JP3529146B2 - 組み換え体ネコヘルペスウイルスワクチン - Google Patents

組み換え体ネコヘルペスウイルスワクチン

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ネコヘルペスウイルス
（ＦＨＶ）ゲノムの一領域に変異を有するＦＨＶ変異体
（ｍｕｔａｎｔ）と、ＦＨＶ挿入領域を含む核酸配列
と、挿入領域由来のＤＮＡをその側方に伴った異種核酸
配列を含む核酸配列と、そのような核酸配列を含む組み
換えＤＮＡ分子と、ＦＨＶ変異体に感染させた細胞培養
物と、ＦＨＶ変異体を含むワクチンとに係わる。
【０００２】
【従来の技術】ネコ科動物の疾病の臨床上主要な問題点
の一つに、気道感染に関連するものが有る。気道感染は
ほとんどの場合、ネコヘルペスウイルス１型（ＦＨＶ）
またはネコカリチウイルスによって惹起される。
【０００３】ＦＨＶは、猫が罹患するネコウイルス性鼻
気管炎の原因物質である。仔猫ではＦＨＶ感染は全身化
し得、その結果死亡率が５０％にも達する。この疾病は
一般的で、世界中に見いだされ、くしゃみ、鬱状態、及
び目鼻からの粘液膿分泌を特徴とする。
【０００４】ＦＨＶは、ヘルペスウイルス科、αヘルペ
スウイルス亜科の一員である。ゲノムは約１２６ｋｂｐ
の長さを有し、約９９ｋｂｐのユニークな長領域
（ＵL）と２７ｋｂｐの短領域とから成り、前記短領域
は約８ｋｂｐの倒置反復配列を側方に伴った約９ｋｂｐ
のユニークな短領域（ＵS）を含む（Ｇｒａｉｌ ｅｔ
ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ． １１６， ｐ
ｐ．２０９−２２０， １９９１）。
【０００５】ＦＨＶ感染が蔓延し、かつその症状が重い
ので、改質生存または死滅ＦＨＶを含むネコウイルス性
鼻気管炎ワクチンが開発され、この疾病の発生率を低下
させるのに成功した。
【０００６】ＦＨＶ感染に加えて、猫はネコ白血病ウイ
ルス（ＦｅＬＶ）、ネコカリチウイルス、ネコ免疫不全
症ウイルス（ＦＩＶ）、ネココロナウイルス及びネコク
ラミジアなど、他の様々な病原体にも感染し得る。現
在、猫の上記病原微生物への感染は通常、生または不活
化ワクチンや当該病原体のサブユニットに由来するワク
チンによって防御され得る。
【０００７】しかし、上記のようなワクチンは幾つかの
欠点を有し得る。弱毒生ワクチンの使用には、動物に弱
毒化の不十分な病原微生物を接種する危険が常に伴う。
そのうえ、弱毒化された病原体が有毒状態に返り、その
結果ワクチン接種された動物が発症して、場合によって
は病原体が他の動物に拡散する恐れも有る。
【０００８】不活化ワクチンは通常低レベルの免疫しか
誘導せず、免疫感作の繰り返しを必要とする。また、中
和を誘導する病原体の抗原決定基が不活性化処理によっ
て変化して、ワクチンの感染防御力を低下させかねな
い。
【０００９】更に、生きたウイルスを複数種組み合わせ
て含有させたワクチンに関連する問題として抗原成分同
士の相互作用が有り、この相互作用は１種以上のワクチ
ン成分の効力低下を招く。
【００１０】組み換え体、または天然由来のサブユニッ
トワクチンにも幾つか欠点が有る。第一に、複製を行な
わない構造体として免疫系に付与されるポリペプチドサ
ブユニットはしばしば長期の免疫を誘導せず、しかもア
ジュバントの存在を必要とする。第二に、複製を行なう
構造体としての付与の方がサブユニット構造体としての
付与より効率的な免疫誘導を実現し得る。
【００１１】更に、現在投与されているＦＨＶの弱毒生
ワクチンまたは不活化ワクチンの下では、或る動物がＦ
ＨＶフィールドウイルスのキャリアであるのか、それと
も以前にワクチン接種を受けたのかを判断することは不
可能である。従って、有毒なフィールドウイルスの拡散
を低減する適当手段を講じることができるように、動物
がＦＨＶワクチンを接種されたのか、それともフィール
ドウイルスに感染したのか確認し得ることが重要とな
る。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ネコウイル
ス性鼻気管炎に対するワクチンの製造のみでなく、ネコ
科動物の他の感染症に対するワクチンの製造にも用いら
れ得るＦＨＶ変異体を提供することを目的とし、この変
異体は弱毒化した生きた病原体をワクチンとして用いる
ことに関連して潜在するいかなる危険も回避し、必ずし
もアジュバントを必要とせずに体液免疫系と細胞免疫系
との両方を有効に刺激し、かつ異なる抗原成分が互いに
不利に干渉する危険を伴わずに多価ワクチン実現の可能
性を提示する。
【００１３】本発明はまた、いかなるフィールド株また
は他のＦＨＶワクチンウイルスからも区別され得るＦＨ
Ｖワクチンウイルスを提供することも目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＦＨＶゲノム
の、配列番号２に示したポリペプチドをコードする転写
解読枠のＤＮＡ配列及び該配列の側方に位置する遺伝子
間配列によって規定された領域に変異を有するＦＨＶ変
異体を提供する。
【００１５】“変異”とは、上記領域の遺伝情報が天然
ＦＨＶのゲノムの同じ領域の遺伝情報に関して変化して
いることと理解される。変異は、例えば核酸の置換、欠
失、挿入もしくは逆位、またはこれらの組み合わせであ
り、配列番号２に示した抗原ポリペプチドもしくは機能
ポリペプチドを一切産生し得ないＦＨＶ変異体をもたら
す。
【００１６】好ましくは、ＦＨＶゲノムの上記のように
規定された領域に導入される変異は欠失または挿入によ
る。
【００１７】本発明は特に、異種核酸配列を含むことを
特徴とする組み換え体ＦＨＶ変異体を提供し、前記核酸
配列はＦＨＶゲノムの、配列番号２に示したポリペプチ
ドをコードする転写解読枠（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列及び
該配列の側方に位置する遺伝子間配列によって規定され
た領域に導入されている。
【００１８】本発明によるＦＨＶ変異体は任意のＦＨＶ
株、例えば株Ｇ２６２０（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂ．Ｖ．， ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅ
ｒｌａｎｄｓから市販）、Ｃ−２７（ＡＴＣＣ ＶＲ−
６３６）、ＦＶＲｍ（ＡＴＣＣ ＶＲ−８１４）、ＦＶ
Ｒｍワクチン（ＡＴＣＣ ＶＲ−８１５）またはＦ２か
ら得ることができる。
【００１９】本明細書中に用いた“組み換え体ＦＨＶ変
