JP2007105040A - 組換体ポックスウイルス−ネコ感染性腹膜炎ウイルス、その組成物およびそれらの製造および使用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）組換体ポックスウイルスおよびそれ由来の産物を提供する。
【解決手段】ＦＩＰＶ抗原（群）をコードしているＤＮＡを含有する弱毒化組換体ウイルス、並びにウイルス、そこからの発現産生物、およびウイルスまたは発現産生物から産生された抗体を用いた方法および組成物。組換体ウイルスは、病原性に関与する特定の遺伝子領域の欠失した弱毒化組換体、特にＮＹＶＡＣ（新しいワクシニアワクチン菌株）、または連結継代によって弱毒化されたＡＬＶＡＣ（カナリアポックス／狂犬病糖タンパク質）組換体ウイルスである組成物、それからの生産物および産生された抗体には、いくつかの予防、治療および診断の用途がある。
【選択図】なし

Description

１９９１年３月７日に出願された出願番号第０７／６６６０５６号の一部継続出願である１９９１年６月１１日に出願された出願番号第０７／７１３９６７号の一部継続出願である１９９２年３月６日に出願された出願番号第０７／８４７９５１号の継続出願である１９９３年８月１２日に出願され、既に許可された出願番号第０８／１０５４８３号、および１９９３年３月２４日に出願され、１９９４年１１月１５日に米国特許第５，３６４，７７３号として許可された、出願番号第０８／０３６２１７号を参照する。前述の参照された出願および特許をここに参考として取り込むものとする。

本発明は、改変ポックスウイルスおよびその製造並びに使用方法；例えば、ワクシニアウイルスまたはアビポックス（例えば、カナリアポックスまたはファウルポックス）ウイルスに関するものである。例えば、本発明は改変ポックスウイルス−ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）組換体、その組成物、および組換体と組成物の製造および使用方法に関する。本発明はさらに、弱毒化組換体、特にＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ ＦＩＰＶ組換体、その組成物および組換体と組成物の製造および使用方法に関するものである。このように、本発明は組換体ポックスウイルス−ＦＩＰＶ、ＦＩＰＶの遺伝子産物（群）を発現する組換体、そのような組換体および／または遺伝子産物（群）を含有する組成物および該組換体または組成物の製造および使用方法に関するものである。当該遺伝子産物はＦＩＰＶ Ｎ、Ｍ、およびＳの３つのバージョン（Ｓ１−完全スパイク（ｓｐｉｋｅ）；Ｓ２−スパイクマイナスシグナル配列；Ｓ３−スパイクＣ末端部分）またはＭおよびＮ等のそれらの組合せとすることができる。組換体またはそれらを含有している組成物は、宿主に投与された時にＦＩＰＶ感染に対する免疫反応を誘導可能である。宿主は好ましくは、ネコまたは子ネコなどのネコである。反応は防御的であり得る。このように、組成物は免疫的または抗原的、またはワクチンであり得る。

本発明はさらに、ポックスウイルスの発現産物であって、抗体を生成させるかまたは細胞仲介反応を刺激する等の免疫反応を誘導するのにそれ自体有用であり、当該抗体または反応はＦＩＰＶ感染に対して有用であるもの、あるいは発現産物もしくはそれらによって誘導された抗体であって、細胞培養または動物から単離されたものであり、ＦＩＰＶ検出のための診断キット、テストまたはアッセイの調製のために有用であるもの、あるいは組換体ウイルス、またはそれに感染した細胞、または他のシステムにおける抗原または産物の発現に関する。組換体によって誘導された、単離された発現産物および抗体は、システム、宿主、血清または試料中の抗体または抗原の検出に特に有用であり；発現産物は抗体の生成に有用である。

いくつかの出版物がこの出願において参照されている。これらの参考文献については、請求の範囲の直前の明細書の終わりまたは出版物が述べられている箇所に完全に引用されている。これらの出版物の各々をここに参照文献として引用する。

ワクシニアウイルスおよびごく最近では他のポックスウイルスが、異種遺伝子の挿入および発現に用いられている。異種遺伝子を感染性生ポックスウイルス中に挿入する基本技術は、ドナープラスミド中の異種遺伝要素に隣接するポックスＤＮＡ配列と、レスキューポックスウイルス中に存在する相同性配列との間の組換えに関するものである（Piccini他, 1987）。

特に、組換体ポックスウイルスは、従来技術において知られており、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４及び特許文献５に記載されているワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルスのようなポックスウイルスの合成組換体を形成する方法と類似の２段階で構築される。上記各米国特許の開示内容をここに参考として取り込む。

第１に、ウイルスに挿入されるべきＤＮＡ遺伝子配列、特に非ポックス供給源由来のオープンリーディングフレームを、ポックスウイルスのＤＮＡ部分に相同的なＤＮＡが既に挿入されているＥ．コリプラスミド中に配置する。それとは別に、挿入されるべきＤＮＡはプロモーターに連結させる。プロモーター−遺伝子連結物は、プロモーター−遺伝子連結物が両端で、非必須座を含むポックスＤＮＡ領域中に隣接するるＤＮＡ配列に相同的なＤＮＡに隣接するようにプラスミド構築物中に位置される。その結果得られるプラスミド構築物を、続いてＥ．コリ細菌の増殖により増幅させ（Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９７２）、単離する（Ｃｌｅｗｅｌｌ 他，１９６９；Ｍａｎｉａｔｉｓ 他，１９８２）。

第２に、挿入されるべきＤＮＡ遺伝子を含む単離されたプラスミドは、例えばニワトリ繊維芽細胞等の細胞培養中に、ポックスウイルスとともに移入される。プラスミド中の相同ポックスＤＮＡとウイルスゲノムそれぞれとの間の組換えは、そのゲノムの非必須領域中に、外来ＤＮＡ配列を存在させることにより改変されたポックスウイルスを提供する。用語「外来」ＤＮＡとは、外因性ＤＮＡ、特に非ポックス供給源由来のＤＮＡで、その外因性ＤＮＡが組み込まれたゲノムによっては本来生産されない遺伝子産物をコードするものを意味する。

遺伝的組換えとは、一般に、ＤＮＡの２つの鎖の間での相同性部分の交換である。ある種のウイルスにおいては、ＲＮＡがＤＮＡと置き換わっていることもあり得る。核酸の相同性部分とは、ヌクレオチド塩基の同じ配列を有する核酸部分（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。

遺伝的組換えは、複製、即ち感染された宿主細胞内部での新しいウイルスゲノムの製造の間に自然に生じ得る。このように、ウイルス遺伝子間の遺伝的組換えが、２またはより多くの異なったウイルスまたはその他の遺伝的構築物で共感染させた宿主細胞中で行われるウイルス複製サイクルの間に起こり得る。第１のゲノム由来のＤＮＡ部分は、ＤＮＡが第１のウイルスゲノムに相同であるところの第２の共感染ウイルスのゲノム部分構築において交換可能に利用される。

しかしながら、組換えはまた、完全には相同でない異なったゲノム中のＤＮＡ部分の間でも生じ得る。そのような部分が、例えば相同性ＤＮＡの部分に挿入された遺伝子マーカーまたは抗原決定基をコードする遺伝子等を第１の部分に有していることを除いて別のゲノム部分と相同である第１のゲノム由来である場合、組換えは依然として起こり得るものであり、そしてその組換え産物は、組換体ウイルスゲノム中のその遺伝的マーカーまたは遺伝子の存在により検出可能である。組換えワクシニアウイルスの産生のための付加的な戦略が近年報告された。

挿入されたＤＮＡ遺伝子配列を改変された感染可能ウイルスによってうまく発現させるには、２つの条件が必要である。第１は、改変ウイルスが生育可能なままであるように、挿入はウイルスの非必須領域中になされなければならない。挿入されたＤＮＡの発現のための第２の条件は、挿入されたＤＮＡと適切な関係にあるプロモーターの存在である。プロモーターは、それが発現されるべきＤＮＡ配列の上流に位置するように配置されなければならない。

ワクシニアウイルスは、天然痘に対する免疫化のために成功して用いられてきており、１９８０年には天然痘の全世界での撲滅を成し遂げた。その歴史において、多くのワクシニア株が生成されている。これらの異なった株は多様な免疫原性を示し、種々の程度で潜在的な複雑性を伴う。その最も深刻なものはワクチン後の脳炎と汎発性種痘疹である（Ｂｅｈｂｅｈａｎｉ，１９８３）。

天然痘の撲滅と共に、ワクシニアの新しい役割、外来遺伝子の発現のための遺伝的に操作されたベクターの役割が重要となった。数多くの異種抗原をコードしている遺伝子がワクシニア中で発現され、その結果、しばしば対応する病原体による攻撃に対して防御的な免疫性を発揮することとなる（Ｔａｒｔａｇｌｉａ 他，１９９０ａにおいて概説）。

ワクシニアベクターの遺伝的背景が、発現された外来免疫原の防御的効率に影響することが示されている。例えば、ワクシニアウイルスＷｙｅｔｈワクチン株におけるエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）ｇｐ３４０の発現では、ＥＢＶウイルス誘導リンパ腫に対してコットントップ タマリン（ｃｏｔｔｏｎｔｏｐ ｔａｍａｒｉｎｓ）を防御しなかったが、一方で、ワクシニアウイルスＷＲ実験室株における前記遺伝子の発現では防御的であった（Ｍｏｒｇａｎ 他，１９８８）。

ワクシニアウイルスベースの組換えワクチン候補の、効率と安全性との微妙なバランスは非常に重要である。組換体ウイルスは、ワクチン接種された動物において防御的免疫反応を誘導するような様式で免疫原（群）を提示しなければならないが、如何なる重大な病原性特性をも有してはならない。故にベクター株の弱毒化は、現在の技術の段階を超えた進歩が大いに望まれている。

数多くのワクシニア遺伝子で、組織培養におけるウイルスの増殖に非必須でありその欠失または不活性化が多様な動物系での毒性を減少させるものが同定されてきた。

ワクシニアウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子についてはマッピングが行われ（Hruby 他、1982）、また、配列決定も行われている（Hruby 他、1983；Wier他、1983）。チミジキナーゼ遺伝子が不活化または完全欠失しても、広範な組織培養中でワクシニアウイルスの増殖は妨げられない。また、ＴＫ⁻ ワクシニアウイルスは各種の投与法により各種の宿主における接種部位においてインビボ複製する能力を有する。

単純ヘルペスウイルス２型については、ＴＫ⁻ ウイルスをモルモットに膣内投与すると、ＴＫ^＋ ウイルスの投与の場合よりも脊髄中のウイルス力価がかなり低くなることが示された（Stanberry 他、1985）。ヘルペスウイルスではインビトロでのＴＫ活性は、代謝の活発な細胞中ではウイルスの増殖に重要でないが、静止細胞中ではウイルス増殖に必須であることが示された（Jamieson他、1974）。 ＴＫ⁻ ワクシニアが弱毒化されていることが、マウスに脳内投与および腹膜内投与することにより明らかとなった（Buller他、1985）。神経毒性のあるＷＲ実験室株およびWyeth ワクチン株の双方について弱毒化が認められた。皮内投与されたマウスにおいては、ＴＫ⁻ 組換えワクシニアが、親株のＴＫ^＋ ワクシニアウイルスと同等の抗ワクシニア中和抗体を産生したが、これは、この試験系では、ＴＫ機能の喪失がワクシニアウイルスベクターの免疫原性を有意に減少させないことを示唆している。ＴＫ⁻ およびＴＫ^＋ の組換えワクシニアウイルス（ＷＲ株）をマウスに鼻内接種すると、他の部位（脳を含む）へのウイルスの伝播が顕著に減少したことが見出された（Taylor他、1991a)。

ヌクレオチドの代謝に関連する別の酵素は、リボヌクレオチドレダクターゼである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）内でウイルスにコードされているリボヌクレオチドレダクターゼの活性が、そのラージサブユニットをコードしている遺伝子を欠失させることにより喪失しても、インビトロの分裂細胞中でのウイルス増殖やＤＮＡ合成は影響されないが、無血清細胞でのウイルスの増殖能力は極めて損なわれることが示された（Goldstein 他、1988）。眼部の急性ＨＳＶ感染および三叉神経ガングリオンにおける再活性性潜伏感染に関するマウスモデルを用いた場合、リボヌクレオチドレダクターゼのラージサブユニットを欠失したＨＳＶについては、野生型ＨＳＶに比べて毒性が減少することが示された（Jacobson他、1989）。

ワクシニアウイルスにおいては、リボヌクレオチドレダクターゼのスモールサブユニット（Slabaugh他、1988）およびラージサブユニット（Schmidtt他、1988）のいずれも同定されている。ワクシニアウイルスのＷＲ株において、挿入によりリボヌクレオチドレダクターゼを不活化すると、ウイルスの弱毒化がもたらされるが、それはマウスの頭蓋内接種により測定され得る（Child 他、1990）。

ワクシニアウイルスの血球凝集素（ＨＡ）遺伝子についてはマッピングおよび配列決定が行われている（Shida 、1986）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子は、組織培養中の増殖にとって非必須なものである（Ichihashi 他、1971）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子を不活化すると、頭蓋内投与されたウサギにおいては神経毒性化が減少し、また、皮膚内投与部位におけるウサギの外傷は小さくなっていた（Shida 他、1988）。ＨＡの遺伝子座を利用して、ワクシニアウイルスのＷＲ株（Shida 他、1987）、Lister株の誘導体（Shida 他、1988）およびCopenhagen株（Guo 他、1989）に外来遺伝子を挿入している。外来遺伝子を発現する組換えＨＡ⁻ ワクシニアウイルスは、免疫原性があり（Guo 他、1989；Itamura 他、1990；Shida 他、1988；Shida 他、1987）、また、関連する病原体による免疫性テストに対して防御効果を有する（Guo 他、1989；Shida 他、1987）ことが示された。

牛痘ウイルス（Brighton赤色株）は、鶏卵の漿尿膜上に赤色（出血性）痘瘡を生じさせる。牛痘ゲノム内で自然欠失すると白色痘瘡を生じる変異体となる（Pichup他、1984）。出血性機能（ｕ）は、初期遺伝子によってコードされた38ｋＤａのタンパク質の遺伝子を配置している（Pickup他、1986）。この遺伝子は、セリンプロテアーゼインヒビターと相同性を有し、牛痘ウイルスに対する宿主の炎症応答を阻害し（Palumbo 他、1989）、また、血液凝固のインヒビターである。

