JP2002513581A - ネコｃｄ８０、ネコｃｔｌａ−４またはネコｃｄ８６をコードする外来ｄｎａを発現する組換えウイルスおよびその使用 - Google Patents

ネコｃｄ８０、ネコｃｔｌａ−４またはネコｃｄ８６をコードする外来ｄｎａを発現する組換えウイルスおよびその使用

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ネコＣＤ８０、ネコＣＴＬＡ−４またはネコＣＤ８６をコードする外来ＤＮＡを発現する組換えウイルスおよびその使用 【解決手段】 本発明は、各外来核酸がタンパク質をコードする、ウイルスのウイルス性ゲノムの非必須領域内に挿入される少なくとも１つの外来核酸を含む組換えウイルスに関する。コードされるタンパク質は、ネコＣＤ２８タンパク質またはその免疫原部分、ネコＣＤ８０タンパク質またはその免疫原部分、またはネコＣＴＬＡ−４タンパク質またはその免疫原部分から構成される群から選択される。そのタンパク質は、組換えウイルスを、適切な宿主に導入するときに発現される能力がある。本発明は、さらに、病原体から由来する免疫原をコードする外来核酸を含む組換えウイルスにも関する。本発明は、ネコにおける免疫応答を増強する能力がある組換えウイルスも含む。本発明は、ネコにおける免疫応答を抑制する能力がある組換えウイルスをも含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （インターフェロンγおよびその使用） 本発明では、１９９８年５月１日に提出された米国特許出願番号第０９／０７
１，７１１号の優先権が主張され、そしてその内容は本明細書の一部をなす参照
として本出願に組込まれる。本出願を通して、種々の刊行物が括弧内に引用され
る。これらの刊行物の全目録は、配列リスト部分の直前の明細書の最後に見るこ
とができる。これらの刊行物の開示は、本発明が関連する技術の現状をいっそう
十分に記述するために、その全体が本明細書の一部として本願に援用される。
【０００２】
【発明の背景】
宿主内での疾病に対する応答におけるＴ細胞活性化および増殖の刺激は、２つ
の相互作用に依存すると思われる。即ち、ＭＨＣクラスＩ分子に関連した免疫原
ペプチドのＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）による認識、並びに、ＣＤ８０およびＣ
Ｄ８６のようなアクセサリーリガンドと、Ｔ細胞上のそれらのコレセプターＣＤ
−２８および／またはＣＴＬＡ−４との二次的相互作用である。これら２つの経
路の首尾よい相互作用は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の活性および増
殖、およびＴｈ１およびＴｈ２型免疫制御サイトカインの産生の増加につながる
。Ｔ細胞の適切な同時刺激の不存在下ではアネルギー状態が発生する可能性があ
り、それにより、Ｔ細胞はサイトカインを増殖および分泌できない。数年かかっ
て、２つの分子がＴ細胞応答の主要なレギュレーターとして出現してきた。即ち
、ＣＤ２８とそのリガンド（ＣＤ８０およびＣＤ８６）である。ＣＤ２８は、そ
の一次Ｔ細胞の同時刺激レセプターであり、それはＣＤ８０およびＣＤ８６との
相互作用により、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞の死を防止するサイトカイン合成を増
強する。ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２とも呼ばれる）、ＣＤ−２８相同体も、同時
刺激における重要な役割を果す。完全には理解されないが、Ｔ細胞同時刺激応答
を阻害するようである。同時刺激工程でのＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４およびそれら
のリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６の中で相互作用および相互役割は、宿主中の
疾病に対する免疫応答の全体的誘導および抑制に重要である（Linsleyら、１９
９１年ａ、１９９３年ａ）。
【０００３】 現在、ネコにおけるネコ免疫不全疾病およびネコの感染性腹膜炎疾病の予防の
ための成功したワクチンは存在しない。現在のネコ白血病ウイルスは入手可能で
はあるが、それらの効力レベルには疑問が残り、ある場合には当該疾病を引起す
可能性がある。実験的なネコ感染性腹膜炎ワクチンは防御性がないか、または、
抗体媒介性増強を通して早期の死亡を起すことが示された。したがって、ワクチ
ンが未だ存在しないこれらの疾患および他の疾病に対する保護を提供し、または
現存し且つ一般に使用されるワクチンの効力を改善する薬剤および組成物が、当
該技術において必要性とされている。さらに、抗体を増強する疾患の不在下にお
いて、細胞媒介性応答を誘導するワクチンおよび薬剤が、当該技術において必要
とされている。そして最終的に、仔ネコのワクチン接種は、仔ネコのなかで母か
ら受継いだ抗体を克服する能力がないので困難である。これらの障壁を克服する
助けになる安全で有効な薬剤が必要とされる。
【０００４】 本発明では、ネコＣＤ２８、ネコＣＴＬＡ−４およびそれらのリガンド、即ち
ネコＣＤ８０およびネコＣＤ８６の同時刺激分子の発現を操作することによって
、特定のネコの病原体またはネコの疾病症状に対する所望の免疫応答を上昇させ
るために、増大、抑制またはリダイレクションを介して、Ｔ細胞の応答を制御す
ることが可能である。特に、これらの同時刺激分子は、感染性疾病に対するワク
チン接種、感染性疾病の治療、および腫瘍の治療、ネコでの分解性、自己免疫性
および免疫不全の症状に有用である。本発明は、上記の現在入手可能なネコワク
チンの効能および有効性の欠如を克服するものである。
【０００５】
【発明の概要】
本発明は、ウイルスのウイルス性ゲノムにおける非必須領域内に挿入された少
なくとも１つの外来核酸を含む組換えウイルスであって、このような外来核酸の
それぞれが蛋白質をコードする組換えウイルスに関する。コードされるタンパク
質は、ネコＣＤ２８タンパク質またはその免疫原部分、ネコＣＤ８０タンパク質
またはその免疫原部分、ネコＣＤ８６タンパク質またはその免疫原部分、または
ネコＣＴＬＡ−４タンパク質またはその免疫原部分からなる群から選択される。
その一部は、組換えウイルスが適切な宿主に導入されるとき発現される能力があ
る。
【０００６】 本発明はまた、病原体に由来する免疫原をコードする外来核酸をさらに含む組
換えウイルスも含む。本発明は、ネコでの免疫応答を増強する能力のある組換え
ウイルスをも含む。本発明は、ネコでの免疫応答を抑制する能力のある組換えウ
イルスをも含む。
【０００７】
【発明の詳細な記述】
本発明は、ウイルスのウイルス性ゲノムにおける非必須領域内に挿入された少
なくとも１つの外来核酸を含む組換えウイルスであって、このような外来核酸の
それぞれが、（ａ）ネコＣＤ２８タンパク質またはその免疫原部分、ネコＣＤ８
０タンパク質またはその免疫原部分、ネコＣＤ８６タンパク質またはその免疫原
部分、またはネコＣＴＬＡ−４タンパク質またはその免疫原部分の群から選択さ
れるタンパク質をコードし、そして（ｂ）前記組換えウイルスが適切な宿主に導
入されたときに発現される能力があることを特徴とする組換えウイルスに関する
。
【０００８】 上記発明の一つの実施形態では、組換えウイルスは、少なくとも２つの外来核
酸を含み、各々は、ウイルスゲノムの必須でない領域内に挿入される。
【０００９】 本発明の別の実施形態では、組換えウイルスは、少なくとも３つの外来核酸を
含み、各々は、ウイルスゲノムの必須でない領域内に挿入される。
【００１０】 本発明の別の実施形態では、組換えウイルスは、４つの外来核酸を含み、各々
は、ウイルスゲノムの必須でない領域内に挿入される。
【００１１】 別の実施形態では、組換えウイルスは、それに限定されないが、アライグマ痘
ウイルス、豚痘ウイルスまたはネコのヘルペスウイルスが含まれる。
【００１２】 上で確認される発明のさらに別の実施形態では、組換えウイルスは、１つ以上
の外来核酸を含み、そして各外来核酸は、同じ非必須領域に挿入される。別の実
施形態では、任意の組換えウイルスは、全外来核酸が同じ非必須領域に挿入され
ない、１つ以上の外来核酸を含む。
【００１３】 別の実施形態では、任意の組換えウイルスは、病原体から由来する免疫原をコ
ードする外来核酸を含む。本発明の別の実施形態では、何れかの組換えウイルス
は、ネコの病原体、狂犬病ウイルス病原体、クラミジア病原体、トキソプラスモ
シス・コンジ(Toxoplasmosis gondii)病原体、ジロフィラリア・イムニチス(Dir
ofilaria immitis)病原体、ノミの病原体、または細菌性病原体をコードする外
来核酸を含む。本発明の別の実施形態では、組換えウイルスは、ネコの免疫不全
ウイルス（ＦＩＶ）、ネコの白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコの感染性腹膜炎
ウイルス（ＦＩＰ）、ネコの汎白血球減少症ウイルス、ネコのカリチウイルス、
ネコのレオウイルス３型、ネコのロタウイルス、ネコのコロナウイルス、ネコの
シンシチウムウイルス、ネコの肉腫ウイルス、ネコのヘルペスウイルス、ネコの
ボルナ病ウイルス、またはネコの寄生生物をコードする。
【００１４】 本発明の別の実施形態では、組換えウイルスは、外来核酸を発現するためのプ
ロモーターを含む少なくとも１つの外来核酸を含む。別の実施形態では、組換え
ウイルスは、そのウイルスに対するプロモーター外来遺伝子の制御下で少なくと
も１つの外来核酸を発現する。
【００１５】 本発明の１つの実施形態では、組換えウイルスは、さらに、検出可能なマーカ
ーをコードする外来核酸を含む。本発明の別の実施形態では、検出可能なマーカ
ーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ベータ・ガラクトシダーゼである。
【００１６】 本発明は、さらに、ＦＩＶｇａｇプロテアーゼ、ＦＩＶエンベロープタンパク
質、ＦｅＬＶｇａｇプロテアーゼ、またはＦｅＬＶエンベロープタンパク質由来
の免疫原をコードする組換えウイルスを提供する。
【００１７】 本発明は、さらに、ネコの免疫不全ウイルスゲノムまたはその一部をコードす
る核酸を含む組換えウイルスを提供する。本発明は、さらに、ネコの白血病ウイ
ルスゲノムまたはその一部をコードする核酸を含む組換えウイルスを提供する。
本発明は、さらに、ネコＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ｐ３５またはｐ４０をコード
する核酸を含む組換えウイルスを提供する。本発明は、さらに、有効な免疫感作
量のこのような組換えウイルスおよび適切な担体を含むワクチンを提供する。
【００１８】 本発明は、ネコのヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｇ遺伝子である非必須領域
を含む組換えネコヘルペスウイルスを提供する。本発明は、Ｓ−ＦＨＶ−０３１
（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２６０４）と称される請求項１２の組換えネコヘルペ
スウイルスを提供する。このウイルスは、特許手続上の微生物の寄託の国際承認
に関するブタペスト条約の規定の下で、アメリカ合衆国バージニア州２０１０８
−０９７１、マナサス、ユニバーシティー・ブルバード１０８０１のジ・アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９９８年５月１に寄
託された。
【００１９】 本発明は、豚痘ウイルスのＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片の大型ＨｉｎｄＩＩＩから
ＢｇｌＩＩまでの副断片中の非必須領域を有する組換え豚痘ウイルスを提供する
。本発明は、さらに、Ｓ−ＳＰＶ−２４６と称される請求項１４の組換えネコの
豚痘（ＡＴＣＣ受諾番号ＶＲ−２６０３）を提供する。このウイルスは、特許手
続上の微生物の寄託の国際承認に関するブタペスト条約の規定の下に、アメリカ
合衆国バージニア州２０１０８、マナサス、ユニバーシティー・ブルバード１０
８０１のジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１
９９８年５月１に寄託された。
【００２０】 上述の発明の実施形態では、組換えウイルスは、タンパク質の可溶性部分中の
ＣＤ２８、ＣＤ８０またはＣＤ８６タンパク質の一部である。本発明の別の実施
形態では、組換えウイルスは、ネコＣＴＬＡ−４タンパク質をコードする外来核
酸を含む。
【００２１】 上に記述される発明は、免疫感作有効量の組換えウイルスおよび適切な担体を
含むワクチンについてである。本発明の１つの実施形態では、ワクチンは、免疫
感作有効量の組換えウイルスを、約１×１０５ｐｆｕ／ｍｌ〜約１×１０８ｐｆ
ｕ／ｍｌ、および約 ｃｆｕ／ｍｌで含む。別の実施形態では、本発明はさらに
、組換えウイルスとの混合物および有効な免疫感作量の第二の免疫原を含むワク
チンを提供する。
【００２２】 本発明は、ネコに、免疫感作有効量の任意の上記組換えウイルスを投与するこ
とを特徴とする、ネコでの免疫応答を増強する方法を提供する。本発明は、さら
に、ネコに、免疫感作有効量の任意の上記組換えウイルスを投与することによっ
て、ネコを免疫化する方法を提供する。
【００２３】 本発明は、可溶性ＣＤ２８、ＣＤ８０またはＣＤ８６を含む、任意の抑制有効
量の組換えウイルスをネコに投与することによって、ネコにおける免疫応答を抑
制する方法を提供する。本発明は、ネコＣＴＬＡ−４タンパク質を含む、任意の
抑制有効量の組換えウイルスを、ネコに投与することによって、ネコにおける免
疫応答を抑制する方法を提供する。
【００２４】 本発明は、静脈、皮下、筋肉内、経筋肉、局所、経口または腹膜組織内経路で
上述の組換えウイルスを投与することを供する。
【００２５】 １つの実施形態では、本発明は、ネコが、移殖臓器または組織の享受側であり
、免疫応答に悩まされている場合に、ネコにおける免疫応答を抑制する方法を提
供する。別の実施形態では、本発明は、（ａ）ネコＣＤ２８ｍＲＮＡ転写物、（
ｂ）ネコＣＤ８０転写物、または（ｃ）ネコＣＤ８６ｍＲＮＡ転写物とハイブリ
ダイズして、その翻訳を阻害する能力のあるアンチセンス核酸をネコに投与する
ことを特徴とする、ネコにおける免疫応答を抑制する方法を提供する。そのアン
チセンス核酸は、翻訳を阻害するのに有効な量で存在しており、それによりネコ
における免疫応答を抑制する。
【００２６】 １つの実施形態では、上述の発明は、腫瘍を減少または排除するのに有効な量
で、ネコＣＤ８０タンパク質、ネコＣＤ８０タンパク質またはその組合せをコー
ドする核酸を含む組換えウイルスを、ネコにおける腫瘍に投与することを特徴と
する、ネコにおける腫瘍を減少させ、または排除する方法を提供する。
【００２７】 １つの実施形態では、本発明は、組換えウイルスがさらに含まれ、そしてネコ
腫瘍に関連した抗原を発現する能力があり、そしてその投与が全身投与で行われ
る、ネコにおける腫瘍を減少させるかまたは排除する方法を提供する。
【００２８】 本発明は、ＣＤ８０またはＣＤ８６またはＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４または
ＲＮＡを部分的あるいは全体で、含むクローニングおよび発現ベクターおよびＣ
Ｄ８０コード化ベクターまたはＣＤ８６コード化ベクターまたはＣＤ２８コード
化ベクターまたはＣＴＬＡ−４コード化ベクターで形質転換される細胞と同様に
、ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）リガンドまたはネコＣＤ８６（Ｂ７−２）リガンド
またはネコＣＤ２８レセプターまたはネコＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）レセプタ
ーをコードする、単離および精製されたＤＮＡを提供する。ＣＤ８０またはＣＤ
８６またはＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４が、選択されるネコ種は、それに限定さ
れないが、家ネコ、ライオン、ピューマ、ボブキャット、およびチーターを含む
群からのものである。
【００２９】 本発明は、約９４１ヌクレオチドの単離され、そして精製されたネコＣＤ８０
（Ｂ７−１）ｃＤＮＡを提供する。本発明は、約３３，４８５ｋＤａの分子量、
約９．１の等電点、１０のｐＨ７．０での総荷電の生来の膜結合形態または成熟
形態である、約２９２アミノ酸の単離および精製されたネコＣＤ８０ポリペプチ
ドも提供する。同時刺激分子ＣＤ２８および腫瘍抗原、または病原体生物から得
られる抗原とＣＤ８０の同時発現は、免疫刺激サイトカインの産生を含めた、Ｔ
リンパ球を活性化または活性を増強し、そして他の細胞型の成長を制御する能力
を示す。同時刺激分子ＣＴＬＡ−４およびＣｄ８０の同時発現は、Ｔリンパ球の
活性化を制御する能力を示す。
【００３０】 本発明は、およそ１１７６ヌクレオチドの単離および精製ネコＣＤ８６（Ｂ７
−２）ｃＤＮＡを提供する。本発明はまた、およそ３２０アミノ酸の単離および
精製ネコＣＤ８６ポリペプチドも提供し、そしてその生来の膜結合形態または成
熟形態は、およそ３６，３９４ｋＤａの分子量、約９．１９の等電点、ｐＨ７．
０で１１．２７の総荷電を示す。同時刺激分子ＣＤ２８および腫瘍抗原または病
原性生物から得られる抗原とのＣＤ８６の同時発現は、免疫刺激サイトカインの
産生を含めたＴリンパ球を活性化し、または活性化を減少させ、そして他の細胞
型の成長を制御する能力を示す。同時刺激分子ＣＴＬＡ−４とのＣＤ８６の同時
発現は、Ｔリンパ球の活性化を制御する能力を示す。
【００３１】 本発明によるネコＣＤ８０またはＣＤ８６は、生来のまたは組換え体源から得
られる。本発明によるネコＣＤ８０またはＣＤ８６は、生来で、そして膜結合形
態、または膜貫通ドメインを欠く分泌形態を含む。
【００３２】 本発明は、およそ６８９ヌクレオチドの単離および精製ネコＣＤ２８ｃＤＮＡ
を提供する。本発明は、およそ２２１アミノ酸の単離および精製されたネコＣＤ
２８ポリペプチドも提供し、その生来の膜結合形態または成熟形態は、約２５，
３１９ｋＤａの分子量、約９．１７の等電点、ｐＨ７．０で９．５８の総荷電を
示す。
【００３３】 本発明は、およそ７４９ヌクレオチドの単離および精製ネコＣＴＬＡ−４ｃＤ
ＮＡを提供する。本発明は、およそ２２３アミノ酸の単離および精製ネコＣＴＬ
Ａ−４ポリペプチドも提供し、その本来の膜結合形態または成熟形態は、約２４
，３８１ｋＤａの分子量、約６．３４の等電点、ｐＨ７．０で−０．９９の総荷
電を示す。
【００３４】 本発明は、外来ＤＮＡを発現する組換え豚痘ウイルス提供し、その外来ＤＮＡ
は、ネコＣＤ８０、ネコＣＤ８６、ネコＣＤ２８、およびネコＣＴＬＡ−４ｃＤ
ＮＡおよびポリペプチドをコードする。
【００３５】 本発明は、外来ＤＮＡを発現する組換えアライグマウイルスを提供し、その外
来ＤＮＡは、ネコＣＤ８０、ネコＣＤ８６、ネコＣＤ２８、およびネコＣＴＬＡ
−４ｃＤＮＡおよびポリペプチドをコードする。
【００３６】 本発明は、外来ＤＮＡを発現する組換えネコヘルペスウイルスを提供し、その
外来ＤＮＡは、ネコＣＤ８０、ネコＣＤ８６、ネコＣＤ２８、およびネコＣＴＬ
Ａ−４ｃＤＮＡおよびポリペプチドをコードする。
【００３７】 別の態様では、本発明は、免疫原に対するネコ科での免疫応答を増強する方法
であって、免疫応答を増強するのに有効な量で、組換え豚痘ウイルスベクター、
組換えアライグマ痘ウイルスベクターまたは組換えネコヘルペスウイルス中の、
ネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４を伴うかまたはこれを伴わないネコＣＤ８
０またはネコＣＤ８６の前、後または実質的にこれと同時に、免疫原を投与する
ことによって達成される方法を提供する。
【００３８】 別の態様では、本発明は、免疫応答を抑制するのに有効な量で、組換え豚痘ウ
イルスベクター、組換えアライグマ痘ウイルスベクターまたは組換えネコヘルペ
スウイルス中の、ネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４を伴うかまたは伴わない
、或いはネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６、ネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−
４をコードする一部または全てがアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを伴う、ネコ
ＣＤ８０またはネコＣＤ８６の前、後または実質的これとに同時に免疫原を投与
することによって達成される、免疫原に対するネコ科での免疫応答を抑制する方
法を提供する。
【００３９】 別の態様では、本発明は、免疫原、および組換え豚痘ウイルスベクター、組換
えアライグマ痘ウイルスベクター、または組換えネコヘルペスウイルスベクター
中の、免疫応答増強のために有効な量のネコＣＤ８０を含むことを特徴とする、
免疫原に対するネコ科での免疫応答を誘導するワクチンを提供する。免疫原は、
例えば、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコバルボウイルス、ネ
ココロナウイルス、ネコレプトウイルスなどのようなネコ病原体に由来する。
【００４０】 別の態様では、本発明は、免疫原のＤＮＡまたはＲＮＡ、および免疫応答を調
節するのに有効な量で、タンパク質またはタンパク質の断片をコードするネコＣ
Ｄ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８アクセサリー分子のＤＮＡまたはＲＮＡを発現する
、組換え豚痘ウイルスベクター、組換えアライグマ痘ウイルスベクター、または
組換えネコヘルペスウイルスベクターを、任意の組合せで投与することによって
達成される、免疫原に対するネコ科での免疫応答を誘導するワクチンを提供する
。
【００４１】 ネコＣＤ８０タンパク質は、それぞれ、ヒトおよびマウスのタンパク質と５９
％および４６％一致するアミノ酸配列を示す。ネコＣＤ８６タンパク質は、それ
ぞれ、ヒトおよびウサギのタンパク質と６８％および６４％一致するアミノ酸配
列を示す。ネコＣＤ２８タンパク質は、それぞれ、ヒトおよびマウスのタンパク
質と８２％および７４％一致するアミノ酸配列を示す。ネコＣＴＬＡ−４タンパ
ク質は、それぞれ、ヒトおよびマウスのタンパク質と８８％および７８％一致す
るアミノ酸配列を示す。ヒトまたはマウスのＣＤ８０またはＣＤ８６タンパク質
は、ネコＣＤ８０またはＣＤ８６タンパク質を機能的に交換することができない
。したがって、ネコＣＤ８０、ネコＣＤ８６、ネコＣＤ２８およびネコＣＴＬＡ
−４は、ネコ科で免疫性を制御するのに必要とされる新規薬剤である。
【００４２】 本発明は、ネコ種から得られるＴ細胞制御アクセサリー分子ＣＤ８０（Ｂ７−
１）またはＣＤ８６（Ｂ７−２）またはＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５
２）を包含する。本発明は、生来または組換え体源の何れかから精製されるＣＤ
８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドと同様に、ネコＣＤ
８０またはネコＣＤ８６またはネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４を部分的に
、または全体でコードする単離および精製核酸を提供する。本発明により産生さ
れるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は、腫瘍および病原
体生物に対するネコワクチンの効力を増強するための治療剤、また、ネコにおけ
るウイルス性または細菌性疾病を治療する治療剤として使用される。本発明によ
り産生されるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は、過剰活
性、過敏活性または方向違いの免疫応答のための疾病を緩和するのにも使用され
る。
【００４３】 ＜核酸、ベクター、形質転換体＞ ネコＣＤ８０（配列番号１、３）、ネコＣＤ８６（配列番号５）、ネコＣＤ２
８（配列番号７）、またはネコＣＴＬＡ−４（配列番号９）をコードする配列は
、図１から５に示され、そしてネコＣＤ８０（配列番号２、４）、ネコＣＤ８６
（配列番号６）、ネコＣＤ２８（配列番号８）、またはネコＣＴＬＡ−４（配列
番号１０）の推定アミノ酸配列は、図１から５に示される。これらのネコポリペ
プチドのＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４としての名称は、こ
れらのポリペプチドのヒトまたはマウスまたはウサギ相同体に対するアミノ酸配
列の部分的同一性、およびネコＣＤ２８レセプター（下に参照）に、またはＣＴ
ＬＡ−４に結合し、そしてＴリンパ球の活性化を活性化または刺激またはさもな
ければ制御するＣＤ８０またはＣＤ８６ポリペプチドの能力に基づく。さらに、
理論に拘束されることを望むものではないが、ネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６
ポリペプチドも、１つまたはそれ以上の以下の生物活性：ＮＫ（ナチュラルキラ
ー）細胞の活性化、Ｂ細胞成熟化の刺激、ＭＨＣ制限内毒性Ｔリンパ球の活性化
、幹細胞の増殖、サイトカインレセプターとの相互作用および免疫制御サイトカ
インの誘導を示すことが推定される。
【００４４】 遺伝コード（すなわち、ある種のアミノ酸をコードする複数コドン）の縮重の
ため、図１から５に示される以外のＤＮＡ配列も、図１から５に示されるネコＣ
Ｄ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４アミノ酸配列をコードできる。
このような他のＤＮＡとしては、例示のコドン中の１つまたはそれ以上のヌクレ
オチドにおける変化が、その位置でコードされるアミノ酸に改変がない「配列保
存性」変異体を含むものが挙げられる。さらに、ポリペプチド中の例示アミノ酸
残基は、しばしば、生来のポリペプチドの全部の配座および機能を変えることな
しに変化させることができる。このような「機能保存的」変異体としては、それ
に限定されないが、例えば酸性、塩基性、疎水性、親水性、芳香族性のような類
似の生理化学的特性を示すものにアミノ酸を置換すること（例えば、リシンをア
ルギニンに、アスパルテートをグルタメートに、またはグリシンをアラニンに置
換すること）が挙げられる。さらに、アミノ酸配列は、分子の生物活性を破壊す
ることなしに添加または欠失される。例えば、別のアミノ酸配列を、アミノまた
はカルボキシル末端の何れかに加えて、ヒスチジンタグ（すなわち、タンパク質
の１段階精製を可能にし、その後それらを、化学的に、または酵素的に除去する
）のような精製タグとして働く。選択的に、追加の配列は、追加の細胞表面結合
部位を付与するか、さもなければ抗体についての抗原結合部位の付加とともにの
ように、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４の標的細胞の特
異性を変える。
【００４５】 本発明の範囲内のネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６またはネコＣＤ２８または
ネコＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡは、配列保存的変異体ＤＮＡ、機能保存的変異体ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列、およびそれらの組合せのような、図１から５
のものである。本発明は、単独、または他の配列または成分との組合せの何れか
で、有用な程度の生物活性を示すネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴ
ＬＡ−４の断片を包含する。下で説明されるとおり、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ
２８またはＣＴＬＡ−４の配列を推定的に操作すること、および指示ネコＣＤ８
０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４変異体が、指示使用についての適切
な安定性および生物活性を保有するかどうか、またはこれらの分子の結合活性に
影響を及ぼす多様性が、有効性が増大するかどうかを確立することは、当業界で
の通常な技術の範囲に十分ある。ネコＣＤ８０およびＣＤ８６は、各々、コレセ
プターＣＤ２８に、またはコレセプターＣＴＬＡ−４に結合する。これは、組換
えシステム中で変異体ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペ
プチドを発現および精製し、そして細胞培養物中で、または動物中でそのＴ細胞
刺激活性および／または成長促進活性を分析し、続いてその使用法で試験するこ
とによって達成できる。変異体ＣＤ８０を、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４レセプ
ターへの官能基結合によって、生物活性について試験する。変異体ＣＤ８６を、
ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４レセプターへの官能基結合によって、生物活性につ
いて試験する。類似の方法で、変異体ＣＤ２８または変異体ＣＴＬＡ−４を、生
物活性について試験する。
【００４６】 本発明は、家ネコに限定しないで、ライオン、トラ、チーター、ボブキャット
などを含めた他のネコ種から由来するネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８または
ＣＴＬＡ−４ＤＮＡ（およびポリペプチド）も包含する。図１から５に示される
配列のネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４同族体は、ｃＤＮ
Ａまたはゲノムライブラリーをスクリーニングして、図１から５の配列の全部ま
たは一部を含むプローブにハイブリット形成するクローンを確認することによっ
て容易に同定される。代替的に、発現ライブラリーは、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６
、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を認識する抗体を使用してスクリーニングされる
。理論に繋げられる望みなしに、他のネコ種から得られるＣＤ８０またはＣＤ８
６遺伝子が、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４遺伝子と少
なくとも約７０％同一性を共有することが予想される。さらに、本発明の範囲に
あるのは、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４と少なくとも
約２５％アミノ酸同一性を共有するポリペプチドをコードするＤＮＡと定義され
る、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４の同族体をコードするＤ
ＮＡである。
【００４７】 一般に、本発明による核酸操作では、例えば、分子クローニング、実験室マニ
ュアル(Molecular Cloning, Alaboratory Manual)（第２版、Sambrook、Fitsch
およびManiatis、コールド・スプリング・ハーバー）または分子生物学における
最新のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)（Aufubel、Bre
nt、Kingston、More、Feidman、SmithおよびStuhl、グリーン・パブル．アソシ
．、ウイリー−インターサイエンス、ニューヨーク州ニューヨーク（ＮＹ，ＮＹ
）、１９９２年）で開示されるもののような、当業界で十分に知られる方法が使
用される。
【００４８】 本発明は、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列およびセンスおよびアンチセンスを包含
する。本発明は、ゲノム性ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−
４配列およびそれに限定されないが、制御配列を含めたフランキング配列も包含
する。ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドをコード
する核酸配列は、プロモーター、エンハンス（enhances）、応答要素、シグナル
配列、ポリアルデヒド化配列、イントロン、５’−および３’−非コーディング
領域などを含めた異種配列とも連結している。ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２
８またはＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡ配列に操作可能に結合した転写性制御要素は、そ
れに制限せずに、原核生物の細胞、真核生物の細胞、原核生物の細胞のウイルス
、真核生物の細胞のウイルス、およびその任意の組合せから由来する遺伝子の発
現を指示する能力を有するものが挙げられる。他の有用な異種制御配列は、当業
者に知られている。
【００４９】 本発明の核酸は、それらの安定性、可溶性、結合アフィニティー、および特異
性を変えるために当業界で習熟したものに知られた方法によって修正される。例
えば、配列は、選択的にメチル化される。本発明の核酸配列も、直接的に、また
は間接的に検出可能なシグナルを供する能力のある標識で修飾される。例示の標
識としては、放射性アイソトープ、蛍光分子、ビオチンなどが挙げられる。
【００５０】 本発明は、一部に、または全体的にＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴ
ＬＡ−４ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターも提供する。このような
ベクターとしては、例えば、多様な真核生物および原核生物の宿主中で発現する
ためのプラスミドベクターが挙げられる。好ましくは、ベクターとしては、ネコ
ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドコード部分に操
作的に結合したプロモーターも挙げられる。コードされたネコＣＤ８０、ＣＤ８
６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチド（類）は、ここに説明されるとお
り、またはさもなければ当業者に知られる任意の適切なベクターおよび宿主細胞
を使用することによって発現される。
【００５１】 本発明は、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチ
ド（類）を部分的に、または全体的にコードする核酸を含むベクターも提供する
。このようなベクターとしては、例えば、多様な真核生物の宿主中での発現のた
め、またはＤＮＡまたはＲＮＡワクチンの発現のための生ウイルス性ベクターが
挙げられる。１つの実施形態では、生ウイルス性ベクターを、遺伝子欠失によっ
て弱毒化する。別の実施形態では、ウイルス性ベクターは、化学的処置または加
熱によって不活性化される。生ウイルス性ベクターは、それに限定されないが、
ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、
レトロウイルス、バキュロウイルス、アルファウイルス、ラブドウイルス、ピコ
ルナウイルスを含む群から選択される。生ウイルス性ベクターは、それに限定さ
れないが、ネコのヘルペスウイルス、イヌのヘルペスウイルス、鳥類のヘルペス
ウイルス、ウシのヘルペスウイルス、ウマのヘルペスウイルス、偽狂犬病ウイル
ス、豚痘ウイルス、アビポックスウイルス、鶏痘ウイルス、アライグマ痘ウイル
ス、カナリア痘ウイルス、ワクシニアウイルス、マロニーネズミの白血病ウイル
ス、シンドビスウイルスおよびセムリキフォーレストウイルスを含む群から選択
される。
【００５２】 生ウイルス性ベクターは、部分的に、または全体的にネコＣＤ８０、ＣＤ８６
、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡである外来ＤＮＡを発現する組換えウイ
ルス性ベクターである。外来ＤＮＡは、病原性生物から得られる抗原についての
ｃＤＮＡもある。組換えウイルス性ベクターは、当業者に知られている同族性組
換え体またはコスミド再構築法によって構築される。好ましくは、ベクターは、
ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドコード部分
に操作的に結合したプロモーターも挙げられる。プロモーターは、それに限定さ
れないが、ネコヘルペスウイルスｇＥプロモーター、ポックスウイルス合成後期
／即時型プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス即時型プロモーター、偽狂犬
病ウイルスｇＸプロモーターを含む。遺伝子発現の増進は、カセット（ｐＣＩＴ
Ｅベクター、ウイスコンシン州マディソンのノバゲン(Novagen)）内に含まれる
内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）要素から得られるＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｃ
Ｄ２８またはＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡの発現も挙げられる。ウイルス性ベクターを
育成するためのセルラインとしては、それに限定されないが、クランデル・ネコ
腎細胞（ＣＲＦＫ）、ニワトリの胚線維芽細胞、胚ブタ腎細胞（ＥＳＫ−４）、
ブタ腎細胞（ＰＫ）が挙げられる。コードされたネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ
２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチド（類）は、ここに説明されるとおり、また
はさもなければ当業者に知られる任意に適切なベクターおよび宿主細胞を使用す
ることによって発現される。
【００５３】 好ましい実施形態では、ネコ病原体から由来する免疫原についての遺伝子との
組合せで、ネコＣＤ８０およびＣＤ２８、ＣＤ８０およびＣＴＬＡ−４、ＣＤ８
６およびＣＤ２８、またはＣＤ８６およびＣＴＬＡ−４をコードする遺伝子は、
単独組換えウイルス性ベクターに組み込まれ、そしてその後、生ワクチンに処方
される。ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４遺伝子は、単独
、またはネコ病原体から由来するネコ遺伝子との組合わせで、組換えウイルスに
組込まれ、その結果、これらの遺伝子の発現は、適切なプロモーターによって制
御される。別の実施形態では、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬ
Ａ−４をコードする遺伝子は、単独で、または組合わせで、組換えウイルス性ベ
クターに組込まれ、そしてネコ病原体から由来する免疫原（類）についての遺伝
子をコードする第二の組換えウイルス性ベクターを有するワクチンに同時投与さ
れる。これらの２つの実施形態では、所望の免疫応答の増強、抑制または再配向
を達成するのと同じ細胞内で、または密接に近接する細胞内で所望の免疫応答が
提供される。
【００５４】 免疫原は、それに限定されないが、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイル
ス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス（パルボウイルス
）、ネコカリチウイルス、ネコ・レオウイルス３型、ネコロタウイルス、ネココ
ロナウイルス（感染性腹膜炎ウイルス）、狂犬病ウイルス、ネコシンチウムのウ
イルス、ネコ肉腫ウイルス、ネコヘルペスウイルス（鼻気管炎ウイルス）、ネコ
のボルナ病ウイルス、クラミジア属（Chlamydia）、トキソプラスモシス・ゴン
ジ(Toxoplasmosis gondii)、ネコ寄生生物、ジロフィラリア・イミチス(Dirofil
aria immitis)、ノミ、細菌性病原体などのようなネコ病原体を含む群から選択
される。
【００５５】 ベクターまたは生ウイルス性ベクターは、しばしば、例えば、抗生物質耐性の
ような、宿主中の選択のための１つまたはそれ以上のマーカー、またはβ−ガラ
クトシダーゼ（ｌａｃＺ）またはβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）のような熱
量測定用マーカー、または緑色蛍光タンパク質のような蛍光マーカー、および１
つまたはそれ以上の発現カセットをクローニングまたは発現するための１つまた
はそれ以上の複製系を包含する。挿入されたコーディング配列を、合成し、天然
源がら単離し、ハイブリッドまたは同等物として作成する。転写的制御配列への
コーディング配列のライゲーションは、当業者に知られている方法によって達成
される。適切な宿主細胞を、電気孔穿、ＣａＣｌ２−またはリポソーム依存性Ｄ
ＮＡ取込み、真菌感染、微細注入、微細投影などを含めた任意の適切な方法によ
って形質転換／形質移入／感染させる。
【００５６】 本発明を実施する上で使用するための適切なベクターとしては、限定なしで、
ＹＥｐ３５２、ｐｃＤＮＡＩ（カリフォルニア州カールスバッドのインビトロゲ
ン(Invitrogen)）、ｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロゲン）、およびｐＳＦＶ１（メ
リーランド州ゲーサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ）が挙げられる。本発明に使用
するための１つの好ましいベクターは、ｐＳＦＶ１である。適切な宿主細胞とし
ては、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、ＣＯＳ細胞、ＰＣ１２細胞、ＣＨＯ細胞、ＧＨ４Ｃ
１細胞、ＢＨＫ−２１細胞、および両生類メラニン細胞が挙げられる。ＢＨＫ−
２１細胞は、本発明を実施する上で使用するための好ましい宿主セルラインであ
る。裸のＤＮＡまたは遺伝的ワクチン接種の構築のための適切なベクターとして
は、限定されないが、ｐＴａｒｇｅｔ（ウイスコンシン州マディソンのプロメガ
）、ｐＳＩ（ウイスコンシン州マディソンのプロメガ）およびｐｃＤＮＡ（カリ
フォルニア州カールスバッドのインビトロゲン）が挙げられる。
【００５７】 ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチド（類）を
コードする核酸は、組換え事象によって細胞にも導入される。例えば、このよう
な配列は、細胞に微細注入されて、それによりポリペプチド、類縁体またはその
偽遺伝子、またはネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペ
プチドコード遺伝子に実質的に同一性を示す配列をコードする内在性遺伝子の部
位に同族性組換えに影響をおよぼす。非同一組換え、および特に多能性細胞での
同一性組換えによる内在性遺伝子の欠失のような他の組換え基本の方法も、使用
される。
【００５８】 本発明は、免疫原に対するネコ科での免疫応答を増強する方法を提供し、それ
は、免疫応答を増強するのに有効な量で、ネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４
と共に、またはなしで、ネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６の前、後または実質的
に同時に免疫原を投与することによって達成される。
【００５９】 本発明は、免疫原に対するネコ科での免疫応答を増強する方法を提供し、そし
てそれは、ネコ病原体から由来する免疫原およびネコＣＤ８０またはネコＣＤ８
６アクセサリー分子を含む発現ベクターを、免疫応答を増強するのに有効な量で
、ネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４と共に、またはなしで投与することによ
って達成される。
【００６０】 本発明は、免疫原に対するネコ科での免疫応答を再配向する方法を提供し、そ
してそれは、免疫応答を増強するのに有効な量で、ネコＣＤ２８またはネコＣＴ
ＬＡ−４と共に、またはなしにネコ病原体およびネコＣＤ８０またはネコＣＤ８
６アクセサリー分子から由来する免疫原を含む発現ベクターを投与することによ
って達成される。
【００６１】 本発明は、免疫原に対するネコ科での免疫応答を抑制する方法を提供し、そし
てそれは、免疫応答を増強するのに有効な量で、ネコＣＤ２８またはネコＣＴＬ
Ａ−４と共に、またはなしに、またはネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６またはネ
コＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４をコードするアンチセンスＲＮＡまたはＤＮ
Ａと共に、ネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６の前、後または実質的に同時に、免
疫原を含む発現ベクターを投与することによって達成される。
【００６２】 本発明は、免疫応答を増強するためのネコＣＤ２８または免疫応答増強のため
のネコＣＴＬＡ−４、または免疫応答抑制のためのネコＣＴＬＡ−４を伴うネコ
ＣＤ８０またはネコＣＤ８６と共に、またはなしに、免疫原、および有効量のネ
コＣＤ８０またはネコＣＤ８６を含むことを特徴とする、免疫原に対するネコ科
での免疫応答を誘導するためのワクチンを提供する。別の実施形態では、本発明
は、ネコ病原体に対する免疫原（類）についての遺伝子、および免疫応答の増強
または抑制についてのネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４と共に、またはなし
にＣＤ８０、ＣＤ８６についての遺伝子を含む発現ベクターを包含することを特
徴とするワクチンを提供する。
【００６３】 ＜ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチド＞ ネコＣＤ８０遺伝子（そのＤＮＡおよびアミノ酸配列は、図１および２に示さ
れる）は、およそ２９２アミノ酸のポリペプチドをコードする。ネコＣＤ８６遺
伝子（そのＤＮＡアミノ酸配列は、図３に示される）は、およそ３２０アミノ酸
のポリペプチドをコードする。ネコＣＤ２８遺伝子（そのＤＮＡおよびアミノ酸
配列は、図４に示される）は、およそ２２１アミノ酸のポリペプチドをコードす
る。ネコＣＴＬＡ−４遺伝子（そのＤＮＡおよびアミノ酸配列は、図５に示され
る）は、およそ２２３アミノ酸のポリペプチドをコードする。
【００６４】 天然または組換え源から得られるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣ
ＴＬＡ−４の精製は、それに限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー、
Ｃ４カラムでの逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、等電点焦点法、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、および同等物を含めて当業界でよく知られる方法によ
って達成される。好ましい実施形態では、大量の生物活性ネコＣＤ８０、ＣＤ８