異体”という語は、異種核酸配列、即ちＦＨＶが天然に
有する遺伝子の核酸配列と同等でない核酸配列を含むＤ
ＮＡのウイルスゲノムへの組み込みによって遺伝的修飾
を施された感染性ウイルスを意味する。
【００２０】上記のような組み換え体ＦＨＶ変異体は、
細胞に侵入すると異種ポリペプチドの形態の異種遺伝子
を発現させ得る。
【００２１】“ポリペプチド”という語はアミノ酸の分
子鎖を意味し、この分子鎖は特定長の産生物ではなく、
また必要であれば、例えばグリコシル化、アミド化、カ
ルボキシル化またはホスホリル化によってｉｎ ｖｉｖ
ｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏに修飾され得る。即ち、特に
ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質がポリペプチ
ドの定義に含まれる。
【００２２】有用な（組み換え体）ＦＨＶ変異体を得る
ための必要条件は、異種核酸配列の挿入などによる変異
がＦＨＶゲノム配列の許容位置もしくは領域、即ちＦＨ
Ｖの感染や複製に必要な機能などの重要機能の破壊を伴
わずに変異の受容に用いられ得る位置もしくは領域にお
いて実現されることである。異種核酸配列が挿入される
場合、上記のような領域は挿入領域と呼称される。
【００２３】現在に至るまで、ＦＨＶゲノム上の遺伝子
の配置についてはさほど知られていない。Ｒｏｔａ等
（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５４， ｐｐ． １６８−１７
９，１９８６）及びＧｒａｉｌ等（Ａｒｃｈ． Ｖｉｒ
ｏｌ． １１６， ｐｐ．２０９−２２０， １９９
１）はＦＨＶゲノムの物理的地図を開示した。Ｎｕｎｂ
ｅｒｇ等（Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６３， ｐｐ．
３２４０−３２４９，１９８９）及びＣｏｌｅ等（Ｊ．
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６４， ｐｐ． ４９３０−４９
３８， １９９０）はチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子
を同定し、この遺伝子をＦＨＶゲノムのＳａｌＩ−Ａ制
限断片（Ｒｏｔａ等、上掲誌）にマッピングした。その
後、ＦＨＶ ＴＫ遺伝子内にＦｅＬＶ ｅｎｖ及びｇａ
ｇ遺伝子を挿入された組み換え体ＦＨＶ株が構成され
た。
【００２４】本発明で言及している（挿入）領域はこれ
まで、ＦＨＶゲノムでは同定されていなかった。驚くべ
きことに、上記領域では異種ＤＮＡの組み込みなどによ
る変異がＦＨＶの重要機能の破壊を伴わずに可能である
ことが判明した。
【００２５】更に意外なことに、先に述べたように規定
された領域に変異を導入すると、生きているＦＨＶ変異
体の毒性が該変異体の感染防御特性への悪影響を伴わず
に著しく低下することが判明した。この発見によって、
弱毒ＦＨＶ変異体を、例えば先に述べたように規定され
た領域への欠失または挿入の導入によって得る可能性が
提示され、そのようにして得られる変異体はワクチン接
種を受けるべき動物に生きた状態で安全に、経口／経鼻
ルートからでも投与され得る。
【００２６】本発明によるＦＨＶ変異体を製造するべく
異種ＤＮＡ配列の挿入などによって変異を導入するのに
用いられる（挿入）領域は、ＦＨＶゲノムＤＮＡを酵素
Ｓａｕ３Ａで部分的に消化することによって得られる１
０．９ｋｂｐの制限断片内に位置する。
【００２７】上記断片は制限酵素マッピングによって詳
細に分析され、実質的にウイルスゲノムの、Ｇｒａｉｌ
等（上掲誌）の地図上で地図単位０．０８から０．１７
に達するＵLセグメント内の１領域に対応する。
【００２８】本明細書に説明する（挿入）領域はＳａｌ
Ｉ断片内に位置し、配列番号２に示した、１９３個のア
ミノ酸から成るポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
と、該配列の上流側及び下流側に位置する遺伝子間配列
とを含む。上流側及び下流側遺伝子間配列はＯＲＦまた
はタンパク質をコードするＤＮＡ配列の一部を成さず、
またはＦＨＶウイルスの複製を調節する配列を含まな
い。これらの側方配列は、最も近い転写解読枠の始点ま
たは終点まで下流または上流方向へ伸長する。
【００２９】好ましくは、上流側及び下流側遺伝子間配
列の長さはそれぞれ約２５２及び１７３ｂｐである。
【００３０】好ましくは本発明は、異種核酸配列の挿入
などによる変異を、実質的に配列番号１に示したＤＮＡ
配列によって規定された（挿入）領域に有する（組み換
え体）ＦＨＶ変異体を提供する。
【００３１】異種ＤＮＡ配列の組み込みなどによる変異
は特に、配列番号２に示したアミノ酸配列を有するアミ
ノ酸１９３個の長鎖ポリペプチドをコードするＦＨＶ
ＤＮＡ配列、即ち配列番号１に示したヌクレオチド位置
２５３〜８３４に対応するＤＮＡ配列内で実現され、そ
の際異種ＤＮＡを挿入するうえで最も好ましい部位はヌ
クレオチド位置５７６にただ１個存在するＢｇｌＩＩ制
限部位である。
【００３２】ＦＨＶゲノムのＤＮＡ配列に関して、個々
のＦＨＶウイルス間に自然の変動（ｎａｔｕｒａｌ ｖ
ａｒｉａｔｉｏｎｓ）が存在し得ると理解される。その
ような変動は１個以上のヌクレオチドの欠失、置換、挿
入、逆位または付加をもたらし得る。この変動の結果生
じるＦＨＶ ＤＮＡ変体（ｖａｒｉａｎｔｓ）は、本明
細書に説明するＯＲＦとは別の対応するＯＲＦをコード
し得る。それらのＯＲＦ変体をコードするＤＮＡ配列
は、配列番号１のＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーショ
ンや、物理的地図の比較によって当該ＯＲＦをコードす
る類似領域を位置決定する方法を含めた幾つかの方法で
位置決定され得る。従って本発明は、任意のＦＨＶ株か
ら取得可能な（挿入）領域を提供する。
【００３３】そのうえ、上述の変動を遺伝子工学技術を
用いて実現し、それによって先に述べたように規定され
た（挿入）領域のＤＮＡ配列に関連するＤＮＡ配列を得
る可能性が存在する。このようにして得られる関連ＤＮ
Ａ配列を特徴とする、ＦＨＶゲノム内の（挿入）領域へ
の異種遺伝子の挿入などによる変異を有する（組み換え
体）ＦＨＶ変異体も本発明の範囲内であることは明らか
である。
【００３４】更に、本発明により同定された（挿入）領
域は重要な機能を有しないので、該領域の一部または全
部を欠失させ、その後所望であれば欠失部分に異種遺伝
