β-Galaktosidase-Markergens beschrieben wurde. Der Abkömmling der Transfektion wurde nach 3 bis 4 Tagen geerntet und in seriellen Verdünnungen auf CRFK-Zellen in Mikrotiterplatten gesät. Nachdem sich ein zytopathischer Effekt entwickelt hatte, wurden die Platten mit Alkohol fixiert und mit Hasenantikörpern, die gegen das gereinigte, native Hüllenprotein von FeLV gezüchtet wurden, inkubiert. Spezifisch gebundene Antikörper wurden mit einem fluoresceinmarkierten anti-Hasen Ziegenserum nachgewiesen und unter einem UV-Mikroskop zur Darstellung gebracht. Plaques, die rekombinante FHV beinhalteten und das Hüllenprotein von FeLV exprimieren, wurden bei einer Frequenz von ungefähr 5 · 10&supmin;&sup4; nachgewiesen.
- Das Gen, welches das Hüllenprotein von FIV kodiert, wurde auch als wichtiger Kandidat für die Insertion in die spezifische Region von U&sub1; von FHV betrachtet. Das Gen stammt von dem proviralen Genom eines holländischen FIV-Isolats, dem FIV-UT 113 (Verschoor, E. J. et al., Virology 193, 433- 438, 1993) und als ein 2,6 kb BamHI-Fragment vor V28, mit dem gleichen Verfahren, wie es oben für das Hüllengen des FeLV beschrieben wurde, subgeklont. Das sich ergebende Rekombinationsplasmid pFHV37 (siehe Abb. 5) wurde zusammen mit FHV-DNA auf CRFK-Zellen transfiziert, wie es in Beispiel 1 für die β-Galaktosidase-Expressionskassette beschrieben worden ist. Der virale Abkömmling der Transfektion wurde auf CRFK-Zellen in Mikrotiterplatten gesät, so dass 50 bis 100 pfu pro Wanne erhalten wurden. Nach der Inkubation wurde der Überstand jeder einzelnen Wanne getrennt gelagert und der verbliebene Rest der Platten mit Alkohol fixiert. Die Platten wurden mit dem ersten Reagenz, das aus einem mit FIV-infizierten Katzenserum besteht, inkubiert. Spezifische Hüllenantikörper wurden mit einem fluoresceinmarkierten anti-Katzen Hasenserum nachgewiesen und unter UV-Licht mikroskopisch zur Darstellung gebracht.
- Wannen mit positiven Stellen wurden bewertet und die korrespondierenden Virusproben, die parallel gelagert worden sind, wurden nochmals in begrenzten Verdünnungen von ungefähr 1 bis 5 pfu pro Wanne gesät und in gleicher Weise behandelt, wie es oben beschrieben wurde. Das Plattieren wurde wiederholt, bis der Virusansatz für die Expression des Hüllenproteins, wie es im Immunfluoreszenztest nachgewiesen wurde, mehr als zu 50% homogen erschien.
- Eine abschliessende Reinigung wurde mit Einzelplaque- Isolierung unter einer Agarosedeckschicht durchgeführt. Eins der Isolate, die durch dieses Verfahren gewonnen wurde, wurde ausgewählt und als FHV-Stamm F2-1 bezeichnet. Es wurden amplifizierte Ansätze mit Titern, die grösser als 1 · 10&sup7; pfu/ml waren, auf CRFK-Zellen hergestellt und bis zum nächsten Experiment bei -80ºC gelagert.
- Die virale Genomstruktur des F2-1-Stammes wurde mit dem Southern-Blot unter Verwendung eines DNA-Fragments mit dem LTR-Promotor als Probe für die Hybridisierung analysiert. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Position der BglII- und EcoRI-Restriktionsstellen in der Region des Genoms, wo das Hüllengen eingefügt wurde, in Übereinstimmung mit den erwarteten Mustern lag.
- Einer der Viren, die wie in Beispiel 1 beschrieben konstruiert wurden und das β-Galaktosidasegen beinhaltet, das an der BglII-Stelle innerhalb der 1 kb Region des einzigartigen langen Segments, wie es in. SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird, eingefügt wurde, wird als FHV-Stamm 05-4- 1-1 bezeichnet. Die Pathogenität dieses Virus und die Fähigkeit vor klinischen Anzeichen, die durch Exposition mit einem virulenten FHV-Stamm erzeugt wurden, zu schützen, wurden in einem Tierexperiment untersucht und mit dem elterlichen Stamm G2620 verglichen.
