JP3745370B2

JP3745370B2 - イヌヘルペスウイルスｇＢ、ｇＣおよびｇＤの、核酸およびアミノ酸配列とその利用

Info

Publication number: JP3745370B2
Application number: JP52584995A
Authority: JP
Inventors: パオレッティ，エンゾ; ジェフリーリムバッチ，ケイス
Original assignee: ヴァイロジェネティクスコーポレイション
Priority date: 1994-03-30
Filing date: 1995-03-30
Publication date: 2006-02-15
Anticipated expiration: 2021-02-15
Also published as: AU683557B2; EP0752888A1; CA2182888C; EP0752888A4; ES2293639T3; AU2234495A; JPH09511145A; ATE369876T1; EP0752888B1; CA2182888A1; DK0752888T3; WO1995026751A1; DE69535561T2; DE69535561D1; US6017542A

Description

発明の分野
本発明はイヌヘルペスウイルス（ＣＨＶ）、ヌクレオチドまたは単離されたＣＨＶｇＢ、ｇＣ、ｇＤ糖タンパク質をコードしている核酸、およびそれらのアミノ酸配列、例えばワクシニアおよびアビポックスウイルス組換体等の組換えポックスウイルス等のベクターであってＣＨＶｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤをコードしているかまたはそれらを発現するもの、それらからの糖タンパク質、ワクチン、核酸（例えば、組換えポックスウイルス、ＣＨＶｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤコードを含有し、それらからの糖タンパク質を発現するワクシニアまたはアビポックスウイルス組換え体等のベクター由来）由来の、または、例えばベクター系内でのヌクレオチドの発現等により得られた糖タンパク質由来の、免疫学的または抗原的組成物に関し、また、前記ヌクレオチド、糖タンパク質、および組成物を用いる方法に関する。
以下の文中でいくつかの文献を、「参考文献」と表題を付した部分での完全なそれぞれの列挙とともに、引用している。文中において引用された出版物はこれにより文書中に参考文献として取り込まれている。
発明の背景
イヌヘルペスウイルス（ＣＨＶ）は、新生児の子犬においては致命的な出血性の疾患を、成犬においては自己限定的な、通常は潜在性の、上部呼吸道感染を引き起こす（Ａｐｐｅｌ，１９８７）。ＣＨＶの遺伝子構造についてはほとんど知られていない。遺伝子はまだマッピングされておらずヌクレオチド配列も公表されていない。特に、免疫関連遺伝子をコードしている遺伝子はまだ同定されていない。
ヘルペスウイルス糖タンパク質は、例えば細胞付着および貫通、細胞から細胞へのウイルスの拡散、および重要なことには感染の病原性プロフィールの決定などの必須のウイルス機能を成立させる。ヘルペスウイルス糖タンパク質は宿主の免疫系との相互作用において重要な成分である（Ｓｐｅａｒ，１９８５ａ；Ｓｐｅａｒ，１９８５ｂ）。ヘルペスウイルス糖タンパク質は液体性および細胞性の両方の免疫システムで認識される抗原であり、ワクチン接種された宿主中で防御免疫反応を喚起することが知られている（Ｗａｃｈｓｍａｎｅｔａｌ．，１９８７；Ｍａｒｃｈｉｏｌｉｅｔａｌ．，１９８７；Ｅｂｅｒｌｅｅｔａｌ．，１９８０；Ｐａｐｐ−Ｖｉｄｅｔａｌ．，１９７９）。
ヘルペスウイルスの感染の間、免疫反応の大部分はウイルスエンベローブ糖タンパク質に対して向けられている。これらの抗原は液体性および細胞性の両方の免疫反応を引き出すことが示されている。他のヘルペスウイルスの系では、ヘルペスウイルスｇＢ、ｇＣ、および／またはｇＤ糖タンパク質による免疫化で防御免疫反応を誘導可能であることが、いくつかの報告で示唆されている。
単純ヘルペスウイルスの十分に特徴づけられた糖タンパク質には、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＪ、ｇＫ、ｇＬおよびｇＭがある（Ｓｐｅａｒ，１９８５ａ；Ｓｐｅａｒ，１９８５ｂ；Ａｃｋｅｒｍａｎｎｅｔａｌ．，１９８６；Ｆｒｉｎｋｅｔａｌ．，１９８３；Ｆｒａｍｅｅｔａｌ．，１９８６；Ｌｏｎｇｎｅｃｋｅｒｅｔａｌ．，１９８７；Ｒｉｃｈｍａｎｅｔａｌ．，１９８６；Ｓｗａｉｎｅｔａｌ．，１９８５；Ｚｅｚｕｌａｋ，１９８４；ＲｏｉｚｍａｎａｎｄＳｅａｒｓ，１９９０；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎｅｔａｌ．，１９９２ａ；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎｅｔａｌ．，１９９２ｂ；ＢａｉｎｓａｎｄＲｏｉｚｍａｎ，１９９３）。多くの研究が単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質の免疫反応の誘導における重要性を示してきた。このように、ｇＢおよびｇＤが重要な免疫反応を誘導可能であることが報告されている（Ｂｅｒｍａｎｅｔａｌ．，１９８３；Ｃａｎｔｉｎｅｔａｌ．，１９８７；Ｃｒｅｍｅｒｅｔａｌ．，１９８５；Ｌａｓｋｙｅｔａｌ．，１９８４；Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ．，１９８７ａ；Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ．，１９８７ｂ；Ｐａｏｌｅｔｔｉｅｔａｌ．，１９８４；Ｐｅｒｋｕｓｅｔａｌ．，１９８５；Ｒｏｏｎｅｙｅｔａｌ．，１９８８；Ｗａｃｈｓｍａｎｅｔａｌ．，１９８７；Ｚａｒｌｉｎｇｅｔａｌ．，１９８６ａ；Ｚａｒｌｉｎｇｅｔａｌ．，１９８６ｂ）。ｇＣはクラスＩ限定細胞障害性リンパ球を刺激することが可能である（Ｇｌｏｒｉｏｓｏｅｔａｌ．，１９８５；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌｅｔａｌ．，１９８７）一方で、ｇＤはクラスＩＩ細胞障害性Ｔ細胞反応を刺激することが可能である（Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ．，１９８７ａ；Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ．，１９８７ｂ；Ｗａｃｈｓｍａｎｅｔａｌ．，１９８７；Ｚａｒｌｉｎｇｅｔａｌ．，１９８６ａ；Ｚａｒｌｉｎｇ１９８６ｂ）。ｇＧは複合体依存性のウイルス中和のための抗体の標的であることが示されている（Ｓｕｌｌｉｖａｎｅｔａｌ．，１９８７；Ｓｕｌｌｉｖａｎｅｔａｌ．，１９８８）。他のヘルペスウイルスの由来の多くの糖タンパク質についてもまた、重要な免疫反応を誘導することが知られている。
ウマヘルペスウイルスの両方の亜型は６種類の多量糖タンパク質を発現する（Ａｌｌｅｎｅｔａｌ．，１９８６；Ａｌｌｅｎｅｔａｌ．，１９８７）。ｇｐ２、ｇｐ１０、ｇｐ１３、ｇｐ１４、ｇｐ１７／１８およびｇｐ２１／２２ａをコードしているＤＮＡ配列のゲノム部位は、ラムダｇｔｌｌ発現ベクターおよびモノクローナル抗体を用いて同定されている（Ａｌｌｅｎｅｔａｌ．，１９８７）。糖タンパク質ｇｐ１３およびｇｐ１４は、単純ヘルペスウイルスマップの、ｇＣおよびｇＤがそれぞれ相同性を有する、ゲノムのＬ成分の内部に位置している（Ａｌｌｅｎｅｔａｌ．，１９８７）。これらのエンベローブ糖タンパク質は、液体性および細胞性の両方の宿主免疫反応の誘導に関与する、単純ヘルペスウイルスの決定的免疫原であり（Ｂｅｎ−Ｐｏｒａｔｅｔａｌ．，１９８６；Ｃａｎｔｉｎｅｔａｌ．，１９８７；Ｇｌｏｒｉｏｓｏｅｔａｌ．，１９８４；Ｗａｃｈｓｍａｎｅｔａｌ．，１９８８；Ｗａｃｈｓｍａｎｅｔａｌ．，１９８９）、そのためワクチン設計を試みるものの最も高い関心の対象である。
近年、ＥＨＶ−１のＫｅｎｔｕｃｋｙＴ４３１株の、ｇｐ１３をコードしている転写単位のヌクレオチド配列が報告された（Ａｌｌｅｎｅｔａｌ．，１９８８）。その糖タンパク質は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のｇＣ−１およびｇＣ−２、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩＩおよびバリセラ−ゾスターウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒｖｉｒｕｓ；ＶＺＶ）ｇｐＶと相同性を有することが示された（Ａｌｌｅｎｅｔａｌ．，１９８８）。ＥＨＶ−１ｇｐ１３はこのように、ヘルペスウイルスｇＣ−類似糖タンパク質の構造的な相同体である。
ＥＨＶ−１ｇｐ１４のヌクレオチド配列（Ｗｈａｌｌｅｙｅｔａｌ．，１９８９；Ｒｉｇｇｉｏｅｔａｌ．，１９８９）が近年報告された。予測されるｇｐ１４糖タンパク質のアミノ酸配列の解析により、対応する糖タンパク質ＨＳＶ、ｇＢとの顕著な相同性が明らかとなった。
いくつかのＥＨＶ−１糖タンパク質に対するモノクローナル抗体が中和することが示された（Ｓｉｎｃｌａｉｒｅｔａｌ．，１９８９）。受動免疫実験により、ｇｐ１３もしくはｇｐ１４（Ｓｉｍｉｚｕｅｔａｌ．，１９８９）、又はｇｐ１３、ｇｐ１４、もしくはｇｐ１７／１８（Ｓｔｏｋｅｓｅｔａｌ．，１９８９）に対するモノクローナル抗体はハムスターを致死投与から防御することが可能であることが示された。他のｇＢおよびｇＣ糖タンパク質アナログもまた、アルファヘルペスウイルスにより引き起こされる疾患に対する防御に関与している（Ｃａｎｔｉｎｅｔａｌ．，１９８７；Ｃｒａｎａｇｅｅｔａｌ．，１９８６；Ｇｌｏｒｉｏｓｏｅｔａｌ．，１９８４）。
仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、アルファヘルペス、は、オーエスキー病の原因となる作用物である。ＰＲＶゲノムは９０ｘ１０⁶ダルトンの、逆反復配列によってユニークロング（Ｕ_L）部分またはユニークショート（Ｕ_S）部分（Ｓｔｅｖｅｌｙ、１９７７；Ｂｅｎ−Ｐｏｒａｔｅｔａｌ．，１９７９）に分けられる二本鎖ＤＮＡから成る（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，１９７５）。ＰＲＶゲノムは約１００の、発現が他のヘルペスウイルスに類似したカスケード様の方式で制限されているポリペプチドをコードしている（Ｂｅｎ−Ｐｏｒａｔｅｔａｌ．，１９８５；Ｈａｍｐｌｅｔａｌ．，１９８４）。
ＰＲＶ糖タンパク質ｇｐ５０は、１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ｇＤのアナログである（Ｗａｔｈｅｎｅｔａｌ．，１９８４）。ＤＮＡオープンリーディングフレームは４０２のアミノ酸をコードしている（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓｅｔａｌ．，１９８６）。成熟したグリコシル化型（５０−６０ｋＤａ）は、Ｎ−リンク型グリコシル化なしで、Ｏ−リンク型炭水化物を含む（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓｅｔａｌ．，１９８６）。ブタ血清はＰＲＶｇｐ５０と非常に反応性が高く、その免疫原としての重要性を示唆している。ｇｐ５０に対するモノクローナル抗体は生体外でＰＲＶを補体とともに、または補体なしで中和し（Ｗａｔｈｅｎｅｔａｌ．，１９８４；Ｗａｔｈｅｎ１９８５；Ｅｌｏｉｔｅｔａｌ．，１９８８）、受動的にマウス（Ｍａｒｃｈｉｏｌｉｅｔａｌ．，１９８８；Ｗａｔｈｅｎ１９８５；Ｅｌｏｉｔｅｔａｌ．，１９８８）およびブタ（Ｍａｒｃｈｉｏｌｉｅｔａｌ．，１９８８）を防御する。ＰＲＶｇｐ５０を発現するワクシニアウイルス組換体は血清中和抗体を誘導し、致死量のＰＲＶ投与からマウスとブタの両方を防御した（Ｋｏｓｔｅｔａｌ．，１９８９；Ｍａｒｃｈｉｏｌｉｅｔａｌ．，１９８７；Ｉｓｈｉｉｅｔａｌ．，１９８８）。
ＰＲＶｇＩＩＩはＨＳＶ−１ｇＣのアナログである（Ｒｏｂｂｉｎｓｅｔａｌ．，１９８６）。ＨＳＶｇＣによるＰＲＶＩＩＩの機能的置換は観察されなかった（Ｗｈｅａｌｙｅｔａｌ．，１９８９）。ＰＲＶｇＩＩＩは生体外での複製には必須ではないが（Ｗａｔｈｅｎｅｔａｌ．，１９８６；Ｒｏｂｂｉｎｓｅｔａｌ．，１９８６）、成熟グリコシル化型（９８ｋＤａ）はＰＲＶエンベローブの多量の構成成分である。抗ｇｐＩＩＩモノクローナル抗体は生体外でウイルスを補体とともに、または補体なしで中和し（Ｈａｍｐｌｅｔａｌ．，１９８４；Ｅｌｏｉｔｅｔａｌ．，１９８８；Ｗａｔｈｅｎｅｔａｌ．，１９８６）、受動的にマウスとブタの両方を防御する（Ｍａｒｃｈｉｏｌｉｅｔａｌ．，１９８８）。ＰＲＶ糖タンパク質ｇＩＩＩは、大腸菌で発現されたＣｒｏ／ｇＩＩＩ融合タンパク質により免疫化した後（Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ａ．，Ｒ．ｗａｔｓｏｎ，Ｌ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，ヨーロッパ特許出願０１６２７３８Ａ１）又はワクシニア組換体中で発現された時（Ｐａｎｉｃａｌｉ，Ｄ．，Ｌ．Ｇｒｉｔｚ，Ｇ．Ｍａｚｚａｒａ，ヨーロッパ特許出願０２６１９４０Ａ２）、ネズミとブタを致死量のＰＲＶ投与から防御することができる。
ＰＲＶｇｐＩＩはＨＳＶ−１ｇＢ相同体である（Ｒｏｂｂｉｎｓｅｔａｌ．，１９８７）。ＰＲＶｇｐＩＩを標的としたモノクローナル抗体はウイルスを生体外で（Ｂｅｎ−Ｐｏｒａｔｅｔａｌ．，１９８６）補体とともに又は補体なしで（Ｗｉｔｔｍａｎｎｅｔａｌ．，１９８９）中和する。さらに、受動免疫の研究により、中和モノクローナル抗体は部分的にブタを防御する（Ｍａｒｃｈｉｏｌｉｅｔａｌ．，１９８８）ことが示された。仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇＩＩ（ｇＢ）またはｇｐ５０（ｇＤ）を発現するＮＹＶＡＣ（高度に弱毒化されたワクシニアウイルス）をベースとした組換体により免疫化することにより、毒性ＰＲＶ投与からブタを保護できることが示された（Ｂｒｏｃｋｍｅｉｅｒｅｔａｌ．，１９９３）。さらに、ＰＲＶｇＩＩおよびｇｐ５０、またはｇＩＩ、ｇＩＩＩ（ｇＣ）およびｇｐ５０を発現するワクシニア組換体は、ｇＩＩまたはｇｐ５０のみを発現する組換体よりも高いレベルの防御を引き出すことが示され、これらの糖タンパク質の潜在的な相乗作用の効果が示唆された（Ｒｉｖｉｅｒｅｅｔａｌ．，１９９２）。
１型単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ１）ゲノムは、少なくとも１１の抗原的に区別できる糖タンパク質をコードしている：ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＪ、ｇＫ、ｇＬおよびｇＭ（Ｒｏｉｚｍａｎｅｔａｌ．，１９９０）。精製されたＨＳＶ１ｇＢ、ｇＣまたはｇＤにより免疫化されたマウスは致死量のＨＳＶ１投与に対して防御される（Ｃｈａｎ，１９８３）。マウスはまた、ＨＳＶ１（Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．，１９７９）またはＨＳＶ２（Ｏａｋｅｓｅｔａｌ．，１９７８）ウイルス全体に対する抗体、および個々のＨＳＶ２ｇＢ、ｇＣ、ｇＤまたはｇＥ糖タンパク質に対する抗体（Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎｅｔａｌ．，１９８２）による受動免疫によって、致死量のＨＳＶ１またはＨＳＶ２投与に対して防御された。
ＨＳＶ１ｇＢ（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ−Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９８８）およびＨＳＶ１ｇＣ（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌｅｔａｌ．，１９８７）ウイルスを発現するワクシニアウイルスベクターは、細胞障害性Ｔ細胞反応を誘導することが示された。加えて、ＨＳＶ１ｇＢ（Ｃａｎｔｉｎｅｔａｌ．，１９８７）、ＨＳＶ１ｇＣ（Ｗｅｉｒｅｔａｌ．，１９８９）またはＨＳＶ１ｇＤ（Ｐａｏｌｅｔｔｉｅｔｅｔａｌ．，１９８４）のいずれかを発現する組換えワクシニアウイルスにより免疫化されたマウスは致死量のＨＳＶ１投与に対して防御されることが示された。ＨＳＶ１ｇＤを発現する組換えワクシニアウイルスもまた、モルモットモデル系においてＨＳＶ２に対して防御的であることが示された（Ｗａｃｈｓｍａｎｅｔａｌ．，１９８７）。
ウシヘルペスウイルス１（ＢＨＶ）は３０以上の構造的ポリペプチドを指定しているが、そのうち１１はグリコシル化されている（Ｍｉｓｒａｅｔａｌ．，１９８１）。これらの糖タンパク質のうちの３つ、ｇＩ、ｇＩＩＩおよびｇＩＶは、特徴付けがなされ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、およびｇＤと相同的であることが発見されている（Ｌａｗｒｅｎｃｅｅｔａｌ．，１９８６；Ｚａｍｂ，１９８７）。精製されたウシヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ１）ｇＩ（ｇＢ）、ｇＩＩＩ（ｇＣ）および／またはｇＩＶ（ｇＤ）による免疫化により、ＢＨＶ１／Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ投与に対して牛は防御された（Ｂａｂｉｕｋｅｔａｌ．，１９８７）。
ネコヘルペスウイルス１型（ＦＭＶ−１）は少なくとも２３の異なったタンパク質を含むことが知られている（Ｍｅａｓｅｔａｌ．，１９８４；Ｆａｒｇｅａｕｄｅｔａｌ．，１９８４）。これらのうち、少なくとも５つが１２０ｋＤａから６０ｋＤａの範囲で報告されている分子量でグリコシル化されている（Ｆａｒｇｅａｕｄｅｔａｌ．，１９８４；Ｃｏｍｐｔｏｎ、１９８９）。ＦＨＶ−１の糖タンパク質は免疫原性であることが示されている（Ｍｅａｓｅｔａｌ．，１９８４；Ｃｏｍｐｔｏｎ，１９８９）。いくつかの他のアルファヘルペスウイルスのように、ＦＨＶ−１はＨＳＶ−１の糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）と相同性を有していると見られる（Ｍａｅｄａｅｔａｌ．，１９９２）。ＦＨＶ−１ｇＢ糖タンパク質は、Ｂ−メルカプトエタノールによって、６６ｋＤａと６０ｋＤａの２つの糖タンパク質に解離する１３４ｋＤａの複合体である。ＦＨＶ−１ＤＮＡゲノムは大きさでおよそ１３４ｋｂである（Ｒｏｔａｅｔａｌ．，１９８６）。
ヒトＢリンパ栄養ヘルペスウイルスであるエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）は、亜科ガンマヘルペスウイルスに属するリンホクリプトウイルス属の仲間である（Ｒｏｉｚｍａｎｅｔａｌ．，１９９０）。ＶＺＶ（Ｄａｖｉｓｏｎｅｔａｌ．，１９８６）、ＨＳＶ１（ＭｃＧｅｏｃｈｅｔａｌ．，１９８８）、ＭＣＨＶ（Ｃｈｅｅｅｔａｌ．，１９９０）およびＥＨＶ１（Ｔｅｌｆｏｒｄｅｔａｌ．，１９９２）のゲノムと同様に、ＥＢＶのゲノムは完全にシークエンスされているので（Ｂａｅｒｅｔａｌ．，１９８４）、これらの異なったヘルペスウイルスの数多くの相同性が記述されている（Ｋｉｅｆｆｅｔａｌ．，１９９０）。
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）はベータヘルペスウイルス亜科（ヘルペスウイルス科）に属する。免疫学的に区別できる、ＨＣＭＶエンベローブに関連する糖タンパク質の３つの科が記述されている（Ｇｒｅｔｃｎｅｔａｌ．，１９８８）：ｇＣＩ（ｇｐ５５およびｇｐ９３−１３０）；ｇＣＩＩ（ｇｐ４７−５２）；およびｇＣＩＩＩ（ｇｐ８５−ｐ１４５）。ｇＣＩをコードしている遺伝子は、ＨＳＶＩｇＢと相同的である。
さらに、マレック病ウイルス（Ｍａｒｅｋ’ｓｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ；ＭＤＶ）ｇＢを発現する鶏痘ウイルス組換体での免疫化は、ニワトリを毒性ＭＤＶ投与に対して防御することが示された（Ｎａｚａｒｉａｎｅｔａｌ．，１９９２）。
これらの研究の結果は、ｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤ糖タンパク質に対する免疫反応により目的とする種の動物をヘルペスウイルス投与に対して防御可能であること、および、ＣＨＶｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖タンパク質に対応するヌクレオチドの供与は、それにより糖タンパク質、および、ベクターシステム又は糖タンパク質からの抗原性、免疫性またはワクチン組成物の供与が可能となるため、現在の技術水準以上の有用な進歩であることを示唆している。
さらに、ヌクレオチドの発現による糖タンパク質は、血清等の試料中の糖タンパク質の存在または不在およびそれによるＣＨＶ、または、（ＣＨＶに、または糖タンパク質に対する）免疫性もしくは抗原性反応の存在または不在の確認のための抗体結合診断アッセイ、キットまたは試験にさらに用いることができる抗体の誘発にも利用することができる。このように、ＣＨＶｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖タンパク質に対応するヌクレオチドの供与からは多くの用途が生じる。
例えばラムダ等のファージやＥ．ｃｏｌｉシステム等の、多様な外来性ＤＮＡの発現のためのベクターシステムが存在する（Ａｌｌｅｎｅｔａｌ．，１９８７；Ｒｏｂｂｉｎｓ、ＥＰＡ０１６２７３８Ａ１；Ｐａｎｉｃａｌｉ、ＥＰＡ０１６２７３８Ａ１、これらはそれぞれここに参考文献として特に取り込まれている。）
ワクシニアウイルスと、近年は他のポックスウイルスが、外来性遺伝子の挿入と発現のために用いられている。生きている感染可能なポックスウイルス中への外来遺伝子の挿入の基本技術は、ドナープラスミド中の外来遺伝子要素に隣接しているポックスＤＮＡ配列とレスキューポックスウイルス中に存在する相同配列との間での組み換えに関与している（Ｐｉｃｃｉｎｉｅｔａｌ．，１９８７）。
特に、ポックスウイルス組換体は、この分野で公知であり、それらの開示が参考文献としてここに取り込まれている米国特許第４７６９３３０号、同第４７７２８４８号、同第４６０３１１２号、同第５１００５８７号および同第５１７９９９３号に記載されている、例えばワクシニアウイルスやアビポックスウイルス人工組換体の創出のための方法に類似である、２段階の工程により構築される。
第一に、ウイルス中に挿入されるＤＮＡ遺伝子配列、特に非ポックス源由来のオープンリーディングフレームを、ポックスウイルスのＤＮＡ部分と相同であるＤＮＡが既に組み込まれたＥ．ｃｏｌｉプラスミド構築物中に配置する。
別に、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列をプロモーターと連結する。プロモーター−遺伝子連結物を、プロモーター−遺伝子連結物がその両端において、非必須座を含むポックスＤＮＡ領域に隣接しているＤＮＡ配列と相同的であるＤＮＡと隣接するように、プラスミド構築物中に配置する。その結果生成されたプラスミド構築物は、続いてＥ．ｃｏｌｉバクテリア内での増殖により増幅され（Ｃｌｅｗｅｌｌ、１９７２）単離される（Ｃｌｅｗｅｌｌｅｔａｌ．，１９６９；Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，１９８２）。
第二に、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を含む単離されたプラスミドを、例えばニワトリ胚繊維芽細胞等の細胞培養へ、ポックスウイルスとともに形質移入する。プラスミド中の相同ポックスＤＮＡとウイルスゲノムそれぞれとの間の組み換えにより、ゲノムの非必須領域内の外来ＤＮＡ配列の存在により改変されたポックスウイルスが供与される。「外来」ＤＮＡという用語は、外因性ＤＮＡ、特に非ポックス源由来のＤＮＡで、そのＤＮＡが配置されたゲノムによっては本来産成されない遺伝子産物をコードしているものを指す。
遺伝子的組み換えとは一般に、２本のＤＮＡ鎖の間のＤＮＡの相同性部分の交換である。ある種のウイルスにおいては、ＲＮＡがＤＮＡと置換しうる。核酸の相同性部分とは、同じヌクレオチド塩基の配列を有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の部分である。
遺伝子的組み換えは感染した宿主細胞内での複製や新しいウイルスゲノムの製造の間に自然に行われる。このように、ウイルス遺伝子の間の遺伝子的組み換えは、２以上の異なったウイルス又は他の遺伝子的構築物が共感染した宿主細胞中においてもウイルス複製サイクルの間に起こりうる。第一のゲノムからのＤＮＡ部分が、ＤＮＡが第一のウイルスゲノムのＤＮＡに相同的である、第二の共感染したウイルスのゲノム部分の構築において、相互転座可能に用いられる。
しかしながら、組み換えは、完全には相同的ではない異なったゲノムのＤＮＡ部分の間においてもまた行われる。もし、第一のゲノム由来の部分が、第一の部分の内部の、例えば遺伝子マーカー又は相同ＤＮＡに挿入された抗原決定基をコードしている遺伝子の存在を除いては、他のゲノム部分と相同的であるときは、組換えは起こり得、その組換えの生成物はその遺伝子マーカーや組換ウイルスゲノム中の遺伝子の存在により検出できる。ワクシニアウイルス組換体の創出のための付加的なストラテジーが最近報告されている。
挿入されたＤＮＡ遺伝子配列の、感染可能な改変されたウイルスでの成功裡の発現には２つの条件が必要である。第一には、改変されたウイルスが生存可能であるように、挿入はウイルスの非必須領域中でなければならない。挿入されたＤＮＡの発現のための第二の条件は、挿入されたＤＮＡと適切な関係にあるプロモーターの存在である。プロモーターは発現されるべきＤＮＡ配列の上流に位置するように配置されなければならない。
ワクシニアウイルスは、天然痘に対する免疫化のために成功裡に利用され、１９８０年には天然痘の世界中での根絶をついに達成した。その歴史の過程において、多くのワクシニア株が創成された。これらの異なった株は多様な免疫原性を示し、潜在的な合併症、そのもっとも深刻なものはワクチン後の脳炎と突発性発疹（Ｂｅｈｂｅｈａｎｉ、１９８３）、と、様々な度合いで関連している。
天然痘の根絶とともに、遺伝子的に操作された外来遺伝子の発現のためのベクターとしての、ワクシニアの新しい役割が重要となった。数多くの異種抗原をコードしている遺伝子がワクシニア中で発現され、しばしば、対応する病原体の投与に対する防御免疫という結果となった（Ｔａｒｔａｇｌｉａｅｔａｌ．，１９９０ａ中で総括）。
ワクシニアベクターの遺伝子的背景は、発現された外来免疫原の防御効率に影響を与えることが示されている。例えば、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）ｇｐ３４０の、ワクシニアウイルスのＷｙｅｔｈワクチン株中での発現は、コットントップタマリン（ｃｏｔｔｏｎｔｏｐｔａｍａｒｉｎ）をリンパ腫によって誘導されたＥＢＶに対して防御しなかったが、同じ遺伝子のワクシニアウイルスＷＲラボラトリー株での発現は防御的であった（Ｍｏｒｇａｎｅｔａｌ．，１９８８）。
効率とワクシニアウイルスベースの組換体ワクチン候補の安全性との間の精密なバランスは非常に重要である。組換ウィルスは、ワクチン接種された動物中で、防御的免疫反応を誘導するがいかなる重要な病原性性質をも欠如したやり方で免疫原（群）を供与しなければならない。それ故に、ベクター株の弱毒化は、現在の技術水準にわたって高度に好ましい進歩である。
数多くのワクシニア遺伝子が、組織培養における増殖に必須ではなく、その欠失もしくは不活性化が多くの動物システム中での毒性を減少するものであるとして同定されている。
ワクシニアウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードしている遺伝子がマッピングされ（Ｈｒｕｂｙｅｔａｌ．，１９８２）、配列決定された（Ｈｒｕｂｙｅｔａｌ．，１９８３；Ｗｅｉｒｅｔａｌ．，１９８３）。チミジンキナーゼ遺伝子の不活性化もしくは完全な欠失は、ワクシニアウイルスの多様な組織培養細胞中での増殖を妨げない。ＴＫ^-ワクシニアウイルスはまた、多様な宿主中の、多様な経路で接種された部位での生体内の複製能力も有している。
単純ヘルペスウイルス２型に対して、ＴＫ^-ウイルスのモルモットへの経膣接種は、脊髄において、ＴＫ⁺ウイルスの接種と比較して顕著に低いウイルス力価という結果となることが示された（Ｓｔａｎｂｅｒｒｙｅｔａｌ．，１９８５）。生体外でＴＫ活性をコードしているヘルペスウイルスは活動的に代謝している細胞中でのウイルス増殖にとっては重要ではないが、静止状態の細胞中での増殖には必要であることが示された（Ｊａｍｉｅｓｏｎｅｔａｌ．，１９７４）。
ＴＫ^-ワクシニアの弱毒化は、大脳内および腹腔内経路で接種されたマウスにおいて示された（Ｂｕｌｌｅｒｅｔａｌ．，１９８５）。弱毒化はＷＲ神経毒性ラボラトリー株とＷｙｅｔｈワクチン株の両方について観察された。皮内経路で接種されたマウスにおいて、ＴＫ^-組換体は、相当する抗ワクシニア中和抗体を、親株のＴＫ⁺ワクシニアウイルスに匹敵するほど発生させ、この試験システムにおいてはＴＫ機能の欠失はワクシニアウイルスベクターの免疫原性を顕著には減少させないことが示唆された。それに続く、ＴＫ^-およびＴＫ⁺組み換えワクシニアウイルス（ＷＲ株）でのマウスの鼻腔内接種においては、脳を含む他の部位への顕著に少ない伝播が見られた（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９１ａ）。
ヌクレオチド代謝に関与する他の酵素はリボヌクレオチド還元酵素である。ラージサブユニットをコードしている遺伝子の欠失による、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）内のウィルスコードリボヌクレオチド還元酵素活性の欠損は、分裂中の細胞内でのウイルス増殖およびＤＮＡ複製に何も影響を与えないが、血清飢餓細胞におけるウイルス増殖能力を厳しく制限した（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，１９８８）。目に対する急性のＨＳＶ感染および三叉神経の神経節における再活性化しうる潜在性の感染のためのマウスモデルを用いたところ、リボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニットが欠失したＨＳＶに関しては、野生型ＨＳＶによって示される毒性と比較して、減少された毒性が示された（Ｊａｃｏｂｓｏｎｅｔａｌ．，１９８９）。
リボヌクレオチド還元酵素の、スモール（Ｓｌａｂａｕｇｈｅｔａｌ．，１９８８）およびラージ（Ｓｃｈｍｉｔｔｅｔａｌ．，１９８８）サブユニットの両方がワクシニアウイルスにおいて同定されている。挿入によるリボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニットの失活は、ワクシニアウイルスのＷＲ株において、マウスの頭蓋内接種によって測定されるウイルスの弱毒化につながる（Ｃｈｉｌｄｅｔａｌ．，１９９０）。
ワクシニアウイルス血球凝集素遺伝子（ＨＡ）はマッピングされ配列決定されている（Ｓｈｉｄａ，１９８６）。ワクシニアウイルスＨＡ遺伝子は、組織培養においての増殖には必須ではない（Ｉｃｈｉｈａｓｈｉｅｔａｌ．，１９７１）。ワクシニアウイルスＨＡ遺伝子の不活性化は、頭蓋内経路で接種されたウサギの神経毒性の減少および皮内接種の部位でのより少ない病斑という結果となる（Ｓｈｉｄａｅｔａｌ．，１９８８）。ＨＡ座は、ワクシニアウイルスのＷＲ株（Ｓｈｉｄａｅｔａｌ．，１９８７）、リスター株（Ｌｉｓｔｅｒｓｔｒａｉｎ）（Ｓｈｉｄａｅｔａｌ．，１９８８）およびコペンハーゲン株（Ｇｕｏｅｔａｌ．，１９８９）において外来遺伝子の挿入に用いられた。外来遺伝子を発現する組換えＨＡ^-ワクシニアウイルスは免疫原性であり（Ｇｕｏｅｔａｌ．，１９８９；Ｉｔａｍｕｒａｅｔａｌ．，１９９０；Ｓｈｉｄａｅｔａｌ．，１９８８；Ｓｈｉｄａｅｔａｌ．，１９８７）、対応する病原体の投与に対して防御的であることが知られている（Ｇｕｏｅｔａｌ．，１９８９；Ｓｈｉｄａｅｔａｌ．，１９８７）。
牛痘ウイルス（ブライトンレッド株；Ｂｒｉｇｈｔｏｎｒｅｄｓｔｒａｉｎ）は、赤い（出血性の）痘をニワトリの卵の漿尿膜上に生じさせる。牛痘ゲノム内の自然発生的欠失は、白い痘を生じさせる変異体を創成する（Ｐｉｃｋｕｐｅｔａｌ．，１９８４）。出血性機能（ｕ）は初期遺伝子にコードされている３８ｋＤａのタンパク質に位置している（Ｐｉｃｋｕｐｅｔａｌ．，１９８６）。この遺伝子は、セリンプロテアーゼインヒビターと相同性を有し、牛痘ウイルスに対する宿主炎症性反応を阻害し（Ｐａｌｕｍｂｏｅｔａｌ．，１９８９）、血液凝固のインヒビターであることが示されている。
このｕ遺伝子は、ワクシニアウイルスＷＲ株において存在している（Ｋｏｔｗａｌｅｔａｌ．，１９８９ｂ）。外来遺伝子の挿入によってｕ遺伝子が不活性化されているＷＲワクシニアウイルス組換体を接種されたマウスは、ｕ遺伝子が手を加えられていない同様の組換ワクシニアウイルスによって接種されたマウスと比べて、高いレベルで外来遺伝子産物に対する抗体を産成した（Ｚｈｏｕｅｔａｌ．，１９９０）。ｕ領域はワクシニアウイルスコペンハーゲン株においても不全な機能しない型で存在している（オープンリーディングフレームＢ１３およびＢ１４Ｇｏｅｂｅｌｅｔａｌ．，１９９０ａ，ｂで報告された用語による）。
牛痘ウイルスは感染した細胞内で細胞質Ａ型封入体（ＡＴＩ）として局在化される（Ｋａｔｏｅｔａｌ．，１９５９）。ＡＴＩの機能は動物から動物への伝播の間に牛痘ウイルス粒子を保護することであると考えられている（Ｂｅｒｇｏｉｎｅｔａｌ．，１９７１）。牛痘ゲノムのＡＴＩ領域は、ＡＴＩボディのマトリックスを形成する１６０ｋＤａのタンパク質をコードしている（Ｆｕｎａｈａｓｈｉｅｔａｌ．，１９８８；Ｐａｔｅｌｅｔａｌ．，１９８７）。ワクシニアウイルスは、ゲノム中に相同領域を有してはいるが、一般にＡＴＩを産生しない。ワクシニアＷＲ株においては、ゲノムのＡＴＩ領域は９４ｋＤａのタンパク質として翻訳される（Ｐａｔｅｌｅｔａｌ．，１９８８）。ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株においては、ＡＴＩ領域に相当するＤＮＡ配列の殆どが欠失しており、ＡＴＩ領域の上流配列と融合された領域の３’末端が残存し、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）Ａ２６Ｌを形成している（Ｇｏｅｂｅｌｅｔａｌ．，１９９０ａ，ｂ）。
多様な自然発生的な（Ａｌｔｅｎｂｕｒｇｅｒｅｔａｌ．，１９８９；Ｄｒｉｌｌｉｅｎｅｔａｌ．，１９８１；Ｌａｉｅｔａｌ．，１９８９；Ｍｏｓｓｅｔａｌ．，１９８１；Ｐａｅｚｅｔａｌ．，１９８５；Ｐａｎｉｃａｌｉｅｔａｌ．，１９８１）および操作された（Ｐｅｒｋｕｓｅｔａｌ．，１９９１；Ｐｅｒｋｕｓｅｔａｌ．，１９８９；Ｐｅｒｋｕｓｅｔａｌ．，１９８６）ワクシニアウイルスゲノムの左端近くでの欠失が報告されている。１０ｋｂの自然発生的欠失を有するＷＲ株（Ｍｏｓｓｅｔａｌ．，１９８１；Ｐａｎｉｃａｌｉｅｔａｌ．，１９８１）は、マウスへの頭蓋内接種により弱毒化されることが示された（Ｂｕｌｌｅｒｅｔａｌ．，１９８５）。この欠失はのちに１７の潜在的ＯＲＦを含んでいることが示された（Ｋｏｔｗａｌｅｔａｌ．，１９８８ｂ）。欠失領域の特異的遺伝子には、ビロキンＮ１Ｌ（ｖｉｒｏｋｉｎｅＮ１Ｌ）および３５ｋＤａタンパク質（Ｃ３Ｌ、Ｇｏｅｂｅｌｅｔａｌ．，１９９０ａ，ｂの報告の用語による）を含んでいる。挿入によるＮ１Ｌの不活性化は、頭蓋内接種による通常のマウスおよびヌードマウスの両方に対する毒性を減少させる（Ｋｏｔｗａｌｅｔａｌ．，１９８９ａ）。３５ｋＤａタンパク質はＮ１Ｌのようにワクシニアウイルス感染細胞の培地中に分泌される。このタンパク質は、補体調整タンパク質（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｃｏｎｔｒｏｌｐｒｏｔｅｉｎｓ）ファミリー、特に補体４Ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）に対する相同性を有している（Ｋｏｔｗａｌｅｔａｌ．，１９８８ａ）。細胞内Ｃ４ｂｐのように、ワクシニア３５ｋＤａタンパク質は補体の第四成分に結合し、古典的補体カスケード（ｃｌａｓｓｉｃａｌｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｃａｓｃａｄｅ）を阻害する（Ｋｏｔｗａｌｅｔａｌ．，１９９０）。このように、ワクシニア３５ｋＤａタンパク質は、ウイルスの宿主防御機構からの回避を援助することに関与しているものと見られる。
ワクシニアゲノムの左端、宿主領域遺伝子Ｋ１Ｌ（Ｇｉｌｌａｒｄｅｔａｌ．，１９８６）およびＣ７Ｌ（Ｐｅｒｋｕｓｅｔａｌ．，１９９０）と同定されている２つの遺伝子を含んでいる。これらの遺伝子の両方の欠失は、ワクシニアウイルスの多様なヒト細胞系列における増殖能力を減少させる（Ｐｅｒｋｕｓｅｔａｌ．，１９９０）。
２つの付加的なワクチンベクターシステムが、本来宿主制限されたポックスウイルス、アビポックスウイルスの利用に関与している。ニワトリポックスウイルス（ｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓ；ＦＰＶ）およびカナリアポックスウイルス（ｃａｎａｒｙｐｏｘｖｉｒｕｓ；ＣＰＶ）が外来遺伝子産物の発現のために操作されてきている。ニワトリポックスウイルス（ＦＲＶ）は、ポックスウイルス科アビポックスウイルス属の標準的なウイルスである。このウイルスは、１９２０年代以来、生弱毒化ワクチンの利用により良好に制御されている、経済的に重要な家禽病を引き起こす。アビポックスウイルスの複製は鳥類種に限られており（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，１９８２ｂ）、アビポックスウイルスが、ヒトを含む非鳥類種への生産的感染を引き起こしたという報告は文献にはない。この宿主制限は、ウイルスの他の種への伝播に対する内在的安全バリアを供与し、アビポックスウイルスベースのワクチンベクターの獣医学およびヒトの用途での利用を、魅力的な問題とする。
ＦＰＶは、家禽病原体由来の抗原を発現するベクターとして有利に利用されてきた。毒性鳥類インフルエンザウイルスの血球凝集素タンパク質が、ＦＰＶ組換体中で発現された（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９８８ａ）。組換体をニワトリおよび七面鳥に接種した後、同種または異種の毒性インフルエンザウイルス投与に対して防御的である免疫反応が誘導された（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９８８ａ）。ニューカッスル病ウイルス（ＮｅｗｃａｓｔｌｅＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ）の表面糖タンパク質を発現するＦＰＶ組換体もまた開発された（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９０；Ｅｄｂａｕｅｒｅｔａｌ．，１９９０）。
ＦＰＶおよびＣＰＶの複製が、鳥類系に限定されているにも拘わらず、これらのウイルスから派生した組換体は、鳥類以外の起源の細胞中で外因性タンパク質を発現することが発見された。さらに、このような組換ウィルスは、外来遺伝子産物に対する免疫学的反応を誘導することが示され、好適な場合には、対応する病原体の投与に対して防御する余裕があることが示された（Ｔａｒｔａｇｌｉａｅｔａｌ．，１９９３ａ，ｂ；Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９２；１９９１ｂ；１９８８ｂ）。
このように、今までは、ＣＨＶｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖タンパク質に対するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は教示も示唆もされておらず、これらの配列の提供は非常に価値の高いものである。さらに、ＣＨＶｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖タンパク質に対するヌクレオチド由来の（例えば、これらのヌクレオチドを含むベクターシステム由来の）、ワクチン、抗原的もしくは免疫的組成物は、糖タンパク質それら自体（例えばベクターシステムにより発現されたもの）と同様に、これまでは教示も示唆もされておらず、そして、これらのヌクレオチド、ベクターシステム、糖タンパク質および組成物は非常に価値の高いものである。
本発明の目的と概要
このように、本発明の一つの目的は、ＣＨＶｇＢ、ｇＣおよびｇＤをコードする単離された核酸またはヌクレオチドを提供することである。
ＣＨＶｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤをコードする単離された核酸またはヌクレオチドを含むベクターを供与することも、本発明のさらなる目的である。
ＣＨＶｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖タンパク質を、とくに、ヌクレオチドまたは単離された核酸をベクター中での発現により供与することが本発明の別の目的である。
ＣＨＶｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤをコードする単離された核酸またはヌクレオチド、またはそれらをコードするベクター由来の、または、例えばベクターの発現などで得られた糖タンパク質それ自体由来の、抗原的、ワクチン、免疫的組成物を供与することも、本発明の付加的な目的である。
改変された組換えウイルスであって、より高い安全性を有するものを提供すること、およびそのような組換えウイルスの作成方法を提供することも本発明の別の目的である。
公知の組換えポックスウイルスの抗原的、ワクチンもしくは免疫的組成物と比較してより高いレベルの安全性を有する組換えポックスウイルス抗原的、ワクチンもしくは免疫的組成物を提供することも本発明の付加的な目的である。
宿主中で遺伝子産物を発現するためのベクターであって、宿主中で低毒性であるようにベクターが改変されているものを供与することも本発明のさらなる目的である。
例えばＣＨＶｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤ等の遺伝子産物を生体外で培養された細胞中で発現するための、より高いレベルの安全性を有する改変組換えウイルスもしくは改変ベクターを用いる方法を提供することもまた本発明の別の目的である。
これらの、および他の本発明の目的および利点は、以下を考慮することによりより容易に明らかとなるであろう。
本発明はＣＨＶｇＢ、ｇＣおよびｇＤヌクレオチド、それらからの糖タンパク質の解析、およびそのヌクレオチド配列および糖タンパク質を用いた抗原的、ワクチンもしくは組成物に関する。
従って、本発明はヌクレオチドもしくはイヌヘルペスウイルスｇＢ糖タンパク質をコードしている単離された核酸を提供する。
本発明はイヌヘルペスウイルスｇＣ糖タンパク質をコードしている単離された核酸を提供する。
本発明はイヌヘルペスウイルスｇＤ糖タンパク質をコードしている単離された核酸を提供する。
そのヌクレオチドは好ましくはＤＮＡである。ヌクレオチドもしくは単離された核酸は好ましくは図１、４および７に示されたＤＮＡ配列を有する。
本発明はまたイヌヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＢを提供する。
本発明はまたイヌヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＣを提供する。
本発明はまたイヌヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＤを提供する。
本発明はさらにイヌヘルペスウイルスｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤに対するヌクレオチドまたは単離された核酸を含むベクターを提供する。好ましくはそのベクターは例えば組換えワクシニアまたはアビポックスウイルスなどの組換えポックスウイルスであり、より好ましくはそのワクシニアまたはアビポックスウイルスは例えばＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣもしくはＴＲＯＶＡＣのように弱毒化されている。
このように、１つの好ましい態様においては、本発明は、組換ウイルスが弱毒化された毒性およびより高い安全性を有するように、ウイルスがコードしている遺伝的機能を不活性化されている改変組換ウィルスに関する。その機能は、必須ではないか、または毒性に関連している。ウイルスは好ましくはポックスウイルス、特に、例えばニワトリポックスウイルスやカナリアポックスウイルスなどのワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルスである。改変組織ウィルスには、ウイルスゲノム中の非必須領域中に、ＣＨＶ抗原性タンパク質、例えばＣＨＶｇＣ、ｇＢおよびｇＤまたはそれらのいずれかの組合せ等をコードしている外来性ＤＮＡ配列を含んでいても良い。
さらに好ましい態様においては、本発明は、ウイルスが弱毒化された毒性を有するように、非必須のウイルスにコードされている遺伝的機能を不活性化されている改変組換ウィルスであって、その改変組織ウィルスはさらにウイルスゲノムの非必須領域中に異種起源由来のＤＮＡを含んでいるものに関する。そのＤＮＡはＣＨＶｇＢ、ｇＣおよびｇＤ、またはそれらのいずれかの組合せをコードしていても良い。特に、毒性要素をコードしているオープンリーディングフレームを欠失させることにより、または天然に宿主が制限されているウイルスを利用することにより、遺伝的機能が不活性化されている。本発明に従って利用されるウイルスは、好ましくは、ポックスウイルス、特に、例えばニワトリポックスウイルスおよびカナリアポックスウイルス等の、ワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルスである。好ましくは、そのオープンリーディングフレームは、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｌ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ、およびＩ４Ｌ（Ｇｏｅｂｅｌｅｔａｌ．，１９９０ａ，ｂで報告された用語による）；およびそれらの組合せから成る群から選択される。これに関して、オープンリーディングフレームは、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主域遺伝子領域またはリボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニット；あるいはこれらの組合せから成る。ワクシニアウイルス改変コペンハーゲン株はＮＹＶＡＣと同定されている（Ｔａｒｔａｇｌｉａｅｔａｌ．，１９９２）。
本発明はさらに、抗原性または免疫的反応をイヌ等の宿主中で誘導するための抗原的、ワクチンまたは免疫的組成物であって、イヌヘルペスウイルスｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤに対するヌクレオチド（群）あるいは単離された核酸（群）を含む適切なベクターおよび適切な担体から成るもの；または、例えば本発明のヌクレオチド（群）を含むベクターにおいてのそれらの発現由来等の、イヌヘルペスウイルスｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤ糖タンパク質（群）、および適切な担体を提供する。
本発明はさらに、発明のヌクレオチド（群）または単離された核酸（群）、糖タンパク質（群）、組成物（群）を用いる方法をも提供する。
このように、本発明はイヌヘルペスウイルスｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤを調製するための、それらに対応するヌクレオチド（群）または単離された核酸（群）を適切なベクター中に挿入し、ベクターを培養し、ベクターから糖タンパク質を回収することから成る方法を提供する。ベクターはワクシニアやアビポックスウイルス等のポックスウイルス、ラムダ等のファージ、またはＥ．ｃｏｌｉや他の適切なウイルスまたは細菌ベクターであってもよい。培養は、ウイルス感染を受けやすい細胞をウイルスベクターで感染させるかまたは、細菌ベクターシステムのコロニーを、例えばプレートや液体培地法等で増殖させてもよい。そして、回収は糖タンパク質をウイルス感染細胞または細菌細胞から分離してもよい。
このように、好ましい態様においては、本発明は、弱毒化された毒性とより高い安全性を有する改変組換ウィルスを細胞に導入し、生体外で培養された細胞内で遺伝子産物を発現させる方法に関している。改変組換ウィルスは、非必須領域内に、例えばＣＨＶｇＢ、ｇＣおよびｇＤまたはこれらのいずれかの組合せ等の、抗原性タンパク質をコードしている外因性ＤＮＡ配列を有していてもよい。
同様に、本発明は、本発明の抗原的、ワクチンまたは免疫的組成物をイヌ等の宿主に投与することから成る、イヌ等の宿主細胞中でイヌヘルペスウイルスに対する抗原的または免疫的反応を刺激する方法または接種する方法に関する。さらには、本発明は、本発明のヌクレオチド（群）の発現により誘導された抗体を含む。この抗体は公知の技術によりモノクローナル抗体とすることができ、そして、抗体もしくはモノクローナル抗体は、血清などの試料中のＣＨＶｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤの存在または不在およびそれによるＣＨＶ、またはＣＨＶもしくはその糖タンパク質に対する抗体または免疫反応、の存在または不在を決定するための結合診断アッセイ、試験またはキットに用いられてもよい。
これらおよび他の本発明の範囲内の実施態様は、記載されているかまたは、以下の詳細な説明から明らかである。
【図面の簡単な説明】
以下の、実施例を通して与えられ、本発明を記載された特定の実施例に限定するために意図されているのではない詳細な説明は、付随している図面と関連づけることによって最もよく理解されるであろうが、ここにおいて、
図１は、ＣＨＶｇＢ相同体のヌクレオチド配列（配列番号１）および予測されるアミノ酸配列（配列番号２）を示し；
図２はＣＨＶｇＢ相同体のハイドロパシー性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）分析を示し；
図３Ａおよび３Ｂは８つのｇＢ相同体のアミノ酸のホモロジーを示し（配列番号３−１０）；
図４はＣＨＶｇＣ相同体のヌクレオチド配列（配列番号１１）と予測されるアミノ酸配列（配列番号１２）、ならびにＯＲＦ２の予測されるアミノ酸配列（配列番号１３）を示し；
図５はＣＨＶｇＤ相同体のハイドロパシー性分析を示し；
図６は４つのｇＣ相同体のアミノ酸のホモロジーを示し（配列番号１４−１７）；
図７はＣＨＶｇＤ相同体のヌクレオチド配列（配列番号１８）と予測されるアミノ酸配列（配列番号１９）を示し；
図８はＣＨＶｇＤ相同体のハイドロパシー性分析を示し；
図９は４つのｇＤ相同体のアミノ酸のホモロジーを示し（配列番号２０−２３）；
図１０は、チミジンキナーゼ遺伝子欠失用のプラスミドｐＳＤ４６０の構築方法および組換ワクシニアウイルスｖＰ４１０の開発を模式的に示し；
図１１は、出血性領域欠失用のプラスミドｐＳＤ４８６の構築方法および組換ワクシニアウイルスｖ５３３の開発を模式的に示し；
図１２は、ＡＴＩ領域欠失用のプラスミドｐＭＰ４９４Δの構築方法および組換ワクシニアウイルスｖＰ６１８の開発を模式的に示し；
図１３は、血液凝集素遺伝子欠失用のプラスミドｐＳＤ４６７の構築方法および組換ワクシニアウイルスｖＰ７２３の開発を模式的に示し；
図１４は、遺伝子クラスター［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］欠失用のプラスミドｐＭＰＣＫ１Δの構築方法および組換ワクシニアウイルスｖＰ８０４の開発を模式的に示し；
図１５は、リボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニット欠失用のプラスミドｐＳＤ５４８の構築方法および組換ワクシニアウイルスｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）の開発を模式的に示し、
図１６は、狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子のＴＫ欠失座への挿入用のプラスミドｐＲＷ８４２の構築方法および組換ワクシニアウイルスｖＰ８７９の開発を模式的に示し；
図１７は、Ｃ５ＯＲＦを含むカナリアポックスＰｖｕII断片のＤＮＡ配列（配列番号６２）を示し；
図１８Ａおよび１８Ｂは、組換カナリアポックスウイルスｖＣＰ６５（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）の構築方法を模式的に示し；
図１９は、ＮＹＶＡＣの開発のために欠失されたＯＲＦを模式的に示し；
図２０は、Ｆ８ＯＲＦを含むＴＲＯＶＡＣＤＮＡ断片のヌクレオチド配列（配列番号７２）を示し；
図２１は、Ｆ７ＯＲＦを含む２３５６塩基対のＴＲＯＶＡＣＤＮＡ断片のヌクレオチド配列（配列番号７５）を示し；
図２２Ａから２２Ｄは、狂犬病中和抗体力価（ＲＦＦＩＴ、ＩＵ／ｍｌ）、ＨＤＣおよびｖＣＰ６５（１０^5.5ＴＣＩＤ５０）の、同一または別のワクチン（０、２８、および１８０日にワクチンが与えられ、抗体力価は０、７、２８、３５、５６、１７３、１８７および２０８日に測定）で前もって免疫化されたボランティアのうちでの追加免疫効果のグラフを示し；
図２３は、ｐＣＨＶ３７およびｖＣＰ３２０に含まれた、Ｉ３ＬでプロモートされたＣＨＶｇＢ遺伝子のヌクレオチド配列を示し；
図２４は、ＡＬＶＡＣＣ６フランキングアーム（ｆｌａｎｋｉｎｇａｒｍ）の遺伝子のヌクレオチド配列を示し；
図２５は、ｖＣＰ３２０感染細胞（³⁵Ｓ標識された偽感染細胞（レーンＡ）、ＡＬＶＡＣ感染細胞（レーンＢ）、ｖＣＰ３２０感染細胞（レーンＣ）およびＣＨＶ感染細胞（レーンＤ）の破砕物は、ＣＨＶｇＢ特異的モノクローナル抗体１１２５Ｂ２（ＲｈｏｎｅＭｅｒｉｅｕｘ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅより入手）とともに免疫沈降され、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で泳動した。分子量マーカーはレーンＥで泳動した。）の免疫沈降分析を示し；
図２６は、ｐＣＨＶ４０およびｖＣＰ３２２に含まれた、Ｈ６でプロモートされたＣＨＶｇＣ遺伝子のヌクレオチド配列を示し；
図２７は、ｖＣＰ３２２感染細胞（³²Ｓ標識された偽感染細胞（レーンＡ）、ＡＬＶＡＣ感染細胞（レーンＢ）、ｖＣＰ３２２感染細胞（レーンＣ）およびＣＨＶ感染細胞（レーンＤ）の破砕物は、ＣＨＶｇＣ特異的モノクローナル抗体２０１１Ａ９（ＲｈｏｎｅＭｅｒｉｅｕｘ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅより入手）とともに免疫沈降され、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で泳動した。分子量マーカーはレーンＥで泳動した。）の免疫沈降分析を示し；
図２８は、ｐＣＨＶ２６およびｖＣＰ２９４に含まれた、Ｈ６でプロモートされたＣＨＶｇＤ遺伝子のヌクレオチド配列を示し；
図２９は、ｖＣＰ２９４感染細胞（³⁵Ｓ標識された偽感染細胞（レーンＡ）、ＡＬＶＡＣ感染細胞（レーンＢ）、ｖＣＰ２９４感染細胞（レーンＣ）およびＣＨＶ感染細胞（レーンＤ）の破砕物は、ＣＨＶｇＤ特異的モノクローナル抗体２０８Ｄ１１（ＲｈｏｎｅＭｅｒｉｅｕｘ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅより入手）とともに免疫沈降され、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で泳動した。分子量マーカーはレーンＥで泳動した。）の免疫沈降分析を示している。
詳細な説明
本発明は、ＣＨＶｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子をコードしているヌクレオチドを提供する。これらの遺伝子は、それぞれ８７９、４５９および３４５アミノ酸のポリペプチドをコードしている。これらの糖タンパク質の予測されるアミノ酸配列と、他のヘルペスウイルスのｇＢ、ｇＣおよびｇＤアミノ酸配列との比較により、ＣＨＶはアルファヘルペスウイルスの一つであること；このウイルスの以前の生物学的特徴に従った分類と一致する結論が示唆された。この分析により、ｇＢ相同体間のホモロジーはｇＣまたはｇＤ相同体間のホモロジーより大きいこともまた明らかとなり、ｇＢに関する構造上または機能上の束縛はｇＣもしくはｇＤに関するものより大きいことが示唆された。
相同性ｇＢ、ｇＣおよびｇＤポリペプチドを並べることにより、非常に多くのシステイン残基が完全に保存されていることが明らかとなった。これらの結果は、これらのシステイン残基が、それらのジスルフィド結合を形成する能力により、ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖タンパク質の構造および機能の無欠さを維持することにおいて重要であることを示唆している。事実、ＨＳＶ１においては、システイン１はシステイン５とともにジスルフィド結合を形成し、システイン２はシステイン６とともにジスルフィド結合を形成し、システイン３はシステイン４とともにジスルフィド結合を形成することが示されている（Ｌｏｎｇｅｔａｌ．，１９９２）。さらに、これらの残基のいずれかに対する変異は、結果として生じる糖タンパク質の立体配置、プロセシング、機能に多大な効果を有する（Ｗｉｌｃｏｘｅｔａｌ．，１９８８；Ｌｏｎｇｅｔａｌ．，１９９０）。故に、本発明の糖タンパク質中でのシステイン残基の保存もまた、構造上の重要性を有する。
ｇＣ、ｇＤ、特にｇＢ相同体の間の高いホモロジーの程度もまた、これらの糖タンパク質が共通した機能を有することを示唆している。事実、ＢＨＶ１のｇＢ相同体はｇＢ^-ＰＲＶウイルスをレスキューできることが示されており、これらの２つの糖タンパク質が機能的に同等であることが示唆されている（Ｋｏｐｐ＆Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ，１９９２）。
相同性ｇＢ、ｇＣおよびｇＤポリペプチドを並べることにより、潜在的なＮ−結合グリコシル化部位がいくらか保存されていることが明らかとなった。Ｎ−グリコシル化は、例えばタンパク質の立体配置の保持、プロテアーゼ分解に対する防御等の多様な機能において役割を有していると考えられている。しかしながら、ヘルペスウイルス糖タンパク質に対するＮ−結合炭化水素の生物学的重要性はまだ完全には理解されていない。例えば、ＨＳＶ１感染細胞のツニカマイシン処理は、感染可能なウイルス粒子の生産を阻害することが示されている（Ｐｉｚｅｒｅｔａｌ．，１９８８）。それに加えて、ＨＳＶ１ウイルス粒子のエンドグリコシダーゼ処理は感染性を減少させることが示された（Ｋｕｈｎｅｔａｌ．，１９８８）。他方では、グリコシル化部位の変異は感染性に影響しないので、ＨＳＶ１ｇＤのＮ−結合グリコシル化に絶対に必須であるとは思われない（Ｓｏｄｏｒａｅｔａｌ．，１９９１）。故に、ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖タンパク質のグリコシル化部位は比較的よく保存されているが、これらのポリペプチドの適切なグリコシル化は、完全には必須ではない。
ヘルペスウイルスのＧ＋Ｃ含量は３３−７５％の間で変化する（Ｒｏｉｚｍａｎ，１９８２）。この拡散している多様性は、ウイルスにコードされているかまたは誘導された、ヌクレオチド代謝に関与する酵素の存在（または不在）に基づく非選択的変異偏向によるものであることが示唆されている（Ｈｏｎｅｓｓｅｔａｌ．，１９８４）。例えば、ＶＺＶおよびヘルペスウイルスサイミリ（ｓａｉｍｉｒｉ；ＨＶＳ）は両方とも比較的低いＧ＋Ｃ含量（それぞれ、４６％と４６％）を有し、そして両方とも酵素チミジル酸シンセターゼをコードしているが、この酵素はＴＴＰ合成に関与している（Ｄａｖｉｓｏｎ＆Ｓｃｏｔｔ，１９８６；Ｈｏｎｅｓｓｅｔａｌ．，１９８６）。他方でＨＳＶ１、ＨＣＭＶおよびＥＢＶは比較的高いＧ＋Ｃ含量を有しているが（６８％、５７％および６０％）、チミジル酸シンセターゼをコードしているようには思われない（Ｈｏｎｅｓｓｅｔａｌ．，１９８６）。ＣＨＶはＤＮＡ密度分析によって、いずれのヘルペスウイルスよりも低いＧ＋Ｃ含量３３％（Ｐｌｕｍｍｅｒｅｔａｌ．，１９６９；Ｒｏｉｚｍａｎｅｔａｌ．，１９８２）；比較的低い本発明のヌクレオチドのＧ＋Ｃ含量に相当する値（２９％）を有することが同定されている。ＣＨＶはヌクレオチド代謝に関する酵素をコードしていないという理論に拘束されることを望んではいないが、本発明から、ＣＨＶｇＣ遺伝子のすぐ下の下流に位置しているＯＲＦはＶＺＶチミジル酸シンセターゼとは相同的ではないと判明した。故に、もしＣＨＶがチミジル酸シンセターゼ遺伝子を含んでいれば、それはＶＺＶと同じゲノム中の位置には発見されなかった。
ＣＨＶにさらされた新生の子犬は通常はＣＨＶ特異的中和抗体を形成することなしに死ぬ。また、母体の抗体、または血清陽性イヌ由来の免疫血清での処理は、子犬を致命的なＣＨＶ感染から防御できる（Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，１９７０）。故に、血清中和抗体は致命的なＣＨＶ感染から子犬を防御できる。同様に、血清中和抗体は成犬を自己限定的な潜在性の上気道感染症から防御できる。
３つのＣＨＶ糖タンパク質である、ｇｐ１４５／１１２、ｇｐ８０およびｇｐ４７は、ＣＨＶ中和抗体を誘導することが知られている（Ｘｕａｎｅｔａｌ．，１９９１）。これらの糖タンパク質をコードしている遺伝子はまだ同定されていない。いかなる一の理論に拘束されることも望んではいないが、しかしながら、これらの抗原は本発明のｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子にコードされている可能性がある。いくつかの報告が、ｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤに対する免疫反応は、標的動物の、ヘルペスウイルス投与からの防御を提供可能であることを示唆しているため（Ｂａｂｕｉｋｅｔａｌ．，１９８７；Ｎａｚａｒｉａｎｅｔａｌ．，１９９２；Ｒｉｖｉｅｒｅｅｔａｌ．，１９９２；Ｂｒｏｃｋｍｅｉｅｒｅｔａｌ．，１９９３）、本発明のＣＨＶｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子は、効率の良いＣＨＶ糖タンパク質、免疫的またはワクチン組成物およびそれらの使用方法を提供する。
特に、本発明のヌクレオチドは発現のためのいかなる適切なベクターシステム中にも挿入できる。例えば、ヌクレオチド（群）は、公知の方法を用いてＥ．ｃｏｌｉシステム等の（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓ、ＥＰＡ０１６２７３８Ａ１；Ｐａｎｉｃａｌｉ、ＥＰＡ０２６１９４０Ａ２を参照）いかなる適切な細菌ベクター中に挿入できる。
このヌクレオチド（群）は、例えばラムダ、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス（参考文献として取り込まれているＲｏｉｚｍａｎ、ＵＳ特許第４７６９３３１号を参照）、バキュロウイルス、ポリオウイルス（Ｋｉｔｓｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，３０６８−３０７５，１９９１参考文献としてここに取込みを参照）。アデノウイルス（Ｇｒｕｎｈａｕｓｅｔａｌ．，１９９２，”Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓａｓｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒｅ”，ＳｅｍｉｎｅｒｓｉｎＶｉｒｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌ．３）ｐ．２３７−５２，１９９３；Ｂａｌｌａｙｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．４，ｐ．３８６１−６５；Ｇｒａｈａｍ，Ｔｉｂｔｅｃｈ８，８５−８７，Ａｐｒｉｌ，１９９０；Ｐｒｅｖｅｃｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．ＶＩｒｏｌ．７０，４２９−４３４を参照、それぞれはここに参考文献として取り込まれている）システム等の、いかなる適切なファージまたはウイルスベクターシステムに、公知の方法により挿入できる。
好ましいベクターシステムはポックスウイルスベクターシステムであり、特に、米国特許第４７６９３３０号、第４７７２８４８号、第４６０３１１２号、５１００５８７号および５１７９９９３号のように組換えられているアビポックスワクシニアウイルスシステムである。しかしながら、弱毒化されたポックスウイルスシステムはさらに好ましい。
新しいワクシニアワクチン株、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）の開発のために、ワクシニアウイルスのコペンハーゲンワクチン株を、公知のまたは潜在性の毒性要素をコードしている、ゲノムの６つの非必須領域を欠失することにより改変した。欠失の順序を以下に詳述する。全てのワクシニア制限酵素断片、オープンリーディングフレームおよびヌクレオチド位置の命名は、Ｇｏｅｂｅｌｅｔａｌ．，１９９０ａ，ｂにおいて報告された用語に基づいている。
欠失遺伝子座を、外来遺伝子挿入のための受容体座としても操作した。
ＮＹＶＡＣにおいて欠失された領域は以下に列挙されている。略語、欠失された領域のオープンリーディングフレームの命名（Ｇｏｅｂｅｌｅｔａｌ．，１９９０ａ，ｂ）および特定された欠失を通した全ての欠失を含むワクシニア組換体（ｖＰ）の命名もまた、以下に列挙する。
（１）チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）ｖＰ４１０；
（２）出血性領域（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ５５３；
（３）Ａ型封入体領域（ＡｔＩ；Ａ２６Ｌ）ｖＰ６１８；
（４）血球凝集素遺伝子（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）ｖＰ７２３；
（５）宿主域遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）ｖＰ８０４；および
（６）リボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニット（Ｉ４Ｌ）ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）
ＮＹＶＡＣは、毒性や宿主領域に関する遺伝子産物をコードしている１８のオープンリーディングフレームの特異的欠失により開発された、遺伝子的操作をされたワクシニアウイルス株である。ＮＹＶＡＣは、ｉ）新生マウスへの大脳内接種後の減少した毒性、ｉｉ）遺伝的（ｎｕ ⁺／ｎｕ ⁺）もしくは化学的（シクロフォスファアミド）に免疫無防備状態のマウス中での無毒性、ｉｉｉ）免疫無防備状態のマウスにおける散在性感染の誘発の欠如、ｉｖ）ウサギ皮膚上での顕著な硬化および潰瘍化の欠如、ｖ）接種部位からの迅速な消散、およびｖｉ）ヒト起源のものを含む組織培養細胞系統上での顕著に減少された複製能力、という数多くの基準からみて高度に弱毒化されている。にもかかわらず、ＮＹＶＡＣをベースとしたベクターは、外因性免疫原に対する完全な反応を誘導し、防御的免疫を提供した。
ＴＲＯＶＡＣとは、生後１日のニワトリのワクチンに認可されているニワトリポックスウイルスのＦＰ−１ワクチン株から派生した、プラーククローン単離体である弱毒化されたニワトリポックスを指す。ＡＬＶＡＣとは、認可されたカナリアポックスワクチンであるＫａｎａｐｏｘ（Ｔａｒｔａｇｌｉａｅｔａｌ．，１９９２）のプラーククローンされた派生体である、弱毒化されたカナリアポックスウイルスベースのベクターである。ＡＬＶＡＣは、いくつかのＫａｎａｐｏｘの一般的性質と同様の、いくつかの一般的性質を有する。ＡＬＶＡＣをベースとした外因性免疫原を発現する組換えウイルスもまた、ワクチンベクターとして効率的であることが示されている（Ｔａｒｔａｇｌｉａｅｔａｌ．，１９９３ａ，ｂ）。このアビポックスベクターは、生産的な複製は鳥類種のみに限られている。ヒト細胞培養においては、カナリアポックスウイルスの複製は、ウイルス複製サイクル中のウイルスＤＮＡ合成の前で中止される。にもかかわらず、外来免疫原を発現するよう操作された場合は、実際の発現とプロセシングが生体外のほ乳類細胞中で観察され、多くのほ乳類種への接種により、外因性免疫原に対する抗体および細胞性免疫反応を誘導し、同種の病原体の投与に対する防御を提供する。（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９２；Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９１）。近年のヨーロッパとアメリカ両方におけるカナリアポックス／狂犬病糖タンパク質組換体（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）のフェーズＩ臨床試験では、実験的ワクチンは十分に抗毒性であり、防御的レベルの狂犬病ウイルス中和抗体力価を誘導することが示された（Ｃａｄｏｚｅｔａｌ．，１９９２；Ｆｒｉｅｓｅｔａｌ．，１９９２）。さらに、ＡＬＶＡＣ−ＲＧワクチン接種から派生した末梢血単核細胞（ＰＭＢＣｓ）は、精製狂犬病ウイルスで刺激された場合に顕著なレベルのリンパ球拡散を示した（Ｆｒｉｅｓｅｔａｌ．，１９９２）。
ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣはまた、国立衛生研究所（ＮＩＨ）（アメリカの公的衛生施設）、組換えＤＮＡ勧告委員会、ウイルスやベクター等の遺伝子的材料の物理的規制のためのガイドライン、すなわち特定のウイルスやベクターの病原性に基づくこのようなベクターやウイルスの利用のための安全な手順のガイドラインを公布している機関が、その物理的規制レベルを物理的規制レベルの減少：ＢＳＬ２からＢＬＳ１へ、を認可したという点で全てのポックスウイルスの中でも独特であると認識されている。ワクシニアウイルスコペンハーゲン株−普通の天然痘ワクチン−ですらも、より高い物理的規制レベル、すなわちＢＳＬ２を有している。従って、当業者はＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣが他のいかなるポックスウイルスよりも低い病原性を有していることを認識している。
明らかに、弱毒化されたＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣのプロフィールとそれらが示す、液体性および細胞性の両方において外因性免疫原に対する免疫的反応を誘導する能力に基づいて（Ｔａｒｔａｇｌｉａｅｔａｌ．，１９９３ａ，ｂ；Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９２；Ｋｏｎｉｓｈｉｅｔａｌ．，１９９２）、このような組換えウイルスは前に記述されたワクシニアベースの組換えウイルスを超えた顕著な利点を提供する。
バクテリアまたは組換えウイルスに感染させた細胞を増殖させた後、糖タンパク質（群）はクロマトグラフィー等の公知の技術により回収される（Ｒｏｂｂｉｎｓ、ＥＰＡ０１６２７３８Ａ１；Ｐａｎｉｃａｌｉ，ＥＰＡ０２６１９４０Ａ２参照）。
回収された糖タンパク質（群）は続いて、適切な担体を含むワクチン、抗原的または免疫的組成物に用いることができる。従って、本発明のヌクレオチドは極めて有用である。
別の選択としては、ウイルスベクターシステム、特に好ましいポックスウイルスベクターシステムは、適切な担体を含むワクチン、抗原的または免疫的組成物中で用いることができる。組成物中のＣＨＶ組換えポックスウイルスは、生体内で投与または接種の後にＣＨＶタンパク質を発現する。
本発明の抗原的、免疫的またはワクチン組成物（本発明のヌクレオチド（群）を含むベクターシステムから発現された糖タンパク質（群）を含むもの又はＣＨＶ組換えポックスウイルス等の適切なベクターシステムを含むもの）は、血清陽性イヌ由来の免疫血清または母体の抗体と同様のやり方で子犬に投与される（Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，１９７０）。血清陰性イヌは、組成物を他の抗原的、ワクチンまたは免疫的組成物が投与されるのと同じやり方で投与される。獣医学の当業者は、この開示から、例えば年齢、体重、品種、性別および全体的な健康等の、特定の犬または子犬の要素を考慮しながら、過度の実験によらずに、投与量を決定できる。
さらには、本発明の組換えウイルスおよびそれらからの発現産物は、動物の体内で免疫または抗体反応を刺激する。これらの抗体から、当業者に公知の方法で、モノクローナル抗体が調製可能であり、これらのモノクローナル抗体または本発明のヌクレオチドから発現された抗体は、公知の抗体結合アッセイ、特定のＣＨＶｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤ抗原（群）またはそれらに対する抗体の存在または不在、およびその結果からのウイルスの存在又は不在の決定、あるいはウイルスまたは抗原（群）に対する免疫反応が容易に刺激されるか否かの決定のための診断キットまたは試験に用いることができる。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞によって生産されたイムノグロブリンである。モノクローナル抗体は単一の抗原決定基のみと反応し、従来の血清から派生した抗体よりも高い特異性を提供する。さらに、多数のモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、所望の特異性、結合活性、イソタイプを有する個々の抗体を選択することができる。ハイブリドーマ細胞系列は、恒常的で、低コストである、化学的に同一の抗体の供給源を提供し、そしてそのような抗体の調製は容易に標準化できる。モノクローナル抗体の作成方法は当業者によく知られており、例えばここに参考文献として取り込まれている、１９８９年４月１日に成立したＫｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｈ．ｅｔａｌ．，米国特許第４１９６２６５号等である。
モノクローナル抗体の使用は知られている。このような使用の一つは診断方法であり、例えばここに参考文献として取り込まれている、１９８３年３月８日に成立したＤａｖｉｄ，Ｇ．およびＧｒｅｅｎ，Ｈ．，米国特許第４３７６１１０号等である。
モノクローナル抗体は例えばここに参考文献として取り込まれているＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，１９８０，ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ２４３：６６，７０等のように、免疫吸着クロマトグラフィーによって物質を回収するためにもまた用いられる。
さらには、本発明のヌクレオチドは、試料中のＣＨＶＤＮＡの存在を確認するためのプローブとして、またＣＨＶＤＮＡのクローニングまたは複製のためのＰＣＲプライマーの開発時と同様に用いることができる。ＤＮＡをプローブとして用いる方法またはＰＣＲプライマーを調製する方法は当業者に公知である。
このように、本発明のヌクレオチドおよび本発明のヌクレオチドの発現産物は（故に、ヌクレオチドそれ自体も）、極めて有用である。
以下の非限定的実施例は、説明のためのみに示され、本発明を制限するものとは考えられていない。
実施例
方法と材料
ＣＨＶＤＮＡゲノムの調製ＣＨＶ（Ｌ．Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ、コーネル大学より入手）はＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ３４）において増殖させた。ウイルスＤＮＡを定法により単離した（Ｔａｒｔａｇｌｉａｅｔａｌ．，１９９０）。
ＤＮＡハイブリダイゼーションＣＨＶゲノムＤＮＡを制限酵素で消化し、アガロースゲルで泳動し、ジーン−スクリーン膜（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）へ製造者が推奨する条件で移動した。ハイブリダイゼーションは４４℃、５３℃または５９℃で、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳおよび１０％デキストラン硫酸中で行った。ハイブリダイゼーションプローブは、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）ｇＢ遺伝子内側部分を含む１８００ｂｐＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片、ＦＨＶｇＣ遺伝子の３’末端を含む９５０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片、ＦＨＶｇＤ遺伝子の３’末端を含む９７０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含んでいた（Ａｕｄｏｎｎｅｔ、結果は公にされなかった）。
ＤＮＡのクローニングとシークエンスＣＨＶゲノム断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にサブクローン化した。プラスミドＤＮＡは定法をもちいて調製、操作した。ヌクレオチド配列決定は二本鎖プラスミドテンプレートに対して、改変Ｔ７酵素、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕ．Ｓ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、製造者の推奨する標準的方法に従って行った。Ｍ１３順方向および逆方向プライマーを用いて最初の配列を得、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ８７００またはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ３８０Ｂオリゴヌクレオチド合成装置により調製されたカスタムプライマーが、それに続く反応に用いられた。
ＤＮＡおよびアミノ酸配列分析ＤＮＡおよびアミノ酸配列分析は、ＰＣ／ＧＥＮＥ（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、ＡＬＩＧＮＰｌｕｓ（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃａｎｄＥｄｕｃａｔｉｏｎａｌＳｏｆｔｗａｒｅ）およびＩＢＩ−Ｐｕｓｔｅｌｌ（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）ソフトウェアパックを用いて行った。ホモロジー検索は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（リリース２０または２３）（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）データベースについて、ＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｒａｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，１９８８）を用いて行った。
ＤＮＡクローニングと合成プラスミドを構築し、スクリーニングし、定法に従って増殖させた（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，１９８２；Ｐｅｒｋｕｓｅｔａｌ．，１９８５；Ｐｉｃｃｉｎｉｅｔａｌ．，１９８７）。制限エンドヌクレアーゼは、ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌｂａｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡおよびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮより入手した。Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより入手した。ＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼおよびファージＴ４ＤＮＡリガーゼはＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓより入手した。試薬は供給者によって特定された方法で用いられた。
合成オリゴデオキシリボヌクレオチドはＢｉｏｓｅａｒｃｈ８７５０またはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ３８０ＢＤＮＡ合成装置により前述のように調製された（Ｐｅｒｋｕｓｅｔａｌ．，１９８９）。ＤＮＡシークエンスはジデオキシ法により（Ｓａｎｇｅｒｅｔａｌ．，１９７７）Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｔａｂｏｒｅｔａｌ．，１９８７）を用いて前述のとおり行った（Ｇｕｏｅｔａｌ．，１９８９）。配列確認のためのＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅（Ｅｎｇｅｌｋｅｅｔａｌ．，１９８８）を、カスタム合成オリゴヌクレオチドプライマーとＧｅｎｅＡｍｐＤＮＡ増幅試薬キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を用いて自動化ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓＤＮＡサーマルサイクラー中で行った。過剰のＤＮＡ配列を、制限酵素消化とそれに続くＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼによる限定切断および合成ヌクレオチドを用いた突然変異（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，１９８６）によりプラスミド中から除去した。
細胞、ウイルス、および形質導入ワクシニアウイルスコペンハーゲン株の起源と培養条件は以前に記述されている（Ｇｕｏｅｔａｌ．，１９８９）。組換えによる組換ウィルスの開発、ニトロセルロースフィルターのin situハイブリダイゼーションおよびベータガラクトシダーゼ活性によるスクリーニングは以前に記述された（Ｐｉｃｃｉｎｉｅｔａｌ．，１９８７）。
ワクシニアウイルスコペンハーゲン株およびＮＹＶＡＣの起源と培養条件は以前に記述されている（Ｇｕｏｅｔａｌ．，１９８９；Ｔａｒｔａｇｌｉａｅｔａｌ．，１９９２）。組換えによる組換ウィルスの開発、ニトロセルロースフィルターのin situハイブリダイゼーションおよびベータガラクトシダーゼ活性によるスクリーニングは以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉｅｔａｌ．，１９８２；Ｐｅｒｋｕｓｅｔａｌ．，１９８９）。
親カナリアポックスウイルス（Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ株）はカナリアのためのワクチン株である。このワクチン株は野生株単離体から得られ、ニワトリ胚繊維芽細胞において２００回以上の連続継代を通して弱毒化された。マスターウイルスシードは寒天の下で４回の連続的プラーク精製にかけられ、１つのプラークは５回のさらなる継代により増幅され、そのあとそのストックウイルスが生体外組換えテストにおいて親株として用いられた。プラーク精製されたカナリアポックス単離体はＡＬＶＡＣと命名された。
ＦＰ−１と命名されたニワトリポックスウイルス（ＦＰＶ）株は以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９８８ａ）。それは生後一日のニワトリのワクチン接種に有用な弱毒化されたワクチン株である。親ウイルス株Ｄｕｖｅｔｔｅはフランスでニワトリからのニワトリポックスうろことして得られた。このウイルスはニワトリ受精卵中で約５０回連続継代され続いてニワトリ胚繊維芽細胞において２５回継代された。このウイルスは４回の連続的プラーク精製にかけられた。１つのプラーク単離体がさらに初代ＣＥＦ細胞中で増幅され、ＴＲＯＶＡＣと命名され、ストックウイルスとした。
ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣウイルスベクターおよびその派生体は以前に記述されたように増殖された（Ｐｉｃｃｉｎｉｅｔａｌ．，１９８７；Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９８８ａ，ｂ）。ＶＥＲＯ細胞およびニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）は以前に記述されたように増殖された（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９８８ａ，ｂ）。
実施例１ＣＨＶｇＢ遺伝子の同定と配列決定
ＣＨＶゲノムＤＮＡと、放射性同位体で標識化したネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子とを、比較的低い厳密性条件でハイブリダイゼーションさせることにより（Ａｕｄｏｎｎｅｔ，結果は公にされなかった）、一つの相補的な配列が同定された。この配列を含む６ｋｂｐのＸｂａＩ断片がクローン化されハイブリダイズした領域のヌクレオチド配列が同定された。ＣＨＶｇＢ遺伝子をコードしているヌクレオチドの配列を、それから予測されるアミノ酸配列発現（ｇＢ糖タンパク質）とともに図１に示す。想像上の膜貫通領域および潜在的ＴＡＴＡ、ＣＡＡＴおよびポリアデニル酸シグナル配列には下線を引いた。ヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸残基には配列の右側へ番号を付した。
位置２０１から始まり位置２８４０で終わるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が同定された。このＯＲＦの（予測された）翻訳産物は８７９アミノ酸長である。このアミノ酸配列をＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（リリース２０）データベースと比較することにより、数多くのヘルペスウイルスのｇＢ糖タンパク質の顕著なホモロジーが明らかとなった。付加的な分析により、（予測された）ＣＨＶ遺伝子産物は、例えばヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）またはエプステイン−バーウイルス（ＥＢＶ）等のベータやガンマヘルペスウイルスよりも、１型単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ１）等のアルファヘルペスウイルスのｇＢ糖タンパク質に相同的であることが判明した。これらの分析およびその結果を以下の表１に示す。これらの分析は、ＣＨＶはアルファヘルペスウイルスに分類されるべきであること；生物学的特性に基づく以前のこのウイルスの分類（Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌｅｔａｌ．，１９６５；Ｒｏｉｚｍａｎ，１９８２）と一致する結論を示唆していた。

