HU219312B - Recombinant feline herpesvirus vaccine - Google Patents

Recombinant feline herpesvirus vaccine Download PDF

Info

Publication number
HU219312B
HU219312B HU9301876A HU9301876A HU219312B HU 219312 B HU219312 B HU 219312B HU 9301876 A HU9301876 A HU 9301876A HU 9301876 A HU9301876 A HU 9301876A HU 219312 B HU219312 B HU 219312B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
fhv
nucleic acid
sequence
acid sequence
mutant
Prior art date
Application number
HU9301876A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT68442A (en
HU9301876D0 (en
Inventor
Paulus Jacobus An Sondermeijer
Martha Jacoba Willemse
Original Assignee
Akzo Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akzo Nv filed Critical Akzo Nv
Publication of HU9301876D0 publication Critical patent/HU9301876D0/hu
Publication of HUT68442A publication Critical patent/HUT68442A/hu
Publication of HU219312B publication Critical patent/HU219312B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16741—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16743—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16761—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/16762—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát macskaherpeszvírus (FHV) mutáns képezi, amely azFHV genomjának inszerciós szakaszába beiktatva egy heterológ génttartalmaz. A találmány kiterjed továbbá az említett FHV mutánsttartalmazó vektorvakcinára, amely egy macskakórokozóból származóheterológ polipeptidet expresszál, és a beoltott gazdaszervezetbenmind az FHV, mind a macskakórokozó ellen megfelelő immunválaszt váltki. ŕ