６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は、ｐＳＦＶ１レプリコン（ギブコ／ＢＲＬ）
中の６Ｃ末端ヒスチジン残基をコードする配列に枠内で融合したネコＣＤ８０、
ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４についてのコーディング領域を含む組換
えＤＮＡ配列を構築することによって達成される。このプラスミドによってコー
ドされるｍＲＮＡは、当業者によく知られる技術を使用して合成され、そして電
気刺穿によってＢＨＫ−２１細胞に導入される。その細胞は、６Ｃ末端ヒスチジ
ンを含む成熟グリコシル化ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−
４ポリペプチドを合成および分泌する。修飾したネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ
２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、ヒスチジン結合樹脂（Ｈｉｓ−結合、
ウイスコンシン州マディソンのノバゲン）を使用したアフィニティークロマトグ
ラフィーによって細胞上清から精製される。
【００６５】 任意の源から単離されるネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６ポリペプチドは、当
業界で知られる方法によって修飾される。例えば、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｃ
Ｄ２８またはＣＴＬＡ−４は、リン酸化または脱リン酸化、グリコシル化または
脱グリコシル化などをされる。特に有用なのは、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ
２８またはＣＴＬＡ−４可溶性、安定性、および結合特異性およびアフィニティ
ーを改変する修飾である。
【００６６】 ＜ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４キメラ分子＞ 本発明は、任意の組合せで、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬ
Ａ−４の断片から作成されるキメラ分子の産生を包含する。例えば、ＣＤ２８結
合部位の場所にＣＴＬＡ−４の結合部位を導入して、免疫応答の増強を維持させ
ながら、ＣＤ２８の結合アフィニティーを増加させること。
【００６７】 １つの実施形態では、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８上のＣＤ８０またはＣＤ８
６についての結合部位は、ＣＴＬＡ−４の結合領域によって置換される。ＣＴＬ
Ａ−４結合領域を用いてのキメラＣＤ２８分子の効果は、ＣＤ８０またはＣＤ８
６についてのＣＤ２８のアフィニティーを増大させ、そして免疫応答の増強の規
模を増大させることである。代替的実施形態では、ＣＤ８０およびＣＤ２８また
はＣＤ８６およびＣＤ２８のキメラ分子、またはその断片は、膜結合形態であり
、そしてこれらの分子の能力を免疫増強することを改善する。代替的実施形態で
は、ＣＤ８０およびＣＴＬＡ−４またはＣＤ８６およびＣＴＬＡ−４のキメラ分
子、またはその断片は、膜結合形態であり、そしてこれらの分子の能力を抑制す
る免疫を改善する。代替的実施形態では、ＣＤ８０およびＣＴＬＡ−４またはＣ
Ｄ８６およびＣＴＬＡ−４のキメラ分子、またはその断片は、膜結合形態であり
、そして所望の効果を達成する免疫応答を再指向する。
【００６８】 代替的実施形態では、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４
は、別のポリペプチドとの融合タンパク質である。そのポリペプチドとしては、
それに限定されないが、免疫グロブリン、抗原、腫瘍抗原、細胞表面レセプター
、または細胞表面リガンダである。
【００６９】 抗ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４抗体 本発明は、上に記述されるとおり同定されるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２
８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドに対して特異的である抗体を包含する。抗体
は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり、そしてネコＣＤ８０、ＣＤ８
６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を異なる種と識別し、機能性ドメインを同定す
るなどである。このような抗体は、当業者に知られる免疫学的およびハイブリド
ーマ技術と同様に、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「抗体、実験室マニュアル」
、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、１９８８年に開示される方
法および組成物を使用して好都合に作成される。天然または合成のＣＤ８０、Ｃ
Ｄ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４由来のペプチドが、ネコＣＤ８０、ＣＤ８
６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４特異的免疫応答を誘導するのに使用される場合
、ペプチドは、ＫＬＨのような適切な担体と都合よく結合し、そしてフロイント
のもののような適切なアジュバント中で投与される。好ましくは、選択ペプチド
を、Ｔａｎ（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８
５巻：５４０９−５４１３頁の方法によって実質的にリシンのコア担体と結合さ
せる。生じる抗体、特に内部造影抗イデオ型抗体も、公知方法を使用して作成さ
れる。
【００７０】 １つの実施形態では、精製ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ
−４を、免疫マウスに使用し、その後、それらの脾臓を除去し、そして脾臓細胞
を、骨髄腫と細胞ハイブリッドを形成するのに使用して、当業界に水準である技
術により抗体分泌細胞のクローンを得る。このような細胞によって分泌される生
じるモノクローナル抗体は、以下の活性についての生体外アッセイに使用してス
クリーニングする。それは、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ
−４への結合、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４のレセプター
結合活性の阻害、およびＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４のＴ
細胞刺激活性を阻害することである。
【００７１】 抗ネコＣＤ８０、抗ネコＣＤ８６、抗ネコＣＤ２８または抗ネコＣＴＬＡ−４
抗体は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどのような免疫アッセイを使用して、ネコＣＤ８
０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を同定および定量するのに使用され
る。抗ネコＣＤ８０、抗ネコＣＤ８６、抗ネコＣＤ２８または抗ネコＣＴＬＡ−
４抗体も、ネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６またはネコＣＤ２８またはネコＣＴ
ＬＡ−４の免疫激減抽出に使用される。さらに、これらの抗体は、様々の源から
ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を同定、単離および精製
し、そして細胞下および組織化学的局在化調査を行うのに使用できる。
【００７２】 使用法 本発明によって産生されるネコＣＤ８０（Ｂ７−１）リガンド、ネコＣＤ８６
（Ｂ７−２）リガンド、ネコＣＤ２８レセプターまたはネコＣＴＬＡ−４（ＣＤ
１５２）レセプターは、ワクチンとして有益に使用して、感染疾病を予防するか
、または同一のまたは異質のネコ種での成長を促進することができる。例えば、
任意の組合せで、同時刺激分子ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４とのＣＤ８０または
ＣＤ８６の同時発現、および病原性生物から得られる腫瘍抗原または抗原である
。ネコＣＴＬＡ−４レセプターとのネコＣＤ８０またはＣＤ８６の同時発現は、
Ｔリンパ球の活性化を阻害し、そして免疫応答を抑制する能力を有する。特定の
例は、ワクチンとして投与される時に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の増
殖を活性化し、増強し、または制御し、そしてＩＬ−２、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１
２、ＴＮＦａ、ＩＬ−６および同等物を誘導するウイルス性ベクターまたはＤＮ
Ａ発現ベクター中のＦＩＶ、ＦｅＬＶまたはＦＩＰ由来の免疫原とのＣＤ８０ま
たはＣＤ８６を同時発現することである。別の特定の例は、治療剤として投与さ
れるときに、免疫応答を制御または再指向するウイルス性ベクターまたはＤＮＡ
発現ベクター中でＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を発現する
ことである。
【００７３】 ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４とのネコＣＤ８０またはＣＤ８６の相互作用を介
しての免疫の増強、またはＣＴＬＡ−４とのネコＣＤ８０またはＣＤ８６の相互
作用を介しての免疫応答の阻害は、全体または長期健康上の有害な影響でさえ倍
量を示しうる外来物質を加えるよりむしろ自然な方法の制御の利益を得る。ＣＤ
８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４分子を、免疫性の導入のために望
ましい抗原をコードするもののような他の組換え分子と共に投与する。ネコＣＤ
８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４遺伝子を、発現ベクター
に挿入し、そして標的細胞に感染または形質移入し、そして標的細胞内に遺伝子
産物を発現させ、その結果、それを、標的細胞または抗原顕在細胞の血漿膜に打
込むか、または標的細胞または抗原顕在細胞の外側に分泌される。プラスミド、
セムリキ・フォーレスト・ウイルス、ポックスウイルスまたはヘルペスウイルス
のような発現ベクターは、抗原顕在細胞に遺伝子を移行させる。任意の組合せで
、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４遺伝子または
遺伝子の断片を、ＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクターに挿入し、そしてネコ科に注
入し、そして「裸の」ＤＮＡ／ＲＮＡまたは遺伝的ワクチンとしてネコ科で遺伝
子産物として発現される。標的細胞またはネコ科内での免疫原と、ＣＤ８０、Ｃ
Ｄ８６、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４遺伝子との同時発現は、Ｔリンパ
球、Ｂリンパ球および他の細胞の活性化、活性化の増強、または制御に寄与する
。代替的に、発現したタンパク質を投与し、続いてプラスミド、セムリキ・フォ
ーレスト・ウイルス、ポックスウイルスまたはヘルペスウイルスまたは他のウイ
ルスまたは細菌ベクターのような原核生物または真核生物系で発現させることが
できた。ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４タンパク質は、
血漿膜アクセサリー分子として細胞膜に打込まれながら正常に機能するが、他の
形態で、特に膜アンカーなしで存在しうる。
【００７４】 １つの実施形態では、ネコＣＤ８０およびネコＣＤ８６は、膜貫通ドメインま
たは疎水性領域を欠きながら可溶性であり、そして膜結合形態または可溶性形態
の何れかで、同時刺激分子ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４と作用する。代替的実施
形態では、ネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６は、膜結合形態であり、そして同時
刺激分子ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は、膜貫通ドメインまたは疎水性領域を欠
きながら可溶性形態である。代替的実施形態では、ネコＣＤ８０またはネコＣＤ
８６は、膜結合形態であり、そして同時刺激分子ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は
、膜貫通ドメインまたは疎水性領域を欠きながら可溶性形態にある。好ましくは
ニ量体形態にある可溶性ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は、ネコでのＴ細胞依存性
免疫抑制に関連した疾病を治療するために有用である。可溶性ＣＤ２８またはＣ
ＴＬＡ−４は、移殖組織の拒絶を防止し、そして自己免疫疾病を治療するのに使
用することができる。特に可溶性ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は、骨髄移殖での
移殖片対宿主疾病を予防するのに有用である。可溶性ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−
４は、膜結合形態のネコＣＤ８０またはＣＤ８６を含む細胞の結合を防止する。
【００７５】 別の実施形態では、ネコＣＴＬＡ−４を、免疫グロブリン（Ｉｇ）に融合させ
る。ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ融合は、免疫応答を抑制するか、または自己免疫疾病を
治療するのに有用である。自己免疫疾病としては、それに限定されないが、関節
炎、乾癬、臓器移殖拒絶、移殖片対宿主疾病が挙げられる。
【００７６】 １つの実施形態では、結合または可溶性形態の何れかで発現されたネコＣＤ８
０、および／またはＣＤ８６タンパク質は、ネコ腫瘍の減少または排除する上で
の治療のために使用される。特に、ネコＣＤ８０および／またはＣＤ８６タンパ
ク質は、ネコ腫瘍関連抗原と同時にベクター化を組合わせて、またはしないで、
直接腫瘍注入を介して、または全身に投与されてウイルス性ベクターから、また
は裸のＤＮＡから発現される。
【００７７】 ネコネコＣＤ８０、ＣＤ８６ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ＤＮＡおよびポリペ
プチドまたは生物活性ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４断
片または副断片の配列保存性および機能保存性変異体を、サイトカイン、インタ
ーロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、病原性微生物から得られる
抗原、抗体、またはＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ、Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ、または
緑蛍光タンパク質のようなｈｉｓタグまたはレポーター遺伝子のような精製配列
のような別の配列に枠内で融合させる。
【００７８】 ＜ワクチン＞ 本発明は、ネコ種での免疫応答の効力を増強するための方法および組成物を包
含する。この実施形態では、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ
−４は、免疫応答を引出すことが望まれる免疫原との結合で使用される。例えば
、ネコ免疫不全ウイルスおよびネコ白血病ウイルスのような病原体、およびネコ
パルボウイルス、ネコレプトウイルス、およびネココロナウイルスのような他の
病原体から得られる免疫原を含むネコのワクチンでは、免疫応答の規模および質
を制御するために、ワクチン中にネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴ
ＬＡ−４を含むことが望ましい。この目的のために、上に記述されるとおりの生
来の、または組換え源から精製されるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８または
ＣＴＬＡ−４は、１匹のネコ当たり、ワクチン当たり約０．０１から１００．０
ｍｇまでの範囲にある濃度でワクチン処方に含まれる。代替的に、ＣＤ８０、Ｃ
Ｄ８６、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４を発現する組換えベクターは、１
匹のネコ当たり、ワクチン当たり約０．０１から１００．０ｍｇまでの範囲にあ
る濃度で、好ましくは、約０．２５ｍｇ／ｋｇ／日から約２５ｍｇ／ｋｇ／日ま
での範囲内にある濃度でワクチン処方での量で、ワクチン処方に含まれる。
【００７９】 ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を、生（すなわち、複
製する）ウイルスワクチンまたは複製しないワクチンと共同して投与する。複製
するワクチンの限定なしの例は、修飾したネコヘルペスウイルスまたは修飾した
アライグマ痘ウイルスのような生来のまたは組換えウイルスまたは細菌を包含す
るものである。ネコ宿主での複製を制限するか、または複製しないが、宿主細胞
中の外来ＤＮＡ（ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４、また
はネコ病原体から得られる免疫原のような）を発現することを示す生ウイルス性
ワクチンの限定なしの例は、修飾したイノシシ痘ウイルス、修飾した豚痘ウイル
スまたはセミリキ・フォーレスト・ウイルスである。複製しないウイルスの限定
なしの例は、死滅または不活性化ウイルスまたは他の微生物を含むもの、または
ネコ白血病ウイルスワクチンのような生来の、組換え、または合成の源から由来
する粗製または精製抗原である。
【００８０】 ネコのワクチンの市販源は、当業者に知られ（獣医治療の概説(Compendium of
Veterinary Pharmaceuticals、1997年)）そして、いっそう有効なワクチンのた
めに本発明と組合わせて使用される。
【００８１】 免疫原に対するネコ科における免疫応答を誘導および制御するためのワクチン
は、免疫原、および免疫応答増強のためのネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４
と共に、またはなしに有効量のネコＣＤ８０またはＣＤ８６、または免疫応答抑
制のためのネコＣＴＬＡ−４と共にネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６から構成さ
れる。
【００８２】 免疫原は、限定されないが、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネ
コ感染性腹膜炎ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス（パルボ）、ネコカルシ
ウイルス、ネコレオウイルス３型、ネコロタウイルス、ネココロナウイルス（感
染性腹膜炎）、狂犬病ウイルス、ネコシンシチウムのウイルス、ネコ肉腫ウイル
ス、ネコヘルペスウイルス（鼻気管炎ウイルス）、ネコボルナ病ウイルス、クラ
ミジア、トキソプラスモシス・ゴンジ、ネコ寄生生物、ジロフィラリア・イミチ
ス、ノミ、細菌性病原体および同等物のようなネコ病原体から構成される群から
選択される。
【００８３】 Ｔリンパ球のような細胞型の成長の制御、または活性化の制御では、制御応答
が、細胞成長を刺激するか、または抑制するかの何れかであることが示される。
ネコ科での免疫応答の制御では、免疫応答が、ネコ科での疾病または感染媒体を
治療するために刺激または抑制されることが示される。
【００８４】 好ましい実施形態では、ネコＣＤ８０とＣＤ２８、ＣＤ８０とＣＴＬＡ−４、
ＣＤ８６とＣＤ２８、またはＣＤ８６とＣＴＬＡ−４をコードする遺伝子は、ネ
コ病原体から得られる免疫原についての遺伝子と組合わせて、単独組換えウイル
ス性ベクターに組込まれ、そしてその後、生ワクチンへ処方される。ネコＣＤ８
０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４遺伝子単独で、またはネコ免疫原遺
伝子と組合わせて、組換えウイルスに組込まれ、その結果、これらの遺伝子の発
現が、適切なプロモーターによって制御される。ワクチンの投与で、生物活性ネ
コＣＤ８０またはＣＤ８６リガンド、およびＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４レセプ
ターの発現、同じ細胞でのネコ免疫原（類）の発現を生じ、その結果、所望の免
疫応答を増強するために必要とされる一次および二次同時刺激シグナルが供され
る。この実施形態は、ネコ免疫原に対する即時型に局在化された免疫応答、およ
び改善された効力を示す、ネコ疾病に対するワクチンを提供する。
【００８５】 別の実施形態では、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４単
独で、または組合わせでコードする遺伝子が、組換えウイルス性ベクターに組込
まれ、そしてネコ免疫原（類）についての遺伝子をコードする二次組換えウイル
ス性ベクターと共に、ワクチンに同時投与され、それにより、同じ細胞中で、ま
たは所望の免疫応答の増強を達成するのに密接に近接する細胞で所望の応答、お
よび改善された効力を示すネコ疾病に対するワクチンが供される。
【００８６】 以下は、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の発現で使用
するための、そして病原体性微生物に挑戦する改善された保護的免疫応答を生じ
るワクチンで使用するための組換えウイルス性ベクターの例である： １．組換え豚痘ウイルス（任意の非必須の挿入部位への挿入）におけるネコＣ
Ｄ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組
合せで、部分的にまたは全体での発現。複製なしのワクチン接種目的については
、ネコ科に限定されないが、ネコ科で使用するための単独、または別のワクチン
または治療剤（組換え、生または死滅させたもの）との組合せを使用する。
【００８７】 ２．組換えネコヘルペスウイルス（ＦＨＶｇＥ部位、または任意の非必須の挿
入部位への挿入）におけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−
４単独、またはそれらの任意の組合せで、部分的にまたは全体での発現。複製す
るワクチン接種目的については、ネコ科に限定されないが、ネコ科で使用するた
めの単独、または別のワクチンまたは治療剤（組換え、生または死滅させたもの
）との組合せを使用する。
【００８８】 ３．組換えアライグマ痘ウイルス（任意の非必須の挿入部位への挿入）におけ
るネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの
任意の組合せで、部分的にまたは全体での発現。複製するワクチン接種目的につ
いては、ネコ科に限定されないが、ネコ科で使用するための単独、または別のワ
クチンまたは治療剤（組換え、生または死滅させたもの）との組合せで使用する
。
【００８９】 ４．ＦＩＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのための遺伝子
を含む組換え豚痘ウイルスにおけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣ
ＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せで、部分的にまたは全体での発現
。
【００９０】 ５．ＦＩＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのための遺伝子
を含む組換えネコヘルペスウイルスにおけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８
およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せで、部分的にまたは全体
での発現。
【００９１】 ６．ＦＩＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのための遺伝子
を含む組換えアライグマ痘ウイルスにおけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８
およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せで、部分的にまたは全体
での発現。
【００９２】 ７．ＦｅＬＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのための遺伝
子を含む組換え豚痘ウイルスにおけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８および
ＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せでの発現。
【００９３】 ８．ＦｅＬＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのための遺伝
子を含む組換えネコヘルペスウイルスにおけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２
８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せで、部分的にまたは全
体での発現。
【００９４】 ９．ＦｅＬＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのための遺伝
子を含む組換えアライグマ痘ウイルスにおけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２
８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せで、部分的にまたは全
体での発現。
【００９５】 １０．ＦｅＬＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのためのお よび ＦＩＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのための遺伝子、
またはその任意の組合せを含む組換え豚痘ウイルスにおけるネコＣＤ８０、ＣＤ
８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せで、部分
的にまたは全体での発現。
【００９６】 １１．ＦｅＬＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのためのお よび ＦＩＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのための遺伝子、
またはその任意の組合せを含む組換えネコヘルペスウイルスにおけるネコＣＤ８
０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せ
で、部分的にまたは全体での発現。
【００９７】 １２．ＦｅＬＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのためのお よび ＦＩＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのための遺伝子、
またはその任意の組合せを含む組換えアライグマ痘ウイルスにおけるネコＣＤ８
０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せ
で、部分的にまたは全体での発現。
【００９８】 １３．組換え豚痘ウイルスまたはアライグマ痘ウイルスにおけるネコＣＤ８０
、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せで
、部分的にまたは全体での発現、または未精製または精製ポリペプチドを生成す
る目的で、それに限定されないがＥ．ｃｏｌｉ、セムリキ・フォーレストウイル
スおよびバキュロウイルスを含めた任意の他の発現系。それに限定されないが、
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生成、および機能アッセイ開発のた
めの薬剤の生成を含めて使用する。
【００９９】 １４．ＦＩＶまたはＦｅＬＶ弱毒化ウイルスベクター中でネコＣＤ８０、ＣＤ
８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、または任意の組合せでの発現。１つの
実施形態では、ＦＩＶまたはＦｅＬＶウイルス性ベクターを、遺伝子欠失によっ
て弱毒化する。
【０１００】 １５．遺伝的ワクチンまたは裸のＤＮＡワクチンとして投与する目的のためネ
コ免疫原のための遺伝子（類）を含む発現ベクター中でネコＣＤ８０、ＣＤ８６
、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、または任意の組合せで、部分的に、または
全体での発現。ベクターは、それに限定されないが、ｐＴａｒｇｅｔ（ウイスコ
ンシン州マディソンのプロメガ）、ｐｃＤＮＡ（カリフォルニア州カールスバッ
ドのインビトロゲン）が挙げられる。（Donnelly JJら、１９９７年；Hassettお
よびWhitton、1996年。） １６．ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、または任意の
組合せでの遺伝子または遺伝子の断片は、ネコ科または他の哺乳類の染色体への
挿入または形質移入されうる。レトロウイルス性ベクターで達成しうる場合これ
らの遺伝子のこのような組込みまたはこれらの遺伝子の断片、そして遺伝子療法
の形態として使用しうる。
【０１０１】 本発明は、医療用および／または市販目的としてネコ種の疾病に対する耐性を
改善するための方法および組成物を提供する。この実施形態では、単独、または
任意の組合せで、部分的または全体に、そしてネコ免疫原をコードする遺伝子と
の組み合わせで、またはなしに発現されるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８ま
たはＣＴＬＡ−４を、投与の適切な態様を用いてネコ科に使用する。成長促進ま
たは疾病耐性について、単独、または任意の組合せで発現されるネコＣＤ８０、
ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を、量で、ネコ当たりワクチンあたり約
０．０１から１００．０ｍｇまでの範囲にはいる濃度で処方で、好ましくは約０
．２５ｍｇ／ｋｇ／日から約２５ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲にはいる濃度で処方
で投与する。成長促進または疾病耐性については、単独、または任意の組合せで
、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を発現する組換えウイ
ルス性ベクターを、量で、ネコ当たりワクチンあたり約０．０１から１００．０
ｍｇまでの範囲にはいる濃度で処方で、好ましくは約０．２５ｍｇ／ｋｇ／日か
ら約２５ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲にはいる濃度で処方で投与する。所望の量の
ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を、用量および頻度のマ
トリックスを樹立し、そして実験単位または対象の群をマトリックス内の各点と
比較するこによるような、当業界でよく知られる日常的な実験によって測定する
ことができる。
【０１０２】 本発明により、生来のまたは組換えネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８または
ＣＴＬＡ−４を、例えば、リン酸緩衝生理食塩水または脱イオン化水のような生
理学上許容しうる担体と処方する。処方は、潤滑剤（類）、可塑剤（類）、吸収
増強剤（類）、殺菌剤（類）および当業界でよく知られる同等物のような助剤も
含有しうる。本発明のネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポ
リペプチドを、限定なしに、静脈、皮下、筋肉内、経筋肉、局所または経口経路
を含めた任意の有効な手段によって投与する。皮下投与については、例えば、用
量形態は、滅菌生理学的生理食塩水中のネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８また
はＣＴＬＡ−４から構成される。経口または吸入投与については、助剤と共に、
またはなしでネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を、例えば
リポソームおよびマイクロスフィア中に微小または巨大封入させる。皮下パッチ
（または他の低速放出用量形態）も使用される。
【０１０３】 ＜材料および方法＞ アライグマ痘ウイルス保存サンプルの調製： アライグマ痘ウイルス（ＲＰＶ）単離ＡＴＣＣ ＶＲ−８３８を、アライグマ
痘ウイルス保存サンプルおよびアライグマ痘ウイルスゲノムＤＮＡの調製のため
に使用した。入手可能な別のＲＰＶ単離物は、センター・フォー・ディジース・
コントロール（ＣＤＣ；ジョージア州アトランタ）から得られるＶ７１−Ｉ−８
５Ａである。アライグマ痘ウイルス（ＲＰＶ）サンプルは、２ｍＭグルタミン、
１００単位／ｍｌペニシリン、１００単位／ｍｌストレプトマイシン（これらの
成分は、シグマまたは同等の供給業者から得られ、そして以降、ＤＭＥＭ負の培
地と称される）を含むダルベッコの修飾イーグル培地中に０．０１ＰＦＵ／細胞
の感染の多様性でＶＥＲＯ細胞、ＣＲＦＫ細胞、またはＭＤＣＫ細胞を感染する
ことによって調製される。感染の前に、細胞単分子層を、一回、ＤＭＥＭ負の培
地で洗浄して、仔ウシ血清の跡を除去する。その後、当初の接種に含まれるＲＰ
Ｖ（１０ｃｍ平板については０．５ｍｌ、Ｔ２２５ｃｍフラスコについて１０ｍ
ｌ）を、２時間、細胞単分子層に吸収させ、それにより毎半時間、再分配された
。この時期の後、当初の接種を、完全ＤＭＥＭ培地（５％仔ウシ血清を加えたＤ
ＭＥＭ負の培地）を添加しながら推奨容積まで行った。細胞変性効果が完了する
まで、平板を、３７℃で、５％ＣＯ２中でインキュベートした。培地および細胞
を、回収し、そして５０ｍｌ円筒スクリュー栓試験管中で−７０℃で凍結した。
３７℃で解凍させて、ウイルス保存物を、１．０ｍｌバイアルに適量とり、そし
て−７０℃で再凍結した。滴定は、通常、約１０６ＰＦＵ／ｍｌであった。
【０１０４】 豚痘ウイルス保存サンプルの調製： 豚痘ウイルス（ＳＰＶ）サンプルを、イスコフの修飾ダルベッコ培地（ＩＭＤ
Ｍ）および２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、１００単位／ｍｌ
ストレプトマイシン（これらの成分は、シグマまたは同等の供給業者から得られ
、そして以降、ＥＭＳＫ負の培地と称される）を含むＰＲＭＩ１６４０倍血の１
：１混合で、０．０１ＰＦＵ／細胞の感染の多重性で、胚の豚腎臓（ＥＭＳＫ）
細胞、ＥＳＫ−４細胞、ＰＫ−１５細胞またはベロ細胞を感染させることによっ
て調製した。感染の前に、細胞単分子層を、一回、ＥＭＳＫ負の培地で洗浄して
、仔ウシ血清の跡を除去する。その後、当初の接種に含まれるＳＰＶ（１０ｃｍ
平板については０．５ｍｌ、Ｔ１７５ｃｍフラスコについて１０ｍｌ）を、２時
間、細胞単分子層に吸収させ、それにより毎半時間、再分配された。この時期の
後、当初の接種を、完全ＥＭＳＫ培地（５％仔ウシ血清を加えたＥＭＳＫ負の培
地）を添加しながら推奨容積まで行った。細胞変性効果が完了するまで、平板を
、３７℃で、５％ＣＯ２中でインキュベートした。培地および細胞を、回収し、
そして５０ｍｌ円筒スクリュー栓試験管中で−７０℃で凍結した。３７℃で解凍
させて、ウイルス保存物を、１．０ｍｌバイアルに適量とり、そして−７０℃で
再凍結した。滴定は、通常、約１０６ＰＦＵ／ｍｌであった。
【０１０５】 ＲＰＶまたはＳＰＶ・ＤＮＡの調製。アライグマ痘ウイルスまたは豚痘ウイル
スＤＮＡ単離については、ＴＲ２２５ｃｍ２フラスコ中のベロ細胞（ＲＰＶのた
めの）またはＥＭＳＫ細胞（ＳＰＶのための）の融合単分子層を、アライグマ痘
ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−８３８）と０．１の多様性で感染させ、そして細胞
が、１００％細胞変性効果を示すまで３−５日間インキュベートした。その後、
感染細胞を、その細胞を培地に擦りつけて回収し、そして臨床用遠心分離装置で
５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した。培地を傾寫し、そして細胞ペレットを
、１．０ｍｌリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：リットルＨ２Ｏ当たり１．５ｇＮ
ａ２ＨＰＯ４、０．２ｇＫＨ２ＰＯ４、０．８ｇ ＮａＣｌおよび０．２ｇ Ｋ
Ｃｌ）（Ｔ１７５当たり）に穏やかに再懸濁させ、そして二回の連続凍結−解凍
（−７０℃から３７℃）にかけた。最後の解凍で、細胞（氷上の）を、三回、３
０秒間、間に各々４５秒冷却して、超音波処理した。その後、細胞崩壊物を、４
℃で、ＨＢ４ローター中で、５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離（ソルバールＲ
Ｃ−５Ｂ超高速遠心分離装置）により取除いた。その後、上清に存在するＲＰＶ
ビリオンを、ＳＳ３４ローター（ソルバール）中で４℃で、２０分間、１５，０
００ｒｐｍで遠心分離することによってペレット化し、そして１０ｍＭトリス（
ｐＨ７．５）に再懸濁させた。この画分を、３６％ショ糖勾配（１０ｍＭトリス
（ｐＨ７．５）中ｗ／ｖ）上に層に形成させ、そして４℃で、ＳＷ４１ローター
（ベックマン）中で６０分間、１８，０００ｒｐｍで遠心分離（ベックマンのＬ
８−７０Ｍウルトラセントリフュージ）した。ビリオンペレットを、１０ｍＭト
リス（ｐＨ７．５）１．０ｍｌ中に再懸濁させ、そして氷上で３０秒間、超音波
処理した。この画分を、２０％から５０％の連続ショ糖勾配上に層に形成させ、
そして４℃で、ＳＷ４１ローター中で６０分間、１６，０００ｒｐｍで遠心分離
した。その勾配の約４分の３下手に配置されるＲＰＶビリオンバンドを回収し、
２０％ショ糖で希釈し、そして４℃で、ＳＷ４１ローター中で６０分間、１８，
０００ｒｐｍで遠心分離した。その後、得られたペレットを、１０ｍＭトリス（
ｐＨ７．５）で一回洗浄して、ショ糖の痕跡を取除き、そして最終的に１０ｍＭ
トリス（ｐＨ７．５）に再懸濁させた。その後、ＲＰＶのＤＮＡを、ＥＤＴＡ、
ＳＤＳ、およびプロテナーゼＫを、それぞれ２０ｍＭ、０．５％および０．５ｍ
ｇ／ｍｌの最終濃度まで添加することによって誘導される透析（４時間、６０℃
で）により精製ビリオンから抽出した。消化後、三回のフェノール：クロロホル
ム（１：１）抽出を行い、そしてサンプルを、２倍量の完全エタノールを添加し
、そして−２０℃で、３０分間インキュベートすることによって沈殿させた。そ
の後、サンプルを、５分間、全速力で、エフェンドルフ・小型遠心分離装置で遠
心分離した。培地を傾寫し、そしてペレットを空気乾燥させ、そして４℃で、０
．０１Ｍトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で脱水させた。
【０１０６】 ＦＨＶウイルス保存サンプルの調製： Ｓ−ＦＨＶ−０００を、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ番号６３６）から得、そしてＳ−
ＦＨＶ−００１を、ＮＶＳＬ（ＮＶＳＬの検証ウイルス株ＳＧＥ、ロットＫＳ）
から得た。ＦＨＶウイルス保存サンプルを、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍ
ｌペニシリン、１００単位／ｍｌストレプトマイシン（これらの成分は、アービ
ン・サイエンティフィックまたは同等の供給業者から得、そして以降、完全ＤＭ
Ｅ培地と称される）、それに５％仔ウシ血清を加えて含むダルベッコの修飾イー
グル培地（ＤＭＥＭ）中で１．０ＰＦＵ／細胞の感染の効率でクランデルのネコ
腎臓（ＣＲＦＫ）細胞を感染させることによって調製した。細胞変性効果が完了
した後、培地および細胞を回収し、適量とり、そして−７０℃で凍結させた。滴
定は、およそ１×１０７から１×１０８ＰＦＵ／ｍｌであった。
【０１０７】 ヘルペスウイルスＤＮＡの調製： ２５ｃｍ２フラスコまたは６０ｍｍペトリ皿中のＣＲＦＫ細胞の融合単分子層
を、１００ｍｌのウイルスサンプルで感染させた。一夜インキュベーション後、
または細胞が、１００％細胞変性効果を示しているときに、細胞を、培地に擦り
落とした。細胞および培地を、医療用遠心分離装置で５分間３０００ｒｐｍで遠
心分離した。培地を傾寫し、そして細胞ペレットを、１．５％ノニデットＰ４０
（登録商標）（分子当たり平均９モルのエチレンオキシドを含むオクチルフェノ
ールエチレンオキシド縮合物）（ＮＰ−４０（登録商標）、ミズーリ州セントル
イスのシグマ・ケミカル・シーオー(Sigma Chemical Co.)から購入した）を含む
０．５ｍｌ溶液に再懸濁させた。サンプルを、１０分間、室温でインキュベート
した。ＲＮエースＡの保存溶液（シグマ・ケミカル・シーオー、ミズーリ州セン
トルイス）１０ｍｌを、添加した（保存は、１０ｍｇ／ｍｌであった。ＤＮエー
スを不活性化させるまで１０分間煮沸した）。サンプルを、ペレット核になるま
で遠心分離した。ＤＮＡペレットを、パスツール・ピペットまたは木製スティッ
クで取除き、排除した。上清液体を、２０％硫酸ドデシルナトリウム（シグマ）
２５ｍｌ、２５ｍｌプロテイナーゼ−Ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ；インディアナ州イン
ディアナポリスのベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ）を含む１．５
ｍｌエッフェンドルフ試験管に傾寫した。サンプルを混合し、そして３０−６０
分間、３７℃でインキュベートした。等量の水飽和フェノールを添加し、そして
サンプルを簡潔に混合した。サンプルを、５分間、全速力で、エッフェンドルフ
小型遠心分離装置で遠心分離した。上部水層を、新たなエッフェンドルフ試験管
に取り、そして２倍容量の完全エタノールを添加し、そして試験管を、３０分間
、−２０℃にして、核酸を沈殿させた。サンプルを、５分間、エッフェンドルフ
試験管で遠心分離した。上清を、傾寫し、そしてペレットを、空気乾燥させ、〜
１６ｍｌのＨ２Ｏで脱水させた。大量のＤＮＡの調製のために、その手段を、ス
ケールアップして、ローラーボトルまたは１７５ｃｍ２フラスコのＣＲＦＫ細胞
で出発させた。ＤＮＡを、４℃で０．０１Ｍトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ中に保存した。
【０１０８】 組換えウイルスを生成するためのＤＮＡ形質移入： 方法は、以下の修飾法でGrahamおよびVan der eb［２５］のリン酸カルシウム
手段に基づいている。ウイルスおよび／またはプラスミドＤＮＡを、０．０１Ｍ
トリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中に２９８ｍｌまで希釈した。４０ｍ
ｌの２ＭＣａＣｌ２を添加し、続いて等量の２×ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（リ
ットルＨ２Ｏ当たり１０ｇのＮ‘’−２−エタンスルホン酸Ｎ−２−ヒドロキシ
エチルピペラジン（ＨＥＰＥＳ）、１６ｇのＮａＣｌ、０．７４ｇのＫＣｌ、０
．２５ｇのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、２ｇデキストロース、そしてＮａＯＨで
ｐＨ７．４まで平衡にした）を添加した。その後、混合物を、氷上で１０分間、
インキュベートし、そしてその後、５ｍｌの培地（ＤＭＥ、それに加えて５％仔
ウシ血清）下で６０ｍｍペトリ皿で成長する８０％融合単分子層のＣＲＦＫ細胞
まで滴加した。細胞を、４時間、３７℃で、５％ＣＯ２を含む湿潤インキュベー
ター中でインキュベートした。平板上の培地を吸引し、そして細胞を、１分間、
１×ＰＢＳ（リットルＨ２Ｏ当たり１．１５ｇのＮａ２ＨＰＯ４、０．２ｇのＫ
Ｈ２ＰＯ４、０．８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ）中の２０％グリセロール
で処理した。その細胞を、１×ＰＢＳ５ｍｌで三回洗浄し、そしてその後、５ｍ
ｌの培地（ＤＭＥ、それに加えて５％仔ウシ血清）で育成した。ウイルスから得
られた細胞変性効果が、５０−１００％であるまで細胞を、上記のとおり３７℃
で、３−７日間インキュベートした。上に記述されるとおり、ウイルス保存の調
製のためにウイルスを回収した。この保存は、形質移入保存と称され、そして酵
素的マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルス用のスクリーンによって
、組換えウイルスについて続いてスクリーニングした。
【０１０９】 感染細胞溶解液の調製： 細胞溶解液調製については、血清不含培地を使用し
た。２５ｃｍ２フラスコまたは６０ｍｍペトリ皿中の細胞（ＶＥＲＯ、ＣＲＦＫ
またはＭＤＣＫ）の融合単分子層を、ウイルスサンプル１００μｌで感染させた
。細胞変性効果が完了した後、細胞および培地を、医療用遠心分離装置で５分間
３０００ｒｐｍでペレットにした。細胞ペレットを、破壊緩衝液（２％硫酸ドデ
シルナトリウム、２％β−メルカプトエタノール）２５０μｌに再懸濁させた。
そのサンプルを、３０分間、氷上で超音波処理し、そしてー２０％℃で保存した
。
【０１１０】 ウエスタンブロッティング手段： 溶解液のサンプルおよびタンパク質標準を
、Ｌａｅｍｎｌｉの手段によってポリアクリルアミドゲルにかけた。ゲル電気泳
動後、タンパク質を移動させ、そしてＳambrookら（１９８９年）によって加工
した。一次抗体は、トリス−塩化ナトリウム中の５％非脂質乾燥ミルク、および
ナトリウムアジド（ＴＳＡ：リットルＨ２Ｏ当たり６．６１ｇトリス−ＨＣｌ、
０．９７ｇトリス−塩基、９．０ｇのＮａＣｌおよび２．０ｇナトリウムアジド
）で１：１０００に希釈した。二次抗体は、アルカリ性フォスファターゼ接合体
であり、そしてＴＳＡで１：１００に希釈した。
【０１１１】 分子生物学的技術。制限エンドヌクレアーゼでの消化、ゲル電気泳動、ゲルか
らのＤＮＡの抽出、ライゲーション、キナーゼを用いたリン酸化、フォスファタ
ーゼでの処置、細菌培養物の成長、ＤＮＡでの細菌の形質転換、および他の分子
生物学上の方法のような手段を含めた細菌およびＤＮＡの操作についての技術は
、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）および分子生物学における最新プロトコー
ル(Current Protocols in Molecular Biology)（１９９２年）によって記述され