このｕ遺伝子は、ワクシニアウイルスのＷＲ株中に存在する（Kotwal他、1989b)。外来遺伝子を挿入することによりｕ領域が不活化されているＷＲワクシニアウイルス組換体が接種されたマウスは、ｕ遺伝子がインタクトのままである類似の組換えワクシニアウイルスが接種されたマウスよりも、該外来遺伝子に対して高い抗体レベルを産生する（Zhou他、1990）。このｕ領域は、ワクシニアウイルスのCopenhagen株内で欠陥性非機能形態として存在する（Goeberu 他による報告（1990a,b)においてＢ13およびＢ14と称されているオープンリーディングフレーム）。

感染細胞内において牛痘ウイルスは、細胞質Ａ型封入体（ＡＴＩ）において局在化している（Kato他、1959）。ＡＴＩの機能は、動物から動物への伝播に際して牛痘ウイルス粒子を防御することにあると考えられている（Bergoin 他、1971）。牛痘ゲノムのＡＴＩ領域は160 ｋＤａのタンパク質をコードしており、これがＡＴＩ封入体のマトリックスを形成する（Funahashi 他、1988；Patel 他、1987）。ワクシニアウイルスは、そのゲノムに相同領域を含有するが、一般にＡＴＩを産生しない。ワクシニアのＷＲ株においては、ゲノムのＡＴＩ領域は94ｋＤａのタンパク質として翻訳される（Patel 他、1988）。ワクシニアウイルスのCopenhagen株においてはＡＴＩ領域に相応するＤＮＡ配列の大部分は欠失されており、該領域の残存する３′末端はＡＴＩ領域の上流にある配列と融合して、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）Ａ26Ｌを形成する（Goebel他、1990a,b)。

ワクシニアウイルスの左末端近傍については、各種の自然欠失（Altenburger 他、1989；Drillien他、1981；Lai 他、1989；Moss他、1981；Paez他、1985；Panicali他、1981）や人為的欠失（Ｐｅｒｋｕｓ 他，１９９１；Ｐｅｒｋｕｓ 他，１９８９；Ｐｅｒｋｕｓ 他，１９８６）が報告されている。10kbが自然欠失したワクシニアウイルスのＷＲ株（Moss他、1981；Panicali他、1981）が弱毒化されていることが、マウスに頭蓋内接種することにより明らかとなった（Buller他、1985）。後に、この欠失部は17ヶの潜在的ＯＲＦを含むことが判明した（Kotwal他、1988b)。該欠失部内にある特定の遺伝子としては、ビロカインＮ１Ｌおよび35ｋＤａタンパク質（Goebel他による1990a,b の報告でＣ３Ｌと称するもの）が挙げられる。挿入によりＮ１Ｌを不活化すると、通常のマウスおよびヌードマウスのいずれについても、頭蓋内接種により毒性が減少する（Kotwal他、1989a)。上記の35ｋＤａタンパク質は、ワクシニアウイルス感染細胞の培地にＮ１Ｌと同様に分泌される。このタンパク質は、補体コントロールタンパク質群、特に補体４Ｂ結合タンパク質（Ｃ４bp）に相同性である（Kotwal他、1988a)。細胞性Ｃ４bpと同様に、ワクシニアの35ｋＤａタンパク質は補体の第４成分と結合し、古典的補体カスケードを阻害する（Kotwal他、1990）。このように、ワクシニアの35ｋＤａタンパク質は、該ウイルスが宿主の防御機構を回避するのを助けることに関与しているものと考えられる。

ワクシニアゲノムの左末端は、宿主範囲遺伝子として同定された２つの遺伝子、Ｋ１Ｌ（Gillard 他、1986）およびＣ７Ｌ（Perkus他、1990）を含む。これらの遺伝子の双方が欠失すると、各種のヒト細胞系でワクシニアウイルスの増殖能が減少する（Perkus他、1990）。

本来的に宿主が制限されているポックスウイルスであるアビポックスウイルスを使用することに関する２つの付加的なワクチンベクター系がある。すなわち、ファウルポックスウイルス（ＦＰＶ：fowlpoxvirus）およびカナリアポックスウイルス（ＣＰＶ：canarypoxvirus）の両者を操作して外来遺伝子産生物を発現させてきた。ファウルポックスウイルス（ＦＰＶ）は、ポックスウイルス科のアビポックス（Avipox）属の原型ウイルスである。このウイルスは、家禽類に経済的に重要な疾病を引き起こすが、1920年代から弱毒化生ワクチンを使用することにより良好な対策が講じられてきた。アビポックスウイルスの複製は鳥類に限られ（Matthews、1982）、ヒトを含む非鳥類においてアビポックスウイルスの感染が起こったという文献の報告は存在しない。このように宿主が制限されているので、他の種にウイルスが伝染することに対する本質的な安全性が確保され、アビポックスウイルス由来のワクチンベクターは魅力ある手段として獣医学やヒト用途へ応用される。

ＦＰＶは、家禽類病原体由来の抗原を発現する優れたベクターとして使用されてきた。毒性トリインフルエンザウイルスの血球凝集素タンパク質がＦＰＶ組換体で発現された（Taylor他、1988a)。この組換体をニワトリおよび七面鳥に接種すると、同種または異種のビルレントインフルエンザウイルスのいずれの免疫性テストに対しても防御能のある免疫応答が誘起された（Taylor他、1988a)。ニューカッスル病ウイルスの表面糖タンパクを発現するＦＰＶ組換体も開発された（Taylor他、1990；Edbauer 他、1990）。

宿主制限によりＦＰＶおよびＣＰＶの複製はトリ系に限られているにも拘わらず、これらのウイルスから誘導された組換体は、非トリ供給源細胞において外来遺伝子を発現することが見出された。さらに、そのような組換体ウイルスは、該外来遺伝子産生物に対する免疫応答を引き起こし、場合によっては、相応する病原体による免疫性テストに対する防御能を有することが示された（Tartaglia 他、1993a,b ；Taylor他、1992；1991b ；1988b)。

ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）は、国内および外国のネコ等のネコにおける慢性、進行性で、免疫学的に媒介される病気である。ＦＩＰＶ感染の経路は主に口腔および咽頭を通して発生すると考えられている。臨床的に明白なＦＩＰは、ウイルスが粘膜バリアを越えた後に生じ、第１次ウイルス血症により、ＦＩＰＶが多くのその標的器官（肝臓、脾臓、腸および肺）へ送られる。２つの病気の型が、発露（ウエット）および非発露（ドライ）として記述されている。発露型は、感染したネコにおいて見られる、補体の活性化と強度の炎症反応によって仲介されたアルツス型脈管炎によって引き起こされた古典的液体蓄積という結果となる。非発露型は、腹水液体蓄積が僅かであるかまたは無いが内部器官は粒状繊維状堆積物により膨張していることがある、という特徴を有する。これまでは、ＦＩＰＶ感染に反応して生成された抗体（主にスパイクタンパク質に対するもの）は、病気の病原性を促進させる傾向にあり、ワクチンまたは免疫学的組成物中には明らかに望まれてはいなかった（Ｏｌｓｅｎ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，１９９１）。（しかしながら、そのようなタンパク質の組換体による発現および組換体それら自身は、抗原またはそれ由来の抗体のためのキット、テストまたはアッセイまたはそのようなものが要望される場合には有用である）。

ＦＩＰＶはコロナウイルス科のメンバーである。コロナウイルスは大型の、ゲノム長２７−３０ｋｂの陽性鎖ＲＮＡウイルスである。ウイルス粒子は覆われており、スパイクと呼ばれるポリマー性構造がちりばめられている。ＦＩＰＶゲノムの左半分は小さい断片に分解されるラージポリプロテインをコードしており、それらのうちのいくつかはＲＮＡ複製に関与している。ＦＩＰＶゲノムの右半分は、ヌクレオキャプシド（Ｎ）、マトリックス（Ｍ）、およびスパイク（Ｓ）と称する３つの主要な構造タンパク質をコードしている。ＦＩＰＶ Ｓ遺伝子産物は、ウイルスの細胞レセプターへの取付を仲介し、膜融合の引き金となり、ウイルス中性化抗体を誘導する。Ｎタンパク質は、ＲＮＡゲノムのキャプシド化（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｎｇ）およびそのキャプシドへの取り込みの指示に必要であり、ＲＮＡ複製に関与していると考えられている。ＦＩＰＶ Ｍ糖タンパク質は、ＦＩＰウイルス成熟に関して、およびウイルス粒子が集合するサイトの決定に関して重要であるように見受けられる（Ｓｐａｎｎ 他、１９８８）。

ＦＩＰのネコにおける抗体依存促進（ＡＤＥ）のため、ＦＩＰＶに対する安全で有効なワクチンまたは免疫学的組成物は概ね不成功に終わっていた。不活性化されたＦＩＰＶワクチンおよび異種生コロナウイルスワクチンは、ＦＩＰＶ感染に対する如何なる防御をも可能とはせず、ワクチン接種は通常、病気に対する感作を増加されるという結果に終わった。改変生ウイルスワクチン、プリムセル（Ｐｒｉｍｕｃｅｌｌ）は最初で唯一の市販されたＦＩＰＶワクチンである。プリムセルは鼻腔内の比較的低い温度においてのみ複製可能であるが全身の温度では可能ではないＦＩＰＶ温度感受性株である（Ｇｅｒｂｅｒ 他、１９９０）。これまで、鼻腔内投与されたプリムセルはＦＩＰＶに対する局在化された免疫を生じさせると考えられている。しかしながら、このワクチンの有効性および促進可能性に関する深刻な疑問は依然残っている（Ｏｌｓｅｎ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，１９９１）。

ワクシニアウイルスは、ＦＩＰＶ構造遺伝子を発現する組換体ウイルスの生成のためのベクターとして利用されてきている。ＦＩＰ Ｍ遺伝子を発現する組換体はＦＩＰＶでの免疫性テストの後のネコの生存時間を増加させることが示された（Ｖｅｎｎｅｍａ 他、１９９０）。

Ｖｅｎｎｅｍａ他（１９９１）は、ネコ感染性腹膜炎ウイルスの膜の１次構造およびヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子、および、子ネコに導入されたそれらの組換体ワクシニアウイルスに関するものである。Ｖｅｎｎｅｍａ他のＦＩＰＶマトリックス遺伝子は病原性株（７９−１１４６）からクローン化され、その配列はマトリックス遺伝子（ここにおいて議論される）と同一であるように見受けられる。Ｖｅｎｎｅｍａ他の組換体ｖＦＭは、チミジンキナーゼ（ｔｋ）座に挿入された、ワクシニア７．５ｋ初期／後期プロモーターと結合されたマトリックスのコード領域を含有している。このプロモーターが正確にマトリックスＡＴＧ開始コドンに結合されておらず、むしろＡＴＣから位置４８上流に結合されていることに注意されたい。また、マトリックス遺伝子のコード領域内に位置しているワクシニアＴ５ＮＴ初期転写終結シグナル（Ｙｕｅｎ 他、１９８７）は除去されていない。

さらに、Ｖｅｎｎｅｍａ他のワクシニア株は、ＷＲ株である（Ｖｅｎｎｅｍａ他、３２８頁、左側縦段、最初の２行；また、同じ頁の左のカラムの中程から始まっている「ＦＩＰＶ ＭおよびＮタンパク質を発現する組換体ワクシニアウイルスの構築」の部分において言及されているドナープラスミドおよび対照ウイルスは、明らかに、引用文献を通して、ＷＲ株が用いられていることを示していることを参照されたい）。株の選択は重要である。それはＷＲ株が実験室用の菌株である（ワクチン菌株ではない）ため、および、最近の接触伝播の懸念により、子ネコ等のネコ、またはヒト、特に子供または免疫抑制個体と接触している他の動物（このような「他の動物」は、抗原発現のため、またはキット、テストまたはアッセイの作成のための抗体生成のための実験室用細胞培養または動物であり得る）を標的としたワクチンまたは抗原性または免疫的組成物などの組成物における組換体はいうまでもなく、ヒトと接触する可能性のあるベクターとして今のところは許容可能とはしていないＷＲ株の毒性のためである。

このように、Ｖｅｎｎｅｍａ他の記事は本発明の組換体、組成物および方法を教示または示唆してはいない。

より特定的には、本発明の組換体は好ましくはＮＹＶＡＣまたはベクターを使用している（ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣはＢＳＬ１汚染レベルを有する高度に弱毒化されたベクターである）。

さらに、本発明の構築物においては、好ましくはコード領域は、介在配列無しにＡＴＧコドンへの厳密な結合によりプロモーターに結合されている。（いずれかのＴ５ＮＴ配列が、ポックスウイルスベクターにおいてアミノ酸配列を変化させないが初期転写終結を防いでいる塩基置換によって不活性化されていても良い）。さらに、複数の、例えば２つの、プロモーターに直接結合されたコード領域のコピーが、本発明の各々の組換体ウイルスゲノム中に存在しても良い。

Ｖｅｎｎｅｍａ他の効率試験では、第０日および第２１日にそれぞれ１ｘ１０^８ および５ｘ１０^８ ｐｆｕで皮下ワクチン接種されたＳＰＦ子ネコ（生後１３−１４週）を用いた。第３５日にネコを、ＦＩＰ株７９−１１４６で経口で免疫性テストした。

ここにおいての手順は、より低いワクチン接種量（１ｘ１０^７ ）という主な違いはあるが同様であった。Ｖｅｎｎｅｍａの防御の結果はｖＦＭでワクチン接種された８匹のネコのうちの３匹が生存した死亡率（３７．５％）に基づいている。Ｖｅｎｎｅｍａ他は、ワクチン接種されていないネコ８匹のうち７匹が免疫性テストを受けて倒れ死亡したことを免疫性試験として十分であるとしている。剖検において、Ｖｅｎｎｅｍａでは、ｖＦＭワクチン接種された３匹の生存したネコを含めた全ての免疫性テストを受けたネコが、内蔵に腹膜溢出および肉芽腫性外傷を含むＦＩＰ感染の病原性兆候を有していた。