表１の数値はＡＬＩＧＮＰｌｕｓプログラムを用いて得られたもので、完全ホモロジーとして表示されている。ｇＢアミノ酸配列全体を用いた。配列変数は：ミスマッチペナルティ＝２、オープンギャップペナルティ＝４、拡張ギャップペナルティ＝１である。文献：ＦＭＶ（Ｍａｅｄａｅｔａｌ．，１９９２）、ＥＨＶ１（Ｗｈａｌｌｅｙｅｔａｌ．，１９８９）、ＰＲＶ（Ｒｏｂｂｉｎｓｅｔａｌ．，１９８７）、ＢＨＶ１（Ｗｈｉｔｂｅｃｋｅｔａｌ．，１９８８）、ＶＺＶ（Ｋｅｌｌｅｒｅｔａｌ．，１９８６）、ＭＤＶ（Ｒｏｓｓｅｔａｌ．，１９８９）、ＨＳＶ１（Ｂｚｉｋｅｔａｌ．，１９８４）、ＨＣＭＶ（Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓｅｔａｌ．，１９８７）およびＥＢＶ（Ｐｅｌｌｅｔｔｅｔａｌ．，１９８５）。
実施例２ＣＨＶｇＢヌクレオチド配列の分析
ＣＨＶｇＢ遺伝子の５’および３’非コード領域は、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックスおよびポリアデニル酸シグナル配列等の、多くのＲＮＡポリメラーゼＩＩ制御配列モチーフを含んでいる（Ｃｏｒｄｅｎｅｔａｌ．，１９８０；Ｐｒｏｄｆｏｏｔ＆Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，１９７６）（図１）。潜在的ＴＡＴＡボックスは位置３４、３６、１１９および１４８、およそ１６５ｂｐ、１６０ｂｐ、８０ｂｐおよび５０ｂｐぶんＣＨＶｇＢ開始コドンの上流に見られる。潜在的ＣＡＡＴボックス配列（ＡＴＴＧ）は位置８９、９７および１６５、および１１０ｂｐ、１００ｂｐおよび３５ｂｐぶんＣＨＶｇＢ開始コドンの上流に見られる。潜在的ポリアデニル酸シグナル配列（ＡＡＴＡＡＡ）は位置２８３９および２９６１、およそ０ｂｐおよび１２０ｂｐぶんＣＨＶｇＢ終止コドンの下流に見られる。
開始コドンの周りのヌクレオチド配列は翻訳開始の効率に影響を与える（Ｋｏｚａｋ，１９８６）。特に、配列［Ａ／Ｇ］ＮＮＡＴＧＧは、最も効率が良いことが判明している。故に、Ｋｏｚａｋの法則と比べて、ＣＨＶｇＢ開始コドンの周辺のヌクレオチド配列（ＡＧＴＡＴＧＴ）は位置−３において好ましいが、位置＋４においては好ましくない（図１）。ＣＨＶｇＢ遺伝子はＫｏｚａｋの法則に従わないという事実は普通でなくはない。ＦＨＶ（Ｍａｅｄａｅｔａｌ．，１９９２）、ＰＲＶ（Ｒｏｂｂｉｎｓｅｔａｌ．，１９８７）、ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒｖｉｒｕｓ（ＶＺＶ）（Ｋｅｌｌｅｒｅｔａｌ．，１９８６）、ＭＤＶ（Ｒｏｓｓｅｔａｌ．，１９８９）およびＨＳＶ１（Ｂｚｉｋｅｔａｌ．，１９８４）ｇＢ遺伝子もまた位置＋４にピリミジンを有している。
実施例３予測されるＣＨＶｇＢアミノ酸配列の分析
ＣＨＶｇＢ相同体の推定されたアミノ酸配列を図１に示す。このアミノ酸配列のハイドロパシー性分析は図２に示されている。このプロフィールは、Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）の方法および１３アミノ酸のインターバルを用いたＰＣ／ＧＥＮＥＳＯＡＰプログラムにより得られた。縦軸は、正の値は疎水性であり負の値は親水性である、相対的なハイドロパシー性を示している。横軸はＣＨＶｇＢ相同体のアミノ酸番号を付している。
このアミノ酸配列のハイドロパシー性の分析により、２つの顕著な疎水性のピークの存在が明らかとなった。第１のピークは、Ｎ末端に位置しており、いかなる一の理論に拘束されることを意図するわけではないが、潜在的なシグナル配列を示している。Ｎ末端シグナル配列は小胞体膜を通過する輸送を開始し、適切な転写後の修飾と糖タンパク質のターゲッティングに重要であり得る（Ｂｌｏｂｅｌｅｔａｌ．，１９８０）。シグナル配列は約１５から３０残基の間で変わり得、通常は塩基性Ｎ末端領域、中央疎水性領域、および短い、比較的極性のＣ末端領域から成る。それに加えて、切断部位は通常−３、−１ルールに従い、位置−１の残基は小さく（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、ＴｈｒまたはＧ１ｎ）、位置−３の残基は芳香性（Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、ＴｙｒまたはＴｒｐ）、荷電（Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＡｒｇ）または大きくて極性（ＡｓｎまたはＧｌｎ）ではなく、そして−３から＋３まではプロリンではない（ｖｏｎＨｅｊｉｎｅ，１９９６）。ＰＳＩＧＮＡＬ、真核シグナル配列を検出するために設計されたＰＣ／ＧＥＮＥプログラム、での分析は、ＣＨＶｇＢのＮ末端は潜在的シグナル配列としては同定されなかったが、この領域は典型的なシグナル配列に相当する要素；すなわち疎水性コア（２−１７残基）および比較的極性のＣ末端領域（図１）、を有している。ＰＳＩＧＮＡＬがＣＨＶｇＢのＮ末端領域にシグナル配列を検出しなかった事実は特有ではない。このアルゴリズムはＶＺＶｇＢ相同体のＮ末端領域においてもまた、シグナル配列を検出しなかった。
第２の、非常に幅広い、疎水性ピーク（群）（図２）は、アミノ酸残基７２５と７４１との間、７４６−７５０および７６６−７７２の予想される膜通過部分（Ｋｌｅｉｎｅｔａｌ．，（１９８５）の方法を用いた）とともにあり、いかなる理論に拘束されることを意図するものではないが、膜固定領域として機能している。ＨＳＶ１ｇＢの膜内外ドメインは、他のｇＢ相同体と同様に、膜を３回横切っているという仮説が出されている（Ｐｅｌｌｅｔｔｅｔａｌ．，１９８５）。ＣＨＶｇＢのハイドロパシー性分析により、少なくとも２つの別個の疎水性ピークの存在が明らかとなった。故に、ＣＨＶｇＢおよびＨＳＶ１ｇＢは類似の膜内外構造を有している。
ＣＨＶｇＢのアミノ酸配列を他のヘルペスウイルス由来の類似の配列と並べることにより、Ｎ末端、推定切断部位（下記参照）をとりまく領域およびＣ末端近傍の領域を除いた配列全体を通しての広い相同性が判明した。図３Ａおよび３Ｂは８つのｇＢ相同体のアミノ酸配列を示している。ＣＨＶ、ＦＨＶ、ＥＨＶ１、ＰＲＶ、ＨＳＶ１、ＶＳＶ、ＨＣＭＶおよびＥＢＶｇＢ相同体のアミノ酸配列（配列が得られた文献については、表１の下のテキストを参照）がＰＣ／ＧＥＮＥＣＬＵＳＴＡＬプログラムを用いて配列された。ダッシュで示されたギャップは相同性を最大にするために導入された。並べられた８つの全ての配列において同一の残基は、アスターリスク（＊）によって示されている。並べられた配列の多数において同一の残基は、ピリオド（．）によって示されている。保存されたシステイン残基は四角で囲った。潜在的なＮ−結合型グリコシル化部位は陰を付されている。推定プロテアーゼ切断部位は下線が引かれている。
この並列により、数多くのシステイン残基の多数が完璧に保存されていることが明らかとなった。例えば、ＣＨＶｇＢは１１のシステイン残基を含有しているが、それらのうちの１０はアルファ、ベータ、ガンマヘルペスウイルスの全てにおいて完全に保存されていた。事実、ＣＨＶｇＢにおいて唯一保存されていないシステイン残基はＮ末端付近で発見され推定シグナル配列中に位置している。これらの結果はｇＢ糖タンパク質は比較的類似の三次構造を有することを示している。
ｇＢアミノ酸配列を並べることにより、潜在的なＮ−結合型グリコシル化部位が比較的よく保存されていることが明らかとなった（図３Ａおよび３Ｂ）。Ｎ−結合型オリゴサッカライドは、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒもしくはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ここにおいて、Ｘはプロリンではない）（Ｂａｕｓｅ，１９８３）という配列を有するＡｓｎ残基に付加されうる。ＣＨＶｇＢは１３の潜在的Ｎ−結合型グリコシル化部位を有している。しかしながら、これらのうち３つは、推定細胞質ドメインに位置しており、そのため、グリコシル化されていないであろう。潜在的Ｎ−結合型グリコシル化部位の配置は、多数のｇＢ糖タンパク質において比較的よく保存されていた（図３Ａおよび３Ｂ）。
殆どのヘルペスウイルスのｇＢ糖タンパク質は成熟化の間に内部で切断され、その後のペプチドはジスルフィド結合により一緒に保持されている。ＶＺＶｇＢ相同体（ｇｐＩＩ）は、例えば、ＡｒｇとＳｅｒ残基の間で切断され、その結果、分子量約６０ｋｄの２つの糖タンパク質となる（Ｋｅｌｌｅｒｅｔａｌ．，１９８６）。ＦＨＶｇＢ糖タンパク質（Ｍａｅｄａｅｔａｌ．，１９９２）、ウマヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ１）（Ｗｈａｌｌｅｙｅｔａｌ．，１９８９）、ＰＲＶ（Ｒｏｂｂｉｎｓｅｔａｌ．，１９８７）、ＢＨＶ１（Ｗｈｉｔｂｅｃｋｅｔａｌ．，１９８８）、ＭＤＶ（Ｒｏｓｓｅｔａｌ．，１９８９）およびＨＣＭＶ（Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓｅｔａｌ．，１９８７）等もまた切断される。さらに、配列Ａｒｇ−Ｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ−−Ｓｅｒ／Ａｌａは、ＶＺＶ切断部位の配列Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−−Ｓｅｒと類似で、これらのｇＢ糖タンパク質それぞれと事実上同一の位置において存在している。これとは逆に、この配列は、切断されないＨＳＶ１（Ｂｚｉｋｅｔａｌ．，１９８４）およびＥＢＶ（Ｐｅｌｌｅｔｔｅｔａｌ．，１９８５）ｇＢ糖タンパク質においては発見されていない。この切断を行うことの重要性は不明である。しかしながら、ＢＨＶ１（Ｂｌｅｗｅｔｔ＆Ｍｉｓｒａ、１９９１）およびＨＣＭＶ（Ｓｐａｅｔｅｅｔａｌ．，１９９０）の株であって、この切断部位を変異させ、そのため切断されないｇＢ糖タンパク質をコードしているものは感染性であるので、それは生体外の複製には必須ではないように見える。ＣＨＶｇＢは内部でプロテアーゼにより切断されるという理論に拘束されることを意図してはいないが、配列Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−−ＳｅｒはＣＨＶにおいてＶＺＶ、ＦＨＶ、ＥＨＶ１、ＰＲＶ、ＢＨＶ１、ＭＤＶおよびＨＣＭＶと同様の位置に存在している。
実施例４ＣＨＶｇＣ遺伝子の同定とシークエンス
ＣＨＶゲノム断片をランダムにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ中にクローン化した。これらの断片の末端のヌクレオチド配列を決定し、潜在的ＯＲＦの予測されるアミノ酸配列を、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（リリース２０）アミノ酸データベースに対してホモロジー分析を行った。この方法を用いることにより、ヘルペスウイルスｇＣ糖タンパク質とホモロジーを有するＯＲＦをコードしている１２ｋｂのＸｂａＩが同定された。このＯＲＦのヌクレオチド配列は図４中に示されている。図４は、ＣＨＶｇＣ相同体およびＯＲＦ２のヌクレオチド配列と予測されるアミノ酸配列を示している。推定膜貫通領域および潜在性ＴＡＴＡ、ＣＡＡＴおよびポリアデニル酸シグナル配列に下線を引いた。ヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸残基には、配列の右に向かって番号を付した。推定ＣＨＶｇＣ遺伝子は位置２０１からはじまり、位置１５８０で終わる。予測された翻訳産物は、４５９アミノ酸長である。このアミノ酸配列と他のヘルペスウイルス由来のｇＣ糖タンパク質の配列との比較を以下の表２に示すが、広いホモロジーが明らかとなり、このＯＲＦはＣＨＶｇＣ相同体をコードしていることが示唆された（表２）。

