CZ20003934A3 - Rekombinantní virus exprimující cizí DNA kódující kočičí CD80, kočičí CTLA-4 nebo kočičí CD-86 a jeho použití - Google Patents

Rekombinantní virus exprimující cizí DNA kódující kočičí CD80, kočičí CTLA-4 nebo kočičí CD-86 a jeho použití Download PDF

Info

Publication number
CZ20003934A3
CZ20003934A3 CZ20003934A CZ20003934A CZ20003934A3 CZ 20003934 A3 CZ20003934 A3 CZ 20003934A3 CZ 20003934 A CZ20003934 A CZ 20003934A CZ 20003934 A CZ20003934 A CZ 20003934A CZ 20003934 A3 CZ20003934 A3 CZ 20003934A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
feline
virus
gene
recombinant
spv
Prior art date
Application number
CZ20003934A
Other languages
English (en)
Inventor
Barbara J. Winslow
Mark D. Cochran
Original Assignee
Schering-Plough Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering-Plough Ltd. filed Critical Schering-Plough Ltd.
Publication of CZ20003934A3 publication Critical patent/CZ20003934A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se týká rekombinantního viru exprimujícího cizí DNA kódující kočičí CD80, kočičí CTLA-4 nebo kočičí CD86 a jeho použití
Dosavadn1 stav techniky
Předpokládá se, že stimulace T-buněčné aktivace a proliferace v odezvě na chorobu hostitele závisí na dvou interakcích: rozpoznání T-buněčného receptoru (TCR) imunogenními peptidy v rozsahu molekul MHC třídy I a sekundární interakci přídatných ligandů, například CD80 a CD86, s jejich koreceptory CD28 a/nebo CTLA-4 na T-buňce. Úspěšná interakce těchto dvou drah vede k aktivaci a proliferaci jak CD4+, tak CD8+ T-buněk a ke zvýšené produkci cytokinu regulujících imunitu typu Thl a Th2. Za absence odpovídající kostimulace T-buněk se může vyvinout anergický stav, při kterém nedochází k proliferaci T-buněk a sekreci cytokinu. V průběhu let byly jako klíčové regulátory T-buněčných odezev, identifikovány dvě molekuly, tj . primární T-buněčný kostimulační
CD28 a jeho ligandů, CD80 a CD86. CD28 je receptor, který po interakci s CD80 a CD86 zvyšuje T-buněčnou proliferaci a syntézu cytokinu, čímž zabraňuje T-buněčné smrti. CTLA-4 (rovněž označovaný jako CD152) CD-28 homolog hraje rovněž důležitou roli při kostimulaci. Přestože jeho úloha není zcela prostudována, zdá se, že inhibuje T-buněčné • 0
01-3118-00-Če • · · · 0 • · 0 · 0 • · 0 0 0 0 0
·· 0 kostimulační odezvy. Interakce a souhra mezi CD28, CTLA-4 a jejich ligandy CD80 a CD86 při kostimulačních procesech představují klíč k celkové indukci a supresi imunitních odezev na choroby hostitele (Linsley a kol., 1991a; 1993a). V současné době neexistuje žádná účinná vakcína pro prevenci kočičí imunodeficience a kočičí infekční peritonitidy u koček. Vakcíny proti viru kočičí leukemie jsou dostupné, ale jejich účinnost zatím zůstává sporná, a v některých případech mohou vyvolat i samotnou chorobu. Ukázalo se, že experimentální vakcíny proti kočičí infekční peritonitidě neposkytují dostatečnou ochranu nebo způsobují brzkou smrt. V této oblasti je tedy třeba vyvinout činidla a kompozice, které poskytnou ochranu před těmito a dalšími chorobami v případě, že tato vakcína ještě neexistuje, nebo které zvýší účinnost již existujících a běžně používaných vakcín. Dále je v této oblasti třeba vyvinout vakcíny a činidla, která budou indukovat buněčně mediovanou odezvu při absenci choroby, zvyšující koncentraci protilátek. Konečně je třeba překonat problémy týkající se vakcinace koťat, které spočívají v nemožnosti překonat mateřské protilátky. Je tedy třeba vyvinout bezpečná a účinná činidla, která pomohou překonat tyto bariéry.
Podle vynálezu lze manipulací exprese kočičího CD28, kočičího CTLA-4 a jejich ligandů, kočičí CD80 a kočičí CD86 kostimulační molekuly, regulovat T-buněčné odezvy přes zesílení, potlačení nebo přesměrování, a vytvořit tak požadovanou imunitní odezvu směřující k určitému kočičímu patogenu nebo kočičímu chorobnému stavu. Tyto kostimulační molekuly jsou použitelné zejména při vakcinaci proti infekčním chorobám, léčení infekčních chorob a novotvarů degenerativních, deficitních stavů u koček.
léčení imunoautoimunitních
Vynález překonává nedostatky oi-3ii8-oo-če *· :
’··· ··· : ·..· .:.
účinnosti a efektivity z výše popsaných, v současné době dostupných kočičích vakcín.
Podstata vynálezu
Vynález se týká rekombinantního viru, který obsahuje alespoň jednu cizí nukleovou kyselinu zavedenou do neesenciální oblasti virového genomu viru, přičemž každá taková cizí nukleová kyselina kóduje protein. Kódovaný protein se zvolí ze skupin sestávajících z kočičího CD28 proteinu nebo jeho imunogenní části, kočičího CD80 proteinu nebo jeho imunogenní části, kočičího CD86 proteinu nebo jeho imunogenní části nebo kočičího CTLA-4 proteinu nebo jeho imunogenní části. Tato část se může, v případě že se rekombinantní virus zavede do vhodného hostitele, exprimovat.
Vynález se rovněž týká rekombinantního viru, který dále obsahuje cizí nukleovou kyselinu kódující imunogen odvozený z patogenu. Dále se vynález týká rekombinantních virů, které jsou schopny zesilovat imunitní odezvu u kočky. Vynález se konečně týká rekombinantních virů, které jsou schopny imunitní odezvu u kočky potlačit.
Stručný popis obrázků
Obr. 1Ά: DNA a aminokyselinová sekvence kočičího CD80 (B7-1)(TAMU).(SEQ ID NO. 1 a 2);
obr. IB: graf hydrofobicity aminokyselinové sekvence kočičího CD80 (B7-1)(TAMU);
01-3118-00-Če obr. 2A: DNA a aminokyselinová sekvence kočičího CD80
(B7-1)(SYNTRO).(SEQ ID NO. 3 a 4);
obr. 2B: graf hydrofobicity aminokyselinové sekvence kočičího CD80 (B7-1)(SYNTRO);
obr. 3A: DNA a (B7-2) (SEQ ID NO. 5 aminokyselinová sekvence kočičího CD86 a 6) ;
obr. 3B: graf kočičího CD86 (B7-2) hydrofobicity aminokyselinové sekvence z
obr. 4A: DNA a (SEQ ID NO. 7 a 8); aminokyselinová sekvence kočičího CD28
obr. 4B: graf kočičího CD28; hydrofobicity aminokyselinové sekvence
obr. 5A: DNA CTLA-4 (CD152) (SEQ a aminokyselinová sekvence kočičího ID NO. 9 a 10) ;
obr. 5B: graf hydrofobicity aminokyselinové sekvence
kočičího CTLA-4 (CD152).
Vynález se týká rekombinantního viru, který obsahuje alespoň jednu cizí nukleovou kyselinu zavedenou do neesenciální oblasti virového genomu viru, přičemž každá taková cizí nukleová kyselina (a) kóduje protein zvolený ze skupin sestávajících z kočičího CD28 proteinu nebo jeho imunogenní části; kočičího CD80 proteinu nebo jeho imunogenní části; kočičího CD86 proteinu nebo jeho imunogenní části; nebo kočičího CTLA-4 proteinu nebo jeho imunogenní části a (b) může se, v případě že se
01-3118-00-Če 5 • ♦ • · • · • · • · • · • · ·* ·«·· • · · · · • · · · · ··· · · » » • · · · • · · · « • · · • · · · • · · • ♦ » · • · · • · · · ·
rekombinantní virus zavede do vhodného hostitele,
exprimovat.
U jednoho z provedení vynálezu rekombinantní virus obsahuje alespoň dvě cizí nukleové kyseliny, přičemž každá z těchto kyselin je zavedena do neesenciální oblasti virového genomu.
U dalšího provedení vynálezu rekombinantní virus obsahuje alespoň tři cizí nukleové kyseliny, přičemž každá z těchto kyselin je zavedena do neesenciální oblasti virového genomu.
U dalšího provedení vynálezu rekombinantní virus obsahuje alespoň čtyři cizí nukleové kyseliny, přičemž každá z těchto kyselin je zavedena do neesenciální oblasti virového genomu.
U ještě dalšího provedení vynálezu rekombinantní virus zahrnuje neomezujícím způsobem virus neštovic mývalů, virus neštovic prasat nebo kočičí herpesvirus.
U dalšího provedení podle vynálezu rekombinantní virus obsahuje více než jednu cizí nukleovou kyselinu, přičemž všechny cizí nukleové kyseliny jsou zavedeny do stejné neesenciální oblasti. U jiného provedení obsahuje libovolný rekombinantní virus více než jednu cizí nukleovou kyselinu, přičemž ne všechny tyto cizí nukleové kyseliny jsou zavedeny do stejné neesenciální oblasti.
U samostatného provedení obsahuje libovolný rekombinantní virus cizí nukleovou kyselinu, která kóduje imunogen odvozený z patogenu. U dalšího provedení vynálezu kóduje rekombinantní virus kočičí patogen, patogen viru vztekliny, patogen Chlamydia, patogen Toxoplasmosis gondii,
01-3118-00-Če • · · fc patogen Dirofilaria immitis, bleší patogen nebo bakteriální patogen. U dalšího provedení vynálezu rekombinantní virus kóduje virus kočičí imunodeficience (FIV), virus kočičí leukemie (FeLV), virus kočičí infekční peritonitidy (FIP) , virus kočičí panleukopenie, ‘ kočičí kalikivirus, kočičí reovirus typu 3, kočičí rotavirus, kočičí koronavirus, kočičí syncytiální virus, kočičí sarkomavirus, kočičí herpesvirus, kočičí virus Bornovy choroby nebo kočičí parazity.
U dalšího provedení podle vynálezu rekombinantní virus obsahuje alespoň jednu cizí nukleovou kyselinu, která obsahuje promotor pro expresi cizí nukleové kyseliny. U jiného provedení rekombinantní virus exprimuje alespoň jednu cizí nukleovou kyselinu za řízení promotoru endogenního k viru.
U dalšího provedení vynálezu rekombinantní virus dále obsahuje cizí nukleovou kyselinu, kódující detekovatelný markér. U dalšího provedení podle vynálezu je detekovatelným markérem E. coli beta galaktosidáza.
Vynález dále poskytuje rekombinantní virus kódující imunogeny z FIV gag proteázy, FIV obalového proteinu, FeLV gag proteázy nebo FeLV obalového proteinu.
Vynález poskytuje rekombinantní virus, který dále obsahuje nukleovou kyselinu kódující genom viru kočičí imunodeficience nebo jeho část. Vynález poskytuje rovněž rekombinantní virus, který dále obsahuje nukleovou kyselinu kódující genom viru kočičí leukemie nebo jeho část. Vynález rovněž poskytuje rekombinantní virus, který dále obsahuje nukleovou kyselinu kódující kočičí IL12, GM-CSF, p35 nebo p40. Vynález dále poskytuje vakcínu, která obsahuje účinné
01-3118-00-Če * · · · . . . , .
·· ·· ·· · .. ...
imunizační množství takového rekombinantního viru a vhodný nosič.
Vynález poskytuje rekombinantní kočičí herpesvirus obsahující neesenciální oblast, kterou je glykoprotein G genu kočičího herpesviru. Vynález poskytuje rekombinantní kočičí herpesvirus podle nároku 12 označený jako S-FHV-031 (ATCC Accession No. VR-2604). Tento virus byl uložen 1. května 1998 American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20108-0971, U.S.A., podle Budapešťské smlouvy o mezinárodním uznávání uložení mikroorganismů pro účely patentového řízení.
Vynález poskytuje rekombinantní virus neštovic prasat s neesenciální oblastí ve větším Hind III až Bgl II subfragmentu Hind III M fragmentu viru neštovic prasat. Vynález poskytuje rekombinantní kočičí virus neštovic prasat podle nároku 14 označený jako S-SPV-246 (ATCC Accession No. VR-2603). Tento virus byl uložen 1. května 1998 American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20108, U.S.A., podle Budapešťské smlouvy o mezinárodním uznávání uložení mikroorganismů pro účely patentového řízení.
U jednoho provedení rekombinantního viru podle vynálezu je část CD28, CD80 nebo CD86 proteinů rozpustnou částí proteinů. U dalšího provedení vynálezu rekombinantní virus obsahuje cizí nukleovou kyselinu, která kóduje kočičí CTLA-4 protein.
Vynález se rovněž týká vakcíny, která obsahuje účinné imunizační množství rekombinantního viru a vhodný nosič. U jednoho provedení podle vynálezu vakcína obsahuje účinné imunizační množství rekombinantního viru přibližně
01-3118-00-Če • · · · ·« ··· · lxlO5 pfu/ml a přibližně lxlO8 cfu/ml. Podle dalšího provedení vynález poskytuje vakcínu, která dále obsahuje směs rekombinantního viru a účinné imunizační množství druhého imunogenu.
Vynález poskytuje způsob zesílení imunitní odezvy u kočky, který zahrnuje podání účinného imunizačního množství libovolného výše definovaného rekombinantního víru kočce. Vynález dále poskytuje způsob imunizace kočky podáním účinného imunizačního množství libovolného výše definovaného rekombinantního viru kočce.
Vynález poskytuje způsob potlačení imunitní odezvy u kočky podáním účinného potlačujícího množství rekombinantního viru obsahujícího rozpustný CD28, CD80 nebo CD86 kočce. Vynález poskytuje způsob potlačení imunitní odezvy u kočky podáním účinného potlačujícího množství rekombinantního viru obsahujícího kočičí CTLA-4 protein.
Vynález poskytuje podání výše popsaného rekombinantního viru intravenózní, subkutánní, intramuskulární, transmuskulární, topickou, orální nebo intraperitoneální cestou.
U jednoho provedení vynález poskytuje způsob potlačení imunitní odezvy u kočky, která má přijmout transplantovaný orgán nebo tkáň, u které se projeví imunitní odezva. U dalšího provedení vynález poskytuje způsob potlačení imunitní odezvy u kočky, který zahrnuje podání protismyslné nukleové kyseliny, která je schopna hybridizace na: (a) kočičí CD28 mRNA transkript, (b) kočičí CD80 transkript nebo (c) kočičí CD86 mRNA transkript a inhibice translace těchto transkriptů, přičemž protismyslná nukleová kyselina
01-3118-00-Če • · · je přítomna v množství účinném pro inhibici translace a následné potlačení imunitní odezvy u kočky.
Podle jednoho provedení vynález poskytuje způsob redukce nebo odstranění nádoru u kočky, přičemž tento způsob zahrnuje zavedení rekombinantního viru obsahujícího nukleovou kyselinu, která kóduje kočičí CD80 protein, kočičí CD86 protein nebo jejich kombinaci do nádoru kočky v množství účinném pro redukci nebo odstranění nádoru.
U jednoho provedení vynález poskytuje způsob redukce nebo odstranění nádoru u kočky, přičemž tento způsob zahrnuje systemicky účinné podání rekombinantního viru, který dále obsahuje, a je schopen exprimovat, antigen související s kočičím nádorem.
Vynález poskytuje izolovanou a purifikovanou DNA kódující kočičí CD80 (B7-1) ligand nebo kočičí CD86 (B7-2) ligand nebo kočičí CD28 receptor nebo kočičí CTLA-4 (CD152) receptor, a rovněž klonující a expresní vektory obsahující CD80 nebo CD86 nebo CD28 nebo CTLA-4 nebo RNA, a to její část nebo celou, a buňky transformované vektory kódujícími CD80 nebo vektory kódujícími CD86 nebo vektory kódujícími CD28 nebo vektory kódujícími CTLA-4. Kočičí druhy, ze kterých se zvolí CD80 nebo CD86 nebo CD28 nebo CTLA-4, spadají do skupiny, která zahrnuje neomezujícím způsobem domácí kočky, lvy, pumy, rysy a gepardy.
Vynález poskytuje izolovanou a purifikovanou kočičí CD80 (B7-1) cDNA obsahující přibližně 941 nukleotidů. Vynález rovněž poskytuje izolovaný a purifikovaný kočičí CD80 polypeptid, který obsahuje přibližně 292 aminokyselin, jejichž nativní membránou vázaná nebo zralá forma má molekulovou hmotnost přibližně 33 485 kDa, isoelektrícký
01-3118-00-Če • 0*0 ♦ 0 0 * 000 bod přibližně 9,1 a celkový náboj při pH 7,0 10. Koexprese CD80 s kostimulační molekulou CD28 a nádorovým antigenem nebo antigenem z patogenního organismu má schopnost aktivovat nebo zesilovat aktivaci T-lymfocytů včetně produkce cytokinu stimulujícího imunitu a rovněž má schopnost regulovat růst dalších buněčných typů. Koexprese CD80 s kostimulační molekulou CTLA-4 má schopnost regulovat aktivaci T-lymfocytů.
Vynález poskytuje izolovanou a purifikovanou kočičí CD86 (B7-2) cDNA obsahující přibližně 1176 nukleotidů. Vynález rovněž poskytuje izolovaný a purifikovaný kočičí CD86 polypeptid, který obsahuje přibližně 320 aminokyselin, jejichž nativní membránou vázaná nebo zralá forma má molekulovou hmotnost přibližně 36 394 kDa, isoelektrický bod přibližně 9,19 a celkový náboj při pH 7,0 11,27. Koexprese CD86 s kostimulační molekulou CD28 a nádorovým antigenem nebo antigenem z patogenního organismu má schopnost aktivovat nebo zesilovat aktivaci T-lymfocytů, včetně produkce cytokinů stimulujících imunitu a rovněž má schopnost regulovat růst dalších buněčných typů. Koexprese CD86 s kostimulační molekulou CTLA-4 má schopnost regulovat aktivaci T-lymfocytů.
Kočičí CD80 nebo CD86 podle vynálezu se získají z přírodních nebo rekombinantních zdrojů. Kočičí CD80 nebo CD86 podle vynálezu obsahuje nativní a membránou vázanou formu nebo sekretovanou formu postrádající transmembránovou doménu.
Vynález poskytuje izolovanou a purifikovanou kočičí CD28 cDNA, která obsahuje přibližně 689 nukleotidů. Vynález rovněž poskytuje izolovaný a purifikovaný kočičí CD28 polypeptid, který obsahuje přibližně 221 aminokyselin,
01-3118-00-Če
přičemž jejich nativní membránou vázaná nebo zralá forma má molekulovou hmotnost přibližně 25 319 kDa, isoelektrický bod přibližně 9,17 a celkový náboj při pH 7,0 9,58.
Vynález poskytuje izolovanou a purifikovanou kočičí CTLA-4 cDNA, která obsahuje přibližně 749 nukleotidů. Vynález rovněž poskytuje izolovaný a purifikovaný kočičí CTLA-4 polypeptid, který obsahuje přibližně 223 aminokyselin, přičemž jejich nativní membránou vázaná nebo zralá forma má molekulovou hmotnost přibližně 24 381 kDa, isoelektrický bod přibližně 6,34 a celkový náboj při pH 7,0 -0,99.
Vynález poskytuje rekombinantní virus neštovic prasat exprimující cizí DNA, přičemž tato cizí DNA kóduje kočičí CD80, kočičí CD86, kočičí CD28 a kočičí CTLA-4 cDNA a polypeptidy.
Vynález poskytuje rekombinantní virus neštovic mývalů exprimující cizí DNA, přičemž tato cizí DNA kóduje kočičí CD80, kočičí CD86, kočičí CD28 a kočičí CTLA-4 cDNA a polypeptidy.
Vynález poskytuje rekombinantní kočičí herpesvirus exprimující cizí DNA, přičemž tato cizí DNA kóduje kočičí CD80, kočičí CD86, kočičí CD28 a kočičí CTLA-4 cDNA a polypeptidy.
Podle dalšího aspektu poskytuje vynález způsob zesílení imunitní odezvy koček na imunogeny, přičemž tohoto zesílení se dosáhne podáním imunogenu před, po nebo v podstatě současně s podáním kočičího CD80 nebo kočičího CD86, případně společně s kočičím CD28 nebo kočičím CTLA-4, ve vektoru rekombinantního viru neštovic prasat, ve vektoru rekombinantního viru neštovic mývalů nebo ve vektoru
01-3118-00-Če
9
9999 rekombinantního kočičího herpesviru, v množství účinném pro zesílení imunitní odezvy.
Podle dalšího aspektu poskytuje vynález způsob potlačení imunitní odezvy koček na imunogen, přičemž tohoto potlačení se dosáhne podáním imunogenu před, po nebo v podstatě současně s podáním kočičího CD80 nebo kočičího CD86, případně společně s kočičím CD28 nebo kočičím CTLA-4 nebo společně s protismyslnou RNA nebo DNA (celou nebo pouze její částí) kódující kočičí CD80 nebo kočičí CD86 nebo kočičí CD28 nebo kočičí CTLA-4, ve vektoru rekombinantního viru neštovic prasat, ve vektoru rekombinantního viru neštovic mývalů nebo ve vektoru rekombinantního kočičího herpesviru, v množství účinném pro potlačení imunitní odezvy.
Podle dalšího aspektu poskytuje vynález vakcínu pro vyvolání imunitní odezvy na imunogen u koček, přičemž tato vakcína zahrnuje imunogen a účinné množství kočičího CD80 ve vektoru rekombinantního viru neštovic prasat, ve vektoru rekombinantního víru neštovic mývalů nebo ve vektoru rekombinantního kočičího herpesviru, pro zesílení imunitní odezvy. Imunogen se například odvodí z kočičích patogenů, jakými jsou například virus kočičí imunodeficience, virus kočičí leukemie, kočičí parvovirus, kočičí koronavirus, kočičí leptovirus a další.
Podle dalšího aspektu poskytuje vynález vakcínu pro vyvolání imunitní odezvy na imunogen u koček, přičemž tato vakcína zahrnuje vektor rekombinantního viru neštovic prasat, vektor rekombinantního viru neštovic mývalů nebo vektor rekombinantního kočičího herpesviru, které exprimují DNA nebo RNA imunogenu a DNA nebo RNA kočičích CD80, CD86, CD28 přídatných molekul v libovolné kombinaci, které kódují
01-3118-00-Če • · ·· ·* ·· · ♦ · · · · · ♦ · · · < · <
• ···«·· ·« • · · · · · • · · · · · « proteiny nebo fragmenty proteinů v množství účinném pro modulaci imunitní odezvy.
Kočičí CD80 protein má aminokyselinovou sekvenci, která je z 59 % a ze 46 % identická s lidskými, resp. myšími proteiny. Kočičí CD86 protein má aminokyselinovou sekvenci, která je ze 68 % a ze 64 % identická s lidskými, resp. králičími proteiny. Kočičí CD28 protein má aminokyselinovou sekvenci, která je z 82 % a ze 74 % identická s lidskými, resp. myšími proteiny. Kočičí CTLA-4 protein má aminokyselinovou sekvenci, která je z 88 % a ze 78 % identická s lidskými, resp. myšími proteiny. Lidský nebo myší CD80 nebo CD86 protein nemůže funkčně nahradit kočičí CD80, resp. CD86 protein. Kočičí CD80, kočičí CD86, kočičí CD28 a kočičí CTLA-4 jsou tedy nová reakční činidla, která jsou potřebná pro regulaci imunity u koček.
Do rozsahu vynálezu spadají T-buňky regulující přídatné molekuly CD80 (B7-1) nebo CD86 (B7-2) nebo CD28 nebo CTLA-4 (CD152) odvozené z kočičích druhů. Vynález poskytuje izolované a purifikované nukleové kyseliny kódující, a to částečně nebo zcela, kočičí CD80 nebo kočičí CD86 nebo kočičí CD28 nebo kočičí CTLA-4 a stejně tak CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 polypeptidy purifikované buď z nativních nebo rekombinantních zdrojů. Kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4, připravené způsobem podle vynálezu, se použijí pro zvýšení účinnosti kočičích vakcín proti nádorům a patogennímu organismu a jako léčivo pro léčení virových a bakteriálních onemocnění u koček. Kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4, připravené způsobem podle vynálezu, se rovněž použijí ke zmírnění onemocnění prostřednictvím hyperaktivní nebo přesměrované imunitní odezvy.
01-3118-00-Če
4# »*·»
44 • 4 4 · • *4 · • · 4 4 41 · • · 4 ♦ · 99
Nukleové kyseliny, vektory, transformanty
Sekvence cDNA kódující kočičí CD80 (SEQ ID NO: 1, 3), kočičí CD86 (SEQ ID NO: 5), kočičí CD28 (SEQ ID NO: 7) nebo kočičí CTLA-4 (SEQ ID NO: 9) jsou znázorněny na obrázcích 1 až 5 a předpokládané aminokyselinové sekvence kočičího CD80 (SEQ ID NO: 2, 4), kočičího CD86 (SEQ ID NO: 6), kočičího
CD28 (SEQ ID NO: 8) nebo kočičího CTLA-4 (SEQ ID NO: 10) jsou rovněž znázorněny na obrázcích 1 až 5. Označení těchto kočičích polypeptidů jako CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 vychází z částečné homologie aminokyselinové sekvence s lidským nebo myším nebo králičím homologem těchto polypeptidů a ze schopnosti polypeptidů CD80 nebo CD86 vázat se na kočičí CD28 receptor (viz níže) nebo na CTLA-4 a ze schopnosti aktivovat nebo stimulovat, nebo jiným způsobem regulovat, aktivaci T-lymfocytů. Dále, aniž bychom se chtěli vázat na některou konkrétní teorii, se dá předpokládat, že kočičí CD80 nebo kočičí CD86 polypeptidy rovněž vykazují alespoň jednu z následujících biologických aktivit: aktivaci NK (přirozený killer) buněk, stimulaci zrání B-buněk, aktivaci MHC omezených cytotoxických T-lymfocytů, bujení žírných buněk, interakci s receptory cytokinů a indukci cytokinů regulujících imunitu.
Vzhledem k degeneraci genetického kódu (tj. více kodonů kóduje určité aminokyseliny) mohou aminokyselinové sekvence kočičího CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 znázorněné na obrázcích 1 až 5 kódovat i jiné DNA sekvence, než které jsou znázorněny na obrázcích 1 až 5. Tyto další DNA sekvence zahrnují sekvence obsahující „sekvenčně-konzervativní varianty, u kterých změna jednoho nebo více nukleotidů v daném kodonu nemá za následek změnu aminokyseliny kódované v této pozici. Kromě toho lze daný
01-3118-00-Če aminokyselinový zbytek v polypeptidu často nahradit bez toho, že by došlo ke změně celkové konformace a funkce přirozeného polypeptidu. Takové „funkčně-konzervativní varianty zahrnují neomezujícím způsobem nahrazení aminokyseliny aminokyselinou, která má podobné fyzikálně jsou například hydrofilicita, kyselost, aromatická chemické vlastnosti, jakými zásaditost, hydrofobicita, struktura apod. (například nahrazení lysinu argininem, aspartátu glutamátem nebo glycinu alaninem). Dále lze přidat nebo vynechat aminokyselinové sekvence bez toho, že by došlo ke znehodnocení biologické aktivity molekuly. Na amino- nebo karboxy-konec lze například přidat další aminokyselinové sekvence, které slouží jako purifikační tag, například histidinový tag (tj. umožní jednostupňovou purifikaci proteinu, po které se chemicky nebo enzymaticky odstraní). Alternativně přidané sekvence poskytují pomocné místo pro navázání na buněčný povrch nebo jiným způsobem mění cílovou buněčnou specifikaci kočičího CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4, a rovněž mohou poskytovat místo pro navázání protilátek.
Do rozsahu vynálezu spadají kočičí CD80 nebo kočičí CD86 nebo kočičí CD28 nebo kočičí CTLA-4 cDNA sekvence, které jsou znázorněny na obrázcích 1 až 5, sekvenčně konzervativní varianty DNA, DNA sekvence kódující funkčně-konzervativní varianty polypeptidů a jejich kombinace. Do rozsahu vynálezu spadají fragmenty kočičího CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4, které vykazují použitelný stupeň biologické aktivity buď samostatně nebo v kombinaci s dalšími sekvencemi nebo složkami. Jak bude vysvětleno níže, metody manipulace se sekvencí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 a určení toho, zda-li daná kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 varianta vykazuje příslušnou stabilitu a biologickou
01-3118-00-Če *· *· ·· ···· • · · > · · 9 ® · · · · · · • · to·· · · · « • · · · · ·« ·· ·· • to 999 aktivitu pro dané aplikace, nebo zda varianty, které ovlivňují vazebnou aktivitu těchto molekul, vedou ke zvýšení účinnosti, jsou v daném oboru známy. Jak kočičí CD80, tak kočičí CD86 se budou vázat na koreceptor CD28 nebo na koreceptor CTLA-4. Toho lze dosáhnout exprimací a purifikací varianty CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 polypeptidu v rekombinantním systému a provedením testů, které mají stanovit jeho aktivitu ve smyslu stimulace T-buněk a/nebo mají stanovit aktivitu podporující růst v buněčné kultuře a ve zvířatech po provedení zkušebních aplikací. U varianty CD80 se biologická aktivita testuje funkčním navázáním na receptory CD28 nebo CTLA-4. U varianty CD86 se biologická aktivita testuje funkčním navázáním na receptory CD28 nebo CTLA-4. Podobným způsobem se biologická aktivita testuje u varianty CD28 nebo varianty CTLA-4.
Do rozsahu vynálezu rovněž spadají kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 DNA (a polypeptidy) odvozené z dalších kočičích druhů, které zahrnují například domácí kočky, lvy, tygry, gepardy, rysy apod. Sekvence kočičího CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 homologu, které jsou znázorněné na obr. 1 až 5, jsou snadno identifikovatelné screenováním cDNA nebo genomových knihoven pro identifikaci klonů, které se hybridizují na sondy obsahující celou sekvenci znázorněnou na obrázku 1 až 5 nebo její část. Alternativně se expresní knihovny screenují za použití protilátek, které rozpoznají kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4. Aniž bychom se chtěli vázat na některou konkrétní teorii, dá se předpokládat, že geny CD80 nebo CD86 z dalších kočičích druhů budou sdílet přibližně alespoň 70 % homologie s kočičími CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 geny. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají DNA, které kódují homolog CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 a
01-3118-00-Če které jsou definovány jako DNA kódující polypeptidy, které sdílejí přibližně alespoň 25% aminokyselinovou identitu s kočičím CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4.
Při manipulaci s nukleovými kyselinami podle vynálezu se zpravidla používají metody, které jsou v daném oboru známé a které jsou například popsány v Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2. vydání, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor) nebo v Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Aufubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith and Stuhl, Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY, NY, 1992).
Vynález rovněž zahrnuje cDNA a RNA sekvence, a to jak smyslné, tak protismyslné. Vynález dále zahrnuje genomové kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 DNA sekvence a lemující sekvence zahrnující neomezujícím způsobem regulační sekvence. Sekvence nukleové kyseliny kódující kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 polypeptid(y) jsou rovněž spojovány s heterologickými sekvencemi zahrnujícími promotory, zesilovače, odezvové prvky, signální sekvence, polyadenylační sekvence, introny, 5'- a 3'- nekódující oblasti apod. Transkripční regulační prvky, které jsou operativně připojeny ke kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 sekvenci (sekvencím), zahrnují neomezujícím způsobem ty prvky, které mají schopnost řídit expresi genů odvozených z prokaryotických buněk, eukaryotických buněk, virů prokaryotických buněk, virů eukaryotických buněk a jejich libovolné kombinace. Další použitelné heterologické regulační sekvence jsou odborníkům v daném oboru známy.
Nukleové kyseliny podle vynálezu jsou modifikované oborníkům v daném oboru známými metodami s cílem modifikovat jejich stabilitu, rozpustnost, vazebnou afinitu
01-3118-00-Če • · • ·
a specifičnost. Sekvence jsou například selektivně methylovány. Nukleokyselinové sekvence podle vynálezu jsou rovněž modifikovány pomocí značení, které je schopno poskytnout buď přímo nebo nepřímo detekovatelný signál. Příklady značení zahrnují radioisotopy, fluorescenční molekuly, biotin apod.
Vynález rovněž poskytuje vektory, které zahrnují nukleové kyseliny kódující CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 polypeptid(y), a to částečně nebo zcela. Tyto vektory například zahrnují plasmidové vektory pro expresi v celé řadě eukaryotických a prokaryotických hostitelů. Vektory rovněž výhodně zahrnují promotor operativně navázaný na část kódující kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 polypeptid. Kódovaný kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 polypeptid(y) se exprimuje za použití libovolného vhodného vektoru a hostitelské buňky zde popsaným způsobem nebo jakýmkoliv jiným, v daném oboru známým, způsobem.
Vynález rovněž poskytuje vektory, které obsahují nukleové kyseliny kódující kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 polypeptid(y), a to částečně nebo zcela. Tyto vektory například zahrnují živé virové vektory pro expresi v různých eukaryotických hostitelích nebo pro expresi DNA nebo RNA vakcín. U jednoho provedení je živý virový vektor zmírněn. U dalšího provedení je živý virový vektor zmírněn genovou delecí. U ještě dalšího provedení je virový vektor inaktivován chemickým ošetřením nebo působením tepla. Živý virový vektor se zvolí ze skupiny zahrnující neomezujícím způsobem herpesvirus, virus neštovic, adenovirus, adenosouvisející virus, retro-virus, bakulovirus, alfavirus, rhabdovirus a picornavirus. Živý virový vektor se zvolí ze skupiny zahrnující neomezujícím způsobem kočičí herpesvirus, psí herpesvirus, ptačí herpesvirus, kravský • · · · • ·
01-3118-00-Če • · ····· · · • 9 · · · · • · · · ♦ · · herpesvirus, koňský herpesvirus, virus pseudovztekliny, virus neštovic prasat (swinepox), virus neštovic ptáků (avipox), virus neštovic drůbeže (fowlpox), virus neštovic mývalů (raccoonpox) , virus neštovic okrasného ptactva (canarypox), virus kravských neštovic (vaccinia), virus myší leukemie Malony, virus Sindbis a virus Semliki Forest.
Živý virový vektor je rekombinantní virový vektor exprimující cizí DNA, kterou je kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 cDNA. a to celá nebo její část. Cizí DNA je rovněž cDNA pro antigen z patogenního organismu. Rekombinantní virový vektor je konstruován konstrukčními metodami, které vedou k získání homologického rekombinantu nebo kosmidu a které jsou v daném oboru známy. Výhodně vektory rovněž zahrnují promotor operativně navázaný na část kódující kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 polypeptid. Promotor se zvolí ze skupiny zahrnující neomezujícím způsobem gE promotor kočičího herpesviru, syntetický pozdní/raný promotor poxviru, raný promotor lidského cytomegaloviru a gX promotor viru pseudovztekliny. Podpora genové exprese rovněž zahrnuje expresi CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 cDNA ze vstupního místa vnitřního ribosomu (IRES), který je součástí kazety (pCITE vector, Novagen, Madison, WI) . Buněčné linie pro rostoucí virové vektory zahrnují neomezujícím způsobem kočičí ledvinové buňky Crandell (CRFK), fibroblasty kuřecího embrya, ledvinové buňky prasečího embrya (ESK-4), prasečí ledvinové buňky (PK). Kódovaný kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 polypeptid(y) se exprimuje za použití libovolného vhodného vektoru a hostitelské buňky způsobem, který je zde vysvětlen nebo jiným, v daném oboru známým, způsobem.
U výhodného provedení se geny kódující kočičí CD80 a CD28, CD80 a CTLA-4, CD86 a CD28, nebo CD86 a CTLA-4
01-3118-00-Če zabudují, společně s geny pro imunogen odvozený z kočičího patogenu, do jediného rekombinantního virového vektoru a následně se formulují do živé vakcíny. Kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 geny samotné nebo v kombinaci s kočičími geny odvozenými z kočičích patogenu se zabudují do rekombinantního viru tak, že expresi těchto genů reguluje vhodný promotor. U dalšího provedení se geny kódující kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 samotné nebo v kombinaci zabudují do rekombinantního virového vektoru a současně se podávají ve vakcíně s druhým rekombinantním virovým vektorem, který kóduje geny pro imunogen(y) odvozený z kočičích patogenu. Tato dvě provedení poskytují požadovanou imunitní odezvu ve stejné buňce nebo v buňkách, které se nacházejí v těsné blízkosti, pro zvýšení potlačení nebo přesměrování požadované imunitní odezvy.
Imunogen se zvolí ze skupiny zahrnující neomezujícím způsobem kočičí patogeny, například virus kočičí imunodeficience, virus kočičí leukemie, infekční peritonitidy, virus kočičí virus kočičí panleukopenie (parvovirus), kočičí kalikivirus, kočičí reovirus typu 3, kočičí rotavirus, kočičí koronavírus (Infectious peritonitis virus), virus vztekliny, kočičí syncytiální virus, kočičí sarkomavirus, kočičí herpesvirus (rhinotracheitis virus), kočičí virus Bornovy choroby, Chlamydia, Toxoplasmosis gondii, kočičí parazity, Dirofilaria immitis, blechy, bakteriální patogeny apod.
Vektory nebo živé virové vektory budou často zahrnovat jeden nebo více replikačních systémů pro klonování nebo expresi jednoho nebo více markérů pro selekci v hostiteli, jakými jsou například antibiotická rezistence nebo kalorimetrické markéry, například β-galaktosidáza (lacZ)
01-3118-00-Če • · ·· ···· ·· · ··· ·· · · · · · • · φ · · · ··· ······ · · · · · · • · · · · φφφ •« · · · · · ··· antibiotická rezistence nebo kalorimetrické markéry, například β-galaktosidáza (lacZ) nebo β-glukuronidáza (uidA), nebo fluorescenční markéry, například zelený fluorescenční protein, a jednu nebo více expresních kazet. Vložené kódující sekvence jsou syntetizované, izolované z přírodních zdrojů, připravené jako hybridy apod. Ligace kódujících sekvencí na transkripční regulační sekvence se dosáhne odborníkům v daném oboru známými metodami. Vhodné hostitelské buňky se transformují/transfektuji/ infektují libovolnou vhodnou metodou zahrnující elektroporaci, CaCl2~ nebo liposomem-mediované DNA absorpci, fungální infekci, mikroskopickou injektáž apod.
Vhodnými vektory pro použití v praxi jsou například YEp352, pcDNAI (Invitrogen, Carlsbad, CA), pRc/CMV (Invitrogen) a pSFVl (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) . Výhodným vektorem pro použití v rámci vynálezu je pSFVl. Mezi vhodné hostitelské buňky lze například zařadit E. coli, kvasinky, COS buňky, PC12 buňky, CHO buňky, GH4C1 buňky, BHK-21 buňky a melanofory obojživelníků. Pro realizaci vynálezu jsou výhodnou hostitelskou buněčnou linií BHK21 buňky. Vhodné vektory pro konstrukci holé DNA nebo genetických vakcinací zahrnují neomezujícím způsobem pTarget (Promega, Madison, WI), pSI (Promega, Madison, WI) a pcDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Nukleové kyseliny kódující kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 polypeptid(y) se rovněž zavádí do buněk rekombinantním způsobem. Tato sekvence se například mikroskopicky injektuje do buňky, přičemž způsobí homologickou rekombinací v místě endogenního genu kódujícího polypeptid, jeho analogu nebo jeho pseudogenu, nebo sekvence, která je v podstatě identická se sekvencí genu kódujícího kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 • 9 9 9 9 9 ·· • 999999 · · · 9 9 ·· 9 9 · · ··
9· 99 99 9 99
01-3118-00-Če polypeptid. Rovněž lze použít další metody na bází rekombinace, například nehomologické rekombinace, a delece endogenního genu prováděná homologickou rekombinací, zejména v pluripotentních buňkách.
Vynález poskytuje způsob zesílení imunitní odezvy u koček na imunogen, kterého se dosáhne podáním imunogenu před, po nebo v podstatě současně s kočičím CD80 nebo kočičím CD86, případně s kočičím CD28 nebo s kočičím CTLA-4 v množství účinném pro zesílení imunitní odezvy.
Vynález poskytuje způsob zesílení imunitní odezvy u koček na imunogen, kterého se dosáhne podáním expresního vektoru, který obsahuje imunogen odvozený z kočičího patogenů a kočičí CD80 nebo kočičí CD86 přídatné molekuly, případně s kočičím CD28 nebo kočičím CTLA-4 v množství účinném pro zesílení imunitní odezvy.
Vynález poskytuje způsob přesměrování imunitní odezvy u koček na imunogen, kterého se dosáhne podáním expresního vektoru, který obsahuje imunogen odvozený z kočičího patogenů a kočičí CD80 nebo kočičí CD86 přídatné molekuly, případně s kočičím CD28 nebo kočičím CTLA-4 v množství účinném pro přesměrování imunitní odezvy.
Vynález poskytuje způsob potlačení imunitní odezvy u koček na imunogen, kterého se dosáhne podáním imunogenu před, po nebo v podstatě současně s kočičím CD80 nebo kočičím CD86, případně s kočičím CD28 nebo kočičím CTLA-4 nebo případně s protismyslnou RNA nebo DNA kódující kočičí CD80 nebo kočičí CD86 nebo kočičí CD28 nebo kočičí CTLA-4 v množství účinném pro potlačení imunitní odezvy.
01-3118-00-Če • · ·· ·· ···· ·· • · · · ·· · · · ···· · · · ·· • ·····* ·· · · · • · · · · · · · • · ·· fc· · fcfc
Vynález poskytuje vakcínu pro vyvolání imunitní odezvy u kočky na imunogen(y), která obsahuje imunogen a účinné množství kočičího CD80 nebo kočičího CD86, případně s kočičím CD28 nebo kočičím CTLA-4, pro zesílení imunitní odezvy, nebo účinné množství kočičího CD80 nebo kočičího CD86, případně s kočičím CD28 nebo kočičím CTLA-4, pro potlačení imunitní odezvy. U dalšího provedení vynález poskytuje vakcínu, která obsahuje expresní vektor obsahující geny pro imunogen(y) proti kočičím patogenům a geny pro CD80, CD86, případně s kočičím CD28 nebo kočičím CTLA-4, pro zesílení nebo potlačení imunitní odezvy.
Kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 polypeptidy
Kočičí CD80 gen (jehož DNA a aminokyselinová sekvence jsou znázorněny na obrázku 1 a 2) kóduje polypeptid, který je tvořen přibližně 292 aminokyselinami. Kočičí CD86 gen (jehož DNA a aminokyselinová sekvence jsou znázorněny na obrázku 3) kóduje polypeptid, který je tvořen přibližně 320 aminokyselinami. Kočičí CD28 gen (jehož DNA a amino-kyselinová sekvence jsou znázorněny na obrázku 4) kóduje polypeptid, který je tvořen přibližně 221 aminokyselinami. Kočičí CTLA-4 gen (jehož DNA a aminokyselinová sekvence jsou znázorněny na obrázku 5) kóduje polypeptid, který je tvořen přibližně 223 aminokyselinami.
Purifikace kočičího CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 z přirozeného nebo rekombinantního zdroje se provádí v daném oboru známými metodami, které zahrnují neomezujícím způsobem iontoměničovou chromatografii, chromatografii s reverzní fází na C4 kolonách, gelovou filtraci, isoelektrickou fokulaci, afinitní chromatografii apod. U výhodného provedení se biologicky účinné • · · ·
01-3118-00-Če • · · · · * • · · · · · • 4 · 4 · · • · ····· · * • 4 4 · · · • · · · · · · kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 získají ve větších množstvích konstrukcí rekombinantní DNA sekvence obsahující kódující oblast pro kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 navázanou na sekvenci kódující 6 C-koncových histidinových zbytků v pSFVl replikonu (GIBCO/BRL). Tímto plasmidem kódovaná mRNA se syntetizuje pomocí technik, které jsou odborníkům v daném oboru známy, a elektroporací zavede do BHK-21 buněk. Tyto buňky syntetizují a vylučují zralé glykosylované kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 polypeptidy obsahující 6 C-koncových histidinů. Modifikované kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 polypeptidy se purifikují z buněčného supernatantu pomocí afinitní chromatografie za použití pryskyřice, která váže histidin (His-bind, Novagen, Madison, WI) .
Kočičí CD80 nebo kočičí CD86 polypeptidy izolované z libovolného zdroje se modifikují v daném oboru známými metodami. Kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 se například fosforyluje nebo defosforyluje, glykosyluje nebo deglykosyluje apod. Zvláště vhodně jsou modifikace, které mění rozpustnost, stabilitu, vazebnou specifikaci a afinitu kočičího CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4.
Chimérické molekuly kočičího CD80, CD86, CD28, CTLA-4
Vynález se rovněž týká výroby chimérických molekul vyrobených z fragmentů kočičího CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 v libovolné kombinaci. Zavedení vazebného místa CTLA-4 namísto vazebného místa CD28 například zvýší vazebnou afinitu CD28 a současně zachová zesílení imunitní odezvy.
01-3118-00-Če ···· * · φ · · · · ♦ · φ φ · φ φ «φ · φ φ φ φφφφφφ φ φ ·· · • Φ · · φ · φ · φ φ
U jednoho provedení se vazebná místa pro CD80 nebo CD86 na CTLA-4 a CD28 zamění tak, že se vazebná oblast na CD28 nahradí vazebnou oblastí CTLA-4. Výsledným účinkem chimérické CD28 molekuly s CTLA-4 vazebnou oblastí je zvýšení afinity CD28 pro CD80 nebo CD86 a zvýšení hodnoty zesílení imunitní odezvy. U alternativního provedení jsou chimérické molekuly CD80 a CD28 nebo CD86 a CD28 nebo jejich fragmenty vázány membránou a zesilují schopnost těchto molekul posílit imunitní odezvu. U alternativního provedení jsou chimérické molekuly CD80 a CTLA-4 nebo CD86 a CTLA-4 nebo jejich fragmenty vázány membránou a zesilují schopnost těchto molekul potlačit imunitní odezvu. U alternativního provedení jsou chimérické molekuly CD80 a CTLA-4 nebo CD86 a CTLA-4 nebo jejich fragmenty vázány membránou a přesměrovávají imunitní odezvu za účelem dosažení požadovaného účinku.
U alternativního provedení je kočičí CD80, CD86, CD28 nebo
CTLA-4 proteinem navázaným na další polypeptid. Tento polypeptid zahrnuje neomezujícím způsobem imunoglobulin, antigen, nádorový antigen, buněčný povrchový receptor nebo buněčný povrchový ligand.
Kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 protilátky
Do rozsahu vynálezu rovněž spadají protilátky, které jsou specifické pro výše popsané kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 polypeptidy. Tyto protilátky jsou polyklonální nebo monoklonální a diskriminují kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 na úkor jiných druhů, identifikují funkční domény apod. Tyto protilátky jsou běžně vyráběny za použití způsobů a kompozic popsaných v Harlow a ·· ► ·
01-3118-00-Če ·· ·· ·· • » · » · · • · · · · · • · »»··· » · 9 9 9 · · · • » · · · · »
Lané, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, a stejně tak za použiti imunologických hybridizačních technologii, které jsou odborníkům v daném oboru známy. Pokud se pro vyvolání imunitní odezvy, specifické pro kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4, použijí peptidy odvozené z přírodních nebo syntetických kočičích CD80, CD86, CD28 nebo
CTLA-4, potom se tyto peptidy zpravidla váží na vhodný nosič, jakým je například KLH, a podávají ve vhodném adjuvansu, například Freundově adjuvansu. Výhodně se zvolené peptidy naváží na nosič s lysinovým jádrem, a to v podstatě způsobem, který popsal Tan (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 5409-5413. Za použití známých metod se připraví i výsledné protilátky, zejména vnitřní zobrazovací anti-idiotypické protilátky.
U jednoho provedení se purifikovaný kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 použil pro imunizaci myší, po které byla myším odebrána slezina a splenocyty byly použity pro standardní přípravu buněčných hybridů společně s buňkami myelomu a k získání klonů buněk vylučujících protilátky. U výsledných monoklonálních protilátek vylučovaných takto připravenými buňkami se pomocí in vitro testů sledovaly následující aktivity: navázání na kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4, inhibice schopnosti CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 vázat se na receptor a inhibice schopnosti CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 stimulovat T-buňky.
Kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 protilátky se používají k identifikaci a kvantitativnímu stanovení kočičího CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 za použití imunologických testů, jakými jsou ELISA, RIA apod. Kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 protilátky se rovněž používají pro imunodepleci extraktů kočičího CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4. Kromě toho lze tyto protilátky použít pro
• 000
01-3118-00-Če identifikaci, izolaci a purifikaci kočičího CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 z různých zdrojů a pro provádění subcelulárních a histochemických lokalizačních studií.
Použití
Kočičí CD80 (B7-1) ligand, kočičí CD86 (B7-2) ligand, kočičí CD28 receptor nebo kočičí CTLA-4 (CD152) receptor připravené způsobem podle vynálezu lze úspěšně použít jako vakcíny pro zabránění infekční chorobě nebo pro podporu růstu v homologických nebo heterologických kočičích druzích, například koexprese CD80 nebo CD86 s kostimulačními molekulami CD28 nebo CTLA-4 v libovolné kombinaci a s nádorovým antigenem nebo antigeny z patogenního organismu. Koexprese kočičího CD80 nebo CD86 společně s kočičím CTLA-4 receptorem má schopnost inhibovat aktivaci Tlymfocytů a schopnost potlačit imunitní odezvu. Specifickým příkladem může být koexprese CD80 nebo CD8 6 spolu s FIV, FeLV nebo FIP odvozenými imunogeny ve virusovém vektoru nebo v DNA expresním vektoru, která pokud se podá formou vakcíny, bude aktivovat, posilovat nebo regulovat bujení CD4+ a CD8+ Tlymfocytů a indukovat cytokiny regulující imunitu, jakými jsou například IL-2, IFN-g, IL-12, TNFa, IL-6 apod. Dalším specifickým příkladem by mohla být exprese CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 ve virusovém vektoru nebo DNA expresním vektoru, která, pokud se podá jako léčivo, bude regulovat nebo přesměrovávat imunitní odezvu.