- Spezifische, pathogenfreie, 12 Wochen alte Katzen wurden oronasal mit ca. 1 · 10&sup5; TCIDso der FHV-Mutante oder mit dem elterlichen Stamm durch auftragen von 0,3 ml pro Nasenloch und 0,4 ml in den Oropharynx infiziert. Die Tiere wurden täglich über einen Zeitraum von 2 Wochen auf spezifische, klinische Zeichen für eine FHV-1-Infektion untersucht und gemäss den Kriterien, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, bewertet. Die Katzen wurden sechs Wochen nach der Impfung oronasal mit 1 · 10&sup5; TCID&sub5;&sub0; des FHV-1-Stammes SGE (National Veterinary Service Laboratory, USA) exponiert und über einen Zeitraum von 2 Wochen auf klinische Zeichen einer FHV-1- Infektion untersucht. Klinische Beobachtungen nach der Impfung sowie nach der Exposition sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Die Katzen in Gruppe 1, die eine oronasale Impfung mit dem Stamm 05-4-1-1 erhalten hatten, zeigten eine vermindertes Punktniveau bezüglich der klinischen Zeichen im Vergleich zu den Tieren in Gruppe zwei, die den elterlichen Stamm G2620 erhielten.
- Nach Exposition zeigten die Katzen der Gruppe eins und zwei eine durchschnittliche, 10-fache Verminderung bezüglich klinischer Krankheitsanzeichen verglichen mit den nicht geimpften Kontrollen in Gruppe 3. Daher wurde hieraus geschlossen, dass der mutierte Stamm 05-4-1-·1 bei der Katze eine verminderte Virulenz bei oronasaler Anwendung zeigt und trotzdem noch in der Lage ist, einen hohen Schutz gegenüber klinischen Krankheitsanzeichen durch die FHV-Infektion nach Exposition zu induzieren. TABELLE 1 TABELLE 2
- Restriktionskarte der 10,9 kb DNA-Insertion von λFHV02. Die Position dieses Fragments im viralen Genom wurde nahe des linken Endes des einzigartigen langen Segments genkartiert. Subklonieren des 5,1 kb BamHI-Fragments ergab pFHV01.
- Karte des Plasmids pFHV01, das das 5,1 kb BamHI Restriktionsfragment von dem in pGEM3Z subgeklonten λFHV02 enthält.
- A-Karte des Plasmids pFHV04, das eine 4,0 kb β- Galaktosidase-Expressionskassette enthält, die an der einzigartigen BglII-Restriktionsstelle von pFHV01 eingefügt ist.
- A-Restriktionskarte von pFHV24. Dieses Konstrukt stammt von pFHV02 durch Eliminierung überschüssiger Sequenzen, welche die Insertionsregion, wie sie in SEQ ID Nr. 1 definiert ist, flankieren. Die Position des offenen Leserahmens (ORF), wie er in SEQ ID Nr. 1 definiert ist, ist oben auf der Seite angegeben.
- B-Restriktionskarte von dem Plasmid pFHV28, der den LTR- Promotor mit multiplen Klonstellen beinhaltet, welcher an der einzigartigen BglII-Stelle des pFHV24 eingefügt wurde. Der Vektor ermöglicht die Integration fremder Gene in das Genom des FHV durch in vivo Rekombination.
- Restriktionskarte von pFHV29, welcher das Gen beinhaltet das das Hüllenprotein von FeLV kodiert, das an der BglII-Stelle von pFHV28 flussabwärts des LTR-Promotors eingefügt wurde.
- Restriktionskarte von pFHV37, welcher das Gen beinhaltet, das das Hüllenprotein von FIV kodiert, das an der BglII- Stelle von pFHV28 flussabwärts des LTR-Promotors eingefügt wurde.
Claims (16)
1. FHV-Mutante, welche eine Mutation in dem FHV-Genom in
einer Region, die durch die DNA-Sequenz eines offenen
Leserahmens definiert wird, der ein in SEQ ID Nr. 2
dargestelltes Polypeptid oder eine Variante des
genannten Polypeptids kodiert, und flankierende,
intergene Sequenzen davon umfasst, wobei die genannte
Mutation eine Änderung der genetischen Information in
der oben erwähnten Region hinsichtlich der genetischen
Information ist, die in dieser Region des natürlich
vorkommenden FHV-Genoms vorhanden ist, vorausgesetzt,
dass die genannte FHV-Mutante nicht in der Lage ist,
irgendein antigenes oder funktionelles Polypeptid, wie
es in SEQ ID Nr. 2 dargestellt wird, oder eine Variante
des genannten Polypeptids herzustellen.