表２の値はＡＬＩＧＮＰｌｕｓプログラムを用いて得、ホモロジーパーセントで示した。ｇＣアミノ酸配列全体を用いた。配列変数は表１を参照されたい。文献：ＦＨＶ（Ａｕｄｏｎｎｅｔ，結果は公にされなかった）、ＥＨＶ１（Ａｌｌｅｎ＆Ｃｏｏｇｌｅ，１９８８）、ＥＨＶ４（Ｎｉｃｏｌｓｏｎ＆Ｏｎｉｏｎｓ，１９９０）、ＰＲＶ（Ｒｏｂｂｉｎｓｅｔａｌ．，１９８６）、ＢＨＶ１（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋｅｔａｌ．，１９８９）、ＶＺＶ（Ｄａｖｉｓｉｏｎ＆Ｓｃｏｔｔ，１９８６）、ＭＤＶ（Ｉｈａｒａｅｔａｌ．，１９８９）およびＨＳＶ１（ＭｃＧｅｏｃｈｅｔａｌ．，１９８８）。
実施例５ＣＨＶｇＣヌクレオチド配列の分析
潜在的ＴＡＴＡボックス配列（ＴＡＴＡ）が位置２２および８１、ＣＨＶｇＣ開始コドンのおよそ１８０ｂｐおよび１２０ｂｐ上流域に見られる（図４）。付加的なＴＡＴＡ配列が位置１７５にも見られる。それはｇＣ開始コドンに近接しているが、しかしながら、潜在的なＴＡＴＡボックス配列ではないかもしれない。潜在的ＣＡＡＴボックス配列（ＣＡＡＴおよびＡＴＴＧ）は、位置１３、５９および１１９、ｇＣ開始コドンの約１９０ｂｐ、１４０ｂｐおよび８０ｂｐ上流域においてみられる。潜在的ポリアデニル酸シグナル配列（ＡＡＴＡＡＡ）は位置１７４４、ＣＨＶｇＣ終止コドンの約１６５ｂｐ下流域でありＯＲＦ２内部の４５ｂｐにおいて見られる（下記参照）。他の潜在的ポリアデニル酸シグナル類似配列はｇＣ−３′非コード領域に見られる。
ＣＨＶｇＢ遺伝子のように、ＣＨＶｇＣ開始コドン（ＡＡＡＡＴＧＡ）の周辺のヌクレオチド配列はＫｏｚａｋの法則に関して位置−３では好ましいが位置＋４では好ましくない（図４）。ＦＨＶ（Ａｕｄｏｎｎｅｔ．結果には公にされなかった）、ＥＨＶ１（Ａｌｌｅｎ＆Ｃｏｏｇｌｅ、１９８８）およびＶＺＶ（Ｄａｖｉｓｏｎ＆Ｓｃｏｔｔ，１９８６）ｇＣ遺伝子もまた位置＋４において好ましくないヌクレオチドを有している。
実施例６予測されるＣＨＶｇＣアミノ酸配列の分析
ＣＨＶｇＣ相同体の推定アミノ酸配列を図４に示す。図５はＣＨＶｇＣ相同体のハイドロパシー性分析を示している。Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）および１３アミノ酸の間隔を用いたＰＣ／ＧＥＮＥＳＯＡＰプログラムによって、プロフィールを得た。垂直軸は、正の値は疎水性、負の値は親水性である相対的ハイドロパシー性を示す。水平軸はＣＨＶｇＣ相同体のアミノ酸番号を示す。
予測されたＣＨＶｇＣアミノ酸配列のハイドロパシー性分析により、２つの顕著な疎水性のピークの存在が明らかとなった（図５）。第１のピークは、Ｎ−末端に位置しており、いかなる一の理論にも拘束されることを望んではいないが、潜在的シグナル配列を表している。ＰＳＩＧＮＡＬでの分析ではこのポリペプチドのＮ−末端を潜在的シグナル配列として同定はできなかったが、この領域は塩基性Ｎ−末端領域、疎水性核（残基６−２０）および相対的極性Ｃ−末端領域を有している（図４）。第２の疎水性ピーク、残基４２４−４３３および４４９−４５６の間の予測された膜貫通部分（Ｋｌｅｉｎｅｔａｌ．，（１９８５）の方法を用いた）は、いかなる一の理論に拘束されることを意図するわけではないが、膜固定領域として機能している。図６は４つのｇＣ相同体のアミノ酸ホモロジーを示している。ＣＨＶ、ＦＨＶ、ＥＨＶ１およびＨＳＶ１ｇＣ相同体のアミノ酸配列（文献については図２を参照）は、ＰＣ／ＧＥＮＥＣＬＵＳＴＡＬプログラムを用いて並べられた。ダッシュで示されるギャップは、ホモロジーを最大化するために導入された。配列された残基で４つの配列全てにおいて同一のものはアスターリスクにより示した。並列された配列の多数において同一であった残基はピリオド（．）で示した。保存されているシステイン残基は四角で囲った。潜在的Ｎ−結合型グリコシル化部位は陰を付した。
ＣＨＶｇＣアミノ酸配列と他のヘルペスウイルス由来の相同体の配列とを並列させることにより、Ｎ−末端の例外を除いた、全体の配列を通しての適度なレベルでのホモロジーが明らかとなった（図６）。この並列により多数のシステイン残基が完璧に保存されていることが明らかとなった。例えば、ＣＨＶｇＣは１０のシステイン残基を含んでいるが、そのうちの８つは全てのアルファヘルペスウイルスにおいて完璧に保存されていた。事実、ＣＨＶｇＣにおいて保存されていないシステイン残基だけが推定膜貫通または細胞内ドメインに位置している。これらの結果はｇＣ糖タンパク質が比較的類似した三次構造を有することを示している。他のｇＣ配列との並列により、潜在的Ｎ−結合型グリコシル化部位が比較的保存されていることが明らかとなった。
実施例７ＯＲＦ２の同定とシークエンス
ＣＨＶｇＣ遺伝子の下流領域のヌクレオチド配列の分析により、第２のＯＲＦの存在が明らかとなった（図４）。このＯＲＦ（ＯＲＦ２）は、位置１６９９からはじまり位置２２２６で終わる。予測される転写産物は１７５アミノ酸長である。以下の図３は、この配列と、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（リリース２３）データベースとの比較を示しているが、他のアルファヘルペスウイルスｇＣ遺伝子の下流域に位置しているＯＲＦとの顕著なホモロジーが判明した。ＯＲＦ２相同体に対するホモロジーのスコアは、ＣＨＶ、ＦＨＶ、ＥＨＶ、ウマヘルペスウイルス４型（ＥＨＶ４）、ＭＤＶ、シチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）および恐らくＨＳＶ１において、ｇＣ遺伝子の下流域に位置しているＯＲＦが、高度に多様であるが進化上で関連している遺伝子ファミリーを表していることを示している。これとは逆に、ＶＺＶｇＣ遺伝子の隣に位置しているＯＲＦ（遺伝子１３）は、対応する位置にある他のいずれのＯＲＦとも、顕著な相同性を示していない。さらに、遺伝子１３はゲノム上で、他の全てのＯＲＦ２類似遺伝子に関連した方向とは逆の方向で配置されている（Ｄａｖｉｓｏｎ＆Ｓｃｏｔｔ，１９８６）。これらの結果はこれらの２群の遺伝子にコードされているタンパク質の、提案されている機能と一致している；ＶＺＶ遺伝子１３は、チミジル酸シンセターゼ（Ｄａｖｉｓｏｎ＆Ｓｃｏｔｔ，１９８６）をコードし、他方、ＨＳＶ１ＯＲＦ２類似遺伝子（ＵＬ４５）は、推定ウイルス粒子タンパク質をコードしている（Ｔｅｌｆｏｒｄｅｔａｌ．，１９９２）。故に、ＣＨＶ、ＦＨＶ、ＥＨＶ１、ＥＨＶ４、ＭＤＶ、ＨＶＴおよび恐らくはＨＳＶ１において、ｇＣ遺伝子の隣に位置しているＯＲＦは、ＶＺＶｇＣ相同体の下流域にコードされているタンパク質とは構造上も機能上も関係のないタンパク質をコードしている。