Zesílení imunity přes interakci kočičího CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4, nebo inhibice imunitní odezvy přes interakci kočičího CD80 nebo CD86 s CTLA-4 je přirozený způsob regulace, který je výhodnější než přidání cizích látek, které by mohly mít
01-3118-00-Če
4 ·· * · φ · • 4 44 se podávají společně s například s molekulami, nebo herpesvirus, Kočičí CD80, CD86, více účinků, v některých případech i škodlivých, na celkový nebo dlouhodobý zdravotní stav. Molekuly CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 dalšími rekombinantními molekulami, které kódují antigeny žádoucí pro vyvolání imunity. Kočičí CD80, CD86, CD28 a/nebo CTLA-4 gen se zavede do expresního vektoru a infikuje nebo transfektuje do cílové buňky, kde dochází k expresi genového produktu, který se buď zachytí v plasmové membráně cílové buňky, nebo v antigenu přítomném v buňce, nebo se vylučuje ven z cílové buňky nebo z antigenu přítomného v buňce. Expresní vektor, jakým je například plasmid, virus Semliki Forest, poxvirus přepravuje gen do antigenu přítomného v buče.
CD28 a/nebo CTLA-4 gen nebo fragmenty genů v libovolné kombinaci se zavádí do DNA nebo RNA expresního vektoru a injektují do těla kočky a exprimují genový produkt v těle kočky jako „holou
DNA/RNA nebo genetickou vakcínu. Koexprese imunogenu a CD80, CD86, CD28 a/nebo CTLA-4 v cílové buňce nebo v těle kočky přispívá k aktivaci, zesílené aktivaci nebo regulaci T-lymfocytů, B-lymfocytů a ostatních buněk. Alternativně by bylo možné eprimovaný protein podat po expresi v prokaryotickém nebo eukaryotickém systému, jakým je například plasmid, virus Semliki Forest, poxvirus nebo herpesvirus, nebo další virusový nebo bakteriální vektor. Kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 proteiny zpravidla fungují zakotvené v buněčné membráně jako přídatné molekuly plasmové membrány, ale mohou existovat i v dalších formách, například bez membránového ukotvení.
U jednoho provedení jsou kočičí CD80 a kočičí CD86 rozpustné, postrádají transmembránovou doménu nebo hydrofobní oblast a vzájemně reagují s kostimulačními molekulami CD28 nebo CTLA-4 buď v membránou vázané, nebo v rozpustné formě. U φφφφ
01-3118-00-Če • · ·· φ φ · φ • · · φ • · φφφ φφ φφφ φ φ • φ φφ φφ φ alternativního provedení jsou kočičí CD80 nebo CD86 membránou vázané a kostimulační molekuly CD28 nebo CTLA-4 se nacházejí v rozpustné formě postrádající transmembránovou doménu nebo hydrofobní oblast. Rozpustný CD28 nebo CTLA-4, výhodně v dimerní formě, se využívá při léčení choroby koček související s imunosupresí mediovanou T-buňkami. Rozpustný CD28 nebo CTLA-4 brání odhojení transplantované tkáně a lze jej použít při léčení chorob autoimunitního systému. Rozpustný CD28 nebo CTLA-4 lze konkrétně použít jako prevenci proti odhojení transplantátu při transplantaci kostní dřeně. Rozpustný CD28 nebo CTLA-4 brání navázání buňky obsahující membránou vázaný kočičí CD80 nebo CD86.
U dalšího provedení se kočičí CTLA-4 naváže na imunoglobulin (lg). Fúze CTLA-4-Ig se použije pro potlačení imunitní odezvy nebo pro léčení chorob autoimunitního systému. Choroby autoimunitního systému zahrnují neomezujícím způsobem artritidu, lupenku, odhojení transplantovaného orgánu a chorobu transplantát vs. hostitel.
U dalšího provedení by mohly být kočičí CD80 a/nebo CD86 proteiny exprimované buď ve vázané, nebo rozpustné formě použity pro léčení nádorů u koček. Konkrétně by bylo možné kočičí CD80 a/nebo CD86 proteiny exprimovat z virusového vektoru nebo z DNA přímým injektováním nádoru nebo systemickým podáním, případně v kombinací s ko-vektorovanými antigeny souvisejícími s nádorem kočky.
Sekvenčně konzervační a funkčně konzervační varianty kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 DNA a polypeptidů nebo biologicky aktivní kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 fagment nebo subfragment se váží na další sekvenci, jakou je například
01-3118-00-Če • · · · · · • · · · · · • ······ · • · · · · ·· ·· ·· cytokin, interleukin, interferon, faktor stimulující kolonii, antigen z patogenního mikroorganismu, protilátka nebo purifikační sekvence, například his-tag nebo reporterový gen, například E. coli lacZ, E. coli iudA nebo zeleně fluoreskující protein.
Vakcíny
Vynález se týká způsobů a kompozic pro zesílení účinnosti imunitní odezvy u kočičích druhů. U tohoto provedení se kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 použijí ve spojení s imunogenem, pro který je požadováno vyvolat imunitní odezvu. Pro kočičí vakcíny, které například obsahují imunogeny z patogenů, jakými jsou například virus kočičí imunodeficience a virus kočičí leukemie, a z dalších patogenů, jakými jsou například kočičí parvovirus, kočičí leptovirus a kočičí koronavirus, je žádoucí, aby rovněž obsahovaly kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 a aby regulovaly hodnotu a kvalitu imunitní odezvy. Z těchto důvodů je ve vakcínách obsažen kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 purifikovaný z přírodního nebo rekombinantního zdroje, které již byly popsány výše, a to v množství, které se pohybuje přibližně od 0,01 do 100,0 mg/vakcína/kočka. Alternativně může být ve vakcíně obsažen rekombinantní vektor exprimující kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 a imunogen z kočičího patogenů v koncentraci přibližně od 0,01 do 100,0 mg/vakcína/kočka a výhodně v koncentraci přibližně od 0,25 do 25 mg/kg/den.
Kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 se podávají ve spojení s živou (tj. replikační) virovou vakcínou nebo nereplikační vakcínou. Neomezující příklady replikačních vakcín zahrnují vakcíny, které obsahují přírodní nebo rekombinantní virusy nebo •· *« ·* ·*·· ·· • · · · · · v ··· • · · · « « 9 9 · • ······ 44 9 · · • · 4 9 9 9 ·· ·· ·· 94 9 44 4
01-3118-00-Če bakterie, například modifikovaný kočičí herpesvirus nebo modifikovaný virus neštovic mývala. Neomezující příklady živých virových vakcin s omezenou nebo žádnou replikací v těle kočičího hostitele, ale s expresí cizí DNA (například kočičího CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 nebo imunogenu z kočičího patogenu) v hostitelské buňce, jsou modifikovaný virus neštovic drůbeže, modifikovaný virus neštovic prasat nebo virus Semliki Forest. Neomezující příklady jsou ty vakcíny, které obsahují mrtvé nebo inaktivované virusy nebo další mikroorganismy nebo čištěné nebo nečištěné antigeny odvozené z přírodních, rekombinantních nebo syntetických zdrojů, jakými jsou například vakcíny virusu kočičí leukemie.
Komerční zdroje kočičích vakcin jsou odborníkům v daném oboru známy (Compendium of Veterinary Pharmaceuticals, 1997) a v kombinaci s vynálezem se používají pro přípravu účinnější vakcíny.
Vakcína pro vyvolání a regulaci imunitní odezvy na imunogen u koček je tvořena imunogenem a množstvím kočičího CD80 nebo kočičího CD86, případně s kočičím CD28 nebo kočičím CTLA-4, které je účinné pro zesílení imunitní odezvy nebo s množstvím kočičího CD80 nebo kočičího CD86 s kočičím CTLA-4, které je účinné pro potlačení imunitní odezvy.
Imunogen se zvolí ze skupiny obsahující neomezujícím způsobem kočičí patogeny, například virus kočičí imunodeficience, virus kočičí leukemie, virus kočičí infekční peritonitidy, virus kočičí panleukopenie (parvovirus), kočičí kalikivirus, kočičí reovirus typu 3, kočičí rotavirus, kočičí koronavirus (Infectious peritonitis virus), virus vztekliny, kočičí syncytiální virus, ··»♦
9 99 99
9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9
9 999 9 9 99
9 9 9 9 9 9 9
99 99 9 99 9
01-3118-00-Če kočičí sarkomavirus, kočičí herpesvirus (rhinotracheitis virus), kočičí virus Bornovy choroby, Chlamydia, Toxoplasmosis gondii, kočičí parazity, Dirofilaria immitis, blechy, bakteriální patogeny apod.
Regulace růstu nebo regulace aktivace buněčného typu, například T-lymfocytu, naznačuje, že regulovaná odezva buď stimuluje nebo potlačuje buněčný růst. Regulace imunitní odezvy u kočky naznačuje, že při léčení chorob nebo infekčních činidel u koček se imunitní odezva buď stimuluje nebo potlačuje.
U výhodného provedení se geny, kódující kočičí CD80 a CD28, CD80 a CTLA-4, CD86 a CD28 nebo CD86 A CTLA-4 v kombinaci s geny pro imunogen získaný z kočičího patogenu zabudují do jediného rekombinantního virového vektoru a následně formulují do živé vakcíny. Kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 geny, samotné nebo v kombinaci s geny kočičího imunogenu, se zabudují do rekombinantního viru tak, že se exprese těchto genů řídí vhodným promotorem. Podání vakcíny má za následek expresi bioaktivního kočičího CD80 nebo CD86 ligandu a CD28 nebo CTLA-4 receptoru a expresi kočičího imunogenu (imunogenu) ve stejné buňce, které jsou tak dodány primární a sekundární kostimulační signály potřebné pro posíleni požadované imunitní odezvy. Toto provedení poskytuje časnou lokalizovanou imunitní odezvu na kočičí imunogen a vakcínu proti kočičímu onemocnění, která má zvýšenou účinnost.
U dalšího provedení jsou geny, kódující kočičí CD80, CD86,
CD28 nebo CTLA-4, samotné nebo v kombinaci, zabudovány do rekombinantního virového vektoru a ve vakcíně podány společně s druhým rekombinantním virovým vektorem, který kóduje geny pro kočičí imunogen(y) a poskytuje tak požadované odpovědi ve stejné
0 0
01-3118-00-Če
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
000*00 0 0 0 0 0*
0000 0· ·· «000 buňce nebo v buňkách, které se nachází v těsné blízkosti, pro zesílení požadované imunitní odezvy a vakcínu proti kočičímu onemocnění, která má zvýšenou účinnost.
Následují příklady rekombinantních virových vektorů, které lze použít při expresi kočičího CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 a ve vakcíně, která poskytuje zvýšenou ochrannou imunitní odezvu proti napadení patogenními mikroorganismy:
1. Částečná nebo celková exprese kočičích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných nebo v libovolné vzájemné kombinaci, v rekombinantním virusu neštovic prasat (zavedeno do libovolného neesenciálního inzertního místa) pro účely nereplikační vakcinace použité samotné nebo v kombinaci s další vakcínou nebo terapeutickým činidlem (rekombinantním živým nebo usmrceným) pro léčbu koček. (Není omezeno pouze na léčení koček.)
2. Částečná nebo celková exprese kočičích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných nebo v libovolné vzájemné kombinaci, v rekombinantním kočičím herpesvirusu (zavedeno do FHV gE místa nebo libovolného neesenciálního inzertního místa) pro účely replikační vakcinace použité samotné nebo v kombinaci s další vakcínou nebo terapeutickým činidlem (rekombinantním živým nebo usmrceným) pro léčbu koček. (Není omezeno pouze na léčení koček.)
3. Částečná nebo celková exprese kočičích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných nebo v libovolné vzájemné kombinaci, v rekombinantním virusu neštovic mývalů (zavedeno do libovolného neesenciálního inzertního místa) pro účely replikační vakcinace použité samotné nebo v kombinaci s další vakcínou nebo terapeutickým činidlem (rekombinantním živým nebo usmrceným) pro léčbu koček. (Není omezeno pouze na léčení koček.)
4« ·«··
·» 44
4 « 4
14 4
4 444
4 4
44
01-3118-00-Če
4. Částečná nebo celková exprese kočičích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných nebo v libovolné vzájemné kombinaci, v rekombinantním virusu neštovic prasat obsahujícím geny pro FIV gag-proteázu a/nebo obálku.
5. Částečná nebo celková exprese kočičích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných nebo v libovolné vzájemné kombinaci, v rekombinantním kočičím herpesvirusu obsahujícím geny pro FIV gagproteázu a/nebo obálku.
6. Částečná nebo celková exprese kočičích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných nebo v libovolné vzájemné kombinaci, v rekombinantním virusu neštovic mývalů obsahujícím geny pro FIV gag-proteázu a/nebo obálku.
7. Částečná nebo celková exprese kočičích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných nebo v libovolné vzájemné kombinaci, v rekombinantním virusu neštovic prasat obsahujícím geny pro FeLV gag-proteázu a/nebo obálku.
8. Částečná nebo celková exprese kočičích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných nebo v libovolné vzájemné kombinaci, v rekombinantním kočičím herpesvirusu obsahujícím geny pro FeLV gag-proteázu a/nebo obálku.
9. Částečná nebo celková exprese kočičích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných nebo v libovolné vzájemné kombinaci, v rekombinantním virusu neštovic mývalů obsahujícím geny pro FeLV gag-proteázu a/nebo obálku.
10. Částečná nebo celková exprese kočičích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných nebo v libovolné vzájemné kombinaci, v rekombinantním virusu neštovic prasat obsahujícím geny pro
4444 »
♦
01-3118-00-Če • · 4 • 4 4 (4 444 4 • · • 4 • 4 • 4
4
4
4
FeLV gag-proteázu a/nebo obálku a pro FIV gag-proteázu a/nebo obálku nebo jejich libovolnou kombinaci.
11. Částečná nebo celková exprese kočičích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných nebo v libovolné vzájemné kombinaci, v rekombinantním kočičím herpesvirusu obsahujícím geny pro FeLV gag-proteázu a/nebo obálku a pro FIV gag-proteázu a/nebo obálku nebo jejich libovolnou kombinaci.
12. Částečná nebo celková exprese kočičích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných nebo v libovolné vzájemné kombinaci, v rekombinantním virusu neštovic mývalů obsahujícím geny pro FeLV gag-proteázu a/nebo obálku a pro FIV gag-proteázu a/nebo obálku nebo jejich libovolnou kombinaci.
13. Částečná nebo celková exprese kočičích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných nebo v libovolné vzájemné kombinaci, ve virusu neštovic prasat nebo virusu neštovic mývalů nebo libovolném dalším expresním systému zahrnujícím neomezujícím způsobem E. coli, virus Semliki Forest a bakulovirus pro účely přípravy nepurifikovaného nebo purifikovaného polypetidu. Tato použití zahrnují neome-zujícím způsobem přípravu polyklonálních a monoklonálních protilátek a přípravu reakčních činidel pro rozvoj funkčního testu.
14. Exprese kočičího CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4, samotného nebo v libovolné kombinaci, v utlumeném FIV nebo FeLV virusovém vektoru. U jednoho provedení je FIV nebo FeLV virusový vektor utlumen genovou delecí.
15. Částečná nebo celková exprese kočičího CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4, samotného nebo v libovolné kombinaci, v expresním
01-3118-00-Če
vektoru obsahujícím gen(y) pro kočičí imunogeny, která je určena pro podání ve formě genetické vakcíny nebo holé DNA vakcíny. Vektory zahrnují neomezujícím způsobem pTarget (Promega, Madison, WI)a pcDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA). (Donnelly J.J. a kol., 1997; Hassett a Whitton, 1996).
16. Celé geny nebo fragmenty genů pro CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotné nebo v libovolné kombinaci, mohou být zavedeny nebo transfektovány do chromozómu kočky nebo jiného savce. Takové integrace těchto genů nebo fragmentů těchto genů lze dosáhnout pomocí retrovirového vektoru a tuto integraci lze použít jako určitou formu genové terapie.
Vynález poskytuje způsoby a kompozice pro lékařské a/nebo komerční účely, které zvyšují odolnost proti chorobám kočičích druhů. U tohoto provedení se vhodným způsobem kočkám podává celý kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 exprimovaný, samotný nebo v libovolné kombinaci, nebo jeho část, a to případně v kombinaci s geny kódujícími kočičí imunogeny. Pro podporu růstu nebo navození odolnosti proti chorobě se kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 exprimovaný, samotný nebo v libovolné kombinaci, podává ve formulaci v koncentraci přibližně 0,01 až 100,0 mg/vakcína/kočka a výhodně v koncentraci přibližně od 0,25 do 25 mg/kg/den. Pro podporu růstu nebo navození odolnosti proti chorobě se rekombinantní virový vektor exprimující kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4, samotný nebo v libovolné kombinaci, podává ve formulaci v koncentraci přibližně 0,01 až 100,0 mg/vakcína/kočka a výhodně v koncentraci přibližně od 0,25 do 25 mg/kg/den. Je zřejmé, že požadované množství kočičího CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 lze určit v daném oboru známými a běžně používanými experimenty, například stanovením matrice dávek a frekvencí a
01-3118-00-Če
• · »9 · · · ··· porovnáním skupiny experimentálních jednotek nebo subjektů s každým bodem v matrici.
Přirozený nebo rekombinantní kočičí CD80, CD86, CD28 nebo
CTLA-4 se podle vynálezu formuluje s fyziologicky přijatelným nosičem, jakým je například fosfátem pufrovaný solný roztok nebo deionizovaná voda. Formulace může rovněž obsahovat excipienty zahrnující lubrikant(y), změkčo-vadlo(a), zesilovač(e) absorpce, bakteriocid(y) apod., které jsou v daném oboru známy. Kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 polypeptid podle vynálezu se podává libovolným účinným způsobem, který přestavuje například intravenózní, subkutánní, intramuskulární, transmuskulární, topický nebo orální způsob podání. Při subkutánním podání je například dávka tvořena kočičím CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4 ve sterilním fyziologickém solném roztoku. Při orálním nebo respiračním podání je kočičí CD80, CD86, CD28 nebo CTLA-4, případně společně s excipienty, mikro- nebo makro- zapouzdřen, například v liposomech a mikrosférách. Rovněž lze použít dermální náplasti (nebo další pozvolna se uvolňující dávkové formy).
Materiály a metody
Příprava zásobních vzorků virusu neštovic mývalů
Pro přípravu zásobních vzorků virusu neštovic mývalů (RPV) a genomové DNA virusu neštovic mývalů se použil izolát virusu neštovic mývalů ATCC VR-838. Dalším dostupným izolátem RPV je V71-I-85A z Centra pro kontrolu chorob (CDC; Atlanta, GA). Vzorky virusu neštovic mývalů (RPV) se připravily infikací VĚRO buněk, CRFK buněk nebo MDCK buněk při četnosti infekce 0,01 PFU/buňka v
01-3118-00-Če • · ·* ···· ·· ···· · · · · · · • ······ · · ·· · · • · · · · · · · · ·· · · · · · ·· ··· médiu (Dulbeccďs Modified Eagle's Medium obsahující 2 mM glutaminu, 100 jenotek/ml penicilinu, 100 jednotek/ml streptomycinu (tyto složky se získaly od společnosti Sigma nebo ekvivalentního dodavatele a dále budou označovány jako DMEM negativní médium) ) . Před infikací se buněčné monovrstvy jednou propláchly DMEM negativním médiem, které mělo odstranit stopové množství fetálního bovinního séra. Potom se nechala buněčná monovrstva dvě hodiny absorbovat RPV obsažené v počátečním inokulu (0,5 ml pro lOcm plotnu; 10 ml pro T225cm baňku). Buněčná monovrstva se každou půl hodinu redistribuovala. Po uplynutí této doby se počáteční inokulum doplnilo přidáním kompletního DMEM média (DMEM negativní médium + 5% fetální bovinní sérum) na doporučený objem. Plotny se inkubovaly v 5% oxidu uhličitém při 37 °C až do kompletního dosažení cytopatického účinku. Médium a buňky se sklidily a při -70 °C zamrazily v 50ml kónické zkumavce opatřené šroubovacím uzávěrem. Po rozmražení při 37 °C se zásobní virus rozdělil do l,0ml lahviček a opět zamrazil při -70 °C. Titry zpravidla představovaly přibližně 106 PFU/ml.
Příprava zásobních vzorků virusu neštovic prasat
Vzorky virusu neštovic prasat (SPV) se připravily infikací buněk ledvin embrya prasete (EMSK), ESK-4 buněk, PK-15buněk nebo Věro buněk při četnosti infekce 0,01 PFU/buňka v médiu (1:1 směs, Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) a RPMI 1640 Medium, obsahující 2 mM glutaminu, 100 jenotek/ml penicilinu, 100 jednotek/ml streptomycinu (tyto složky se získaly od společnosti Sigma nebo ekvivalentního dodavatele a dále budou označovány jako EMSK negativní médium)). Před infikací se buněčné
01-3118-00-Če
monovrstvy jednou propláchly EMSK negativním médiem, které mělo odstranit stopové množství fetálního bovinního séra. Potom se nechala buněčná monovrstva dvě hodiny absorbovat SPV obsažené v počátečním inokulu (0,5 ml pro lOcm plotnu; 10 ml pro T175cm baňku). Buněčná monovrstva se každou půl hodinu redistribuovala. Po uplynutí této doby se počáteční inokulum doplnilo přidáním kompletního EMSK média (EMSK negativní médium + 5% fetální bovinní sérum) na doporučený objem. Plotny se inkubovaly v 5% oxidu uhličitém při 37 °C až do kompletního dosažení cytopatického účinku. Médium a buňky se sklidily a při -70 °C zamrazily v 50ml kónické zkumavce opatřené šroubovacím uzávěrem. Po rozmražení při 37 °C se zásobní virus rozdělil do l,0ml lahviček a opět zamrazil při -70 °C. Titry zpravidla představovaly přibližně 106 PFU/ml.
Příprava RPV nebo SPV DNA
Při izolaci DNA virusu neštovic mývalů nebo neštovic prasat se stékající se monovrstva VĚRO buněk (pro RPV) nebo EMSK buněk (pro SPV) v t225 cm baňce infikovala při četnosti 0,1 virusem neštovic mývalů (ATCC VR-838) a inkubovala 3 až 5 dní, dokud buňky nevykazovaly 100% cytopatický účinek. Infikované buňky se následně sklidily seškrábnutím buněk do média a 5 minut odstřeďovaly při frekvenci otáčení 3000 min-1 v klinické odstředivce. Médium se dekantovalo a buněčná peleta se mírně resuspendovala v 1,0 ml fosfátem pufrovaného solného roztoku (PBS:1,5 g Na2HPO4, 0,2 g KH2PO4, 0,8 g NaCl a 0,2 g Kel na litr vody)(na T175) a následně dvakrát postupně zamrazila a rozmrazila (-70 °C až +37 °C) . Po posledním rozmražení se buňky (na ledu)
01-3118-00-Če • ·····« · · · · · • · ·· ·· · · * · ·* dvakrát 30 sekund sonikovaly, přičemž mezi těmito dvěma periodami proběhlo 45sekundové chlazení. Buněčný odpad se následně odstranil pětiminutovým odstřeďováním (odstředivka Sorvall RC-5B Superspeed) při frekvenci otáčení 3000 min-1, teplotě 4 °C a použití rotoru HB4. RPV viriony přítomné v supernatantu se potom peletovaly dvacetiminutovým odstřeďováním při frekvenci otáčení 15 000 min-1, teplotě 4 °C a použití rotoru SS34 (Sorvall) a resuspendovaly v 10 mM Tris (pH 7,5). Tato frakce se potom nanesla ve vrstvě na 36% sacharózový gradient (hmotn./obj. v 10 mM Tris, pH 7,5) a 60 minut odstřeďovala (Beckman 18-70M Ultracentrifuge) při frekvenci otáčení 18 000 min-1, teplotě 4 °C a za použití rotoru SW41. Pelety virionů se resuspendovaly v 1,0 ml 10 mM Tris, pH 7,5, a sonikovaly 30 sekund na ledu. Tato frakce se nanesla ve formě vrstvy na 20% až 50% kontinuální sacharózový gradient a 60 minut odstřeďovala při frekvenci otáčení 16 000 min-1, teplotě 4 °C a za použití rotoru SW41. Pás virionů RPV ležící přibližně tři čtverce pod gradientem se sklidil, naředil 20% sacharózou a peletoval 60minutovým odstřeďováním při frekvenci otáčení 18 000 min“1, teplotě 4 °C a za použití rotoru SW41. Výsledná peleta se následně jednou propláchla 10 mM Tris, pH 7,5, čímž se odstranilo stopové množství sacharózy, a na závěr se resuspendovala v 10 mM Tris, pH 7,5. RPV DNA Se potom extrahovala z purifikovaných virionů lyzou (4 hodiny při 60 °C) indukovanou přidáním EDTA, SDS a proteinázy K do konečných koncentrací 20 mM, 0,5 %, resp. 0,5 mg/ml. Po digeraci se provedly tři fenol/chloroformové (1:1) extrakce a vzorek se vysrážel přidáním dvou objemů bezvodého ethanolu a 30 minut inkuboval při -20 °C. Vzorek se potom 5 minut odstřeďoval při plné rychlosti v Eppendorfově miniodstředivce.
• · · · · · · · • · 9 9 9
01-3118-00-Če
Supernatant se dekantoval a peleta se sušila na vzduchu a rehydratovala v 0,01 M Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA při 4 °C.
Příprava zásobních roztoků viru FHV
S-FHV-000 se získal od ATCC (ATCC č. 636) a S-FHV-001 se získal od NVSL (NVSL Challenge Virus Strain SGE, Lot KS). Zásobní vzorky viru FHV se připravily infikací buněk ledvin koček Crandell (CRFK) při četnosti infekce 1,0 PFU/buňka v médiu (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) obsahujícím 2 mM glutaminu, 100 jednotek/ml penicilinu, 100 jednotek/ml streptomycinu (tyto složky se získaly od společnosti Irvine Scientific nebo ekvivalentního dodavatele a dále budou označovány jako kompletní DME médium) + 5% fetální bovinní sérum). Po dosažení 100% cytopatického účinku se médium a buňky sklidily, rozdělily na alikvotní podíly a zamrazily při -70 °C. Titry představovaly přibližně 1 χ 107 až 1 χ 108 PFU/ml.
Příprava DNA herpesviru
Stékající se monovrstva CRFK buněk ve 25 cm2 baňce nebo 60ml Petriho misce se infikovala 10 ml vzorku viru. Po celonoční inkubaci nebo potom, co buňky vykazovaly 100% cytopatický účinek, se buňky seškrábly do média a 5 minut odstřeďovaly v klinické odstředivce při frekvenci otáčení 3000 min-1. Médium se dekantovalo a buněčná peleta se lehce resuspendovala v 0,5 ml roztoku obsahujícího 0,5% NONIDED p-40 (oktylfenolethylenoxidový kondenzát obsahující průměrně 9 molů ethylenoxidu na molekulu)(NP-40, nakoupený u společnosti Sigma Chemical Co., St.
01-3118-00-Če ·· · · ···* • · · · · · · 9 9 9 9 9 9 « • 9 99999 9 9
99 99
Louis, MO) . Vzorek se při pokojové teplotě inkuboval 10 minut. Přidalo se 10 ml zásobního roztoku Rnázy A (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; zásobní roztok měl koncentraci 10 mg/ml; vařil se 10 minut s cílem inaktivovat DNázu). Vzorek se odstřeďoval na peletová jádra. DNA Peleta se odstranila pomocí pasteurovy pipety nebo dřevěné tyčinky a zlikvidovala. Supernatant se dekantoval do l,5ml Eppendorfovy zkumavky obsahující 25 ml 20% nátriumdodecylsulfátu (sigma) a 25 ml proteinázy-K (10 mg/ml; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) . Vzorek se míchal a inkuboval při 37 °C po dobu 30 min až 60 min. Potom se přidal stejný objem vodou nasyceného fenolu a vzorek se lehce promíchal. Potom se vzorek 5 minut odstřeďoval při plné rychlosti v Eppendorfově miniodstředivce. Horní vodná fáze se přemístila do nové Eppendorfovy zkumavky, do které se přidaly dva objemy absolutního ethanolu, který v průběhu třicet minut při -20 °C vysrážel nukleovou kyselinu. Vzorek se 5 minut odstřeďoval v Eppendorfově miniodstředivce. Supernatant se dekantoval a peleta se sušila na vzduchu a rehydratovala v přibližně 16 ml vody. Při přípravě většího množství DNA se postup zahajuje s válcovými láhvemi nebo 175cm2 baňkami CRFK buněk. DNA se skladovala při 4 °C v 0,01 M Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA.
DNA Transfekce při generování rekombinantního viru
Tato metoda je založena na kalcium-fosfátovém postupu, který popsal Graham a Van der eb [25] a odlišuje se následujícími modifikacemi. Virová a/nebo plasmidová DNA se naředila na 298 ml v 0,01 M Tris, pH7,5, lmM EDTA. Potom se přidalo 40 ml 2M
01-3118-00-Če • φ φφφφφ φ φ ♦ φ φ · φφ φφ φφ chloridu vápenatého a následně stejný objem 2X HEPES pufrovaného solného roztoku (10 g kyseliny N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2ethansulfonové (HEPES), 16 g chloridu sodného, 0,74 g chloridu draselného, 0,25 g Na2HPO4 2H2O, 2 g dextrózy na litr vody a pufrováno hydroxidem sodným na pH 7,4). Potom se směs 10 minut inkubovala na ledu a po uplynutí této doby se směs po kapkách přidala do 80% stékající se monovrstvy CRFK buněk rostoucích v 60mm Petriho misce pod 5 ml média (DME + 5% bovinní sérum). Buňky se 4 hodiny inkubovaly ve zvlhčeném inkubátoru obsahujícím 5% oxid uhličitý při teplotě 37 °C. Médium na plotnách se odsálo a buňky se 1 minutu ošetřovaly 20% glycerolem v 1XPPS (1,15 g hydrogenfosforečnanu sodného, 0,2 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,8 g chloridu sodného, 0,2 g chloridu draselného na litr vody). Buňky se třikrát propláchly 5 ml 1XPPS a následně doplnily 5 ml média (DME + 5% bovinní fetální sérum). Buňky se potom inkubovaly 3 až 7 dní při 37 °C, dokud se nedosáhlo 50% až 100% cytopatického efektu viru. Virus se sklidil způsobem popsaným v souvislosti s přípravou zásobních vzorků virů. Tento zásobní vzorek byl označen jako transfektovaný zásobní vzorek a následně se analyzoval na rekombinantní virus vyhledáváním rekombinantního herpesviru exprimujícího enzymatické markerové geny.
Příprava infikovaných buněčných lyzátů
Při přípravě buněčného lyzátu se použilo sérum prosté média. Stékající se monovrstva buněk’(VĚRO, CRFK nebo MDCK) 25cm2 baňce nebo 60mm Petriho misce se infikovala 100 ml virového vzorku. Po dosažení 100% cytopatického účinku se médium a buňky sklidily a φφφφ » · · * * · φ · · · φ ····♦·♦ φ φ · φ ΦΦΦΦ·· · φ φφ · · • φ φφφφ φφφ φφ φ· φφ φ φφ φφφ
Ol-3118-OO-Če buňky se 5 minut peletovaly v klinické odstředivce při frekvenci otáčení 3000 min1. Buněčná peleta se resuspendovala ve 250 ml rozkladného pufru (2% nátriumdodecylsulfát, 2% β-merkaptoethanol). Vzorky se 30 sekund sonikovaly na ledu a uskladnily při -20 °C.
Westernový přenos
Vzorky lyzátů a proteinové standardy se nanesly způsobem podle Laemnliho na polyakrylamidový gel. Po ukončení gelové elektroforézy se proteiny přemístily a zpracovaly postupem, který popsal Sambrook a kol. (1989). Primární protilátka se naředila 5% netučným sušeným mlékem v Tris-chloridu sodném a azidu sodném (TSA: 6,61 g Tris-HCl, 0,97 g Tris-báze, 9,0 g NaCl a 2,0 g azidu sodného na 1 1 H20) v poměru 1:100. Sekundární protilátka se navázala na alkalinfosfatázu a TSA naředila v poměru 1:1000.
Molekulární biologické techniky
Techniky pro manipulace s bakteriemi a DNA, včetně takových postupů, jakými jsou digerace restikční endonukleázou, gelová elektroforéza, extrakce DNA z gelů, ligace, fosforylace kinázou, ošetření fosfatázou, růst bakteriálních kultur, tranformace bakterií pomocí DNA a další molekulární biologické metody popsal Sambrook a kol. (1989) a Current Protocols in Molecular Biology (1992). Pokud není uvedeno jinak, jsou tyto metody prováděny pouze s minimálními odchylkami.
01-3118-00-Če • · »♦ *· ···· · · · • * · · ·· · · · · · • · · · · · · · · 0 • 000··· · · · 0 · · • · · · 0 0 · · 0 ·· ·♦ »· ♦ ·· 000
Sekvencování DNA
Sekvencování DNA se provádělo za použití reakcí pro sekvencování fluorescenčně značených dideoxyskupin, k jejichž realizaci se použila sada ABI PRISM Dye Terminátor Cycle Sequencing Ready Reaction Kit s Amplitaq DNA polymerázou, FS (Perkin-Elmer; podle instrukcí výrobce) a elektroforéza se prováděla na přísroji Perkin-Elmer/Applied Biosystems DNA sequencer, model 373A, podle instrukcí výrobce. Reakce používající dGTP směsi a dITP směsi se prováděly s cílem nalézt oblasti komprese. Oblasti komprese lze alternativně identifikovat na formamidových gelech. Jako matrice se použily dvojřetězcové plasmidové subklony nebo jednořetězcové M13 subklony a primery se navázaly na vektor bezprostředně před inzertem, který se měl sekvencovat nebo na již získanou sekvenci. Získané sekvence se odebraly a porovnaly za použití software DNAStar.
Klonování za použití polymerázové řetězcové reakce
Polymerázová řetězcová reakce (PCR) se použila pro zavedení restrikčních míst vhodných pro manipulaci s různými DNA. Postupy, které se v této souvislosti použily popsal Innis a kol. (1990). Velikost amplifikovaných fragmentů byla zpravidla menší než 500 bazických párů a kritické oblasti amplifikovaných fragmentů byly potvrzeny DNA sekvencováním. Primery, použité pro jednotlivé případy, jsou podrobně popsány v části popisující konstrukci homologických vektorů.
• 4
4 *4 44 4··4
4 4 4 4 4 *
4 4 4 4 4 4 4 4 44444 4 4 • ♦ 4444 444 ·· ·· 44 4 44 444
01-3118-00-Če
Homologický rekombinantní postup použitý při generování rekombinantního RPV, SPV nebo FHV
Tento postup se týká homologické rekombinace DNA viru neštovic mývalů a DNA plasmidového homologického vektoru, ke které dochází v buňkách tkáně obsahující DNA viru neštovic mývalů a současně transfektovaný plasmidový homologický vektor. Homologická rekombinace se provádí tak, že se monovrstva buněk (CRFK, MDCK nebo VĚRO) infikuje S-RPV-000 (ATCC VR-838) nebo SSPV-001 nebo S-FHV-001 při četnosti infekce 0,01 PFU/buňka, čímž se do buněk zavede replikace RPV (tj . DNA syntéza). Plasmidový homologický vektor DNA se do těchto buněk následně transfektuje za použití postupu infikace-transfekce. Konstrukce homologických vektorů použitých u tohoto postupu bud popsána níže.
Postup infikace-transfekce
Šesticentimetrové plotny buněk (CRFK, MDCK nebo VĚRO), které tvořily přibližně z 80 % celistvou vrstvu, se infikovaly S-RPV000 nebo S-SPV-001 nebo S-FHV-001 při četnosti infekce 0,01 PFU/buňka v DMEM negativním médiu a po dobu dvou až tří hodin se inkubovaly při teplotě 37 °C ve zvlhčeném 5% oxidu uhličitém. Jako transfekční postup se v podstatě použil postup doporučený pro transfekci reakčního činidla Lipofectin (Německo). Takže pro každou z šesticentimetových ploten se 15 pg plasmidové DNA doplnilo vodou do 100 pl. Odděleně se 50 pg reakčního činidla Lipofectin doplnilo vodou do 100 pl. 100 pl Naředěného reakčního činidla Lipofectin se potom po kapkách přidalo do naředěné plasmidové DNA obsažené v 5ml polystyrénové zkumavce opatřené
01-3118-00-Če • · ·« ·· zástrčným uzávěrem a mírně promíchalo. Směs se následně inkubovala 15 až 20 minut při pokojové teplotě. Během této doby se virové inokulum odstranilo z 6cm ploten a buněčné monovrstvy se jednou propláchly DMEM negativním médiem. Do směsi plasmidové DNA a Lipofectinu se potom přidaly 3 ml DMEM negativního média a obsah se napípetoval na buněčnou monovrstvu. Buňky se inkubovaly přes noc (přibližně 16 hodin) při 37 °C ve zvlhčeném 5% oxidu uhličitém. Následující den se odebraly 3 ml DMEM negativního média a nahradily 5 ml DMEM kompletního média. Buňky se inkubovaly při 37 °C v 5% oxidu uhličitém 3 až 5 dní, dokud nedosáhl cytopatický účinek viru 80 % až 100 %. Virus se sklidil způsobem, který již byl popsán v souvislostí s přípravou zásobních vzorků virů. Tento zásobní vzorek byl označen jako transfekční zásobní vzorek a následně se použil pro vyhledávání rekombinantního viru pomocí BLUOGAL SCREEN FOR RECOMBINANT RACCOONPOX VIRUS OR CPRG SCREEN FOR RECOMBINANT RACCONPOX VIRUS.
Vyhledávání β-galaktosidázy (testy BLUOGAL a CPRG) nebo βglukuronidasy (test X-GLUC) exprimujících rekombinantní RPV nebo SPV nebo FHV
Pokud se do rekombinantního viru zabuduje markerový gen E. coli β-galaktosidázy (lacZ), potom se plaky obsahující rekombinanty vizualizují jednou ze dvou jednoduchých metod. Při provádění první metody se do agarosy při analýze plaku zabuduje chemické činidlo Bluogal (200 pg/ml; Life Sciences Technology, Bethesda, MD) a plaky exprimující aktivní β-galaktosidázu se zbarví modře. Modré plaky se následně nanesou na čerstvé buňky (MDCT, CRFT nebo VĚRO) a purifikují další izolací modrého plaku.
01-3118-00-Če *· ** 99 9999 ·« » ···· · · · · · ··
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 999 9999 999 9 ·· · · · 9 9 9 9 * * 9 * 9 9 9 9 9 99 9
Při provádění druhé metody se do agarosy při analýze plaku zabuduje CPRG (400 pg/ml; Boehringer Mannheim) a plaky exprimující aktivní β-galaktosidázu se zbarví červeně. Červené plaky se následně nanesou na čerstvé buňky (MDCK, CRFK nebo VĚRO) a purifikují další izolací červeného plaku. V obou případech se viry zpravidla purifikují třemi až čtyřmi cykly plakové purifikace.
Pokud se do rekombinantního. viru zabuduje markerový gen E. coli β-glukuronidasy (uidA), potom se plaky obsahující rekombinanty vizualizují za použití chromogenního substrátu Xbeta-D-gluUA CHX (X-GLUC; kyselina 5-brom-4-chlor-3-inoxyl-betaD-glukuronová, cyklo-hexylamonná sůl; Biosynth AG; Švýcarsko), který se zabudoval (200 pg/ml) do agarosy při analýze plaku a plaky exprimující aktivní β-glukuronidasu se zbarvily modře. Modré plaky se následně nanesly na čerstvé buňky (MDCK, CRFK nebo VĚRO) a purifikovaly další izolací modrého plaku.
Vyhledávání exprese cizího genu v rekombinantním RPV za použití testu s černým plakem
Při analýze exprese cizích antigenů exprimovaných rekombinantními viry neštovic mývalů se monovrstvy buněk (MDCK, CRFK nebo VĚRO) infikovaly rekombinantním RPV nebo SPV nebo FHV, překryly živným agarosovým médiem a inkubovaly 3 až 5 dní při 37 °C. Agarosová vrstva se následně z misky odstranila a buňky se fixovaly po dobu 10 minut 100% methanolem při pokojové teplotě a nechaly se oschnout na vzduchu. Fixace buněk měla za následek detekci cytoplasmového antigenu a povrchového antigenu, přičemž expresi specifického povrchového antigenu lze detekovat za ·· «<
• · · « » · · · ► · »»♦ » · · «« ·«
01-3118-00-Če ·♦«« použití nefixovaných buněk. Primární protilátka se následně naředila na vhodná ředění IX blotto (5% netučné sušené mléko v Tris-chloridu sodném a azidu sodném (TSA: 6,61 g Tris-HCl, 0,97 g Tris-báze, 9,0 g NaCl a 2,0 g azidu sodného na 1 1 H2O) ) a inkubovala po dobu dvou hodin při pokojové teplotě na buněčné monovrstvě. Nenavázaná protilátka se potom odstranila třemi průplachy buněk TS pufrem, které se prováděly při pokojové teplotě. Druhá protilátka, konjugát alkálie-fosfatázy, se naředil v poměru 1:1000 IX blotto a inkubovala s buňkami 2 hodiny při pokojové teplotě. Nenavázaná sekundární protilátka se potom odstranila třemi průplachy buněk TS pufrem (6,61 g Tris-HCl, 0,97 g Tris-báze, 9,0 g NaCl a 2,0 g azidu sodného na 1 1 H2O) při pokojové teplotě. Buňky se následně inkubovaly 15 až 30 minut při pokojové teplotě čerstvě připraveným roztokem substrátu (100 mM Tris HC1 pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,3 mg/ml
Nitro Blue Tetrazolium a 0,15 mg/ml 5-brom-4-chlor-3-indoylfosfatasy). Plaky exprimující správný antigen se zbarví černě. Pro zastavení vývoje barevné reakce se použil fixační roztok (20 mM Tris-HCl pH 2,9 a lmM EDTA).
Vyhledávání exprese kočičího CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2) v rekombinantním SPV, RPV nebo FHV za použití testů s černým plakem
Při analýze exprese CD80 nebo CD86 se ko-stimulační molekuly exprimované rekombinantními viry neštovic prasat, rekombinantními viry neštovic mývalů nebo rekombinantními kočičími herpesviry na monovrstvách buněk (MDCK, CRFK, VĚRO nebo ESK-4) infikovaly rekombinantními RPV nebo SPV nebo FHV viry exprimuj ícími CD80 nebo CD86, překryly živným agarosovým médiem a inkubovaly 3 až 5 ·· · « · ·· • · · » · to · * · · ·· ·*«
01-3118-00-Če toto •
• to • · ·· •to to·· · to toto totototo • to to ·♦· • · · ··· to* · dní při 37 °C. Potom se agarosa z misky odstranila a buňky se buď 10 minut fixovaly 100% methanolem a sušily na vzduchu nebo se ponechaly nefixované a okamžitě se ošetřily IX PBS. Fixace buněk vedla k detekci cytoplasmového antigenu a povrchového antigenu, zatímco expresi specifického povrchového antigenu bylo možné určit za použití nefixovaných buněk. Chiméra huCTLA-4/Fc (R&D Systems, Minn. MN, kat. č. 325-CT) se potom naředila na vhodné ředění IX blotto (5% netučné sušené mléko v Tris-chloridu sodném (TS: 6,61 g Tris-HCl, 0,97 g Tris-báze, 9,0 g NaCl na 1 1 H2O)) a inkubovala na buněčné monovrstvě 2 hodiny při pokojové teplotě. Nenavázaná chiméra se následně odstranila třemi průplachy buněk TS pufrem, které se provedly při pokojové teplotě. Detekční protilátka monoklonální anti-hulgGI fc alkálie-fosfatázový konjugát (Zymed, kat. č. 05-3322) se naředila na vhodnou koncentraci IX blotto a 2 hodiny se při pokojové teplotě inkubovala s buňkami. Nenavázaná detekční protilátka se následně odstranila třemi průplachy buněk TS pufrem (6,61 g Tris-HCl, 0,97 g Trisbáze, 9,0 g NaCl na 11 H2O) při pokojové teplotě. Buňky se následně inkubovaly 15 až 30 minut při pokojové teplotě čerstvě připraveným roztokem substrátu (100 mM Tris HC1 pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,3 mg/ml Nitro Blue Tetrazolium a 0,15 mg/ml 5-brom-4-chlor-3-indoylfosfatázy). Plaky exprimující CD80 nebo CD86 se zbarvily černě. Pro zastavení vývoje barevné reakce se použil fixační roztok (20 mM Tris-HCl pH 2,9 a lmM EDTA).
• ·
01-3118-00-Če
Vyhledávání kočičí interferonové gama bioaktivity exprimované z rekombinantního SPV, RPV nebo FHV za použití redukce VSV plaku
CRFKS Nebo některá vhodná kočičí linie se v 96jamkových plotnách ošetřila supernatanty získanými z buněk infikovaných rekombinantními viry exprimujícími kočičí IFN-γ a 6 až 12 hodin inkubovala při teplotě 37 °C. Do příslušných jamek se následně přidal VSV virus (100 až 1000 částic/jamka) a inkuboval 24 hodin nebo do okamžiku, kdy byla v kontrolních jamkách, které obsahovaly pouze buňky, dokončena lyže. Buňky se třikrát propláchly IX PBS a monovrstvy se fixovaly 100% methanolem a vysušily na vzduchu. Do všech jamek se v průběhu 10 minut přidal při pokojové teplotě 0,05% roztok fialového barviva Crystal a jamky se následně nechaly sušit na vzduchu. U jednotlivých jamek se zhodnotila přítomnost fialového zabarvení. Zdravá monovrstva buněk absorbuje fialové barvivo Crystal. Supernatanty s IFN-γ aktivitou budou chránit CRFK buňky před buněčnou lyží indukovanou VSV viry a fialovým zabarvením.
Postup pro purifikaci virových glykoproteinů použitelných jako diagnostická činidla
Virové glykoproteiny se purifikovaly za použití kolon s afinitou na protilátky. Při výrobě monoklonálních protilátek se samičky myší BALB/c 8 až 10 týdnů staré intraperitoneálně vakcinovaly 7x během dvou- až čtyřtýdenních intervalů rekombinanty virů neštovic mývalů v dávce 107 PFU. Tři týdny po poslední vakcinaci se myším intraperitoneálně injektovalo 40 mg
01-3118-00-Če ·· ·· 9 9 · · · · ·· • · · · 9 9 · ·· • · · · · · · ··
999999 99 99 9 odpovídajícího virového glykoproteinu. Tři dny po poslední dávce antigenu se myším vyjmula slezina.
Splenocyty se navázaly na myší NSl/Ag4 plasmacytomy modifikovaným způsobem podle Oi a Herzengerga. Splenocyty a plasmacytomy se společně peletovaly centrifugací při 300xG, po dobu 10 minut. Do buněčné pelety se za míchání, v průběhu jedné minuty přidal 1 ml 50% roztoku polyethylenglykolu (molekulová hmotnost 1300 až 1600) . Během tří minut se k buňkám přidalo médium (Dulbecco's modified Eagles's medium, 5 ml). Buňky se peletovaly centrifugací při 300xG po . dobu 10 minut a resuspendovaly v médiu s 10% fetálním bovinním sérem, které obsahovalo 100 mM hypoxanthinu, 0,4 mM aminopterinu a 16 mM thymidinu (HAT) . Buňky (10 ml) se přidaly do jamek 8 až 10 96jamkových ploten obsahujících 100 ml normální živnou vrstvu buněk sleziny a inkubovaly se při 37 °C. Buňkám se každé 3 až 4 dny poskytlo čerstvé HAT médium.
Supernatanty hybridomové kultury se testovaly testem ELISA v 96jamkových mikrotitračních plotnách, které byly potaženy 100 ng virového glykoproteinu. Supernatanty z reakčních hybridomů se dále analyzovaly pomocí testu s černým plakem a pomocí Westernového přenosu. Zvolené hybridomy se dvakrát klonovaly limitujícím ředěním. Intraperitoneálním vstřikováním 5xl06 hybridomových buněk do těla přistáném ošetřeních BALB/c myší se produkovala asketická tekutina.
Buněčné lyzáty se z rekombinantů viru neštovic mývalů získaly způsobem popsaným v souvislosti s přípravou infikovaných buněčných lyzátů. Buněčné lyzáty obsahující glykoprotein (100 ml) se vedly přes 2 ml pryskyřice s afinitou k agarose, na které bylo
01-3118-00-Če podle instrukcí výrobce (AFC Medium, New Brunswick Scientific, Edison, N.J.) imobilizováno 20 mg glykoproteinové monoklonální proti-látky. Kolona se propláchla 100 ml 0,1% roztoku Nonidet P-40 ve fosfátem pufrovaném solném roztoku (PBS), jehož cílem bylo odstranit nespecificky navázaný materiál. Navázaný glykoprotein se eluoval 100 mM karbonátového pufru, pH 10,6 (40). Čistota frakce před a po eluaci se sledovala na základě reaktivity vůči RPV monoklonálním protilátkám v systému ELISA.