Description

A találmány tárgyát a macskaherpeszvírus (FHV) genomjában mutációt hordozó FHV mutáns, egy FHV inszerciós szakaszt tartalmazó nukleinsavszekvencia, egy, az inszerciós szakaszból származó DNS-sel határolt heterológ nukleinsavszekvenciát tartalmazó nukleinsavszekvencia, ilyen nukleinsavszekvenciákat tartalmazó rekombináns DNS-molekula, egy FHV mutánssal fertőzött sejttenyészet, valamint az FHV mutánst tartalmazó vakcina képezi.
A macskafélék megbetegedéseinél az egyik fő klinikai problémát a légúti fertőzések jelentik. Ezeknek az eseteknek a legnagyobb részét vagy 1-es típusú macskaherpeszvírus (FHV) vagy macska-calicivírus okozza.
Az FHV a macska vírusos rhinotracheitis (orrlégcső gyulladás) kórokozója macskákban. Kismacskákban az FHV-fertőzés általánossá válhat, és az elhullás az 50%-ot is elérheti. A betegség gyakori, világszerte előfordul, tünetei tüsszögés, elesettség, a szem, valamint az on váladékozása. Az FHV a herpeszvírusok családjának és az alfa-herpeszvírusok alcsaládjának a tagja. A genom körülbelül 126 kilobázispár (kbp) méretű, és egy 99 kbp méretű különösen hosszú (UL) szakaszból, valamint egy körülbelül 8 kbp méretű fordított ismétlődésekkel határolt, körülbelül 9 kbp méretű különösen rövid (Us) szakaszt tartalmazó 27 kbp hosszúságú rövid szakaszból áll [Arch. Virol., 116, 209-220, (1991)].
Az FHV-fertőzés gyakorisága és súlyossága indokolta módosított élő, vagy elölt FHV-t tartalmazó macskavírusos rhinotracheitis vakcinák kifejlesztését, amelyek a betegség előfordulását sikeresen csökkentették.
Az FHV-fertőzésen kívül a macskák különböző egyéb kórokozókkal való fertőzésekre is fogékonyak, ilyenek például a macskaleukémia-vírus (FeLV), macska-calicivírus, macska-immundefíciencia vírus (FIV), macska-coronavírus és macska-Chlamydia.
Jelenleg ezen kórokozó mikroorganizmusok okozta fertőzésekkel szemben általában élő vagy inaktivált vakcinákkal vagy az adott kórokozóból származó alegységekből készült vakcinákkal hozhatunk létre védelmet macskákban.
Az ilyen típusú vakcináknak azonban számos hátrányuk lehet. Gyengített élő vakcinák alkalmazása mindig magában rejti annak a veszélyét, hogy az állatokat nem kellően gyengített kórokozó mikroorganizmussal oltjuk. Ezenkívül a gyengített kórokozók visszaalakulhatnak virulensekké, és az oltott állat megbetegedését okozhatják, valamint a kórokozó más állatokra teqedhet.
Inaktivált vakcinák általában csak alacsony szintű immunitást váltanak ki, és ismételt immunizálást igényelnek. Továbbá az inaktiválást létrehozó kezelés megváltoztathatja a kórokozó neutralizáló ellenanyagok termelődését kiváltó antigéndeterminánsait, így csökkentve a vakcina védő hatását.
Kombinált élő vírus vakcinákkal a probléma ezenkívül az, hogy az antigénkomponensek kölcsönös egymásra hatása következtében egy vagy több összetevő hatása csökken.
A rekombináns vagy természetes eredetű alegységvakcinák szintén számos hátránnyal rendelkeznek. Először is az immunrendszer felé nem replikálódó struktúraként prezentált polipeptidalegység gyakran nem vált ki hosszú távú immunitást, és így egy adjuváns jelenlétét is igényli. Másodszor pedig replikálódó struktúraként való prezentálással sokkal hatékonyabban lehet immunitást létrehozni, mint egy alegységstruktúra prezentálásával.
A jelenleg adagolt élő, gyengített vagy inaktivált FHV vakcinák esetében ezenkívül nem lehet eldönteni, hogy az adott állat egy FHV mezei vírust hordoz vagy vakcinázva volt. Pedig az FHV vakcinával vakcinázott vagy mezei vírussal fertőzött állatok azonosítása fontos abból a célból, hogy megfelelő intézkedéseket hozhassunk a virulens mezei vírus terjedésének csökkentésére.
A találmány tárgyát képezi egy FHV mutáns, amely nem csupán macska vírusos rhinotracheitis ellen, hanem a macskafélék egyéb fertőző megbetegedései ellen is védelmet kiváltó vakcina előállítására használható, és amely elhárítja az élő, gyengített kórokozó vakcinaként való felhasználásával járó bármely lehetséges kockázatot, amely mind a humorális, mind a celluláris immunrendszert hatásosan stimulálja anélkül, hogy kifejezetten szükség volna egy adjuvánsra. A találmány szerinti mutáns multivalens vakcina lehetőségeit nyújtja különböző antigénkomponensek egymással való hátrányos interferenciájának kockázata nélkül.
A találmány további tárgyát képezi egy FHV vakcinavírus előállítása, amely bármely mezei törzstől vagy bármely egyéb FHV vakcinavírustól megkülönböztethető.
A találmány kiteljed egy FHV mutánsra, amely az FHV genomban mutációt hordoz a 2. szekvencia (1. Szekvencialista) szerinti polipeptidet kódoló, nyitott leolvasási keret DNS-szekvenciája és az ezt határoló intergénes szekvenciák által meghatározott szakaszon belül.
Mutáció alatt a fent említett szakasz genetikai információjának megváltoztatását értjük a természetben előforduló FHV genomjának ezen szakasza által hordozott információhoz képest. A mutáció lehet például nukleinsavhelyettesités, deléció, inszertálás vagy inverzió vagy ezek kombinációja, amely olyan FHV mutánst eredményez, amely nem termel a 2. szekvencia szerinti antigén hatású vagy funkcionális polipeptidet.
Az FHV genom maghatározott szakaszában létrehozott mutáció előnyösen deléció vagy inszertálás.
A találmány különösen egy olyan FHV mutánsra terjed ki, amely heterológ nukleinsavszekvenciát tartalmaz, és az említett nukleisavszekvenciát az FHV genomnak a 2. szekvencia szerinti polipeptidet kódoló, nyitott leolvasási keret (ORF) DNS-szekvenciája és az ezt határoló intergénes szekvenciák által meghatározott szakaszába építettük be.
A találmány szerinti FHV mutánst bármely FHV törzsből előállíthatjuk, például a G2620 törzsből (kereskedelemben hozzáférhető: Intervet International Β. V., Hollandia), a C-27 törzsből (ATCC VR-636), az FVRm törzsből (ATCC VR-814), az FVRm vakcinatörzsből (ATCC VR-815) vagy az F2 törzsből.
A „rekombináns FHV mutáns” elnevezés egy olyan genetikailag módosított fertőző vírust jelöl, amely vírus
HU 219 312 Β genomjában egy heterológ nukleinsavszekvenciát, vagyis egy, az FHV-ban a természetben előforduló gén nukleinsavszekvenciájával nem azonos nukleinsavszekvenciával rendelkező DNS-t tartalmaz.
A rekombináns FHV mutánssal fertőzött sejt a heterológ gént egy heterológ polipeptid formájában expresszálhatja.
A „polipeptid” elnevezés aminosavak molekuláris láncára és nem egy meghatározott hosszúságú termékre vonatkozik, és kívánt esetben in vivő vagy in vitro módosítható például glikozilezéssel, amidálással, karboxilezéssel vagy foszforilezéssel; így a polipeptid meghatározásba többek között peptidek, oligopeptidek és proteinek tartoznak.
Egy előnyösen alkalmazható (rekombináns) FHV mutáns előfeltétele az, hogy a mutációt, például az inszertált heterológ nukleinsavszekvenciát a genomiális FHV-szekvencia permisszív pozíciójába vagy szakaszába iktassuk be, vagyis egy olyan pozícióba vagy szakaszba, amely az FHV lényeges, például a fertőzéshez vagy replikációhoz szükséges funkcióinak megszakítása nélkül felhasználható a mutáció beiktatására. Egy heterológ nukleinsavszekvencia inszertálása esetén az ilyen szakaszt inszerciós szakasznak nevezzük.
Mostanáig keveset tudtunk az FHV genomban a gének elhelyezkedéséről. Rota és munkatársai [Virology, 154, 168-179, (1986)], valamint Grail és munkatársai [Arch. Virol. 116, 209-220, (1991)] közölték az FHV genom fizikai térképeit.
Nunberg és munkatársai [J. Virology, 63, 3240-3249, (1989)], valamint Colé és munkatársai [J. Virology, 64,4930-4938, (1990)] azonosították a timidin-kináz (TR) gént és a gént az FHV genom Sall-A restrikciós fragmensén (Rota és munkatársai, lásd fent) lokalizálták. Ezt követően több olyan rekombináns FHV törzset állítottak elő, melyekben FeLV env és gag géneket inszertáltak az FHV TK. génbe.
A találmány szerinti inszerciós szakaszt korábban nem azonosították az FHV genomon belül. Meglepetésünkre kiderült, hogy ebben a szakaszban az FHV alapvető funkcióinak megszakítása nélkül létrehozható mutáció, például heterológ DNS beiktatása.
Még váratlanabb volt az a tény, hogy a fent meghatározott szakaszba beiktatott mutáció lényegesen csökkenti az élő FHV mutáns virulenciáját anélkül, hogy befolyásolná az FHV mutáns védő hatást létrehozó tulajdonságait. Ez a megfigyelés kínálta azt a lehetőséget, hogy a fent említett szakaszban létrehozott delécióval vagy inszertálással gyengített FHV mutánst állítsunk elő, amely mutáns élő formában biztonságosan adagolható a vakcinázandó állatoknak, akár szájon-orron át is.
A találmány szerinti FHV mutáns előállítása céljából létrehozott mutáció beiktatására, például egy heterológ DNS-szekvencia inszertálására felhasznált (inszerciós) szakasz egy 10,9 kb nagyságú restrikciós fragmensen található, amelyet genomiális FHV DNS Sau3A enzimmel való részleges emésztésével kaptunk.
Az említett fragmenst restrikciós enzimes emésztésekkel végzett térképezéssel részletesen vizsgáltuk, és az lényegében megfelel a vírus genom UL szegmentjén belül, a Grail és munkatársai szerinti (lásd fent, 1991) 0,08 és 0,17 térképegység között található szakasznak.
A találmány szerinti (inszerciós) szakasz egy Sáli fragmensen belül található, a 2. szekvencián bemutatott 193 aminosavból álló polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát, valamint attól 5’- és 3’-irányban található határoló intergénes szekvenciákat tartalmaz. Ezek az 5’- és 3’-irányban található határoló intergénes szekvenciák nem képezik egy ORF, vagy proteint kódoló DNS-szekvencia részét, és nem tartalmaznak a vírus replikációját szabályozó szekvenciákat. Az említett határolószekvenciák a legközelebbi nyitott leolvasási keret kezdetéig, vagy végéig terjednek 5’ és 3’ irányban.