これとは対照的に、ここにおける試行はより厳密であった。ここにおいて、出願人は、生存し、剖検においてＦＩＰ病原を有していないことを防御として評価した。この判断基準を用いて、本出願人はワクチン接種されていないネコの０％が防御された条件で５匹のうち３匹を防御した。Ｖｅｎｎｅｍａの結果を本出願人の基準で評価すると、Ｖｅｎｎｅｍａでは防御が得られず、従ってワクチンとしての使用に好適な組換体も得られていない。さらに、Ｖｅｎｎｅｍａにおいては、免疫性テストを受けた全てのネコにおいて熱および体重減少が見られた。本出願人の試行においては、投与後に体重減少も低温の発熱反応すらも見られなかった（特に試行３を参照）。

このように、本発明の組換体は、全ての利用のために許容可能であるベクターおよびＶｅｎｎｅｍａ他のワクシニア組換体と比較してより低い用量で驚異的に高い防御レベルを採用している。

Ｓ遺伝子に対するモノクローナル抗体を用いた最近の研究により（Ｏｌｓｅｎ 他、１９９２）、ウイルスを中性化するｍＡＢ群もまたＡＤＥを引き起こすことが示された。マトリックスまたはヌクレオキャプシドタンパク質に対するｍＡＢ群に関しては促進は見られなかった。

このように、本発明の以前には、ポックスウイルス−ＦＩＰＶ組換体、特に許容できるベクターを用いた組換体であって確実に防御を可能とする低い用量での発現を有する組換体の需要があった；そして、そのような組換体を含む組成物に対する需要、並びに、それらの製造および使用方法に対する需要があった。さらには、このポックスウイルス−ＦＩＰＶ組換体が弱毒化されるよう改変されるかどうか、例えば、ＮＹＶＡＣ−ＦＩＰＶまたはＡＬＶＡＣ−ＦＩＰＶ組換体等の弱毒化されたワクシニアウイルス−ＦＩＰＶまたはアビポックス−ＦＩＰＶ組換体はまったく驚異的で予想されてはいなかった；例えば弱毒化および宿主中でのポックスウイルスの生産的複製を減少されているかまたは欠失していることから、弱毒化組換体の有用性、特にネコその他の宿主のための組成物においての、さらに特にネコにおける防御を含む反応を提供する組成物においての有用性を当業者は予想しなかったであろうし、それに驚かされるであろう。

弱毒化ポックスウイルスベクターは抗原的またはワクチン組成物のために、特に、意図された宿主に関して、または、例えばベクターまたは抗原の調合または投与に関わる者、またはそれ以外にそれらと接触する機会のある者等の潜在的、偶発的な意図されていない宿主に関して病原性特性をもたらさないという観点から非常に有用である。即ち、ネコ、子ネコおよびそのようなもの等の意図された宿主、および、意図されていない宿主、例えば、投与のための組成物中へのベクターの配合、または組成物の投与に従事している人（獣医師、技術者、その他の労働者等）、またはそれ以外にベクターと接触する機会のある者（ペットのオーナー等）に弱毒化されたポックスウイルスがもたらす病原性は、減少された、または僅かであるか、または無である。
米国特許第4,769,330号公報 米国特許第4,772,848号公報 米国特許第4,603,112号公報 米国特許第5,100,587号公報 米国特許第5,179,993号公報

このように、ＦＩＰＶ組換体ポックスウイルスおよびそれ由来の産物、特にＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣベースの、ＦＩＰＶ組換体および組成物およびそれら由来の産物、およびそれ由来の組成物および産物を供給することは、現在の技術水準を超える高度に好ましい前進であろう。

したがって、本発明の目的は、安全性の向上した改変組換体ウイルスを提供すること、およびそのような組換体ウイルスを製造する方法を提供することにある。

本発明の付加的な目的には、組換体ポックスウイルス−ＦＩＰＶ、該組換体を含む組成物、該組換体由来または該組成物由来の抗原（群）、組換体と組成物の製造方法、例えば、投与または感染によるインビボまたはインビトロでの発現のための使用等の、組換体と組成物の使用方法が含まれる。好ましくは、ポックスウイルス−ＦＩＰＶ組換体組成物は抗原性またはワクチンまたは免疫性組成物である（即ち、抗原を発現する組換体、または抗原の発現からの産物を含む組成物）。

本発明のさらなる目的は、既知の組換体ポックスウイルスワクチンと比較して安全性のレベルが増大した免疫組成物または組換体ポックスウイルス抗原ワクチンを提供することにある。

本発明のさらなる目的は、ベクターが宿主中において弱毒化された毒性を有するように改変されている、宿主中において遺伝子産生物を発現する改変ベクターを提供することにある。

本発明の別の目的は、安全性のレベルが増大した改変組換体ウイルスまたは改変ベクターを用いて、インビトロで培養された細胞中で遺伝子産生物を発現する方法を提供することにある。

１つの側面において、本発明は、組換体ウイルスが減衰された毒性と促進された安全性を有するように、ウイルスにコードされた遺伝的機能が不活性化された改変組換体ウイルスに関する。その機能とは、非必須かまたは毒性に関連したものであり得る。ウイルスは、有利には、ポックスウイルス、特にワクシニアウイルス、または、ファウルポックスウイルスおよびカナリアポックスウイルス等のアビポックスウイルスである。改変組換体ウイルスは、ウイルスゲノムの非必須領域内に、ＦＩＰＶから派生された抗原またはエピトープをコードしている異種ＤＮＡ配列を有していても良い。

別の側面においては、本発明は、その組成物が接種された宿主動物において抗原性または免疫性または防御反応を誘導するための抗原性、免疫性またはワクチン組成物または治療組成物であって、そこにおいて当該組成物は担体と改変組換体ウイルスであって当該組換体ウイルスが減衰された毒性および促進された安全性を有するように非必須ウイルスコード遺伝子領域を不活性化されているものを含有しているものに関する。本発明に従った組成物において用いられているウイルスは、有利には、ポックスウイルス、特にワクシニアウイルス、または、例えばファウルポックスウイルスおよびカナリアポックスウイルス等のアビポックスウイルスである。改変組換体ウイルスは、ウイルスゲノムの非必須領域内に、ＦＩＰＶから派生された等の抗原タンパク質をコードしている異種ＤＮＡ配列を有していても良い。組成物は、ＦＩＰＶ抗原（群）をコードし発現する組換体または単離された抗原（群）を含有していても良い。

さらに別の側面においては、本発明は、前述の組換体または組成物を用いる方法に関する；例えば、ＦＩＰＶ抗原（群）に対するインビボ反応を得ることである。この方法は、キット、アッセイおよびそのような物のための抗体の製造のために、ネコまたは実験動物等（ラット、マウス、ジャービルまたはそのような物等のげっ歯類等）の他の宿主に組換体または組成物を投与することを含んでも良い。

さらなる側面においては、本発明は、減衰された毒性と促進された安全性を有する改変組換体ウイルスを細胞中に導入することによりインビトロで遺伝子産物を発現させるための方法に関する。改変組換体ウイルスは、ウイルスゲノムの非必須領域内に、ＦＩＰＶウイルスから派生された抗原タンパク質をコードしている異種ＤＮＡ配列を有していても良い。産物は続いて、免疫反応を刺激するためにネコまたはネズミ等の個体に投与可能である。生成された抗体は個体内でＦＩＰＶの防御または治療に有用であり得、そして、個体または動物由来の抗体または単離されたインビトロ発現産物は、狂犬病や他の疾患またはそれ由来の抗原またはそれに対する抗体の、血清などの試料における存在または不在（および、それ故、ウイルスまたはその産物またはウイルスまたは抗原に対する免疫反応の存在または不在）を決定するためのウイルス診断キット、アッセイまたは試験のために利用可能である。

またさらなる側面においては、本発明は改変組換体ウイルスおよびそのような物を含む組成物に関する。該組換体ウイルスは、ウイルスにコードされている非必須遺伝子機能が不活化されていることにより毒性が弱毒化されており、さらに、ウイルスゲノムの非必須領域に外来源のＤＮＡを含有している。このＤＮＡは、ＦＩＰＶ抗原（群）をコードしていても良い。さらに詳述すれば、遺伝子機能は、毒性因子をコードするオープンリーディングフレームを欠失させることにより、または、自然の宿主制限ウイルスを利用することによって不活化されている。本発明に用いるウイルスは、ポックスウイルスが有利であり、特にワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルス、例えばファウルポックスウイルスまたはカナリアポックスウイルスである。オープンリーディングフレームは、Ｊ２Ｒ、Ｂ13Ｒ＋Ｂ14Ｒ、Ａ26Ｌ、Ａ56Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ、およびＩ４Ｌ（Goebel他による1990a,b の報告における名称による）から成る群、ならびにそれらの組合せにより選択されるのが好ましい。ここで、オープンリーディングフレームは、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主範囲遺伝子領域もしくはリボヌクレオチドレダクターゼのラージサブユニット、またはそれらの組合せを含むゲノム領域から成る。ワクシニアウイルスの好適な改変Copenhagen株は、ＮＹＶＡＣとして同定されたものであり( Tartaglia 他、1992）、または、Ｊ２Ｒ、Ｂ13Ｒ＋Ｂ14Ｒ、Ａ26Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１ＬおよびＩ４Ｌまたはチミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主範囲領域、リボヌクレオチドレダクターゼのラージサブユニットが欠失されたワクシニアウイルスである（米国特許第5,364,773 号も参照されたい）。他の好適なポックスウイルスは、ＡＬＶＡＣであり、カナリアポックスウイルス( Rentschlerワクチン株）が、例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞による200 回を超える継代培養により弱毒化され、そのマスター種株が寒天培地下の４回の連続的なプラーク精製に供された後、５回の追加の継代培養によりプラーククローンが増幅されたものである。

本発明は、さらに別の態様として、本発明によるポックスウイルス−ＦＩＰＶ組換体の発現産生物およびその使用、例えば、ネコ等の動物等の宿主への投与、または治療、予防、診断または試験のための、または防御または反応のための投与のための抗原性、免疫性またはワクチン組成物の調製、およびそのような組成物の使用方法に関する。ＦＩＰＶ抗原（群）、またはＦＩＰＶ抗原群をコードしているＤＮＡは、Ｍ、Ｎ、および３つのバージョンのＳ；Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３またはＭ＋Ｎ等のそれらの組合せをコードしていても良い。

本発明（組換体、組成物および方法および使用）は、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ組換体、特にＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣ−ＦＩＰＶ組換体は、弱毒化されているにもかかわらず、驚くべき発現を有し、その発現は感受性宿主において真正の防御的反応を付与するものであるという発見に基礎を見いだしている。

これらの態様およびその他の態様は、以下の詳細な説明によって提供され、それより明らかであろう。

新しいワクシニアワクチン菌株ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）を開発するために、ワクシニアウイルスのコペンハーゲンワクチン菌株を、既知または潜在的な毒性要因をコード化するゲノムの６つの非必須領域の欠失により改変した。一連の欠失が以下詳細に記載されている（米国特許第5,364,773号を参照されたい）。ワクシニア制限断片、オープンリーディングフレームおよびヌクレオチド位置の全ての指定は、Goebel等, 1990a,bに報告されている用語法に基づいている。

欠失座もまた、異種遺伝子を挿入するための受容体座として設計された。

ＮＹＶＡＣ中で欠失された領域が以下に列記されている。欠失された領域の省略形およびオープンリーディングフレームの命名（Goebel等，1990a,b）並びに指定された欠失により全ての欠失を含有するワクシニア組換体（ｖＰ）の命名もまた列記されている：
(1) チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）ｖＰ４１０；
(2) 出血性領域（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ５５３；
(3) Ａ型封入体領域（ＡＴＩ；Ａ２６Ｌ）ｖＰ６１８；
(4) 血球凝集素遺伝子（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）ｖＰ７２３；
(5) 宿主範囲遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）ｖＰ８０４；および
(6) リボヌクレオチドレダクターゼラージサブユニット（Ｉ４Ｌ）ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）。

ＮＹＶＡＣは、毒性および宿主範囲に関連する遺伝子産生物を含む遺伝子産生物をコードする18のオープンリーディングフレームを特異的に欠失させることにより遺伝子工学的手法で得られたワクシニアウイルス株である。ＮＹＶＡＣは高度に弱毒化されるが、このことは以下のような多くの特徴からも判る：i)新生マウスに脳内接種後の毒性が減少されていること、ii) 遺伝学的に（nu+ / nu+ ）または化学的（シクロホスホアミド）に免疫無防備状態であるマウスにおける接種可能であること、iii)免疫無防備状態マウスにおいて、播種性感染を起こさないこと、iv) ウサギ皮膚の顕著な硬化や潰瘍形成がなくなること、v)接種部位から迅速に消散すること、vi) 多くの組織培養細胞系統（ヒト由来のものを含む）において複製能が激減していること。これにも拘わらず、ＮＹＶＡＣに基づくベクターは、外来性免疫原に対して優れた応答を誘起し防御免疫を提供する。

ＴＲＯＶＡＣとは、弱毒化ファウルポックスであって、ニワトリへのワクチン接種がライセンスされているファウルポックスウイルスＦＰ−１ワクチン株からプラーククローンされた単離体である。ＡＬＶＡＣは、弱毒化カナリアポックスを基礎とするベクターであり、ライセンスされているカナリアポックスワクチンＫａｎａｐｏｘ（Tartaglia 他、1992）からプラーククローンにより得られたものである。ＡＬＶＡＣの一般的性質には、Ｋａｎａｐｏｘの一般的性質と同じものがある。外来性免疫原を発現するＡＬＶＡＣ系組換体ウイルスは、ワクチンベクターとしても有効であることが示されている（Tartaglia 他、1993a,b)。このアビポックスベクターは、その複製がトリ類に限定されている。ヒトの培養細胞においては、ウイルスのＤＮＡ合成の前にウイルス複製サイクルの初期にカナリアポックスウイルスの複製は中断してしまう。しかしながら、外来性免疫原を発現するように操作すれば、哺乳動物細胞中でインビトロで真正な発現とプロセシングが認められ、多くの哺乳動物種に接種すると該外来性免疫原に対する抗体および細胞性免疫応答を誘発し、同種の病原体の免疫性テストに対する防御を与える（Taylor他、1992；Taylor他、1991）。カナリアポックス／狂犬病糖タンパク質組換体（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）に関するヨーロッパおよび米国における最近のフェーズＩ臨床試験によれば、この試験ワクチンは、充分に受け入れられるものであり、防御レベルの狂犬病ウイルス中和抗体を誘起することが示された（Cadoz 他、1992；Fries 他、1992）。さらに、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ被接種者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、精製狂犬病ウイルスで刺激すると有意レベルのリンパ球増殖を示した（Fries 他、1992）。