Test ELISA
Ke stanovení imunního stavu zvířete po vakcinaci se použil standardní, na enzym navázaný imunosorbentní testovací (ELISA) protokol. Glykoproteinový roztok antigenů (100 ml při ng/ml v PBS) se nechal při teplotě 4 °C 18 hodin absorbovat na jamky mikrotitračních ploten. Potažené buňky se jednou propláchly PBS. Buňky se blokovaly přidáním 250 ml PBS obsahujícího 0,02 % Tween 20. Do jamek se přidalo 50 ml testovacího séra (předem naředěného v poměru 1:2 v PBS obsahujícím 1 % BSA) a 1 hodinu se inkubovaly při 37 °C. Protisérum se odstranilo a jamky se třikrát propláchly PBS obsahujícího 0,02 % Tween 20. Vizualizace jamek obsahujících protilátku proti specifickému antiviru se provedla přidáním 50 ml roztoku obsahujícího antibovinní IgG navázaný na peroxidáze z křenu (naředěný v poměru 1:500 v PBS obsahujícím 1 % BSA, Kirkegaard and Perrry Laboratories, lne.). Roztok se 1 hodinu inkuboval při 37 °C, načež se odstranil a třikrát propláchnul PBS obsahujícím 0,02 % Tween 20. Do každé jamky se přidalo 100 ml roztoku substrátu (ATBS, Kirkegaard and Perry Laboratories, lne.) a 15 minut se nechalo vyvíjet zabarvení.
• ·
01-3118-00-Če • · ···*· · ·
Reakce se ukončila přidáním 0,1 M kyseliny oxalové. Zabarvení se odečetlo při absorbanci 410 nm na automatickém čítači ploten.
Strategie pro konstrukci syntetických virových promotorů neštovic
Syntetické neštovicové promotory nabízí rekombinantním vektorům neštovic prasat několik výhod, včetně schopnosti řídit sílu a načasování exprese cizího genu. Byly navrženy tři promotorové kazety LPI, EP1 a LP2 na bázi promotorů definovaných ve viru vztekliny. Každá kazeta byla navržena tak, aby obsahovala DNA sekvence definované ve vzteklině obklopující restrikční místa, která by mohla být použita při kombinaci kazet v libovolném pořadí. Každá kazeta rovněž obsahuje iniciační methioniny, takže k fúzím by mohlo dojít buď v EcoRI nebo BamHI místě. Za fúzním místem v každém ze tří čtecích rámců se rovněž nachází sada translačních koncových kodonů a raně transkripční terminační signál. DNA Kódující každou kazetu se syntetizovala podle standardních technik a nakloňovala do vhodných homologových vektorů.
Izolace počátečního fragmentu CD80 mRNA Se extrahovala z periferních jednojaderných krvinek (PBMC)stimulovaných 16 hodin Con A za použití RNAzolB RNA extrakčního reakčního činidla (Biotexc, Houston, TX) . Nejprve se z této RNA pomocí reakce reverzní transkriptázy (RT) používající jako 3'. primer oligo dT odvodila cDNA. RNA a oligo dT se 3 minuty zahřívaly na 75 °C s cílem odstranit sekundární strukturu. Potom se přidala RT, dNTP, pufr a destilovaná voda a směs se inkubovala
01-3118-00-Če
hodinu při 42 °C. Po této inkubaci se vzorek ohřál na dobu 5 minut na 95 °C s cílem inaktivovat RT. Degenerované primery odvozené z koncových oblastí lidských a myších CD80 publikovaných sekvencí (GeneBank, Gaíthersburg, MA) se následně použily při počáteční amplifikaci 344nukleotidového fragmentu kódujícího středovou oblast konstantní domény genu.
5' primer B7-2 GGC CCG AGT A(CT)A AGA ACC GGA C (SEQ ID NO. 56)
3' primer B7-3 CAG (AT)TT CAG GAT C(CT)T GGG AAA (CT)TG (SEQ ID NO. 57)
Při amplifikaci produktů s použil polymerázový řetězový reakční protokol s horkým startem, který používá Taq polymerasu. Reakční směs postrádají Taq enzym se nejprve po dobu 5 minut ohřívala na 95 °C, tj. tzv. horký start, aby se zabránilo tvorbě dimerních primerů. Před iniciací teplotního cyklu se přidal enzym. PCR Reakční směs se následně ohřála na 30 sekund na 95 °C, což vedlo k roztavení dvouřetězcové DNA. Potom se reakce ochladila na 30 sekund na 42 °C, což usnadnilo temperování degeneračních primerů. Nízká temperační teplota usnadnila navázání primerů, které nebyly 100% homologické. Reakční směs se potom ohřála na 45 sekund na teplotu 72 °C, což je optimální teplota pro to, aby Taq polymerasa prodloužila primer a zkopírovala opačný DNA řetězec. Teplotní cyklus se opakoval 30x. Po třiceti cyklech se použil konečný extenzní krok, při kterém se teplota zvýšila na 7 minut na 72 °C a který usnadnil extenzi všech nekompletních produktů. Po vizualizaci na 1% agarovém gelu se produkt přes noc ligoval při 16 °C do TA klonovacího vektoru (InVitrogen, San Diego, CA) pro účely sekvencování. 2 ml Ligační reakce se použily pro transformaci kompetentních InvaF' buněk. Transformované • · · · · ·
01-3118-00-Če bakterie se v pásech nanesly na LB plotny (50 mg/ml ampicilinu) potažené 40 ml 50 mg/ml roztoku x-gal. Následující den se vybraly bílé kolonie, které se naočkovaly do 5 ml LB média obsahujícího 100 mg/ml ampicilinu a nechaly se růst přes noc při 37 °C a při frekvenci protřepávání 225 min-1.
Minipreparáty se připravily na noc starých kulturách s cílem určit klony, které vykazovaly plasmid se správným inzertem. Plasmid se z kultur extrahoval za použití standardní alkalické lyže, přičemž DNA se dále purifikovala fenol/chloroformovou extrakcí (Maniatis a kol., 1982). DNA se vysrážela ve dvou objemech ethanolu a následně digerovala EcoRI. Digesty se vizualizovaly na 1% agarózovém gelu s cílem určit kolonie s plasmidem, který obsahoval správný inzert. Plasmid se potom purifikoval z pozitivních klonů a sekvencoval pomocí S35 radiologicky značeného dideoxyterminátoru na bázi sekvenásy (USB, Cleveland, OH) nebo cyklického sekvencování pomocí fluorescenčního barviva jako terminátoru (Perkin Elmer, Norwalk CT) . Ze sekvence cDNA se zkonstruovaly specifické 3'a 5'primery, které se použily při 5'rychlé amplifikaci reakcí cDNA konců (RACE) a derivaci 3'sekvence společně s degeneračními primery z 3'nepřenesené oblasti (UTR).
Izolace 5'oblasti CD80
Pro derivaci 5'sekvence genu se použil cDNA amplifikační protokol „Marathon (Clonetech, Palo Alto, CA) . Z PBMC stimulovaného 12 hodin pomocí Con A a současně 4 hodiny pomocí LPS se připravila mRNA. mRNA se extrahovala za použití ULTRASPEC RNA extrakčního činidla (Biotexc, Houston TX). cDNA se připravila za použití kotvícího oligo dT primerů s degeneračními nukleotidy
01-3118-00-Če ·· ·· ·♦ *·· · ·· • · · · · · · · * · na 5'konci, jehož cílem je navázat primer na poslední 5' konec póly A konce. Potom se již popsaným způsobem přepsala cDNA. Pomocí T4 DNA ligasy se na cDNA naligovaly specifické linkery. Na cDNA s vnitřním 3'primerem specifickým pro již amplifikovanou oblast:
B7-284: TTA TAC TAG GGA CAG GGA AG (SEQ ID NO. 58)
B7-190: AGG CTT TGG AAA ACC TCC AG (SEQ ID NO. 59) a kotvícím primerem komplimentárním pro ligovanou linkerovou sekvenci se provedla „Touchdown PCR. Parametry „Touchdown PCR reakci, při které se použila KlenTaq polymerasová směs (Clontech, Palo Alto, CA) byly následující: 95 °C 5 min 1 cyklus; 95 °C 30 s, 72 °C 30 s a 68 °C 45 s 5 cyklů; 95 °C 30 s, 65 °C 30 s a 68 °C 45 s 5 cyklů; 95 °C 30 s, 60 °C 30 s a 68 °C 45 s 25 cyklů. Jeden mililitr této reakční směsi se naředil 50 ml vody a 5 ml tohoto ředěného roztoku se použilo při „nested PCR reakci (95 °C 5 min 1 cyklus; 95 °C 30 s, 65 °C 30 s a 68 °C 45 s 30 cyklů při použití KlenTaq polymerasové směsi) s pro linker specifickým kotvícím primerem a pro gen specifickým 3' primerem na 5' konci počátečního primeru (obr. 6).
B7-20 TTG TTA TCG GTG ACG TCA GTG (SEQ ID NO. 60)
B7-135: CAA TAA CAT CAC CGA AGT CAG G (SEQ ID NO. 61)
Na 1,5% agarózovém gelu se vizualizovalo 20 ml každé reakce a správný fragment se vyříznul z gelu. Odstřeďováním gelového řezu
01-3118-00-Če • · fcfc ·· · · · · · · · • fcfcfc fcfc · · · · · • « · · fc· · fcfc · • ······ fcfc fcfc · · • fc fcfcfcfc fcfcfc fcfc fcfc fcfc · fcfc fcfcfc přes gelový nebulizér a 0,22mm filtr „Micropure (Amicon, Beverly, MA) se z agarózy extrahovala a purifikovala cDNA. Purifikované DNA se následně sekvencovala přímo za použití cyklického sekvencování pomocí barviva jako terminátoru. (Perkin Elmer, Norwalk, CN).
Izolace 3'oblasti CD80
3'oblast genu se odvodila zvolením 5 pro gen specifických primerů z 344 ntd. fragmentu a již sekvencované 5'oblasti:
B7-S220 GTC ATG TCT GGC AAA GTA CAA G (SEQ ID NO. 62)
B7-50 CAC TGA CGT CAC CGA TAA CCA C (SEQ ID NO. 63)
B7-140 CTG ACT TCG GTG ATG ΤΤΆ TTG G
(SEQ ID NO. 64)
B7-550: GCC ATC AAC ACA ACA GTT TCC
(SEQ ID NO. 65)
B7-620: TAT GAC AAA CAA CCA TAG CTT
(SEQ ID NO. 66)
Z konvenčních oblastí humánní a myší CD80 3' UTR se následně zvolily degenerační 3'primery.
B7-1281 G(A/G)A AGA (A/T)TG CCT CAT GA(G/T) CC (SEQ ID NO. 67)
B7-1260 CA(C/T) (A/G)AT CCA ACA TAG GG
01-3118-00-Če
0« 0 • 0 0 «00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 • « 0 0 0 0 0
0 0 000 0 0 0 0 0 0 0 0
• 0 0 0 0 0 0 0 0
00 • 0 0 0 0 • 0 0 0 0
(SEQ ID NO. 68) cDNA se připravila z ENA extrahované pomocí ULTRASPEC extrakčního činidla (Biotexc, Houston TX) z PBMC stimulované již popsaným způsobem pomocí Con A a LPS.
Ukotvený oligo dT primer se použil jako počáteční 3primer pro RNA transkripci na cDNA. PCR reakce na bázi Taq polymerasy se prováděly na této cDNA pomocí specifických 5'primerů a degeneračních 3'primerů (95 °C 5 min 1 cyklus; 95 °c 30 s, 42 °C 30 s a 72 °C 45 s 30cyklů; 72 °C 7 min).
Před připravením jediného segmentu o správné velkosti bylo třeba provést 2 cykly „nested PCR reakcí. Získaný produkt se vyřízl z 1,5% agarózového gelu, purifikoval již popsaným způsobem a cyklicky sekvencoval pomocí terminátoru na bázi barvíva (Perkin Elmer, Norwalk, CN).
Ze sekvenčních dat 5'a 3oblastí se zkonstruovaly primery, které budou amplifikovat oblast kódující celý otevřený čtecí rámec kočičího CD80 genu:
B7 START: ATG GGT CAC GCA GCA AAG TGG (SEQ ID NO. 69)
B7-960: CCT ATG AGA GAA GAG CTA AAG AGG C (SEQ ID NO. 70)
Použila se již dříve připravená PBMC cDNA, o které je známo, že obsahuje DNA kódující uvedený gen. Tato PCR reakce (95 °C 5 min 1 cyklus; 95 °C 30 s, 42 °C 30 s a 72 °C 45 s 30 cyklů; 72 °C 7 min), která jako enzymatický koktejl zachycující určitou 5'exonukleasovou aktivitu použila KlenTaq DNA polymerasu ve snaze
01-3118-00-Če
ΦΦΦ φ φ ** φ · » · redukovat náhodné chyby často spojované s Taq polymerasou. Reakce amplifikovala fragment obsahující 960 bazických párů (bp) , který se nakloňoval do TA klonujícího vektoru (Invitrogen, San Diego, CA) a sekvencoval již popsaným způsobem. Finální sekvence genu obsahoval cDNA ze dvou různých zvířat. Každý bazický pár genu se nezávisle ověřil v alespoň 3 samostatných sekvencích odvozených z jednotlivých PCR reakcí ve snaze redukovat možnost přenosu chyb, které vznikly v rámci PCR reakcí.
Izolace počátečního fragmentu CD28 mRNA se extrahovala z HK5 lymfocytů periferní krve stimulovaných 16 hodin ConA za použití RNAzolB RNA extrakčního činidla (Biotexc, Houston, TX) . Nejprve se z této RNA reakcí reverzní transkryptasy (RT) využívající jako 3'primer oligo dT primer odvodila cDNA. RNA a oligo dT se 3 minuty zahřívaly na 75 °C s cílem odstranit sekundární strukturu. Potom se přidaly RT, dNTP, pufr a destilovaná voda a směs se 1 hodinu inkubovala při 42 °C. Po této inkubaci se vzorek ohřál na 95 “C a při této teplotě udržoval 5 minut ve snaze inaktivovat RT. Degenerační primery odvozené z konvenčních oblastí, které se nacházejí v humánních, myších a králičích CD28 publikovaných sekvencí nukleových kyselin (GeneBank, Bethesda, MD) se potom použily při počáteční amplifikaci 673 ntd fragmentu kódujícího většinu otevřeného čtecího rámce.
CD28-113: CAA CCT TAG CTG CAA GTA CAC (SEQ ID NO. 71)
CD28-768: GGC TTC TGG ATA GGG ATA GG *0 0* *0 0**0 ·· * • 0 · · 0 0 0 «000 • 00« 0« 0 00 ·
00000« 00 0« 0 0 00 0000 000
00 00 0 «0 000
01-3118-00-Če (SEQ ID NO. 72)
Pro amplifikaci produktu se požil PCR protokol s horkým startem, který používá Taq polymerasu (95 °C 5 min lcyklus; 95 °C 30 s, 48 °C 30 s a 72 °C 45 s, 30 cyklů; 72 °C 7 min 1 cyklus) . Tento fragment se následně vizualizoval na 1% agarózovém gelu, ligoval do TA chlorovacího vektoru (InVitrogen, San Diego, CA) a sekvencoval již popsaným způsobem. Ze sekvence cDNA se odvodily specifické 3'primery a syntetizovaly pro použití při 5'RACE reakcích.
CD28-190: CGG AGG TAG AAT TGC ACT GTC C (SEQ ID NO. 73)
CD28-239: ATT TTG CAG AAG TAA ATA TCC (SEQ ID NO. 74)
Izolace 5'oblasti CD28 pro získání zbývající 5'sekvence kočičí CD28 molekuly se použil modifikovaný GIBCO 5'RACE protokol (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). RNA se extrahovala z PBMC stimulované 16 hodin Con A. pro syntézu 1 řetězce cDNA se použil 3'genově specifický primer. RNA a primer se před přidáním dalších RT reakčních činidel ohřívaly 5 minut na 75 °C. Po denaturaci se směs ochladila na 4 °C a přidal se pufr, chlorid horečnatý, dMPP, DTT a SuperScript RT (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). RT směs se inkubovala 30 minut při 42 °C, načež se zahřála na 70 °C a při této teplotě udržovala 15 minut ve snaze denaturovat RT. Potom se přidal RNasový koktejl a reakční směs se 10 minut inkubovala při 55 °C, čímž se odstranila RNA residua a zabránilo se nesprávné
01-3118-00-Če
44 44 44 «444 • 4
• 4 * * 4 4 4 * 4 44
4 4 444 4 4 » 4 4 4 ♦
«4 4 • 4 4 4 4
44 4 4 44 4 44 44
extenzi koncové transferasy (TdT). cDNA se následně purifikovala přes kolonu GlassMax Spin (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) s cílem odstranit nezabudovanou dNTP a primer. Purifikovaná cDNA se následně spojila s TdT. TdT se použila pro zavedení dC paty obsahující 20 až 30 nukleotidů do cDNA. Do směsi purifikované cDNA, chloridu hořečnatého, reakčního pufru a dCTP se po denaturaci cDNA 3 minuty při 95 °C přidal enzym. Reakční směs se 10 minut inkubovala při 37 °C, načež se enzym inaktivoval lOminutovým ohřevem na 70 °C. Patou ukončená cDNA se amplifikovala PCR reakcí s horkým startem na bázi Taq polymerasy (95 °C 5 min; 95 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 45 s 35 cyklů; 72 °C 7 min). Primery pro tuto reakci zahrnovaly 3'primer nacházející se na 5'konci primeru cDNA syntézy a kotvící primer specifický pro dC linker tvořený převážně dG s několika dl residui. 1 ml Této reakční směsi se naředil 50 ml vody a 5 ml tohoto naředěného roztoku se následně použilo při „nested PCR reakci (95 °C 5 min 1 cyklus; 95 °c 30 s, 55 °C 30 s a 72 °C 45 s 30 cyklů při použití KlenTaq polymerasové směsi)s dG/dl 5'kotvícím primerem a dalším upstream genově specifickým 3'primerem. 30 ml „Nested reakce se následně vizualizovalo na 1,5% agarosovém gelu a správný fragment se z gelu extrahoval (obr. 19) . cDNA se purifikovala již popsaným způsobem pomocí gelového nebulizeru Amicon a filtru Micropure (Amicon, Beverly, MA) . Purifikovaný vzorek cDNA se cyklicky sekvencoval pomocí barviva jako terminátoru (Perkin Elmer, Norwalk, CN) . Z ukončených fragmentů se odvodila konvenční sekvence. Z této sekvence se syntetizoval průměrový pár, který zahrnoval celý otevřený čtecí rámec kočičího CD28 genu:
feCD28 5': CGC GGA TCC ACC GGT AGC ACA ATG ATC CTC AGG (SEQ ID NO. 75)
01-3118-00-Če • ·
feCD28 3': CGC GGA TCC TCT GGA TAG GGG TCC ATG TCA G (SEQ ID NO. 76)
Za použití těchto primerů se z Con A stimulovaných EK6 a ED3 PBMC odvozené cDNA amplifikovala cDNA molekula obsahující celou kódující oblast. Na takto připravené PBMC cDNA se demonstrovalo, že obsahuje RNA kódující gen. Tato PCR reakce (95 °C 5 min 1 cyklus; 95 °C 30 s, 42 °C 30 s a 72 °C 45 s 30 cyklů; 72 °C 7 min) používající KlenTaq DNA polymerasu ve snaze redukovat náhodné chyby spojované s Taq polymerasou produkovala 754 bp fragment, který se nakloňoval do TA klonovacího vektoru a sekvencoval již popsaným způsobem. Stejně jako v případě CD80 molekuly bylo každé nukleotidové místo ověřeno alespoň 3 nezávisle odvozenými sekvencemi.
Homologní vektor 902-49.46. Pro účely inzerce cizí DNA do RPV se zkonstruoval plasmid 902-49.46. Tento plasmid zabudovává E.coli β-galaktosidasový (lacZ) markerový gen ohraničený RPV DNA. Cizímu genu předchází přibližně 906 bp fragment RPV DNA. Za cizími geny následuje přibližně 895 bp fragment RPV DNA. Pokud se plasmid použije podle homologního rekombinantního postupu pro generování rekombinantního RPV, potom se získá vir obsahující DNA kódující cizí geny. Je třeba poznamenat, že β-galakto-sidasový (lacZ) markerový gen je řízen pozdním promotorem (LPI) a druhá cizí DNA je zavedena do EcoRI nebo BamHI místa a je řízena pozdním/časným promotorem (LP2EP2). Homologní vektor se zkonstruoval za použití standardních rekombinantních DNA technik (Sambrook a kol.) spojením restrikčních fragmentů z následujících zdrojů se syntetickými DNA sekvencemi. Plasmidový vektor se odvodil z
01-3118-00-Če přibližně 2990 bp Hindlll restrikčního fragmentu pSP64 (Promega). Fragmentem 1 byl přibližně 906 bp Hindlll až Xbal restrikční subfragment RPV Hindlll restrikčního fragmentu U (Knight a kol.). Fragmentem 2 byl přibližně 3010 bp BamHI až PvuII restrikční fragment plasmidu pJF 751 (Ferrari a kol.). Fragmentem 3 byl přibližně 895 bp Xbal až Hindlll subfragment RPV Hindlll fragmentu U. Xbal místa ve fragmentech 1 a 3 se za použití Notl linkerů převedly na unikátní Notl místa.
Homologní vektor 904-63-B7. Homologní vektor 904-63-B7 se použil pro inzerci cizí DNA do RPV. Tento plasmid zabudovává E.coli βgalaktosidasový (lacZ) markerový gen a gag/proteasu viru kočičí imunodeficience (FIV) a env geny ohraničené SPV DNA. Pokud se tento homologní vektor použije podle homologního rekombinantního postupu pro generování rekombinantního SPV, potom se získá vir obsahující DNA kódující cizí geny. Je třeba poznamenat, že β-galaktosidasový (lacZ) markerový gen je řízen syntetickým pozdním neštovicovým promotorem (LPI) a FIV gag/proteasa a env geny jsou řízeny samostatnými, nicméně identickými syntetickými pozdními/časnými neštovicovými promotory (LP2EP2). Kazety FIV gag/proteasy a FIV env promotoru/genu jsou orientovány v opačných směrech, takže transkripce gag/proteasy a env genů probíhá proti sobě, čímž se vylučuje možnost homologní rekombinace mezi identickými promotory. Homologní vektor se zkonstruoval za použití standardních rekombinantních DNA technik (Sambrook a kol.) spojením restrikčních fragmentů z následujících zdrojů s vhodnými syntetickými DNA sekvencemi. Plasmidový vektor se odvodil z přibližně 2972 bp Hindlll restrikčního fragmentu pSP64 (Promega). Fragmentem 1 byl přibližně 1484 bp Bglll až AccI φ φ · β φ φ φ φ φ • φφφφφφ ·· φ φ · «φ φ φ φ φ φ · φφ φφ φφ φ φφ
Ol-3118-OO-Če restrikční subfragment SPV HindlII restrikčního fragmentu M (23). Fragmentem 2 byl přibližně 2580 bp EcoRI až BglII fragment FIV obalového genu syntetizovaného reverzní transkripcí (RT) a polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) (15,42) za použití cDNA z FIV PPR řetězce. Upstream primer (5'-GCCCGGATCCTATGGCAGAAGGGTTTGCAGC-3'; 10/93.21) (SEQ ID NO. 77) se syntetizoval z 5'konce FIV env genu a zavedl Bamtil místo na 5'konci uvedeného genu. Downstrean primer (5'-CCGTGGATCCGGCACTCCATCATTCCTCCTC-3'; 10/
93.20) (SEQ ID NO. 78) se syntetizoval ze 3' konce FIV env genu, zavedl BamHI místo na 3' konec genu a použil se pro reverzní transkripci a polymerázovou řetězovou reakci. PCR Produkt se digeroval BamHI a poskytl fragment obsahující 2580 bazických párů v délce odpovídá-jící FIV env genu. Fragmentem 3 je přibližně 1839 bp EcoRI až BglII fragment FIV gag/proteasový gen syntetizovaný reverzní transkripcí (RT) a polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) (15,42) za použití cDNA z FIV PPR řetězce. Upstream primer (5'-GCGTGAATTCGGGGAATGGACAGGGGCG-GAT-3'; 11/94.9) (SEQ ID
NO. 79) se syntetizoval z 5' konce FIV gag/proteasového genu a zavedl EcoRI místo na 5'konec genu. Downstream primer (5'-GAGCCAGATCTGCTCTTTTTACTTTCCC-3'; 11/94.10) (SEQ ID NO. 80) se syntetizoval z 3'konce FIV gag/proteasového genu a zavedl BglII místo na 3'konec tohoto genu a použil se pro reverzní transkripci a polymerázovou řetězovou reakci. PCR Produkt se digeroval EcoRI a BglII a poskytl fragment obsahující přibližně 1839 bazických párů v délce odpovídající FIV gag/proteasovému genu. Fragmentem 4 je přibližně 3010 bp BamHI až PvuII restrikční fragment plasmidu pJF751 (Ferrari a kol.). Fragmentem 5 je přibližně 2149 bp AccI až HindlII restrikční subfragment SPV HindlII restrikčního fragmentu M. AccI místo ve SPV homologním vektoru se za použití syntetických linkerů převedlo na unikátní Notl místo.
01-3118-00-Če ·· «· ·· · · · · ·· · • 9 · · ·· · · · · · • · · · ·· · · · · • 9999·· · · · · · · • · · · · · · · · • 9 9· · · · · · ··»
Homologní vektor 917-60.B9. Pro účely inzerce cizí DNA do SPV se zkonstruoval plasmid 917-60.B9. Tento plasmid zabudovává E.coli β-galaktosidasový (lacZ) markerový gen a kočičí IFN-γ gen (Onions a kol. (1996); Argyle a kol (1995)) ohraničené SPV DNA. Cizímu genu předchází přibližně 1484 bp fragment SPV DNA. Za cizími geny následuje přibližně 2149 bp fragment SPV DNA. Pokud se plasmid použije podle homologního rekombinantního postupu pro generování rekombinantního SPV, potom se získá vir obsahující DNA kódující cizí geny. Je třeba poznamenat, že β-galaktosidasový (lacZ) markerový gen je řízen promotorem OPI neštovic prasat a kočičí CD28 gen je řízen syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem (LP2EP2). Homologní vektor se zkonstruoval za použití standardních rekombinantních DNA technik (Sambrook a kol.) spojením restrikčních fragmentů z následujících zdrojů. Plasmidový vektor se odvodil z přibližně 2972 bp HindlII až BamHI restrikčního fragmentu pSP64 (Promega). Fragmentem 1 byl přibližně 1484 bp BglII až AccI restrikční subfragment SPV HindlII restrikčního fragmentu M. Fragmentem 2 byl EcoRI až BamlI restrikční fragment syntetizovaný reverzní transkripcí (RT) a polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) za použití RNA z ConA stimulovaných buněk kočičí sleziny jako templátu. Při syntézu kočičího IFN-γ se primer (5'-TCGAGAATTCGATGAATTACACAAGTTTTATTTTCG-3'; 1/97.4) (SEQ ID NO. 81) syntetizoval z 5' konce kočičího IFN-γ genu, zavedl EcoRI místo na 5konci uvedeného genu. Primer (5'-TCG-AGGATCCTTATTTCGATGCTCTACGGCCTC-3'; 1/97.3) (SEQ ID NO. 82) se syntetizoval z 3 konce kočičího IFN-y genu, zavedl BafflHI místo na 3 konec genu a použil se pro reverzní transkripci a polymerázovou řetězovou reakci. PCR produkt se digeroval EcoRI a BamHI a poskytl fragment obsahující 504 bazických párů v délce odpovídající kočičímu IFN-y genu. Fragmentem 3 je přibližně • · · · • · · · • · · ·
01-3118-00-Če
3010 bp BamBI až Pvull restrikční fragment plasmidu pJF751 (Ferrari a kol.). Fragmentem 4 je přibližně 2149 bp AccI až HindlII subfragment SPV HindlII fragmentu M. AccI místo ve fragmentech 1 a 4 se za použití Notl linkerů převedly na unikátní Notl místa.
Homologní vektor 926-76.D7. Pro účely delece části gE kódující oblasti z kočičího herpesviru a inzerce cizí DNA se zkonstruoval plasmid 926-76.D7. Tento plasmid zabudovává kočičí CD80 gen ohraničený FHV DNA. Kočičí CD80 gen je řízen FHV gE promotorem. Homologní vektor je konstruován z označených DNA zdrojů za použití standardních rekombinantních technik (Sambrook a kol.). Plasmidový vektor se odvodil z přibližně 2958 bp Asp718I až Asp718I restrikčního endonukleázového fragmentu pSP!8/19. Fragmentem 1 je přibližně 1415 bp Asp718l až Smál subfragment FHV Sall B fragmentu. Fragmentem 2 je přibližně 879 bp FcoRI až BamHI fragmentu kočičího CD80 genu syntetizovaného klonováním polymerázovou řetězovou reakcí. Templátem pro PCR reakci byla RNA z ConA stimulovaných buněk kočičí sleziny. Upstream primer (5'— TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-35; 1/97.43) (SEQ ID NO. 52) se syntetizoval z 5' konce kočičího CD80 genu a zavedl FcoRI místo. (5 '-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-3 '; 1/97.6) (SEQ ID NO. 53) se syntetizoval ze 3' konce kočičího CD80 genu, zavedl BamBI místo na 3' konec genu a použil se pro reverzní transkripci a polymerázovou řetězovou reakci. Fragmentem 3 je přibližně 2205 bp Sall až Asp718l subfragment FHV FcoRI E fragmentu.
·· · · · · · · · · ·· • · · · · · * · · • ······ · · · · · • · · · · · · · • · · · · · · ·· ·
01-3118-00-Če
Homologní vektor 930-23. Al. Pro inzerce cizí DNA do SPV se zkonstruoval plasmid 930-23.Al. Tento plasmid zabudovává E.coli β-galaktosidasový (lacZ) markerový gen a kočičí CD80 gen ohraničené SPV DNA. Cizím genům předchází přibližně 1484 bp fragment SPV DNA. Za cizími geny následuje přibližně 2149 bp fragment SPV DNA. Pokud se plasmid použije podle homologního rekombinantního postupu pro generování rekombinantního SPV, potom se získá vir obsahující DNA kódující cizí geny. Je třeba poznamenat, že β-galaktosidasový (lacZ) markerový gen je řízen syntetickým pozdním promotorem neštovicovým (LPI) a kočičí CD80 gen je řízen syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem (LP2EP2). Homologní vektor lze zkonstruovat za použití standardních rekombinantních DNA technik (Sambrook a kol.) spojením restrikčních fragmentů z následujících zdrojů. Plasmidový vektor se odvodil z přibližně 2972 bp HindlII až BamHI restrikčního fragmentu pSP64 (Promega). Fragmentem 1 byl přibližně 1484 bp BglII až AccI restrikční subfragment SPV HindlII restrikčního fragmentu M. Fragmentem 2 byl EcoRI až BamlI restrikční fragment syntetizovaný reverzní transkripcí (RT) a polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) za použití RNA z ConA stimulovaných buněk kočičí sleziny jako templátu. Při syntéze kočičího CD80 se primer (5'-TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCA7\AGTGG-3 '; 1/97.43) (SEQ ID NO. 52) syntetizoval z 5Z konce kočičího CD80 genu, zavedl EcoRI místo na 5' konci uvedeného genu. Primer (5'-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-3'; 1/97.6) (SEQ ID NO. 53) se syntetizoval z 3' konce kočičího CD80 genu, zavedl BamHI místo na 3' konec genu a použil se pro reverzní transkripci a polymerázovou řetězovou reakci. PCR produkt se digeroval BcoRI a BamHI a poskytl fragment obsahující přibližně 879 bazických párů v délce odpovídající kočičímu CD80 genu. Fragmentem 3 je • · · · ·» ···· · » • · · · · · · · · · • · · · ·· · ·· • V ··· · · · · ·· 9
9 9 9 9 9 9 9
99 9 9 9 99 9
01-3118-00-Če přibližně 3010 bp Ba/nHI až Pvull restrikční fragment plasmidů pJF751 (Ferrari a kol.). Fragmentem 4 je přibližně 2149 bp AccI až HindlII subfragment SPV HindlII fragmentu M. AccI místo ve fragmentech 1 a 4 se za použití Notl linkerů převedly na unikátní Notl místa.
Homologní vektor 930-26. Al. Pro inzerce cizí DNA do SPV se zkonstruoval plasmid 930-26.Al. Tento plasmid zabudovává E.coli β-galaktosidasový (lacZ) markerový gen a kočičí CD28 gen ohraničené SPV DNA. Cizím genům předchází přibližně 1484 bp fragment SPV DNA. Za cizími geny následuje přibližně 2149 bp fragment SPV DNA. Pokud se plasmid použije podle homologního rekombinantního postupu pro generování rekombinantního SPV, potom se získá vir obsahující DNA kódující cizí geny. Je třeba poznamenat, že β-galaktosidasový (lacZ) markerový gen je řízen syntetickým pozdním neštovicovým promotorem (LPI) a kočičí CD28 gen je řízen syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem (LP2EP2). Homologní vektor lze zkonstruovat za použití standardních rekombinantních DNA technik (Sambrook a kol.) spojením restrikčních fragmentů z následujících zdrojů. Plasmidový vektor se odvodil z přibližně 2972 bp HindlII až BamHI restrikčního fragmentu pSP64 (Promega). Fragmentem 1 byl přibližně 1484 bp BglII až AccI restrikční subfragment SPV HindlII restrikčního fragmentu M. Fragmentem 2 byl FcoRI až BamlI restrikční fragment syntetizovaný reverzní transkripcí (RT) a polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) za použití RNA z ConA stimulovaných buněk kočičí sleziny jako templátu. Při syntéze kočičího CD28 se primer (5'-GATGAATTCCATGATCCATGATCCTCAGGCTGGGCTTCT-3'; 7/97.1) (SEQ ID NO. 54) syntetizoval z 5' konce kočičího • · • · · · • · • *
01-3118-00-Če
CD28 genu, zavedl BcoRI místo na 5' konci uvedeného genu. Primer (5'-GATCAGATCTCAGGAACGGTATGCCGCAA-3'; 7/97.2) (SEQ ID NO. 55) se syntetizoval z 3' konce kočičího CD28 genu, zavedl BamHI místo na 3' konec genu a použil se pro reverzní transkripci a polymerázovou řetězovou reakci. PCR produkt se digeroval BcoRI a BamHI a poskytl fragment obsahující přibližně 666 bazických párů v délce odpovídající kočičímu CD28 genu. Fragmentem 3 je přibližně 3010 bp BamHI až PvuII restrikční fragment plasmidu pJF751 (Ferrari a kol.). Fragmentem 4 je přibližně 2149 bp AccI až HindlII subfragment SPV HindlII fragmentu M. AccI místo ve fragmentech 1 a 4 se za použití Notl linkerů převedly na unikátní Notl místa.
Homologní vektor 931-21.Al. Pro inzerce cizí DNA do SPV se zkonstruoval plasmid 931-21.Al. Tento plasmid zabudovává E.coli β-glukuronidasový (uidA) markerový gen a kočičí CD80 gen ohraničené SPV DNA. Pokud se homologní vektor použije podle homologního rekombinantního postupu pro generování rekombinantního SPV, potom se získá vir obsahující DNA kódující cizí geny. Je třeba poznamenat, že β-glukuronidasový (uidA) markerový gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem (EP2) a kočičí CD80 gen je řízen syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem (LP2EP2). Homologní vektor se zkonstruoval za použití standardních rekombinantních DNA technik (Sambrook a kol.) spojením restrikčních fragmentů z následujících zdrojů s vhodnými syntetickými DNA sekvencemi. Plasmidový vektor se odvodil z přibližně 2700 bp Dral restrikčního fragmentu PNEB193 (New England Biolabs). Fragmentem 1 byl přibližně 881bp Dral až BcoRI restrikční subfragment SPV HindlII fragmentu K. Fragmentem 2 byl
4 4 4 4 4 · 4 4 • ····♦· 4 · « » « • · 4 4 4 4 4 4
4 4« 4 · 4 4 4 4
01-3118-00-Če přibližně 879 bp EcoRI až BamlI fragment kočičího CD80 genu syntetizovaný klonováním s polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) za použití RNA z ConA stimulovaných buněk kočičí sleziny jako templátu. Upstream primer (5'-TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3 '; 1/97.43) (SEQ ID NO. 52) se syntetizoval z 5' konce kočičího CD80 genu, zavedl EcoRI místo. Downstream primer (5'-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-3'; 1/97.6) (SEQ ID NO. 53) se syntetizoval z
3' konce kočičího CD80 genu, zavedl BamHI místo na 3' konec genu a použil se pro reverzní transkripci a polymerázovou řetězovou reakci. Fragmentem 3 je přibližně 1823 bp EcoRI až Smál restrikční fragment plasmidu pRAJ260 (Clontech). Fragmentem 4 je přibližně 994 bp EcoRI až Dral restrikční subfragment SPV Hindlll fragmentu K. EcoRI místo v SPV homologním vektoru se za použití syntetických linkerů převedly na unikátní Notl místa.
Homologní vektor 931-22. Al. Pro inzerce cizí DNA do RPV se zkonstruoval plasmid 931-22.Al. Tento plasmid zabudovává kočičí CD80 gen ohraničený RPV DNA. Upstream cizího genu je přibližně 906 bp fragment RPV DNA. Downstream cizích genů je přibližně 895 bp fragment RPV DNA. Pokud se plasmid použije podle homologního rekombinantního postupu pro generování rekombinantního RPV, potom se získá virus obsahující DNA kódující cizí geny. Je třeba poznamenat, že kočičí CD80 gen je řízen syntetickým pozdním/časným promotorem (LP2EP2). Homologní vektor se zkonstruoval za použití standardních rekombinantních DNA technik (Sambrook a kol.) spojením restrikčních fragmentů z následujících zdrojů s vhodnými syntetickými DNA sekvencemi. Plasmidový vektor se odvodil z přibližně 2999bp Hindlll restrikčního fragmentu pSP64 (Promega). Fragmentem 1 byl přibližně 906bp Hindlll až Xbal
01-3118-00-Če restrikční subfragment RPV HindlII restrikčního fragmentu U (Knight a kol.). Fragmentem 2 byl přibližně 879 bp BcoRI až BamlI fragment kočičího CD80 genu syntetizovaný klonováním s polymerasovou řetězovou reakcí. Templátem pro PCR reakci byla RNA z ConA stimulovaných buněk kočičí sleziny. Upstream primer (5 '-TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-31/97.43) (SEQ ID NO. 52) se syntetizoval z 5' konce kočičího CD80 genu, zavedl BcoRI místo. Downstream primer (5'-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-3 ' ; 1/97.6) (SEQ ID NO. 53) se syntetizoval z 3' konce kočičího CD80 genu, zavedl BamHI místo na 3' konec genu a použil se pro reverzní transkripci a polymerázovou řetězovou reakci. Fragmentem 3 je přibližně 895bp Xbal až HindlII subfragment RPV HindlII fragmentu U. Xbal místa ve fragmentech 1 a 3 se za použití Notl linkerů převedly na unikátní Notl místa. Syntetická DNA mezi fragmentem 2 a 3 obsahovala LP2EP2 promotor a BcoRI místo a BamHI místo pro inzerci cizí DNA.
Homologní vektor 931-32. A5. Pro inzerce cizí DNA do RPV se zkonstruoval plasmid 931-32.A5. Tento plasmid zabudovává kočičí CD80 gen a E. coli (-galaktosidasový (lacZ) markerový gen ohraničené RPV DNA. Upstream cizích genů je přibližně 906 bp fragment RPV DNA. Downstream cizích genů je přibližně 895 bp fragment RPV DNA. Pokud se plasmid použije podle homologního rekombinantního postupu pro generování rekombinantního RPV, potom se získá virus obsahující DNA kódující cizí geny. Homologní vektor se zkonstruoval za použití standardních rekombinantních DNA technik (Sambrook a kol.) spojením restrikčních fragmentů z následujících zdrojů se syntetickými DNA sekvencemi. Plasmidový vektor se odvodil z přibližně 2999bp HindlII restrikčního • ΦΦΦ φφ φ » φ φ φφφφ · φ φ φφφφ φ φ φ φ φ φφφφφ φ φ * · φφφφ φφ φφ φφ φφ φ φφ ·
Ol-3118-OO-Če fragmentu pSP64 (Promega). Fragmentem 1 byl přibližně 906bp HindlII až Xbal restrikční subfragment RPV HindlII restrikčního fragmentu U (Knight a kol.). Fragmentem 2 byl přibližně 879 bp EcoRI až BamlI fragment ' kočičího CD80 genu syntetizovaný klonováním s polymerázovou řetězovou reakcí. Templátem pro PCR reakci byla RNA z ConA stimulovaných buněk kočičí sleziny. Upstream primer (5 '-TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3'; 1/97.43) (SEQ ID NO. 52) se syntetizoval z 5' konce kočičího CD80 genu, zavedl EcoRI místo. Downstream primer (5'-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-31/97.6) (SEQ ID NO. 53) se syntetizo-val z 3' konce kočičího CD80 genu, zavedl BamHI místo na 3' konec genu a použil se pro reverzní transkripci a polymerázovou řetězovou reakci. Fragmentem 3 je přibližně 3010bp BamHI až PvuII restrikční fragment plasmidu pJF751 (Ferrari a kol.). Fragmentem 4 je přibližně 895bp Xbal až HindlII subfragment RPV ífincřlll fragmentu U. Xbal místa ve fragmentech 1 a 4 se za použití Notl linkerů převedly na unikátní Notl místa.
Homologní vektor 931-55.B12. Pro inzerce cizí DNA do SPV se použil homologní vektor 931-55.B12. Tento homologní vektor zabudovává E. coli (-glukuronidázový (uídA) markerový gen a kočičí IFN-γ gen (Onions a kol., (1996); Argyle a kol. (1995)) ohraničené SPV DNA. Pokud se tento homologní vektor použije podle homologního rekombinantního postupu pro generování rekombinantního SPV, potom se získá virus obsahující DNA kódující cizí geny. Je třeba poznamenat, že (-glukuronidasový (uídA) markerový gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem (EP2) a kočičí IFN-γ gen je řízen samostatným a unikátním syntetickým pozdním/ časným neštovicovým promotorem (LP2EP2).
•9 * to·φ • ·
01-3118-00-Če
Homologní vektor se zkonstruoval za použití standardních rekombinantních DNA technik (Sambrook a kol.) spojením restrikčních fragmentů z následujících zdrojů s vhodnými syntetickými DNA sekvencemi. Plasmidový vektor se odvodil z přibližně 2700bp Dral restrikčního fragmentu PNEB193 (New England Biolabs). Fragmentem 1 byl přibližně 881bp Dral až EcoRl restrikční subfragment SPV HindlII fragmentu K. Fragmentem 2 byl BcoRI až BamHI restrikční fragment syntetizovaný reverzní transkripcí a polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) za použití RNA z ConA stimulovaných buněk kočičí sleziny jako templátu. Při syntéze kočičího IFN-γ zavedl upstream primer (5'TCGAGAATTCGATGAATTACACAA-GTTTTATTTTCG-3'; 1/97.4) (SEQ ID NO. 81) syntetizovaný z 5' konce kočičího IFN-γ genu BcoRI místo na 5' konec genu. Primer (5'-TCGAGGATCCTTATTTCGATGCTCTACGGCCTC-3'; 1/97.3) (SEQ ID NO. 82) se syntetizoval z 3' konce kočičího IFN-γ genu, zavedl BamHI místo na 3' konec genu a použil se pro reverzní transkripci a polymerázovou řetězovou reakci. PCR produkt se digeroval EcoRl a BamHI, čímž se získal fragment o délce přibližně 504 bazických párů, která odpovídala kočičímu IFN-γ genu. Fragmentem 3 je přibližně 1823bp BcoRI až Smál restrikční fragment plasmidu pRAJ260 (Clonetech). Fragmentem 4 je přibližně 994bp EcoRl až Dral restrikční subfragment SPV HindlII restrikčního fragmentu K. EcoRl místo ve SPV homologním vektoru se za použití syntetických linkerů převedlo na unikátní Notl místo.
Homologní vektor 846-88.B17. Pro účely delece celé gE kódující oblasti z kočičího herpesviru a inzerce cizí DNA se sestrojil plasmid 846.88.B17. Tento plasmid zabudovává E. coli (-
• · •φ *·φφ
φ φ φ φ φ φ φ φ φ
01-3118-00-Če galaktosidasový (lacZ) markerový gen inzerovaný do FHV gE vypuštěného místa ohraničeného HV DNA. Plasmid 846-88.B17 obsahuje 1638bp deleci gE genu ze Smál místa v FHV Sall B fragmentu až Sall místě v FHV FcoRI E fragmentu. Smál místo v FHV Sall B fragmentu a Sall místo v FHV EcoRI E fragmentu definují koncové body delece gE genu. Upstreamem cizího genu je přibližně 1415bp Asp718 až Sami subfragment FHV Sall B obsahující celou kódující sekvenci gl genu (370 aminokyselin). Downstreamem cizího genu je přibližně 2205bp Sall až Asp 718 subfragment FHV FcoRI E fragmentu, který obsahuje unikátní krátkou a koncovou opakující se sekvenci. Pokud se plasmid použije podle homologního rekombinantního postupu pro generování rekombinantního RPV, SPV nebo FHV, potom bude výsledkem vir obsahující DNA kódující cizí gen. Je třeba poznamenat, že E. coli lacZ gen je řízen konstitutivním FHV gE promotorem. Homologní vektor se zkonstruoval za použití standardních rekombinantních DNA technik (Sambrook a kol.).
Homologní vektor 921-65.B5. Pro účely delece SPV 15L genu (přibližně 237 bp) a inzerce cizí DNA do SPV se zkonstruoval homologní vektor 921-65.B5. Tento homologní vektor zabudovává E. coli (-galaktosidázový (LacZ) markerový gen a kočičí FeLV (virus kočičí leukémie) gag/proteasový a env gen ohraničené SPV DNA. Pokud se tento homologní vektor použije podle homologního rekombinantního postupu pro generování rekombinantního RPV, SPV nebo FHV, potom se získá virus obsahující DNA kódující cizí geny. Homologní vektor se zkonstruoval za použití standardních rekombinantních DNA technik (Sambrook a kol.). Je třeba poznamenat, že (-galaktosidasový (lacZ) markerový gen je řízen • · » » ♦ 9 • · · 9 9 • 99 9 9 9
9 9 9 9 ·· · ·· · (I5L) a distínkčními ·· • · · · • · · · • · ··· · • · · ·· ··
01-3118-00-Če konstitutivním časným neštovicovým promotorem FeLVgag/proteasový a FeLV env gen jsou řízeny syntetickými časnými neštovicovými promotory EP2, resp. EP1. SPV sekvence ohraničující cizí genové inzerce se odvodila z 3,2kb Hindlll N genomového fragmentu. Upstreamovou sekvencí cizích genů byl 903bp fragment obsahující část SPV 14L genu a downstreamovou sekvencí byl 966bp fragment obsahující část SPV 16L genu. Otevřené čtecí rámce E. coli lacZ genu, FeLV env a FeLVgag/proteasy probíhaly stejným směrem vzhledem k SPV 16L a SPV 14L genům.
Homologní vektor 942-03.C6. Pro účely delece částí gE kódující oblasti z kočičího herpesviru a inzerce tří cizích genů do gE vypuštěného místa se sestrojil plasmid 942-03.C6. Tento plasmid zabudovává kočičí CD80 gen (-879 bp) a FlVgag/proteasový gen (-1800 bp) a FIV env gen (-2600 bp) ohraničené FHV DNA. Kočičí CD80 gen se řídil FHV gE promotorem; FlVgag/proteasový gen je řízen gX promotorem pseudovztekliny. a FlVenv gen je řízen cytomegalovirovým bezprostředně předcházejícím genem. Upstreamem cizích genů je přibližně 1415bp Asp718 až Sami subfragment FHV Sall B fragmentu). Downstreamem cizích genů je přibližně 2205bp Sall až Asp 718 subfragment FHV EcoRI E fragmentu, který obsahuje unikátní krátkou a koncovou opakující se sekvenci. Pokud se plasmid použije podle homologního rekombinantního postupu pro generování rekombinantního RPV, SPV nebo FHV, potom bude výsledkem vir obsahující DNA kódující cizí gen. Homologní plasmid 942-03.C6 se zkonstruoval za použití standardních rekombinantních DNA technik (Sambrook a kol.).
fc· · · • · · · · · · ·« ······ · · « · « • · · · · · « * ·· * · · · · ·· ·
01-3118-00-Če
Příklady provedení vynálezu
Příklad IA
Klonování kočičí CD80 (B7-1)-TAMU, CD80 (B7-1)-SPAH, C86 (B7-2), CD28 a CTLA-4 cDNA:
Kočičí CD80 (B7-1), C86 (B-7-2), CD28 a CTLA-4 cDNA se klonovaly nejprve RT-PCR (reverzní transkriptasovou/polymerasovou řetězovou reakcí) amplifikaci oblasti mezi dvěma sekvencemi, které se konzervují tak, že vytvoří degenerační primery, které vzájemně působí na kočičí mRNA. Zdrojem mRNA byly jednojaderné buňky periferní krve (PBMC) nebo splenocyty stimulované alespoň 16 hodin Con A. Tento PCR produkt se sekvencoval. Sekvence se použila pro přípravu primerů pro RACE (rychlou amplifikaci cDNA konců)PCR. 5'Konec se amplifikoval tak, e se nejprve připravila cDNA s downstream primerem komplimentárním k nově sekvencované konzervované oblasti. Oligonukleotid se ligoval na 3'konec cDNA (doplněk k 5'konci mRNA). Tato sekvence sloužila jako vazebné místo pro upstream primer, který byl PCR kompatibilní s downstream PCR primerem, který odpovídal další oblasti v nově sekvencované oblasti. Degenerační primery se použily v množině běhů „nested reakcí vedoucí k získání 3'konce. Tento upstream primer pro PCR byl navržen tak, aby reagoval se sekvencí v nově sekvencované oblasti. Produkty se sekvencovaly buď přímo nebo se klonovaly do TA klonovacího vektoru a sekvencovaly z plasmidu. Celý otevřený čtecí rámec se klonoval PCR amplifikaci jako celek s primery konstruovanými ze známých sekvencí. ORFs se klonovaly a sekvencovaly 3x. B7-1 ORF se subklonoval do pSI plasmidu s SV40 promotorem a do SFV plasmidu. pSI se použil k zajištění funkční interakce mezi B7-1 a kočičím CD28.