る。特に記述される場合を除き、小さな変化を伴って使用される。
【０１１２】 ＤＮＡ配列： ＤＮＡ配列は、ＡｍｐｌｉｔａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ（
パーキン−エルマー；製造業者の指示当たり）を備えたＡＢＩプリズム染色ター
ミネーターサイクルシーケンシング既成反応キットを用いた蛍光標識ジデオキシ
シーケンシング反応によって行い、そして製造業者の指示に従って、パーキン−
エルマー／アプライド・バイオシステムズの自動制御ＤＮＡシーケンサーモデル
３７３Ａ上で電気泳動した。ｄＧＴＰ混合およびｄＩＴＰ混合の両方を用いた反
応を行って、圧縮の領域を透明にした。代替的には、圧縮領域を、ホルムアミド
ゲルで溶解させた。テンプレートは、二重標準プラスミドサブクローンまたは単
独標準Ｍ１３サブクローンであり、そしてプライマーを、配列されるべき挿入物
のすぐ外側のベクターにするか、または先に得られた配列にするか何れかにした
。得られた配列は、似ており、そしてＤＮＡＳｔａｒ ソフトウエアーを用いて
比較した。
【０１１３】 ポリメラーゼ連鎖反応を用いたクローニング： ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を使用して、種々のＤＮＡの操作について都合のよい制限部位を導入した。
使用される手段は、Ｉｎｎｉｓら、（１９９０年）によって記述される。一般に
、増幅断片は、寸法で５００塩基対より低く、そして増幅断片の重大な領域を、
ＤＮＡシーケンシングによって確認した。各事例で使用されるプライマーは、以
下の相同のベクターの構築の説明で詳述される。
【０１１４】 組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを生成するための相同組換え手段： この
方法は、アライグマ痘ウイルスＤＮＡと形質移入プラスミド相同ベクターの両方
を含む組織培養細胞中で生じるアライグマ痘ウイルスと、プラスミド相同ベクタ
ーＤＮＡとの間の相同な組換えによる。生じる相同な組換えについては、細胞（
ＣＲＦＫ、ＭＤＣＫまたはＶＥＲＯ）の単分子層を、０．０１ＰＦＵ／細胞の感
染の重複度で、Ｓ−ＲＰＶ−０００（ＡＴＣＣ ＶＲ−８３８）またはＳ−ＳＰ
Ｖ−００１またはＳ−ＦＨＶ−００１で感染させて、細胞へのＰＲＶの複製（す
なわち、ＤＮＡ合成）を導入した。その後、プラスミド相同性ベクターＤＮＡを
、感染−形質移入手段によりこれらの細胞に形質移入させた。この手段に使用さ
れる相同性ベクターの構築は、以下に記述される。
【０１１５】 感染−形質移入手段： 約８０％融合で細胞（ＣＲＦＫ、ＭＤＣＫまたはＶＥ
ＲＯ）の６ｃｍ平板を、ＤＭＥＭ負の培地中の０．０１ＰＦＵ／細胞の感染の重
複度で、Ｓ−ＲＰＶ−０００またはＳ−ＳＰＶ−００１またはＳ−ＦＨＶ−００
１で感染させ、そして２−３時間、湿潤５％ＣＯ２環境で、３７℃でインキュベ
ーションした。使用された形質移入手段は、リポフェクチンＴＭ試薬（ＢＲＬ）
について基本的に推奨されるものである。簡潔には、各６ｃｍ平板については、
１５μｇのプラスミドＤＮＡを、Ｈ２Ｏで１００μｌまで希釈した。別々に、５
０マイクログラムのリポフェクチン試薬を、Ｈ２Ｏで１００μｌまで希釈した。
その後、１００μｌの希釈リポフェクチン試薬を、プリスチレン５ｍｌスナップ
栓試験管に含まれる希釈プラスミドＤＮＡに滴加し、そして穏やかに混合した。
その後、混合液を、室温で１５−２０分間インキュベートした。この時の間、ウ
イルス接種物を、６ｃｍ平板から取り、そして細胞単分子層を、ＤＭＥＭ負の培
地で一回洗浄した。３ｍｌのＤＭＥＭ負の培地を、プラスミドＤＮＡ／リポフェ
クチン混合物に添加し、そして内容物を、細胞単分子層の上にピペットで取った
。細胞を、湿潤５％ＣＯ２環境で、３７℃で一夜（約１６時間）インキュベート
した。次の日に、３ｍｌのＤＭＥＭ負の培地を、除去し、そして５ｍｌＤＭＥＭ
完全培地に交換した。ウイルスから得られる細胞変性効果が、８０−１００％に
なるまで、細胞を、３−５時間、５％ＣＯ２環境で、３７℃でインキュベートし
た。ウイルス保存の調製のため、ウイルスを上に記述のとおりに回収した。この
保存物は、形質移入保存物と称され、そして順次、組換えアライグマ痘ウイルス
用のブルーガルのスクリーン、または組換えアライグマ痘ウイルス用のＣＰＲＧ
スクリーンによって組換えウイルスについてスクリーニングした。
【０１１６】 βガラクトシダーゼ（ブルーガルおよびＣＰＲＧアッセイ）またはβグルクロ
ニダーゼ（Ｘ−グルクアッセイ）を発現する組換えＲＰＶまたはＳＰＶまたはＦ
ＨＶ用のスクリーン： Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マー
カー遺伝子を、組換えウイルスに組込んだ。２つの簡単な方法の内の１つによっ
て組換え体を含むプラークを可視化した。最初の方法では、化学的ブルーガルＴ
Ｍ（商標）（ライフ・サイエンス・テクノロジー、メリーランド州ベセズダ）を
、プラークアッセイの間、覆い被さったアガロースに組込ませ（２００μｌ／ｍ
ｌ）、そして活性β−ガラクトシダーゼを発現するプラークは青色になった。そ
の後、青色プラークを、新たな細胞（ＭＤＣＫ、ＣＲＦＫまたはＶＥＲＯ）に取
り、そして更に青色プラーク単離によって精製した。第二の方法では、ＣＰＲＧ
（ベーリンガー・マンハイム）を、プラークアッセイの間、覆い被さったアガロ
ースに組込ませ（４００μｌ／ｍｌ）、そして活性β−ガラクトシダーゼを発現
するプラークは赤色になった。その後、赤色プラークを、新たな細胞（ＭＤＣＫ
、ＣＲＦＫまたはＶＥＲＯ）に取り、そして更に赤色プラーク単離によって精製
した。両方の場合に、ウイルスを、特徴的に、３から４回のプラーク精製で精製
した。
【０１１７】 Ｅ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子が、組換え
ウイルスに取り込まれるときに、組換え体を含むプラークを、色素原物質を使用
することによって可視化させ、Ｘ−ベータ−Ｄ−ｇｌｕＵＡ ＣＨＸ（Ｘ−ＧＬ
ＵＣ；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸
、シクロヘキシルアンモニウム塩；バイオシンスＡＧ、スイス国）を、プラーク
アッセイの間、覆い被さったアガロースに組込ませ（２００μｌ／ｍｌ）、そし
て活性β−グルクロニダーゼを発現するプラークは青色になった。その後、青色
プラークを、新たな細胞（ＭＤＣＫ、ＣＲＦＫまたはＶＥＲＯ）に取り、そして
更に青色プラーク単離によって精製した。
【０１１８】 黒色プラークアッセイを用いた組換えＲＰＶでの外来遺伝子発現用のスクリー
ン： 組換えアライグマ痘ウイルスによって発現される外来抗原の発現を分析するた
めに、細胞（ＭＤＣＫ、ＣＲＦＫまたはＶＥＲＯ）の単分子層を、組換えＲＰＶ
またはＳＰＶまたはＦＨＶで感染させ、栄養アガロース培地で被覆させ、そして
プラーク発生を生じるために、３７℃で３−５日間インキュベートした。その後
、アガロース被覆を、皿から取除き、そして細胞を、１０分間、室温で、１００
％メタノールで固定し、そしてその細胞を、空気乾燥させた。細胞の固定で、表
層抗原検出と同様に細胞変性抗原を生じるのに対して、特異的表層抗原発現は、
非固定細胞を用いて検出することができる。その後、一次抗体を、１×ブロット
（トリス−塩化ナトリウム中の５％非脂質乾燥ミルク）、およびナトリウムアジ
ド（ＴＳＡ：リットルＨ２Ｏ当たり６．６１ｇトリス−ＨＣｌ、０．９７ｇトリ
ス塩基、９．０ｇＮａＣｌおよび２．０ｇナトリウムアジド）で適切な希釈率ま
で希釈し、室温で、２時間、細胞単分子層上でインキュベートした。その後、未
結合抗体を、細胞を、室温でＴＳ緩衝液で三回細胞を洗浄することによって除去
した。第二抗体であるアルカリ性フォスファターゼ接合体を、１×ブロットで１
：１０００に希釈し、室温で、２時間、細胞と共にインキュベートした。その後
、未結合抗体を、細胞を、室温でＴＳ緩衝液（リットルＨ２Ｏ当たり６．６１ｇ
トリス−ＨＣｌ、０．９７ｇトリス塩基、９．０ｇＮａＣｌ）で三回細胞を洗浄
することによって除去した。その後、細胞を、新たに調製した基質溶液（１００
ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ
２、０．３ｍｇ／ｍｌニトロブルーテトラゾリウムおよび０．１５ｍｇ／ｍｌの
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル・ホスファターゼ）で、室温で、１５
−３０分間インキュベートした。プラークは、正確な抗原株黒色を発現する。固
定溶液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ２．９）および１ｍＭのＥＤＴＡ）を使
用して、色素発生反応を止めた。
【０１１９】 黒色プラークアッセイを用いた組換えＳＰＶ、ＲＰＶまたはＦＨＶ中でのネコ
ＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）発現用のスクリーン： 細胞
（ＭＤＣＫ、ＣＲＦＫ、ＶＥＲＯまたはＥＳＫ−４）の単分子層上の組換え豚痘
ウイルス、アライグマ痘またはネコヘルペスウイルスによって発現されるＣＤ８
０またはＣＤ８６同時刺激分子の発現を分析するために、ＣＤ８０またはＣＤ８
６を発現する組換えＲＰＶまたはＳＰＶまたはＦＨＶウイルスに感染させ、栄養
アガロース培地上に被覆し、そしてプラーク発生が起こるために、３７℃で３−
５日間インキュベートした。その後、アガロース被覆をその皿から取除き、細胞
を、１００％メタノールで１０分間、室温で固定して、細胞を空気乾燥させるか
、または未固定物を除去し、そして１×ＰＢＳで直ぐに処理した。細胞の固定化
で、表層抗原検出と同様に、細胞変性抗原を生じるのに対して、特異的表層抗原
発現は、非固定細胞を用いて検出することができる。その後、ｈｕＣＴＬＡ−４
／Ｆｃキメラ（アールアンドディー・システムズ、Ｍｉｎｎ．ＭＮ、カタログ番
号３２５−ＣＴ）を、１×ブロット（トリス−塩化ナトリウム（ＴＳ：リットル
Ｈ２Ｏ当たり６．６１ｇトリス−ＨＣｌ、０．９７ｇトリス−塩基、９．０ｇの
ＮａＣｌ）中の５％非脂質乾燥ミルク）で、適切な希釈率まで希釈し、そして室
温で、２時間、細胞単分子層上でインキュベートした。その後、未結合キメラを
、室温で、ＴＳ緩衝液で三回細胞を洗浄することによって除去した。検出抗体、
モノクローナル抗−ｈｕＩｇＧ１ ｆｃ アルカリ性フォスファターゼ接合体（
ジメド（Ｚｙｍｅｄ）、カタログ番号０５−３３２２）を、１×ブロットで適切
な濃度に希釈し、そして室温で２時間、細胞と共にインキュベートした。その後
、未結合検出抗体を、室温で、ＴＳ緩衝液（リットルＨ２Ｏ当たり６．６１ｇト
リス−ＨＣｌ、０．９７ｇトリス−塩基、９．０ｇのＮａＣｌ）で三回細胞を洗
浄することによって除去した。その後、細胞を、新たに調製した基質溶液（１０
０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣ
ｌ２、０．３ｍｇ／ｍｌニトロブルーテトラゾリウムおよび０．１５ｍｇ／ｍｌ
の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル・ホスファターゼ）で、室温で、１
５−３０分間インキュベートした。プラークは、ＣＤ８０またはＣＤ８６株黒色
を発現する。固定溶液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ２．９）および１ｍＭの
ＥＤＴＡ）を使用して、色素発生反応を止めた。
【０１２０】 ＶＳＶプラーク産生を用いた組換えＳＰＶ、ＲＰＶまたはＦＨＶから発現され
るネコ・インターフェロン・ガンマ生物活性用のスクリーン： ９６ウェル平板中のＣＲＦＫＳまたは適切なネコ・セルラインを、ネコＩＦＮ
ガンマを発現する組換えウイルスに感染した細胞から得られる上清で処理した。
その後、ＶＳＶウイルス（１００−１０００粒子／ウエル）を、適切なウエルに
添加し、そして２４時間、または細胞のみを有する対照ウエルが完全に溶解され
るまでインキュベートした。ウエルを、１×ＰＢＳで三回洗浄し、そして単分子
層を、１００％メタノールで固定し、そして空気乾燥させた。結晶性バイオレッ
トの０．０５％溶液を、室温で、１０分間、全ウエルに添加し、その後空気乾燥
させた。ウエルを、紫色の染料の存在について等級分けした。感触で、健康な単
分子層の細胞は、結晶性バイオレット染料を取り込む。ＩＦＮガンマ活性を有す
る上清は、ＣＲＦＫをＶＳＶ誘導細胞溶解から保護し、そして紫に染色する。
【０１２１】 診断に使用するためのウイルス性糖タンパク質の精製のための手段。 ウイル
ス性糖タンパク質を、抗体アフィニティーカラムを用いて精製する。モノクロー
ナル抗体を生成するために、８から１０週齢のＢＡＬＢ／ｃメスマウスに、１０
７ＰＦＵのアライグマ痘ウイルス組換え体を２から４週間隔で、７回腹膜組織内
にワクチン接種した。最後のワクチン接種の３週後、マウスに、４０ｍｇの対応
のウイルス性糖タンパク質を腹膜組織内に注入した。最後の抗原投与の３日後、
脾臓をマウスから取り出した。
【０１２２】 脾臓細胞を、ＯｉおよびHerzenbergから修飾した手段によって、マウスＮＳ１
／Ａｇ４形質細胞腫の細胞と融合させた。脾臓細胞および形質細胞腫の細胞を、
３００×ｇで、１０分間、遠心分離によって一緒にペレット化させた。ポリエチ
レングリコール（分子量１３００−１６００）の５０％溶液の内の１ｍｌを、１
分間かけて、攪拌しながら細胞ペレットに添加する。ダルベッコの修飾イーグル
培地（５ｍｌ）を３分間かけて細胞に添加する。細胞を、１０分間、３００×ｇ
で遠心分離によってペレット化し、１０％仔ウシ血清を有し、１００ｍＭヒポキ
サンチン、０．４ｍＭアミノプテリンおよび１６ｍＭチミジン（ＨＡＴ）を含む
培地に再懸濁させた。細胞（１００ｍｌ）を、１００ｍｌの正常な脾臓育成層細
胞を含む、８から１０の９６ウェル組織培養平板のウエルに添加し、そして３７
℃でインキュベートした。細胞を、３から４日毎に新たなＨＡＴ培地で育成する
。
【０１２３】 ハイブリドーマ培養上清を、１００ｎｇのウイルス性糖タンパク質で被覆され
た９６ウェルウエルマイクロタイター平板でのＥＬＩＳＡアッセイによって試験
する。反応性ハイブリドーマから得られる上清を、黒色プラークアッセイおよび
ウエスタンブロットによってさらに分析する。選択ハイブリドーマを、限定希釈
によって二回クローン化する。腹水液を、５×１０６ハイブリドーマ細胞を、プ
リスタン処置ＢＡＬＢ／ｃマウスへの腹膜組織内に注入することによって産生し
た。
【０１２４】 アライグマ痘ウイルス組換え体から得られる細胞溶解液は、「感染細胞溶解液
の調製」で記述されるとおりに得られる。糖タンパク質含有細胞溶解液（１００
ｍｌ）を、２ｍｌアガロースアフィニティー樹脂を通過させ、それに２０ｍｇの
糖タンパク質モノクローナル抗体は、製造業者の指示（ＡＦＣ培地、ニュージャ
ージー州エジソンのニュー・ブルンスウィック・サイエンティフィック）に従っ
て固定化させた。そのカラムを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００ｍ
ｌの０．１％ノニデットＰ−４０で洗浄して、非特異的結合材料を除去する。結
合糖タンパク質を、１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ１０．６）で溶出させる（４０
）。
【０１２５】 前および後溶出画分を、ＥＬＩＳＡ系でのＲＰＶモノクローナル抗体に対する
反応性によって純度について監視する。
【０１２６】 ＥＬＩＳＡアッセイ： 標準酵素結合免疫媒体アッセイ（ＥＬＩＳＡ）プロト
コールを使用して、ワクチン接種および誘発に続く動物の免疫状態を測定する。
糖タンパク質抗原溶液（ＰＢＳ中ｎｇ／ｍｌで１００ｍｌ）を、４℃で、１８時
間、マイクロタイター皿のウエルに吸収させる。被覆したウエルを、ＰＢＳで一
回洗浄する。１％ＢＳＡ（シグマ）を含有する、２５０ｍｌのＰＢＳを添加し、
３７℃で１時間インキュベートすることによってウエルを遮断する。遮断された
ウエルを、０．０２％ツイーン２０を含むＰＢＳで一回洗浄する。５０ｍｌの試
験血清（先に、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：２に希釈した）を、ウエルに添
加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。抗血清を除去し、そしてウエ
ルを、０．０２％ツイーン２０を含むＰＢＳで一回洗浄する。西洋ワサビペルオ
キシダーゼ（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：５００に希釈した、キルケガード
・アンド・ペリ・ラボラトリーズ，インク．（Kirkegaard and Perry Laborator
ies, Inc.）に結合した抗ウシＩｇＧを含む溶液５０ｍｌを、添加して、特異的
抗原に対する抗体を含むウエルを可視化させる。溶液を、３７℃で１時間、イン
キュベートし、その後、除去し、そしてウエルを、０．０２％ツイーン２０を含
むＰＢＳで三回洗浄する。１００ｍｌの基質溶液（ＡＴＢＳ、キルケガード・ア
ンド・ペリ・ラボラトリーズ，インク．）を各ウエルに添加し、そして色を、１
５分間展開させる。０．１ｍシュウ酸の添加によって、反応を終了させる。色を
、自動平板読取装置で、吸光度４１０ｎｍで読み取る。
【０１２７】 合成ポックスウイルスプロモーターの構築のための攻略法 組換え豚痘ベクタ
ーについて、合成ポックスプロモーターは、外来遺伝子発現の強度とタイミング
を制御する能力を含めた幾つかの利点を供する。ワクシニアウイルスで規定され
たプロモーターに基づいた３つのプロモーターカセットＬＰ１、ＥＰ１およびＬ
Ｐ２を設計した。各カセットは、任意の順番または組合せでカセットを組合わせ
て使用できる制限部位によって挟まれるワクシニアで定義されるＤＮＡ配列を含
むように設計された。イニシエーター・メチオニンも、枠内融合が、ＥｃｏＲＩ
またはＢａｍＨＩ部位の何れかで作ることができるように各カセットに設計され
る。全３つの読取枠内の１組の翻訳終止コドンおよび即時型翻訳終止シグナルも
、枠内融合部位の下流に操作した。各カセットをコードするＤＮＡを、標準技術
によって合成し、そして適切な相同性ベクターにクローン化させた。
【０１２８】 ＣＤ８０の即時型断片の単離： ＲＮＡｚｏｌＢのＲＮＡ抽出試薬（バイオテックス（Ｂｉｏｔｅｘｃ）、テキ
サス州ヒューストン）を用いてＣｏｎＡで１６時間刺激した末梢血単核細胞（Ｐ
ＢＭＣ）からｍＲＮＡを抽出した。最初に、３’−プライマーとしてオリゴｄＴ
を使用する逆転写酵素（ＲＴ）反応によって、ｃＤＮＡをこのＲＮＡから誘導し
た。簡単に、ＲＮＡおよびオリゴｄＴを７５℃で、３分間加熱して、二次構造を
取除いた。その後、ＲＴ、ｄＮＴＰ、緩衝液および蒸留水を添加し、混合液を、
１時間、４２℃でインキュベートした。このインキュベーションに続いて、サン
プルを、９５℃まで、５分間加熱して、ＲＴを不活性化させた。その後、ヒトお
よびネズミのＣＤ８０公表配列（ジーンバンク、マサチューセッツ州ゲーサーズ
バーグ）内の共通領域から誘導される変性プライマーを、遺伝子の一定ドメイン
内の中央領域をコードする３４４ヌクレオチド（ｎｔｄ）断片の当初の増幅に使
用した。
【０１２９】 ５’プライマーＢ７−２ ＧＧＣ ＣＣＧ ＡＧＴ Ａ（ＣＴ）Ａ ＡＧＡ Ａ
ＣＣ ＧＧＡ Ｃ （配列番号５６） ３’プライマーＢ７−３ ＣＡＧ （ＡＴ）ＴＴ ＣＡＧ ＧＡＴ Ｃ（ＣＴ）
Ｔ ＧＧＧ ＡＡＡ （ＣＴ）ＴＧ （配列番号５７） Ｔａｑポリメラーゼを使用するホットスタートポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）プロトコールを使用して、産物を増幅させた。Ｔａｑ酵素を欠く反応混合液を
、最初、ホットスタート段階で、９５℃で、５分間加熱して、プライマー二量体
の形成を防止した。酵素を加えてから、温度サイクルを開始した。その後、ＰＣ
Ｒ反応液を、９５℃まで３０秒間加熱して、二本鎖ＤＮＡを融解させた。その後
、反応液を、４２℃まで、３０秒間冷却して、変性プライマーのアニーリングを
促進させた。低アニーリング温度を使用して、１００％相同ではないプライマー
の結合を促進させた。その後、反応液を、プライマーを拡張し、そして対峙ＤＮ
Ａ鎖をコピーするＴａｑポリメラーゼについての最適温度、７２℃まで、４５秒
間加熱した。温度サイクルを、３０回繰返した。３０サイクルに続いて、７分間
、７２℃の最終伸長段階を、使用して、任意の未完成産物の伸長を促進した。１
％アガロースゲル上ので可視化の後、産物を、一夜、１６℃で、シーケンシング
についてのＴＡクローニングベクター（カリフォルニア州サンディエゴのインビ
トロゲン）にライゲートした。２ｍｌのライゲート反応液を使用して、競合Ｉｎ
ｖａＦ’細胞を形質転換した。形質転換した細菌を、ｘ−ｇａｌの５０ｍｇ／ｍ
ｌ溶液４０ｍｌで被覆したＬＢ平板（５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン）上に画線接
種した。続く日に、白色コロニーを選択し、そして１００ｍｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含む５ｍｌのＬＢ培地に接種し、そして２２５ｒｐｍで振蘯させながら３
７℃で一夜育成させた。
【０１３０】 一夜、培地でミニ調製を行って、正確な挿入物を伴うプラスミドを保有したク
ローンを測定した。プラスミドを、標準アルカリ性溶解手段を用いて培地から抽
出し、それに伴い、ＤＮＡは、さらにフェノール：クロロホルム抽出（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら、１９８２年）によってさらに精製された。ＤＮＡを、２倍量のエタ
ノールに沈殿させ、そしてその後、ＥｃｏＲＩで消化させた。消化物を、１％ア
ガロースゲル上で可視化させて、適切な挿入物を含むプラスミドを有するコロニ
ーを測定した。その後、プラスミドを陽性クローンから精製し、そしてシーケナ
ーゼ基本（ＵＳＢ、オハイオ州クレーブランド）Ｓ３５放射線標識ジデオキシタ
ーミネーターシーケンシングまたは蛍光染色ターミネーターサイクルシーケンシ
ング（パーキン・エルマー、コネチカット州ノルウォーク）によるかの何れかを
使用して配列した。ｃＤＮＡの配列から、特異的３’および５’プライマーを、
ｃＤＮＡ末端反応の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）に使用するために、そして３‘’
未翻訳領域（ＵＴＲ）から得られる変性プライマーとの接合で３’配列の誘導の
ために構築した。
【０１３１】 ＣＤ８０の５’領域の単離： マラソンのｃＤＮＡ増幅プロトコール（クローンテック、カリフォルニア州パ
ロアルト）を使用して、その遺伝子の５’配列を誘導した。ｍＲＮＡを、１２時
間、ＣｏｎＡで、そして同時発生で４時間、ＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣから産
生させた。ウルトラスペックＲＮＡ抽出試薬（バイオテックス、テキサス州ヒュ
ーストン）を用いてｍＲＮＡを抽出させた。ｃＤＮＡを、５’末端に変性ヌクレ
オチドを伴うアンカー・オリゴｄＴプライマーで産生させて、ポリＡ尾部の５’
のほとんどの末端に対するプライマーの結合を促進させた。その後、ｃＤＮＡを
、先に記述されるとおり転写させた。特異的リンカーを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで
ｃＤＮＡにライゲートさせた。先に増幅させた領域について特異的である内部３
’プライマー： Ｂ７−２８４：ＴＴＡ ＴＡＣ ＴＡＧ ＧＧＡ ＣＡＧ ＧＧＡ ＡＧ （配列番号５８） Ｂ７−１９０：ＡＧＧ ＣＴＴ ＴＧＧ ＡＡＡ ＡＣＣ ＴＣＣ ＡＧ （配列番号５９） およびライゲートしたリンカー配列に相補的なアンカープライマーを用いてｃＤ
ＮＡ上でタッチダウンＰＣＲを行った。ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ混合液（ク
ローンテック、カリフォルニア州パロアルト）を用いてタッチダウンＰＣＲ反応
についてのパラメーターは、９５℃で５分間、１サイクル；９５℃で３０秒間、
７２℃で３０秒間、そして６８℃で４５秒間、５サイクル；９５℃で３０秒間、
６５℃で３０秒間、そして６８℃で４５秒間、５サイクル；９５℃で３０秒間、
６０℃で３０秒間、そして６８℃で４５秒間、２５サイクルであった。１ｍｌの
この反応液を、５０ｍｌの水で希釈し、そしてその後５ｍｌのこの希釈液を、リ
ンカー特異的アンカープライマーおよび当初のプライマーの５’に配置される遺
伝子特異的３’プライマーを用いて重ね合せＰＣＲ反応（ＫｌｅｎＴａｑポリメ
ラーゼ混合液を用いて９５℃で５分間、１サイクル；９５℃で３０秒間、６５℃
で３０秒間、そして６８℃で４５秒間、３０サイクル）に使用した（図６）。
【０１３２】 Ｂ７−２０：ＴＴＧ ＴＴＡ ＴＣＧ ＧＴＧ ＡＣＧ ＴＣＡ ＧＴＧ （配列番号６０） Ｂ７−１３５：ＣＡＡ ＴＡＡ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＧＡ ＡＧＴ ＣＡＧ Ｇ
（配列番号６１） ２０ｍｌの各反応液を、１．５％アガロースゲル上で可視化させ、そして適切
な断片をゲルから切取った。ｃＤＮＡを抽出し、そしてゲル・ネブライザーおよ
びマイクロピュアー０．２２ｍｍフィルター（アミコン、マサチューセッツ州ビ
バリー）を介してゲル切片を遠心分離することによってアガロースから精製した
。その後、精製ＤＮＡを、染料ターミネーターサイクルシーケンシング（パーキ
ン・エルマー、コネチカット州ノルウォーク）を用いて直接的に配列した。
【０１３３】 ＣＤ８０の３’領域の単離： ３４４ｎｔｄ断片および先に配列された５’領域： Ｂ７−ｓ２２０ ＧＴＣ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＧＴＡ ＣＡＡ
Ｇ （配列番号６２） Ｂ７−５０ ＣＡＣ ＴＧＡ ＣＧＴ ＣＡＣ ＣＧＡ ＴＡＡ ＣＣＡ Ｃ （配列番号６３） Ｂ７−１４０ ＣＴＧ ＡＣＴ ＴＣＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＴＴＡ ＴＴＧ Ｇ
（配列番号６４） Ｂ７−５５０：ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＣＡ ＡＣＡ ＧＴＴ ＴＣＣ （配列番号６５） Ｂ７−６２０：ＴＡＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＣＡＡ ＣＣＡ ＴＡＧ ＣＴＴ Ｃ
（配列番号６６） から得られる５遺伝子特異的プライマーを選択することによって、遺伝子の３’
領域を、誘導した。
【０１３４】 その後、変性３’プライマーを、ヒトおよびネズミのＣＤ８０３’ＵＴＲの共
通領域から選択した。
【０１３５】 Ｂ７−１２８１ Ｇ（Ａ／Ｇ）Ａ ＡＧＡ （Ａ／Ｔ）ＴＧ ＣＣＴ ＣＡＴ
ＧＡ（Ｇ／Ｔ） ＣＣ （配列番号６７） Ｂ７−１２６０ ＣＡ（Ｃ／Ｔ） （Ａ／Ｇ）ＡＴ ＣＣＡ ＴＡＧ ＧＧ （配列番号６８） ｃＤＮＡを、先に記述されるとおりＣｏｎＡおよびＬＰＳで刺激したＰＢＭＣ
から得られるウルトラスペック（バイオテックス、テキサス州ヒューストン）で
抽出されたＲＮＡから産生した。
【０１３６】 アンカー付けしたオリゴｄＴを、ｃＤＮＡに対するＲＮＡ転写のための即時型
３’プライマーとして使用した。特異的５’プライマーおよび変性３’プライマ
ーを用いて、このｃＤＮＡでＴａｑポリメラーゼ基本のＰＣＲ反応を行った（９
５℃で５分間、１サイクル；９５℃で３０秒間、４２℃で３０秒間、そして７２
℃で４５秒間、３０サイクル；７２℃で７分間）。
【０１３７】 正しい寸法の単独断片を産生する前に、２回りの重ね合せ反応を必要とした。
この産物を、１．５％アガロースゲルから切り取り、先に記述されるとおりに精
製し、そして染色ターミネーターサイクルシーケンシング（パーキン・エルマー
、コネチカット州ノルウォーク）で配列した。
【０１３８】 ５’および３’領域の配列データから、ネコＣＤ８０遺伝子： Ｂ７開始：ＡＴＧ ＧＧＴ ＣＡＣ ＧＣＡ ＧＣＡ ＡＡＣ ＴＧＧ （配列番号６９） Ｂ７−９６０：ＣＣＴ ＡＧＴ ＡＧＡ ＧＡＡ ＧＡＧ ＣＴＡ ＡＡＧ Ａ
ＧＧ Ｃ （配列番号７０） の全開放読取枠をコードする領域を増幅するプライマーを構築させた。
【０１３９】 先に産生され、そしてその遺伝子をコードするＤＮＡを含むＰＢＭＣのｃＤＮ
Ａを使用した。このＰＣＲ反応（９５℃で５分間、１サイクル；９５℃で３０秒
間、４２℃で３０秒間、そして７２℃で４５秒間、３０サイクル；７２℃で７分
間）は、Ｔａｑポリメラーゼとしばしば関連してランダムな誤差を減少させる希
望である程度５’エキソヌクレアーゼ活性を保持する酵素カクテルであるＫｌｅ
ｎＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用した。反応液を、ＴＡクローニングベクター
（カリフォルニア州サンディエゴのインビトロゲン）にクローン化され、そして
先に記述されるとおり配列された９６０塩基対（ｂｐ）断片を増幅した。遺伝子
の最終配列は、２つの別々の動物から得られるｃＤＮＡを含んだ。遺伝子の各塩
基対を、個々のＰＣＲ反応から誘導される少なくとも３つの別々の配列で独立に
立証して、ＰＣＲ誘導間違えから誘導される誤差の可能性を減少させた。
【０１４０】 ＣＤ２８の当初の断片の単離 ｍＲＮＡを、１６時間、ＲＮＡｚｏｌＢ ＲＮ
Ａ抽出試薬（バイオテックス、テキサス州ヒューストン）を用いてＣｏｎＡで刺
激したＨＫ５末梢血リンパ球から抽出させた。オリゴｄＴを３’プライマーとし
て使用する逆転写酵素（ＲＴ）反応によって、当初のｃＤＮＡを、このＲＮＡか
ら誘導した。簡潔には、ＲＮＡ、およびオリゴｄＴを、３分間、７５℃まで加熱
して、二次構造を取除いた。その後、ＲＴ、ｄＮＴＰ、緩衝液および蒸留水を添
加し、そしてその混合液を、１時間、４２℃でインキュベートした。このインキ
ュベーションに続いて、サンプルを、５分間、９５℃まで加熱して、ＲＴを不活
性化させた。その後、ヒト、ネズミおよびウサギＣＤ２８公表核酸配列（ジーン
バンク、マサチューセッツ州ゲーサーズバーグ）の中で見られる共通領域から誘
導される変性プライマーを、大半の開放読取枠をコードする６７３ｎｔｄ断片の
当初の増幅のために使用した。
【０１４１】 ＣＤ２８−１１３：ＣＡＡ ＣＣＴ ＴＡＧ ＣＴＧ ＣＡＡ ＧＴＡ ＣＡＣ
（配列番号７１） ＣＤ２８−７６８：ＧＧＣ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＴＡ ＧＧＧ ＡＴＡ ＧＧ （配列番号７２） Ｔａｑポリメラーゼを使用するホットスタートＰＣＲプロトコールを使用して
、産物を増幅させた（９５℃で５分間、１サイクル；９５℃で３０秒間、４８℃
で３０秒間、そして７２℃で４５秒間、３０サイクル；７２℃で７分間、１サイ
クル）。その後、断片を１％アガロースゲル上で可視化させ、そしてＴＡクロー
ニングベクター（カリフォルニア州サンディエゴのインビトロゲン）にライゲー
トさせ、そして先に記述されるとおり配列した。ｃＤＮＡの配列から、特異的３
’プライマーを誘導し、５’ＲＡＣＥ反応に使用するために合成した。
【０１４２】 ＣＤ２８１９０：ＣＧＧ ＡＧＧ ＴＡＧ ＡＡＴ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＴＣ
Ｃ （配列番号７３） ＣＤ２８ ２３９：ＡＴＴ ＴＴＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＴＡＡ ＡＴＡ ＴＣＣ
（配列番号７４） ＣＤ２８の５’領域の単離 修飾ギブコ５‘’ＲＡＣＥプロトコール（ギブコ ＢＲＬ、メリーランド州ゲ
ーサーズバーグ）を使用して、ネコＣＤ２８分子の残りの５’配列を得た。１６
時間、ＲＮＡを抽出し、ＣｏｎＡがＰＢＭＣを刺激した。３’遺伝子特異的プラ
イマーを、最初の鎖のｃＤＮＡ合成のために使用した。ＲＮＡおよびプライマー
を、７５℃まで、５分間加熱し、その後、他のＲＴ試薬を添加した。変性に続い
て、混合液を、４℃に冷却し、そして反応緩衝液、塩化マグネシウム、ｄＮＴＰ
、ＤＴＴおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＲＴ（ギブコ ＢＲＬ、メリーランド州
ゲーサーズバーグ）を添加した。ＲＴ混合液を、４２℃で、３０分間、インキュ
ベートし、そしてその後、１５分間、７０℃に加熱して、ＲＴを変性させた。そ
の後、ＲＮエースカクテルを添加し、そして反応液を１０分間、５５℃でインキ
ュベートして、残余ＲＮＡを除去し、そして誤った末端トランスフェラーゼ（Ｔ
ｄＴ）伸長を防止した。その後、グラスマックス（ギブコ ＢＲＬ、メリーラン
ド州ゲーサーズバーグ）回転カラム上でｃＤＮＡを精製して、未取り込みｄＮＴ
Ｐおよびプライマーを除去した。その後、そのカラムから溶出される精製ｃＤＮ
Ａに、ＴｄＴで尾部付けした。ＴｄＴを用いて、２０−３０ヌクレオチドｄＣ尾
部をｃＤＮＡに添加した。精製ｃＤＮＡ、塩化マグネシウム、反応緩衝液、およ
びｄＣＴＰの混合液に酵素を添加し、続いて９５℃で３分間、ｃＤＮＡを変性さ
せた。反応液を、３７℃で１０分間、インキュベートし、そしてその後、酵素を
、加熱し、さらに１０分間、７０℃で不活性化させた。尾部を付けたｃＤＮＡを
、Ｔａｑポリメラーゼ基本のホットスタートＰＣＲ反応（９５℃で５分間；９５
℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４５秒間、３５サイクル；７２℃で
７分間）で増幅させた。この反応のためのプライマーとしては、ｃＤＮＡ合成プ
ライマーの５’に配置される３’プライマー、およびｄＣリンカーに特異的で、
そして主に、少数のｄＩ残基を有するｄＧから構成されるアンカープライマーが
挙げられる。この反応液中の１ｍｌを、５０ｍｌの水で希釈し、そしてその後、
この希釈液の内の５ｍｌを、ｄＧ／ｄＩ５’アンカープライマーおよび追加の上
流遺伝子特異的３’プライマーを用いて、重ね合せＰＣＲ反応（９５℃で５分間
、１サイクル；ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ混合液を用いて９５℃で３０秒間、
５５℃で３０秒間、そして７２℃で４５秒間、３０サイクル）に使用した。その
後、３０ｍｌの重ね合せ反応液を、１．５％アガロースゲル上で可視化させ、そ
して適切な断片を、そのゲルから抽出させた（図１９）。先に記述されるとおり
、アミコンゲル・ネブライザーおよびマイクロピュアフィルター（アミコン、マ
サチューセッツ州ビバリー）を用いてｃＤＮＡを精製した。精製ｃＤＮＡサンプ
ルを、染色ターミネーターサイクルシーケンシング（パーキン・エルマー、コネ
チカット州ノルウォーク）により配列した。完成した断片から、共通配列を誘導
した。その配列から、ネコＣＤ２８遺伝子： ｆｅＣＤ２８ ５’：ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＧＧＴ ＡＧＣ ＡＣ
Ａ ＡＴＧ ＡＴＣ ＣＴＣ ＡＧＧ（配列番号７５） ｆｅＣＤ２８ ３’：ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＣＴ ＧＧＡ ＴＡＧ ＧＧ
Ｇ ＴＣＣ ＡＴＧ ＴＣＡ Ｇ（配列番号７６） の全開放読取枠を包含するプライマー対を合成した。
【０１４３】 これらのプライマーを使用して、全コーディング領域を含むｃＤＮＡ分子を、
ＣｏｎＡ刺激ＥＫ６およびＥＤ３ ＰＢＭＣ誘導ｃＤＮＡから増幅させた。この
ＰＢＭＣのｃＤＮＡを、先に産生させ、そして遺伝子をコードするＲＮＡを含む
ことが示された。しばしばＴａｑポリメラーゼに関連したランダム間違えを減少
させる望みで、ＫｌｅｎＴａｑのＤＮＡポリメラーゼを用いて、このＰＣＲ反応
（９５℃で５分間、１サイクル；９５℃で３０秒間、４２℃で３０秒間、そして
７２℃で４５秒間、３０サイクル；７２℃で７分間）は、７５４ｂｐ断片を産生
させ、そしてそれは、ＴＡクローニングベクターにクローン化させ、そして先に
記述されるとおり配列した。ＣＤ８０分子を用いるように、各ヌクレオチド部位
を、少なくとも３つの独立に誘導された配列によって確認した。
【０１４４】 相同ベクター９０２−４９．４６．プラスミド９０２−４９．４６を、外来Ｄ
ＮＡをＲＰＶに挿入する目的のために構築した。それは、ＲＰＶのＤＮＡによっ
て挟まれたＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を
組込む。外来遺伝子の上流は、およそ９０６塩基対断片のＲＰＶのＤＮＡである
。外来遺伝子の下流は、およそ８９５塩基対断片のＲＰＶのＤＮＡである。プラ
スミドを、「組換えＲＰＶを生成するための相同な組換え手段」によって使用す
る場合、外来遺伝子のためのＤＮＡコーディングを含むウイルスを生じる。β−
ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は、後期プロモーター（ＬＰ１）
の制御下にあり、そして第二の外来ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩ部位
に挿入し、そして第二の外来遺伝子は、後期／即時型プロモーター（ＬＰ２ＥＰ
２）の制御下にあることは注目される。それは、合成ＤＮＡ配列を有する以下の
源から制限断片を結合することによって、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）
を利用して構築された。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）のおよ
そ２９９９塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片から誘導される。断片１は、ＲＰＶＨ
ｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｕ（Knightら）のおよそ９０６塩基対のＨｉｎｄＩＩＩか
らＸｂａＩまでの制限副断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ferr
ariら）のおよそ３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限断片で
ある。断片３は、ＲＰＶＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｕのおよそ８９５塩基対のＸｂ
ａＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの副断片である。ＮｏｔＩリンカーを用いて、断片
１および３中のＸｂａＩ部位を、特徴的なＮｏｔＩ部位に変換した。
【０１４５】 相同ベクター９０４−６３．Ｂ７．相同ベクター９０４−６３．Ｂ７を、外来
ＤＮＡをＲＰＶに挿入するのに使用した。それは、ＳＰＶのＤＮＡによって挟ま
れたＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびネ
コ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ｇａｇ／プロテアーゼおよびエンベロープ遺伝子
を組込む。この相同ベクターを、「組換えＳＰＶを生成するための相同な組換え
手段」によって使用する場合、外来遺伝子のためのＤＮＡコーディングを含むウ
イルスを生じる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は、合成後
期ポックスプロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、そしてＦＩＶｇａｇ／プロ
テアーゼおよびエンベロープ遺伝子は、別々であるが、同一の合成後期／前期ポ
ックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＦＩＶｇａｇ／プロテア
ーゼおよびＦＩＶエンベローププロモーター／遺伝子カセットは、ｇａｇ／プロ
テアーゼおよびエンベロープ遺伝子の転写が、互いに向かって走り、同一プロモ
ーターの間の相同な組換えの可能性を避けるように対峙する方向に向けられる。
合成ＤＮＡ配列を有する以下の源から制限断片を結合することによって、標準組
換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して、相同ベクターを構築した。プラスミ
ドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）のおよそ２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩ
ＩからＢａｍＨＩまでの制限断片から誘導される。断片１は、ＳＰＶＨｉｎｄＩ
ＩＩ断片Ｍ（２３）のおよそ１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制
限副断片である。断片２は、ＦＩＶ ＰＰＲ株を用いた逆転写（ＲＴ）およびポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成されるＦＩＶエンベ
ロープ遺伝子のおよそ２５８０塩基対のＥｃｏＲＩからＢｇｌＩＩまでの断片で
ある。上流プライマー（５’−ＧＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧ
ＧＴＴＴＧＣＡＧＣ−３’ １０／９３．２１）（配列番号７７）は、ＦＩＶエ
ンベロープ遺伝子の５’末端から合成し、そしてその遺伝子の５’末端にＢａｍ
ＨＩ部位を導入する。下流プライマー（５’−ＣＣＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＣ
ＴＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＴＣ−３’；１０／９３．２０）（配列番号７８
）は、ＦＩＶエンベロープ遺伝子の３’末端から合成し、そしてその遺伝子の３
’末端にＢａｍＨＩ部位を導入し、そして逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応に
使用される。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩで消化させて、ＦＩＶエンベロープ遺伝
子に対応する長さで断片２５８０塩基対を得た。断片３は、ＦＩＶ ＰＰＲ株か
ら得られるｃＤＮＡを用いた逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）（１５、４２）によって合成されるＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子のお
よそ１８３９塩基対のＥｃｏＲＩからＢｇｌＩＩまでの断片である。上流プライ
マー（５’−ＧＣＧＴＧＡＡＴＴＣＧＧＧＧＡＡＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＧＡＧ
ＡＴ−３’；１１／９４．９）（配列番号７９）は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアー
ゼ遺伝子の５’末端から合成し、そしてその遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位
を導入する。下流プライマーは、（５’−ＧＡＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＣＴＴ
ＴＴＴＡＣＴＴＴＣＣＣ−３’；１１／９４．１０）（配列番号８０）であり、
そしてＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子の３’末端から合成し、そしてその遺
伝子の３’末端にＢｇｌＩＩ部位を導入し、そして逆転写およびポリメラーゼ連
鎖反応に使用された。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで消化させて
、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子に対応する長さで断片およそ１８３９塩基
対を得た。断片４は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ferrariら）のおよそ３０１０
塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの断片である。断片５は、ＳＰＶ Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ制限断片Ｍのおよそ２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩま
での制限副断片である。合成リンカーを用いて、ＳＰＶ相同ベクター中のＡｃｃ
Ｉ部位を、特徴的なＮｏｔＩ部位に変換した。
【０１４６】 相同ベクター９１７−６０．Ｂ９．プラスミド９１７−６０．Ｂ９を、外来Ｄ
ＮＡをＲＰＶに挿入する目的のために構築した。それは、ＳＰＶのＤＮＡによっ
て挟まれたＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子お
よびネコＩＦＮ−γ遺伝子（Onionら、（１９９６年）；Argyleら、（１９９５
年））を組込む。外来遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡのおよそ１４８４塩基対
断片である。外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡのおよそ２１４９塩基対断片
である。このプラスミドを、「組換えＳＰＶを生成するための相同な組換え手段
」によって使用する場合、外来遺伝子のためのＤＮＡコーディングを含むウイル
スを生じる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は、豚痘０１Ｌ
プロモーターの制御下にあり、そしてネコＣＤ２８遺伝子は、合成後期／前期ポ
ックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注目する。以下の源
から制限断片を結合することによって、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を
利用して、それを構築しうる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）
のおよそ２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限断片から誘
導された。断片１は、ＳＰＶＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍのおよそ１４８４塩基対
のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限副断片である。断片２は、テンプレートと
してＣｏｎＡ刺激ネコ脾臓細胞から得られるＲＮＡを用いた逆転写およびポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成されるＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの
制限断片である。ネコＩＦＮ−γを合成するために、プライマー（５’−ＴＣＧ
ＡＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＡＣＡＣＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＴＴＣＧ−３’
；１／９７．４）（配列番号８１）は、ネコＩＦＮ−γ遺伝子の５’末端から合