表３の数値はＦＡＳＴＡおよびＲＤＦ２プログラムを用いて得られた（Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，１９８８）。１のｋｔｕｐ（ａｋｔｕｐｏｆ１）が用いられた。括弧内の数値は、ＦＡＳＴＡスコアと、１００個の無作為に置換された型の潜在的に関連している配列から得られたスコアの平均との間の標準偏差の数字を示している。文献：ＦＨＶ（Ａｕｄｏｎｎｅｔ，結果は公にされなかった）、ＥＨＶ１（Ｔｅｌｆｏｒｄｅｔａｌ．，１９９２）、ＥＨＶ４（Ｎｉｃｏｌｓｏｎ＆Ｏｎｉｏｎｓ，１９９０）、ＭＤＶ（Ｉｈａｒａｅｔａｌ．，１９８９）、ＨＶＴ（Ｋａｔｏｅｔａｌ．，１９８９）、ＨＳＶ１（ＭｃＧｅｏｃｈｅｔａｌ．，１９８８）およびＶＺＶ（Ｄａｖｉｓｏｎ＆Ｓｃｏｔｔ，１９８６）。
実施例８ＣＨＶＯＲＦ２ヌクレオチド配列の分析
潜在的ＴＡＴＡボックス配列（ＴＡＴＡ）は、位置１６０４、１６０６、１６３５および１６６２、ＯＲＦ２の開始コドンのおよそ９５、９３、６５および３５ｂｐ上流であって、ｇＣ遺伝子の終止コドンのおよそ２４、２６、５５および８０ｂｐ下流にみられる（図４）。潜在的ＣＡＡＴボックス配列（ＣＡＡＴ）は、位置１５８４、開始コドンのおよそ１１５ｂｐ上流でみられる。潜在的ポリアデニル酸シグナル配列（ＡＡＴＡＡＡ）は、ＯＲＦ２の終止コドンから０−１５ｂｐ下流域であるオーバーラップしている位置２２２５、２２２９、２２３４および２２３８でみられる。ＯＲＦ２開始コドン（ＡＡＴＡＴＧＧ）を取り巻いているヌクレオチド配列は、Ｋｏｚａｋの法則に関しては位置−３と＋４において好ましい。
実施例９ＣＨＶｇＤ遺伝子の同定とシークエンス
ＣＨＶｇＣ相同体をマッピングした時に用いた方法と同様の方法を用いて、ヘルペスウイルスｇＤ糖タンパク質とホモロジーを有する７ｋｂのＰｓｔＩ断片を同定した。図７はＣＨＶｇＤ相同体のヌクレオチド配列と予測されたアミノ酸配列を示している。推定シグナル配列、膜貫通領域および潜在的ポリアデニル酸シグナル配列に下線を引いた。ヌクレオチド配列および予測されたアミノ酸残基には配列の右から番号を付した。ＣＨＶｇＤ遺伝子は位置２０１からはじまり位置１２３８で終わる。（予測される）翻訳産物は３４５アミノ酸長である。以下の表４は、このアミノ酸配列と他のｇＤ糖タンパク質の配列との比較、および明らかとなった広いホモロジーを示しており、このＯＲＦがＣＨＶｇＤ相同体をコードしていることを示唆している。