Az 5’- és 3’-irányban található határoló intergénes szekvenciák előnyösen körülbelül 252, illetve 173 bp hosszúságúak.
Előnyösen a találmány tárgyát egy (rekombináns) FHV mutáns előállítása képezi, amely mutációt, például heterológ nukleinsavszekvenciát tartalmaz az 1. szekvencia szerinti DNS-szekvencia által meghatározott (inszerciós) szakaszban.
Pontosabban mutációt, például heterológ nukleinsavszekvenciát iktatunk be a 2. szekvencia szerinti aminosavszekvenciával meghatározott 193 aminosav hosszúságú polipeptidet kódoló, még pontosabban az 1. szekvencia szerinti 253-834. nukleotidpozícióknak megfelelő DNS-szekvenciával meghatározott FHV DNS-szekvenciába, ahol az 576. nukleotidpozícióban található egyetlen BglII restrikciós hasítási hely a legelőnyösebb pozíció a heterológ DNS inszertálására.
Érthető, hogy az FHV genom DNS-szekvenciájában az egyes FHV vírusok között természetes variációk létezhetnek. Ezek a variációk eredményezhetnek deléciókat, szubsztitúciókat, inszertálásokat, inverziókat vagy egy, illetve több nukleotid hozzáadását. Ezek az FHV variánsok egy megfelelő, a találmány szerinti ORF-tól különböző ORF-et kódolhatnak. Az ilyen ORF variánsokat kódoló DNS-szekvencia több eljárással lokalizálható, többek között az 1. szekvencia szerinti DNS-szekvenciával végzett hibridizálással vagy az említett ORF-et kódoló analóg szakaszok lokalizálásával a fizikai térkép összehasonlítása révén. A találmány tehát kiterjed bármely FHV törzsből nyerhető (inszerciós) szakaszra.
Lehetőség van továbbá a fenti variációk létrehozására géntechnikai módszerrel, hogy a fent meghatározott (inszerciós) szakasszal rokonságot mutató DNS-szekvenciát kapjunk. Érthetően, egy mutációt tartalmazó (rekombináns) FHV mutáns, például az FHV genomban található (inszerciós) szakaszba inszertált, ezzel rokon DNS-szekvenciával jellemzett heterológ gént tartalmazó mutáns szintén a találmány tárgyát képezi.
Ezenkívül, mivel a találmány által meghatározott (inszerciós) szakasz nem hordoz lényeges funkciókat, az említett szakasz részlegesen vagy teljesen deletálható, ezután a deléció helyére kívánság szerint heterológ gén inszertálható.
Összefoglalva, a fent lényegében meghatározott (inszerciós) szakasz az FHV genomon belül annak a szakasznak a lokalizációját jellemzi, amely - kívánt
HU 219 312 Β esetben ebből a szakaszból DNS-szekvenciák deletálását követően - felhasználható heterológ nukleinsavszekvencia beiktatására, vagy egyéb mutációk, különösen deletálás létrehozására az említett szakaszban.
Az FHV genomba a találmány szerint beiktatandó heterológ nukleinsavszekvencia származhat bármely forrásból, például lehet vírus, prokarióta, eukarióta, vagy szintetikus eredetű. Az említett nukleinsavszekvencia származhat egy kórokozóból, előnyösen egy macskakórokozóból, mely szekvencia az FHV genomba való inszertálást követően alkalmas betegség elleni immunitás kiváltására.
Előnyösen macskaleukémia-vírus, macska-immundeficienciavírus, macska-calicivírus, macskaparvovírus, macska-coronavírus és macska-Chlamydia eredetű polipeptideket kódoló nukleinsavszekvenciák inszertálhatók az FHV genom (inszerciós) szakaszába.
Ezenkívül gyógyszerészeti vagy diagnosztikus felhasználásra alkalmazható polipeptideket, különösen immunmodulátorokat, például limfokineket, interferonokat vagy citokineket kódoló nukleinsavszekvenciák iktathatok be az említett (inszerciós) szakaszba.
Egy rekombináns FHV mutánsban a heterológ nukleinsavszekvencia expresszálásának alapvető követelménye az, hogy a heterológ nukleinsavszekvencia egy megfelelő promoterhez legyen működőképes formában kötve. A gyakorlatban járatos személy számára nyilvánvaló, hogy a választott promoter lehet a rekombináns FHV-vel fertőzött sejtekben géntranszkripció irányítására képes bármely eukarióta, prokarióta vagy vírus promoter, például a retrovírus hosszú terminális ismétlődés promoterei [Gorman és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6777-6781 (1982)], az SV40 promoter [Mulligan és Berg, Science, 209,1422-1427 (1980)] vagy a cytomegalovírus közvetlen korai promotere [Schaffner és munkatársai, Cell, 41, 521-530 (1985)].
Amennyiben egy találmány szerinti deléciós mutánst kívánunk előállítani, a fent ismertetett vírusgenomból a szakasz részleges, vagy teljes deletálását in vivő homológ rekombinációs technikával érhetjük el.
Először az 1. szekvencia szerinti különösen hosszú szekvencia egy részét, valamint mindkét végén legalább 100 nukleotidból álló határolószekvenciát tartalmazó DNS-fragmenst szubklónozhatunk egy megfelelő plazmidba.
Az ismertetett szakaszban létrehozandó deletálás ebben a plazmidban egy vagy több olyan restrikciós enzimmel végzett emésztéssel történhet, melyek hasítási helyei pontosan a nyitott leolvasási keretben vagy annak közelében találhatók. A maradék plazmidmolekulát újra körkörössé alakítva olyan származékot kapunk, amelyből az újonnan azonosított szakaszban levő kódolószekvencia legalább egy része hiányzik. Más eljárás szerint, egy, a nyitott leolvasási keret szekvenciáján belül található restrikciós hasítási helyről kiindulva egy vagy két irányban progresszív deletálást végezhetünk. Erre a célra használhatók a Ball vagy endonukleáz III enzimek. Az ismételten cirkularizált plazmidmolekulákkal E. coli-sejteket transzformáltunk, és különálló telepeket vizsgáltunk restrikciós enzimekkel végzett térképezéssel, hogy megállapíthassuk az adott szakaszban létrehozott deletálás nagyságát. A deletálás pontos helye szekvenciavizsgálattal határozható meg. A meghatározott deletálást tartalmazó plazmidot FHV vírus-DNSsel együtt macska eredetű sejttenyészetbe kotranszfektálhatjuk. Az in vivő rekombinációt követően a deletálás megjelenik a vírusgenom ismertetett szakaszán belül a megfelelő pozícióban. A vírusutódok között a rekombinánsokat például olyan 15-20 bázishosszúságú szintetikus oligomerek segítségével azonosíthatjuk, amelyek specifikusan a deletálásnál kapott végek összekapcsolásánál keletkezett nukleinsavszekvenciával hibridizálnak.
Az in vivő homológ rekombinációs technika alkalmazható a heterológ nukleinsavszekvencia beiktatására az FHV genomba. Ehhez először egy rekombináns DNS-molekulát kell előállítanunk az FHV genomiális DNS-sel való rekombináció céljára. Egy ilyen molekula származhat bármely alkalmas plazmidból, kozmidból vagy fágból, legelőnyösebb a plazmidok alkalmazása, és tartalmaz egy heterológ nukleinsavszekvenciát, kívánt esetben működőképes formában egy promoterhez kötve. Az említett nukleinsavszekvenciát és promotert a rekombináns DNS-molekulába szubklónozott, találmány szerinti inszerciósszakasz-szekvenciákat tartalmazó genomiális FHV DNS-fragmensbe iktattuk be. A heterológ nukleinsavszekvenciát határoló inszerciósszakasz-szekvenciáknak megfelelő hosszúságúnak például 50-3000 bázispár méretűnek kell lenniük, hogy az in vivő homológ rekombináció a vírus FHV genommal végbemehessen. Kívánság szerint előállíthatunk olyan konstrukciót, amely ugyanazon vagy különböző kórokozókból származó két vagy több különböző heterológ nukleinsavszekvenciát tartalmaz, és az említett szekvenciákat a találmány szerinti FHV inszerciósszakasz-szekvenciák határolják. Egy ilyen rekombináns DNS-molekula felhasználható két vagy több különböző antigenitású polipeptidet expresszáló rekombináns FHV előállítására multivalens vakcina céljára.
Másodszor, sejtek, például macskavesesejtek (CRFK) vagy macska-embrionálissejtek transzfektálhatók FHV DNS-sel a megfelelő FHV-szekvenciákkal határolt heterológ nukleinsavszekvenciát tartalmazó rekombináns DNS-molekula jelenlétében, miáltal rekombináció jön létre a rekombináns DNS-molekulában található inszerciósszakasz-szekvenciák és az FHV genomban található inszerciósszakasz-szekvenciák között.
Rekombináció úgy is létrehozható, hogy a fertőzött sejteket plazmidszekvenciákat nem tartalmazó, a megfelelő határoló inszerciósszakasz-szekvenciákkal határolt heterológ nukleinsavszekvenciát tartalmazó nukleinsavszekvenciával transzfektáljuk. Ezután rekombináns vírusutódokat állítunk elő sejttenyészetben, és azokat genotípusuk vagy fenotípusuk alapján válogathatjuk ki, például hibridizációval, a heterológ nukleinsavszekvenciával együtt beiktatott gén által kódolt enzim aktivitásának meghatározásával, vagy a rekombináns FHV által expresszált antigén hatású heterológ polipeptid immunológiai módszerekkel való meghatározásával. Rekombi4
HU 219 312 Β náns vírusok kiválogathatok továbbá vegyületekkel, például neomycinnel gentamycinnel vagy mycophenolsavval szemben mutatott rezisztenciájuk alapján. A kiválogatott rekombináns FHV nagy mennyiségben tenyészthető sejttenyészetekben, azután abból a rekombináns FHV-tartalmú anyag vagy az említett FHV által expresszált heterológ polipeptidek összegyűjthetők.
A találmány szerinti élő FHV mutáns, és különösen egy adott kórokozó egy vagy több különböző heterológ polipeptidjét expresszáló, élő, rekombináns FHV felhasználható állatok, különösen házi és nem házi macskák, valamint kutyafajok vakcinázására. Egy ilyen élő vektorvakcinával való vakcinázást követően előnyösen a rekombináns FHV replikálódik a beoltott gazdaszervezetben, és az FHV polipeptidekkel együtt a heterológ polipeptid in vivő expresszálódik. A beoltott gazdaszervezetben az expresszált polipeptidek immunválaszt váltanak ki az FHV és a meghatározott kórokozó ellen. Abban az esetben, ha az adott kórokozóból származó heterológ polipeptid képes protektiv immunválasz kiváltására, a találmány szerinti rekombináns FHV mutánssal beoltott állat immunis lesz az adott kórokozóval, valamint FHV-val való későbbi fertőzésekkel szemben is. Tehát a találmány szerinti FHV genom inszerciós szakaszába beiktatott heterológ nukleinsavszekvencia in vivő folyamatosan expresszálódhat, erős, biztonságos és hosszú távú immunitást nyújtva egy kórokozóval szemben.