また、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣは、以下の点において、あらゆるポックスウイルスの中でも独特であると考えられている。すなわち、米国公衆衛生局「ＮＩＨ」（National Institutes of Health)の組換えＤＮＡ勧告委員会（Recombinant DNA Advisory Committee）は、ウイルスやベクターのような遺伝子材料の物理的封じ込めに関するガイドライン、すなわち、特定のウイルスやベクターの病原性に基づくそれらのウイルスやベクターの利用における安全な取扱に関するガイドラインを出しているが、この物理的封じ込めのレベルをＢＳＬ２からＢＳＬ１に下げることを認めた。ここで、他のいずれのポックスウイルスもＢＳＬ１の物理的封じ込めレベルを認められていない。ワクシニアウイルスのCopenhagen株（最も一般的な天然痘ワクチンである）ですら、これよりも高い物理的封じ込みレベル、すなわち、ＢＳＬ２を有する。このように、当該分野においては、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣは他の何れのポックスウイルスよりも病原性が低いことが認められている。

ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣベクターの弱毒化特性およびそれらの示す外来免疫原に対する体液および細胞の両方の免疫学的反応を誘導する能力に明らかに基づいて（Ｔａｒｔａｇｌｉａ 他，１９９３ａ，ｂ；Ｔａｙｌｏｒ 他，１９９２；Ｋｏｎｉｓｈｉ 他，１９９２）、そのような組換体ウイルスは、以前に記述されたワクシニアベースの組換体ウイルスを超えためざましい利点を提供するものである。

本発明はポックスウイルス−ＦＩＰＶ組換体、好ましくはＦＩＰＶ Ｍ、Ｎ、およびＳの３つのバージョン；Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３またはＭ＋Ｎ等のそれらの組合せ、の何れかまたは全てをコードしている異種ＤＮＡを含んでいるＮＹＶＡＣ−またはＡＬＶＡＣ−ＦＩＰＶ組換体を提供するものである。

組換体ポックスウイルス−ＦＩＰＶまたはその発現産生物、組成物、例えば、免疫原性、抗原性もしくはワクチン組成物または治療組成物の投与手順は、非経口経路（皮内、筋肉または皮下）であっても良い。そのような投与により全身性免疫応答が可能となる。

さらに概説すれば、本発明に従うポックスウイルス−ＦＩＰＶ組換体、抗原性、免疫原性もしくはワクチンポックスウイルス−ＦＩＰＶ組換体組成物または治療組成物は、製薬または獣医の技術分野における当業者に周知の標準的な方法に従って調製することができる。それらの組成物は、特定の患者の年齢、性別、体重、種および症状、ならびに投与経路を考慮しながら、適当な投与量で獣医学または医学的分野の当業者に周知の方法に従って投与することができる。該組成物は、単独投与することもできるが、さらに、「他の」免疫原性、抗原性、ワクチンもしくは治療組成物と同時に、または、それらとともに特定の順序で逐次的に、動物または患者に投与することもでき、それにより本発明の、多価または「カクテル」または組合せ組成物、およびそれらを用いる方法が提供される。再び、成分および投与方法（逐次的または同時）並びに用量は、特定の患者の年齢、性別、体重および症状ならびに投与経路などの因子を考慮して決定できる。これに関し、ここに参考文献として取り込まれている、１９９５年６月７日に出願され、狂犬病組成物および組合せ組成物およびそれらの使用を標的としている米国特許出願番号第０８／４８６９６９号を参照する。

本発明の組成物の例には、例えば、腔部（例えば、口、鼻、肛門、膣、経口、胃内など）投与用の液状製剤、例えば、懸濁液、シロップまたはエリキシル剤など；さらには、非経口、皮下、皮内、筋肉内または静脈内投与（例えば、注入投与）用製剤、例えば、無菌の懸濁液またはエマルジョンが含まれる。それらの組成物においては、組換体ポックスウイルスに、適当なキャリア、稀釈剤、または賦形剤、例えば無菌水、生理食塩水、ブドウ糖などを混合させてもよい。組成物は凍結乾燥されていても良い。組成物は、潤化またはエマルジョン化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、ゲル化または粘度増加添加物、保存剤、調味料、着色剤等の補助物質を、投与経路および所望の調製に応じて含んでいても良い。標準的なテキスト「ＲＥＭＩＮＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ」、第１７版（ここに参考文献として取り込まれている）等が、過度の実験を行うことなく好適な調製物を調製するために参考にされるであろう。

さらに、本発明の組換体ポックスウイルスの発現産生物およびそれらを含む組成物を直接使用して、ヒトまたは動物における免疫応答を刺激することもできる。すなわち、上述の組成物における本発明の組換体ウイルスの代わりにまたはそれに加えて、該発現産生物を使用することができる。

さらに、本発明の組換体ポックスウイルスおよびそれに由来する発現産生物は、動物における免疫または抗体応答を刺激し、したがって該産生物は抗原である。これらの抗体または抗原から、当該技術分野で周知の手法により、モノクローナル抗体を調製することができ、そして、周知の抗体結合アッセイ系、診断キットまたはテストにおいてこれらのモノクローナル抗体または抗原を、特定のＦＩＰＶ抗原（群）の有無、したがって、該ウイルスまたは抗原群の有無を測定したり、または、該ウイルスまたは抗原に対する免疫応答が単に刺激されたか否かを判定するための公知の結合アッセイ、診断キットまたは試験において用いることができる。これらのモノクローナル抗体または抗原は、免疫吸着クロマトグラフィーに使用されて、ＦＩＰＶ抗原（群）または本発明の組換体ポックスウイルスの発現産生物または本発明の組成物を回収したり単離することもできる。

モノクローナル抗体を製造する方法およびモノクローナル抗体の使用方法、ならびにＦＩＰＶ抗原（本発明のポックスウイルスの発現産生物および組成物）の使用法などは当該技術分野における当業者には周知である。それらは、診断法、キット、テストまたはアッセイなどに使用されるとともに、免疫吸着クロマトグラフィーまたは免疫沈降反応による物質回収に使用され得る。

モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞により産生される免疫グロブリンである。モノクローナル抗体は、単一の抗原決定基に反応し、通常の血清由来の抗体よりも高い特異性を与える。さらに、多数のモノクローナル抗体にスクリーニングを行うことにより、所望の特異性、アビディディ（抗原結合力）およびイソタイプを有する個々の抗体を選択することができる。ハイブリドーマ細胞系は、化学的に同一の抗体の恒常的且つ安価な供給源となり、そして、そのような抗体の調製は容易に標準化できる。モノクローナル抗体を産生する方法は当該技術分野における当業者には周知であり、例えば、Koprowski,H 他による米国特許第4,196,265 号1989年４月１日査定）が参考文献としてここに取り込まれている。

モノクローナル抗体の用途も既知である。そのような用途の一つは診断法に利用するものであり、例えば1983年３月８日付でDavid,G.およびGreene,H. に付与された米国特許第4,376,110 号を引用しておく。モノクローナル抗体は、免疫吸着クロマトグラフィーにより物質を回収するのにも利用されており、例えば、Milstein,C. による「Scientific American 243 : 66, 70 (1980) 」を引用しておく。

さらに、本発明の組換体ポックスウイルスおよび組成物は、ここにおいて言及されたいくつかの用途を有する。本発明の実施態様としてはその他の用途もある。

本発明およびその多くの利点は、説明のために記載する以下の実施例から良好に理解されよう。

ＤＮＡクローニングおよび合成 標準的な方法により、プラスミドを構築し、スクリーニングし、増殖させた（Maniatis等，1982; Perkus等，1985; Piccini等，1987）。制限エンドヌクレアーゼは、メリーランド州、ゲイサースブルグのベセスダリサーチラボラトリーズ；マサチューセッツ州、ビバーリーのニューイングランドバイオラド；およびインディアナ州、インディアナポリスのベーリンガーマンハイムバイオケミカルズから得た。Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片は、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルズから得た。ＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼおよびファージＴ４ ＤＮＡリガーゼは、ニューイングランドバイオラボから得た。様々な供給者により指定された試薬を用いた。

合成オリゴデオキシリボヌクレオチドは、既述のように（Perkus他、1989）Biosearch 8750またはApplied Biosystems 380B ＤＮＡ合成装置を用いて調製した。ＤＮＡ配列決定は、既述の手法に従い（Guo 他、1989）シークエナーゼ（Sequenase)を用いて（Tabor 他、1987）ジデオキシ−チェインターミネーション法により（Sanger他、1977）行った。配列確認のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅（Engelke 他、1988）は、自動式Perkin Elmer Cetus ＤＮＡ熱サイクル装置（ＤＮＡ Thermal Cycler)によりカスタム合成オリゴヌクレオチドプライマーおよびGeneAmp ＤＮＡ増幅試薬キット（米国コネチカット州Norwalk のパーキン・エルマー・シータス（Perkin Elmer Cetus）社製）を用いて実施した。制限エンドヌクレアーゼでの消化、それに続くＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼによる限定的消化、および合成オリゴヌクレオチドを用いた突然変異法（Mandecki,1986)により、過剰ＤＮＡ配列をプラスミドから除去した。

細胞、ウイルスおよびトランスフェクション ワクシニアウイルスのコペンハーゲン（Copenhagen）株の起源および培養条件については既に記述されている（Guo 他、1989；）。組換えによる組換体ウイルスの調製、ニトロセルロースフィルターを用いるインサイチュハイブリダイゼーションおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を利用するスクリーニングについては既に記述されている（Piccini 他、1987）。

ワクシニアウイルスのコペンハーゲン（Copenhagen）株およびＮＹＶＡＣの起源および培養条件については既に記述されている（Guo 他、1989；Ｔａｒｔａｇｌｉａ他、１９９２）。組換えによる組換体ウイルスの調製、ニトロセルロースフィルターを用いるインサイチュハイブリダイゼーションおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を利用するスクリーニングについては既に記述されている（Ｐａｎｉｃａｌｉ 他，１９８２；Ｐｅｒｋｕｓ 他，１９８９）。

ＮＹＶＡＣは、ここに参考文献として取り込まれている米国特許第５３６４７７３号および許可された米国特許出願第１０５４８３号を参照し調製された。

カナリアポックスウイルスの親株（Rentschler株）はカナリアのワクシニア菌株である。このワクチン株は、野生型の単離体から得られ、ニワトリ胚繊維芽細胞を用いる200 回を超える継代培養を経て弱毒化されたものである。そのマスターウイルス種株は寒天を用いたの４回の連続的なプラーク精製に供され、そのプラーククローンの１つが５回の追加の継代培養により増幅され、その後、このストックウイルスが親ウイルスとしてインビトロ組換え試験に使用されてきた。このプラーク精製カナリアポックス単離体をＡＬＶＡＣと称する。

ＦＰ−１と称するファウルポックスウイルス（ＦＰＶ）株については既に明らかにされている（Taylor他、1988a)。これは、日齢のニワトリのワクチン接種に有用な弱毒化ワクチン株である。親ウイルス株Duvette は、フランスにおいてニワトリからファウルポックス疥癬として入手された。このウイルスが胚ニワトリ卵での約50回の連続的な継代培養およびそれに続くニワトリ胚繊維芽細胞における25回の継代培養により弱毒化された。該ウイルスは４回の連続的なプラーク精製に供された。プラークの１つが単離され、初期ＣＥＦ細胞中で増幅され、ＴＲＯＶＡＣと称するストックウイルスが確率された。

ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣ各ウイルスベクターおよびそれらの派生体が既に記述されている（Piccini 他、1987；Taylor他、1988a,b)とおりに増殖させた。ベロ（Vero）細胞およびニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を既に明らかにされているとおりに（Taylor他、1988a,b)増殖させた。

実施例１−ＡＬＶＡＣベースのＦＩＰＶ組換体の生成
１．ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）マトリックス糖タンパク質遺伝子オープンリーディングフレームを発現するＡＬＶＡＣ組換体（ｖＣＰ２６２）の生成
７９−１１４６ＦＩＰＶ株をＤｒ．Ｆ．Ｓｃｏｔｔ（Ｃｏｒｎｅｌｌ大学、Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ）より入手した。ＦＩＰＶ感染ＣＲＦＫ細胞から全ＲＮＡを、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ他（１９７９）のグアニジウムイソチオシアネート−塩化セシウム手順を用いて単離した。第１鎖ｃＤＮＡを、ＡＭＶ逆転写酵素およびランダムオリゴヌクレオチドプライマー（６マー）を用いてＷａｔｓｏｎ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ（１９８５）の手順により合成し、ＦＩＰＶ陽性鎖ｍＲＮＡに相補的な１本鎖ｃＤＮＡを得た。

マトリックス遺伝子（Ｍ）を、第１鎖ｃＤＮＡから、オリゴヌクレオチドプライマーＲＧ７３９（配列番号１）（５’−ＴＡＡＧＡＧＣＴＣＡＴＧＡＡＧＴＡＣＡＴＴＴＴＧＣＴ−３’）およびＲＧ７４０（配列番号２）（５’−ＡＴＴＧＧＴＡＣＣＧＴＴＴＡＧＴＴＡＣＡＣＣＡＴＡＴＧ−３’）を用いて増幅した。これらのプライマーはＧｅｎＢａｎｋ配列ＣＯＦＩＰＶＭＮ（預託番号Ｘ５６４９６）（Ｖｅｎｎｅｍａ 他、１９９１）から派生された。この８００ｂｐＰＣＲ断片をＡｓｐ７１８／ＳａｃＩで消化し、ゲル精製し、Ａｓｐ７１８／ＳａｃＩで消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋中に連結し、ｐＢＳＦＩＰＭを得た。Ｍ遺伝子ＯＲＦは配列決定され、図１に示されている（配列番号３）。