表４の数値はＡＬＩＧＮＰｌｕｓプログラムを用いて得られ、ホモロジー％で示されている。ｇＤアミノ酸配列全体を用いた。配列変数については図１を参照されたい。文献：ＦＨＶ（Ａｕｄｏｎｎｅｔ，結果は公にされなかった）、ＥＨＶ１（Ｆｌｏｗｅｒｓｅｔａｌ．，１９９１）、ＰＲＶ（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓｅｔａｌ．，１９８６）、ＢＨＶ１（Ｔｉｋｏｏｅｔａｌ．，１９９０）およびＨＳＶ１（Ｌａｓｋｙ＆Ｄｏｗｂｅｎｋｏ，１９８４）。
実施例１０ＣＨＶｇＤヌクレオチド配列の分析
ＣＨＶｇＤ遺伝子のすぐ近くの上流域にはＴＡＴＡあるいはＣＡＡＴ／ＡＴＴＧ配列は同定されなかった（図７）。しかしながら、多数のＴＡＴＡボックス類似配列は見つかった。潜在的ポリアデニル酸シグナル配列（ＡＡＴＡＡＡ）は、位置１２６０および１２８７、ＣＨＶｇＤ終止コドンのおよそ２５および５０ｂｐ上流に見られた。ＣＨＶｇＢおよびｇＣ遺伝子のように、ＣＨＶｇＤ遺伝子（ＡＡＡＡＴＧＡ）を取り巻くヌクレオチド配列は、Ｋｏｚａｋの法則に関して、位置−３では好ましく、位置＋４ではそうではなかった（図７）。ＨＦＶ（Ａｕｄｏｎｎｅｔ，結果は公にはされなかった）、ＥＨＶ１（Ａｕｄｏｎｎｅｔｅｔａｌ．，１９９０；Ｆｌｏｗｅｒｓｅｔａｌ．，１９９１）、ＰＲＶ（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓｅｔａｌ．，１９８６）およびＢＨＶ１（Ｔｉｋｏｏｅｔａｌ．，１９９０）ｇＤ遺伝子もまた、位置＋４において好ましくないヌクレオチドを有している。
実施例１１予測されるＣＨＶｇＤアミノ酸配列の分析
ＣＨＶｇＤ相同体の推定アミノ酸配列を図７に示す。図８はＣＨＶｇＤ相同体のハイドロパシー性分析を示している。プロフィールは、Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（１９８２）および１１のアミノ酸のインターバルを用いた、ＰＣ／ＧＥＮＥＳＯＡＰプログラムにより得られた。垂直軸は、正の値が疎水性で負の値が親水性である相対ハイドロパシー性を示している。水平軸は、ＣＨＶｇＤ相同体のアミノ酸の番号を付している。
予測されたＣＨＶｇＤアミノ酸配列のハイドロパシー性の分析により、二つの顕著な疎水性ピークの存在が判明した（図８）。第１のピークはＮ−末端に位置し、いかなる一の理論に拘束されることを意図するものではないが、潜在的シグナル配列を示している。事実、ＰＳＩＧＮＡＬは位置１６および１７の間に潜在的切断部位を同定した。第２の疎水性ピークは、残基３０４−３１１および３２７−３３２の間の予測された膜貫通部分（Ｋｌｅｉｎｅｔａｌ．，（１９８５）の方法を用いた）とともに、いかなる一の理論に拘束されることを望んではいないが、膜固定領域として機能している。
図９は４種のｇＤ相同体のアミノ酸ホモロジーを示している。ＣＨＶ、ＦＨＶ、ＥＨＶ１およびＨＳＶ１ｇＤ相同体のアミノ酸配列（文献については表４を参照）ＰＣ／ＧＥＮＥＣＬＵＳＴＡＬプログラムを用いて並列された。ダッシュで示されるギャップはホモロジーを最大化するために導入された。４配列全てにおいて同一である並列された残基はアスターリスク（＊）で示されている。多数の配列において同一である並列された残基はピリオド（．）で示されている。保存されているシステイン残基は四角で囲った。潜在的Ｎ−結合型グリコシル化部位は陰を付した。他のヘルペスウイルス由来の相同配列とＣＨＶｇＤアミノ酸配列との並列により、Ｎ−末端を除いた配列全体に亘る適度な度合いのホモロジーが明らかとなった（図９）。この並列から、大多数のシステイン残基が完全に保存されていることが判明した。例えば、ＣＨＶｇＤは６個のシステイン残基を有しているが、それら全てが、全てのヘルペスウイルス中で完全に保存されていた。これらの結果は、ｇＤ糖タンパク質は比較的類似の三次構造を有していることを示している。この並列から、潜在的Ｎ−結合型グリコシル化部位がよく保存されていることもまた判明した。ＣＨＶｇＤグリコシル化部位が利用されているという、いかなる一の理論に拘束されることを望んではいないが、潜在的ＨＳＶ１ｇＤ糖タンパク質部位は全て利用されていることが知られている（Ｓｏｄｏｒａｅｔａｌ．，１９９１）。
実施例１２ゲノム構造
ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ遺伝子はＣＨＶゲノム上での特定の位置にマッピングされていない。しかしながら、これらの遺伝子に隣接する領域のヌクレオチド分析により、ＣＨＶのゲノム構造は他のアルファヘルペスウイルスに類似していることが示唆された。例えば、ＣＨＶｇＢ遺伝子のすぐ上流に位置しているＯＲＦは、ＶＺＶの遺伝子３０（Ｄａｖｉｓｏｎ＆Ｓｃｏｔｔ，１９８６）およびＨＳＶ１のＵＬ２８（ＭｃＧｅｏｃｈｅｔａｌ．，１９８８）とホモロジーを有しているが、両方ともそれらのウイルスのｇＢ相同体のすぐ上流に位置している。ＯＲＦ２は、ＣＨＶｇＣ遺伝子のすぐ下流に位置しているが、ＦＨＶ（Ａｕｄｏｎｎｅｔ，結果は公にされなかった）、ＥＨＶ１（Ｔｅｌｆｏｒｄｅｔａｌ．，１９９２）、ＥＨＶ４（Ｎｉｃｏｌｓｏｎ＆Ｏｎｉｏｎｓ，１９９０）、ＨＶＴ（Ｋａｔｏｅｔａｌ．，１９８８）および恐らくＨＳＶ１（ＭｃＧｅｏｃｈｅｔａｌ．，１９８８）において、ｇＣ相同体のすぐ下流に位置しているＯＲＦ群とホモロジーを有している。さらには、ＣＨＶｇＤ遺伝子のすぐ下流に位置しているＯＲＦは、ＥＨＶ１のｇＩ遺伝子（Ａｕｄｏｎｎｅｔｅｔａｌ．，１９９０）およびＰＲＶのｇｐ６３遺伝子（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓｅｔａｌ．，１９８６）と相同性を有しているが、それらは両方とも、それらのウイルス中でｇＤ相同体のすぐ下流に位置している（データは示していない）
実施例１３チミジンキナーゼ遺伝子（Ｊ２Ｒ）の欠失のためのプラスミドｐＳＤ４６０の構築
今、図１０を参照しているが、プラスミドｐＳＤ４０６は、ｐＵＣ８中にクローン化されたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩＪ（位置８３３５９−８８３７７）を含んでいる。ｐＳＤ４０６はＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｖｕＩＩで切断され、ＨｉｎｄＩＩＩＪの左側からの１．７ｋｂ断片が、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで消化されたｐＵＣ８中にクローン化され、ｐＳＤ４４７となった。ｐＳＤ４４７はＪ２Ｒ（位置８３８５５−８４３８５）全体の遺伝子を有している。開始コドンはＮｌａＩＩＩ部位内部に含まれ、終止コドンはＳｓｐＩ部位内部に含まれている。転写方向は図１０中に矢印で示されている。
左側の隣接アーム（ｆｌａｎｋｉｎｇａｒｍ）を得るため、０．８ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＳＤ４４７から単離し、続いてＮｌａＩＩＩで消化し、０．５ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｌａＩＩＩ断片を単離した。アニーリングさせた合成ヌクレオチドＭＰＳＹＮ４３／ＭＰＳＹＮ４４（配列番号２４／配列番号２５）

を０．５ｋｐＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｌａＩＩＩ断片とともにＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ１８中へ連結し、プラスミドｐＳＤ４４９を生成した。
ワクシニア右隣接アームおよびｐＵＣベクター配列を含む制限酵素断片を得るために、ｐＳＤ４４７をワクシニア配列内部においてＳｓｐＩで（部分的に）、そしてＨｉｎｄＩＩＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部分において消化し、２．９ｋｂｐのベクター断片を単離した。このベクター断片を、アニーリングさせた合成ヌクレオチドＭＰＳＹＮ４５／ＭＰＳＹＮ４６（配列番号２６／配列番号２７）

と連結し、ｐＳＤ４５９を創出した。
隣接アームの左側と右側とをひとつのプラスミド中で結合するために、０．５ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ断片をｐＳＤ４４９から単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで消化したｐＳＤ４５９と連結し、プラスミドｐＳＤ４６０を創出した。ｐＳＤ４６０を、野生型親ワクシニアウイルスコペンハーゲン株ＶＣ−２との組換えのドナープラスミドとして用いた。ＭＰＳＹＮ４５（配列番号２６）をテンプレートとして、および相補的な２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４７（配列番号２８）（５’ ＴＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣ３’）をプライマーとして用いたプライマーエクステンション法により、³²Ｐ標識されたプローブを合成した。組換えウイルスｖＰ４１０がプラークハイブリダイゼーションにより同定された。
実施例１４出血性領域（Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）の欠失のためのプラスミドｐＳＤ４８６の構築
今、図１１を参照しているが、プラスミドｐＳＤ４１９は、ｐＵＣ８中にクローン化されたワクシニアＳａｌＩＧ（位置１６０７４４−１７３３５１）を有している。ｐＳＤ４２２は、右側に近接したワクシニアＳａｌＩ断片、ｐＵＣ８中にクローン化されたＳａｌＩＪ（位置１７３３５１−１８２７４６）を有している。出血性領域、ｕ、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ（位置１７２５４９−１７３５５２）を欠失させたプラスミドを構築するために、ｐＳＤ４１９を左側隣接アームの源として、そしてｐＳＤ４２２を右側の隣接アームの源として用いた。領域ｕの転写方向は図１１において矢印で示されている。
所望でない配列をｐＳＤ４１９から取り除くため、ＮｃｏＩ部位（位置１７２２５３）の左側の配列は、ｐＳＤ４１９をＮｃｏＩ／ＳｍａＩで消化し続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片により平滑末端化したのちライゲーションし、プラスミドｐＳＤ４７６を生成した。ワクシニア右隣接アームは、ｐＳＤ４２２を、Ｂ１４Ｒの終止コドンにおいてＨｐａＩで消化し、そして０．３ｋｂｐ右側をＮｒｕＩで消化して得た。この０．３ｋｂｐ断片を単離し、ｐＳＤ４７６から単離した３．４ｋｂｐのＨｉｎｃＩＩベクター断片と連結し、プラスミドｐＳＤ４７７とした。ワクシニアｕ領域のｐＳＤ４７７の部分的欠失の位置は三角形で示した。残りのプラスミドｐＳＤ４７７中のＢ１３Ｒをコードしている領域配列を、ＣｌａＩ／ＨｐａＩでの消化により取り除き、その結果生じた断片を、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオチドＳＤ２２ｍｅｒ／ＳＤ２０ｍｅｒ（配列番号２９／配列番号３０）

と連結させ、ｐＳＤ４７９とした。ｐＳＤ４７９は、ＢａｍＨＩ部位が続いている開始コドン（下線）を有している。Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼをＢ１３−Ｂ１４ｕ欠失座中に、ｕプロモーターのコントロール下で配置するため、３．２ｋｂｐのベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａｅｔａｌ．，１９８３）を含むＢａｍＨＩ断片を、ｐＳＤ４７９のＢａｍＨＩに挿入し、ｐＳＤ４７９ＢＧとした。ｐＳＤ４７９ＢＧは、ワクシニアウイルスｖＰ４１０との組換えのドナープラスミドとして用いた。組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３は、色素基質Ｘ−ｇａｌ存在下でプループラークとして単離された。ｖＰ５３３において、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ領域は欠失されベータガラクトシダーゼで置換されていた。
ベータガラクトシダーゼ配列をｖＰ５３３から取り除くため、ｐＳＤ４７７からの派生体でポリリンカー領域は含むが、ｕ欠失結合部分の開始コドンは有さないｐＳＤ４６８を用いた。第１に、前述のｐＳＤ４７７由来のＣｌａＩ／ＨｐａＩベクター断片を、アニーリングさせた合成ヌクレオチドＳＤ４２ｍｅｒ／ＳＤ４０ｍｅｒ（配列番号３１／配列番号３２）

と連結させ、プラスミドｐＳＤ４７８とした。次にｐＵＣ／ワクシニア結合部分のＥｃｏＲＩ部位を、ｐＳＤ４７８をＥｃｏＲＩで消化し続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片により平滑化し、ライゲーションすることにより破壊して、プラスミドｐＳＤ４７８Ｅ^-とした。ｐＳＤ４７８Ｅ^-をＢａｍＨＩおよびＨｐａＩで消化したのち、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオチドＨＥＭ５／ＨＥＭ６（配列番号３３／配列番号３４）

と連結し、プラスミドｐＳＤ４８６とした。ｐＳＤ４８６は、組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３との組換えにドナープラスミドとして用いて、Ｘ−ｇａｌ存在下で透明プラークとして単離されたｖＰ５３３を創出した。
実施例１５ＡＴＩ領域（Ａ２６Ｌ）欠失のためのプラスミドｐＭＰ４９４Δの構築
今、図１２を参照しているが、ｐＳＤ４１４はｐＵＣ８中にクローン化されたＳａｌＩＢを含んでいる。Ａ２６Ｌ領域の左側の所望でないＤＮＡ配列を取り除くため、ｐＳＤ４１４を、ＸｂａＩでワクシニア配列の内部（位置１３７０７９）で、ＨｉｎｄＩＩＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部分で切断し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化しライゲーションし、プラスミドｐＳＤ４８３とした。Ａ２６Ｌ領域の右側の所望でないワクシニア配列を取り除くため、ｐＳＤ４８３をＥｃｏＲＩで切断し（位置１４０６６５およびｐＵＣ／ワクシニア結合部分）、ライゲーションし、プラスミドｐＳＤ４８４とした。Ａ２６Ｌレコード領域を除去するため、ｐＳＤ４８４はＮｄｅＩで（部分的に）Ａ２６ＬＯＲＦの僅かに上流を（位置１３９００４）、ＨｐａＩでＡ２６ＬＯＲＦの僅かに下流を（位置１３７８８９）切断した。５．２ｋｂｐのベクター断片を単離し、アニーリングさせた人工合成オリゴヌクレオチドＡＴＩ３／ＡＴＩ４（配列番号３５／配列番号３６）

と連結し、Ａ２６Ｌ上流領域を再構築し、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩ制限酵素部位を有する短いポリリンカー領域で、Ａ２６ＬＯＲＦを上記のように置換した。構築されたプラスミドをｐＳＤ４８５と命名した。ｐＳＤ４８５のポリリンカー領域のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位は固有ではないので、所望でないＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位をｐＳＤ４８３（前述）から、ＢｇｌＩＩ（位置１４０１３６）、およびＥｃｏＲＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部分を消化し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化することにより取り除いた。生成されたプラスミドをｐＳＤ４８９と命名した。ｐＳＤ４８９由来のＡ２６ＬＯＲＦを含む１．８ｋｂｐのＣｌａＩ（位置１３７１９８）／ＥｃｏＲＶ（位置１３９０４８）断片を、対応するｐＳＤ４８５由来の０．７ｋｂｐポリリンカーを含むＣｌａＩ／ＥｃｏＲＶ断片で置換し、ｐＳＤ４９２を生成した。ｐＳＤ４９２のポリリンカー領域中のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位は固有である。
Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａｅｔａｌ．，１９８３）をワクシニア１１ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔｅｔａｌ．，１９８５；Ｐｅｒｋｕｓｅｔａｌ．，１９９０）の支配下で含む３．３ｋｂｐのカセットをｐＳＤ４９２のＢｇｌＩＩ部位に挿入し、ｐＳＤ４９３ＫＢＧとした。プラスミドｐＳＤ４９３ＫＢＧはレスキューウイルスｖＰ５５３の組換えにおいて用いられた。組換えワクシニアウイルスｖｐ５８１は、ベータガラクトシダーゼをＡ２６Ｌ欠失領域内に有し、Ｘ−ｇａｌ存在化でブループラークとして単離された。
ベータガラクトシダーゼ遺伝子配列を組換えワクシニアウイルスｖＰ５８１から除去するためのプラスミドを開発するために、プラスミドｐＳＤ４９２のポリリンカー領域を、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ１７７（配列番号３７）

を用いた突然変異により欠失させた（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，１９８６）。生成されたプラスミド、ｐＭＰ４９４Δにおいては、Ａ２６ＬＯＲＦの全体を含む位置［１３７８８９−１３８９３７］を取り巻くワクシニアウイルスＤＮＡが欠失していた。ｐＭＰ４９４Δと、ベータガラクトシダーゼを含むワクシニア組換体ｖＰ５８１との間での組換えにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ６１８が、Ｘ−ｇａｌ存在下での透明プラークとして単離され、得られた。
実施例１６血球凝集素遺伝子（Ａ５６Ｒ）の欠失のためのプラスミドｐＳＤ４６７の構築
今、図１３を参照しているが、ワクシニアＳａｌＩＧ制限酵素断片（位置１６０７４４−１７３３５１）はＨｉｎｄＩＩＩＡ／Ｂ結合部分（位置１６２５３９）で交差している。ｐＳＤ４１９は、ｐＵＣ８中にクローン化されたワクシニアＳａｌＩＧ断片を有している。血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の転写方向は図１３中に矢印で示されている。ＨｉｎｄＩＩＩＢから派生したワクシニア配列は、ｐＳＤ４１９をＨｉｎｄＩＩＩでワクシニア配列内部とｐＵＣ／ワクシニア結合部分を消化し続いてライゲーションすることにより取り除いた。生成されたプラスミド、ｐＳＤ４５６は、ＨＡ遺伝子Ａ５６Ｒを、左に０．４ｋｂｐのワクシニア配列、右に０．４ｋｂｐのワクシニア配列と隣接した状態で有している。Ａ５６Ｒコード配列を、ｐＳＤ４５６をＲｓａＩで（部分的；位置１６１０９０）Ａ５６Ｒコード配列の上流を、またＥａｑＩで（位置１６２０５４）遺伝子の末端ちかくを切断することにより除去した。３．６ｋｂｐＲｓａＩ／ＥａｑＩベクター断片を単離し、アニーリングさせた合成ヌクレオチドＭＰＳＹＮ５９（配列番号３８）ＭＰＳＹＮ６２（配列番号３９）、ＭＰＳＹＮ６０（配列番号４０）およびＭＰＳＹＮ６１（配列番号４１）

とライゲーションし、Ａ５６ＲＯＲＦの上流域を再構築し、Ａ５６ＲＯＲＦを上記のポリリンカー領域で置換した。その結果生成されたプラスミドはｐＳＤ４６６である。プラスミドｐＳＤ４６６中のワクシニア欠失は位置［１６１１８５−１６２０５３］を含んでいる。ｐＳＤ４６６中の欠失部位は図１３に三角形で示されている。
Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａｅｔａｌ．，１９８３）をワクシニア１１ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔｅｔａｌ．，１９８５；Ｇｕｏｅｔａｌ．，１９８９）の支配下で含む３．３ｋｂｐのカセットをｐＳＤ４６６のＢｇｌＩＩ部位に挿入し、ｐＳＤ４６６ＫＢＧとした。プラスミドｐＳＤ４６６ＫＢＧはレスキューウイルスｖＰ６１８の組換えにおいて用いられた。組換えワクシニアウイルスｖｐ７０８は、ベータガラクトシダーゼをＡ２６Ｌ欠失部内に有し、Ｘ−ｇａｌ存在化でブループラークとして単離された。
ベータガラクトシダーゼ配列を、ｖＰ７０８からドナープラスミドｐＳＤ４６７を用いて除去した。ｐＳＤ４６７は、ｐＳＤ４６６をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化した後にＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化しライゲーションして、ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ部位がｐＵＣ／ワクシニア結合部分から取り除いてある以外はｐＳＤ４６６と同一である。ｖＰ７０８とｐＳＤ４６７との組換えの結果、組換えワクシニアウイルス欠失変異体、ｖＰ７２３が生成し、Ｘ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離された。
実施例１７オープンリーディングフレーム［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］の欠失のためのプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δの構築
今は、図１４を参照しているが、以下のワクシニアクローンがｐＭＣＳＫ１Δの構築のために利用された。ｐＳＤ４２０はｐＵＣ８中にクローン化されたＳａｌＩＨである。ｐＳＤ４３５は、ｐＵＣ１８中にクローン化されたＫｐｎＩＦである。ｐＳＤ４３５はＳｐｈＩで切断され、再び連結され、ｐＳＤ４５１となった。ｐＳＤ４５１中では、ＨｉｎｄＩＩＩＭ中のＳｐｈＩ部位（位置２７４１６）の左側のＤＮＡ配列は取り除かれている（Ｐｅｒｋｕｓｅｔａｌ．，１９９０）。ｐＳＤ４０９はｐＵＣ８中にクローン化されたＨｉｎｄＩＩＩＭである。
ワクシニア由来の［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］遺伝子クラスターの欠失のための基質を供与するために、Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼが最初にワクシニアＭ２Ｌ欠失座に以下のように挿入された（Ｇｕｏｅｔａｌ．，１９９０）。ｐＳＤ４０９中のＢｇｌＩＩ部位を除去するために、プラスミドをワクシニア配列中（位置２８２１２）でＢｇｌＩＩで、そしてＢａｍＨＩでｐＵＣワクシニア結合部分で切断し、続いて連結しｐＭＰ４０９Ｂとした。ｐＭＰ４０９Ｂを固有のＳｐｈＩ部位（位置２７４１６）で切断した。続いてＭ２Ｌコード配列を合成ヌクレオチドを用いた突然変異で除去した（Ｇｕｏｅｔａｌ．，１９９０；Ｍａｎｄｅｃｋｉ，１９８６）。
ＭＰＳＹＮ８２（配列番号４２）

その結果生成されたプラスミドｐＭＰ４０９Ｄは、Ｍ２Ｌ欠失座に上記のように挿入された固有のＢｇｌＩＩ部位を含んでいる。Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａｅｔａｌ．，１９８３）をワクシニア１１ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔｅｔａｌ．，１９８５）の支配下で含む３．２ｋｂｐのＢａｍＨＩ（部分）／ＢｇｌＩＩカセットをｐＭＰ４０９ＤのＢｇｌＩＩ部位に挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＭＰ４０９ＤＢＧはレスキューワクシニアウイルスｖＰ７２３の組換えにおいてドナープラスミドとして用いられた。組換えワクシニアウイルスｖｐ７８４は、Ｍ２Ｌ欠失座に挿入されたベータガラクトシダーゼを有し、Ｘ−ｇａｌ存在下でブループラークとして単離された。
ワクシニア遺伝子［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］欠失のためのプラスミドが、ＳｍａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、で切断されＥ．ｃｏｌｉポリメーラゼクレノー断片で平滑化されたｐＵＣ８中に集められた。ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩＣ配列からなる左隣接アームはｐＳＤ４２０をＸｂａＩで消化し（位置１８６２８）続いてＥ．ｃｏｌｉポリメーラゼクレノー断片で平滑化した後ＢｇｌＩＩで消化して（位置１９７０６）得た。ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩＫ配列からなる右隣接アームはｐＳＤ４５１をＢｇｌＩＩ（位置２９０６２）およびＥｃｏＲＶ（位置２９７７８）で消化して得た。その結果生成されたプラスミド、ｐＭＰ５８１ＣＫは、ＨｉｎｄＩＩＩＣ中のＢｇｌＩＩ部位（位置１９７０６）とＨｉｎｄＩＩＩＫ中のＢｇｌＩＩ部位（位置２９０６２）との間のワクシニア配列を欠失された。プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫ中のワクシニア配列の欠失部位は図１４において三角形で示されている。
ワクシニア欠失結合部位の過剰のＤＮＡを取り除くため、プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫをワクシニア配列内のＮｃｏＩ部位（位置１８８１１；１９６５５）で切断し、Ｂａｌ−３１エキソヌクレアーゼ処理し、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２３３（配列番号４３）

を用いた突然変異にかけた。その結果生成したプラスミド、ｐＭＣＳＫ１Δは、１２のワクシニアオープンリーディングフレーム［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を含む位置１８８０５−２９１０８のワクシニア配列を欠失していた。ｐＭＣＳＫ１Δと、ベータガラクトシダーゼを含むワクシニア組換体ｖＰ７８４との組換えにより、ワクシニア欠失変異体、ｖＰ８０４が生成し、Ｘ−ｇａｌ存在下で透明プラークとして単離された。
実施例１８リボヌクレアーゼ還元酵素ラージサブユニット（Ｉ４Ｌ）の欠失のためのプラスミドｐＳＤ５４８の構築
今、図１５を参照しているが、プラスミドｐＳＤ４０５は、ｐＵＣ８中にクローン化されたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩＩ（位置６３８７５−７０３６７）を有している。ｐＳＤ４０５をＥｃｏＲＶでワクシニア配列内部（位置６７９３３）を、およびＳｍａＩでｐＵＣ／ワクシニア結合部分を消化し、連結させ、プラスミドｐＳＤ５１８とした。ｐＳＤ５１８はｐＳＤ５４８の構築において用いられた、全てのワクシニア制限断片の供給源として用いられた。
ワクシニアＩ４Ｌ遺伝子は位置６７３７１−６５０５９にわたっている。Ｉ４Ｌの転写方向は図１５中で矢印によって示されている。Ｉ４Ｌコード配列部分を欠失させたベクタープラスミド断片を得るため、ｐＳＤ５１８をＢａｍＨＩ（位置６５３８１）、およびＨｐａＩ（位置６７００１）で消化し、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で平滑化した。この４．８ｋｂｐのベクター断片は、Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（Ｓｈａｐｉｒａｅｔａｌ．，１９８３）をワクシニア１１ｋＤａプロモーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔｅｔａｌ．，１９８５；Ｐｅｒｋｕｓｅｔａｌ．，１９９０）の支配下で含む３．２ｋｂｐのＳｍａＩカセットと連結され、プラスミドｐＳＤ５２４ＫＢＧとなった。ｐＳＤ５２４ＫＢＧを、ワクシニアウイルスｖＰ８０４との組換えでドナープラスミドとして用いた。組換えワクシニアウイルス、ｖｐ８５５は、ベータガラクトシダーゼをＩ４Ｌ遺伝子部分欠失部位中に含み、Ｘ−ｇａｌ存在下でブループラークとして得られた。
ベータガラクトシダーゼとＩ４ＬＯＲＦの残りの部分をｖＰ８５５から欠失させるために、欠失プラスミドｐＳＤ５４８を構築した。左および右ワクシニア隣接アームは別々に、以下に詳細に、および図１５中に模式的に示されているようにｐＵＣ８中に集められた。
左ワクシニア隣接アームを受け入れるベクタープラスミドを構築するために、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオチド５１８Ａ１／５１８Ａ２（配列番号４４／配列番号４５）