-·«
9 999 9999 999 • · · · · · « 9 ♦♦ 99 99 9 99
01-3118-00-Če
DNA primery použitými pro RT/PCR kočičí CD80 (B7-1) cDNA byly:
5' Primer: 5'-CGCGGATCCGCACCATGGGTCACGCAGCAAAGTGGAAAAC-3';
(SEQ ID NO. 11)
3' Primer: 5'-CCTAGTAGAGAAGAGCTAAAGAGGC-3'; (SEQ ID NO. 12) (Viz výše kompletní seznam primerů pro kočičí CD80 cDNA.)
DNA primery použitými pro RT/PCR kočičí CD28 cDNA byly:
5' Primer: 5'-CGCGGATCCACCGGTAGCACAATGATCCTCAGG-3';
(SEQ ID NO. 13)
3' Primer: 5'-CGCGGATCCTCTGGATAGGGGTCCATGTCAG-3'; (SEQ ID NO: 14) (Viz výše kompletní seznam primerů pro kočičí CD28 cDNA.)
DNA primery použitými pro RT/PCR kočičí CTLA-4 cDNA byly:
1. Degenerační primery pro první PCR produkt (672 bp) :
Deg 5' P: 5'-ATGGCTT(C)GCCTTGGATTT(C)CAGC(A)GG-3 ' ;
(SEQ ID NO. 15)
Deg 3' P: 5'-TCAATTG(A)ATG(A)GGAATAAAATAAGGCTG-3 ';
(SEQ ID NO. 16) • · ·· 0« • · · · · « • 0 · « · ♦ • · · ·· · · · · • » · » · 9
99 99 9
01-3118-00-Če • · • ·
9
2. 5' a z CTLA-4 (455 bp) : Degenerační, gen-specifické (GSP) a „nested gen-specifické (NGSP) primery:
První kolo PCR:
Deg 5' P: 5'-TGTTGGGTTTC(T)G(A)CTCTG(A)CTT(C)CCTG-3';
(SEQ ID NO. 17)
3' GSP: 5'-GCATAGTAGGGTGGTGGGTACATG-3'; (SEQ ID NO. 18) „Nested PCR s PCR produktem z prvního kola:
Deg 5' P: 5'-TGTTGGGTTTC(T)G(A)CTCTG(A)CTT(C)CCTG-3';
(SEQ ID NO. 19)
3' NGSP: 5'-ACATGAGCTCCACCTTGCAG-3'; (SEQ ID NO. 20)
3. 3' konec CTLA-4: Adaptor primer 1 (API, Clontech Lab, lne., Palo Alto, CA) ; „Nested adaptor primer (AP2, Clontech Lab) , genově-specifický primer (GSP) a „nested genový specifický primer (NGSP):
3' RACE PCR:
API: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'; (SEQ ID NO. 21)
5' GSP: 5'-GTGAATATGGGTCTTCAGGCAATG-3'; (SEQ ID NO. 22)
3' Nested RACE PCR s produktem 3' RACE PCR:
AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3'; (SEQ ID NO. 23)
5' NGSP: 5'-GAAATCCGAGTGACTGTGCTAG-3'; (SEQ ID NO. 24)
4. Primer pro celý CTLA-4 gen
01-3118-00-Če ' Primer: 5'-AACCTGAACACTGCTCCCATAAAG-3';
• 4 «· • · · 4 * · 4 • 4 4 4 4 4 4 «44444 4 4 • 4 4 4 4 4
44 44 «
4 · « «
4« 4
Kočičí CTLA-4
(SEQ ID NO. 25)
Kočičí CTLA-4
(SEQ ID NO. 2 6)
' Primer: 5 ' -GCCTCAGCTCTTAGAAATTGGACAG-3' ;
DNA primery použitými pro RT/PCR kočičí CD86 (B7-2) cDNA byly:
1. Degenerační primery pro první PCR produkt (423 bp):
Deg 5' P: 5'-TAGTATTTTGGCAGGACCAGG-3'; (SEQ ID NO. 27)
Deg 3' P: 5'-CTGTGACATTATCTTGAGATTTC-3'; (SEQ ID NO. 28)
2. Degenerační primery pro druhý PCR produkt (574 bp)
Deg 5' P: 5'-GA(G)CA(T)GCACT(A)ATGGGACTGAG-3'; (SEQ ID NO. 29)
Deg 3' P: 5'-CTGTGACATTATCTTGAGATTTC-3'; (SEQ ID NO. 30)
3. 5' konec CD86: API, AP2 (Clontech Lab); Degenerační 3'-genově specifický (GSP) a 3'- „nested gene-specifický (NGSP) primer:
5' RACE PCR:
API: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'; (SEQ ID NO. 31)
3' GSP: 5'-TGGGTAACCTTGTATAGATGAGCAGGTC-3'; (SEQ ID NO: 32) „Nested 5' RACE PCR s PCR produktem 5' RACE:
AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3'; (SEQ ID NO. 33)
3' NGSP: 5'-CAGGTTGACTGAAGTTAGCAAGCAC-3'; (SEQ ID NO. 34)
4. 3' konec B7-2: API, AP2, 5' GSP a 5' NGSP:
• · ·»· fcfc « · fcfc · ·· · · * fc fcfc ··» ·· fcfc · fcfc fc
01-3118-00-Če
3' RACE PCR:
API: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'; (SEQ ID NO. 35)
GSP: 5'-GGACAAGGGCACATATCACTGTTTC-3'; (SEQ ID NO. 36) „Nested 3' RACE PCR s PCR produktem 3' RACE:
AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3(SEQ ID NO. 37)
5' NGSP: 5'-CAGTGCTTGCTAACTTCAGTCAACC-3'; (SEQ ID NO. 38)
Celý CD86 gen:
Kočičí (SEQ ID B72 NO. (1) 39) 5' Primer: 5'-CGGGAATGTCACTGAGCTTATAG-3 ';
Kočičí B72 (1176) 3' Primer: 5'-GATCTTTTTCAGGTTAGCAGGGG-3 ';
(SEQ ID NO. 40)
Příklad IB
Klonování CD80 (B7-1)- -Syntro/SPAH, Plasmid 917-19-8/16
Buňky kočičí slinivky se extrahovaly z koček a kultivovaly 5 hodin s Concanavalinen A. potom se buňky peletovaly, propláchly PBS a použily k izolaci celé RNA. (Qiagen Rneasy Total RNA System). Na celou RŇA se působilo DNAse I (Boehringer Mannheim) ve snaze odstranit DNA kontaminací z RNA přípravků. Z těchto přípravků se následně extrahovala mRNA za použití Qiagen's Oligotex perliček (Santa Clara, CA) a rychlých kolon. cDNA se generovala z mRNA v přítomnosti nahodilých hexamerů, dMTPs, RNAsin, reverzní transkryptasy (Promega) a reverzního • · • · • · ·
01-3118-00-Če transkryptasového pufru (Promega) a 30 minut inkubovala při 42 °C. PCR se následně použila pro generování dvojité šroubovice cDNA klonu kočičího B7-1 otevřeného čtecího rámce v celé jeho délce za použití smyslového primeru 5/97.50 (5'ATGGGTCACGCAGCAAAGTG-3'); (SEQ ID NO. 41) a protismyslový primer 5/97.51 (5'-CTATGTAGACAGGTGAGATC-3'); (SEQ ID NO. 42), dNTPs, B71 cDNA (1. řetězec) MgSO4 „vent polymerasa (BRL) a „vent polymerasový pufr (BRL). PCR podmínky byly následující: 1 cyklus 94 °C, 15 s; 35 cyklů 94 °C 30 s, 48 °C 2 min, 72 °C 2 min; 1 cyklus 72 °C 10 min. PCR reakce probíhaly na 1% nízkotavném agarosovém gelu a DNA fragmenty odpovídající očekávané velikosti B7-1 ORF se izolovaly, gelově purifikovaly (Qiagen's Gel Purification Kit, Santa Clara, CA) a klonovaly do pCR-BLUNT plasmidového vektoru za použití kitu reagencii z Invitrogen's Zero Blunt PCR Cloning Kit (San Diego, CA).
DNA extrahovaná z kanamycinově resistentních bakterálních koloniích se „prescreenovaly na přítomnost unikátního Nhel místa (obsaženého v kočičí CD80 (B7-1)-TAMU). Inzerty, které se nacházely v rozmezí velikosti 800 až 900 bp a obsahovaly Nhel místo se sekvencovaly za použití ABI fluorescenčních automatizovaných sekvenčních protokolů a zařízení (Perkin-EmlerCetus; Applied Biosystems, lne.).
Plasmidový vektor a B7-1 genově specifické primery, které se odvodily z již klonovaného B7-1 genu se použily pro generování DNA sekvence pCR-Blunt primerů 1/97.36 (5 '-CAGGAAACAGCTATGAC-3') ; (SEQ ID NO. 43) a 1/97.37 (5'-AATACGACTCACTATAGG-3'); (SEQ ID NO. 44).
01-3118-00-Če ·· 9 9 ·· 9 9 9 9 · · 9 • 9 9 · 99 9 9 9 9 9
9999 9 9 9 99 9
999999 99 99 9 9
9999 999 • 9 99 99 9 99 999
B7-1 genově specifickými primery jsou: 12/96.22 (5'-AACACCATTTCATCATCCTTT-3') ; (SEQ ID NO. 45), 1/97.33 (5'-ATACAAGTGTATTTGCCATTGTC-3'); (SEQ ID NO. 46), 12/96.20 (5'-AGCTCTGACCAATAACATCA-3'); (SEQ ID NO. 47), 12/96.21 (5'-ATTAGAAATCCAGTTCACTGCT-3'); (SEQ ID NO. 48), 1/97.32 (5'-TCATGTCTGGCAAAGTACAAG-3'); (SEQ ID NO. 49), 11/96.32 (5'-ATTCACTGACGTCACCGA-3') ; (SEQ ID NO. 50), 11/96.31 (5'-AAGGCTGTGGCTCTGA-3'); (SEQ ID NO. 51). Určily se dva klony, které obsahovaly celou délku CD80 sekvence odpovídající původní CD80 sekvenci s výjimkou dvou DNA bodových mutací. Jedna z těchto bodových mutací neovlivnila aminokyselinovou sekvenci. Druhá mutace způsobila změnu aminokyselin z leucinu na isoleucin. Byl navržen výsledný kočičí CD80 klon 917-19.8/16. (CD80Syntro/SPAH).
Příklad 2
S-SPV-229 je virus neštovic prasat, který exprimuje alespoň dva cizí geny. Gen pro E. coli β-galaktosidasu(lacZ) a gen pro kočičí CD80 se inzerovaly do SPV AccI místa ve větším BglII až HindlII subfragmentu SPV genomového fragmentu HindlII M (unikátní Notl restrikční místo nahradilo unikátní AccI restrikční místo). Gen pro lacZ je řízen syntetickým pozdním promotorem (LPI) a kočičí CD80 gen je řízen syntetickým pozdním/časným promotorem (LP2EP2).
S-SPV-229 se odvodil z S-SPV-001 (Kasza Strain). Tento virus se získal za použití homologního vektoru 913-23.Al (viz materiály a metody) a viru S-SPV-001 homologickým rekombinantním postupem pro generování rekombinantního SPV. Transfekční zásobní surovina • · · · • · · · · · · • · · ·
01-3118-00-Če se screenovala s cílem nalézt rekombinantní SPV exprimující β-galaktosidasu (Bluogal a CPRG testy). Konečným výsledkem purifikace červeného plaku byl rekombinantní virus označený jako S-SPV-229. U tohoto viru se provedla analýza na β-galaktosídasovou expresi, čistotu a stabilitu inzertu množinou pasáží monitorovaných testem modrým plakem a testem černým plakem vakcíny, které byly již popsány v části materiály a metody. Po počátečních třech kolech purifikace se všechny plaky prohlédly , přičemž modré zabarvení naznačilo, že virus je stabilní, čistý a že exprimuje β-galaktosidasu (patent US 5,382,425).
U S-SPV-229 viru se provedla analýza na expresi β-galaktosidásově specifických antigenů screenováním černého plaku s cílem nalézt v rekombinantním SPV expresi cizího genu. Ukázalo se, že monoklonální látka β-galaktosidasy reaguje specificky s plaky SSPV-229 a nikoliv s negativními kontrolními plaky S-SPV-001. Všechny pozorované S-SPV-229 plaky reagovaly s monoklonální protilátkou β-galaktosidasy, což naznačilo, že virus stabilně exprimoval β-galaktosidasový cizí gen. Zde popsané testy se prováděly v ESK-4 buňkách, které jak se ukázalo jsou vhodným substrátem pro produkci SPV rekombinantních vakcín.
U S-SPV-229 se provedla analýza, která měla určit expresi pro kočičí CD80 gen specifických antigenů. Při tomto testu se screenovala kočičí rekombinantním SPV,
CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2) exprese v RPV nebo FHV za použití testu s černým plakem. Ukázalo se, že humánní CTLA-4/Fc chimérická protilátka reaguje specificky s plaky S-SPV-229 (exprimujícími kočičími CD80) a nikoliv s negativními kontrolními plaky S-SPV-001. Ukázalo se že, všechny pozorované S-SPV-229 plaky reagují s ·· · · ···· · · · ··· · · · ···· ··· · · · · · 9 ······ · 9 ·· 9 · • · · · · 9 9 9 ·· ·· 9 ·· 999
01-3118-00-Če humánní CTLA-4/Fc chimérickou protilátkou, což naznačilo, že virus stabilně exprimuje kočičí CD80 cizí gen.
Ve snaze potvrdit expresi kočičího CD80 genového produktu se buňky infikovaly S-SP/V-229 virem a vzorky infikovaných buněčných lysátů se podrobily SDS-polyakrylamidové gelové elektroforéze. Gel se blotoval a analyzoval za použití Westernového přenosu.
S-SPV-229 je použitelný jako vakcína proti chorobám koček. S-SPV-229 zvyšuje účinnost vakcín proti FIV, FeLV, FIP nebo dalším onemocněním, pokud se použije samostatně nebo v kombinací s FIV, FeLV, FIP nebo dalšími kočičímu vakcínami. S-SPV-229 je rovněž použitelný při expresi kočičího CD80 polypeptidu. Buněčný lysát S-SPV-229 infikovaných buněk se injektuje do těla myší nebo králíků ve snaze vytvořit polyklonální monospecifické protilátky kočičího CD80.
Příklad 3
S-SPV-230 je virus neštovic prasat, který exprimuje alespoň dva cizí geny. Gen pro E. coli β-galaktosidasu (lacZ) a gen pro kočičí CD28 se inzerovaly do SPV AccI místa ve větším BglII až Binc/III subfragmentu SPV genomového fragmentu HindlII M (unikátní Notl restrikční místo nahradilo unikátní AccI restrikční místo). Gen pro lacZ je řízen syntetickým pozdním promotorem (LPI) a kočičí CD28 gen je řízen syntetickým pozdním/časným promotorem (LP2EP2) .
S-SPV-230 se odvodil z S-SPV-001 (Kasza Strain). Tento virus se získal za použití homologního vektoru 913-26.Al (viz materiály a metody) a viru S-SPV-001 homologním rekombinantním postupem pro
01-3118-00-Če pro generování rekombinantního SPV. Transfekční zásobní surovina se screenovala s cílem nalézt rekombinantní SPV exprimující β-galaktosidasu (Bluogal a CPRG testy). Konečným výsledkem purifikace červeného plaku byl rekombinantní virus označený jako
S-SPV-230, tohoto viru se provedla analýza na β-galaktosidasovou expresi, čistotu a stabilitu inzertu množinou pasáží monitorovaných testem modrým plakem, který byl již popsán v části nazvané Materiály a metody. Po počátečních třech kolech purifikace se všechny plaky prohlédly, přičemž modré zabarvení naznačilo, že virus je stabilní, čistý a že exprimuje cizí gen.
U S-SPV-230 se provedla analýza, která měla určit expresi pro kočičí CD28 gen specifických antigenů. Při tomto testu se screenovala exprese cizího genu v rekombinantním SPV za použití testu s černým plakem. Popsané testy se prováděly v ESK-4 buňkách, což naznačuje, že ESK-4 buňky budou vhodným substrátem pro produkci SPV rekombinantních vakcín.
Ve snaze potvrdit expresi kočičího CD28 genového produktu se buňky infikovaly S-SPV-230 virem a vzorky infikovaných buněčných lysátů se podrobily SDS-polyakrylamidové gelové elektroforéze. Gel se blotoval a analyzoval za použití Westernového přenosu.
S-SPV-230 je použitelný jako vakcína proti chorobám koček. S-SPV-230 zvyšuje účinnost vakcín proti FIV, FeLV, FIP nebo dalším onemocněním, pokud se použije samostatně nebo v kombinaci s FIV, FeLV, FIP nebo dalšími kočičími vakcínami. S-SPV-230 je rovněž použitelný při expresi kočičího CD28 polypeptidu. Buněčný lysát S-SPV-230 infikovaných buněk se injektuje do těla myší nebo králíků ve snaze vytvořit polyklonální monospecifické protilátky kočičího CD28.
01-3118-00-Če ·· ·· 9» ···· · · · « · · · 9 9 · · · * · • 9 9 · · 9 9 9 9 9
999999 99 99 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 ·· · · ·« · ·· ··«
Přiklad 4
S-SPV-225 je virus neštovic prasat, který exprimuje alespoň dva cizí geny. Gen pro E. coli β-galaktosidasu (lacZ) a gen pro kočičí interferon-γ (kočičí IFN-γ se inzerovaly do SPV AccI místa ve větším BglII až HindlII subfragmentu SPV genomového fragmentu HindlII M (unikátní Notl restrikční místo nahradilo unikátní AccI restrikční místo). Gen pro lacZ je řízen 01L promotorem neštovic prasat a kočičí IFN-γ gen je řízen syntetickým pozdním/časným promotorem (LP2EP2).
S-SPV-225 se odvodil z S-SPV-001 (Kasza Strain). Tento virus se získal za použití homologního vektoru 917-60.B9 (viz materiály a metody) a viru S-SPV-001 homologickým rekombinantním postupem pro generování rekombinantního SPV. Transfekční zásobní surovina se screenovala s cílem nalézt rekombinantní SPV exprimující β-galaktosidasu (Bluogal a CPRG testy). Konečným výsledkem purifikace červeného plaku byl rekombinantní virus označený jako S-SPV-225. U tohoto viru se provedla analýza na β-galaktosidasovou expresi, čistotu a stabilitu inzertu množinou pasáží monitorovaných testem modrým plakem, který byl již popsán v části nazvané Materiály a metody. Po počátečních třech kolech purifikace se všechny piaky prohlédly, přičemž modré zabarvení naznačilo, že virus je stabilní, čistý a že exprimuje cizí gen.
U S-SPV-225 se provedla analýza, která měla určit expresi pro kočičí IFN-γ specifických antigenu. Při tomto testu se screenovala exprese cizího genu v rekombinantním SPV za použití testu s černým plakem. Popsané testy se prováděly v ESK-4 buňkách, což naznačuje, že ESK-4 buňky budou vhodným substrátem pro produkci SPV rekombinantních vakcín.
01-3118-00-Če • · ·· · · · · · · · · · • · · · ·· · ·♦·♦ ···· ··· ··· • e · · · · · · · ·· · · • · ···· · · · • 4 ·· ·· · ·'» ···
Ve snaze potvrdit expresi kočičího IFN-γ genového produktu se buňky infikovaly S-SPV-225 virem a vzorky infikovaných buněčných lysátů se podrobily SDS-polyakrylamidové gelové elektroforéze. Gel se blotoval a analyzoval za použití Westernového přenosu.
U S-SPV-225 se zjišťovala exprese bioaktivního kočičího IFNγ za použití metody screenování, která vyhledává bioaktivitu kočičího IFN-γ exprimovanou rekombinantními SPV, RPV nebo FHV za použití VSV plakové redukce.
S-SPV-225 je použitelný jako vakcína proti chorobám koček. S-SPV-225 zvyšuje účinnost vakcin proti FIV, FeLV, FIP nebo dalším onemocněním, pokud se použije samostatně nebo v kombinaci s FIV, FeLV, FIP nebo dalšími kočičími vakcínamí.
Příklad 5
S-SPV-200 virus neštovic prasat, který exprimuje 3 cizí geny. Geny pro gag/proteasu viru kočičí imunodeficience (FIV) a FlVenv (celá délka) a gen pro E. coli β-galaktosidasu (lacZ) se inzerovaly do unikátního Notl restrikčního místa (Notl linkery inzerované do unikátního AccI restrikčního místa v 01L ORF SPV HindlII M fragmentu). FlVgag/proteasový a env gen jsou řízeny samostatným nicméně identickým syntetickým pozdním/časným promotorem (LP2EP2). Gen lacZ je řízen syntetickým pozdním promotorem (LPI).
S-SPV-200 se odvodil z S-SPV-001 (Kasza Strain). Tento vir se připravil za použití homologního vektoru 904-63.B7 a viru S-SPV-001 a homologního rekombinantního postupu pro generování
01-3118-00-Če
• · · · 0 0 0 0 0 0 · • · · · · · · · · ·· *·· 0·· «0··· · · 9 · · ·
0 0 0 0 0 0
0» ·« · ·· ··· rekombinantního SPV. Transfekční zásobní surovina se screenovala z cílem nalézt rekombinantní SPV exprimující β-galaktosidázu (Bluogal a CPRG testy a screenování na rekombinantní herpesvirus exprimující enzymatické markerové geny. Finálním výsledkem purifikace červeného plaku byl rekombinantní virus S-SPV-157. U tohoto viru se provedla analýza na expresi β-galaktosidasy za použití testu s modrým plakem, který byl popsán v části nazvané Materiály a metody. Analýza čistoty a stability inzertu po 5 pasážích se provedla detekcí FlVgag a β-galaktosidasy v testu s černý plakem a detekcí FlVgag a env v testu Western blot.
S-SPV-200 je rekombinantní virus neštovic prasat exprimující FlVgag/proteasový a FlVenv protein, který je použitelný jako kočičí vakcína proti FIV infekci. S-SPV-200 je rovněž použitelný při expresi FlVgag/proteasového a FlVenv proteinu.
Příklad 6
S-SPV-233 je virus neštovic prasat, který exprimuje 5 cizích genů: FlVgag, FlVenv, kočičí CD80, E.coli lacZ a E.coli uidA. Celá délka kočičího CD80 genu a genu pro E.coli β-glukuronidasu (uidA) se inzerovaly do unikátního Notl restrikčního místa (Notl linkery inzerované do unikátního FcoRI restrikčního místa v přibližně 3,2kb oblasti 6,7kb SPV HindlII K fragmentu). Geny pro FlVgag/proteasu a FlVenv (celá délka) a gen pro E.coli βgalaktosidasu (lacZ) se inzerovaly do unikátního Notl restrikčního místa (Notl linkery inzerované do unikátního AccI restrikčního místa v 01L ORF SPV HindlII N fragmentu) . CD80 gen je řízen syntetickým pozdním/časným promotorem (LP2EP2) a uidA gen je řízen samostatným a unikátním syntetickým časným
01-3118-00-Če
4 4» 44 ···· 4 4
4 4 · 4 4 4 444
4444 44 4 44
444444 4« * 4 4 promotorem (EP2). FlVgag/proteasový a env gen jsou řízeny samostatným nicméně identickým syntetickým pozdním/časným promotorem (LP2EP2). Gen pro lacZ je řízen syntetickým pozdním promotorem (LPI). (PCR mezinárodní patentová přihláška WO 96/22363).
S-SPV-233 se odvodil z S-SPV-200 (obsahuje FlVgag, FlVenv a E.coli lacZ gen). Tento virus se připravil za použití homologního vektoru 931-21.Al a viru S-SPV-200 a homologního rekombinantního postupu pro generování rekombinantního SPV. Transfekční zásobní surovina se screenovala ve snaze najít rekombinantní SPV exprimující β-glukuronidasu (X-gluc a screenování na rekombinantní herpesvirus exprimující enzymatické markerové geny). Finálním výsledkem modro/zelené purífikace bude rekombinantní virus označený jako S-SPV-233.
U S-SPV-233 se provedla analýza na expresi FlVgag, FlVenv a pro kočičí CD80 specifické antigeny za použití screenování černého plaku na expresi cizího genu v rekombinantním SPV. Zde popsané testy se prováděly v ESK-4 buňkách, což naznačuje, že ESK-4 buňky budou vhodným substrátem pro výrobu SPV rekombinantních vakcín.
U S-SPV-233 se provedla analýza, která měla určit expresi pro kočičí CD80 gen specifických antigenů. Při tomto testu se screenovala kočičí rekombinantním SPV, plakem. Ukázalo se,
CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2) exprese v RPV nebo FHV za použití testu s černým že humánní CTLA-4/Fc chimérická protilátka reaguje specificky s plaky S-SPV-233 (exprimujícími kočičími CD80) a nikoliv s negativními kontrolními plaky S-SPV-001. Ukázalo se že, všechny pozorované S-SPV-233 plaky reagují s
01-3118-00-Če ♦ ··· humánní CTLA-4/Fc chimérickou protilátkou, což naznačilo, že virus stabilně exprimuje kočičí CD80 cizí gen.
Ve snaze potvrdit expresi FlVgag, FlVenv a kočičího CD80 genového produktu se buňky infikovaly S-SPV-233 virem a vzorky infikovaných buněčných lysátů se podrobily SDS-polyakrylamidové gelové elektroforéze. Gel se blotoval a analyzoval za použití Westernového přenosu.
S-SPV-233 je rekombinantním virem neštovic prasat exprimujícím FlVgag/proteasový a FIV env protein a je použitelný jako vakcína proti FIV infekci u koček. S-SPV-233 je rovněž použitelný při expresi FlVgag/proteasového a FIV env proteinu.
Příklad 7
S-SPV-235 je virus neštovic prasat, který exprimuje pět cizích genů: FlVgag, FlVenv, kočičí IFN-γ E.coli lacZ a E.coli uidA. Celá délka kočičího IFN-γ genu a genu pro E.coli β-, glukuronidasu (uidA) se inzerovaly do unikátního Notl restrikčního místa {Notl linkery inzerované do unikátního EcoRI restrikčního místa v přibližně 3,2kb oblasti 6,7kb SPV HindlII K fragmentu). Geny pro FlVgag/proteasu a FlVenv (celá délka) a gen pro E.coli β-galaktosidasu (lacZ) se inzerovaly do unikátního Notl restrikčního místa {Notl linkery inzerované do unikátního AccI restrikčního místa v 01L ORF SPV HindlII N fragmentu). IFN-γ gen je řízen syntetickým pozdním/časným promotorem (LP2EP2) a uidA gen je řízen samostatným a unikátním syntetickým časným promotorem (EP2). FlVgag/proteasový a env gen jsou řízeny samostatným nicméně identickým syntetickým pozdním/časným
01-3118-00-Če • ♦ * · ·*···· tt · • » · · · · · ···· • · ♦ · « · * 9 9 9
999999 99 · · · φ
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 999 promotorem (LP2EP2). Gen pro lacZ je řízen syntetickým pozdním promotorem (LPI).
S-SPV-235 se odvodil z S-SPV-200 (obsahuje FlVgag, FlVenv a E.coli lacZ gen). Tento virus se připravil za použití homologního vektoru 931-55.B12 a viru S-SPV-200 a homologního rekombinantního postupu pro generování rekombinantního SPV. Transfekční zásobní surovina se screenovala ve snaze najít rekombinantní SPV exprimující β-glukuronidasu (X-gluc a screenování na rekombinantní herpes virus exprimující enzymatické markerové geny). Finálním výsledkem modro/zelené purifikace bude rekombinantní virus označený jako S-SPV-235.
U S-SPV-235 se provedla analýza na expresi FlVgag, FlVenv a pro kočičí IFN-γ specifické antigeny za použití screenování černého plaku na expresi cizího genu v rekombinantním SPV. Zde popsané testy se prováděly v ESK-4 buňkách, což naznačuje, že ESK-4 buňky budou vhodným substrátem pro výrobu SPV rekombinantních vakcín.
U S-SPV-235 se provedla analýza, která měla určit expresi bioaktivního kočičího IFN-γ za použití screenování na bioaktivitu kočičího IFN-γ exprimovanou rekombinantním SPV, RPV nebo FHV realizovaného pomocí VSV plakové redukce.
Ve snaze potvrdit expresi FlVgag, FlVenv a kočičího IFN-γ genového produktu se buňky infikovaly S-SPV-235 virem a vzorky infikovaných buněčných lysátů se podrobily SDS-polyakrylamidové gelové elektroforéze. Gel se blotoval a analyzoval za použití Westernového přenosu.
φφ φφ ·»♦··♦ φφ φ •φφφ φφ φ φφφφ φφφφ φφφ φφφ φ φφφφφφ φφ φφ φ φ φφ φφφφ φφφ • Φ φφ φφ φ ·· φφφ
Ol-3118-OO-Če
S-SPV-235 je rekombinantním virem neštovic prasat exprimujícím FlVgag/proteasový a FIV env protein a je použitelný jako vakcína proti FIV infekci u koček. S-SPV-235 je rovněž použitelný při expresi FlVgag/proteasového a FlVenv proteinu.
Příklad 8
S-SPV-224 je virus neštovic prasat, který exprimuje tři cizí geny. Geny pro vir kočičí leukémie (FeLV)gag/proteasu a FeLVenv (celá délka) a gen pro E.coli (lacZ) se inzerovaly do vypuštěného SPV I5L místa odvozeného z SPV 1869bp parciálního HindlII N genomového fragmentu. FeLVgag/proteasový gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem (EP2). FeLVenv gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem (EP1). Gen pro lacZ je řízen konstitutivním pozdním SPV I5L promotorem.
S-SPV-224 se odvodil z S-SPV-001 (obsahuje Kasza Strain). Tento virus se připravil za použití homologního vektoru 921-65.B5 a viru S-SPV-001 a homologního rekombinantního postupu pro generování rekombinantního RPV, SPV, OF FHV. Transfekční zásobní surovina se screenovala ve snaze najít rekombinantní RPV OR SPV FHV exprimujicí β-galaktosidasu (Bluogal a CPRG test). Finálním výsledkem purifikace červeného plaku bude rekombinantní virus označený jako S-SPV-224.
U S-SPV-224 se provedla analýza na expresi FeLVgag/proteasy, FeLVenv a β-galaktosidasového proteinu za použití screenování
01-3118-00-Če «« 0« • 0 0 0 0 ·
0 0 0 0 0 «
0 000 0 0 0 0 • 0 0 0 0 0
0000 000
0000
0·0 00 000 černého plaku na expresi cizího genu v rekombinantním RPV, SPV, OR FHV. Zde popsané testy se prováděly v ESK-4 buňkách, což naznačuje, že ESK-4 buňky budou vhodným substrátem pro výrobu SPV rekombinantních vakcín.
Ve snaze potvrdit expresi FeLVgag/proteasového a FeLenv genového produktu se buňky infikovaly S-SPV-224 virem a vzorky infikovaných buněčných lysátů se podrobily SDS-polyakrylamidové gelové elektroforéze. Gel se blotoval a analyzoval za použití Westernového přenosu.
S-SPV-224 je rekombinantním virem neštovic prasat exprimujícím FeLVgag/proteasový a FeLVenv protein a je použitelný jako vakcína proti FeLV infekci u koček. S-SPV-224 je rovněž použitelný při expresi FeLVgag/ proteasového a FeLVenv proteinu.
Příklad 9
S-SPV-246
S-SPV-246 je virus neštovic prasat, který exprimuje pět cizích genů: FeLVgag/proteasy, FeLVenv, kočičí CD80, E.coli lacZ a E.coli uidA. Celá délka kočičího CD80 genu a genu pro E.coli βglukuronidasu (uidA) se inzerovaly do unikátního Notl restrikčního místa (Notl linker se inzeroval do unikátního EcoRI restrikčního místa v přibližně 3,2kb oblasti 6,7kb SPV Hindlll K fragmentu). CD80 gen je řízen syntetickým pozdním/časným promotorem (LP2EP2). a uidA gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem (EP2). FeLVgag/proteasový, FeLVenv gen (celá délka) a E. coli (-galaktosidasový (lacZ) gen se inzerují do vypuštěného I5L místa odvozeného z 1869 parciálního Hindlll N
01-3118-00-Če ·· · · to · to to · · » · to to ·· · » · to · ·· · l · ··· ·· ·· » · · · · · ·· ·· ·· · genomového fragmentu. FeLVgag/proteasový gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem EP2. FeVLenv gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem EP1. LacZ gen je řízen konstitutivním pozdním neštovicovým promotorem I5L. (PCT mezinárodní patentová přihláška WO 96/22263).
S-SPV-246 se odvodil z S-SPV-224 (obsahuje FeLVgag/proteasový, FeLVenv a E.coli lacZ gen v I5L vypuštěném 1869kb parciálním HindlII N fragmentu) . Tento virus se připravil za použití homologního vektoru 931-21.Al a viru S-SPV-224 a homologního rekombinantního postupu pro generování rekombinantního RPV,SPV nebo FHV. Transfekční zásobní surovina se screenovala ve snaze najít rekombinantní RPV nebo SPV nebo FHV exprimující β-galakto-sidasu (Bluogal a CPRG testy) nebo (-galaktosidasu (X-GLUC test) . Finálním výsledkem modro/zelené purifikace bude rekombinantní virus označený jako S-SPV-246.
U S-SPV-246 se provedla analýza na expresi FeLVgag/proteasového, FeLVenv proteinu za použití screenování černého plaku na expresi cizího genu v rekombinantním RPV, SPV nebo FHV. Zde popsané testy se prováděly v ESK-4 buňkách, což naznačuje, že ESK-4 buňky budou vhodným substrátem pro výrobu SPV rekombinantních vakcín.
U S-SPV-246 se provedla analýza, která měla určit expresi pro kočičí CD80 specifického antigenu screenováním exprese kočičího CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2) v rekombinantním SPV, RPV nebo FHV za použití testů s černým plakem. Ukázalo se, že humánní CTLA-4/Fc chimérická protilátka specificky reaguje s S-SPV-246 plaky (exprimujíčími kočičí CD80) a nikoliv s negativními kontrolními plaky S-SPV-001. Rovněž se ukázalo, že všechny
4444 44 4 44 4 4 4 444 4444 444 4 44 4444 444 • 4 44 4 4 4 44 444
01-3118-00-Če pozorované S-SPV-246 plaky reagují s humánní CTLA-4/Fc chimérickou protilátkou, což naznačuje, že virus stabilně exprimuje kočičí CD80 cizí gen.
Ve snaze potvrdit expresi FeLVgag/proteasového, FeLVenv a kočičího CD80 genového produktu se buňky infikovaly S-SPV-246 virem a vzorky infikovaných buněčných lysátů se podrobily SDSpolyakrylamidové gelové elektroforéze. Gel se blotoval a analyzoval za použití Westernového přenosu.
S-SPV-246 je rekombinantním virem neštovic prasat exprimujícím FeLVgag/proteasový a FeLVenv protein a je použitelný jako vakcína proti FeLV infekce u koček. S-SPV-246 je rovněž použitelný při expresi FeLVgag/protea-sového a FeLVenv proteinu.
Příklad IQ
Dalšími použitelnými (FIV) , viru peritonitidy příklady rekombinantního jako vakcínu proti viru kočičí leukémie (FeLV) (FIP) jsou:
viru neštovic prasat kočičí imunodeficience nebo kočičí infekční
Rekombinantní virus neštovic prasat exprimující pět cizích genů. FlVenv gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem EPI; FlVgag/proteasový gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem EP2; E. coli lacZ gen je řízen promotorem neštovic prasat I5L; kočičí CD80 gen je řízen syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem LP2EP2; E. coli uidA gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem EP2. FlVenv gen, FlVgag/proteasový a E. coli lacZ gen se nacházejí v neesenciálních SPV inzertních místech, která jsou jiná než * · ·» ·«·· • w
9 9 9 9 9 9 · · · 9 9 9
999999 99
9 9 9 9 9 «··
9 9 9 9 9 9 9 9 999
01-3118-00-Če inzertní místa kočičí CD80 a E. coli uídA genů a jsou od těchto inzertních míst odlišitelná.
Rekombinantní virus neštovic prasat exprimující pět cizích genů. FlVenv Gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem EPI; FlVgag/proteasový gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem EP2; E. coli lacZ gen je řízen promotorem neštovic prasat I5L; kočičí CD86 gen je řízen syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem LP2EP2; E. coli uídA gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem EP2. FlVenv gen, FlVgag/proteasový a E. coli lacZ gen se nacházejí v neesenciálních SPV inzertních místech, která jsou jiná než inzertní místa kočičí CD86 a E. coli uídA genů a jsou od těchto inzertních míst odlišitelná.
Rekombinantní virus neštovic prasat exprimující dva cizí geny. Kočičí CD86 gen je řízen syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem LP2EP2; E. coli uídA gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem EP2. Virus se použije samotný nebo v kombinaci s dalšími rekombinantními proteiny nebo vakcínami.
Další příklady rekombinantních virů neštovic prasat použitelné při výrobě vakcín proti FeLV onemocnění by byla shodná s výše uvedenými příklady s výjimkou nahrazení FIV genu srovnatelným FeLV specifickými geny.
Dalšími příklady rekombinantních virů neštovic prasat použitelné pro výrobu proteinů vhodných jako vakcíny pro výrobu a purifikaci polyklonální protilátky jsou:
01-3118-00-Če
·· • ·· 9 9 9 • 9999 9 · • · • • ·
9 •
•
• 9 9 99 9 9 • · 9 9 • •
* • · • • · 9 • •
Φ · ·· ·· • 9 9 • 9 ·
Rekombinantní virus neštovic prasat exprimuje jeden cizí gen. Kočičí CD80 gen postrádající transmembránovou doménu je řízen syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem LP2EP2. Alternativně má CD80 gen postrádající transmembránovou doménu na karboxylovém konci histidinovou tag fúzi, která umožňuje purifikaci na niklově afinitní koloně.
Rekombinantní virus neštovic prasat exprimuje jeden cizí gen. Kočičí CD28 gen postrádající transmembránovou doménu je řízen syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem LP2EP2. Alternativně má CD28 gen postrádající transmembránovou doménu na karboxylovém konci histidinovou tag fúzi, která umožňuje purifikaci na niklově afinitní koloně.
Rekombinantní virus neštovic prasat exprimuje jeden cizí gen. Kočičí CD86 gen postrádající transmembránovou doménu je řízen syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem LP2EP2. Alternativně má CD86 gen postrádající transmembránovou doménu na karboxylovém konci histidinovou tag fúzi, která umožňuje purifikaci na niklově afinitní koloně.
Dalšími příklady rekombinantních virů neštovic prasat, které využívají CD80 i CD86 a které jsou použitelné při vývoji vakcíny pro FIV a FeLV choroby u koček jsou:
Rekombinantní virus neštovic prasete exprimuje pět cizích genů. Kočičí CD8 6 gen a kočičí CD80 gen jsou exprimovány v bicistronní kazetě za řízení syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem LPI pohánějícím transkripci CD80 a CD86 a zahrnujícím EMCV IRES prvek mezi dvěma otevřenými čtecími rámci; E. coli uidA gen je řízen syntetickým časným promotorem EP2. FlVgag/proteasový gen je řízen promotorem neštovic prasat OIL;
·« 9
9 99 • 99
9 9 9
9 9
999
01-3118-00-Če • 9 ··
9 9 9 99
9 9 9 9 9
9 999 9 9 · « « · ft *· ·« «·
E.coli lacZ gen je řízen syntetickým pozdním neštovicovým promotorem LPI. CD80/CD86 a E. coli uidA geny jsou obsaženy v neesenciálních SPV inzertním místě, které je jiné než inzertní místo FlVgag/proteasového genu E.coli lacZ genu a je od těchto inzertních míst odlišitelné.
Rekombinantní virus neštovic prasete exprimuje pět cizích genů. Kočičí CD86 gen a kočičí CD80 gen jsou exprimovány v bicistronní kazetě za řízení syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem LPI pohánějícím transkripci CD80 a CD86 a zahrnujícím EMCV IRES prvek mezi dvěma otevřenými čtecími rámci; E. coli lacZ gen je řízen syntetickým pozdním promotorem LPI. FlVenv gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem EPl. E.coli uidA gen je řízen syntetickým pozdním neštovicovým promotorem LPI. CD80/CD86 a E. coli uidA geny jsou obsaženy v neesenciálních SPV inzertním místě, které je jiné než inzertní místo FlVenv genu E.coli lacZ genu a je od těchto inzertních míst odlišitelné.
Rekombinantní virus neštovic prasete exprimuje šest cizích genů. Kočičí CD8 6 gen a kočičí CD80 gen jsou exprimovány v bicistronní kazetě za řízení syntetickým pozdním neštovicovým promotorem LPI pohánějícím transkripci CD80 a CD86 a zahrnujícím EMCV IRES prvek mezi dvěma otevřenými čtecími rámci; E. coli uidA gen je řízen syntetickým časným promotorem EP2. FlVgag/proteasový gen je řízen časným neštovicovým promotorem EP2; FlVenv gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem EPl; E.coli lacZ gen je řízen syntetickým konstitutivním 15L neštovicovým promotorem. CD80/CD8 6 a E. coli uidA geny jsou inzerovány na místo, které je odlišitelné od místa inzerce FlVenv genu, FlVgag/proteasového genu a E.coli lacZ genu.
fcfc • · · · • fcfc • fcfcfc • · ·
01-3118-00-Če ·· ·· • · · fc fcfc • fcfc· fc · • · fc·· fcfc · • fc fcfcfc • fc fcfc fcfc ·· ····
100
Další viry neštovic prasat pro FeLV vakcíny určené pro kočky by se zkonstruovaly výše popsaným způsobem s tou výjimkou, že by se FIV geny nahradily srovnatelnými FeLV genovými konstrukty.
Příklad 11
Dalšími příklady viru neštovic mývalů použitelnými jako vakcína proti kočičím onemocněním, jakými jsou například virus kočičí imunodeficience (FIV), virus kočičí leukémie (FeLV) nebo infekční kočičí peritonitida (FIP), jsou:
Rekombinantní virus neštovic mývalů exprimuje dva cizí geny. Kočičí CD86 je řízen syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem LP2EP2; E. coli lacZ gen je řízen syntetickým pozdním neštovicovým promotorem LI.
Další příklady rekombinantních virů neštovic mývalů použitelné pří výrobě proteinů použitelných jako vakcína nebo při výrobě a purifikaci polyklonální protilátky.
Rekombinantní virus neštovic mývalů exprimuje jeden cizí gen. Kočičí CD80 gen postrádající transmembránovou doménu je řízen syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem LP2EP2. Alternativně má CD80 gen postrádající transmembránovou doménu na karboxylovém konci histidinovou tag fúzi, která umožňuje purifikaci na niklově afinitní koloně.
Rekombinantní virus neštovic mývalů exprimuje jeden cizí gen. Kočičí CD28 gen postrádající transmembránovou doménu je řízen syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem LP2EP2. Alternativně má CD28 gen postrádající transmembránovou doménu na
01-3118-00-Če • ······ · · · · · · • · ···· ··· • · ·· · · · · · · · ·
101 karboxylovém konci histidinovou tag fúzi, která umožňuje purifikaci na niklově afinitní koloně.
Rekombinantní virus neštovic mývalů exprimuje jeden cizí gen. Kočičí CD86 gen postrádající transmembránovou doménu je řízen syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem LP2EP2. Alternativně má CD86 gen postrádající transmembránovou doménu na karboxylovém konci histidinovou tag fúzi, která umožňuje purifikaci na niklově afinitní koloně.
Rekombinantní virus neštovic mývalů exprimuje čtyři cizí geny. Kočičí CD86 gen a kočičí CD80 gen jsou exprimovány v bicistronní kazetě za řízení syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem LP2EP2 pohánějícím transkripcí CD80 a CD86 a zahrnujícím EMCV IRES prvek mezi dvěma otevřenými čtecími rámci pohánějící translaci druhého downstream genu CD80; FlVgag gen je řízen promotorem neštovic prasat OIL; a E. coli uidA gen je řízen syntetickým časným promotorem EP2.
Rekombinantní virus neštovic mývalů exprimuje čtyři cizí geny. Kočičí CD8 6 gen a kočičí CD80 gen jsou exprimovány v bicistronní kazetě za řízení syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem LP2EP2 pohánějícím transkripci CD80 a CD86 a zahrnujícím EMCV IRES prvek mezi dvěma otevřenými čtecími rámci pohánějící translaci druhého downstream genu CD80; FlVenv gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem El; a E. coli uidA gen je řízen syntetickým časným promotorem EP2.
Rekombinantní virus neštovic mývalů exprimuje pět cizích genů. Kočičí CD8 6 gen a kočičí CD80 gen jsou exprimovány v bicistronní kazetě za řízení syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem LP2EP2 pohánějícím transkripci CD80 a
01-3118-00-Če • 000000 0 · 0 0 0 · ·· ···· · · ·
0 · · ·· 0 0 0 000
102
CD86 a zahrnujícím EMCV IRES prvek mezi dvěma otevřenými čtecími rámci pohánějící translaci druhého downstream genu CD80; FlVgag gen je řízen promotorem neštovic prasat OIL; FlVenv gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem El; a E. coli uidA gen je řízen syntetickým časným promotorem EP2.
Dalšími příklady viru neštovic mývalů použitelnými jako vakcína proti kočičím onemocněním, jakými jsou například virus kočičí imunodeficience (FIV), virus kočičí leukémie (FeLV) nebo infekční kočičí peritonitida (FIP), jsou:
Rekombinantní virus neštovic mývalů exprimující dva cizí geny. Kočičí CD86 gen je řízen syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem LP2EP2; E. coli lacZ gen je řízen syntetickým pozdním neštovicovým promotorem LPI.
Dalšími příklady rekombinantních virů neštovic mývalů, které využívají CD80 i CD86 a které jsou použitelné při vývoji vakcíny pro FIV a FeLV choroby u koček jsou:
Rekombinantní virus neštovic mývalů exprimuje čtyři cizí geny. Kočičí CD86 gen a kočičí CD80 gen jsou exprimovány v bicistronní kazetě za řízení syntetickým pozdním neštovicovým promotorem LPI pohánějícím transkripci CD80 a CD86 a zahrnujícím EMCV IRES prvek mezi dvěma otevřenými čtecími rámci. FlVgag/proteasový gen je řízen pozdním/časným neštovicovým promotorem LP2EP2; a E. coli uidA gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem EP2. CD80/CD86, FlVgag/proteasový a uidA gen jsou inzerovány do jediného neesenciálního RPV místa.
Rekombinantní virus neštovic mývalů exprimuje čtyři cizí geny. Kočičí CD86 gen a kočičí CD80 gen jsou exprimovány v • ·
9 9 • · • · ·
01-3118-00-Če
103 bicistronní kazetě za řízení syntetickým pozdním/časným neštovicovým promotorem LP2 pohánějícím transkripci CD80 a CD86 a zahrnujícím EMCV IRES prvek mezi dvěma otevřenými čtecími rámci; E. coli lacZ gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem El; a E. coli uidA gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem EP2. CD80/CD86, FlVenv a uidA gen jsou inzerovány do jediného neesenciálního RPV místa.
Rekombinantní virus neštovic mývalů exprimuje šest cizích genů. Kočičí CD8 6 gen a kočičí CD80 gen jsou exprimovány v bicistronní kazetě za řízení syntetickým pozdním neštovicovým promotorem LPI pohánějícím transkripci CD80 a CD86 a zahrnujícím EMCVIRiS prvek mezi dvěma otevřenými čtecími rámci; E coli. lacZ gen je řízen pozdním neštovicovým promotorem. FlVgag/proteasový gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem EP2; FlVenv gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem EPI; a E. coli uidA gen je řízen. E coli. lacZ geny jsou inzerovány do místa, které je odlišitelné od místa inzerce FlVenv, FlVgag/proteasového a E. coli. uidA genu.
Další viry neštovic mývalů pro FeLV vakcíny určené pro kočky by se zkonstruovaly výše popsaným způsobem s tou výjimkou, že by se FIV geny nahradily srovnatelnými FeLV geny.
Příklad 12
S-FHV-020
S-FHV-020 je rekombinantní kočičí herpesvirus, který má deleci celého FHV gE genu (1638 bazických párů a inzerci E. coli.
01-3118-00-Če • · · · ·« ···* · · • · · · · · · ··· • · · · · · · ·· • ······ · · ·· · • · ···· · φ ·· · · · · · ·· ·
104 lacZ genu na vypuštěném gE místě. Transkripce E. coli lacZ genu je řízena konstitutivním FHV gE promotorem.