成し、その遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−
ＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＣＴＣＴＡＣＧＧＣＣＴＣ−３’
；１／９７．３）（配列番号８２）を逆転写およびＰＣＲのために使用し、そし
てネコＩＦＮ−γ遺伝子の３’末端から合成し、その遺伝子の３’末端にＢａｍ
ＨＩ部位を導入した。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化させて
、ネコＩＦＮ−γ遺伝子に対応する長さで断片およそ５０４塩基対を得た。断片
３は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ferrariら）のおよそ３０１０塩基対のＥｃｏ
ＲＩからＰｖｕＩＩまでの制限断片である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ
断片Ｍのおよそ２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの副断片であ
る。断片１および４にあるＡｃｃＩ部位を、ＮｏｔＩリンカーを使用して特徴的
なＮｏｔＩ部位に変換した。
【０１４７】 相同ベクター９２６−７６．Ｄ７．相同ベクター９２６−７６．Ｄ７を、ネコ
ヘルペスウイルスからｇＥコーディング領域の一部を欠失し、そして外来ＤＮＡ
を挿入する目的のために構築した。それは、ＦＨＶのＤＮＡによって挟まれたネ
コＣＤ８０遺伝子を組込む。ネコＣＤ８０遺伝子は、ＦＨＶ ｇＥプロモーター
の制御下にあった。それを、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して例
示ＤＮＡ源から構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ１８／１９のおよそ２
９５８塩基対のＡｓｐ７１８ＩからＡｓｐ７１８Ｉまでの制限エンドヌクレアー
ゼ断片から誘導される。断片１は、ＦＨＶ ＳａｌＩ Ｂ断片のおよそ１４１５
塩基対のＡｓｐ７１８ＩｋからＳｍａＩ副断片である。断片２は、「ポリメラー
ゼ連鎖反応を用いたクローニング」により合成されるネコＣＤ８０遺伝子のおよ
そ８７９塩基対のＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの断片である。ＰＣＲ反応のた
めのテンプレートを、ＣｏｎＡ刺激ネコ脾臓細胞から得られるＲＮＡであった。
上流プライマー（５’−ＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＴＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡ
ＧＴＧＧ−３’；１／９７．４３）（配列番号５２）は、ネコＣＤ８０遺伝子の
５’末端から合成し、そしてＥｃｏＲＩ部位を導入する。下流プライマー（５’
−ＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＡＴ−３’
；１／９７．６）（配列番号５３）は、ネコＣＤ８０遺伝子の３’末端から合成
し、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入し、そして逆転写およびポリ
メラーゼ連鎖反応のために使用した。断片３は、ＦＨＶ ＥｃｏＲＩ Ｅ断片の
およそ２２０５塩基対のＳａｌＩからＡｓｐ７１８Ｉまでの副断片である。
【０１４８】 相同ベクター９３０−２３．Ａ１．プラスミド９３０−２３．Ａ１を、ＳＰＶ
に外来ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。それは、ＳＰＶのＤＮＡによっ
て挟まれたＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子お
よびネコＣＤ８０遺伝子を組込む。外来遺伝子の上流は、ＳＰＶ ＤＮＡのおよ
そ１４８４塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＳＰＶ ＤＮＡのおよそ２
１４９塩基対断片である。そのプラスミドが、「組換えＳＰＶを生成するための
相同組換え手段」によって使用されるとき、外来遺伝子についてのＤＮＡコーデ
ィングを含むウイルスが生じる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺
伝子は、合成後期ポックスプロモーター（ＬＰ１）の制御下であり、そしてネコ
ＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制
御下であることに注目すべきである。以下の源から得られる制限断片を結合する
ことによって、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して構築した。その
プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）のおよそ２９７２塩基対のＨｉ
ｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限断片から誘導された。断片１は、ＳＰＶ
ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍのおよそ１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩま
での制限副断片である。断片２は、テンプレートとしてＣｏｎＡ刺激ネコ脾臓細
胞から得られるＲＮＡを使用して、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）によって合成されるＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの制限断片である。ネコＣ
Ｄ８０を合成するために、プライマー５’−ＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＴＣＡ
ＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧ−３’；１／９７．４３）（配列番号５２）は、ネ
コＣＤ８０遺伝子の５’末端から合成し、そしてその遺伝子の５’末端にＥｃｏ
ＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴ
ＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＡＴ−３’；１／９７．６）（配列番号５３）は、
逆転写およびＰＣＲのために使用し、そしてネコＣＤ８０遺伝子の３’末端から
合成し、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入した。ＰＣＲ産物を、Ｅ
ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ネコＣＤ８０遺伝子に対応する長さでお
よそ８７９塩基対の断片を得た。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ferrari
ら）のおよそ３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限断片である
。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍのおよそ２１４９塩基対のＡｃｃＩ
からＨｉｎｄＩＩＩまでの副断片である。断片１および４にあるＡｃｃＩ部位は
、ＮｏｔＩリンカーを用いて特徴的なＮｏｔＩ部位に変換された。
【０１４９】 相同ベクター９３０−２６．Ａ１．プラスミド９３０−２６．Ａ１を、ＳＰＶ
に外来ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。それは、ＳＰＶのＤＮＡによっ
て挟まれたＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子お
よびネコＣＤ２８遺伝子を組込む。外来遺伝子の上流は、ＳＰＶ ＤＮＡのおよ
そ１４８４塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＳＰＶ ＤＮＡのおよそ２
１４９塩基対断片である。そのプラスミドが、「組換えＳＰＶを生成するための
相同組換え手段」によって使用されるとき、外来遺伝子についてのＤＮＡコーデ
ィングを含むウイルスが生じる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺
伝子は、合成後期ポックスプロモーター（ＬＰ１）の制御下であり、そしてネコ
ＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制
御下であることに注目すべきである。以下の源から得られる制限断片を結合する
ことによって、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して構築した。その
プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）のおよそ２９７２塩基対のＨｉ
ｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限断片から誘導された。断片１は、ＳＰＶ
ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍのおよそ１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩま
での制限副断片である。断片２は、テンプレートとしてＣｏｎＡ刺激ネコ脾臓細
胞から得られるＲＮＡを使用して、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）によって合成されるＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの制限断片である。ネコＣ
Ｄ２８を合成するために、プライマー５’−ＧＡＴＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＡＴＣ
ＣＴＣＡＧＧＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴ−３’；７／９７．１）（配列番号５４）は
、ネコＣＤ２８遺伝子の５’末端から合成し、その遺伝子の５’末端にＥｃｏＲ
Ｉ部位を導入する。プライマー（５’−ＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＣＡＧＧＡＡＣＧ
ＧＴＡＴＧＣＣＧＣＡＡ−３’；７／９７．２）（配列番号５５）は、逆転写お
よびＰＣＲのために使用し、そしてネコＣＤ２８遺伝子の３’末端から合成し、
その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入した。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ
およびＢａｍＨＩで消化して、ネコＣＤ２８遺伝子に対応する長さでおよそ６６
６塩基対の断片を得た。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ferrariら）のお
よそ３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限断片である。断片４
は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍのおよそ２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉ
ｎｄＩＩＩまでの副断片である。断片１および４にあるＡｃｃＩ部位は、Ｎｏｔ
Ｉリンカーを用いて特徴的なＮｏｔＩ部位に変換された。
【０１５０】 相同ベクター９３１−２１．Ａ１．相同ベクター９３１−２１．Ａ１を、ＳＰ
Ｖに外来ＤＮＡを挿入するのに使用した。それは、ＳＰＶのＤＮＡによって挟ま
れたＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子およびネ
コＣＤ８０遺伝子を組込む。このプラスミドが、「組換えＳＰＶを生成するため
の相同組換え手段」によって使用されるとき、外来遺伝子についてのＤＮＡコー
ディングを含むウイルスが生じた。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー
遺伝子は、合成前期ポックスプロモーター（ＥＰ２）の制御下であり、そしてネ
コＣＤ８０遺伝子は、別々で、そして特徴的な合成後期／前期ポックスプロモー
ター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下であることに注目すべきである。その相同ベクタ
ーは、以下の源から得られる制限断片を、適切な合成ＤＮＡ配列と結合させるこ
とによって、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して構築した。そのプ
ラスミドベクターは、ＰＮＥＢ１９３（ニュー・イングランド・バイオラボズ）
のおよそ２７００塩基対のＤｒａＩ制限断片から誘導された。断片１は、ＳＰＶ
ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｋのおよそ８８１塩基対のＤｒａＩからＥｃｏＲＩまでの
制限副断片である。断片２は、「ポリメラーゼ連鎖反応でのクローニング」によ
って合成されるネコＣＤ８０遺伝子のおよそ８７９塩基対のＥｃｏＲＩからＢａ
ｍＨＩまでの断片である。ＰＣＲ反応についてのテンプレートは、ＣｏｎＡ刺激
ネコ脾臓細胞から得られるＲＮＡであった。上流プライマー（５’−ＴＣＧＡＧ ＡＡＴＴＣ ＧＧＧＴＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧ−３’；１／９７．４３）
（配列番号５２）は、ネコＣＤ８０遺伝子の５’末端から合成し、ＥｃｏＲＩ部
位を導入する。下流プライマー（５’−ＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴＧ
ＴＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＡＴ−３’；１／９７．６）（配列番号５３）は、ネ
コＣＤ８０遺伝子の３’末端から合成し、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部
位を導入し、そして逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応のために使用した。断片
３は、プラスミドｐＲＡＪ２６０（クローンテック）のおよそ１８２３塩基対の
ＥｃｏＲＩからＳｍａＩまでの制限断片である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩ
ＩＩ断片Ｋのおよそ９９４塩基対のＥｃｏＲＩからＤｒａＩまでの制限副断片で
ある。ＳＰＶ相同ベクターにあるＥｃｏＲＩ部位は、合成リンカーを用いて特徴
的なＮｏｔＩ部位に変換された。
【０１５１】 相同ベクター９３１−２２．Ａ１．プラスミド９３１−２２．Ａ１を、ＳＰＶ
に外来ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。それは、ＲＰＶのＤＮＡによっ
て挟まれたネコＣＤ８０遺伝子を組込む。外来遺伝子の上流は、ＲＰＶ ＤＮＡ
のおよそ９０６塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＲＰＶ ＤＮＡのおよ
そ８９５塩基対断片である。そのプラスミドが、「組換えＲＰＶを生成するため
の相同組換え手段」によって使用されるとき、外来遺伝子についてのＤＮＡコー
ディングを含むウイルスが生じる。ネコＣＤ８０遺伝子は、後期／前期プロモー
ター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下であることに注目すべきである。それは、合成Ｄ
ＮＡ配列と共に、以下の源から得られる制限断片を結合することによって、標準
組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して構築した。そのプラスミドベクター
は、ｐＳＰ６４（プロメガ）のおよそ２９９９塩基対のＨｉｎｄＩＩＩの制限断
片から誘導された。断片１は、ＲＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｕ（Knightら）
のおよそ９０６塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＸｂａＩまでの制限副断片である。
断片２は、「ポリメラーゼ連鎖反応を用いたクローニング」によって合成される
ネコＣＤ８０遺伝子のおよそ８７９塩基対のＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの断
片である。ＰＣＲ反応についてのテンプレートは、ＣｏｎＡ刺激ネコ脾臓細胞か
ら得られるＲＮＡであった。上流プライマー（５’−ＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧ
ＧＴＴＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧ−３’；１／９７．４３）（配列番号５
２）は、ネコＣＤ８０遺伝子の５’末端から合成し、ＥｃｏＲＩ部位を導入する
。下流プライマー（５’−ＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＡ
ＧＧＴＧＡＧＡＴ−３’；１／９７．６）（配列番号５３）は、ネコＣＤ８０遺
伝子の３’末端から合成し、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入し、
そして逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応のために使用した。断片３は、ＲＰＶ
ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｕのおよそ８９５塩基対のＸｂａＩからＨｉｎｄＩＩＩま
での副断片である。断片１および３にあるＸｂａＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを
用いて特徴的なＮｏｔＩ部位に変換された。断片２および３の間の合成ＤＮＡは
、ＬＰ２ＥＰ２プロモーターおよび外来ＤＮＡの挿入のためのＥｃｏＲＩ部位お
よびＢａｍＨＩ部位を含む。
【０１５２】 相同ベクター９３１−３２．Ａ５．プラスミド９３１−３２．Ａ５を、ＲＰＶ
に外来ＤＮＡを挿入するのに使用する目的で構築した。それは、ネコＣＤ８０遺
伝子およびＲＰＶのＤＮＡによって挟まれたＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダー
ゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を組込む。外来遺伝子の上流は、ＲＰＶ ＤＮＡ
のおよそ９０６塩基対の断片である。外来遺伝子の下流は、ＲＰＶ ＤＮＡのお
よそ８９５塩基対の断片である。このプラスミドが、「組換えＲＰＶを生成する
ための相同組換え手段」によって使用されるとき、外来遺伝子についてのＤＮＡ
コーディングを含むウイルスが生じる。それは、以下の源から得られる制限断片
を、合成ＤＮＡ配列と結合させることによって、標準組換えＤＮＡ技術（Sambro
okら）を利用して構築した。そのプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ
）のおよそ２９９９塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ制限断片から誘導された。断片１は
、ＲＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｕ（Knightら）のおよそ９０６塩基対のＨｉ
ｎｄＩＩＩからＸｂａＩまでの制限副断片である。断片２は、「ポリメラーゼ連
鎖反応でのクローニング」によって合成されるネコＣＤ８０遺伝子のおよそ８７
９塩基対のＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの断片である。ＰＣＲ反応についての
テンプレートは、ＣｏｎＡ刺激ネコ脾臓細胞から得られるＲＮＡであった。上流
プライマー（５’−ＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＴＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴ
ＧＧ−３’；１／９７．４３）（配列番号５２）は、ネコＣＤ８０遺伝子の５’
末端から合成し、ＥｃｏＲＩ部位を導入する。下流プライマー（５’−ＧＣＴＡ
ＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＡＴ−３’；１／９７
．６）（配列番号５３）は、ネコＣＤ８０遺伝子の３’末端から合成し、その遺
伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入し、そして逆転写およびポリメラーゼ連
鎖反応のために使用した。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ferrariら）の
およそ３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限断片である。断片
４は、ＲＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｕのおよそ８９５塩基対のＸｂａＩからＨｉ
ｎｄＩＩＩまでの副断片である。断片１および４にあるＸｂａＩ部位は、Ｎｏｔ
Ｉリンカーを用いて特徴的なＮｏｔＩ部位に変換された。
【０１５３】 相同ベクター９３１−５５．Ｂ１２．相同ベクター９３１−５５．Ｂ１２を、
ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するのに使用した。それは、ＳＰＶのＤＮＡによって
挟まれたＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子およ
びネコＩＦＮ−γ遺伝子（Onionsら、(1996年)；Argyleら(1995年)）を組込む。
この相同ベクターが、「組換えＳＰＶを生成するための相同組換え手段」によっ
て使用されるとき、外来遺伝子についてのＤＮＡコーディングを含むウイルスが
生じた。β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子は、合成前期ポック
スプロモーター（ＥＰ２）の制御下であり、そしてネコＩＦＮ−γ遺伝子は、別
々で、そして特徴的な合成後期／前期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の
制御下であることに注目すべきである。その相同ベクターは、以下の源から得ら
れる制限断片を、適切な合成ＤＮＡ配列と結合させることによって、標準組換え
ＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して構築した。そのプラスミドベクターは、Ｐ
ＮＥＢ１９３（ニュー・イングランド・バイオラボズ）のおよそ２７００塩基対
のＤｒａＩ制限断片から誘導された。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｋ
のおよそ８８１塩基対のＤｒａＩからＥｃｏＲＩまでの制限副断片である。断片
２は、テンプレートとしてＣｏｎＡ刺激ネコ脾臓細胞から得られるＲＮＡを用い
て逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成されるＥｃｏＲＩ
からＢａｍＨＩまでの制限断片である。ネコＩＮＦ−γを合成するために、プラ
イマー５’−ＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＡＣＡＣＡＡＧＴＴＴＴＡ
ＴＴＴＴＣＧ−３’；１／９４．４）（配列番号８１）は、ネコＩＮＦ−γ遺伝
子の５’末端から合成し、その遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。
プライマー（５’−ＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＣＴＣＴＡＣ
ＧＧＣＣＴＣ−３’；１／９７．３）（配列番号８２）は、逆転写およびＰＣＲ
のために使用し、そしてネコＩＮＦ−ｇ遺伝子の３’末端から合成し、その遺伝
子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入した。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＢ
ａｍＨＩで消化させて、ネコＩＮＦ−γ遺伝子に対応する長さでおよそ５０４塩
基対の断片を生じた。断片３４は、プラスミドｐＲＡＪ２６０（クローンテック
）のおよそ１８２３塩基対のＥｃｏＲＩからＳｍａＩまでの制限断片である。断
片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｋのおよそ９９４塩基対のＥｃｏＲＩから
ＤｒａＩまでの制限副断片である。ＳＰＶ相同ベクターにあるＥｃｏＲＩ部位は
、合成リンカーを用いて特徴的なＮｏｔＩ部位に変換された。
【０１５４】 相同ベクター８４６−８８．Ｂ１７．プラスミド８６４．８８．ｂ１７を、ネ
コヘルペスウイルスから全ｇＥコーディング領域を欠失させ、そして外来ＤＮＡ
を挿入する目的のために構築した。それは、ＨＶのＤＮＡによって挟まれたＦＨ
ＶｇＥ欠失部位に挿入されるＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）
マーカー遺伝子を組込む。プラスミド８４６．８８．Ｂ１７は、ＦＨＶＳａｌＩ
Ｂ断片にあるＳｍａＩ部位からＦＨＶＥｃｏＲＩＥ断片にあるＳａｌＩ部位まで
ｇＥ遺伝子の１６３８塩基対欠失を含む。ＦＨＶＳａｌＩＢ断片にあるＳｍａＩ
部位と、ＦＨＶＥｃｏＲＩ Ｅ断片にあるＳａｌＩ部位は、ｇＥ遺伝子の欠失の
終点を規定する。外来遺伝子の上流は、ｇＩ遺伝子の全コーディング配列（３７
０アミノ酸）を含むＦＨＶ ＳａｌＩ Ｂのおよそ１４１５塩基対のＡｓｐ７１
８からＳａｍＩまでの副断片である。外来遺伝子の下流は、特徴的な短く、そし
て末端の繰返し配列を含むＦＨＶ ＥｃｏＲＩ Ｅ断片のおよそ２２０５塩基対
のＳａｌＩからＡｓｐ ７１８までの副断片である。そのプラスミドが、「組換
えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを生成するための相同組換え手段」によって使用
されるとき、外来ｅｎｅ（遺伝子）についてのＤＮＡコーディングを含むウイル
スが生じる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ Ｚ遺伝子は、構造的ＦＨＶｇＥプロモータ
ーの制御下であることに注目すべきである。それは、標準組換えＤＮＡ技術（Sa
mbrookら）を利用して構築された。
【０１５５】 相同ベクター９２１−６５．Ｂ５．相同ベクター９２１−６５６．Ｂ５を、Ｓ
ＰＶ １５Ｌ遺伝子（およそ２３７ｂｐ）を欠失するため、そしてＳＰＶに外来
ＤＮＡを挿入するために構築した。それは、ＳＰＶのＤＮＡによって挟まれたＥ
．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）マーカー遺伝子およびネコ白血
病ウイルス（ＦｅＬＶ）ｇａｇ／プロテアーゼおよびエンベロープ遺伝子を組込
む。この相同ベクターが、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを生成するため
の相同組換え手段」によって使用されるとき、外来遺伝子についてのＤＮＡコー
ディングを含むウイルスが生じる。それは、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら
）を利用して構築された。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は、
構造的後期ポックスプロモーター（Ｉ５Ｌ）の制御下にあり、そしてＦｅＬＶｇ
ａｇ／プロテアーゼおよびＦｅＬＶエンベロープ遺伝子は、各々、異なった合成
前期ポックスプロモーターＥＰ２およびＥＰ１の制御下にあることに注目すべき
である。外来遺伝子挿入を挟むＳＰＶ配列は、３．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ
ゲノム断片から誘導された。外来遺伝子の上流配列は、ＳＰＶ １４Ｌ遺伝子の
一部を含む９０３ｂｐの断片であり、そして下流配列は、ＳＰＶ １６Ｌ遺伝子
の一部を含む９６６ｂｐの断片である。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子、ＦｅＬ
ＶエンベロープおよびＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ開放読取枠は全て、ＳＰＶ
１６ＬおよびＳＰＶ１４Ｌ遺伝子に関して同じ配向で作動する。
【０１５６】 相同ベクター９４２−０３．Ｃ６．プラスミド９４２−０３．Ｃ６を、ネコヘ
ルペスウイルスからｇＥコーディング領域の一部を欠失させ、そして３つの外来
遺伝子をｇＥ欠失部位に挿入する目的のために構築した。それは、ネコＣＤ８０
遺伝子（〜８７９ｂｐ）、およびＦＨＶのＤＮＡによって挟まれたＦＩＶｇａｇ
／プロテアーゼ遺伝子（〜１８００ｂｐ）およびＦＩＶエンベロープ遺伝子（〜
２６００ｂｐ）を組込む。ネコＣＤ８０遺伝子は、ＦＨＶｇＥプロモーターの制
御下にあり、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーター
の制御下であり、そしてＦＩＶエンベロープ遺伝子は、サイトメガロウイルス即
時型遺伝子の制御下にある。外来遺伝子の上流は、ＦＨＶ ＳａｌＩ Ｂ断片の
およそ１４１５塩基対のＡｓｐ７１８からＳａｍＩまでの副断片である。外来遺
伝子の下流は、特徴的な短く、そして末端の繰返し配列を含むＦＨＶ ＥｃｏＲ
Ｉ Ｅ断片のおよそ２２０５塩基対のＳａｌＩからＡｓｐ ７１８までの副断片
である。そのプラスミドが、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを生成するた
めの相同組換え手段」によって使用されるとき、外来遺伝子についてのＤＮＡコ
ーディングを含むウイルスが生じる。相同プラスミド９４２−０３．Ｃ６は、標
準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して構築された。
【０１５７】
【実施例】
（例１Ａ） ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）−ＴＡＭＵ、ＣＤ８０（Ｂ７−１）−ＳＰＡＨ、Ｃ８
６（Ｂ７−２）、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡのクローニング： ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）、Ｃ８６（Ｂ７−２）、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−
４ｃＤＮＡを、ネコｍＲＮＡと相互作用する変性プライマーを作るのに十分保存
された２つの配列の間の領域を増幅する最初のＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素／ポリ
メラーゼ連鎖反応）によってクローン化した。ｍＲＮＡの源は、末梢血単核細胞
（ＰＢＭＣ）または少なくとも１６時間ＣｏｎＡで刺激した脾臓細胞であった。
このＰＣＲ産物を配列した。その配列は、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の高速増幅）
ＰＣＲについてのプライマーを作成するのに使用された。５’末端を、新たに配
列された保存領域に相補的である下流プライマーでｃＤＮＡを最初に作成するこ
とによって増幅させた。オリゴヌクレオチドを、ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡの５’末端
に贈られる）の３’末端にライゲートさせた。この配列は、新たに配列された領
域中の別の領域に対応する下流ＰＣＲプライマーに適合するＰＣＲである上流プ
ライマーについての結合部位として役割を果した。変性プライマーを、複数回の
重ね合せ反応に使用して、３’末端を得た。ＰＣＲのためのこの上流プライマー
は、新たに配列された領域内の配列と反応するように設計した。産物を、直接配
列するか、またはＴＡクローニングベクターにクローン化させて、プラスミドか
ら配列するかの何れかであった。全開放読取枠は、既知配列から構築されるプラ
イマーを用いたＰＣＲによってその全体的に増幅させることによってクローン化
された。ＯＲＦをクローン化させ、そして三回配列した。Ｂ７−１ＯＲＦを、Ｓ
Ｖ４０プロモーターを用いてｐＳＩプラスミドに、そしてＳＦＶプラスミドにサ
ブクローニングした。ｐＳＩは、ネコＣＤ２８とのＢ７−１の機能的相互作用を
確立するために使用された。
【０１５８】ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）ｃＤＮＡのＲＴ／ＰＣＲのために使用されるＤＮＡプ ライマーは、 ５’−プライマー：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＡＣＧ
ＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＣ−３’；（配列番号１１） ３’−プライマー：５’−ＣＣＴＡＧＴＡＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＡＡＡＧＡＧＧ
Ｃ−３’；（配列番号１２） （ネコＣＤ８０ｃＤＮＡのためのプライマーの完全リストについて上に参照）。
【０１５９】ネコＣＤ２８ｃＤＮＡのＲＴ／ＰＣＲのために使用されるＤＮＡプライマーは、 ５’−プライマー：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＧＧＴＡＧＣＡＣＡＡＴＧ
ＡＴＣＣＴＣＡＧＧ−３’；（配列番号１３） ３’−プライマー：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＧＧＡＴＡＧＧＧＧＴＣＣ
ＡＴＧＴＣＡＧ−３’；（配列番号１４） （ネコＣＤ２８ｃＤＮＡのためのプライマーの完全リストについて上に参照）。
【０１６０】ネコＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡのＲＴ／ＰＣＲのために使用されるＤＮＡプライマー は、 １．最初のＰＣＲ産物についての変性プライマー（６７２ｂｐ）： Ｄｅｇ５’Ｐ：５’−ＡＴＧＧＣＴＴ（Ｃ）ＧＣＣＴＴＧＧＡＴＴＴ（Ｃ）ＣＡ
ＧＣ（Ａ）ＧＧ−３’；（配列番号１５） Ｄｅｇ３’Ｐ：５’−ＴＣＡＡＴＴＧ（Ａ）ＡＴＧ（Ａ）ＧＧＡＡＴＡＡＡＡＴ
ＡＡＧＧＣＴＧ−３’；（配列番号１６） ２．ＣＴＬＡ−４の５’末端（４５５ｂｐ）：変性、遺伝子特異的（ＧＳＰ）
および重ね合せ遺伝子特異的（ＮＧＳＰ）プライマー： 初回のＰＣＲ： Ｄｅｇ５’Ｐ：５’−ＴＧＴＴＧＧＧＴＴＴＣ（Ｔ）Ｇ（Ａ）ＣＴＣＴＧ（Ａ）
ＣＴＴ（Ｃ）ＣＣＴＧ−３’；（配列番号１７） ３’ＧＳＰ：５’−ＧＣＡＴＡＧＴＡＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＡＣＡＴＧ−３’
；（配列番号１８） 初回のＰＣＲ産物を有する重ね合せＰＣＲ： Ｄｅｇ５’Ｐ：５’−ＴＧＴＴＧＧＧＴＴＴＣ（Ｔ）Ｇ（Ａ）ＣＴＣＴＧ（Ａ）
ＣＴＴ（Ｃ）ＣＣＴＧ−３’；（配列番号１９） ３’ＮＧＳＰ：５’−ＡＣＡＴＧＡＧＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＣＡＧ−３’；（配
列番号２０） ３．ＣＴＬＡ−４の３’末端；アダプタープライマー１（ＡＰ１、クロノテッ
ク・ラボ，インク．、カリフォルニア州パロアルト）；重ね合せアダプタープラ
イマー（ＡＰ２、クロノテック・ラボ）、遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）、
および重ね合せ遺伝子特異的プライマー（ＮＧＳＰ）： ３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ： ＡＰ１：５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３
’；（配列番号２１） ５’ＧＳＰ：５’−ＧＴＧＡＡＴＡＴＧＧＧＴＣＴＴＣＡＧＧＣＡＡＴＧ−３’
；（配列番号２２） ３’ＲＡＣＥ ＰＣＲの産物を有する３’重ね合せＲＡＣＥ ＰＣＲ： ＡＰ２：５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’；（配
列番号２３） ５’ＮＧＳＰ：５’−ＧＡＡＡＴＣＣＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧＡＧ−３’
；（配列番号２４） ４．全ＣＴＬＡ−４遺伝子のためのプライマー Ｆｅｌ ＣＴＬＡ−４ ５’プライマー：５’−ＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＴＧＣ
ＴＣＣＣＡＴＡＡＡＧ−３’；（配列番号２５） Ｆｅｌ ＣＴＬＡ−４ ３’プライマー：５’−ＧＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＴＡＧ
ＡＡＡＴＴＧＧＡＣＡＧ−３’；（配列番号２６）ネコＣＤ８６（Ｂ７−２）ｃＤＮＡのＲＴ／ＰＣＲのために使用されるＤＮＡプ ライマーは、 １．最初のＰＣＲ産物のための変性プライマー（４２３ｂｐ）： Ｄｅｇ５’Ｐ：５’−ＴＡＧＴＡＴＴＴＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣ−３’；（
配列番号２７） Ｄｅｇ３’Ｐ：５’−ＣＴＧＴＧＡＣＡＴＴＡＴＣＴＴＧＡＧＡＴＴＴＣ−３’
；（配列番号２８） ２．二次ＰＣＲ産物についての変性プライマー（５７４ｂｐ）： Ｄｅｇ５’Ｐ：５’−ＧＡ（Ｇ）ＣＡ（Ｔ）ＧＣＡＣＴ（Ａ）ＡＴＧＧＧＡＣＴ
ＧＡＧ−３’；（配列番号２９） Ｄｅｇ３’Ｐ：５’−ＣＴＧＴＧＡＣＡＴＴＡＴＣＴＴＧＡＧＡＴＴＴＣ−３’
；（配列番号３０） ３．ＣＤ８６の５’末端：ＡＰ１、ＡＰ２（クロノテック・ラボ）、変性３’
遺伝子特異的（ＧＳＰ）および３’−重ね合せ遺伝子特異的（ＮＧＳＰ）プライ
マー： ５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ： ＡＰ１：５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３
’；（配列番号３１） ３’ＧＳＰ：５’−ＴＧＧＧＴＡＡＣＣＴＴＧＴＡＴＡＧＡＴＧＡＧＣＡＧＧＴ
Ｃ−３’；（配列番号３２） ５’ＲＡＣＥのＰＣＲ産物を伴う重ね合せ５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ： ＡＰ２：５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’；（配
列番号３３） ３’ＮＧＳＰ：５’−ＣＡＧＧＴＴＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＣＡＡＧＣＡＣ−
３’；（配列番号３４） ４．Ｂ７−２の３’末端：ＡＰ１、ＡＰ２、５’ＧＳＰ、および５’ＮＧＳＰ
： ３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ： ＡＰ１：５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３
’；（配列番号３５） ５’ＧＳＰ：５’−ＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＡＣＡＴＡＴＣＡＣＴＧＴＴＴＣ−３
’；（配列番号３６） ３’ＲＡＣＥのＰＣＲ産物を伴う重ね合せ３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ： ＡＰ２：５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’；（配
列番号３７） ５’ＮＧＳＰ：５’−ＣＡＧＴＧＣＴＴＧＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＴＣＡＡＣＣ−
３’；（配列番号３８） 全ＣＤ８６遺伝子： Ｆｅｌ Ｂ７２（１）５’プライマー：５’−ＣＧＧＧＡＡＴＧＴＣＡＣＴＧＡ
ＧＣＴＴＡＴＡＧ−３’；（配列番号３９） Ｆｅｌ Ｂ７２（１１７６）３’プライマー：５’−ＧＡＴＣＴＴＴＴＴＣＡＧ
ＧＴＴＡＧＣＡＧＧＧＧ−３’；（配列番号４０） である。
【０１６１】 （例１Ｂ） ＣＤ８０（Ｂ７−１）−シントロ／ＳＰＡＨのクローニング；プラスミド９１７
−１９−８／１６： ネコ脾臓細胞を、ネコから抽出し、そして５時間、コンカナバリンＡと共に培
養し、細胞をペレット化し、ＰＢＳで洗浄し、そしてそれを使用して総ＲＮＡ（
キアゲン・ＲＮエーシー・トータルＲＮＡシステム）を単離させた。総ＲＮＡを
、ＲＮエースＩ（ベーリンガー・マンハイム）で処理して、ＲＮＡ調製物からＤ
ＮＡ混入を除去した。その後、キアゲンのオリゴテックス・ビーズ（カリフォル
ニア州サンタクララ）およびクイックカラムを用いてメセンジャーＲＮＡを、こ
れらの調製物から抽出した。ランダム・ヘキサマー、ｄＮＴＰ、ＲＮＡｓｉｎ、
逆転写酵素（プロメガ）および逆転写酵素緩衝液（プロメガ）の存在下で、コピ
ーＤＮＡを、ｍＲＮＡから生成し、そして４２℃で、３０分間、インキュベート
し、その後ＰＣＲを使用して、センス・プライマー５／９７．５０（５’−ＡＴ
ＧＧＧＴＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧ−３’）；（配列番号４１）およびアン
チセンスプライマー５／９７．５１（５’−ＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡ
ＧＡＴＣ−３’）：（配列番号４２）、ｄＮＴＰ、Ｂ７−１ｃＤＮＡ（一本鎖）
、ＭｇＳＯ４、ベントポリメラーゼ（ＢＲＬ）およびベントポリメラーゼ緩衝液
（ＢＲＬ）を使用して、ネコＢ７−１開放読取枠（ＯＲＦ）の二本鎖の全長ｃＤ
ＮＡクローンを生成した。ＰＣＲ条件は、以下のとおりであった：９４℃、１５
秒の１サイクル；９４℃、３０秒間、４８℃で２分間、７２℃で２分間の３５サ
イクル；７２℃で１０分間の１サイクル。ＰＣＲ反応を、１％低融解アガロース
ゲル上で行い、そしてＢ７−１ＯＲＦの予測サイズに対応するＤＮＡ断片を単離
し、ゲルを精製し（キアゲンのゲル精製キット、カリフォルニア州サンタクララ
）、そしてインビトロゲンのゼロ平滑ＰＣＲクローニングキット（カリフォルニ
ア州サンディエゴ）から得たキット試薬を用いてｐＣＲ−ＢＬＵＮＴプラスミド
ベクターにクローン化させた。カナマイシン耐性細菌コロニーから抽出されるＤ
ＮＡを、特徴的なＮｈｅＩ部位（ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）−ＴＡＭＵ中に含ま
れる）の存在について予備スクリーニングした。８００−９００ｂｐサイズの範
囲にあり、そしてＮｈｅＩ部位を含んだ挿入物を、ＡＢＩの蛍光自動スクリーニ
ング・プロトコールおよび装置（パーキン−エルマー−シータス；アプライド・
バイオシステムズ，インク．）を用いて配列決定した。プラスミドベクターおよ
びＢ７−１、先にクローン化されたＢ７−１から誘導された遺伝子特異的プライ
マーを、ＤＮＡ配列を得た。ｐＣＲ−平滑プライマーは、１／９７．３６（５’
−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’）；（配列番号４３）および１／
９７．３７（５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’）：（配列番
号４４）である。
【０１６２】 Ｂ７−１遺伝子特異的プライマーは：１２／９６．２２（５’−ＡＡＣＡＣＣ
ＡＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴ−３’）；（配列番号４５）、１／９７．３３
（５’−ＡＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＴＣ−３’）：（配列番
号４６）、１２／９６．２０（５’−ＡＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣ
Ａ−３’）；（配列番号４７）、１２／９６．２１（５’−ＡＴＴＡＧＡＡＡＴ
ＣＣＡＧＴＴＣＡＣＴＧＣＴ−３’）：（配列番号４８）、１／９７．３２（５
’−ＴＣＡＴＧＴＣＴＧＧＣＡＡＡＧＴＡＣＡＡＧ−３’）；（配列番号４９）
、１１／９６．３２（５’ＡＴＴＣＡＣＴＧＡＣＧＴＣＡＣＣＧＡ−３’）：（
配列番号５０）、１１／９６．３１（５’−ＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＡ
−３’）；（配列番号５１）である。２つのクローンが、２つのＤＮＡ点突然変
異を例外として、元のＣＤ８０配列に対応する全長ＣＤ８０配列を含むと決定さ
れた。１つのそのような点突然変異は、アミノ酸配列に影響を及ぼさなかった。
第二の突然変異は、ロイシンからイソロイシンへのアミノ酸変化を生じた。生じ
たネコＣＤ８０クローンは、９１７−１９．８／１６（ＣＤ８０−シントロ／Ｓ
ＰＡＨ）と示された。
【０１６３】 （例２） Ｓ−ＳＰＶ−２２９： Ｓ−ＳＰＶ−２２９は、少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルス
である。Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）のための遺伝子およ
びネコＣＤ８０のための遺伝子を、ＳＰＶゲノム断片ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍの大型
のＢｇｌＩＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの副断片内のＳＰＶ ＡｃｃＩ部位に挿入
した（特徴的なＮｏｔＩ制限部位は、特徴的なＡｃｃＩ制限部位を変換した）。
ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、そしてネ
コＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下に
ある。
【０１６４】 Ｓ−ＳＰＶ−２２９は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（カザ菌株(Kasza Strain)）から
誘導された。これは、「組換えＳＰＶを生成するための相同な組換え手段」で相
同ベクター９３０−２３．Ａ１（「材料および方法」参照）およびウイルスＳ−
ＳＰＶ−００１を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダ
ーゼ（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣＰＲＧアッセイ）を発現する組換えＳＰＶ用のス
クリーン」によってスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−