Az egy vagy több különböző heterológ polipeptidet tartalmazó és expresszáló, találmány szerinti rekombináns FHV mutáns monovalens vagy multivalens vakcinaként alkalmazható.
Élő vakcina előállítása céljára a találmány szerinti rekombináns FHV mutánst macska eredetű sejttenyészetben szaporíthatjuk. Az ily módon tenyésztett vírusokat ezután a sejttenyésztő folyadék és/vagy a sejtek összegyűjtésével nyerhetjük ki. Az élő vakcinát szuszpenzió formájában vagy liofilezett formában állíthatjuk elő.
A rekombináns FHV hatékony immunogén mennyiségén kívül a vakcina tartalmazhat továbbá egy, a gyógyszergyártásban szokásos hordozóanyagot vagy hígítóanyagot.
A találmány szerint alkalmazható, a gyógyszergyártásban elfogadott hordozóanyagok vagy hígítóanyagok közé tartoznak stabilizátorok, például SPGA, szénhidrátok (például szorbit, mannit, keményítő, szacharóz, glükóz, dextrán), proteinek, például albumin vagy kazein, proteintartalmú anyagok, például marhaszérum vagy lefölözött tej, valamint pufferek (például foszfátpuffer).
Kívánság szerint egy vagy több adjuváns hatású vegyület adható a vakcinához. Szokásos adjuvánsok például az alumínium-hidroxid, -foszfát vagy -oxid, olajemulziók (például Bayol F(R) vagy Marcol 52<R)), szaponinok vagy E-vitamin-oldat.
Az adagolandó hatásos mennyiség kortól, testtömegtől és az adagolás módjától függően változik. Az adagolandó mennyiség például körülbelül 104·5 plakkképző egység/állat lehet.
A találmány szerinti FHV mutáns inaktivált vakcina előállítására is felhasználható.
A találmány szerinti FHV mutáns többek között orron át, bőrbe oltva, bőr alá oltva vagy izomba oltva adagolható az állatoknak.
A találmány tárgyát képezi továbbá alegységvakcinák, a találmány szerinti FHV mutáns által expresszált heterológ polipeptidet tartalmazó, gyógyszerészeti és diagnosztikus készítmények előállítása. Ezt az említett rekombináns FHV-vel fertőzött sejteknek a heterológ polipeptid expresszálását elősegítő körülmények között végzett tenyésztésével érhetjük el. A heterológ polipeptidet ezután a felhasználás céljától függően szokásos eljárásokkal egy meghatározott fokig tisztíthatjuk, és immunizáló, gyógyászati vagy diagnosztikai aktivitással rendelkező készítménnyé alakíthatjuk tovább.
A meghatározott kórokozó elleni fent ismertetett aktív immunizálást egészséges állatoknál alkalmazzuk védelem létrehozása céljából. Magától értetődő, hogy egy adott kórokozóval már fertőződött állatok az adott kórokozóból származó, egy antigén hatású polipeptidet kódoló, heterológ gént tartalmazó, találmány szerinti rekombináns FHV mutánssal termelt ellenanyagokat tartalmazó antiszérummal kezelhetők. A találmány szerinti rekombináns FHV elleni antiszérum állatok, például macskák immunizálásával állítható elő az említett rekombináns FHV megfelelő immunválasz kiváltására elegendő hatásos mennyiségének adagolásával. Az állatokat ezután elvéreztetjük, és antiszérumot készíthetünk.
A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük.
1. példa
Egy új inszerciós szakasz jellemzése az FHV genom különlegesen hosszú szekvenciájában - FHV DNS előállítása és génkönyvtár létesítése
EMBL4 lambda vektorban
Az FHV-1 vakcinatörzset (kereskedelmileg macska-rhinotracheitisvírusként hozzáférhető, G2620 törzs, Intervet International Β. V.; Hollandia) Crandell-Rees macskavese (CRFK) sejtekben [Crandell, R. A. és munkatársai, In Vitro, 9, 176-185, (1973)] tenyésztettük 2,0 g/1 triptózzal, 2,5 g/1 laktalbumin hidrolizátummal és 5% boíjúszérummal kiegészített Glasgow-féle módosított minimális tápfolyadékban. Miután a citopatogén hatás teljesen kialakult, a tenyészet felülúszóját összegyűjtöttük, és polietilénglikollal végzett kicsapással a vírusokat koncentráltuk [Yamamoto, K. R. és munkatársai, Virology, 40, 734-744, (1970)]. A vírusrészecskékből a DNS-t 20 mmol/1 Tris-HCl-t (pH 7,5), 10 mmol/1 EDTA-t, és 0,5% SDS-t tartalmazó pufferben 100 pg/ml proteináz K-val (Promega, Wisconsin, USA) 37 °C-on, 2 óráig végzett emésztéssel szabadítottuk fel. Fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével végzett ismételt extrakciókat követően a nukleinsavakat kétszeres térfogatnyi mennyiségű etanollal kicsaptuk, és TE-pufferben (10 mmol/1 Tris-HCl, pH 7,5; 1 mmol/1 EDTA) oldottuk. A vírus eredetű DNS-t az enzimet gyártó cég utasításai szerinti feltételek mellett Sau3A restrikciós enzimmel részlegesen emésztettük, és a reakció termékeit 0,8%-os preparatív agarózgélen elválasztottuk.
HU 219 312 Β
A 10-15 kb közti nagyságú fragmenseket izoláltuk és BamHI, valamint Sáli enzimekkel emésztett EMBL4 lamda bakteriofág DNS-sel ligáltuk 2 órán át 15 °C-on [Kaiser K., és Murray N., „DNA Cloning”, 1. kötet, 1. fejezet, IRL Press, (1985)]. A reakció termékeit in vitro „becsomagoltuk” (Promega, Wisconsin, USA), és a rekombináns fágokkal LE392 E. coli gazdasejteket fertőztünk. Az EMBL4 lambda génkönyvtárat meghatározottan a vírusgenom viszonylag nagy méretű Sáli restrikciós fragmensein található szekvenciákat hordozó inszerteket tartalmazó rekombinánsokra nézve dúsítottuk oly módon, hogy Sáli enzimmel emésztett FHV genomiális DNS-ből preparatív agarózgél-elektroforézissel izolált 32P-vel jelölt 10-15 kb restrikciós fragmensekből álló DNS-próbával nitrocellulóz szűrőlenyomatokat vizsgáltunk [a technikai részleteket lásd: Sambrook J. és munkatársai, „Molecular Cloning: A laboratory manual”, 2. fejezet, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]. Az ebből a vizsgálatból származó egyes rekombinánsokat sokszorosítottuk, és a lambda inszert DNS restrikciós térképét összehasonlítottuk a teljes FHV genom közölt térképével [Grail A. és munkatársai, Arch. Virol., 116, 209-220 (1991)]. Az izolátumok egyikét, amelyet lambda-FHV02-nek neveztünk, választottuk további vizsgálataink céljára, és a kiónban található 10,9 kb nagyságú inszertet (lásd 1. ábra) a vírusgenom különösen hosszú régiójának bal vége közelében, a Grail szerinti 0,08-0,17 térképegységek között (lásd fent) lokalizáltuk.
- Egy markergén inszertálása
A pFHVOl plazmidban (lásd 2A. ábra), amelyet úgy kaptunk, hogy a lambda-FHV02 5,1 kb méretű BamHI fragmensét a pGEM3Z plazmidba klónoztuk, találtunk egy markergén beiktatására alkalmas, egyedi BglII restrikciós hasítási helyet. Az inszertált gént a pCH 110-ből nyertük (Pharmacia, Uppsala, Svédország) oly módon, hogy a pCH 110-ben található SV40 replikációs origó közelében található 72 bázispárból álló SphI-fragmenst a következő szekvenciával rendelkező dupla szálú szintetikus oligonukleotiddal (3. és 4. szekvencia) cseréltük fel:
’-GGATCCGTCGACCATG-3 ’ '-GTACCCTAGGCAGCTG-5 ’
A pCHllO két Sphl restrikciós hasítási helye közé inszertált linker egyik végén sem áll helyre Sphl enzim által felismerhető szekvencia, és az SV40 korai promoterétől 5’-irányban egy BamHI, valamint egy Sáli hasítási hely jön létre. Ezután BamHI enzimmel végzett emésztéssel egy 4,0 kb nagyságú β-galaktozidáz expressziós kazettát kaptunk, amelyet pFHVOl plazmid BglII hasítási helyére inszertáltunk, így kaptuk a pFHV04 plazmidot (lásd 2B. ábra). Linearizált pFHV04 DNS-t és vírus-DNS-t juttattunk be CRFK-sejtekbe kalcium-foszfát közvetítette DNS-precipitációs módszerrel [Graham F. L., és v. d. Eb A. J., Virology, 52,456-467, (1973)]. 1 pg pFHV04 DNS-t összekevertünk 15 pg FHV-val fertőzött sejtekből nyert DNS-sel 376 pl végtérfogatú vízben, majd ezt 2 x HBSP-pufferrel (10 mmol/1 KC1, 280 mmol/1 NaCl, 12 mmol/1 glükóz, 1,5 mmol/1 Na2HPO4, 50 mmol/1 HEPES, pH 7,0)
500 pl-re egészítettük ki. 124 pl 1 mol/1 koncentrációjú CaCl2-oldat fokozatos hozzáadásával, és a keverék 30 percig szobahőmérsékleten való inkubálásával precipitátumot kaptunk. A kicsapott DNS-szuszpenziót óvatosan két 6 cm átmérőjű edényben található félig összefolyó egyrétegű CRFK-sejttenyészethez adtuk 5 ml tápfolyadékban. 5 óra elteltével a tápfolyadékot eltávolítottuk, és a sejteket 5 ml 15% glicerint tartalmazó HBSPpufferrel fedtük. 1-2 perces inkubálás után az oldatot eltávolítottuk, a sejteket tápfolyadékkal mostuk, és az edényeket 0,75% agaróztartalmú tápfolyadékkal felülrétegezve inkubáltuk. 3-4 nap elteltével, amikor a citopatogén hatás kezdett kialakulni, egy második, 0,2 mg/ml koncentrációban Bluogal-szubsztrátot (Gibco-BRL, Maryland, USA) tartalmazó agarózréteget adtunk a sejtekhez, és a lemezeket kék plakkok megjelenéséig inkubáltuk. Pozitív plakkokat válogattunk makroszkóposán, és azokat friss CRFK-sejteket tartalmazó palackokba vittük át a vírusok szaporítása céljából. A beoltást és plakkizolálást addig ismételtük, amíg homogén rekombináns vírustörzset nem kaptunk. A végső készítményből nyert vírusokat használtuk a vírusgenom részletes vizsgálatára Southem-lenyomattechnikával, és állatokon végzett vakcinázási kísérletek céljára. Az FHV01 BglII hasítási helyére inszertált béta-galaktozidáz markergént tartalmazó rekombináns FHV stabilnak bizonyult a CRFK-sejttenyészeteken végzett sorozatos passzálások során.
- Az FHV genom különösen hosszú régiójában található inszerciós szakasz strukturális vizsgálata