ｐＢＳＦＩＰＭをＧＭ４８（ｄａｍ−）細胞中に形質転換し、ジメチル化されたプラスミドを単離した（ｐＢＳＦＩＰＭ−ｄｅｍｅｔｈ）。３３０ｂｐのＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチドＲＧ７５１（配列番号４）(5’-TCTGAGCTCTTTATTGGGAAGAATATGATAATATTTT-GGGATTTCAAAATTGAAAATATATAATTACAATATAAAATGAAGTACATTTTGCT-3’)およびＲＧ７５２（配列番号５）(5’-CACATGATCAGCATTTTAATGCCATAAACGAGCCAGCTAAA-TTGTGGTCTGCCATATTG TAACACTGTTATAAATACAATC-3’)を用いてｐＢＳＦＩＰＭから増幅し、ＳａｃＩ／ＢｃｌＩで消化した。この断片をゲル精製し、ＢｃｌＩで消化されたｐＢＳＦＩＰＭ（ｄｅｍｅｔｈ）中に連結し、ｐＦＩＰＭ４２Ｋを得た。８５ｂｐ断片を、オリゴヌクレオチドＲＧ７４９（配列番号６）(5’-TCCGAGCTCTAATTAATT-AACGAGCAGATAGTCTCGTTCTCGCCCTGCCTG-3’)およびＲＧ７５０（配列番号７）(5’-TACGAGCTCAAGCTTCCCGGGTTAATTAATTAGTCATCAGGCAGGGCGAGAACG-3’)からＰＣＲダイマーとして生成した。この断片をＳａｃＩで消化し、ＳａｃＩで消化されたｐＦＩＰＭ４２Ｋ中に連結し、ｐＦＩＰＭ４２ＫＶＱを得た。このプラスミド構築物は、エントモポックス４２Ｋプロモーター（配列番号８）(5’-TTTATTGGGAAGAATATGATAATATTTTGGG-ATTTCAAAATTGAAAATATATAATTACAATATAAA-3’)と結合された完全ＦＩＰＶマトリックスＯＲＦ（変異Ｔ５ＮＴ早期転写停止コドン有り）から成る発現カセットを有している。Ｔ５ＮＴ配列は、それ自身がもはや早期転写停止シグナルとして機能せず、またアミノ酸は変化しないように改変されている。このカセットはｐＦＩＰＭ４２ＫＶＱをＡｓｐ７１８／ＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより切り出され、９５０ｂｐの断片として単離される。この断片の末端をクレノーポリメラーゼを用いて平滑化し、ＳｍａＩ消化されたＡＬＶＡＣ Ｃ５座挿入プラスミドｐＮＣ５ＬＳＰ−５と連結した。その結果得られるドナープラスミドｐＣ５ＦＩＰＭ４２Ｋを、ＤＮＡ配列分析で確認した。それは、ＡＬＶＡＣ Ｃ５挿入座の左および右腕が隣接している、ＡＴＧでＦＩＰＶマトリックスＯＲＦに結合されたエントモポックス４２Ｋプロモーターを有している（図２（配列番号９））。

ドナープラスミドｐＣ５ＦＩＰＭ４２Ｋを、ＡＬＶＡＣウイルスベクターとともにインビボ組換え（Ｐｉｃｃｉｎｉ他、１９８７）において用い、組換体ウイルスｖＣＰ２６２を生成した。

ｖＣＰ２６２を感染させたＶＥＲＯ細胞の放射性標識破砕物を、１５Ａ９．９と称するＦＩＰマトリックス特異的モノクローナル抗体（Ｏｌｓｅｎ他、１９９２）を用いて免疫沈降分析することにより、３０ｋＤａのポリペプチドバンドの発現が示された。これはＭ遺伝子産物の期待される大きさと一致している。さらに、このバンドはＦＩＰＶ感染細胞から免疫沈降されたバンドと共に移動する。同じモノクローナル抗体を用いた蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析により、この発現されたタンパク質は感染細胞の細胞質に局在化されることが判明した。

２．ＦＩＰＶヌクレオキャプシド遺伝子オープンリーディングフレームを発現するＡＬＶＡＣ組換体（ｖＣＰ２６１Ａ）の生成
ＦＩＰＶヌクレオキャプシド遺伝子（Ｎ）を、第１鎖ｃＤＮＡ（上記１に記載）をテンプレートとして、およびプライマーＲＧ７４１（配列番号１０）（５’−ＴＡＡＧＡＧＣＴＣＡＴＧ−ＧＣＣＡＣＡＣＡＧＧＧＡＣＡＡ−３’）およびＲＧ７４２（配列番号１１）（５’−ＴＡＴＧＧＴＡＣＣＴＴＡ−ＧＴＴＣＧＴＡＡＣＣＴＣＡＴＣ−３’）を用いてＰＣＲにより増幅した。これらのプライマーはＧｅｎＢａｎｋ配列ＣＯＦＩＰＶＭＮ（預託番号Ｘ５６４９６）（Ｖｅｎｎｅｍａ 他、１９９１）から派生された。この１１５０ｂｐＰＣＲ断片をＡｓｐ７１８／ＳａｃＩで消化し、ゲル精製し、Ａｓｐ７１８／ＳａｃＩで消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋中に連結し、ｐＢＳＦＩＰＮを得た。Ｎ遺伝子ＯＲＦは配列決定され、図３に示されている（配列番号１２）。

ワクシニアＩ３Ｌプロモーター（配列番号１３）(5’-TGAGATAAAGTGAAAATATATATCATTATATTACAAAGTACAATTATTTAGGTTTAATC-3’)（Ｓｃｈｍｉｔｔ ａｎｄ Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）をＮ ＯＲＦのＡＴＧに以下のように連結した。３７０ｂｐのＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチドプライマーＲＧ７４７（配列番号１４）(5’-CATCAGCATGAGGTCCTGTACC-3’)およびＲＧ７４８（配列番号１５）(5’-TAAGAGCTCTGAGATAAAGTGAAAATATATA-TCATTATATTACAAAGTACAATTATTTAGGTTTAATCATGGCCACACAGGGACAA-3’)を用いてｐＢＳＦＩＰＮをテンプレートとしてＰＣＲにより増幅した。この断片をＳａｃＩ／ＰＰｕＭＩで消化し、ＳａｃＩ／ＰＰｕＭＩで消化されたｐＢＳＦＩＰＮ中に連結し、ｐＦＩＰＮＩ３Ｌを得た。８５ｂｐの断片を、オリゴヌクレオチドＲＧ７４９（配列番号６）(5’-TCCGAGCTCTAATTAATTAACGAGCAGATAGTCTCGTTCTCGCCCTGCCTG-3’)およびＲＧ７５０（配列番号７）(5’-TACGAGCTCAAGCTTCCCGGGTTAATTAATTAGTCATCAGGCAGGGCGAGAACG-3’)からＰＣＲダイマーとして生成した。この断片をＳａｃＩで消化し、ＳａｃＩで消化されたｐＦＩＰＮＩ３Ｌ中に連結し、ｐＦＩＰＮＩ３ＬＶＱを得た。このＮ遺伝子発現カセット（Ｉ３ＬプロモートされたＮ）は、ｐＦＩＰＮＩ３ＬＶＱをＡｓｐ７１８／ＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより１３００ｂｐの断片として切り出された。この断片の末端をクレノーポリメラーゼを用いて平滑化し、ＳｍａＩ消化されたＣ３座挿入プラスミドｐＳＰＣＰ３ＬＳＡ（以下を参照）と連結した。その結果得られるドナープラスミドｐＣ３ＦＩＰＮＩ３Ｌを、ＤＮＡ配列分析で確認した。それは、ＡＬＶＡＣ Ｃ３挿入座の左および右腕が隣接している、ＦＩＰＶ Ｎ遺伝子ＯＲＦに結合されたワクシニアＩ３Ｌプロモーターを有している（図４（配列番号１６））。

このドナープラスミドｐＣ５ＦＩＰＮＩ３Ｌを、ＡＬＶＡＣウイルスベクターとともにインビボ組換え（Ｐｉｃｃｉｎｉ他、１９８７）において用い、組換体ウイルスｖＣＰ２６１Ａを生成した。

ｖＣＰ２６１Ａを感染させたＶＥＲＯ細胞の放射性標識破砕物を、１７Ｂ７．１と称するＦＩＰヌクレオキャプシド特異的モノクローナル抗体（Ｏｌｓｅｎ他、１９９２）を用いて免疫沈降分析することにより、４５ｋＤａのポリペプチドバンドの発現が示された。これはＮ遺伝子産物の期待される大きさと一致している。さらに、このバンドはＦＩＰＶ感染細胞から免疫沈降されたバンドと共に移動する。同じモノクローナル抗体を用いたＦＡＣＳ分析により、このｖＣＰ２６１Ａ由来の発現されたタンパク質は感染細胞の細胞質に局在化されることが判明した。

３．ＦＩＰＶマトリックスおよびヌクレオキャプシドオープンリーディングフレームの両方を発現するＡＬＶＡＣ組換体（ｖＣＰ２８２）の生成
エントモポックス４２Ｋプロモーターに結合されたＦＩＰＶマトリックス遺伝子ＯＲＦを含むプラスミドｐＣ５ＦＩＰＭ４２Ｋ（図２、配列番号９）を、ＡＬＶＡＣ−ＦＩＰ−Ｎ組換体（ｖＣＰ２６１Ａ）（上記２に記載）とともにインビボ組換え（Ｐｉｃｃｉｎｉ他、１９８７）において用い、二重組換体ｖＣＰ２８２を生成した。この組換体は、Ｃ５座に挿入されたＦＩＰＶ Ｍ遺伝子ＯＲＦ（４２Ｋプロモーター）およびＣ３座に挿入されたＦＩＰＶ Ｎ遺伝子ＯＲＦ（Ｉ３Ｌプロモーター）を有している。

ｖＣＰ２８２を感染させたＶＥＲＯ細胞の放射性標識破砕物を、１５Ａ９．９（Ｏｌｓｅｎ他、１９９２）と称するＦＩＰマトリックス特異的モノクローナル抗体を用いて免疫沈降分析することにより、３０ｋＤａのポリペプチドバンドの発現が示され、一方で１７Ｂ７．１と称するＦＩＰヌクレオキャプシド特異的モノクローナル抗体を用いて免疫沈降分析することにより、４５ｋＤａのポリペプチドバンドの発現が示された。このことはＭおよびＮ遺伝子産物の期待される大きさと一致している。さらに、両方のバンドはＦＩＰＶ感染細胞から免疫沈降されたバンドとともに移動した。同じモノクローナル抗体を用いた蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析により、これらの発現されたタンパク質は感染細胞の細胞質に局在化されることが判明した。

４．完全ＦＩＰＶ スパイク糖タンパク質遺伝子ＯＲＦを発現するＡＬＶＡＣ組換体（ｖＣＰ２８１）の生成
ＦＩＰＶスパイク遺伝子（Ｓ）を、第１鎖ｃＤＮＡテンプレート（上記１に記載）から３つの部分でＰＣＲ増幅により得た。ＰＣＲプライマーを、Ｇｅｎｂａｎｋ配列ＣＯＦＩＰＥ２（預託番号Ｘ０６１７０）（Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ他、１９８７）に基づいて合成した。５’末端はオリゴヌクレオチドプライマーＪＰ５３（配列番号１７）（５’−ＣＡＴＣＡＴＧＡＧＣＴＣＡＴＧＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＡＡＣ−３’）およびＪＰ７７（配列番号１８）（５’−ＡＡＣＡＧＣＣＧＣＴＴＧＴＧＣＧＣ−３’）を用いて増幅させた。単離した１６３０ｂｐ断片をＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋中に連結し、ｐＢＳＦＩＰ−ＳＡを得、これをＤＮＡ配列分析で確認した。

Ｓの中間部分を、オリゴヌクレオチドプライマーＪＰ８４（配列番号１９）（５’−ＣＴＴＧＧＴＡＴＧＡＡＧＣＴＴＡＧ−３’）およびＪＰ８５（配列番号２０）（５’−ＧＧＴＧＡＣＴＴＡＡＡＧＣＴＴＧＣ−３’）を用いてＰＣＲによって増幅した。単離した１７１５ｂｐ断片をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋中に連結した。２つのクローン、ｐＫＲ５およびｐＫＷ１３を配列決定したが、エラー（ＧｅｎＢａｎｋ配列ＣＯＦＩＰＥ２に基づく）を異なった位置に有していることが判明した。これらのＰＣＲエラーを修正するため、ｐＫＷ１３の部分をｐＫＲ５のサブ断片で以下のように置換した。ｐＫＲ５をＣｌａＩで消化し、クレノーポリメラーゼで平滑化し、ＢｓｔＥＩＩで消化し、単離した７５０ｂｐ断片を、ＳｍａＩ／ＢｓｔＥＩＩで消化したｐＫＲ１３中に連結した。その結果得られたプラスミドｐＢＳＦＩＰ−ＭＩＩを、ＤＮＡ配列決定で確認した。

Ｓの３’部分を、オリゴヌクレオチドプライマーＪＰ７１（配列番号２１）（５’−ＴＡＡＴＧＡＴＧＣＴＡＴＡＣＡＴＣ−３’）およびＪＰ９０（配列番号２２）（５’−ＣＡＴＣＡＴＧＧＴＡＣＣＴＴＡＧＴＧＧＡＣＡＴＧＣＡＣＴＴＴ−３’）を用いてＰＣＲにより増幅させた。単離した１０２０ｂｐ断片をＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｓｐ７１８で消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｓｐ７１８で消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋中に連結させ、ｐＢＳＦＩＰＳ−Ｃを得、ＤＮＡ配列分析により確認した。