S-FHV-020 se odvodil z S-FHV-001 (NVSL řetězec). Ten se připravil za použití homologního vektoru 486-88.B17 a viru S-FHV001 homologním rekombinantním způsobem přípravy rekombinantního RPV, SPV nebo FHV. Transfekční zásobní surovina se screenovala ve snaze nalézt rekombinantní RPV nebo SPV nebo FHV exprimující βgalaktosidasu (BLUOGAL a CPRG testy) nebo β-glukuronidasu (X-GLUC test). Finálním výsledkem purifikace modrého plaku byl rekombinantní virus označený jako S-FJV-020. K analýze čistoty a stability inzertu po 5 pasážích se použila detekce βgalaktosidasy při screenování exprese cizího genu v rekombinantním RPV, SPV nebo FHV za použití testu s černým plakem.
Příklad 13
S-FHV-031
S-FHV je rekombinantní kočičí herpesvirus, který má deleci celého 1638bp FHV gE genu a inzerci tří cizích genů v gH vypuštěném místě. Transkripce CD80 genu je řízena konstitutivním FHV gE promotorem a orientace je stejná jako u vypuštěného gE genu. FlVgag/proteasový gen je řízen gX promotorem pseudovztekliny a FlVenv gen je řízen bezprostředně předcházejícím promotorem cytomegaloviru. Gag/proteasový a env gen jsou orientovány stejným směrem, opačným směrem než CD80 gen.
S-FHV-031 se odvodí z S-FHV-020 (za gE promotorem obsahuje E. coli LacZ gen). Ten se připravil za použití homologního
01-3118-00-Če ·· · · · · ···· · · ···· 4 4 · · • 444444 4 · 44 4 4 44 4444 444 ·· 44 44 4 44 444
105 vektoru 942-03.C6 (viz odstavec „Materiály a metody) a viru SFHV-020 homologním rekombinantním způsobem přípravy rekombinantního RPV, SPV nebo FHV. Transfekční zásobní surovina se screenovala ve snaze nalézt rekombinantní RPV nebo SPV nebo FHV exprimující β-galakto-sidasu (Bluogaland a CPRG testy) nebo β-glukuronidasu (X-GLUCAtest). Rekombinantní plaky se vybraly a purifikovaly selekcí s bílým plakem. tento virus se charakterizoval restrikční endonukleasovým mapováním a Southernovým přenosem DNA. Tato analýza potvrdila inzerci kočičího CD80, FlVgag/proteasového a FlVenv genu a deleci 1638bp FIV gE genu. (PCT mezinárodní patentová přihláška WO 96/13575).
U S-FHV-031 se v tomto testu pomocí Westernového přenosu zjišťovala exprese pro kočičí CD80, FlVgag/proteasu a FlVenv specifických antigenů. Zde popsané testy se prováděly v CRFK buňkách, což naznačilo, že tyto SRFK buňky budou vhodným substrátem pro produkci FHV rekombinantních vakcín. Lysat z rekombinantního kočičího herpesviru se infikoval buňkami vykazujícími pás očekávané velikosti kočičího CD80 proteinu, FlVgag/proteasy a FlVenv.
U S-FHV-031 se zjišťuje exprese pro kočičí CD80 specifických antigenů screenovaným za použití testů s černým plakem ve snaze nalézt v rekombinantním SPV, RPV nebo FHV expresi kočičího CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2). Ukázalo se, že humánní CTLA-4/Fc chimérická protilátka specificky reaguje s plaky rekombinantního kočičího herpesviru (exprimujícími kočičí CD80) a nikoliv s negativními kontrolními plaky SFHV-001. Rovněž se ukázalo, že všechny pozorované plaky rekombinantního kočičího herpesviru reagují s
01-3118-00-Če ·· ·· ·* ···· ·· · • · · · · · · · · · · • · · · · · · ··· » ······ · · · · · · ·· ···· ··· ·· ·· ·· · · · ···
106 humánní CTLA-4/Fc chimérickou protilátkou, což naznačilo, že virus stabilně exprimuje kočičí CD80 cizí gen.
S-FHV-031 je rekombinantní kočičí herpesvirus exprimujicí FlVgag/proteasový, FlVenv a kočičí CD80 protein a používá se jako vakcína u koček proti FIV infekci.
Příklad 14
Rekombinantní kočičí herpesvirus má deleci gE genu a inserci alespoň jednoho cizího genu na gE vypuštěném místě. Cizím genem je kočičí CD86 gen a jeho transkripce je řízena FHV gE promotorem.
Rekombinantní kočičí herpesvirus exprimujicí kočičí CD86 je použitelný jako vakcína proti chorobám koček. Rekombinantní kočičí herpesvirus zvyšuje účinnost vakcín proti FIV, FeLV, FIP nebo dalším kočičím onemocněním, pokud se použije samostatně nebo v kombinaci s FIV, FeLV, FIP nebo další kočičí vakcínou.
Příklad 15
Dalšími příklady rekombinantního kočičího herpesviru použitelného jako vakcína proti viru kočičí imunodeficience (FIV), viru kočičí leukémie (FeLV) nebo kočičí infekční peritonitidě (FIP) jsou:
Rekombinantní kočičí herpesvirus exprimuje tři cizí geny na FHV gE vypuštěných místech. FeLVenv gen je řízen gX promotorem pseudovztekliny; FlVgag gen je řízen bezprostředně předcházejícím
01-3118-00-Če
107 promotorem cytomegaloviru; kočičí CD80 gen je řízen gE promotorem kočičího herpesviru. Rekombinantní kočičí herpesvirus exprimuje na FHV gE vypuštěném místě tři cizí geny. FeLVenv gen je řízen gX promotorem pseudovztekliny; FlVgag gen je řízen bezprostředně předcházejícím promotorem cytomegaloviru; kočičí CD86 gen je řízen gE promotorem kočičího herpesviru. Rekombinantní kočičí herpesvirus exprimuje na FHV gE vypuštěném místě tři cizí geny. FeLVenv gen je řízen gX promotorem pseudovztekliny; FeLVgag gen je řízen bezprostředně předcházejícím promotorem cytomegaloviru; kočičí CD86 gen je řízen gE promotorem kočičího herpesviru.
Rekombinantní kočičí herpesvirus exprimuje pět cizích genů. Kočičí CD86 gen a CD80 gen se exprimují za řízení bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru v bicistronní kazetě, která pohání transkripci CD80 a CD86 a mezi dvěma otevřenými čtecími rámci zahrnuje EMCV IRES prvek; a E. coli uidA gen je řízen gl promotorem viru infekční laryngotracheitidy. CD80, CD86 a E. coli uidA gen se inzerují do unikátní dlouhé oblasti FHV genomu v místě, které bylo určeno jako neesenciální. FlVgag/proteasový gen je pod kontrolou bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru a E. coli lacZ gen je pod kontrolou gX promotoru pseudovztekliny inzerován na FHV gE vypuštěné místo.
Rekombinantní kočičí herpesvirus exprimuje pět cizích genů. Kočičí CD86 gen a CD80 gen se exprimují za řízení bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru v bicistronní kazetě, která pohání transkripci CD80 a CD86. Transkripce druhého CD80 otevřeného čtecího rámce je řízena EMCV IRES prvkem. E. coli uidA gen je řízen gl promotorem viru infekční laryngotracheitidy. CD80, CD86 a E. coli uidA gen se inzerují do unikátní dlouhé
0 • 000 00 0 00 0 • 0 000 0000 000 0 ·· 0000 000 ·· ·· 00 0 00 000
01-3118-00-Če
108 oblasti FHV genomu v místě, které bylo určeno jako neesenciální. FlVenv gen je pod kontrolou bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru a E. coli lacZ gen je pod kontrolou gX promotoru pseudovztekliny inzerován na FHV gE vypuštěné místo.
Rekombinantní kočičí herpesvirus exprimuje šest cizích genů. Kočičí CD86 gen a CD80 gen se exprimují za řízení bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru v bicistronní kazetě, která pohání transkripci CD80 a CD86 a mezi dvěma otevřenými čtecími rámci zahrnuje EMCV IRES prvek; a E. coli uidA gen je řízen gl promotorem viru infekční laryngotracheitidy. CD80, CD86 a E. coli uidA gen se inzerují do unikátní dlouhé oblasti FHV genomu v místě, které bylo určeno jako neesenciální. FlVenv gen je řízen bezprostředně předcházejícím promotorem cytomegalo-viru; FlVgag/proteasový gen je pod kontrolou gX promotoru viru pseudovztekliny; a E. coli lacZ gen je pod kontrolou FHV gE promotoru inzerován na FHV vypuštěné místo.
Rekombinantní kočičí herpesvirus exprimuje pět cizích genů. Kočičí CD86 gen a CD80 gen se exprimují za řízení bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru v bicistronní kazetě, která pohání transkripci CD80 a CD86 a mezi dvěma otevřenými čtecími rámci zahrnuje EMCV IRES prvek; a E. coli uidA gen je řízen gl promotorem viru infekční laryngotracheitidy. CD80, CD86 a E. coli uidA gen se inzerují do unikátní dlouhé oblastí FHV genomu v místě, které bylo určeno jako neesenciální. FeLVgag/proteasový gen je pod kontrolou bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru a E. coli lacZ gen je pod kontrolou gX promotoru pseudovztekliny inzerován na FHV gE vypuštěné místo.
··«·
9 9 9 9 9 9 9 9 99
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 999 9999 999 9
9 9 9 9 9 9 9 9
99 99 9 99 000
01-3118-00-Če
109
Rekombinantní kočičí herpesvirus exprimuje pět cizích genů. Kočičí CD86 gen a CD80 gen se exprimuj i za řízení bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru v bicistronní kazetě, která pohání transkripci CD80 a CD86. Transkripce druhého CD80 otevřeného čtecího rámce je řízena EMCV IRES prvkem. E. coli uidA gen je řízen gl promotorem viru infekční laryngotracheitidy. CD80, CD86 a E. coli uidA gen se inzerují do unikátní dlouhé oblasti FHV genomu v místě, které bylo určeno jako neesenciální. FeLVenv gen je pod kontrolou bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru a E. coli lacZ gen je pod kontrolou gX promotoru pseudovztekliny inzerován na FHV gE vypuštěné místo.
Rekombinantní kočičí herpesvirus exprimuje šest cizích genů. Kočičí CD86 gen a CD80 gen se exprimují za řízení bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru v bicistronní kazetě, která pohání transkripci CD80 a CD86 a mezi dvěma otevřenými čtecími rámci zahrnuje EMCV IRES prvek; a E. coli uidA gen je řízen gl promotorem viru infekční laryngotracheitidy. CD80, CD86 a E. coli uidA gen se inzerují do unikátní dlouhé oblasti FHV genomu v místě, které bylo určeno jako neesenciální. FeLVenv gen je řízen bezprostředně předcházejícím promotorem cytomegalo-viru; FeLVgag/proteasový gen je pod kontrolou gX promotoru viru pseudovztekliny; a E. coli lacZ gen je pod kontrolou FHV gE promotoru inzerován na FHV vypuštěné místo.
Příklad 17
Rekombinantní kočičí herpesvirus má deleci gE genu a inzerci alespoň jednoho cizího genu na vypuštěném gE místě. Cizím genem • · • φ • * · · * · φ φφφφ • •«•φφφ φφφ • · ··· φφφφ φφφ φ ·· φφφφ φφφ ·· ♦* ·· φ φφ φφφ
Ol-3118-OO-Če
110 je kočičí CD80 gen, jehož transkripce je řízena FHV gE promotorem.
Rekombinantní kočičí herpesvirus se odvodil z S-FHV-001 (NVSL řetězec). Ten se připravil za použití homologního vektoru 926-76.D7 (viz odstavec „Materiály a metody) a viru S-FHV-001 homologním rekombinantním způsobem přípravy rekombinantního RPV, SPV nebo FHV. Transfekční zásobní surovina se screenovala ve snaze nalézt rekombinantní herpesvirus exprimující enzymatické markerové geny. Tento virus se charakterizoval restrikčním endonukleasovým mapováním a Southernovým přenosem DNA. Tato analýza potvrdila inzerci kočičího CD80 a deleci 1638bp FIV gE genu. (PCT mezinárodní patentová přihláška WO 96/13575).
U tohoto rekombinantního kočičího herpesviru se v tomto testu zjišťovala exprese pro kočičí CD80 specifických antigenů za použití screenu černého plaku zjišťujícího expresi cizího genu v rekombinantním FHV. Zde popsané testy se prováděly v CRFK buňkách, což naznačilo, že tyto SRFK buňky budou vhodným substrátem pro produkci FHV rekombinantních vakcín.
U rekombinantního kočičího herpesviru se zjišťuje exprese pro kočičí CD80 specifických antigenů screenovaným za použití testů s černým plakem ve snaze nalézt v rekombinantním SPV, RPV nebo FHV expresi kočičího CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2). Ukázalo se, že humánní CTLA-4/Fc chimérická protilátka specificky reaguje s plaky rekombinantního kočičího herpesviru (exprimujícími kočičí CD80) a nikoliv s negativními kontrolními plaky SFHV-001. Rovněž se ukázalo, že všechny pozorované plaky rekombinantního kočičího herpesviru reagují s humánní CTLA-4/Fc chimérickou protilátkou, což naznačilo, že virus stabilně exprimuje kočičí CD80 cizí gen.
01-3118-00-Če • · to· · · · · λ · «♦ · • · · · · · · to··· toto····· ··· • · ··· ···· ··· · ·· ···· ··· ·· · * toto to ·· ···
111
Ve snaze potvrdit expresi kočičího CD80 genového produktu, se buňky infikovaly rekombinantním kočičím herpesvirem podle tohoto příkladu a vzorky infikovaných buněčných lysátů se podrobily SDS-polyakrylamidové gelové elektroforéze. Gely se přenesly a analyzovaly za použití Westernového přenosu. Lysát z buněk infikovaných rekombinantním kočičím herpesvirem vykazovaly pás očekávané velikosti kočičího CD80 proteinu.
Příklad 18
Rekombinantní kočičí herpesvirus má deleci gE genu a inserci alespoň jednoho cizího genu na gE vypuštěném místě. Cizím genem je kočičí CD86 gen a jeho transkripce je řízena FHV gE promotorem.
Rekombinantní kočičí herpesvirus exprimující kočičí CD86 je použitelný jako vakcína proti FIV, FeLV, FIP nebo dalším kočičím onemocněním, pokud se použije samostatně nebo v kombinaci s FIV, FeLV, FIP nebo další kočičí vakcínou.
Příklad 19
Dalšími příklady rekombinantního kočičího herpesviru použitelnými jako vakcína proti viru kočičí imunodeficience (FIV) , viru kočičí leukémie (FeLV) nebo kočičí virové peritonitidě jsou:
Rekombinantní kočičí herpesvirus exprimuje tři cizí geny. FlVenv gen je řízen gX promotorem pseudovztekliny; FIV gag gen je
9 9
9 9 9
01-3118-00-Če ·· ··
9 9 9 9 · • · * · · »
9 999 99 9
9 9 9 9
99 99
9 9
9 9
999
112 řízen bezprostředně předcházejícím promotorem cytomegaloviru; a kočičí CD80 gen je řízen gE promotorem kočičího herpesviru.
Rekombinantní kočičí herpesvirus exprimuje tři cizí geny. FeLVenv gen je řízen gX promotorem pseudovztekliny; FeLV gag gen je řízen bezprostředně předcházejícím promotorem cytomegaloviru; a kočičí CD80 gen je řízen gE promotorem kočičího herpesviru.
Rekombinantní kočičí herpesvirus exprimuje tři cizí geny. FlVenv gen je řízen gX promotorem pseudovztekliny; FIV gag gen je řízen bezprostředně předcházejícím promotorem cytomegaloviru; a kočičí CD86 gen je řízen gE promotorem kočičího herpesviru.
Rekombinantní kočičí herpesvirus exprimuje tři cizí geny. FeLVenv gen je řízen gX promotorem pseudovztekliny; FeLV gag gen je řízen bezprostředně předcházejícím promotorem cytomegaloviru; a kočičí CD86 gen je řízen gE promotorem kočičího herpesviru.
Rekombinantní kočičí herpesvirus exprimuje pět cizích genů. Kočičí CD86 gen a CD80 gen se exprimují za řízení bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru v bicistronní kazetě, která pohání transkripci CD80 a CD86 a mezi dvěma otevřenými čtecími rámci zahrnuje EMCV IRES prvek, který pohání translaci druhého downstream genu CD80; a E. coli uidA gen je řízen gl promotorem viru infekční laryngotracheitidy; a E. coli lacZ gen je řízen gX promotorem pseudovztekliny. Pět cizích genů je obsaženo ve dvou distinkčních inzertních místech kočičího herpesviru.
Rekombinantní kočičí herpesvirus exprimuje pět cizích genů. Kočičí CD86 gen a CD80 gen se exprimují za řízení bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru v bicistronní kazetě,
01-3118-00-Če *9 94 » 9 · 4 9
4 4 4 9 4 • 4 444 9 4 · «4 9 9· *· 4 94
4 04 4 9
4« 9 • * · 99 • 9 9 9
4 4 4 4
4 4 4
44 444
113 která pohání transkripci CD80 a CD86. Transkripce druhého CD80 otevřeného čtecího rámce je řízena EMCV IRES prvkem. E. coli uidA gen je řízen gl promotorem viru infekční laryngotracheitidy; FlVenv gen je pod kontrolou bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru; a E. coli lacZ gen je řízen gX promotorem pseudovztekliny.
Rekombinantní kočičí herpesvírus exprimuje šest cizích genů. Kočičí CD86 gen a CD80 gen se exprimují za řízení bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru v bicistronní kazetě, která pohání transkripci CD80 a CD86 a mezi dvěma otevřenými čtecími rámci zahrnuje EMCV IRES prvek, který pohání translaci druhého downstream genu CD80; a E. coli uidA gen je řízen gl promotorem viru infekční laryngotracheitidy; FlVgag gen je řízen bezprostředně předcházejícím promotorem cytomegaloviru; FlVenv gen je řízen bezprostředně předcházejícím promotorem cytomegaloviru; a E. coli lacZ gen je řízen gX promotorem pseudovztekliny.
Rekombinantní kočičí herpesvírus exprimuje pět cizích genů. Kočičí CD86 gen a CD80 gen se exprimují za řízení bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru v bicistronní kazetě, která pohání transkripci CD80 a CD86 a mezi dvěma otevřenými čtecími rámci zahrnuje EMCV IRES prvek, který pohání translaci druhého downstream genu CD80; a E. coli uidA gen je řízen gl promotorem viru infekční laryngotracheitidy; FeLVgag gen je řízen bezprostředně předcházejícím promotorem cytomegaloviru; a E. coli lacZ gen je řízen gX promotorem pseudovztekliny. Pět cizích genů je obsaženo ve dvou dístinkčních inzertních místech kočičího herpesviru.
• · · · · · • ·
01-3118-00-Če
114
Rekombinantní kočičí herpesvirus exprimuje pět cizích genů. Kočičí CD86 gen a CD80 gen se exprimují za řízení bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru v bicistronní kazetě, která pohání transkripci CD80 a CD86 a mezi dvěma otevřenými čtecími rámci zahrnuje EMCV IRES prvek, který pohání translaci druhého downstream genu CD80; a E. coli uidA gen je řízen gl promotorem viru infekční laryngotracheitidy; FeLVenv gen je řízen bezprostředně předcházejícím promotorem cytomegaloviru; a E. coli lacZ gen je řízen gX promotorem pseudovztekliny.
Rekombinantní kočičí herpesvirus exprimuje šest cizích genů. Kočičí CD86 gen a CD80 gen se exprimují za řízení bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru v bicistronní kazetě, která pohání transkripci CD80 a CD86 a mezi dvěma otevřenými čtecími rámci zahrnuje EMCV IRES prvek, který pohání translaci druhého downstream genu CD80; a E. coli uidA gen je řízen gl promotorem viru infekční laryngotracheitidy; FlVgag gen je řízen bezprostředně předcházejícím promotorem cytomegaloviru; FlVenv gen je řízen bezprostředně předcházejícím promotorem cytomegaloviru; a E. coli lacZ gen je řízen gX promotorem pseudovztekliny.
Příklad 20
Charakterizace kočičí CD80 (B7-1) -TAMU, CD86 (B7-2), CD28, CTLA4 a CD80 (B7-1) -Syntro/SPAH cDNA a polypeptidů:
Izolovaná a purifikovaná CD80 (B7-1) cDNA o délce přibližně 941 nukleotidových kódů pro otevřený čtecí rámec kočičího CD80 polypeptidu o délce při bližně 292 aminokyselin, jejíž přirozená
01-3118-00-Če
115 membránou vázaná nebo zralá forma má molekulovou hmotnost přibližně 33 485 kDa, isoelektrický bod přibližně 9,1, celkový náboj při pH 7,0 10,24. Transmembránovou doménou proteinu jsou aminokyseliny přibližně 241 až 271.
Kočičí CD80-TAMU a kočičí CD80-Syntro/SPAH jsou cDNA a polypeptidy nezávisle izolované ze dvou různých zdrojů a jejich aminokyselinové sekvence se mírně liší. Zdrojem CD80-TAMU mRNA byly kočičí jednojaderné buňky periferní krve stimulované ConA a zdrojem CD80-Syntro/SPAH RNA byly buňky kočičí sleziny stimulované ConA. Rozdíly mezi cDNA sekvencí CD80-TAMU a CD80Syntro/SPAH jsou T a C v nukleotidu 351 a C a A v nukleotidu 670. Změna v nukleotidu 351 je v aminokyselinové sekvenci tichou změnou, zatímco změna v nukleotidu 670 vede ke konzervativní změně neutrální aminokyseliny leucinu na isoleucin v aminokyselinovém zbytku 224.
Izolovaná a purifikovaná CD86 (B7-2) cDNA o délce přibližně 1176 nukleotidových kódů pro otevřený čtecí rámec kočičího CD86 polypeptidu o délce při bližně 320 aminokyselin, jejíž přirozená membránou vázaná nebo zralá forma má molekulovou hmotnost přibližně 36 394 kDa, isoelektrický bod přibližně 9,19, celkový náboj při pH 7,0 11,27.
Izolovaná a purifikovaná CD28 cDNA o délce přibližně 689 nukleotidových kódů pro otevřený čtecí rámec kočičího CD28 polypeptidu o délce při bližně 221 aminokyselin, jejíž přirozená membránou vázaná nebo zralá forma má molekulovou hmotnost přibližně 25 319 kDa, isoelektrický bod přibližně 9,17, celkový náboj při pH 7,0 9,58.
• fcfcfc • · · ·
01-3118-00-Če fc ······ ·· · · · • fc · · fc · fcfc • fc fcfc fcfc · fcfc ·
116
Izolovaná a purifikované KOČIČÍ CTLA-4 cDNA o délce přibližně 749 nukleotidových kódů pro otevřený čtecí rámec kočičího CTLA-4 polypeptidu o délce při bližně 223aminokyselin, jejíž přirozená membránou vázaná nebo zralá forma má molekulovou hmotnost přibližně 24 381 kDa, isoelektrický bod přibližně 6,34, celkový náboj při pH 7,0 -0,99.
Koexprese CD80 s kostimulačnimi molekulami CD28 nebo CTLA-4 a nádorového antigenu nebo antigenu z patogenního organizmu má schopnost aktivovat nebo zvyšovat aktivitu T-lymfocytu, konkrétněji The-1 lymfocytů a podporovat růst dalších buněčných typů. Koexprese CD80 s kostimulační molekulou CTLA-4 má schopnost potlačit aktivitu T-lymfocytů, konkrétněji The-1 lymfocytů. Koexprese CD86 s kostimulačnimi molekulami CD28 nebo CTLA-4 a nádorového antigenu nebo antigenu z patogenního organizmu má schopnost aktivovat nebo zvyšovat aktivitu T-lymfocytu, konkrétněji The-1 lymfocytů a podporovat růst dalších buněčných typů. Koexprese CD28 s kostimulační molekulou CTLA-4 má schopnost potlačit aktivitu T-lymfocytů, konkrétněji The-1 lymfocytů.
• · · ·
01-3118-00-Če
117
DNA Humánní Humánní Myší Myší Králičí Kuřecí
a AA homolog. homolog. homolog. homolog. homolog. homolog.
sekvenč- (DNA (AA (DNA (AA (DNA/AA (DNA/AA
ní % sekvenč- sekvenč- sekvenč- sekvenč- sekvenč- sekvenč-
identita ní) % ní) % ní) % ní) % ní) % ní) %
identita identita identita identita identita identita
Kočičí 77 59 62 46 — —
CD80
Kočičí 72 68 — — 67/64 —
CD8 6
Kočičí 85 82 77 74 84/84 59/50
CD28
Kočičí 88 88 79 78 — —
CTLA-4
Příklad 21
Použití CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD28 a CTLA-4 ve vakcínách
Cílem následujících experimentů je zhodnotit schopnost CD80, CD8 6, CD28 a CTLA-4 v kočičích vakcínách zvyšovat imunitu.
Kočičí CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 se vkládají do rekombinantních virových vektorů (odvozených z kočičího herpesviru, viru neštovic prasat nebo viru neštovic mývalů) použitelných pro expresi rekombinantních proteinů v těle koček (viz PCT mezinárodní patentová přihláška WO 96/22363 nebo WO 96/13575). Rekombinantní virové vektory exprimující všechny čtyři imunitu-zvyšující molekuly nebo alternativně exprimující párové kombinace CD80 a CD28 nebo CD80 a CTLA-4, nebo CD86 a CD28 nebo CD86 a CTLA-4 se podávají kočkám ve věku 8 týdnů orálně nebo • · • · · · • · « · • · · · · · ♦
9 9 9 9 9 9
9 9999· 9 9
9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 99 9 99 9
01-3118-00-Če
118 intramuskulámě v dávce 0,1 mg až 10,0 mg/kg tělesné hmotnosti nebo v dávce přibližně 104 až 109 klak tvořících jednotek (pfu) nebo výhodně v dávce přibližně 106 pfu. Subjednotková vakcína pro FIV nebo FeLV nebo vakcína virového vektoru pro FIV nebo FeLV (viz výše) se podává v minimální proteinové dávce, současně s imunitu-zvyšující kočičí CD80, CD86, CD28 a CTLA-4-vektorovanou vakcínou. O tři až čtyři týdny později se kočkám podá druhá dávka vakcíny. Kočky se infikují virulentním FIV kmenem (PPR nebo Petaluma) nebo FeLV Rickardovým kmenem (podaným s methylprednisolonem, který potlačí imunitu u koček) ve USDA standardní dávce a po dobu následujících 12 týdnů se pravidelně vyšetřují na vývoj virémie. Skupina vakcinovaných koček se podrobila dvanáctitýdennímu pozorování, které bylo zaměřeno na vývoj nádoru způsobeného FeLV. Počet výskytů onemocnění u koček se porovnal s kontrolními kočkami, kterým nebyla poskytnuta žádná vakcína, nebo kterým byla poskytnuta pouze FIV nebo FeLV vakcína bez imunitu-zvyšujících molekul. Výsledky imunologických experimentů byly následující: u koček, kterým nebyla podána žádná vakcína a následně byly infikované FeLV nebo FIV, se objevil více než 60% vývoj perzistentní virémie; kočky vakcinované subjednotkovou FIV nebo FeLV vakcínou a následně infikované, byly chráněny ze 75 % před virémii; a u koček, kterým byla podána subjednotková FIV nebo FeLV vakcína a kombinace imunituzvyšujícího kočičí CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 vektorované vakcíny a které byly následně infikovány, byla zjištěna 100% ochrana před virémii. Dalším přínosem podání kočičí CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 vektorované vakcíny je kromě 100% ochrana proti virémii a/nebo tvorbě nádoru, dlouhé trvání imunity (delší než 1 rok); brzký nástup imunity; nebo možnost primární vakcinace c jedné dávce namísto dvou dávek, které v současné době vyžadují všechny
4* 4 4 44 4 44 4
01-3118-00-Če
119 doposud dostupné vakcíny. Kočky vakcinované virově vektorovanými FIV nebo FeLV vakcínami jsou chráněny před infekcí podstatně vyšší měrou než kočky vakcinované subjednotkovou FIV nebo FeLV vakcínou. Kočky přijímající virovou vektorovanou FIV nebo FeLV vakcínu a kombinaci imunitu-zvyšující kočičí CD80, CD86, CD28 a CTLA-4-vektorovanou vakcínu a následně jsou infikovány, jsou 100% chráněny před virémií. U koček vakcinovaných virovou vektorovanou FIV nebo FeLV vakcínu a kombinaci imunitu-zvyšující kočičí CD80, CD86, CD28 a CTLA-4-vektorovanou vakcínu se rovněž projevily další výše popsané přínosné aspekty.
U alternativního postupu se kočkám ve věku 8 týdnů intramuskulární injekcí podalo 100 pg plasmidu obsahujícího cDNA pro kočičí CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 molekuly ve směsi s plasmidem obsahujícím cDNA pro FlVenv a gag nebo FeLVenv a gag, nebo se alternativně těmto kočkám intramuskulární injekcí aplikovalo 100 pg plasmidu obsahujícího cDNA exprimujíci párové kombinace CD80 a CD28 nebo CD80 a CTLA-4 nebo CD86 a CD28 nebo CD86 a CTLA-4 spárované s CD28 a CTLA-4 ve směsi s plasmidem obsahujícím cDNA pro FlVenv a gag nebo FeLVenv a gag. Kontrolní kočky nepřijaly CD80, CD86, CD28 a CTLA-4. Kočky se infikovaly virulentním FeLV nebo FIV a podrobily se pozorování, které mělo odhalit příznaky výše popsaných onemocnění. Výsledky těchto experimentů s provokační injekcí byly následující: kočky přijímající cDNA vektor obsahující kočičí CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 a cDNA vektor obsahující FIV geny nebo FeLV geny vykazují 100% ochranu před onemocněním v porovnání s kočkami, které přijaly pouze cDNA vektor obsahující FIV geny nebo FeLV geny a které vykazovaly pouze 75% ochranu před onemocněním.
φφφ φ φ
Ol-3118-OO-Če
120
U alternativního postupu se kočkám ve věku 8 týdnů intrámuskulární injekcí aplikovalo 0,1 mg ažlOO mg purifikovaného proteinu pro kočičí CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 molekuly nebo alternativně párových kombinací CD80 nebo CD86 spárovaných s CD28 nebo CTLA-4 proteiny z výše popsaných rekombinantních cDNA vektorů a opět intramuskulární injekcí aplikovalo 0,1 mg až 100 mg subjednotkové vakcíny obsahující FlVenv a gag nebo FeLVenv a gag. Kontrolní kočky nepřijaly CD80, CD86, CD28 a CTLA-4. Kočky se infikovaly virulentním FIV kmenem nebo FeLV kmenem a podrobily se pravidelným pozorováním zaměřeným na vývoj onemocnění. Výsledky experimentů s provokační injekcí byly následující: kočky přijímající purifikovaný protein pro kočičí CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 a subjednotkovou vakcínu obsahující FIV a FeLV vykazují podstatně nižší počet výskytu onemocnění v porovnání s kočkami, které přijímaly pouze subjednotkovou vakcínu obsahující FIV a FeLV proteiny.
Příklad 22
Použití kočičího CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 jako profylaktické vakcíny pro ochranu před onemocněním
Kočičí CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 ve virovém vektoru rekombinantního viru neštovic prasat, rekombinantního viru neštovic mývalů nebo rekombinantního kočičího herpesviru, pokud se podají, jak popisuje příklad 17 ale bez podání subjednotkových nebo virových vektorovaných antigenu z patogenních organizmů, jsou použitelné pro stimulaci imunity a The-1 odezvy, která vyvolá ochrannou imunitní odezvu, pokud jsou napadeny virovým parasitickým nebo bakteriálním patogenem. Při alternativním
01-3118-00-Če
9 9 9 · 9 9 9 9 9 99
9999 99 9 · · 9
9999 99 « 99
999999 99 99 9
9999 99
9 99 99 9 99 9
121 postupu jsou kočičí CD80, CD86 v kombinaci s kočičím CTLA-4 ve virových vektorech, pokud se podají způsobem popsaným v příkladu 3, použitelné pro potlačení imunitní odezvy a při ochraně proti autoimunitním onemocněním u koček.
Příklad 23
Použití kočičího CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 k inhibicí a ničení růstu nádorových buněk
Nádorové buňky odebrané z těla kočky se transfektovaly virovým vektorem rekombinantního viru neštovic prasat, rekombinantního viru neštovic mývalů nebo rekombinantního kočičího herpesviru exprimujícím kočičí CD80 nebo CD86 v kombinaci s CD28 nebo CTLA-4. Transfektované nádorové buňky se podaly kočce a přítomnost CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 na povrchu nádorové buňky vyvolala širokou imunologickou odezvu na transfektované a netransfektované nádorové buňky, která způsobila usmrcení lokalizovaných a metastatických nádorových buněk. Při alternativním postupu jsou přímo do nádoru, který se nachází v těle kočky, indikovány vektory exprimující kočičí CD80 nebo CD86 v kombinaci s CD28 nebo CTLA-4, což vyvolalo širokou imunologickou odezvu na nádorové buňky, která způsobila usmrcení lokalizovaných a metastatických nádorových buněk.
01-3118-00-Če
Φ Φ φφ φφ φφφφ φφ φφφφ · φ · · φ φ φ φφφφφφ φφ · φ φ φφ φφφφ φφ φφφφ φφ φ φφ φ
122
Přiklad 24
Použití kočičího CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 jako terapeutického činidla pro léčení onemocnění koček
Kočičí CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 ve virovém vektoru rekombinantního viru neštovic prasat, rekombinantního viru neštovic mývalů nebo rekombinantního kočičího herpesviru, pokud se podají, jak popisuje příklad 17 ale bez podání subjednotkových nebo virových vektorovaných antigenů z patogenních organizmů, jsou použitelné při stimulaci imunity vedoucí k úplné eliminaci nebo alespoň redukci patologické úrovně onemocnění.
Experimentální data: SPV 246
Bezpečnost a účinnost rekombinantní virové vektorované SPV vakcíny obsahující FeLV gag a env a kočičí CD80
Konstrukce rekombinantního SPV viru, SPV 246, byla popsána výše. SPV 246 obsahuje pět cizích genů zahrnujících geny kódující FeLV gag a env a kočičí CD80 a jako dva markerové geny β-glukuronídasu a β-galaktosidasu. Exprese FeLV gag a env a CD80 v buňkách infikovaných SPV 246 se potvrdila analýzou Westernového přenosu. Pásy reprezentující specifický FeLV gag a env proteiny se detekovaly pomocí kozí polyklonální protilátky proti FeLV P27 (Biodesign, ME) , resp. monoklonální protilátky proti FeLV gp70 (Biodesign, ME) . Ukázalo se, že FeLV gag a env proteiny se posttranslačně zpracovávají podobně jako nativní virové proteiny. K analýze čistoty, exprese a stability se použil test s černým plakem a výše popsané protilátky. SPV 246 byl po alespoň pěti
01-3118-00-Če ·· 0 0 000· 0 0 0 · 0 0 0 0 0 0 0 0
00000 0 0
0 0 0 0
0 0 0 0
123 pasážích stabilní. 100% plaky generované z buněk infikovaných SPV 246 byly pozitivní pro FeLVgag, env, β-galaktosidasu a βglukuronidasu.
Exprese kočičího CD80 se potvrdila analýzou Westernového přenosu při použití polyklonální anti-humánní CD80 protilátky. Detekovala se množina pásů dosahujících velikostí od 30 kDa do 60 kDa, které jsou specifické pro kočičí CD80. Tyto pásy představují střídavé vzory CD80 s množinou glykosylací exprimovaného a modifikovaného v kontextu SPV a ESK-4 buněk.
SPV 246 a kontrolní virus SPV 003 a stejně tak další rekombinantní FHV a SPV FeLV vakcíny se testovaly, zdali jsou schopny chránit kočky proti perzistentní infekci. Test se prováděl v krátkosti následujícím způsobem. Osm týdnů stará koťata (10 koček ve skupině) se subkutánně vakcinovalo 1 ml SPV 246, kontrolním virem nebo dalšími rekombinantními viry (dávky se pohybovaly v rozmezí od 7xl05 pfu/kočku do lxlO7 pfu/kočku. Kočky se vakcinovaly třikrát v týdenních odstupech. Po vakcinaci se kočky infikovaly oro-nazální cestou Rickardovým FeLV standardním čelendž kmenem (106,2TCID50/ml/kočku) , po předchozím ošetření methylprednisolonacetátem (Depo-Medrol).
Sérum z těla koček se jednou týdne po dobu 15 týdnů po aplikaci provokační injekce analyzovalo na perzistentní virémii. Po pozitivním testování na přítomnost FeLV p27 po dobu 3 následujících týdnů se posuzovalo, zda jsou kočky perzistentně viremické.
Výsledky:
01-3118-00-Če
Φ Φ φφ φφφφ φφ φφφ· φ φ · φφφ
Φ·Φ· ·· * ·· • φ φ φ φ φ φ ·· φ · · • Φ φφφφ ·· • Φ ♦· φφ φ φφ φ
124
Kočky vakcinované SPV 24 6 byly částečně chráněny před FeLV virémií v FeLV čelendž studii. Předpokládanou chránitelnou frakční (PF) hodnotou pro kočky ošetřené SPV 246 byla 50% hodnota (Tabulka 1).
Tabulka 1: Počet a procento koček s perzistentní virémií 15 týdnů po aplikaci provokační injekce. Předpokládaná chránitelná frakce (PF) pro každou skupinu se vypočetla.
Sku- pina č. VIR (viry) počet koček s perzistentní virémií % koček s per- zistentní virémií PF (%C-%V) %c
1 FHV 018 (CMV-FeLVenv) FHV 019 (CMV-FeLVgag) 7/10 70% -16%
2 FHV 018 (CMV-FeLVenv) FHV 019 (CMV-FeLVgag) FHV 030 (gE-CD80) 6/10 60 0%
3 FHV 018 (CMV-FeLVenv) FHV 019 (CMV-FeLVgag) FHV 022 (L2E2-CD80) 7/10 70 -16%
4 SPV 089 (L2E2FeLVgag) SPV 195 (ElFeLVenv) FHV 030 (gECD80) 5/10 50 16%
5 SPV 246 (E2- FeLVgag/E- lFelVenv//L2E2-CD80) 3/10 30 50%
6 (SC) SPV 258 (L2E2- FeLVgag/L2E2- FeLVgp70) 5/10 50 16%
7 (IM) SPV 258 (L2E2- FeLVgag/L2E2- FeLVgp70) 6/10 60 0
8 SPV 003, FHV 005 6/10 60% 0
• · 0 0 0 0
00 0 · 0 0
01-3118-00-Ce
125
Příklady dalších rekombinantních virů obsahující CD80 a CD8 6
SPV 280
SPV 280 je rekombinantní virus neštovic prasat exprimující šest cizích genů. Homologní vektor označený jako 992-23.6 se zkonstruoval následujícím způsobem: Kočičí CD86 gen a CD80 gen se exprimovaly v bicistronní DNA kazetě za řízení syntetického pozdního neštovicového promotoru LPI, která pohání transkripci CD80 a CD8 6 a zahrnuje EMCV IRES prvek mezi dvěma otevřenými čtecími rámci; E. coli β-glukuronidasový gen je řízen syntetickým časným promotorem EP2. SPV 280 se odvodil z SPV 258, který obsahuje geny pro FeLVgag a env a β-galaktosidasu. SPV 258 se nejprve se nejprve zpracoval tak, aby obsahoval FeLV gag/proteasové geny a sestřihem upravený FeLV env (gp70) gen se za řízení syntetických časných/pozdních neštovicových promotorů LP2EP2; E. coli β-galaktosidasový gen se pod řízením konstitutivního I5L neštovicového promotoru inzerují do vypuštěného 1869bp parciálního Hindlll N fragmentu. CD80/CD86 a E. coli β-glukuronidasový gen se klonovaly do homologního vektoru 992-23.6 v distinkčním a neesenciálním SPV parciálním Hindlll K fragmentu.
SPV 280 se odvodil z SPV 258. Připravil se za použití homologního vektoru 992-23.6 a viru S-SPV-258 homologním rekombinantním postupem pro generování rekombinantního RPV, SPV nebo FHV. Transfekční zásobní surovina se screenovala s cílem nalézt rekombinantní SPV exprimující β-galaktosidasu (Bluogal a β-glukuronidasu kol purifikace
CPRG testy) nebo výsledkem několika rekombinantní virus označený jako SPV 280 (X-gluc test) modro/zeleného
Konečným plaku byl • « · ·« ♦
01-3118-00-Če ·· • · · · • · · · · · • ······ · · • · · · « · ♦ · ·· ♦ · · ·· • ·
126
U S-SPV-229 viru se provedla analýza na expresi FeLVgag, FeLVenv a markerových genů β-galaktosidásy a β-glukuronidasy analýzou s černým plakem. Za použití kozí polyklonální protilátky pro FeLVgag (Biodesign, ME) a myší monoklonální protilátky pro FeLVenv gp70 (Biodesign, ME) se zjistilo, že 100 % plaků generovaných z ESK-4 buněk infikovaných purifikovaným SPV 280 exprimuje FeLVgag a FeLVenv.
Exprese kočičího CD80 a CD86 se potvrdila pomocí analýzy Westernového přenosu za použití kozí polyklonální anti-humánní CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN). Detekovala se množina pásů v rozmezí velikostí od 30 kDa do 60 kDa specifických pro kočičí CD80 a množina pásů v rozmezí velikostí od 40 kDa do 70 kDa specifických pro kočičí CD86. Tyto pásy představují střídavé vzory CD80 a CD86 s množinou glykosylací exprimovaných v kontextu SPV a ESK-4 buněk.
SPV 281
SPV 281 je rekombinantní virus neštovic prasat exprimující šest cizích genů. Homologní vektor označený jako 992-23.6 se zkonstruoval způsobem popsaným pro SPV 280. SPV 281 se odvodil z SPV 228, který obsahuje geny pro FlVgag a env a β-galaktosidasu. FIV gag/proteasový geny se řídil syntetickým neštovicovým časným promotorem EP2; FlVenv gen se řídil syntetickým neštovicovým časným promotorem EPI; a E. coli β-galaktosidasový gen se řídil konstitutivním I5L neštovicovým promotorem. FlVgag/proteasa, env a E. coli β-galaktosidasa se inzerovaly do vypuštěného 1869bp parciálního HindlII N fragmentu. CD80/CD86 a E. coli β-gluku01-3118-00-Če
• 4 44 4 4 44«4 44 4
4 • 4 · • 4 4 4 4 4 4
•
• • * · · 4 · • 4 4 4 4 4
4 • · • 4 4 • • 4
44 • · 44 4 • 4 4 4 4
127 ronidasový gen se inzerovaly do distinkčního a neesenciálního SPV parciálním Hindlll K fragmentu.
SPV 281 se odvodil z SPV 228. Připravil se za použití homologního vektoru 992-23.6 a viru S-SPV-228 homologním rekombinantním postupem pro generování rekombinantního RPV, SPV nebo FHV. Transfekční zásobní surovina se screenovala s cílem nalézt rekombinantní SPV exprimující β-galaktosidasu (Bluogal a CPRG testy) nebo β-glukuronidasu (X-gluc test). Konečným výsledkem několika kol purifikace modro/zeleného plaku byl rekombinantní virus označený jako SPV 281.
U SPV 281 se provedla analýza na expresi FlVgag, FlVenv a markerových genů β-galaktosidásy a β-glukuronidasy analýzou s černým plakem. Za použití myších monoklonálních protilátek pro FlVgag (p27) a FlVenv (gplOO) (Custom Monoclonals, CA; resp. BioDesign International, ME) myší monoklonální protilátky pro βgalaktosidasu a králičí polyklonální protilátky pro βglukuronidasu (Biodesign, ME; resp. Molecular Probes, OR) se zjistilo, že 100 % plaků generovaných z ESK-4 buněk infikovaných purifikovaným SPV 281 exprimuje FlVgag a FlVenv.
Exprese kočičího CD80 a CD86 se potvrdila pomocí analýzy Westernového přenosu za použití polyklonální anti-humánní CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN) . Detekovala se množina pásů v rozmezí velikostí od 30 kDa do 60 kDa specifických pro kočičí CD80 a množina pásů v rozmezí velikostí od 40 kDa do 70 kDa specifických pro kočičí CD86. Tyto pásy představují střídavé vzory CD80 a CD86 s množinou glykosylací exprimovaných v kontextu SPV a ESK-4 buněk. FlVgag a env exprese se rovněž potvrdila analýzou Westernového přenosu za použití výše popsaných ·* ···« ··
9 «I • s 9 ·
9 9 9 • ··· · ·
9 9
01-3118-00-Ce
128 protilátek. Ukázalo se, že FlVgag a env jsou zpracovány do P24, resp. gp 100.
FHV 043
FHV 043 je rekombinantní kočičí herpesvirus exprimujicí pět cizích genů. Homologní vektor označený jako 987-57.Al se zkonstruoval následujícím způsobem: kočičí CD86 a CD80 gen se pod kontrolou bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru (CMV IE) klonovaly do bicistronní kazety, která pohání transkripci CD80 a CD86. Transkripci druhého downstream CD80 otevřeného čtecího rámce řídil EMCV IRES prvek. E. coli β-glukuronidasový gen je řízen gl promotorem infekčního viru laryngotracheitidy. CD80, CD86 a E. coli β-glukuronidasový gen se inzerovaly do FHV unikátní dlouhé oblasti v unikátním EcoRI místě odvozeném z parciálního Sáli H fragmentu FHV. Inzerce byla mezi gL a sousedními transkripčně aktivačními geny.
FHV 043 se odvodil z FHV 017, který obsahuje geny pro FlVenv a E. coli β-galaktosidasu. FlVenv gen se řídil CMV IE promotorem; a E. coli β-galaktosidasový gen se řídil gX promotorovým prvkem pseudovztekliny. FlVenv a E. coli β-galaktosidasa se inzerovaly do FHV US gE vypuštěného místa.
FHV 043 se odvodil z FHV 017. Připravil se za použití homologního vektoru 987-57.Al a viru FHV 017 homologním rekombinantním postupem pro generování rekombinantního RPV, SPV nebo FHV. Transfekční zásobní suroviny se screenovaly s cílem nalézt rekombinantní SPV exprimujicí β-galaktosidasu (Bluogal a CPRG testy) nebo β-glukuronidasu (X-gluc test). Konečným
01-3118-00-Če ·· 99 • · · * 9 9 · · 9 9 9 9 • 9 999 4 9 4 4 • 4 9 4 9 9
4* 99 9 ·« 9999 β
· ·· «99 4 9 9 9
9 9
99«
129 výsledkem několika kol purifikace modro/zeleného plaku byl rekombinantní virus označený jako FHV 043.
U FHV 043 se provedla analýza na expresi markerových genů β-galaktosidásy a β-glukuronidasy analýzou s černým plakem. Za použití myší monoklonální protilátky pro β-galaktosidasu (Biodesign, ME) a králičí polyklonální protilátky pro β-glukuronidasu (Molecular Probes, OR) se zjistilo, že 100 % plaků generovaných z CRFK buněk infikovaných plakem purifikovaným FHV 043 exprimuje β-galaktosidasu a β-glukuronidasu. Tento virus byl po alespoň pěti pasážích stabilní.
Exprese kočičího CD80 a CD86 se potvrdila pomocí analýzy Westernového přenosu za použití polyklonální anti-humánní CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN) . Detekovala se množina pásů v rozmezí velikostí od 30 kDa do 60 kDa specifických pro kočičí CD80 a množina pásů v rozmezí velikostí od 40 kDa do 70 kDa specifických pro kočičí CD86. FlVenv (gpl30) exprese se rovněž potvrdila analýzou Westernového přenosu za použití séra zotavené FIV infikované kočky.
Homologní vektor 1015-18.8A (LP1-CD86/IRES-CD80):
Pro vytvoření rekombinantního RPV viru exprimujícího CD80 a CD86 se použil homologní vektor 1015-18.8A: Zkonstruoval se plasmid obsahující neštovicový LPI promotor, EMCV IRES prvek a neštovicový polyA transkripční terminátor. Kočičí CD80 gen se PCR amplifikoval s primery 1/97.6 (5'-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-3') a 3/98.4 (5'-TCGAGGATCCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3') , přičemž oba primery obsahovaly BamHI klonovací místa. CD80 se klonoval za
01-3118-00-Če • · · · ·· · to to to ·· toto·· · · · · · · toto·· toto to toto ♦ to····· ·· ·· · ·· ·· ·· · ·· to « to
130
LPI promotorem. Kočičí CD86 gen se PCR amplifíkoval s primery 1/98.18 (5'-TCGACAATTGGATGGGCATTTGTGACAG-3') s Mfel klonovacím místem a se sestřihem upraveným 8/97.31 (5'-GTGGATCCAGGATCCGGAGCGG-3')· CD86 se klonoval za EMCV IRES prvkem. Kazeta se následně digerovala Notl a za řízení syntetického pozdního promotoru I5L se klonovala do RPV HindlII N vektoru obsahujícího E. coli β-galaktosidasový gen. Finální homologní vektor 101518.8A se použil pro přípravu virů obsahujících FIV nebo FeLV genů a CD80 a CD86 pomocí homologního rekombinantního postupu pro generování rekombinantního RPV.
S-RPV-045
S-RPV-045 je rekombinantní virus neštovic mývalů exprimující tři cizí geny. S-RPV-045 se odvodil z viru neštovic mývalů RPV-000 (ATCC VR-838). Připravil se za použití homologního vektoru 1015-18.8A a parentálního viru S-RPV-000 homologním rekombinantním postupem pro přípravu rekombinantního RPV. Transfektované zásobní suroviny se screenovaly ve snaze nalézt rekombinant za použití screenu vyhledávajícího rekombinantní RPV exprimující β-galaktosidasu (BLUO-GAL testy a screen na rekombinantní RPV exprimující enzymatické markerové geny). Virus se purifikoval plakem a podrobil pěti pasážím.