A nukleotidszekvencia-vizsgálatot a pFHVOl plazmidban található 5,1 kb nagyságú BamHI-fragmens megfelelő részein végeztük el. Ebből a célból ugyanazt a fragmenst mindkét irányban pSP72 plazmid (Promega, Wisconsin, USA) BglII hasítási helyére szubklónoztuk, így kaptuk a pFHV02, illetve a pFHV03 plazmidokat.
Miután a plazmid-DNS-t a megfelelő, 5’- és 3’- túlérő végeket eredményező restrikciós enzimekkel emésztettük, fokozatosan növekvő méretű deletálásokat végeztünk exonukleáz III enzimmel [Heinkoff S., Gene, 28, 351-359, (1984)]. A túlérő egyszálú 3’-vég jelenléte meggátolta, hogy az exonukleáz III lebontsa a plazmid vektor-DNS-t. A reakcióelegyből 30 másodpercenként mintákat vettünk, és azokat Heinkoff szerint kezeltük (lásd fent), hogy újból körkörös DNS-molekulákat kapjunk, amelyeket kompetens E. coli-sejtekbe transzformáltunk. Különálló telepekből származó mini plazmid készítményeket vizsgáltunk restrikciós enzimekkel végzett térképezéssel az eredeti 5,1 kb nagyságú fragmensben létrehozott deletálás méretére nézve. Fokozatosan növekvő nagyságú deletálásokat tartalmazó jelöltek sorozatát vizsgáltuk nukleotidszekvenálással T7-polimeráz (Pharmacia, Uppsala, Svédország) felhasználásával dupla szálú DNS-en végzett láncterminációs reakcióban. A nukleotidszekvencián belül a nem olvasható, vagy kétértelműen olvasható bázisokat a pFHVOl, a pFHV02, vagy a pFHV03 plazmidok inszertált DNSén a láncmeghosszabbítási reakció megfelelő helyen való megindítása segítségével határoztuk meg. A szekvenciaadatokat összegyűjtöttük, és Gene-Master
HU 219 312 Β (Bio-Rad, Califomia, USA), vagy ennek megfelelő softver segítségével értékeltük. Az adatok értékelése az FHV genom különösen hosszú régióján belül egy 1,0 kb nagyságú szakasz (1. szekvencia) azonosítását eredményezte, amely a markergén beiktatására használt aktuális BglII hasítási helyet tartalmazó, a 2. szekvencia szerinti polipeptidet kódoló 579 nukleotidból álló, nyitott olvasási keretet, valamint egy 0,4 kb nagyságú nem transzlálódó határoló DNS-szekvenciát tartalmazott. A körülbelül 1,0 kb nagyságú szakasz a fertőzéshez és replikációhoz szükséges lényeges vírusfunkciók megbénítása nélkül felhasználható idegen gének beiktatására az FHV genomjába.
2. példa
A macskaleukémia-vírus (FeLV) burokproteint expresszáló rekombináns FHV előállítása
Az 1. szekvencia adatai alapján előállítottuk a pFHV02 plazmid egy fragmensét tartalmazó származékát oly módon, hogy exonukleáz III enzim felhasználásával az 5,1 kb nagyságú BamHI inszert mindkét végét megrövidítettük, és a nukleotidszekvencia-vizsgálatnál ismertetetthez hasonló eljárást követtünk. így kaptuk a pFHV24 plazmidot, amely a pGEM7Z(f+) plazmidba (Promega, Wisconsin, USA) beépítve egy 0,9 kb nagyságú inszertet tartalmazott, és amelyben a pFHVOl esetében korábban meghatározott egyedi BglII hasítási hely egy idegen DNS beépítése, és azt követően a vírus-genommal való in vivő rekombináció szempontjából (lásd 3A. ábra) megfelelő helyzetben található. Az FHV vírusgenomjába való inszertálásukat követően az idegen gének expresszálását irányítani képes erős promotert választottunk a Rous-szarkómavírus (RSV) LTR szekvenciájából.
A promoter a pRSVcat [Gorman C. M. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6777-6781, (1982)] 580 bázispárból álló Ndel/HindlII restrikciós fragmensén volt található, és ezt a fragmens mindkét végén dupla szálú szintetikus linkerek alkalmazásával pGEM3Z plazmid HindllI és PstI hasítási helyei közé inszertáltuk. A pGEM3Z vektor HindllI hasítási helye, valamint az LTR promotert hordozó RSV-fargmens Ndel hasítási helye közti kapcsolatot egy, az egyik végén HindllI, a másik végén Ndel hasítási helyekkel összeillő ragadós végeket tartalmazó, 30 bázispárból álló linker segítségével teremtettük meg. A ligálást követően azonban a hat bázispárból álló felismerőszekvencia külső nukleotidjaiban létrehozott szándékos módosításnak köszönhetően egyik hasítási hely sem áll helyre. A fenti két hely eltávolításán felül egy magában a linkerben található új hasítási helyet (BamHI) hoztunk létre a megfelelő helyzetben. Egy második, 20 bázispárból álló linkért szintetizáltunk, amely az LTR HindllI hasítási helyét kötötte össze a pGEM3Z PstI hasítási helyével, ezúttal anélkül, hogy egyik végfelismerő szekvenciáit megszüntettük volna, és a pGEM3Z polilinker régiójában már jelen levő restrikciós felismerő helyekhez, például PstI, Xbal és BamHI helyhez, a további előnyös BglII, valamint Xhol egyedi restrikciós felismerő helyeket adtuk hozzá. A kapott pGEM3Z-származék, amelyet pVECO 1-nek neveztünk, tehát tartalmazza az LTR promoterszekvenciát hordozó 650 bázispárból álló restrikciós fragmenst, amelyet közvetlenül idegen gének beiktatására alkalmas többszörös restrikciós felismerő helyek kövemek. A 650 bázispárból álló fragmenst mindkét végén BamHI hasítási helyek határolják, és mint ilyent a pFHV24 plazmidban található egyedi BglII hasítási helyre vittük át. Az ezen két enzim által létrehozott ragadós végek összeillenek, de a ligálást követően sem az eredeti BglII, sem a BamHI felismerőszekvencia nem áll helyre. A kapott konstrukciók egyikét pFHV28-nak neveztük, és restrikciós térképezéssel ellenőriztük (lásd 3B. ábra). Ennek az FHV rekombinációs vektornak a szerkezete lehetővé teszi idegen gének inszertálását az LTR promotertől közvetlenül 3’-irányban, és ezt követően in vivő rekombináció révén a teljes expressziós kazetta beépítését az FHV genomba. Az LTR promotertől 3’-irányban található különböző restrikciós enzimek hasítási helyeinek, különösen a BglII és Xhol enzimek hasítási helyeinek pozícióját úgy terveztük, hogy több gén inszertálása is elképzelhető legyen. Ezt a vektort először az FeLV/A alcsoportjának burokproteinjét kódoló gén esetében alkalmaztuk, ezt pFGA-5-ből izoláltuk egy 2,0 kb nagyságú Pstl-fragmensen [Stewart M. A. és munkatársai, J. Virol., 58, 825-834, (1986)] és kódolószállal T7-orientációba szubklónoztuk a pGEM3Z plazmidba. A vektor polilinker szakaszában található egyedi Sphl hasítási helyet egy szintetikus linker hozzáadásával BamHI hasítási hellyel helyettesítettük, a pCHllO plazmidban létrehozott módosításhoz hasonló eljárással (lásd 1. példa). A most már egy 2,0 kb nagyságú BamHI-fragmensen izolálható teljes gént a pFHV28 BglII hasítási helyére inszertáltuk, és a kapott plazmidot pFHV29-nek neveztük. Az FeLV burokgén megfelelő orientációját az LTR promoterhez képest restrikciós enzimtérképezéssel igazoltuk (lásd 4. ábra). 1 pg linearizált pFHV29 plazmid-DNS-t kotranszfektáltunk CRFK-sejtekbe 15 pg vírus-DNS-el az 1. példában a béta-galaktozidáz markergén inszertálásánál ismertetettek szerint. A transzfektálásból származó utód vírusokat 3-4 nap elteltével összegyűjtöttük, és azok sorozathígításaival 96 rekeszü mikrolemezeken CRFK-sejteket oltottunk be. Miután a citopatogén hatás kialakult, a lemezeket etanollal fixáltuk, és az FeLV tisztított natív burokproteinje ellen nyúlban termelt ellenanyagokkal inkubáltuk. A fajlagosan megkötött ellenanyagokat fluoreszceinnel jelölt, kecskében termelt antinyúlszérummal határoztuk meg, és UV-mikroszkóp alatt szemmel vizsgáltuk. Rekombináns FHV-t tartalmazó és az FeLV burokproteinjét expresszáló plakkok körülbelül 5x10 4 gyakorisággal fordultak elő.
3. példa
A macska-immunhiányvírus (FIV) burokproteinjét expresszáló rekombináns FHV előállítása A FIV burokproteinjét kódoló gén szintén fontos jelöltje volt az FHV-ból származó U[ meghatározott régiójába inszertálandó géneknek. A gén egy FIV-UT 113 elnevezésű holland FIV-izolátum provírusgenomjából származott [Verschoor E. J. és munkatársai,
HU 219 312 Β
Virology, 193, 433-438 (1993)], és egy 2,6 kb nagyságú BamHI-fragmensként szubklónoztuk, mielőtt azt a pFHV28 BglII hasítási helyére inszertáltuk volna a FeLV burokprotein génje esetében fent ismertetett eljáráshoz hasonló módon. A kapott pFHV37 elnevezésű rekombináns plazmidot (lásd 5. ábra) FHV vírus-DNSsel együtt CRFK-sejtekbe transzfektáltuk az 1. példában a béta-galaktozidáz expressziós kazetta esetében ismertetettek szerint. A transzfektálásból származó vírusutódokkal 96 rekeszű mikrolemezen CRFK-sejteket oltottunk be úgy, hogy egy rekeszbe körülbelül 50-100 plakkképzó egység kerüljön. Az inkubálást követően a felülúszót mindegyik rekeszből külön tároltuk, és a visszamaradt lemezeket etanollal fixáltuk. A lemezeket az első reagenssel inkubáltuk, amely FIV-vei fertőzött macskákból származó szérumból állt. A burokspecifikus ellenanyagokat nyúlban termelt, fluoreszceinnel jelölt, antimacskaszérummal határoztuk meg, és UV fény alatt mikroszkóposán szemmel vizsgáltuk. A pozitív jeleket tartalmazó rekeszeket megjelöltük, és a párhuzamosan tárolt megfelelő vírusminták rekeszenként körülbelül 1-5 plakk-képző egységet tartalmazó határhígításaival újból sejteket fertőztünk, és azokat a fentiekhez hasonló módon kezeltük. A kioltást addig ismételtük, amíg a vírustörzs immunfluoreszcens vizsgálattal több mint 50%ban homogénnek tűnt a burokprotein expressziójára nézve. A végső tisztítást agaróz felülrétegezéssel kapott különálló plakk izolálásával végeztük. Kiválasztottuk az ezzel az eljárással kapott egyik izolátumot, és azt FHV F2-1 törzsnek neveztük. CRFK-sejteken milliliterenként több mint 1 χ 107 plakk-képző egységet tartalmazó amplifikált törzstenyészetet készítettünk, és azt a további kísérletig -80 °C-on fagyasztva tároltuk.