７９−１１４６株ｃＤＮＡから派生されたＦＩＰＶ スパイク遺伝子の完全ＤＮＡ配列は図５に示されている（配列番号２３）。

スパイクＯＲＦは３つのＴ５ＮＴ早期転写停止シグナルを含んでいる。２つをＰＣＲを介して変異を導入することにより中間部分から除去した。３３０ｂｐのＰＣＲ断片をｐＢＳＦＩＰＳ−ＭＩＩから、オリゴヌクレオチドプライマーＲＧ７５７Ｂ（配列番号２４）(5’-CATTAGACTCTGTGACGCCATGTGATGTAA-GCGCACAAGCGGCTGTTATCGATGGTGCCATAGTTGGAGCTATGACTTCCATTAACAGT-GAACTGTTAGGCCTAACACATTGGACAACGACACCTAATTTCTATTAC-3’)およびＲＧ７５８Ｂ（配列番号２５）(5’-CATTAGACTGTAAACCTGCATGTATTCAACTTG-CACAGATATTGTAAAATTTGTAGGTATCGTGACATTACCAGTGCTAATTGGTTGCACGT-CTCCGTCAGAATGTGTGACGTTAATAAATACCAAAG-3’)を用いて増幅し、ＨｇａＩ／ＢｓｐＭＩで消化し、ＨｇａＩ／ＢｓｐＭＩ消化されたｐＢＳＦＩＰＳ−ＭＩＩ中にクローン化しｐＭＪ５を得た。ｐＭＪ５の配列分析により、３３ｂｐの欠失が明らかとなったが、これは２５０ｂｐのＳｔｕＩ／ＢｓｐＭＩ断片を、オリゴヌクレオチドプライマーＲＧ７５８Ｂ（配列番号２５）およびＪＰ１６２（配列番号２６）(5’-GTGAACTGTTAGGCCTAACACA-TTGGACAACGACACCTAATTTCTATTAC-3’)を用いてｐＢＳＦＩＰＳ−ＭＩＩから増幅した断片で置き換えることにより修正した。単離された断片をＳｔｕＩ／ＢｓｐＭＩで消化し、ＳｔｕＩ／ＢｓｐＭＩ消化されたｐＭＪ５中にクローン化してｐＮＲ３を得た。このプラスミドは位置２３８４に塩基の変化を有していたが、これをＵ．Ｓ．Ｅ変異キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて修正し、ｐＢＳＦＩＰＳ−ＭＩＩＤＩＩを得た。このプラスミドは、正しいアミノ酸配列を維持する一方で変化されたＴ５ＮＴ配列および新しく導入されたＣｌａＩおよびＳｔｕサイトを有するところのＳ遺伝子の中間部分を含んでいる。

ワクシニアウイルスＨ６プロモーター（配列番号２７）(5’-TTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGA-GGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAAAAAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCG-ATATCCGTTAAGTTTGTATCGTA-3’)（Ｐｅｒｋｕｓ 他、１９８９）をＳ遺伝子のＡＴＧに結合させるために、以下のことを実行した。ｐＢＳＦＩＰＳ−Ａ（Ｓ遺伝子の５’部分）から、オリゴヌクレオチドプライマーＲＧ７５５（配列番号２８）（５’−ＣＴＴＧＴＡＴＧＣＡＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＧ−３’）およびＲＧ７５６（配列番号２９）(5’-TCCGAGCTCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGATTGTGCTCGTAAC-3’)を用いたＰＣＲ断片として増幅されたＳ遺伝子に、Ｈ６プロモーターの３’末端を結合した。１００ｂｐの断片をＳａｃＩ／ＮｓｉＩで消化し、ＳａｃＩ／ＮｓｉＩで消化されたｐＢＳＦＩＰＳ−Ａに連結させ、ｐＢＳＦＩＰＳ−ＡＨ６を得た。

５’部分のスパイク遺伝子部分のＴ５ＮＴをアミノ酸配列を変更せずに除去するために、３５０ｂｐのＰＣＲ断片を、ｐＢＳＦＩＰＳ−ＡＨ６から、オリゴヌクレオチドプライマーＲＧ７５３（配列番号３０）（５’−ＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＡＣＡＡＴＣＴＧ−３’）およびＲＧ７５４（配列番号３１）(5’-CAGTATACGATGTGTAAGCAATTGTCCAAAAA-GCTCCACTAACACCAGTGGTTAAAT- TAAAAGATATACAACCAATAGGAAATGTGCTAAAGAAATTGTAACCATTAATATAGAAATGG-3’)を用いて増幅した。断片はＰｓｔＩ／ＡｃｃＩで消化し、ＰｓｔＩ／ＡｃｃＩで消化したｐＢＳＦＩＰＳ−ＡＨ６中に連結し、ｐＮＪ１を得た。

Ｓ遺伝子の５’、中間および３’末端は、完全ＯＲＦを形成するために以下のように一緒に結合させた。第１に、３’領域を、ｐＢＳＦＩＰＳ−ＣをＡｓｐ７１８／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し１０００ｂｐ断片として切り出し、Ａｓｐ７１８／ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＮＪＩ（５’部分）中に連結しｐＢＳＦＩＰＳ−ＡＨ６を得た。ｐＢＳＦＩＰＳＭＩＩＤＩＩからＨｉｎｄＩＩＩ消化により１７００ｂｐの断片を切り出し、ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＢＳＦＩＰＳ−Ａ／ＣＨ６中に連結し方向を検索することにより中間部分を付加した。その結果得られたプラスミドｐＢＳＦＩＰＳＨ６ＩＩは、Ｈ６プロモーターの３’末端に結合された完全ＳＯＲＦを、３つすべてのＴ５ＮＴ配列を除去した状態で有している。

完全ＳＯＲＦをＣ６ドナープラスミド中に挿入するために、４．４ｋｂのカセットをｐＢＳＦＩＰＳＨ６ＩＩから、ＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩで消化し末端をクレノーポリメラーゼで埋めることにより切り出した。このカセットをＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ消化されクレノーポリメラーゼで埋めたｐＪＣＡ０７０中に連結した。その結果得られたプラスミドｐＯＧ９は、ＤＮＡ分析により、Ｈ６プロモーター中のＮｒｕＩサイトとＥｃｏＲＩサイトとの間に１１０ｂｐのインサートを有していることが判明した。これらの配列を除去するために、ｐＯＧ９をＮｒｕＩ／ＥｃｏＲＶで消化し再度ライゲーションし、早期および後期転写には必要ではないＮｒｕＩとＥｃｏＲＩサイト間の４塩基対を欠失している完全Ｈ６プロモーターを有するドナープラスミドｐＣ６ＦＩＰＳＨ６ＩＩを得た。このプラスミドは、Ｃ６座の左腕、Ｈ６プロモーター、完全Ｓ遺伝子ＯＲＦおよびＣ６座の右腕から成る（図６（配列番号３２））。停止コドンにおける変異により、スパイクのＣ末端に９つの付加的なアミノ酸が付加されている（図７）。

このドナープラスミドｐＣ６ＦＩＰＳＨ６ＩＩをＡＬＶＡＣウイルスベクターとのインビボ組換え（Ｐｉｃｃｉｎｉ他、１９８７）に用いて、組換えウイルスｖＣＰ２８１を生成した。

ｖＣＰ２８１を感染させたＣＲＦＫ細胞の放射性標識破砕物を、２３Ｆ４．５と称するＦＩＰスパイク特異的モノクローナル抗体（Ｏｌｓｅｎ他、１９９２）を用いて免疫沈降分析することにより、２２０ｋＤａのポリペプチドバンドが発現していることが示された。これは期待されるＳ遺伝子産物の大きさと一致している。さらに、このバンドはＦＩＰＶ感染細胞から免疫沈降されたバンドと共に移動したが、これは適当にグリコシル化されていることと一致していた。同じ抗体を用いたＦＡＣＳ分析により、ｖＣＰ２８１から発現されたタンパク質は、感染細胞の細胞質に局在化していることが示された。しかしながら、ＣＲＦＫ細胞の単層にｖＣＰ２８１を接種すると、強力なフュージジェニック（ｆｕｓｉｇｅｎｉｃ）活性が見られ、タンパク質はまたこれら細胞表面上にも存在していることを示唆していた。親ウイルスＡＬＶＡＣ（対照）を感染させたＣＲＦＫ細胞においてはフュージジェニック活性は見られなかった。

５．ＦＩＰＶスパイク糖タンパク質遺伝子ＯＲＦマイナスシグナル配列を発現するＡＬＶＡＣ組換体（ｖＣＰ２８３Ｂ）の生成
以下のように、２７０ｂｐのＰＣＲ断片をｐＯＧ９中に挿入することにより５７ｂｐのシグナル配列を除去し、ＡＴＧで置換した。ＰＣＲ断片はｐＢＳＦＩＰＳ−Ａから、オリゴヌクレオチドプライマーＲＧ７５９（配列番号３３）（５’−ＧＣＴＡＴＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＣ−３’）およびＲＧ７６０（配列番号３４）(5’-TCCGAGCTCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGA-CAACAAATAATGAATGC-3’)を用いて増幅した。断片をＥｃｏＲＶ／ＮｃｏＩで消化し、ＥｃｏＲＶ／ＮｃｏＩで消化したｐＯＧ９に連結し、ｐＯＭ１２を得た。ｐＯＭ１２をＥｃｏＲＶ／ＮｒｕＩで消化した後再連結させ、Ｈ６プロモーター中の１１０ｂｐのインサートを除去した。その結果得られたドナープラスミドｐＣ６ＦＩＰＳＨ６−ＳＳをＤＮＡ配列分析で確認した（図７（配列番号３５）。

このドナープラスミドｐＣ６ＦＩＰＳＨ６−ＳＳを、ＡＬＶＡＣウイルスベクターとインビボ組換え（Ｐｉｃｃｉｎｉ他、１９８７）に用いて組換体ウイルスｖＣＰ２８３Ｂを生成した。

ｖＣＰ２８３Ｂを感染させたＣＲＦＫ細胞の放射性標識破砕物を、ネコＦＩＰ−免疫血清（＃５１１）を用いて免疫沈降分析することにより、約１４５±１０ｋＤａのポリペプチドバンドが発現していることが示された。これは非グリコシル化Ｓ遺伝子産物の期待される大きさと一致している。同じポリクローナル抗体を用いた免疫蛍光分析により、この発現されたタンパク質は、ｖＣＰ２８３Ｂ感染ＣＥＦ細胞の細胞質に局在化していることが示された。ＣＲＦＫ細胞においてはフュージジェニック活性は見られなかった。

６．ＦＩＰＶスパイク糖タンパク質遺伝子ＯＲＦのＣ末端部分を発現するＡＬＶＡＣ組換体（ｖＣＰ３１５）の生成
Ｓ遺伝子の１７４９ｂｐのＣ末端（全１４５２ａａからの末端５８２ａａ）を、以下のようにＨ６プロモーターに結合した。ｐＯＧ９をＮｒｕＩ／ＢｓｔＥＩＩで消化し、６．２ｋｂの断片を単離した。この断片はＳ遺伝子の１７４９ｂｐＣ末端を含む。ＢｓｔＥＩＩサイトが隣接しているＡＴＧコドンと結合されたＨ６プロモータの３’末端を、オリゴヌクレオチドＪＰ２２６（配列番号３６）(5’-CATTAGCATGATATCCGTTAAGTTTGTATCGT-AATGGGTAACCCTGAGTAGCAT-3’)およびＪＰ２２７（配列番号３７）(5’-ATGCTACTCAGGGTTACCCATTACGATACAAACTTAACGGATATCATGCTAATG-3’)をアニーリングさせ、ＮｒｕＩ／ＢｓｔＥＩＩで消化することにより生成した。この断片を６．２ｋｂのｐＯＧ９断片（上の４を参照）中に連結させ、ドナープラスミドｐＣ６ＦＩＰＳＨ６−Ｃを得て、これをＤＮＡ配列分析で確認した（図８（配列番号３８））。

このドナープラスミドをｐＣ６ＦＩＰＳＨ６−ＳＳを、ＡＬＶＡＣウイルスベクターとインビボ組換え（Ｐｉｃｃｉｎｉ他、１９８７）に用いて組換体ウイルスｖＣＰ３１５を生成した。

ネコＦＩＰ免疫血清（＃５１１）を用いて、ｖＣＰ３１５を感染させたＣＲＦＫ細胞の破砕物をウエスタンブロット分析することにより、５６ｋＤａのポリペプチドバンドの発現が示された。これは、一部を切断されていてグリコシル化されていないＳ遺伝子産物（６４ｋＤａ）の予期される大きさよりも少し小さい。同じポリクローナル血清を用いた免疫蛍光分析により、ｖＣＰ３１５感染ＣＥＦ細胞の細胞質に局在化されたタンパク質が僅かに検出されることが判明した。ＣＲＦＫ細胞においてはフュージジェニック活性は見られなかった。

実施例２ Ｃ３、Ｃ５およびＣ６挿入プラスミド
Ｃ３挿入プラスミドｐＳＰＣＰ３ＬＡの生成
８．５ｋｂカナリアポックスＢｇｌＩＩ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＢａｍＨＩサイトにクローン化し、ｐＷＷ５を得た。この断片のヌクレオチド配列分析により、図９に示された配列（配列番号３９）中の位置１４５８から始まり位置２８９７で終わる、Ｃ３と称するオープンリーディングフレームが明らかにされた。Ｃ３オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全体を欠失させるために、Ｃ３ＯＲＦに関連した５’および３’断片を増幅するためにＰＣＲプライマーを設計した。オリゴヌクレオチドプライマーＲＧ２７７（配列番号４０）（５’−ＣＡＧＴＴＧ−ＧＴＡＣＣＡＣＴＧＧＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＣＡＧ−３’）およびＲＧ２７８（配列番号４１）(5’-TATCTGAATTCCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCAAATG-TGAGTTAATATTAG-3’)を、ｐＷＷ５から５’断片を増幅するために用い、オリゴヌクレオチドプライマーＲＧ２７９（配列番号４２）(5’-TCGCTGAATTCGATATCAAGCTTATCGATTTTTATGACTAGTTAATCAAATAAAAA-GCATACAAGC-3’)を、ｐＷＷ５から３’断片を増幅するために用いた。５’断片をＡｓｐ７１８／ＥｃｏＲＩで消化し、３’断片をＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩで消化した。５’および３’を続いて、Ａｓｐ７１８／ＳａｃＩで消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋に連結させ、ｐＣ３Ｉを得た。このプラスミドはＣ３ＯＲＦを欠失し、ワクシニア早期転写および翻訳終了シグナルが隣接しているマルチクローニングサイトを有するＣ３挿入座を含む。ｐＣ３ＩをＤＮＡ配列分析で確認した。