Za použití testu s černým plakem se u RPV-045 analyzovala exprese β-galaktosidasy. Při použití králičí polyklonální protilátky (ICN, OH) se ukázalo, že 100 % plaků generovaných z VĚRO buněk infikovaných purifikovaným RPV-045 exprimuje β-galaktosidasu.
01-3118-00-Če • · ·· 9 9·9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
999999 99 99 9
9 99 9
131
Analýza Westernového přenosu potvrdila expresi CD80 a CD86 za použití kozích polyklonálních anti-humánních CD80, resp. CD86 protilátek (R&D Systems, MN). Detekovala se množina pásů v rozmezí velikostí od 30kDa do 60kDa specifických pro kočičí CD80 a množina pásů v rozmezí velikostí od 40 kDa do 70 kDa specifických pro kočičí CD86. FlVenv (gpl30) exprese se rovněž potvrdila analýzou Westernového přenosu za použití séra zotavené FIV infikované kočky. Tyto pásy představují střídavé vzory CD80 a CD8 6 s množinou glykosylací exprimovaného v kontextu RPV ve VĚRO buňkách.
S-RPV-046
RPV-046 je rekombinantní virus neštovic mývalů exprimující pět cizích genů. RPV-046 se odvodil z viru neštovic mývalů RPV-036. Připravil se za použití homologního vektoru 1015-18.8A a parentálního viru RPV-036 homologním rekombinantním postupem pro přípravu rekombinantního RPV. Transfektované zásobní suroviny se screenovaly ve snaze nalézt rekombinant za použití screenu vyhledávajícího rekombinantní RPV exprimující β-galaktosidasu (BLUO-GAL testy a screen na rekombinantní RPV exprimující enzymatické markerové geny). Virus se purifikoval plakem a podrobil pěti pasážím. Finálním výsledkem více kol purifikace modro/zeleného plaku byl rekombinantní virus RPV 046. RPV 046 obsahuje FlVgag gen řízený syntetickým časným/pozdním neštovicovým promotorem LP2EP2 a β-glukuronidasový gen řízený syntetickým časným neštovicovým promotorem EP2. Tyto geny jsou obsaženy v distinkčním a neesenciálním parciálním RPV HindlII U místě. CD80 a CD86 geny a β-galaktosidasa jsou obsaženy • · ·
01-3118-00-Če
132 v unikátním a distinkčním neesenciálním parciálním RPV Hindlll N místě.
U RPV-046 se provedla analýza na expresi β-galaktosidásy a β-glukuronidasy analýzou s černým plakem. Ukázalo se, že 100 % plaků generovaných z VĚRO buněk infikovaných purifikovaným RPV-046 exprimuje β-galaktosidasu a β-glukuronidasu.
Exprese kočičího CD80 a CD86 se potvrdila pomocí analýzy Westernového přenosu za použití kozí polyklonální anti-humánní CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN) . Detekovala se množina pásů v rozmezí velikostí od 30kDa do 60kDa specifických pro kočičí CD80 a množina pásů v rozmezí velikostí od 40 kDa do 70 kDa specifických pro kočičí CD86. Tyto pásy představují střídavé vzory CD80 a CD86 s množinou glykosylací exprimovaných v kontextu RPV ve VĚRO buňkách. FlVgag/proteasová exprese se rovněž potvrdila analýzou Westernového přenosu za použití myších monoklonálních protilátek pro FlVgag (p27) (Custom Monoclonals, CA) .
S-RPV-047
RPV-047 je virus neštovic mývalů exprimující pět cizích genů. Výše popsaným způsobem se zkonstruoval homologní vektor 1015-18.8A, který obsahoval LP1-CD86/IRES-CD80 kazetu a E. coli β-galaktosidasový gen řízený syntetickým pozdním promotorem I5L v Hindlll N fragmentu. RPV-047 se odvodil z RPV-044, který obsahuje geny pro FlVenv a E. coli β-glukuronidasu v RPV Hindlll U fragmentu. FlVenv Gen je řízen syntetickým časným promotorem EP1.
01-3118-00-Če ·· · · · · · · · φ ·· • · · φ φφ φ φφ • · φ φ φφ · φφ • ΦΦΦ·»· φφ · φ φ •ΦΦΦ ·· φ ··
133 β-glukuronidasový Gen je řízen syntetickým pozdním promotorem LPI.
RPV-047 se odvodil z viru neštovic mývalů RPV-044. Připravil se za použití homologního vektoru 1015-18.8A a parentálního viru
RPV-044 homologním rekombinantního RPV. screenovaly ve rekombinantním postupem pro přípravu Transfektované zásobní suroviny se snaze nalézt rekombinant za použití screenu vyhledávajícího rekombinantní RPV exprimující β-galaktosidasu (BLUO-GAL testy a screen na rekombinantní RPV exprimující enzymatické markerové geny). Virus se purifikoval plakem a podrobil pěti pasážím. Finálním výsledkem více kol purifikace modro/zeleného plaku byl rekombinantní virus RPV 047.
U RPV-047 se provedla analýza na expresi β-galaktosidásy analýzou s černým plakem. Za použití králičí polyklonální protilátky (ICN, OH) se zjistilo, že 100 % plaků generovaných z VĚRO buněk infikovaných purifikovaným RPV-047 exprimuje β-galaktosidasu.
Exprese kočičího CD80 a CD86 se potvrdila pomocí analýzy Westernového přenosu za použití kozí polyklonální anti-humánní CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN). Detekovala se množina pásů v rozmezí velikostí od 30kDa do 60kDa specifických pro kočičí CD80 a množina pásů v rozmezí velikostí od 40 kDa do 70 kDa specifických pro kočičí CD86. Tyto pásy představují střídavé vzory CD80 a CD86 s množinou glykosylaci exprimovaných v kontextu RPV ve VĚRO buňkách. FlVenv exprese se rovněž potvrdila analýzou Westernového přenosu za použití myších monoklonálních protilátek pro FlVenv (gplOO) (BioDesign International, ME) .
01-3118-00-Če
4 · · ·· · · · · ·· • ••4 · · · ·· • •44 44 · ·· • ······ · · · « 4 • 4 ···· ··
44 ·· « 4·
134
S-RPV-048
RPV-048 je virus neštovic mývalů exprimující pět cizích genů. Výše popsaným způsobem se zkonstruoval homologní vektor 1015-18.8A, který obsahoval LP1-CD86/IRES-CD80 kazetu a E. coli β-galaktosidasový gen řízený syntetickým pozdním promotorem I5L v HindlII N fragmentu. RPV-048 se odvodil z RPV-038, který obsahuje geny pro FlVgag/proteasu a E. coli β-glukuronidasu v RPV HindlII U fragmentu. FlVgag/proteasový Gen je řízen syntetickým pozdním/časným promotorem LP2EP2. β-glukuronidasový gen je řízen syntetickým pozdním promotorem LPI.
RPV-048 se odvodil z viru neštovic mývalů RPV-038. Připravil se za použití homologního vektoru 1015-18.8A a parentálního viru
RPV-038 homologním rekombinantního RPV.
rekombinantním postupem pro přípravu Transfektované zásobní suroviny se screenovaly ve snaze nalézt rekombinant za použití screenu vyhledávajícího rekombinantní RPV exprimující β-galaktosidasu (BLUO-GAL testy a screen na rekombinantní RPV exprimující enzymatické markerové geny). Virus se purifikoval plakem a podrobil pěti pasážím. Finálním výsledkem více kol purifikace modro/zeleného plaku byl rekombinantní virus RPV 048.
U RPV-048 se provedla analýza na expresi β-galaktosidásy analýzou s černým plakem. Za použití králičí polyklonální protilátky (ICN, OH) se zjistilo, že 100 % plaků generovaných z VĚRO buněk infikovaných purifikovaným RPV-048 exprimuje β-galaktosidasu.
Exprese kočičího CD80 a CD86 se potvrdila pomocí analýzy Westernového přenosu za použití kozí polyklonální anti-humánní CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN) . Detekovala se
01-3118-00-Če
135 množina pásů v rozmezí velikostí od 30kDa do 60kDa specifických pro kočičí CD80 a množina pásů v rozmezí velikostí od 40 kDa do 70 kDa specifických pro kočičí CD86. Tyto pásy představují střídavé vzory CD80 a CD86 s množinou glykosylací exprimovaných v kontextu RPV ve VĚRO buňkách. FlVgag/proteasová exprese se rovněž potvrdila analýzou Westernového přenosu za použití králičích monoklonálních protilátek pro FlVgag (p27) (BioDesign International, ME).
S-RPV-052
RPV-052 je virus neštovic mývalů exprimující šest cizích genů. Výše popsaným způsobem se zkonstruoval homologní vektor 1015-18.8A, který obsahoval LP1-CD86/IRES-CD80 kazetu a E. coli β-galaktosidasový gen řízený syntetickým pozdním promotorem I5L v HindlII N fragmentu. RPV-052 se odvodil z RPV-030, který obsahuje geny pro FeLVgag/proteasu, FeLVenv a E. coli β-glukuronidasu v RPV HincřlII U fragmentu. FeLVgag/proteasový gen je řízen syntetickým časným promotorem EP2. FeLVenv Gen je řízen syntetickým časným promotorem EPl. β-glukuronidasový Gen je řízen syntetickým pozdním promotorem LPI.
RPV-052 se odvodil z viru neštovic mývalů RPV-030. Připravil se za použití homologního vektoru 1015-18.8A a parentálního viru
RPV-030 homologním rekombinantního RPV.
rekombinantním postupem pro přípravu Transfektované zásobní suroviny se screenovaly ve snaze nalézt rekombinant za použití screenu vyhledávajícího rekombinantní RPV exprimující β-galaktosidasu (BLUO-GAL testy a screen na rekombinantní RPV exprimující enzymatické markerové geny). Virus se purifikoval plakem a « · • ······ · · · 0 0 0 · · 0 · 0 · · • · 0 0 · · 0 ·· 000
01-3118-00-Če
136 podrobil pěti pasážím. Finálním výsledkem více kol purifikace modro/zeleného plaku byl rekombinantní virus RPV 052.
U RPV-052 se provedla analýza na expresi β-galaktosidás.y, βglukuronidasy, FeLVgag a FeLVenv analýzou s černým plakem. Analýza Westernového přenosu prováděná za použití kozí polyklonální anti-humánní protilátky CD80, resp. CD86 (R&D Systems, MN)potvrdila expresi CD80 a CD86. FeLVgag/proteasová a FeLVenv env exprese se rovněž potvrdila analýzou Westernového přenosu za použití králičích polyklonálních protilátek pro FeLVgag (p27) (BioDesign International, ME) a myší monoklonální protilátky pro FeLVenv (gplOO) (BioDesign International, ME).
S-RPV-053
RPV-053 je virus neštovic mývalů exprimující šest cizích genů. Výše popsaným způsobem se zkonstruoval homologní vektor 1015-18.8A, který obsahoval LP1-CD86/IRES-CD80 kazetu a E. coli β-galaktosidasový gen řízený syntetickým pozdním promotorem I5L v HindlII N fragmentu. RPV-053 se odvodil z RPV-034, který obsahuje geny pro FlVgag/proteasu, FlVenv a E. coli β-glukuronidasu v RPV HindlII U fragmentu. FlVgag/proteasový gen je řízen syntetickým časným promotorem EP2. FlVenv Gen je řízen syntetickým časným promotorem EP1. β-glukuronidasový Gen je řízen syntetickým pozdním promotorem LPI.
RPV-053 se odvodil z viru neštovic mývalů RPV-034. Připravil se za použití homologního vektoru 1015-18.8A a parentálního viru RPV-034 homologním rekombinantním postupem pro přípravu rekombinantního RPV. Transfektované zásobní suroviny se • 9 • 9 · · · · · · 9 9
9·« 99 9 ···
9 9 9 · 9 9 ·9 99 9 9
9999 999
99 9· 9 99 999
01-3118-00-Če
137 screenovaly ve snaze nalézt rekombinant za použití screenu vyhledávajícího rekombinantní RPV exprimující β-galaktosidasu (BLUO-GAL testy a screen na rekombinantní RPV exprimující enzymatické markerové geny). Virus se purifikoval plakem a podrobil pěti pasážím. Finálním výsledkem více kol purifikace modro/zeleného plaku byl rekombinantní virus RPV 053.
S-SPV-275
S-SPV-275 je rekombinantní virus neštovic prasat exprimující pět cizích genů. Homologní vektor označený jako 992-23.6 se zkonstruoval následujícím způsobem: Kočičí CD86 gen a CD80 gen se exprimovaly v bicistronní DNA kazetě za řízení syntetického pozdního neštovicového promotoru LPI, která pohání transkripci CD80 a CD8 6 a zahrnuje EMCV IRES prvek mezi dvěma otevřenými čtecími rámci. E. coli β-Glukuronidasový gen je řízen syntetickým neštovicovým časným promotorem EP2. Jako parentální virus se použil S-SPV-046, který obsahuje gen pro FlVgag/proteasu řízený syntetickým časným/pozdním neštovicovým promotorem LP2EP2; a E. coli β-galaktosidasový gen řízený konstitutivním neštovicovým promotorem OIL.FlVgag/proteasový a β-galaktosidasový gen se inzerují do SPV parciálního HíncřlII M fragmentu, zatímco CD80/CD86 a E. coli β-glukuronidasový gen se inzerovaly do SPV parciálního HindlII K fragmentu.
S-SPV-275 se odvodil z S-SPV 046. Připravil se za použití homologního vektoru 992-23.6 a viru S-SPV 046 homologním rekombinantním postupem pro generování rekombinantního FHV. Transfekční zásobní surovina se screenovala s cílem nalézt rekombinantní FHV exprimující β-glukuronidasu (X-gluc test).
01-3118-00-Če
138
Konečným výsledkem několika kol purifikace modro/zeleného plaku byl rekombinantní virus označený jako SPV 275.
U S-SPV-275 viru se provedla analýza na expresi FlVgag a markerových genů β-galaktosidásy a β-glukuronidasy analýzou s černým plakem. Za použití myší monoklonální protilátky pro FlVgag (Custom Monoclonals, CA) se zjistilo, že 100 % plaků generovaných z ESK-4 buněk infikovaných purifikovaným S-SPV 275 exprimuje FlVgag a je po 5 pasážích stabilní.
Exprese FlVgag, CD80 a CD86 se potvrdila pomocí analýzy Westernového přenosu za použití myší monoklonální protilátky pro FlVgag a kozí polyklonální anti-humánní CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN) . Při 50 kDa a 27 kDa se detekovaly dva distinkční pásy specifické pro FlVgag. Dále se detekovala množina pásů v rozmezí velikostí od 30kDa do 60kDa specifických pro kočičí CD80 a množina pásů v rozmezí velikostí od 40 kDa do 70 kDa specifických pro kočičí CD86.
S-FHV-040
S-FHV-040 je rekombinantní kočičí herpesvirus exprimující pět cizích genů. Homologní vektor označený jako 957-87.Al se zkonstruoval následujícím způsobem: Kočičí CD86 gen a CD80 gen se exprimovaly za řízení bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru (CMV IE) v bicistronní kazetě, která pohání transkripci CD80 a CD86 a mezi dvěma otevřenými čtecími rámci zahrnuje EMCV IRES prvek. β-Glukuronidasový gen je řízen gl promotorem viru infekční laryngotracheitidy. CD80, CD86 a β-glukuronidasový gen se inzerují do unikátní dlouhé oblasti FHV
01-3118-00-Če ·· ·♦···· ·· * 000« · 0 0 0 · 0 · 0000 00 0 00 0
0 000 0000 000 0 00 00·« «00
00 00 · 0· »0·
139 genomu v unikátním EcoRI místě odvozeném z parciálního Sáli H fragmentu FHV mezi gL a sousedními transkripčně aktivačními geny. Jako parentální virus se použil S-FHV 019, který obsahuje CMV IE promotorem řízený FeLVgag gen a E. coli β-galaktosidasový gen řízený gX promotorem pseudovztekliny; oba tyto geny se nacházejí na FHV unikátním krátkém (US) gE vypuštěném místě.
S-FHV 040 se odvodil z S-FHV 019. Připravil se za použití homologního vektoru 987-57.Al a viru S-FHV 019 homologním rekombinantním postupem pro generování rekombinantního FHV. Transfekční zásobní surovina se screenovala s cílem nalézt rekombinantní FHV exprimující β-glukuronidasu (X-gluc test). Konečným výsledkem několika kol purifikace modro/zeleného plaku byl rekombinantní virus označený jako S-FHV 040.
U S-FHV 040 viru se provedla analýza na expresi FeLVgag a markerových genů β-galaktosidásy a β-glukuronidasy analýzou s černým plakem. Zjistilo se, že 100 % plaků generovaných v CRFK buňkách exprimuje β-galaktosidasu a β-glukuronidasu. Exprese FeLVgag se rovněž potvrdila testem s černým plakem využívajícím kozí polyklonální protilátku proti FeLV gp27 (BioDesigns; ME) . Ukázalo se, že tento virus je po pěti pasážích stabilní.
Exprese FeLVgag, kočičího CD80 a CD86 se potvrdila pomocí analýzy Westernového přenosu. Pro kočičí CD80 a CD86 se použily kozí polyklonální anti-humánní CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN) . Detekovala se množina pásů v rozmezí velikostí od 30kDa do 60kDa specifických pro kočičí CD80 a množina pásů v rozmezí velikostí od 40 kDa do 70 kDa specifických pro kočičí CD86. Exprese FeLV se potvrdila použitím kozí polyklonální protilátky proti FeLV gp27 (BioDesigns, ME).
01-3118-00-Če
4 4 4 4 4 4444 44 4
4444 4 4 4 4444
4444 44 4 44 4
4 444 4444 ««4 4
4444 4 4 4
44 44 4 44 444
140
S-FHV 042
S-FHV-042 je rekombinantní kočičí herpesvirus exprimujíci pět cizích genů. Homologní vektor označený jako 957-87.Al se zkonstruoval následujícím způsobem: Kočičí CD86 gen a CD80 gen se exprimovaly za řízení bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru (CMV IE) v bicistronní kazetě, která pohání transkripci CD80 a CD86 a mezi dvěma otevřenými čtecími rámci zahrnuje EMCV IRES prvek. β-Glukuronidasový gen je řízen gl promotorem viru infekční laryngotracheitidy. CD80, CD86 a β-glukuronidasový gen se inzerují do unikátní dlouhé oblasti FHV genomu v unikátním EcoRI místě odvozeném z parciálního Sáli H fragmentu FHV mezi gL a sousedními transkripčně aktivačními geny. Jako parentální virus se použil S-FHV 018, který obsahuje CMV IE promotorem řízený FeLVenv gen a E. coli β-galaktosidasový gen řízený gX promotorem pseudovztekliny; oba tyto geny se nacházejí na FHV unikátním krátkém (US) gE vypuštěném místě.
S-FHV 042 se odvodil z S-FHV 018. Připravil se za použití homologního vektoru 987-57.Al a viru S-FHV 018 homologním rekombinantním postupem pro generování rekombinantního FHV. Transfekční zásobní surovina se screenovala s cílem nalézt rekombinantní FHV exprimujíci β-glukuronidasu (X-gluc test). Konečným výsledkem několika kol purifikace modro/zeleného plaku byl rekombinantní virus označený jako S-FHV 042. U S-FHV 042 viru se provedla analýza na expresi FeLVenv a markerových genů β-galaktosidásy a β-glukuronidasy analýzou s černým plakem. Zjistilo se, že 100 % plaků generovaných v CRFK buňkách exprimuje β-galaktosidasu a β-glukuronidasu. Exprese FeLVenv se rovněž potvrdila testem s černým plakem využívajícím myší monoklonální
01-3118-00-Če • Φ φ · φ φ · φ φ · · · φφφφ φφ φ φφφ φ φ φφφ φ φ φ φ φ · φ φφφ φφ φφ φφ φ
141 protilátku proti FeLV gp70 (BioDesigns; ΜΕ). Ukázalo se, že tento virus je po pěti pasážích stabilní.
Exprese kočičího CD80, CD86 a FeLVenv se potvrdila pomocí analýzy Westernového přenosu. Pro kočičí CD80 a CD86 se použily kozí polyklonální anti-humánní CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN) . Detekovala se množina pásů v rozmezí velikostí od 30kDa do 60kDa specifických pro kočičí CD80 a množina pásů v rozmezí velikostí od 40 kDa do 70 kDa specifických pro kočičí CD86. lOOkDa FeLVenv Pás se detekoval za použití myší monoklonální protilátky proti FeLV gp70 (BioDesigns, ME).
S-FHV 044
S-FHV 044 je rekombinantní kočičí herpesvirus exprimujicí pět cizích genů. Homologní vektor označený jako 957-87.Al se zkonstruoval následujícím způsobem: Kočičí CD86 gen a CD80 gen se exprimovaly za řízení bezprostředně předcházejícího promotoru cytomegaloviru (CMV IE) v bicistronní kazetě, která pohání transkripci CD80 a CD86 a mezi dvěma otevřenými čtecími rámci zahrnuje EMCV IRES prvek. β-Glukuronidasový gen je řízen gl promotorem viru infekční laryngotracheitidy. CD80, CD86 a β-glukuronidasový gen se inzerují do unikátní dlouhé oblasti FHV genomu v unikátním EcoRI místě odvozeném z parciálního Sáli H fragmentu FHV mezi gL a sousedními transkripčně aktivačními geny. Jako parentální virus se použil S-FHV 016, který obsahuje CMV IE promotorem řízený FlVgag/proteasový gen (s deleci devíti aminokyselin v 5' konci proteasového genu) a E. coli β-galaktosidasový gen řízený gX promotorem pseudovztekliny; oba tyto geny se nacházejí na FHV unikátním krátkém (US) gE vypuštěném místě.
01-3118-00-Če
♦ · • • 4 « 4 4 4 « 4 4 4 • 4 • 4 4 • ·
• 4 · *
4
* • 444 4 · 4 4 4 · · •
• 4 4 • • 4 • 4 4
·· • 4 • 4 4 4 4 444
142
S-FHV 044 se odvodil z S-FHV 016. Připravil se za použití homologního vektoru 987-57.Al a viru S-FHV 016 homologním rekombinantním postupem pro generování rekombinantního FHV. Transfekční zásobní surovina se screenovala s cílem nalézt rekombinantní FHV exprimující β-glukuronidasu (X-gluc test). Konečným výsledkem několika kol purifikace modro/zeleného plaku byl rekombinantní virus označený jako S-FHV 044. U S-FHV 044 viru se provedla analýza na expresi FlVgag a markerových genů β-galaktosidásy a β-glukuronidasy analýzou s černým plakem. Zjistilo se (za použití myších monoklonálních protilátek (BioDesign, ME) , že 100 % piaků generovaných v CRFK buňkách exprimuje β-galaktosídasu a β-glukuronidasu. Exprese FlVgag se rovněž potvrdila testem s černým plakem využívajícím myší monoklonální protilátku proti FlVgag (Custom Monoclonals, CA) . Ukázalo se, že tento virus je po pěti pasážích stabilní.
Exprese kočičího CD80, CD86 a FlVgag se potvrdila pomocí analýzy Westernového přenosu. Pro kočičí CD80 a CD86 se použily kozí polyklonální anti-humánní CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN) . Detekovala se množina pásů v rozmezí velikostí od 30kDa do 60kDa specifických pro kočičí CD80 a množina pásů v rozmezí velikostí od 40 kDa do 70 kDa specifických pro kočičí CD86. Za použití myší monoklonální protilátky proti FlVgag se detekovaly dva distinkční pásy, 50 kDa a 27 kDa, specifické pro FlVgag.
01-3118-00-Če
• • 00 0· • 0 ♦ • 0· 000· 0 0 00 0 0 0 0 0
• 0 «·· 0 0 «0 0 0 0 0
• • 0 0 0 0 0 0 0
00 00 00 0 0 0 0 0 0
143
Tabulka 2: SPV Rekombinantní viry obsahující geny kódující CD80 a/nebo CD28.
Vir č. Popis inzercí cizích genů Analýza exprese Westernovým přenosem nebo testem s černým plakem
CD 80 CD 86 GAG ENV β-GAL β-GLU
SPV 228 EP2-FTVgag/EPl-FIVenv/l5LlacZ Hcmologní vektor = 926-45.7X17 Parentální virus-SPV 001 + + +
SPV 261 EP2-FIVgag/EPl-FIVenv/I5LlacZ//L2E2-CD80/E2-UIDA Homologní vektor = 93121 .Al Parentální virus-SPV 228 + + + + +
SPV 275 L2E2-FIVgag/01L-lacZ//LlCD86/IRES-CD80/E2-UIDA Hcmologní vektor = 99223.6 a 992-23.2 Parentální virus = SPV 046 + + + + +
SPV 258 L2E2-FeLVGag/L2E2FeLVATMenv/Ll-lacZ Hcmologní vektor = 95444.1 Parentální virus = SPV 001 + + +
SPV 281 EP2-FTVgag/EPl-FIVenv/I5LlacZ//Ll-CD86/IRESCD80/E2-UIEA Hcmologní vektor = 992-23.6 Parentální virus = SPV 228 + + + + + -1-
SPV 246 E2-FeLVgag/L2E2FeLVenv/I5L-lacZ//L2E2CD80/E2-uidA Hcmologní vektor = 931-21.7X1 Parentální virus = SPV 224 + + + +
SPV 276 L2E2-FeLVgag/Ll- lacZ//LlCD86/IRES-CD80/E2-UIEA Hcmologní vektor = 99223.6 Parentální virus = SPV 089 + + + + +
01-3118-00-Če
ΦΦ φφ • · φ * · φ φ φφφφ φ φ φ φ φ ··· · φ · · • · · φφφ φφ φ φ φ φ φ
144
SPV 279 El-FeLVenv/Ll-lacZ//LlCD86/IRES/CD80/E2-UIDA Homologní vektor = 99223.6 Parentální virus = SPV 195 + + + + +
SPV 280 L2E2-FeLVGag/L2E2FeLVATMenv/Ll-lacZ//LlCD8 6/IRES-CD80/E2-UIDA Homologní vektor = 99223.6 Parentální virus = SPV 258 + + + + + +
SPV 285 E2-FeLVgag/ElFeLVMenv/I5L-lacZ//LlCD80/IRES/CD8 6/gI-UIDA Homologní vektor = 99223.6 Parentální virus = SPV 224 + + + + + +
SPV 270 LE-CD80ůlM/HIS/E2-uidA Homologní vektor = 96127.4 Parentální virus = SPV 001 + +
SPV 272 I£-CD86AIM/HIS/E2-uiciA (19-2) Homologní vektor = 969-20.9 Parentální virus = SPV 001 + +
SPV 273 LE-CD28ATM/HIS/E2-uidA Homologní vektor = 93091.2 Parentální virus = SPV 001 +
SPV 274 LE-CD86 (EL) /EP2-UIDA Homologní vektor = 97740.1 Parentální virus = SPV 001 + +
SPV 282 LP1-CD-86/IRES-GD80/E2UIQA Homologní vektor = 992-23.6 Parentální virus = SPV 001 + + + + +
·· ·· • ♦ · 9 • ·
01-3118-00-Če • · ··♦ 9 9 9 9
9 9 9 9 9
99 99 9
9
9
145
Tabulka 3: RPV rekombinantní viry obsahující geny kódující CD80 a/nebo CD86 a CD-28
Vir č. Popis inzercí cizích genů Analýza exprese Westernovým přenošen nebo testem s černým plakem
CD 80 CD 86 GAG ENV β-GAL β-GLU
RPV 046 L2E2-FIVgag/E2-UIDA//LPlCD86/IEES-CD80/l5L-LacZ Homologní vektor = 101518.8A Parentální virus = RPV 036 + + + + +
RPV 047 El-FIVenv/E2-UIDA//LPlCD86/IRES-CD80/I5L-LacZ Homologní vektor = 101518.8Ά Parentální virus = RPV 037/044 + + + + +
RPV 048 L2E2-FeLV Gag/E2-UIDA LPl-B7-/IRES-CD80/I5L-LacZ Hcmologní vektor = 101518.8A Parentální virus = RPV 038 + + + + 4*
RPV 052 H3 „UXfcaI misto/LPluicH/EPl-FeLVenv/S-RPV-030 EP2-FeLVgag H3 „H I5LJacZ/Ll-FeCD86/IRES/FeCD80 Hcmologní vektor = 101518.8A Parentální virus = RPV 030 + + + + + +
RPV 053 H3 „J' Xha I misto/EP2- ETVgag/EPl-FTVenv/S-RPV- 034 LPl-uicW/H3 „N I5L2acZ/Ll-FeCD86/IRES/FeCD80 Hcmologní vektor = 101518.8A Parentální virus = RPV 034 + + + + + +
RPV 022 L2E2-CD80/Ll-lacZ Hcmologní vektor = 93132 .A5 Parentální virus = RPV 000 + +
999
01-3118-00-Če
·· · · • ♦
9
9 9 ·
9 9
9 9
99 9
146
RPV 045 LP1-CD86/IRES-CD80/I5LLacZ Hcmologní vektor = 1015-18.8A Parentální virus = RPV 000 + + +
Tabulka 4: FHV rekombinantní viry obsahující geny kódující CD80 a nebo CD86 a CD28
Vir č. Popis inzercí cizích genů Analýza exprese Westernovým přenosem nebo testem s černým plakem
CD 80 CD 86 GAG ENV β-GAL β-GLU
FHV 044 IE-FIVgag(-9a.a.)gXlacZ//IE-CD86/IRESCD80/gI-UIDA Hcmologní vektor = 987-57.Al Parentální virus = FHV 016 + + + + +
FHV 047 IE-FIVgag(-9a.a.)gXlacZ//IE-CD86-TkpA/g.I-UIDA Hcmologní vektor = 99468.4 Parentální virus = FHV 016 + + + +
FHV 048 IE-FIVenv/gX-LacZ (AgE)// IE-CD86-TkpA/gI-UIDA Hcmologní vektor = 99468.4 Parentální virus = FHV 017 + + + +
FHV 042 IE-FeLVenv/gX-LacZ (AgE)// IE-CD8 6/IRES-CD80/gI-UIDA (SalH IG) Hcmologní vektor = 987-57. Al Parentální virus = EHV 018 + + + + +
FHV 040 IE-FeLVgag/gX-LacZ (AgE)// IE-CD86/IRES-CD80/gI-UIDA (SalH IG) Hcmologní vektor = 987-57 .Al Parentální virus = FHV 019 + + + + +
01-3118-00-Če ·· 0« ·0 0000 • 0 0 0 0 0 · • 0 0 0 0 0 · · ·00 ·0 00
0 0 0 0 0
0» 00 00 0
147
FHV 049 IE-FeLVenv/gX-LacZ (AgE)// IE-FeCD8 6-TkpA/gI-uidA (SalH IG) Hcmologní vektor = 994-68.4 Parentální virus = FHV 018 + + + +
EHV 050 IE-FeLVgag/gX-LacZ (AgE) IE-FeCD8 6-TkpA/gI-uidA (SalH IG) Hcmologní vektor = 994-68.4 Parentální virus = FHV 019 + + + +
EHV 030 gE-CD80/gE-lacZ (AgE) Hcmologní vektor = 92676.D7 Parentální virus = EHV 020 “l· +
Další příklady zahrnující ko-vektorující kočičí CD80 a CD86, atd. s částečnými nebo úplnými genomy FIV nebo FeLV:
Poznámka: Rekombinantní virové vektory obsahují CD80, CD86, CTLA4 nebo CD28 v rekombinantním viru s parciálním nebo plným genomovým doplňkem FIV a/nebo FIV a případně s IL-12 p35 a p40. Tyto rekombinantní viry mají potenciál jako vakcíny proti FIV a FeLV onemocněním u koček.
1. Exprese CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, kombinaci, v rekombinantním viru neštovic úplný nebo částečný genom FIV.
samotného nebo v prasat obsahujícím
2. Exprese CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného nebo v kombinaci, v rekombinantním kočičím herpesviru obsahujícím úplný nebo částečný genom FIV.
4
4 • 4 ·
01-3118-00-Če
4 44 • 4 · 4 4 4 * · 4 « «4
4 444 44 4
4 4 · 4
44 44 «4 *«·«
148
3. Exprese CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného nebo v
kombinaci, v rekombinantním viru neštovic mývalů obsahujícím
úplný nebo částečný genom FIV.
4. Exprese CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného nebo v
kombinaci, v rekombinantním viru neštovic prasat obsahujícím
úplný nebo částečný genom FeLV.
5. Exprese CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného nebo v kombinaci, v rekombinantním kočičím herpesviru obsahujícím úplný nebo částečný genom FeLV.
6. Exprese CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, kombinaci, v rekombinantním viru neštovic úplný nebo částečný genom FeLV.
samotného nebo v mývalů obsahujícím
7. Exprese CD80, CD86, CD28 a kombinaci, v rekombinantním viru úplný nebo částečný genom FIV a geny a p40.
CTLA-4, samotného nebo v neštovic prasat obsahujícím pro kočičí IL12, GM-CSF, p35
8. Exprese CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného nebo v kombinaci, v rekombinantním kočičím herpesviru obsahujícím úplný nebo částečný genom FIV a geny pro kočičí IL12, GM-CSF, p35 a p40.
9. Exprese CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného nebo v kombinaci, v rekombinantním viru neštovic mývalů obsahujícím úplný nebo částečný genom FIV a geny pro kočičí IL12, GM-CSF, p35 a p40.
10. Exprese CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného nebo v kombinaci, v rekombinantním viru neštovic prasat obsahujícím
01-3118-00-Če
fcfc fcfc • fc fcfcfcfc ·· fc
• fcfc fc « fc · • • fc ·
•
• • fcfcfc fc · • · fc · fc •
• • · • • fc • • fc
• fc fcfc «4 · ·« • fcfc
149 úplný nebo částečný genom FeLV a geny pro kočičí IL12, GM-CSF, p35 a p4 0.
11. Exprese CD80, CD8 6, CD28 a CTLA-4, samotného nebo v kombinaci, v rekombinantním kočičím herpesviru obsahujícím úplný nebo částečný genom FeLV a geny pro kočičí IL12, GM-CSF, p35 a p40.
12. Exprese CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného nebo v kombinaci, v rekombinantním viru neštovic mývalů obsahujícím úplný nebo částečný genom FeLV a geny pro kočičí IL12, GM-CSF, p35 a p40.
Tabulka 5: Rekombinantní viry obsahující FIV genom (ALTRs) a geny kódující kočičí CD80 a/nebo CD86
Vir č. Popis inzercí cizích genů Analýza exprese Westernovým přenosem nebo testem s černým plakem
CD 80 CD 86 GAG ENV β-GAL β-GLU
EHV 054 CMV-FTVgencm/gX-lacZ//gECD-80 Homologní vektor = 1016-75.Bl Parentálni virus = FHV 030 + + + +
FHV 055 CMV-FIVgencm/ gX-lacZ / /gECD-86/gX-UIDA Homologní vektor = 1016-75.Bl Parentálni virus = EHV 041 + + + + +
RPV 055 CMV-FTVgenon/LPlUIEA//LP1-CD86/IRESCD80/I5L-lacZ Homologní vektor = 1005-95.1 Parentálni virus = RPV 045 + + + + + +
SPV 288 CMV-FIVgencm/I5LlacZ//LPl-CD86/IRESCD80/EP2-UIDA Homologní vektor = 1007-70.A2 Parentálni virus = RPV 045 + + + + + +
*· »· • · · * • · · · • · ··· · • · · *· ·· ·· • · · • · • · · • ·
4· ·
01-3118-00-Če ·· 4»··· » · · • · « • · · • · · ·· ·
150
Příklady provedení vynálezu
Homologní vektor 1007-70.A2 (SPV N/CMV-FIVgenomÁLTR/l5L-lac2).
Homologní vektor 1007-70.A2 se použil pro inzert cizí DNA do HindlII N inzertního místa SPV. Zabudovává E. coli βgalaktosidasový markerový gen a celou délku FIV genomu (8,5 kb) bez ohraničujících dlouhých terminačních opakujících se (LTR) prvků. Tato kazeta je ohraničena SPV DNA homologickou s neesenciálním místem v SPV HindlII N fragmentu. Pokud se tento homologní vektor použije podle homologického rekombinantního postupu pro generování rekombinantního SPV viru, potom se získá virus obsahující DNA kódující cizí geny. Je třeba poznamenat, že β-galaktosidasový markerový gen je řízen konstitutivním neštovicovým promotorem I5L a FIV genom (ALTRs) je řízen bezprostředně předcházejícím promotorem cytomegaloviru (CMV IE). Homologní vektor se zkonstruoval za použití standardních rekombinantních DNA technik (Sambrook a kol.). FIV genom (ALTRs) se syntetizoval klonováním pomocí polymerasové řetězové reakce. Templátem pro PCR reakci byla provirová DNA z plasmidů obsahujícího celou délku FIV PPR viru. Upstream primer (5'-ACGCGTCGACCAGCTAACAAGGTAGGAGAGACTCT-311/23/98BW.3) se syntetizuje z 5' konce FIV genomu proti směru oblasti kódující gag a zavádí unikátní Sáli místo. Downstream primer (5'-TCGAGTCGACTTGTGACAGTTCTTAGTCCATAAGC-3'; 11/11/98BW.1) se syntetizuje z 3' konce FIV genomu po směru druhého Rev exonu a zavádí unikátní Sáli místo. Finální homologní vektor 1007-70.A2 se použil pro přípravu rekombinantních virů obsahujících FIV genom (bez LTRs) a kočičí CD80 a CD86 nebo pro přípravu rekombinantních virů obsahujících FlVgenom (mínus LTR) a kočičí CD80 a CD86 a kočičí IL-12 geny,
01-3118-00-Če
151 p35 a p40 podle homologického rekombinantního postupu pro generování rekombinantního SPV, RPV a FHV.
Homologní vektor 1005-95.1 (RPV U/CMV-FIVgenomALTR/l5LrLacZ).
Homologní vektor 1005-95.1 se zkonstruoval pro účely inzertu cizí DNA do RPV. Zabudovává FIVgenom-ALTR a E. coli β-glukuronidasový gen ohraničený RPV DNA. Upstreamem cizího genu je přibližně 906bp fragment RPV DNA. Downstreamem cizích genů je přibližně 895bp fragment ROV DNA. Pokud se plasmid použije podle homologického rekombinantního postupu pro generování rekombinantního RPV viru, potom se získá virus obsahující DNA kódující cizí geny. Je třeba poznamenat, že FIVgenom-ALTR je řízen bezprostředně předcházejícím promotorem cytomegalovíru a β-glukuronidasový gen je řízen syntetickým časným neštovicovým promotorem EP2. Homologní vektor se zkonstruoval za použití standardních rekombinantních DNA technik (Sambrook a kol.) spojením restrikčních fagmentů z následujících zdrojů se syntetickými DNA sekvencemi. Plasmidový vektor se odvodil z přibližně 2999bp HindlII restrikčního fragmentu pSP64 (Promega). Fragmentem 1 je přibližně 906 bp HindlII až Xbal restrikční subfragment RPV HindlII restrikčního fragmentu U (Knight a kol.). Fragmentem 2 je přibližně 8,5 kb Sall fragment FIV genomu bez LTR prvků, který se syntetizoval klonováním s pomocí polymerasové řetězové reakce. Templátem pro PCR reakci byla provirová DNA z plasmidu obsahujícího celou délku FIV PPR viru. Upstream primer (5'-ACGCGTCGACCAGCTAACAAGGTAGGAGAGACTCT-3'; 11/23/98BW.3) se syntetizuje z 5' konce FIV genomu proti směru oblasti kódující gag a zavádí unikátní Sall místo. Downstream primer (5'-TCGAGTCGACTTGTGACAGTT-CTTAGTCCATAAGC-3'; 11/11/98BW.1) se syntetizuje z 3' konce FIV genomu po směru
01-3118-00-Če ·· ·· · · ···· ·· • · · · ·· · ···
152 druhého Rev exonu a zavádí unikátní Sall místo. Fragmentem 3 je přibližně2,Okb fragment obsahující E. coli β-glukuronidasový gen. Fragmentem 4 je přibližně 895 bp Xbal až HindlII subfragment RPV HindlII fragmentu U. Finální homologní vektor 1005-95.1 se použil pro přípravu rekombinantních virů obsahujících FIV genom (Δ LTRs) a kočičí CD80 a CD86 nebo pro vytvoření rekombinantních virů obsahujících FlVgenom (Δ LTR) a kočičí CD80 a CD86 a kočičí IL-12 geny, p35 a p40 podle homologického rekombinantního postupu pro generování rekombinantního SPV, RPV a FHV.
Homologní vektor 1016-74.A6 (FHVAgE/CMV-FIVgenom-ALTR/gX-lacZ).
Homologní vektor 1016-74.A6 se zkonstruoval pro účely delece části gE kódující oblastí z kočičího herpesviru a pro inzert cizí DNA. Zabudovává FlVgenom (mínus LTRs) a E. coli β-galaktosidasový gen ohraničený FHV DNA. FIVgenom-ŮLTR je řízen IE promotorem cytomegaloviru a β-galaktosidasový gen je řízen gX promotorem viru pseudovztekliny. Homologní vektor se zkonstruoval za použití standardních rekombinantních DNA technik (Sambrook a kol.) z následujících zdrojů DNA. Plasmidový vektor se odvodil z přibližně 2958bp Asp718I restrikčního endonukleasového fragmentu pSP18/19. Fragmentem 1 je přibližně 1415 bp Asp718l až Smál subfragment FHV Sall B fragmentu. Fragmentem 2 je přibližně 8,5 kb Sall fragment FIV genomu bez LTR prvků, který se syntetizoval klonováním s pomocí polymerasové řetězové reakce. Templátem pro PCR reakci byla provirová DNA z plasmidu obsahujícího celou délku FIV PPR viru. Upstream primer (5'-ACGCGTCGACCAGCTAACAAGGTAGGAGA-GACTCT-311/23/98BW.3) se syntetizuje z 5' konce FIV. genomu proti směru oblasti kódující gag a zavádí unikátní Sall místo. Downstream primer (5'-TCGAGTCGACTT01-3118-00-Če φφφφ φ φ φ φ φφφ
ΦΦΦ φ
φ · φ φ φφφ
153
GTGACAGTT-CTTAGTCCATAAGC-3'; 11/11/98BW.1) se syntetizuje z 3' konce FIV genomu po směru druhého Rev exonu a zavádí unikátní Sáli místo. Fragmentem 3 je přibližně 3,5kb β-galaktosidasový genový fragment. Fragmentem 4 je přibližně 2205 bp Sáli až Asp718I subfragment FHV EcoRI E fragmentu. Finální homologní vektor 1016-74.A6 se použil pro přípravu rekombinantních virů obsahujících FIV genom (Δ LTRs) a kočičí CD80 a CD86 nebo pro vytvoření rekombinantních virů obsahujících FlVgenom (Δ LTR) a kočičí CD80 a CD86 a kočičí IL-12 geny, p35 a p40 podle homologického rekombinantního postupu pro generování rekombinantního SPV, RPV a FHV.
SPV 288
SPV 288 je rekombinantní virus neštovic prasat exprimujicí celý doplněk otevřených čtecích rámců obsažených ve FIV genomu a 4 další cizí geny. SPV 288 se odvodil z SPV 282. SPV 282 obsahuje kočičí CD86 gen a CD80 gen exprimované za řízení syntetického pozdního neštovicového promotoru LPI v bicistronní DNA kazetě, která pohání transkripci CD80 a CD86 a zahrnuje EMCV IRES prvek mezi dvěma otevřenými čtecími rámci; E. coli β-glukuronidasový gen je řízen syntetickým časným promotorem EP2 v SPV HindlII K genomovém fragmentu. Homologní vektor 992-23.6 se použil pro konstrukci SPV 282 homologickým rekombinantním postupem pro generování rekombinantního RPV, SPV nebo FHV. CD80/CD86 a E. coli β-glukuronidasový gen se inzerovaly do distinkčního a neesenciálního SPV parciálního HindlII K fragmentu. CMV-FIV genom a β-galaktosidasové geny se inzerovaly do distinkčního a neesenciálního SPV parciálního HindlII N fragmentu.
01-3118-00-Če ·· · · · · ···· ·· • · · · ·· · ··· • · · · ·· · · · • ······ · · · · · • · · · ·· · · · · · ·
154
SPV 288 se odvodil z SPV 282. Připravil se za použití homologního vektoru 1007-70.A2 (viz výše) a viru SPV-282 homologickým rekombinantním postupem pro generování rekombinantního RPV, SPV nebo FHV. Transfekční zásobní surovina s cílem nalézt rekombinantní SPV exprimující (BLUOGAL a CPRG testy) nebo β-glukuronidasu Konečným výsledkem několika plaku byl rekombinantní virus se screenovala β-galaktosidasu (X-GLUC test). modro/zeleného SPV 288.
kol purifikace označený jako
U S-SPV-288 viru se provedla analýza na expresi FeLVgag, FeLVenv z FIV genomu a markerových genů β-galaktosidásy a βglukuronidasy analýzou s černým plakem. Za použití kozí polyklonální protilátky pro FeLVgag (Biodesign, ME) a myší monoklonální protilátky pro FeLVenv gp70 (Biodesign, ME) se zjistilo, že 100 % plaků generovaných z ESK-4 buněk infikovaných purifikovaným SPV 288 exprimuje FeLVgag a FeLVenv.
Exprese kočičího CD80 a CD86 se potvrdila pomocí analýzy Westernového přenosu za použití kozí polyklonální anti-humánní CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN) . Detekovala se množina pásů v rozmezí velikostí od 30 kDa do 60 kDa specifických pro kočičí CD80 a množina pásů v rozmezí velikostí od 40 kDa do 70 kDa specifických pro kočičí CD86. Tyto pásy představují střídavé vzory CD80 a CD86 s množinou glykosylací exprimovaných v kontextu SPV v ESK-4 buňkách. Exprese proteinů kódovaných v FIV genomu se potvrdila v analýze Westernového přenosu za použití kočičího séra odebraného z těla koček infikovaných FIV.
01-3118-00-Če
«· 99 94 4 49 449
155
FHV 054
FHV 054 je rekombinantní kočičí herpesvírus exprimující celý doplněk otevřených čtecích rámců obsažených ve FIV genomu a 2 další cizí geny. Homologní vektor označený jako 1016-75.Bl se zkonstruoval pro účel insertu FIV genomu (ALTR) a β-galaktosidasy do FHV unikátního dlouhého parciálního Sal H fragmentu. Inzert je mezi gL genem a sousedními transkripčně aktivačními geny. FIV genom je řízen CMV IE promotoru; a E. coli β-galaktosidasový gen je řízen gX promotorovým prvkem pseudovztekliny.
FHV 054 se odvodil z FHV 030, který obsahuje kočičí CD80 gen v FHV gE vypuštěném místě. Připravil se za použití homologního vektoru 1016-75.Bl a viru FHV 030 homologickým rekombinantním postupem pro generování rekombinantního RPV, SPV nebo FHV. Transfekční zásobní suroviny se screenovaly s cílem nalézt rekombinantní FHV exprimující β-galaktosidasu (BLUOGAL a CPRG testy) nebo β-glukuronidasu (X-GLUC test). Konečným výsledkem několika kol purifikace modro/zeleného plaku byl rekombinantní virus označený jako FHV 054.
U FHV 054 viru se provedla analýza na expresi β-galaktosidásy analýzou s černým plakem. Za použití myší monoklonální protilátky (Biodesign, ME) se zjistilo, že 100 % plaků generovaných z CRFK buněk infikovaných purifikovaným FHV 054 exprimuje β-galaktosidasu.
Exprese kočičího CD80, FlVgag a FlVenv se potvrdila pomocí analýzy Westernového přenosu za použití polyklonální anti-humánní CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN) , myších monoklonálních anti-FIVgag protilátek (Custom Monoclonals, CA) a
01-3118-00-Če
156 myší monoklonální anti-FIVenv protilátky (Biodesign). Exprese celého doplňku FIV genů kódovaných v genomu se potvrdila v analýze Westernového přenosu za použití kočičího séra odebraného z těla zotavených koček infikovaných FIV.
FHV 055
FHV 055 je rekombinantní kočičí herpesvirus exprimující celý doplněk otevřených čtecích rámců obsažených ve FIV genomu a 3 další cizí geny. Homologní vektor označený jako 1016-75.B1 se zkonstruoval pro účel insertu FIV genomu (ALTR) a β-galaktosidasy do FHV unikátního dlouhého parciálního Sal H fragmentu.
Inzert je mezi FHV gL genem a sousedními transkripčně aktivačními geny. FIV genom je řízen CMV IE promotoru; a E. coli β-galaktosidasový gen je řízen gX promotorovým prvkem pseudovztekliny .
FHV 055 se odvodil z FHV 041, který obsahuje kočičí CD86 gen a β-glukuronidasový gen v FHV gE vypuštěném místě. Kočičí CD86 je řízen FHV gE promotorem a β-glukuronidasový gen je řízen gX promotorem pseudovztekliny. Připravil se za použití homologního vektoru 1016-75.B1 a viru FHV 041 homologickým rekombinantním postupem pro generování rekombinantního RPV, SPV nebo FHV. Transfekční zásobní suroviny se screenovaly s cílem nalézt rekombinantní FHV exprimující β-galaktosidasu (BLUOGAL a CPRG testy) nebo β-glukuronidasu (X-GLUC test). Konečným výsledkem několika kol purifikace modro/zeleného plaku byl rekombinantní virus označený jako FHV 055.
01-3118-00-Če
157
U FHV 055 viru se provedla analýza na expresi β-galaktosidásy a β-glukuronidasy analýzou s černým plakem. Za použití myší monoklonální protilátky (Biodesign, ME) a králičí polyklonální protilátky (Molecular Probes, OR) se zjistilo, že 100 % plaků generovaných z CRFK buněk infikovaných purifikovaným FHV 055 exprimuje β-galaktosidasu a β-glukuronidasu. Ukázalo se, že připravený virus je po 5 pasážích stabilní.