Az F2-1 törzsvírusgenom szerkezetét Southem-lenyomattechnikával vizsgáltuk, a hibridizációban az LTR promotert tartalmazó DNS-fragmenst használva próbaként. A BglII és az EcoRI hasítási helyek pozíciója a genom azon régiójában, ahová a burokgént inszertáltuk megfelelt a várt mintának.
4. példa
Az FHV mutáns patogenitása fertőzött állatokban
Az 1. példában fent ismertetett és az 1. szekvencia szerinti különösen hosszú régió 1 kb nagyságú szakaszában található BglII hasítási helyre inszertált bétagalaktozidáz gént tartalmazó rekombináns vírusok egyikét FHV 05-4-1-1 törzsnek neveztük. Ennek a vírusnak a patogenitását, és egy virulens FHV törzzsel való fertőzéssel kiváltott klinikai tünetek ellen létrehozott védőképességét állatkísérletben vizsgáltuk, és azt összehasonlítottuk a szülői G2620 törzzsel.
Specifikus kórokozóktól mentes 12 hetes macskákat szájon, illetve orron át körülbelül 1 χ 105 TCID50 mennyiségű FHV-1 mutánssal, illetve a szülői törzzsel fertőztünk oly módon, hogy az orrba 0,3 ml-t, és a garatba 0,4 ml-t adagoltunk. Az állatokat egy kéthetes időszakon át naponta megfigyeltük az FHV-fertőzésre jellemző klinikai tünetek megjelenésére nézve, és pontoztuk az 1. táblázatban felsorolt ismérvek alapján. A macskákat hat héttel a vakcinázást követően szájon, illetve orron át 1 χ 104 5 TCID5o mennyiségű SGE FHV-1 törzzsel (National Veterinary Service Laboratory, USA) fertőztük, és azokat kéthetes időszakon át az FHV-1 fertőzésre jellemző klinikai tünetek megjelenésére nézve megfigyeltük. A vakcinázást és a ráfertőzést követően klinikai megfigyeléseinket a 2. táblázatban összegeztük. Az első csoportba tartozó macskák, amelyeket szájon, illetve orron át a 05-4-1-1 törzzsel vakcináztunk, alacsonyabb pontszámot értek el a klinikai tünetek értékelésénél, mint a szülői G2620 törzzsel fertőzöttek. A ráfertőzés után az 1. és 2. csoportba tartozó vakcinázott macskáknál a klinikai pontszámok átlagosan 10-szeres csökkenését tapasztaltuk a 3. csoportba tartozó nem vakcinázott kontrollokhoz képest. Ana a következtetésre jutottunk tehát, hogy a 05-4-1-1 mutáns törzs csökkent virulenciával rendelkezik macskákban szájon-orron át való fertőzésnél, de magas szintű védelmet képes létrehozni egy FHV ráfertőzés klinikai tünetei ellen.
1. táblázat
Klinikai tünet Súlyosság Napi pontszám
Láz >39,6-39,9 1
40,0-40,4 2
40,5-40,9 3
>41,0 4
Tüsszögés ritka 1
gyakori 2
rohamokban jelentkező 3
Köhögés ritka 1
gyakori 2
Légzés ŰRT zaj 1
szörcsögő légzés 1
szájlégzés 2
Nyáladzás 2
Kötőhártya-gyulla- dás enyhe 1/szem
mérsékelt 2/szem
súlyos 3/szem
Szemváladékozás súlyos 1/szem
nyákos-gennyes 2/szem
Orrváladékozás súlyos 1/orrlyuk
nyákos-gennyes 2/orrlyuk
Fekélyesedés orr 2
orr/vérzéssel 3
száj 2
száj/vérzéssel 3
Szájüregi pír 1
Étvágytalanság 1
Levertség 1
HU 219 312 Β
2. táblázat
A klinikai tünetek pontszámai
vakcinázás után ráfertőzés után
Csoport Vakcina Az állat kódja egyedi átlag egyedi átlag
pontszám pontszám
4OL 2 2
4OM 0 7
1 05-4-11 4OP 0 0,5 10 7,3
4OR 0 10
4OV 1 1
4OW 8 7
2 G2620 4OX 5 7,0 6 5,5
H18 14 8
H14 - 77
H12 - 85
3 semmi Hll - - 69 79,7
B39 - 88
Az ábrák rövid ismertetése
1. ábra:
A lambda-FHV02 10,9 kb nagyságú inszertjének restrikciós térképe. Ennek a fragmensnek a vírusgenomon belüli pozícióját a különösen hosszú régió bal vége közelében határoztuk meg. Az 5,1 kb nagyságú 35 BamHI fragmens szubklónozásával kaptuk a pFHVOl plazmidot.
2. ábra:
A) A lambda-FHV02-ból a pGEM3Z plazmidba szubklónozott 5,1 kb nagyságú restrikciós fragmenst 40 tartalmazó pFHVOl plazmid térképe.
B) A pFHVOl egyedi BglII hasítási helyére inszertált 4,0 kb nagyságú béta-galaktozidáz expressziós kazettát tar tartalmazó pFHV04 plazmid térképe.
3. ábra: 45
A) A pFHV24 restrikciós térképe. Ezt a konstrukciót a pFHV02-ből állítottuk elő az 1. szekvencia szerinti inszerciós szakaszt határoló felesleges szekvenciák eltávolításával. Az 1. szekvencia szerinti nyitott olvasási keret (ORF) pozícióját az ábra tetején jelöltük. 50
B) A pFHV28 plazmid restrikciós térképe, amely a pFHV24 egyedi BglII hasítási helyére inszertált LTR promotert és többszörös klónozási helyeket tartalmaz.
Ez a vektor lehetővé teszi in vivő rekombináció révén idegen gének beépítését az FHV genomjába. 55
4. ábra:
A pFHV29 restrikciós térképe, amely az FeLV burokproteinjét kódoló gént tartalmazza az LTR promotertől 3’-irányban a pFHV28 BglII hasítási helyére inszertálva. 60
5. ábra:
A pFHV37 restrikciós térképe, amely a FIV burokproteinjét kódoló gént tartalmazza az LTR promotertől 3’-irányban a pFHV28 BglII hasítási helyére inszertálva.
SZEKVENCIALISTA (1) Általános információ:
(i) Bejelentő:
(A) Név: AkzoN.V.
(B) Utca: Velperweg76 (C) Város: Anthem (E) Ország: Hollandia (F) Irányi tószám: 6824 BM (G) Telefon: 04120-66379 (H) Telefax: 04120-50592 (I) Telex: 37503 alpha ni (ii) Bejelentés címe: Macskaherpeszvírus-rekombináns vakcina (iii) Szekvenciák száma: 4 (iv) Komputerrel olvasható forma:
(A) Hordozó típusa:
(B) Komputer:
(C) Operátorrendszer:
(D) Softver:
(2) Információk az 1. szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossz: 1007 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: kettős (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (genomiális)
HU 219 312 Β (vi) Eredeti forrás: (ix) Tulajdonság:
(A) Szervezet: Macskaherpeszvírus (FHV-1) (A) Név/kulcs: CDS (B) Törzs: G2620 (B) Elhelyezkedés: 253... 834 (vii) Közvetlen forrás: (xi) Szekvencia leírása: 1. szekvencia:
(B)Klón: pFHVOl 5
TAACTCTTAT AGTTCGTATA AATTACTTAT CATAACCGTG TTTCAGCGGT TATATTTTTA 60
TAACAGTTAA TTGTTTACTA ATAGTTTACA AAGTCCATCG TTTATAAAAA ACAAGCCCAG 120
TGGTATTATA ATCATTCGTA TGGATATAAA CCGACTCCAA TCCGTGATCT TTGGTAACCC 180
GCGACGTAAT TACTCTCACA CATTTTAACT AGTCTACGAT CACCCAGATA TAATAAAAAG 240
ATTCGCGTGG AC ATG CAA GGT ATG AGG TCT ACG TCA CAG CCG TTG GTC 288
Met Gin Gly Met Arg Ser Thr Ser Gin Pro Leu Val
10
GAG ATA CCA Glu Ile Pro CTG Leu GTA Val GAT Asp ATG GAA CCA Pro CAG CCA TCT ATA CAC TCC AAC Ser Asn 336
Met Glu 20 Gin Pro Ser Ile 25 His
15
GAG CCT AAC CCA CCG AAT AAA ATG TTG ACG ACA GCT ATT TCA TCG CGT 384
Glu Pro Asn Pro Pro Asn Lys Met Leu Thr Thr Alá Ile Ser Ser Arg
30 35 40
AGG AGT GGA ATT TTT TTA TTT TCT CTG GGT ATG TTT TTT TTC GGA GTT 432
Arg Ser Gly Ile Phe Leu Phe Ser Leu Gly Met Phe Phe Phe Gly Val
45 50 55 60
ATC CTA ACA GCT ACT ATT ATA GTA TGT ACA TTC ATA TTT ACA ATA CCA 480
Ile Leu Thr Alá Thr Ile Ile Val Cys Thr Phe Ile Phe Thr Ile Pro
65 70 75
GTG GAT ATG CTC CAG ATG CCA CGC TGC CCT GAG GAA ACG GTG GGT ATC 528
Val Asp Met Leu Gin Met Pro Arg Cys Pro Glu Glu Thr Val Gly Ile
80 85 90
AAA AAC TGT TGT ATC CGA CCG ATT AGA CGC CAT GTT AAA TCA CAC CAA 576
Lys Asn Cys Cys Ile Arg Pro Ile Arg Arg His Val Lys Ser HÍS Gin
95 100 105
GAT CTA GTT GCC ACA TGT GCC GAA TAC ATG GAA CAA CCC GCC ACC GCA 624
Asp Leu Val Alá Thr Cys Alá Glu Tyr Met Glu Gin Pro Alá Thr Alá
110 115 120
TCT GCT GTT GGA GCT CTT ATA CCA TTA TTG GAC ATC TTC AAT GGA GAT 672
Ser Alá Val Gly Alá Leu Ile Pro Leu Leu Asp Ile Phe Asn Gly Asp
125 130 135 140
GGG ATA TCT ACA AAC GAC TCT CTT TAC GAT TGT ATT CTC TCT GAT GAA 720
Gly Ile Ser Thr Asn Asp Ser Leu Tyr Asp Cys Ile Leu Ser Asp Glu
145 150 155
AAA AAA TCG TGT AAT ACA TCA ATG GCC GTA TGT CAA TCA ACA TAT CTT 768
Lys Lys Ser Cys Asn Thr Ser Met Alá Val Cys Gin Ser Thr Tyr Leu
160 165 170
HU 219 312 Β
CCA AAT CCC CTA AGT GAC TTT ATT ATG CGC GTT AGG CAG ATA TTT TCT 816
Pro Asn Pro Leu Ser Asp Phe Ile Méh Arg Val Arg Gin Ile Phe Ser
175 180 185
GGA ATC CTA AAT CAT TAATCCATTT ACTAAATAAA TAAACAATAC CGTTTAGGTA 871
Gly Ile Leu Asn His
190
ATTAAACATG ATTCTAGTGT TTATTGTCGT ATGTACGGGC GATGGTTGGA TAACAACTCG 931 ACAATGATCA ATTATATTGA TTAACCTTGT AATAAATTCG TCGGATTATT GGATATATCG 991 AGATGATATC ACATTA 1007 (2) Információk a 2. szekvenciához: (i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossz: 193 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: protein (xi) Szekvencia leírása: 2. szekvencia:
Met 1 Gin Gly Met Arg 5 Ser Thr Ser Gin Pro 10 Leu Val Glu Ile Pro 15 Leu
Val Asp Met Glu 20 Pro Gin Pro Ser Ile 25 His Ser Asn Glu Pro 30 Asn Pro
Pro Asn Lys 35 Met Leu Thr Thr Alá 40 Ile Ser Ser Arg Arg 45 Ser Gly Ile
Phe Leu 50 Phe Ser Leu Gly Met 55 Phe Phe Phe Gly Val 60 Ile Leu Thr Alá
Thr 65 Ile Ile Val Cys Thr 70 Phe Ile Phe Thr Ile 75 Pro Val Asp Met Leu 80
Gin Met Pro Arg Cys 85 Pro Glu Glu Thr Val 90 Gly Ile Lys Asn Cys 95 Cys
Ile Arg Pro Ile 100 Arg Arg His Val Lys 105 Ser His Gin Asp Leu 110 Val Alá
Thr Cys Alá 115 Glu Tyr Met Glu Gin 120 Pro Alá Thr Alá Ser 125 Alá Val Gly
Alá Leu 130 Ile Pro Leu Leu Asp 135 Ile Phe Asn Gly Asp 140 Gly Ile Ser Thr
Asn 145 Asp Ser Leu Tyr Asp 150 Cys Ile Leu Ser Asp 155 Glu Lys Lys Ser Cys 160
Asn Thr Ser Met Alá 165 Val Cys Gin Ser Thr 170 Tyr Leu Pro Asn Pro 175 Leu
Ser Asp Phe Ile Met Arg Val Arg Gin Ile Phe Ser Gly Ile Leu Asn
180 185 190
His
HU 219 312 Β (2) Információk a 3. szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossz: 16 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: egyszeres (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (genomiális) (ix) Tulajdonság:
(A) Név/kulcs: (B) Elhelyezkedés: 1...16 (D) Egyéb információ: /jelölés=linker_l (xi) Szekvencia leírása: 3. szekvencia: GGATCCGTCG ACCATG 16 (2) Információk a 4. szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossz: 16 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: egyszeres (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (genomiális) (ix) Tulajdonság:
(A) Név/kulcs: (B) Elhelyezkedés: 1...16 (D) Egyéb információ: /jelölés=linker_2 (xi) Szekvencia leírása: 4. szekvencia: GTACCCTAGG CAGCTG 16