ＳＰＶ−２２９と表される組換えウイルスについて分析された。「材料および方
法」に記述されるとおり青色プラークアッセイおよび黒色プラークアッセイによ
って監視される複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現
、純度および挿入物安定性について分析した。当初の三回の精製後、観察される
全プラークは、青色であり、それにより、ウイルスが、純粋で、安定で、そして
β−ガラクトシダーゼを発現していることが示された。（米国特許第５，３８２
，４２５号は、参照してここに組込まれる。） 「組換えＳＰＶ中での外来遺伝子発現についての黒色プラークスクリーン」を
使用して、Ｓ−ＳＰＶ−２２９を、β−ガラクトシダーゼ特異的抗原の発現につ
いて分析した。β−ガラクトシダーゼに対するモノクローナル抗体は、Ｓ−ＳＰ
Ｖ−２２９プラークと特異的に反応し、そしてＳ−ＳＰＶ−００１負の対照プラ
ークとは反応しないことが示された。全Ｓ−ＳＰＶ−２２９観察プラークは、β
−ガラクトシダーゼに対するモノクローナル抗体と反応し、それにより、ウイル
スが、β−ガラクトシダーゼ外来遺伝子を安定に発現していることが示された。
ここに記述されるアッセイは、ＥＳＫ−４細胞で行われ、それにより、ＥＳＫ−
４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの産生のための安定な基質であることが示され
た。
【０１６５】 「黒色プラークアッセイを用いた組換えＳＰＶ、ＲＰＶまたはＦＨＶ中のネコ
ＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）発現のためのスクリーン」を
用いて、Ｓ−ＳＰＶ−２２９を、ネコＣＤ８０特異的抗原の発現について分析し
た。ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃキメラ抗体は、Ｓ−ＳＰＶ−２２９プラーク（ネコ
ＣＤ８０を発現する）と特異的に反応し、Ｓ−ＳＰＶ−００１負の対照プラーク
とは反応しないことが示される。全Ｓ−ＳＰＶ−２２９観察プラークは、ヒトＣ
ＴＬＡ−４／Ｆｃキメラ抗体と反応することが示され、それによりウイルスは、
ネコＣＤ８０外来遺伝子を安定に発現していることが示される。
【０１６６】 ネコＣＤ８０遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−２２
９で感染させ、そして感染細胞溶解液のサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動に掛けた。ゲルを、ブロットにかけ、そして「ウエスタン・ブロ
ッティング手段」を用いて分析する。
【０１６７】 Ｓ−ＳＰＶ−２２９は、ネコ科での疾病に対するワクチンとして有用である。
【０１６８】 Ｓ−ＳＰＶ−２２９は、単独で、またはＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰまたは他の
ネコ疾病ワクチンとの組合せで使用されるときに、ＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰま
たは他のネコ疾病に対するワクチンの効力を改善する。Ｓ−ＳＰＶ−２２９は、
ネコＣＤ８０ポリペプチドの発現のために有用でもある。Ｓ−ＳＰＶ−２２９感
染細胞の細胞溶解液を、マウスまたはウサギに注入して、ネコＣＤ８０に対する
ポリクローナルで、単一特異的抗体を生成する。
【０１６９】 （例３） Ｓ−ＳＰＶ−２３０： Ｓ−ＳＰＶ−２３０は、少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルス
である。Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）のための遺伝子、お
よびネコＣＤ２８のための遺伝子を、ＳＰＶゲノム断片ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ（特
徴的ＮｏｔＩ制限部位は、特徴的ＡｃｃＩ制限部位に置換した）の大型のＢｇｌ
ＩＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの副断片内のＳＰＶＡｃｃＩ部位に挿入した。ｌａ
ｃＺ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、そしてネコＣ
Ｄ２８遺伝子は、合成後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある
。
【０１７０】 Ｓ−ＳＰＶ−２３０は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（カザ菌株）から誘導された。こ
れは、「組換えＳＰＶを生成するための相同な組換え手段」で相同ベクター９３
０−２６．Ａ１（「材料および方法」参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１
を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（Ｂｌｕｏ
ｇａｌおよびＣＰＲＧアッセイ）を発現する組換えＳＰＶ用のスクリーン」によ
ってスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−ＳＰＶ−２３０
と表される組換えウイルスについて分析された。「材料および方法」に記述され
るとおり青色プラークアッセイによって監視される複数継代によって、このウイ
ルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度および挿入物安定性について分析した
。当初の三回の精製後、観察される全プラークは、青色であり、それにより、ウ
イルスが、純粋で、安定で、そして外来遺伝子を発現していることが示された。
【０１７１】 「組換えＳＰＶ中での外来遺伝子発現についての黒色プラークスクリーン」を
使用して、Ｓ−ＳＰＶ−２３０を、ネコＣＤ２８特異的抗原の発現について分析
した。ここに記述されるアッセイは、ＥＳＫ−４細胞で行われ、それにより、Ｅ
ＳＫ−４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの産生のための安定な基質であることが
示された。
【０１７２】 ネコＣＤ２８遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−２３
０で感染させ、そして感染細胞溶解液のサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動に掛けた。ゲルを、ブロットにかけ、そして「ウエスタン・ブロ
ッティング手段」を用いて分析する。
【０１７３】 Ｓ−ＳＰＶ−２３０は、ネコ科での疾病に対するワクチンとして有用である。
Ｓ−ＳＰＶ−２３０は、単独で、またはＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰまたは他のネ
コ疾病ワクチンとの組合せで使用されるときに、ＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰまた
は他のネコ疾病に対するワクチンの効力を改善する。Ｓ−ＳＰＶ−２３０は、ネ
コＣＤ２８ポリペプチドの発現のために有用でもある。Ｓ−ＳＰＶ−２３０感染
細胞の細胞溶解液を、マウスまたはウサギに注入して、ネコＣＤ２８に対するポ
リクローナルで、単一特異的抗体を生成する。
【０１７４】 （例４） Ｓ−ＳＰＶ−２２５： Ｓ−ＳＰＶ−２２５は、少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルス
である。Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）のための遺伝子、お
よびネコインターフェロン−γ（ネコＩＦＮ−γ）のための遺伝子を、ＳＰＶゲ
ノム断片ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ（特徴的ＮｏｔＩ制限部位は、特徴的ＡｃｃＩ制限
部位に置換した）の大型のＢｇｌＩＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの副断片内のＳＰ
ＶＡｃｃＩ部位に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は、豚痘０１Ｌプロモーターの制御
下にあり、そしてネコＩＦＮ−γ遺伝子は、合成後期／前期プロモーター（ＬＰ
２ＥＰ２）の制御下にある。
【０１７５】 Ｓ−ＳＰＶ−２２５は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（カザ菌株）から誘導された。こ
れは、「組換えＳＰＶを生成するための相同な組換え手段」で相同ベクター９１
７−６０．Ｂ９（「材料および方法」参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１
を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（Ｂｌｕｏ
ｇａｌおよびＣＰＲＧアッセイ）を発現する組換えＳＰＶ用のスクリーン」によ
ってスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−ＳＰＶ−２２５
と表される組換えウイルスについて分析された。「材料および方法」に記述され
るとおり青色プラークアッセイによって監視される複数継代によって、このウイ
ルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度および挿入物安定性について分析した
。当初の三回の精製後、観察される全プラークは、青色であり、それにより、ウ
イルスが、純粋で、安定で、そして外来遺伝子を発現していることが示された。
【０１７６】 「組換えＳＰＶ中での外来遺伝子発現についての黒色プラークスクリーン」を
使用して、Ｓ−ＳＰＶ−２２５を、ネコＩＦＮ−γ特異的抗原の発現について分
析した。ここに記述されるアッセイは、ＥＳＫ−４細胞で行われ、それにより、
ＥＳＫ−４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの産生のための安定な基質であること
が示された。
【０１７７】 ネコＩＦＮ−γ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−２
２５で感染させ、そして感染細胞溶解液のサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動に掛けた。ゲルを、ブロットにかけ、そして「ウエスタン・ブ
ロッティング手段」を用いて分析する。
【０１７８】 「ＶＳＶプラーク減少を用いた組換えＳＰＶ、ＲＰＶまたはＦＨＶから発現さ
れるネコインターフェロン・ガンマ生物活性についてのスクリーン」を用いて、
Ｓ−ＳＰＶ−２２５を、生物活性ネコＩＦＮ−γの発現について分析する。
【０１７９】 Ｓ−ＳＰＶ−２２５は、ネコ科での疾病に対するワクチンとして有用である。
Ｓ−ＳＰＶ−２２５は、単独で、またはＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰまたは他のネ
コ疾病ワクチンとの組合せで使用されるときに、ＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰまた
は他のネコ疾病に対するワクチンの効力を改善する。
【０１８０】 （例５） Ｓ−ＳＰＶ−２００： Ｓ−ＳＰＶ−２００は、３つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ネ
コ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ｇａｇ／プロテアーゼ、およびＦＩＶエンベロー
プ（全長）のための遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａ
ｃＺ）のための遺伝子を、特徴的なＮｏｔＩ制限部位に挿入した（ＮｏｔＩリン
カーは、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片の０１Ｌ ＯＲＦ中の特徴的ＡｃｃＩ
制限部位に挿入した）。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびエンベロープ遺伝子
は、別々であるが同一の合成後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下
にある。ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。
【０１８１】 Ｓ−ＳＰＶ−２００は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（カザ菌株）から誘導された。こ
れは、「組換えＳＰＶを生成するための相同な組換え手段」で相同ベクター９０
４−６３．Ｂ７およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。形質
移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣＰＲＧアッセ
イ）を発現する組換えＳＰＶ用のスクリーン、および酵素的マーカー遺伝子を発
現する組換えヘルペスウイルス用のスクリーン」によってスクリーニングした。
赤色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−ＳＰＶ−１５７と表される組換えウイルス
であった。「材料および方法」に記述されるとおり青色プラークアッセイによっ
て、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現について分析した。黒色プラー
クアッセイでのＦＩＶｇａｇおよびβ−ガラクトシダーゼの検出、およびウエス
タン・ブロットアッセイでのＦＩＶｇａｇおよびエンベロープの検出を介して、
５回継代後の純度および挿入物安定性の分析を行った。
【０１８２】 Ｓ−ＳＰＶ−２００は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＦＩＶエンベロー
プタンパク質を発現し、そしてＦＩＶ感染に対するネコ科でのワクチンとして有
用である組換え豚痘ウイルスである。Ｓ−ＳＰＶ−２００は、ＦＩＶｇａｇ／プ
ロテアーゼおよびＦＩＶエンベロープタンパク質の発現に有用でもある。
【０１８３】 （例６） Ｓ−ＳＰＶ−２３３： Ｓ−ＳＰＶ−２３３は、５つの外来遺伝子：ＦＩＶｇａｇ、ＦＩＶｅｎｖ、ネ
コＣＤ８０、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺおよびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡを発現する
豚痘ウイルスである。全長のネコＣＤ８０遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉ β−ガ
ラクトシダーゼ（ｕｉｄＡ）のための遺伝子を、特徴的なＮｏｔＩ制限部位に挿
入した（ＮｏｔＩリンカーは、６．７ｋｂのＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ断片の
およそ３．２ｋｂ領域（配列番号）の範囲にある特徴的ＡｃｃＩ制限部位に挿入
した）。ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ｇａｇ／プロテアーゼ、およびＦＩＶ
エンベロープ（全長）のための遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダ
ーゼ（ｌａｃＺ）のための遺伝子を、特徴的ＮｏｔＩ制限部位に挿入した（Ｎｏ
ｔＩリンカーを、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片の０１Ｌ ＯＲＦ中の特徴的
ＡｃｃＩ限定部位に挿入した）。ＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期プロモータ
ー（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、そしてｕｉｄＡ遺伝子は、別々で、そして
特徴的な合成前期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。ＦＩＶｇａｇ／プロ
テアーゼ、およびＦＩＶエンベロープは、別々であるが、同一の合成後期／前期
プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下である。ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期プ
ロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。（ＰＣＴ国際出願ＷＯ９６／２２３６３
号は、参照してここに組込まれる。） Ｓ−ＳＰＶ−２３３は、Ｓ−ＳＰＶ−２００（ＦＩＶｇａｇ、ＦＩＶエンベロ
ープおよびＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子を含む）から誘導された。これは、「
組換えＳＰＶを生成するための相同な組換え手段」で相同ベクター９３１−２１
．Ａ１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−２００を利用して達成された。形質移入保存
物を、「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶ用のスクリーン（Ｘ−ｇ
ＬＵＣ、および酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルス用のス
クリーン）」によってスクリーニングした。青色／緑色プラーク精製の最終結果
は、Ｓ−ＳＰＶ−２３３と表される組換えウイルスであった。
【０１８４】 「組換えＳＰＶ中での外来遺伝子発現についての黒色プラークスクリーン」を
使用して、Ｓ−ＳＰＶ−２３３を、ＦＩＶｇａｇ、ＦＩＶｅｎｖおよびネコＣＤ
８０特異的抗原の発現について分析する。ここに記述されるアッセイは、ＥＳＫ
−４細胞で行われ、それにより、ＥＳＫ−４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの産
生のための安定な基質であることが示された。
【０１８５】 「黒色プラークアッセイを用いた組換えＳＰＶ、ＲＰＶまたはＦＨＶ中でのネ
コＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）発現用のスクリーン」を使
用して、Ｓ−ＳＰＶ−２３３を、ネコＣＤ８０特異的抗原の発現について分析す
る。ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃキメラ抗体は、Ｓ−ＳＰＶ−２３３プラーク（ネコ
ＣＤ８０を発現する）に特異的に反応し、Ｓ−ＳＰＶ−００１負の対照プラーク
とは反応しないことが示される。全てのＳ−ＳＰＶ−２３３観察プラークは、ヒ
トＣＴＬＡ−４／Ｆｃキメラ抗体と反応することが示され、それにより、ウイル
スは、ネコＣＤ８０外来遺伝子を安定に発現することが示される。
【０１８６】 ＦＩＶｇａｇ、ＦＩＶｅｎｖ、およびネコＣＤ８０遺伝子産物の発現を確認す
るために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−２３３で感染させ、そして感染細胞溶解液のサ
ンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に掛けた。ゲルを、ブロッ
トにかけ、そして「ウエスタン・ブロッティング手段」を用いて分析する。
【０１８７】 Ｓ−ＳＰＶ−２３３は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＦＩＶエンベロー
プタンパク質を発現し、そしてＦＩＶ感染に対するネコ科でのワクチンとして有
用である組換え豚痘ウイルスである。Ｓ−ＳＰＶ−２３３は、ＦＩＶｇａｇ／プ
ロテアーゼおよびエンベロープタンパク質の発現に有用でもある。
【０１８８】 （例７） Ｓ−ＳＰＶ−２３５： Ｓ−ＳＰＶ−２３５は、５つの外来遺伝子：ＦＩＶｇａｇ、ＦＩＶｅｎｖ、ネ
コＩＮＦ−γ、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺおよびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡを発現す
る豚痘ウイルスである。全長のネコＩＦＮ−γ遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉ β
−ガラクトシダーゼ（ｕｉｄＡ）のための遺伝子を、特徴的なＮｏｔＩ制限部位
に挿入した（ＮｏｔＩリンカーは、６．７ｋｂのＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ断
片のおよそ３．２ｋｂ領域（配列番号）の範囲にある特徴的ＥｃｏＲＩ制限部位
に挿入した）。ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ｇａｇ／プロテアーゼ、および
ＦＩＶエンベロープ（全長）のための遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラク
トシダーゼ（ｌａｃＺ）のための遺伝子を、特徴的ＮｏｔＩ制限部位に挿入した
（ＮｏｔＩリンカーを、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片の０１Ｌ ＯＲＦ中の
特徴的ＡｃｃＩ制限部位に挿入した）。ＩＮＦ−γ遺伝子は、合成後期／前期プ
ロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、そしてｕｉｄＡ遺伝子は、別々で
、そして特徴的な合成前期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。ＦＩＶｇａ
ｇ／プロテアーゼ、およびエンベロープは、別々であるが、同一の合成後期／前
期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下である。ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期
プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。
【０１８９】 Ｓ−ＳＰＶ−２３５は、Ｓ−ＳＰＶ−２００（ＦＩＶｇａｇ、ＦＩＶエンベロ
ープおよびＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子を含む）から誘導された。これは、「
組換えＳＰＶを生成するための相同な組換え手段」で相同ベクター９３１−５５
．Ｂ１２およびウイルスＳ−ＳＰＶ−２００を利用して達成された。形質移入保
存物を、「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶ用のスクリーン（Ｘ−
ｇＬＵＣ、および酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルス用の
スクリーン）」によってスクリーニングした。青色／緑色プラーク精製の最終結
果は、Ｓ−ＳＰＶ−２３５と表される組換えウイルスである。
【０１９０】 「組換えＳＰＶ中での外来遺伝子発現についての黒色プラークスクリーン」を
使用して、Ｓ−ＳＰＶ−２３５を、ＦＩＶｇａｇ、ＦＩＶｅｎｖおよびネコＩＦ
Ｎ−γ特異的抗原の発現について分析する。ここに記述されるアッセイは、ＥＳ
Ｋ−４細胞で行われ、それにより、ＥＳＫ−４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの
産生のための安定な基質であることが示された。
【０１９１】 「ＶＳＶプラーク減少を用いた組換えＳＰＶ、ＲＰＶまたはＦＨＶから発現さ
れるネコインターフェロン・ガンマ生物活性用のスクリーン」を使用して、Ｓ−
ＳＰＶ−２２５を、生物活性ネコＩＮＦ−γの発現について分析する。
【０１９２】 ＦＩＶｇａｇ、ＦＩＶｅｎｖ、およびネコＩＮＦ−γ遺伝子産物の発現を確認
するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−２３５で感染させ、そして感染細胞溶解液の
サンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に掛けた。ゲルを、ブロ
ットにかけ、そして「ウエスタン・ブロッティング手段」を用いて分析する。
【０１９３】 Ｓ−ＳＰＶ−２３５は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＦＩＶエンベロー
プタンパク質を発現し、そしてＦＩＶ感染に対するネコ科でのワクチンとして有
用である組換え豚痘ウイルスである。Ｓ−ＳＰＶ−２３５は、ＦＩＶｇａｇ／プ
ロテアーゼおよびエンベロープタンパク質の発現に有用でもある。
【０１９４】 （例８） Ｓ−ＳＰＶ−２２４： Ｓ−ＳＰＶ−２２４は、３つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ネ
コ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）ｇａｇ／プロテアーゼ、およびＦｅＬＶエンベロ
ープ（全長）についての遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉ（ｌａｃＺ）についての遺伝
子を、ＳＰＶ１８６９ｂｐ部分ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎゲノム断片から由来する欠失
ＳＰＶＩ５Ｌに挿入した。ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成前期ポ
ックスプロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子は
、合成前期ポックスプロモーター（ＥＰ１）の制御下にある。ｌａｃＺ遺伝子は
、構造的後期ＳＰＶ Ｉ５Ｌプロモーターの制御下にある。
【０１９５】 Ｓ−ＳＰＶ−２２４は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（カザ菌株）から誘導された。こ
れは、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶ、ＦＨＶを生成するための相同な組換え手段」で
相同ベクター９２１−６５．Ｂ５およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して
達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ブルーガルおよびＣ
ＰＲＧアッセイ）またはβ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−グルクアッセイズ）を発現
する組換えＲＰＶまたはＳＰＶ ＦＨＶ用のスクリーン」によってスクリーニン
グした。赤色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−ＳＰＶ−２２４と表される組換え
ウイルスであった。このウイルスは、「材料および方法」に記述されるとおり青
色プラーク酸によるβ−ガラクトシダーゼについての酸であった。
【０１９６】 「黒色プラークアッセイを用いた組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶ中での外
来遺伝子発現についてのスクリーン」を使用して、Ｓ−ＳＰＶ−２２４を、ＦＩ
Ｖｇａｇ／プロテアーゼ、ＦｅＬＶｅｎｖおよびβ−ガラクトシダーゼタンパク
質の発現について分析する。ここに記述されるアッセイは、ＳＰＶ組換えワクチ
ンの産生のための安定な基質であるＥＳＫ−４細胞で行われた（１９９８年８月
１４日）。
【０１９７】 ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子産物の発現を確認す
るために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−２２４で感染させ、そして感染細胞溶解液のサ
ンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に掛けた。ゲルを、ブロッ
トにかけ、そして「ウエスタン・ブロッティング手段」を用いて分析する。
【０１９８】 Ｓ−ＳＰＶ−２２４は、ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＦＩＶエンベロ
ープタンパク質を発現し、そしてＦｅＬＶ感染に対するネコ科でのワクチンとし
て有用である組換え豚痘ウイルスである。Ｓ−ＳＰＶ−２２４は、ＦｅＬＶｇａ
ｇ／プロテアーゼおよびエンベロープタンパク質の発現に有用でもある。
【０１９９】 （例９） Ｓ−ＳＰＶ−２４６： Ｓ−ＳＰＶ−２４６は、４つの外来遺伝子：ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ、
ＦｅＬＶｅｎｖ、ネコＣＤ８０、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺおよびＥ．ｃｏｌｉ
ｕｉｄＡを発現する豚痘ウイルスである。全長ネコＣＤ８０遺伝子、およびＥ．
ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｕｉｄＡ）についての遺伝子を、特徴的なＮ
ｏｔＩ制限部位に挿入した（ＮｏｔＩリンカーは、６．７ｋｂのＳＰＶ Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ Ｋ断片のおよそ３．２ｋｂ領域の範囲にある特徴的ＥｃｏＲＩ制限部
位に挿入した）。ＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ
２）の制御下にあり、そしてｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーター
（ＥＰ２）の制御下にある。ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ、ＦｅＬＶエンベロ
ープ（全長）およびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を
、１８６９部分ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎゲノム断片から由来する欠失Ｉ５Ｌ部位に挿
入した。ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成前期ポックスプロモータ
ー（ＥＰ２）の制御下である。ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子は、合成前期ポック
スプロモーター（ＥＰ１）の制御下にある。ｌａｃＺ遺伝子は、構造的後期ポッ
クスプロモーター（Ｉ５Ｌ）の制御下にある。（ＰＣＴ国際出願ＷＯ９６／２２
２６３号は、参照してここに組込まれる。） Ｓ−ＳＰＶは、Ｓ−ＳＰＶ−２２４（ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ、ＦｅＬ
ＶエンベロープおよびＩ５Ｌ欠失した１８６９ｋｂ部分ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片
中のＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子を含む）から誘導された。これは、「組換え
ＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを生成するための相同な組換え手段」で相同ベクタ
ー９３１−２１．Ｂ１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−２２４を利用して達成された
。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ブルーガルおよびＣＰＲＧアッ
セイ）またはβ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ）を発現する組換え
ＲＰＶまたはＳＰＶまたはＦＨＶ用のスクリーン」によってスクリーニングした
。青色／緑色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−ＳＰＶ−２４６と表される組換え
ウイルスである。
【０２００】 「黒色プラークアッセイを用いた組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶ中での外
来遺伝子発現についてのスクリーン」を使用して、Ｓ−ＳＰＶ−２４６を、Ｆｅ
ＬＶｇａｇ／プロテアーゼ、およびＦｅＬＶエンベロープタンパク質の発現につ
いて分析する。ここに記述されるアッセイは、ＥＳＫ−４細胞で行われ、それに
より、ＥＳＫ−４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの産生のための適切な基質であ
ることが示された。
【０２０１】 「黒色プラークアッセイを用いた組換えＳＰＶ、ＲＰＶまたはＦＨＶでのネコ
ＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）発現用のスクリーン」を使用
して、Ｓ−ＳＰＶ−２４６を、ネコＣＤ８０特異的抗原の発現について分析する
。ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃキメラ抗体は、Ｓ−ＳＰＶ−２４６プラーク（ネコＣ
Ｄ８０を発現する）と特異的に反応するが、Ｓ−ＳＰＶ−００１負の対照プラー
クとは反応しないことが示される。全Ｓ−ＳＰＶ−２４６で観察されるプラーク
は、ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｅキメラ抗体と反応することが示され、それによりそ
のウイルスは、ネコＣＤ８０外来遺伝子を安定に発現していることが示される。
【０２０２】 ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ、ＦＩＶエンベロープ、およびネコＣＤ８０遺
伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−２４６で感染させ、そ
して感染細胞溶解液のサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
掛けた。ゲルを、ブロットにかけ、そして「ウエスタン・ブロッティング手段」
を用いて分析する。
【０２０３】 Ｓ−ＳＰＶ−２４６は、ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＦｅＬＶエンベ
ロープタンパク質を発現し、そしてＦｅＬＶ感染に対するネコ科でのワクチンと
して有用である組換え豚痘ウイルスである。Ｓ−ＳＰＶ−２４６は、ＦＩＶｇａ
ｇ／プロテアーゼおよびエンベロープタンパク質の発現に有用でもある。
【０２０４】 （例１０） ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）またはネコ
感染性腹膜炎（ＦＩＰ）に対するワクチンとして有用な組換え豚痘ウイルスの別
の例は： 組換え豚痘ウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ＦＩＶｅｎｖ遺伝子は
、合成前期ポックスプロモーターＥＰＩの制御下にある。ＦＩＶｇａｇ／プロテ
アーゼ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある。Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、豚痘プロモーターＩ５Ｌの制御下にある。ネコＣＤ
８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にあ
る。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の
制御下にある。ＦＩＶエンベロープ遺伝子、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよび
Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、ネコＣＤ８０およびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ
遺伝子挿入から得られる、異なり、そして区別できる非必須ＳＰＶ挿入部位に配
置される。
【０２０５】 組換え豚痘ウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ＦＩＶｅｎｖ遺伝子は
、合成前期ポックスプロモーターＥＰＩの制御下にある。ＦＩＶｇａｇ／プロテ
アーゼ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある。Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、豚痘プロモーターＩ５Ｌの制御下にある。ネコＣＤ
８６遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にあ
る。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の
制御下にある。ＦＩＶエンベロープ遺伝子、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよび
Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、ネコＣＤ８０およびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ
遺伝子挿入から得られる、異なり、そして区別できる非必須ＳＰＶ挿入部位に配
置される。
【０２０６】 組換え豚痘ウイルスは、２つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子は
、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にある。Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある
。このウイルスは、単独で、または他の組換えタンパク質またはワクチンと組合
わせた用途を示す。
【０２０７】 である。
【０２０８】 ＦｅＬＶ疾病の対するワクチンの発現に有用な組換え豚痘ウイルスの別の例は
、ＦＩＶ遺伝子を比較できるＦｅＬＶ特異的遺伝子に変える以外は、上に記述さ
れるものと同じである。
【０２０９】 ポリクローナル抗体産生および精製用のワクチンとして使用するためのタンパ
ク質の産生に有用な組換え豚痘ウイルスの別の例は、 組換え豚痘ウイルスは、１つの外来遺伝子を発現する。膜貫通ドメインを欠く
ネコＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制
御下にある。代替的には、膜貫通ドメインを欠くネコＣＤ８０遺伝子は、カルボ
キシル末端にヒスチジンタグ融合を有して、ニッケルアフィニティーカラムでの
精製を可能にする。
【０２１０】 組換え豚痘ウイルスは、外来遺伝子を発現する。膜貫通ドメインを欠くネコＣ
Ｄ２８遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下に
ある。代替的には、膜貫通ドメインを欠くネコＣＤ２８遺伝子は、カルボキシル
末端にヒスチジンタグ融合を有して、ニッケルアフィニティーカラムでの精製を
可能にする。
【０２１１】 組換え豚痘ウイルスは、１つの外来遺伝子を発現する。膜貫通ドメインを欠く
ネコＣＤ８６遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制
御下にある。代替的には、膜貫通ドメインを欠くネコＣＤ８６遺伝子は、カルボ
キシル末端にヒスチジンタグ融合を有して、ニッケルアフィニティーカラムでの
精製を可能にする。
【０２１２】 である。
【０２１３】 ＣＤ８０およびＣＤ８６の両方を利用し、そしてネコ科でのＦＩＶおよびＦｅ
ＬＶ疾病のためのワクチン開発に有用な組換え豚痘ウイルスの別の例は、 組換え豚痘ウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子お
よびＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ１の制御下で
、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の
転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含ま
れる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２
の制御下にある。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、豚痘プロモーター０Ｉ
Ｌの制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期ポックスプロモ
ーターＬＰ１の制御下にある。ネコＣＤ８０／ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌｉ ｕ
ｉｄＡ遺伝子は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺
伝子挿入から得られる、異なっており、そして区別できる非必須ＳＰＶ挿入部位
に含まれる。
【０２１４】 組換え豚痘ウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子お
よびＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ１の制御下で
、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の
転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含ま
れる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１
の制御下にある。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、合成前期ポックス・アンダープ
ロモーターＥＰ１の制御下にある。
【０２１５】 Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の制
御下にある。ＣＤ８０／ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、ＦＩ
Ｖｇａｇ／プロテアーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子挿入から得られる
、異なっており、そして区別できる非必須ＳＰＶ挿入部位に含まれる。
【０２１６】 組換え豚痘ウイルスは、６つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子お
よびＣＤ８０遺伝子は、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の制御下で、ビシ
ストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が
起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。
Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御
下にある。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成前期ポックスプロモータ
ーＥＰ２の制御下にある。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、合成前期ポックスプロ
モーターＥＰ１の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、構造的１５
Ｌポックスプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０／ＣＤ８６、およびＥ．ｃｏ
ｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、ＦＩＶエンベロープの挿入、ＦＩＶｇａｇ／プロテア
ーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子挿入と異なった部位に挿入される。
【０２１７】 である。
【０２１８】 ネコ科でのＦｅＬＶワクチン用途の別の組換え豚痘ウイルスは、上に記述され
るとおり構築され、それにより、ＦＩＶ遺伝子を比較できるＦｅＬＶ遺伝子構築
物に変える。
【０２１９】 （例１１） ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、またはネ
コ感染性腹膜炎（ＦＩＰ）に対するワクチンとして有用な組換えアライグマ痘ウ
イルスの別の例は： 組換えアライグマ痘ウイルスは、２つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８０
は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にある。Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、後期ポックスプロモーターＬ１の制御下にある。
【０２２０】 ワクチンとして使用するための、またはポリクローナル抗体産生および精製の
ためのタンパク質の産生に有用な組換えアライグマ痘ウイルスの別の例。
【０２２１】 組換えアライグマ痘ウイルスは、１つの外来遺伝子を発現する。膜貫通ドメイ
ンを欠くネコＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２Ｅ
Ｐ２の制御下にある。代替的には、膜貫通ドメインを欠くネコＣＤ８０遺伝子は
、カルボキシル末端にヒスチジンタグ融合を有して、ニッケルアフィニティーカ
ラム上で精製させる。
【０２２２】 組換えアライグマ痘ウイルスは、１つの外来遺伝子を発現する。膜貫通ドメイ
ンを欠くネコＣＤ２８遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２Ｅ
Ｐ２の制御下にある。代替的には、膜貫通ドメインを欠くネコＣＤ２８遺伝子は
、カルボキシル末端にヒスチジンタグ融合を有して、ニッケルアフィニティーカ
ラム上で精製させる。
【０２２３】 組換えアライグマ痘ウイルスは、１つの外来遺伝子を発現する。膜貫通ドメイ
ンを欠くネコＣＤ８６遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２Ｅ
Ｐ２の制御下にある。代替的には、膜貫通ドメインを欠くネコＣＤ８６遺伝子は
、カルボキシル末端にヒスチジンタグ融合を有して、ニッケルアフィニティーカ
ラム上で精製させる。
【０２２４】 組換えアライグマ痘ウイルスは、４つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６
遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２Ｅ
Ｐ２の制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０お
よびＣＤ８６の転写が起動され、そして第二の下流遺伝子ＣＤ８０の翻訳を起動
する２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。ＦＩＶｇａｇ
遺伝子は、豚痘プロモーター０ＩＬの制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺
伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥ２の制御下にある。
【０２２５】 組換えアライグマ痘ウイルスは、４つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６
遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２Ｅ
Ｐ２の制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０お
よびＣＤ８６の転写が起動され、そして第二の下流遺伝子ＣＤ８０の翻訳を起動
する２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。ＦＩＶエンベ
ロープ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥ１の制御下にある。Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある
。
【０２２６】 組換えアライグマ痘ウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６
遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２Ｅ
Ｐ２の制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０お
よびＣＤ８６の転写が起動され、そして第二の下流遺伝子ＣＤ８０の翻訳を起動
する２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。ＦＩＶｇａｇ
遺伝子は、豚痘プロモーター０ＩＬの制御下にある。ＦＩＶエンベロープ遺伝子
は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ１の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉ
ｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある。
【０２２７】 である。
【０２２８】 ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）またはネ
コ感染性腹膜炎（ＦＩＰ）のようなネコ疾病に対するワクチンとして有用な組換
えアライグマ痘ウイルスの別の例は、 組換えアライグマ痘ウイルスは、２つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６
遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にある。
Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の制御
下にある である。
【０２２９】 ＣＤ８０およびＣＤ８６の両方を利用し、ネコ科におけるＦＩＶおよびＦｅＬ
Ｖ疾病のためのワクチン開発に有用である、組換えアライグマ痘ウイルスの別の
例は、 組換えアライグマ痘ウイルスは、４つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６
遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の制御下
で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６
の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含
まれる。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモ
ーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前
期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子
は、合成前期ポックスプロモーターＬＰ２の制御下にある。ＣＤ８０／ＣＤ８６
、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、全て、単独の非必須ＲＰＶ部位に挿入
される。
【０２３０】 組換えアライグマ痘ウイルスは、４つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６
遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２の
制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣ
Ｄ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要
素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、合成前期ポックスプロモータ
ーＥ１の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプ
ロモーターＥ２の制御下にある。ＣＤ８０／ＣＤ８６、ＦＩＶエンベロープおよ
びｕｉｄＡ遺伝子は、全て、単独の非必須ＲＰＶ部位に挿入される。
【０２３１】 組換えアライグマ痘ウイルスは、６つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６
遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の制御下
で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６
の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶＩＲＩＳ要素が含ま
れる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期ポックスプロモーターの制御
下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥ
２の制御下にある。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成前期プロモータ
ーＥＰ２の制御下にある。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、合成前期ポックスプロ
モーターＥＰ２の制御下にある。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、合成前期ポック
スプロモーターＥＰＩの制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、Ｅ．
ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子の制御下にあり、ＦＩＶエンベロープの挿入、ＦＩＶ
ｇａｇ／プロテアーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子挿入から異なる部位
に挿入される。
【０２３２】 である。
【０２３３】 ネコ科についてのＦｅＬＶワクチンとして使用するための別のアライグマ痘組
換えウイルスは、上に記述されるとおり構築され、それによりＦＩＶ遺伝子を比
較に値するＦｅＬＶ遺伝子に置換される。
【０２３４】 （例１２） Ｓ−ＦＨＶ−０２０： Ｓ−ＦＨＶ−０２０は、全ＦＨＶｇＥ遺伝子（１６３８塩基対）の欠失を示す
組換えネコヘルペスウイルスである。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子の挿入は、
ｇＥ部位を欠失させる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、構造的ＦＨＶｇＥプ
ロモーターの転写制御下にある。
【０２３５】 Ｓ−ＳＰＶ−０２０は、Ｓ−ＦＨＶ−００１（ＮＶＳＬ菌株）から誘導された
。これは、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを生成するための相同な組換え
手段」で相同ベクター４８６−８８．Ｂ１７およびウイルスＳ−ＦＨＶ−００１
を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ブルーガ
ルおよびＣＰＲＧアッセイ）またはβ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセ
イ）を発現する組換えＲＰＶまたはＳＰＶまたはＦＨＶ用のスクリーン」によっ
てスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−ＦＪＶ−０２０と
表される組換えウイルスであった。純度の分析、および５継代後の挿入安定性を
、「黒色プラークアッセイを用いた組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶ中での外
来遺伝子発現用のスクリーン」中でのβ−ガラクトシダーゼの検出を介して行っ
た。
【０２３６】 （例１３） Ｓ−ＦＨＶ−０３１： Ｓ−ＦＨＶ−０３１は、全１６３８塩基対ＦＨＶｇＥ遺伝子の欠失を示し、そ
してｇＥ欠失部位に３つの外来遺伝子の挿入を示す組換えネコヘルペスウイルス
である。ＣＤ８０遺伝子は、構造的ＦＨＶｇＥプロモーターの転写制御下にあり
、欠失ｇＥ遺伝子として同じ方向に向けられる。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺
伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にあり、ＦＩＶエンベロープ遺伝子
は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。ｇａｇ／プロテ
アーゼおよびエンベロープ遺伝子は、互いに関して同じ方向に向けられるが、し
かしＣＤ８０遺伝子に対する配向で対峙する。
【０２３７】 Ｓ−ＦＨＶ−０３１は、Ｓ−ＦＨＶ−０２０（ｇＥプロモーターの後ろにＥ．
ｃｏｌｉ ＬａｃＺ遺伝子を含む）から誘導される。これは、「相同な組換えＲ
ＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶ」で相同ベクター９４２−０３．Ｘ６（「材料および
方法」参照）およびウイルスＳ−ＦＨＶ−０２０を利用して達成される。形質移
入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ブルーガルおよびＣＰＲＧアッセイ）ま
たはβ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ）を発現する組換えＲＰＶま
たはＳＰＶまたはＦＨＶ発現用のスクリーン」によってスクリーニングする。組
換えプラークを選択し、そして白色プラーク選択によって精製する。このウイル
スは、制限エンドヌクレアーゼマッピングおよび「サザンブロッティングＤＮＡ
」手段によって特徴付けられる。この分析では、ネコＣＤ８０、ＦＩＶ／プロテ
アーゼおよびＦＩＶエンベロープ遺伝子の挿入、および１６３８塩基対のＦＩＶ
ｇＥ遺伝子の欠失を確認される。（ＰＣＴ国際出願ＷＯ９６／１３５７５は、参
照してここに組込まれる）。
【０２３８】 「ウエスタンブロッティング手段」を用いて、本実施例でのＳ−ＦＨＶ−０３
１を、ネコＣＤ８０、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＦＩＶエンベロープ特
異的抗原の発現について分析する。ここに記述されるアッセイは、ＣＲＦＫ細胞
中で行われ、それにより、ＣＲＦＫ細胞が、ＦＨＶ組換えワクチンの産生に適切
な基質であることが示された。組換えネコヘルペスウイルスに感染した細胞から
得られる溶解液は、ネコＣＤ８０タンパク質の予測サイズでハンドを示した。
【０２３９】 「黒色プラークアッセイを用いた組換えＳＰＶ、ＲＰＶまたはＦＨＶ中でのネ
コＣＤ８０（ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）発現用のスクリーン」を用
いて、本実施例でのＳ−ＦＨＶ−０３１ｉｎを、ネコＣＤ８０特異的抗原の発現
について分析する。ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃキメラ抗体は、組換えネコ・ヘルペ
スウイルス・プラーク（ネコＣＤ８０を発現する）と特異的に反応するが、ＳＦ
ＨＶ−００１負の対照プラークとは反応しないことが示された。全組換えネコ・
ヘルペスウイルス観察プラークは、ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃキメラ抗体と作用す
ることが示され、それによりウイルスは、ネコＣＤ８０外来遺伝子を安定に発現
することが示される。
【０２４０】 Ｓ−ＦＨＶ−０３１は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼを発現する組換えネコ・
ヘルペスウイルスである。ＦＩＶエンベロープおよびネコＣＤ８０タンパク質は
、ＦＩＶ感染に対するネコ科におけるワクチンとして有用である。
【０２４１】 （例１４） 組換えネコ・ヘルペスウイルスは、ｇＥ遺伝子の欠失、およびｇＥ欠失部位での
少なくとも１つの外来遺伝子の挿入を示す。外来遺伝子は、ネコＣＤ８６遺伝子
であり、そしてＦＨＶｇＥプロモーターの転写制御下にある。
【０２４２】 ネコＣＤ８６を発現する組換えネコ・ヘルペスウイルスは、ネコ科における疾
病に対するワクチンとして有用である。組換えネコヘルペスウイルスは、単独で
、またはＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰまたは他のネコワクチンとの組合せで使用さ
れるときに、ＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰまたは他のネコ疾病に対するワクチンの
効力を改善する。
【０２４３】 （例１５） ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）またはネコ
感染性腹膜炎（ＦＩＰ）に対するワクチンとして有用な組換えネコ・ヘルペスウ
イルスの別の例は、 組換えネコ・ヘルペスウイルスは、ＦＨＶ ｇＥ欠失部位で３つの外来遺伝子
を発現する。ＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にあ
る。ＦＩＶｇａｇ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下
にある。ネコＣＤ８０遺伝子は、ネコ・ヘルペスウイルスｇＥプロモーターの制
御下にある。組換えネコ・ヘルペスウイルスは、ＦＨＶｇＥ欠失部位で３つの外
来遺伝子を発現する。ＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制
御下にある。ＦＩＶｇａｇ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーター
の制御下にある。ネコＣＤ８６遺伝子は、ネコ・ヘルペスウイルスｇＥプロモー
ターの制御下にある。組換えネコ・ヘルペスウイルスは、ＦＨＶｇＥ欠失部位で
３つの外来遺伝子を発現する。ＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモー
ターの制御下にある。ＦＩＶｇａｇ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロ
モーターの制御下にある。ネコＣＤ８６遺伝子は、ネコ・ヘルペスウイルスｇＥ
プロモーターの制御下にある。
【０２４４】 組換えネコ・ヘルペスウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８
６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモ
ーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０
およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ Ｉ
ＲＥＳ要素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウ
イルスｇｌプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌ
ｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、非必須であると決定された部位中のＦＨＶゲノムの特徴
的な長い領域に挿入される。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、サイトメガ
ロウイルス即時型プロモーターの制御下にあり、そして偽狂犬病ｇＸプロモータ
ーの制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ ＬａｃＺ遺伝子は、ＦＨＶｇＥ欠失部位に向け
られる。
【０２４５】 組換えネコ・ヘルペスウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８
６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモ
ーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０
およびＣＤ８６の転写が起動される。第二の下流ＣＤ８０開放読取枠の翻訳は、
ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感
染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０、ＣＤ８６
およびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、非必須であると決定された部位中のＦ
ＨＶゲノムの特徴的な長い領域に挿入される。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、サ
イトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にあり、そして偽狂犬病ｇＸプ
ロモーターの制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、ＦＨＶｇＥ欠失部
位に向けられる。
【０２４６】 組換えネコ・ヘルペスウイルスは、６つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８
６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモ
ーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０
およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ Ｉ
ＲＥＳ要素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウ
イルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌ
ｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、非必須部位中のＦＨＶゲノムの特徴的な長い試薬(reage
nt)に挿入される。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型
プロモーターの制御下にある。狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にあるＦＩＶｇ
ａｇ／プロテアーゼ遺伝子、およびＦＨＶｇＥプロモーターの制御下にあるＥ．
ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、ＦＨＶｇＥ欠失部位に向けられる。
【０２４７】 組換えネコ・ヘルペスウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８
６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモ
ーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０
およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ Ｉ
ＲＥＳ要素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウ
イルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌ
ｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、非必須部位中のＦＨＶゲノムの特徴的な長い領域に挿入
される。サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にあるＦＩＶｇａｇ
／プロテアーゼ遺伝子、および狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にあるＥ．ｃｏ
ｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、ＦＨＶｇＥ欠失部位に挿入される。
【０２４８】 組換えネコ・ヘルペスウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８
６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモ
ーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０
およびＣＤ８６の転写が起動さる。第二の下流ＣＤ８０開放読取枠の翻訳は、Ｅ
ＭＣＶ ＩＲＥＳ要素の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感染
性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０、ＣＤ８６お
よびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、非必須部位中のＦＨＶゲノムの特徴的な
長い領域に挿入される。サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にあ
るＦｅＬＶエンベロープ遺伝子、および狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある
Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、ＦＨＶｇＥ欠失部位に挿入される。
【０２４９】 組換えネコ・ヘルペスウイルスは、６つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８
６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモ
ーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０
およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ Ｉ
ＲＥＳ要素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウ
イルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌ
ｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、非必須部位中のＦＨＶゲノムの特徴的な長い領域に挿入
される。サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にあるＦＩＶエンベ
ロープ遺伝子、狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にあるＦｅＬＶ／プロテアーゼ
遺伝子、およびＦＨＶｇＥプロモーターの制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ
遺伝子は、ＦＨＶｇＥ欠失部位に挿入される。
【０２５０】 である。
【０２５１】 （例１７） 組換えネコ・ヘルペスウイルスは、ｇＥ欠失部位にｇＥ遺伝子の欠失、および少
なくとも１つの外来遺伝子の挿入を示す。外来遺伝子は、ネコＣＤ８０遺伝子で
あり、そしてＦＨＶｇＥプロモーターの転写制御下にある： 組換えネコ・ヘルペスウイルスは、ＦＨＶ−００１から誘導される。これは、
「組換えヘルペスウイルスを生成するための相同な組換え手段」で相同ベクター
９２６−７６．Ｄ７（「材料および方法」参照）およびウイルスＳ−ＦＨＶ−０
０１を利用して達成される。形質移入保存物を、「酵素的マーカー遺伝子を発現
する組換えヘルペスウイルス用のスクリーン」によってスクリーニングする。こ
のウイルスは、制限エンドヌクレアーゼマッピングおよび「サザンブロッティン
グＤＮＡ」手段によって特徴付けられる。この分析では、ネコＣＤ８０の挿入、
および１６８３塩基対のＦＨＶｇＥ遺伝子の欠失を確認される。（ＰＣＴ国際出
願ＷＯ９６／１３５７５は、参照してここに組込まれる）。
【０２５２】 「組換えＦＨＶ中の外来遺伝子発現用の黒色プラークスクリーン」を用いて、
本実施例での組換えネコ・ヘルペスウイルスを、ネコＣＤ８０特異的抗原の発現
について分析する。ここに記述されるアッセイは、ＣＲＦＫ細胞で行われ、それ
によりＣＲＦＫ細胞は、ＲＰＶ組換えワクチンの産生に適切な基質であることが
示された。
【０２５３】 「黒色プラークアッセイを用いた組換えＳＰＶ、ＲＰＶまたはＦＨＶでのネコ
ＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）発現用のスクリーン」を使用
して、本実施例での組換えネコ・ヘルペスウイルスを、ネコＣＤ８０特異的抗原
の発現について分析する。ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃキメラ抗体は、組換えネコ・
ヘルペスウイルス・プラーク（ネコＣＤ８０を発現する）と特異的に反応するが
、Ｓ−ＦＨＶ−００１負の対照プラークとは反応しないことが示される。全組換
えネコ・ヘルペスウイルスで観察されるプラークは、ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｅキ
メラ抗体と反応することが示され、それによりそのウイルスは、ネコＣＤ８０外
来遺伝子を安定に発現していることが示される。
【０２５４】 である。
【０２５５】 ネコＣＤ８０遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、本実施例の組換え
ネコ・ヘルペスウイルスで感染させ、そして感染細胞溶解液のサンプルを、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に掛けた。ゲルを、ブロットにかけ、そし
て「ウエスタン・ブロッティング手段」を用いて分析する。組換えネコ・ヘルペ
スウイルスで感染した細胞からえられる溶解液は、のネコＣＤ８０タンパク質の
予想されるサイズでバンドを示した。
【０２５６】 （例１８） 組換えネコヘルペスウイルスは、ｇＥ遺伝子の欠失、およびｇＥ欠失部位に少な
くとも１つの外来遺伝子の挿入を示す。外来遺伝子は、ネコＣＤ８０遺伝子であ
り、そしてＦＨＶｇＥプロモーターの転写制御下にある： ネコＣＤ８６を発現する組換えネコ・ヘルペスウイルスは、ネコ科での疾病に
対するワクチンとして有用である。組換えネコ・ヘルペスウイルスは、単独で、
またはＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰまたは他のネコワクチンと組合わせて使用され
る場合、ＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰまたは他のネコ疾病に対するワクチンの効力
を改善する。
【０２５７】 （例１９） ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）またはネコ
感染性腹膜炎（ＦＩＰ）に対するワクチンとして有用な組換えネコ・ヘルペスウ
イルスの別の例は： 組換えネコ・ヘルペスウイルスは、３つの外来遺伝子を発現する。ＦＩＶｅｎ
ｖ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある。ＦＩＶｇａｇ遺伝子は
、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。ネコＣＤ８０遺伝
子は、ネコ・ヘルペスウイルスｇＥプロモーターの制御下にある。
【０２５８】 組換えネコ・ヘルペスウイルスは、３つの外来遺伝子を発現する。ＦｅＬＶｅ
ｎｖ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある。ＦｅＬＶｇａｇ遺伝
子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。ネコＣＤ８０
遺伝子は、ネコ・ヘルペスウイルスｇＥプロモーターの制御下にある。
【０２５９】 組換えネコ・ヘルペスウイルスは、３つの外来遺伝子を発現する。ＦＩＶｅｎ
ｖ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある。ＦＩＶｇａｇ遺伝子は
、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。ネコＣＤ８６遺伝
子は、ネコ・ヘルペスウイルスｇＥプロモーターの制御下にある。
【０２６０】 組換えネコ・ヘルペスウイルスは、３つの外来遺伝子を発現する。ＦｅＬＶｅ
ｎｖ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある。ＦｅＬＶｇａｇ遺伝
子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。ネコＣＤ８６
遺伝子は、ネコ・ヘルペスウイルスｇＥプロモーターの制御下にある。
【０２６１】 組換えネコ・ヘルペスウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８
６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモ
ーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０
およびＣＤ８６の転写が起動され、そして第二の下流遺伝子ＣＤ８０の起動する
２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕ
ｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇｌプロモーターの制御下にある。
ＦＩＶｇａｇ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にあ
る。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にあ
る。５つの外来遺伝子は、２つの別々のネコ・ヘルペスウイルス挿入部位に含ま
れる。
【０２６２】 組換えネコ・ヘルペスウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８
６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモ
ーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０
およびＣＤ８６の転写が起動さる。第二の下流遺伝子ＣＤ８０の開放読取枠の翻
訳は、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子
は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇｌプロモーターの制御下にある。ＦＩＶエンベ
ロープ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。Ｅ
．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある。ネ
コＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポック
スプロモーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それにより
ＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間のＥＭ
ＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれ、第二の下流遺伝子ＣＤ８０の翻訳が起動される。
Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーター
の制御下にある。ＦＩＶｇａｇ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモー
ターの制御下にある。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時
型プロモーターの制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、偽狂犬病ｇ
Ｘプロモーターの制御下にある。
【０２６３】 組換えネコ・ヘルペスウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８
６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモ
ーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０
およびＣＤ８６の転写が起動され、そして第二の下流遺伝子ＣＤ８０の翻訳を起
動する２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下に
ある。ＦＩＶｇａｇ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御
下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御
下にある。５つの外来遺伝子は、２つの異なるネコ・ヘルペスウイルス挿入部位
に含まれる。
【０２６４】 組換えネコ・ヘルペスウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８
６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモ
ーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０
およびＣＤ８６の転写が起動される。第二の下流ＣＤ８０開放読取枠の翻訳は、
ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感
染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＦｅＬＶエンベロー
プ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある。
【０２６５】 組換えネコ・ヘルペスウイルスは、６つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８
６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモ
ーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０
およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ Ｉ
ＲＥＳ要素が含まれ、第二の下流遺伝子の翻訳が起動される。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕ
ｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。
ＦｅＬＶｇａｇ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下に
ある。ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモータ
ーの制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、狂犬病ｇＸプロモーター
の制御下にある。
【０２６６】 である。
【０２６７】 （例２０） ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）−ＴＡＭＵ、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、ＣＤ２８、ＣＴ
ＬＡ−４およびＣＤ８０（Ｂ７−１）−シントロ／ＳＰＡＨｃＤＮＡおよびポリ
ペプチドの特徴付け： およそ９４１ヌクレオチドの単離および精製されたネコＣＤ８０（Ｂ７−１）
ｃＤＮＡは、およそ２９２アミノ酸のネコＣＤ８０ポリペプチドの開放読取枠を
コードし、その生来の膜結合形態または成熟形態は、約３３，４８５ｋＤａの分
子量、約９．１の等電点、１０．２４のｐＨ７・０での総荷電を示す。膜貫通ド
メインのタンパク質は、アミノ酸およそ２４１から２７１である。
【０２６８】 ネコＣＤ８０−ＴＡＭＵおよびＣＤ８０−シントロ／ＳＰＡＨは、２つの異な
る源から独立して単離されるｃＤＮＡおよびポリペプチドであり、そしてＤＮＡ
およびアミノ酸配列は、わずかに異なる。ＣＤ８０−ＴＡＭＵ ｍＲＮＡの源は
、ＣｏｎＡで刺激されるネコ末梢血単核細胞であり、そしてＣＤ８０−シントロ
／ＳＰＡＨ、ＲＮＡの源は、ＣｏｎＡで刺激されるネコ脾臓細胞であった。ＣＤ
８０−ＴＡＭＵおよびＣＤ８０（Ｂ７−１）−シントロ／ＳＰＡＨの間のｃＤＮ
Ａ配列における差異は、ヌクレオチド３５１でＴからＣ、そしてヌクレオチド６
７０でＣからＡである。アミノ酸配列で、ヌクレオチド３５１での変化は、サイ
レントであり、そしてヌクレオチド６７０での変化は、アミノ酸残基２２４での
中性アミノ酸ロイシンからイソロイシンへの保存的変化を生じる。
【０２６９】 およそ１１７６ヌクレオチドの単離および精製されたネコＣＤ８６（Ｂ７−２
）ｃＤＮＡは、およそ３２０アミノ酸のネコＣＤ８６ポリペプチドの開放読取枠
をコードし、その生来の膜結合形態または成熟形態は、約３６，３９４ｋＤａの
分子量、約９．１９の等電点、１１．２７のｐＨ７・０での総荷電を示す。
【０２７０】 およそ６８９ヌクレオチドの単離および精製されたネコＣＤ２８ｃＤＮＡは、
およそ２２１アミノ酸のネコＣＤ２８ポリペプチドの開放読取枠をコードし、そ
の生来の膜結合形態または成熟形態は、約２５，３１９ｋＤａの分子量、約９．
１７の等電点、９．５８のｐＨ７・０での総荷電を示す。
【０２７１】 およそ７４９ヌクレオチドの単離および精製されたネコＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡ
は、およそ２２３アミノ酸のネコＣＴＬＡ−４ポリペプチドの開放読取枠をコー
ドし、その生来の膜結合形態または成熟形態は、約２４，３８１ｋＤａの分子量
、約６．３４の等電点、−０．９９のｐＨ７・０での総荷電を示す。
【０２７２】 同時刺激分子ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４との、および腫瘍抗原または病原体
生物から得られる抗原とのＣＤ８０の同時発現は、Ｔリンパ球、いっそう特には
１型リンパ球の活性化を活性または増強し、そして他の型の成長を促進する能力
を示す。同時刺激分子ＣＴＬＡ−４との、および腫瘍抗原または病原体生物から
得られる抗原とのＣＤ８０の同時発現は、Ｔリンパ球、いっそう特には１型リン
パ球の活性化を活性または増強する能力を示す。同時刺激分子ＣＤ２８またはＣ
ＴＬＡ−４との、および腫瘍抗原または病原体生物から得られる抗原とのＣＤ８
６の同時発現は、Ｔリンパ球、いっそう特には１型リンパ球の活性化を活性また
は増強し、そして他の細胞型の成長を促進する能力を示す。同時刺激分子ＣＴＬ
Ａ−４との、ＣＤ８６の同時発現は、Ｔリンパ球、いっそう特には１型リンパ球
の活性化を抑制する能力を示す。
【０２７３】
【表１】 （例２１） ワクチンでのネコＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、ＣＤ２８、お
よびＣＴＬＡ−４の使用法： 以下の実験は、ネコワクチンでのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、および
ＣＴＬＡ−４免疫増強活性を評価するために行われる。
【０２７４】 ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４は、ネコ科での組換
えタンパク質の発現に有用な組換えウイルス性ベクター（ネコ・ヘルペスウイル
ス、豚痘ウイルス、またはアライグマ痘ウイルスから誘導される）に挿入される
（ＰＣＴ国際出願ＷＯ９６／２２３６３またはＷＯ９６／１３５７５参照）。全
４つの免疫増強分子を発現するか、または選択的にはＣＤ８０とＣＤ２８、また
はＣＤ８０とＣＴＬＡ−４、またはＣＤ８６とＣＤ２８、またはＣＤ８６とＣＴ
ＬＡ−４の対方法の組合せを発現する組換えウイルス性ベクターは、８週齢にあ
るネコに、経口で、または筋肉内に、０．１から１０．０ｍｇまでの投与範囲で
、またはおよそ１０４から１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）の投与量で、また
は好ましくはおよそ１０６ｐｆｕの投与量で投与される。ＦＩＶまたはＦｅＬＶ
についてのサブ単位ワクチン、またはＦＩＶまたはＦｅＬＶ（上記参照）につい
てのウイルス性ベクターのワクチンを、最小保護容量で、免疫増強ネコＣＤ８０
、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４ベクターワクチンと同時に投与する
。３から４週後、そのネコに、第二の用量のワクチンを付与した。ネコに、ＵＳ
ＤＡ標準誘発用量レベルで、毒性ＦＩＶ菌株（ＰＰＲまたはペタルマ(Petalum)
）またはＦｅＬＶリチャード菌株（ネコを免疫抑制するためにメチルプレドニソ
ロンを投与する）を誘発させ、そしてウイルス血症の発生について１２週間常に
観察する。ワクチン接種したネコの１群を、ＦｅＬＶによって引起された腫瘍の
発生について１２ヶ月間まで観察する。ネコにおける疾病の発生を、ワクチンを
受けない対照、または免疫増強分子なしのＦＩＶまたはＦｅＬＶワクチンと比較
する。発生実験の結果は、ワクチンを受けていないで、そしてその後、ＦｅＬＶ
またはＦＩＶを発生させるネコでは、６０％以上が、頑固なウイルス血症を発生
する。サブユニットＦＩＶまたはＦｅＬＶワクチンでワクチン接種され、そして
その後誘発されたネコは、７５％、ウイルス血症から保護される。サブユニット
ＦＩＶまたはＦｅＬＶワクチン、および免疫増強ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ
２８、およびＣＴＬＡ−４ベクター化ワクチンの組合せを受け、そしてその後誘
発されたネコは、１００％、ウイルス血症から保護される。ネコＣＤ８０、ＣＤ
８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４ベクター化ワクチンを加える別の有益な態
様は、ウイルス血症および／または腫瘍形成に対して１００％保護がある。長期
間の免疫性（１年以上）；免疫性の早期発症；または２回投与ではなく単回投与
一次ワクチン接種が、現在、全ての製造業者に要求されている。ウイルス性ベク
ター化ＦＩＶまたはＦｅＬＶワクチンでワクチン接種されたネコは、サブユニッ
トＦＩＶまたはＦｅＬＶワクチンでワクチン接種したネコより明らかに高いレベ
ルで、誘発から保護される。ウイルス性ベクター化ＦＩＶまたはＦｅＬＶワクチ
ン、および免疫増強ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４ベ
クター化ワクチンの組合せを受け、そしてその後誘発させたネコでは、１００％
が、ウイルス血症から保護される。ウイルス性ベクター化ＦＩＶまたはＦｅＬＶ
ワクチン、および免疫増強ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ
−４ベクター化ワクチンの組合せでワクチン接種たネコも、上に記述される別の
有益な態様を受ける。
【０２７５】 選択的手段では、８週齢にあるネコに、ＦＩＶｅｎｖとｇａｇ、またはＦｅＬ
ＶｅｎｖとｇａｇについてのｃＤＮＡを含むプラスミドとの混合で、ネコＣＤ８
０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４分子についてのｃＤＮＡを含む１
００μｇのプラスミドを、筋肉内に注入するか、または代替的には、ＦＩＶｅｎ
ｖとｇａｇ、またはＦｅＬＶｅｎｖとｇａｇについてのｃＤＮＡを含むプラスミ
ドとの混合で、ＣＤ８０とＣＤ２８、またはＣＤ８０とＣＴＬＡ−４、またはＣ
Ｄ２８またはＣＴＬＡ−４と対にしたＣＤ８６とＣＤ２８またはＣＤ８６とＣＴ
ＬＡ−４の対の組合せを発現するｃＤＮＡを含む１００μｇのプラスミドを筋肉
内に注入する。対照ネコは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−
４を受けない。ネコに、有毒なＦｅＬＶまたはＦＩＶを誘発させ、そして上に記
述されるとおり疾病の徴候について観察する。誘発実験の結果は、ネコＣＤ８０
、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４を含むｃＤＮＡベクター、およびＦ
ＩＶ遺伝子またはＦｅＬＶ遺伝子を含むｃＤＮＡベクターを受けるネコが、疾病
から７５％保護を示すＦＩＶ遺伝子またはＦｅＬＶ遺伝子を含むｃＤＮＡベクタ
ーのみを受けるネコと比較して、疾病から１００％保護を示すことである。
【０２７６】 選択的手段では、８週齢にあるネコに、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、
およびＣＴＬＡ−４分子についての０．１から１００ｍｇの精製タンパク質を、
または代替的には、上に記述される組換えｃＤＮＡベクターから得られる、ＣＤ
８０またはＣＤ８６の対の組合せで筋肉内に注入し、そしてＦＩＶｅｎｖとｇａ
ｇ、またはＦｅＬＶｅｎｖとｇａｇを含むサブユニットワクチン０．１から１０
０ｍｇを筋肉内に注入する。対照ネコは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およ