と連結し、プラスミドｐＳＤ５３１とした。ｐＳＤ５３１をＲｓａＩ（部分）およびＢａｍＨＩで切断し、２．７ｋｂｐの断片を単離した。ｐＳＤ５１８をＢｇｌＩＩ（位置６４４５９）／ＲｓａＩ（位置６４９９４）で切断し、０．５ｋｂｐの断片を単離した。２つの断片を連結し、Ｉ４Ｌコード配列の左の完全ワクシニア隣接アームを有するプラスミドｐＳＤ５３７とした。
右ワクシニア隣接アームを受け入れるためのベクターを構築するため、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニーリングさせた合成オリゴヌクレオチド５１８Ｂ１／５１８Ｂ２（配列番号４６／配列番号４７）

と連結させ、ｐＳＤ５３２とした。ｐＳＤ５３２をＲｓａＩ（部分的）／ＥｃｏＲＩで切断し、２．７ｋｂｐのベクター断片を単離した。ｐＳＤ５１８を、ＲｓａＩでワクシニア内部（位置６７４３６）を、ＥｃｏＲＩでワクシニア／ｐＵＣ結合を切断し、０．６ｋｂｐの断片を単離した。この２つの断片を連結し、Ｉ４Ｌコード領域の右の完全ワクシニア隣接アームを含むｐＳＤ５３８とした。
右ワクシニア隣接アームは、ｐＳＤ５３８由来の０．６ｋｂｐＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片として単離され、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩで切断されたｐＳＤ５３７中へ連結された。その結果生成したプラスミドｐＳＤ５３９においては、Ｉ４ＬＯＲＦ（６５０４７−６７３８６）はポリリンカー領域で置換され、ポリリンカー領域は左で０．６ｋｂｐのワクシニア配列、右で０．６ｋｂｐのワクシニア配列と、すべてｐＵＣのバックグラウンド内部で隣接している。ワクシニア配列内部での欠失部位は、図１５で三角形で示されている。組換えワクシニアウイルスｖＰ８５５中のベータガラクトシダーゼ配列と、ｐＳＤ５３９のｐＵＣ派生部分のベータガラクトシダーゼとの、起こりうる組換えを避けるために、ワクシニアＩ４Ｌ欠失カセットがｐＳＤ５３９からｐＲＣ１１へ移動され、ｐＵＣ派生体からすべてのベータガラクトシダーゼを除去し、ポリリンカー領域で置換した（Ｃｏｌｉｎａｓｅｔａｌ．，１９９０）。ｐＳＤ５３９をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断し、１．２ｋｂｐ断片を単離した。この断片をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断したｐＲＣ１１（２．３５ｋｂｐ）中へ挿入し、ｐＳＤ５４８とした。ｐＳＤ５４８とベータガラクトシダーゼを含むワクシニア組換体ｖＰ８５５との組換えの結果、ワクシニア欠失変異体ｖＰ８６６が生成し、Ｘ−ｇａｌ存在下で透明プラークとして単離された。
組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６由来のＤＮＡを、制限酵素消化とそれに続くアガロースゲル上での電気泳動により分析した。制限パターンは期待通りのものであった。ｖＰ８６６をテンプレートとして、上に詳述された６欠失座に隣接するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｅｎｇｅｌｋｅｅｔａｌ．，１９８８）により、期待されたサイズのＤＮＡ断片が生産された。ＰＣＲにより生産された断片の、欠失結合部位の範囲の周りの配列分析により、結合部位は期待された通りであることが確認された。組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６は、上記の６つの操作された欠失を有し、ワクシニアワクチン株「ＮＹＶＡＣ」と命名された。
実施例１９狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子のＮＹＶＡＣへの挿入
ワクシニアＨ６プロモーター（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９８８ａ，ｂ）の支配下で狂犬病糖タンパク質Ｇをコードしている遺伝子を、ＴＫ欠失プラスミドｐＳＤ５１３中に挿入した。ｐＳＤ５１３は、ポリリンカー領域の存在を除いてプラスミドｐＳＤ４６０（図１０）と同一である。
今、図１６を参照しているが、ポリリンカー領域はｐＳＤ４６０をＳｍａＩで切断し、プラスミドベクターをアニーリングさせた合成ヌクレオチドＶＱ１Ａ／ＶＱ１Ｂ（配列番号４８／配列番号４９）

と連結することにより挿入され、ベクターｐＳＤ５１３を生成した。ｐＳＤ５１３をＳｍａＩで切断し、ワクシニアＨ６プロモーター（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９８８ａ，ｂ）支配下の狂犬病糖タンパク質Ｇを含むＳｍａＩ末端化１．８ｋｂｐのカセットと連結した。生成したプラスミドはｐＲＷ８４２と命名された。ｐＲＷ８４２はＮＹＶＡＣレスキューウイルス（ｖＰ８６６）との組換えのドナープラスミドとして用いられた。組換えワクシニアウイルスｖＰ８７９を、狂犬病糖タンパク質Ｇに対する³²Ｐ−標識ＤＮＡプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションにより同定した。
本発明の改変組換えウイルスは、組換えワクチンベクターとしての利点を供与する。弱毒化されたベクターの毒性は、ワクチン接種によるワクチン接種された個体内でのランナウェイ感染（ｒｕｎａｗａｙｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を有利に減少させ、ワクチン接種された個体からされていない個体への伝播もしくは環境への汚染も減少させる。
改変組換えウイルスはまた、遺伝子産物をコードし細胞内で発現する外来遺伝子を有する改変組換えウイルスを、細胞内に導入することにより、生体外で培養された細胞中での遺伝子発現の方法にもまた有利に用いることができる。
実施例２０ニューカッスル病ウイルスの融合および血球凝集素ノイラミニダーゼ糖タンパク質を発現するＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶの構築
本実施例では、ニワトリポックスウイルスベクターＴＲＯＶＡＣ、およびＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶと命名されたニワトリポックスニューカッスル病ウイルス組換体の開発、およびその安全性並びに効率を記述する。毒性ＮＤＶ株テキサスのＦおよびＨＮ遺伝子を両方発現するニワトリポックスウイルス（ＦＰＶ）ベクターを構築した。創出された組換体はＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶと命名された。ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶは実際にプロセシングされたＮＤＶ糖タンパク質を、組換えウイルスを感染させた鳥類細胞中で発現し、生後１日のニワトリへの接種により、それに続く毒性ＮＤＶ投与に対して防御する。
細胞とウイルスＮＤＶテキサス株は短期潜伏性の株である。ＦおよびＨＮ遺伝子のｃＤＮＡの調製は以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９０；Ｅｄｂａｕｅｒｅｔａｌ．，１９９０）。ＦＰＶウイルスのＦＰ−１と命名された株は以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９８８ａ）。それは生後１日のニワトリのワクチン接種に有用なワクチン株である。親ウイルス株Ｄｕｖｅｔｔｅはフランスでニワトリからのニワトリポックスのかさぶたとして得られた。ウイルスはふ化鶏卵における約５０回の連続継代とそれに続くニワトリ胚繊維芽細胞で２５回の継代により弱毒化された。ウイルスは４回の連続プラーク精製にかけられた。１つのプラーク単離体を初代ＣＥＦ細胞中で増幅し、ＴＲＯＶＡＣと命名されたストックウイルスとした。この生体外組換えテストでＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶを生成するために用いられたストックウイルスは、プラーク単離体から初代ＣＥＦ中で１２回の継代にかけられた。
ＮＤＶ−Ｆのカセットの構築５’末端からの２２ヌクレオチドを除く全てのＦタンパク質をコードしている配列を含む１．８ｋｂのＢａｍＨＩ断片を、ｐＮＤＶ８１（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９０）から切り出し、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＣＥ１３とした。以前に記述されたワクシニアウイルスＨ６プロモーター（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９８８ａ，ｂ；Ｇｕｏｅｔａｌ．，１９８９；Ｐｅｒｋｕｓｅｔａｌ．，１９８９）は、ｐＣＥ１３をＳａｌＩで消化し、粘着末端をＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で充填し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより、ｐＣＥ１３中に挿入した。Ｈ６プロモーター配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片を、続いてｐＣＥ１３中に挿入し、ｐＣＥ３８とした。完全５’末端は、ｐＣＥ３８をＫｐｎＩおよびＮｒｕＩで消化し、アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドＣＥ７５（配列番号５０）およびＣＥ７６（配列番号５１）を挿入して生成し、ｐＣＥ４７を生成した。

ＮＤＶ−Ｆの３’末端非コード領域を取り除くため、ｐＣＥ１３由来のＳｍａＩからＰｓｔＩ断片をｐＵＣ１８のＳｍａＩおよびＰｓｔＩ部位に挿入し、ｐＣＥ２３とした。非コード領域をｐＣＥ２３のＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ＳＩヌクレアーゼおよびＥｃｏＲＩによる連続的消化により除去した。アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドＣＥ４２（配列番号５２）およびＣＥ４３（配列番号５３）を続いて挿入しｐＣＥ２９とした。

ＮＤＶ−Ｆ配列の３’末端を続いて、既にｐＣＥ２９からのＰｓｔＩ−ＳａｃＩ断片をｐＣＥ２０のＰｓｔＩ−ＳａｃＩ部位に挿入することによりＮＤＶ−Ｆの５’末端を有しているプラスミドｐＣＥ２０に挿入しｐＣＥ３２とした。ｐＣＥ２０の開発は以前にＴａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９０中で記述された。
Ｈ６プロモーターおよびｐＣＥ４７に含まれているＮＤＶ−Ｆ５’配列を、ｐＣＥ３２に含まれている３’ＮＤＶ−Ｆ配列と整列させるために、ｐＣＥ４７のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＣＥ３２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ部位へ挿入し、ｐＣＥ４９とした。Ｈ６プロモートされたＮＤＶ−Ｆは続いてＯＲＦを除いたＦ８座（以下に記述）へ、ｐＣＥ４９由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｒｕＩ断片をｐＪＣＡ００２（以下に記述）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩ部位へ挿入することにより移し、ｐＣＥ５４とした。ｐＣＥ５４をＳａｃＩで、部分的にＢａｍＨＩで消化し、アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドＣＥ１６６（配列番号５４）およびＣＥ１６７（配列番号５５）を挿入することにより、ｐＣＥ５４へ転写終結シグナルを挿入し、ｐＣＥ５８とした。

ＮＤＶ−Ｆ完全３’末端を、ｐＣＥ５４をテンプレートとして、オリゴヌクレオチドＣＥ１８２（配列番号５６）およびＣＥ１８３（配列番号５７）をプライマーとしたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得た。

ＰＣＲ断片はＰｖｕＩＩおよびＨｐａＩにより消化させ、ＨｐａＩおよび部分的にＰｖｕＩＩにより消化したｐＣＥ５８中へクローン化した。その結果生成されたプラスミドはｐＣＥ６４と命名された。ｐＣＥ６４由来の完全Ｈ６プロモーターおよびＦコード配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ断片を、ｐＲＷ８４６のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ部位にクローン化することにより、翻訳終結シグナルを挿入し、最終ＮＤＶ−ＦカセットであるｐＣＥ７１を生成した。プラスミドｐＲＷ８４６は実質的にｐＪＣＡ００２（以下に記述）と同一ではあるが、Ｈ６プロモーターおよび転写並びに翻訳終結シグナルを有している。ｐＲＷ８４６をＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｐａＩで消化することによって、Ｈ６プロモーターは除かれるが停止シグナルは手つかずで残る。
ＮＤＶ−ＨＮカセットの構築プラスミドｐＲＷ８０２の構築は以前にＥｄｂａｕｅｒｅｔａｌ．，１９９０中で記述された。このプラスミドはワクシニアウイルスＨ６プロモーターの３’末端に連結したＮＤＶ−ＨＮ配列をｐＵＣ９ベクター中に有している。ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの５’末端を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐＲＷ８０２のＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶ部位に挿入しｐＲＷ８３０とした。アニーリングさせキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドＣＥ１６２（配列番号５８）およびＣＥ１６３（配列番号５９）をｐＲＷ８３０に挿入することにより、ＮＤＶ−ＨＮの完全３’末端を得て、最終ＮＤＶ−ＨＮカセットであるｐＣＥ５９を生成した。

ＦＰＶ挿入ベクターの構築プラスミドｐＲＷ７３１−１５は、ゲノムＤＮＡからクローン化された１０ｋｂｐのＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片をコードしている。３６６０ｂｐのＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片の両方の鎖に関してヌクレオチド配列が決定された。ここでＦ８と名付けられたオープンリーディングフレームの限定が決定された。プラスミドｐＲＷ７６１は２４３０ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶ断片を含むｐＲＷ７３１−１５のサブクローンである。Ｆ８オープンリーディングフレームの全体は、ｐＲＷ７６１中のＸｂａＩ部位およびＳｓｐＩ部位の間に含まれている。ＴＲＯＶＡＣゲノムＤＮＡとの組換えにおいてＦ８ＯＲＦを取り除く挿入プラスミドを創出するために、以下の工程が行われた。プラスミドｐＲＷ７６１を完全にＸｂａＩで、部分的にＳｓｐＩで消化した。ゲルから単離された３７００ｂｐのＸｂａＩ−ＳｓｐＩバンドをアニーリングさせた２本鎖オリゴヌクレオチドＪＣＡ０１７（配列番号６０）およびＪＣＡ０１８（配列番号６１）と連結した。

このライゲーションの結果生成されたプラスミドはｐＪＣＡ００２と命名された。
ＮＤＦＦおよびＨＮの二重挿入ベクターの構築Ｈ６プロモートされたＮＤＶ−ＨＮ配列を、Ｈ６プロモートされたＮＤＶ−Ｆカセット中に、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼクレノー断片で充填したｐＣＥ５９由来のＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＣＥ７１のＨｐａＩ部位へクローン化することにより挿入し、ｐＣＥ８０とした。プラスミドｐＣＥ８０は完全にＮｄｅＩで、ＢｇｌＩＩで部分的に消化し、Ｆ８隣接アームに連結し、ともにＨ６プロモーターによって駆動されているＮＤＶＦおよびＨＮ遺伝子を含む４７６０ｂｐ断片を生成した。プラスミドｐＪＣＡ０２１は、ｐＲＷ７３１−１５由来の４９００ｂｐのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄＩＩ断片をｐＢＳＳＫ⁺のＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩに挿入することにより得られた。プラスミドｐＪＣＡ０２１を続いてＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ｐＣＥ８０の４７６０ｂｐのＮｄｅＩ−ＢｇｌＩＩ断片と連結し、ｐＪＣＡ０２４とした。プラスミドｐＪＣＡ０２４は、それ故、ＦＰＶ隣接アームの間に３’末端が隣接した逆向きの方向で挿入されたＮＤＶ−ＦおよびＨＮ遺伝子を有している。両方の遺伝子はワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結されている。ＮＤＶ−Ｆ配列に近い右隣接アームは２３５０ｂｐのＦＰＶ配列からなる。ＮＤＶ−ＨＮ配列に近い左隣接アームは１７００ｂｐＦＰＶ配列からなる。
ＲＴＯＶＡＣ−ＮＤＶの開発プラスミドｐＪＣＡ０２４を、ＴＲＯＶＡＣを感染させた初代ＣＥＦ細胞中に、以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉｅｔａｌ．，１９８２；Ｐｉｃｃｉｎｉｅｔａｌ．，１９８７）リン酸カルシウム沈殿法を用いて形質導入した。陽性プラークを、ＮＤＶ−ＦおよびＨＮ特異的放射性標識プローブとのハイブリダイゼーションに基づいて選択し、続いて純粋な集団が達成されるまでプラーク精製の連続的過程にかけた。続いて１つの代表プラークを増幅し、その結果得られたＴＲＯＶＡＣ組換体はＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ（ｖＦＰ９６）と命名された。
免疫蛍光直接的ではない免疫蛍光を、記述されたように（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９０）、ポリクローナル抗ＮＤＶ血清、およびモノ特異的試薬として、ＮＤＦ−ＶまたはＮＤＶ−ＨＮを発現するワクシニアウイルス組換体に対するウサギ体内で作られた血清を用いて行った。
免疫沈降免疫沈降反応を、記述されたように（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９０）ＳＰＡＦＡＳＩｎｃ．Ｓｔｏｒｒｓ，ＣＴより得たポリクローナル抗ＮＤＶ血清を用いて行った。
ストックウイルスを、Ｆ８ＯＲＦのが欠失されていることを確認するためにin situプラークハイブリダイゼーションにより選別した。ＴＲＯＶＡＣゲノムへのＮＤＶ遺伝子の正確な挿入およびＦ８ＯＲＦの欠失は、サザンブロットハイブリダイゼーションによってもまた確認された。
ＮＤＶ感染細胞中では、Ｆ糖タンパク質は、カルボキシル末端付近の疎水性膜貫通領域によって膜に固定され、プレカーサーＦ₀の、２つのジスルフィド結合したポリペプチドＦ₁およびＦ₂への翻訳後の切断を必要とする。Ｆ₀の切断は、与えられたＮＤＶ株の病原性の決定において重要であり（ＨａｍｍａａｎｄＯｃｈｉａｉ，１９７３；Ｎａｇａｉｅｔａｌ．，１９７６；Ｎａｇａｉｅｔａｌ．，１９８０）、切断部位のアミノ酸配列は、それ故にウイルスの毒性の決定に重要である。ＦＰＶ中に挿入され、組換体ｖＦＰ２９を生成したＮＤＶ−Ｆ配列中の切断部位のアミノ酸は、配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号４２）（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９０）を有し、これは毒性ＮＤＶ株で要求されると判明している配列（Ｃｈａｍｂｅｒｓｅｔａｌ．，１９８６；Ｅｓｐｉｏｎｅｔａｌ．，１９８７；Ｌｅｅｔａｌ．，１９８８；ＭｃＧｉｎｎｅｓａｎｄＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９８６；Ｔｏｙｏｄａｅｔａｌ．，１９８７）と一致していた。ＮＤＶ毒性株に感染した細胞中で合成されるＨＮ糖タンパク質は切断されていない７４ｋＤａの糖タンパク質である。例えばＵｌｓｔｅｒおよびＱｕｅｅｎｓｌａｎｄのような極端に無毒性の株は、活性化には切断を要求するＨＮ（ＨＮ₀）をコードしている（Ｇａｒｔｅｎｅｔａｌ．，１９８０）。ＦおよびＨＮ遺伝子のＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ中での発現を、遺伝子産物が正確にプロセシングされ、提供されているかどうかを確認するために分析した。ポリクローナル抗ＮＤＶニワトリ血清を用いた、直接的ではない免疫蛍光により、免疫活性なタンパク質が感染細胞の表面に提供されていることが確認された。両方のタンパク質が原形質膜上に提供されていることを決定するために、ＦもしくはＨＮ糖タンパク質のいずれかを発現するワクシニア組換体に対するモノ特異的ウサギ血清が生成された。これらの血清を用いた直接的でない免疫蛍光により、両方のタンパク質の表面での提供が確認された。
免疫沈降実験を、親および組換えウイルスに感染させたＣＥＦ細胞の（³⁵Ｓ）メチオニン標識破砕物を用いて行った。Ｆ₁およびＦ₂のグリコシル化された状態での見かけの分子量の期待値は、それぞれ５４．７および１０．３ｋＤａである（Ｃｈａｍｂｅｒｓｅｔａｌ．，１９８６）。ポリクローナル抗ＮＤＶ血清を用いた免疫沈降実験において、適当なサイズの融合特異的産物がＮＤＶ−Ｆ単独組換体ｖＦＰ２９（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９０）およびＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ二重組換体ｖＦＰ９６から検出された。適切なサイズのＨＮ糖タンパク質もまたＮＤＶ−ＨＮ単独組換体ｖＦＰ４７（Ｅｄｂａｕｅｒｅｔａｌ．，１９９０）およびＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶから検出された。感染させなかった細胞、および親ＴＲＯＶＡＣを感染させたＣＥＦ細胞からはＮＤＶ特異的産物は検出されなかった。
ＣＥＦ細胞においてＦおよびＨＮ糖タンパク質は、適切に細胞表面上に提供され、そこにおいてそれらはＮＤＶ免疫血清によって認識された。免疫沈降分析により、毒性株で要求されるようにＦ₀タンパク質は正確にＦ₁およびＦ₂成分へと切断されることが示された。同じようにＨＮ糖タンパク質は組換体ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶに感染させたＣＥＦ細胞中で正確にプロセシングされた。
以前の報告（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９０；Ｅｄｂａｕｅｒｅｔａｌ．，１９９０；Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌｅｔａｌ．，１９９０ａ，ｂ，ｃ；Ｏｇａｗａｅｔａｌ．，１９９０）では、ＨＮもしくはＦのいずれかのみの発現で、ＮＤＶ投与に対する防御免疫の誘導には十分であると示唆されていた。しかしながら、他のパラミクソウイルスについての研究により、十分な防御免疫には両方のタンパク質に対する抗体要求され得ることが示唆されている。ＳＶ５ウイルスはＨＮ糖タンパク質に対する抗体の存在下で組織培養中に拡散できるが、Ｆ糖タンパク質に対する抗体の場合はできない。（Ｍｅｒｚｅｔａｌ．，１９８０）。加えて、殺された麻疹ウイルスワクチンでのワクチン失敗は融合成分の不活性化によるものであると提案されている（Ｎｏｒｒｂｙｅｔａｌ．，１９７５）。両方のＮＤＶ糖タンパク質はウイルス中和抗体の誘導に反応性であり（Ａｖｅｒｙｅｔａｌ．，１９７９）、および両方の糖タンパク質は、独立してニワトリポックスベクターで発現された場合にも防御的免疫反応を誘導できることが示されているが、最も効果的なＮＤＶワクチンには両方の糖タンパク質を発現しなくてはならないことが理解されている。
実施例２１狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇを発現するＡＬＶＡＣ組換体の構築
本実施例では、カナリアポックスウイルスベクター、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）と命名されたカナリアポックス−狂犬病組換体の開発およびその安全性と効率を記述する。
細胞とウイルス親カナリアポックス（Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ株）はカナリアのためのワクチン株である。ワクチン株は野生株単離体から得られ、ニワトリ胚繊維芽細胞上で２００回以上の継代を通して弱毒化された。マスターウイルスシードは４回の連続した寒天下プラークハイブリダイゼーションにかけられ、１つのプラーククローンがさらに５回の付加的な継代により増幅され、その後ストックウイルスが親株として生体外組換え試験において用いられた。プラーク精製されたカナリアポックス単離体はＡＬＶＡＣと命名された。
カナリアポックス挿入ベクターの構築８８０ｂｐのカナリアポックスＰｖｕＩＩ断片を、ｐＵＣ９中のＰｖｕＩＩ部位の間にクローン化し、ｐＲＷ７６４．５とした。この断片の配列を図１７（配列番号６２）中の位置１３７２および２２５１の間に示す。Ｃ５と命名されたオープンリーディングフレームの限定が決定された。オープンリーディングフレームは断片中の位置１６６から開始され、位置４８７で終了することが決定された。オープンリーディングフレームに干渉することなくＣ５の欠失がなされた。位置１６７から位置４５５までの塩基は配列（配列番号６３）
ＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴ
により置換された。この置換用配列はＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、およびＥｃｏＲＩ挿入部位および、それに続くワクシニアウイルスＲＮＡポリメラーゼによって認識される翻訳停止および転写終結シグナル（Ｙｕｅｎｅｔａｌ．，１９８７）を有している。Ｃ５ＯＲＦ欠失は以下に記述されるように行った。プラスミドｐＲＷ７６４．５を部分的にＲｓａＩで切断し、線状産物を単離した。ＲｓａＩ線状断片を再びＢｇｌＩＩで切断し、今、位置１５６から位置４６２へのＲｓａＩからＢｇｌＩＩへの欠失のあるｐＲＷ７６４．５断片を単離し、以下の合成ヌクレオチドのためのベクターとして用いた