Claims (16)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. FHV mutáns, azzal jellemezve, hogy az FHV genomban a 2. szekvencia szerinti antigén hatású vagy funkcionális polipeptidet nem termelő mutációt tartalmaz a 2. szekvencia szerinti polipeptidet vagy ennek módosulatát kódoló nyitott olvasási keret szekvenciája és az ezt határoló intergénes szekvenciák alkotta DNSszakaszon belül.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti FHV mutáns, azzal jellemezve, hogy egy heterológ nukleinsavszekvenciát tartalmaz, az említett nukleinsavszekvenciát az FHV genomjának a 2. szekvencia szerinti polipeptidet kódoló nyitott olvasási keret DNS-szekvenciája és az ezt határoló intergénes szekvenciák alkotta szakasz által meghatározott inszerciós szakaszába inszertálva.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti FHV mutáns, azzal jellemezve, hogy az inszerciós szakasz az 1. szekvencia szerinti DNS-szekvenciával rendelkezik.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti FHV mutáns, azzal jellemezve, hogy a heterológ nukleinsavszekvenciát a 2. szekvencia szerinti polipeptidet kódoló nyitott olvasási keret DNS-szekvenciája által meghatározott inszerciós szakaszba beiktatva tartalmazza.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti FHV mutáns, azzal jellemezve, hogy a heterológ nukleinsavszekvenciát a nyitott olvasási keret BglII restrikciós felismerő helyére beiktatva tartalmazza.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti FHV mutáns, azzal jellemezve, hogy az inszerciós szakaszon belül az FHV DNS-szekvenciájának legalább egy része törölve van.
  7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti FHV mutáns, azzal jellemezve, hogy a heterológ nukleinsavszekvencia egy polipeptidet kódol, és az említett rekombináns FHV-vel fertőzött sejtben az említett nukleinsavszekvencia expresszióját szabályozó promoter irányítása alatt áll.
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti FHV mutáns, azzal jellemezve, hogy a heterológ nukleinsavszekvencia egy macskakórokozó antigénjét kódolja.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti FHV mutáns, azzal jellemezve, hogy antigénként macskaleukémia-vírus, macska-immunhiányvírus, macska-calicivírus, macskaparvovírus, macska-coronavírus vagy macska-Chlamydia eredetű antigént tartalmaz.
  10. 10. Nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy az FHV genomjának a 2. szekvencia szerinti polipeptidet vagy annak módosulatát kódoló nyitott olvasási keret DNS-szekvenciája által meghatározott régióját és a határoló intergénes szekvenciákat tartalmazza.
  11. 11. Nukleinsavszekvencia, azzal jellemezve, hogy egy promoter irányítása alatt álló, FHV-hez képest heterológ gént tartalmaz, amelyet az FHV genomjának a 2. szekvencia szerinti polipeptidet kódoló nyitott olvasási keret DNS-szekvenciája és az ezt határoló intergénes szekvenciák alkotta szakasz által meghatározott inszerciós szakaszból származó DNS-szekvenciák határolnak.
  12. 12. Rekombináns DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy egy, a 10. vagy 11. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmaz.
  13. 13. Gazdasejt, azzal jellemezve, hogy egy, a 12. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekulával van transzfektálva.
  14. 14. Eljárás az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti FHV mutáns előállítására, azzal jellemezve, hogy egy sejttenyészetet FHV genomiális DNS-sel és egy olyan rekombináns DNS-molekulával transzfektálunk, amely egy, all. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmaz.
  15. 15. Sejttenyészet, azzal jellemezve, hogy egy, az 1-9. igénypontok szerinti FHV mutánssal van fertőzve.
  16. 16. Vakcina, azzal jellemezve, hogy egy, az 1-9. igénypontok szerinti FHV mutánst tartalmaz.
HU9301876A 1992-06-26 1993-06-25 Recombinant feline herpesvirus vaccine HU219312B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP92201898 1992-06-26