ｐＣ３Ｉの隣接腕を、以下のように延長させた。Ｃ３座の上流の９０８ｂｐの断片をｐＷＷ５をＮｓｉＩおよびＳｓｐＩで消化することによって得た。６０４ｂｐのＰＣＲ断片をｐＷＷ５から、オリゴヌクレオチドプライマーＣＰ１６（配列番号４３）（５’−ＴＣＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＣＴＴＣＴＧＣ−３’）およびＣＰ１７（配列番号４４）（５’−ＴＣＧＣＴＣＧＡＧＴＡＧＧＡＴＡＣＣＴＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＡ−ＣＧ−３’）を用いて増幅させ、Ａｓｐ７１８／ＸｈｏＩで消化し、ｐＩＢＩ２５（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ ｈａｖｅｎ，ＣＴ）中に連結し、ｐＳＰＣ３ＬＡを得た。ｐＳＰＣ３ＬＡをｐＩＢＩ２５内部をＥｃｏＲＶで、インサート（カナリアポックスＤＮＡ）内部をＮｓｉＩで消化し、９０８ｂｐのＮｓｉＩ／ＳｓｐＩ断片と連結してｐＳＰＣＰＬＡＸを得たが、これはＣ３座の上流の１４４４ｂｐのカナリアポックスＤＮＡを含むものである。２１７８ｂｐのカナリアポックスＤＮＡのＢｇｌＩＩ／ＳｔｙＩ断片をｐＸＸ４（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋のＰｓｔＩサイト中にクローン化された６．５ｋｂのカナリアポックスＤＮＡのＮｓｉＩ断片を有する）から単離した。２７９ｂｐのＰＣＲ断片をｐＸＸ４から、オリゴヌクレオチドプライマーＣＰ１９（配列番号４５）（５’−ＴＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＡＣＡＡＴＡＡＣＡＴＡＧ−３’）およびＣＰ２０（配列番号４６）（５’−ＴＡＧＧＡＧＣＴＣＴＴＴＡＴＡＣＴＡＣＴＧＧＧＴＴＡＣＡＡＣ−３’）を用いて増幅し、ＸｈｏＩ／ＳａｃＩで消化し、ＳａｃＩ／ＸｈｏＩ消化されたｐＩＢＩ２５中に連結し、ｐＳＰＣ３ＲＡを得た。

付加的な単一のサイトをｐＣ３Ｉのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）に付加するために、ｐＣ３ＩをＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ（ＭＣＳ中）で消化して、キナーゼ処理されアニーリングしているオリゴヌクレオチドＣＰ１２（配列番号４７）（５’−ＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＣＣ−３’）および（配列番号４８）（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧ−ＡＧＧ−３’）（ＥｃｏＲＩ粘着末端およびＸｈｏＩサイトおよびＢａｍＨＩサイトおよびＣｌａＩ互換の粘着末端を有する）に連結し、ｐＳＰＣＰ３Ｓを得た。ｐＳＰＣＰ３Ｓを、Ｃ３座の下流のカナリアポックス配列内部でＳｔｙＩおよびＳａｃＩで消化し（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋より）、ｐＳＰＣ３ＲＡ由来の２６１ｂｐのＢｇｌＩＩ／ＳａｃＩ断片およびｐＸＸ４由来の２１７８ｂｐのＢｇｌＩＩ／ＳｔｙＩ断片と連結させ、２５７２ｂｐのＣ３座の下流のカナリアポックス配列を含むｐＣＰＲＡＬを得た。ｐＳＰＣＰ３Ｓを、Ｃ３座の上流のカナリアポックス配列内部でＡｓｐ７１８（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋内）およびＡｃｃＩで消化し、ｐＳＰＣＰＬＡＸ由来の１４３６ｂｐのＡｓｐ７１８／ＡｃｃＩ断片と連結し、ｐＣＰＬＡＩＡを得たが、これはＣ３座の上流の１４５７ｂｐのカナリアポックスＤＮＡを含む物である。ｐＣＰＬＡＩを、Ｃ３座下流のカナリアポックス配列内部でＳｔｙＩ／ＳａｃＩ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋中）で消化し、ｐＣＰＲＡＬ由来の２４３８ｂｐＳｔｙＩ／ＳａｃＩ断片と連結させ、プラスミドｐＳＰＣＰ３ＬＡを得た。ｐＳＰＣＰ３ＬＡの左腕を、以下のように、約５００ｂｐまで短縮した。ｐＳＰＣＰ３ＬＡをＮｏｔＩ／ＮｓｉＩで消化し、６４３３ｂｐの断片を単離した。オリゴヌクレオチドＣＰ３４（配列番号４９）（５’−ＧＧＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＡ−３’）およびＣＰ３５（配列番号５０）（５’−ＴＧＴＣＧＡＣＧＣ−３’）をアニーリングさせ、この断片に連結してｐＳＰＣＰ３ＬＳＡを得た。これがＣ３挿入プラスミドであり、９３９ｂｐのＣ３座の上流カナリアポックスＤＮＡ、６つのリーディングフレーム内の停止コドン、早期転写終結シグナル、ＭＣＳ、早期転写終結シグナル、６つのリーディングフレーム内の停止コドン、および２５７５ｂｐのＣ３座下流のカナリアポックスＤＮＡから成っている。

Ｃ５挿入プラスミドｐＮＣ５ＬＳＰ−５の生成
カナリアポックスＤＮＡのゲノムライブラリーをコスミドベクターｐＶＫ１０２（Ｋｎａｕｆ ａｎｄ Ｎｅｓｔｅｒ，１９８２）中に構築し、ｐＲＷ７６４．５（Ｃ５ＯＲＦを含む８８０ｂｐのカナリアポックスＰｖｕＩＩ断片を含有するｐＵＣ９ベースのプラスミド）で探索し、２９ｋｂｐのインサートを含有するコスミドクローンが同定された（ｐＨＣＯＳ１）。ｐＨＣＯＳ１由来のＣ５領域を含む３．３ｋｂｐＣｌａＩ断片を同定した。Ｃ５ＯＲＦは図１０に示された配列（配列番号５１）中の位置１５３７から始まり位置１８５７で終わっている。

Ｃ５挿入ベクターを２段階で構築した。１５３５ｂｐ上流配列を、オリゴヌクレオチドプライマーＣ５Ａ（配列番号５２）（５’−ＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＴＧＴＴＡＴＡＣＴＴＴＧ−３’）およびＣ５Ｂ（配列番号５３）（５’−ＧＧＧＧＧＴＡＣＣＴＴＴＧＡＧＡＧＴＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧ−３’）を用いて精製ゲノムカナリアポックスＤＮＡからＰＣＲ増幅によって生成した。この断片をＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ消化されたｐＵＣ８中に連結し、ｐＣ５ＬＡＢを得た。４０４ｂｐの腕を、オリゴヌクレオチドＣ５Ｃ（配列番号５４）(5’-GGGTCTAGAGCGGCCGCTTATAAAGATCTAAAATGCATAATTTC-3’)およびＣ５ＤＡ（配列番号５５）(5’-ATCATCCTGCAGGTATTCTAAACTAGGAATAGATG-3’)を用いてＰＣＲ増幅により生成した。この断片をＰｓｔＩで消化し、ＳｍａＩ／ＰｓｔＩ消化されたｐＣ５ＬＡＢ中にクローン化しｐＣ５Ｌを得た。ｐＣ５ＬをＭＣＳ内部でＡｓｐ７１８／ＮｏｔＩで消化し、キナーゼ処理しアニーリングさせたオリゴヌクレオチドＣＰ２６（配列番号５６）(5’-GTACGTGACTAATTAGCTATAAAAAGGATCCGGTACCCTCGAGTCTAGAATCGATCC-CGGGTTTTTATGACTAGTTAATCAC-3’)およびＣＰ２７（配列番号５７）(5’-GGCCGTGATTAACTAGTCATAAAAACCCGGGATCGATTCTAGACTCGAGGGTACCGG-ATCCTTTTTATAGCTAATTAGTCAC-3’)と連結し、ｐＣ５ＬＳＰを得た。このプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、キナーゼ処理し自己アニーリングしたオリゴヌクレオチドＣＰ２９（配列番号５８）（５’−ＡＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’）に連結し、ＮｏｔＩで消化した。この直線化されたプラスミドを精製し、自己連結し、ｐＮＣ５ＬＳＰ−５を生成した。このＣ５挿入プラスミドはＣ５ＯＲＦの上流の１５３５ｂｐのカナリアポックスＤＮＡ、６つのリーディングフレーム中の翻訳停止コドン、ワクシニア早期転写終結シグナル、ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＸｈｏＩ、ＣｌａＩおよびＳｍａＩ制限サイトを有するＭＣＳ、ワクシニア早期転写終結シグナル、６つのリーディングフレーム中の翻訳停止コドンおよび４０４ｂｐの下流カナリアポックス配列（３１ｂｐのＣ５コード領域および３７３ｂｐの下流カナリアポックス配列）を含有している。

Ｃ６挿入プラスミドｐＣ６Ｌの生成
図１１（配列番号５９）は、カナリアポックスＤＮＡの３．７ｋｂの部分の配列を示している。配列の分析により、Ｃ６Ｌと称するＯＲＦが位置３７７から始まり位置２２５４で終わっていることが判明した。以下は、Ｃ６ＯＲＦを欠失させ、転写および翻訳停止シグナルに隣接しているＭＣＳで置き換えることにより構築されたＣ６挿入プラスミドを記述する。３８０ｂｐのＰＣＲ断片をゲノムカナリアポックスＤＮＡから、オリゴヌクレオチドプライマーＣ６Ａ１（配列番号６０）(5’-ATCATCGAG-CTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT-3’)およびＣ６Ｂ１（配列番号６１）(5’-GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTT-TTCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAA-3’)を用いて増幅した。１１５５ｂｐのＰＣＲ断片をゲノムカナリアポックスＤＮＡから、オリゴヌクレオチドプライマーＣ６Ｃ１（配列番号６２）(5’-CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTT-TTTATTGATTAACTAGTCAAATGAGTATATATAATTGAAAAAGTAA-3’)およびＣ６Ｄ１（配列番号６３）(5’-GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTT-AAGTTG-3’)を用いて増幅した。この３８０ｂｐおよび１１５５ｂｐ断片を、ともにテンプレートとして加え、オリゴヌクレオチドプライマーＣ６Ａ１（配列番号４９）およびＣ６Ｄ１（配列番号５２）を用いて１６１３ｂｐのＰＣＲ断片を増幅することにより融合した。この断片をＳａｃＩ／ＫｐｎＩで消化し、ＳａｃＩ／ＫｐｎＩ消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋中に連結した。この結果得られたプラスミドｐＣ６ＬをＤＮＡ配列分析により確認した。それは、Ｃ６の上流の３７０ｂｐのカナリアポックスＤＮＡ、ワクシニア早期終了シグナル、６つのリーディングフレーム中の翻訳停止コドン、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩサイトを有するＭＣＳ、ワクシニア早期終結シグナル、６つのリーディングフレーム中の翻訳停止コドンおよび１１５６ｂｐの下流カナリアポックス配列から成る。

別の外来遺伝子に結合されたワクシニアＨ６プロモーターを有するカセットをｐＣ６ＬのＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩサイト中へ連結することによって、ｐＪＣＡ０７０をｐＣ６Ｌから派生させた。ｐＪＣＡ０７０をＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩで切断することにより、外来遺伝子とＨ６プロモーターの５’末端が切り出される。

実施例３ ＡＬＶＡＣベースのネコ感染性腹膜炎ウイルス組換体に関しての効率の試行
試行１ ｖＣＰ２６１Ａ（Ｎ）、ｖＣＰ２６２（Ｍ）、およびｖＣＰ２８２（Ｍ＋Ｎ）についての安全性、抗原性および効率の試行
Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｅ Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．より入手した２５匹の特定病原体不在（ＳＰＦ）１０−１２週齢のネコをランダムに５つの群に分けた（５匹のネコ／群）。群を、皮下で（頸部）２回（第０日および第２１日）、１０^７ ＴＣＩＤ５０／投与量で、ｖＣＰ２６１、ｖＣＰ２６２、ｖＣＰ２８２あるいはｖＣＰ２６１Ａ＋ｖＣＰ２６２の何れかでワクチン接種した。１つの群の５匹のネコはワクチン接種されず免疫性テスト対照とした。第３５日に、全てのネコに、経口でネコあたり１０^３．５ ＴＣＩＤ５０の毒性ＦＩＰウイルス（１１４６株）で免疫性テストを行った。免疫性試験後３３日間、ＦＩＰウイルス感染の明らかな症状発現を調べるために、ネコを毎日観察した。第３３日目に全ての生存していたネコを剖検し、ＦＩＰ病原性を調べた。腸管からのＦＩＰウイルスの単離およびウイルス中和抗体の同定により、非発露型が検出された。発露型を有していたネコは腹腔に厚い黄色の液体、肋膜に白い水腫液および腸、脾臓および肝臓に外傷を有していた。感染したネコのいくつかは、結膜炎、眼瞼痙攣および網膜混濁とともに目の関与を示した。

ワクチン接種されたネコで、何れかの好ましくない局所的または全身のワクチン接種後の反応を示したものはなかった。５匹のワクチン接種されなかったネコの全ては、ＦＩＰ兆候を示して死ぬか、剖検でＦＩＰ兆候を有しており、このように免疫性テスト用量の妥当性を示していた。死亡したかまたは死んでゆくネコは、ＦＩＰの発露型および非発露型の両方を兆候を示した。ＡＬＶＡＣ−ＦＩＰ組換体でワクチン接種されたネコから得られた結果は表１に示されている。これらのネコのうち、免疫性テスト前の第３５日にウイルス中和公知を生成したものはなかった。全てのネコは、免疫性テストに続いて発熱性反応を示した。全てのワクチン接種された群は部分的防御を示したが、最も良く防御されたのはｖＣＰ２６２およびｖＣＰ２８２ワクチン接種群で、各々３／５のネコを、ＦＩＰ死亡または兆候の無いものとしていた。このように、この研究からＡＬＶＡＣ−ＦＩＰマトリックス組換体は全てを越える最高の防御を提供した。

試行２．プリムセルと比較したｖＣＰ２６２（Ｍ）の安全性、抗原性および効率の試行
Ｈｉｌｌ Ｇｒｏｖｅ、Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎより入手した２３匹の１０−１２週齢のＳＰＦネコをこの試行で用いた。１０匹のネコを、皮下で、１０^８ ＴＣＩＤ５０／投与量で、ｖＣＰ２６２で第０日と第２１日にワクチン接種した。５匹のネコに、市販のＦＩＰワクチン（プリムセル、Ｓｎｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）を製造者が推薦するように投与した（２用量を２１日間隔で、鼻腔経路、１０^４．８ ＴＣＩＤ５０）。８匹のネコはワクチン接種されず免疫性テスト対照とした。第３５日に、全てのネコに、鼻腔経路で３２０ＤＥＣＰ５０の投与量で毒性ＦＩＰウイルス（７９−１１４６株）で免疫性テストを行った。生存したネコには第８４日に再度免疫性テストを行い、これらの生存したネコは第１０４日に剖検し、ＦＩＰ病原性に関して調べた。