Exprese kočičího CD86, FlVgag a FlVenv se potvrdila pomocí analýzy Westernového přenosu za použití polyklonální anti-humánní CD86 protilátky (R&D Systems, MN) , myších monoklonálních antiFlVgag protilátek (Custom Monoclonals, CA) a myší monoklonální anti-FIVenv protilátky (Biodesign). Exprese celého doplňku FIV genů kódovaných v genomu se potvrdila v analýze Westernového přenosu za použití kočičího séra odebraného z těla zotavených koček infikovaných FIV.
RPV 055
RPV 055 je rekombinantní virus neštovic mývalů exprimující celý doplněk otevřených čtecích rámců obsažených ve FIV genomu a 4 další cizí geny. RPV 055 se odvodil z RPV 054, který obsahuje kočičí CD86 gen a CD80 gen exprimované za řízení syntetického pozdního neštovicového promotoru LPI v bicistronní DNA kazetě, která pohání transkripci CD80 a CD8 6 a zahrnuje EMCV IRES prvek mezi dvěma otevřenými čtecími rámci; E. coli β-glukuronidasový gen je řízen syntetickým časným promotorem EP2 v RPV HindlII N genomovém parciálním fragmentu. Homologní vektor 1005-95.1 se použil pro konstrukci RPV 055 homologickým rekombinantním postupem pro generování rekombinantního RPV, SPV nebo FHV.
01-3118-00-Če
4 · · · 4 · · ♦ · * · · • · · · · 4 · · · · · ······« · · · • ···«·· ·· · · · 4 • · · 4 4 4 4 4 · • · 4 4 4 4 4 44 444
158
CD80/CD86 a E. coli β-galaktosídasový gen se inzerovaly do distinkčního a neesenciálního RPV parciálního Hindlll N fragmentu. CMV-FIV genom a β-glukuronidasové geny se inzerovaly do distinkčního a neesenciálního RPV parciálního Hindlll U fragmentu.
RPV 055 se odvodil z RPV 054. Připravil se za použití homologního vektoru 1005-95.1 a viru RPV 054 homologickým rekombinantním postupem pro generování rekombinantního RPV, SPV nebo FHV. Transfekční zásobní surovina se screenovala s cílem nalézt rekombinantní RPV exprimujíci β-galaktosidasu (BLUOGAL a CPRG testy) nebo β-glukuronidasu (X-GLUC test). Konečným výsledkem několika kol purifikace modro/zeleného plaku byl rekombinantní virus označený jako RPV 055.
U RPV 055 viru se provedla analýza na expresi FeLVgag, FeLVenv z FIV genomu a markerových genů β-galaktosidásy a β-glukuronidasy analýzou s polyklonální protilátky pro černým plakem. Za použití kozí FeLVgag (Biodesign, ME) a myší monoklonální protilátky pro FeLVenv gp70 (Biodesign, ME) se zjistilo, že 100 % plaků generovaných z VĚRO buněk infikovaných purifikovaným RPV 055 exprimuje FeLVgag a FeLVenv.
Exprese kočičího CD80 a CD86 se potvrdila pomocí analýzy Westernového přenosu za použití kozí polyklonální anti-humánní CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN). Detekovala se množina pásů v rozmezí velikostí od 30 kDa do 60 kDa specifických pro kočičí CD80 a množina pásů v rozmezí velikostí od 40 kDa do 70 kDa specifických pro kočičí CD86. Tyto pásy představují střídavé vzory CD80 a CD86 s množinou glykosylací exprimovaných v kontextu RPV ve VĚRO buňkách. Exprese proteinů kódovaných v FIV
01-3118-00-Če ·· ·· ·· 44 4 4 4 9 9
4 4 4 4 9 9 9 9 9 4
4 4 9 4 4 4 4 4 4 · 494 4494 444 9
4 ···« 4 4 4
44 44 4 49 449
159 genomu se potvrdila v analýze Westernového přenosu za použití kočičího séra odebraného z těla koček infikovaných FIV.
Reference:
1. Argyle a kol., DNA Seq. 5, 169-171 (1995)
2. Azuma, M. a kol., J. Immunology 149, 1115-1123 (1992).
3. Azuma, M. a kol., Nátuře 366, 76-79 (1993).
4. Chambers a kol., Current Opinion in Immunology 9, 396-404 (1997) .
5. Chen a kol., J. Immunology 148, 2617-2621 (1992).
6. Chen a kol., Cell 71, 1093-1102 (1992).
7. Donnelly JJ a kol., Annu Rev Immunol 1997; 15: 617-648.
8. Freeman a kol., J. Immunology 143, 2714-2722 (1989).
9. Freeman a kol., J. Exp. Med. 174, 625-631 (1991).
10. Gimmmi a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 6575-6579 (1991).
11. Hathcock a kol., J. of Exp. Med. 180, 631-640 (1994) .
12. Hassett a Whitton, Trends Microbiol 1996; 4: 307-312.
13. Linsley a kol., Proč. Nati. Acad. Sel. USA 87, 5031-5035 (1990).
14. Jenkins a kol., J. Immunology 147, 2461-2466 (1991).
4···
01-3118-00-Če
160
Onions a kol., PCT Intl. Application WO 96/03435, Q-One Biotech., 8. února 1996.
Riley a kol.,J. Immunology 158, 5545-5553 (1997).
Tsuji a kol., Eur J Immunology 27(3), 782-787 (1997).
PCT mezinárodní patentová přihláška WO 92/00092, Bristol Myers Squibb.
PCT mezinárodní patentová přihláška WO 92/15671, Cytomed, lne., 17. září 1992.
PCT mezinárodní patentová přihláška WO 93/00431, Bristol Myers Squibb, 7. ledna 1993.
Akeson, A.L. a Woods, C.W. (1993). A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. J. Immunol. Meth. 163, 181-185.
Allison, J.P. a Lanier L. (1987). The structure and function of the T-cell antigen receptor. Immunol. 5, 503-540.
Allison, J.P. (1994). CD28-B7 interaction activation, Current Opinion Immunol. 6, 414-419.
, serology, Annu. Rev.
in T-cell
Anderson, P., Morimoto, C., Breitmeyer, J.B., Schlossman, S.F. (1988). Regulátory interactions between members of the immunoglobulin superfamily. Immunol. Today 9, 199-203.
Antonia, S.J., Munoz,-Antonia , T., Soldevila, G., Miller, J:, Flavell, R.A. (1995). B7-1 expression by a non-antigen presenting cell- derived tumor. Can. Res. 55, 2253-2256.
• 9 99
9 9 9 9 9
9 9 9 9 9
9 999 99 «
9 9 9 9
99 99
01-3118-00-Če ·« ··*·
161
26. Arima, T., Rehman, A., Hickey, W., Flye, M. (1996). Inhibition by CTLA-4Ig of experimental allergic encephalomyelitis. J. Immunol. 156, 4917-4924.
27. Arruffo, A. a Seed, B. (1987). Molecular cloning of a CD28 sDNA by a COS cell expression systém. Proč. Nat. Acad. Sci. USA 84, 8573-8577.
28. Asjo, B., Cefai, D., Debre, P., Dudoit, Y., Autran, B. (1993). A novel mode of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) activation: ligation of CD28 alone induces HIV-1 replication in naturally infected iymphocytes. J. Virol. 67, 4395-4398.
29. Azuma, Μ. , Cayabyab, Μ., Buck, Μ., Phillips, J.H., Lanier, L.L. (1992) . Involvement of CD28 in MHC unrestricted cytotoxicity mediated by a human killer leukaemic cell line. J. Immunol. 149, 1115-1123.
30. Azuma, M., Yssel, H., Phillips, J.H., Spits, H., Lanier, L.L. (1993b). Functional expression of B7/BB1 on activated T-lymphocytes. J. Exp. Med. 177, 845-850.
31. Azuma, Μ., Cayabyab, Μ., Phillips, J.H., Lanier, L.L. (1993c). Requirements for CD28-dependant T cell-mediated cytotoxicity. J. Immunol. 150, 2091-2101.
32. Bajorath, J. , Stenkamp, R., Aruffo, A. (1993). Knowledge based protein modeling: concepts and examples. Prot. Sci. 2, 1798-1810.
44 94 • 9 9 9 49 »·*« «· · • · 4 4 9 94
4 4 4 9 4 9 4 4 9 9
4 · 444 ···· ··· *
«9 9 • · 9 4 4«
44 44 44 4 44 944
01-3118-00-Če
162
33. Bajorath, J., Peach, R., Linsley, P.S. (1994). Immunoglobin
fold characteristic of B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86) . Prot.
Sci. 3, 2148-2150.
34. Balazano, C., Buonavista, N., Rouvier, E., Golstein, P. (1992) CTLA-4 and CD28: similar proteins, neighboring genes. Int. J. Can. Suppl. 7, 28-32.
35. Barcy, S., Wettendorf, M., Leo, 0., Urbain, J., Kruger, M., Ceuppens, J.L., de Boers, M. (1995).FcR crosslinking on monocytes results in impaired T cell stimulatory capacity. Int. Immunol. 7, 179-189.
36. Beale, D. (1985). A comparison of the amino acid sequences of the extracellular domains of the immunoglobin superfamily. Possible correlations between conservancy and conformation. Comp Biochem Physiol. 80, 181-194.
37. Bellone, M., Iezzi, G., Manfredi, A.A., Protti, M.P.,
Dellabona, P., Casorati, G., Rugarli, C. (1994). In vitro priming of cytotoxic T lymphocytes against poorly immunogenic epitopes by engineered antigen presenting cells. Eur. J. mmun. 24, 2691-2698.
38. Berke, G. (1993). The functions and mechanisms of action of cytolytic lymphocytes. In „Fundamental Immunology, (W. Paul), str. 965-1014. New York: Raven Publ. 3. vydání.
39. Berke, G. (1994). The binding and lysis of targeT-cells by cytotoxic lymphocytes. Annu. Rev. of Immunol. 12, 735-773.
40. Boise, L.H., Minn, A.J., Noel. P.J., June, C.H., Accavitti, M., Lindstein, T., Thompson, C.B. (1993). CD28 costimulation
9
01-3118-00-Če ·· ♦« ♦ 9 9 9
9 9 9 • 9 999
9 ·
99 ·· ·· · ·
163 can promote T cell survival by anhancing the expression of Bcl-xL. Immunity 3, 87-89.
41. Brinchmann, J.E., Doblung, J.H., Heger, B.H., Haaheim, L.L., Sannes, M., Egeland, T. (1994). Expression of costimulatory molecule CD28 on T-cells in human immunodeficiency virus type 1 infection: dunctional and clinical coorelations. J. Inf Dis. 169, 730-738.
42. Brown, W.C., Bissey, L., Logan, K.S., Pedersen, N.C., Elders, J.H., Collisson, E.W. (1991). Feline immunodef iciency virus infects both CD4+ and CD8+ Tlymphocytes. J. of Virol. 62, 3359-3364.
43. Buck, C.A. (1992). Immunoglobulin Superfamily: structure function and relatonship to other receptor molecules. Semin.
Cell Biol. 3, 179-188.
44. Buelens, C. , Willems, F. , Delvaux, A. , Pierard, G.,
Delville, J.P. , Velu, T. , Goldman, M. (1995). Interleukin 10
differentially regulates B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86)
expression on human peripheral blood dendritic cells. Eur. J. Immunol. 25, 2668-2675.
45. Caruso, A., Cantalamessa, A., Licenziati, S., Peroni, L., Prati,' E., Martinelli, F., Canaris, A.D., Folghera, S., Gorla, R., Balsari, A. (1994). Expression of CD28 on CD8 + and CD4+ lymphocytes during HIV infection. Scan. J. Immunol. 40, 485-490.
46. Cerdan, C., Martin, Y., Brailly, H., Courcoul, M., Flavetta, S., Costello, R., Mawas, C., Birg, F., Olivě, D. (1991). IL01-3118-00-Če by T lymphocytes activated via the CD2 plus
J. Immunol. 146, 560-564.
164
ΦΦ φφ • · « φ φ φ • φφφ φ φ φ • · φφφ φ φ φ φ • φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ ·· φφφφ • φφφ φφφ • φ φ φ • φ φ φφ φφφ is produced CD28 pathways.
47. Chen, L., Linsley, P.S., Hellstrom, K.E. (1993). Costimulation of T cells for tumor immunity. Immunol. Today 14, 483-486.
Cehesnut, R.W. a Grey, H.M. (1986) B cells and its significance in Immunol. 39, 51-59.
Antigen presentation by T-B interactions. Adv.
49. Clark, S.J., Saag M.S., Decker, W.D., Campbell, H.S., Roberson, J.L., Veldkamp, P.J. (1991). High titers of cytopathic virus in plasma of patients with symptoms of proimary HIV-1 infection. N. Eng. J. Med. 324, 954-960.
50. Clayberger, C., Lyu, S.C., DeKruyff, R. , Parham, P., Krensky, A.M. (1994). Peptides corresponding to the CD8 and CD4 binding domains of HLA molecules block T-lymphocyte immune responses in vitro. J. Immunol. 153, 946-951.
51. Clevers, H., Alarcon, B., Wileman, T., Terhorst, C. (1998). The T-cell receptor-CD3 complex: A dynamic protein ensemble. Annu. Rev. Immunol. 6, 629-662.
52. Connor, R.I., Mohri, H., Cao, Y., Ho, D.D. (1993). Incrased viral burden and cytopathicity correlate temporally with CD4+T- lymphocyte decline and clinical progression in human immunodefíciency virus type 1-infected individuals. J.
Virol. 67, 1772-1777.
53. Cooper, D.A., Tindall, B., Wilson, E.J., Imreie, A.A., Penny, R. (1988). Characterization of T-lymphocyte responses
01-3118-00-Če *· 99 • •99 · 9 • 9 9 9 9 9 *99999 9 ·· 9 9 9
99 99 • 9 ·**»
9« * • 9 9 9 9 • 9 9 9 • 9 · 9 9
9 9 9 • 99 999
165 during infection with human immunodeficiency virus. J, Inf. Dis. 157, 889-896.
54. Damle, N.K., Doyle, L.V., Grossmaire, L.S., Ledbetter, J.A. (1988) . Differential regulátory signals delivered by antibody binding to the CD28 molecule during the activation of human T lymphocytes. J. Immunol. 140, 1753-1761.
55. Damle, N.K., Klussman, K., Leytze, G., Martial, S., Arruffo, A., Ledbetter, J.A., Linsley, P.S. (1994). Costimulation of lymphocytes with integrin ligands ICAM-1 or VCAM-1 induces functional expression of CTLA-4 a second receptor for B7. J. Immunol. 152, 2686-2697.
56. Davis, M.M a Bjorkman, P.K. (1988). T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nátuře 334, 395-402.
57. de Boer, Μ. , Kasran, A., Kwekkeboom, J., Walter, H., Vanderbenghe, P., Ceuppens, J.L. (1993). Ligation of B7 with CD28/CTLA-4 on T-cells results in CD40 ligand expression, interleukin-4 secretion and efficient help for antibody production by B cells. Eur. J, Immunol. 23, 3120-3125.
R., Yssel, H., de Vries, J.E. (1993). Direct on subsets of human CD4+ T cell dones and Specific inhibition of 11-2 production and . Immunol. 150, 4754-4765.
deWaal Malefyt, effects of IL-10 resting T cells. proliferation. <J
59. Ding, L., Linsley, P.S., Huang, L.Y., Germain, R.N., Shevach, E.M. (1993). IL-10 inhibits macrophage costimulatory activity by selectively inhibiting up regulation of B7 expression. J. Immunol. 151, 1224-1234.
94
9 9 9 9 ·
9 9 9 9 9
9 999 99 9 • 9 9 9 «
99 49
01-3118-00-Če
9999
C 9 9
9 9
4 9 9
9 9
166
60. Driscoll, P.C., Cyster, J., Campbell, I., Williams, A., (1991). Structure of domain 1 of rat T-lymphocyte CD2 antigen. Nátuře 353, 762-765.
61. Ellis, J.H., Burden, M., Vinogradov, D., Linge, C., Crowe, J. (1996). Interactions of CD80 and CD86 with CD28 and CTLA4. J. Immunol. 155, 2700-2709.
62. Englehardt, V.H. (1994). Structure of peptides associated with MHC class I molecules. Curr. Op. Immunol. 6, 13-21.
63. English, R.V., Nelson, P., Johnson, C.M., Naisse, M.,
Tompkins, W.A., Tompkins, M.B. (1994). Development of clinical disease in cats experimentally infected with feline immunodeficiency virus. J, Inf. Dis. 170, 543-552.
64. Eauci, A.S. a Dále, D.C. (1975). The effect of hydrocortisone on the kinetics of normál human lymphocytes. Blood 46, 235-243.
65. Fauci, A., Macher, A., Longo, D. , Lané, H., Rook>! A., Masur, H., Gelmann, E. (1984). Aquired immunodeficiency syndrome: epidemiological, clinical, immunological and therapeutic considerations. Ann. Int. Med. 100, 92-106.
66. F.A. Ferrari a kol., Journal of Bacteriology (1985) 161,
556-562.
67. Fong, T.A. a Mosmann, T.R. (1990). Alloreactive murine CD8+ T cell dones secrete the Thl pattern of cytokines. J Immunol. 144, 1744-1752.
01-3118-00-Če • · · · · · · 9 0
4 444 4 4 4 4 44 · ·· · · · · · * • · ·· *· 4 4 4 4
167
68. Fouchier, R.A., Meyard, L., Brouwer, Μ. , Hovenkamp, E.,
Schuitemaker, H. (1996). Broader trpism and higher cytopathicity for CD4 + T-cells of asyncytium-inducing compared to a non-syncytium-inducing HIV-1 isolate as a mechanism for accelerated CD4+ T cell declíne in vivo. Virology 219, 87-95.
69. Freedman, A.S., Freeman, G., Horowitz, J.C., Daley, J., Nadler, L.M. (1987). A B-cell restricted antigen that identifies preactivated B cells. J. Immunol. 139, 3260-3267.
70. Freeman, G.J., Borriello, F., Hodes, R.J., Reiser, H., Hathcock, K.S., Laszlo, G., McKnight, A.J., Kim, J., Du, L., Lombard, D.B., Gray, G.S., Nadler, L.M., Sharpe, A.H. (193). Uncovering a functional alternativě CTLA-4 counter receptor in B7-ldeficient mice. Science 262, 907-909.
71. Gajewski, T.F. Schell, S.R., Nau, G., Fitch, F.W. (1989). Regulation of T-cell activation: Differences among T-cell subsets. Immunol. Rev. 111, 79-110.
72. Germain, R.N. (1993). The Biochemistry and cell biology of antigen processing and presentation. Annu. Rev. Immunol. 11, 403-450.
73. Haffar, O.K., Smithgall, M.D., Bradshaw, J., Brady, W., Damle, N.K., Lindsley, P.S.(1993). Costimulation of T-cell activation and virus production by B7 antigen on activated CD4+ T-cells from human immunodeficiency virus type 1infected donors. Immunology 90, 11094-11098.
74. Harlan, D.M., Abe, R., Lee, K.P., June, C.H. (1995). Potential roles of the B7 and CD28 receptor families in
01-3118-00-Če
168 autoimmunity and immune evasion. Clin. Immunol. Immunopath. 75, 99-111.
75. Hodge, J.W., Abrami, S., Schlom, J., Kantor, J.A. (1994). Induction of antitumor immunity by recombinant vaccinia viruses expressing B7-1 or B7-2 costimulatory molecules. Can. Res. 54, 5552-5555.
76. Hutchcroft, J.E. a Bierer, B.E. (1996). Signaling throug CD28/CTLA-4 family receptors. J. Immunol. 155, 4071-4074.
77. M.A. Innis a kol., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academie Press, lne., San Diego (1990).
78. Jenkins, M.K., Pardoll, D.M., Mizuguchi, J., Quíll, H.
Schwartz, R.H. (1987). T cell responsivenessin vivo and in vitro: Fine specifuity of induction and molecular chyracterisation of the unresponsive statě. Immunol. Rev. 95, 113-135.
79. June, C.H., Ledbetter, J.H., Linsley, P.S., Thompson, C.B. (1990) . Role of the CD28 molecule in T-cell activation. Immunol. Today 11, 211-216.
80. June, C.H., Bluestone, J.A., Nadler, L.M., Thompson, C.B. (1994). The B7 and CD28 receptor families. Immunol. Today 12, 321-333.
81. Knight, J.C. a kol., (1992), Virology 190, 423-433.
82. Kozber, D., Moretta, A., Messner, H.A., Moretta, L., Croce, C.M. (1987). Tp44 molecules involved in antigen-independant • · · ··
01-3118-00-Če
169
T cell activation are expressed on human plasma cells. J. Immunol. 138, 4128-4132.
83. Kupfer, A. a Singer, S.J. (1989). Cell biology of cytotoxic and helper T-cell functions. Annu. Rev. Immunol. 7, 309-337.
84. Landay, A.L., Mackewicz, C.E., Levý, J.A. (1993). An activated CD8+ T cell phenotype coorelates with an anti-HIV activity and assymptomatic clinical status. Clin Immun.
Immunopath. 69, 106-116.
85. Lané P., Burdet, C., Hubele, S., Scheidegger, D,, Muller, U., McConnell, F., Kosco-Vilbois, M. (1994). B cell function in mice transgenic for mCTLA4-H gamma 1: lack of germinal centers correlated with poor affinity maturation and class switching despite normál priming of CD4+ T-cells. J. Exp. Med. 179, 819-830.
86. Lanier, L.L., O'Fallon, S., Somoza, C., Phillips, J.H., Linsley, P.S., Okumura, K., Ito, D., Azuma, M. (1995). CD80 (B7) and CD86 (B7O) provide similar costimulatory signals for T cell proliferation, cytokine production, and generatíon of CTL. J. Immunol. 154, 97-105.
Larsen, C. P., Lowry, R.P. costimulatory populations. J.
Ritchie, (1992) .
molecule Exp. Med
S.C., Pearson, T.C., Linsley, Functional expression of
B7/BB1 in murine dendritic 176, 1215-1220.
P.S., the cell
88. Leahy, D., Axel, R., Hendrickson, W. (1992). Crystal structure of a soluble form of human T cell counter receptor CD8 at 2.8 resolution. Cell 68, 1145-1162.
01-3118-00-Če
170
89. Lechler, R.I., Lombardů, G., Batchelor J.R., Reinsmoen N., Bach, F.H. (1990). The molecular basis of alloreactivity. Annu. Rev. Immunol. 10, 83-88.
90. Lenschow, D.J., Substituován, G.H-T., Zuckermann, L.A., Nabavi, N., Jellis, C.L., Gray, G.S., Miller, J., Bluestone, J.A. (1993). Expression and functional significance of an sdditional ligand for CTLA-4. Proč. Nat. Acad. Sci. USA. 90, 11054-11058.
91. Lenschow, D.J., Walunas, T.L., Bluestone, J.A. (1996). CD28/B7 systém of T cell costimulation. Annu. Rev. Immunol. 14, 233-258.
92. Leung, H.T. a Linsley, P.S. (1994). The CD28 costimulatory pathway. Therap. Immunol. 1, 217-228.
93. Lewis, D.E., Ng Thang, D,S., Adu-Oppong,' A., Schober, W., Rodgers, J. (1994). Anergy and apoptosois in CD8+ T-cells from HIV infected persons. J. Immunol. 153, 412-420.
94. Li, Y., McGowan, P., Hellstrom, I., Hellstrom, K.E., Chen, L. (1994) . Costimulation of tumor reactive CD4 and CD8 Tlymphocytes by B7 a natural ligand for CD28 can be ušed to treat estabilished mouše melanoma. J. Immunol. 153, 421-428.
95. Lindsten, T., Lee, K.P., Harris, E.S., Petryniak, B., Craighead, N., Reynolds, P.J., Lombard, D.B., Freeman, G.J., Nadler, L.M., Gray, G.S. (1993). Characterization of CTLA-4 structure and expression on human T-cells. J. Immunol. 151, 3489-3499.
·· ·· ·· ····
9 · · · *
01-3118-00-Če
171
96. Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L.S., Damle, N.K., Ledbetter, J.A. (1991a). Binding of the B-cell activation antigen B7 to CD28 costimulates T-cell proliferation and Interleukin-2 mRNA accumulation. J. Exp. Med. 173, 721-730.
97. Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L.S., Damle, N.K., Ledbetter, J.A. (1991b). CTLA-4 is a second receptor
for the B-cell activation antigen B7. J. Exp. Med. 174, 561-
569.
98. Linsley, P. S . , Wallace, P.M., Johnson, J. , Gibson, M.G.,
Greene, J.L., Ledbetter, J.A. , Singh, C., Tepper, M.A.
(1992a) . Immunosuppression in vivo by a soluble form of the CTLA-4 T cell activation molecule. Science 257, 792-795.
99. Linsley, P.S., Greene, J.L., Tan, P., Bradshaw, J., Ledbetter, J.A., Anasetti, C., Damle, N.K. (1992b). Coexpression and functional cooperation of CTLA-4 and CD28 on activated T-lymphocytes. J. Exp. Med. 176, 1595-1604.
100. Linsley, P.S. a Ledbetter, J.A. (1993a) . The role of CD28 receptor during T cell responses to antigen. Ann. Rev. Immunol. 11, 191-212.
101. Linsley, P.S., Bradshaw, J., Urnes, M., Grosmaire, L.,
Thompson, C.B. (1993b). CD28 engagement by B7/BB-1 induces transient down-regulation of CD28 synthesis and prolonged unresponsiveness to CD28signaling. J. Immunol. 150, 31613169.
102. Linsley, P.S., Greene, J.L., Brady, W., Bajorath, J.,
Ledbetter, J.A., Peach, R. (1994a). Human B7-1 (CD80) and
01-3118-00-Če
172
B7-2 (CD86) bind similar avidities but distincts to CD28 and CTLA-4 receptors. Immunity 1, 793-801.
103. Linsley, P.S., Peach, R., Gladstone, P., Bajorath, J.
(1994b) . Extending the B7(CD80) gene family. Prot. Sci. 3,
1341-1343 •
104. Linsley, P.S., Ledbetter, J. , Peach, R., Bajorath, J.
(1995a). CD28/CTLA-4 receptor structure, binding
stoichiometry and aggregation during T cell activation. Res. Immunol. 146, 130-140.
105. Linsley, P.S., Nadler, S.G., Bajorath, J., Peach, R., Leung,
H.T., Rogers, J. , Bradshaw, J., Stebbins, M., Leytze, G., Brady, W. , Malacko, A.R., Marquart, H., Shaw, S. (1995b). Binding stoichiometry of the cytotoxic T-lymphocyteassociated molecule-4 (CTLA-4). J. Biol. Chem. 270, 1541715424.
106. Littman, D.R. (1987). The structure of the CD4 and CD8 genes. Annu. Rev. Immunol. 5, 561-584.
107. Liu, C.C., Welsh, C.M., Young, J. D-E. (1995). Perforin:
Structure and function. Immunol. Today 16, 194-201.
108. Liu, Y., Jones, B., Brady, W., Janeway, C.A . , Linsley , P.
(1992). Murine CD4 T cell growth: B7 and heat stable antigen
both participate in co-stimulation. Eur. J. 1905-1912. Immunol. 115,
109. Lombardi, S., Garzelli, ., Pistello, M. , Massi, C.,
Matteucci, D., Baldinotti, F., Cammarota, G., Da Prato, L.,
Bandecchi, P. , Tozzini, F. , Bendinelli, M. (1994) A
01-3118-00-Če
173
110.
111.
112.
113.
114.
115.
• · · · · · • · « ·· ·· neutralizing antibody-inducing peptide of the V3 domain of feline immunodeficiency virus envelope glycoprotein does not induce protective immunity. J. Virol. 68, 8374-8379.
Lu, Y., Granelli-Piperno C.A., Trevillyan J.M. activation. Evidence for transductions pathway. J.
, A., Bjorndahl, J.M., Phillips, (1992). CD28-induced T cell a protein-tyrosine kinase signál
Immunol. 149, 24-29.
Luria, S.E. a Darnell, J.E. (1968). „General Virology. New York: John Willey and Sons, lne.
Lwoff, A. (1957). The concept of virus. J. Gen. Microbiol. 17, 239-253.
Maniatis, T., Fritsch, E.F. a Sambrook, J. (1982). „Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Press.
Martin, P.J., Ledbetter, J.A., Morishita, Y., June, C.H., Beatty, P.J., Hansen, J.A. (1986). A 44 kilodalton cell surface homodimer regulates interleukin 2 production by activated human T lymphocytes. J. Immunol. 136, 3282-3287.
Matasumura, M., Fremont, D.H., Peterson, P.A., Wilson, I.A. (1992). Emerging principles for the recognition of peptide antigens by MHC class I molecules. Science 257, 927-934.
Mescher, M.F. (1992). Surface contact requirements for activation of cytotxic T-lymphocytes. J. Immunol. 49, 24022405.
116.
01-3118-00-Če
174
117.
118.
119.
120.
121.
122.
•4 ·· <» · · • · · · *4 • 4 · 4 4 · • 4 · 4 4 4 4 » 4 • 4 4 4··
44 ·· ♦
Minty, A., Chalon, P., Derocq, J.M., Dumont, X., Guillemot, J.C., Kaghad, M., Labit, C., Leplatois, P., Liauzun, P., Miloux, B., Minty, C., Casellas, P., Loison, G., Lupker, J. , Shire, D., Ferrara, P., Caput, D., (1993). Interleukin 13 is a new human regulating inflammatory and immune responses. Nátuře 362, 248-250.
Moffet, C.W. and Paden, C.M. (1994) . Microglia in the rat neurohypophysis increase expression of class I major histocompatibility antigens following centrál nervous systém injury. J Neuroimmunol. 50, 139-51.
Mosmann, T. a Coffman, R.L. (1989). TH1 and TH2 cells: Different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu. Rev. Immunol. 7, 145-173.
Nabavi, N., Freeman, G L.M., Glimcher, L.M. cytoplasmic domain is induces B7 expression.
.J., Gault, D., Godfrey, G.N., Nadler, (1992). Signaling trough the MHC Cil required for antigen presentation and Nátuře 360, 266-268.
Nagata, S. a Golstein, P. (1995) . The Fas death factor. Science 267, 1449-1465.
Nickoloff, B.J., Mitra, R.S., Lee, K. , Turka, L.A., Greem, J., Thompson, C., Shimizu, Y. (1993).Discordant expression of CD28 ligands BB-1 and B7 on keratinocytes in vitro and psoriatic cells in vivo. Am. J. Path. 142, 1029-1040.
Novotney, C., Nasisse, M., changes in
English, R., Housman, J., Davidson, M.,
Jeng, C.R. (1990). Lymphocyte population cats naturally infected with feline immunodeficiency virus. AIDS 4, 1213-1218
123.
01-3118-00-Če
175
124. 0'Doherty, U., Steinman, R.M., Peng, M., Cameron, P.U., Gezelter, S., Kopeloff, I., Swiggard, W.J., Pope, M., Bhardwaj, N. (1993). Dendritic cells freshly isolated from human blood express CD4 and mature into typical immunostimulatory dendritic cells after culture in moncyteconditioned media. J. Exp. Med. 178, 1067-1076.
125. Ozawa, H., Aiba, S., Nakagawa, S., Tagami, H. (1995). Interferon gamma and interleukin 10 inhbit antigen presentation by Langerhan's cells for T helper type 1 cells by suppressing their CD80 (B7-1) expression. Eur. J. Immunol. 26, 648-652.
126. Page, C., Thompson, C., Yacoub, M., Rose, M. (1994). Human endothelial stimulation of allogenic T-cells via a CTLA-4 independant pathway. Trans. Immunol. 2, 342-347.
127. Peach, R., Bajorath, J., Brady, W., Leytze, G., Greene, J.,
Naemura, J., Linsley, P.S. (1994). CDR1 and CDR3-analogous regions in CTLA-4 and CD28 determine the binding to B7-1. J. Exp. Med. 180, 2049-2058.
128. Peach, R., Bajorath, J., Naemura, J., Leytze, G., Greene, J., Aruffo, A., Linsley, P.S. (1995). Both extracellular immunoglobulin-like domains of CD80 contain residues critical for binding T-cell surface receptors CTLA-4 and CD28. J. Biol. Chem. 270, 21181-21187.
129. Pedersen, N.C., Ho, E., Brown, M.L., Yamoto, J.K. (1987). Isolation of a T lymphotropic virus from domestic cats with an immunodeficiency like syndrome. Science 235, 790-793.
01-3118-00-Če
4 · «* 4 4»· «· · • 9 · · · · · 4 4 9 4
9994 4 4 4 · 4 4
44944· ·< 44 4 4
4444 4 4 9 ·· ·· »· · ·· ···
176
130. Prasad, K.V., Cai Y.C., Raab, M., Duckworth, B. , Cantley, L., Shoelson, S.E., Rudd, C.E. (1994). T-cell anigen CD28 interacts with the lipid kinase phosphatidylinositol3-kinase by a cytoplasmic Tyr(P)-Met-Xaa-Met motif. Proč Nati Acad Sci USA. 91, 2834-2838.
131. Radvanyi, L.G., Shi, Y., Vaziri, H., Sharma, A., Dhala, R. , Mills, G.B., Miller, R.G. (19996) CD28 costimulation inhibits TCR-induced apoptosis during a primary T cell response. J. Immunol. 158, 1788-1798.
132. Ranheim, E.A. a Kipps, TJ. (1995). Tumor necrosis factoralpha facilitates induction of CD80 (B7-1) on human B cells by actívated T-cells: complex regulation by IL-4, IL-10, and CD40L. Cell. Immunol. 161, 226-235.
133. Razí-Wolf, Z., Freeman, G., Galvin, F., Benacerraf, B., Nadler, L., Reiser, H. (1992). Expression and function of the murine B7 antiggen and the major costimulatory molecule expressed by peritoneal exudate cells. Proč. Nat. Acad. Sci. USA. 89, 4210-4214.
134. Ronchese, F. , Hausmann, B., Hubele, S., Lané, P. (1994). Mice transgenic for a souble form of murine CTLA-4 show enhanced expasion of antigen-specific CD4+ T-cells and defective antibody production in vivo. J. Exp Med. 179, 809817.
135. Rotzschke, O. a Falk, K. (1994). Origin structure and motifs of naturally processed MHC class II ligands. Curr. Op Immunol. 6, 45-51.
01-3118-00-Če
177
136. Russel, J.H. (1983). Internal disintegration model of cytotoxic lymhocyte induced target damage. Immunol. Rev. 72, 97-118.
137. Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold spring Harbor, N.Y. (1989).
138. Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Aufubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith and Stuhl, Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY, NY, 1992).
139. Saukkonen, J.J., Kornfield, H., Berman, J.S. (1993). Expansion of a CD8+CD28+ cell population in the blood and lung of HIV- positive patients. JAIDS 11, 1194-1199.
140. Schattner, E. a Laurence, J. (1994). HIV induced Tlymphocyte depletion. Clin. Lab. Med. 14, 221-227.
141. Schmittel, A., Scheibenbogen, C., Keiholz, U. (1995).
Lipopolysaccharide effectively up-regulates B7-1 (CD80) expression and costimulatory function of human monocytes. Scan. J. Immunol. 42, 701-704.
142. Schwartz, R.H. (1992). Costimulation of T-lymphocytes: the role of’ CD28, CTLA-4 and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunottherapy. Cell 71, 1065-1068.
143. Seder, R.A., Germain, R.N., Linsley, P.S., Paul, W:E: (1994). CD28 mediated co-stimulation of IL-2 production plays a critical role in T cell priming for IL-4 and IFNg production, J. Exp Med. 179, 299-304.
«φ «· φ* φφφφ φ · φ φ · φ φφ φ φφφ φφφφ φφ · φ* φ φφφφφφ «φ φ φ φ φφ φφφ φ φ»
• Φ φ Φ • · Φ Φ Φ φφφ
01-3118-00-Če 178
144. Shahinian, A., Pfeffer, K. , Lee, K.P., Kundig, T.M. ,
Kishihara, K., Wakeham, A. , Kawai, K., Ohashi, P.S.,
Thompson, C.B., Mak, T.B. (1993). Differential T cell
costimulatory requiremens in CD28 deficient mice, Science 261, 609-612.
145. Sher, A., Gazzinelli, R.T., Oswald, I.P., Clerici, M., Kullberg, M., Pearce, E.J., Berzofsky, J.A., Mosmann, T.R., James, S.L., Morse, H.C. (1992). Role of T-cell derived cytokines in the down regulation of immune responses inparasitic and retroviral infection. Immunol Rev. 127, 183204.
146. Siebelink, K.H., Chu, I.H., Rimmelzwaan, G.F., Weijer, K., van Herwijnen, H.R., Knell, P. (1990). Feline Immunodefíciency virus (FIV) infecttion in the cat as a model for HIV infection in man: FIV induced impairment of immune function. AIDS Res. Hum. Retroviiruses 6, 1373-1378.
147. Siebelink, K.H., Tijhaar, E., Huisman, R.C., Huisman, W. , deRonde, A., Darby, I.H., Francis, M.J., Rimmelzwaan, G.F., Osterhaus, A.D. (1995). Enhancement of feline immunodeficiency virus infection after immunization with envelope glycoprotein subunit vaccines. J. Virol. 69, 37043711.
148. Singer, S.J. (1992). Intracellular communication and cell:cell adhesion. Science 255, 1671-1674.
149. Smithgall, M.D., Wong, J.G., Linsley, P.S., Haffar, O.K. (1995). Costimulation of CD4+ T-cells via CD28 modulates
01-3118-00-Če ·« ·4 «4 4444 44 4
4444 44 4 · 4 4 4
4444 44 4 44 4
444444 44 44 4 4
4* 4444 444
44 44 4 44 ··«
179 human immunodeficiency type 1 infection and replication in vitro. AIDS Res. Hu. Retro. 11, 885-892.
150. Springer, Τ.Ά., Dustin, M.L., Kishimoto, T.K., Mariin, S.D.
(1987). The lymphocyte function associated LFA-1, CD2 and LFA-3 molecuules: cell adhesion receptors of the immune systém. Annu. Rev. Immunol. 5, 223-252.
151. Springer, T.A. (1990). Adhesion receptors of the immune systém. Nátuře 346, 425-434.
152. Stack, R.M., Lenschow, D.J., Gray, G.S., Bluestone, J.A., Fitch, F.W. (1994) . IL-4 treatment of smáli splenic B cells induces co- stimulatory molecules B7-1 and B7-2. J, Immunol. 152, 5723-5733.
153. Symington, F.W., Brady, W., Linsley, P.S. (1993). Expressionand function of B7 on human epidermal Langerhan's cells. J, Immunol. 150, 1286-1295.
154. Taylor, M.K. a Cohen, J.J. (1992). Cell mediated cytotoxicity. Curr. Opin. Immunol. 4, 338-343.
155. Thomas, R., Davi, L.S., Lipsky, P.E. (1994). Rheumatoid synovium is enriched in mature antigen presenting dendritic cells. J. Immunol. 152, 2613-2623.
156. Townsend, S.E. a Allison, J.P. (1993). Tumor rejection after direct costimulation of CD8+ T-cells by B7 transfected melanoma cells. Science 259, 368-370.
157. Turka, L.A., Ledbetter, J.A., Lee, K., June, C.H., Thompson, C.B. (1990) . CD28 is an inducible T cell surface antigen
4 4
4 4 4« • 4 4 4 · 4 4 4
4*4 • 44 444
01-3118-00-Če • 4 44
4 4 9 · ·
4 4 4 4 4
444444 4
4 4 4 4
44 »· «4 4 4 4 4
180 that transduces a proliferative signál in CD3+ mature thymocytes. J. Immunol. 144, 1646-1653.
158. Turka, L.A., Linsley, P.S., Painee, R., Schieven, G.L., Thompson, C.B., Ledbetter, J.A. (1991). Signál transduction via CD4, CD8 and CD28 in mature and immature thymocytes. J. Immunol. 146, 1428-1436.
159. Unanue, E.R. (1984). Antigen presenting function of the macrophage. Annu. Rev. Immunol. 2, 395—428.
160. van Koten, C., Rensink, I., Pascual, -Salcedo, D., van Oers, R., Aarden, L. (1991). Monokine production by human T-cells: IL-1 alpha production is limited to memory T-cells. J. Immunol. 146, 2654-2658.
161. van Seventer, G.A., Shimizu, Y., Shaw, S. (1991). Roles of multiple accesory molecules in T cell activation. Curr. Opin Immunol. 3, 294-303.
162. Wang,R., Murphy, K.M., Loh, D.Y., Weaver, C., Russell, J.H. (1993). Differential activation of antigen-stimulated suicide and cytokine production pathways in CD4+ T-cells is regulated by the antigen-presenting cell. J. Immunol. 150, 3832-42.
163. Weiss, A. a Litman, D.R. (1994). Signál transduction by lymphocyte antigen receptors. Cell 76, 263-274.
164. Williams, A. a Barclay, A. (1988). The immunoglobulin superfamily-domains for cell surface recognition. Ann. Rev. Immunol. 6, 381-405.
01-3118-00-Če
A., Newcombe, J. , Dangond, F., Strand, C.,
M.N., Cuzner, M.L., Hafler, D.A. (1995).
of costimulatory molecules B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) and interleukin 12 in multiple schierosis lesions. J. Exp. Med. 182, 1985-1996.
181
165. Windhagen, Woodroofe,
Expression
166. Yamamoto, J.K., Hansen, H., Ho, W.E., Morishita, T.Y., Okuda, T., Sawa, T.R. (1989). Epidemiological and clinical aspects of feline immunodeficiency virus infection in část from the Continental United States and Canada and possible mode of transmission. J.A.V.M.A. 194, 213-220.
167. Yasukawa, M., Inatsuki, A., Kobayashi, Y. (1989). Differential in vitro activation of CD4+CD8- and CD8+CD4herpes simplex virus-specific human cytotoxic T-cells. J. Immunol·. 143, 2051-2057.
168. Yssel, H., Schneider, P.V., Lanier, L.L. (1993). Interleukin
7 specifically índuces B7/BB1 and peripheral blood T-cells Immunol. 5, 753-759. antigen on human cord blood Int.
and T cell dones.
169. Zannussi, S., Simonelli, C., D'Andrea , M., Caffau, c.,
Clerici, M., Tirelli, (J., DePaoli, P. (1996). CD8 +
lymphocyte phenotype and cytokine production in long-term non-progressor and in progressor patients with HIV-1 infection. Clin. Exp. Immunol. 105, 220-224.
170. Zhou, T., Weaver, C., Linsley, P.S., Mountz, J.D. (1994). Tcells of staphylococcal enterotoxin B-tolerized autoimmune MRL- lpřibližně/lpřibližně mice require costimulation through the B7- CD28/CTLA-4 pathway for activation and can «0 ·« ·0
0 0 0 0 ·
0 0 0 0 0 >
0 00« « 0 00
0 0 0 0 0
00 00 0
0000
01-3118-00-Če
182 be reanergized in vivo by stimulation of the T cell receptor in the absence of costimulatory signál. Eur. J. Immunol, 24, 1019-1025.
01-3118-00-Ce
Φ
Φ
Φ • · φ · φ φ • φφφ φ φ • · ··· · · · • 9 φφφ φφ φφ φφφφ
SEKVENČNÍ PROTOKOL <110> Winslow, Barbara 0.
Cochran, Mark D.