びＣＴＬＡ−４を受けない。ネコに、有毒なＦＩＶ菌株またはＦｅＬＶ菌株を誘
発させ、そして疾病の徴候について常に観察する。誘発実験の結果は、ネコＣＤ
８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４についての精製タンパク質、お
よびＦＩＶまたはＦｅＬＶを含むサブユニットワクチンを受けるネコが、ＦＩＶ
またはＦｅＬＶタンパク質を含むサブユニットワクチンのみを受けるネコと比較
して、疾病の発生を明らかに減少させたことを示す。
【０２７７】 （例２２） 疾病保護のについての予防ワクチンとしてのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８
、およびＣＴＬＡ−４の使用法： 例１７に記述されるとおり投与されるが、病原体生物からサブユニットまたは
ウイルス性ベクター化抗原を投与させない場合、組換え豚痘、組換えアライグマ
痘、または組換えネコ・ヘルペスウイルス・ベクターにおける、ネコＣＤ８０、
ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４は、ウイルス性、寄生、または細菌性
病原体を誘発させる場合、保護的免疫応答を引出す免疫原および１型応答を刺激
するのに有用である。選択的手段では、例３に記述されるとおり投与される場合
、ウイルス性ベクター中のネコＣＴＬＡ−４と組合せたネコＣＤ８０またはＣＤ
８６は、免疫応答を抑制し、そしてネコにおける自己免疾病に対して保護するの
に有用である。
【０２７８】 （例２３） 腫瘍細胞成長を阻害し、そして破壊するネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、お
よびＣＴＬＡ−４の使用法： ネコから得られる腫瘍細胞を、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４と組合わせてネコ
ＣＤ８０またはＣＤ８６を発現する組換え豚痘、組換えアライグマ痘、または組
換えネコ・ヘルペスウイルス・ベクターに形質移入させた。形質移入した腫瘍細
胞を、ネコに再投与し、そして腫瘍細胞の表面におけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６
、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４の存在は、形質移入および非形質移入腫瘍細胞
に対する広範な免疫学上の応答を生じさせ、それにより、局在化し、そして転移
した腫瘍細胞の死滅を生じさせた。選択的手段では、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−
４と組合わせてネコＣＤ８０またはＣＤ８６を発現するベクターを、ネコにある
腫瘍に直接注入し、それにより局在化し、そして転移した腫瘍細胞の死滅を生じ
させる腫瘍細胞に対する広範な免疫学上の応答を生じさせる。
【０２７９】 （例２４） ネコにおける疾病を治療する治療薬としてのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８
、およびＣＴＬＡ−４の使用法： 例１７に記述されるとおり投与されるが、病原体生物からサブユニットまたは
ウイルス性ベクター化抗原を投与させない場合、組換え豚痘、組換えアライグマ
痘、または組換えネコ・ヘルペスウイルス・ベクターにおける、ネコＣＤ８０、
ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４は、疾病の病原体のレベルを排除する
かまたは減少させるのに有用である。
【０２８０】 支持実験データ：ＳＰＶ２４６ＦｅＬＶｇａｇおよびエンベロープおよびネコＣＤ８０を含む組換えウイルス性 ベクター化ＳＰＶワクチンの安全性および効力 組換えＳＰＶウイルス、ＳＰＶ２４６の構築は、上に記述された（元のファイ
ルの本体で）。ＳＰＶ２４６は、２つのマーカー遺伝子β−グルクロニダーゼお
よびβ−ガラクトシダーゼと同様に、ＦｅＬＶｇａｇおよびエンベロープおよび
ネコＣＤ８０をコードする遺伝子を含めた５つの外来遺伝子を含む。ＳＰＶ２４
６で感染されたＦｅＬＶｇａｇおよびエンベロープおよびＣＤ８０の発現は、「
ウエスタンブロット」分析によって確認された。特異的ＦｅＬＶｇａｇおよびエ
ンベロープタンパク質を表すバンドを、それぞれ、ＦｅＬＶ Ｐ２７に対するヤ
ギポリクローナル抗体（バイオデザイン、ＭＥ）およびＦｅＬＶ ｇｐ７０に対
するモノクローナル抗体（バイオデザイン、ＭＥ）で検出した。ＦｅＬＶｇａｇ
およびエンベロープタンパク質は、生来のウイルス性タンパク質に類似して後期
翻訳で明らかに加工される。上に記述される抗体を利用する「黒色プラーク」ア
ッセイによって純度、発現および安定性の分析を行った。ＳＰＶ２４６を、少な
くとも５回、安定して継代させた。ＳＰＶ２４６で感染した細胞から発生される
１００％のプラークは、ＦｅＬＶｇａｇ、エンベロープ、β−ガラクトシダーゼ
およびβ−グルクロニダーゼについて陽性であった。
【０２８１】 ネコＣＤ８０の発現は、ポリクローナル抗ヒトＣＤ８０抗体を用いて「黒色プ
ラーク」アッセイで確認された。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋｄａから６０ｋ
ｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出した。これらのバンドは、ＳＰ
ＶおよびＥＳＫ−４細胞の内容物中で発現され、そして修飾されたＣＤ８０の選
択的で複数のグリコシル化パターンを表す。
【０２８２】 ＳＰＶ２４６および対照ウイルス、ＳＰＶ００３、並びに他の組換えＦＨＶお
よびＳＰＶ ＦｅＬＶワクチン候補を、ＦｅＬＶの頑固な感染に対してネコを保
護するそれらの能力について試験した。簡便には、８週齢の仔ネコ１０ネコ／群
を、１ｍｌのＳＰＶ２４６、対照ウイルスまたは他の組換えウイルスを皮下にワ
クチン接種した（７×１０５ｐｆｕ／ネコから１×１０７ｐｆｕ／ネコまでの範
囲内の用量）。ネコに、３週ずれて、三回ワクチン接種した。ワクチン接種に続
いて、酢酸メティルプレドニソロン（デポ−メドロール(Depo-Medrol)）を用い
た前処置した後、ネコを、リチャードＦｅＬＶ標準誘発菌株（１０６．２ＴＣＩ
Ｄ５０／ｍｌ／ネコ）で経口鼻腔経路によって誘発させた。
【０２８３】 ネコから得られる血清を、１５週後誘発の間、週基本で、頑固なウイルス血症
について分析した。継続３週間、ＦｅＬＶ ｐ２７の存在について陽性を試験し
た後、ネコは、頑固にウイルス血症であると考えられた。
【０２８４】 結果： ＳＰＶ２４６でワクチン接種したネコは、ＦｅＬＶ誘発調査でのＦｅＬＶウイ
ルス血症から部分的に保護される。ＳＰＶ２４６で処置されるネコについての推
定される防止可能な画分（ＰＦ）値は、５０％であった（表１）。
【０２８５】 表１： 抗原接種後１５週において一貫したウイルス血漿をもつ猫の数 およびパーセンテージ。各群についての推定予防可能画分（ＰＦ） を計算した
【表２】 ＣＤ８０およびＣＤ８６を含む別の組換えウイルスの例 ＳＰＶ２８０： ＳＰＶ２８０は、６つの外来遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスである。９
９２−２３．６と表される相同ベクターを、以下の方法で構築した：ネコＣＤ８
６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の制御
下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８
６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が
含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ遺伝子は、合成前期ポックスプ
ロモーターＥＰ２の制御下にある。ＳＰＶ２８０は、ＦｅＬＶｇａｇおよびエン
ベロープおよびβ−ガラクトシダーゼを含むＳＰＶ２５８から誘導された。ＳＰ
Ｖ２５８は、先に、ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子を含むように遺伝子操
作され、そして合成前期／後期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下で切
断ＦｅＬＶエンベロープ（ｇｐ７０）遺伝子；Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子は、構造的Ｉ５Ｌポックスプロモーターの制御下にあり、そして欠失
された１８６９ｂｐ部分的ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片に挿入される。ＣＤ８０／Ｃ
Ｄ８６およびＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ遺伝子を、異なり、そして非
必須ＳＰＶ部分的ＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ断片中の相同なベクター９９２−２３．６
にクローン化させた。
【０２８６】 ＳＰＶ２８０は、ＳＰＶ２５８から誘導された。これは、「組換えＲＰＶ、Ｓ
ＰＶまたはＦＨＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター９９２−２３
．６およびウイルスＳ−ＳＰＶ−２５８を利用して達成された。形質移入保存物
を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣＰＲＧアッセイ）または
β−グルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ）を発現する組換えＳＰＶ用のス
クリーン」によってスクリーニングした。複数回の青色／緑色プラーク精製の最
終結果は、組換えウイルスＳＰＶ２８０であった。
【０２８７】 「黒色プラークアッセイ」により、ＳＰＶ２８０を、ＦｅＬＶｇａｇ、ＦｅＬ
Ｖエンベロープおよびマーカー遺伝子、β−ガラクトシダーゼおよびβ−グルク
ロニダーゼの発現について分析した。ＦｅＬＶｇａｇについてのヤギポリクロー
ナル抗体（バイオデザイン、ＭＥ）およびＦｅＬＶエンベロープについてのマウ
スのモノクローナル抗体ｇｐ７０（バイオデザイン、ＭＥ）を使用して、精製Ｓ
ＰＶ２８０で感染されたＥＳＫ−４細胞から発生される１００％のプラークは、
ＦｅＬＶｇａｇおよびＦｅＬＶエンベロープを発現していると決定された。
【０２８８】 ネコＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を、それぞれ、ヤギのポリクローナル抗ヒ
トＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）
を用いて、「ウエスタンブロット」分析によって確認した。ネコＣＤ８０に特異
的な３０ｋｄａから６０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出し、
そしてネコＣＤ８６に特異的な４０ｋｄａから７０ｋｄａまでのサイズの範囲に
ある多重バンドを検出した。これらのバンドは、ＥＳＫ−４細胞中のＳＰＶの内
容物中で発現されたＣＤ８０およびＣＤ８６の選択的で複数のグリコシル化パタ
ーンを表す。
【０２８９】 ＳＰＶ２８１： ＳＰＶ２８１は、６つの外来遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスである。９
９２−２３．６と表される相同ベクターを、上に記述されるとおり、ＳＰＶ２８
０について構築した。ＳＰＶ２８１は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびエン
ベロープおよびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼを含むＳＰＶ２２８から誘
導された。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成前期ポックスプロモータ
ーＥＰ２の制御下にある。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、合成前期ポックスプロ
モーターＥＰ１の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子は
、構造的Ｉ５Ｌポックスプロモーターの制御下にある。ＦＩＶｇａｇ／プロテア
ーゼ、エンベロープおよびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼを、ＳＰＶの欠
失した１８６９ｂｐ部分的ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片に挿入させた。ＣＤ８０／Ｃ
Ｄ８６およびＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ遺伝子を、異なり、そして非
必須ＳＰＶ部分的ＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ断片に挿入した。
【０２９０】 ＳＰＶ２８１は、ＳＰＶ２２８から誘導された。これは、「組換えＲＰＶ、Ｓ
ＰＶまたはＦＨＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター９９２−２３
．６およびウイルスＳ−ＳＰＶ−２２８を利用して達成された。形質移入保存物
を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣＰＲＧアッセイ）または
β−グルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ法）を発現する組換えＳＰＶ用の
スクリーン」によってスクリーニングした。複数回の青色／緑色プラーク精製の
最終結果は、組換えウイルスＳＰＶ２８１であった。
【０２９１】 「黒色プラークアッセイ」により、ＳＰＶ２８１を、ＦｅＬＶｇａｇ、ＦｅＬ
Ｖエンベロープおよびマーカー遺伝子、β−ガラクトシダーゼおよびβ−グルク
ロニダーゼの発現について分析した。プラーク精製ＳＰＶ２８１で感染したＥＳ
Ｋ−４細胞から得た１００％のプラークは、ＦＩＶｇａｇ（ｐ２７）およびＦＩ
Ｖエンベロープ（ｇｐ１００）（それぞれ、カスタム・モノクローナルズ、カリ
フォルニアウ州；バイオデザイン・インターナショナル、メイン州）についての
マウスのモノクローナル抗体、β−ガラクトシダーゼに対するマウスのモノクロ
ーナル、およびβ−グルクロニダーゼに対するウサギのポリクローナル抗体（そ
れぞれ、バイオデザイン・インターナショナル、メイン州、およびモレキュラー
・プローブス、オレゴン州）を利用して、ＦｅＬＶｇａｇ、ＦＩＶエンベロープ
、β−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼを発現していると決定され
た。
【０２９２】 ネコＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を、ポリクローナル抗ヒトＣＤ８０および
ＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）を利用して、「ウ
エスタンブロット」分析によって確認した。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋｄａ
から６０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ
８６に特異的な４０ｋｄａから７０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンド
を検出した。これらのバンドは、ＥＳＫ−４細胞中のＳＰＶの内容物中で発現さ
れたＣＤ８０およびＣＤ８６の選択的で複数のグリコシル化パターンを表す。Ｆ
ＩＶｇａｇおよびエンベロープ発現も、上に記述される抗体を利用して「ウエス
タンブロット」分析によって確認した。ＦＩＶｇａｇおよびエンベロープは、そ
れぞれ、Ｐ２４およびｇｐ１００に加工されるようであった。
【０２９３】 ＦＨＶ０４３： ＦＨＶ０４３は、５つの外来遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスである。９
８７−５７．Ａ１と表される相同ベクターを、以下の方法で構築した。：ネコＣ
Ｄ８６およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーター（Ｃ
ＭＶ ＩＥ）の制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣ
Ｄ８０およびＣＤ８６の転写が起動された。第二の下流ＣＤ８０の開放読取枠の
翻訳は、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素の制御下にあった。Ｅ．ｃｏｌｉ β−グルク
ロニダーゼ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にあ
る。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ遺伝子を、
ＦＨＶの部分的Ｓａｌ Ｉ Ｈ断片から誘導される特徴的なＥｃｏＲＩ部位中の
ＦＨＶ特徴的な長い領域に挿入した。挿入は、ｇＬの間にあり、そして転写アク
チベーター遺伝子に隣接した。
【０２９４】 ＦＨＶ０４３は、ＦＩＶエンベロープおよびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダ
ーゼを含むＦＨＶ０１７から誘導された。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、ＣＭＶ
ＩＥプロモーターの制御下にある。そして、イー．β−ガラクトシダーゼ遺伝
子は、偽狂犬病ｇＸプロモーター要素の制御下にある。ＦＩＶエンベロープおよ
びＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼを、ＦＨＶ ＵＳ ｇＥ欠失部位に挿入
される。
【０２９５】 ＦＨＶ０４３は、ＦＨＶ０１７から誘導された。これは、「組換えＲＰＶ、Ｓ
ＰＶまたはＦＨＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター９８７−５７
．Ａ１およびウイルスＦＨＶ０１７を利用して達成された。形質移入保存物を、
「β−ガラクトシダーゼ（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣＰＲＧアッセイ）またはβ−
グルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ法）を発現する組換えＳＰＶ用のスク
リーン」によってスクリーニングした。複数回の青色／緑色プラーク精製の最終
結果は、組換えウイルスＦＨＶ０４３であった。
【０２９６】 「黒色プラークアッセイ」により、ＦＨＶ０４３を、マーカー遺伝子、β−ガ
ラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼの発現について分析した。β−ガラ
クトシダーゼについてのマウスのモノクローナル抗体（バイオデザイン、メイン
州）およびβ−グルクロニダーゼについてのウサギのポリクローナル抗体（モレ
キュラー・プローブス、オレゴン州）を利用して、プラーク精製ＦＨＶ０４３で
感染されたＣＲＦＫ細胞から得られる１００％のプラークは、β−ガラクトシダ
ーゼおよびβ−グルクロニダーゼを発現していると決定された。このウイルスは
、少なくとも５継代後、安定であると決定された。
【０２９７】 ネコＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を、ポリクローナル抗ヒトＣＤ８０および
ＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）を利用して、「ウ
エスタンブロット」分析によって確認した。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋｄａ
から６０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ
８６に特異的な４０ｋｄａから７０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンド
を検出した。ＦＩＶエンベロープ（ｇｐ１３０）の発現を、ＦＩＶ感染ネコから
得られる回復期ネコ血清を利用して、「ウエスタンブロット」分析で確認した。
【０２９８】 相同ベクター１０１５−１８．８Ａ（LP1-CD86/IRES-CD80）： 相同ベクター１０１５−１８．８Ａを使用して、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発
現する組換えＲＰＶウイルスを作成した。ポックスＬＰ１プロモーター、ＥＭＣ
Ｖ ＩＲＥＳ要素、およびポックス・ポリＡ転写ターミネーターを含むプラスミ
ドを構築した。ネコＣＤ８０遺伝子を、プライマー１／９７．６（５’−ＧＣＴ
ＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＡＴ−３’）および
３／９８．４（５’−ＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧ
ＴＧＧ−３’）でＰＣＲ増幅させ、そして両方が、ＢａｍＨＩクローニング部位
を含んだ。ＣＤ８０を、ＬＰ１プロモーターの後ろでクローニングした。ネコＣ
Ｄ８６遺伝子を、ＭｆｅＩクローニング部位を有するプライマー１／９８．１８
（５’−ＴＣＧＡＣＡＡＴＴＧＧＡＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧＴＧＡＣＡＧ−３’）
および８／９７．３１（５’−ＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＧＧ
−３’）平滑末端でＰＣＲ増幅させた。ＣＤ８０を、ＥＭＣＶ要素の後でクロー
ニングした。その後、カセットを、ＮｏｔＩで消化し、そして合成後期プロモー
ターＩ５Ｌの制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＲ
ＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎベクターにクローニングさせた。最終の相同ベクター
１０１５−１８．８Ａを使用して、「組換えＲＰＶを発生する相同な組換え手段
」によって、ＦＩＶまたはＦｅＬＶ遺伝子およびＣＤ８０およびＣＤ８６を含む
ウイルスを作成した。
【０２９９】 Ｓ−ＲＰＶ−０４５： Ｓ−ＲＰＶ−０４５は、３つの外来遺伝子を発現する組換えアライグマ痘ウイ
ルスである。Ｓ−ＲＰＶ−０４５は、アライグマ痘ウイルスＲＰＶ−０００（Ａ
ＴＣＣ ＶＲ−８３８）から誘導された。これは、「組換えＲＰＶを発生する相
同な組換え手段」で相同なベクター１０１５−１８．８Ａおよび親のウイルスＳ
−ＲＰＶ−０００を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシ
ダーゼ（ＢＬＵＯ−ＧＡＬアッセイおよび酵素的マーカー遺伝子を発現する組換
えＲＰＶ用のスクリーン）を発現する組換えＲＰＶ用のスクリーン」によって組
換え体についてスクリーニングした。ウイルスを、プラーク精製し、そして５回
継代させた。
【０３００】 「黒色プラークアッセイ」により、ＲＰＶ−０４５を、β−ガラクトシダーゼ
の発現について分析した。ウサギのポリクローナル抗体（アイ・シー・エヌ、オ
ハイオ州）を利用して、精製ＲＰＶ−０４５で感染されたＶＥＲＯ細胞から発生
される１００％のプラークは、β−ガラクトシダーゼを発現していると決定され
た。
【０３０１】 「ウエスタンブロット手段」を使用するウエスタン分析では、それぞれ、ヤギ
・ポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー
・システムズ、ＭＮ）の発現が確認された。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋｄａ
から６０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ
８６に特異的な４０ｋｄａから７０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンド
を検出した。これらのバンドは、ＶＥＲＯ細胞中のＲＰＶの内容物中で発現され
たＣＤ８０およびＣＤ８６の選択的で複数のグリコシル化パターンを表す。
【０３０２】 Ｓ−ＲＰＶ−０４６： ＲＰＶ−０４６は、５つの外来遺伝子を発現する組換えアライグマ痘ウイルス
である。ＲＰＶ−０４６は、アライグマ痘ウイルスＲＰＶ−０３６から誘導され
た。これは、「組換えＲＰＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター１
０１５−１８．８Ａおよび親のウイルスＲＰＶ−０３６を利用して達成された。
形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢＬＵＯ−ＧＡＬアッセイおよび
「酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えＲＰＶ用のスクリーン」）を発現する
組換えＲＰＶ用のスクリーン」によって組換え体についてスクリーニングした。
ウイルスを、プラーク精製し、そして５回継代させた。複数回の青色／緑色プラ
ーク精製の最終結果は、組換えウイルスＦＨＶ０４６であった。
【０３０３】 ＲＰＶ０４６は、合成前期／後期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下
でＦＩＶｇａｇ遺伝子を、そして合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下
でβ−グルクロニダーゼ遺伝子を含む。これらの遺伝子は、異なり、そして非必
須の部分的ＲＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｕ部位に含まれる。ＣＤ８０およびＣＤ８
６遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼが、特徴的で、異なる非必須の部分的ＲＰ
Ｖ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ部位に含まれる。
【０３０４】 「黒色プラーク分析」によって、ＲＰＶ−０４６を、β−ガラクトシダーゼお
よびβ−グルクロニダーゼ発現について分析した。精製ＲＰＶ−０４６で感染さ
れたＶＥＲＯ細胞から発生される１００％のプラークは、β−ガラクトシダーゼ
およびβ−グルクロニダーゼを発現していると決定された。
【０３０５】 「ウエスタンブロット手段」を使用するウエスタン分析では、それぞれ、ヤギ
・ポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー
・システムズ、ＭＮ）の発現が確認された。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋｄａ
から６０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ
８６に特異的な４０ｋｄａから７０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンド
を検出した。これらのバンドは、ＶＥＲＯ細胞中のＲＰＶの内容物中で発現され
たＣＤ８０およびＣＤ８６の選択的で複数のグリコシル化パターンを表す。ＦＩ
Ｖｇａｇ／プロテアーゼ発現も、ＦＩＶｇａｇについてのマウスのモノクローナ
ル抗体（ｐ２７）（カスタム・モノクローナルズ、カリフォルニア州）を利用し
て「ウエスタンブロット」分析によって確認された。
【０３０６】 Ｓ−ＲＰＶ−０４７： ＲＰＶ−０４７は、５つの外来遺伝子を発現するアライグマ痘ウイルスである
：ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片中で合成後期プロモーター（Ｉ５Ｌ）の制御下でＬＰ
１−ＣＤ８０／ＩＲＥＳ−ＣＤ８０カセットおよびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクト
シダーゼ遺伝子を含む１０１５−１８．８Ａ相同ベクターは、上に記述されると
おり構築された。ＲＰＶ−０４７は、ＲＰＶ−０４４から誘導され、それはＨｉ
ｎｄＩＩＩ Ｎ断片中でＦＩＶｅｎｖおよびＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダー
ゼ（β−グルクロニダーゼ）についての遺伝子を含んた。ＦＩＶｅｎｖ遺伝子は
、合成前期プロモーター（ＥＰ１）の制御下にある。β−グルクロニダーゼ遺伝
子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。
【０３０７】 Ｓ−ＲＰＶ−０４７は、アライグマ痘ウイルスＲＰＶ−０４４から誘導された
。これは、「組換えＲＰＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター１０
１５−１８．８Ａおよび親のウイルスＳ−ＲＰＶ−０４４を利用して達成された
。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢＬＵＯ−ＧＡＬアッセイおよ
び酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えＲＰＶ用のスクリーン）を発現する組
換えＲＰＶ用のスクリーン」によって組換え体についてスクリーニングした。ウ
イルスを、プラーク精製し、そして５回継代させた。複数回の青色／緑色プラー
ク精製の最終結果は、組換えウイルスＦＨＶ０４７であった。
【０３０８】 「黒色プラーク」分析により、ＲＰＶ−０４７を、β−ガラクトシダーゼの発
現について分析した。ウサギのポリクローナル抗体（アイ・シー・エヌ、オハイ
オ州）を利用して、精製ＲＰＶ−０４７で感染されたＶｅｒｏ細胞から発生され
る１００％のプラークは、β−ガラクトシダーゼを発現していると決定された。
【０３０９】 「ウエスタンブロット手段」を使用するウエスタン分析では、それぞれ、ヤギ
・ポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー
・システムズ、ＭＮ）を使用してＣＤ８０およびＣＤ８６の発現が確認された。
ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋｄａから６０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多
重バンドを検出し、そしてネコＣＤ８６に特異的な４０ｋｄａから７０ｋｄａま
での範囲にある多重バンドを検出した。これらのバンドは、ＶＥＲＯ細胞中のＲ
ＰＶの内容物中で発現されたＣＤ８０およびＣＤ８６の選択的で複数のグリコシ
ル化パターンを表す。ＦＩＶｅｎｖ発現も、ＦＩＶｅｎｖについてのマウスのモ
ノクローナル抗体（ｇｐ１００）（バイオデザイン・インターナショナル、メイ
ン州）を利用して「ウエスタンブロット」分析によって確認された。
【０３１０】 Ｓ−ＲＰＶ−０４８： ＲＰＶ−０４８は、５つの外来遺伝子を発現するアライグマ痘ウイルスである
。ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片中の合成後期プロモーター（Ｉ５Ｌ）の制御下でＬＰ
１−ＣＤ８６／ＩＲＥＳ−ＣＤ８０カセットおよびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクト
シダーゼ遺伝子を含む１０１５−１８．８Ａ相同ベクターを、上に記述のとおり
構築した。ＲＰＶ−０４８は、アライグマ痘ウイルスＲＰＶ−０３６から誘導さ
れ、それはＲＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｕ断片中のＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ
およびＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼについての遺伝子を含んた。ＦｅＬ
Ｖｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２
）の制御下にある。β−グルクロニダーゼ遺伝子は、合成後期プロモーター（Ｌ
Ｐ１）の制御下にある。
【０３１１】 ＲＰＶ−０４８は、組換えアライグマ痘ＲＰＶ−０３８から誘導された。これ
は、「組換えＲＰＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター１０１５−
１８．８Ａおよび親のウイルスＲＰＶ−０３８を利用して達成された。形質移入
保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢＬＵＯ−ＧＡＬアッセイおよび「酵素的
マーカー遺伝子を発現する組換えＲＰＶ用のスクリーン」）を発現する組換えＲ
ＰＶ用のスクリーン」によって組換え体についてスクリーニングした。ウイルス
を、プラーク精製し、そして５回継代させた。複数回の青色／緑色プラーク精製
の最終結果は、組換えウイルスＦＨＶ０４８であった。
【０３１２】 ＲＰＶ０４８を、黒色プラーク分析によってβ−ガラクトシダーゼ発現につい
て分析した。ウサギのポリクローナル抗体（アイ・シー・エヌ、オハイオ州）を
使用して、精製ＲＰＶ−０４６で感染されたＶｅｒｏ細胞から発生される１００
％のプラークは、β−ガラクトシダーゼを発現していると決定された。
【０３１３】 「ウエスタンブロット手段」を使用するウエスタン分析では、それぞれ、ヤギ
・ポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー
・システムズ、ＭＮ）を使用してＣＤ８０およびＣＤ８６の発現が確認された。
ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋｄａから６０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多
重バンドを検出し、そしてネコＣＤ８６に特異的な４０ｋｄａから７０ｋｄａま
でのサイズの範囲にある多重バンドを検出した。これらのバンドは、ＶＥＲＯ細
胞中のＲＰＶの内容物中で発現されたＣＤ８０およびＣＤ８６の選択的で複数の
グリコシル化パターンを表す。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ発現も、ＦＩＶｇａ
ｇについてのウサギのポリクローナル抗体（ｐ２７）（バイオデサイン・インタ
ーナショナル、ＭＥ）を利用して「ウエスタンブロット」分析によって確認され
た。
【０３１４】 Ｓ−ＲＰＶ−０５２： ＲＰＶ−０５２は、６つの外来遺伝子を発現するアライグマ痘ウイルスである
。ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片中の合成後期プロモーター（Ｉ５Ｌ）の制御下でＬＰ
１−ＣＤ８６／ＩＲＥＳ−ＣＤ８０カセットおよびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクト
シダーゼ遺伝子を含む１０１５−１８．８Ａ相同ベクターを、上に記述のとおり
構築した。ＲＰＶ−０５２は、ＲＰＶ−０３０から誘導され、それはＲＰＶ Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ Ｕ断片中のＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ、ＦｅＬＶｅｎｖ、お
よびＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ（β−グルクロニダーゼ）についての
遺伝子を含んた。ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成前期プロモータ
ー（ＥＰ２）の制御下にある。ＦｅＬＶ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ
１）の制御下にある。β−グルクロニダーゼ遺伝子は、合成後期プロモーター（
ＬＰ１）の制御下にある。
【０３１５】 ＲＰＶ−０５２は、アライグマ痘ウイルスＲＰＶ−０３０から誘導された。こ
れは、「組換えＲＰＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター１０１５
−１８．８Ａおよび親のウイルスＲＰＶ−０３０を利用して達成された。形質移
入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢＬＵＯ−ＧＡＬアッセイおよび「酵素
的マーカー遺伝子を発現する組換えＲＰＶ用のスクリーン」）を発現する組換え
ＲＰＶ用のスクリーン」によって組換えウイルスについてスクリーニングした。
ウイルスを、プラーク精製し、そして５回継代させた。複数回の青色／緑色プラ
ーク精製の最終結果は、組換えウイルスＦＨＶ０５２であった。
【０３１６】 ＲＰＶ０５２を、黒色プラーク分析によってβ−ガラクトシダーゼ、β−グル
クロニダーゼ、ＦｅＬＶｇａｇおよびＦｅＬＶエンベロープ発現について分析し
た。それぞれ、ヤギのポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アー
ル・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）を使用して、「ウエスタンブロット手
段」を使用するウエスタン分析では、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現が確認され
た。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＦｅＬＶエンベロープの発現も、ＦＩＶ
ｇａｇについてのウサギのポリクローナル抗体（ｐ２７）（バイオデサイン・イ
ンターナショナル、ＭＥ）およびマウスのモノクローナル抗ＦｅＬＶｅｎｖ（ｇ
ｐ１００）（バイオデザイン、ＭＥ）を利用して「ウエスタンブロット」分析に
よって確認された。
【０３１７】 Ｓ−ＲＰＶ−０５３： ＲＰＶ−０５３は、６つの外来遺伝子を発現するアライグマ痘ウイルスである
。ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片中の合成後期プロモーター（Ｉ５Ｌ）の制御下でＬＰ
１−ＣＤ８６／ＩＲＥＳ−ＣＤ８０カセットおよびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクト
シダーゼ遺伝子を含む１０１５−１８．８Ａ相同ベクターを、上に記述のとおり
構築した。ＲＰＶ−０５３は、ＲＰＶ−０３４から誘導されたが、それはＲＰＶ
ＨｉｎｄＩＩＩ Ｕ断片中のＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ、ＦｅＬＶｅｎｖ
、およびＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼについての遺伝子を含む。ＦｅＬ
Ｖｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成前期プロモーター（ＥＰ２）の制御下に
ある。ＦｅＬＶ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ１）の制御下にある。β
−グルクロニダーゼ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある
。
【０３１８】 ＲＰＶ−０５３は、アライグマ痘ウイルスＲＰＶ−０３４から誘導された。こ
れは、「組換えＲＰＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター１０１５
−１８．８Ａおよび親のウイルスＲＰＶ−０３４を利用して達成された。形質移
入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢＬＵＯ−ＧＡＬアッセイおよび「酵素
的マーカー遺伝子を発現する組換えＲＰＶ用のスクリーン」）を発現する組換え
ＲＰＶ用のスクリーン」によって組換え体についてスクリーニングした。ウイル
スを、プラーク精製し、そして５回継代させた。複数回の青色／緑色プラーク精
製の最終結果は、組換えウイルスＦＨＶ０５３であった。
【０３１９】 Ｓ−ＳＰＶ２７５： Ｓ−ＳＰＶ２７５は、５つの外来遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスである
。９９２−２３．６と表される相同ベクターを、以下のとおり構築した：ネコＣ
Ｄ８６およびＣＤ８０遺伝子は、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の制御下
でビシストロンＤＮＡカセット中で発現され、それにより、ＣＤ８６およびＣＤ
８０の両方の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥ
Ｓ要素を含んだ。Ｅ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ遺伝子は、合成ポックス
前期プロモーターＥＰ２の制御下にある。使用される親のウイルスは、Ｓ−ＳＰ
Ｖ０４６であったが、それは、合成後期／初期プロモーターＬＰ２ＥＰ２によっ
て促進されるＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子を含み、そしてβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子は、構造的ポックスプロモーター０１Ｌの制御下にある。ＦＩＶｇ
ａｇ／プロテアーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ＳＰＶ部分的Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ Ｍ断片に挿入した一方で、ＣＤ８６／ＣＤ８０およびβ−グルクロ
ニダーゼ遺伝子を、ＳＰＶ部分的ＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ断片に挿入した。
【０３２０】 Ｓ−ＳＰＶ２７５は、Ｓ−ＳＰＶ０４６から誘導された。これは、「組換えＳ
ＰＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター９２２−２３．６およびＳ
−ＳＰＶ０４６を利用して達成された。形質移入保存物を、「ｂ−グルクロニダ
ーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ）を発現する組換えＳＰＶ用のスクリーン」によっ
てスクリーニングした。複数回の青色／緑色プラークについての精製の最終結果
は、組換えウイルスＳＰＶ２７５であった。
【０３２１】 Ｓ−ＳＰＶ２７５を、「黒色プラーク」分析によってＦＩＶｇａｇ、およびマ
ーカー遺伝子、β−グルクロニダーゼの発現について分析した。ＦＩＶｇａｇの
ためのマウスのモノクローナル抗体（カスタム・モノクローナルズ、カリフォル
ニア州）を使用して、精製Ｓ−ＳＰＶ２７５で感染されたＥＳＫ−４細胞で発生
される１００％のプラークは、ＦＩＶｇａｇを発現していると決定され、そして
５継代後に安定である。
【０３２２】 ＦＩＶｇａｇについてのマウス・モノクローナル、およびネコＣＤ８６および
ＣＤ８０についてのヤギのポリクローナル抗ヒトＣＤ８６およびＣＤ８０抗体（
アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）を使用して、ＦＩＶｇａｇ、ＣＤ
８６およびＣＤ８０の発現が「ウエスタンブロット」分析で確認された。２つの
異なるバンドが、ＦＩＶｇａｇに特異的な５０ｋｄａおよび２７ｋｄａで検出さ
れた。ネコＣＤ８６に特異的な４０ｋＤａから７０ｋＤａまでの範囲にある多重
バンドを検出し、そしてネコＣＤ８０に特異的な３０ｋＤａから６０ｋＤａまで
の範囲にあるバンドを検出した。
【０３２３】 Ｓ−ＦＨＶ０４０： Ｓ−ＦＨＶ０４０は、５つの外来遺伝子を発現する組換えネコ・ヘルペスウイ
ルスである。９５７−８７．Ａ１と表される相同ベクターを、以下のとおり構築
した：ネコＣＤ８６およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロ
モーター（ＣＭＶ ＩＥ）の制御下でビシストロンＤＮＡカセット中で発現され
、それにより、ＣＤ８６およびＣＤ８０の転写が起動され、そして２つの開放読
取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素を含んだ。β−グルクロニダーゼ遺伝子は、
感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０、ＣＤ８
６およびβ−グルクロニダーゼ遺伝子を、ｇＬの間で、そして転写アクチベータ
ー遺伝子に隣接するＦＨＶの部分的ＳａｌＩ Ｈ断片から誘導される特徴的なＥ
ｃｏＲＩ部位中のＦＨＶの特徴的な長い領域に挿入した。使用される親のウイル
スは、ＣＭＶ ＩＥ促進ＦｅＬＶｇａｇ遺伝子、および偽狂犬病ｇＸプロモータ
ー下にあるＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＳ−ＦＨＶ０１９
であった。両方の遺伝子は、ＦＨＶ特徴的な短い（ＵＳ）ｇＥ欠失部位に配置さ
れる。
【０３２４】 Ｓ−ＦＨＶ０４０は、Ｓ−ＦＨＶ０１９から誘導された。これは、「組換えＦ
ＨＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター９８７−５７．Ａ１および
ウイルスＳ−ＦＨＶ０１９を利用して達成された。形質移入保存物を、「ｂ−グ
ルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ）を発現する組換えＦＨＶ用のスクリー
ン」によってスクリーニングした。複数回の緑色／青色プラークについての精製
の最終結果は、組換えウイルスＳ−ＦＨＶ０４０であった。
【０３２５】 Ｓ−ＦＨＶ０４０を、「黒色プラーク」分析によってＦＩＶｇａｇ、およびマ
ーカー遺伝子、β−グルクロニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの発現につい
て分析した。ＣＲＦＫ細胞で発生される１００％のプラークは、β−グルクロニ
ダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼを発現していると決定された。ＦｅＬＶｇａ
ｇの発現も、ＦｅＬＶｇｐ２７（バイオデザイン、ＭＥ）に対するヤギ・ポリク
ローナル抗体を用いて「黒色プラーク」分析によって確認した。このウイルスは
、５継代後安定しているようである。
【０３２６】 ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＦｅＬＶｇａｇの発現が、「ウエスタンブロ
ット」分析で確認された。ヤギのポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６
抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）を、ネコＣＤ８０およびＣ
Ｄ８６のために使用した。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋＤａから６０ｋＤａま
での範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ８６に特異的な４０ｋＤａ