2. FHV-Mutante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass sie eine heterologe Nukleinsäuresequenz, wobei die
genannte Nukleinsäuresequenz, die in eine
Insertionsregion des FHV-Genoms eingeführt wird, die
durch die DNA-Sequenz eines offenen Leserahmens, welcher
ein in SEQ ID Nr. 2 dargestelltes Polypeptid kodiert,
definiert wird, sowie flankierende, intergene Sequenzen
umfasst.
3. FHV-Mutante nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, dass die Insertionsregion eine DNA-
Sequenz besitzt, wie sie in SEQ ID Nr. 1 dargestellt
ist.
4. FHV-Mutante nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet,
dass die heterologe Nukleinsäuresequenz in die
Insertionsregion eingeführt wird, welche durch die DNA-
Sequenz des offenen Leserahmens, der das in SEQ ID Nr. 2
dargestellte Polypeptid kodiert, definiert ist.
5. FHV-Mutante nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet,
dass die heterologe Nukleinsäuresequenz an der Bglll-
Restriktionsstelle im offenen Leserahmen eingeführt
wird.
6. FHV-Mutanten nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet,
dass wenigstens ein Teil der DNA-Sequenz des FHV
innerhalb der Insertionsregion deletiert wird.
7. FHV-Mutante nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet,
dass die heterologe Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid
kodiert und unter der Kontrolle eines Promotors steht,
der die Expression der genannten Nukleinsäuresequenz in
einer Zelle, die mit dem genannten, rekombinanten FHV
infiziert ist, reguliert.
8. FHV-Mutante nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet,
dass die heterologe Nukleinsäuresequenz ein Antigen
eines Katzenpathogens kodiert.
9. FHV-Mutanten nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
dass das Antigen von einem Krankheitserreger stammt, der
aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus dem
Katzenleukämievirus, dem Katzenimmunmangelvirus, dem
Katzencalicivirus, dem Katzenparvovirus, dem
Katzencoronavirus und den Katzenchlamydien besteht.
10. Nukleinsäuresequenz, welche eine Region des FHV-Genoms,
das durch die DNA-Sequenz des offenen Leserahmens, der
das in SEQ ID Nr. 2 dargestellte Polypeptid kodiert,
definiert ist, und flankierende, antigene Sequenzen
umfasst.
11. Nukleinsäuresequenz, welche ein Gen, das heterolog zu
FHV ist und unter der Kontrolle eines Promotors steht,
das von DNA-Sequenzen flankiert ist, die von der
Insertionsregion des FHV-Genoms stammen, die durch die
DNA-Sequenz des offenen Leserahmens, der das in SEQ ID
Nr. 2 dargestellte Polypeptid oder eine Variante davon
kodiert, definiert ist, sowie flankierende, intergene
Sequenzen umfasst.
12. Rekombinantes DNA-Molekül, welches eine
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 10 oder 11 umfasst.
13. Wirtszelle, welche mit einem rekombinanten DNA-Molekül
nach Anspruch 12 transfiziert wird.
14. Verfahren zur Herstellung einer FHV-Mutante nach
Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass eine
Zellkultur mit FHV-genomischer DNA und einem
rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 12 transfiziert
wird.
15. Zellkultur, welche mit einer FHV-Mutante nach Anspruch
1-9 infiziert wird.
16. Impfstoff, welcher eine FHV-Mutante nach Anspruch 1-9
umfasst.
SEQUENCE LISTING
(1) GENERAL INFORMATION:
(i) APPLICANT:
(A) NAME: Akzo N. V.
(B) STREET: Velperweg 76
(C) CITY: Arnhem
(E) COUNTRY: The Netherlands
(F) POSTAL CODE (ZIP): 6824 BM
(G) TELEPHONE: 04120-66379
(H) TELEFAX: 04120-50592
(I) TELEX: 37503 alpha nl
(ii) TITLE OF INVENTION: Recombinant feline herpesvirus vaccine
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 4
(iv) COMPUTER READABLE FORM:
(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 1007 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Feline herpesvirus (FHV-1)
(B) STRAIN: G 2620
(vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: pFHV01
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 253. .834
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 193 amino acids
(B) TYPE: amino acid
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(ii) MOLECULE TYPE: protein
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(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:
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(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
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GGATCCGTCG ACCATG 1
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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 16 base pairs
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(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
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TACCCTAGG CAGCTG
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