<120> Rekombinantní virus exprimující cizí DNA kódující kočičí CD86, kočičí CD8 6, kočičí CD28, kočičí CTLA-4 nebo kočičí interferon-γ a jeho použití
<130> 54957-B -PCT
<140> <141> Not Yet Known 1999-04-30
<150> <151> 09/071,711 1998-05-01
<160> 82
<170> Patentln Ver. 2.0
<210> 1 <211> 941 <2I2> DNA <213> kočičí CD80 <220>
<221> CDS
<222> (1).. (876)
<400> 1
atg ggt cac gca gca aag tgg aaa aca cca cta ctg aag cac cca tat 48
Met Gly His Al a Ala Lys Trp Lys Thr Pro Leu Leu Lys His Pro Tyr
1 5 10 15
ccc aag ctc ttt ccg ctc ttg atg cta gct agt ctt ttt tac c tc tgt 96
Pro Lys Leu Phe Pro Leu Leu Met Leu Ala Ser Leu Phe Tyr Phe Cys
20 25 30
tca ggt atc atc cag gtg aac aag aca gtg gaa gaa gta gca. gta cta 144
Ser Gly Ile Ile Gin Val Asn Lys Thr Val Glu Glu Val Ala Val Leu
35 40 45
tcc tgt gat tac aac att tcc acc aaa gaa ctg acg gaa att ega atc 192
Ser Cys Asp Tyr Asn Ile Ser Thr Lys Glu Leu Thr Glu Ile Arg Ile
50 55 60
tat tgg caa aag gat gat gaa atg gtg ttg gct gtc atg tet ggc aaa 240
• ·
01-3118-00-Ce
Tyr Trp Gin Lys Asp Asp Glu Met Val Leu Ala Val Met Ser Gly Lys
65 70 75 80
gta caa gtg tgg ccc aag tac aag aac ege aca ttc act gac gtc acc 288
Val Gin Val Trp Pro Lys Tyr Lys Asn Arg Thr Phe Thr Asp Val Thr
8 5 90 95
gat aac cac tcc att gtg atc atg get ctg ege ctg tca gac aat ggc 336
Asp Asn His Ser Ile Val Ile Met Ala Leu Arg Leu Ser Asp Asn Gly
100 105 110
aaa tac act tgt att att caa aag att gaa aaa ggg tet tac aaa gtg 384
Lys Tyr Thr Cys Ile Ile Gin Lys Ile Glu Lys Gly Ser Tyr Lys Val
115 120 125
aaa cac ctg act tcg gtg atg tta ttg atc aga get gac ttc cct gtc 432
Lys His, Leu Thr Ser Val Met Leu Leu Val Arg Ala Asp Phe Pro Val
130 135 140
cct agt ata act gat ctt gga aat cca tet cat aac atc aaa agg ata 480
Pro Ser Ile Thr Asp Leu Gly Asn Pro Ser His Asn Ile Lys Arg Ile
145 150 155 160
atg tgc tta act tet gga ggt ttt cca aag cct cac ctc tcc tgg ctg 528
Met Cys Leu Thr Ser Gly Gl y Phe Pro Lys Pro His Leu Ser Trp Leu
165 170 175
gaa aat gaa gaa gaa tta aat gcc atc aac aca aca gtt tcc caa gat 576
Glu Asn Glu Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Glr. Asp
180 185 190
cct gaa act gag ctc tac act att age agt gaa ctg gat ttc aat atg 624
Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Glu Leu Asp Phe Asn Met
195 200 205
aca aac aac cat age ttc ctg tgt ctt gtc aag tat gga aac tta cta 672
Thr Asn Asn His Ser Phe Leu Cys Leu Val Lys Tyr Gly Asn Leu Leu
210 215 220
gta tca cag atc ttc aac tgg caa aaa tca gag cca cag cct tet aat 720
Val Ser Gin Ile Phe Asn Trp Gin Lys Ser Glu Pro Gin Pro Ser Asn
225 230 235 240
aat cag ctc tgg atc att atc ctg age tca gta gta agt ggg att gtt 768
Asn Gin Leu Trp Ile Ile Ile Leu Ser Ser Val Val Ser Gly Ile Val
245 250 255
gtg atc act gca ctt acc tta aga tgc cta gtc cac aga cct gcc gca 816
01-3118-00-Če ♦ · ·· • · · · • · « « • ··· • · · ·· ·· ·· ····
Val Ile Thr Ala Leu Thr Leu Arg Cys Leu Val His Arg Pro Ala Ala
260 265 270
agg tgg aga caa aga gaa atg ggg aga gcg cgg aaa tgg aaa aga tet 864
Arg Trp Arg Gin Arg Glu Met Gly Arg Ala Arg Lys Trp Lys Arg Ser
275 280 285
cac ctg tet aca tagattctgc , agaaccactg tatgcagagc atctggaggt 916
His Leu Ser Thr
290
agcctcttta gctcttctct ac.tag 941 <210> 2 <211> 292 <212> PRT <213> kočičí CD80 <400> 2
Met 1 Gly His Ala Ala 5 Lys Trp Lys Thr Pro 10 Leu Leu Lys His Pro 15 Tyr
Pro Lys Leu Phe 20 Pro Leu Leu Met Leu 25 Ala Ser Leu Phe Tyr 30 Phe Cys
Ser Gly Ile 35 Ile Gin Val Asn Lys 4 0 Th r Val Glu Glu Val 4 5 Ala Val Leu
Ser Cys 50 Asp Tyr Asn Ile Ser 55 Thr Lys Glu Leu Thr 60 Glu Ile Arg Ile
Tyr 65 Trp Gin Lys Asp Asp 70 Glu Met Val Leu Ala 75 Val Met Ser Gly Lys 80
Val Gin Val Trp Pro 85 Lys Tyr Lys Asn Arg 90 Thr Phe Thr Asp Val 95 Thr
Asp Asn His Ser 100 Ile Val Ile Met Ala 105 Leu Arg Leu Ser Asp 110 Asn Gly
Lys Tyr Thr 115 Cys Ile Ile Gin Lys 120 Ile Glu Lys Gly Ser 125 Tyr Lys Val
Lys His 130 Leu Thr Ser Val Met 135 Leu Leu Val Arg Ala 140 Asp Phe Pro Val
Pro Ser Ile Thr Asp Leu Gly Asn Pro Ser His Asn Ile Lys Arg Ile
01-3118-00-Če
4« ··«· ·· «» • ·» · · · • · · · * « « • · ·*·«< « « • · · « » · * · ·· ·· • · · • · »· *
155
160
150
145
Met Cys Leu Thr Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro His Leu Ser Trp Leu
165 170 175
Glu Asn Glu Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gin Asp
180 185 190
Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Glu Leu Asp Phe Asn Met
195 200 205
Thr Asn Asn His Ser Phe Leu Cys Leu Val Lys Tyr Gly Asn Leu Leu
210 215 220
Val Ser Gin Ile Phe Asn Trp Gin Lys Ser Glu Pro Gin Pro Ser Asn
225 230 235 24 0
Asn Gin Leu Trp Ile Ile Ile Leu Ser Ser Val Val Ser Gly Ile Val
245 250 255
Val Ile Thr Ala Leu Thr Leu Arg Cys Leu Val His Arg Pro Ala Ala
260 265 270
Arg Trp Arg Gin Arg Glu Met Gly Arg Ala Arg Lys Trp Lys Arg Ser
275 280 285
His l.eu Ser Thr
290 <210> 3 <211> 879 <212 > DMA <213> kočičí CD80 <220>
<221> CDS <222> (1)..(876) <400> 3
atg Met 1 ggt Gly cac His gca Ala gca Ala 5 aag Lys tgg Trp aaa Lys aca Thr cca Pro 10 cta Leu ctg Leu aag Lys cac His cca Pro 15 tat Tyr 48
ccc aag ctc ttt ccg ctc ttg atg cta gct agt ctt ttt tac ttc tgt 96
Pro Lys Leu Phe Pro Leu Leu Met Leu Ala Ser Leu Phe Tyr Phe Cys
20 25 30
01-3118-00-Če • 9 *9
9 9 9
9 9 9 • » <·Ι ·
9 9
9 «θ
9999
9 9 • 99 • 99
9 9
9
9 £ 9 99
9 9
9 9 9
9 9 • 9 99 9
tca ggt atc atc cag gtg aac aag aca gtg gaa gaa gta gca gta cta
Ser Gly Ile Ile Gin Val Asn Lys Thr Val Glu Glu Val Ala Val Leu
35 40 45
tcc tgt gat tác aac att tcc acc aaa gaa ctg acg gaa att ega atc
Ser Cys Asp Tyr Asn Ile Ser Thr Lys Glu Leu Thr Glu Ile Arg Ile
50 55 60
tat tgg caa aag gat gat gaa atg gtg ttg get gtc atg tet ggc aaa
Tyr Trp Gin Lys Asp Asp Glu Met Val Leu Ala Val Met Ser Gly Lys
65 70 75 80
gta caa gtg tgg ccc aag tac aag aac ege aca ttc act gac gtc acc
Val Gin Val Trp Pro Lys Tyr Lys Asn Arg Thr Phe Thr Asp Val Thr
85 90 95
gat aac· cac tcc att gtg atc atg get ctg ege ctg tca gac aat ggc
Asp Asn His Ser Ile Val Ile Met Ala Leu Arg Leu Ser Asp Asn Gly
100 105 110
33čl tac act tgt atc att caa aag att caa aaa ggg tet tac aaa gtg
Lys Tyr Thr Cys Ile Ile Gin Lys Ile Gin Lys Gly Ser Tyr Lys Val
115 120 125
aaa cac ctg act tcg gtg atg tta ttg gtc aga get gac ttc cct gtc
Lys His Leu Thr Ser Val Met Leu Leu Val Arg Ala Asp Phe Pro Val
130 135 140
cct agt ata act gat ctt gga aat cca tet cat aac atc aaa agg ata
Pro Ser Ile Thr Asp Leu Gly Asn Pro Ser His Asn Ile Lys Arg Ile
145 150 155 160
atg tgc tta act tet gga ggt ttt cca aag cct cac ctc tcc tgg ctg
Kec Cys Leu Thr Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro His Leu Ser Trp Leu
165 170 175
gaa aat gaa gaa gaa tta aat gcc atc aac aca aca gtt tcc caa gat
Glu Asn Glu Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gin Asp
180 185 190
ccc gaa act gag ctc tac act att age agt gaa ctg gat ttc aat atg
Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Glu Leu Asp Phe Asn Met
195 200 205
aca aac aac cat age ttc ctg tgt ctt gtc aag tat gga aac tta ata
Thr Asn Asn His Ser Phe Leu Cys Leu Val Lys Tyr Gly Asn Leu Ile
210 215 220
144
192
240
288
336
384
432
480
528
576
624
672
0
0
0
0 • 0
01-3118-00-Če • « • · · 0
0 000
0 0
00 •0 0000 0 0 0 Λ 0 0
0 0
0· 0 b
0*0
gta Val 225 tca Ser cag Gin atc Ile ttc Phe aac Asn 230 tgg Trp caa Gin aaa Lys tca Ser gag Glu 235 cca Pro cag Gin cct Pro tet Ser aat Asn 240 720
aat cag ctc tgg atc att atc ctg agc tca gta gta agt ggg att gtt 768
Asn Gin Leu Trp Ile Ile Ile Leu Ser Ser Val Val Ser Gly IJe Val
245 250 255
gtg atc act gca ctt acc tta aga tgc cta gtc cac aga cct get gca 816
Val Ile Thr Ala Leu Thr Leu Arg Cys Leu Val His Arg Pro Ala Ala
260 265 270
aag tgg aga caa aga gaa atg ggg aga gcg cgg aaa tgg aaa aga tet 864
Arg Trp Arg Gin Arg Glu Met Gly Arg Ala Arg Lys Trp Lys Arg Ser
275 280 285
cac ctg, tet aca tag 879
His Leu Ser Thr 290 <210> 4 <211> 292 <212> PRT <213> kočičí CD80
<400> 4 Lys His Pro 15 Tyr
Met 1 Gly His Al a Ala 5 Lys Trp Lys Thr Pro 10 Leu Leu
Pro Lys Leu Phe 20 Pro Leu Leu Met Leu 2 5 Ala Ser Leu Phe Tyr 30 Phe Cys
Ser Gly Ile 35 Ile Gin Val Asn Lys 40 Thr Val Glu Glu Val 45 Ala Val Leu
Ser Cys 50 Asp Tyr Asn Ile Ser 55 Thr Lys Glu Leu Thr 60 Glu Ile Arg Ile
Tyr 65 Trp Gin Lys Asp Asp 70 Glu Met Val Leu Ala 75 Val Met Ser .Gly Lys 80
Val Gin Val Trp Pro 85 Lys Tyr Lys Asn Arg 90 Thr Phe Thr Asp Val 95 Thr
Asp Asn His Ser 100 Ile Val Ile Met Ala 105 Leu Arg Leu Ser Asp 110 Asn Gly
· • ·
01-3118-00-Če /ί) ·· ·· ·· ···· »4 • 4 · · • ··· 4 4 ·« ·· «·
Lys Tyr Thr Cys Ile Ile Gin Lys Ile Gin Lys Gly Ser Tyr Lys Val
115 120 125
Lys His Leu Thr Ser Val Met .Leu Leu Val Arg Ala Asp Phe Pro Val
130 135 140
Pro Ser Ile Thr Asp Leu Gly Asn Pro Ser His Asn Ile Lys Arg Ile
145 150 155 160
Met Cys Leu Thr Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro His Leu Ser Trp Leu
165 170 175
Glu Asn Glu Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gin A.sp
180 185 190
Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Glu Leu Asp Phe Asn Met
195 200 205
Thr Asn Asn His Ser Phe Leu Cys Leu Val Lys Tyr Gly Asn Leu Ile
210 215 220
Val Ser Gin ZIle Phe Asn Trp Gin Lys Ser Glu Pro Gin Pro Ser Asn
225 230 235 240
Asn Gin Leu Trp Ile Ile Ile Leu Ser Ser Val Val Ser Gly Ile Val
245 250 255
Val Ile Thr Ala Leu Thr Leu Arg Cys Leu Val His Arg Pro Ala Ala
260 265 270
Arg Trp Arg Gin Arg Glu Met Gly Arg Ala Arg Lys Trp Lys Arg Ser
275
280
265
His Leu Ser Thr 290
<210> 5
<211> 1080
<212> DNA
<213> kočičí CD86
<220>
<221> CDS
<222> (63) . . (1052
<400> 5
gtttctgtgt tcctcgggaa tgtcactgag cttatacatc tggtctctgg gagctgcagt 60 • ·
01-3118-00-Če • · · · 0 • 0 0 0 0 0 0 0 · 0 0
0 0 0
gg atg ggc att tgt gac age act atg gga ctg agt cac act ctc ctt 107
Met Gly Ile Cys . Asp Ser Thr : Met Gly Leu Ser His Thr Leu Leu
1 5 10 15
gtg atg gcc ctc ctg ctc tet ggt gtt tet tcc atg aag agt caa gca 155
Val Met Ala Leu Leu Leu Ser Gly Val Ser Ser Met Lys Ser Gin Ala
20 25 30
tat ttc aac aag act gga gaa ctg cca tgc cat ttt aca aac tet caa 203
Tyr Phe Asn Lys Thr Gly Glu Leu Pro Cys His Phe Thr Asn Ser Gin
35 40 45
aac ata age ctg gat gag ctg gta gta ttt tgg cag gac cag gat aag 251
Asn Ile Ser Leu Asp Glu Leu Val Val Phe Trp Gin Asp Gin Asp Lys
50 55 60
ctg gtt ctg tat gag ata ttc aga ggc aaa gag aac cct caa aat gtt 299
Leu Val Leu Tyr Glu Ile Phe Arg Gly Lys Glu Asn Pro Gin Asn Val
65 70 75
cat ctc aaa tat aag ggc cgt aca age ttt gac aag gac aac tgg acc 347
His Leu Lys Tyr Lys Gly Arg Thr Ser Phe Asp Lys Asp Asn Trp Thr
80 85 90 95
ctg aga ctc cac aat gtt cag atc aag gac aag ggc aca u 3 t cac tgt 395
Leu Arg Leu His Asn Val Gin Ile Lys Asp Lys Gly Thr Tyr His Cys
100 105 110
ttc att car tat 3 3 3 ggg ccc aaa gga cta gtt ccc atg cac caa atg 443
Pne Ile His Tyr Lys Gly Pro Lys Gly Leu Val Pro Met His Gin Met
115 120 125
agt tet gac cta tca gtg ctt get aac ttc agt caa cct gaa ata aca 491
Ser Ser Asp Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gin Pro Glu Ile Thr
130 135 140
gta act tet aat aga aca gaa aat tet ggc atc ata aat ttg acc tgc 539
Val Thr Ser Asn Arg Thr Glu Asn Ser Gly Ile Ile Asn Leu Thr Cys
145 150 155
tca tet ata caa ggt tac cca gaa cct aag gag atg tat ttt cag cta 587
Ser Ser Ile Gin Gly Tyr Pro Glu Pro Lys Glu Met Tyr Phe Gin Leu
160 165 170 175
aac act gag aat tca act act aag tat gat act gtc atg aag aaa tet 635
Asn Thr Glu Asn Ser Thr Thr Lys Tyr Asp Thr Val Met Lys Lys Ser
180 185 190
• · • · · · · · • · ·.··» · • · · · · • · · · · ·
01-3118-00-Če
683 ····
caa Gin aat Asn aat Asn gtg Val 195 aca Thr gaa Glu ctg Leu tac Tyr aac Asn 200 gtt Val tet Ser atc Ile age Ser ttg Leu 205 cct Pro ttt Phe
tca gtc cct gaa gca cac aat gtg age gtc ttt tgt gcc ctg aaa ctg
Ser Val Pro Glu Ala His Asn Val Ser Val Phe Cys Ala Leu Lys Leu
210 215 220
gag aca ctg gag atg ctg ctc tcc cta cct ttc aat ata gat gca caa
Glu Thr Leu Glu Met Leu Leu Ser Leu Pro Phe Asn Ile Asp Ala Gin
225 230 235
cct aag gat aaa gac cct gaa caa ggc cac ttc ctc tgg att gcg get
Pro Lys Asp Lys Asp Pro Glu Gin Gly His Phe Leu Trp Ile Ala Ala
240 245 250 255
gta ctt gta atg ttt gtt gtt ttt tgt ggg atg gtg tcc ttt aaa aca
Val Leu Val Met Phe Val Val Phe Cys Gly Met Val Ser Phe Lys Thr
260 265 270
cca agg aaa agg aag aag aag cag cct ggc ccc tet ca.t gaa tgt gaa
Leu Arg Lys Arg Lys Lys Lys Gin Pro Gly Pro Ser His Glu Cys Glu
275 280 285
acc atc aaa agg gag aga aaa gag age aaa cag acc aac gaa aga gta
Thr Ile Lys Arg Glu Arg Lys Glu Ser Lys Gin Thr Asn Glu Arg Val
290 295 300
cca tac cac gta cct gag aga tet gat gaa gcc cag tgt gtt aac att
Pro Tyr His Val Pro Glu Arg Ser Asp Glu Ala Gin Cys Val Asn Ile
305 310 315
ttg aag aca gcc tca ggg gac aaa aat cag tag gaaaatggtg gcttggcgtg
Leu Lys Thr Ala Ser Gly Asp Lys Asn Gin
320 325 330
ctgacaat
731
779
827
875
923
971
1019
1072
1080 <210> 6 <211> 329 <212> PRT <213> kočičí CD86 <400> 6
Met Gly Ile Cys Asp Ser Thr Met Gly Leu Ser His Thr Leu Leu Val 15 10 15 φ φ φ φ φ φ
Λ/3 ί φφφφφφ φφφ 'Μ φφφφφφφ · · ι ν< Φ · φφφ φ · φ φ > φ φ
Ol-3118-OO-Ce
Met Ala Leu Leu Leu Ser Gly Val Ser Ser Met Lys Ser Gin Ala Tyr
20 25 30
Phe Asn Lys Thř Gly Glu Leu Pro Cys His Phe Thr Asn Ser Gin Asn
35 40 45
Ile Ser Leu Asp Glu Leu Val Val Phe Trp Gin Asp Gin Asp Lys Leu
50 55 60
Val Leu Tyr Glu Ile Phe Arg Gly Lys Glu Asn Pro Gin Asn Val His
65 70 75 80
Leu Lys Tyr Lys Gly Arg Thr Ser Phe Asp Lys Asp Asn Trp Thr Leu
85 90 95
Arg Leu . His Asn Val Gin Ile Lys Asp Lys Gly Thr Tyr His Cys Phe
100 105 110
Ile His Tyr Lys Gly Pro Lys Gly Leu Val Pro Met His Gin Met Ser
115 120 125
Ser Asp Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gin Pro Glu Ile Thr Val
130 135 140
Thr Ser Asn Arg Thr Glu Asn Ser Gly Ile Ile Asn Leu Thr Cys Ser
145 150 155 160
Ser Ile Gin Gly Tyr Pro Glu Pro Lys Glu Met Tyr Phe Gin Leu Asn
165 170 175
Thr Glu Asn Ser Thr Thr l.ys Tyr Asp Thr Val Met Lys Lys Ser Gin
180 185 190
Asn Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asn Val Ser Ile Ser Leu Pro Phe Ser
195 200 205
Val Pro Glu Ala His Asn Val Ser Val Phe Cys Ala Leu Lys Leu Glu
210 215 220
Thr Leu Glu Met Leu Leu Ser Leu Pro Phe Asn Ile Asp Ala Gin Pro
225 230 235 240
Lys Asp Lys Asp Pro Glu Gin Gly His Phe Leu Trp Ile Ala Ala Val
245 250 255
Leu Val Met Phe Val Val Phe Cys Gly Met Val Ser Phe Lys Thr Leu
260
265
270 • · · · • ·
01-3118-00-Ce
Arg Lys Arg 275 Lys Lys Lys Gin Pro 280 Gly Pro Ser His Glu 285 Cys Glu Thr
Ile Lys 290 Arg Glu Arg Lys Glu 295 Ser Lys Gin Thr Asn 300 Glu Arg Val Pro
Tyr 305 His Val Pro Glu Arg 310 Ser Asp Glu Ala Gin 315 cys Val Asn Ile Leu 320
Lys Thr Ala Ser Gly 325 Asp Lys Asn Gin
<210> 7 <211> 688 <212> DNA <213> kočičí CD28 <220>
<221> CDS <222> (1)..(663!
<400> 7
atg Met 1 atc Ile ctc Leu agg Arg ctg Leu 5 ctt Leu ctg Leu gct Ala ctc Leu aac Asn 10 ttc Phe ttc Phe ccc Pro tca Ser att Ile 15 caa Gin 48
gta aca gaa aac aag att ttg gtg aag cag ttg ccc agg cct gtg gtg 96
Val Thr Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Gin Leu Pro Arg Leu Val Val
20 25 30
tac aac aat gag gtc aac ctt agc tac aag tac act cac aac ttc ttc 144
Tyr Asn Asn Glu Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Thr His Asn Phe Phe
35 40 45
tca aag gag ttc cgg gca tcc ctt tat aag gga gta gat agt gct gtg 192
Ser Lys Glu Phe Arg Ala Ser Leu Tyr Lys Gly Val Asp Ser Ala Val
50 55 60
gaa gtc tgc gtt gtg aat gga aat tac tcc cat cag cct cag ttc tac 240
Glu Val Cys Val Val Asn Gly Asn Tyr Ser His Gin Pro Gin Phe Tyr
65 70 75 80
tca agt aca gga ttc gac tgt gat ggg aaa ttg ggc aat gaa aca gtg 288
Ser Ser Thr Gly Phe Asp Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Thr Val
85 90 95
«0 00 00 0 <0 ·00
01-3118-00-Če
aca Thr ttc Phe tac Tyr ctc Leu 100 ega Arg aat Asn ttg Leu ttt Phe gtt Val 105 aac Asn caa Gin acg Thr gat Asp att Ile 110 tac Tyr ttc Phe 336
tgc aaa att gaa gtc atg tat cca cct cct. tac ata gac aat gag aag 384
Cys Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Ile Asp Asn Glu Lys
115 120 125
agc aat ggg acc att atc cac gtg aaa gag aaa cat ctt tgt cca get 432
Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Glu Lys His Leu Cys Pro Ala
130 135 140
cag ctg tet cct gaa tet tcc aag cca ttt tgg gca ctg gtg gtg gtt 480
Gin Leu Ser Pro Glu Ser Ser Lys Pro Phe Trp Ala Leu Val Val Val
145 150 155 160
ggt gga atc cta ggt ttc tac agc ttg cta gca aca gtg get ctt ggt 528
Gly Gly Ile Leu Gly Phe Tyr Ser Leu Leu Ala Thr Val Ala Leu Gly
165 170 175
gcc tgc tgg atg aag acc aag agg agt agg atc ctt cag agt gac tat 576
Ala Cys Trp Met Lys Thr Lys Arg Ser Arg Ile Leu Gin Ser Asp Tyr
180 185 190
atg aac atg acc ccc cgg agg cca ggg ccc acc ega agg cac tac caa 624
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Arg His Tyr Gin
195 200 205
cct tac gcc cca gca ege gac ttt gcg gca tac cgt tcc tgacatggac 673
Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
210 215 220
ccctatccag aagcc ¢88 <210> 8 <211> 221 <212> PRT <213> kočičí CD28 <400> 8
Met 1 Ile Leu Arg Leu 5 Leu Leu Ala Leu Asn 10 Phe Phe Pro Ser Ile 15 Gin
Val Thr Glu Asn 20 Lys Ile Leu Val Lys 25 Gin Leu Pro Arg Leu 30 Val Val
Tyr Asn Asn Glu Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Thr His Asn Phe Phe
4
01-3118-00-Če
4 · ·
4 · « · « »4 4· 4 44 ·
35 40 45
Ser Lys Glu Phe Arg Ala Ser Leu Tyr Lys Gly Val Asp Ser Ala Val
50 55 60
Glu Val Cys Val Val Asn Gly Asn Tyr Ser His Gin Pro Gin Phe Tyr
65 70 75 80
Ser Ser Thr Gly Phe Asp Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Thr Val
85 90 95
Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Leu Phe Val Asn Gin Thr Asp Ile Tyr Phe
100 105 110
Cys Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Ile Asp Asn Glu Lys
115 120 125
Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Glu Lys His Leu Cys Pro Ala
130 135 140
Gin Leu Ser Pro Glu Ser Ser Lys Pro Phe Trp Ala Leu Val Val Val
145 150 155 160
Gly Gly Ile Leu Gly Phe Tyr Ser Leu Leu Ala Thr Val Ala Leu Gly
165 170 175
Ala Cys Trp Met Lys Thr Lys Arg Ser Arg Ile Leu Gin Ser Asp Tyr
180 18 5 190
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Arg His Tyr Gin
195 200 205
Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
210 215 220 <210> 9 <211> 749 <212> DNA <213> kočičí CTLA-4 <220 <221> CDS <222> (27)..(698) <400> 9 aacctgaaca ctgctcccat aaagcc atg gct tgc ttt gga ttc cgg agg cat 53 Met Ala Cys Phe Gly Phe Arg Arg His
• · • · * · « φ
01-3118-00-Če
5
ggg Gly 10 gct Ala cag Gin ctg Leu gac Asp ctg Leu 15 gct Ala tet Ser agg Arg acc Thr tgg Trp 20 ccg Pro tgc Cys act gct ctg 101
Thr Ala Leu 25
ttt tet ctt ctc ttt atc ccc gtc ttc tcc aaa ggg atg cat gtg gcc 149
Phe Ser Leu Leu Phe 30 Ile Pro Val Phe Ser 35 Lys Gly Met His Val 40 Ala
cac cct gca gtg gtg ctg gcc age age ega ggt gtc gcc age tcc gtg 197
His Pro Ala Val 45 Val Leu Ala Ser Ser 50 Arg Gly Val Ala Ser Phe 55 Val
tgt gaa tat ggg tet tea ggc aat gcc gcc aaa ttc ega gtg act gtg 245
Cys Glu Tyr 60 Gly Ser Ser Gly Asn 65 Ala Ala Lys Phe Arg 70 Val Thr Val
ctg agg caa act ggc age caa atg act gaa gtc tgt gct gcg aca tac 293
Leu Arg 75 Gin Thr Gl y Ser. Gin 80 Met Thr Glu Val Cys 85 Ala Ala Thr Tyr
aca gtg gag aat gag ttg gcc ttc cta aat gat tcc acc tgc act ggc 341
Thr 90 Val Glu Asn Glu Leu 95 Ala Phe Leu Asn Asp 100 Ser Thr Cys Thr Gly 105
atc tcc age gga aac aaa gtg aac ctc acc atc caa ggg ttg agg gcc 389
Ile Ser Ser Giy Asn 110 Lys Val Asn Leu Thr 115 Ile Gin Gly Leu Arg 120 Ala
atg gac acg gga ctc tac atc tgc aag gtg gag ctc atg tac cca cca 437
Met Asp Thr Gly 125 Leu Tyr Ile Cys Lys 130 Val Glu Leu Met Tyr Pro 135 Pro
ccc tac tat gca ggc arg ggc aat gga acc cag att tat gtc atc gat 485
Pro Tyr Tyr 140 Ala Gly Met Gly Asn 145 Gly Thr Gin Ile Tyr 150 Val Ile Asp
cct gaa cct tgc cca gat tet gac ttc ctc ctc tgg atc ctc gca gca 533
Pro Glu 155 Pro Cys Pro Asp Ser 160 Asp Phe Leu Leu Trp 165 Ile Leu Ala Ala
gtc agt tea gga ttg ttt ttt tat age ttc ctt atc aca gct gtt tet 581
Val 170 Ser Ser Gly Leu Phe 175 Phe Tyr Ser Phe Leu 180 Ile Thr Ala Val Ser 185
ttg age aaa atg cta aag aaa aga age cct ctt act aca ggg gtc tat 629
Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr
«
01-3118-00-Če
4* · · ·* • 4 · · · · »444 · « • 944944 4 · • 4 9 · · 9 ♦· 4 4 ·
190 195 200
gtg aaa atg ccc cca aca gag cca gaa tgt gaa aag caa ttt cag cct 67
Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gin Phe Gin Pro
205 210 215
tat ttt att ccc atc aat tga cacaccgtta tgaagaagg a agaacactgt 72
Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
220
ccaatttcta agagctgagg c 74
<210> 10 <211> 223 <212> PRT <213> kočičí CTLA-4
<400> 10 Met Ala Cys 1 Phe Gly 5 Phe Arg Arg
Ser Arg Thr Trp 20 Pro Cys Thr Ala
Val Phe Ser 35 Lys Gly Met His Val 40
Ser Ser 50 Arg Gly Val Ala Ser 55 Phe
Asn Ala 65 Ala Lys Phe Arg 70 Val Thr
Met Thr Glu Val Cys 85 Ala Ala Thr
Phe Leu Asn Asp 100 Ser Thr Cys Thr
Asn Leu Thr 115 I le Gin Gly Leu Arg 120
Cys Lys 130 Val Glu Leu Met Tyr 135 Pro
Asn Gly 145 Thr Gin Ile Tyr 150 Val Ile
His Gly Ala Gin Leu Asp Leu Ala 10 15
Leu Phe Ser Leu Leu Phe Ile Pro 25 30
Ala His Pro Ala Val Val Leu Ala 45
Val Cys Glu Tyr Gly Ser Ser Gly 60
Val Leu Arg Gin Thr Gly Ser Gin 75 80
Tyr Thr Val Glu Asn Glu Leu Ala 90 95
Gly Ile Ser Ser Gly Asn Lys Val 105 110
Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile 125
Pro Pro Tyr Tyr Ala Gly Met Gly 140
Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser 155 160 • 4 · · 44 · 4 · 4 « ·
01-3118-00-Če
Asp Phe Leu Leu Trp 165 Ile Leu Ala Ala Val 170 Ser Ser Gly Leu Phe 175 Phe
Tyr Ser Phe Leu 180 Ile Thr Ala Val Ser 185 Leu Ser Lys Met Leu 190 Lys Lys
Arg Ser Pro 195 Leu Thr Thr Gly Val 200 Tyr Val Lys Met Pro 205 Pro Thr Glu
Pro Glu Cys Glu Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> kočičí CD80 primer <400> 11 cgcggatccg caccatgggt cacgcagcaa agtggaaaac 40 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> kočičí CD80 primer <400> 12 cctagtagag aagagctaaa g.aggc 25 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> kočičí CD28 primer <400> 13 cgcggatcca ccggtagcac aatgatcctc agg 33 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> kočičí CD28 primer <400> 14 cgcggatcct ctggataggg gtccatgtca g 31 • φφ * φ ♦ * • · · • · · • « . · ··*· · · ·· ♦» ·· * ·» ι · » ·
01-3118-00-Ce <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> kočičí CTLA-4 primer <400> 15 atggcttcgc cttggatttc cagcagg <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> kočičí CTLA-4 primer <400> 16· tcaattgaat gaggaataaa ataaggctg <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> kočičí CTLA-4 primer <400> 17 tgttgggttt ctgactctga cttccctg <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> kočičí CTLA-4 primer <400> 18 gcatagtagg gtggtgggta catg <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> kočičí CTLA.-4 primer <400> 19 tgttgggttt ctgactctga cttccctg <210> 20 • * · • ·
* I
01-3118-00-Če ·· · 4
4 4 4 4 4
9 4 4 4 4 • 4 49944 4 9 < 4 4 4 4 4
44 44 4 <211> 20 <212> DNA <213> kočičí CTLA-4 primer <400> 20 acatgagctc caccttgcag 20 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> kočičí CTLA-4 primer <400> 21 ccatcctaat acgactcact acagggc 27 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> kočičí CTLA-4 primer <400> 22 gtgaatatgg gtcttcaggc aatg 24 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> kočičí CTLA-4 primer <400> 23 actcactata gggctcaagc ggc 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> kočičí CTLA-4 primer <400> 24 gaaatccgag tgactgtgct gag 23 <210> 25 <211> 24 <212> DMA <213> kočičí CTLA-4 primer
fc ·
01-3118-00-Če
*·<· • fc <400> 25 aacctgaaca ctgctcccat aaag <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> kočičí CTLA-4 primer <400> 26 gcctcagctc ttagaaattg gacag 25 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> kočičí C.D86 primer <400> 27 tagtattttg gcaggaccag g <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> kočičí CD86 primer <400> 28 ctgtgacatt atcttgagat ttc <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> kočičí CD86 primer <400> 29 gagcatgcac taatgggact gag 23 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> kočičí CD86 primer <400> 30 ctgtgacatt atcttgagat ttc
XoV ·« · ·
01-3118-00-Če
<210> <211> <212> <213> 31 27 DNA
kočičí CD86 primer
<400> 31
ccatcctaat acgactcact atagggc
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> kočičí CD8 6 primer
<400> 32-
tgggtaacct tgtatagatg agcaggtc
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> kočičí CD86 primer
<400> 33
actcactata gggctcgagc ggc
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<2 13 > kočičí CD86 primer
<400> 34
caggttgact gaagttagca agcac
<210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> kočičí CD86 primer <400> 35 ccatcctaat acgactcact atagggc 27 <210> 36 * *
9
9
01-3118-00-Če ti) ♦ · ·· • · · ř • 9 9 » • 9 9 99
9 9
99 ·· «·#· <211> 25 <212> DNA <213> kočičí CD86 primer <400> 36 ggacaagggc acatatcact gtttc 25 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> kočičí CD86 primer <400> 37 actcactata gggctcgagc ggc 23 <210> 38 <211> .25 <212> DNA <213> kočičí CD8ó primer <400> 38 cagtgcttgc taacttcagt caacc 25 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> kočičí CD86 primer <400> 39 cgggaatgtc actgagctta tag <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> kočičí CD86 primer <400> 40 gatctttttc aggttagcag ggg 23 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> kočičí CD80 primer • 4
4
4* • 4
01-3118-00-Če
4 4 4
4 4 4
4 444
4 4
44
4« «494
<400 41
atgggtcacg cagcaaagtg 20
<210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> kočičí CD80 primer <400> 42 ctatgtagac aggtgagatc 20
<210> 43 <211> 17 <212> DNA <213> kočičí CD80 primer <400 43 caggaaacag ctatgac 17
<21O> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> kočičí CD80 primer
<400 44
aatac gactc actatagg 18
<210 45
<211> 21
<212> DNA
<213> kočičí CD80 primer
<400 45
aacac cattt catcatcctt t 21
<210 46 <211> 23 <212> DNA <213> kočičí CD80 primer <400 46 atacaagtgt atttgccatt gtc 23 φφ φ φ
Ol-3118-OO-Če φ · φ φ φ φ φφφ φφ φφφφ φ φ φ φ · φ • φφφ φφ φ <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> kočičí CD80 primer <400> 47 agctctgacc aataacatca 20 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> kočičí CD80 primer <400> 48 attagaaatc cagttcactg ct <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> kočičí CD80 primer <400> 49 tcatgtctgg caaagtacaa g 21 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> kočičí CD80 primer <400> 50 attcactgac gtcaccga <210> 51 <211> 16 <212> DNA <213> kočičí CD80 primer <400> 51 aaggctgtgg ctctga 16 <210> 52
4444
4 4 4 4
4 4 4 4
4 444 4 4 • · 4 4
44
4
01-3118-00-Če <211> 29 <212> DNA <213> kočičí CD80 primer <400> 52 tcgagaattc gggtcacgca gcaaagtgg 29 <210> 53 <211> 32 <212> DNA <213> kočičí CD80 primer <400> 53 gctaggatcc aatctatgta gacaggtgag at <210> 54 <211> 32 <212> DNA <213> kočičí CD80 primer <400> 54 gatgaattcc atgatcctca ggctgggct.t ct 32 <210> 55 <211> 29 <212> DNA <213> kočičí CD80 primer <400> 55 gatcagatct caagaacggt atgccgcaa <210> 56 <211> 22 <212> DNA <213> B7-2 primer <400> 56 ggcccgagta kaagaaccgg ac 22 <210> 57 <211> 24 <212> DNA <213> B7-3 primer • · ·
99 9 9 9 9 • ·
01-3118-00-Če ·· ·«·· <400> 57 cagwttcagg atcytgggaa aytg <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> B7-284 primer <400> 58 ttatactagg gacagggaag <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> B7-190 primer <400> 59 aggctttgga aaacctccag <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> B7-20 primer <400> 60 ttgttatcgg tgacgtcagt g <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> B7-135 primer <400> 61 caataacatc accgaagtca gg <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> B7-S220 primer <400> 62 gtcatgtctg gcaaagtaca ag
01-3118-00-Če *· • · · · « · · * fc fc fcfcfc • fc ···· fcfc fcfc <210> 63 <211> 22 <212> DNA <213> B7-50 primer <400> 63 cactgacgtc accgataacc ac <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> B7-140 primer <400> 64 ctgacttcgg tgatgttatt gg <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> B7-550 primer <400> 65 gccatcaaca caacagtttc c <210> 66 <211> 22 <212> DNA <213> B7-620 primer <400> 66 tatgacaaac aaccatagct tc <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> B7-1281 primer <400> 67 graagawtgc ctcatgakcc <210> 68 *9 ···· • ♦
01-3118-00-Če
• 99 <211> 17 <212> DNA <213> B7-1260 primer <400> 68 cayratccaa cataggg <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> B7 start primer <400> 69 atgggtcacg cagcaaagtg g <210> 70 <211> 25 <212> DNA <213> B7-960 primer <400> 70 cctagtagag aagaactaaa gaggc <210> 71 <211> 21 <212 > DNA <213> CD28-113 primer <400> 71 caaccttagc tgcaagtaca c <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> CD28-768 primer <400> 72 ggcttctgga tagggatagg <210> 73 <211> 22 <212> DNA <213> CD28-190 primer
99 • · 9 9 9 9
9 9 9 9 » « 999 9 9 9 9 » · « · 4 0 ·* ·· 9 9 9
01-3118-00-Če
Ho ····
9 9 9
9 9
9 9
9
9
<400> 73
cggaggtaga attgcactgt cc
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> CD28-239 primer
<400> 74
attttgcaga agtaaatatc c
<210> 75
<211> 33
<212> DNA
<213> feCD28 primer
<400> 75
cgcggatcca ccggtagcac aatgatcctc
<210> 76
<211> 31
<212> DNA
<213> feCD28 primer
<400> 76
cgcggatcct ctggatagcc ctccatgtca
<210> 77
<211> 31
<212> DNA
<213> FIV PPR upstream primer
<400> 77
gcccggatcc tatggcagaa gggtttgcag
<210> 78
<211> 31
<212> DNA
<213> FIV PPR downstream primer
<400> 78 ccgtggatcc ggcactccat cattcctcct c
01-3118-00-Če
<210> 79 <211> 32
<212> DNA <213> FIV PPR upstream primer
<400> 79
gcgtgaattc ggggaatgga caggggcgag
<210> 80 <211> 28 <212> DNA <213> FIV PPR downstream primer
<400> 80 . gagccagatc tgctcttttt actttccc
<210> 81
<211> 36
<212> DNA
<213> IFN primer
<400> 81
tcgagaattc gatgaattac acaagtttta ttttcg <210> 82 <211> 33 <212> DNA <213> IFN primer <400> 82 tcgaggatcc ttatttcgat gctctacggc ctc • 0 • 0 • · • · • · ·· • · • · ··· ·· ··· • · • · 0 • 0 ·
0 0 ·· · ·· · • 0 00 • · · • · · ·
0 0
0· >0 0
01-3118-00-Če
V2-
4444 44
4 4 4
4 4
4 4 4
4 4
44 4
PATENTOVÉ N
1. Rekombinantní virus, který • 4 4« ··
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 • 4 444 44 4 4 4 4 4 4
44 44 jY/Ý

Claims (35)

  1. obsahuje alespoň jednu cizí nukleovou kyselinu zavedenou do neesenciální oblasti virového genomu viru, přičemž každá taková cizí nukleová kyselina (a) kóduje protein zvolený ze skupin sestávajících z kočičího CD28 proteinu nebo jeho imunogenní části, kočičího CD80 proteinu nebo jeho imunogenní části, kočičího CD86 proteinu nebo jeho imunogenní části nebo kočičího CTLA-4 proteinu nebo jeho imunogenní části a (b)je schopna, v případě že se rekombinantní virus zavede do vhodného hostitele, se exprimovat.
  2. 2. Rekombinantní virus podle nároku 1, který obsahuje alespoň dvě cizí nukleové kyseliny, přičemž každá z těchto nukleových kyselin je zavedena do neesenciální oblasti virového genomu.
  3. 3. Rekombinantní virus podle nároku 2, který obsahuje alespoň tři cizí nukleové kyseliny, přičemž každá z těchto nukleových kyselin je zavedena do neesenciální oblasti virového genomu.
  4. 4. Rekombinantní virus podle nároku 3, který obsahuje alespoň čtyři cizí nukleové kyseliny, přičemž každá z těchto nukleových kyselin je zavedena do neesenciální oblasti virového genomu.
    01-3118-00-Če **··
  5. 5. Rekombinantní virus podle nároku 1, ve kterém je virem virus neštovic mývalů, virus neštovic prasat nebo kočičí herpesvirus.
  6. 6. Rekombinantní virus podle některého z nároků 1 až 5, který obsahuje více než jednu cizí nukleovou kyselinu, přičemž každá z těchto nukleových kyselin je zavedena do stejné neesenciální oblasti.
  7. 7. Rekombinantní virus podle některého z nároků 1 až 5, který obsahuje více než jednu cizí nukleovou kyselinu, přičemž všechny tyto nukleové kyseliny nejsou zavedeny do stejné neesenciální oblasti.
  8. 8. Rekombinantní virus podle některého z nároků 1 až 7, který dále obsahuje cizí nukleovou kyselinu kódující imunogen odvozený z patogenu.
  9. 9. Rekombinantní virus podle nároku 8, kde patogenem je kočičí patogen, virus vztekliny, patogen Chlamydia, patogen Toxoplasmosis gondii, patogen Dirofilaria immitis, bleší patogen nebo bakteriální patogen.
  10. 10. Rekombinantní virus podle nároku 9, kde je kočičím patogenem virus kočičí imunodeficience (FIV), virus kočičí leukemie (FeLV), virus kočičí infekční peritonitidy (FIP),
    01-3118-00-Če ·« «·«<
    1^5 virus kočičí panleukopenie, kočičí kalikivirus, kočičí reovirus typu 3, kočičí rotavirus, kočičí koronavirus, kočičí syncytiální virus, kočičí sarkomavirus, kočičí herpesvirus, kočičí virus Bornovy choroby nebo kočičí parazit.
  11. 11. Rekombinantní virus podle některého z nároků 1 až 7, kde alespoň jedna cizí nukleová kyselina obsahuje promotor exprimující cizí nukleovou kyselinu.
  12. 12. Rekombinantní virus podle některého z nároků 1 až 7, kde exprese alespoň jedné cizí nukleové kyseliny je řízena promotorem endogenním k viru.
  13. 13. Rekombinantní virus podle některého z nároků 1 až 10, který dále obsahuje cizí nukleovou kyselinu kódující detekovatelný markér.
  14. 14. Rekombinantní virus podle nároku 13, kde je detekovatelným markérem E. coli β-galaktosidasa.
  15. 15. Rekombinantní virus podle nároku 10, kde je imunogenem z kočičího patogenu FIV gag proteasa, FIV env protein, FeLV gag proteasa nebo FeLV env protein.
    01-3118-00-Če ·· ♦ ·
    9 9 9 9
    9 9 9 · • 9 999 9 • 9 ·
    99 99 •a 9 99 9 í/ě
  16. 16. Rekombinantní virus podle některého z nároků 1 až 7, kde virem je kočičí herpesvirus a neesenciální oblastí je glykoproteinový G gen kočičího herpesviru.
  17. 17. Rekombinantní kočičí herpesvirus podle nároku 12 označený jako S-FHV-031 (ATCC přístupové číslo VR-2604).
  18. 18. Rekombinantní virus podle některého z nároků 1 až 7, kde virem je virus neštovic prasat a neesenciální oblastí je větší HindlII až Bglll subfragment HindlII M fragmentu viru neštovic prasat.
  19. 19. Rekombinantní virus neštovic prasat podle nároku 14 označený jako S-SPV-246 (ATCC přístupové číslo VR-2603).
  20. 20. Rekombinantní virus podle některého z nároků 1 až 7, kde je částí CD28, CD80 nebo CD86 proteinu rozpustná část proteinu.
  21. 21. Rekombinantní virus podle některého z nároků 1 až 7, kde cizí nukleová kyselina kóduje kočičí CTLA-4 protein.
  22. 22. Vakcína vyznačená tím, že obsahuje účinné imunizující množství rekombinantního viru podle některého z nároků 1 až 19 a vhodný nosič.
    ·»«·
    01-3118-00-Če
    UG tím, viru je
    Vakcína podle nároku 22 v y z n že účinným imunizujícím množstvím rekombinantního přibližně lxlO5 pfu/ml až lxlO8 pfu/ml.
  23. 24. vakcina podle nároku 22 vyznačená tím, že dále obsahuje směs rekombinantního viru s účinným imunizačním množstvím druhého imunogenu.
  24. 25. Způsob zesílení imunitní odezvy u koček vyznačený tím , že zahrnuje podání účinného imunizujícího množství rekombinantního viru podle některého z nároků 1 až 19 kočce.
  25. 26. Způsob imunizace kočky vyznačený tím , že zahrnuje podání účinného imunizujícího množství rekombinantního viru podle některého z nároků 1 až 19 kočce.
  26. 27. Způsob potlačení imunitní odezvy u koček vyznačený tím , že zahrnuje podání účinného potlačujícího množství rekombinantního viru podle nároku 20 nebo 21 kočce.
  27. 28. Způsob podle některého z nároků 24 až 26 vyznačený tím , že podání zahrnuje intravenózní podání, subkutánní podání, intramuskulární podání, ·· ·« • * » » • · · · » · · ·· • * · ·« ♦*
    01-3118-00-Če v*?
    transmuskulární podání, topické podání, orální podání nebo intraperitoneální podání.
  28. 29. Způsob podle nároku 27 vyznačený tím , že kočka je příjemcem transplantovaného orgánu nebo tkáně nebo trpí imunitní odezvou.
  29. 30. Způsob potlačení imunitní odezvy u kočky vyznačený tím , že zahrnuje podání protismyslné nukleové kyseliny, která je schopna hybridizace na: (a) kočičí CD28 mRNA transkript, (b) kočičí CD80 transkript nebo (c) kočičí CD86 mRNA transkript a inhibice translace těchto transkriptů, přičemž protismyslná nukleová kyselina je přítomna v množství účinném pro inhibicí translace a takto potlačení imunitní odezvy u kočky.
  30. 31. Způsob redukce nebo odstranění nádoru u kočky vyznačený tím , že zahrnuje zavedení rekombinantního viru podle nároku 1 obsahujícího nukleovou kyselinu, která kóduje kočičí CD80 protein, kočičí CD86 protein nebo jejich kombinaci do nádoru kočky v množství účinném pro redukci nebo odstranění nádoru.
  31. 32. Způsob podle nároku 31 vyznačený tím , že rekombinantní virus dále obsahuje, a je schopen exprimovat, antigen související s kočičím nádorem a podání je provedeno systemicky.
    01-3118-00-Če
    44 4*
    4 · 4 4 • · · · • 4 44· • 9 4
    94 44 • 4 Φ···
    4 « • ·
    9 4
    4 ·
    4« • 4
    4 »9
    4 4<
    4 · 4 ·
    4 <4 • **
    444
  32. 33. Rekombinantní virus podle nároku 1 dále obsahuje nukleovou kyselinu kódující genom viru kočičí imunodeficience nebo jeho část.
  33. 34. Rekombinantní virus podle nároku 1 dále obsahuje nukleovou kyselinu kódující genom viru kočičí leukémie nebo jeho část.
  34. 35. Rekombinantní virus podle nároku 33 nebo 34 dále obsahuje nukleovou kyselinu kódující kočičí IL12, p35 nebo p40.
  35. 36. Vakcína vyznačená tím, že obsahuje účinné imunizující množství rekombinantního viru podle nároku 33 nebo 34 a vhodný nosič.
CZ20003934A 1998-05-01 1999-04-30 Rekombinantní virus exprimující cizí DNA kódující kočičí CD80, kočičí CTLA-4 nebo kočičí CD-86 a jeho použití CZ20003934A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7171198A 1998-05-01 1998-05-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20003934A3 true CZ20003934A3 (cs) 2001-09-12

Family

ID=22103082

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20003934A CZ20003934A3 (cs) 1998-05-01 1999-04-30 Rekombinantní virus exprimující cizí DNA kódující kočičí CD80, kočičí CTLA-4 nebo kočičí CD-86 a jeho použití

Country Status (20)

Country Link
EP (1) EP1073759B1 (cs)
JP (2) JP2002513581A (cs)
KR (1) KR100796799B1 (cs)
AT (1) ATE511545T1 (cs)
AU (1) AU761755B2 (cs)
BR (1) BR9915970A (cs)
CA (1) CA2327528C (cs)
CZ (1) CZ20003934A3 (cs)
ES (1) ES2367245T3 (cs)
HK (1) HK1032606A1 (cs)
HU (1) HUP0200320A3 (cs)
IL (2) IL139372A0 (cs)
NO (1) NO20005482L (cs)
NZ (1) NZ507793A (cs)
PL (1) PL199359B1 (cs)
RU (1) RU2244006C2 (cs)
SK (1) SK16162000A3 (cs)
UA (1) UA73718C2 (cs)
WO (1) WO1999057295A1 (cs)
ZA (1) ZA200006124B (cs)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7078512B2 (en) 1998-05-01 2006-07-18 Schering-Plough Animal Health Corporation Nucleic acid encoding feline CD86
EP1218393A4 (en) * 1999-10-06 2004-03-31 Univ Pennsylvania CELL TARGETING COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
CN101137674A (zh) 2005-03-08 2008-03-05 肯顿有限公司 刚地弓形虫的嵌合重组抗原
GB201601498D0 (en) 2016-01-27 2016-03-09 Pirbright Inst The Coronavirus
BR112018069371A2 (pt) 2016-03-21 2019-01-22 South Dakota Board Of Regents construção de ácido nucleico, vetor, vacina ou composição imunogênica, método de entrega de uma vacina, método de produção de uma construção de ácido nucleico e método para conferir imunidade contra um antígeno

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0487587A1 (en) * 1989-08-18 1992-06-03 Chiron Corporation Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
ES2188589T3 (es) * 1992-06-26 2003-07-01 Akzo Nobel Nv Vacuna recombinante del herpes virus felino.
AU4702293A (en) * 1992-07-30 1994-03-03 Akzo Nobel N.V. Vector vaccines of recombinant feline herpesvirus
US6084067A (en) * 1993-07-26 2000-07-04 Dana-Farber Cancer Institute CTLA4/CD28 ligands and uses therefor
TW377373B (en) * 1993-09-22 1999-12-21 Wyeth Corp Recombinant raccoon pox viruses and their use as an effective vaccine against feline infectious peritonitis virus disease
ATE197765T1 (de) * 1994-10-03 2000-12-15 Us Gov Health & Human Serv Zusammensetzung enthaltend ein antigen exprimierendes rekombinantes virus und ein immunstimulierendes molekül exprimierendes rekombinantes virus
US6221361B1 (en) * 1995-01-19 2001-04-24 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
US5820869A (en) * 1995-06-07 1998-10-13 American Home Products Corporation Recombinant raccoon pox viruses and their use as an effective vaccine against feline immunodeficiency virus infection

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200006124B (en) 2002-04-02
IL139372A (en) 2010-11-30
HUP0200320A3 (en) 2006-03-28
BR9915970A (pt) 2001-12-04
UA73718C2 (en) 2005-09-15
ATE511545T1 (de) 2011-06-15
ES2367245T8 (es) 2011-12-09
NO20005482D0 (no) 2000-10-31
HK1032606A1 (en) 2001-07-27
EP1073759B1 (en) 2011-06-01
CA2327528C (en) 2010-10-12
PL346012A1 (en) 2002-01-14
KR20010085242A (ko) 2001-09-07
AU3968899A (en) 1999-11-23
ES2367245T3 (es) 2011-10-31
SK16162000A3 (sk) 2001-12-03
RU2244006C2 (ru) 2005-01-10
PL199359B1 (pl) 2008-09-30
EP1073759A1 (en) 2001-02-07
IL139372A0 (en) 2001-11-25
JP2002513581A (ja) 2002-05-14
WO1999057295A1 (en) 1999-11-11
NO20005482L (no) 2000-12-27
JP2009178163A (ja) 2009-08-13
CA2327528A1 (en) 1999-11-11
KR100796799B1 (ko) 2008-01-22
NZ507793A (en) 2003-05-30
HUP0200320A2 (hu) 2002-05-29
AU761755B2 (en) 2003-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8071738B2 (en) Feline CD86 polypeptides and nucleic acids
IL184202A (en) Nuclear nuclei encoding the CTLA-4 receptor of cat origin, vectors, surrogate cells and vaccines containing them, and CTLA-4 polypeptide of cat origin
KR100796799B1 (ko) 고양이의 ｃｄ80, 고양이의 ｃｔｌａ-4 또는 고양이의ｃｄ86을 코딩하는 외래 ｄｎａ를 발현시키는 재 조합바이러스 및 이들의 용도
US20130295133A1 (en) Recombinant virus expressing foreign dna encoding feline cd80, feline cd86, feline cd28, or feline ctla-4 and uses thereof
MXPA00010613A (es) Virus recombinante que expresa adn extraño que codifica para cd80 de felino, ctla-4 de felino o cd86 de felino y usos del mismo
AU2007214286B2 (en) Feline CD80, feline CD86, feline CD28 and feline CTLA-4 nucleic acid and polypeptides
AU2003271367A1 (en) Feline CD80, feline CD86, feline CD28, and feline CTLA-4 nucleic acid and polypeptides
MXPA00010618A (en) Feline cd80, feline cd86, feline cd28, and feline ctla-4 nucleic acid and polypeptides