から７０ｋＤａまでの範囲にあるバンドを検出した。ＦｅＬＶｇｐ２７に対する
ヤギのポリクローナル抗体バイオデザイン、ＭＥ）を使用することによって、Ｆ
ｅＬＶの発現を確認した。
【０３２７】 Ｓ−ＦＨＶ０４２： Ｓ−ＦＨＶ０４２は、５つの外来遺伝子を発現する組換えネコ・ヘルペスウイ
ルスである。９５７−８７．Ａ１と表される相同ベクターを、以下のとおり構築
した：ネコＣＤ８０およびＣＤ８６遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロ
モーター（ＣＭＶ ＩＥ）の制御下でビシストロンＤＮＡカセット中で発現され
、それにより、ＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読
取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素を含んだ。β−グルクロニダーゼ遺伝子は、
感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０、ＣＤ８
６およびβ−グルクロニダーゼ遺伝子を、ｇＬの間で、そして転写アクチベータ
ー遺伝子に隣接するＦＨＶの部分的ＳａｌＩ Ｈ断片から誘導される特徴的なＥ
ｃｏＲＩ部位中のＦＨＶの特徴的な長い領域に挿入した。親のウイルスは、ＣＭ
Ｖ ＩＥ促進ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子、および偽狂犬病ｇＸプロモーター下
にあるＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＦＨＶ０１８であった
。両方の遺伝子は、ＦＨＶ特徴的な短い（ＵＳ）ｇＥ欠失部位に配置される。
【０３２８】 Ｓ−ＦＨＶ０４２は、Ｓ−ＦＨＶ０１８から誘導された。これは、「組換えＦ
ＨＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター９８７−５７．Ａ１および
ウイルスＳ−ＦＨＶ０１８を利用して達成された。形質移入保存物を、「ｂ−グ
ルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ）を発現する組換えＦＨＶ用のスクリー
ン」によってスクリーニングした。複数回の緑色／青色プラークについての精製
の最終結果は、組換えウイルスＳ−ＦＨＶ０４２であった。Ｓ−ＦＨＶ０４２を
、「黒色プラーク」分析によってＦＩＶｅｎｖ、およびマーカー遺伝子、β−グ
ルクロニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの発現について分析した。ＣＲＦＫ
細胞で発生される１００％のプラークは、β−グルクロニダーゼおよびβ−ガラ
クトシダーゼを発現していると決定された。ＦｅＬＶｅｎｖの発現は、ＦｅＬＶ
ｇｐ７０に対するマウスのモノクローナル抗体（バイオデザイン、ＭＥ）を用い
て「黒色プラーク」分析によって確認した。このウイルスは、５継代後安定して
いた。
【０３２９】 ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＦｅＬＶｅｎｖの発現が、「ウエスタンブロ
ット」分析で確認された。ヤギのポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６
抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）を、ネコＣＤ８０およびＣ
Ｄ８６のために使用した。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋＤａから６０ｋＤａま
での範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ８６に特異的な４０ｋＤａ
から７０ｋＤａまでの範囲にあるバンドであった。ｇｐ７０に対するマウスのモ
ノクローナル抗体（バイオデザイン、ＭＥ）を使用することによって、１００ｋ
ＤａのＦｅＬＶｅｎｖバンドを確認した。
【０３３０】 Ｓ−ＦＨＶ０４４： Ｓ−ＦＨＶ０４４は、５つの外来遺伝子を発現する組換えネコ・ヘルペスウイ
ルスである。９５７−８７．Ａ１と表される相同ベクターを、以下のとおり構築
した：ネコＣＤ８０およびＣＤ８６遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロ
モーター（ＣＭＶ ＩＥ）の制御下でビシストロンＤＮＡカセット中で発現され
、それにより、ＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読
取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素を含んだ。β−グルクロニダーゼ遺伝子は、
感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０、ＣＤ８
６およびβ−グルクロニダーゼ遺伝子を、ｇＬの間で、そして転写アクチベータ
ー遺伝子に隣接するＦＨＶの部分的ＳａｌＩ Ｈ断片から誘導される特徴的なＥ
ｃｏＲＩ部位中のＦＨＶの特徴的な長い領域に挿入した。親のウイルスは、ＣＭ
Ｖ ＩＥ促進ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ（プロテアーゼ遺伝子の５つのプライ
ム末端での９つのアミノ酸欠失と共に）、および偽狂犬病ｇＸプロモーター下に
あるＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＳ−ＦＨＶ０１６であっ
た。両方の遺伝子は、ＦＨＶ特徴的な短い（ＵＳ）ｇＥ欠失部位に配置される。
【０３３１】 Ｓ−ＦＨＶ０４４は、Ｓ−ＦＨＶ０１６から誘導された。これは、「組換えＦ
ＨＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター９８７−５７．Ａ１および
ウイルスＳ−ＦＨＶ０１６を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−グ
ルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ）を発現する組換えＦＨＶ用のスクリー
ン」によってスクリーニングした。複数回の緑色／青色プラークについての精製
の最終結果は、組換えウイルスＳ−ＦＨＶ０４４であった。Ｓ−ＦＨＶ０４４を
、「黒色プラーク」分析によってＦＩＶｇａｇ、およびマーカー遺伝子、β−グ
ルクロニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの発現について分析した。ＣＲＦＫ
細胞で発生される１００％のプラークは、マウスのモノクローナル抗体（バイオ
デザイン、ＭＥ）を利用する両方のマーカー遺伝子を発現していると決定された
。ＦｅＬＶｇａｇの発現も、ＦｅＬＶｇｐに対するマウスのモノクローナル抗体
（カスタム・モノクローナル、カリフォルニア州）を用いて「黒色プラーク」分
析によって確認した。このウイルスは、５継代後安定していた。
【０３３２】 ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＦｅＬＶｇａｇの発現が、「ウエスタンブロ
ット」分析で確認された。ヤギのポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６
抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）を、ネコＣＤ８０およびＣ
Ｄ８６のために使用した。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋＤａから６０ｋＤａま
での範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ８６に特異的な４０ｋＤａ
から７０ｋＤａまでの範囲にあるバンドであった。２つの異なるバンドが、モノ
クローナル抗体ＦＩＶｇａｇ抗体を使用して、ＦＩＶｇａｇに特異的な５０ｋＤ
ａと２７ｋＤａであると検出した。
【０３３３】 表２： ＣＤ８０および／またはＣＤ８６、またはＣＤ２８をコードする 遺伝子を含むＳＰＶ組換えウイルス
【表３】
【表４】
【表５】 表３： ＣＤ８０および／またはＣＤ８６、およびＣＤ２８をコードする 遺伝子を含むＲＰＶ組換えウイルス
【表６】
【表７】 表４： ＣＤ８０および／またはＣＤ８６、およびＣＤ２８をコードする 遺伝子を含むＦＨＶ組換えウイルス
【表８】
【表９】 ＦＩＶまたはＦＥＬＶの部分的に、または全長のゲノムと共に同時ベクター化
ネコＣＤ８０およびＣＤ８６などを含む別の例 注：ＦＩＶおよび／またはＦＩＶの部分または全ゲノム補体と共に、そしてネコ
ＩＬ−１２ｐ３５およびｐ４０と共に、またはなしに、組換えウイルス中にＣＤ
８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８を含む組換えウイルス性ベクター
。これらの組換えウイルスは、ネコ科でのＦＩＶおよびＦｅＬＶ疾病に対するワ
クチンとして能力を示す。
【０３３４】 １．ＦＩＶの全長または部分ゲノムを含む組換え豚痘ウイルス中でのネコＣＤ
８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せの発現。
【０３３５】 ２．ＦＩＶの全長または部分ゲノムを含む組換えネコヘルペスウイルス中での
ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せ
の発現。
【０３３６】 ３．ＦＩＶの全長または部分ゲノムを含む組換えアライグマ痘ウイルス中での
ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せ
の発現。
【０３３７】 ４．ＦｅＬＶの全長または部分ゲノムを含む組換え豚痘ウイルス中でのネコＣ
Ｄ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せの発現
。
【０３３８】 ５．ＦｅＬＶの全長または部分ゲノムを含む組換えネコヘルペスウイルス中で
のネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合
せの発現。
【０３３９】 ６．ＦｅＬＶの全長または部分ゲノムを含む組換えアライグマ痘ウイルス中で
のネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合
せの発現。
【０３４０】 ７．ＦＩＶの全長または部分ゲノムおよびネコＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ｐ３
５およびｐ４０についてのゲノムを含む組換え豚痘ウイルス中でのネコＣＤ８０
、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せの発現。
【０３４１】 ８．ＦＩＶの全長または部分ゲノムおよびネコＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ｐ３
５およびｐ４０についてのゲノムを含む組換えネコヘルペスウイルス中でのネコ
ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せの発
現。
【０３４２】 ９．ＦＩＶの全長または部分ゲノムおよびネコＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ｐ３
５およびｐ４０についてのゲノムを含む組換えアライグマ痘ウイルス中でのネコ
ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せの発
現。
【０３４３】 １０．ＦｅＬＶの全長または部分ゲノムおよびネコＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ、
ｐ３５およびｐ４０についてのゲノムを含む組換え豚痘ウイルス中でのネコＣＤ
８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せの発現。
【０３４４】 １１．ＦｅＬＶの全長または部分ゲノムおよびネコＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ、
ｐ３５およびｐ４０についてのゲノムを含む組換えネコヘルペスウイルス中での
ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せ
の発現。
【０３４５】 １２．ＦＩＶの全長または部分ゲノムおよびネコＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ｐ
３５およびｐ４０についてのゲノムを含む組換えアライグマ痘ウイルス中でのネ
コＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せの
発現。
【０３４６】 表５： ＦＩＶゲノム（ΔＬＴＲｓ）およびネコＣＤ８０および／または ＣＤ８６をコードする遺伝子含む組換えウイルス
【表１０】 例。
【０３４７】 相同ベクター１００７−７０．Ａ２（ＳＰＶ Ｎ／ＣＭＶ−ＦＩＶゲノムΔＬ
ＴＲ／Ｉ５Ｌ−ｌａｃＺ）： 相同ベクター１００７−７０．Ａ２を使用して、外来ＤＮＡをＳＰＶのＨｉｎ
ｄＩＩＩ Ｎ挿入部位に挿入した。それは、フランキング長末端反復（ＬＴＲ）
要素なしに、Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子および全長の
ＦＩＶゲノム（８．５ｋｂ）を組み込む。このカセットは、ＳＰＶ Ｈ．ＩＩＩ
Ｎ断片内の非必須部位に相同なＳＰＶ ＤＮＡによって挟まれる。この相同ベ
クターは、「組換えＳＰＶを生成する相同組換え手段」によって使用されたとき
、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスを生じる。β−ガラクトシダー
ゼマーカー遺伝子は、構造的ポックスプロモーターＩ５Ｌの制御下にあり、そし
てＦＩＶゲノム（ΔＬＴＲ）は、サイトメガロウイルス即時型（ＣＭＶ ＩＥ）
の制御下にあることに注目されたい。相同ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（
Sambrookら）を利用して構築した。ＦＩＶゲノム（ΔＬＴＲ）は、「ポリメラー
ゼ連鎖反応を用いてクローニング」することによって合成した。ＰＣＲ反応につ
いてのテンプレートは、全長ＦＩＶ ＰＰＲウイルスを含むプラスミドから得ら
れる前ウイルス性ＤＮＡであった。上流プライマー（５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡ
ＣＣＡＧＣＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＧＧＡＧＡＧＡＣＴＣＴ−３’；１１／２３／
９８ＢＷ．３）は、Ｇａｇコーディング領域の上流のＦＩＶゲノムの５’末端か
ら合成し、そして特徴的なＳａｌＩ部位を導入する。下流プライマー（５’−Ｔ
ＣＧＡＧＴＣＧＡＣＴＴＧＴＧＡＣＡＧＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＡＴＡＡＧＣ−３
’；１１／１１／９８ＢＷ．１）は、第二のＲｅｖエキソンの下流のＦＩＶゲノ
ムの３’末端から合成し、そして特徴的なＳａｌＩ部位を導入する。
【０３４８】 最終相同ベクター１００７．７０．Ａ２を使用して、「組換えＳＰＶ、ＲＰＶ
およびＦＨＶを生成する相同組換え手段」によって、ＦＩＶゲノム（ＬＴＲなし
）およびネコＣＤ８０およびＣＤ８６を含むか、ＦＩＶゲノム（マイナスＬＴＲ
）およびネコＣＤ８０およびＣＤ８６およびネコＩＬ−１２ゲノムｐ３５および
ｐ４０を含む組換えウイルスを作成した。
【０３４９】 相同ベクター１００５−９５．１（ＲＰＶ Ｕ／ＣＭＶ−ＦＩＶゲノム（ΔＬ
ＴＲ）／Ｉ５Ｌ−ｌａｃＺ）： プラスミド１００５−９５．１を、外来ＤＮＡをＲＰＶに挿入する目的のため
に構築した。それは、ＰＲＶ ＤＮＡによって挟まれるＦＩＶゲノム−ΔＬＴＲ
およびＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ遺伝子を組み込む。外来遺伝子の上
流は、ＲＰＶ ＤＮＡのおよそ９０６塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、
ＲＰＶ ＤＮＡのおよそ８９５塩基対断片である。そのプラスミドは、「組換え
ＲＰＶを生成する相同組換え手段」によって使用されたとき、外来遺伝子をコー
ドするＤＮＡを含むウイルスを生じる。ＦＩＶゲノム−ΔＬＴＲは、サイトメガ
ロウイルス即時型ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にあり、そしてＥ．ｃｏ
ｌｉ β−グルクロニダーゼ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の
制御下にあることに注目されたい。相同ベクターは、以下の源から得られる制限
断片を、合成ＤＮＡ配列と繋げることによって、標準組換えＤＮＡ技術（Sambro
okら）を利用して構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）の
およそ２９９９塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片から誘導された。断片１は、ＲＰ
Ｖ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｕ（Ｋｎｉｇｈｔら）のおよそ９０６塩基対Ｈｉｎ
ｄＩＩＩからＸｂａＩまでの制限副断片である。断片２は、ＬＴＲ要素なしのＦ
ＩＶゲノムのおよそ８．５ｋｂＳａｌＩ断片であり、そして「ポリメラーゼ連鎖
反応を用いてクローニング」することによって合成した。ＰＣＲ反応についての
テンプレートは、全長ＦＩＶ ＰＰＲウイルスを含むプラスミドから得られる前
ウイルス性ＤＮＡであった。上流プライマー（５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＡ
ＧＣＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＧＧＡＧＡＧＡＣＴＣＴ−３’；１１／２３／９８Ｂ
Ｗ．３）は、Ｇａｇコーディング領域の上流のＦＩＶゲノムの５’末端から合成
し、そして特徴的なＳａｌＩ部位を導入する。下流プライマー（５’−ＴＣＧＡ
ＧＴＣＧＡＣＴＴＧＴＧＡＣＡＧＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＡＴＡＡＧＣ−３’；１
１／１１／９８ＢＷ．１）は、第二のＲｅｖエキソンの下流のＦＩＶゲノムの３
’末端から合成し、そして特徴的なＳａｌＩ部位を導入する。断片３は、ＲＰＶ
ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｕのおよそ８９５塩基対ＸｂａＩからＨｉｎｄＩＩＩ
までの副断片である。最終相同ベクター１００５．９５．１を使用して、「組換
えＳＰＶ、ＲＰＶおよびＦＨＶを生成する相同組換え手段」によって、ＦＩＶゲ
ノム（ΔＬＴＲ）およびネコＣＤ８０およびＣＤ８６遺伝子を含む組換えウイル
スを作成するか、ＦＩＶゲノム（ΔＬＴＲ）およびネコＣＤ８０およびＣＤ８６
およびネコＩＬ−１２ゲノムｐ３５およびｐ４０を含む組換えウイルスを作成し
た。
【０３５０】 相同ベクター１０１６−７４．Ａ６（ＦＨＶΔｇＥ／ＣＭＶ−ＦＩＶゲノム−
ΔＬＴＲ／ｇＸ−ｌａｃＺ）： 相同ベクター１０１６−７４．Ａ６を、ネコ・ヘルペスウイルスからｇＥコー
ディング領域の一部を欠失する目的のために構築した。それは、ＦＨＶ ＤＮＡ
によって挟まれるＦＩＶゲノム（マイナスＬＴＲ）およびＥ．ｃｏｌｉ β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子を組み込む。ＦＩＶゲノム−ΔＬＴＲは、サイトメガロウ
イルスＩＥプロモーターの制御下であり、そしてβ−ガラクトシダーゼマーカー
遺伝子は、偽狂犬病ウイルスｇＸプロモーターの制御下にある。それは、標準組
換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して例示のＤＮＡ源から構築された。プラ
スミドベクターは、ｐＳＰ１８／１９のおよそ２９５８塩基対Ａｓｐ７１８Ｉか
らＡｓｐ７１８Ｉまでの制限エンドヌクレアーゼ断片である。断片１は、ＦＨＶ
ＳａｌＩ Ｂ断片のおよそ１４１５塩基対のＡｓｐ７１８ＩからＳｍａＩまで
の副断片である。断片２は、ＬＴＲ要素なしのＦＩＶゲノムのおよそ８．５ｋｂ
ＳａｌＩ断片であり、そして「ポリメラーゼ連鎖反応を用いてクローニング」す
ることによって合成した。ＰＣＲ反応についてのテンプレートは、全長ＦＩＶ
ＰＰＲウイルスを含むプラスミドから得られる前ウイルス性ＤＮＡであった。上
流プライマー（５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＧＧ
ＡＧＡＧＡＣＴＣＴ−３’；１１／２３／９８ＢＷ．３）は、Ｇａｇコーディン
グ領域の上流のＦＩＶゲノムの５’末端から合成する。下流プライマー（５’−
ＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＴＴＧＴＧＡＣＡＧＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＡＴＡＡＧＣ−
３’；１１／１１／９８ＢＷ．１）は、第二のＲｅｖエキソンの下流のＦＩＶゲ
ノムの３’末端から合成し、そして特徴的なＳａｌＩ部位を導入する。断片３は
、およそ３．５ｋｂのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子断片である。断片４は、ＦＨ
Ｖ ＥｃｏＲＩ Ｅ断片のおよそ２２０５塩基対のＳａｌＩからＡｓｐ７１８Ｉ
までの副断片である。最終相同ベクター１０１６．７４．Ａ６を使用して、「組
換えＳＰＶ、ＲＰＶおよびＦＨＶを生成する相同組換え手段」によって、ＦＩＶ
ゲノム（ΔＬＴＲ）およびネコＣＤ８０およびＣＤ８６遺伝子を含む組換えウイ
ルスを作成するか、ＦＩＶゲノム（ΔＬＴＲ）およびネコＣＤ８０およびＣＤ８
６およびネコＩＬ−１２ゲノムｐ３５およびｐ４０を含む組換えウイルスを作成
した。
【０３５１】 ＳＰＶ２８８： ＳＰＶ２８８は、ＦＩＶゲノムに含まれるＯＲＦの全補体および４つの別の外
来遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスである。ＳＰＶ２８８は、ＳＰＶ２８２
から誘導された。ＳＰＶ２８２は、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の制御
下でビシストロンＤＮＡカセット中で発現されるネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ
８０遺伝子を含み、ＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開
放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素を含んだ。そして、Ｅ．ｃｏｌｉ β−
グルクロニダーゼ遺伝子は、ＳＰＶ Ｈ．ＩＩＩ Ｋゲノム断片内の合成前期プ
ロモーターＥＰ２の制御下にある。相同ベクター９９２−２３．６は、「組換え
ＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを生成する相同組換え手段」を利用して構築された
。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ遺伝子は、異
なり、そして非必須のＳＰＶ部分ＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ断片に挿入される。ＣＭＶ
―ＦＩＶゲノムおよびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は、異なり、そして非必須の
ＳＰＶ部分ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片に挿入される。
【０３５２】 ＳＰＶ２８８は、ＳＰＶ２８２から誘導された。これは、「組換えＲＰＶ、Ｓ
ＰＶまたはＦＨＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター１００７−７
０．Ａ２（上記参照）およびウイルスＳＰＶ２８２を利用して達成された。形質
移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ブルーガルおよびＣＰＲＧアッセイ）
またはβ−グルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ）を発現する組換えＳＰＶ
用のスクリーン」によってスクリーニングした。複数回の青色／緑色プラーク精
製の最終結果は、組換えウイルスＳＰＶ２８８であった。
【０３５３】 ＳＰＶ２８８を、「黒色プラーク」分析によって、ＦｅＬＶｇａｇ、ＦＩＶゲ
ノムから得られるＦｅＬＶエンベロープおよびマーカー遺伝子、β−ガラクトシ
ダーゼおよびβ−グルクロニダーゼの発現について分析した。精製ＳＰＶ２８０
で感染したＥＳＫ−４細胞から発生される１００％のプラークは、ＦｅＬＶｇａ
ｇについてのヤギのポリクローナル抗体（バイオデザイン、ＭＥ）およびＦｅＬ
Ｖエンベロープについてのマウスのモノクローナル抗体ｇｐ７０（バイオデザイ
ン、ＭＥ）を利用して、ＦｅＬＶｇａｇおよびＦｅＬＶエンベロープを発現して
いると決定された。
【０３５４】 ネコＣＤ８０およびＣＤ８６の発現は、それぞれ、ヤギのポリクローナル抗ヒ
トＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）
を用いて、「ウエスタン・ブロット」分析で確認された。ネコＣＤ８０に特異的
な３０ｋＤａから６０ｋＤａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出し、そ
してネコＣＤ８６に特異的な４０ｋＤａから７０ｋＤａまでの範囲にあるバンド
を検出した。これらのバンドは、ＥＳＫ−４細胞中のＳＰＶの内容物で発現され
るＣＤ８０およびＣＤ８６の選択的で複数のグリコシル化パターンを表す。ＦＩ
Ｖゲノムでコードされるタンパク質の発現は、ＦＩＶで感染されたネコから得ら
れるネコ血清を使用して、「ウエスタンブロット」分析で確認された。
【０３５５】 ＦＨＶ０５４： ＦＨＶ０５４は、ＦＩＶゲノムに含まれるＯＲＦの全補体および２つの別の外
来遺伝子を発現する組換えネコ・ヘルペスウイルスである。１０１６−７５．Ｂ
１と表される相同ベクターを、ＦＩＶゲノム（ΔＬＴＲ）およびβ−ガラクトシ
ダーゼを、ＦＨＶ特徴的長い部分的ＳａｌＨ断片に挿入する目的のために構築し
た。
【０３５６】 その挿入は、ｇＬ遺伝子と隣接の転写アクチベーター遺伝子との間にある。
【０３５７】 ＦＩＶゲノムは、ＣＭＶ ＩＥプロモーターの制御下にある。そしてβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーター要素の制御下にある。
【０３５８】 ＦＨＶ０５４は、ＦＨＶ０３０から誘導され、それは、ＦＨＶｇＥ欠失部位に
ネコＣＤ８０遺伝子を含んだ。これは、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを
発生する相同な組換え手段」で相同なベクター１０１６−７５．Ｂ１およびウイ
ルスＦＨＶ０３０を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシ
ダーゼ（ブルーガルおよびＣＰＲＧアッセイ）またはβ−グルクロニダーゼ（Ｘ
−ＧＬＵＣアッセイ法）を発現する組換えＦＨＶ用のスクリーン」によってスク
リーニングした。複数回の青色／緑色プラーク精製の最終結果は、組換えウイル
スＦＨＶ０５４であった。
【０３５９】 ＦＨＶ０５４を、「黒色プラーク」分析によってβ−ガラクトシダーゼの発現
について分析した。プラーク精製ＦＨＶ０５４で感染されたＣＲＦＫ細胞から得
られる１００％のプラークは、マウスのモノクローナル抗体（バイオデザイン、
ＭＥ）を利用するβ−ガラクトシダーゼを発現していると決定された。このウイ
ルスは、少なくとも５継代後安定していると決定された。
【０３６０】 ネコＣＤ８０、ＦＩＶｇａｇおよびＦＩＶエンベロープの発現は、ポリクロー
ナル抗ヒトＣＤ８０抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）、マウ
スのモノクローナル抗ＦＩＶｇａｇ抗体（カスタム・モノクローナル、カリフォ
ルニア州）およびマウスのモノクローナル抗ＩＦＶエンベロープ抗体（バイオデ
ザイン）を利用いて、「ウエスタン・ブロット」分析で確認された。ゲノム中で
コードされるＦＩＶ遺伝子の全補体の発現は、ＦＩＶ感染ネコから得られる回復
期ネコ血清を利用して、「ウエスタンブロット」分析で確認された。
【０３６１】 ＦＨＶ０５５： ＦＨＶ０５５は、ＦＩＶゲノムに含まれるＯＲＦの全補体および３つの別の外
来遺伝子を発現する組換えネコ・ヘルペスウイルスである。１０１６−７５．Ｂ
１と表される相同ベクターを、ＦＩＶゲノム（ΔＬＴＲ）およびβ−ガラクトシ
ダーゼを、ＦＨＶ特徴的長い部分的ＳａｌＨ断片に挿入する目的のために構築し
た。
【０３６２】 その挿入は、ＦＨＶｇＬ遺伝子と隣接の転写アクチベーター遺伝子との間にあ
る。
【０３６３】 ＦＩＶゲノムは、ＣＭＶ ＩＥプロモーターの制御下にある。そしてＥ．ｃｏ
ｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーター要素の制御下
にある。
【０３６４】 ＦＨＶ０５５は、ＦＨＶ０４１から誘導され、それは、ＦＨＶｇＥ欠失部位に
ネコＣＤ８６遺伝子およびβ−グルクロニダーゼ遺伝子を含んだ。ネコＣＤ８６
は、ＦＨＶｇＥプロモーターの制御下にあり、そしてβ−グルクロニダーゼ遺伝
子は、偽狂犬病ウイルスｇＸプロモーターの制御下にある。これは、「組換えＲ
ＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター１０
１６−７５．Ｂ１およびウイルスＦＨＶ０４１を利用して達成された。形質移入
保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ブルーガルおよびＣＰＲＧアッセイ）また
はβ−グルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ法）を発現する組換えＦＨＶ用
のスクリーン」によってスクリーニングした。複数回の青色／緑色プラーク精製
の最終結果は、組換えウイルスＦＨＶ０５５であった。
【０３６５】 ＦＨＶ０５５を、「黒色プラーク」分析によってβ−ガラクトシダーゼおよび
β−グルクロニダーゼの発現について分析した。プラーク精製ＦＨＶ０５５で感
染されたＣＲＦＫ細胞から得られる１００％のプラークは、それぞれ、マウスの
モノクローナル抗体（バイオデザイン、ＭＥ）およびウサギのポリクローナル（
モレキュラー・プローブス、オレゴン州）を利用するβ−ガラクトシダーゼおよ
びβ−グルクロニダーゼを発現していると決定された。このウイルスは、５継代
後安定していると決定された。
【０３６６】 ネコＣＤ８６、ＦＩＶｇａｇおよびＦＩＶエンベロープの発現は、ポリクロー
ナル抗ヒトＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）、マウ
スのモノクローナル抗ＦＩＶｇａｇ抗体（カスタム・モノクローナル、カリフォ
ルニア州）およびマウスのモノクローナル抗ＩＦＶエンベロープ抗体（バイオデ
ザイン）を利用いて、「ウエスタン・ブロット」分析で確認された。ゲノム中で
コードされるＦＩＶ遺伝子の全補体の発現は、ＦＩＶ感染ネコから得られる回復
期ネコ血清を利用して、「ウエスタンブロット」分析で確認された。
【０３６７】 ＲＰＶ０５５： ＲＰＶ０５５は、ＦＩＶゲノムに含まれるＯＲＦの全補体および４つの別の外
来遺伝子を発現する組換えアライグマ痘ウイルスである。ＲＰＶ０５５は、ＲＰ
Ｖ０４５から誘導され、そしてそれは、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の
制御下でビシストロンＤＮＡカセット中で発現されるネコＣＤ８６遺伝子および
ＣＤ８０遺伝子を含み、ＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つ
の開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素を含んだ。そして、Ｅ．ｃｏｌｉ
β−グルクロニダーゼ遺伝子は、ＲＰＶ Ｈ．ＩＩＩ Ｎゲノム部分的断片内の
合成前期プロモーターＥＰ２の制御下にある。相同ベクター１００５−９５．１
を使用して、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを生成する相同組換え手段」
を利用して構築した。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子は、異なり、そして非必須のＲＰＶ部分的ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片
に挿入される。ＣＭＶ―ＦＩＶゲノムおよびβ−グルクロニダーゼ遺伝子は、異
なり、そして非必須のＲＰＶ部分的ＨｉｎｄＩＩＩ Ｕ断片に挿入される。
【０３６８】 ＲＰＶ０５５は、ＲＰＶ０４５から誘導された。これは、「組換えＲＰＶ、Ｓ
ＰＶまたはＦＨＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター１００５−９
５．１およびウイルスＲ ＰＶ０４５を利用して達成された。形質移入保存物を
、「β−ガラクトシダーゼ（ブルーガルおよびＣＰＲＧアッセイ）またはβ−グ
ルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ）を発現する組換えＳＰＶ用のスクリー
ン」によってスクリーニングした。複数回の青色／緑色プラーク精製の最終結果
は、組換えウイルスＲＰＶ０５５であった。
【０３６９】 ＲＰＶ０５５を、「黒色プラーク」分析によって、ＦｅＬＶｇａｇ、ＦＩＶゲ
ノムから得られるＦｅＬＶエンベロープおよびマーカー遺伝子、β−ガラクトシ
ダーゼおよびβ−グルクロニダーゼの発現について分析した。精製ＲＰＶ０５５
で感染したＶＥＲＯ細胞から発生される１００％のプラークは、ＦｅＬＶｇａｇ
についてのヤギのポリクローナル抗体（バイオデザイン、ＭＥ）およびＦｅＬＶ
エンベロープについてのマウスのモノクローナル抗体ｇｐ７０（バイオデザイン
、ＭＥ）を利用して、ＦｅＬＶｇａｇおよびＦｅＬＶエンベロープを発現してい
ると決定された。
【０３７０】 ネコＣＤ８０およびＣＤ８６の発現は、それぞれ、ヤギのポリクローナル抗ヒ
トＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）
を利用いて、「ウエスタン・ブロット」分析で確認された。ネコＣＤ８０に特異
的な３０ｋｄａから６０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出し、
そしてネコＣＤ８６に特異的な４０ｋｄａから７０ｋｄａまでのサイズの範囲に
ある多重バンドを検出した。これらのバンドは、ＶＥＲＯ細胞中のＲＰＶの内容
物中で発現されたＣＤ８０およびＣＤ８６の選択的で複数のグリコシル化パター
ンを表す。ＦＩＶゲノム中でコードされるタンパク質の発現は、ＦＩＶで感染さ
れたネコから得られるネコ血清を用いて、「ウエスタン・ブロット」分析で確認
された。
【０３７１】
【参照文献】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ−１】 図１Ａ−１は、ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）（ＴＡＭＵ）のＤＮＡおよびアミノ
酸配列である（配列番号１および２）。
【図１Ａ−２】 図１Ａ−２は、ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）（ＴＡＭＵ）のＤＮＡおよびアミノ
酸配列である（配列番号１および２）。
【図１Ｂ】 図１Ｂは、ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）（ＴＡＭＵ）のアミノ酸配列の疎水性プ
ロットである。
【図２Ａ−１】 図２Ａ−１は、ネコＣＤ８０（ｂ７−１）（ＳＹＮＴＲＯ）のＤＮＡおよびア
ミノ酸配列である（配列番号３および４）。
【図２Ａ−２】 図２Ａ−２は、ネコＣＤ８０（ｂ７−１）（ＳＹＮＴＲＯ）のＤＮＡおよびア
ミノ酸配列である（配列番号３および４）。
【図２Ｂ】 図２Ｂは、ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）（ＳＹＮＴＲＯ）のアミノ酸配列の疎水
性プロットである。
【図３Ａ−１】 図３Ａ−１は、ネコＣＤ８６（Ｂ７−２）のＤＮＡおよびアミノ酸配列である
（配列番号５および６）。
【図３Ａ−２】 図３Ａ−２は、ネコＣＤ８６（Ｂ７−２）のＤＮＡおよびアミノ酸配列である
（配列番号５および６）。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、ネコＣＤ８６（Ｂ７−２）のアミノ酸配列の疎水性プロットである
。
【図４Ａ】 図４Ａは、ネコＣＤ２８のＤＮＡおよびアミノ酸配列である（配列番号７およ
び８）。
【図４Ｂ】 図４Ｂは、ネコＣＤ２８のアミノ酸配列の疎水性プロットである。
【図５Ａ】 図５Ａは、ネコＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）のＤＮＡおよびアミノ酸配列であ
る（配列番号９および１０）。
【図５Ｂ】 図５Ｂは、ネコＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）のアミノ酸配列の疎水性プロット
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/23 Ａ６１Ｋ 39/245 39/245 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １７１ Ａ６１Ｐ 43/00 １７１ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 // Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA04 DA20 EA02 GA11 HA12 4B065 AA90Y AA95X AA95Y AB01 AC14 BA01 CA24 CA43 4C084 AA13 MA02 MA52 MA55 MA63 MA66 NA14 ZB072 ZB082 ZB262 ZB272 ZC612 4C085 AA03 BA51 BA52 BA56 BA71 BA75 BA78 DD62 DD63 EE01 EE03 GG02 GG03 GG04 GG06 GG08 4H045 AA11 AA20 AA30 CA01 CA03 CA11 CA20 CA50 DA86 EA31 FA74

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ウイルスのウイルス性ゲノムにおける非必須領域内に挿入さ
    れた少なくとも１つの外来核酸を含む組換えウイルスであって、このような外来
    核酸のそれぞれが、（ａ）ネコＣＤ２８タンパク質またはその免疫原部分、ネコ
    ＣＤ８０タンパク質またはその免疫原部分、ネコＣＤ８６タンパク質またはその
    免疫原部分、またはネコＣＴＬＡ−４タンパク質またはその免疫原部分の群から
    選択されるタンパク質をコードし、そして（ｂ）前記組換えウイルスが適切な宿
    主に導入されたときに発現される能力があることを特徴とする組換えウイルス。
  2. 【請求項２】 少なくとも２つの外来核酸を含み、その各々が、前記ウイル
    ス性ゲノムの非必須領域内に挿入される請求項１に記載の組換えウイルス。
  3. 【請求項３】 少なくとも３つの外来核酸を含み、その各々が、前記ウイル
    ス性ゲノムの非必須領域内に挿入される請求項２に記載の組換えウイルス。
  4. 【請求項４】 少なくとも４つの外来核酸を含み、その各々が、前記ウイル
    ス性ゲノムの非必須領域内に挿入される請求項３に記載の組換えウイルス。
  5. 【請求項５】 前記ウイルスが、アライグマ痘ウイルス、豚痘ウイルスまた
    はネコヘルペスウイルスである請求項１に記載の組換えウイルス。
  6. 【請求項６】 １つ以上の外来核酸を含み、その各外来核酸が、同じ非必須
    領域に挿入される請求項１〜５の何れか１項に記載の組換えウイルス。
  7. 【請求項７】 １つ以上の前記外来核酸を含み、その全ての外来核酸が同じ
    非必須領域に挿入される請求項１〜５の何れか１項に記載の組換えウイルス。
  8. 【請求項８】 さらに、病原体に由来する免疫原をコードする外来核酸を含
    む請求項１〜７の何れか１項に記載の組換えウイルス。
  9. 【請求項９】 前記病原体が、ネコ病原体、狂犬病ウイルス、クラミジア、
    タキソプラスモシス・ゴンジ(Taxoplasmosis gondii)、ジロフィラリア・イミチ
    ス(Dirofilaria immitis)、ノミ、または細菌性病原体である請求項８に記載の
    組換えウイルス。
  10. 【請求項１０】 前記ネコ病原体が、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネ
    コ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰ）、ネコ汎
    白血球減少症、ネコカルシウイルス、ネコレオウイルス３型、ネコロタウイルス
    、ネココロナウイルス、ネコシンチウムウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ネコヘル
    ペスウイルス、ネコボロン病ウイルス、またはネコ寄生生物である請求項９に記
    載の組換えウイルス。
  11. 【請求項１１】 少なくとも１つの前記外来核酸が、該外来核酸を発現する
    ためのプロモーターを含む請求項１〜７の何れか１項に記載の組換えウイルス。
  12. 【請求項１２】 少なくとも１つの前記外来核酸の発現が、前記ウイルスに
    対して内因性のプロモーターの制御下にある請求項１〜７の何れか１項に記載の
    組換えウイルス。
  13. 【請求項１３】 さらに、検出可能なマーカーをコードする外来核酸を含む
    、請求項１〜１０の何れか１項に記載の組換えウイルス。
  14. 【請求項１４】 前記検出可能なマーカーが、Ｅ．ｃｏｌｉベータ・ガラク
    トシダーゼである請求項１３に記載の組換えウイルス。
  15. 【請求項１５】 前記ネコ病原体から得られる免疫原が、ＦＩＶｇａｇプロ
    テアーゼ、ＦＩＶエンベロープタンパク質、ＦｅＬＶｇａｇプロテアーゼ、また
    はＦｅＬＶエンベロープタンパク質である請求項１０に記載の組換えウイルス。
  16. 【請求項１６】 前記ウイルスがネコヘルペスウイルスであり、前記非必須
    領域がネコヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｇ遺伝子である、請求項１〜７の何
    れか１項に記載の組換えウイルス。
  17. 【請求項１７】 Ｓ−ＦＨＶ−０３１（ＡＴＴＣ受託番号ＶＲ−２６０４）
    と称される、請求項１２に記載の組換えネコヘルペスウイルス。
  18. 【請求項１８】 前記ウイルスが豚痘ウイルスであり、前記非必須領域が、
    豚痘ウイルスのＨｉｎｄＩＩＩＭ断片の大型ＨｉｎｄＩＩＩからＢｇｌＩＩまで
    の副断片である請求項１〜７の何れか１項に記載の組換えウイルス。
  19. 【請求項１９】 Ｓ−ＳＰＶ−２４６（ＡＴＴＣ受託番号ＶＲ−２６０３）
    と称される、請求項１４に記載の組換えネコ豚痘ウイルス。
  20. 【請求項２０】 ＣＤ２８、ＣＤ８０またはＣＤ８６タンパク質の一部が、
    そのタンパク質の可溶性部分である請求項１〜７の何れか１項に記載の組換えウ
    イルス。
  21. 【請求項２１】 前記外来核酸が、ネコＣＴＬＡ−４タンパク質をコードす
    る請求項１〜７の何れか１項に記載の組換えウイルス。
  22. 【請求項２２】 請求項１〜１９の何れか１項に記載の組換えウイルスの免
    疫感作有効量、および適切な担体を含むことを特徴とするワクチン。
  23. 【請求項２３】 前記組換えウイルスの免疫感作有効量が、約１×１０５ｐ
    ｆｕ／ｍｌと約１×１０ｃｆｕ／ｍｌの間の量である請求項２２に記載のワクチ
    ン。
  24. 【請求項２４】 さらに、前記組換えウイルスとの混合物と混合された、免
    疫感作有効量の第二の免疫原を含む請求項２２に記載のワクチン。
  25. 【請求項２５】 ネコに、免疫感作有効量の請求項１〜１９の何れか１項の
    組換えウイルスを投与することを特徴とする、ネコでの免疫応答を増強する方法
    。
  26. 【請求項２６】 ネコに、免疫感作有効量の請求項１〜１９の何れか１項の
    組換えウイルスを投与することを特徴とする、ネコを免疫化する方法。
  27. 【請求項２７】 ネコに、免疫感作有効量の請求項２０または２１の組換え
    ウイルスを投与することを特徴とする、ネコにおける免疫応答を抑制する方法。
  28. 【請求項２８】 前記投与が、静脈、皮下、筋肉内、経筋肉、局所、経口ま
    たは腹膜組織内投与を含む請求項２４〜２６の何れか１項の方法。
  29. 【請求項２９】 ネコが、移殖臓器または組織のレシピエントであるか、ま
    たは免疫応答に悩まされている請求項２７に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 （ａ）ネコＣＤ２８ｍＲＮＡ転写物、（ｂ）ネコＣＤ８０
    転写物、または（ｃ）ネコＣＤ８６ｍＲＮＡ転写物に対してハイブリダイズし、
    その翻訳を阻害する能力のあるアンチセンス核酸をネコに投与することを含み、
    前記アンチセンス核酸は前記翻訳を阻害するのに有効な量で存在し、それにより
    ネコにおける免疫応答を抑制する、ネコにおける免疫応答を抑制する方法。
  31. 【請求項３１】 ネコにおける腫瘍に請求項１の組換えウイルスを投与する
    ことを含み、前記核酸は腫瘍を減少または排除するのに有効な量で、ネコＣＤ８
    ０タンパク質、ネコＣＤ８６タンパク質またはその組合せをコードする、ネコに
    おける腫瘍を減少または排除する方法。
  32. 【請求項３２】 前記組換えウイルスがさらに、ネコ腫瘍に関連した抗原を
    含み且つこれを発現する能力があり、そしてその投与が全身投与で行われる、請
    求項３１に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 さらに、ネコ免疫不全ウイルスゲノムまたはその部分をコ
    ードする核酸を含む、請求項１に記載の組換えウイルス。
  34. 【請求項３４】 さらに、ネコ白血病ウイルスゲノムまたはその一部をコー
    ドする核酸を含む、請求項１に記載の組換えウイルス。
  35. 【請求項３５】 さらに、ネコＩＬ１２、ｐ３５またはｐ４０をコードする
    核酸を含む、請求項３３または３４に記載の組換えウイルス。
  36. 【請求項３６】 請求項３３または３４の組換えウイルスの免疫感作有効量
    、および適切な担体を含むワクチン。
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