ワクチン接種されたネコで、何れかの好ましくない局所的または全身のワクチン接種後の反応を示したものはなかった。対照群のうちでは、４匹のネコが死ぬか、剖検された際にＦＩＰ病原性を有していた。残りの４匹の対照（もう一方の対照とは分離されたユニットに収納された）は、両方の免疫性テストに生存し、防御されたと見受けられた。それらの全ては、免疫性テストに続いて、血清中のＦＩＰに対する中和抗体の顕著な増加を示し、このようにウイルスへの接触を示していた。これが免疫性テスト手順の技術的問題点を示唆しているのかあるいは自然の防御なのかは不明である。

血清学的分析により、ｖＣＰ２６２の接種を２回受けたネコにおいて、ＦＩＰに対する、顕著なウイルス中和抗体力価が見られなかった。これとは対照的に、１度のプリムセル接種後には顕著な力価が見られ、これらの力価は第２の接種の後に追加免疫された。両方の群のネコが、免疫性テストに続いて高い力価を示した。

ワクチン接種されたネコの死亡率データの結果を表２に示す。ｖＣＰ２６２群においては、８／１０のネコ（８０％）が第１の免疫性試験で生存し、一方６／１０（６０％）が両方の免疫性テストで生存した（６０％）。これとは対照的に、プリムセルの群においては、１／５のみが第１の免疫性テストで生存した。生存したネコは、第２の免疫性テストでも生存した。死んだ４匹のプリムセルをワクチン接種されたネコのうちの３匹が第１１日までに死亡しており、このことは通常の病気の進行の促進を示唆していることは重要である。ｖＣＰ２６２をワクチン接種されたネコにおいては促進は見られなかった。このように、プリムセルと比較して、ｖＣＰ２６２は、病気を促進することなくより大きな防御を提供している。

試行３．スパイク組換体（ｖＣＰ２８１（Ｓ１）、ｖＣＰ２８３Ｂ（Ｓ２）およびｖＣＰ３１５（Ｓ３））と組み合わせたｖＣＰ２６２（Ｍ）の安全性、抗原性および効率の試行
Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｅ Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．より入手した３６匹の９週齢のＳＰＦネコをランダムに６つの群に分けた（６匹のネコ／群）。群を、皮下で２回（第０日および第２１日にそれぞれ約１０^７ ＴＣＩＤ５０／投与量で）、以下の組換体でワクチン接種した：１）ｖＣＰ２６２（マトリックス）、２）ｖＣＰ２６２プラスｖＣＰ２８１（Ｓ１スパイク−完全）、３）ｖＣＰ２６２プラスｖＣＰ２８３Ｂ（Ｓ２スパイク−マイナスシグナル配列）、４）ｖＣＰ２６２プラスｖＣＰ３１５（Ｓ３−Ｃ末端部分）。１つの群のネコに、市販のＦＩＰワクチン（プリムセル、Ｐｆｉｚｅｒ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）を製造者が推薦するように鼻腔経路でワクチン接種した（２用量、第０日および第２１日）。１つの群のネコはワクチン接種されず免疫性テスト対照とした。第２のワクチン接種（第３６日）に続く１５日、全てのネコに、経口でネコあたり１０^３．５ ＴＣＩＤ５０の毒性ＦＩＰウイルス（ＮＶＳＬ ＦＩＰ−１１４６、８９−５−１）で免疫性テストを行った。免疫性テスト後３５日間、体重、温度、血清反応および死亡率を調べるために、ネコを観察した。死亡したネコの大部分に対してＦＩＰ兆候を調べるために剖検を行い、ＦＩＰウイルスが２匹のネコから単離され、感染が確認された。

ＡＬＶＡＣ組換体でワクチン接種されたネコは全て、局所的または全身のワクチン接種後の好ましくない反応を示さなかった。プリムセルでワクチン接種されたネコは全て、ウイルス中和力価を有していた。組換体の群においては、マトリックスプラス完全スパイクを受容した群のネコのみがウイルス中和力価を有していた（第２のワクチン接種後の３／６）。

死亡率のデータを表３に示す。剖検されたネコは発露型（多数）および非発露型の病気の兆候を示した。１匹のネコがＦＩＰ誘導脳炎を罹病していた（対照群）。最も低い死亡率（３３％）はｖＣＰ２６２（マトリックス）単独でワクチン接種された群でみられた。ｖＣＰ２６２プラス何れかのスパイク組換体を受容した群は、防御を、たとえあったとしても僅かに示した。プリムセルワクチン接種群は６６．７％の死亡率を示した。抗体誘導促進（早期死亡）は、プリムセルおよびｖＣＰ２８１（Ｓ１−完全スパイク）群の両方で見られた。ワクチン接種されていない対照のネコ６匹のうち５匹がＦＩＰ感染により死亡したが、このことは免疫性テストの妥当性を示している。

熱および体重減少はＦＩＰ疾患の指標である。全ての群において免疫性試験後の相対的な体重減少が示された。しかしながら、ｖＣＰ２６２でワクチン接種された群は、プリムセルおよび対照群と比較して僅かな体重減少のみを示した。慢性熱が全てのネコにおいて見られたが、ｖＣＰ２６２でワクチン接種された群は一致して他の群よりも低い温度を示した。

この研究から、ｖＣＰ２６２は過酷なＦＩＰ免疫性テストに対して防御（６７．７％）を提供したと結論づけられた。さらに、この組換体ウイルスでワクチン接種されたネコはより低い発熱性反応およびより少ない体重減少を示した。他の組換体（ｖＣＰ２８１、ｖＣＰ２８３ＢおよびｖＣＰ３１５）並びにプリムセルは貧弱な防御を提供し、また死亡率を促進させることさえも提供した（プリムセル、ｖＣＰ２８１）。

実施例４ ＮＹＶＡＣベースのＦＩＰＶ組換体の生成
参考文献として取り込まれている米国出願第１０５４８３号にあるように、挿入座およびプロモーターを用いて、例えば、狂犬病糖タンパク質ＧをＴＫ欠失座へ挿入するためのプラスミドｐＲＷ８４２（ｖＰ８７９の生成に用いられた）を改変することによる等、例えばｐＲＷ８４２から狂犬病ＤＮＡを切り出し、その代わりにここに記載されている、Ｍ、Ｎ、およびＳの３つのバージョン；Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、またはそれらの組合せ（例えばＭおよびＮ）をコードしているＦＩＰＶ ＤＮＡを挿入し、続いてその結果得られるプラスミドをＮＹＶＡＣ、ｖＰ８６６との組換えにおいて用いることによって、ＮＹＶＡＣ−ＦＩＰＶ（Ｍ）、（Ｎ）、および３つの（Ｓ）のバージョン；（Ｓ１）、（Ｓ２）、（Ｓ３）および（Ｍ＋Ｎ）組換体を生成し、分析により発現を確認した。

このように、本発明の好ましい実施態様を詳細に記述してきたが、添付されたクレームによって定義される本発明は、上の記述において示された特定の細目に限定されるものではなく、その精神または範囲から離れることなく、それらの数多くの明らかな変化型が可能である。

参考文献

図１は、ＦＩＰＶマトリックス遺伝子オープンリーディングフレーム（７９−１１４６）のＤＮＡ配列を示す 図２−１は、ＦＩＰＶマトリックス遺伝子ドナープラスミド（改変マトリックス遺伝子コード領域は２４０８から開始し１６２０で終結する；エントモポックス４２ｋプロモーターは２４７４から開始する；Ｃ５左腕は１から１５４９であり、Ｃ５右腕は２５８０から２９８９までである）のＤＮＡ配列を示す 図２−２は、図２−１の続きを示す 図３は、ＦＩＰＶヌクレオキャプシド遺伝子オープンリーディングフレーム（７９−１１４６）のＤＮＡ配列を示す 図４−１は、ＦＩＰＶヌクレオキャプシド遺伝子ドナープラスミド（ヌクレオキャプシド遺伝子コード領域は２１０１から開始し９６８で終結する；ワクシニアＩ３Ｌプロモーターは２１６０から開始する；Ｃ３左腕は１から９３９であり、Ｃ３右腕は２２８５から４８５７までである）のＤＮＡ配列を示す 図４−２は、図４−１の続きを示す 図４−３は、図４−２の続きを示す 図５−１は、ＦＩＰＶスパイク遺伝子オープンリーディングフレーム（７９−１１４６）のＤＮＡ配列を示す 図５−２は、図５−１の続きを示す 図５−３は、図５−２の続きを示す 図６−１は、ＦＩＰＶスパイク遺伝子ドナープラスミド（改変スパイク遺伝子コード領域は５９１から開始し４９７６で終結する；ワクシニアＨ６プロモーターは４７１から開始する；Ｃ６左腕は１から３８７であり、Ｃ６右腕は４９８３から６１４４までである）のＤＮＡ配列を示す 図６−２は、図６−１の続きを示す 図６−３は、図６−２の続きを示す 図６−４は、図６−３の続きを示す 図７−１は、ＦＩＰＶスパイク遺伝子マイナスシグナル配列ドナープラスミド（改変スパイク遺伝子コード領域は５９１から開始し４９２２で終結する；ワクシニアＨ６プロモーターは４７１から開始する；Ｃ６左腕は１から３８７であり、Ｃ６右腕は４９２９から６０９０までである）のＤＮＡ配列を示す 図７−２は、図７−１の続きを示す 図７−３は、図７−２の続きを示す 図７−４は、図７−３の続きを示す 図８−１は、ＦＩＰＶスパイク遺伝子Ｃ末端断片ドナープラスミド（改変スパイク遺伝子コード領域は５９１から開始し２３６９で終結する；ワクシニアＨ６プロモーターは４７１から開始する；Ｃ６左腕は１から３８７であり、Ｃ６右腕は２３７６から３５３７までである）のＤＮＡ配列を示す 図８−２は、図８−１の続きを示す 図９−１は、Ｃ３オープンリーディングフレームを含むカナリアポックスＤＮＡの７３５１ｂｐ断片（Ｃ３オープンリーディングフレームは１４５８から開始し２８９７で終結する）のＤＮＡ配列である 図９−２は、図９−１の続きを示す 図９−３は、図９−２の続きを示す 図９−４は、図９−３の続きを示す 図９−５は、図９−４の続きを示す 図１０−１は、Ｃ５オープンリーディングフレームを含むカナリアポックスＤＮＡの３２０８ｂｐ断片（Ｃ５オープンリーディングフレームは１５３７から開始し１８５７で終結する）のＤＮＡ配列である 図１０−２は、図１０−１の続きを示す 図１１−１は、Ｃ６オープンリーディングフレームを含むカナリアポックスＤＮＡの３７０６ｂｐ断片（Ｃ６オープンリーディングフレームは３７７から開始し２２５４で終結する）のＤＮＡ配列である 図１１−２は、図１１−１の続きを示す 図１１−３は、図１１−２の続きを示す

Claims (17)

1. ポックスウイルスゲノムの非必須領域にネコ感染性腹膜炎ウイルス由来のＤＮＡを含有する組換えポックスウイルスであって、該ポックスウイルスが、
   （ｉ）Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１ＬおよびＩ４Ｌ、が欠失しているか、もしくはチミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体、血球凝集素遺伝子、宿主範囲領域およびリボヌクレオチドレダクターゼラージサブユニットが欠失しているワクシニアウイルスか；または
   （ii）ニワトリ胚繊維芽細胞での２００回を超える連続継代、マスターシードの４回の寒天下での連続プラーク精製、およびプラーククローンの５回の付加的な継代による増幅によって弱毒化されたカナリアポックスウイルス；であることを特徴とする組換えポックスウイルス。
2. 前記ポックスウイルスがカナリアポックスウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組換えポックスウイルス。
3. ｖＣＰ２６２、ｖＣＰ２６１Ａ、ｖＣＰ２８２、ｖＣＰ２８１、ｖＣＰ２８３Ｂ、ｖＣＰ３１５であることを特徴とする請求の範囲第２項記載の組換えポックスウイルス。
4. 前記ネコ感染性腹膜炎ウイルスＤＮＡが、Ｍ、Ｎ、およびＳの３つのバージョンＳ１、Ｓ２、Ｓ３、またはそれらの組合せをコードしていることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組換えポックスウイルス。
5. 前記ＤＮＡがＭをコードしていることを特徴とする請求の範囲第４項記載の組換えポックスウイルス。
6. 前記ＤＮＡがＮをコードしていることを特徴とする請求の範囲第４項記載の組換えポックスウイルス。
7. 前記ＤＮＡがＳをコードしていることを特徴とする請求の範囲第４項記載の組換えポックスウイルス。
8. 前記ＤＮＡがＳ１をコードしていることを特徴とする請求の範囲第４項記載の組換えポックスウイルス。
9. 前記ＤＮＡがＳ２をコードしていることを特徴とする請求の範囲第４項記載の組換えポックスウイルス。
10. 前記ＤＮＡがＳ３をコードしていることを特徴とする請求の範囲第４項記載の組換えポックスウイルス。
11. 前記ＤＮＡがＭ＋Ｎをコードしていることを特徴とする請求の範囲第４項記載の組換えポックスウイルス。
12. 前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組換えポックスウイルス。
13. ｖＣＰ２６２であることを特徴とする請求の範囲第３項記載の組換えポックスウイルス。
14. 請求の範囲第１、２、３、１１、１２または１３項記載の組換えポックスウイルスおよび担体を含有することを特徴とする免疫学的組成物。
15. 請求の範囲第１、２、３、１１、１２または１３項記載の組換えポックスウイルスを宿主（ヒトを除く）に投与することを含む、宿主中で免疫反応を誘導する方法。
16. 請求の範囲第１４項記載の組成物を宿主（ヒトを除く）に投与することを含む、宿主中で免疫反応を誘導する方法。
17. 請求の範囲第１、２、３、１１、１２または１３項記載の組換えポックスウイルスを培養細胞に感染させることを含む、インビトロで遺伝子産物を発現させる方法。

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