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9301876D0 HU9301876D0 (en) 1993-10-28
HUT68442A HUT68442A (en) 1995-06-28
HU219312B true HU219312B (en) 2001-03-28

Family

ID=8210722

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9301876A HU219312B (en) 1992-06-26 1993-06-25 Recombinant feline herpesvirus vaccine

Country Status (12)

Country Link
US (2) US5652119A (hu)
EP (1) EP0576092B1 (hu)
JP (1) JP3529146B2 (hu)
AT (1) ATE226257T1 (hu)
AU (1) AU660093B2 (hu)
CA (1) CA2099069C (hu)
DE (1) DE69332393T2 (hu)
DK (1) DK0576092T3 (hu)
ES (1) ES2188589T3 (hu)
HU (1) HU219312B (hu)
NZ (1) NZ247971A (hu)
PT (1) PT576092E (hu)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5833993A (en) * 1994-04-29 1998-11-10 Pharmacia & Upjohn Company Feline immunodeficiency virus vaccine
US6300118B1 (en) 1995-06-07 2001-10-09 American Home Products Corporation Plasmids comprising a genetically altered feline immunodeficiency virus genome
US5820869A (en) * 1995-06-07 1998-10-13 American Home Products Corporation Recombinant raccoon pox viruses and their use as an effective vaccine against feline immunodeficiency virus infection
FR2741806B1 (fr) * 1995-11-30 1998-02-20 Rhone Merieux Vaccin vivant recombinant a base d'herpesvirus felin de type 1, notamment contre la peritonite infectieuse feline
US6410311B1 (en) * 1997-05-09 2002-06-25 Schering-Plough Veterinary Corporation Recombinant feline herpesvirus comprising a foreign DNA inserted into a region corresponding to a 3.0 kb EcoRI-SalI fragment of a feline herpesvirus genome
US7279168B2 (en) 1998-05-01 2007-10-09 Texas A & M University System Recombinant virus expressing foreign DNA encoding feline CD86 and uses thereof
AU761755B2 (en) * 1998-05-01 2003-06-12 Schering-Plough Ltd Recombinant virus expressing foreign DNA encoding feline CD80, feline CTLA-4 or feline CD86 and uses thereof
JP2002112770A (ja) * 2000-10-05 2002-04-16 Kyoritsu Seiyaku Kk 新規組換えネコヘルペスウイルス１型およびこれを用いた多価ワクチン
WO2009051823A2 (en) * 2007-10-18 2009-04-23 Michigan State University Bacterial artificial chromosome containing feline herpes virus type 1 genome and uses thereof
CN104044104B (zh) * 2013-03-12 2016-02-10 南京德朔实业有限公司 通孔式动力棘轮扳手

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4877737A (en) * 1985-09-06 1989-10-31 Prutech Research And Development Partnership Attenuated pseudorabies virus which has a deletion in at least a portion of a repeat sequence and vaccine containing same
WO1987004463A1 (en) * 1986-01-27 1987-07-30 Syntro Corporation Attenuated herpesviruses, herpesviruses which include foreign dna encoding an amino acid sequence and vaccine containing same
WO1990001547A1 (en) * 1988-08-08 1990-02-22 The Upjohn Company Methods for isolating herpes virus thymidine kinase-encoding dna

Also Published As

Publication number Publication date
ATE226257T1 (de) 2002-11-15
JPH0670761A (ja) 1994-03-15
JP3529146B2 (ja) 2004-05-24
US5652119A (en) 1997-07-29
HUT68442A (en) 1995-06-28
US5783192A (en) 1998-07-21
DE69332393T2 (de) 2003-06-18
AU4149693A (en) 1994-01-06
ES2188589T3 (es) 2003-07-01
PT576092E (pt) 2003-02-28
AU660093B2 (en) 1995-06-08
CA2099069C (en) 2007-08-21
DK0576092T3 (da) 2003-02-17
EP0576092A1 (en) 1993-12-29
HU9301876D0 (en) 1993-10-28
CA2099069A1 (en) 1993-12-27
DE69332393D1 (de) 2002-11-21
NZ247971A (en) 1995-05-26
EP0576092B1 (en) 2002-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU633663B2 (en) Recombinant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof
KR100746524B1 (ko) 재조합 돼지 아데노바이러스 벡터
US6387376B1 (en) Recombinant vaccine containing feline herpes virus type 1 particularly for treating feline infectious peritonitis
JPH10506782A (ja) 組換え型シチメンチョウヘルペスウイルス、及びその使用
EP0652287B1 (en) Poxviral vectors and their use as a vaccine against feline infectious peritonitis virus disease
EP0510773B1 (en) Canine coronavirus subunit vaccine
EP0576092B1 (en) Recombinant Feline herpesvirus vaccine
EP0606452B1 (en) Vector vaccines of recombinant feline herpesvirus
US6241989B1 (en) Recombinant multivalent viral vaccine
WO1994000586A2 (fr) Mutants et vaccins du virus de la rhinotracheite infectieuse bovine
JP3710838B2 (ja) ウマヘルペスウイルス感染からウマを防御するためのワクチン
EP0668355B1 (en) Vaccine for the protection of horses against equine herpesvirus infection
US7087234B1 (en) Recombinant multivalent viral vaccine
GB2282601A (en) Coronavirus vaccines
JP3428666B2 (ja) 組換えマレック病ウイルスおよびその製法
JPH09267A (ja) チミジンキナーゼ遺伝子に変異を有する組換えネコヘルペスウイルス１型及びそれを含むワクチン
US5874280A (en) Vector vaccines of bovine herpesvirus I
JPH07255488A (ja) 組換えマレック病ウイルスおよびその作出法
JPH099979A (ja) 組み換え体、多価組み換え体、及びその作製方法

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: INTERVET INTERNATIONAL B.V., NL

Free format text: FORMER OWNER(S): AKZO N.V., NL

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees