KR100796799B1 - 고양이의 ｃｄ80, 고양이의 ｃｔｌａ-4 또는 고양이의ｃｄ86을 코딩하는 외래 ｄｎａ를 발현시키는 재 조합바이러스 및 이들의 용도 - Google Patents

고양이의 ｃｄ80, 고양이의 ｃｔｌａ-4 또는 고양이의ｃｄ86을 코딩하는 외래 ｄｎａ를 발현시키는 재 조합바이러스 및 이들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이러스성 게놈의 비필수적 영역내에 최소한 하나 이상의 외래 핵산이 각각 삽입된 재조합 바이러스에 있어서, 상기 외래 핵산은 (a) 고양이의 CD28 단백질이나 그의 한 면역원부분; 고양이의 CD80 단백질이나 그의 한 면역원부분; 고양이의 CD86 단백질이나 그의 한 면역원부분; 또는, 고양이의 CTLA-4 단백질이나 그의 한 면역원부분으로 구성된 그룹중에서 선택된 단백질을 코딩시키는 핵산이며, 또한 (b) 상기 재조합 바이러스가 적절한 숙주에 감염되었을 때 해당 단백질을 발현할 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 하나의 병원체로부터 유래된 면역원을 코딩하는 외래 핵산으로 구성된 재조합 바이러스에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 고양이의 체내에서 면역반응을 증강시킬 수 있는 재조합 바이러스에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 고양이의 체내에서 면역반응을 억제시킬 수 있는 재조합 바이러스에 관한 것이다.

Description

고양이의 ＣＤ80, 고양이의 ＣＴＬＡ-4 또는 고양이의 ＣＤ86을 코딩하는 외래 ＤＮＡ를 발현시키는 재 조합 바이러스 및 이들의 용도{RECOMBINANT VIRUS EXPRESSING FOREIGN DNA ENCODING FELINE CD80, FELINE CTLA-4 OR FELINE CD86 AND USES THEREOF}
인터페론-Υ 와 이의 용도
본 출원은 1998년 5월 1일 출원한 미국특허출원 제09/071,711호를 우선권으로 수반하고 있으며, 그 우선권 출원의 내용은 참고로 본 출원에 합해져 보다 구체화되어 있다. 또한, 본 출원내에는 여러 가지의 공지문헌이 서열목록 앞 명세서 말미에 덧붙여 인용되어 있으며, 이와 같이 본 출원에 참고로 공지문헌을 개시함으로써 본 발명과 관련된 기술의 상태를 자세히 알 수 있다.
숙주내에서 질병에 대응하여 T세포의 활성과 증식을 자극하는 것은 두가지의 상호반응, 즉 MHC 클라스 I 분자내에 면역원 펩티드를 가지고 있는 T세포 수용체의 인식 및 T세포상에서 CD80/CD86 같은 부속 리간드와 이들의 수용체(receptor) CD28 및/또는 CTLA-4와의 상호작용에 기인한다고 알려지고 있다. 상기 두가지 경로에서 적절한 상호작용이 이루어지는 경우 CD4+ 및 CD8+ T세포의 활성과 증식을 유도하게 되어 Th1 및 Th2 형태인 면역조절인자인 사이토카인의 양이 증가하게 된다. T세포에 대하여 적절한 공동자극이 가해지지 않는 경우 면역성 무감작현상(anergic state)에 의해 T세포가 증식하지 않으므로 사이토카인이 분비되지 않게 된다. 지난 수년동안 상기 두가지 분자는 T세포, 즉 CD28 및 그 공동자극수용체, CD80/CD86의 반응에 있어 주요 조절인자로서 부상하고 있다. CD28은 T세포의 주요 공동자극수용체이며 CD80/CD86과 상호작용하는 경우 상기 단백질은 T세포의 증시과 사이토카인의 합성을 증진시켜서 T세포의 괴사를 방지하게 된다. CD28의 상동체인 CTLA-4(일명 CD152)는 상기 공동자극반응에 중요한 역할을 한다. 아직까지 분명히 밝혀지지는 않았으나 CTLA-4는 T세포의 공동자극반응을 억제한다고 알려지고 있다. 상기 공동자극반응에서 CD28, CTLA-4 및 이들의 리간드 CD80/CD86와의 상호작용이야 말로 숙주내에 면역반응을 유도하고 억제시키는데 중요하다(Linsley 등, 1991a; 1993a).
최근까지 고양이의 면역결핍증 및 고양이의 감염성 복막염을 효과적으로 예방하는 백신이 등장하지 않고 있다. 현재 고양이의 백혈병 바이러스 백신이 시판중에 있으나 그 효과는 의심스러우며 어떤 경우에는 각종 질병을 야기시킬 수 있다. 실험실내 고양이의 감염성 복막염 백신의 경구 예방효과가 없으며 항체량이 증가함에 따라 동물이 조기 사망하는 예도 보고되어 있다. 따라서, 기존의 백신제제의 효과를 개선시키는 약제가 아직 개발되지 않는 상태에서 고양이의 관련질환을 예방할 수 있는 제제 및 조성물이 개발이 시급한 실정이다. 또한, 질병에 대한 항체의 양을 증가시키지 않고 세포매개성 반응을 유도하는 백신 및 제재의 개발이 관련분야 에서 요구되고 있다. 또한, 새끼 고양이에 대한 백신화는 모체의 항체를 극복하는데 어려움을 겪고 있다. 현재 상기 문제점을 극복할 수 있는 안전하고 유효한 제재의 개발이 시급한 실정에 있다.
이에 본 발명에서는 고양이의 CD28, 고양이의 CTLA-4 및 이들의 리간드인 고양이의 공동자극분자 CD80/CD86의 발현을 조작함으로써 상기 물질의 증강, 억제 또는 재유도를 통하여 T세포 반응을 조절하는 동시에 특정한 고양이의 병원체나 고양이의 관련 질환에 대하여 바람직한 면역반응을 나타날 수 있도록 하는데 있다. 특히, 공동자극분자는 감염성질환에 대한 백신화, 고양이의 감염성 질환 및 신종양, 퇴행성질환, 자가면역 및 면역결핍질환을 치료하는데 유용하다.
본 발명은 상기한 바와 같이 시판 중에 있는 고양이의 백신 제재의 효과 및 유효성에 대한 단점을 극복하는데 성공하였다.
발명의 요약
이에 본 발명은 상기한 문제점등을 해결하기 위하여 안출한 것으로서, 본 발명의 첫 번째 목적은 바이러스성 게놈의 비필수적 영역내에 최소한 하나 이상의 외래 핵산이 각각 삽입된 재조합 바이러스에 있어서, 상기 외래 핵산은 (a) 고양이의 CD28 단백질이나 그의 한 면역원부분; 고양이의 CD80 단백질이나 그의 한 면역원부분; 고양이의 CD86 단백질이나 그의 한 면역원부분; 또는, 고양이의 CTLA-4 단백질 이나 그의 한 면역원부분으로 구성된 그룹 중에서 선택된 단백질을 코딩하는 핵산이며, 또한 (b) 상기 재조합 바이러스가 적절한 숙주에 감염되었을 때 해당 단백질을 발현할 수 있는 것을 특징으로 하는 재 조합 바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 하나의 병원체로부터 유래된 면역원을 코딩하는 외래 핵산으로 구성된 재 조합 바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 세 번째 목적은 고양이의 체내에서 면역반응을 증강시킬 수 있는 재 조합 바이러스를 제공하는 것이다..
본 발명의 네 번째 목적은 고양이의 체내에서 면역반응을 억제시킬 수 있는 재 조합 바이러스를 제공하는 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 바이러스성 게놈의 비필수적 영역내에 최소한 하나 이상의 외래 핵산이 각각 삽입된 재 조합 바이러스에 있어서, 상기 외래 핵산은 (a) 고양이의 CD28 단백질이나 그의 한 면역원부분; 고양이의 CD80 단백질이나 그의 한 면역원부분; 고양이의 CD86 단백질이나 그의 한 면역원부분; 또는, 고양이의 CTLA-4 단백질이나 그의 한 면역원부분으로 구성된 그룹 중에서 선택된 단백질을 코딩하는 핵산이며, 또한 (b) 상기 재 조합 바이러스가 적절한 숙주에 감염되었을 때 해당 단백질을 발현할 수 있는 재 조합 바이러스를 특징으로 한다.
본 발명은 적어도 둘 이상의 외래 핵산이 각각 바이러스성 게놈의 비필수적 영역내에 삽입된 재 조합 바이러스를 하나의 구현 예로 한다.
본 발명은 적어도 셋 이상의 외래 핵산이 각각 바이러스성 게놈의 비필수적 영역내에 삽입된 재 조합 바이러스를 또 다른 구현 예로 한다.
본 발명은 적어도 넷 이상의 외래 핵산이 각각 바이러스성 게놈의 비필수적 영역내에 삽입된 재 조합 바이러스를 또 다른 구현 예로 한다.
본 발명은 상기 재조합 바이러스는 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스, 돈두 바이러스(swinepox virus), 또는 고양이의 헤르페스 바이러스를 또 다른 구현 예로 한다.
본 발명은 상기 재 조합 바이러스는 한가지 이상의 외래 핵산을 함유하고 있으며 이들은 각각 동일한 비필수적 영역내에 삽입된 것을 또 다른 구현예로 한다. 또한, 본 발명은 한가지 이상의 외래 핵산이 모두 동일한 비필수적 영역내에 삽입되지 않은 것을 또 다른 구현 예로 한다.
본 발명은 하나의 외래 핵산이 병원체에서 유래된 면역원을 코딩하는 것을 또 다른 구현 예로 한다. 또한, 본 발명의 상기 재 조합 바이러스는 고양이의 병원체, 광견병 바이러스 병원체, 클라미디아 병원체, 톡소파스모시스 곤디(Taxopasmosis gondii) 병원체, 디로필라리아 이미티스(Dirofilaria immitis) 병원체, 벼룩 병원체, 또는 박테리아성 병원체를 코딩하는 것을 또 다른 구현예로 한다.
본 발명의 재조합 바이러스는 고양이의 면역결핍 바이러스(FIV), 고양이의 백혈병 바이러스(FeLV), 고양이의 감염성 복막염 바이러스(FIP), 고양이의 판루코페니아(panleukopenia) 바이러스, 고양이의 칼리시바이러스(calicivirus), 고양이 의 제3형 레오바이러스(reovirus), 고양이의 로타바이러스(rotavirus), 고양이의 코로나바이러스(coronavirus), 고양이의 싱키셜(syncytial) 바이러스, 고양이의 육종 바이러스 (sarcoma virus), 고양이의 헤르페스 바이러스, 고양이의 보르나병 바이러스(Borna disease virus), 또는 고양이의 기생충을 코딩하는 것을 또 다른 구현 예로 한다.
본 발명의 재 조합 바이러스에 있어서 최소한 하나 이상의 외래 핵산이 해당 외래 핵산을 발현시키는 프로모터로서 포함하는 것을 또 다른 구현 예로 한다.
본 발명의 재 조합 바이러스에 있어서 최소한 하나 이상의 외래 핵산의 발현은 해당 바이러스에 대한 프로모터 내부유전자(endogene)에 의해 조절되는 것을 또 다른 구현 예로 한다.
본 발명의 재 조합 바이러스에 있어서 탐지 가능한 마커를 코딩하는 외래핵산을 더 포함하는 것을 또 다른 구현 예로 한다. 또한, 본 발명의 상기 재 조합 바이러스에 있어서 상기 탐지 가능한 표지는 대장균 β-갈락토시다제인 것을 또 다른 구현 예로 한다.
또한, 본 발명은 고양이의 병원체에서 유래된 상기 면역원은 FIV gag 프로테아제, FIV 피막 단백질, FeLV gag 프로테아제, 또는 FeLV 피막 단백질인 것을 특징으로 하는 재 조합 바이러스를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 하나의 외래 확산이 고양이의 면역결핍 바이러스이나 그 한 부분을 코딩하는 재 조합 바이러스를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 하나의 외래 확산이 고양이의 백혈병 바이러스이나 그 한 부분을 코딩하는 재조합 바이러스를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 하나의 외래 핵산이 고양이의 IL12, GM-CSF, p35 또는 p40을 코딩하는 재조합 바이러스를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 효과적인 면역량을 포함하는 백신과 적절한 운반자(carrier)를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 비 필수적 영역을 함유하는 재 조합 바이러스는 고양이의 헤르페스 바이러스이며 그 비 필수적 영역은 당 단백질 G 유전자인 재 조합 바이러스를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 S-FHV-031(ATCC Accession No. VR-2604)로 명명된 청구항 12에 기재된 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스를 제공하는 것이다. 상기 바이러스는 특허 절차상의 목적을 위하여 미생물 기탁의 국제적 인정에 관한 부다페스트 조약의 관련 규정하에서 American Type Culture Collection(ATCC; 미합중국의 VA 20108-0971, Manassas, 10801 University Boulevard 소재)에 1998년 5월 1일자로 기탁하였다.
또한, 본 발명은 비 필수적 영역을 함유하는 재 조합 바이러스는 고양이의 돈두 바이러스(swinepox virus)이며 그 비 필수적 영역은 돈두 바이러스(swinepox virus)의 Hind III M 단편 중 큰 것인 HindIII- Bgl II 부분단편인 재조합 바이러스를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 S-SPV-246(ATCC Accession No. VR-2603)로 명명된 청구항 14에 기재된 고양이의 재조합 돈두 바이러스(swinepox virus)를 제공하는 것이다. 상기 바이러스는 특허절차상의 목적을 위하여 미생물 기탁의 국제적 인정에 관한 부다페스트 조약의 관련 규정하에서 American Type Culture Collection(ATCC; 미합중국의 VA 20108-0971, Manassas, 10801 University Boulevard 소재)에 1998년 5월 1일자로 기탁하였다.
본 발명의 재 조합 바이러스에 있어서 CD28, CD80 또는 CD86 단백질의 해당 부분은 상기 단백질의 수용성 부분인 것을 하나의 구현 예로 한다. 또한, 본 발명의 재조합 바이러스에 있어서 상기 외래 핵산은 고양이의 CTLA-4 단백질을 코딩하는 것을 또 다른 구현예로 한다.
본 발명은 상기 재 조합 바이러스가 효과적인 면역 가능량으로서 적절한 캐리어와 같이 함유된 백신을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명에 있어서 상기 재 조합 바이러스의 효과적인 면역가능량은 약 1x105 pfu/ml 및 1x10 8pfu/ml 사이에 있는 것을 하나의 구현 예로 한다. 또한, 본 발명에 있어서 상기 백신은 재 조합 바이러스 및 두 번째 면역원의 효과적인 면역 가능량이 혼합되어 구성된 것을 또 다른 구현 예로 한다.
본 발명은 재 조합 바이러스의 효과적인 면역 가능량을 고양이에게 투여함으로서 고양이의 면역반응을 증강시키는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 재 조합 바이러스의 효과적인 면역 가능량을 고양이에게 투여하여 고양이를 면역시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 용해성의 CD28, CD80 또는 CD86을 함유하는 재 조합 바이러스의 효과적인 면역 억제량을 고양이에게 투여하여 고양이의 면역반응을 억제시키는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 CTLA-4 단백질을 함유하는 재 조합 바이러스의 효과적인 면역 억제량을 고양이에게 투여하여 고양이의 면역반응을 억제시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 재 조합 바이러스를 투여함에 있어서 정맥내주사, 피하내주 사, 근육내주사, 근육간주사(transmuscular), 국소투여, 경구투여, 또는 복강내주사로 하는 투여방법을 제공한다.
본 발명은 기관이나 조직을 이식한 고양이이거나 현재면역반응에 이상이 있는 고양이를 대상으로 면역반응을 억제시키는 방법을 제공하는 것을 한 구현 예로 한다. 또한 본 발명은 고양이의 면역반응을 억제시키는 방법에 있어서, 혼성화 (hybridizing)가 가능한 안티센스(antisense) 핵산을 고양이에게 투여하여 (a) 고양이의 CD28 mRNA 전사, (b) 고양이의 CD80 전사, 또는 (c) 고양이의 CD86 mRNA 전사에 대한 해독을 억제하며, 상기 안티센스 핵산은 고양이에 있어 해당 번역이 억제되어 그 면역반응이 억제될 수 있는 효과적인 함량이 포함된 것을 특징으로 하는 고양이의 면역반응을 억제시키는 방법을 또 다른 구현 예로서 제공한다.
본 발명은 재 조합 바이러스를 고양이에게 투여하여 발생한 종양을 감소시키거나 제거하는 방법에 있어서, 상기 핵산은 해당 종양을 감소시키거나 제거시킬 수 있는 유효한 양으로 하여 고양이의 CD80 단백질, 고양이의 CD86 단백질, 또는 이의 혼합물로 구성되는 것을 특징으로 하는 고양이에게 발생한 종양을 감소시키거나 제거하는 방법을 한 구현 예로 제공한다.
본 발명은 재 조합 바이러스를 고양이에게 투여하여 발생한 종양을 감소시키거나 제거하는 방법에 있어서, 상기 재 조합 바이러스는 발현할 수 있는 고양이 종양 관련 항원을 더 포함하고, 그 투여가 전신적으로 이뤄지는 것을 특징으로 하는 고양이에게 발생한 종양을 감소시키거나 제거하는 방법을 한 구현 예로서 제공한다
본 발명은 일부 또는 전체로서 CD80, CD86, CD28, CTLA-4 또는 RNA와 같은 벡터를 클로닝하거나 발현시킬 뿐만 아니라 고양이의 CD80(B7-1) 리간드, 고양이의 CD86(B7-2) 리간드, CD28 수용체 또는 고양이의 CTLA-4(CD152) 수용체를 발현하는 분리·정제된 DNA를 제공하며, 또한 CD80이 코딩하는 벡터, CD86이 코딩하는 벡터, CD28이 코딩하는 벡터 또는 CTLA-4가 코딩하는 벡터에 의해 형질 변경된 세포를 제공한다. CD80, CD86, CD28, CTLA-4 또는 RNA와 같은 벡터를 지니고 있는 고양이 종(species)는 집 고양이, 사자, pumas, bobcat 및 cheetan으로 구성된 구룹에서 선택한다.
본 발명은 분리 및 정제과정을 통하여 얻어진 941개의 뉴클레오티드로 구성된 고양이의 CD80(B7-1) cDNA를 제공한다. 또한, 본 발명은 약 33,485 kDA의 분자량, 약 9.1의 등전점, 10의 순전하(pH 7.0)등과 같은 특성을 지니고 있는 결합형태의 고유한 막이나 성숙한 형태의 아미노산(약 292개)로 구성된 고양이의 분리 및 정제과정을 통하여 얻어진 CD80 폴리펩티드를 제공한다. 공동자극분자인 CD28과 함께 CD80의 공동발현 및 종양항원 또는 병원성 유기체의 항원 등은 T-임파구를 활성화시키거나 증강을 위시하여 면역자극인자인 사이토카인의 생성을 유도하고 기타 세포들의 성장을 조절한다. 공동자극물질인 CTLA-4와 함께 CD80의 공동발현은 T-임파구의 활성을 조절하는데 기여한다.
본 발명은 분리 및 정제과정을 통하여 얻어진 1176개의 뉴클레오티드로 구성된 고양이의 CD86(B7-2) cDNA를 제공한다. 또한, 본 발명은 약 36,394 kDA의 분자량, 약 9.19의 등전점, 11.27의 순전하(pH 7.0)등과 같은 특성을 지니고 있는 결합형태의 고유한 막이나 성숙한 형태의 아미노산(약 320개)로 구성된 고양이의 분리 및 정제과정을 통하여 얻어진 CD86 폴리펩티드를 제공한다. 공동자극분자인 CD28과 함께 CD86의 공동발현 및 종양항원 또는 병원성 유기체의 항원 등은 T-임파구를 활성화시키거나 증강을 위시하여 면역자극인자인 사이토카인의 생성을 유도하고 기타 세포들의 성장을 조절한다. 공동자극물질인 CTLA-4와 함께 CD86의 공동발현은 T-임파구의 활성을 조절하는데 기여한다.
본 발명에 따른 고양이의 CD80 또는 CD86은 천연물이나 재조합물로부터 얻어진다. 상기 고양이의 CD80 또는 CD86은 천연적으로 막이 결합된 형태이거나 횡단막 영역이 결여된 분비물 형태이다.
본 발명은 분리 및 정제과정을 통하여 얻어진 689개의 뉴클레오티드로 구성된 고양이의 CD28 cDNA를 제공한다. 또한, 본 발명은 약 25,319 kDA의 분자량, 약 9.17의 등전점, 9.58의 순전하(pH 7.0)등과 같은 특성을 지니고 있는 결합형태의 고유한 막이나 성숙한 형태의 아미노산(약 221개)로 구성된 고양이의 분리 및 정제과정을 통하여 얻어진 CD28 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 분리 및 정제과정을 통하여 얻어진 749개의 뉴클레오티드로 구성된 고양이의 CTLA-4 cDNA를 제공한다. 또한, 본 발명은 약 24,381 kDA의 분자량, 약 6.34의 등전점, -0.99의 순전하(pH 7.0)등과 같은 특성을 지니고 있는 결합형태의 고유한 막이나 성숙한 형태의 아미노산(약 292개)로 구성된 고양이의 분리 및 정제과정을 통하여 얻어진 CTLA-4 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 외래 DNA를 발현하는 재조합 돈두 바이러스(swinepox virus), 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4 cDNA를 코딩하는 외래 DNA 및 해당 폴리펩티드 를 제공한다.
본 발명은 외래 DNA를 발현하는 재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스, 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4 cDNA를 코딩하는 외래 DNA 및 해당 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 외래 DNA를 발현하는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스, 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4 cDNA를 코딩하는 외래 DNA 및 해당 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 재조합 돈두 바이러스(swinepox virus) 벡터, 재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스 벡터 또는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스 베터내에서 고양이의 CD28 또는 CTLA-4가 존재 또는 비존재하에서 고양이의 CD80 또는 CD86을 투여하기 이전이나 이후, 또는 CD28 및 CTLA-4를 동시에 면역반응을 증강시키는데 유효한 양으로 투여하여 고양이과 동물로 하여금 얻어진 면역원에 대하여 면역반응을 증가시키는 방법을 또 하나의 구현예로서 제공한다.
본 발명은 재조합 돈두 바이러스(swinepox virus) 벡터, 재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스 벡터 또는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스 벡터 내에서 고양이의 CD28 또는 CTLA-4가 존재 또는 비존재하에서 고양이의 CD80 또는 CD86을 투여하기 이전이나 이후, 또는 CD28 및 CTLA-4를 동시에 고양이과 동물에게 면역반응을 억제시키는데 유효한 양으로 투여하여 얻어진 면역원에 대하여 면역반응을 억제시키는 방법을 또 하나의 구현 예로서 제공한다.
본 발명은 면역반응을 증강시키기 위하여 재조합 돈두 바이러스(swinepox virus) 벡터, 재조합 라쿤폭스(라쿤폭스(racoonpox)) 바이러스 벡터 또는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스 베터내에서 면역원과 유효한 양의 고양이의 CD80을 함유한 면역원에 대하여 고양이과 동물로 하여금 면역반응을 유도하는 백신을 또 하나의 구현예로서 제공한다.
본 발명은 면역반응 조절할 수 있는 유효한 양의 단백질이나 이의 단편을 코딩하는 면역원의 DNA 또는 RNA, 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 기타 부속물질의 DNA 또는 RNA를 조합물의 형태로 발현하는 재 조합 돈두 바이러스(swinepox virus) 벡터, 재 조합 라쿤폭스(raccoonpox) 바이러스 벡터 또는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스 벡터를 투여하여 획득한 면역반응을 유도하는 백신을 제공한다.
고양이의 CD80 단백질은 인간과 마우스의 단백질과 비교하여 각각 59% 및 46%의 유사한 아미노산 배열을 가지고 있다. 고양이의 CD86 단백질은 인간과 토끼의 단백질과 비교하여 각각 68% 및 64%의 유사한 아미노산 배열을 가지고 있다. 고양이의 CD28 단백질은 인간과 마우스의 단백질과 비교하여 각각 82% 및 74%의 유사한 아미노산 배열을 가지고 있다. 고양이의 CTLA-4 단백질은 인간과 마우스의 단백질과 비교하여 각각 88% 및 78%의 유사한 아미노산 배열을 가지고 있다. 인간이나 마우스의 CD80 또는 CD86 단백질은 고양이의 CD80 또는 CD86 단백질로 기능적으로 대치될 수 없다. 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4는 고양이과에서 면역조절에 요구되는 신규한 제재이다.
본 발명은 고양이 종으로부터 유래되는 T세포 조절부속분자, CD80(B7-1), CD86(B7-2), CD28 또는 CTLA-4(CD152)를 포함한다. 본 발명은 천연물이나 재 조합 물로부터 정제된 T세포의 조절부속분자, 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4를 위시하여 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4를 전체 또는 부분적으로 코딩하는 분리 및 정제과정을 통하여 얻어진 핵산을 제공한다. 본 발명에 따라 제조된 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4는 종양이나 병원성 유기체에 대한 백신의 유용성을 높여주며 고양이와 관련된 바이러스성 질환이나 박테리아성 질환에 대한 치료제로서의 역할을 한다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4는 과도반응적이거나 잘못 유도된 면역반응으로 인하여 야기된 질환을 개선시키는데 사용한다.
핵산, 벡터 및 형질전환체
고양이의 CD80(SEQ ID No: 1,3), 고양이의 CD86(SEQ ID No: 5), 고양이의 CD28(SEQ ID No: 7) 또는 고양이의 CTLA-4(SEQ ID No: 9)을 코딩하는 cDNA의 배열을 도 1~5에 나타내었으며, 또한 고양이의 CD80(SEQ ID No: 2,4), 고양이의 CD86(SEQ ID No: 6), 고양이의 CD28(SEQ ID No: 8) 또는 고양이의 CTLA-4(SEQ ID No: 10)에 대한 예상된 아미노산 배열을 도 1~5에 나타내었다. 상기 고양이의 폴리 펩티드를 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4라고 명명한 것은 상기 폴리 펩티드가 인간, 마우스 또는 토끼의 상동체에 대한 부분적 아미노산의 상동성, 그리고 CD80 또는 CD86 폴리 펩티드가 CD28 수용체(이하 참조) 또는 CTLA-4에 결합하여 T-임파구를 활성화시키거나 자극하며 이의 활성을 조절하는 능력에 기인한다. 더구나, 이론에 구애됨이 없이 고양이의 CD80 또는 CD86 폴리 펩티드는 다음과 같은 하나 이상 의 생물학적활성을 나타낸다고 보여진다. 즉, NK(천연킬러)세포의 활성화, B세포 성숙의 자극, MHC 제한성 세포독성 T-임파구의 활성화, 비만세포의 증식, 사이토카인 수용체와의 상호작용 및 면역조절인자 사이토카인의 유도등을 들 수 있다.
유전코드의 변성(즉, 다발성 코돈이 특정한 아미노산을 코딩하는 것)으로 인하여 도 1~5에 나타낸 것을 제외한 DNA 배열은 도 1~5에 나타낸 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4에 대한 아미노산을 또한 코딩한다. 원래의 DNA와 다른 DNA는 "서열보존성(sequence-conservative)"의 변수를 가지고 있어서 특정 코돈 내에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 그 위치에 코딩된 아미노산에 변화를 일으키지 않는다. 더구나, 한 폴리 펩티드내에서 특정 아미노산 잔기는 쳔연 폴리 펩티드의 전반적인 형상이나 기능에 변화를 주지 않고 흔히 변화가 가능하다. 상기 "기능보존성(function-conservative)"의 변수인자로서는 한 아미노산이 유사한 물리화학적 성상을 지닌 다른 아미노산으로 대치되는 것인데 예를 들면 산성, 염기성, 소수성, 친수성, 방향족등을 들 수 있다(예: 라이신에서 아르기닌, 아스파테이트에서 글루타메이트 또는 글리신에서 알라닌). 또한, 아미노산의 배열이 아미노산 말단이나 카르복시 말단에 추가되어 히스티딘 tag와 같은 정제 tag로서의 역할을 한다(예를 들면, 단백질의 1단계 정제가 이뤄진 후에 화학적 또는 효소학적으로 제거되는 것). 또한, 아미노산의 추가배열은 세포표면 결합부위를 추가적으로 제공하거나 항체에 대한 항원의 결합부위가 추가됨으로써 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4에 대하여 표적세포 특이성에 변화를 주지 않게 된다.
본 발명의 범위내에서 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4에 대한 cDNA 는 도 1~5에 나타낸 것과 더불어 기능보존성 변종DNA를 코딩하는 배열보존성 변종 DNA 및 이의 조합물등을 들 수 있다. 본 발명은 유용한 생물학적 활성을 단독 또는 다른 배열이나 성분과의 조합물로서 나타내는 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4에 대한 단편을 포함한다. 이하, 설명하는 바와 같이 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4에 대한 배열을 조작하고, 또한 특정한 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4에 대한 변종이 적용시에 적절한 안정성과 생물학적 활성을 유지하는 것을 설정하며, 또한 상기 분자들의 결합 활성에 영향을 끼치는 변종이 치료학적 효과를 증대시킨다는 사실을 예상하는 것은 통상적인 지식을 가진 당업자에게 주지된 사실이다.
고양이의 CD80 및 CD86은 각각 공동수용체인 CD28 또는 CTLA-4와 결합한다. 이는 재 조합시스템에서 변종인 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4 폴리펩타이드를 발현 및 정제하고, 또한 세포 배양물이나 동물에서 T세포의 자극활성 및/또는 성장촉진활성을 정량하며 그 적용시에 실험에 의해 증명될 수 있다. 변종 CD80이 CD28이나 CTLA-4에 기능적으로 결합시에 그 생물학적 활성도를 시험하게 된다. 변종 CD86도 CD28이나 CTLA-4에 기능적으로 결합시에 그 생물학적 활성도를 시험하게 된다. 동일한 방법으로 변종 CD28 또는 CTLA-4의 생물학적 활성도를 시험하게 된다.
또한, 본 발명은 집 고양이, 사자, 호랑이, 치타, 삵괭이 등과 같은 기타 고양이종으로부터 유래된 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4에 대한 DNA(및 폴리펩티드)을 포함한다. 도 1~5에 나타낸 배열을 가진 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4는 도1~5에 나타낸 전체 또는 일부의 서열을 구성하고 있는 프로브와 교잡하는 클론을 동정하기 위하여 cDNA 또는 게놈성 라이브러리를 스크린함으로써 용이하게 동정한다. 또한 발현 라이브러리도 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4를 인신하는 항체를 사용하여 스크린한다. 기존 이론에 구애됨이 없이 다른 고양이과로부터 유래된 CD80 또는 CD86은 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4과 최소한 약 70%의 상동성을 공유한다고 가정할 수 있다. 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4의 아미노산 배열과 최소한 25%의 상동성을 공유하고 있는 폴리펩티들를 코딩하는 DNA로서 정의된 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4의 상동성을 코딩하는 DNA류는 본 발명에 포함된다.
일반적으로 본 발명에 따라 핵산을 조작하는 것은 기존에 알려진 방법을 사용한다[(Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2nd Ed., Sambrook, Fritsch and Maniatris, Cold Spring Harbor 또는 Current Protocols in Molecular Biology(Ed. Aufubel, Brent, Kingston, More, Feiman, Smith and Stuhl, Greene Publ. Assoc., Wiley-Internscience, NY, NY, 1992)].
본 발명은 cDNA/RNA 배열 및 센스/안티센스를 포함한다. 또한, 본 발명은 고양이의 게놈성 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4에 대한 DNA 배열 및 정규 배열을 포함하는 측면배열을 포함한다. 또한, 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 배열은 프로모터, 증강인자, 반응인자, 시그날 배열, 폴리아데닐화 배열, 인트론, 5'- 및 3'-비코드화 영역을 포함하는 이종 배열(heterologous sequence)와 관련이 있다. 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4의 배열에 기능적으로 결합되는 전사적 정규인자는 원핵세포, 진핵세포, 원 핵세포의 바이러스, 진핵세포의 바이러스 및 이의 조합물로부터 유래된 유전의 발현을 지시하는 능력이 있는 인자를 포함한다. 기타 유용한 이종 정규배열은 당업계에 통상적인 지식을 가진 자에 잘 알려져 있다.
본 발명에 따른 핵산류의 안정성, 용해도, 결합친화도 및 특이성을 변경하는 방법은 당업계에 통상적인 지식을 가진 자에 잘 알려진 방법으로 수행한다. 예를 들면, 해당 배열을 메틸화시킨다. 본 발명에 따른 핵산의 배열은 직,간접적으로 탐지할 수 있는 시그날을 제공할 수 있는 라벨에 의해 변성된다. 라벨의 예로서는 방사선동위원소, 형광분자, 비옥틴등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 전체 또는 부분적으로 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 가지고 있는 벡터를 제공한다. 상기 벡터의 예로서는 각종의 원핵세포 및 진핵세포의 숙주에서 발현에 관여하는 플라스미드 벡터를 들 수 있다. 상기 벡터는 해당 부분을 코딩하는 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4 폴리펩티드에 기능적으로 결합된 프로모터를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 코딩된 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4 폴리펩티드는 본 발명이나 당업계에 통상적인 지식을 가진 자에 의해 알려진 적절한 벡터와 숙주 세포를 사용하여 발현시킬 수 있다.
한편, 본 발명은 전체 또는 부분적으로 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4 폴리 펩티드를 코딩하는 핵산을 가지고 있는 벡터를 제공한다. 상기 벡터의 예로서는 상기 벡터의 예로서는 각종의 진핵세포 숙주 또는 DNA나 RNA에서 발현에 관여하는 생바이러스 벡터를 들 수 있다. 본 발명의 한 구현 예에서 생바이러스 벡 터를 약독화시킨다. 본 발명의 또 다른 구현 예에서 상기 생바이러스 벡터를 유전자 결실방법으로 약독화시킨다. 또한, 본 발명의 또 다른 구현 예에서 상기 생바이러스 베터를 화학적처리나 열에 의해 약독화시킨다. 본 발명의 또 다른 구현 예에서 상기 생바이러스 베터를 화학적처리나 열에 의해 불활성화시킨다. 상기 방법에 의해 선택된 생바이러스 백신의 예로서는 헤르페스 바이러스, 마마바이러스, 아데노바이러스, 알파바이러스, 라브도바이러스(rhabdovirus) 및 피코르나바이러스(picornavirus) 등을 들 수 있다. 이밖에 본 발명에 따른 생바이러스 베터의 예로서는 고양이의 헤르페스 바이러스, 개의 헤르페스 바이러스, 새의 헤르페스 바이러스, 소의 헤르페스 바이러스, 말의 헤르페스 바이러스, 가성광견병 바이러스, 카나리폭스(canarypox) 바이러스, 백시니아(vaccinia) 바이러스, 말로니 뮤린(Malony murine) 백혈병 바이러스, 신드비스(Sindbis) 바이러스 및 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스 등을 들 수 있다.
상기 생바이러스 벡터는 전체 또는 부분적으로 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4의 cDNA를 발현하는 재 조합 바이러스성 벡터이다. 또한, 외래 DNA는 병원성 유기체에서 유래된 항원에 대한 cDNA이다. 상기 재 조합 바이러스성 벡터는 당업계에 통상적인 지식을 가진 자에게 알려진 동종 재 조합 방법이나 코스미드(cosmid) 재생성방법에 의해 제조된다. 상기 벡터는 해당 부분을 코딩하는 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4 폴리 펩티드에 기능적으로 결합된 프로모터를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 프로모터의 예로서는 고양이의 헤르페스 gE 프로모터, 마마바이러스의 전기 또는 후기 합성 프로모터, 인간 사이토메갈로바이 러스의 합성이 극히 빠른 프로모터, 가성광견병 바이러스 gX 프로모터등을 들 수 있다. 유전자 발현에 관여하는 프로모터의 역할은 하나의 카셋트에 포함된 내부의 리보좀 친입 부위(IRES) 인자에서 유래된 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4의 cDNA를 발현하는 것이다(pCITE 벡터, Novagen, Medison, WI). 성장바이러스 벡터에 대한 세포주의 예로서는 크란델(Crandell) 고양이의 신장세포(CRFK), 병아리의 태아 섬유아세포, 돼지의 태아 신장세포(ESK-4), porcine 신장세포(PK)등을 들 수 있다. 상기 코딩된 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4 폴라펩티드는 본 발명이나 당업계에 통상적인 지식을 가진 자에게 알려진 적절한 벡터와 숙주 세포를 사용하여 발현시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에서 고양이의 병원체에서 유래된 면역원에 대한 유전자와 함께 고양이의 CD80/CD28, CD80/CTLA-4, CD86/CD28 또는 CD86/CTLA-4를 코딩하는 유전자는 단일 재 조합 바이러스성 벡터에 포함되어 생백신으로 제재화된다. 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4 유전자를 단독, 또는 고양이의 병원체에서 유래된 고양이의 유전자와 함께 재조합 바이러스에 이입시켜서 적절한 프로모터에 의해 상기 유전자의 발현을 통제한다. 본 발명의 또 다른 구현예에서 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4 유전자를 코딩하는 유전자를 단독, 또는 병용하여 재조합 바이러스성 벡터에 이입시켜서 고양이의 병원체에서 유래된 면역원에 대한 유전자를 코딩하는 두번째 재조합 바이러스성 벡터를 함유한 백신으로 동시 투여한다. 상기 두가지 구현예는 바람직한 면역반응의 증강, 억제 또는 재유도를 수행함에 있어서 동일한 세포나 거의 근사치의 세포 내에서 바람직한 면역반응을 나 타낸다.
상기 면역원은 고양이의 병원체로부터 선택되며 그 구체적인 예는 다음과 같다: 고양이의 면역결핍 바이러스, 고양이의 백혈병 바이러스, 고양이의 감염성 복막염 바이러스, 고양이의 범백혈구감소증 바이러스(parvovirus), 고양이의 칼리시바이러스(calicivirus), 고양이의 제3형 레오바이스, 고양이의 로타바이러스, 고양이의 콜로나바이러스(감염성 복막염 바이러스), 광견병 바이러스, 고양이의 싱키셜(syncytial) 바이러스, 고양이의 육종 바이러스, 고양이의 헤르페스 바이러스(rhinotracheitis virus), 고양이의 보르나병 바이러스, 클라미디아, 톡소플라스모시스 곤디(Toxoplasmosis gondii), 고양이의 기생충, 디로필라리아 이미티스(Dirofilaria immitis), 벼룩, 박테리아성 병원체.
벡터 또는 생 바이러스 벡터는 가끔 클로닝이나 발현을 위한 하나 이상의 복제시스템, 숙주내에서 항생제 내성 마커, β-갈락토시다제(lacZ) 또는 β-글루쿠로니다제(uidA)와 같은 열량측정용 마커 또는 녹색 형광단백질과 같은 형광마커를 선별하기 위한 하나 이상의 마커 및 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 삽입된 코딩 배열은 합성 후에 천연물질로부터 분리되어 하이브리드 등으로 제조된다. 전사적 조절성 배열에 대한 토드화 배열의 결찰(ligation)은 통상적인 지식을 가진 자에게 알려진 방법으로 실시한다. 적절한 숙주세포는 전기영동, 매개 DNA 유입(uptake), 진균감염, 마이크로인젝션, 마이크로프로젝타일(microprojectile) 등을 포함한 적절한 방법에 의해 형질변경과 형질감염이 이뤄진다.
본 발명을 위하여 사용되는 적절한 백터의 예로서는 YEp 352, pcDNAI(Invitrogen, Carlsbad, Ca), pRc/CMV(Invitrogen) 및 psFVI(GIBCO/BRL, Gaitherburg, MD) 등을 들 수 잇다. 본 발명에 사용되는 바람직한 벡터는 pSFV1이다. 적절한 숙주세포의 예로서는 대장균, 효모, COS 세포, PC12 세포, CHO 세포, GH4Cl 세포, BHK-21 세포 및 양서류의 melanophore 세포를 들 수 있다. 본 발명에서 바람직하게 사용되는 숙주 세포주는 BHK-21 세포이다. DNA 또는 유전백신물의 예로서는 pTarget(Prometa, Medison, WI), pSI(Prometa, Medison, WI) 및 pcDNA(Invitrogen, Carlsbad, CA) 등을 들 수 있다.
또한, 고양이의 CD80/CD28, CD80/CTLA-4, CD86/CD28 또는 CD86/CTLA-4 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 재 조합 과정을 통하여 세포에 도입된다. 예를 들면, 상기 배열을 세포에 미세주사(microinjection)하여 폴리펩티드, 이의 유사체 또는 슈도겐 또는 고양이의 CD80/CD28, CD80/CTLA-4, CD86/CD28 또는 CD86/CTLA-4 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 상당한 동일성을 지닌 배열을 코딩하는 내인성 유전자의 부위에서 동종 재조합을 추진하게 된다. 또한, 비상동성 재조합과 같은 기타 재조합방법 및 특히 다분화능세포에서 동종 재조합에 의한 내인성 유전자의 결실이 사용되고 있다.
본 발명은 고양이의 CD28 또는 CTLA-4가 존재 또는 비존재하에서 고양이의 CD80 또는 CD86을 투여하기 이전이나 이후, 또는 CD28 및 CTLA-4를 동시에 고양이과 동물에게 면역반응을 억제시키는데 유효한 양으로 투여하여 얻어진 면역원에 대하여 고양이과 동물의 면역반응을 증강시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 고양이의 CD28 또는 CTLA-4가 존재 또는 비존재하에서 고양이의 병원체 및 고양이의 CD80 또는 CD86과 같은 보조분자에서 유래된 면역원을 함유하는 발현 백터를 면역반응을 증가시키는데 유효한 양으로 투여하여 얻어진 면역원에 대하여 면역반응을 증강시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 고양이의 CD28 또는 CTLA-4가 존재 또는 비존재하에서 고양이의 병원체 및 고양이의 CD80 또는 CD86과 같은 보조분자에서 유래된 면역원을 함유하는 발현 백터를 면역반응을 증가시키는데 유효한 양으로 투여하여 얻어진 면역원에 대하여 면역반응을 재 지시하는 방법을 제공한다.
본 발명은 고양이의 CD28 또는 CTLA-4가 존재 또는 비존재하에서 고양이의 CD80 또는 CD86, 또는 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4를 코딩하는 안티센스 RNA 또는 DNA를 투여하기 이전이나 이후, 또는 CD28 및 CTLA-4를 동시에 고양이과 동물에게 면역반응을 억제시키는데 유효한 양으로 투여하여 얻어진 면역원에 대하여 면역반응을 억제시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 고양이의 CD28 또는 CTLA-4가 존재 또는 비존재하에서 고양이의 병원체 및 고양이의 CD80 또는 CD86과 같은 보조분자에서 유래된 면역원을 함유하는 발현 백터를 면역반응을 증가시키는데 유효한 양으로 투여하여 얻어진 면역원에 대하여 면역반응을 유도하는 백신을 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현 예에서 면역반응을 증강 또는 억제시키기 위하여 고양이의 CD28 또는 CTLA-4가 존재 또는 비존재하에서 고양이의 병원체 및 고양이의 CD80 또는 CD86과 같은 보조분자에서 유래된 면역원을 함유하는 발현 백터에 대한 백신을 제공한다.
고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4 폴리펩티드
고양이의 CD80 유전자(도 1~2에 나타낸 DNA 및 아미노산 배열)는 약 292개의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드를 코딩한다. 고양이의 CD86 유전자(도 3에 나타낸 DNA 및 아미노산 배열)는 약 320개의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드를 코딩한다. 고양이의 CD28 유전자(도 4에 나타낸 DNA 및 아미노산 배열)는 약 221개의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드를 코딩한다. 고양이의 CTLA-4 유전자(도 5에 나타낸 DNA 및 아미노산 배열)는 약 223개의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드를 코딩한다.
천연물이나 재 조합물로부터 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4를 정제하는 방법은 기존에 이미 알려진 방법으로 그 예를 들면 이온교환 크로마토그래피, C4 칼럼상에서 역상 크로마토그래피, 겔여과, 등전점 포커싱(isoelectric focusting), 친화도 크로마토그래피등이 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서 다량의 생물학적 활성이 있는 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4는 pSFV1 레프리콘(replicon)에서 제 6번째 C-말단 히스티딘 잔기를 코딩하는 배열의 프레임에 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4가 용융된 코딩영역을 가지고 있는 재 조합 DNA를 합성함으로써 얻어진다.
상기 플라스미드에서 코딩된 mRNA는 당업계에 통상적 지식이 있는 자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 합성하고 이를 전기영동법에 의해 BHK-21 세포에 도입시킨다. 이와 같이 합성된 분비형의 성숙한 세포는 제 6번째 C-말단 히스티딘을 함유하는 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4 폴리펩티드에 당화반응을 일으킨다. 변성된 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4 폴리펩티드는 히스티딘 결합수지(His-bind, Novagen, Madison, WI)를 이용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 세포의 상청액으로터 정제된다.
특정물질로부터 분리된 고양이의 CD80 또는 CD86 폴리펩티드는 기존에 알려진 방법을 사용하여 변성시킨다. 예를 들면, 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4에 대하여 인산화반응, 탈인산화반응, 당화반응 또는 탈당화반응을 실시한다. 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4에 대하여 그 용해도, 안정도, 결합특이성 및 친화도를 변화시키는 변성방법이 특히 유용하다.
고양이의 CD80, CD86, CD28, CTLA-4 키메릭(Chimeric)분자들
본 발명은 고양이의 CD80, CD86, CD28, CTLA-4의 단편들을 임의의 조합으로 하여 키메릭분자들을 제조하는 것으로서, 예를 들면, CD-28의 결합위치(binding site)에 CTLA-4 결합부위를 삽입시킴으로써 면역반응을 증강시키는 동시에 CD28의 결합적 친화력을 증대시키는 것이다.
구체적으로는, CTLA-4 및 CD28에 있는 CD80 와 CD86에 대한 결합부위가 서로 교환되어서 결국 CD28의 결합부위가 CTLA-4의 결합부위로 전환되는 것이다. 따라서 CTLA-4의 결합부위를 지닌 키메릭 CD28분자는 CD80 또는 CD86에 대한 CD28의 친화력을 향상시킴과 더불어 면역반응의 상당한 증대를 낳게되는 효과가 있다. 예를 들어, CD80과 CD28 또는 CD86과 CD28의 키메릭 분자 또는 그 단편들은 막에 결합되어 있는 것으로서 이러한 분자들의 면역증강력을 향상시키게 된다. CD80과 CTLA-4 또 는 CD86 과 CTLA-4의 키메릭 분자 또는 그 단편들의 경우에는 막에 결합되어 있는 것으로서 이러한 분자들의 면역 억제력을 향상시키게 된다. CD80과 CTLA-4 또는 CD86과 CTLA-4의 키메릭 분자 또는 그 단편들의 경우에는 막에 결합되어 있는 것으로서 소기의 효과를 달성키 위하여 면역반응을 재 조절하게 된다. 상기의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4는 또다른 폴리펩타이드에 결합된 융합(fusion) 단백질들로서 상기 폴리펩타이드의 예로는 면역 글로블린, 항원, 종양 항원, 세포표면의 수용체 또는 세표 표면의 리간드를 들 수 있으나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다.
고양이의 CD80, CD86, CD28, CTLA-4에 대한 항체
본 발명은 상기에서 언급한 바와 같이 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4 폴리펩타이드에 특이한 항체에 대한 것이다. 상기 항체들은 폴리클로날 또는 모노클로날 항체들로서 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4를 다른 종으로부터 구별하게 하며 또한 기능 부위등을 판별하게 한다. 상기 항체들은 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988에 기술된 Harlow 및 Lane의 방법과 조성물 및 기타 동분야에 널리 알려진 면역학적 및 하이브리도마(hybridoma) 기술을 이용하여 제조하였다. 자연의 또는 합성된 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4로부터 유래된 펩타이드들로 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4 특이성 면역반응을 유도할 때에는 상기 펩타이드들은 적절한 캐리어로 편의하게 커플(couple)되어 Freund's와 같은 적절한 보강제(adjuvant)를 이용하여 투여하게 되며 Tan의 방법에 따라 라이신 코어 캐리어에 커플되는 것이 바람 직하다 (Tan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5409-5413). 상기의 방법에 따라 얻어지는 항체들, 특히 내부의 이미지화를 위한 항-이디오티픽(anti-idiotypic) 항체들은 또한 기존 방법들을 통하여 준비될 수 있다.
정제된 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4들은 쥐의 면역에도 사용되는데 쥐의 비장을 제거한 후 비세포(splenocytes)와 골수종 세포(myeloma cells)의 세포간 하이브리드(hybrids)를 형성하여 당분야의 통상적인 기술을 사용하여 항체를 분비하는 클론을 얻게 된다. 상기결과로 얻게되는 모노클로날 항체들에 대하여는 실험실내에서 다음의 활성을 측정하게 된다: 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4에 대한 결합, CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 수용체결합 활성에 대한 억제력, 및 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 T세포 자극적 활성(stimulatory activity)에 대한 억제력.
항-고양이CD80, 항-고양이CD86, 항-고양이CD28 및 항-고양이CTLA-4 항체들은 ELISA 및 RIA등의 면역학적 분석방법을 통하여 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4를 동정(identify)하고 그 양을 계량하는데 사용된다. 상기 항체들은 또한 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 추출액(extracts)을 면역고갈(immunodeplete)시키는데 사용할 수 있다. 아울러, 상기 항체들은 서로 다른 자원들로부터 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4를 동정, 분리 및 정제하며 세포 내적 및 화학적 세포조직의 추적을 연구하는데 활용된다.
구체적 적용
본 발명에 따라 제조된 고양이의 CD80 (B7-1) 리간드, CD86(B7-2) 리간드, CD28 수용체 또는 CTLA-4(CD152) 수용체들은 동종 또는 서로 다른 고양이과 동물들의 감염성 질병을 예방하고 성장을 촉진하는 백신으로서 사용할 수 있다. 예를 들면, CD80이나 CD86이, 공통적으로 자극이 가능한 CD28 또는 CTLA-4의 분자들(임의로 조합한)과, 공동발현과 병원균을 보유한 유기물의 종양항원(들). CD80 이나 CD86가 CTLA-4의 수용체와 공동으로 발현하면 T세포의 활성을 저해하고 면역반응을 억제하게 된다. 특정 예로서는, CD80 이나 CD86을 바이러스 벡터나 DNA 발현벡터내에 있는 FIV, FeLV, 또는 FIP에서 유래된 면역원들과 공동으로 발현시킨 후 백신으로서 투여함으로써 CD4+와 CD8+ T세포의 증식을 조절 및 향상시키며 IL-2, IFN-g, IL-2, TNFa, IL-6등의 면역조절 싸이토카인(cytokines)을 유도하는 것이다. 또다른 예로는, CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4를 바이러스 벡터나 DNA 발현벡터내에서 발현시켜 치료제로 투여함으로써 면역반응을 재조절케 하는 것이다.
고양이의 CD80이나 CD86을 CD28 또는 CTLA-4와의 상호반응으로 면역력을 향상시키거나 저해하는 것은 건강에 장기적으로 복잡하거나 심지어 치명적인 효과를 유발할 수 있는 외래물질을 첨가함에 의한 것이 아니라 자연적인 조절과정을 이용하는 것이다. CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4분자는 면역을 유발하기에 적합한 항원을 코딩하는 기타 재조합 분자들과 같이 투여된다. 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4 유전자는 발현벡터에 삽입하여 표적세포에서 감염 및 발현되며 표적세포나 항원을 공여하는 세포의 세포질막에 결합되거나, 상기 표적세포나 항원을 공여하는 세포의 외부로 분비된다. 플라스미드, Semliki Forest 바이러스, pox 바이러스, 또 는 헤르페스 바이러스와 같은 발현벡터들은 유전자를 항원공여세포에 전달한다. CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4 유전자나 이의 단편들은 임의로 조합하여 DNA나 RNA 발현벡터로 삽입되며, 공양이과 동물에 투여되어 이들 동물내에서 보호되지 않은(naked) DNA/RNA 또는 유전적 백신을 발현하게 된다. 표적세포나 상기 고양이과 동물내에서CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4을 항원과 더불어 공동으로 발현하게 되면 T세포, B세포 및 기타 세포들을 조절하고 활성화하는데 있어서 향상을 꾀할 수 있다. 또 다른 방법으로는, 단백질을 플라스미드, Semliki Forest 바이러스, pox 바이러스, 또는 헤르페스 바이러스와 같은 무핵계(prokaryotic system) 또는 진핵계(eukaryotic system)에서 발현시킨 후 투여할 수도 있다. CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4 단백질은 세포질막의 부속적인 분자들로서 세포막에 결합되었을 때 정상적으로 기능을 발휘하게 되나 막에 결합되지 않고 기타 다른 형태로 존재할 수도 있다.
본 발명의 한 구현 예에서 고양이의 CD80 및 CD86은 수용성이고, 횡단막 영역이나 소수성 영역이 결여되어 있으며 공동자극분자인 CD28 또는 CTLA-4와 막이 결합되어 있거나 수용성 형태로서 상호 작용한다. 본 발명의 또 다른 구현 예에서 고양이의 CD80 또는 CD86은 막이 결합되어 있으며, 또한 공동자극분자인 CD28 또는 CTLA-4는 수용성이며 횡단막 영역이나 소수성 영역이 결여되어 있다. 바람직하게는 이량체 형태의 수용성 CD28 또는 CTLA-4는 고양이의 T세포가 매개하는 면역억제질환을 치료하는데 유용하다. 상기 수용성 CD28 또는 CTLA-4는 이식된 조직의 거부반응을 예방하며 자가면역치료에 사용될 수 있다. 특히, 골수이식에서 상기 수용성 CD28 또는 CTLA-4는 이식편 숙주질병을 예방하는데 유용하며 막이 결합된 고양이의 CD80 또는 CD86을 함유하는 세포의 결합을 방지한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서 고양이의 CTLA-4는 면역글로블린(Ig)에 용융된다. CTLA-4-Ig 용해물은 면역반응을 억제하거나 자가면역질환을 치료하는데 유용하다. 상기 자가면역질환은 관절염, 건선, 조직이식의 거부반응 및 이식편숙주질환을 포함한다.
본 발명의 한 구현 예에서 막이 결합되었거나 수용성형태로서 고양이의 CD80 및/또는 CD86 단백질은 고양이에게 발생하는 종양을 축소시키거나 괴사시키는데 유용하다. 특히, 고양이의 CD80 및/또는 CD86 단백질은 고양이의 공동 벡터화 종양과 관련된 항원과 함께 직접 종양을 주사하거나 전신성 투여경로를 통하여 바이러스성 벡터 또는 형태를 갖추지 않은 DNA로부터 발현된다.
고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4 DNA 및 폴리펩티드의 배열보존성 및 기능보존성 변종이나 생물학적 활성이 있는 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4 단편 또는 부분단편은 프레임내에서 사이토카인, 인터루킨, 인터페론, 콜로니자극인자, 병원성 유기체의 항원, 항체 또는 his-tag와 같은 정제 배열 또는 대장균 lacZ, 대장균 uidA 또는 녹색형광 단백질과 같은 리포터 유전자등과 같은 또 하나의 배열에 용융된다.
백신 제재
본 발명은 고양이 종에서 면역반응을 증대시키기 위한 제조 방법과 조성물을 포함한다. 본 발명의 구현 예에서 면역반응을 증대시킬 목적으로 하나의 면역원과 함께 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4이 사용된다. 예를 들면, 고양이의 면역결핍 바이러스 및 고양이의 백혈병 바이러스와 같은 병원체와 고양이의 parvovirus, leptovirus 및 coronavirus와 같은 병원체로부터 유래된 면역원을 함유하는 고양이 백신의 경우 면역반응의 크기와 면질을 조절하기 위하여 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4를 함유시키는 것이 바람직하다. 이를 위하여 상기에서 언급한 바와 같이 천연물이나 재조합물로부터 정제된 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4를 고양이 1마리당 백신의 양을 0.01~100.0 mg의 농도에서 백신 제재에 함유시킨다. 또한, 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4를 발현하는 재 조합 벡터 및/또는 고양이의 병원체에서 유래된 면역원을 고양이 1 마리 당 백신의 양을 0.01~100.0 mg의 농도에서 백신제재에 함유시키며 바람직하게는 1일 약 0.25 mg/kg~25 mg/kg의 용량으로 백신제재에 함유시킨다.
고양이 1 마리 당 백신의 양을 0.01~100.0 mg의 농도에서 백신제제에 함유시킨다. 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4는 생(복제한) 바이러스성 백신이나 비복제한 백신과 함께 투여한다. 상기 복제백신의 예로서는 변성된 고양이의 헤르페스 바이러스나 변성된 raccoonpos 바이러스와 같은 천연 또는 재 조합 바이러스 또는 박테리아 등을 들 수 있다. 고양이의 수주에서 제한을 가하거나 복제하지 않았으나 숙주세포에서 외래 DNA(고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4, 또는 고양이의 병원체에서 유래된 면역원)을 발현시킨 생바이러스성 백신의 예로서는 변성 fowlpox 바이러스, 변성 돈두 바이러스 또는 Semliki Forest 바이러스 등을 들 수 있다. 비복제 백신의 예로서는 살균 또는 불활성된 바이러스 또는 기타 미생물, 천연물이나 조합물 또는 고양이의 백혈병 바이러스 백신과 같은 합성물ㅇ로부터 유래된 조항원 또는 정제항원을 들 수 있다.
고양이 백신의 시판제품은 당업계에서 통상적인 지식을 가지고 있는 자에게 이미 알려져 있으며(Compendium of Vetrinary Pharmaceuticals, 1997), 이들 제품들은 본 발명의 백신과 함께 치료효과를 높이기 위하여 병용된다.
한 면역원에 대하여 면역반응을 유도하고 조절하기 위한 백신은 면역원과, 고양이의 CD28 또는 CTLA-4가 존재 또는 비존재하에서 면역반응을 증대시에는 고양이의 CD80 또는 CD86, 또는 면역반응을 억제시에는 고양이의 CTLA-4가 존재하에서 고양이의 CD80 또는 CD86을 함유한다.
고양이의 병원체로부터 선택된 면역원의 구체적인 예로서는 고양이의 면역결핍 바이러스, 고양이의 백혈병 바이러스, 고양이의 감염성 복막염 바이러스, 고양이의 범백혈구감소증 바이러스(parvovirus), 고양이의 칼리시바이러스(calicivirus), 고양이의 레오바이스 3형, 고양이의 로타바이러스, 고양이의 콜로나바이러스(감염성 복막염 바이러스), 광견병 바이러스, 고양이의 싱키셜(syncytial) 바이러스, 고양이의 육종 바이러스, 고양이의 헤르페스 바이러스(rhinotracheitis virus), 고양이의 보르나병 바이러스, 클라미디아, 톡소플라스모시스 곤디(Toxoplasmosis gondii), 고양이의 기생충, 디로필라리아 이미티스(Dirofilaria immitis), 벼룩, 박테리아성 병원체 등이 있다.
T 임파구와 같은 세포의 성장이나 활성이 조절되는 것은 그 조절반응이 해당 세포의 성장을 자극하거나 억제되는 것을 의미한다. 고양이과 동물에서 면역반응이 조절되는 것은 고양이과 동물의 관련 질병이나 감염성 인자를 치료하기 위하여 면역반응이 자극되거나 억제되는 것을 의미한다.
본 발명의 한 구현 예에서 CD80/CD28, CD80/CTLA-4, CD86/CD28 또는 CD86/CTLA-4를 코딩하는 유전자는 고양이의 병원체에서 유래된 유전자와 함꼐 단일의 재조합 바이러스성 벡터에 포함되어 생백신으로 제재화된다. 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4 유전자는 단독 또는 고양이의 유전자와 함께 재조합 바이러스에 포함되어 상기 유전자의 발현은 적절한 프로모터에 의해 조절된다. 백신이 투여되면 동일 세포 내에 생물학적 활성을 지닌 CD80 또는 CD86 리간드, CD28 또는 CTLA-4 수용체 및 고양이의 면역원이 발현되며 이에 따라 바람직한 면역반응을 증진시키는데 필요한 1차 및 2차 공동신호가 나타나게 된다. 본 발명의 상기 구현 예에서 고양이의 면역원에 대한 조기적이고 국소적 면역반응이 일어나며 고양이의 질병에 대하여 보다 치료효과가 개선된 백신의 제공이 가능하다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서 단독 또는 조합물로서 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4를 코딩하는 유전자는 재 조합 바이러스성 벡터에 포함되며, 고양이의 면역원에 대한 유전자를 코딩하는 제 2차 재 조합 바이러스성 벡터를 함유하는 백신을 투여함으로써 동일세포 또는 극히 유산 세포내에서 바람직한 면역반응을 가져오거나 고양이의 질병에 대하여 보다 치료효과가 개선된 백신의 제공이 가능하다.
이하, 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4를 발현시키기 위하여 사용된 재 조합 바이러스성 벡터와 병원성 미생물을 이용한 면역 공격 시험시에 개선된 예방 적 면역반응을 유도하는 백신의 예를 들면 다음과 같다.
1. 바이러스의 전체 또는 부분 게놈을 함유하는 고양이의 재조합 돈두 바이러스(비 필수적 삽입부위에 삽입)에서 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 단독 또는 둘 이상의 조합된 발현. 상기 바이러스의 비복제화와 관련하여 고양이를 위시한 고양이과 동물에서 상기 바이러스를 단독 사용하거나 다른 백신 제재 또는 치료제(재 조합, 생 또는 살균 바이러스).
2. 바이러스의 전체 또는 부분 게놈을 함유하는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스(FHV gE 부위 또는 비 필수적 삽입부위에 삽입)에서 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 단독 또는 둘 이상의 조합된 발현. 상기 바이러스의 비복제화와 관련하여 고양이를 위시한 고양이과 동물에서 상기 바이러스을 단독 사용하거나 다른 백신 제재 또는 치료제(재조합, 생 또는 살균 바이러스).
3. 바이러스의 전체 또는 부분 게놈을 함유하는 고양이의 재조합 raccoonpox 바이러스(비필수적 삽입부위에 삽입)에서 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 단독 또는 둘 이상의 조합된 발현. 상기 바이러스의 비복제화와 관련하여 고양이를 위시한 고양이과 동물에서 상기 바이러스을 단독 사용하거나 다른 백신 제재 또는 치료제(재조합, 생 또는 살균 바이러스).
4. 유전자로서 FIV gag/프로테아제 및/또는 피막을 전체 또는 부분적으로 함유하는 고양이의 재조합 돈두 바이러스에서 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 단독 또는 둘 이상의 조합된 발현.
5. 유전자로서 FIV gag/프로테아제 및/또는 피막을 전체 또는 부분적으로 함 유하는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스에서 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 단독 또는 둘 이상의 조합된 발현.
6. 유전자로서 FIV gag/프로테아제 및/또는 피막을 전체 또는 부분적으로 함유하는 고양이의 재조합 라쿤폭스(raccoonpox) 바이러스에서 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 단독 또는 둘 이상의 조합된 발현.
7. 유전자로서 FeLV gag/프로테아제 및/또는 피막을 전체 또는 부분적으로 함유하는 고양이의 재조합 돈두 바이러스에서 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 단독 또는 둘 이상의 조합된 발현.
8. 유전자로서 FeLV gag/프로테아제 및/또는 피막을 전체 또는 부분적으로 함유하는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스에서 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 단독 또는 둘 이상의 조합된 발현.
9. 유전자로서 FeLV gag/프로테아제 및/또는 피막을 전체 또는 부분적으로 함유하는 고양이의 재조합 라쿤폭스(raccoonpox) 바이러스에서 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 단독 또는 둘 이상의 조합된 발현.
10. 유전자로서 FeLV gag/프로테아제 및/또는 엔벨로프, 및 FIV gag/프로테아제 및/또는 피막 또는 이의 조합물을 전체 또는 부분적으로 함유하는 고양이의 재조합 돈두 바이러스에서 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 단독 또는 둘 이상의 조합된 발현.
11. 유전자로서 FeLV gag/프로테아제 및/또는 피막, 및 FIV gag/프로테아제 및/또는 피막 또는 이의 조합물을 전체 또는 부분적으로 함유하는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스에서 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 단독 또는 둘 이상의 조합된 발현.
12. 유전자로서 FeLV gag/프로테아제 및/또는 피막, 및 FIV gag/프로테아제 및/또는 피막 또는 이의 조합물을 전체 또는 부분적으로 함유하는 고양이의 재조합 라쿤폭스(raccoonpox) 바이러스에서 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 단독 또는 둘 이상의 조합된 발현.
13. 비정제되었거나 정제된 폴리펩티드를 생성하기 위하여 돈두 바이러스, 라쿤폭스(raccoonpox) 바이러스 또는 기타 생물계(대장균, Semliki forest 바이러스 및 바쿠로바이러스)에서 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 단독 또는 둘 이상의 조합된 발현. 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 생성과 기능성 정량법 개발에 위한 시약에 대한 용도.
14. 약독화된 FIV 또는 FeLV 바이러스성 벡터에서 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 단독 또는 둘 이상의 조합된 발현. 본 발명의 한 구현예에서 FIV 또는 FeLV 바이러스성 벡터는 유전자 결실법에 의해 약독화된다.
15. 유전자 백신이나 형태를 갖추지 않은 DNA 백신으로 투여하기 위하여 유전자로서 고양이의 면역원을 전체 또는 부분적으로 함유하는 하나의 발현벡터에서 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 단독 또는 둘 이상의 조합된 발현. 상기 벡터의 예로서는 pTarget(promega, Medison, WI), pcDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA), (Donnelly JJ등, 1977; Hassett and Whitton, 1906)등을 들 수 있다.
16. 유전자로서 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 단독 또는 둘 이상의 조합물 에 대한 유전자 또는 그 단편을 전체 또는 부분적으로 고양이나 다른 포유물의 염색체에 삽입하거나 형질 감염시킬 수 있다. 상기 유자나 단편의 통합은 레트로 바이러스성 벡터나 유전자치료의 형태로서 이뤄지거나 사용될 수 있다.
본 발명은 의학적이고 상업적인 목적을 위하여 고양이의 종과 관련된 질병의 저항력을 증진시키는 각종의 방법과 조성물을 제공한다. 본 발명의 구현 예에서 전체 또는 부분적으로 발현된 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4의 단독 또는 둘 이상의 조합물, 및 고양이의 면역원을 코딩하는 유전자가 존재하거나 비존재하에 적절한 투여경로를 통하여 고양이에게 투여한다. 고양이의 성장촉진과 질병의 대한 내성을 증진시키기 위하여 발현된 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4의 단독 또는 둘 이상의 조합물에 있어 한 마리당 투여하는 백신의 양을 약 0.01~100.0 mg의 농도, 바람직하게는 1일 약 0.25~25 mg/kg의 농도로 하여 고양이에게 투여한다. 고양이의 성장촉진과 질병의 대한 내성을 증진시키기 위하여 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4의 단독 또는 둘 이상의 조합물을 발현하는 재조합 바이러스성 벡터에 있어 한 마리당 투여하는 백신의 양을 약 0.01~100.0 mg의 농도, 바람직하게는 1일 약 0.25~25 mg/kg의 농도로 하여 고양이에게 투여한다. 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4을 함유한 투여량의 경우 매트릭스 형태 및 투여횟수를 설정하거나 매트릭스 내에서 각 실시항목에 대한 실험단위 또는 피험동물을 비교함에 있어 기존에 알려진 정기적 실험방법에 의해 측정할 수 있다.
본 발명에서 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4는 천연물이나 재조합물의 형태로서 생리학적으로 허용가능한 캐리어, 예를 들면 인산염완충식염수 또는 탈이온화수 와 함께 제제화시킨다. 또한, 상기 제제물은 기존에 잘 알려진 활탁제, 가소제, 흡수증진제, 살균제제을 포함하는 부형제를 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4는 유효한 투여경로를 통하여 투여할 수 있는 바, 그 예로서는 정맥투여, 피하투여, 근육간투여, 국소투여 또는 경구투여를 들 수 있다. 피하투여의 경우 그 제형으로서는 멸균 생리식염수에 녹인 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4를 포함한다. 경구투여나 호흡기에 투여하는 경우 부형제가 포함되거나 포함되지 않은 고양이의 CD80, CD86, CD28 또는 CTLA-4를 리포좀 및 미세구상형태로 하여 미세 또는 거대켑슐제형으로 제형화한다. 또한, 경피패취제제(또는 기타 서방제제)도 사용이 가능하다.
재료 및 방법
라쿤폭스(Raccoonpox) 바이러스(RPV) 표본 제조
RPV 분리물인 ATCC VR-838은 RPV 표본 및 RPV 게놈 DNA 제조에 사용되었다. 이 외에 사용가능한 분리물은 질병퇴치센터(CDC; Atlanta, GA)에서 소개한 V71-I-85A이다. RPV 표본은 둘베코(Dulbecco)의 변성된 이글(Eagle) 배지에서 0.01 PFU/cell의 감염 다원성(multiplicity)으로 VERO, CRFK 또는 MDCK 세포를 감염시켜서 제조되었다. 이 배양액은 2 nM의 글루타민, 100 units/ml의 페니실린, 100 units/ml의 스트렙토마이신으로 구성된다. (이러한 구성성분들은 Sigma 또는 동일 제조자로부터 공급되었으며, 이하 "DMEM 음성 배양액"으로 한다.) 감염전에 소태아 의 혈청 파편을 제거하기 위해 세포단층을 DMEM 음성 배양액으로 한 번 씻는다. 초기 접종물(10 cm 플레이트에 0.5 ml; T225 cm 플라스크에 10 ml)에 담겨진 RPV는 두 시간동안 세포단층에 흡수되도록 두고 30분마다 재분포시킨다.
이 기간이 지난 후에, 오리지날 접종물에 완전한 DMEM 음성 배양액을 보충하여 제시된 적정용량으로 맞춘다. (DMEM 음성 배양액+5% 태아 소의 혈청) 플레이트는 세포변성 효과를 나타낼 때까지 5% CO2에서 37℃로 배양한다.
배양액과 세포는 -70℃에서 50ml의 원추형 튜브(screw cap tube)에 모은 후 냉각시킨다. 37℃에서 바이러스를 해빙하여 1.0 ml 바이알에 나누어 넣고 -70℃로 다시 냉각시킨다. 역가는 보통 약 106 PFU/ml이다.
돈두바이러스(Swinepox virus, SPV) 표본 제조
SPV 표본은 Iscove의 변성된 둘베코(Dulbecco) 배양액(IMDM)과 2 nM의 글루타민, 100 units/ml의 페니실린, 100units/ml의 스트렙토마이신이 포함된 RPMI 1640 배양액 (이러한 구성성분들은 Sigma 또는 동일 제조자로부터 공급되었으며, 이하 "EMSK 음성 배양액"으로 한다)을 1:1로 섞은 혼합물에서 0.01 PFU/cell의 감염 다원성으로 돼지의 배자(embryo) 신장(EMSK) 세포, ESK-4 세포, PK-15 세포 또는 Vero 세포를 감염시켜 제조된다. 감염전에 소태아의 혈청 파편을 제거하기 위해 세포단층을 EMSK 음성 배양액으로 한 번 씻는다. 초기 접종물(10 cm 플레이트에 0.5 ml; T175 cm 플라스크에 10 ml)에 담겨진 SPV는 두 시간동안 세포단층에 흡수되도록 두고 30분마다 재분포시킨다.
이 기간이 지난 후에, 오리지날 접종물에 완전한 EMSK 음성 배양액을 보충하여 제시된 적정용량으로 맞춘다. (EMSK 음성 배양액+5% 소태아의 혈청) 플레이트는 세포변성 효과를 나타낼 때까지 5% CO2에서 37℃로 배양한다.
배양액과 세포는 -70℃에서 50ml의 원추형 튜브(screw cap tube)에 모은 후 냉각시켰다. 37℃에서 바이러스를 해빙하여 1.0 ml 바이알에 나누어 넣고 -70℃로 다시 냉각시킨다. 역가는 보통 약 106 PFU/ml이다.
RPV 또는 SPV DNA의 제조
라쿤폭스 바이러스(Raccoonpox virus) 또는 돈두바이러스 DNA를 분리하려면, VERO 세포(for RPV) 또는 EMSK 세포(for SPV)의 융합(confluent) 단층을 T225 ㎠ 플라스크에서 라쿤폭스 바이러스(Raccoonpox virus)(ATCC VR-838)로 0.1의 다원성으로 감염시킨 다음 세포가 100% 세포변성 효과를 나타낼 때까지 3-5일간 배양한다. 감염된 세포들을 배양액 안으로 긁어모아 원심분리기에서 3000 rpm으로 5분 간 원심분리한다. 배양액을 가만히 따라낸 뒤 세포 펠렛(pellet)을 조심스럽게 1.0 ml의 인산염 완충 식염수(Phosphate Buffer Saline, PBS: 물 1L 당 1.5g의 Na2HPO4, 0.2g의 KH2PO4, 0.8g의 NaCl 및 0.2g의 KCl이 포함됨)(per T175)에 다시 풀어준 다음 연속해서 두 번 냉각과 해동을 반복한다.(-70℃에서 37℃) 마지막 해동에서 냉각된 세포들을 30초씩 두 번 초음파처리를 하고, 그 사이에 45초간 냉각기(cooling time)를 갖는다. 세포 파편을 4℃의 HB4 회전자(rotor)에서 3000 rpm으로 5분 동안 원심분리한다. 상층액으로 나타나는 RPV 비리온을 4℃의 SS34 회전자에서 15,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 펠렛상태로 만든 후 10 nM Tris(pH 7.5)에서 다시 풀어준다. 이 파편(fraction)을 36% 수크로즈 그라디언트(sucrose gradient; w/v in 10 nM Tris pH 7.5)를 걸어 층을 만들고 4℃의 SW41 회전자(Beckman)에서 18,000 rpm으로 60분 간 원심분리한다.(Beckman L8-70M Ultracentrifuge) 비리온 펠렛을 1.0 ml의 10 nM Tris pH 7.5에 다시 풀어서 얼음에 박아둔 상태로 30초 동안 초음파처리한다.
이 파편을 또한 20%-50% 수크로즈 그라디언트를 걸어 위에 층을 만들고 4℃의 SW41 회전자에서 16,000 rpm으로 60분 간 원심분리한다. 그라디언트(gradient)보다 3/4정도 아래 위치한 RPV 비리온 결합을 모아서 20% 자당과 희석한 후 4℃의 SW41 회전자(Beckman)에서 18,000 rpm로 60분 간 원심분리하여 펠렛을 만든다. 최종적으로 만들어진 펠렛에 있는 수크로즈(자당)의 찌꺼기를 제거하기 위해 10 nM Tris pH 7.5로 한 번 씻고 마지막으로 10 nM Tris pH 7.5에 다시 풀어준다. RPV DNA는 최종 농도가 각각 20 nM, 0.5% 및 0.5 mg/ml로 EDTA, SDS 및 단백분해효소 K를 첨가하여 유도된 세포용해(60℃에서 4시간동안)로 인해 정제된 비리온으로부터 추출된다. 코딩작용 후에, 페놀:클로로포름(1:1)을 세 번 추출하고, 두 배의 100% 에탄올을 첨가하여 표본을 침전시키고 -20℃에서 30분 간 배양시킨다. 표본을 최고속도로 5분 동안 Eppendorf minifuge에서 원심분리한다. 상층액을 가만히 따르고 펠렛을 공기중에 건조시킨 뒤 4℃의 0.01 M Tris pH 7.5, 1 nM EDTA에서 다시 가수(rehydrated)시킨다.
FHV 바이러스 표본 제조
S-FHV-000은 ATCC(ATCC No. 636)으로부터 얻으며 S-FHV-001은 NVSL(NVSL Challenge Virus Strain SGE, Lot KS)로부터 얻는다. FHV 바이러스 표본은 2 nM의 글루타민, 100 units/ml의 페니실린, 100units/ml의 스트렙토마이신 및 5% 태아 소의 혈청이 포함된 Dulbecco의 변성된 Eagle 배양액(medium)(DMEM)(이러한 구성성분들은 Irvine Scientific 또는 동일 제조자로부터 공급되었으며, 이하 완전한 DME 배양액으로 명한다.)에서 1.0 PFU/세포의 감염 다원성으로 Crandell 고양이 신장(CRFK) 세포를 감염시켜서 준비한다. 세포변성효과가 완전히 나타난 뒤에 배양액과 세포를 모은 뒤 나누어서 -70℃로 냉각시킨다. 역가는 약 1x107에서 1x108 PFU/ml이다.
헤르페스바이러스 DNA의 제조
CRFK 세포의 융합단층을 25 ㎠ 플라스크 또는 60 mm 페트리접시(petri dish)에서 100ml의 바이러스 표본으로 감염시켰다. 하루 밤동안 배양하거나 100% 세포변성 효과가 나타나면 세포를 배양액속으로 긁어 넣는다. 세포와 배양액은 임상의 원심분리기에서 3000 rpm으로 5분 간 원심분리한다. 배양액을 가만히 따른 후 세포 펠렛을 0.5% NONIDET P-40을 포함한 0.5 ml 용액에 조심스럽게 다시 풀어준다. (0.5% NONIDET P-40은 분자당 평균 9 몰의 에틸렌 산화물을 포함하는 옥틸 페놀 에틸렌 산화물 응축액이고 NP-40는 St. Louis에 있는 Sigma Chemical Co.에서 구입) 표본은 실온에서 10분 간 배양시킨다. 여기에 10 ml의 RNase A(St. Louis의 Sigma Chemical Co.)의 스톡(stock) 용액(10 mg/ml). 을 첨가하여, 불활성 DNAse가 되도록 10분 간 가열한다. 표본이 환핵이 되도록 원심분리한다. DNA 펠렛을 파스퇴르 피펫 또는 나무 막대기로 제거한 후 버린다. 상층액을 25 ml의 20% 도데실 황산나트륨(Sigma)과 25 ml의 단백분해효소-K(10 mg/ml; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis)가 들어있는 1.5 ml의 Eppendorf 튜브로 가만히 따른다. 표본을 섞어서 37℃에서 30-60분 간 배양한다. 물이 포화된 페놀을 동량 첨가하고 표본을 잠깐 섞는다. 표본을 Eppendorf minifuge에서 최고속도로 5분 간 원심분리한다. 상층의 수성(水性)부분은 새로운 Eppendorf 튜브로 제거해내고, 두 배의 100% 에탄올을 첨가한 뒤 핵산이 떨어지도록 튜브를 -20℃에 30분 간 둔다. 그런 다음 표본을 Eppendorf minifuge에서 5분 간 원심분리한다. 상층액을 조심스럽게 따른 후 펠렛을 건조시켰다가 16ml 물로 다시 수화시킨다. 많은 양의 DNA를 제조하기 때문에, 처음부터 roller bottle이나 175 ㎠ 플라스크의 CRFK 세포로 시작한다. DNA는 4℃의 0.01 M Tris pH 7.5, 1 nM EDTA에 저장하였다.
재 조합 바이러스 생산을 위한 DNA 형질감염
이 방법은 Graham과 Van der eb[25]의 인산칼슘 과정을 근거로 다음과 같은 변형을 주었다. 바이러스 및/또는 플라스미드 DNA는 0.01 M Tris pH 7.5, 1 nM EDTA에서 298ml로 희석되었다. 40ml의 2M Cacl2를 첨가한 뒤 동량의 2X HEPES를 식염수에 완화시킨다. (물 1리터당 10g의 N-2-하이드록시에틸 피페라진 N'-2-에탄설폰산(HEPES), 16g의 NaCl, 0.74g KCl, 0.25g Na2HPO4-2H2O, 2g dextrose를 넣고, NaOH to pH 7.4로 완충한다) 혼합물을 10분 동안 얼음위에서 배양한 뒤, dropwise를 60 mm 페트리접시내 5ml 의 배양액(DME + 5% 태아 소의 혈청)에서 증식되는 CRFK 세포의 80% 융합단층에 첨가한다. 세포는 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃로 4시간동안 배양된다. 플레이트 중앙을 흡인하여 세포를 1xPBS(1.15g Na2HPO4, 0.2g KH2PO4, 0.8g NaCl, 0.2g Kcl per liter H2O)에서 1분간 20% 글리세롤로 처리한다. 세포를 세 번 5ml의 1XPBS로 씻어내고 5ml의 배양액(DME + 5% 태아 소의 혈청)을 넣어준다. 바이러스가 세포변성 효과를 50-100% 나타낼 때까지 세포를 위와 같은 방법으로 37℃에서 배양한다. 바이러스 스톡을 제조하기 위해 앞서 언급한 바와 같이 바이러스를 모은다. 이 스톡을 트랜스펜션 스톡이라 하며 효소성 표지 유전자를 발현하는 재조합 헤르페스 바이러스에 대한 스크린(Screen for Recombinant Herpesvirus Expressing Enzymatic Marker Genes)으로 재조합 바이러스에 대해 스크린된다.
감염된 세포용해액(cell lysates)의 제조
세포 용해액 제조에 혈청이 없는 배양액을 사용하였다. 25 ㎠ 플라스크 또는 60 mm 페트리접시에서 세포(VERO, CRFK, 또는 MDCK)의 융합단층을 100 ㎕의 바이러스 표본으로 감염시켰다. 세포변성효과가 완전히 나타난 후에 배양액과 세포를 모으고 세포는 임상 원심분리기에서 300 rpm으로 5분간 펠렛으로 만든다. 세포펠렛을 250 ㎕의 분열완충액(2% 도데실 황산나트륨, 2% β-mercapto-ethanol)으로 다시 풀어준다. 표본은 얼음에서 30초 동안 초음파처리된 후 -20℃에 저장된다.
웨스턴 블럿팅 과정(Western blotting procedure)
용해액과 단백질의 표본은 Laemnli의 방법에 따라 폴리아크릴아마이드겔(polyacrylamide gel)에 넣었다. 겔전기영동 후에 단백질들은 전이되고, Sambrook와 그의 연구진(1989)에 의한 과정을 따른다. 일차항체는 Tris-염화나트륨과 sodium Azide(TSA: 6.61g Tris-HCl. 0.97g Tris-base, 9.0g NaCl 2.0g Sodium Azide per liter H2O)에 있는 5% 무지방 건유(non-fat dry milk)로 1:100으로 희석되었다. 이차항체는 알칼라인 인산효소와 결합되고 TSA와 1:1000으로 희석되었다.
분자생물학적 기술
박테리아 및 DNA의 조작기술에는 다음과 같은 내용들이 포함된다. 억제 엔도뉴클레아제 코드화, 겔 전기영동법, 겔에서 DNA 추출, 결찰, 키나아제 인산화, 인산효소 치료, 세균배양의 증식, DNA를 지닌 박테리아의 형질변환 및 기타 분자생물학 방법등이 해당하며 이는 삼브룩(Sambrook)과 그의 동료들(1989) 및 분자생물학의 Current Protocol(1992)에서 소개한 것이다. 언급된 내용외에 다음에 소개하는 내용들은 경미한 변화에 사용된다.
DNA 서열분석
DNA 서열분석은 제조자의 지시에 따라 Amplitaq DNA 중합효소, FS(Perkin- Elmer)가 있는 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit를 이용하여 형광의 디데옥시 시퀀싱 반응을 수행하고, 를 Perkin-Elmer/Applied Biosystems의 자동화된 DNA 시퀀싱 모델 373A상에서 전기영동한다. 압박부위를 명확히 하기위해 dGTP 합제(mix)와 dITP 합제를 모두 사용하여 반응을 수행한다. 또는 압박 부위를 포름아마이드(formamide) 겔상에서 용해시킨다. 주형은 이중나선 플러스미드 소클론 또는 단일나선의 M13 소콜론이며, 그리고 프라이머는 시퀀싱이 되도록 외부에서 주입되어 벡터가 되거나 이전에 얻어진 서열이 된다. 얻어진 서열은 DNAStar 소프트웨어를 이용하여 조합하여 비교한다.
중합효소 결합작용에 의한 클론화
중합효소 결합작용(PCR)은 다양한 DNAs 조작에 용이한 억제부위 유도에 사용되었다. 사용된 방법은 Innis와 그의 동료들에 의해 소개되었다(1990). 일반적으로 증폭된 부분단편은 500쌍 이하의 염기쌍을 지나고 있으며 증폭된 부분단편의 분리부분은 DNA 서열분석한다. 각각에 사용된 프라이머에 대하서는 다음에 소개되는 상동벡터의 구성에서 자세하게 소개될 것이다.
재조합 RPV, SPV 또는 FHV 바이러스를 생산하는 동종 재조합 과정
이 방법은 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스 DNA와 플라스미드 상동벡터 DNA간의 상동적인 재조합에 의하며, 이는 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스 DNA 및 트랜스펙션된 플라스미드 상동벡터를 모두 포함하는 조직배양세포에서 발생한다. 상동적 인 재조합이 일어나려면, 복제된 RPV(예: DNA 합성)을 세포로 유도하기 위해 세포의 단층(MDCK, CRFK 또는 VERO)을 0.01 PFU/cell의 감염다원성으로 S-RPV-000(ATCC VR-838) 또는 S-SPV-001 또는 S-FHV-001로 감염시킨다. 플라스미드 상동벡터 DNA는 감염-트랜스펙션 방법(INFECTION-TRANSFECTION PROCEDURE)에 따라 이 세포내로 트랜스펙션시킨다. 이 방법에 사용되는 상동벡터의 제조는 다음과 같다.
감염-형질감염 방법(INFECTION-TRANSFECTION PROCEDURE)
약 80% 융합된 6cm 플레이트의 세포들(MDCK, CRFK 또는 VERO)을 DMEM 음성 배양액에서 0.01 PFU/cell의 감염다원성으로 S-RPV-000(ATCC VR-838) 또는 S-SPV-001 또는 S-FHV-001로 감염시킨 후 가습된 5% 이산화탄소 환경으로 37℃에서 2-3시간 동안 배양한다. 트랜스펜션과정에는 LipofectinTM 시약(BRL)이 사용된다. 각 6cm 플레이트에 15㎍의 플라스미드 DNA를 물을 섞어 100㎕로 희석시킨다. 이와 구별하여 50㎍의 Lipofectin 시약에 물을 섞어 100㎕로 희석시킨다. 희석된 100㎕의 Lipofectin에 희석된 플라스미드 DNA를 떨어뜨려 폴리스틸렌 5ml의 snap cap 튜브에 담아 조심스럽게 섞어준다. 혼합물을 실온에서 15-20분 간 배양한다. 이 기간동안 바이러스 이노칼럼(inoculum)은 6cm 플레이트에서 제거되고 세포단층은 DMEM 음성 배양액으로 한 번 씻어낸다. 3ml의 DMEM 음성 배양액을 플라스미드 DNA/Lipofectin 혼합물에 가하여 이를 세포 단층에 피펫으로 떨어뜨린다. 이 세포를 가습된 5% 이산화탄소 환경으로 37℃에서 약 16시간동안 배양한다. 다음 날 3ml의 DMEM 음성 배양액을 제거하고 5ml의 DMEM 완전 배양액을 넣는다. 바이러스에서 세포변성 효과를 80-100% 나타낼 때까지 이 세포를 5% CO2에서 37℃로 3-5일 간 배양한다. 바이러스 스톡(stock)을 제조하기 위해 앞서 언급한 바와 같이 바이러스를 모은다. 이 스톡은 트랜스펙션 스톡으로 명하며 재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스에 대한 BLUOFAL SCREEN또는 재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스에 대한 CPRG SCREEN에 따라 재조합 바이러스에 대한 스크린을 실시한다.
β-갈락토시다아제(BLUOGAL and CPRG 분석법) 또는 β-글루쿠로니다아제(X-GLUC 분석법)를 발현하는 재조합 RPV, SPV 또는 FHV에 대한 스크린
대장균 β-갈락토시다아제(lacZ) 표지 유전자가 재조합바이러스와 결합하면 재조합체를 함유한 플라그가 다음의 두 방법으로 나타난다. 첫 번째 방법에서 화합물 BluogalTM(Lifr Science Technology, Bethesda, MD)은 플라그 분석실험동안 한천에 결합하여 활성 β-갈락토시다아제를 발현하는 플라그를 청색으로 나타낸다. 청색 플라그를 새로운 세포(MDCK, CRFK 또는 VERO)로 이동시켜서 더욱 푸른 플라그를 분리하여 정제한다.
두 번째 방법은 CPRG(Boehringer Mannheim)을 플라그 분석실험동안 한천에 결합하여 활성 β-갈락토시다아제를 발현하는 플라그는 적색을 나타낸다. 적색플라그를 새로운 세포(MDCK, CRFK 또는 VERO)로 이동시켜서 더욱 붉은 플라그를 분리하여 정제한다. 두 방법에서 바이러스는 전형적으로 3-4번의 플라그 정제과정을 거쳐 정제되었다.
대장균 β-글루쿠로니다아제(uidA) 표지 유전자를 재조합바이러스와 결합하 면 재조합체를 함유한 플라그가 염색기질인 X-beta-D-gluUA CHX (X-GLUC; 5-Bromo-4-Chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, cyclohexylammonium salt; Biosynth AG; Switzerland)을 이용하여 나타난다. 이 염색기질은 플라그 분석실험동안 한천에 결합하여 활성 β-글루쿠로니다아제를 발현하는 플라그를 청색으로 나타낸다. 청색 플라그를 새로운 세포(MDCK, CRFK 또는 VERO)로 이동시켜서 더욱 푸른 플라그를 분리하여 정제한다.
블랙플라그 분석법을 이용한 재조합 RPV내의 외래 유전자 발현에 대한 스크린
재조합 라쿤폭스(raccoonpox)에 의해 발현되는 외래항원의 발현을 분석하기 위해서는 단층세포(MDCK, CRFK, VERO 또는 ESK-4)를 재조합 RPV, SPV 또는 FHV 바이러스로 감염시킨다. 그런 다음 영양 한천 배지에 두어 플라그가 나타나도록 37℃에서 3-5일 동안 배양한다. 덮혀있는 한천를 제거하고 세포를 100% 메탄올로 실온에서 10분간 고정시킨다. 특이 표면항원 발현은 비고정 세포를 이용하여 검출되는 반면, 세포를 고정시키면 표면항원 검출뿐만 아니라 세포질 항원을 나타낸다. 일차항원은 1X blotto(5% non-fat dry milk in Tris-염화나트륨, sodium Azide(TSA: 물 1리터당 6.61g Tris-HCl, 0.97g Tris-base, 9.0g NaCl 및 2.0g sodium Azide)로 적당히 희석하여 세포단층에서 실온으로 2시간동안 배양한다. 결합하지 않은 항체는 TS 완충액으로 실온에서 세 번 씻어내 제거한다. 이차항체인 알카라인-인산염 결합체는 1X blotto와 1:1000으로 희석하여 실온에서 세포와 함께 배양한다. 결합하지 않은 이차항체는 세포를 실온에서 TS 완충액(물 1리터당 6.61g Tris-HCl, 0.97g Tris-base 및 9.0g NaCl)으로 세 번 씻어내어 제거한다. 그런 다음 세포를 실온에서 제조된 기질용액에 15-30분 간 배양한다.(100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100nM NaCl, 5nM MgCl2, 0.3 mg/ml Nitro Blue Tetrazolium 및 0.15 mg/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-Indoyl Phophatase) 정확한 항원을 발현하는 플라그는 검은색을 나타낸다, 색반응의 진행을 멈추기위해 고정액(20nM Tris-HCl, pH 2.9 및 1nM EDTA)을 사용한다.
블랙플라그 분석법을 이용한 재조합 SPV, RPV 또는 FHV내의 고양이의 CD80(B7-1) 및 CD86(B7-2) 발현에 대한 스크린
재조합 돈두 바이러스, 라쿤폭스(raccoonpox) 또는 고양이의 헤르페스바이러스에 의해 발현되는 CD80 및 CD86 공동자극(costimulatory) 분자의 발현을 분석하기 위해서는 단층세포(MDCK, CRFK, VERO 또는 ESK-4)을 CD80 또는 CD86을 발현하는 재조합 RPV, SPV 또는 FHV 바이러스로 감염시킨다. 그런 다음 한천 배지에 두어 플라그가 나타나도록 37℃에서 3-5일 동안 배양한다. 덮혀있는 한천를 제거하고 세포를 100% 메탄올로 실온에서 10분간 고정시켜 건조하거나 고정시키지 않거나 고정시키지 않고 즉각 1X PBS로 처리한다. 비고정 세포를 이용하여 특이 표면 항원 발현을 검출하는 반면, 세포를 고정시키면 표면항원 검출뿐만 아니라 세포질 항원이 나타난다. huCTLA-4/Fc 키메라(R&D Systems, Minn. MN, cat. #325-CT)는 1X blotto(Tris-염화나트륨(TS: 6.61g Tris-HCl, 0.97g Tris-base, 9.0g NaCl per liter 물)에 있는 5% non-fat dry milk)로 적당하게 희석하여 세포단층에서 실온으로 2시간 동안 배양한다.
결합하지 않은 키메라를 실온에서 TS 완충액으로 세 번 씻어내어 제거한다. 검출항체, 단일클론 항-huIgG1 fc 알칼라인-인산염 결합체(Zymed, cat. 05-3322)는 1X blotto로 적당하게 희석시켜서 세포와 함께 실온에서 2시간 동안 배양한다. 결합하지 않은 검출항체를 실온에서 TS 완충액(TS: 6.61g Tris-HCl, 0.97g Tris-base, 9.0g NaCl per liter 물)으로 세 번 씻어내어 제거한다. 세포를 새로 준비된 기질용액(100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100nM NaCl, 5nM MgCl2, 0.3 mg/ml Nitro Blue Tetrazolium 및 0.15 mg/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-Indoyl Phophatase)과 함께 실온에서 15-30분 간 배양한다. CD80 및 CD86를 발현하는 플라그는 검은색을 나타낸다. 색반응의 진행을 멈추기위해 고정액(20nM Tris-HCl, pH 2.9 및 1nM EDTA)을 사용한다.
VSV 플라그 리덕션을 이용한 재조합 SPV, RPV 또는 FHV에서 발현되는 고양이의 인터페론 감마 생동성(bioactivity) 스크린
CRFKS 또는 96-웰(well) 플레이트에 있는 고양이의 적절한 세포계를 IFNgamma를 발현하는 재조합 바이러스로 감염된 세포의 상층액으로 처리하여 37℃에서 6-12시간 배양한다. VSV 바이러스(100-1000 particles/well)를 적당한 웰에 가하여 24시간동안 배양하거나 웰에 세포만 남도록 완전히 분해한다. 1X PBS로 웰을 세 번 씻어주고 100% 메탄올로 단층을 고정한 후 건조시킨다. 0.05% 크리스탈 바이올렛(Crystal violet) 용액을 모든 웰에 가하여 실온으로 10분간 둔 다음 건조시킨다. 보라색이 나타나는 웰을 기록한다. 건강한 단층 세포를 crystal violet으로 염색한다. IFN 감마 활성에 의한 상층액은 VSV에 의한 세포분해에 대해 CRFKS를 보호하고 보라색을 나타낸다.
진단제로 사용되는 바이러스 당단백의 정제화 과정
바이러스 당단백은 항체 친화성 칼럼을 이용하여 정제된다. 단일클론 항체들을 생산하기 위해 8-10주 된 BALB/c 암컷 쥐에게 107 PFU의 라쿤폭스(raccoonpox) 바이러스 재조합체를 2-4 주 간격으로 복강내에 접종한다. 접종한 지 3주 후에, 쥐에게 복강내로 40mg의 바이러스 당단백을 주사한다. 마지막으로 항원을 주입한 후 3일 뒤에 쥐의 비장을 떼어낸다.
비세포와 쥐의 NS1/Ag4 형질세포종 세포를 Oi와 허젠베르그(Herzenberg)가 변형한 방법으로 융합한다. 비세포와 형질세포종 세포를 함께 10분동안 300 x g로 원심분리하여 환으로 만든다. 50% 폴리에틸렌 글라이콜 용액(m.w. 1300-1600) 1ml를 세포 펠렛에 섞어 1분 간 저어준다. Dulbecco의 변성된 Eagles 배양액(5ml)을 3분 간 세포에 가한다. 세포를 10분동안 300 x g로 원심분리하여 펠렛으로 만든다음 100 mM의 하이포크산틴(hypoxanthine), 0.4 mM의 아미노프테린(aminopterin) 및 16 mM 티미딘(thymidine)(HAT)를 포함하는 10% 태아 소의 혈청에서 풀어준다. 100ml의 정상 비세포를 포함한 8-10개의 96-웰 조직배양 플레이트의 웰에 세포(100ml)를 가하여 37℃에서 배양한다. 3-4일 마다 신선한 HAT 배양액을 공급한다.
100 ng의 바이러스 당단백으로 코팅된 96-웰 마이크로티터 플레이트에서 하이브리도마 배양 상층액을 ELISA 검사한다. 반응하는 하이브리도마 상층액을 블랙플라그 분석법 및 웨스턴 블럿(Western Blot)으로 분석한다. 선택된 하이브리도마를 한정희석법으로 두 번 클론화한다. 5×106 하이브라도마 세포를 프리스탄이 투여된 BALB/c 쥐에게 복강내로 주입하여 아세틱 플루이드(ascetic fluid)를 만든다.
라쿤폭스(raccoonpox) 바이러스 재조합체에서 감염세포 용균제제(Preparation of Infected Cell Lysates)에 소개된 대로 세포용해액을 얻는다. 당단백을 포함하는 세포용해액(100mls)을 20mg의 당단백 단일클론 항체가 제조자의 방법(AFC Medium, New Brunswick Scientific, Edison, N.J.)에 따라 고정된 2ml의 한천 친화성 레신을 통과시킨다. 비특이적인 결합물질을 제거하기 위해 인산염 완충액에 들어있는 0.1% Nonidet P-40의 100ml로 칼럼을 씻어준다. 결합한 당단백을 pH 10.6(40)인 100 mM의 탄산염 완충액으로 용출시킨다. ELISA 시스템에서 RPV 단일클론 항체에 대한 반응으로 용출이전 및 이후의 물질의 순도를 위해 모니터한다.
ELISA 검사
효소결합면역흡착검사(ELISA) 프로토콜은 접종이나 항원투여 후 동물의 면역상태를 결정하는데 사용된다. 당단백 항원용액(100ml at ng/ml in PBS)은 4℃에서 18시간동안 미량역가 접시(microtitier dish)의 웰을 흡수하도록 둔다. 코팅된 웰을 PBS로 한 번 씻는다. 1% BSA(Sigma)를 함유한 250ml의 PBS로 웰을 봉쇄하여 37 ℃에서 1시간 동안 배양한다. 그런 다음 0.02% Tween 20을 함유한 PBS로 봉쇄된 웰을 한 번 씻어준다. 50ml의 실험혈청(이전에 1% BSA를 포함한 PBS에 1:2로 희석됨)을 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 항혈청을 제거하고 웰을 0.02% Tween 20을 함유한 PBS로 세 번 씻어준다. 특이항원에 대한 항체를 포함하는 웰이 가시화되도록 horseradish 페록시다제(1% BSA를 포함한 PBS에 1:500으로 희석됨, Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.)에 결합된 소의 항IgG 50ml의 용액을 첨가한다. 이 용액을 37℃에서 1시간 동안 배양한 다음 제거하고 웰을 0.02% Tween 20을 함유한 PBS로 세 번 씻어준다. 100ml의 기질용액(ATBS, Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.)을 각 웰에 첨가하여 색이 변하도록 15분동안 둔다. 0.1 M 수산을 첨가하여 작용을 마무리한다. 자동 플레이트 판독기에서 흡수도 410 nm으로 색을 판독한다.
합성 두진 바이러스 프로모터의 구성을 위한 전략
재조합 돈두벡터에 대해 합성 두진 프로모터가 외래 유전자 발현의 강도와 시간을 조절하는 능력과 같은 이점을 제공한다. 백시니아 바이러스(vaccinia virus)로밝혀진 프로모터에 근거한 세 개의 프로모터 카세트인 LP1, EP1 및 LP2가 고안되었다. 각 카세트는 어떤 조합으로도 카세트와 결합할 수 있는 억제부분이 측면으로 연결된 백시니아로 밝혀진 DNA 염기서열을 내포하도록 고안되었다. 프레임 융합이 EcoRI 또는 BamHI부분에 형성되는 것 처럼 개시인자인 메치오닌은 또한 각 카세트내에 고안되었다. 세 개의 판독 프레임에서 변위된 정지 코돈(stop codons) 과 초기에 변위된 말단부 신호는 또한 프레임 융합부위의 하류에서 처리한다. DNA를 코딩하는 각각의 카세트는 표준 기술에 따라 합성되고 적절한 상동벡터내에서 클론화된다.
CD80의 초기 부분 단편 분리
mRNA는 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 16시간동안 Con A로 자극하여 추출하며, RNAzolB RNA 추출시약(Biotexc, Houston, TX)을 이용한다. 처음에 cDNA는 올리고 dT를 3' 프라이머로 이용하는 역전사 반응으로 이 RNA에서 유도된다. 간단히 말해서 RNA와 올리고 dT는 이차적인 구조를 제거하기 위해 75℃가 되도록 3분 동안 가열되었다. RT, dNTP, buffer 및 증류수가 첨가되고 이 혼합물은 42℃에서 1 시간동안 배양된다. 배양 후에 이 표본은 RT를 불활성화하기 위해 95℃가 되도록 5분 간 가열한다. 사람 및 쥐의 CD80 서열(GeneBank, Gaithersburg, MA)내 보존부분에서 유도된 변질된 프라이머는 유전자의 불변 도메인에 있는 중심부분을 코딩하는 344 누클레오타이드 부분단편의 초기 증폭에 사용된다.
5' 프라이머 B7-2 GGC CCG AGT A(CT)A AGA ACC GGA C(SEQ ID NO: 56)
3' 프라이머 B7-3 CAG (AT)TT CAG GAT C(CT)T GGG AAA (CT)TG(SEQ ID NO: 57)
Taq 중합효소를 이용하는 핫 스타트(hot start) 중합효소 결합작용(PCR) 프로토콜은 산물을 증폭하는데 사용된다. 핫 스타트(hot start) 단계에서 Taq 효소가 결여된 작용 혼합물을 처음에 95℃가 되도록 5분 간 가열하며 이는 프라이머 이량 체의 형성을 막기 위함이다. 온도 순환과정(temperature cycle)이 시작하기 전에 효소를 첨가한다. PCR 반응은 두줄기 DNA를 용해하기 위해 95℃가 되도록 5분 간 가열한다. 그런 다음 변성된 프라이머의 어닐링(annealing)이 용이하도록 작용을 42℃로 30초간 낮춘다. 낮은 어닐링(annealing) 온도는 100% 상동이 아닌 프라이머 결합을 용이하게 하는데 이용된다. 이 작용은 Taq 중합효소가 프라이머를 늘리고 상대 DNA 가닥을 복사하는데 적정온도인 72℃가 되도록 45초 간 가열된다. 온도 순환과정은 30번 반복된다. 그런 다음 어떤 불완전한 산물이라도 늘리는데 용이하도록 72℃에서 7분간 가열된다. 1% 한천 겔에 가시화한 후, 이 물질을 시퀀싱하기 위해 TA 클로닝 벡터(InVitrogen, San Diego, CA)에 16℃로 하루 밤동안 결찰해둔다. 결찰작용의 2ml를 InvaF 세포를 형질전환하는데 사용한다. 형질전환된 박테리아를 x-gal의 50mg/ml 용액의 40ml로 코팅된 LB 플레이트(50 mg/ml 암피실린)에 길게 긁어둔다(streak한다. ) 다음 날, 흰색 부분을 떼내서 100mg/ml의 암피실린이 포함된 5ml의 LB 배지에서 배양시키고 225 rpm으로 흔들어 37℃에서 하루 밤동안 둔다.
정확하게 삽입된 플라스미드를 내포한 클론을 결정하기 위해 하루 밤동안의 짧은 배양기간을 갖는다. 플라스미드는 표준 알카라인 분해방법을 이용한 배양물에서 페놀:클로로포름 추출(Maniatis, 1982)로 정제된 DNA로 추출된다. 이 DNA를 2 배의 에탄올에 떨어뜨리고 EcoRI로 코드화시킨다. 제대로 삽입된 플라스미드를 지닌 콜로니를 결정하기 위해 코드화물을 1% 한천 겔에 가시화한다. 그런 다음 플라스미드를 양성 클론에서 정제하고 Sequenase based(USB, Cleveland, OH) S35 방사표시된 디데옥시 터미네이터 시퀀싱 또는 형광염료 터미네이터 싸이클 시퀀싱(terminator cycle sequencing)(Perkin Elmer, Norwalk CT)를 이용하여 서열분석한다. cDNA의 서열에서, cDNA 말단(RACE) 작용의 5' 빠른 증폭 및 3'의 변위되지 않은 부분(UTR)으로부터 변질된 프라이머와 연결된 3' 서열의 유도를 위해 특이 3' 및 5' 프라이머를 만든다.
CD80의 5' 결합부위 분리
마라톤(Marathon) cDNA 증폭 프로토콜(Clonetech, Palo Alto, CA)을 사용하여 유전자의 5' 서열을 유도되도록 하였다. mRNA는 Con A로 12시간 그리고 뒤이어 LPS로 4시간 자극받은 PBMC에서 생산되었다. 이런 mRNA는 ULTRASPEC(Biotexc, Houston, TX) RNA 추출시약을 이용하여 추출되었다. cDNA는 폴리 A 꼬리(poly A tail)의 5' 말단에 프라이머의 결합이 용이하도록 5' 종단부에 변성된 누클레오타이드를 지닌 앵커(anchor) 올리고 dT로 생산되었다. 그런 다음 cDNA는 앞서 언급한대로 전사되었다. 특이 링커는 T4 DNA 리가아제를 지닌 cDNA에 연결된다. Touchdown PCR은 이전에 증폭된 부위에 특이하는 내부 3' 프라이머를 지닌 cDNA에서 일어난다.
B7-284 : TTA TAC TAG GGA CAG GGA AG(SEQ ID NO: 58)
B7-190 : AGG CTT TGG AAA ACC TCC AG(SEQ ID NO: 59)
그리고 고착(anchor) 프라이머는 연결된 링커의 서열을 보완한다. KlenTaq 중합효소 믹스(Clonetech, Palo Alto, CA)를 이용한 PCR 범위는 다음과 같다.: 95℃에서 5분 1 cycle; 95℃에서 30초, 72℃에서 30초 및 68℃에서 45초 5cycle; 95 ℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 68℃에서 45초 25cycle. 이 작용의 1ml를 50 ml의 물에 희석시키고 이 희석액의 5ml를 네스티드(nested) PCR 반응에 사용하며(95℃에서 5분 1 cycle; 95℃에서 30초, 65℃에서 30초 및 68℃에서 45초 30 cycle KlenTaq 중합효소 믹스이용) 이 작용에는 링커 특이 고정 프라이머와 초기 프라이머의 5'에 위치한 유전자에 특이적인 3' 프라이머를 이용한다(도 6).
B7-20 : TTG TTA TCG GTG ACG TCA GTG(SEQ ID NO: 60)
B7-135 : CAA TAA CAT CAC CGA AGT CAG G(SEQ ID NO: 61)
각 작용의 20ml를 1.5% 한천 겔에 나타내고 겔에서 적절한 부분단편을 잘라낸다.
cDNA는 겔분무기와 micropure 0.22mm 필터(Amicon, Beverly, MA)를 통해 한천 겔 조각을 원심분리하여 추출하고 정제한다. 정제된 DNA는 염색 터미네이터 싸이클 시퀀싱(Perkin Elmer, Norwalk, CN)을 이용하여 직접 서열을 분석한다.
CD80의 3' 결합부위 분리
유전자의 3' 부분은 344 ntd 부분단편과 이전에 서열분석된 5' 부분에서 5개의 유전자 특이 프라이머를 선택하여 유도하였다.
B7-s220 GTC ATG TCT GGC AAA GTA CAA G(SEQ ID NO: 62)
B7-50 CAC TGA CGT CAC CGA TAA CCA C(SEQ ID NO: 63)
B7-140 CTG ACT TCG GTG ATG TTA TTG G(SEQ ID NO: 64)
B7-550 : GCC ATC AAC ACA ACA GTT TCC(SEQ ID NO: 65)
B7-620 : TAT GAC AAA CAA CCA TAG CTT C(SEQ ID NO: 66)
사람과 쥐의 CD80 3' UTR의 잘 보존된 부분에서 변질된 3' 프라이머를 선택한다.
B7-1281 G(A/G)A AGA (A/T)TG CCT CAT GA(G/T) CC(SEQ ID: NO
67)
B7-1260 CA(C/T) (A/G)AT CCA ACA TAG GG(SEQ ID NO: 68)
cDNA는 ULTRASPEC(Biotexc, Houston, TX)를 이용하여 앞서 소개한 대로 Con A와 LPS로 자극된 PBMC에서 추출된 RNA로부터 생산되었다.
고정된 올리고 dT는 cDNA에 대한 RNA 전사에 초기 3' 프라이머로 사용되었다. Taq 중합효소에 의한 PCR 반응은 이 cDNA를 가지고 특이 5' 프라이머와 디제너레이트(degenerate) 3' 프라이머를 이용하여 수행한다(95℃에서 5분 1 cycle; 95℃에서 30초, 42℃에서 30초 및 72℃에서 45초 30cycle; 72℃에서 7분).
정확한 크기의 단일 부분단편이 생산되기 전에 준비작용이 2회 요구된다. 이 산물은 1.5% 한천 겔로 절단되고 앞서 소개한 바와 같이 정제되며 염색 터미네이터 싸이클 배열(dye terminator cycle sequence)로 서열분석한다(Perkin Elmer, Norwalk, CN).
5' 과 3'의 서열 데이터로부터, 프라이머는 고양이의 CD80유전자의 전체 개판독구간(OPEN READING FRAME)을 코딩하는 부분을 확장하도록 조립된다:
B7 START : ATG GGT CAC GCA GCA AAG TGG(SEQ ID NO 69)
B7-960 : CCT AGT AGA GAA GAG CTA AAG AGG C(SEQ ID NO 70)
이전에 생산되었고 유전자를 코딩하는 DNA를 포함한 것으로 알려진 PBMC cDNA가 사용되었다. 이 PCR 반응(95℃에서 5분 1 cycle; 95℃에서 30초, 42℃에서 30초 및 72℃에서 45초 30cycle; 72℃에서 7분)은 KlenTaq DNA 중합효소를 사용하였다. 이 중합효소는 종종 Taq 중합효소와 관련되는 실수를 줄이기 위해 5' exonuclease 활성을 보유한 효소꼬리이다. 이 작용은 TA 클론닝 벡터(InVitrogen, San Diego, CA)에서 클론화되고 앞서 소개한 바와 같이 시퀀싱되는 960개의 염기쌍(bp) 부분단편을 증폭시킨다. 이 유전자의 최종 염기배열에는 두 마리의 동물에게서 얻은 cDNA가 포함된다. 이 유전자의 각 염기쌍은 개별적인 PCR 반응에서 유도된 최소한 세 개의 서열에서 독립적으로 확인되는데 이는 PCR에 의한 에러 가능성을 낮추기 위함이다.
CD28의 초기 부분단편 분리
mRNA는 16시간 동안 Con A로 자극된 HK5 말초혈액 림프구에서 RNAzolB RNA 추출시약(Biotexc, Houston, TX)을 이용하여 추출되었다. 처
음에 cDNA는 3' 프라이머로 올리고 dT를 이용하는 역전사(RT)작용으로 이 RNA에서 유도되었다. 간단히 말해서 RNA와 올리고dT는 이차구조를 제거하기 위해 75℃에서 3분 간 가열된다. RT, dNTP, buffer 및 증류수를 첨가하여 이를 42℃에서 1 시간동안 배양한다. 배양 후에 표본을 RT가 불활성화되도록 5분 동안 95℃로 가열한다. 핵산 염기배열로 공고된 사람, 쥐 및 토끼의 CD28에서 발견되는 잘 보존된 부분에서 유도된 변질된 (degenerated) 프라이머는 개시해독 프레임(open reading frame)의 대부분을 코딩하는 673 ntd 부분단편의 초기 증폭에 사용되었다.
CD28-113 : CAA CCT TAG CTG CAA GTA CAC (SEQ ID NO 71)
CD28-768 : GGC TTC TGG ATA GGG ATA GG (SEQ ID NO 72)
Taq 중합효소를 이용하여 고온에서 시작하는 PCR 프로토콜은 이 산물(95℃에서 5분 1cycle; 95℃에서 30초, 48℃에서 30초 및 72℃에서 45초, 30 cycle; 72℃에서 7분, 1cycle)을 증폭시키는데 사용되었다. 이 부분단편을 1% 한천겔에 나타내서 TA 클론닝 벡터(InVitrogen, SanDiego, CA)내로 연결시키고 앞서 소개한 바와 같이 시퀀싱한다. 특이 3' 프라이머는 5' RACE 작용에 사용되기 위해 cDNA의 염기배열에서 유도되고 합성된다.
CD28 190 : CGG AGG TAG AAT TGC ACT GTC C(SEQ ID NO 73)
CD28 239 : ATT TTG CAG AAG TAA ATA TCC(SEQ ID NO 74)
CD28의 5' 결합부위 분리
변성된 GIBCO 5' RACE 프로토콜(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)는 고양이의 CD28 분자네 남아있는 5' 서열을 얻는데 시용되었다. RNA는 16 시간동안 Con A로 자극된 PBMC에서 추출되었다. 3' 유전자 특이 프라이머는 cDNA의 첫 번째 가닥을 합성하는데 이용되었다. RNA와 프라이머는 다른 RT 시약을 첨가하기 전에 5분 동안 75℃로 가열되었다. 변성과정은 다음과 같다. 혼합물을 4℃로 식혀서 작용 완충액, 염화마그네슘, dNTP, DTT 및 SuperScript RT(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)를 첨가 한다. RT 혼합물을 42℃에서 30분 간 배양하여 RT를 변성시키기 위해 15분 동안 70℃까지 가열한다. RNase 혼성물을 첨가하여 55℃에서 10분간 배양하는데 이는 남아있는 RNA를 제거하고 부정확한 말단 트랜스페라제(TdT)의 확장을 예방하기 위함이다. 그런 다음 cDNA를 GlassMax(Gibco BRL, Gaithersburg, MD) spin column으로 결합되지 않은 dNTP와 프라이머를 제거하여 정제한다. column에서 뽑아낸 정제된 cDNA에 TdT를 덧붙인다. TdT는 cDNA에 20-30개의 누클레오타이드 dC 꼬리(tail)를 붙이는데 사용되었다. 95℃에서 3분 간 cDNA를 변성시킨 다음 정제된 cDNA, 염화마그네슘, 작용 완충액 및 dCTP로 구성된 혼합물에 효소를 첨가한다. 이를 37 ℃에서 10분 간 배양한 후 효소가 활성화되지 않도록 70℃까지 10분 간 더 가열한다. 덧붙은 cDNA는 고온에서 시작된 PCR 반응을 바탕으로 Tag 중합효소에서 증폭된다(95℃에서 5분 간; 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 45초를 35회; 72℃에서 7분 간). 이 반응에 필요한 프라이머에는 cDNA 합성 프라이머의 5'에 위치한 3' 프라이머와 dC 링커에 특이하는 고정 프라이머가 포함되고 상당부분 소수의 dI 잔기를 지닌 dG로 구성되었다. 이 반응의 1ml를 네스티드(nested) PCR 반응에 사용한다(95℃에서 5분 간 1cycle; KlenTag 중합효소 믹스를 더해 95℃에서 30초 간, 55℃에서 30초 간 그리고 72℃에서 45초 간 30 cycle) with dG/dI 5' 고정 프라이머 및 추가된 상류 유전자에 특이적인 3' 프라이머. nested 작용의 30ml를 1.5% 한천겔에 나타내고서 적절한 부분단편을 겔로부터 추출해낸다.(도 19) cDNA를 앞서 소개한 방법으로 아미콘 겔(Amicon gel) 분무기 및 마이크로퓨어(micropure) 필터(Amicon, Beverly, MA)를 이용하여 정제한다. 정제된 cDNA 표본을 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱(dye terminator cycle sequencing)을 통해 서열분석한다(Perkin Elmer, Norwalk, CN). 완성된 부분단편로부터 보존된 서열을 유도해내고, 이 보존 서열로부터 고양이의 CD28 유전자의 전체 개시해독프레임을 포함하는 프라이머 쌍을 합성한다.
feCD28 5' : CGC GGA TCC ACC GGT AGC ACA ATG ATC CTC AGG
(SEQ ID NO 75)
feCD28 3' : CGC GGA TCC TCT GGA TAG GGG TCC ATG TCA G
(SEQ ID NO 76)
이 프라이머를 이용하여 전체 코딩부분을 포함한 cDNA 분자를 Con A로 자극된 EK6와 ED3 PBMC-유래 cDNA로부터 증폭된다. 이 PBMC cDNA는 이전에 생산되었으며 RNA를 코딩하는 유전자를 포함하는 것으로 나타났다. 실수를 줄이기 위해 KlenTag 중합효소 믹스를 이용한 이 PCR 반응(95℃에서 5분 간 1cycle; 95℃에서 30초, 42℃에서 30초 및 72℃에서 45초 간 30 cycles; 72℃에서 7분 간)은 종종 Tag 중합효소와 관련이 있다. 이 중합효소는 TA 클론닝 벡터내로 클론화되고 앞서 소개한 바와 같이 시퀀싱되는 754 bp 부분단편을 생산한다. CD 80분자로 각각의 누클레오타이드 부위는 최소한 세 개의 독립적으로 유도되는 서열에 의해 확인된다.
상동벡터 902-49.46
플라스미드 902-49.46는 외래 DNA를 RPV에 주입하기 위해 만들어졌다. 이 벡터는 SPV DNA가 측면으로 연결된 대장균 β-galoctosidase(lacZ) 표지유전자와 결 합한다. 외래 유전자의 상류는 약 906개의 염기쌍으로 된 RPV DNA 부분단편이다. 외래 유전자의 하류는 약 895개의 염기쌍으로 된 RPV DNA 부분단편이다. 플라스미드가 재조합 SPV를 생산하는 Homologous Recombination Procedure에 따라 사용될 때, 외래유전자에 대한 DNA 코딩을 포함한 바이러스를 얻게될 것이다. β-galoctosidase(lacZ) 표지 유전자는 후기 합성 프로모터(LP1)의 조절을 받으며 두 번째 외래 DNA는 합성이 빠르거나 늦은 프로모터(LP2EP2)의 조절을 받는다. 상동벡터는 표준 재조합 DNA 기술(Sambrook)을 이용하여 합성 DNA 서열을 지닌 following sources의 제한단편의 결합으로 만들어졌다. 플라스미드 벡터는 pSP64의 약 2999개의 염기쌍인 HindIII 제한단편(Promega)에서 유도되었다. 부분단편 1은 약 906개의 염기쌍으로 HindIII에서 RPV HindIII 제한절단편 U(Knight)의 XbaI 하류 제한단편이다. 부분단편 2는 약 3010개의 염기쌍으로 BamHI에서 플리스미드 pJF751의 PvuII 제한단편이다.(Ferrari) 부분단편 3은 약 895개의 염기쌍으로 XbaI에서 RPV HindIII 부분단편 U의 HindIII 하류분절이다. 부분단편 1과 3의 XbaI 부위는 NotI 링커를 이용하여 독특한 NotI 부위로 변환된다.
상동벡터 904-63.B7
상동벡터 904-63.B7은 외래 DNA를 SPV에 주입하기 위해 만들어졌다. 이 벡터는 대장균 β-갈락토시다제(galoctosidase)(lacZ) 표지유전자와 고양이의 면역결핍성 바이러스(FIV) gag/protease 및 SPV DNA에 의해 플랭크된(flanked) env. 유전자와 결합되어 있다. 재조합 SPV를 생산하는 상동 재조합방법에 따라 이 상동벡터를 사용하는 경우, 외래유전자를 코딩하는 DNA를 포함한 바이러스를 얻게 될 것이다. β-갈락토시다제(lacZ) 표지 유전자는 합성 후기 폭스(pox) 프로모터(LP1)의 조절을 받고, FIV gag/protease 및 env. 유전자들은 서로 분리된 조절을 받지만, 합성 전기 또는 후기의 폭스 프로모터(LP2EP2)의 조절을 받는다. FIV gag/protease 및 FIV env. 프로모터/유전자 카세트는 gag/protease 및 env. 유전자의 전사가 서로의 방향으로 진행되고 동일 프로모터 간에 상동 재조합의 가능성을 피하기 위한 것처럼 반대방향으로 인식된다. 상동벡터는 표준 재조합 DNA 기술(Sambrook)을 이용하여 적절한 합성 DNA 서열을 지닌 플라스미드 벡터의 제한단편을 결합하여 만들었다. 플라스미드 벡터는 약 2972개의 염기쌍으로 HindIII에서 pSP64의 BamHI 제한단편(Progma)으로 유도되었다. 부분단편 1은 약 1484개의 염기쌍으로 BglII에서 SPV HindIII 부분단편 M의 AccI 하류 제한단편이다. (23) 부분단편 2는 약 2580개의 염기쌍으로 EcoRI에서 역전사와 중합효소 결합작용(PCR)으로 합성된 FIV 피막 유전자의 BglII 부분단편이다. 중합효소 결합작용에는 FIV PPR strain의 cDNA가 이용되었다. 상류 프라이머(5'-GCCCGGATCCTATGGCAGAAGGGTTTGCAGC-3' 20/93.21) (SEQ ID NO 77)는 FIV 피막 유전자의 5' 말단를 합성하고 유전자의 5' 말단에 BamHI부위를 유도한다. 하류 프라이머는 (5'-CCGTGGATCCGGCACTCCATCATTCCTCCTC-3'; 10/93.20) (SEQ ID NO 78)은 FIV 피막 유전자의 3' 말단를 합성하고 유전자의 5' 말단에 BamHI부위를 유도하며 역전사와 중합효소 결합반응에도 사용된다. PCR 산물은 고양이의 FIV 피막 유전자 길이에 따라 약 2580개의 염기쌍이 있는 부분단편을 생산하기 위해 BamHI와 함께 코딩된다. 부분단편 3은 약 1839개의 염기쌍으로 EcoRI에서 역전사와 FIV PPR strain의 cDNA가 이용된 중합효소 결합반응으로 합성된 FIV gag/protease 유전자의 BglII 부분단편이다. 상류 프라이머는 (5'-GCGTGAATTCGGGGAATGGACAGGGGCGAGAT-3'; 11/94.9) (SEQ ID NO 79) FIV gag/protease 유전자의 5' 말단를 합성하여 유전자의 5' 말단에 EcoRI 부위를 유도한다. 하류 프라이머는 (5'-GAGCCAGATCTGCTCTTTTTACTTTCCC-3'; 11/94.10) (SEQ ID NO 80) FIV gag/protease 유전자의 3' 말단를 합성하여 유전자의 3'말단에 BglII 부위를 유도하며 역전사와 중합효소 결합작용에도 사용된다. PCR 산물은 FIV gag/protease 유전자의 길이에 따라 1839개의 염기쌍 부분단편을 생산하기 위해 EcoRI와 BglII와 함께 코딩된다. 부분단편 4는 약 3010개의 염기쌍으로 BamHI에서 플라스미드 pJF751의 PvuII 제한단편(Ferrari)이다. 부분단편 5는 약 2149개의 염기쌍으로 Accl에서 SPV HindIII 제한단편 M의 HindIII 하류 제한단편이다. SPV 상동벡터의 AccI 부위는 합성 링커를 이용하여 독특한 NotI 부위로 전환된다.
상동벡터 917-60.B9
플라스미드 917-60.B9는 외래 DNA를 SPV에 주입하기 위해 만들어졌다. 이 벡터는 대장균 β-갈락토시다제(galoctosidase)(lacZ) 표지유전자와 SPV DNA가 측면으로 연결된 고양이의 IFN-Y 유전자(Onions(1996); Argyle(1995))를 결합시킨다. 외래 유전자의 상류는 약 1484개의 염기쌍으로 되어진 SPV DNA 부분단편이다. 외래 유전자의 하류는 약 2149개의 염기쌍으로 된 SPV DNA 부분단편이다. 플라스미드가 재조합 SPV를 생산하는 상동재조합 방법에 따라 사용될 때, 외래유전자에 대한 DNA 코딩을 포함한 바이러스를 얻게 될 것이다. β-갈락토시다제(galoctosidase)(lacZ) 표지 유전자는 돈두 O1L 프로모터의 조절을 받고 고양이의 CD28 유전자는 합성 전기 또는 후기 프로모터(LP2EP2)의 조절을 받는다. 상동벡터는 표준 재조합 DNA 기술(Sambrook)을 이용하여 플라스미드 벡터의 제한단편의 결합으로 만들어졌다. 플라스미드 벡터는 약 2972개의 염기쌍이 있는 pSP64의 HindIII에서 BamHI 제한단편(Promega)으로 유도되었다. 부분단편 1은 약 1484개의 염기쌍으로 BglII에서 SPV HindIII 제한단편 M의 AccI 하류 제한단편이다. 부분단편 2는 EcoRI에서 역전사와 중합효소 결합작용(PCR)으로 합성된 BamHI 제한단편이다. PCR 반응에서 ConA로 자극된 고양이의 비장세포의 RNA을 주형(template)으로 이용하였다. 고양이의 IFN-Υ 을 합성하기 위해, 프라이머 (5'-TCGAGAATTCGATGAATTACACAAGTTTTATTTTCG-3'; 1/97.4) (SEQ ID NO 81)는 고양이의 IFN-Y유전자의 5' 말단에서 합성되고 유전자의 5' 말단에 EcoRI 부위를 유도한다. 프라이머(5'-TCGAGGATCCTTATTTCGATGCTCTACGGCCTC-3'; 1/97.3) (SEQ ID NO: 82)는 역전사와 PCR에 이용되고 고양이의 IFN-Υ 유전자의 3' 종단부에서 합성되고 유전자의 3' 말단에 BamHI 부위를 유도한다. PCR 산물은 고양이의 IFN-Υ 유전자 길이에 따라 약 504개의 염기쌍이 있는 부분단편을 생산하기 위해 EcoRI 및 BamHI와 함께 코딩된다. 부분단편 3은 약 3010개의 염기쌍으로 BamHI에서 플라스미드 pJF751의 PvuII 제한단편이다(Ferrari, et al.,). 부분단편 4는 약 2149개의 염기쌍으로 AccI에서 SPV HindIII 부분단편 M의 HindIII의 하류부분단편이다. 부분단편 1과 4의 AccI 부위는 NotI 링커를 이용하여 독특한 NotI 부위로 전환된다.
상동벡터 926-76.D7
상동벡터 926-76.D7은 고양이의 헤르페스바이러스의 gE 코딩부분을 제거하고 외래 DNA를 주입하기 위해 만들어졌다. 이 벡터는 FHV DNA가 측면으로 연결된 고양이의 CD80 유전자와 결합한다. 고양이의 CD80 유전자는 FHV gE 프로모터의 조절을 받는다. 이 벡터는 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 지시된 DNA로부터 만들어졌다(Sambrook, et al.,). 플라스미드 벡터는 약 2958개의 염기쌍이 있는 Asp718I에서 pSP18/19의 Asp718I 핵내소체 제한단편으로 유도되었다. 부분단편 1은 약 1415의 염기쌍으로 Asp718I에서 FHV SalI B 부분단편의 SmaI 하류부분단편까지이다. 부분단편 2는 약 879개의 염기쌍으로 EcoRI에서 중합효소 결합작용으로 클론화되어 합성된 고양이의 CD80 유전자의 BamHI부분단편까지이다. 중합효소 결합작용의 template는 ConA로 자극된 고양이의 비장세포의 RNA이다. 상류 프라이머(5'-TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3'; 1/97.43) (SEQ ID NO: 52)는 고양이의 CD80 유전자의 5' 말단에서 합성되고 EcoRI 부위를 유도한다. 하류 프라이머(5'-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-3'; 1/97.6) (SEQ ID NO: 53)는 고양이의 CD80 유전자의 3' 말단에서 합성하여 유전자의 3' 말단에 BamHI 부위를 유도하고 역전사와 중합효소 결합작용에도 이용된다. 부분단편 3은 약 2205개의 염기쌍으로 SalI에서 FHV EcoRI E 부분단편의 Asp718I 하류부분단편이다.
상동벡터 930-23.A1
플라스미드 930-23.A1은 외래 DNA를 SPV에 주입하기 위해 만들어졌다. 이 벡터는 대장균 β-갈락토시다제(galoctosidase)(lacZ) 표지유전자와 SPV DNA가 측면으로 연결된 고양이의 CD80 유전자를 결합시킨다. 외래 유전자의 상류는 약 1484개의 염기쌍으로 되어진 SPV DNA 부분단편이다. 외래 유전자의 하류는 약 2149개의 염기쌍으로 된 SPV DNA 부분단편이다. 플라스미드가 재조합 SPV를 생산하는 상동 재조합 방법(Homologous Recombination Procedure)에 따라 사용될 때, 외래유전자에 대한 DNA 코딩을 포함한 바이러스를 얻게될 것이다. β-갈락토시다제(galoctosidase)(lacZ) 표지 유전자는 전기 합성 두진 프로모터(LP1)의 조절을 받고 고양이의 CD28 유전자는 합성이 빠르거나 느린 프로모터(LP2EP2)의 조절을 받는다. 상동벡터는 표준 재조합 DNA 기술(Sambrook)을 이용하여 플라스미드 벡터의 제한단편의 결합으로 만들어졌다. 플라스미드 벡터는 약 2972개의 염기쌍이 있는 pSP64의 HindIII에서 BamHI까지의 제한단편(Promega)에서 유도되었다. 부분단편1은 약 1484개의 염기쌍으로 되어있으며 BglII에서 SPV HindIII 제한단편 M의 AccI 하류 제한단편까지이다. 부분단편 2는 EcoRI에서 역전사와 중합효소 결합작용(PCR)으로 합성된 BamHI 제한단편이다. PCR 반응에서 ConA로 자극된 고양이의 비장세포의 RNA을 주형으로 이용하였다. 고양이의 CD80을 합성하기 위해 프라이머(5'-TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3'; 1/97.43) (SEQ ID NO 52)는 고양이의 CD80 유전자의 5' 말단에서 합성되고 유전자의 5' 종단부에 EcoRI 부위를 유도한다. 프라이머(5'-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-3'; 1/97.6) (SEQ ID NO: 53)는 고양이의 CD80 유전자의 3' 말단에서 합성하여 유전자의 3' 말 단에 BamHI 부위를 유도한다. PCR 산물은 고양이의 CD80 유전자 길이에 따라 약 879개의 염기쌍이 있는 부분단편을 생산하기 위해 EcoRI 및 BamHI와 함께 코딩된다. 부분단편 3은 약 3010개의 염기쌍으로 되어있고 BamHI에서 플라스미드 pJF751의 PvuII 제한단편까지이다(Ferrari, et al.,). 부분단편 4는 약 2149개의 염기쌍으로 되어 있고 SPV HindIII 부분단편 M의 AccI에서 HindIII의 하류부분단편이다. 부분단편 1과 4의 AccI 부위는 NotI 링커를 이용하여 독특한 NotI 부위로 전환된다.
상동벡터 930-26.A1
플라스미드 930-26.A1는 외래 DNA를 SPV에 주입하기 위해 만들어졌다. 이 벡터는 대장균 β-갈락토시다제(galoctosidase)(lacZ) 표지유전자와 SPV DNA가 측면으로 연결된 고양이의 CD28 유전자를 결합시킨다. 외래 유전자의 상류는 약 1484개의 염기쌍으로 되어진 SPV DNA 부분단편이다. 외래 유전자의 하류는 약 2149개의 염기쌍으로 된 SPV DNA 부분단편이다. 플라스미드가 재조합 SPV를 생산하는 상동재조합 방법(Homologous Recombination Procedure)에 따라 사용될 때, 외래유전자에 대한 DNA 코딩을 포함한 바이러스를 얻게될 것이다. β-갈락토시다제(galoctosidase)(lacZ) 표지 유전자는 전기 합성 두진 프로모터(LP1)의 조절을 받고 고양이의 CD28 유전자는 합성이 빠르거나 느린 두진 프로모터(LP2EP2)의 조절을 받는다. 상동벡터는 표준 재조합 DNA 기술(Sambrook)을 이용하여 플라스미드 벡터의 제한단편의 결합으로 만들어졌다. 플라스미드 벡터는 약 2972개의 염기쌍이 있는 pSP64의 HindIII에서 BamHI까지의 제한단편(Promega)에서 유도되었다. 부분단편1은 약 1484개의 염기쌍으로 되어있으며 BglII에서 SPV HindIII 제한단편 M의 AccI 하류 제한단편까지이다. 부분단편 2는 EcoRI에서 역전사와 중합효소 결합작용(PCR)으로 합성된 BamHI 제한단편이다. PCR 반응에서 ConA로 자극된 고양이의 비장세포의 RNA을 주형(template)으로 이용하였다. 고양이의 CD28을 합성하기 위해 프라이머 (5'- GATGAATTCCATGATCCTCAGGCTGGGCTTCT -3'; 7/97.1) (SEQ ID NO 54)가 고양이의 CD28 유전자의 5'말단에서 합성되고 유전자의 5' 말단에 EcoRI 부위를 유도한다. 프라이머 (5'- GATCAGATCTCAGGAACGGTAYTGCCGCAA -3'; 7/97. 2) (SEQ ID NO 55)가 역전사와 PCRDP 사용되었고, 고양이의 CD28 유전자의 3'말단에서 합성되고, 유전자의 3'말단에 BamHI부분을 유도한다. PCR 산물은 고양이의 CD28 유전자 길이에 따라 약 666개의 염기쌍이 있는 부분단편을 생산하기 위해 EcoRI 및 BamHI와 함께 코딩된다. 부분단편 3은 약 3010개의 염기쌍으로 되어있고 BamHI에서 플라스미드 pJF751의 PvuII 제한단편까지이다(Ferrari. et al.,). 부분단편 4는 약 2149개의 염기쌍으로 되어 있고 SPV HindIII 부분단편 M의 AccI에서 HindIII의 하류부분단편이다. 부분단편 1과 4의 AccI 부위는 NotI 링커를 이용하여 독특한 NotI 부위로 전환된다.
상동벡터 931-21.A1
상동벡터 931-21.A1는 외래 DNA를 SPV에 주입하기 위해 만들어졌다. 이 벡터는 대장균 β-글루쿠로니다제(glucuronidase)(uidA) 표지 유전자와 SPV DNA가 측면 으로 연결된 고양이의 IFN-Υ 유전자를 결합시킨다(Onions(1996); Argyle(1995)). 이 상동벡터가 재조합 SPV를 생산하는 상동재조합 방법(Homologous Recombination Procedure)에 따라 사용될 때 외래유전자에 대한 DNA 코딩을 포함한 바이러스를 얻게 될 것이다. β-글루쿠로니다제(glucuronidase)(uidA) 표지 유전자는 합성 전기 폭스 프로모터(EP2)의 조절을 받고 고양이의 CD80 유전자는 독립되고 독특한 합성 후기/초기 폭스(pox) 프로모터(LP2EP2)의 조절을 받는다. 상동벡터는 표준 재조합 DNA 기술(Sambrook)을 이용하여 플라스미드 벡터의 제한단편과 적절한 합성 DNA 서열을 연결하여 만들어졌다. 플라스미드 벡터는 약 2700개의 염기쌍이 있는 PNEB193의 DraI 제한단편(New England Biolabs)에서 유도되었다. 부분단편 1은 약 881개의 염기쌍으로 되어 있으며 DraI에서 SPV HindIII 부분단편 K의 EcoRI 하류제한단편까지이다. 부분단편 2는 약 879개의 염기쌍으로 되어있고 EcoRI에서 중합효소 결합 작용으로 클론화되어 합성되는 고양이의 CD80 유전자의 BamHI 제한단편까지 이다. PCR 반응을 위한 주형(template)은 ConA로 자극된 고양이의 비장세포의 RNA이다. 상류 프라이머(5'-TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3'; 1/97.43) (SEQ ID NO 52)는 고양이의 CD80 유전자의 5'의 말단에서 EcoRI 부위로 유도한다. 하류 프라이머(5'-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-3'; 1/97.6) (SEQ ID NO 53)는 고양이의 CD80 유전자의 3' 말단에서 합성하여 유전자의 3' 말단에 BamHI 부위를 유도하며 역전사 및 중합효소 결합 작용에도 이용된다. 부분단편 3은 약 1823개의 염기쌍으로 되어있고 EcoRI에서 플라스미드 pRAJ260의 SmaI 제한단편까지이다(Clonetech). 부분단편 4는 약 994개의 염기쌍으로 되어 있고 EcoRI에서 SPV HindIII 제한단편 K의 DraI 하류 제한단편까지이다. SPV 상동벡터의 EcoRI 부위는 합성 링커를 이용하여 독특한 NotI 부위로 전환되었다.
상동벡터 931-22.A1
플라스미드 931-22.A1은 외래 DNA를 RPV로 주입하기 위해 만들어졌다. 이 벡터는 RPV DNA가 측면으로 연결된 고양이의 CD80 유전자를 결합시킨다. 외래유전자의 상류는 약 906개의 염기쌍으로 되어진 RPV DNA 부분단편이다. 외래 유전자의 하류는 약 895개의 염기쌍으로 된 RPV DNA 부분단편이다. 플라스미드가 재조합 RPV를 생산하는 상동재조합 방법(Homologous Recombination Procedure)에 따라 사용될 때, 외래유전자에 대한 DNA 코딩을 포함한 바이러스를 얻게될 것이다. 고양이의 CD80 유전자는 합성이 빠르거나 느린 프로모터의 조절을 받는다(LP2EP2). 상동벡터는 표준 재조합 DNA 기술(Sambrook)을 이용하여 플라스미드 벡터의 제한단편과 적절한 합성 DNA 서열을 연결하여 만들어졌다. 플라스미드 벡터는 약 2999개의 염기쌍이 있는 pSP64의 HindIII 제한단편(Promega)에서 유도되었다. 부분단편1은 약 906개의 염기쌍으로 되어있으며 HindIII에서 RPV HindIII 제한단편 U의 Xbal 하류 제한단편까지이다(Knight). 부분단편 2는 약 879개의 염기쌍으로 되어있고 EcoRI에서 중합효소 결합작용으로 클론화되어 합성된 고양이의 CD80 유전자의 BamHI 부분단편까지이다. PCR 반응을 위한 주형은 ConA로 자극된 고양이의 비장세포의 RNA이다. 상류 프라이머(5'-TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3'; 1/97.43) (SEQ ID NO: 52)는 고양이의 CD80 유전자의 5'의 말단에서 EcoRI 부위로 유도한다. 하류 프라이 머(5'-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-3'; 1/97.6) (SEQ ID NO: 53)는 3' 말단에서 합성하여 유전자의 3' 말단에 BamHI 부위를 유도하며 역전사 및 중합효소 결합 작용에도 이용된다. 부분단편 3은 약 895개의 염기쌍으로 되어 있고 Xbal에서 RPV HindIII 부분단편 U의 HindIII 하류부분단편까지이다. 부분단편 1과 3의 Xbal 부위는 NotI 링커를 이용하여 독특한 NotI 부위로 전화되었다. 부분단편 2와 3 사이의 합성 DNA는 LP2EP2 프로모터와 외래 DNA의 주입을 위한 EcoRI 부위와 BamHI 부위를 포함하고 있다.
상동벡터 931-32.A5
플라스미드 931-32.A5는 외래 DNA를 RPV로 주입하기 위해 만들어졌다. 이 벡터는 고양이의 CD80 유전자와 RPV DNA가 측면으로 연결된 대장균 β-galoctosidase(lacZ) 표지유전자를 결합시킨다. 외래 유전자의 상류는 약 906개의 염기쌍으로 되어진 RPV DNA 부분단편이다. 외래 유전자의 하류는 약 895개의 염기쌍으로 된 RPV DNA 부분단편이다. 플라스미드가 재조합 RPV를 생산하는 상동재조합 방법(Homologous Recombination Procedure)에 따라 사용될 때, 외래유전자에 대한 DNA 코딩을 포함한 바이러스를 얻게될 것이다. 상동벡터는 표준 재조합 DNA 기술(Sambrook)을 이용하여 플라스미드 벡터의 제한단편과 적절한 합성 DNA 서열을 연결하여 만들어졌다. 플라스미드 벡터는 약 2999개의 염기쌍이 있는 pSP64의 HindIII 제한단편(Promega)에서 유도되었다. 부분단편1은 약 906개의 염기쌍으로 되어있으며 HindIII에서 RPV HindIII 제한단편 U의 Xbal 하류 제한단편까지이다. (Knight) 부분단편 2는 약 879개의 염기쌍으로 되어있고 EcoRI에서 중합효소 결합작용으로 클론화되어 합성된 고양이의 CD80 유전자의 BamHI 부분단편까지이다. PCR 반응을 위한 주형은 ConA로 자극된 고양이의 비장세포의 RNA이다. 상류 프라이머(5'-TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3'; 1/97.43) (SEQ ID NO: 52)는 고양이의 CD80 유전자의 5' 말단에서 합성하여, EcoRI 부위를 유도한다. 하류 프라이머(5'-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-3'; 1/97.6) (SEQ ID NO: 53)는 고양이의 CD80 유전자의 3' 말단에서 합성하여 유전자의 3' 말단에 BamHI 부위를 유도하며 역전사 및 중합효소 결합 작용에도 이용된다. 부분단편 3은 약 3010개의 염기쌍으로 되어있고 BamHI에서 플라스미드 pJF751의 PvuII 제한단편까지이다(Ferrari. et al.,). 부분단편 4는 약 895개의 염기쌍으로 되어 있고 XbaI에서 RPV HindIII 부분단편 U의 HindIII 하류부분단편까지이다. 부분단편 1과 4의 XbaI 부위는 NotI 링커를 이용하여 독특한 NotI 부위로 전환되었다.
상동벡터 931-55.B12
상동벡터 931-55.B12는 외래 DNA를 SPV에 주입하기 위해 사용된다. 이 벡터는 대장균(E. coli) β-글루쿠로니다제(glucuronidase)(uidA) 표지 유전자와 SPV DNA가 측면으로 연결된 고양이의 IFN-Υ 유전자(Onions(1996); Argyle(1995))를 결합시킨다. 이 상동벡터가 재조합 SPV를 생산하는 상동재조합방법(Homologous Recombination Procedure)에 따라 사용될 때 외래유전자에 대한 DNA 코딩을 포함한 바이러스를 얻게될 것이다. β-glucuronidase(uidA) 표지 유전자는 합성된 전기 폭 스 프로모터(EP2)의 조절을 받고 고양이의 IFN-Υ 유전자는 독립되고 독특한 합성 후기/전기 폭스 프로모터(LP2EP2)의 조절을 받는다. 상동벡터는 표준 재조합 DNA 기술(Sambrook)을 이용하여 플라스미드 벡터의 제한단편과 적절한 합성 DNA 서열을 연결하여 만들어졌다. 플라스미드 벡터는 약 2700개의 염기쌍이 있는 PNEB193 DraI 제한단편(New England Biolabs)에서 유도되었다. 부분단편 1은 약 881개의 염기쌍으로 되어 있으며 DraI에서 SPV HindIII 부분단편 K의 EcoRI 하류제한단편까지이다. 부분단편 2는 EcoRI에서 역전사와 ConA로 자극된 고양이의 비장세포의 RNA를 주형으로 이용한 중합효소 결합작용(PCR)에 의해 합성되는 BamHI 제한단편까지이다. 고양이의 IFN-Y를 합성하기 위해 프라이머 (5'-TCGAGAATTCGATGAATTACACAAGTTTTATTTTCG-3'; 1/97.4) (SEQ ID NO: 81)는 고양이의 IFN-Y유전자의 5' 말단에서 합성되고 유전자의 5' 말단에 EcoRI부위를 유도한다. 프라이머(5'-TCGAGGATCCTTATTTCGATGCTCTACGGCCTC-3'; 1/97.3) (SEQ ID NO: 82)는 역전사와 PCR에 이용된다. 고양이의 IFN-g 유전자의 3'말단에서 합성되고 유전자의 3'말단에 BamHI 부위를 유도한다. PCR 산물은 고양이의 IFN-Y유전자의 길이에 따라 504개의 염기쌍을 지닌 부분단편을 생산하기 위해 EcoRI 및 BamHI와 함께 코딩된다. 부분단편 34는 약 1823개의 염기쌍이 있으며 EcoRI에서 플라스미드 pRAJ260의 SmaI 제한단편까지이다(Clonetech). 부분단편4는 약 994개의 염기쌍이 있으며 EcoRI에서 SPV HindIII 제한단편 K의 DraI 하류 제한단편까지이다. SPV 상동벡터의 EcoRI 부위는 합성링커를 이용하여 독특한 NotI 부위로 전환된다.
상동벡터 846-88.B17
플라스미드 846-88.B17는 고양이의 헤르페스바이러스에서 전체 gE 코딩부위를 제거하고 외래 DNA를 주입하기 위해 만들어졌다. 벡터는 HV DNA가 측면으로 연결된 FHV gE 제거부위로 대장균(E. coli) β-갈락토시다제(galoctosidase)(lacZ) 표지 유전자를 주입시킨다. 플라스미드 846-88.B17은 1638의 염기쌍이 있고 FHV SalI B 부분단편의 SmaI에서 FHV EcoRI E 부분단편의 SalI까지 제거되었다. FHV SalI B 부분단편의 SmaI와 FHV EcoRI E 부분단편의 SalI는 제거된 부위의 양끝을 이룬다. 외래유전자의 상류는 약 1415개의 염기쌍으로 Asp718에서 gI 유전자(370개의 아미노산)의 전체 서열을 포함한 FHV SalI B의 SmaI 하류부분단편까지이다. 외래유전자의 하류는 약 2205개의 염기쌍으로 SalI에서 독특하게 짧고 말단이 반복되는 FHV EcoRI E 부분단편의 Asp718 하류부분단편까지이다. 플라스미드가 재조합 RPV, SPV 또는 FHV를 생산하는 상동재조합방법(Homologous Recombination Procedure)에 따라 사용될 때 외래유전자에 대한 DNA 코딩을 포함한 바이러스를 얻게 될 것이다. 대장균(E.Coli) lac Z유전자는 지속적인 FHV gE 프로모터의 조절을 받는다. 이는 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들어졌다(Sambrook).
상동벡터 921-65.B5
상동벡터 921-65.B5은 SPA 15L유전자(약 237bp)를 제거하고 SPV에 외래(foreign) DNA를 주입하기 위해 만들어졌다. 벡터는 대장균(E.coli) β-갈락토시다제(galactosidase)(LacZ) 표지 유전자와 고양이의 루키미아 바이러스(lukimia virus)(FeLV) gag/protease와 SPV DNA가 측면에 결합된 피막유전자(envelope gene)를 결합시킨다. 이 상동벡터가 재조합 RPV, SPV 또는 FHV를 생산하는 상동재조합방법(Homologous Recombination Procedure)에 따라 사용될 때 외래유전자에 대한 DNA 코딩을 포함한 바이러스를 얻게 될 것이다. 이는 표준 제조합 DNA 기술을 이용하여 만들어졌다(Sambrook. et al.,). β-갈락토시다제(galactosidase)(LacZ) 표지 유전자는 구성이 늦은 두진 프로모터(15L)에 의해 조절되고 FeLV gag/protease 및 FeLV 피막유전자는 전기 합성 두진 프로모터인 EP2 및 EP1에 의해 각각 조절된다. 외래 유전자가 측면으로 삽입된 SPV 서열은 3.2 kb HingIII N 유전자 부분단편에서 유도되었다. 외래 유전자의 상류 서열은 SPV 14L 유전자 부분을 포함하는 903 bp 부분단편이고, 하류 서열은 SPV 16L 유전자 부분을 포함하는 966 bp 부분단편이다. 대장균(E. coli) lacZ 유전자, FeLV env 및 FeLV gag/protease, 개시해독프레임(ORF) 모두는 SPV 16L 및 SPV 14L 유전자와 동일한 오리엔테이션으로 진행된다.
상동벡터 942-03.C6.
플라스미드 942-03.C6는 고양이의 헤르페스바이러스로부터 gE 코딩 부위의 일부를 제거하고 제거된 부위에 세 개의 외래 유전자를 주입하기 위해 만들어졌다. 이 벡터는 고양이의 CD80 유전자(-879 bp)를 FHV DNA가 측면에 연결된 FIV gag/protease 유전자(-1800 bp) 및 FIV 피막 유전자(-2600 bp)와 결합시킨다. 고양이의 CD80 유전자는 FHV gE 프로모터의 조절에 의해 FIV gag/protease 유전자는 가 성광견벙(pseudorabis) gX 프로모터의 조절을 받으며 FIV 피막 유전자는 거대세포바이러스 초기 유전자의 조절을 받는다. 외래 유전자의 상류는 약 1415의 염기쌍으로 Asp718에서 FHV SalIB 부분단편의 SmaI 하류부분단편이다. 외래 유전자의 하류는 약 2205 의 염기쌍으로 Sall에서 특이하게 짧으며 말단위가 반복되는 FHV EcoRI E 부분단편의 Asp718 하류부분단편까지이다. 플라스미드가 재조합 RPV, SPV 또는 FHV를 생산하는 상동재조합 방법(Homologous Recombination Procedure)에 따라 사용될 때 외래 유전자에 대한 DNA 코딩을 포함한 바이러스를 얻게 될 것이다. 상동 플라스미드, 942-03.C6은 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들어졌다(Sambrook, et al.,).
도 1, 도 2는 고양이의 CD80(B7-1) (TAMU)의 DNA 배열 및 아미노산 배열; (SEQ ID No. 1~2).
도 3는 고양이의 CD80(B7-1) (TAMU)의 아미노산 배열에 대한 소수성 플롯(hydrophobicity plot).
도 4, 도 5는 고양이의 CD80(B7-1) (SYNTRO)의 DNA 배열 및 아미노산 배열; (SEQ ID No. 3~4).
도 6은 고양이의 CD80(B7-1) (SYNTRO)의 아미노산 배열에 대한 소수성 플롯(hydrophobicity plot).
도 7, 도 8은 고양이의 CD86(B7-2)의 DNA 배열 및 아미노산 배열; (SEQ ID No. 5~6).
도 9는 고양이의 CD86(B7-2)의 아미노산 배열에 대한 소수성 플롯(hydrophobicity plot).
도 10은 고양이의 CD28의 DNA 배열 및 아미노산 배열; (SEQ ID No. 7~8).
도 11은 고양이의 CD28의 아미노산 배열에 대한 소수성 플롯(hydrophobicity plot).
도 12는 고양이의 CTLA-4(CD152)의 DNA 배열 및 아미노산 배열; (SEQ ID No. 9~10).
도 13은 고양이의 CTLA-4(CD152)의 아미노산 배열에 대한 소수성 플롯(hydrophobicity plot).
실시예 1A
고양이의 CD80(B701)-TAMU, CD80(B7-1)-SPAH, C86(B7-2), CD28 및 CTLA-4 dDNA에 대한 클로닝
고양이의 CD80(B701)-TAMU, CD80(B7-1)-SPAH, C86(B7-2), CD28 및 CTLA-4 dDNA에 대한 클로닝은 고양이의 mRNA와 상호반응하는 프라이머들을 충분히 변성시킬 수 있도록 내재된 두가지 변성 사이의 한 영역을 증폭시키는 첫번째 RT-PCR (역전사효소/중합효소 연쇄반응; reverse transcriptase/polymerase)에 의해 이루워졌 다. mRNA는 concanavalin(Con A)에 이용하여 적어도 16시간 이상동안 자극시킨 말초혈 단핵세포(PBMC) 또는 비세포(splenocytes)를 사용하였다. 상기 PCR 생성물을 배열화하였다. 상기 배열은 RACE(cDNA 말단의 신속한 증폭화; rapid amplification of cDNA ends) PCR을 위한 프라이머를 합성하기 위하여 사용하였다. 5' 말단은 새로이 배열된 내재 영역에 상보적인 하류의 프라이머를 이용하여 첫번째로 cDNA를 합성함으로서 증폭시켰다. 올리고뉴클레오티드를 cDNA(mRNA의 5' 말단과 상보적임)의 3' 말단에 결합시켰다. 이 배열은 새로이 배열된 영역에서 다른 영역과 일치하는 하류의 PCR 프라이머와 융합가능한 PCR인 상류의 프라이머에 대하여 결합부위로서의 역할을 한다. 수회에 걸쳐 계속된 반응에 degenerate 프라이머를 사용하여 3' 말단을 얻었다. PCR에 대한 상기 상류의 프라이머는 새로이 배열된 영역에서 하나의 배열과 반응시키고자 하였다. 해당 생성물을 직접 배열시키거나 TA 클로닝에 클론화하고 플라즈미드에서 배열화시켰다. 전체의 개시해독프레임은 기존의 배열에서 설정된 프라이머를 지닌 PCR에 의해 그 전부를 증폭하여 클론화시켰다. 상기 개시해독프레임을 클론화하여 세번에 걸쳐 배열화하였다. B7-1 개시해독프레임을 서브클로닝하여 SV40 프로모터를 가진 pSI 플라즈미드로 합성하였다. 상기 pSI는 B7-1이 고양이의 CD28과 상호작용을 할 수 있도록 사용하였다.
고양이 CD80(B7-1) cDNA의 RT/PCR 반응에 사용되는 DNA 프라이머는 다음과 같다:
5' 프라이머: 5'CGCGGATCCGCACCATGGGTCACGCAGCAAAGTGGAAAAC-3';(SEQ ID NO. 11)
3' 프리이머: 5'-CCTAGTAGAGAAGAGCTAAAGAGGC-3';(SEQ ID NO. 12)
(고양이 CD80 cDNA와 관련된 전체의 프라이머 리스트에 대해서는 상기 참조).
고양이 CD28 cDNA의 RT/PCR 반응에 사용되는 DNA 프라이머는 다음과 같다:
5' 프라이머: 5'-CGCGGATCCACCGGTAGCACAATGATCCTCAGG-3'; (SEQ ID No. 13)
3' 프라이머: 5'-CGCGGATCCTCTGGATAGGGGTCCATGTCAG-3'; (SEQ ID No. 14)
(고양이 CD28 cDNA와 관련된 전체의 프라이머 리스트에 대해서는 상기 참조).
고양이 CTLA-4 cDNA의 RT/PCR 반응에 사용되는 DNA 프라이머는 다음과 같다:
1. 최초의 PCR 반응산물에 대한 degenerate 프라이머(672 bp):
Deg 5' P: 5'-ATGGCTT(C)GCCTTGGATTT(C)CAGC(A)GG-3'; (SEQ ID No. 15)
Deg 3' P: 5'-TCAATTG(A)ATG(A)GGAATAAAATAAGGCTG-3'; (SEQ ID No. 16)
2. CTLA-4의 5' 말단(455 bp): Degenerate, 유전자에 특이적(GSP)이며 또한 nested 유전자에 특이적(NGSP) 프라이머:
제 1회 PCR 반응:
Deg 5' P: 5'-TGTTGGGTTTC(T)G(A)CTCTG(A)CTT(C)CCTG-3': (SEQ ID No. 17)
Deg 3' GSP: 5'-GCATAGTAGGGTGGTGGGTACATG-3': (SEQ ID No. 18)
제 1회의 PCR 반응산물을 가진 nested PCR:
Deg 5' P: 5'-TGTTGGGTTTC(T)G(A)CTCTG(A)CTT(C)CCTG-3'; (SEQ ID No. 19)
3' NGSP: 5'-ACATGAGCTCCACCTTGCAG-3'; (SEQ ID No. 20)
3. CTLA-4의 3' 말단: 아탑터 프라이머 1(AP1,Clonetech Lab, Inc., Palo Alto, 캘리포니아); nested 아탑터 프라이머(AP2, Clonetech Lab), 유전자에 특이적 프라이머(GSP) 및 nested 유전자에 특이적 프라이머(NGSP):
3' RACE PCR:
AP1: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'; (SEQ ID NO. 21)
5' GSP: 5'-GTGAATATGGGTCTTCAGGCAATG-3'; (SEQ ID NO. 22)
3' Nested RACE PCR with the product of 3' RACE PCE:
AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3': (SEQ ID NO. 23)
5' NGSP: 5'-GAAATCCGAGTGACTGTGCTGAG-3'; (SEQ ID NO. 24)
4. Primers for whole CTLA-4 gene
Fel CTLA-4 5' primer: 5'-AACCTGAACACTGCTCCCATAAAG-3'; (SEQ ID NO. 25)
Fel CTLA-4 3' Primer: 5'-GCCTCAGCTCTTAGAAATTGGACAG-3; (SEQ ID NO. 26)
DNA primers used for RT/PCT of the feline CD86 (B7-2) cDNA were:
1. Degenerate primers for the first PCR product (423 bp):
Deg 5' P: 5-TAGTATTTTGGCAGGACCAGG-3'; (SEQ ID No. 27)
Deg 3' P: 5-CTGTGACATTATCTTGAGATTTC-3'; (SEQ ID NO. 28)
2. Degenerate primers for the second PCR product (574 bp);
Deg 5' P: 5'-GA(G)CA(T)GCACT(A)ATGGGACTGAG-3'; (SEQ ID NO. 29)
Deg 3' P: 5'-CTGTGACATTATCTTGAGATTTC-3'; (SEQ ID NO. 30)
3. 5' end of CD86: AP1, AP2 (Clontech Lab), Degenerate, 3'-gene- specific (GSP) and 3'-nested gene-specific (NGSP) primers:
5' RACE PCR:
AP1: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'; (SEQ ID NO. 31)
3' GSP: 5'-TGGGTAACCTTGTATAGATGAGCAGGTC-3'; (SEQ ID NO. 32)
Nested 5' RACE PCR with the PCR product of 5' RACE:
AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3'; (SEQ ID NO. 33)
3' NGSP: 5'-CAGGTTGACTGAAGTTAGCAAGCAC-3'; (SEQ ID NO. 34)
4. 3' end of B7-2: AP1, AP2, 5' GSP, and 5' NGSP:
3' RACE PCR:
AP1 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'; (SEQ ID NO. 35)
5 GSP: 5'-GGACAAGGGCACATATCACTGTTTC-3'; (SEQ ID NO. 36)
Nested 3'-RACE PCR with the PCR product of 3' RACE:
AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3'; (SEQ ID NO. 37)
5' NGSP: 5'-CAGTGCTTGCTAACTTCAGTCAACC-3'; (SEQ ID NO. 38)
Whole CD86 gene:
Fel B72 (1) 5' Primer: 5'-CGGGAATGTCACTGAGCTTATAG-3'; (SEQ ID NO. 39)
Fel B72 (1176) 3' Primer: 5'-GATCTTTTTCAGGTTAGCAGGGG-3'; (SEQ ID No. 40)
실시예 1B
CD80(B7-1)-Syntro/SPAH의 클론닝; 플라즈미드 917-19-8/16
고양이의 비장세포를 추출하여 concanavalin A로 5시간 동안 배양시켰다. 상기 비장세포를 펠렛화하여 인산완충용액(PBS)로 세척한 후 전체의 RNA(Qiagen RNeasy Total RNA System)을 분리시키는데 사용하였다. 전체의 RNA를 DNAse I(베링거 만하임사 제품)으로 처리하여 상기 RNA 생성물로부터 DNA 오염물을 제거하였다. Qiagen의 Oligotex 비드(Santa Clara, 캘리포니아)와 quick column를 사용하여 mRNA를 상기 RNA 생성물로부터 추출하였다. DNA 복제물은 랜텀 헥사머(random hexamer), dNTP, RNAsin, 역전사효소(Promega) 및 역전사효소완충액(promega)이 존재하에 상기 mRNA로부터 생성되었으며 42℃에서 30분 동안 배양하였다. 이어서 PCR 반응에서 센스 프라이머 5/97.50(5'-ATGGGTCACGCAGCAAAGTG-3'); (SEQ ID No. 41) 및 안티센스 프라이머 5/97.50(5'-CTATGTAGACAGGTGAGATC-3'); (SEQ ID No. 42), dNTPs, B7-1 cDNA (첫번째 가닥), 황산마그네슘, 벤트 중합효소(BRL) 및 벤트 중합효소 완충액(BRL)을 사용하여 고양이의 CD80(B7-1) 개시해독프레임(ORF)의 이중가닥으로 완전한 길이를 갖춘 cDNA 를 합성하였다. PCR 반응조건은 15초동안 94도의 1 사이클; 30초동안 94도의 35 사이클, 2분동안 48도, 2분도안 72도; 10분동안 72도의 1 사이클로 하였다. PCR 반응은 1%의 낮은 용해성 한천 겔상에서 실시하였으며, B701 ORF의 기대 크기에 부합하는 DNA 단편을 분리하여 겔상에서 정제(Qiagen 사의 겔 정제키트, Santa Clara, 캘리포니아)하여 Invitrogen사(Zero Blunt PCR Cloning Kit; San Diego, 캘리포니아)의 키트시약을 사용하여 pCR-Blunt 플라즈미드 벡터에 클로닝하였다. 카나마이신에 내성을 지닌 박테리아콜로니에서 추출한 DNA에 대하여 비반복 NheI 부위(고양이 CD80(B7-1)-TAMU에 포함되어 있음)가 존재하는 가를 확인하기 위하여 사전 스크리닝을 실시하였다. 크기가 800~900 bp의 범위에 있으며 NheI 부위를 포함하는 삽입물에 대하여 ABI사의 형광자동배열 프로토콜(fluorescenated automated sequencing protocol) 및 관련기기(Perkin-Elmer-Cetus; Applied Biosystems, Inc.)을 사용하여 이를 배열화하였다. 이전에 클로닝시킨 B7-1 유전자로부터 유래된 플라즈미드 벡터, B7-1 및 유전자에 특이적 프라이머를 사용하여 DNA 배열 pCR-Blunt 프라이머를 합성하였는데 그 예를 들면 1/97.36(5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'); (SEQ ID No. 43) 및 1/97.36(5'-AATACGACTCACTATAGG-3'); (SEQ ID No. 44) 등이 있다.
B7-1 유전자에 특이적 프라이머의 예로서는 12/96.22(5'-AACACCATTTCATCATCCTTT-3); (SEQ ID No. 45), Q/97.33(5'-ATACAAGTGTATTTGCCATTGTC-3'); (SEQ ID No. 46), 12/96.20(5'-AGCTCTGACCAATAACATCA-3'); (SEQ ID No. 47), 12/96.21(5'-ATTAGAAATCCAGTICACTGCT-3'); (SEQ ID No. 48), 1/97.32(5'-TCATGTCTGGCAAAGTACAAC-3); (SEQ ID No. 49), 11/96.32 (5'-ATTCACTGACGTCACCGA-3'); (SEQ ID No. 50) 및 11/96.31(5'-AAGGCTGTGGCTCTGA-3'); (SEQ ID No. 51) 등이 있다. 두개의 클론을 측정하여 두개의 DNA 점 돌연변이(point mututation)이 있는 것은 제외시키고 원래의 CD80 배열에 부합되는 완전히 길이를 갖춘 CD80을 포함시켰다. 하나의 점 돌연변이는 아미노산 배열에 영향이 주지 않았다. 또 다른 점 돌연변이는 아미노산 배열에 있어 로이신이 이소로이신으로 변화되는 결과를 가져 왔다. 최종적인 고양이의 CD80 클론을 917-19.8/16으로 명명하였다.
실시예 2
S-SPV-229
S-SPV-229는 최소한 둘 이상의 외래 유전자를 발현시키는 돈두 바이러스(swinepox virus)이다. SPV 게놈성 단편인 HindIII M이 BglII에 의해 절단되는 두 부분단편중 큰 BgII~HindIII 부분단편내로 대장균 β-갈락토시다제 유전자(lacZ)와 고양이의 CD80 유전자를 SPV AccI 부위에 삽입시켰다(비반복 Not I 제한부위는 비반복 AccI 제한부위로 교체됨). 상기 lacZ 유전자는 후기 합성 프로모터(LP1)에 의해 조절되고 있으며 고양이의 CD80 유전자는 전기 또는 후기 합성 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절되고 있다.
S-SPV-229는 S-SPV-001(Kasza 균주)로부터 유래되었다. 상기 바이러스는 상동벡터인 930-23.A1(상기한 재료 및 시험방법을 참조) 및 재조합 SPV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러스 S-SPV-001에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제를 발현시키는 재조합 SPV 스크린법에 따라 스크린되었다(BLUOGAL 및 CPRG 정량법). 상기 재조합 바이러스는 적색 용균반 정제를 거친 후에 S-SPV-229로 명명되었다. β-갈락토시다제의 발현, 순도 및 삽입안정성을 확인하기 위하여 상기 재료 및 시험방법에서 언급한 바 있는 청색 용균반 정량법 및 흑색 용균반 검정법에 따라 모니터한 다중 계대접종을 거쳐 S-SPV-229를 정량하였다. 최초 3회에 걸친 정제과정에서 관찰된 모든 용균반은 청색을 나 타내었는데 이는 상기 바이러스가 순수하고, 안정하며 β-갈락토시다제를 발현시키고 있음을 보여주고 있다(미합중국 특허 제5,382,425호는 참고적으로 본 특허에 포함되었다).
β-갈락토시다제에 특이적인 항원을 발현시키기 위하여 재조합 SPV에서 외래 유전자를 발현시키기 위한 적색 용균반 스크린규정에 따라 S-SPV-229를 정량하였다. β-갈락토시다제에 대한 모노클로날 항체는 S-SPV-229 용균반과 특이적으로 반응하였으나 S-SPV-001 음성대조 용균반과는 반응하지 않았다. β-갈락토시다제에 대한 모노클로날 항체와 반응하여 관찰된 모든 S-SPV-229 용균반읕 통하여 상기 바이러스는 β-갈락토시다제의 외래 유전자를 안정하게 발현시키고 있음을 보여주고 있다. 본 발명에 따른 상기 정량법을 ESK-4 세포에 실시하였은데, 그 결과 상기 ESK-4 세포가 SPV 재조합 백신의 생산에 있어 적절한 기질이 될 수 있음이 밝혀졌다.
고양이의 CD80에 특이적인 항원을 발현시키기 위하여 재조합 SPV, RPV 또는 FHV로부터 고양이의 CD80 (B7-1) 및 CD86(B7-2)을 발현시키기 위한 흑색 용균반 스크린법에 따라 S-SPV-229를 정량하였다. 인간 CTLA-4/Fc 키메릭성 항체는 S-SPV-229 용균반과 특이적으로 반응하였으나(고양이의 CD80을 발현시킴), S-SPV-001 음성대조 용균반과는 반응하지 않았다. 인간 CTLA-4/Fc 키메릭성 항체와 반응하여 관찰된 모든 S-SPV-229 용균반읕 통하여 상기 바이러스는 CD80의 외래 유전자를 안정하게 발현시키고 있음을 보여주고 있다.
고양이의 CD80 유전자생성물에 대한 발현을 확인하기 위하여 해당 세포를 S- SPV-229에 감염시키고 그 감염된 세포용해질의 검체를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 상기 겔을 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 방법으로 블롯팅하여 분석하였다.
S-SPV-229는 고양이과 동물에 발생하는 질병에 대하여 백신으로서 유용한 효과를 나타낸다. S-SPV-229는 단독 사용하거나 FIV, FeLV, FIP 또는 기타 고양이에 대한 백신을 병용하여 사용시에 FIV, FeLV, FIP 또는 기타 고양이에 대한 질병에 대하여 백신의 치료효과를 개선시킨다. 또한, S-SPV-229는 고양이의 CD80 폴리펩타이드를 발현시키는데 유용하다. S-SPV-229에 의해 감염된 세포의 용해질을 마우스나 토끼에 주사하면 고양이의 CD80에 대한 폴리클로날 및 단일특이적 항체를 증가시키게 된다.
실시예 3
S-SPV-230
S-SPV-230은 최소한 둘 이상의 외래 유전자를 발현시키는 돈두 바이러스(swinepox virus)이다. SPV 게놈성 단편인 HindIII M이 BglII에 의해 절단되는 두 부분단편중 큰 BgII~HindIII 부분단편내로 대장균 β-갈락토시다제 유전자(lacZ)와 고양이의 CD28 유전자를 SPV AccI 부위에 삽입시켰다(비반복 Not I 제한부위는 비반복 AccI 제한부위로 교체됨). 상기 lacZ 유전자는 후기 합성 프로모터(LP1)에 의해 조절되고 있으며 고양이의 CD80 유전자는 전기 또는 후기 합성 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절되고 있다.
S-SPV-230은 S-SPV-001(Kasza 균주)로부터 유래되었다. 상기 바이러스는 상동벡터인 930-26.A1(상기한 재료 및 시험방법을 참조) 및 재조합 SPV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러스 S-SPV-001에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제를 발현시키는 재조합 SPV 스크린법에 따라 스크린되었다(BLUOGAL 및 CPRG 정량법). 상기 재조합 바이러스는 적색 용균반 정제를 거친 후에 S-SPV-230로 명명되었다. β-갈락토시다제의 발현, 순도 및 삽입안정성을 확인하기 위하여 상기 재료 및 시험방법에서 언급한 바 있는 청색 용균반 정량법 및 흑색 용균반 검정법에 따라 모니터한 다중 계대접종을 거쳐 S-SPV-230을 정량하였다. 최초 3회에 걸친 정제과정에서 관찰된 모든 용균반은 청색을 나타내었는데 이는 상기 바이러스가 순수하고, 안정하며 외래 유전자를 발현시키고 있음을 보여주고 있다. 본 발명에 따른 상기 정량법을 ESK-4 세포에 실시하였은데, 그 결과 상기 ESK-4 세포가 SPV 재조합 백신의 생산에 있어 적절한 기질이 될 수 있음이 밝혀졌다.
고양이의 CD26 유전자생성물에 대한 발현을 확인하기 위하여 해당 세포를 S-SPV-230에 감염시키고 그 감염된 세포용해질의 검체를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 상기 겔을 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 방법으로 블롯팅하여 분석하였다.
S-SPV-230은 고양이과 동물에 발생하는 질병에 대하여 백신으로서 유용한 효과를 나타낸다. S-SPV-230은 단독 사용하거나 FIV, FeLV, FIP 또는 기타 고양이에 대한 백신을 병용하여 사용시에 FIV, FeLV, FIP 또는 기타 고양이에 대한 질병에 대하여 백신의 치료효과를 개선시킨다. 또한, S-SPV-230은 고양이의 CD28 폴리펩타이드를 발현시키는데 유용하다. S-SPV-230에 의해 감염된 세포의 용해질을 마우스나 토끼에 주사하면 고양이의 CD28에 대한 폴리클로날 및 단일특이적 항체를 증가시키게 된다.
실시예 4
S-SPV-225
S-SPV-225는 최소한 둘 이상의 외래 유전자를 발현시키는 돈두 바이러스(swinepox virus)이다. SPV 게놈성 단편인 HindIII M이 BglII에 의해 절단되는 두 부분단편중 큰 BgII~HindIII 부분단편내로 대장균 β-갈락토시다제 유전자(lacZ)와 고양이의 CD28 인터페론-γ유전자 (고양이의 IFN-γ)를 SPV AccI 부위에 삽입시켰다(비반복 Not I 제한부위는 비반복 AccI 제한부위로 교체됨). 상기 lacZ 유전자는 돈두 바이러스(swinepox virus) 프로모터(OlL)의 조절을 받고 있으며 고양이의 IFN-γ 유전자는 전기 또는 후기 합성 프로모터(LP2EP2)의 조절되고 있다.
S-SPV-225는 S-SPV-001(Kasza 균주)로부터 유래되었다. 상기 바이러스는 상동벡터인 917-60.B9(상기한 재료 및 시험방법을 참조) 및 재조합 SPV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러스 S-SPV-001에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제를 발현시키는 재조합 SPV 스크린법에 따라 스크린되었다(BLUOGAL 및 CPRG 정량법). 상기 재조합 바이러스는 적색 용 균반 정제를 거친 후에 S-SPV-225로 명명되었다. β-갈락토시다제의 발현, 순도 및 삽입안정성을 확인하기 위하여 상기 재료 및 시험방법에서 언급한 바 있는 청색 용균반 정량법 및 흑색 용균반 검정법에 따라 모니터한 다중 계대접종을 거쳐 S-SPV-225를 정량하였다. 최초 3회에 걸친 정제과정에서 관찰된 모든 용균반은 청색을 나타내었는데 이는 상기 바이러스가 순수하고, 안정하며 외래 유전자를 발현시키고 있음을 보여주고 있다.
재조합 SPV에서 외래 유전자 발현을 위한 흑색 용균반 스크린법을 사용하여 고양이의 IFN-γ에 특이적 항원을 발현시키기 위하여 S-SPV-225를 정량하였다. 본 발명에 따른 상기 정량법을 ESK-4 세포에 실시하였는데, 그 결과 상기 ESK-4 세포가 SPV 재조합 백신의 생산에 있어 적절한 기질이 될 수 있음이 밝혀졌다.
고양이의 IFN-γ 유전자생성물에 대한 발현을 확인하기 위하여 해당 세포를 S-SPV-225에 감염시키고 그 감염된 세포용해질의 검체를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 상기 겔을 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 방법으로 블롯팅하여 분석하였다.
S-SPV-225는 고양이과 동물에 발생하는 질병에 대하여 백신으로서 유용한 효과를 나타낸다. S-SPV-225는 단독 사용하거나 FIV, FeLV, FIP 또는 기타 고양이에 대한 백신을 병용하여 사용시에 FIV, FeLV, FIP 또는 기타 고양이에 대한 질병에 대하여 백신의 치료효과를 개선시킨다.
실시예 5
S-SPV-200
S-SPV-200은 세가지의 외래 유전자를 발현시키는 돈두 바이러스(swinepox virus)이다. 고양이의 면역결핍바이러스(FIV) gag/프로테아제 유전자, FIV 피막 유전자(완전한 길이를 갖춤) 및 대장균 β-갈락토시다제 유전자(lacZ)를 Not I 제한부위에 삽입시켰다(링커 Not I는 SPV HindIII M 단편의 O1L ORF에서 비반복 AccI 제한부위에 삽입됨). FIVgag/프로테아제 및 피막 유전자는 별개이면서도 전기 또는 후기 합성 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절되고 있다. lacZ 유전자는 후기 합성 프로모터(LP1)에 의해 조절되고 있다.
S-SPV-200은 S-SPV-001(Kasza 균주)로부터 유래되었다. 상기 바이러스는 상동벡터인 904-63.B7 및 재조합 SPV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러스 S-SPV-001에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제를 발현시키는 재조합 SPV 스크린법에 준하여 스크린되었다(BLUOGAL/CPRG 정량법 및 효소학적 마커유전자를 발현시키는 재조합 헤르페스 바이러스에 대한 스크린법). 상기 재조합 바이러스는 적색 용균반 정제를 거친 후에 S-SPV-157로 명명되었다. β-갈락토시다제의 발현을 확인하기 위하여 상기 재료 및 시험방법에서 언급한 바 있는 청색 용균반 정량법을 이용하여 상기 바이러스를 정량하였다. 5회에 거친 계대접종을 실시한 후에 흑색 용균반 정량법에 따른 FIVgag 및 β-갈락토시다제의 검출과 웨스톤 블롯 정량법에 따른 FIVgag 및 피막의 검출을 통하여 순도 및 삽입안정성에 대한 분석을 실시하였다.
S-SPV-200은 FIVgag/프로테아제 및 FIV 피막을 발현시키는 돈두 바이러스(swinepox virus)이며 고양이과 동물에 발생하는 FIV 감염증에 대하여 백신으로서 유용한 효과를 나타낸다. 또한, S-SPV-200은 FIVgag/프로테아제 및 FIV 피막을 발현시키는데 유용하다.
실시예 6
S-SPV-233
S-SPV-233은 다섯가지의 외래 유전자, 즉 FIVgag, FIVenv, 고양이의 CD80, 대장균 lacZ 및 대장균 uidA를 발현시키는 돈두 바이러스(swinepox virus)이다.. 완전한 길이를 갖춘 CD80 유전자와 대장균 β-글루크로니다제 유전자(uidA)를 비반복 Not I 영역에 삽입시켰다(링커 Not I는 SPV HindIII K 단편의 약 3.2 kb 영역(SEQ ID No.)내에서 비반복 EcoRI 제한부위에 삽입됨). 고양이의 면역결핍바이러스(FIV) gag/프로테아제, FIV 피막(완전한 길이를 갖춤) 및 대장균 β-갈락토시다제 유전자(lacZ)를 Not I 제한부위에 삽입시켰다(링커 Not I는 SPV HindIII M 단편의 O1L ORF에서 비반복 AccI 제한부위에 삽입됨). 상기 CD80 유전자는 전기 또는 후기 합성 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절되고 있으며, uidA 유전자는 개별적이고 전기 합성 비반복 프로모터(EP2)에 의해 조절되고 있다. FIVgag/프로테아제 및 피막 유전자는 별개이면서도 전기 또는 후기 합성 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절되고 있다. lacZ 유전자는 후기 합성 프로모터(LP1)에 의해 조절되고 있다(PCT 국제출원 WO 96/22363은 참고적으로 본 특허에 포함되었다).
S-SPV-233 바이러스는 S-SPV-200에서 유래되었다(FIVgag, FIVenvelope 및 대 장균 lacz 유전자를 함유). 상기 바이러스는 상동벡터인 931-21.A1 및 재조합 SPV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러스 S-SPV-200에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제를 발현시키는 재조합 SPV 스크린법에 따라 스크린되었다(X-gLUC 및 효소학적 마커유전자를 발현시키는 재조합 헤르페스 바이러스에 대한 스크린법). 상기 재조합 바이러스는 청색 및 녹색 용균반 정제를 거친 후에 재조합 바이러스 S-SPV-233으로 명명되었다.
고양이의 CD80에 특이적인 항원을 발현시키기 위하여 재조합 SPV, RPV 또는 FHV로부터 고양이의 CD80 (B7-1) 및 CD86(B7-2)을 발현시키기 위한 흑색 용균반 스크린법에 따라 S-SPV-233를 정량하였다. 인간 CTLA-4/Fc 키메릭성 항체는 S-SPV-233 용균반과 특이적으로 반응하였으나(고양이의 CD80을 발현시킴), S-SPV-001 음성대조 용균반과는 반응하지 않았다. 인간 CTLA-4/Fc 키메릭성 항체와 반응하여 관찰된 모든 S-SPV-233 용균반읕 통하여 상기 바이러스는 CD80의 외래 유전자를 안정하게 발현시키고 있음을 보여주고 있다.
FIV gag, FIV 피막 및 고양이의 CD80 유전자생성물에 대한 발현을 확인하기 위하여 해당 세포를 S-SPV-233에 감염시키고 그 감염된 세포용해질의 검체를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 상기 겔을 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 방법으로 블롯팅하여 분석하였다.
S-SPV-233은 FIVgag/프로테아제 및 FIV 피막을 발현시키는 돈두 바이러스(swinepox virus)이며 고양이과 동물에 발생하는 FIV 감염증에 대하여 백신으로서 유용한 효과를 나타낸다. 또한, S-SPV-233은 FIVgag/프로테아제 및 FIV 피막 단백질을 발현시키는데 유용하다.
실시예 7
S-SPV-235
S-SPV-235는 다섯가지의 외래 유전자, 즉 FIVgag, FIVenv, 고양이의 IFN-γ, 대장균 lacZ 및 대장균 uidA을 발현시키는 돈두 바이러스(swinepox virus)이다. 완전한 길이를 갖춘 IFN-γ 유전자와 대장균 β-글루크로니다제 유전자(uidA)를 비반복 Not I 영역에 삽입시켰다(링커 Not I는 6.7 kb인 SPV HindIII K 단편의 약 3.2 kb 영역(SEQ ID No.)내에서 비반복 EcoRI 제한부위에 삽입됨). 고양이의 면역결핍바이러스(FIV) gag/프로테아제, FIV 피막(완전한 길이를 갖춤) 및 대장균 β-갈락토시다제 유전자(lacZ)를 Not I 제한부위에 삽입시켰다(링커 Not I는 SPV의 HindIII M 단편의 O1L ORF에서 비반복 AccI 제한부위에 삽입됨). 상기 IFN-γ 유전자는 전기 또는 후기 합성 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절되고 있으며, uidA 유전자는 개별적이고 전기 합성 비반복 프로모터(EP2)에 의해 조절되고 있다. FIVgag/프로테아제 및 피막 유전자는 별개이면서도 전기 또는 후기 합성 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절되고 있다. lacZ 유전자는 후기 합성 프로모터(LP1)에 의해 조절되고 있다.
S-SPV-235 바이러스는 S-SPV-200에서 유래되었다(FIVgag, FIVenvelope 및 대장균 lacz 유전자를 함유). 상기 바이러스는 상동벡터인 931-55.B12 및 재조합 SPV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러스 S-SPV-200에 의거하여 제조된 것이 다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-글루크로니다제를 발현시키는 재조합 SPV 스크린법에 따라 스크린되었다(X-gLUC 및 효소학적 마커유전자를 발현시키는 재조합 헤르페스 바이러스에 대한 스크린법). 상기 재조합 바이러스는 청색 및 녹색 용균반 정제를 거친 후에 재조합 바이러스 S-SPV-235로 명명되었다.
고양이의 생물학적 활성을 지니고 있는 IFN-γ을 발현시키기 위하여 흑색 용균반 스크린법에 의해 발현된 고양이의 인터페론-γ 생물학적활성도에 대한 스크린법을 사용하여 S-SPV-235를 정량하였다.
FIV gag, FIV 피막 및 고양이의 IFN-γ 유전자생성물에 대한 발현을 확인하기 위하여 해당 세포를 S-SPV-235에 감염시키고 그 감염된 세포용해질의 검체를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 상기 겔을 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 방법으로 블롯팅하여 분석하였다.
S-SPV-235는 FIVgag/프로테아제 및 FIV 피막을 발현시키는 재조합 돈두 바이러스(swinepox virus)이며 고양이과 동물에 발생하는 FIV 감염증에 대하여 백신으로서 유용한 효과를 나타낸다. 또한, S-SPV-235는 FIVgag/프로테아제 및 FIV 피막 단백질을 발현시키는데 유용하다.
실시예 8
S-SPV-224
S-SPV-224는 세가지의 외래 유전자를 발현시키는 돈두 바이러스(swinepox virus)이다. 고양이의 백혈병 바이러스 (FeLV) gag/프로테아제, FeLV 피막(완전한 길이를 갖춤) 및 대장균 lacZ 유전자를 SPV의 부분적 HindIII N 게놈성 단편(1869 bp)에서 유래된 결실(deleted) SPV 15L 부위에 삽입시켰다. FeLV gag/프로테아제 유전자는 전기 합성 마마(pox) 프로모터(EP2)에 의해 조절되고 있으며 lacZ 유전자는 구성성(constitutive)이 늦은 SPV 15 프로모터에 의해 조절되고 있다.
S-SPV-224 바이러스는 S-SPV-200에서 유래되었다 (Kasza 균주). 상기 바이러스는 상동벡터인 921-65.B5 및 재조합 RPV, SPV 또는 FHV을 제조하기 위한 상동재조합기법에 따른 바이러스 S-SPV-200에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제를 발현시키는 재조합 RPV, SPV 또는 FHV 스크린법(BLUOGAL 및 CPRG 정량법 또는 X-GLUCASSAYS)에 따라 스크린되었다. 상기 재조합 바이러스는 적색 용균반 정제를 거친 후에 재조합 바이러스 S-SPV-224로 명명되었다. 상기한 재료 및 시험방법에서 설명한 바와 같이 β-갈락토시다제를 발현시키기 위하여 청색 용균반 산에 의해 상기 바이러스를 정량하였다.
FeLV gag/프로테아제, FeLV 피막 및 β-글루크로니다제을 발현시키기 위하여 재조합 RPV, SPV 또는 FHV에서 흑색 용균반 정량법에 따른 외래 유전자 발현관련 스크린법을 사용하여 S-SPV-224를 정량하였다. 본 발명에 따른 상기 정량법을 ESK-4 세포에 실시하였는데, 그 결과 상기 ESK-4 세포가 SPV 재조합 백신의 생산에 있어 적절한 기질이 될 수 있음이 밝혀졌다.
FeLV gag/프로테아제 및 FeLV 피막 유전자생성물에 대한 발현을 확인하기 위하여 해당 세포를 S-SPV-224에 감염시키고 그 감염된 세포용해질의 검체를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 상기 겔을 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 방법으로 블롯팅하여 분석하였다.
S-SPV-235는 FeLV gag/프로테아제 및 FeLV 피막 단백질을 발현시키는 재조합 돈두 바이러스(swinepox virus)이며 고양이과 동물에 발생하는 FeLV 감염증에 대하여 백신으로서 유용한 효과를 나타낸다. 또한, S-SPV-224는 FeLV gag/프로테아제 및 FeLV 피막 단백질을 발현시키는데 유용하다.
실시예 9
S-SPV-246
S-SPV-246는 다섯가지의 외래 유전자, 즉 FeLV gag/프로테아제, FeLVenv, 고양이의 CD80, 대장균 lacZ 및 대장균 uidA을 발현시키는 돈두 바이러스(swinepox virus)이다. 완전한 길이를 갖춘 고양이의 CD80 유전자와 대장균 β-글루크로니다제 유전자(uidA)를 비반복 Not I 영역에 삽입시켰다(링커 Not I는 6.7 kb인 SPV HindIII K 단편의 약 3.2 kb 영역(SEQ ID No.)내에서 비반복 EcoRI 제한부위에 삽입됨). 상기 CD80 유전자는 전기 또는 후기 합성 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절되고 있으며 uidA 유전자는 전기 합성 마마 프로모터(EP2)에 의해 조절되고 있다. FeLV gag/프로테아제, FeLVenv 및 대장균 β-갈락토시다제(lacz) 유전자를 1869 부분적 HindIII N 게놈성 단편에서 유래된 결실(deleted) I5L 부위에 삽입되었다. FeLV gag/프로테아제 유전자는 전기 합성 마마 프로모터(EP2)에 의해 조절되고 있으며 FeLV 피막 유전자는 전기 합성 마마 프로모터(EP1)에 의해 조절되고 있다. 또한, lacZ 유전자는 구성성(constitutive)이 늦은 SPV 15 프로모터에 의해 조절되고 있다(PCT 국제출원 WO 96/22363은 참고적으로 본 특허에 포함되었다).
S-SPV-246 바이러스는 S-SPV-224에서 유래되었다(I5L이 결실된(deleted) 1869 kb 부분적 HindIII N 단편에 있는 FeLV gag/프로테아제, FeLV 피막 및 대장균 lacZ 유전자를 함유). 상기 바이러스는 상동벡터인 931-55.B12 및 상기 바이러스는 상동벡터인 931-21.A1 및 재조합 RPV, SPV 또는 FHV을 제조하기 위한 상동재조합기법에 따른 바이러스 S-SPV-224에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제를 발현시키는 재조합 RPV, SPV 또는 FHV 스크린법(BLUOGAL 및 CPRG 정량법 또는 X-GLUCASSAYS)에 따라 스크린되었다. 상기 재조합 바이러스는 적색 및 녹색 용균반 정제를 거친 후에 재조합 바이러스 S-SPV-226로 명명되었다.
FeLV gag/프로테아제 및 FeLV 피막 단백질을 발현시키기 위하여 재조합 RPV, SPV 또는 FHV에서 흑색 용균반 정량법에 따른 외래 유전자 발현관련 스크린법을 사용하여 S-SPV-246를 정량하였다. 본 발명에 따른 상기 정량법을 ESK-4 세포에 실시하였는데, 그 결과 상기 ESK-4 세포가 SPV 재조합 백신의 생산에 있어 적절한 기질이 될 수 있음이 밝혀졌다.
고양이의 CD80에 특이적인 항원을 발현시키기 위하여 재조합 SPV, RPV 또는 FHV로부터 고양이의 CD80 (B7-1) 및 CD86(B7-2)을 발현시키기 위한 흑색 용균반 스크린법에 따라 S-SPV-246를 정량하였다. 인간 CTLA-4/Fc 키메릭성 항체는 S-SPV-246 용균반과 특이적으로 반응하였으나(고양이의 CD80을 발현시킴), S-SPV-001 음성대조 용균반과는 반응하지 않았다. 인간 CTLA-4/Fc 키메릭성 항체와 반응하여 관 찰된 모든 S-SPV-246 용균반읕 통하여 상기 바이러스는 CD80의 외래 유전자를 안정하게 발현시키고 있음을 보여주고 있다.
FeLV gag/프로테아제, FeLV 피막, 고양이의 CD80 유전자생성물에 대한 발현을 확인하기 위하여 해당 세포를 S-SPV-246에 감염시키고 그 감염된 세포용해질의 검체를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 상기 겔을 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 방법으로 블롯팅하여 분석하였다.
S-SPV-235는 FeLV gag/프로테아제 및 FeLV 피막 단백질을 발현시키는 제조합 돈두 바이러스(swinepox virus)이며 고양이과 동물에 발생하는 FeLV 감염증에 대하여 백신으로서 유용한 효과를 나타낸다. 또한, S-SPV-224는 FeLV gag/프로테아제 및 FeLV 피막 단백질을 발현시키는데 유용하다.
실시예 10
고양이의 면역결핍바이러스(FIV), 고양이의 백혈병 바이러스(FeLV) 또는 고양이의 감염성 복막염(FIP)에 대하여 백신으로서 유용한 재조합 돈두 바이러스(swinepox virus)의 추가적인 실시예는 다음과 같다.
재조합 돈두 바이러스(swinepox virus)는 다섯가지의 외래 유전자를 발현하는데, 즉 FIV 피막 유전자는 전기 합성 마마(pox) 프로모터(EPI)에 의해 조절되며, FIV gag/프로테아제 유전자는 전기 합성 마마(pox) 프로모터(EP2)에 의해 조절된다. 또한, 대장균 lacZ 유전자는 돈두 바이러스(swinepox virus) 프로모터(I5L)에 의해 조절되며, 고양이의 CD80 유전자는 전기 또는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절된다. 마지막으로 대장균 uidA 유전자는 전기 합성 마마(pox) 프로모터(EP2)에 의해 조절된다. 상기 FIV 피막 유전자, FIV gag/프로테아제 유전자 및 대장균 lacZ 유전자는 고양이의 CD80 및 대장균 uidA 유전자의 삽입부위와 비교하여 분명히 다른 비필수적 SPV 삽입부위에 위치하고 있다.
재조합 돈두 바이러스(swinepox virus)는 다섯가지의 외래 유전자를 발현하는데, 즉 고양이의 CD86 유전자는 전기 또는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절되며 대장균 uidA 유전자는 전기 합성 마마(pox) 프로모터(EP2)에 의해 조절된다. 상기 바이러스는 단독, 또는 다른 재조합 단백질이나 백신과 함께 병용하여 사용될 수 있다.
FeLV 질병에 치료효과를 가지고 있는 백신생산에 유용한 재조합 돈두 바이러스(swinepox virus)의 추가적인 실시예는 FIV 유전자를 비교대상이 될 수 있는 FeLV에 특이적 유전자로 교체할 수 있는 것을 제외하고는 상기에 설명한 것과 동일하다.
폴리클로날 항체 생산 및 정제를 위한 백신의 용도로서 단백질 생산에 유용한 돈두 바이러스(swinepox virus)의 추가적인 실시예는 다음과 같다.
재조합 돈두 바이러스(swinepox virus)는 하나의 외래 유전자를 발현하는데, 막투과 영역이 결여되어 있는 고양이의 CD80 유전자는 전기 또는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절된다. 그 대신에 상기 막투과 영역이 결여되어 있는 고양이의 CD80 유전자는 그 카복실기 말단에 히스티딘 tag 융합(fusion)을 가지고 있음으로 니켈친화성 칼럼상에서 정제를 시킬 수 있다.
재조합 돈두 바이러스(swinepox virus)는 하나의 외래 유전자를 발현하는데, 막투과 영역이 결여되어 있는 고양이의 CD28 유전자는 전기 또는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절된다. 그 대신에 상기 막투과 영역이 결여되어 있는 고양이의 CD28 유전자는 그 카복실기 말단에 히스티딘 tag 융합(fusion)을 가지고 있음으로 니켈친화성 칼럼상에서 정제를 시킬 수 있다.
재조합 돈두 바이러스(swinepox virus)는 하나의 외래 유전자를 발현하는데, 막투과 영역이 결여되어 있는 고양이의 CD86 유전자는 전기 또는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절된다. 그 대신에 상기 막투과 영역이 결여되어 있는 고양이의 CD86 유전자는 그 카복실기 말단에 히스티딘 tag fusion을 가지고 있음으로 니켈친화성 칼럼상에서 정제를 시킬 수 있다.
CD80 및 CD86 단백질을 이용하여 관련 분야에서 FIV 및 FeLV 질병치료에 유용한 백신으로서의 재조합 돈두 바이러스(swinepox virus)에 대한 추가적인 실시예는 다음과 같다.
재조합 돈두 바이러스(swinepox virus)는 다섯 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD80 및 CD86 유전자는 전기 또는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LPI)에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진시키며 두개의 개시해독프레임 사이에 하나의 EMCV IRES 인자를 함유한다. 즉, 대장균 uidA 유전자는 전기 합성 프로모터(EP2)에 의해 조절되며 FIV gag/프로테아제 유전자는 돈두 프로모터 (OIL)에 의해 조절된다. 또한, 대장균 LacZ 유전자는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LPI)에 의해 조절된다. 상기 CD80 및 CD86 유전자 그리고 대장균 uidA 유전자는 FIVgag/프로테아제 및 대장균 lacZ 유전자의 삽입부위와 비교하여 분명히 다른 비필수적 SPV 삽입부위에 위치하고 있다.
재조합 돈두 바이러스(swinepox virus)는 다섯 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 전기 또는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LPI)에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진시키며 두개의 개시해독프레임 사이에 하나의 EMCV IRES 인자를 함유한다. 즉, 대장균 lacZ 유전자는 후기 합성 프로모터(LP1)에 의해 조절되며, FIV 피막 유전자는 전기 합성 마마(pox) 프로모터(EPI)에 의해 조절된다.
대장균 uidA 유전자는 후기 합성 프로모터(LP1)에 의해 조절된다. 상기 CD80 및 CD86 단백질 그리고 대장균 uidA 유전자는 FIVgag/프로테아제 및 대장균 lacz 유전자의 삽입부위와 비교하여 분명히 다른 비필수적 SPV 삽입부위에 위치하고 있다.
재조합 돈두 바이러스(swinepox virus)는 여섯 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LPI)에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진시키며 두개의 개시해독프레임 사이에 하나의 EMCV IRES 인자를 함유한다. 즉, 대장균 uidA 유전자는 전기 합성 프로모터(EP2)에 의해 조절되며, FIV gag/프로테아제 유전자는 전기 합성 마마(pox) 프로모터(EP2)에 의해 조절된다. 또한, FIV 엔벨레프 유전자는 전기 합성 마마(pox) 프로모터(EP1)에 의해 조절되며 대장균 LacZ 유전자는 SPV 15 프로모터에 의해 지속적으로 조절되고 있다. 상기 CD80 및 CD86 유전자 그리고 대장균 uidA 유전자는 FIV 엔벨레프, FIVgag/프로테아제 및 대장균 lacZ 유전자의 삽입부위와 비교하여 분명히 다른 비필수적 SPV 삽입부위에 위치하고 있다.
관련분야에서 FeLV 백신의 용도로 유용한 재조합 돈두 바이러스(swinepox virus)의 추가적인 실시예는 FIV 유전자를 비교대상이 될 수 있는 FeLV에 특이적 유전자생성물로 교체할 수 있는 것을 제외하고는 상기에 설명한 것과 동일하다.
실시예 11
고양이의 면역결핍바이러스(FIV), 고양이의 백혈병 바이러스(FeLV) 또는 고양이의 감염성 복막염(FIP)에 대하여 백신으로서 유용한 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스의 추가적인 실시예는 다음과 같다.
재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스는 두가지 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86은 전기 또는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LPI)에 의해 조절되며 대장균 lacZ은 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LPI)에 의해 조절된다.
폴리클로날 항체 생산 및 정제를 위한 백신의 용도로서 단백질 생산에 유용한 재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스의 추가적인 실시예는 다음과 같다.
재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스는 하나의 외래 유전자를 발현하는데, 막투과 영역이 결여되어 있는 고양이의 CD80 유전자는 전기 또는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절된다. 그 대신에 상기 막투과 영역이 결여되어 있는 고양이의 CD80 유전자는 그 카복실기 말단에 히스티딘 tag 융합(fusion)을 가지고 있음으로 니켈친화성 칼럼상에서 정제를 시킬 수 있다.
재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스는 하나의 외래 유전자를 발현하는데, 막투과 영역이 결여되어 있는 고양이의 CD28 유전자는 전기 또는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절된다. 그 대신에 상기 막투과 영역이 결여되어 있는 고양이의 CD28 유전자는 그 카르복실기 말단에 히스티딘 tag 융합(fusion)을 가지고 있음으로 니켈친화성 칼럼상에서 정제를 시킬 수 있다.
재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스는 하나의 외래 유전자를 발현하는데, 막투과 영역이 결여되어 있는 고양이의 CD86 유전자는 전기 또는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절된다. 그 대신에 상기 막투과 영역이 결여되어 있는 고양이의 CD86 유전자는 그 카르복실기 말단에 히스티딘 tag 융합(fusion)을 가지고 있으므로 니켈친화성 칼럼상에서 정제를 시킬 수 있다.
재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스는 네 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 전기 또는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LPI)에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진시키며 두개의 개시해독프레임 사이에 하나의 EMCV IRES 인자를 함유하며, 또한 두번째의 하류 유전자인 CD80의 번역을 촉진한다. FIV gag 유전자는 돈두 프로모터 (OIL)에 의해 조절되며 대장균 uidA 유전자는 전기 합성 마마(pox) 프로모터(E2)에 의해 조절된다.
재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스는 네 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 전기 또는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LPI)에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진시키며 두개의 개시해독프레임 사이에 하나의 EMCV IRES 인자를 함유하며, 또한 두번째의 하류 유전자인 CD80의 번역을 촉진한다. FIV 엔벨레프 유전자는 전기 합성 마마(pox) 프로모터(E1)에 의해 조절되며 대장균 uidA 유전자는 전기 합성 마마(pox) 프로모터(E2)에 의해 조절된다.
재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스는 네 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 전기 또는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LPI)에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진시키며 두개의 개시해독프레임 사이에 하나의 EMCV IRES 인자를 함유하며, 또한 두번째의 하류 유전자인 CD80의 번역을 촉진한다. FIVgag 유전자는 전기 합성 마마(pox) 프로모터(E1)에 의해 조절되며 대장균 uidA 유전자는 전기 합성 마마(pox) 프로모터(E2)에 의해 조절된다.
고양이의 면역결핍바이러스(FIV), 고양이의 백혈병 바이러스(FeLV) 또는 고양이의 감염성 복막염(FIP)에 대하여 백신으로서 유용한 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스의 추가적인 실시예는 다음과 같다.
재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스는 두 가지의 외래 유전자를 발현하는데, 고양이의 CD86 유전자는 전기 또는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절되며 대장균 lacZ 유전자는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LP1)에 의해 조절된다.
CD80 및 CD86 단백질을 이용하면서 관련 분야에서 FIV 및 FeLV 질병치료에 유용한 백신으로서의 재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스에 대한 추가적인 실시예는 다음과 같다.
재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스는 네 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LPI)에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진시키며 두개의 개시해독프레임 사이에 하나의 EMCV IRES 인자를 함유한다. FIV gag/프로테아제 유전자는 전기 또는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절되며 대장균 uidA 유전자는 전기 합성 마마(pox) 프로모터(EP2)에 의해 조절된다. 고양이의 CD80/CD86, FIVgag/프로테아제 및 대장균 uidA 유전자는 단일의 비필수적 RPV 부위에 모두 삽입된다.
재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스는 네 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 전기 또는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LP2)에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진시키며 두개의 개시해독프레임 사이에 하나의 EMCV IRES 인자를 함유한다. 대장균 lacZ 유전자는 전기 합성 마마(pox) 프로모터(E1)에 의해 조절되며, 대장균 uidA 유전자는 전기 합성 마마(pox) 프로모터(E2)에 의해 조절된다. 고양이의 CD80/CD86, FIV 피막 및 대장 균 uidA 유전자는 단일의 비필수적 RPV 부위에 모두 삽입된다.
재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스는 네 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LPI)에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진시키며 두개의 개시해독프레임 사이에 하나의 EMCV IRES 인자를 함유한다. 대장균 lacZ 유전자는 후기 합성 마마(pox) 프로모터에 의해 조절되며 FIVgag/프로테아제 유전자는 전기 합성 프로모터(EP2)에 의해 조절된다. FIV 피막 유전자는 전기 합성 마마(pox) 프로모터(EP2)에 의해 조절되며 FIV 엔벨레프 유전자는 전기 합성 마마(pox) 프로모터(EP1)에 의해 조절된다. 대장균 uidA 유전자는 전기 합성 마마(pox) 프로모터(EP2)에 의해 조절된다.
상기 CD80 및 CD86 단백질 그리고 대장균 lacZ 유전자는 uidA 유전자는 FIVgag/프로테아제 및 대장균 uidA 유전자의 삽입부위와 비교하여 분명히 다른 비필수적 SPV 삽입부위에 위치하고 있다.
관련분야에서 FeLV 백신의 용도로 유용한 재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스의 추가적인 실시예는 FIV 유전자를 비교대상이 될 수 있는 FeLV에 특이적 유전자생성물로 교체할 수 있는 것을 제외하고는 상기에 설명한 것과 동일하다.
실시예 12
S-FHV-020
S-FHV-020 바이러스는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스로서 전체의 FHV gE 유전자(1638개의 염기쌍) 중에 하나의 결실(deletion)을 가지고 있으므로 대장균 lacZ 유전자가 상기 결실된 gE 부위에 삽입된다. 상기 대장균 lacZ 유전자는 FHV gE 프로모터에 의해 지속적으로 전사-조절된다.
S-FHV-020 바이러스는 S-FHV-001에서 유래되었다(NVSV 균주). 상기 바이러스는 상동벡터인 486-88.B17 및 재조합 RPV, SPV 또는 FHV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러스 S-FHV-001에 의거하여 제조된 것이다. 형질감염주(transfection stock)는 β-갈락토시다제를 발현시키는 재조합 RPV, SPV 또는 FHV의 스크린법에 따라 스크린되었다(BLUOGAL 및 CPRG 정량법, 또는 X-gLUC 정량법). 상기 재조합 바이러스는 청색 용균반 정제를 거친 후에 재조합 바이러스 S-FHV-020으로 명명되었다. 5회에 걸친 계대접종후에 순도 및 삽입안정성에 대한 분석은 재조합 RPV, SPV 또는 FHV에서 흑색 용균반 정량법을 사용한 외래 유전자의 발현스크린법에 의해 β-갈락토시다제를 검출함으로써 실시되었다.
실시예 13
S-FHV-031
S-FHV--031 바이러스는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스로서 전체의 FHV gE 유전자(1638개의 염기쌍) 중에 하나의 결실(deletion)을 가지고 있으므로 세가지의 외래 유전자가 상기 gE 결실부위에 삽입된다. 상기 CD80 유전자는 FHV gE 프로모터에 의해 지속적으로 전사-조절되며 상기 결실된 gE 유전자와 동일한 방향을 향하게 된다. FIV gag/프로테아제 유전자는 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절 되며 FIV 피막 유전자는 즉각적으로 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절된다. FIV gag/프로테아제 및 FIV 피막 유전자는 서로에 대해 동일한 방향을 취하고 있으나 CD80 유전자와는 반대방향을 지향하고 있다.
S-FHV-031 바이러스는 S-FHV-020에서 유래되었다(gE 프로모터 배후에 대장균 lacZ 유전자를 함유). 상기 바이러스는 상동벡터인 942.03.C6(재료 및 시험방법 참조) 및 재조합 RPV, SPV 또는 FHV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러스 S-FHV-020에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제(BLUOGAL 및 CPRG 정량법) 또는 β-글루쿠로니다제(X-GLUCASSAY)를 발현시키는 재조합 RPV, SPV 또는 FHV의 스크린법에 따라 스크린되었다. 재조합 용균반을 백색 용균반 선별법에 의해 선택하여 정제시켰다. 상기 바이러스는 제한 엔도뉴클레아제 지도 및 서던블롯팅 DNA 방법을 특징으로 하고 있다. 상기 분석을 통하여 고양이의 CD80, FIV gag/프로테아제 및 FIV 피막 유전자가 FIV gE 유전자(1638개의 염기쌍)의 결실부위에 삽이된 것을 확인할 수 있었다(PCT 국제출원 WO 96/13575을 참고용으로 첨부하였다).
본 발명의 실시예에서 고양이의 CD80, FIV gag/프로테아제 및 FIV 피막 유전자에 특이적인 항원을 발현시키기 위하여 서던블롯팅 방법을 사용하여 S-FHV-031을 정량하였다. 본 발명의 상기 정량법을 CRFK 세포에 적용하였을 때 상기 CRFK 세포가 재조합 FHV 백신제조에 적합한 기질이 될 수 있음을 확인하였다. 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스에 감염된 세포의 용해질은 고양이의 CD80, FIV gag/프로테아제 및 FIV 피막 유전자의 기대되는 크기에서 밴드형태를 나타내었다.
또는 X-gLUC 정량법). 상기 재조합 바이러스는 청색 용균반 정제를 거친 후에 재조합 바이러스 S-FHV-020으로 명명되었다. 5회에 걸친 계대접종후에 순도 및 삽입안정성에 대한 분석은 재조합 RPV, SPV 또는 FHV에서 흑색 용균반 정량법을 사용한 외래 유전자의 발현스크린법에 의해 β-갈락토시다제를 검출함으로써 실시되었다.
본 발명의 실시예에서 고양이의 CD80에 특이적인 항원을 발현시키기 위하여 재조합 SPV, RPV 또는 FHV로부터 고양이의 CD80 (B7-1) 및 CD86(B7-2)을 발현시키기 위한 흑색 용균반 스크린법에 따라 S-FHV-031을 정량하였다. 인간 CTLA-4/Fc 키메릭성 항체는 재조합 고양이의 헤르페스 바이러스 용균반과 특이적으로 반응하였으나(고양이의 CD80을 발현시킴), S-FHV-001 음성대조 용균반과는 반응하지 않았다. 인간 CTLA-4/Fc 키메릭성 항체와 반응하여 관찰된 모든 재조합 고양이의 헤르페스 바이러스 용균반읕 통하여 상기 바이러스는 CD80의 외래 유전자를 안정하게 발현시키고 있음을 보여주고 있다.
S-FHV-031은 FIV gag/프로테아제, FIV 피막 및 고양이의 CD80 단백질을 발현시키는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스이며 FIV 감염증을 치료하는 백신으로서 유용하다.
실시예 14
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 gE 유전자중에 하나의 결실부위와 상기 결실부위에서 최소한 하나 이상의 유전자가 삽입되는 부위를 가지고 있다. 상기 외래 유전자는 고양이의 CD86 유전자이며 FHV gE 프로모터에 의해 전사-조절된다.
고양이의 CD86 유전자를 발현시키는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 관련 감염증을 치료하는 백신으로서 유용하다. 또한, 상기 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스를 단독 또는 FIV, FeLV, FIP 또는 기타 고양이 백신제제를 병용하여 사용시에 FIV, FeLV, FIP 또는 기타 고양이과 질병에 대하여 백신으로서 우수한 치료효과를 나타낸다.
실시예 15
고양이의 면역결핍바이러스(FIV), 고양이의 백혈병 바이러스(FeLV) 또는 고양이의 감염성 복막염(FIP)에 대하여 백신으로서 유용한 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스의 추가적인 실시예는 다음과 같다.
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 세가지의 외래 유전자를 발현한다. FHV gE 결실부위에서 FeLV 피막 유전자는 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절되며 FIV gag 유전자는 즉각적으로 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절된다. 또한, 고양이의 CD80 유전자는 고양이의 헤르페스 바이러스 gE 프로모터에 의해 조절된다. 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 FHV gI 결실부위에서 세가지의 외래 유전자를 발현한다. FeLV 피막 유전자는 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절되며 FIV gag 유전자는 즉각적으로 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절된다. 또한, 고양이의 CD86 유전자는 고양이의 헤르페스 바이러스 gE 프로모터에 의해 조절된다.
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 세가지의 외래 유전자를 발현한다. FHV gE 결실부위에서 FeLV 피막 유전자는 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절되며 FIV gag 유전자는 즉각적으로 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절된다. 또한, 고양이의 CD86 유전자는 고양이의 헤르페스 바이러스 gE 프로모터에 의해 조절된다.
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 다섯 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진시키며 두개의 개시해독프레임 사이에 하나의 EMCV IRES 인자를 함유한다. 대장균 uidA 유전자는 감염성 라링고트라체이티스(laryngotracheitis) 바이러스 gI 프로모터에 의해 조절된다. 상기 CD80/CD86 및 대장균 uidA 유전자는 비필수적으로 결정된 부위에서 FHV 게놈의 길이가 긴 비반복 영역에 삽입된다. FIV gag/프로테아제 유전자는 즉각적으로 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절되며 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절되는 대장균 lacZ 유전자는 FHV gE 결실부위에 삽입된다.
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 다섯 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진시킨다. 두번째의 하류 CD80 개시해독프레임에 대한 번역은 EMCV IRES 인자에 의해 조절된다. 대장균 uidA 유전자는 감염성 라 링고트라체이티스(laryngotracheitis) 바이러스 gI 프로모터에 의해 조절된다. 상기 CD80/CD86 및 대장균 uidA 유전자는 비필수적으로 결정된 부위에서 FHV 게놈의 길이가 긴 비반복 영역에 삽입된다. FIV 피막 유전자는 즉각적으로 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절되며 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절되는 대장균 lacZ 유전자는 FHV gE 결실부위에 삽입된다.
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 여섯 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진하며 두개의 CD80 개시해독프레임 사이에 EMCV IRES 인자를 포함한다. 대장균 uidA 유전자는 감염성 라링고트라체이티스(laryngotracheitis) 바이러스 gI 프로모터에 의해 조절된다. 상기 CD80/CD86 및 대장균 uidA 유전자는 비필수적으로 결정된 부위에서 FHV 게놈의 길이가 긴 비반복 영역에 삽입된다. FIV 피막 유전자는 즉각적으로 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절된다. 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절되는 FIV gag/프로테아제 유전자 및 FHV gE 프로모터에 의해 조절되는 대장균 lacZ 유전자는 FHV gE 결실부위에 삽입된다.
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 다섯 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진하며 두개의 CD80 개시해독프레임 사이에 EMCV IRES 인자를 포함한다. 대장균 uidA 유전자는 감염성 라링고트라체이티스(laryngotracheitis) 바이러스 gI 프로모터에 의해 조절된다. 상기 CD80/CD86 및 대장균 uidA 유전자는 비필수적으로 결정된 부위에서 FHV 게놈의 길이가 긴 비반복 영역에 삽입된다. FeLVgag/프로테아제 유전자는 즉각적으로 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절된다. 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절되는 대장균 lacZ 유전자는 FHV gE 결실부위에 삽입된다.
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 다섯 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진시킨다. 두번째의 하류 CD80 개시해독프레임에 대한 번역은 EMCV IRES 인자에 의해 조절된다. 대장균 uidA 유전자는 감염성 라링고트라체이티스(laryngotracheitis) 바이러스 gI 프로모터에 의해 조절된다. 상기 CD80/CD86 및 대장균 uidA 유전자는 비필수적 부위에서 FHV 게놈의 비반복 영역에 삽입된다. FIV 피막 유전자는 즉각적으로 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절되며 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절되는 대장균 lacZ 유전자는 FHV gE 결실부위에 삽입된다.
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 여섯 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진하며 두개의 CD80 개시해독프레임 사이에 EMCV IRES 인자를 포함한다. 대장균 uidA 유전자는 감염성 라링고트라체이티스(laryngotracheitis) 바이러스 gI 프로모터에 의해 조절된다. 상기 CD80/CD86 및 대장균 uidA 유전자는 비필수적 부위에서 FHV 게놈의 비반복 영역에 삽입된다. FeLV 피막 유전자는 즉각적으로 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절된다. 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절되는 FIV gag/프로테아제 유전자 및 FHV gE 프로모터에 의해 조절되는 대장균 lacZ 유전자는 FHV gE 결실부위에 삽입된다.
실시예 17
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 gE 유전자중에 하나의 결실부위와 상기 결실부위에서 최소한 하나 이상의 유전자가 삽입되는 부위를 가지고 있다. 상기 외래 유전자는 고양이의 CD80 유전자이며 FHV gE 프로모터에 의해 전사적으로 조절된다.
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 S-FHV-001에서 유래되었다(NVSL 균주). 상기 바이러스는 상동벡터인 926-76.D7(재료 및 시험방법 참조) 및 재조합 헤르페스 바이러스의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러스 S-FHV-001에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 효소학적 마커 유전자를 발현시키는 재조합 헤르페스 바이러스에 관한 상동재조합기법에 스크린되었다. 상기 바이러스는 제한 엔도뉴클레아제 지도 및 서던블롯팅 DNA 방법을 특징으로 하고 있다. 상기 분석을 통하여 고양이의 CD80의 삽입과 FHV gE 유전자(1638개 의 염기쌍)의 결실을 확인할 수 있었다 (PCT 국제출원 WO 96/13575를 참고용으로 첨부하였다).
본 발명의 실시예에서 고양이의 CD80에 특이적인 항원을 발현시키기 위하여 재조합 FHV에서 외래항원의 발현을 위한 흑색 용균반 스크린법에 따라 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스를 정량하였다. 본 발명의 상기 정량법을 CRFK 세포에 적용하였을 때 상기 CRFK 세포가 재조합 RPV 백신제조에 적합한 기질이 될 수 있음을 확인하였다.
본발명의 실시예에서 고양이의 CD80에 특이적인 항원을 발현시키기 위하여 재조합 SPV, RPV 또는 FHV로부터 고양이의 CD80 (B7-1) 및 CD86(B7-2)을 발현시키기 위한 흑색 용균반 스크린법에 따라 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스를 정량하였다. 인간 CTLA-4/Fc 키메릭성 항체는 재조합 고양이의 헤르페스 바이러스 용균반과 특이적으로 반응하였으나(고양이의 CD80을 발현시킴), S-FHV-001 음성대조 용균반과는 반응하지 않았다. 인간 CTLA-4/Fc 키메릭성 항체와 반응하여 관찰된 모든 재조합 고양이의 헤르페스 바이러스 용균반읕 통하여 상기 바이러스는 CD80의 외래 유전자를 안정하게 발현시키고 있음을 보여주고 있다.
고양이의 CD80 유전자생성물이 발현되는 것을 확인하기 위하여 해당세포를 본발명에 따른 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스에 감여시키고 그 감염된 세포용해질 검체를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 이온영동법을 사용하여 분리하였다. 상기 겔을 웨스턴 블롯팅방법에 의해 블롯팅하여 분석하였다. 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스에 감염된 세포의 용해질은 고양이의 단백질의 기대되는 크기에서 밴드형 태를 나타내었다.
실시예 18
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 gE 유전자중에 하나의 결실부위와 상기 결실부위에서 최소한 하나 이상의 유전자가 삽입되는 부위를 가지고 있다. 상기 외래 유전자는 고양이의 CD86 유전자이며 FHV gE 프로모터에 의해 전사적으로 조절된다.
고양이의 CD86 유전자를 발현시키는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 관련 감염증을 치료하는 백신으로서 유용하다. 또한, 상기 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스를 단독 또는 FIV, FeLV, FIP 또는 기타 고양이 백신제제를 병용하여 사용시에 FIV, FeLV, FIP 또는 기타 고양이과 질병에 대하여 백신으로서 우수한 치료효과를 나타낸다.
실시예 19
고양이의 면역결핍바이러스(FIV), 고양이의 백혈병 바이러스(FeLV) 또는 고양이의 감염성 복막염(FIP)에 대하여 백신으로서 유용한 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스의 추가적인 실시예는 다음과 같다.
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 세가지의 외래 유전자를 발현한다. FIV 피막 유전자는 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절되며 FIV gag 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절된다. 또한, 고양이의 CD80 유전자는 고 양이의 헤르페스 바이러스 gE 프로모터에 의해 조절된다.
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 세가지의 외래 유전자를 발현한다. FeLV 피막 유전자는 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절되며 FeLV gag 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절된다. 또한, 고양이의 CD80 유전자는 고양이의 헤르페스 바이러스 gE 프로모터에 의해 조절된다.
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 세가지의 외래 유전자를 발현한다. FIV 피막 유전자는 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절되며 FIV gag 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절된다. 또한, 고양이의 CD86 유전자는 고양이의 헤르페스 바이러스 gE 프로모터에 의해 조절된다.
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 세가지의 외래 유전자를 발현한다. FeLV 피막 유전자는 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절되며 FeLV gag 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절된다. 또한, 고양이의 CD86 유전자는 고양이의 헤르페스 바이러스 gE 프로모터에 의해 조절된다.
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 다섯 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진하며 두개의 CD80 개시해독프레임 사이에 EMCV IRES 인자를 포함하고 있어 두번째의 하류 유전자 CD80의 번역을 촉진한다. 대장균 uidA 유전자는 감염성 라링고트라체이티스(laryngotracheitis) 바이러스 gI 프로모터에 의해 조절되며 FIVgag 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의 해 조절된다. 또한, 대장균 lacZ 유전자는 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절된다. 상기 다섯가지의 유전자는 두개의 분명한 고양이의 헤르페스 바이러스 삽입부위에 함유되어 있다.
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 다섯 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진시킨다. 두번째의 하류 CD80 개시해독프레임에 대한 번역은 EMCV IRES 인자에 의해 조절된다. 대장균 uidA 유전자는 감염성 라링고트라체이티스(laryngotracheitis) 바이러스 gI 프로모터에 의해 조절되며 FIV 피막 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절된다. 또한, 대장균 lacZ 유전자는 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절된다.
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 여섯 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진하며 두개의 CD80 개시해독프레임 사이에 EMCV IRES 인자를 포함하고 있어 두번째의 하류 유전자 CD80의 번역을 촉진한다. 대장균 uidA 유전자는 감염성 라링고트라체이티스(laryngotracheitis) 바이러스 gI 프로모터에 의해 조절되며 FIVgag 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절된다. 또한, FIV 피막 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절되며 대장균 lacZ 유전자는 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절된다.
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 다섯 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진시킨다. 두번째의 하류 CD80 개시해독프레임에 대한 번역은 EMCV IRES 인자에 의해 조절된다. 대장균 uidA 유전자는 감염성 라링고트라체이티스(laryngotracheitis) 바이러스 gI 프로모터에 의해 조절되며 FeLVgag 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절된다. 또한, 대장균 lacZ 유전자는 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절된다. 상기 다섯가지의 유전자는 두개의 분명한 고양이의 헤르페스 바이러스 삽입부위에 함유되어 있다.
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 다섯 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진하며 두개의 CD80 개시해독프레임 사이에 EMCV IRES 인자를 포함하고 있어 두번째의 하류 유전자 CD80의 번역을 촉진한다. 대장균 uidA 유전자는 감염성 라링고트라체이티스(laryngotracheitis) 바이러스 gI 프로모터에 의해 조절되며 FeLV 피막 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절된다. 또한, 대장균 lacZ 유전자는 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절된다.
고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 여섯 가지의 외래 유전자를 발현한다. 고양이의 CD86 및 CD80 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절되어 바이시스트로닉 카세트(bicistronic cassette)에서 발현하게 되는데 이들은 고양이의 CD80 및 CD86 단백질의 전사를 촉진하며 두개의 CD80 개시해독프레임 사이에 EMCV IRES 인자를 포함하고 있어 두번째의 하류 유전자 CD80의 번역을 촉진한다. 대장균 uidA 유전자는 감염성 라링고트라체이티스(laryngotracheitis) 바이러스 gI 프로모터에 의해 조절되며 FIVgag 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절된다. 또한, FIV 피막 유전자는 전기 합성 싸이토메갈로바이러스에 의해 조절되며 대장균 lacZ 유전자는 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절된다.
실시예 20
고양이의 CD80(B7-1) -TAMU, CD86(B7-2), CD28, CTLA-4 및 CD-80(B7-1) -Syntro/SPAH cDNA 및 폴리펩타이드에 대한 특성
분리 및 정제과정을 통하여 얻어진 941개의 뉴클레오티드로 구성된 고양이의 CD80(B7-1) cDNA는 약 33,485 KDa의 분자량, 약 9.1의 등전점, 10.24의 순전하(pH 7.0)등과 같은 특성을 지니고 있는 결합형태의 고유한 막이나 성숙한 형태의 아미노산(약 292개)에 대한 고양이의 CD80 폴리펩티드의 개시해독프레임을 코딩한다. 단백질의 막투과영역은 제 241~271번쩨에 거의 존재하게 된다.
고양이의 CD80-TAMU와 CD80-Syntro/SPAH는 서로 다른 두가지의 물질로부터 독자적으로 분리한 cDNA 및 폴리펩티드를 나타내고 있으나, DNA와 아미노산의 배열은 약간 다르다. CD80-TAMU mRNA는 ConA에 의해 자극이 가해진 고양이의 말초혈 단핵세포에서 유래되었으며 CD80-Syntro/SPAH는 ConA에 의해 자극이 가해진 고양이의 비장세포에서 유래되었다. 상기 CD80-TAMU와 CD80-Syntro/SPAH 사이에 있어 cDNA의 상이점은 제 351번째의 뉴클레오티드에서 T~C 및 제 670번째의 뉴클레오티드에서 C~A에 있다. 아미노산 배열의 경우 제 351번째의 뉴클레오티드에서 T~C 변화에 따른 영향은 없으나 제 670번째의 뉴클레오티드에서 제 224번째의 아미노산 잔기에 있는 류신이 이소류신으로 변화시킨다.
분리 및 정제과정을 통하여 얻어진 1,176개의 뉴클레오티드로 구성된 고양이의 CD86(B7-2) cDNA는 약 36,394 KDa의 분자량, 약 9.19의 등전점, 11.27의 순전하(pH 7.0)등과 같은 특성을 지니고 있는 결합형태의 고유한 막이나 성숙한 형태의 아미노산(약 320개)에 대한 고양이의 CD86 폴리펩티드의 개시해독프레임을 코딩한다.
분리 및 정제과정을 통하여 얻어진 689개의 뉴클레오티드로 구성된 고양이의 CD28 cDNA는 약 25,319 KDa의 분자량, 약 9.17의 등전점, 9.58의 순전하(pH 7.0)등과 같은 특성을 지니고 있는 결합형태의 고유한 막이나 성숙한 형태의 아미노산(약 221개)에 대한 고양이의 CD28 폴리펩티드의 개시해독프레임을 코딩한다.
분리 및 정제과정을 통하여 얻어진 749개의 뉴클레오티드로 구성된 고양이의 CTLA-4 cDNA는 약 24,381 KDa의 분자량, 약 6,34의 등전점, -0.99의 순전하(pH 7.0)등과 같은 특성을 지니고 있는 결합형태의 고유한 막이나 성숙한 형태의 아미노산(약 223개)에 대한 고양이의 CTLA-4 cDNA 폴리펩티드의 개시해독프레임을 코딩한다.
공동자극물질인 CD28이나 CTLA-4와 함께 CD80의 공동발현 및 종양항원 또는 병원성 유기체의 항원등은 T-임파구, 보다 상세하게는 The-임파구를 활성화시키거나 증강시키며 기타 세포들의 성장을 촉진한다. 공동자극물질인 CTLA-4와 함께 CD80의 공동발현은 T-임파구, 보다 상세하게는 The-임파구의 활성을 억제시키게 된다.
공동자극물질인 CD28이나 CTLA-4와 함께 CD86의 공동발현 및 종양항원 또는 병원성 유기체의 항원등은 T-임파구, 보다 상세하게는 The-임파구를 활성화시키거나 증강시키며 기타 세포들의 성장을 촉진한다. 공동자극물질인 CTLA-4와 함께 CD86의 공동발현은 T-임파구, 보다 상세하게는 The-임파구의 활성을 억제시키게 된다.
DNA/아미노산 백분율 인간 상동체(DNA 배열) % 동일성 인간 상동체(아미노산 배열) % 동일성 마우스 상동체(DNA 배열) % 동일성 마우스 상동체(아미노산 배열) % 동일성 토끼 상동체(DNA 배열) % 동일성 토끼 상동체(아미노산 배열) % 동일성
고양이의 CD80 77 59 62 46 - -
고양이의 CD88 72 68 - - 67/44 -
고양이의 CD28 85 82 77 74 84/84 59/50
고양이의 CTLA-4 38 86 79 78 - -


실시예 21
고양이의 CD80(B7-1), CD86(B7-2), CD28 및 CTLA-4를 함유한 백신의 용도
고양이의 CD80(B7-1), CD86(B7-2), CD28 및 CTLA-4를 함유한 백신의 면역증 강활성도를 평가하기 위하여 하기의 실험을 실시하였다.
고양이과에서 재조합 단백질의 발현에 유용한 재조합 바이러스성 벡터(고양이의 헤르페스 바이러스, 돈두 바이러스, 또는 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스에서 유래)에 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4를 삽입하였다(PCT 국제출원 WO 96/22363 또는 WO 96/13575). 상기 4개의 모든 면역증강물질을 발현하는 재조합 바이러스성 벡터 또는 CD80/CD28, CD80/CTLA-4, CD86/CD28, 또는 CD86/CTLA-4와 같은 쌍의 조합을 8주령의 고양이에게 체중당 0.1~10.0mg, 또는 104~109 용균반 형성단위(pfu) 또는 바람직하게는 약 106 pfu의 용량으로 경구 또는 근육주사하였다. FIV 또는 FeLV에 대한 소단위 백신이나 바이러스성 벡터백신(상기 참조)은 면역증강물질인 고양이의 벡터화 CD80(B7-1), CD86(B7-2), CD28 및 CTLA-4와 병용하여 최소 허용용량을 고양이에게 투여하였다. 3~4주가 경과한 후에 두번째의 백신용량을 고양이에게 투여하였다.
상기 고양이를 대상으로 USDA의 표준챌렌지용량수준에서 독성이 강한 균주(PPR 또는 Petaluma) 또는 FeLV Rickard 균주(면역이 억제된 고양이에게 메칠프레드니솔론을 병용투여함)를 사용하여 면역공격시험을 실시하였으며 이후 12주에 걸쳐 정기적으로 바이러스혈증의 발생을 관찰하였다. 백신투여군은 FeLV에 의해 야기된 종양발생을 가능성을 평가하기 위하여 12개월에 걸쳐 관찰하였다. 백신투여군의 질병발생율을 백신이나 면역증강물질이 함유되어 있지 않은 FIV 또는 FeLV 백신을 투여받지 않은 대조군과 비교하였다. 상기 면역공격시험을 실시한 결과, 백신을 접종하지 않은 대조군을 FeLV 또는 FeLV에 노출시켰을 때 60% 이상의 바이러스혈증 이 지속적으로 나타났다. FeLV 또는 FeLV 소단위백신을 투여받은 고양이들은 상기 면역공격시험에서 75%가 바이러스혈증을 나타내지 않았으며 FeLV 또는 FeLV 소단위백신과 함께 면역증강물질인 고양이의 벡터화된 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4를 병용투여후 면역공격시험을 실시한 결과 100%의 고양이가 바이러스혈증을 나타내지 않았다. 상기 고양이의 벡터화된 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4와 병용투여시에 나타나는 잇점으로는 1) 바이러스혈증 및/또는 종양형성에 대하여 100%의 억제효과, 2) 장기간의 면역활성(1년 이상), 3) 조기의 면역발현, 또는 4) 현재 모든 제조업자들이 적용하고 있는 두가지 용량 대신에 단일용량의 제 1차 백신등을 들 수 있다. 바이러스성 벡터화 FeLV 또는 FeLV 백신을 투여받은 고양이들은 FeLV 또는 FeLV 소단위백신을 투여한 고양이들보다 현저히 높은 수준의 치료효과를 나타내었다. 바이러스성 벡터화 FeLV 또는 FeLV 백신과 함께 면역증강물질인 고양이의 벡터화된 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4와 병용투여후 면역공격시험을 실시한 결과 100%의 고양이가 바이러스혈증을 나타내지 않았다. 바이러스성 벡터화 FeLV 또는 FeLV 백신과 함께 면역증강물질인 고양이의 벡터화된 CD80(B7-1), CD86(B7-2), CD28 및 CTLA-4와 병용투여하는 경우 고양이에게 상기에서 설명한 치료상의 효과를 부여할 수 있다.
다른 투여방법으로 8주령의 고양이에게 FIV 피막/gag 또는 FeLV 피막/gag의 cDNA를 함유하는 플라스마와 함께 혼합물로서 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4를 함유하는 100㎍의 플라즈미드를 근육주사하거나 FIV 피막/gag 또는 FeLV 피막/gag의 cDNA를 함유하는 플라스마와 함께 혼합물로서 CD28 또는 CTLA-4와 쌍을 이룬 CD80/CD28, CD80/CTLA-4, CD86/CD28, 또는 CD86/CTLA-4와 같은 쌍의 조합물을 함유하는 100㎍의 플라즈미드를 근육주사하였다. 상기 고양이를 대상으로 독성이 강한 FeLV 또는 FIV를 투여한 후에 상기에 언급한 질환의 발생을 관찰하였다. 상기 면역공격시험을 실시한 결과, FeLV 또는 FIV 유전자를 함유하는 cDNA와 함께 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4를 함유하는 cDNA 벡터를 투여받은 고양이의 경우에 75%의 치료효과를 나타낸 cDNA 벡터투여군에 비하여 100%의 치료효과가 관찰되었다.
또한, 8주령의 고양이에게 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 혼합물이 함유된 0.1~100mg의 정제단백질을 근육주사하거나 상기 재조합 cDNA 벡터로부터 CD28 또는 CTLA-4와 쌍을 이룬 CD80 또는 CD80의 조합물, 그리고 FIV 피막/gag 또는 FeLV 피막/gag를 함유하는 0.1~100mg의 소단위 백신을 근육주사하였다. 대조군에게는 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 혼합물을 투여하지 않았다. 상기 고양이를 대상으로 독성이 강한 FeLV 또는 FIV를 투여한 후에 상기에 언급한 질환의 발생을 관찰하였다.
상기 면역공격시험을 실시한 결과, CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 혼합물이 함유된 정제단백질과 FeLV 또는 FIV를 함유한 소단위 백신을 투여받은 고양이의 경우에 FeLV 또는 FIV를 함유한 소단위 백신만을 투여한 고양이들에 비하여 현저하게 낮은 질병발생율이 확인되었다.
실시예 22
질병에 대한 예방백신으로서 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 용도
재조합 돈두(swinepox), 재조합 라쿤폭스(racoonpox). 또는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스 및 각종 벡터로부터 유래된 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4 물질을 본 발명의 실시예 17에서 설명한 바와 같이 투여하고 바이러스, 기생충 또는 박테리아와 같은 병원체를 사용하여 면역공격시험을 실시하였을 때 병원성유기체에서 유래된 소단위나 바이러스성 벡터항원을 투여하지 않아도 면역성을 자극하는데 유용하며 보호적 면역반응을 유도할 수 있는 The-1 면역반응이 나타나게 된다. 또 다른 투여방법으로 고양이의 바이러스성 벡터인 CTLA-4와 병용하여 고양이의 CD80 또는 CD86을 본 발명의 실시예 3과 같은 방법으로 투여하였을 때 면역반응을 억제시키며 고양이의 자가면역을 보호하는데 유용한 것이 확인되었다.
실시예 23
종양세포를 억제하거나 괴사시키는 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 용도
고양이에게서 발생한 종양세포를 CD28 또는 CTLA-4와 함께 고양이의 고양이의 CD80 또는 CD86을 발현하는 재조합 돈두(swinepox), 재조합 라쿤폭스(racoonpox). 또는 고양이의 바이러스성 재조합 헤르페스 바이러스 벡터에 의해 형질감염시켰다. 형질감염된 종양세포를 고양이에게 재투여하였을 때 종양세포의 표면에 존재하는 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4에 의해 형질전환되었거나 비형질전환된 종양세포에 광범위한 면역반응이 일어나서 국소적으로 암전이성 종양세포를 괴사시켰다. 또 다른 투여방법으로 CD28 또는 CTLA-4와 함께 고양이의 CD80 또 는 CD86을 직접 종양세포에 주사하였을 때 종양세포에 광범위한 면역반응이 일어나서 국소적으로 암전이성 종양세포를 괴사시켰다.
실시예 24
고양이의 질병을 치료하는 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4의 치료학적 용도
재조합 돈두(swinepox), 재조합 라쿤폭스(racoonpox). 또는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스 및 각종 벡터로부터 유래된 고양이의 CD80, CD86, CD28 및 CTLA-4 물질을 본 발명의 실시예 17에서 설명한 바와 같이 투여하고 바이러스, 기생충 또는 박테리아와 같은 병원체를 사용하여 면역공격시험을 실시하였을 때 병원성유기체에서 유래된 소단위나 바이러스성 벡터항원을 투여하지 않아도 면역성을 자극하는데 유용하며 병소적 질병의 정도를 축소하는 면역성을 증강시키는데 유용하다.
실험보조자료: SPV 246
FeLV gag, FeLV 피막 및 고양이의 CD80을 함유하는 재조합 바이러스성 벡터화 SPV 백신에 대한 유효성 및 안전성.
재조합 SPV 바이러스 및 SPV 246 바이러스에 대한 제조는 상기에서 설명한 바와 같다(오리지날 서류의 내용). SPV 246 바이러스는 두개의 마커유전자(β-글루쿠로니다제, β-갈락토시다제)를 위시하여 FeLV gag, FeLV 피막 및 고양이의 CD80 을 함유하는 다섯가지의 유전자를 포함하고 있다. SPV 246에 감염된 FeLV gag, FeLV 피막 및 고양이의 CD80의 발현은 웨스턴블롯팅 방법에 의해 확인되었다. 특이적 FeLV gag 및 FeLV 피막을 나타내는 밴드는 각각 염소의 FeLV p27(Biodesign, ME) 및 FeLV p70(Biodesign, ME)에서 검출되었다. FeLV gag 및 FeLV 피막은 쳔연의 바이러스성 단백질과 유사하게 번역과정을 거친 후에 처리되는 것으로 보인다. 순도, 발현 및 안정성검사는 상기에서 언급한 항체를 사용하는 흑색 용균반 정량법에 의해 실시하였다. SPV 246은 적어도 5회이상 안정하게 계대접종시켰다. SPV 246으로 감염된 세포에서 생성되는 100%의 용균반의 경우 FeLV gag, FeLV 피막 및 β-글루쿠로니다제에 대하여 양성을 나타내었다. 고양이의 CD80의 발현은 폴리클로날 비인체용 CD80 항체를 사용하는 웨스톤블롯팅 방법에 의해 확인되었다. 고양이의 CD80에 특이적이며 크기가 30~60KDa의 범위에 있는 다발성 밴드(multiple band)가 검출되었다. 상기 밴드는 ESK-4 세포의 SPV에서 발현되고 변성된 CD80의 교대적이고 다발성 당화(glycosylation) 패턴을 나타낸다.
SPV 246, 대조 바이러스 SPV 003 및 기타 재조합 FHV/SPV 백신 후보물질의 고양이 FeLV 감염증에 대한 보호능을 조사하였다. 즉, 1군당 10마리로 구성된 8주령의 새끼 고양이를 1ml의 SPV 246, 대조 바이러스 또는 기타 재조합 바이러스(투여용량: 1마리당 7x105 pfu~1x107 pfu)를 피하주사하였다. 고양이에게 3주마다 3회 백신을 주사하였다. 백신을 주사한 후 경구 및 비강경로를 통하여 초산 메칠프레드니솔론으로 전처리한 후에 Richard FeLV 표준챌렌지균주(106.2 TCID50/ml/cat)를 사용하여 면역공격시험을 실시하였다(Depo-Medrol).
상기 면역공격시험을 실시한 후에 15주에 걸쳐 일주일 간격으로 고양이의 혈청에 나타나는 바이러스혈증을 관찰하였다. 그 결과 고양이들은 FeLV p27에 대하여 3주간에 걸쳐 연속하여 양성인 것이 확인되었다.
결과: SPV 246 바이러스를 투여받은 고양이들은 FeLV 챌렌지시험에서 FeLV 바이러스혈증을 나타내지 않았다. SPV 246으로 처치한 고양이의 예상된 예방분획(PF) 수치는 50%를 나타내었다(표 1).



면역시험공격후 15주에 걸쳐 지속적 바이러스혈증을 나타내는 고양이 수 및 백분율. 각군에 대한 예상된 예방분획율을 산출함
그룹번호 바이러스(ES) 지속적 바이러스혈증을 나타내는 고양이의 수 지속적 바이러스혈증을 나타내는 고양이의 백분율 RF (%C-%V)/%C
1 FHV 018(CMV-FeLVenv) FHV 019(CMV-FeLVgag) 7/10 70% -16%
2 FHV 018(CMV-FeLVenv) FHV 019(CMV-FeLVgag) FHV 030(gE-CD80) 6/10 60 0
3 FHV 018(CMV-FeLVenv) FHV 019(CMV-FeLVgag) RPV 022(L2E2-CD80) 7/10 70 -16
4 SPV 089(L2E2-FeLVgag) SPV 195(E1-FeLVenv) FHV 030(qE-CD80) 5/10 50 16
5 SPV 246(E2-FeLVgag/E1- FeLVenv//L2E2-CD80 3/10 30 50
6(SC) SPV 258(L2E2-FeLVgag/ L2E2-FeLVgp70) FHV 030(gE-CD80) 5/10 50 16
7 SPV 258(L2E2-FeLVgag/ L2E2-FeLVgp70) FHV 030(gE-CD80) 6/10 60 0
8 SPV 003, FHV 005 6/10 60 0


CD80 및 CD86을 함유하는 추가 재조합 바이러스의 실시예
SPV 280
SPV 280은 여섯가지의 외래항원을 발현하는 재조합 돈두 바이러스이다. 992-23.6으로 명명된 상동벡터를 하기와 같이 제조하였다.
고양이의 CD80 및 CD86 유전자는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LP1)에 의해 조절된 바이시스트로닉(bicistronic) DNA 카셋트에서 발현되어 CD80 및 CD86의 전사를 촉진하였고 두개의 개시해독프레임 사이에 EMCV IRES 인자를 포함하였다. 대 장균 β-글루쿠로니다제 유전자는 전기 합성 프로모터(EP2)에 의해 조절된다. SPV 280은 SPV 258에서 유래되었으며 FeLV gag, FeLV 피막 및 β-갈락토시다제를 함유하고 있다. SPV 258은 이전에 FeLV gag/프로테아제 유전자를 함유하도록 유도되었으며 상기 절두상(truncated)의 FeLV 피막 유전자(gp 70)는 합성 전기 또는 후기 마마(pox) 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절된다. 대장균 β-갈락토시다제는 I5L 마마(pox) 프로모터에 의해 지속적으로 조절되며 결실된 1869 bp 부분 HindIII N 단편에 삽입된다. CD80/CD86 및 재대장균 β-글루쿠로니다제 유전자는 분명히 비필수적인 SPV 부분 HindIII K 단편에서 상동벡터 992-23.5에 클론화된다.
SPV 280 바이러스는 SPV 258에서 유래되었다. 상기 바이러스는 상동벡터인 992-23.6 및 재조합 RPV, SPV 또는 FHV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러스 S-SPV-258에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제(BLUOGAL 및 CPRG 정량법) 또는 β-글루쿠로니다제(X-gLUC 정량법)를 발현시키는 재조합 SPV의 스크린법에 따라 스크린되었다. 상기 재조합 바이러스는 청색/녹색 용균반 정제를 거친 후에 재조합 바이러스 SPV 280으로 명명되었다. FeLV gag, FeLV 피막 및 마커유전자(β-갈락토시다제 및 β-글루쿠로니다제)를 발현시키기 위하여 흑색 용균반 분석법을 사용하여 SPV 280 바이러스를 정량하였다. 정제된 SPV 280에 의해 감염된 ESK-4 세포로부터 생성된 100%의 용균반의 경우 FeLV p27(Biodesign, ME)에 대한 염소의 폴리클로날 항체 및 FeLV 피막 p70(Biodesign, ME)애 대하여 마우스의 모노클로날 항체를 사용하여 FeLV gag 및 FeLV 피막을 발현하도록 하였다.
고양이의 CD80 및 CD86의 발현은 각각 염소의 폴리클로날 비인간 CD80 및 CD86 항체(R&D Systems, MN)를 사용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다. 고양이의 CD80에 특이적이며 크기가 30~60KDa의 범위에 있는 다발성 밴드(multiple band)가 검출되었으며 고양이의 CD86에 특이적이며 크기가 40~70KDa의 범위에 있는 다발성 밴드(multiple band)도 검출되었다. 상기 밴드는 ESK-4 세포의 SPV에서 발현되고 변성된 CD80의 교대적이고 다발성 당화(glycosylation) 패턴을 나타낸다.
SPV 281
SPV 281은 여섯가지의 외래항원을 발현하는 재조합 돈두 바이러스이다. 992-23.6으로 명명된 상동벡터를 상기 SPV 280을 제조한 방법에 따라 제조하였다. SPV 281은 SPV 228에서 유래되었으며 유전자로서 FIV gag/프로테아제, FIV 피막 및 β-갈락토시다제를 함유하고 있다. FIV gag/프로테아제 유전자는 전기 합성 프로모터(EP2)에 의해 조절되며, FIV 피막 유전자는 전기 합성 프로모터(EP1)에 의해 조절된다. 또한, 대장균 β-갈락토시다제 유전자는 I5L 마마(pox) 프로모터에 의해 지속적으로 조절된다. FIV gag/프로테아제, FIV 피막 및 β-갈락토시다제는 결실된 1869 bp 부분 HindIII N 단편에 삽입된다. CD80/CD86 및 재대장균 β-글루쿠로니다제 유전자는 분명히 비필수적인 SPV 부분 HindIII K 단편에서 상동벡터 992-23.5에 삽입된다.
SPV 281 바이러스는 SPV 228에서 유래되었다. 상기 바이러스는 상동벡터인 992-23.6 및 재조합 RPV, SPV 또는 FHV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러 스 S-SPV-258에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제(BLUOGAL 및 CPRG 정량법) 또는 β-글루쿠로니다제(X-gLUC 정량법)를 발현시키는 재조합 SPV의 스크린법에 따라 스크린되었다. 상기 재조합 바이러스는 청색/녹색 용균반 정제를 거친 후에 재조합 바이러스 SPV 281로 명명되었다.
FIV gag, FIV 피막 및 마커유전자(β-갈락토시다제 및 β-글루쿠로니다제)를 발현시키기 위하여 흑색 용균반 분석법을 사용하여 SPV 281 바이러스를 정량하였다. 정제된 SPV 281에 의해 감염된 ESK-4 세포로부터 생성된 100%의 용균반의 경우 β-갈락토시다제에 대한 마우스의 모노클로날 항체 및 β-글루쿠로니다제에 대한 토끼의 폴리클로날 항체(각각 Biodesign, ME 및 Molecular Probes, OR)로서 FIV gag(p27) 및 FIV 피막(gp100)[각각 Custom Monoclonals, CA; Biodesign International, ME)에 대하여 마우스의 모노클로날 항체를 사용하여 FIV gag, FIV 피막, β-갈락토시다제 및 β-글루쿠로니다제를 발현하도록 하였다.
고양이의 CD80 및 CD86의 발현은 각각 염소의 폴리클로날 비인간 CD80 및 CD86 항체(R&D Systems, MN)를 사용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다. 고양이의 CD80에 특이적이며 크기가 30~60KDa의 범위에 있는 다발성 밴드(multiple band)가 검출되었으며 고양이의 CD86에 특이적이며 크기가 40~70KDa의 범위에 있는 다발성 밴드(multiple band)도 검출되었다. 상기 밴드는 ESK-4 세포의 SPV에서 발현된 CD80 및 CD86의 교대적이고 다발성 당화(glycosylation) 패턴을 나타낸다. 또한, FIV gag 및 FIV 피막의 발현은 상기에 언급한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다. 상기 FIV gag 및 FIV 피막은 각각 p24 및 gp100에서 처리 되는 것으로 보인다.
FHV 043
FHV 043은 다섯가지의 외래항원을 발현하는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스이다. 987-57.A1으로 명명된 상동벡터를 하기와 같이 제조하였다.
고양이의 CD80 및 CD86 유전자는 합성이 극히 빠른 싸이토메갈로 바이러스(CMV IE)에 의해 조절된 바이시스트로닉(bicistronic) DNA 카셋트에 클론화되어 CD80 및 CD86의 전사를 촉진하였다. 두개의 하류 CD80 개시해독프레임에 대한 번역은 EMCV IRES 인자에 의해 조절되었다.
대장균 β-글루쿠로니다제 유전자는 전염성 라링고트라체이티스 (laryngotracheitis) 바이러스 gI 프로모터에 의해 조절된다. CD80, CD86 및 대장균 β-글루쿠로니다제 유전자는 FHV의 부분적 Sal I H 단편에서 유래된 비반복 EcoRI 부위에 있는 길이가 긴 비반복 FHV 영역에 삽입된다. 상기 삽입은 gL 및 인근에 위치한 전사촉진 유전자 사이에 이루워진다.
FHV 043 바이러스는 FHV 017에서 유래되었으며 유전자로서 FIV 피막 및 대장균 β-갈락토시다제를 함유한다. 상기 FIV 피막 유전자는 CMV IE 프로모터에 의해 조절되며 대장균 β-갈락토시다제는 가성광견병 gX 프로모터 인자에 의해 조절된다. FIV 피막 및 대장균 β-갈락토시다제를 FHV US gE의 결실부위에 삽입하였다.
FHV 043 바이러스는 FHV 017에서 유래되었다. 상기 바이러스는 상동벡터인 987-57.A1 및 재조합 RPV, SPV 또는 FHV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러 스 FHV 017에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제(BLUOGAL 및 CPRG 정량법) 또는 β-글루쿠로니다제(X-gLUC 정량법)를 발현시키는 재조합 SPV의 스크린법에 따라 스크린되었다. 상기 재조합 바이러스는 청색/녹색 용균반 정제를 거친 후에 재조합 바이러스 FHV 043으로 명명되었다.
마커유전자인 β-갈락토시다제 및 β-글루쿠로니다제를 발현시키기 위하여 흑색 용균반 분석법을 사용하여 FHV 043 바이러스를 정량하였다. 정제된 FHV 043에 의해 감염된 ESK-4 세포로부터 생성된 100%의 용균반의 경우 β-갈락토시다제(Biodesign, ME)에 대한 마우스의 모노클로날 항체 및 β-글루쿠로니다제(Molecular Probes, OR)애 대하여 토끼의 폴리클로날 항체를 사용하여 β-갈락토시다제 및 β-글루쿠로니다제를 발현하도록 하였다.
고양이의 CD80 및 CD86의 발현은 각각 염소의 폴리클로날 비인간 CD80 및 CD86 항체(R&D Systems, MN)를 사용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다. 고양이의 CD80에 특이적이며 크기가 30~60KDa의 범위에 있는 다발성 밴드(multiple band)가 검출되었으며 고양이의 CD86에 특이적이며 크기가 40~70KDa의 범위에 있는 다발성 밴드(multiple band)도 검출되었다. FIV 피막(gp130)의 발현은 FIV에 감염된 고양이로부터 회복기에 있는 고양이 혈청을 이용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다.
상동벡터 1015-18.8A(LP1-CD86/IRES-CD80)
상동벡터 1015-18.8A을 사용하여 CD80 및 CD86을 발현하는 재조합 RPV 바이 러스를 제조하였다.
마마(pox) LP2 프로모터, EMCV IRES 인자 및 마마(pox) 폴리 A 전사종결인자를 함유하는 플라즈미드를 제조한다. 고양이의 CD80 유전자를 BamHI 클로닝부위를 가지고 있는 프라이머 1/97.6(5'-GCTAGGATCCAATCTATGTACACAGGTGAGAT-3') 및 프라이머 3/98.4(5'-TCGAGGATCCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3')를 사용하여 PCT 반응에 의해 증폭화시켰다. CD80은 LP1 프로모터의 배후에서 클론화되었다. 고양이의 CD86 유전자는 MfeI 클로닝부위를 가지고 있는 프라이머 1/98.18(5'-TCGACAATTGGTTGGGCATTTGTGACAG-3) 및 평체말단부위의 프라이머 8/97.31(5'-GTGGATCCAGGATCCGGAGCGG-3')를 사용하여 PCT 반응에 의해 증폭화시켰다. CD86은 NotI에 의해 코딩되어 후기 합성 프로모터(I5L)의 조절하에서 대장균 β-갈락토시다제 유전자를 함유하는 RPV HindIII에 클론화되었다. 최후의 상동벡터 1015-18.8A를 사용하여 재조합 RPV의 제조관련 상동재조합기법에 준하여 FIV 또는 FeLV 유전자 및 CD80/CD86을 함유하는 바이러스를 제조하였다.
S-RPV-045
S-RPV-045는 세가지의 외래 유전자를 발현하는 재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스이다. S-RPV-045는 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스 RPV-000(ATCC VR-838)에서 유래되었다. 상기 바이러스는 상동벡터인 1015-18.8A 및 재조합 RPV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 모바이러스(parental virus) RPV-000에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제를 발현시키는 재조 합 RPV의 스크린법(BLUOGAL 및 효소학적 마커유전자를 발현하는 재조합 RPV 스크린법)에 따라 스크린되었다. 상기 재조합 바이러스는 용균반 정제와 5회에 걸친 계대접종이 이루워졌다.
β-갈락토시다제를 발현시키기 위하여 흑색 용균반 분석법을 사용하여 S-RPV-045 바이러스를 정량하였다. 정제된 S-RPV-045에 의해 감염된 VERO 세포로부터 생성된 100%의 용균반은 토끼의 폴리클로날 항체(ICN, OH)를 사용하여 β-갈락토시다제를 발현하도록 하였다.
고양이의 CD80 및 CD86의 발현은 각각 염소의 폴리클로날 비인간 CD80 및 CD86 항체(R&D Systems, MN)를 사용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다. 고양이의 CD80에 특이적이며 크기가 30~60KDa의 범위에 있는 다발성 밴드(multiple band)가 검출되었으며 고양이의 CD86에 특이적이며 크기가 40~70KDa의 범위에 있는 다발성 밴드(multiple band)도 검출되었다. 상기 밴드는 VERO 세포의 RPV에서 발현된 CD80 및 CD86의 교대적이고 다발성 당화(glycosylation) 패턴을 나타낸다.
S-RPV-046
S-RPV-046은 세가지의 외래 유전자를 발현하는 재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스이다. S-RPV-046은 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스 RPV-036에서 유래되었다. 상기 바이러스는 상동벡터인 1015-18.8A 및 재조합 RPV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 모바이러스(parental virus) RPV-036에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제를 발현시키는 재조합 RPV의 스크린법(BLUOGAL 및 효소학적 마커유전자를 발현하는 재조합 RPV 스크린법)에 따라 스크린되었다. 상기 재조합 바이러스는 용균반 정제와 5회에 걸친 계대접종이 이루워졌다. 여러 번에 걸친 청색/녹색 용균반 정제를 거친 후에 상기 바이러스를 재조합 바이러스 RPV-046으로 명명하였다.
RPV-046은 전기 또는 후기 합성 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절되는 FIV gag 유전자와 전기 합성 프로모터(EP2)에 의해 조절되는 β-갈락토시다제를 함유한다. 상기 유전자들은 분명히 비필수적인 부분적 RPV HindIII U 부위에 삽입되어 있다. CD80/CD86 및 β-갈락토시다제는 비반복적이고 분명히 비필수적인 부분적 RPV HindIII N 부위에 삽입되어 있다.
β-갈락토시다제 및 β-글루쿠로니다제를 발현시키기 위하여 흑색 용균반 분석법을 사용하여 RPV-046 바이러스를 정량하였다. 정제된 S-RPV-046에 의해 감염된 VERO 세포로부터 생성된 100%의 용균반을 통하여 β-갈락토시다제 및 β-글루쿠로니다제를 발현하도록 하였다.
고양이의 CD80 및 CD86의 발현은 각각 염소의 폴리클로날 비인간 CD80 및 CD86 항체(R&D Systems, MN)를 사용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다. 고양이의 CD80에 특이적이며 크기가 30~60KDa의 범위에 있는 다발성 밴드(multiple band)가 검출되었으며 고양이의 CD86에 특이적이며 크기가 40~70KDa의 범위에 있는 다발성 밴드(multiple band)도 검출되었다. 상기 밴드는 VERO 세포의 RPV에서 발현된 CD80 및 CD86의 교대적이고 다발성 당화(glycosylation) 패턴을 나타낸다. 또한, FIV gag/프로테아제의 발현은 FIV gag(p27)(Custom Monoclonals, CA)에 대하여 마우스의 모노클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다.
S-RPV-047
RPV-047은 다섯가지의 외래 유전자를 발현하는 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스이다. 상기에서 언급한 방법에 따라 제조된 상동벡터 1015-18.8A는 HindIII N 단편내에 후기 합성 프로모터(I5L)에 의해 조절되는 LP1-CD86/IRES-CD80 카세트 및 대장균 β-갈락토시다제를 함유한다. RPV-044에서 유래된 RPV-047은 RPV HindIII U 단편내에 유전자로서 FIV 피막 및 대장균 β-갈락토시다제(β-글루쿠로니다제)를 함유한다. FIV 피막 유전자는 전기 합성 프로모터(EP1)에 의해 조절되며 β-글루쿠로니다제는 후기 합성 프로모터(LP1)에 의해 조절된다.
RPV-047은 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스 RPV-044에서 유래되었다. 상기 바이러스는 상동벡터인 1015-18.8A 및 재조합 RPV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 모 바이러스(parental virus) RPV-044에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제를 발현시키는 재조합 RPV의 스크린법(BLUOGAL 및 효소학적 마커유전자를 발현하는 재조합 RPV 스크린법)에 따라 스크린되었다. 상기 재조합 바이러스는 용균반 정제와 5회에 걸친 계대접종이 이루워졌다. 여러 번에 걸친 청색/녹색 용균반 정제를 거친 후에 상기 바이러스를 재조합 바이러스 RPV-047로 명명하였다.
β-갈락토시다제를 발현시키기 위하여 흑색 용균반 분석법을 사용하여 RPV-047 바이러스를 정량하였다. 정제된 S-RPV-046에 의해 감염된 VERO 세포로부터 생 성된 100%의 용균반의 경우 토끼의 폴리클로날 항체(ICN, OH)를 사용하여 β-갈락토시다제를 발현하도록 하였다.
고양이의 CD80 및 CD86의 발현은 각각 염소의 폴리클로날 비인간 CD80 및 CD86 항체(R&D Systems, MN)를 사용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다. 고양이의 CD80에 특이적이며 크기가 30~60KDa의 범위에 있는 다발성 밴드(multiple band)가 검출되었으며 고양이의 CD86에 특이적이며 크기가 40~70KDa의 범위에 있는 다발성 밴드(multiple band)도 검출되었다. 상기 밴드는 VERO 세포의 RPV에서 발현된 CD80 및 CD86의 교대적이고 다발성 당화(glycosylation) 패턴을 나타낸다. 또한, FIV 피막의 발현은 FIV 피막(p27)(Biodesign International, ME)에 대하여 마우스의 모노클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다.
S-RPV-048
RPV-048은 다섯가지의 외래 유전자를 발현하는 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스이다. 상기에서 언급한 방법에 따라 제조된 상동벡터 1015-18.8A는 HindIII N 단편내에 후기 합성 프로모터(I5L)에 의해 조절되는 LP1-CD86/IRES-CD80 카세트 및 대장균 β-갈락토시다제를 함유한다.
RPV-038에서 유래된 RPV-048은 RPV HindIII U 단편내에 유전자로서 FeLV gag/프로테아제 및 대장균 β-글루쿠로니다제를 함유한다. FeLV gag/프로테아제 유전자는 전기 또는 후기 합성 프로모터(LP2EP2)에 의해 조절되며 β-글루쿠로니다제는 후기 합성 프로모터(LP1)에 의해 조절된다.
RPV-048은 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스 RPV-038에서 유래되었다. 상기 바이러스는 상동벡터인 1015-18.8A 및 재조합 RPV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 모바이러스(parental virus) RPV-038에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제를 발현시키는 재조합 RPV의 스크린법(BLUOGAL 및 효소학적 마커유전자를 발현하는 재조합 RPV 스크린법)에 따라 스크린되었다. 상기 재조합 바이러스는 용균반 정제와 5회에 걸친 계대접종이 이루워졌다. 여러 번에 걸친 청색/녹색 용균반 정제를 거친 후에 상기 바이러스를 재조합 바이러스 RPV-048로 명명하였다.
β-갈락토시다제를 발현시키기 위하여 흑색 용균반 분석법을 사용하여 RPV-048 바이러스를 정량하였다. 정제된 S-RPV-048에 의해 감염된 VERO 세포로부터 생성된 100%의 용균반의 경우 토끼의 폴리클로날 항체(ICN, OH)를 사용하여 β-갈락토시다제를 발현하도록 하였다.
고양이의 CD80 및 CD86의 발현은 각각 염소의 폴리클로날 비인간 CD80 및 CD86 항체(R&D Systems, MN)를 사용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다. 고양이의 CD80에 특이적이며 크기가 30~60KDa의 범위에 있는 다발성 밴드(multiple band)가 검출되었으며 고양이의 CD86에 특이적이며 크기가 40~70KDa의 범위에 있는 다발성 밴드(multiple band)도 검출되었다. 상기 밴드는 VERO 세포의 RPV에서 발현된 CD80 및 CD86의 교대적이고 다발성 당화(glycosylation) 패턴을 나타낸다. 또한, FeLV gag/프로테아제의 발현은 FeLV gag/프로테아제(p27)(Biodesign International, ME)에 대하여 토끼의 폴리클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅방 법에 의해 확인하었다.
S-RPV-052
RPV-052은 여섯가지의 외래 유전자를 발현하는 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스이다. 상기에서 언급한 방법에 따라 제조된 상동벡터 1015-18.8A는 HindIII N 단편내에 후기 합성 프로모터(I5L)에 의해 조절되는 LP1-CD86/IRES-CD80 카세트 및 대장균 β-갈락토시다제를 함유한다. RPV-030에서 유래된 RPV-052는 RPV HindIII U 단편내에 유전자로서 FeLV gag/프로테아제, FeLV 피막 및 대장균 β-글루쿠로니다제(β-갈락토시다제)를 함유한다. FeLV gag/프로테아제 유전자는 전기 합성 프로모터(EP2)에 의해 조절되며 FeLV 피막 유전자는 전기 합성 프로모터(EP1)에 의해 조절된다. 또한, β-글루쿠로니다제 유전자는 후기 합성 프로모터(LP1)에 의해 조절된다.
RPV-052는 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스 RPV-030에서 유래되었다. 상기 바이러스는 상동벡터인 1015-18.8A 및 재조합 RPV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 모바이러스(parental virus) RPV-030에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제를 발현시키는 재조합 RPV의 스크린법(BLUOGAL 및 효소학적 마커유전자를 발현하는 재조합 RPV 스크린법)에 따라 스크린되었다. 상기 재조합 바이러스는 용균반 정제와 5회에 걸친 계대접종이 이루워졌다. 여러 번에 걸친 청색/녹색 용균반 정제를 거친 후에 상기 바이러스를 재조합 바이러스 RPV-052로 명명하였다.
FeLV gag/프로테아제, FeLV 피막, β-글루쿠로니다제 및 β-갈락토시다제를 발현시키기 위하여 흑색 용균반 분석법을 사용하여 RPV-052 바이러스를 정량하였다. 고양이의 CD80 및 CD86의 발현은 각각 염소의 폴리클로날 비인간 CD80 및 CD86 항체(R&D Systems, MN)를 사용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다. 또한, FeLV gag/프로테아제 및 FeLV 피막의 발현은 FeLV gag(p27)(Biodesign International, ME) 대하여 토끼의 폴리클로날 항체 및 마우스의 모노클로날 항-FeLV 피막(gp100)(Biodesign, ME)를 사용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다.
S-RPV-053
RPV-053은 여섯가지의 외래 유전자를 발현하는 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스이다. 상기에서 언급한 방법에 따라 제조된 상동벡터 1015-18.8A는 HindIII N 단편내에 후기 합성 프로모터(I5L)에 의해 조절되는 LP1-CD86/IRES-CD80 카세트 및 대장균 β-갈락토시다제를 함유한다. RPV-034에서 유래된 RPV-053은 RPV HindIII U 단편내에 유전자로서 FIV gag/프로테아제, FIV 피막 및 대장균 β-글루쿠로니다제를 함유한다. FIV gag/프로테아제 유전자는 전기 합성 프로모터(EP2)에 의해 조절되며 FIV 피막 유전자는 전기 합성 프로모터(EP1)에 의해 조절된다. 또한, β-글루쿠로니다제 유전자는 후기 합성 프로모터(LP1)에 의해 조절된다.
RPV-053는 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스 RPV-034에서 유래되었다. 상기 바이러스는 상동벡터인 1015-18.8A 및 재조합 RPV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 모바이러스(parental virus) RPV-034에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제를 발현시키는 재조합 RPV의 스크린법(BLUOGAL 및 효소학적 마커유전자를 발현하는 재조합 RPV 스크린법)에 따라 스크린되었다. 상기 재조합 바이러스는 용균반 정제와 5회에 걸친 계대접종이 이루워졌다. 여러 번에 걸친 청색/녹색 용균반 정제를 거친 후에 상기 바이러스를 재조합 바이러스 RPV-053으로 명명하였다.
SPV 275
SPV 275은 다섯가지의 외래항원을 발현하는 재조합 돈두 바이러스이다. 992-23.6으로 명명된 상동벡터를 하기와 같이 제조하였다.
고양이의 CD80 및 CD86 유전자는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LP1)에 의해 조절된 바이시스트로닉(bicistronic) DNA 카셋트에서 발현되어 CD80 및 CD86의 전사를 촉진하였고 두개의 개시해독프레임 사이에 EMCV IRES 인자를 포함하였다. 대장균 β-글루쿠로니다제 유전자는 전기 합성 프로모터(EP2)에 의해 조절된다. 본 발명에서 사용된 모 바이러스(parental virus)는 S-SPV 046으로서 합성이 빠르거나 늦은 프로모터(LP2EP2)에 의해서 조절된 FIV gag/프로테아제를 함유하고 있다. 또한, β-갈락토시다제는 구성성(constitutive)의 마마(pox) 프로모터(OIL)에 의해 조절된다. 유전자로서 FIV gag/프로테아제 및 β-갈락토시다제는 SPV 부분적 HindIII M 단편에 삽입되며, CD80/CD86 및 재대장균 β-글루쿠로니다제 유전자는 SPV 부분적 HindIII K 단편에 삽입된다.
SPV 275 바이러스는 S-SPV 046에서 유래되었다. 상기 바이러스는 상동벡터인 992-23.6 및 재조합 SPV 의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러스 S-SPV-046에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-글루쿠로니다제(X-gLUC 정량법)를 발현시키는 재조합 SPV의 스크린법에 따라 스크린되었다. 상기 재조합 바이러스는 수차례의 청색/녹색 용균반 정제를 거친 후에 재조합 바이러스 SPV 275로 명명되었다.
FeLV gag 및 마커유전자 β-글루쿠로니다제를 발현시키기 위하여 흑색 용균반 분석법을 사용하여 S-SPV-275 바이러스를 정량하였다. 정제된 S-SPV-275에 의해 감염된 ESK-4 세포로부터 생성된 100%의 용균반의 경우 FIV gag (Custom Monoclonals, CA)에 대하여 마우스의 모노클로날 항체를 사용하여 FeLV gag 및 FeLV 피막을 발현하도록 하였으며 5회에 걸친 계대접종 후에도 안정하였다.
FIV gag 및 고양이의 CD80/CD86의 발현은 각각 FIV gag에 대하여 마우스의 모노클로날 항체 및 고양이의 CD80 및 CD86에 대하여 염소의 폴리클로날 비인간 CD80 및 CD86 항체(R&D Systems, MN)를 사용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다. 고양이의 CD86에 특이적인 크기가 40~70KDa의 범위에 있는 다발성 밴드가 검출되었으며, 또한 고양이의 CD80에 특이적인 크기가 30~60KDa의 범위에 있는 밴드도 검출되었다.
S-FHV 040
S-FHV 040은 다섯가지의 외래항원을 발현하는 고양이의 재조합 헤르페스 바 이러스이다. 957-87.A1으로 명명된 상동벡터를 하기와 같이 제조하였다.
고양이의 CD80 및 CD86 유전자는 합성이 아주 빠르게 이루어지는 프로모터(CMV IE)에 의해 조절된 바이시스트로닉(bicistronic) DNA 카셋트에서 발현되어 CD80 및 CD86의 전사를 촉진하였고 두개의 개시해독프레임 사이에 EMCV IRES 인자를 포함하였다.
대장균 β-글루쿠로니다제 유전자는 전염성 라링고트라체이티스(laryngotracheitis) 바이러스 gI 프로모터에 의해 조절된다. CD80, CD86 및 대장균 β-글루쿠로니다제 유전자는 FHV의 부분적 Sal I H 단편에서 유래된 비반복 EcoRI 부위에 있는 길이가 긴 비반복 FHV 영역에 삽입된다. 상기 삽입은 gL 및 인근에 위치한 전사촉진 유전자 사이에 이루워진다. 본발명에서 사용된 모 바이러스(parental virus)는 S-FHV 019이며 CMV IE 프로모터에 의해 조절된 FeLV gag 유전자 및 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절된 β-갈락토시다제를 함유한다.
S-FHV 040은 S-FHV 019에서 유래되었다. 상기 바이러스는 상동벡터인 987-57.A1 및 재조합 FHV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러스 S-FHV 019에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-글루쿠로니다제(X-gLUC 정량법)를 발현시키는 재조합 FHV의 스크린법에 따라 스크린되었다. 상기 재조합 바이러스는 수차례의 청색/녹색 용균반 정제를 거친 후에 재조합 바이러스 S-FHV 040로 명명되었다.
FeLV gag 및 마커유전자 (β-갈락토시다제 및 β-글루쿠로니다제)를 발현시 키기 위하여 흑색 용균반 분석법을 사용하여 S-FHV 040 바이러스를 정량하였다. CRFK 세포로부터 생성된 100%의 용균반의 경우 β-갈락토시다제 및 β-글루쿠로니다제를 발현하도록 하였다. 또한, FeLV gag의 발현은 FeLV gp27에 대하여 염소의 폴리클로날 항체(Biodesigns, ME)를 사용하여 흑색 용균반 정량법에 의해 확인하였다. 상기 바이러스는 5회에 걸친 계대접종 후에도 안정한 것으로 보인다.
고양이의 CD80/CD86 및 FeLV gag의 발현은 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다. 염소의 폴리클로날 비인간 CD80 및 CD86 항체(R&D Systems, MN)을 고양이의 CD80 및 CD86에 대하여 사용하였다. 고양이의 CD80에 특이적인 크기가 30~60KDa의 범위에 있는 다발성 밴드 및 고양이의 CD86에 특이적인 크기가 40~70KDa의 범위에 있는 밴드로 검출되었다. FeLV의 발현은 FeLV gp27에 대하여 염소의 폴리클로날 항체(Biodesigns, ME)를 사용하여 흑색 용균반 정량법에 의해 확인하였다.
S-FHV 042
S-FHV 042은 다섯가지의 외래항원을 발현하는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스이다. 957-87.A1으로 명명된 상동벡터를 하기와 같이 제조하였다.
고양이의 CD80 및 CD86 유전자는 합성이 아주 빠르게 이루어지는 프로모터(CMV IE)에 의해 조절된 바이시스트로닉(bicistronic) DNA 카셋트에서 발현되어 CD80 및 CD86의 전사를 촉진하였고 두개의 개시해독프레임 사이에 EMCV IRES 인자를 포함하였다.
대장균 β-글루쿠로니다제 유전자는 전염성 라링고트라체이티스(laryngotracheitis) 바이러스 gI 프로모터에 의해 조절된다. CD80, CD86 및 대장균 β-글루쿠로니다제 유전자는 FHV의 부분적 Sal I H 단편에서 유래된 비반복 EcoRI 부위에 있는 길이가 긴 비반복 FHV 영역에 삽입된다. 상기 삽입은 gL 및 인근에 위치한 전사촉진 유전자 사이에 이루워진다. 본발명에서 사용된 모 바이러스(parental virus)는 S-FHV 018이며 CMV IE 프로모터에 의해 조절된 FeLV 피막 유전자 및 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절된 β-갈락토시다제 유전자를 함유한다. 상기 두가지 유전자들은 비반복 부위가 짧은 gE 결실부위가 있는 FHV 내에 위치한다.
S-FHV 042는 S-FHV 018에서 유래되었다. 상기 바이러스는 상동벡터인 987-57.A1 및 재조합 FHV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러스 S-FHV 018에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-글루쿠로니다제(X-gLUC 정량법)를 발현시키는 재조합 FHV의 스크린법에 따라 스크린되었다. 상기 재조합 바이러스는 수차례의 청색/녹색 용균반 정제를 거친 후에 재조합 바이러스 S-FHV 042로 명명되었다.
FeLV 피막 및 마커유전자 (β-갈락토시다제 및 β-글루쿠로니다제)를 발현시키기 위하여 흑색 용균반 분석법을 사용하여 S-FHV 040 바이러스를 정량하였다. CRFK 세포로부터 생성된 100%의 용균반의 경우 β-갈락토시다제 및 β-글루쿠로니다제를 발현하도록 하였다. 또한, FeLV 피막의 발현은 FeLV gp27에 대하여 염소의 폴리클로날 항체(Biodesigns, ME)를 사용하여 흑색 용균반 정량법에 의해 확인하였다. 상기 바이러스는 5회에 걸친 계대접종 후에도 안정하였다.
고양이의 CD80/CD86 및 FeLV 피막의 발현은 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다. 염소의 폴리클로날 비인간 CD80 및 CD86 항체(R&D Systems, MN)을 고양이의 CD80 및 CD86에 대하여 사용하였다. 고양이의 CD80에 특이적인 크기가 30~60KDa의 범위에 있는 다발성 밴드 및 고양이의 CD86에 특이적인 크기가 40~70KDa의 범위에 있는 밴드로 검출되었다. 밴드의 크기가 100KDa에 있는 FeLV 피막은 gp70d에 대하여 마우스의 모노클로날 항체(Biodesigns, ME)를 사용시에 검출되었다.
S-FHV 044
S-FHV 044은 다섯가지의 외래항원을 발현하는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스이다. 957-87.A1으로 명명된 상동벡터를 하기와 같이 제조하였다.
고양이의 CD80 및 CD86 유전자는 합성이 아주 빠르게 이루어지는 프로모터(CMV IE)에 의해 조절된 바이시스트로닉(bicistronic) DNA 카셋트에서 발현되어 CD80 및 CD86의 전사를 촉진하였고 두개의 개시해독프레임 사이에 EMCV IRES 인자를 포함하였다.
대장균 β-글루쿠로니다제 유전자는 전염성 라링고트라체이티스(laryngotracheitis) 바이러스 gI 프로모터에 의해 조절된다. CD80, CD86 및 대장균 β-글루쿠로니다제 유전자는 FHV의 부분적 Sal I H 단편에서 유래된 비반복 EcoRI 부위에 있는 길이가 긴 비반복 FHV 영역에 삽입된다. 상기 삽입은 gL 및 인근에 위치한 전사촉진 유전자 사이에 이루워진다. 본발명에서 사용된 모 바이러스(parental virus)는 S-FHV 016이며 CMV IE 프로모터에 의해 조절된 FIV gag/프로테아제 (프로테아제 유전다의 제 5번째 프라임 말단내에 9개의 아미노산 결실부위가 있음) 및 가성광견병 gX 프로모터에 의해 조절된 β-갈락토시다제 유전자를 함유한다. 상기 두가지 유전자들은 비반복 부위가 짧은 gE 결실부위가 있는 FHV 내에 위치한다.
S-FHV 044는 S-FHV 016에서 유래되었다. 상기 바이러스는 상동벡터인 987-57.A1 및 재조합 FHV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러스 S-FHV 016에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-글루쿠로니다제(X-gLUC 정량법)를 발현시키는 재조합 FHV의 스크린법에 따라 스크린되었다. 상기 재조합 바이러스는 수차례의 청색/녹색 용균반 정제를 거친 후에 재조합 바이러스 S-FHV 044로 명명되었다.
FIV gag 및 마커유전자 (β-갈락토시다제 및 β-글루쿠로니다제)를 발현시키기 위하여 흑색 용균반 분석법을 사용하여 S-FHV 044 바이러스를 정량하였다. CRFK 세포로부터 생성된 100%의 용균반의 경우 마우스의 모노클로날 항체(Biodesigns, ME)를 사용하여 β-갈락토시다제 및 β-글루쿠로니다제를 발현하도록 하였다. 또한, FIV gag에 대한 마우스의 모노클로날 항체 (Customs Monoclonals, CA)를 사용하여 흑색 용균반 정량법에 의해 확인하였다. 상기 바이러스는 5회에 걸친 계대접종 후에도 안정하였다.
고양이의 CD80/CD86 및 FeLV gag의 발현은 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다. 염소의 폴리클로날 비인간 CD80 및 CD86 항체(R&D Systems, MN)을 고양이의 CD80 및 CD86에 대하여 사용하였다. 고양이의 CD80에 특이적인 크기가 30~60KDa의 범위에 있는 다발성 밴드 및 고양이의 CD86에 특이적인 크기가 40~70KDa의 범위에 있는 밴드로 검출되었다. 모노클로날 FIV gag 항체를 사용시에 FIV gag에 특이적인 두개의 분명한 밴드가 50KDa 및 27KDa에서 검출되었다.
CD80 및/또는 CD86 또는 CD28 단백질을 코딩하는 유전자를 함유 SPV 재조합 바이러스
바이러스 번호 외래 유전자 삽입물 웨스턴 블롯 또는 블랙 용균반 정량법에 의한 발현분석
CD80 CD86 GAG ENV β-GAL β-GLU
SPV 228 EP2-FIVgag/EPI- FIVenv/I5L-lacZ 상동성 벡터 = 926-45.A17 모체 바이러스 = SPV 001 + + +
SPV 261 EP2-FIVgag/EPI- FIVenv/I5L-LacZ L2E2-CD80/E2-UIDA 상동성 벡터 = 931-21.A1 모체 바이러스 = SPV 228 + + + + +
SPV 275 L2E2-FIVgag/O1L- LacZ// L1-CD86/IRES- CD80/E2-UIDA 상동성 벡터 = 922-23.6 및 992-23.2 모체 바이러스 = SPV 046 + + + + +
SPV 258 L2E2-FeLVGag/L2E2- FeLV?Tmenv/L1-lacZ 상동성 벡터 = 954-44.1 모체 바이러스 = SPV 001 + + +

바이러스번호 외래유전자 삽입물 웨스턴 블롯 또는 블랙 용균반 정량법에 의한 발현분석
CD80 CD86 GAG ENV β-GAL β-GLU
SPV 281 EP2-FIVgag/EP1- FIVenv/I5L- lacZ//L1- CD86/IRES- CD80/E2-UIDA 상동성 벡터=992-23.6 모체바이러스=SPV228 + + + + + +
SPV 246 E2-FeLVgag/E1- FIVenv/I5L- lacZ//L2E2- CD80/E2-uida 상동성벡터=931-21.A1 모체바이러스=SPV224 + + + + +
SPV 276 L2E2-FeLVgag/L1- LacZ// L1-CD86/IRES- CD80/E2-UIDA 상동성벡터=992-23.6 모체바이러스=SPV089 + + + + +
SPV 279 E1-FeLVGag/L1- lacZ// L1-CD86/IRES- CD80/E2-UIDA 상동성벡터=992-23.6 모체바이러스=SPV195 + + + + +

바이러스번호 외래유전자 삽입물 웨스턴 블롯 또는 블랙 용균반 정량법에 의한 발현분석
CD80 CD86 GAG ENV β-GAL β-GLU
SPV 280 L2E2-FeLVGag/L2E2- FeLVΔTMenv/L1- lacZ/ L1-CD86/IRES- CD80/E2-UIDA 상동성벡터 = 992-23.6 모체바이러스=SPV 258 + + + + + +
SPV 285 E2-FeLVgag/E1- FeLVenv/I5L- lacZ//L1- CD80/IRES/CD86/gI UIDA 상동성벡터 = 992-23.6 모체바이러스 = SPV224 + + + + + +
SPV 270 LE-CD80ΔTM/HIS/E2- uidA 상동성벡터 = 961-27.4 모체바이러스 = SPV001 + +
SPV 272 LE-CD86ΔTM/HIS/E2- uidA (19-2) 상동성벡터 = 969-20.9 모체바이러스 = SPV001 + +
SPV 273 LE-CD28ΔTM/HIS/E2- uidA 상동성벡터 = 930-91.2 모체바이러스 = SPV001 +

바이러스번호 외래유전자 삽입물 웨스턴 블롯 또는 블랙 용균반 정량법에 의한 발현분석
CD80 CD86 GAG ENV β-GAL β-GLU
SPV 274 LE-CD86(FL)/EP2- uidA 상동성벡터=977-40.1 모체바이러스=SPV001 + +
SPV 282 LP1-CD86/IRES- CD80/E2-UIDA 상동성벡터 =992-23.6 모체바이러스=SPV001 + + + + +


CD80 및/또는 CD86 또는 CD28 단백질을 코딩하는 유전자를 함유 RPV 재조합 바이러스
바이러스번호 외래유전자 삽입물 웨스턴 블롯 또는 블랙 용균반 정량법에 의한 발현분석
CD 80 CD 86 GAG ENV β-GAL β-GLU
RPV 046 L2E2-FIVgag/E2- UIDA// LP1-CD86/IRES- CD80/I5L=LacZ 상동성벡터=1015-18.8A 모체바이러스=RPV036 + + + + +

바이러스번호 외래유전자 삽입물 웨스턴 블롯 또는 블랙 용균반 정량법에 의한 발현분석
CD 80 CD 86 GAG ENV β-GAL β-GLU
RPV 047 E1-FIVenv/E2- uidA LP1-CD86-IRES- CD80/I5L-LacZ 상동성벡터=1015-18.8a 모체바이러스=RPV 036/044 + + + + +
RPV 048 L2E2-FeLV Gag/E2- uidA LP1-B7-/IRES- CD80/I5L-lacZ 상동성벡터=1015-18.8a 모체바이러스=RPV038 + + + + +
RPV 052 H3"U"Xbal site/LP1-uidA/EP1- FeLVenv/ S-RPV-030 EP2-FeLVgag H3 "N" I5L-lacZ/L1- FeCD86/Ires/FeCD80 상동성벡터=1015-18.8A 모체바이러스=RPV-030 + + + + + +

바이러스번호 외래유전자 삽입물 웨스턴 블롯 또는 블랙 용균반 정량법에 의한 발현분석
CD 80 CD 86 GAG ENV β-GAL β-GLU
RPV 053 H3 "U" Xba I site/EP2- FIVgag/EP1-FIVenv/ S-RPV- 034 LP1-uidA//H3 "N" I5L-lacZ/L1- FeCD86/IRES/FeCD80 상동성벡터=1015-18.8A 모체바이러스=RPV034 + + + + + +
RPV 022 L2E2-CD80/L1-lacZ 상동성벡터=931-32.A5 모체바이러스=RPV RPV-000 + +
RPV 045 LP1-CD86/IRES- CD80/I5L-LacZ 상동성벡터=1015-18.8A 모체바이러스=RPV000 + + +
CD80 및/또는 CD86 또는 CD28 단백질을 코딩하는 유전자를 함유 FHV 재조합 바이러스
바이러스번호 외래유전자 삽입물 웨스턴 블롯 또는 블랙 용균반 정량법에 의한 발현분석
CD 80 CD 86 GAG ENV β-GAL β-GLU
FHV 044 IE-FIVgag(- 9a.a.)/gX-lacZ// IE-CD86/IRES- CD80/gI-UIDA 상동성벡터=987-57.A1 모체바이러스=FHV016 + + + + +
FHV 047 IE-FIVgag(- 9a.a.)/gX-lacZ// IE-CD86-TkpA/gI- UIDA 상동성벡터=994-68.4 모체바이러스=FHV016 + + + +
FHV 048 IE-FIVenv/gX-LacZ (ΔgE)// IE-CD86-TkpA/gI- UIDA 상동성벡터=994-68.4 모체바이러스=FHV017 + + + +
FHV 042 IE-FeLVenv/gX-LacZ (ΔgE)// IE-CD86-IRES- CD80/gI-UIDA(SalHIG) 상동성벡터=987-57.A1 모체바이러스=FHV018 + + + + +

바이러스번호 외래유전자 삽입물 웨스턴 블롯 또는 블랙 용균반 정량법에 의한 발현분석
CD 80 CD 86 GAG ENV β-GAL β-GLU
FHV 040 IE-FeLVgag/gX-LacZ (ΔgE)// IE-CD86/IRES- CD80/gI-UIDA (SalH IG) 상동성벡터=987-57.A1 모체바이러스=FHV019 + + + + +
FHV 049 IE-FeLVenv/gX-LacZ (ΔgE) IE-FeCD86-TkpA/gI- UIDA (SalH IG) 상동성벡터=994-68.4 모체바이러스=FHV018 + + + +
FHV 050 IE-FeLVgag/gX-LacZ (ΔgE) IE-FeCD86-TkpA/gI- UIDA(SalH IG) 상동성벡터=994-68.4 모체바이러스=FHV019 + + + +
FHV 030 gE-CD80/gE-lacZ (ΔgE) 상동성벡터=926-76.7D7 모체바이러스=FHV020 + +


FIV 또는 FELV 바이러스의 부분 또는 전체 게놈과 함께 고양이의 공동벡터 CD80 및 CD86에 대한 추가 실시예
주: FIV의 부분 또는 전체 게놈의 보체 및/또는 고양이의 IL-12 p35 및 p40가 존재하거나 비존재하는 FIV를 포함하는 재조합 바이러스내에 CD80, CD86, CTLA4 또는 CD28을 함유하는 재조합 바이러스성 벡터. 상기 재조합 바이러스는 관련분야에서 FIV 및 FeLV 질병에 대한 백신 후보물질으로서의 가능성을 가지고 있다.
1. FIV의 전체 또는 부분 게놈을 함유하는 고양이의 재조합 돈두 바이러스에 서 고양이의 CD80, CD28 및 CTLA4의 단독 또는 둘이상의 조합된 발현.
2. FIV의 전체 또는 부분 게놈을 함유하는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스에서 고양이의 CD80, CD28 및 CTLA4의 단독 또는 둘이상의 조합된 발현.
3. FIV의 전체 또는 부분 게놈을 함유하는 고양이의 재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스에서 고양이의 CD80, CD28 및 CTLA4의 단독 또는 둘이상의 조합된 발현.
4. FeLV의 전체 또는 부분 게놈을 함유하는 고양이의 재조합 돈두 바이러스에서 고양이의 CD80, CD28 및 CTLA4의 단독 또는 둘이상의 조합된 발현.
5. FeLV의 전체 또는 부분 게놈을 함유하는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스에서 고양이의 CD80, CD28 및 CTLA4의 단독 또는 둘이상의 조합된 발현.
6. FeLV의 전체 또는 부분 게놈을 함유하는 고양이의 재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스에서 고양이의 CD80, CD28 및 CTLA4의 단독 또는 둘이상의 조합된 발현.
7. FIV의 전체 또는 부분 게놈 및 유전자로서 고양이의 IL12, GM-CSF, p35 및 p40을 함유하는 고양이의 재조합 돈두 바이러스에서 고양이의 CD80, CD28 및 CTLA4의 단독 또는 둘이상의 조합된 발현.
8. FIV의 전체 또는 부분 게놈 및 유전자로서 고양이의 IL12, GM-CSF, p35 및 p40을 함유하는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스에서 고양이의 CD80, CD28 및 CTLA4의 단독 또는 둘이상의 조합된 발현.
9. FIV의 전체 또는 부분 게놈 및 유전자로서 고양이의 IL12, GM-CSF, p35 및 p40을 함유하는 고양이의 재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스에서 고양이의 CD80, CD28 및 CTLA4의 단독 또는 둘이상의 조합된 발현.
10. FeLV의 전체 또는 부분 게놈 및 유전자로서 고양이의 IL12, GM-CSF, p35 및 p40을 함유하는 고양이의 재조합 돈두 바이러스에서 고양이의 CD80, CD28 및 CTLA4의 단독 또는 둘이상의 조합된 발현.
11. FeLV의 전체 또는 부분 게놈 및 유전자로서 고양이의 IL12, GM-CSF, p35 및 p40을 함유하는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스에서 고양이의 CD80, CD28 및 CTLA4의 단독 또는 둘이상의 조합된 발현.
12. FeLV의 전체 또는 부분 게놈 및 유전자로서 고양이의 IL12, GM-CSF, p35 및 p40을 함유하는 고양이의 재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스에서 고양이의 CD80, CD28 및 CTLA4의 단독 또는 둘이상의 조합된 발현.
FIV 게놈(LTRs) 및 고양이의 CD80 및/또는 CD86 또는 CD28 단백질을 코딩하는 유전자를 함유한 재조합 바이러스
바이러스번호 외래유전자 삽입물 웨스턴 블롯 또는 블랙 용균반 정량법에 의한 발현분석
CD 80 CD 86 GAG ENV β-GAL β-GLU
FHV 054 CMV-FIVgenome/gX- lacZ//gE-CD80 상동성벡터=1016-75.B1 모체바이러스=FHV 030 + + + +
FHV 055 CMV-FIVgenome/gX- lacZ//gE-CD80/gX- UIDA 상동성벡터=1016-75.B1 모체바이러스=FHV 041 + + + + +
RPV 055 CMV-FIVgenome/LP1- UIDA//LP1- CD86/IRES- CD80/I5L-lacZ 상동성벡터=1005-95.1 모체바이러스=RPV 045 + + + + + +
SPV 288 CMV-FIV genome/I5L- lacZ//LP1- CD86/IRES- CD80/EP2-UIDA 상동성벡터=1007-70.A2 모체바이러스=RPV 045 + + + + + +



실시예
상동벡터1007-70.A2 (SPV N/CMV-FIV게놈△LTR/I5L-lacZ)
상동벡터인 1007-70.A2를 사용하여 SPV의 HindIII N 삽입위치에 외래DNA를 삽입하였다. 이 벡터는 좌우의 긴 말단반복부분(LTR) 없이 대장균(E. coli)의 β- 갈락토시다제 마커 및 전장(全長의 FIV게놈(8.5kb)를 함유하며 이 카세트는 SPV의 Hind III N단편내의 비필수적 위치부분과 유사한 SPV DNA에 의해 양쪽끝이 연결되어 있다. 재조합 SPV를 제조하기 위하여 상동재조합방법에 따라 이 상동벡터를 사용하여 외래 유전자를 코딩하는 DNA를 포함하는 바이러스를 낳게 되었다. 여기서, β-갈락토시다제 마커유전자는 구성성(constitutive)의 마마(pox) 프로모터인 I5L의 조절을 받으며 FIV게놈(△LTRs)/I5L-lacZ는 합성이 극히 빠른 싸이토메갈로바이러스(CMV IE)의 조절을 받게 된다. 이 상동벡터는 표준 재조합 DNA기술을 사용하여 제조하였다(Sambrook 등). FIV게놈(△LTRs)은 PCR을 이용하여 클로닝하여 합성하였다. 상기 PCR반응의 주형(template)으로는 全長의 FIV PPR 바이러스를 함유하는 플라스미드로부터 얻어진 proviral DNA를 사용하였다. 싱류 프라이머(5'-ACGCGTCGACCAGCTAACAAGGTAGGAGAGACTCT-3': 11/23/98BW.3)는 Gag를 코딩하는 부분의 싱류 영역인 FIV게놈의 5'쪽 끝으로부터 합성을 시작하여 유일한 Sal I위치를 형성시켰으며, 하류 프라이머 (5'-TCGAGTCGACTTGTGACAGTTCTTAGTCCATAAGC-3': 11/11/98BW.1)는 두번째 Rev 엑손의 하류 영역인 FIV게놈의 3'쪽 끝으로부터 합성을 시작하여 유일한 Sal I위치를 형성시켰다.
마지막 상동벡터인 1007.70.A2는 재조합 SPV, RPV 및 FHV를 제조하는데 사용되는 상동재조합방법을 통하여 FIV 게놈(LTRs없이)과 고양이의 CD80과 CD86의 재조합 바이러스 또는 FIV게놈(LTR 없이)과 고양이의 CD80과 CD86 및 고양이의 IL-2유전자들인 p35 및 p40을 함유하는 재조합 바이러스를 제조하는데 사용하였다.
상동벡터 1005-95.1 (RPV U/CMV-FIV게놈(△LTR)/I5L-LacZ)
외래 DNA를 RPV로 삽입시키기 위하여 벡터 1005-95.1을 제조하였다. 상기 벡터는 FIV게놈-△LTR 및 좌우에 RPV DNA로 둘러싸인 E. coli의 β-갈락토시다제 유전자를 함유하며, 외래 유전자의 싱류 영역은 약 906염기의 RPV DNA단편으로 되어 있으며, 하류 영역은 약 895염기의 RPV DNA단편으로 되어 있다. 재조합 RPV를 제조하기 위하여 상동재조합방법에 따라 이 플라스미드를 사용하여 외래 유전자를 코딩하는 DNA를 포함하는 바이러스를 낳게 되었다. 여기서, FIV게놈-△LTR은 합성이 극히 빠른 싸이토메갈로바이러스(CMV IE)프로모터의 조절을 받으며 β-글루쿠로니다제 유전자는 합성 early pox 프로모터인 EP2의 조절을 받게 된다. 이 상동벡터는 표준 재조합 DNA기술을 사용하여 합성 DNA서열을 갖는 다음의 제한효소단편들을 연결하여 제조하였으며(Sambrook등) 약 2999염기로 된 pSP64 (Promega)의 Hind III 단편에서 유래되었다. 단편1은 RPV의 Hind III 단편인 U의 Hind III - Xba I부분단편으로서 약 906개의 염기로 되어 있으며(Knight등), 단편2는 LTRs이 없는 FIV게놈의 Sal I 단편으로서 크기가 약 8.5kb이며 PCR 반응을 통한 클로닝에 의해 합성되었다. PCR의 주형으로서는 전장(全長)의 FIV PPR 바이러스를 함유하는 플라스미드로부터 유래된 proviral DNA가 사용되었다. 싱류 프라이머(5'-ACGCGTCGACCAGCTAACAAGGTAGGAGAGACTCT-3': 11/23/98BW.3)는 Gag를 코딩하는 부분의 싱류 영역인 FIV게놈의 5'쪽 끝으로부터 합성을 시작하여 유일한 Sal I위치를 형성시켰으며, 하류 프라이머 (5'-TCGAGTCGACTTGTGACAGTTCTTAGTCCATAAGC-3': 11/11/98BW.1)는 두번째 Rev 엑손의 하류 영역인 FIV게놈의 3'쪽 끝으로부터 합성 을 시작하여 유일한 Sal I 위치를 형성시켰다. 단편3은 E. coli의 β-글루쿠로니다제 유전자를 함유하는 약 2.0 kb의 단편이며, 단편4는 단편 RPV Hind III 단편인 U의 Xba I- Hind III 부분단편으로서 약 895염기로 되어 있다.
마지막 상동벡터인 1005.95.1은 재조합 SPV, RPV 및 FHV를 제조하는데 사용되는 상동재조합방법을 통하여 FIV게놈(△LTRs)과 고양이의 CD80과 CD86의 재조합 바이러스 또는 FIV게놈(△LTR)과 고양이의 CD80과 CD86 및 고양이의 IL-2유전자들인 p35 및 p40을 함유하는 재조합 바이러스를 제조하는데 사용하였다.
상동벡터 1016-74. A6 (FHV△gE/CMV-FIV게놈-△LTR/gX-lacZ)
상동 벡터 1016-74 . A6은 고양이 헤르페바이러스의 gE를 코딩하는 영역의 일부를 결실시키거나, 외래 DNA를 삽입할 목적으로 제조되었다. 상기 벡터는 FIV게놈(minus △LTR) 및 좌우에 FHV DNA로 둘러싸인 E. coli의 β-갈락토시다제 유전자를 함유한다. FIV 게놈-△LTR은 시토메갈로바이러스의 IE 프로모터 하에 있으며, β-갈락토시다아제 유전자는 가성 광견병 바이러스의 gX 프로모터의 조절 하에 있다. 상기 상동 벡터는 표준 재조합 DNA기술을 사용하여(Sambrook등), 지시된 DNA 소스로부터 제조되었다. 플라스미드 벡터는 약 2958염기로 된 Asp718I로부터, pSP18/19의 Asp718I 제한 효소 단편에서 유래되었다. 단편1은 FHV 의 SalI 단편의 Hind III - Xba I부분단편으로서 약 1415개의 염기로 되어 있으며, 단편2는 LTRs이 없는 FIV게놈의 Sal I 단편으로서 크기가 약 8.5kb이며 PCR 반응을 통한 클로닝에 의해 합성되었다. PCR의 주형으로서는 전장(全長)의 FIV PPR 바이러스를 함유하는 플라스미드로부터 유래된 proviral DNA가 사용되었다. 싱류 프라이머(5'-ACGCGTCGACCAGCTAACAAGGTAGGAGAGACTCT-3': 11/23/98BW.3)는 Gag를 코딩하는 부분의 싱류 영역인 FIV게놈의 5'쪽 끝으로부터 합성을 시작하여 유일한 Sal I위치를 형성시켰으며, 하류 프라이머 (5'-TCGAGTCGACTTGTGACAGTTCTTAGTCCATAAGC-3': 11/11/98BW.1)는 두번째 Rev 엑손의 하류 영역인 FIV게놈의 3'쪽 끝으로부터 합성을 시작하여 유일한 Sal I 위치를 형성시켰다. 단편3은 약 3.5kb의 β-갈락토시다아제 유전자 단편이며, 단편4는 단편 FHV EcoRI E의 SalI- Asp718I 부분단편으로서 약 2205염기로 되어 있다.
마지막 상동벡터인 1016.74.A6은 재조합 SPV, RPV 및 FHV를 제조하는데 사용되는 상동재조합방법을 통하여 FIV게놈(△LTRs)과 고양이의 CD80과 CD86의 재조합 바이러스 또는 FIV게놈(△LTR)과 고양이의 CD80과 CD86 및 고양이의 IL-2유전자들인 p35 및 p40을 함유하는 재조합 바이러스를 제조하는데 사용하였다.
SPV 288
SPV 288은 FIV 게놈 및 4개의 추가적 외래항원에 함유된 개시해독프레임의 전체 보체를 발현하는 재조합 돈두 바이러스이다. SPV 288은 SPV 282에서 유래되었다. 고양이의 CD80 및 CD86 유전자는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LP1)에 의해 조절된 바이시스트로닉(bicistronic) DNA 카셋트에서 발현되어 CD80 및 CD86의 전사를 촉진하였고 두개의 개시해독프레임 사이에 EMCV IRES 인자를 포함하였다. 대장균 β-글루쿠로니다제 유전자는 SPV HindIII K 게놈성 단편내에서 전기 합성 프 로모터(EP2)에 의해 조절된다. 상동벡터 992-23.6을 이용하여 재조합 RPV, SPV 또는 FHV의 제조관련 상동재조합기법에 따라 SPV 282를 제조하였다. 유전자인 CD80/CD86 및 β-글루쿠로니다제를 분명히 비필수적인 SPV 부분 Hind III K 단편에 삽입하였다. CMV-FIV 게놈 및 β-갈락토시다제 유전자를 분명히 비필수적인 SPV 부분 Hind III N 단편에 삽입하였다.
SPV 288 바이러스는 SPV 282에서 유래되었다. 상기 바이러스는 상동벡터인 1007-70.A2(상기 참조) 및 재조합 RPV, SPV 또는 FHV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러스 FHV 017에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제(BLUOGAL 및 CPRG 정량법) 또는 β-글루쿠로니다제(X-gLUC 정량법)를 발현시키는 재조합 SPV의 스크린법에 따라 스크린되었다. 상기 재조합 바이러스는 여러 차례의 청색/녹색 용균반 정제를 거친 후에 재조합 바이러스 SPV 288으로 명명되었다.
FIV 게놈 및 마커유전자(β-갈락토시다제 및 β-글루쿠로니다제)로부터 FeLV gag 및 FeLV 피막을 발현시키기 위하여 흑색 용균반 분석법을 사용하여 SPV 288를 정량하였다. 정제된 SPV 288에 의해 감염된 ESK-4 세포로부터 생성된 100%의 용균반의 경우 FeLV gag에 대한 염소의 폴리클로날 항체(Biodesign, ME) 및 FeLV 피막(gp70)애 대하여 마우스의 모노클로날 항체를 사용하여 FeLV gag 및 FeLV 피막을 발현하도록 하였다.
고양이의 CD80 및 CD86의 발현은 각각 염소의 폴리클로날 비인간 CD80 및 CD86 항체(R&D Systems, MN)를 사용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다. 고 양이의 CD80에 특이적이며 크기가 30~60KDa의 범위에 있는 다발성 밴드(multiple band)가 검출되었으며 고양이의 CD86에 특이적이며 크기가 40~70KDa의 범위에 있는 다발성 밴드(multiple band)도 검출되었다. 상기 밴드는 ESK-4 세포의 SPV에서 발현된 CD80 및 CD86의 교대적이고 다발성 당화(glycosylation) 패턴을 나타낸다. FIV 게놈에 코딩된 단백질의 발현은 FIV에 감염된 고양이의 혈청을 이용하여 웨스턴 블롯팅 분석법에 의해 확인하였다.
FHV 054
FHV 054는 FIV 게놈 및 2개의 추가적 외래항원에 함유된 개시해독프레임의 전체 보체를 발현하는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스이다. 1016-75.B1이라고 명명된 상동벡터는 FIV 게놈(???LTR) 및 β-갈락토시다제를 FHV의 길이가 긴 비반복 부분 Sal H 단편에 삽입할 목적으로 제조하였다. 삽입부위는 gL 유전자와 그 주위에 있는 전사촉진 유전자의 사이에 있다.
FIV 게놈은 CMV IE 프로모터에 의해 조절되며 대장균 β-갈락토시다제 유전자는 가성광견병 gX 프로모터 인자에 의해 조절된다.
FHV 030에서 유래된 FHV 054는 FHV의 gE 결실부위에서 고양이의 CD80 유전자를 함유한다.
상기 바이러스는 상동벡터인 1016-75.B1 및 재조합 RPV, SPV 또는 FHV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러스 FHV 030에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제(BLUOGAL 및 CPRG 정량법) 또 는 β-글루쿠로니다제(X-gLUC 정량법)를 발현시키는 재조합 FHV의 스크린법에 따라 스크린되었다. 상기 재조합 바이러스는 여러 차례의 청색/녹색 용균반 정제를 거친 후에 재조합 바이러스 FHV 054으로 명명되었다.
β-갈락토시다제를 발현시키기 위하여 흑색 용균반 분석법을 사용하여 FHV 054를 정량하였다. 용균반으로 정제된 FHV 054에 의해 감염된 CRFK 세포로부터 생성된 100%의 용균반의 경우 마우스의 모노클로날 항체를 사용하여 β-갈락토시다제를 발현하도록 하였다. 상기 바이러스는 최소한 5번이상의 계대접종을 실시한 후에도 안정한 것으로 판단되었다.
고양이의 CD80, FIV gag 및 FIV 피막의 발현은 폴리클로날 비인간 CD80 항체(R&D Systems, MN), 마우스의 모노클로날 항-FIV gag 항체(Custom Monoclonals, CA) 및 마우스의 모노클로날 항-FIV 피막 항체(Biodesign)를 사용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다. 게놈에 코딩된 FIV 게놈의 전체 보체에 대한 발현은 회복기에 있는 FIV에 감염된 고양이의 혈청을 사용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다.
FHV 055
FHV 055는 FIV 게놈 및 3개의 추가적 외래항원에 함유된 개시해독프레임의 전체 보체를 발현하는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스이다. 1016-75.B1이라고 명명된 상동벡터는 FIV 게놈(???LTR) 및 β-갈락토시다제를 FHV의 길이가 긴 비반복 부분 Sal H 단편에 삽입할 목적으로 제조하였다. 삽입부위는 gL 유전자와 그 주 위에 있는 전사촉진 유전자의 사이에 있다.
FIV 게놈은 CMV IE 프로모터에 의해 조절되며 대장균 β-갈락토시다제 유전자는 가성광견병 gX 프로모터 인자에 의해 조절된다.
FHV 041에서 유래된 FHV 055는 FHV의 gE 결실부위에서 고양이의 CD80 유전자 및 β-갈락토시다제 유전자를 함유한다. 고양이의 CD86은 FHV gE 프로모터에 의해 조절되며 β-갈락토시다제 유전자는 가성광견병 gX 프로모터 인자에 의해 조절된다. FHV 055는 상동벡터인 1016-75.B1 및 재조합 RPV, SPV 또는 FHV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러스 FHV 041에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제(BLUOGAL 및 CPRG 정량법) 또는 β-글루쿠로니다제(X-gLUC 정량법)를 발현시키는 재조합 FHV의 스크린법에 따라 스크린되었다. 상기 재조합 바이러스는 여러 차례의 청색/녹색 용균반 정제를 거친 후에 재조합 바이러스 FHV 055으로 명명되었다.
β-갈락토시다제 및 β-글루쿠로니다제를 발현시키기 위하여 흑색 용균반 분석법을 사용하여 FHV 054를 정량하였다. 용균반으로 정제된 FHV 054에 의해 감염된 CRFK 세포로부터 생성된 100%의 용균반의 경우 각각 마우스의 모노클로날 항체(Biodesign, ME) 및 토끼의 폴리클로날 항체(Molecular Probes, OR)를 사용하여 β-갈락토시다제 및 β-글루쿠로니다제를 발현하도록 하였다. 상기 바이러스는 5번이상의 계대접종을 실시한 후에도 안정한 것으로 판단되었다.
고양이의 CD85, FIV gag 및 FIV 피막의 발현은 폴리클로날 비인간 CD86 항체(R&D Systems, MN), 마우스의 모노클로날 항-FIV gag 항체(Custom Monoclonals, CA) 및 마우스의 모노클로날 항-FIV 피막 항체(Biodesign)를 사용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다. 게놈에 코딩된 FIV 게놈의 전체 보체에 대한 발현은 회복기에 있는 FIV에 감염된 고양이의 혈청을 사용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다.
RPV 055
RPV 055은 다섯가지의 외래 유전자를 발현하는 FIV 게놈 및 3개의 추가적 외래항원에 함유된 개시해독프레임의 전체 보체를 발현하는 고양이의 재조합 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스이다. RPV-045에서 유래된 RPV-055는 고양이의 CD80 및 CD86 유전자를 함유하고 있다. 상기 고양이의 CD80 및 CD86 유전자는 후기 합성 마마(pox) 프로모터(LP1)에 의해 조절된 바이시스트로닉(bicistronic) DNA 카셋트에서 발현되어 CD80 및 CD86의 전사를 촉진하였고 두개의 개시해독프레임 사이에 EMCV IRES 인자를 포함하였다. 대장균 β-글루쿠로니다제 유전자는 RPV HindIII N 게놈성 부분단편내에서 전기 합성 프로모터(EP2)에 의해 조절된다. 상동벡터 1005-95.1을 이용하여 재조합 RPV, SPV 또는 FHV의 제조관련 상동재조합기법에 따라 RPV 055를 제조하였다. 유전자인 CD80/CD86 및 β-글루쿠로니다제를 분명히 비필수적인 RPV 부분 Hind III N 단편에 삽입하였다. CMV-FIV 게놈 및 β-갈락토시다제 유전자를 분명히 비필수적인 RPV 부분 Hind III N 단편에 삽입하였다.
RPV 055 바이러스는 RPV 045에서 유래되었다. 상기 바이러스는 상동벡터인 1005-95.1 및 재조합 RPV, SPV 또는 FHV의 제조관련 상동재조합기법에 따른 바이러 스 FHV 017에 의거하여 제조된 것이다. 형질변환감염 주(transfection stock)는 β-갈락토시다제(BLUOGAL 및 CPRG 정량법) 또는 β-글루쿠로니다제(X-gLUC 정량법)를 발현시키는 재조합 SPV의 스크린법에 따라 스크린되었다. 상기 재조합 바이러스는 여러 차례의 청색/녹색 용균반 정제를 거친 후에 재조합 바이러스 RPV 055로 명명되었다.
FIV 게놈으로부터 FeLV gag 및 FeLV 피막 및 마커유전자(β-갈락토시다제 및 β-글루쿠로니다제)를 발현시키기 위하여 흑색 용균반 분석법을 사용하여 RPV 055를 정량하였다. 정제된 RPV 055에 의해 감염된 VERO 세포로부터 생성된 100%의 용균반의 경우 FeLV gag에 대하여 염소의 폴리클로날 항체(Biodesign, ME) 및 FeLV 피막 gp70(Biodesign, ME)애 대하여 마우스의 모노클로날 항체를 사용하여 FeLV gag 및 FeLV 피막을 발현하도록 하였다.
고양이의 CD80 및 CD86의 발현은 각각 염소의 폴리클로날 비인간 CD80 및 CD86 항체(R&D Systems, MN)를 사용하여 웨스턴 블롯팅방법에 의해 확인하었다. 고양이의 CD80에 특이적이며 크기가 30~60KDa의 범위에 있는 다발성 밴드(multiple band)가 검출되었으며 고양이의 CD86에 특이적이며 크기가 40~70KDa의 범위에 있는 다발성 밴드(multiple band)도 검출되었다. 상기 밴드는 VERO 세포의 RPV에서 발현된 CD80 및 CD86의 교대적이고 다발성 당화(glycosylation) 패턴을 나타낸다. FIV 게놈에 코딩된 단백질의 발현은 FIV에 감염된 고양이의 혈청을 이용하여 웨스턴 블롯팅 분석법에 의해 확인하였다.
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SEQUENCE LISTING <110> Winslow, Barbara J. Cochran, Mark D. <120> Recombinant Virus Expressing Foreign DNA Encoding Feline CD80, Feline CD86, Feline CD28, Feline CTLA-4 or Feline Interferon-gama And Uses Thereof <130> SPP009124KR <150> 09/071,711 <151> 1998-05-01 <160> 82 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 941 <212> DNA <213> feline CD80 <220> <221> CDS <222> (1)..(876) <400> 1 atg ggt cac gca gca aag tgg aaa aca cca cta ctg aag cac cca tat 48 Met Gly His Ala Ala Lys Trp Lys Thr Pro Leu Leu Lys His Pro Tyr 1 5 10 15 ccc aag ctc ttt ccg ctc ttg atg cta gct agt ctt ttt tac ttc tgt 96 Pro Lys Leu Phe Pro Leu Leu Met Leu Ala Ser Leu Phe Tyr Phe Cys 20 25 30 tca ggt atc atc cag gtg aac aag aca gtg gaa gaa gta gca gta cta 144 Ser Gly Ile Ile Gln Val Asn Lys Thr Val Glu Glu Val Ala Val Leu 35 40 45 tcc tgt gat tac aac att tcc acc aaa gaa ctg acg gaa att cga atc 192 Ser Cys Asp Tyr Asn Ile Ser Thr Lys Glu Leu Thr Glu Ile Arg Ile 50 55 60 tat tgg caa aag gat gat gaa atg gtg ttg gct gtc atg tct ggc aaa 240 Tyr Trp Gln Lys Asp Asp Glu Met Val Leu Ala Val Met Ser Gly Lys 65 70 75 80 gta caa gtg tgg ccc aag tac aag aac cgc aca ttc act gac gtc acc 288 Val Gln Val Trp Pro Lys Tyr Lys Asn Arg Thr Phe Thr Asp Val Thr 85 90 95 gat aac cac tcc att gtg atc atg gct ctg cgc ctg tca gac aat ggc 336 Asp Asn His Ser Ile Val Ile Met Ala Leu Arg Leu Ser Asp Asn Gly 100 105 110 aaa tac act tgt att att caa aag att gaa aaa ggg tct tac aaa gtg 384 Lys Tyr Thr Cys Ile Ile Gln Lys Ile Glu Lys Gly Ser Tyr Lys Val 115 120 125 aaa cac ctg act tcg gtg atg tta ttg gtc aga gct gac ttc cct gtc 432 Lys His Leu Thr Ser Val Met Leu Leu Val Arg Ala Asp Phe Pro Val 130 135 140 cct agt ata act gat ctt gga aat cca tct cat aac atc aaa agg ata 480 Pro Ser Ile Thr Asp Leu Gly Asn Pro Ser His Asn Ile Lys Arg Ile 145 150 155 160 atg tgc tta act tct gga ggt ttt cca aag cct cac ctc tcc tgg ctg 528 Met Cys Leu Thr Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro His Leu Ser Trp Leu 165 170 175 gaa aat gaa gaa gaa tta aat gcc atc aac aca aca gtt tcc caa gat 576 Glu Asn Glu Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp 180 185 190 cct gaa act gag ctc tac act att agc agt gaa ctg gat ttc aat atg 624 Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Glu Leu Asp Phe Asn Met 195 200 205 aca aac aac cat agc ttc ctg tgt ctt gtc aag tat gga aac tta cta 672 Thr Asn Asn His Ser Phe Leu Cys Leu Val Lys Tyr Gly Asn Leu Leu 210 215 220 gta tca cag atc ttc aac tgg caa aaa tca gag cca cag cct tct aat 720 Val Ser Gln Ile Phe Asn Trp Gln Lys Ser Glu Pro Gln Pro Ser Asn 225 230 235 240 aat cag ctc tgg atc att atc ctg agc tca gta gta agt ggg att gtt 768 Asn Gln Leu Trp Ile Ile Ile Leu Ser Ser Val Val Ser Gly Ile Val 245 250 255 gtg atc act gca ctt acc tta aga tgc cta gtc cac aga cct gct gca 816 Val Ile Thr Ala Leu Thr Leu Arg Cys Leu Val His Arg Pro Ala Ala 260 265 270 agg tgg aga caa aga gaa atg ggg aga gcg cgg aaa tgg aaa aga tct 864 Arg Trp Arg Gln Arg Glu Met Gly Arg Ala Arg Lys Trp Lys Arg Ser 275 280 285 cac ctg tct aca tagattctgc agaaccactg tatgcagagc atctggaggt 916 His Leu Ser Thr 290 agcctcttta gctcttctct actag 941 <210> 2 <211> 292 <212> PRT <213> feline CD80 <400> 2 Met Gly His Ala Ala Lys Trp Lys Thr Pro Leu Leu Lys His Pro Tyr 1 5 10 15 Pro Lys Leu Phe Pro Leu Leu Met Leu Ala Ser Leu Phe Tyr Phe Cys 20 25 30 Ser Gly Ile Ile Gln Val Asn Lys Thr Val Glu Glu Val Ala Val Leu 35 40 45 Ser Cys Asp Tyr Asn Ile Ser Thr Lys Glu Leu Thr Glu Ile Arg Ile 50 55 60 Tyr Trp Gln Lys Asp Asp Glu Met Val Leu Ala Val Met Ser Gly Lys 65 70 75 80 Val Gln Val Trp Pro Lys Tyr Lys Asn Arg Thr Phe Thr Asp Val Thr 85 90 95 Asp Asn His Ser Ile Val Ile Met Ala Leu Arg Leu Ser Asp Asn Gly 100 105 110 Lys Tyr Thr Cys Ile Ile Gln Lys Ile Glu Lys Gly Ser Tyr Lys Val 115 120 125 Lys His Leu Thr Ser Val Met Leu Leu Val Arg Ala Asp Phe Pro Val 130 135 140 Pro Ser Ile Thr Asp Leu Gly Asn Pro Ser His Asn Ile Lys Arg Ile 145 150 155 160 Met Cys Leu Thr Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro His Leu Ser Trp Leu 165 170 175 Glu Asn Glu Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp 180 185 190 Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Glu Leu Asp Phe Asn Met 195 200 205 Thr Asn Asn His Ser Phe Leu Cys Leu Val Lys Tyr Gly Asn Leu Leu 210 215 220 Val Ser Gln Ile Phe Asn Trp Gln Lys Ser Glu Pro Gln Pro Ser Asn 225 230 235 240 Asn Gln Leu Trp Ile Ile Ile Leu Ser Ser Val Val Ser Gly Ile Val 245 250 255 Val Ile Thr Ala Leu Thr Leu Arg Cys Leu Val His Arg Pro Ala Ala 260 265 270 Arg Trp Arg Gln Arg Glu Met Gly Arg Ala Arg Lys Trp Lys Arg Ser 275 280 285 His Leu Ser Thr 290 <210> 3 <211> 879 <212> DNA <213> feline CD80 <220> <221> CDS <222> (1)..(876) <400> 3 atg ggt cac gca gca aag tgg aaa aca cca cta ctg aag cac cca tat 48 Met Gly His Ala Ala Lys Trp Lys Thr Pro Leu Leu Lys His Pro Tyr 1 5 10 15 ccc aag ctc ttt ccg ctc ttg atg cta gct agt ctt ttt tac ttc tgt 96 Pro Lys Leu Phe Pro Leu Leu Met Leu Ala Ser Leu Phe Tyr Phe Cys 20 25 30 tca ggt atc atc cag gtg aac aag aca gtg gaa gaa gta gca gta cta 144 Ser Gly Ile Ile Gln Val Asn Lys Thr Val Glu Glu Val Ala Val Leu 35 40 45 tcc tgt gat tac aac att tcc acc aaa gaa ctg acg gaa att cga atc 192 Ser Cys Asp Tyr Asn Ile Ser Thr Lys Glu Leu Thr Glu Ile Arg Ile 50 55 60 tat tgg caa aag gat gat gaa atg gtg ttg gct gtc atg tct ggc aaa 240 Tyr Trp Gln Lys Asp Asp Glu Met Val Leu Ala Val Met Ser Gly Lys 65 70 75 80 gta caa gtg tgg ccc aag tac aag aac cgc aca ttc act gac gtc acc 288 Val Gln Val Trp Pro Lys Tyr Lys Asn Arg Thr Phe Thr Asp Val Thr 85 90 95 gat aac cac tcc att gtg atc atg gct ctg cgc ctg tca gac aat ggc 336 Asp Asn His Ser Ile Val Ile Met Ala Leu Arg Leu Ser Asp Asn Gly 100 105 110 aaa tac act tgt atc att caa aag att caa aaa ggg tct tac aaa gtg 384 Lys Tyr Thr Cys Ile Ile Gln Lys Ile Gln Lys Gly Ser Tyr Lys Val 115 120 125 aaa cac ctg act tcg gtg atg tta ttg gtc aga gct gac ttc cct gtc 432 Lys His Leu Thr Ser Val Met Leu Leu Val Arg Ala Asp Phe Pro Val 130 135 140 cct agt ata act gat ctt gga aat cca tct cat aac atc aaa agg ata 480 Pro Ser Ile Thr Asp Leu Gly Asn Pro Ser His Asn Ile Lys Arg Ile 145 150 155 160 atg tgc tta act tct gga ggt ttt cca aag cct cac ctc tcc tgg ctg 528 Met Cys Leu Thr Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro His Leu Ser Trp Leu 165 170 175 gaa aat gaa gaa gaa tta aat gcc atc aac aca aca gtt tcc caa gat 576 Glu Asn Glu Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp 180 185 190 cct gaa act gag ctc tac act att agc agt gaa ctg gat ttc aat atg 624 Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Glu Leu Asp Phe Asn Met 195 200 205 aca aac aac cat agc ttc ctg tgt ctt gtc aag tat gga aac tta ata 672 Thr Asn Asn His Ser Phe Leu Cys Leu Val Lys Tyr Gly Asn Leu Ile 210 215 220 gta tca cag atc ttc aac tgg caa aaa tca gag cca cag cct tct aat 720 Val Ser Gln Ile Phe Asn Trp Gln Lys Ser Glu Pro Gln Pro Ser Asn 225 230 235 240 aat cag ctc tgg atc att atc ctg agc tca gta gta agt ggg att gtt 768 Asn Gln Leu Trp Ile Ile Ile Leu Ser Ser Val Val Ser Gly Ile Val 245 250 255 gtg atc act gca ctt acc tta aga tgc cta gtc cac aga cct gct gca 816 Val Ile Thr Ala Leu Thr Leu Arg Cys Leu Val His Arg Pro Ala Ala 260 265 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Cys Leu Thr Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro His Leu Ser Trp Leu 165 170 175 Glu Asn Glu Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp 180 185 190 Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Glu Leu Asp Phe Asn Met 195 200 205 Thr Asn Asn His Ser Phe Leu Cys Leu Val Lys Tyr Gly Asn Leu Ile 210 215 220 Val Ser Gln Ile Phe Asn Trp Gln Lys Ser Glu Pro Gln Pro Ser Asn 225 230 235 240 Asn Gln Leu Trp Ile Ile Ile Leu Ser Ser Val Val Ser Gly Ile Val 245 250 255 Val Ile Thr Ala Leu Thr Leu Arg Cys Leu Val His Arg Pro Ala Ala 260 265 270 Arg Trp Arg Gln Arg Glu Met Gly Arg Ala Arg Lys Trp Lys Arg Ser 275 280 285 His Leu Ser Thr 290 <210> 5 <211> 1080 <212> DNA <213> feline CD86 <220> <221> CDS <222> (63)..(1052) <400> 5 gtttctgtgt tcctcgggaa tgtcactgag cttatacatc tggtctctgg gagctgcagt 60 gg atg ggc att tgt gac agc act atg gga ctg agt cac act ctc ctt 107 Met Gly Ile Cys Asp Ser Thr Met Gly Leu Ser His Thr Leu Leu 1 5 10 15 gtg atg gcc ctc ctg ctc tct ggt gtt tct tcc atg aag agt caa gca 155 Val Met Ala Leu Leu Leu Ser Gly Val Ser Ser Met Lys Ser Gln Ala 20 25 30 tat ttc aac aag act gga gaa ctg cca tgc cat ttt aca aac tct caa 203 Tyr Phe Asn Lys Thr Gly Glu Leu Pro Cys His Phe Thr Asn Ser Gln 35 40 45 aac ata agc ctg gat gag ctg gta gta ttt tgg cag gac cag gat aag 251 Asn Ile Ser Leu Asp Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Asp Lys 50 55 60 ctg gtt ctg tat gag ata ttc aga ggc aaa gag aac cct caa aat gtt 299 Leu Val Leu Tyr Glu Ile Phe Arg Gly Lys Glu Asn Pro Gln Asn Val 65 70 75 cat ctc aaa tat aag ggc cgt aca agc ttt gac aag gac aac tgg acc 347 His Leu Lys Tyr Lys Gly Arg Thr Ser Phe Asp Lys Asp Asn Trp Thr 80 85 90 95 ctg aga ctc cac aat gtt cag atc aag gac aag ggc aca tat cac tgt 395 Leu Arg Leu His Asn Val Gln Ile Lys Asp Lys Gly Thr Tyr His Cys 100 105 110 ttc att cat tat aaa ggg ccc aaa gga cta gtt ccc atg cac caa atg 443 Phe Ile His Tyr Lys Gly Pro Lys Gly Leu Val Pro Met His Gln Met 115 120 125 agt tct gac cta tca gtg ctt gct aac ttc agt caa cct gaa ata aca 491 Ser Ser Asp Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Thr 130 135 140 gta act tct aat aga aca gaa aat tct ggc atc ata aat ttg acc tgc 539 Val Thr Ser Asn Arg Thr Glu Asn Ser Gly Ile Ile Asn Leu Thr Cys 145 150 155 tca tct ata caa ggt tac cca gaa cct aag gag atg tat ttt cag cta 587 Ser Ser Ile Gln Gly Tyr Pro Glu Pro Lys Glu Met Tyr Phe Gln Leu 160 165 170 175 aac act gag aat tca act act aag tat gat act gtc atg aag aaa tct 635 Asn Thr Glu Asn Ser Thr Thr Lys Tyr Asp Thr Val Met Lys Lys Ser 180 185 190 caa aat aat gtg aca gaa ctg tac aac gtt tct atc agc ttg cct ttt 683 Gln Asn Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asn Val Ser Ile Ser Leu Pro Phe 195 200 205 tca gtc cct gaa gca cac aat gtg agc gtc ttt tgt gcc ctg aaa ctg 731 Ser Val Pro Glu Ala His Asn Val Ser Val Phe Cys Ala Leu Lys Leu 210 215 220 gag aca ctg gag atg ctg ctc tcc cta cct ttc aat ata gat gca caa 779 Glu Thr Leu Glu Met Leu Leu Ser Leu Pro Phe Asn Ile Asp Ala Gln 225 230 235 cct aag gat aaa gac cct gaa caa ggc cac ttc ctc tgg att gcg gct 827 Pro Lys Asp Lys Asp Pro Glu Gln Gly His Phe Leu Trp Ile Ala Ala 240 245 250 255 gta ctt gta atg ttt gtt gtt ttt tgt ggg atg gtg tcc ttt aaa aca 875 Val Leu Val Met Phe Val Val Phe Cys Gly Met Val Ser Phe Lys Thr 260 265 270 cta agg aaa agg aag aag aag cag cct ggc ccc tct cat gaa tgt gaa 923 Leu Arg Lys Arg Lys Lys Lys Gln Pro Gly Pro Ser His Glu Cys Glu 275 280 285 acc atc aaa agg gag aga aaa gag agc aaa cag acc aac gaa aga gta 971 Thr Ile Lys Arg Glu Arg Lys Glu Ser Lys Gln Thr Asn Glu Arg Val 290 295 300 cca tac cac gta cct gag aga tct gat gaa gcc cag tgt gtt aac att 1019 Pro Tyr His Val Pro Glu Arg Ser Asp Glu Ala Gln Cys Val Asn Ile 305 310 315 ttg aag aca gcc tca ggg gac aaa aat cag tag gaaaatggtg gcttggcgtg 1072 Leu Lys Thr Ala Ser Gly Asp Lys Asn Gln 320 325 330 ctgacaat 1080 <210> 6 <211> 329 <212> PRT <213> feline CD86 <400> 6 Met Gly Ile Cys Asp Ser Thr Met Gly Leu Ser His Thr Leu Leu Val 1 5 10 15 Met Ala Leu Leu Leu Ser Gly Val Ser Ser Met Lys Ser Gln Ala Tyr 20 25 30 Phe Asn Lys Thr Gly Glu Leu Pro Cys His Phe Thr Asn Ser Gln Asn 35 40 45 Ile Ser Leu Asp Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Asp Lys Leu 50 55 60 Val Leu Tyr Glu Ile Phe Arg Gly Lys Glu Asn Pro Gln Asn Val His 65 70 75 80 Leu Lys Tyr Lys Gly Arg Thr Ser Phe Asp Lys Asp Asn Trp Thr Leu 85 90 95 Arg Leu His Asn Val Gln Ile Lys Asp Lys Gly Thr Tyr His Cys Phe 100 105 110 Ile His Tyr Lys Gly Pro Lys Gly Leu Val Pro Met His Gln Met Ser 115 120 125 Ser Asp Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Thr Val 130 135 140 Thr Ser Asn Arg Thr Glu Asn Ser Gly Ile Ile Asn Leu Thr Cys Ser 145 150 155 160 Ser Ile Gln Gly Tyr Pro Glu Pro Lys Glu Met Tyr Phe Gln Leu Asn 165 170 175 Thr Glu Asn Ser Thr Thr Lys Tyr Asp Thr Val Met Lys Lys Ser Gln 180 185 190 Asn Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asn Val Ser Ile Ser Leu Pro Phe Ser 195 200 205 Val Pro Glu Ala His Asn Val Ser Val Phe Cys Ala Leu Lys Leu Glu 210 215 220 Thr Leu Glu Met Leu Leu Ser Leu Pro Phe Asn Ile Asp Ala Gln Pro 225 230 235 240 Lys Asp Lys Asp Pro Glu Gln Gly His Phe Leu Trp Ile Ala Ala Val 245 250 255 Leu Val Met Phe Val Val Phe Cys Gly Met Val Ser Phe Lys Thr Leu 260 265 270 Arg Lys Arg Lys Lys Lys Gln Pro Gly Pro Ser His Glu Cys Glu Thr 275 280 285 Ile Lys Arg Glu Arg Lys Glu Ser Lys Gln Thr Asn Glu Arg Val Pro 290 295 300 Tyr His Val Pro Glu Arg Ser Asp Glu Ala Gln Cys Val Asn Ile Leu 305 310 315 320 Lys Thr Ala Ser Gly Asp Lys Asn Gln 325 <210> 7 <211> 688 <212> DNA <213> feline CD28 <220> <221> CDS <222> (1)..(663) <400> 7 atg atc ctc agg ctg ctt ctg gct ctc aac ttc ttc ccc tca att caa 48 Met Ile Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Phe Phe Pro Ser Ile Gln 1 5 10 15 gta aca gaa aac aag att ttg gtg aag cag ttg ccc agg ctt gtg gtg 96 Val Thr Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Leu Pro Arg Leu Val Val 20 25 30 tac aac aat gag gtc aac ctt agc tgc aag tac act cac aac ttc ttc 144 Tyr Asn Asn Glu Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Thr His Asn Phe Phe 35 40 45 tca aag gag ttc cgg gca tcc ctt tat aag gga gta gat agt gct gtg 192 Ser Lys Glu Phe Arg Ala Ser Leu Tyr Lys Gly Val Asp Ser Ala Val 50 55 60 gaa gtc tgc gtt gtg aat gga aat tac tcc cat cag cct cag ttc tac 240 Glu Val Cys Val Val Asn Gly Asn Tyr Ser His Gln Pro Gln Phe Tyr 65 70 75 80 tca agt aca gga ttc gac tgt gat ggg aaa ttg ggc aat gaa aca gtg 288 Ser Ser Thr Gly Phe Asp Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Thr Val 85 90 95 aca ttc tac ctc cga aat ttg ttt gtt aac caa acg gat att tac ttc 336 Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Leu Phe Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe 100 105 110 tgc aaa att gaa gtc atg tat cca cct cct tac ata gac aat gag aag 384 Cys Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Ile Asp Asn Glu Lys 115 120 125 agc aat ggg acc att atc cac gtg aaa gag aaa cat ctt tgt cca gct 432 Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Glu Lys His Leu Cys Pro Ala 130 135 140 cag ctg tct cct gaa tct tcc aag cca ttt tgg gca ctg gtg gtg gtt 480 Gln Leu Ser Pro Glu Ser Ser Lys Pro Phe Trp Ala Leu Val Val Val 145 150 155 160 ggt gga atc cta ggt ttc tac agc ttg cta gca aca gtg gct ctt ggt 528 Gly Gly Ile Leu Gly Phe Tyr Ser Leu Leu Ala Thr Val Ala Leu Gly 165 170 175 gct tgc tgg atg aag acc aag agg agt agg atc ctt cag agt gac tat 576 Ala Cys Trp Met Lys Thr Lys Arg Ser Arg Ile Leu Gln Ser Asp Tyr 180 185 190 atg aac atg acc ccc cgg agg cca ggg ccc acc cga agg cac tac caa 624 Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Arg His Tyr Gln 195 200 205 cct tac gcc cca gca cgc gac ttt gcg gca tac cgt tcc tgacatggac 673 Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 210 215 220 ccctatccag aagcc 688 <210> 8 <211> 221 <212> PRT <213> feline CD28 <400> 8 Met Ile Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Phe Phe Pro Ser Ile Gln 1 5 10 15 Val Thr Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Leu Pro Arg Leu Val Val 20 25 30 Tyr Asn Asn Glu Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Thr His Asn Phe Phe 35 40 45 Ser Lys Glu Phe Arg Ala Ser Leu Tyr Lys Gly Val Asp Ser Ala Val 50 55 60 Glu Val Cys Val Val Asn Gly Asn Tyr Ser His Gln Pro Gln Phe Tyr 65 70 75 80 Ser Ser Thr Gly Phe Asp Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Thr Val 85 90 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gtg gcc 149 Phe Ser Leu Leu Phe Ile Pro Val Phe Ser Lys Gly Met His Val Ala 30 35 40 cac cct gca gtg gtg ctg gcc agc agc cga ggt gtc gcc agc ttc gtg 197 His Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Val Ala Ser Phe Val 45 50 55 tgt gaa tat ggg tct tca ggc aat gcc gcc aaa ttc cga gtg act gtg 245 Cys Glu Tyr Gly Ser Ser Gly Asn Ala Ala Lys Phe Arg Val Thr Val 60 65 70 ctg agg caa act ggc agc caa atg act gaa gtc tgt gct gcg aca tac 293 Leu Arg Gln Thr Gly Ser Gln Met Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr 75 80 85 aca gtg gag aat gag ttg gcc ttc cta aat gat tcc acc tgc act ggc 341 Thr Val Glu Asn Glu Leu Ala Phe Leu Asn Asp Ser Thr Cys Thr Gly 90 95 100 105 atc tcc agc gga aac aaa gtg aac ctc acc atc caa ggg ttg agg gcc 389 Ile Ser Ser Gly Asn Lys Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala 110 115 120 atg gac acg gga ctc tac atc tgc aag gtg gag ctc atg tac cca cca 437 Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro 125 130 135 ccc tac tat gca ggc atg ggc aat gga acc cag att tat gtc atc gat 485 Pro Tyr Tyr Ala Gly Met Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp 140 145 150 cct gaa cct tgc cca gat tct gac ttc ctc ctc tgg atc ctc gca gca 533 Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala 155 160 165 gtc agt tca gga ttg ttt ttt tat agc ttc ctt atc aca gct gtt tct 581 Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Ile Thr Ala Val Ser 170 175 180 185 ttg agc aaa atg cta aag aaa aga agc cct ctt act aca ggg gtc tat 629 Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr 190 195 200 gtg aaa atg ccc cca aca gag cca gaa tgt gaa aag caa ttt cag cct 677 Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro 205 210 215 tat ttt att ccc atc aat tga cacaccgtta tgaagaagga agaacactgt 728 Tyr Phe Ile Pro Ile Asn 220 ccaatttcta agagctgagg c 749 <210> 10 <211> 223 <212> PRT <213> feline CTLA-4 <400> 10 Met Ala Cys Phe Gly Phe Arg Arg His Gly Ala Gln Leu Asp Leu Ala 1 5 10 15 Ser Arg Thr Trp Pro Cys Thr Ala Leu Phe Ser Leu Leu Phe Ile Pro 20 25 30 Val Phe Ser Lys Gly Met His Val Ala His Pro Ala Val Val Leu Ala 35 40 45 Ser Ser Arg Gly Val Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Gly Ser Ser Gly 50 55 60 Asn Ala Ala Lys Phe Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr Gly Ser Gln 65 70 75 80 Met Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Thr Val Glu Asn Glu Leu Ala 85 90 95 Phe Leu Asn Asp Ser Thr Cys Thr Gly Ile Ser Ser Gly Asn Lys Val 100 105 110 Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile 115 120 125 Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Ala Gly Met Gly 130 135 140 Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser 145 150 155 160 Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe 165 170 175 Tyr Ser Phe Leu Ile Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys 180 185 190 Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu 195 200 205 Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn 210 215 220 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> feline CD80 primer <400> 11 cgcggatccg caccatgggt cacgcagcaa agtggaaaac 40 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> feline CD80 primer <400> 12 cctagtagag aagagctaaa gaggc 25 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> feline CD28 primer <400> 13 cgcggatcca ccggtagcac aatgatcctc agg 33 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> feline CD28 primer <400> 14 cgcggatcct ctggataggg gtccatgtca g 31 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> feline CTLA-4 primer <400> 15 atggcttcgc cttggatttc cagcagg 27 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> feline CTLA-4 primer <400> 16 tcaattgaat gaggaataaa ataaggctg 29 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> feline CTLA-4 primer <400> 17 tgttgggttt ctgactctga cttccctg 28 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> feline CTLA-4 primer <400> 18 gcatagtagg gtggtgggta catg 24 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> feline CTLA-4 primer <400> 19 tgttgggttt ctgactctga cttccctg 28 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> feline CTLA-4 primer <400> 20 acatgagctc caccttgcag 20 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> feline CTLA-4 primer <400> 21 ccatcctaat acgactcact atagggc 27 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> feline CTLA-4 primer <400> 22 gtgaatatgg gtcttcaggc aatg 24 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> feline CTLA-4 primer <400> 23 actcactata gggctcgagc ggc 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> feline CTLA-4 primer <400> 24 gaaatccgag tgactgtgct gag 23 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> feline CTLA-4 primer <400> 25 aacctgaaca ctgctcccat aaag 24 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> feline CTLA-4 primer <400> 26 gcctcagctc ttagaaattg gacag 25 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> feline CD86 primer <400> 27 tagtattttg gcaggaccag g 21 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> feline CD86 primer <400> 28 ctgtgacatt atcttgagat ttc 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> feline CD86 primer <400> 29 gagcatgcac taatgggact gag 23 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> feline CD86 primer <400> 30 ctgtgacatt atcttgagat ttc 23 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> feline CD86 primer <400> 31 ccatcctaat acgactcact atagggc 27 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> feline CD86 primer <400> 32 tgggtaacct tgtatagatg agcaggtc 28 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> feline CD86 primer <400> 33 actcactata gggctcgagc ggc 23 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> feline CD86 primer <400> 34 caggttgact gaagttagca agcac 25 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> feline CD86 primer <400> 35 ccatcctaat acgactcact atagggc 27 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> feline CD86 primer <400> 36 ggacaagggc acatatcact gtttc 25 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> feline CD86 primer <400> 37 actcactata gggctcgagc ggc 23 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> feline CD86 primer <400> 38 cagtgcttgc taacttcagt caacc 25 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> feline CD86 primer <400> 39 cgggaatgtc actgagctta tag 23 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> feline CD86 primer <400> 40 gatctttttc aggttagcag ggg 23 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> feline CD80 primer <400> 41 atgggtcacg cagcaaagtg 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> feline CD80 primer <400> 42 ctatgtagac aggtgagatc 20 <210> 43 <211> 17 <212> DNA <213> feline CD80 primer <400> 43 caggaaacag ctatgac 17 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> feline CD80 primer <400> 44 aatacgactc actatagg 18 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> feline CD80 primer <400> 45 aacaccattt catcatcctt t 21 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> feline CD80 primer <400> 46 atacaagtgt atttgccatt gtc 23 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> feline CD80 primer <400> 47 agctctgacc aataacatca 20 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> feline CD80 primer <400> 48 attagaaatc cagttcactg ct 22 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> feline CD80 primer <400> 49 tcatgtctgg caaagtacaa g 21 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> feline CD80 primer <400> 50 attcactgac gtcaccga 18 <210> 51 <211> 16 <212> DNA <213> feline CD80 primer <400> 51 aaggctgtgg ctctga 16 <210> 52 <211> 29 <212> DNA <213> feline CD80 primer <400> 52 tcgagaattc gggtcacgca gcaaagtgg 29 <210> 53 <211> 32 <212> DNA <213> feline CD80 primer <400> 53 gctaggatcc aatctatgta gacaggtgag at 32 <210> 54 <211> 32 <212> DNA <213> feline CD80 primer <400> 54 gatgaattcc atgatcctca ggctgggctt ct 32 <210> 55 <211> 29 <212> DNA <213> feline CD80 primer <400> 55 gatcagatct caggaacggt atgccgcaa 29 <210> 56 <211> 22 <212> DNA <213> B7-2 primer <400> 56 ggcccgagta kaagaaccgg ac 22 <210> 57 <211> 24 <212> DNA <213> B7-3 primer <400> 57 cagwttcagg atcytgggaa aytg 24 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> B7-284 primer <400> 58 ttatactagg gacagggaag 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> B7-190 primer <400> 59 aggctttgga aaacctccag 20 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> B7-20 primer <400> 60 ttgttatcgg tgacgtcagt g 21 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> B7-135 primer <400> 61 caataacatc accgaagtca gg 22 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> B7-s220 primer <400> 62 gtcatgtctg gcaaagtaca ag 22 <210> 63 <211> 22 <212> DNA <213> B7-50 primer <400> 63 cactgacgtc accgataacc ac 22 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> B7-140 primer <400> 64 ctgacttcgg tgatgttatt gg 22 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> B7-550 primer <400> 65 gccatcaaca caacagtttc c 21 <210> 66 <211> 22 <212> DNA <213> B7-620 primer <400> 66 tatgacaaac aaccatagct tc 22 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> B7-1281 primer <400> 67 graagawtgc ctcatgakcc 20 <210> 68 <211> 17 <212> DNA <213> B7-1260 primer <400> 68 cayratccaa cataggg 17 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> B7 start primer <400> 69 atgggtcacg cagcaaagtg g 21 <210> 70 <211> 25 <212> DNA <213> B7-960 primer <400> 70 cctagtagag aagagctaaa gaggc 25 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> CD28-113 primer <400> 71 caaccttagc tgcaagtaca c 21 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> CD28-768 primer <400> 72 ggcttctgga tagggatagg 20 <210> 73 <211> 22 <212> DNA <213> CD28-190 primer <400> 73 cggaggtaga attgcactgt cc 22 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> CD28-239 primer <400> 74 attttgcaga agtaaatatc c 21 <210> 75 <211> 33 <212> DNA <213> feCD28 primer <400> 75 cgcggatcca ccggtagcac aatgatcctc agg 33 <210> 76 <211> 31 <212> DNA <213> feCD28 primer <400> 76 cgcggatcct ctggatagcc ctccatgtca g 31 <210> 77 <211> 31 <212> DNA <213> FIV PPR upstream primer <400> 77 gcccggatcc tatggcagaa gggtttgcag c 31 <210> 78 <211> 31 <212> DNA <213> FIV PPR downstream primer <400> 78 ccgtggatcc ggcactccat cattcctcct c 31 <210> 79 <211> 32 <212> DNA <213> FIV PPR upstream primer <400> 79 gcgtgaattc ggggaatgga caggggcgag at 32 <210> 80 <211> 28 <212> DNA <213> FIV PPR downstream primer <400> 80 gagccagatc tgctcttttt actttccc 28 <210> 81 <211> 36 <212> DNA <213> IFN primer <400> 81 tcgagaattc gatgaattac acaagtttta ttttcg 36 <210> 82 <211> 33 <212> DNA <213> IFN primer <400> 82 tcgaggatcc ttatttcgat gctctacggc ctc 33

Claims (37)

  1. 바이러스성 게놈의 비필수적 영역 내에 최소한 하나 이상의 발현가능한 외래 핵산이 삽입된 재조합 바이러스에 있어서, 상기 발현가능한 외래 핵산은 고양이의 단백질 또는 그 면역원 부분을 코딩하고, 이때 상기 발현가능한 외래 핵산은 고양이의 CD28 단백질 또는 고양이의 CTLA-4 단백질, 혹은 이들 단백질의 면역원 부분을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  2. 제 1항에 있어서, 바이러스성 게놈의 비필수적 영역 내에 최소한 제 2의 외래 핵산이 삽입되고, 상기 제 2의 외래핵산은 고양이의 CD80 단백질, 고양이의 CD86 단백질, 고양이의 CD28 단백질 및 고양이의 CTLA-4 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 고양이 단백질, 혹은 상기 고양이 단백질의 면역원 부분을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  3. 제 2항에 있어서, 바이러스성 게놈의 비필수적 영역 내에 최소한 제 3의 외래 핵산이 각각 삽입되고, 상기 제 3의 외래핵산은 고양이의 CD80 단백질, 고양이의 CD86 단백질, 고양이의 CD28 단백질 및 고양이의 CTLA-4 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 고양이 단백질, 혹은 상기 고양이 단백질의 면역원 부분을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  4. 제 3항에 있어서, 바이러스성 게놈의 비필수적 영역 내에 최소한 제 4의 외래 핵산이 각각 삽입되고, 상기 제 4의 외래핵산은 고양이의 CD80 단백질, 고양이의 CD86 단백질, 고양이의 CD28 단백질 및 고양이의 CTLA-4 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 고양이 단백질, 혹은 상기 고양이 단백질의 면역원 부분을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 라쿤폭스(racoonpox) 바이러스, 돈두 바이러스(swinepox virus), 또는 고양이의 헤르페스 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  6. 제 1항에 있어서, 한가지 이상의 외래 핵산이 각각 동일한 비필수적 영역내에 삽입된 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  7. 제 1항에 있어서, 한가지 이상의 외래 핵산이 모두 동일한 비필수적 영역내에 삽입되지 않은 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  8. 제 1항에 있어서, 하나의 외래 핵산이 병원체에서 유래된 면역원을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 병원체는 고양이의 병원체, 광견병 바이러스, 클라미디아, Taxopasmosis gondii, Dirofilaria immitis, 벼룩, 또는 박테리아성 병원체인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 고양이의 병원체는 고양이의 면역결핍 바이러스(FIV), 고양이의 백혈병 바이러스(FeLV), 고양이의 감염성 복막염 바이러스(FIP), 고양이의 panleukopenia 바이러스, 고양이의 calicivirus, 고양이의 제3형 레오바이러스(reovirus), 고양이의 로타바이러스(rotavirus), 고양이의 코로나바이러스(coronavirus), 고양이의 싱키셜(syncytial) 바이러스, 고양이의 육종 바이러스 (sarcoma virus), 고양이의 헤르페스 바이러스, 고양이의 보르나병 바이러스(Borna disease virus), 또는 고양이의 기생충인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  11. 제 1항에 있어서, 최소한 하나 이상의 외래 핵산이 해당 외래 핵산을 발현시키는 프로모터로서 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  12. 제 1항에 있어서, 최소한 하나 이상의 외래 핵산의 발현은 해당 바이러스에 대한 내인성 프로모터에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  13. 제 1항에 있어서, 탐지 가능한 마커를 코딩하는 외래 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 탐지 가능한 마커는 대장균 β-갈락토시다제인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  15. 제 10항에 있어서, 고양이의 병원체에서 유래된 상기 면역원은 FIV gag 프로테아제, FIV 피막 단백질, FeLV gag 프로테아제, 또는 FeLV 피막 단백질인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 바이러스는 고양이의 헤르페스 바이러스, 그리고 비필수적 영역은 고양이의 헤르페스 바이러스의 당단백 E 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  17. 제 12항에 있어서 상기 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스는 S-FHV-031(ATCC Accession No. VR-2604)로서 명명된 것을 특징으로 하는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스.
  18. 제 1항에 있어서, 상기 바이러스는 돈두 바이러스(swinepox virus), 그리고 비필수적 영역은 돈두 바이러스(swinepox virus)의 Hind III M 단편 중 큰 것인 Hind III- Bgl II 부분단편인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  19. 제 14항의 상기 고양이의 재조합 돈두 바이러스(swinepox virus)는 S-SPV-246(ATCC Accession No. VR-2603)로서 명명된 것을 특징으로 하는 고양이의 재조합 헤르페스 바이러스.
  20. 제 1항에 있어서, CD28, CD80 또는 CD86 단백질의 해당 부분은 상기 단백질의 수용성 부분인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  21. 제 1항에 있어서, 상기 외래 핵산은 고양이의 CTLA-4 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  22. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 의한 재조합 바이러스가 효과적인 면역가능량으로서 적절한 담체와 같이 함유된 백신.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 재조합 바이러스의 효과적인 면역가능량은 약 1x105 pfu/ml 및 1x108 pfu/ml 사이에 있는 것을 특징으로 하는 백신.
  24. 제 22항에 있어서, 상기 백신은 재조합 바이러스 및 두 번째 면역원의 효과적인 면역가능량이 혼합되어 구성된 것을 특징으로 하는 백신.
  25. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 의한 재조합 바이러스의 효과적인 면역가능량을 고양이에게 투여하여 고양이의 면역반응을 증강시키는 방법.
  26. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 의한 재조합 바이러스의 효과적인 면역가능량을 고양이에게 투여하여 고양이를 면역시키는 방법.
  27. 제 20항 또는 21항에 의한 재조합 바이러스의 효과적인 면역억제량을 고양이에게 투여하여 고양이의 면역반응을 억제시키는 방법.
  28. 제 25항에 있어서, 상기 투여는 정맥내주사, 피하내주사, 근육내주사, 근육간주사(transmuscular), 국소투여, 경구투여, 또는 복강내주사인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 27항에 있어서, 상기 고양이는 기관이나 조직을 이식한 고양이이거나 현재면역반응에 이상이 있는 고양이를 특징으로 하는 방법.
  30. 제 27항에 있어서, 상기 투여는 정맥내주사, 피하내주사, 근육내주사, 근육간주사(transmuscular), 국소투여, 경구투여, 또는 복강내주사인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 1항의 재조합 바이러스를 고양이에게 투여하여 발생한 종양을 감소시키거나 제거하는 방법에 있어서, 상기 핵산은 해당 종양을 감소시키거나 제거시킬 수 있는 유효한 양으로 하여 고양이의 CD80 단백질, 고양이의 CD86 단백질, 또는 이의 혼합물로 구성되는 것을 특징으로 하는 고양이에게 발생한 종양을 감소시키거나 제거하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 발현할 수 있는 고양이 종양 관련 항원을 더 포함하고, 그 투여가 전신적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 고양이에게 발생한 종양을 감소시키거나 제거하는 방법.
  33. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 고양이의 면역결핍 바이러스게놈 또는 이의 한 부분을 코딩하는 핵산으로 구성된 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  34. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 고양이의 백혈병 바이러스게놈 또는 이의 한 부분을 코딩하는 핵산으로 구성된 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  35. 제 33항 또는 34항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 인터루킨 12(Interleukin-12) p35 또는 인터루킨 12(Interleukin-12) p40을 코딩하는 핵산으로 구성된 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스.
  36. 제 33항 또는 34항에 있어서, 면역이 유효한 양의 상기 바이러스 및 적절한 담체를 함유한 백신.
  37. 제 26항에 있어서, 상기 투여는 정맥내주사, 피하내주사, 근육내주사, 근육간주사(transmuscular), 국소투여, 경구투여, 또는 복강내주사인 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020007012144A 1998-05-01 1999-04-30 고양이의 ｃｄ80, 고양이의 ｃｔｌａ-4 또는 고양이의ｃｄ86을 코딩하는 외래 ｄｎａ를 발현시키는 재 조합바이러스 및 이들의 용도 KR100796799B1 (ko)

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