子を導入することが可能である。
【００３５】要約すると、実質的に先に述べたように規
定された（挿入）領域は、ＦＨＶゲノム内の領域であっ
て所望であればこの領域からＤＮＡ配列が欠失した後に
異種核酸配列の組み込みに用いられ得るか、または別様
の変異、特にこの領域での欠失による変異の導入に用い
られ得る領域の位置を特徴付けている。
【００３６】本発明によりＦＨＶゲノムに組み込まれる
べき異種核酸配列は、例えばウイルス、原核生物、真核
生物、または合成的なものなど、任意の供給源に由来し
得る。この核酸配列は病原体、好ましくはネコ病原体に
由来し得、ＦＨＶゲノムへの挿入後疾病に対する免疫の
誘導に適用され得る。
【００３７】好ましくはネコ白血病ウイルス、ネコ免疫
不全症ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコパルボウイ
ルス、ネココロナウイルス及びネコクラミジアのポリペ
プチドをコードする核酸配列が、ＦＨＶゲノムの挿入領
域への組み込みに用いられる。
【００３８】更に、医薬品用または診断用のポリペプチ
ド、特にリンフォカイン、インターフェロンまたはサイ
トカインといった免疫調節剤をコードする核酸配列が上
記挿入領域に組み込まれ得る。
【００３９】組み換え体ＦＨＶ変異体において異種核酸
配列が発現するための重要な必要条件は、異種核酸配列
に適当なプロモーターが機能可能に結合していることで
ある。プロモーターが、組み換え体ＦＨＶに感染した細
胞内での遺伝子転写を誘導し得る任意の真核生物、原核
生物またはウイルスプロモーター、例えばレトロウイル
スの長い末端繰り返し配列（ＬＴＲ）のプロモーター
（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９，ｐｐ．
６７７７−６７８１， １９８２）、ＳＶ４０プロモー
ター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ， Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２０９， ｐｐ． １４２２−１４２７，
１９８０）またはサイトメガロウイルス直前プロモータ
ー（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ
４１， ｐｐ． ５２１−５３０， １９８５）などか
ら広く選択されることは当業者には明白である。
【００４０】本発明による変異体が欠失による変異を有
することが望ましい場合、先に述べたように同定された
領域のウイルスゲノムからの部分的または全体的欠失が
ｉｎｖｉｖｏ相同組み換え技術によって実現され得る。
【００４１】まず、配列番号１に示したユニークな長配
列の一部を含み、かつ各一方の側方部位に少なくとも１
００個のヌクレオチドを伴ったＤＮＡ断片が適当なプラ
スミド媒体中でサブクローニングされ得る。
【００４２】先に述べた領域に導入されるべき欠失は上
記プラスミドにおいて、転写解読枠にかまたはその近傍
に適正に配置された部位での１種以上の酵素による制限
消化によって実現され得る。残りのプラスミド分子の再
環化によって、新たに同定された領域内に存在するコー
ド配列の少なくとも一部を欠く誘導体が得られる。ある
いは他の場合には、転写解読枠の配列内に存在する制限
部位内から１または２方向に進行する欠失が導入され得
る。この欠失導入のためには、ＢａｌＩやエキソヌクレ
アーゼＩＩＩといった酵素が用いられ得る。再環化され
たプラスミド分子でＥ．ｃｏｌｉ細胞が形質転換され、
個々のコロニーが上記特定領域に導入された欠失の大き
さを決定するべく制限マッピングによって分析される。
欠失の正確な位置は配列分析によって求めることができ
る。明確な欠失を有するプラスミドとＦＨＶウイルスＤ
ＮＡとで同時に、培養されたネコ細胞がトランスフェク
ションされ得る。ｉｎ ｖｉｖｏ組み換えが生起した
後、ウイルスゲノムの先に述べた領域内の適正位置に欠
失が導入される。ウイルス子孫中の組み換え体は、例え
ば本来欠失が導入された位置である接合部に生じるヌク
レオチド配列と特異的にハイブリダイズする１５〜２０
塩基長の合成オリゴマーによって同定され得る。
【００４３】ｉｎ ｖｉｖｏ相同組み換えの技術は、Ｆ
ＨＶゲノムに異種核酸配列を導入するのに用いられ得
る。この導入を達成するために、まずＦＨＶゲノムＤＮ
Ａとの組み換えのための組み換え体ＤＮＡ分子が構成さ
れる。そのような分子は任意の適当なプラスミド、コス
ミドまたはファージ、最も好ましくはプラスミドに由来
し得、かつ、所望であればプロモーターと機能可能に結
合した異種核酸配列を含む。この核酸配列及びプロモー
ターは本明細書中に定義した挿入領域配列を含むＦＨＶ
ゲノムＤＮＡの断片に導入され、組み換え体ＤＮＡ分子
においてサブクローニングされる。異種核酸配列の側方
に位置する挿入領域配列は、ＦＨＶウイルスゲノムとの
ｉｎ ｖｉｖｏ相同組み換えを生起させ得る、例えば５
０〜３０００ｂｐの適当な長さを有するべきである。所
望であれば、同じかまたは異なる病原体に由来する２種
以上の異なる異種核酸配列を含む構成体が製造され得、
その際前記核酸配列は本明細書に定義されたＦＨＶの挿
入領域配列を側方に伴う。このような組み換え体ＤＮＡ
分子は、２種以上の異なる抗原ポリペプチドを発現させ
て多価ワンチンをもたらす組み換え体ＦＨＶの製造に用
いられ得る。
【００４４】次に、適当なＦＨＶ配列を側方に伴った異
種核酸配列を含む組み換え体ＤＮＡ分子の存在下にＦＨ
Ｖ ＤＮＡで細胞、例えばネコ腎細胞（ＣＲＦＫ）また
はネコ胚細胞がトランスフェクションされ得、それによ
って組み換え体ＤＮＡ分子の挿入領域配列とＦＨＶゲノ
ムの挿入領域配列との間に組み換えが生起する。組み換
えは、プラスミド配列を有しない、適当な挿入領域配列
を側方に伴った異種核酸配列を含む核酸配列で感染細胞
をトランスフェクションすることによっても実現され得
る。このような組み換えの結果として細胞培養物中に生
じた組み換え体ウイルス子孫は、例えばハイブリダイゼ
ーションや、異種核酸配列に沿って同時に組み込まれた
遺伝子がコードする酵素の活性の検出や、組み換え体Ｆ
ＨＶで発現した抗原性の異種ポリペプチドの免疫学的検
出などによって遺伝子型または表現型に基づき選択され
得る。組み換え体ウイルスの選択は、ネオマイシン、ゲ
ンタマイシンまたはミコフェノール酸といった化合物に
対する耐性に基づいて実際的に行なうことも可能であ
る。選択された組み換え体ＦＨＶは細胞培養物中で大規
模に培養され得、その後該ＦＨＶで発現した物質もしく
は異種ポリペプチドを含む組み換え体ＦＨＶが前記培養
物から回収され得る。
【００４５】本発明による生きたＦＨＶ変異体、特に特
定病原体に由来する１種以上の異種ポリペプチドを発現
させる生きた組み換え体ＦＨＶは、動物、特に猫及びイ
ヌ科動物種の家畜であるもの及び家畜でないものへのワ
クチン接種に用いられ得る。上記のような生ベクターワ
クチンの接種後、好ましくは接種を受けた宿主内で組み
換え体ＦＨＶの複製が起こり、ＦＨＶポリペプチドに沿
って異種ポリペプチドがｉｎ ｖｉｖｏで発現する。接
種を受けた宿主で発現したポリペプチドは、ＦＨＶと特
定病原体との両方に対する免疫応答を誘導する。特定病
原体に由来する異種ポリペプチドが感染防御免疫応答を
刺激し得る場合、本発明による組み換え体ＦＨＶ変異体
を接種された動物は以後、当該病原体への感染にもＦＨ
Ｖへの感染にも免疫性となる。即ち、本発明によりＦＨ
Ｖゲノムの挿入領域に組み込まれた異種核酸配列はｉｎ
ｖｉｖｏで連続的に発現して、病原体に対する確実
で、安全で、かつ持続する免疫を実現し得る。
【００４６】１種以上の異なる異種ポリペプチドを含
み、かつ発現させる本発明による組み換え体ＦＨＶ変異
体は、一価または多価ワクチンとして機能し得る。
【００４７】生ワクチン製造のために、本発明による組
み換え体ＦＨＶ変異体はネコ由来の細胞培養物上で増殖
させ得る。増殖したウイルスは組織細胞培養液及び／ま
たは細胞を集めることによって回収され得る。生ワクチ
ンは懸濁液の形態に製造され得、または凍結乾燥され得
る。
【００４８】免疫学的有効量の組み換え体ＦＨＶに加え
て、ワクチンは薬剤学的に許容可能なキャリヤまたは稀
釈剤も含有し得る。
【００４９】本発明に有用である薬剤学的に許容可能な
キャリヤまたは稀釈剤の例には、ＳＰＧＡなどの安定
剤、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、澱
粉、スクロース、グルコース、デキストラン）、アルブ
ミンやカゼインなどのタンパン質、ウシ血清や脱脂乳な
どのタンパン質含有製剤、及び緩衝液（例えばリン酸塩
緩衝液）が含まれる。
【００５０】場合によっては、アジュバント活性を有す
る１種以上の化合物がワクチンに添加され得る。適当な
アジュバントは、例えば水酸化アルミニウム、リン酸ア
ルミニウムもしくは酸化アルミニウム、［例えばＢａｙ
ｏｌ Ｆ（登録商標）またはＭａｒｃｏｌ ５２（登録
商標）の］油乳濁液、サポニンまたはビタミンＥ溶解物
などである。
【００５１】有効な投与量は年齢、体重及び投与モード
に従って変化する。適当な投与量は、例えば動物１体当
たり約１０4・5ｐｆｕであり得る。
【００５２】本発明によるＦＨＶ変異体は不活化ワクチ
ンの製造にも用いられ得る。
【００５３】動物への投与に関して、本発明によるＦＨ
Ｖ変異体は特に鼻腔内、皮内、皮下または筋肉内投与さ
れ得る。
【００５４】本発明は、本発明による組み換え体ＦＨＶ
変異体で発現した異種ポリペプチドを含むサブユニット
ワクチン、医薬品用調製物及び診断用調製物も提供す
る。これらは、上記組み換え体ＦＨＶ変異体に感染させ
た細胞を異種ポリペプチドの発現を促進する条件下に培
養することによって得ることができる。発現した異種ポ
リペプチドはその所期の用途に応じて或る程度慣用技術
で精製し、かつ更に処理して、免疫活性、治療活性また
は診断活性を有する調製物とされ得る。
【００５５】特定病原体に対する上述の能動免疫付与
は、健康な動物への感染防御処置として適用され得る。
既に特定病原体に感染した動物が、抗原ポリペプチドを
コードする当該病原体由来の異種遺伝子を含む本発明に
よる組み換え体ＦＨＶ変異体によって誘発された抗体を
含む抗血清で治療され得ることは言うまでもない。本発
明による組み換え体ＦＨＶに対する抗血清は、動物、例
えば猫を有効量の前記組み換え体ＦＨＶで免疫感作して
適当な免疫応答を誘導することによって製造され得る。
免疫応答誘導後、動物から採血して抗血清を製造し得
る。
【００５６】
【実施例】実施例１ ＦＨＶゲノムのユニークな長い配列における新規挿入領
域の特徴付け −ＦＨＶ ＤＮＡの調製及びλベクターＥＭＢＬ４にお
けるゲノムライブラリーの樹立。
【００５７】トリプトース２．０ｇ／ｌ、ラクトアルブ
ミン水解物２．５ｇ／ｌ及びウシ胎児血清５％を補充し
たグラスゴーの変形最少必須培地中で、Ｃｒａｎｄｅｌ
ｌ−Ｒｅｅｓネコ腎臓（ＣＲＦＫ）細胞（Ｃｒａｎｄｅ
ｌｌ， Ｒ．Ａ．ら， ＩｎＶｉｔｒｏ ９， １７６
−１８５， １９７３）上でＦＨＶ−１のワクチン株
（ネコ鼻気管炎ウイルス、Ｇ２６２０株としてオラン
ダ、ＩｎｔｅｒｖｅｔＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂ．Ｖ．から市販）を生長させた。十分な細胞変性効果
が生じた後に細胞上清を回収し、ポリエチレングリコー
ル沈殿によりウイルスを濃縮した（Ｙａｍａｍｏｔｏ，
Ｋ．Ｒ．ら， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０，７３４−７４
４， １９７０）。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．５％ＳＤＳを含
有する緩衝液中で１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ
（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， 米国）で
３７℃で２時間消化することによりＤＮＡをウイルス粒
子から遊離させた。
【００５８】フェノール／クロロホルム１：１混合物で
繰り返し抽出後、核酸を２倍容量のエタノールで沈殿さ
せ、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ７．
５，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解させた。酵素製造業者に
より推奨される条件に従ってウイルスＤＮＡを制限酵素
Ｓａｕ３Ａ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，
米国）で部分的に消化し、反応生成物を分取０．８％
アガロースゲル上で分離した。
【００５９】１０〜１５ｋｂのサイズフラクションのフ
ラグメントを単離し、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化し
たバクテリオファージλＥＭＢＬ４からのＤＮＡと２時
間１５℃で連結した（Ｋａｉｓｅｒ，Ｋ．及びＭｕｒｒ
ａｙ，Ｎ．“ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， 第１巻、第
１章、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８５）。反応生成物
をｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングし（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， 米国）、組換ファージを
大腸菌宿主株ＬＥ３９２にプレート培養した。ＳａｌＩ
で消化したＦＨＶゲノムＤＮＡの分取アガロースゲル電
気泳動により単離した１０〜１５ｋｂ制限フラグメント
から構成される32Ｐ標識ＤＮＡプローブでニトロセルロ
ースレプリカフィルターをスクリーニングすることによ
りλＥＭＢＬ４中のライブラリーを集積し、ウイルスゲ
ノムの比較的大きいＳａｌＩ制限フラグメント中に特異
的に存在する配列を有するインサートを含む組換体を得
た（技術的詳細についてはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，
“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”， 第２章， Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照されたい）。このス
クリーニング手順から得た個々の組換体を増幅し、λイ
ンサートＤＮＡの制限パターンを完全ＦＨＶゲノムの公
知地図（Ｇｒａｉｌ Ａ．ら， Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏ
ｌ．， １１６， ２０９−２２０，１９９１）と比較
した。更に調査するために単離株の１つλＦＨＶ０２を
選択し、このクローンの１０．９ｋｂインサート（図１
参照）を前出のＧｒａｉｌらの地図の単位０．０８〜
０．１７のウイルスゲノムのユニークな長いセグメント
の左端の近傍に配置した。
【００６０】−マーカー遺伝子の挿入。
【００６１】λＦＨＶ０２の５．１ｋｂ ＢａｍＨＩフ
ラグメントをｐＧＥＭ３Ｚにサブクローニングして得た
ｐＦＨＶ０１（図２Ａ参照）は、マーカー遺伝子の組み
込みに適切な位置にユニークなＢｇｌＩＩ制限部位を示
した。挿入に使用した遺伝子は、ｐＣＨ１１０（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， スウェーデン）中
に存在するようなＳＶ４０複製起源の近傍の７２ｂｐ
ＳｐｈＩフラグメントを以下の配列（配列番号３及び
４）： ５’−ＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧ−３’ ３’−ＧＴＡＣＣＣＴＡＧＧＣＡＧＣＴＧ−５’ を有する二重鎖合成オリゴヌクレオチドで置換すること
により、ｐＣＨ１１０から誘導した。
【００６２】ｐＣＨ１００の２つのＳｐｈＩ制限部位の
間にリンカーを挿入すると、どちらの部位のＳｐｈＩの
認識配列も復元されず、いずれもＳＶ４０初期プロモー
ターの上流にＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ部位を生成する。
次いでＢａｍＨＩで消化し、ｐＦＨＶ０１のＢｇｌＩＩ
部位に挿入された４．０ｋｂのβ−ガラクトシダーゼ発
現カセットを生成し、こうしてｐＦＨＶ０４を得た（図
２Ｂ参照）。リン酸カルシウム媒介ＤＮＡ沈殿（Ｇｒａ
ｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖ．ｄ．ＥＢ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ ５２， ４５６−４６７， １９７３）に
よりＣＲＦＫ細胞にウイルスＤＮＡと共にプラスミドｐ
ＦＨＶ０４の直鎖化ＤＮＡを導入した。ｐＦＨＶ０４か
らのＤＮＡ１μｇを最終容量３７６μｌのＨ2Ｏ中でＦ
ＨＶ感染細胞からのＤＮＡ１５μｇと混合し、２×ＨＢ
ＳＰ（１０ｍＭ ＫＣｌ， ２８０ｍＭ ＮａＣｌ，
１２ｍＭグルコース、１．５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4， ５
０ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ７．０）５００μｌに加え
た。１Ｍ ＣａＣｌ2溶液１２４μｌを漸次加え、混合
物を室温で３０分間インキュベートすることにより沈殿
を形成した。培養培地５ｍｌ中にＣＲＦＫ細胞の半集密
的単層を各々収容する２つのφ６ｃｍの皿に沈殿ＤＮＡ
の懸濁液を静かに加えた。５時間後、培地を除去し、１
５％グリセロールを含有するＨＢＳＰ５ｍｌを細胞に重
層した。１〜２分間インキュベーション後、溶液を除去
し、細胞を培地で洗い、皿を培養培地中０．７５％アガ
ロースの上層と共にインキュベートした。３〜４日後、
細胞変性効果が現れ始めたら、最終濃度０．２ｍｇ／ｍ
ｌの基質Ｂｌｕｏｇａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ， Ｍａ
ｒｙｌａｎｄ， 米国）を含有する第２のアガロース上
層を加え、青色のプラークが検出されるまでプレートを
インキュベートした。陽性プラークを肉眼的に釣菌し、
新鮮なＣＲＦＫ細胞を含むフラスコに移し、ウイルスを
増幅した。組換ウイルスの均質なストックが樹立される
までプレート培養手順及びプラーク単離を続けた。最終
調製物からのウイルス材料を使用してサザンブロッティ
ングによりウイルスゲノムを詳細に分析すると共に、動
物ワクチン接種実験を行った。
【００６３】ｐＦＨＶ０１中に存在するようなＢｇｌＩ
Ｉ部位に挿入したβ−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子
を含む組換ＦＨＶは、ＣＲＦＫ細胞上の組織培養物で連
続継代後も安定的であることが判明した。
【００６４】−ＦＨＶゲノムのユニークな長いセグメン
トにおける挿入領域の構造解析。
【００６５】ｐＦＨＶ０１中に存在する５．１ｋｂ Ｂ
ａｍＨＩフラグメントの該当部分でヌクレオチド配列解
析を行った。ｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｗｉｓｃ
ｏｎｓｉｎ， 米国）のＢｇｌＩＩ部位に両方向に同一
フラグメントをサブクローニングし、夫々ｐＦＨＶ０２
及びｐＦＨＶ０３を得た。
【００６６】張り出した５’及び３’末端を生成する適
切な制限酵素でプラスミドＤＮＡを二重消化後、酵素エ
キソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，
Ｇｅｎｅ ２８， ３５１−３５９， １９８４）を使
用して漸進的欠失を導入した。張り出した一重鎖３’末
端の存在により、プラスミドベクターＤＮＡはエキソヌ
クレアーゼＩＩＩにより消化されなかった。反応混合物
のサンプルを３０秒間隔で採取し、前出のＨｅｎｉｋｏ
ｆｆの方法に従って処理し、再環状化したＤＮＡ分子を
生成し、コンピテント大腸菌細胞に形質転換させた。個
々のコロニーのミニ調製物からのプラスミドＤＮＡを、
元の５．１ｋｂフラグメントに導入した欠失のサイズの
制限マッピングにより分析した。Ｔ７ポリメラーゼ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， スウェーデ
ン）を使用する鎖停止反応で二重鎖ＤＮＡ上のヌクレオ
チド配列決定により、漸進的欠失を含む候補群を分析し
た。
【００６７】プラスミドｐＦＨＶ０１，ｐＦＨＶ０２又
はｐＦＨＶ０３の挿入ＤＮＡ上の鎖伸長反応を特異的に
開始させることにより、ヌクレオチド配列内の不完全又
は曖昧な読み取り値の解像度を上げた。配列データをま
とめ、Ｇｅｎｅ−Ｍａｓｔｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｃ
ａｌｉｆｏｒｎｉａ， 米国）又は同等のソフトウェア
を使用して解析した。全データをまとめた結果、マーカ
ー遺伝子の挿入に使用した実際のＢｇｌＩＩ制限部位を
含む配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードする５７９ヌクレオチドオープンリーディン
グフレームからなるＦＨＶゲノムのユニークな長いセグ
メント内の約１．０ｋｂ領域（配列番号１）と、非翻訳
フランキングＤＮＡ配列の約０．４ｋｂとが判明した。
約１．０ｋｂの領域は、感染及び複製に必要な本質的な
ウイルス機能を失わせることなくＦＨＶのゲノムに外来
遺伝子を挿入するために使用することができる。
【００６８】実施例２ ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）のエンベロープタンパ
ク質を発現する組換えＦＨＶの構築 配列番号１に示す配列に基づき、ヌクレオチド配列解析
に関して記載した手順と同様の手順に従い、酵素エキソ
ヌクレアーゼＩＩＩを用いて５.１ｋｂのＢａｍＨＩイ
ンサートの両端をトリミングすることによってｐＦＨＶ
０２から１つのフラグメントを誘導した。その結果、ｐ
ＧＥＭ７Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｗｉｓｃｏｎｓ
ｉｎ、ＵＳＡ）中に０.９ｋｂのインサートを含むｐＦ
ＨＶ２４が得られた。得られたこのｐＦＨＶ２４におい
ては、予めｐＦＨＶ０１中に規定されていた非反復Ｂｇ
ｌＩＩ制限部位が、外来ＤＮＡの取込み及びウイルスゲ
ノムとのｉｎ ｖｉｖｏ組換えを順次行なうことができ
るように正確に位置決めされていた（図３Ａ参照）。Ｆ
ＨＶウイルスのゲノムに挿入された外来遺伝子の発現を
指令する強力なプロモーターをラウス肉腫ウイルス（Ｒ
ＳＶ）のＬＴＲ配列から選択した。
【００６９】プロモーターは、ｐＲＳＶｃａｔに由来の
５８０ｂｐのＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメン
トにマッピングされており（Ｇｏｒｍａｎ、Ｃ.Ｍ.ら、
Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ７９、６
７７７〜６７８１、１９８２）、フラグメントの両側の
二重鎖合成リンカーによってｐＧＥＭ３ＺのＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位とＰｓｔＩ部位との間に挿入された。ベクター
ｐＧＥＭ３ＺのＨｉｎｄＩＩＩ部位とＬＴＲプロモータ
ーを保有するＲＳＶフラグメントのＮｄｅＩ部位との結
合には、一方でＨｉｎｄＩＩＩ他方でＮｄｅＩと適合性
の付着端を含む３０ｂｐのリンカーを用いた。しかしな
がら、結合後に６塩基対の認識配列の外層ヌクレオチド
を計画的に修飾したので双方の制限部位が復元しなかっ
た。これらの２つの部位が除去されたことに加えて、リ
ンカー自体の内部に存在した新しい制限部位（ＢａｍＨ
Ｉ）が対応する位置に生じた。２０ｂｐの第２のリンカ
ーを合成した。このリンカーはＬＴＲフラグメントに由
来のＨｉｎｄＩＩＩ部位をｐＧＥＭ３Ｚに由来のＰｓｔ
Ｉ部位に連結した。この場合には、両端の認識配列は破
壊されず、ｐＧＥＭ３Ｚのポリリンカーに既に存在して
いた部位例えばＰｓｔＩ、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ部位
に適当な非反復認識部位ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩが付加
された。得られたｐＧＥＭ３Ｚの誘導体をｐＶＥＣ０１
と命名した。従ってこの誘導体は、ＬＴＲプロモーター
を含み且つ該プロモーターの直後に外来遺伝子の挿入に
使用できる多数の制限部位を含む６５０ｂｐの制限フラ
グメントを含んでいた。６５０ｂｐのフラグメントの一
端にＢａｍＨＩ制限部位がフランキングしており、この
部位はｐＦＨＶ２４中に存在する非反復ＢｇｌＩＩ部位
にそのまま転移した。これらの２つの制限酵素によって
生じた付着端は適合性であるがＢｇｌＩＩまたはＢａｍ
ＨＩに対する初期認識配列はいずれも復元されない。得
られた構築物の１つをｐＦＨＶ２８と命名し、制限マッ
ピングによってチェックした（図３Ｂ）。このＦＨＶ組
換えベクターの構造は、ＬＴＲプロモーターのすぐ下流
に外来遺伝子が挿入でき、その後のｉｎ ｖｉｖｏ組換
えによって完全発現カセットがＦＨＶゲノムに取込まれ
得る構造である。ＬＴＲの下流の種々の制限部位、特に
酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩに対する制限部位の位置
は、遺伝子の多重挿入もできるように設計されている。
このベクターの第１の例をＦｅＬＶ／サブグループＡに
由来のエンベロープタンパク質をコードする遺伝子から
構成した。このベクターを、ｐＦＧＡ−５（Ｓｔｅｗａ
ｒｔ、Ｍ.Ａ.ら、Ｊ.Ｖｉｒｏｌ.５８、８２５〜８３
４、１９８６）に由来の２.０ｋｂのＰｓｔＩフラグメ
ント上で単離し、ｐＧＥＭ３ＺのＴ７配向のコーディン
グ鎖と共にサブクローニングした。ｐＣＨ１１０に導入
された修飾と同様の合成リンカーを付加することによっ
てベクターのポリリンカー中に存在する非反復ＳｐｈＩ
部位をＢａｍＨＩ部位に置換した（実施例１参照）。
【００７０】２.０ｋｂのＢａｍＨＩフラグメント上で
単離した完全遺伝子をｐＦＨＶ２８のＢｇｌＩＩ部位に
挿入し、ｐＦＨＶ２９を得た。ＬＴＲプロモーターに対
するＦｅＬＶエンベロープ遺伝子の正確な配向を制限分
析によって確認した（図４参照）。β−ガラクトシダー
ゼマーカー遺伝子の挿入に関する実施例１の記載と同様
にして、プラスミドｐＦＨＶ２９の直鎖化した１μｇの
ＤＮＡを１５μｇのウイルスＤＮＡと共にＣＲＦＫ細胞
にコトランスフェクトした。トランスフェクション子孫
を３〜４日後に採取し、系列希釈してマイクロタイター
プレートのＣＲＦＫ細胞に播種した。ｃｐｅの増殖後、
プレートをエタノールで定着させ、精製したＦｅＬＶの
天然型エンベロープタンパク質に対して感作させたウサ
ギ抗体と共にインキュベートした。特異的に結合した抗
体をフルオレセイン標識ヤギ抗ウサギ血清によって検出
し、ＶＵ顕微鏡で観察した。組換えＦＨＶを保有しＦｅ
ＬＶのエンベロープタンパク質を発現するプラークを約
５×１０-4の頻度で検出した。
【００７１】実施例３ ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）に由来のエンベロープ
タンパク質を発現する組換えＦＨＶの構築 ＦＩＶのエンベロープタンパク質をコードする遺伝子
も、ＦＨＶのＵ1の特異的領域に挿入できる遺伝子の有
力な候補であると考えられた。ＦＩＶ−ＵＴ １１３と
呼ばれるオランダのＦＩＶ単離物（Ｖｅｒｓｃｈｏｏ
ｒ、Ｅ.Ｊ.ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９３、４３３〜４
３８、１９９３）のプロウイルスゲノムから遺伝子を誘
導し、２.６ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントとしてサブ
クローニングした後、ＦｅＬＶのエンベロープ遺伝子に
関する上記の手順と同様の手順でｐＦＨＶ２８のＢｇｌ
ＩＩ部位に挿入した。β−ガラクトシダーゼ発現カセッ
トに関する実施例１の記載と同様にして、得られた組換
えプラスミドｐＦＨＶ３７（図５参照）をＦＨＶウイル
スＤＮＡと共にＣＲＦＫ細胞にトランスフェクトした。
ウイルスのトランスフェクション子孫をマイクロタイタ
ープレートのＣＲＦＫ細胞に、ウェルあたり約５０〜１
００ｐｆｕが得られるように播種した。インキュベーシ
ョン後、個々のウェルの上清を別々に保存し、プレート
の残りをエタノールで定着させた。プレートを、ＦＩＶ
感染ネコの血清から成る第１試薬と共にインキュベート
した。エンベロープ特異的抗体をフルオレセイン標識ウ
サギ抗ネコ血清によって検出し、ＵＶ光下で顕微鏡観察
した。陽性フォーカスを含むウェルを採点し、対応する
保存ウイルスサンプルをウェルあたり約１〜５ｐｆｕに
限界希釈して同時に再度播種し、上記と同様にして処理
した。ウイルス原液が蛍光抗体アッセイで検出したエン
ベロープタンパク質の発現に関して５０％以上均質にな
るまでプレーティング手順を繰返した。アガロースオー
バーレイ下の単一プラーク単離によって最終精製を行な
った。この手順で得られた単離物の１つを選択し、ＦＨ
Ｖ菌Ｆ２−１株と命名した。１×１０7ｐｆｕ／ｍｌを
上回る力価を有する増幅した原液をＣＲＦＫ細胞上で調
製し、次の実験まで−８０℃で凍結した。
【００７２】ＬＴＲプロモーターをハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして含むＤＮＡフラグメントを用いたサ
ザンブロット法によってＦ２−１株のウイルスゲノム構
造を分析した。エンベロープ遺伝子が挿入されたゲノム
の領域のＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位の位置は、
予想パターンと一致した。
【００７３】実施例４ 感染動物中のＦＨＶ突然変異体の病原性 実施例１に記載のごとく構築し配列番号１で定義した長
い非反復セグメントの１ｋｂの領域内に存在するＢｇｌ
ＩＩ部位に挿入されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含
む組換えウイルスの１つをＦＨＶ菌０５−４−１−１株
と命名した。このウイルスの病原性及びＦＨＶのビルレ
ント株の抗原投与によって生じた臨床徴候防御能力を動
物実験によって研究し、親株Ｇ２６２０と比較した。
【００７４】特異的病原体を含まない１２週齢のネコに
１×１０5 ＴＣＩＤ50のＦＨＶ−１突然変異体または
親株を、外鼻孔から０.３ｍｌ、口腔いん頭から０.４ｍ
ｌ投与することによって口鼻感染させた。動物のＦＨＶ
−１感染に特異的な臨床徴候を２週間にわたって毎日観
察し、表１に示すような基準に基づいて採点した。ワク
チン接種の６週後に１×１０5 ＴＣＩＤ50のＦＨＶ−
１株ＳＧＥ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ
Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）を
口鼻投与することによってネコに抗原投与し、ＦＨＶ−
１感染の臨床徴候を２週間にわたってモニターした。ワ
クチン接種及び抗原投与後の臨床観察を表２にまとめ
る。０５−４−１−１株でワクチン接種したグループ１
のネコは親株Ｇ２６２０を接種したグループ２の動物に
比較して臨床徴候のスコアレベルが下がっていた。
【００７５】抗原投与後に、グループ１及び２のワクチ
ン接種したネコは、グループ３のワクチン非接種の対照
に比較して臨床スコアが平均で１／１０に減少してい
た。従って突然変異体０５−４−１−１株をネコに口鼻
投与すると、ビルレンスが減少し、しかも抗原投与ＦＨ
Ｖ感染の臨床徴候に対して高レベルの防御を誘発し得る
ことが判明した。
【００７６】
【表１】
【００７７】
【表２】
【００７８】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：１００７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 元の取得源： 生物：ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ−１） 株：Ｇ ２６２０ 直接の取得源： クローン：ｐＦＨＶ０１ 配列の特徴 特徴を表わす記号：ＣＤＳ 存在位置：２５３〜８３４ 配列
【００７９】
【表３】
【００８０】配列番号：２ 配列の長さ：１９３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 配列
【００８１】
【表４】
【００８２】配列番号：３ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：１〜１６ その他の情報：／ラベル＝リンカー １ 配列 ＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧ ＡＣＣＡＴＧ 配列番号：４ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：１〜１６ その他の情報：／ラベル＝リンカー ２ 配列 ＧＴＡＣＣＣＴＡＧＧ ＣＡＧＣＴＧ
【図面の簡単な説明】
【図１】λＦＨＶ０２の１０.９ｋｂのＤＮＡインサー
トの制限地図。ウイルスゲノム中のこのフラグメントの
位置を長い非反復セグメントの左端の近傍にマッピング
した。５.１ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントのサブクロ
ーニングによってｐＦＨＶ０１が得られた。
【図２】Ａ−ｐＧＥＭ３ＺにサブクローニングしたλＦ
ＨＶ０２に由来の５.１ｋｂのＢａｍＨＩ制限フラグメ
ントを含むプラスミドｐＦＨＶ０１の地図。Ｂ−ｐＦＨ
Ｖ０１の非反復ＢｇｌＩＩ制限部位に挿入された４.０
ｋｂのβ−ガラクトシダーゼ発現カセットを含むプラス
ミドｐＦＨＶ０４の地図。
【図３】Ａ−ｐＦＨＶ２４の制限地図。この構築物は、
配列番号１に定義された挿入領域にフランキングする余
剰配列を除去することによってｐＦＨＶ０２から得られ
た。配列番号１に定義された読取枠（ＯＲＦ）の位置を
上部に示す、Ｂ−ｐＦＨＶ２４の非反復ＢｇｌＩＩ部位
に挿入された多重クローニング部位と共にＬＴＲプロモ
ーターを含むプラスミドｐＦＨＢ２８の制限地図。この
ベクターはｉｎ ｖｉｖｏ組換えによって外来遺伝子を
ＦＨＶのゲノムに取込ませることができる。
【図４】ｐＦＨＶ２８に由来のＢｇｌＩＩ部位に挿入さ
れたＦｅＬＶのエンベロープタンパク質をコードする遺
伝子をＬＴＲプロモーターの下流に含むｐＦＨＶ２９の
制限地図。
【図５】ｐＦＨＶ２８に由来のＢｇｌＩＩ部位に挿入さ
れたＦＩＶのエンベロープタンパク質をコードする遺伝
子をＬＴＲプロモーターの下流に含むｐＦＨＶ３７の制
限地図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特表 平４−500007（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．64，Ｎ ｏ．10（1990）ｐ．4930−4938 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．154，Ｎ ｏ．１（1986）ｐ．168−179 Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ. 116，Ｎｏ．１−４（1991）ｐ．209− 220 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号２に示したポリペプチドをコー
    ドする転写解読枠のＤＮＡ配列によって規定された領域
    に変異を有し、該変異は天然に存在するＦＨＶのゲノム
    上の該領域に存在する遺伝情報に関する上述の領域にお
    ける遺伝情報の変化であり、配列番号２に記載のポリペ
    プチドと同様の抗原性若しくは機能的ポリペプチドを産
    生できない、ＦＨＶ変異体。
  2. 【請求項２】 異種核酸配列を含み、この核酸配列は配
    列番号２に示したポリペプチドをコードする転写解読枠
    に導入されていることを特徴とする請求項１に記載のＦ
    ＨＶ変異体。
  3. 【請求項３】 異種核酸配列が転写解読枠のＢｇｌＩＩ
    制限部位に導入されていることを特徴とする請求項２に
    記載のＦＨＶ変異体。
  4. 【請求項４】 配列番号２に示すポリペプチドをコード
    する転写解読枠の少なくとも一部が欠失していることを
    特徴とする請求項１に記載のＦＨＶ変異体。
  5. 【請求項５】 異種核酸配列がポリペプチドをコード
    し、かつ該核酸配列を含む組み換え体ＦＨＶに感染した
    細胞内での該核酸配列の発現を調節するプロモーターの
    制御下に有ることを特徴とする請求項２または３に記載
    のＦＨＶ変異体。
  6. 【請求項６】 異種核酸配列がネコ病原体の抗原をコー
    ドすることを特徴とする請求項５に記載のＦＨＶ変異
    体。
  7. 【請求項７】 抗原がネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不
    全症ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコパルボウイル
    ス、ネココロナウイルス及びネコクラミジアの中から選
    択された病原体に由来することを特徴とする請求項６に
    記載のＦＨＶ変異体。
  8. 【請求項８】 配列番号２に示したポリペプチドをコー
    ドする核酸。
  9. 【請求項９】 プロモーターの制御下に有るＦＨＶにと
    って異種の遺伝子が挿入された請求項８に記載の核酸。
  10. 【請求項１０】 請求項８に記載の核酸を含む組み換え
    体ＤＮＡ分子。
  11. 【請求項１１】 請求項９に記載の核酸を含む組み換え
    体ＤＮＡ分子。
  12. 【請求項１２】 請求項１０または１１に記載の組み換
    え体ＤＮＡ分子でトランスフェクションした宿主細胞。
  13. 【請求項１３】 細胞培養物をＦＨＶゲノムＤＮＡ及び
    請求項１１に記載の組み換え体ＤＮＡ分子でトランスフ
    ェクションすることを特徴とする、請求項１から７のい
    ずれか１項に記載のＦＨＶ変異体を製造する方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１から７のいずれか１項に記載
    のＦＨＶ変異体に感染させた細胞培養物。
  15. 【請求項１５】 請求項１から７のいずれか１項に記載
    のＦＨＶ変異体を含むワクチン。
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