オリゴヌクレオチドＲＷ１４５およびＲＷ１４６をアニーリングさせ、ｐＲＷ７６４．５ＲｓａＩおよびＢｇｌＩＩベクターに上記のように挿入した。その結果生成されたプラスミドはｐＲＷ８３１と命名された。
狂犬病Ｇ遺伝子を含む挿入ベクターの構築ｐＲＷ８３８の構築を以下に記述する。オリゴヌクレオチドＡからＥは、Ｈ６プロモーターの翻訳開始コドンおよび狂犬病ＧのＡＴＧとオーバーラップしているが、これらをｐＵＣ９中にｐＲＷ７３７としてクローン化した。オリゴヌクレオチドＡからＥはＨ６プロモーター、ＮｒｕＩでの開始、狂犬病ＧのＨｉｎｄＩＩＩを通ってそれに続くＢｇｌＩＩを含んでいる。
オリゴヌクレオチドＡからＥ（（配列番号６６）−（配列番号７０））の配列は：

アニーリングさせたオリゴヌクレオチドＡからＥの配置は以下の通りである：

オリゴヌクレオチドＡからＥをキナーゼ処理し、アニーリングさせ（９５℃、５分間、続いて室温まで冷却）、ｐＵＣ９のＰｖｕＩＩ部位に挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ７３７を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、ｐｔｇ１５５ＰＲＯ（Ｋｉｅｎｙｅｔａｌ．，１９８４）の１．６ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ部位のためのベクターとして用い、ｐＲＷ７３９を生成した。ｐｔｇ１５５ＰＲＯのＨｉｎｄＩＩＩ部位は狂犬病Ｇ遺伝子の翻訳開始コドンから８６ｂｐ下流にある。ＢｇｌＩＩはｐｔｇ１５５ＰＲＯ中の狂犬病Ｇ遺伝子翻訳終了コドンの下流にある。ｐＲＷ７３９を部分的にＮｒｕＩで切断し、完全にＢｇｌＩＩで切断し、以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９８８ａ，ｂ；Ｇｕｏｅｔａｌ．，１９８９；Ｐｅｒｋｕｓｅｔａｌ．，１９８９）Ｈ６プロモーターの３’末端を狂犬病Ｇ遺伝子全体を通して含んでいる１．７ｋｂｐのＮｒｕＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、ｐＲＷ８２４のＮｒｕＩおよびＢａｍＨＩ部位の間に挿入した。その結果生成されたプラスミドはｐＲＷ８３２と命名された。ｐＲＷ８２４への挿入によりＮｒｕＩのＨ６プロモーター５’を付加した。ｐＲＷ８２４の、ＳｍａＩが続いているＢａｍＨＩの配列は（配列番号７１）：ＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧである。ｐＲＷ８２４は、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターに正確に連結した非関連遺伝子を有している。ＮｒｕＩおよびＢａｍＨＩでの消化によりこの非関連遺伝子を完全に切り出した。１．８ｋｂｐｐＲＷ８３２のＳｍａＩ断片は、Ｈ６プロモートされた狂犬病Ｇを有しており、ｐＲＷ８３１のＳｍａＩ部位中に挿入され、プラスミドｐＲＷ８３８を生成した。
ＡＬＶＡＣ−ＲＧの開発プラスミドｐＲＷ８３８を、ＡＬＶＡＣを感染させた初代ＣＥＦ細胞に、以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉｅｔａｌ．，１９８２；Ｐｉｃｃｉｎｉｅｔａｌ．，１９８７）リン酸カルシウム沈殿法により形質導入した。狂犬病Ｇ遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な集団が達成させるまで６回の連続したプラーク精製過程にかけた。１つの代表プラークが続いて増幅され、その結果生成されたＡＬＶＡＣ組換体はＡＬＶＡＣ−ＲＧと命名された（ｖＣＰ６５）（図１８Ａおよび１８Ｂもまた参照されたい）。狂犬病Ｇ遺伝子のＡＬＶＡＣゲノムへの、続いて起こる変異なしでの正確な挿入を、配列分析により確認した。
免疫蛍光成熟狂犬病ウイルス粒子の集合の最後の段階で、糖タンパク質成分はゴルジ体から、細胞質へ伸長しているカルボキシ末端および細胞膜の外側表面上のタンパク質のバルクとともにそれが蓄積する原形質膜へと輸送される。ＡＬＶＡＣ−ＲＧで発現された狂犬病糖タンパク質が正確に提供されていることを確認するために、ＡＬＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させた初代ＣＥＦ細胞について免疫蛍光を行った。免疫蛍光は以前に記述されたように（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９０）、狂犬病Ｇモノクローナル抗体を用いて行った。ＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させたＣＥＦ細胞では強力な表面蛍光が検出されたが、親ＡＬＶＡＣに感染させたものは検出されなかった。
免疫沈降予め形成された初代ＣＥＦ単層、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓細胞の系統、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１）およびＭＲＣ−５細胞（ノーマルヒト胎児肺組織から派生した繊維芽様細胞系統、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１）を、１０ｐｆｕの親ウイルスＡＬＶＡＣおよび組換えウイルスＡＬＶＡＣ−ＲＧで放射性標識³⁵Ｓ−メチオニンの存在下で接種し、以前に記述されたように処理した（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９０）。免疫沈降を、狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用いて行った。約６７ｋＤａの分子量の狂犬病特異的糖タンパク質の効果的な発現が組換体ＡＬＶＡＣ−ＲＧに関して検出された。感染させていない細胞もしくは親ＡＬＶＡＣウイルスに感染させた細胞においては、狂犬病特異的産物は検出されなかった。
連続継代実験非鳥類種の範囲でのＡＬＶＡＣウイルスの研究においては、拡散的感染も明白な病気も観察されなかった（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９１ｂ）。しかしながら、親も組換体もどちらも非鳥類種細胞中で増殖可能に適応しないようにするために、連続継代実験を行った。
２つのウイルス、ＡＬＶＡＣとＡＬＶＡＣ−ＲＧを３種類の細胞系統で１０連続盲継代（ｂｌｉｎｄｐａｓｓａｇｅ）を行った：
（１）１１日経過白レグホン胚から調製された初代ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞；
（２）Ｖｅｒｏ細胞−アフリカミドリザル腎臓細胞の連続系統（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１）；
（３）ＭＲＣ−５細胞−ヒト胎児肺組織から派生した二倍体細胞系統（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１）。
最初の接種は０．１ｐｆｕ／細胞のｍ．ｏ．ｉで、一皿あたりの２ｘ１０⁶の細胞を含む３枚の６０ｍｍのディッシュを用いて行った。ひとつのディッシュは、４０μｇ／ｍｌのＤＮＡ複製阻害剤シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）の存在下で接種した。１時間、３７℃での吸収期間の後、接種物を取り除き、単層を吸収されなかったウイルスを除去するために洗浄した。このとき、培地を、２つのディッシュ（試料ｔ０からｔ７）では５ｍｌのＥＭＥＭ＋２％ＮＢＣＳで、第３のディッシュでは４０μｇ／ｍｌのＡｒａＣを含む５ｍｌのＥＭＥＭ＋２％ＮＢＣＳで（試料ｔ７Ａ）置換した。残存投入ウイルスの指標を提供するため、試料ｔ０は−７０℃で凍結した。試料ｔ７およびｔ７Ａを３７℃で７日間保温し、その後で内容物を回収し細胞を非直接的超音波破砕により破砕した。
それぞれの細胞系統のｔ７試料の１ｍｌを希釈せずに、同じ細胞系統の３枚のディッシュ（試料ｔ０、ｔ７およびｔ７Ａを提供するため）に、そして１枚の初代ＣＥＦ細胞のディッシュに接種した。試料ｔ０、ｔ７およびｔ７Ａを継代１として扱った。付加的なＣＥＦ細胞への接種は、非鳥類種の細胞中に存在するかも知れないウイルスの、より高感度の検出のための増幅工程である。
この工程を１０回（ＣＥＦおよびＭＲＣ−５）または８回（Ｖｅｒｏ）の連続盲継代について繰り返した。試料は続いて３回凍結、融解させ、初代ＣＥＦ単層上での滴定によりアッセイした。
それぞれの試料中のウイルス収量を、寒天下のＣＥＦ単層上のプラーク滴定により決定した。まとめた実験の結果を表５および６に示す。
結果より、親ＡＬＶＡＣおよび組換体ＡＬＶＡＣ−ＲＧは両方ともＣＥＦ単層上で力価の損失なしに持続した複製が可能であることが示唆された。Ｖｅｒｏ細胞においては、ＡＬＶＡＣは２回の継代で、そしてＡＬＶＡＣ−ＲＧは１回の継代で、ウイルスレベルは検出レベル以下に低下した。ＭＲＣ−５細胞においては、同様の結果が明白となり、１継代の後はウイルスは検出されなかった。表５および６には４継代の結果のみを示したが、この一連の工程はＶｅｒｏについては８継代、ＭＲＣ−５については１０継代続けたが、いずれのウイルスも非鳥類種細胞中で増殖可能であるような検出可能な適応は無かった。
継代１においては、比較的高いレベルのウイルスが、ＭＲＣ−５およびＶｅｒｏ細胞のｔ７試料中に存在していた。しかしながら、このウイルスのレベルはｔ０試料、およびウイルス複製が起こり得ないシトシンアラビノシドの存在下で保温されたｔ７Ａ試料においてみられたものと同等であった。このことは、非鳥類種細胞で７日に見られたウイルスレベルは、新たに複製されたウイルスではなく残存ウイルスを示していることを表している。
アッセイをより敏感にするため、それぞれの細胞系統からの７日の回収物を許容的ＣＥＦ単層に接種し、細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られた時点、またＣＰＥが見られなかった場合は７日で回収した。この実験の結果を表７に示す。許容的細胞系統を通した増幅の後ですらも、ＭＲＣ−５およびＶｅｒｏ細胞は付加的な２継代においてのみ検出された。これらの結果は、用いられた条件においては、いずれのウイルスもＶｅｒｏもしくはＭＲＣ−５細胞中での増殖への適応は無かったことを示している。
サル科マカク属のサル（Ｍａｃａｑｕｅ）への接種４匹のＨＩＶ血清陽性のサルを最初にＡＬＶＡＣ−ＲＧで表８に記述したように接種した。１００日後、これらの動物の追加免疫効果を決定するために再接種し、さらに付加的に７匹の動物をある投与量範囲で接種した。血液を適当な間隔で取り出し、５６℃、３０分間熱失活させた後、抗狂犬病抗体の存在について、高速蛍光焦点阻害アッセイ（Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，１９７３）を用いて血清を分析した。
チンパンジーへの接種２匹の雄成チンパンジー（５０−６５ｋｇの体重範囲）を、１ｘ１０⁷ｐｆｕのｖＣＰ６５で筋肉内または皮下で接種した。動物の反応を観察し、ＲＦＦＩ試験（Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，１９７３）による抗狂犬病抗体の存在分析のために定期的に採血した。動物を、最初の接種から１３週間後に同じ投与量で再接種した。
マウスへの接種マウスの群を５０−１００μｌの範囲の異なったバッチのｖＣＰ６５の希釈液で接種した。マウスは足部で接種された。１４日目に、１５−４３マウスＬＤ５０の狂犬病ウイルス毒性ＣＶＳ株を頭蓋内接種で投与した。マウスの生存を観察し、５０％防御率（ＰＤ₅₀）を、接種後２８日に計算した。
イヌおよびネコへの接種生後５ヶ月の１０匹のビーグル犬および生後４ヶ月の１０匹のネコに、６．７もしくは７．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀のＡＬＶＡＣ−ＲＧを皮下で接種した。４匹のイヌおよびネコには接種しなかった。動物から接種後１４および２８日に採血し、抗狂犬病抗体をＲＦＦＩ試験で評価した。６．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀のＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した動物には接種後２９日に、３．７ｌｏｇ₁₀マウスＬＤ₅₀（イヌ）もしくは４．３ｌｏｇ₁₀マウスＬＤ₅₀（ネコ）のＮＹＧＳ狂犬病ウイルス投与株を投与した。
リスザルへの接種４匹のリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉｓｃｉｕｒｅｕｓ）の３つの群に、３つのウイルス、（ａ）ＡＬＶＡＣ、親カナリアポックスウイルス、（ｂ）ＡＬＶＡＣ−ＲＧ、狂犬病Ｇ遺伝子を発現する組換体、または（ｃ）ｖＣＰ３７、ネコ白血病ウイルスエンベローブ糖タンパク質を発現するカナリアポックス組換体、の１つを接種した。接種は、ケタミン麻酔（ｋｅｔａｍｉｎｅａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ）のもとで行った。各々の動物は同時：（１）２０μｌを右目の表面に傷付処理なしに点眼；（２）１００μｌを口内へいくつかの水滴として；（３）１００μｌを、右腕の外側表面の剃った皮膚上の２つの皮内接種部位それぞれに；（４）１００μｌを右大腿部前方筋肉中に投与された。
４匹の猿に各々のウイルスを、２匹はトータルで５．０ｌｏｇ₁₀ｐｆｕ、２匹はトータルで７．０ｌｏｇ₁₀ｐｆｕ接種した。動物から規則的な間隔で採血し、血清をＲＦＦＩ試験（Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，１９７３）を用いて抗狂犬病抗体の存在に関して分析した。動物のワクチン接種に対する反応を毎日観察した。最初の接種の６ヶ月後、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを投与された４匹の猿、最初にｖＣＰ３７を投与された２匹の猿、最初にＡＬＶＡＣを投与された２匹の猿に加えて接種されていない猿に、６．５ｌｏｇ₁₀ｐｆｕのＡＬＶＡＣ−ＲＧを皮下接種した。ＲＦＦＩ試験（Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，１９７３）により狂犬病中和抗体の存在について血清を観察した。
ヒト細胞系統へのＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種ウイルスが生産的に複製されない非鳥類種細胞中で、外来遺伝子の効率的な発現が得られるか否かを決定するため、５つの細胞型、１つは鳥類種で４つは非鳥類種を、ウイルス収量、外来狂犬病Ｇ遺伝子の発現およびウイルス特異的ＤＮＡ蓄積に関して分析した。接種された細胞は：
（ａ）Ｖｅｒｏ、アフリカミドリザル腎臓細胞、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１；
（ｂ）ＭＲＣ−５、ヒト胚肺、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１；
（ｃ）ＷＩＳＨ、ヒト羊膜、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２５；
（ｄ）デトロイト−５３２、ヒト包皮、ダウン症、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ５４；および
（ｅ）初代ＣＥＦ細胞。
１１日経過白レグホン胚から調製されたニワトリ胚繊維芽細胞を陽性コントロールとして含んだ。全ての接種は、予め形成された２ｘ１０⁶の細胞の単層について以下に記述するように行った。
ＡＤＮＡ分析の方法
３枚のそれぞれの細胞系統のディッシュを５ｐｆｕ／細胞のウイルスで試験のもとで接種し、別の１つのそれぞれの細胞系統のディッシュを接種しないでおいた。１つのディッシュは４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）の存在下で保温した。３７℃、６０分間の吸収期間の後、接種物を取り除き、単層を吸収されなかったウイルスを除去するために２回洗浄した。培地（ＡｒａＣが存在もしくは不在）は続いて置換された。１つのディッシュ（ＡｒａＣ無し）からの細胞を、時間０の試料として回収した。残りのディッシュは、３７℃で７２時間保温し、そのとき細胞を回収しＤＮＡ蓄積分析に用いた。２ｘ１０⁶の細胞それぞれは、０．５ｍｌの４０ｍＭＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、３７℃で５分間保温した。等量の、４２℃で予め保温された１２０ｍＭのＥＤＴＡを含む１．５％アガロースを細胞懸濁液に加え、穏やかに混合した。懸濁液はアガロースプラグ型へ移され少なくとも１５分固定化された。アガロースプラグを続いて取り除き、プラグを完全にカバーする量の溶解バッファー（１％サルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）、１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５、２００ｍＭＥＤＴＡ）中で１２−１６分間５０℃で保温した。溶解バッファーを、続いて５．０ｍｌの滅菌０．５ｘＴＢＥ（４４．５ｍＭトリス−ホウ酸、４４．５ｍＭホウ酸、０．５ｍＭＥＤＴＡ）で置換し、４℃で６時間にわたり３回ＴＢＥバッファーを交換して平衡化した。プラグ内のウイルスＤＮＡをパルスフィールド電気泳動により細胞ＲＮＡおよびＤＮＡと分画した。電気泳動は２０時間にわたり１８０Ｖで５０−９０秒のランプで、１５℃、０．５ｘＴＢＥ中で行った。ＤＮＡはラムダＤＮＡ分子量スタンダードとともに泳動した。電気泳動後、ウイルスＤＮＡバンドはエチジウムブロミド染色により可視化した。ＤＮＡは続いてニトロセルロース膜に移され、精製ＡＬＶＡＣゲノムＤＮＡから調製された放射性標識プローブで探索した。
Ｂ．ウイルス収量の評価
投入多重度を０．１ｐｆｕ／細胞にしたこと以外は、正確に上記のようにディッシュに接種した。感染後７２時間で、３回連続の凍結融解サイクルにより破砕した。ウイルス収量はＣＥＦ単層上のプラーク滴定により評価した。
Ｃ．狂犬病Ｇ遺伝子の発現の分析
多重度１０ｐｆｕ／細胞で、組換体もしくは親ウイルスをディッシュに接種し、さらに付加的に、１つのディッシュをウイルス感染させていない対照とした。１時間の吸収期間の後、培地を取り除きメチオニンフリーの培地で置換した。３０分の期間の後に、この培地を２５μＣｉ／ｍｌの³⁵Ｓ−メチオニンを含むメチオニンフリー培地で置換した。感染させた細胞を一晩標識し、続いてバッファーＡ溶解バッファーを添加して溶解させた。免疫沈降を、狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用いて、以前に記述されたように（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９０）行った。
結果：ウイルス収量の評価０．１ｐｆｕ／細胞での接種後７２時間後の収量の滴定の結果を表９に示す。この結果は、鳥類細胞においては生産的感染がなされうる一方で、４つの非鳥類種細胞システムでは、ウイルス収量の増加はこの方法では検出されなかったことを示唆している。
ウイルスＤＮＡの蓄積の分析生産的ウイルス複製の防御が、ＤＮＡ複製の前で行われているかもしくは後でかを決定するために、細胞破砕物由来のＤＮＡを電気泳動により分画し、ニトロセルロース膜に移し、ウイルス特異的ＤＮＡの存在を探索した。感染させなかった細胞、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させた時間０のＣＥＦ細胞、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させた感染後７２時間のＣＥＦ細胞、および４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシドの存在下でＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させた感染後７２時間のＣＥＦ細胞由来のＤＮＡは全て、いくらかの、恐らくは放射性標識ＡＬＶＡＣＤＮＡプローブの調製におけるＣＥＦ細胞ＤＮＡの混入によるバックグラウンド活性を示した。しかしながら、感染後７２時間のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞は、ＡＬＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡ蓄積を示す約３５０ｋｂｐの領域にある強いバンドを示した。このようなバンドは、培地をＤＮＡ合成阻害剤シトシンアラビノシドの存在下で保温した場合には検出されなかった。Ｖｅｒｏ細胞中で生成された相当する試料では、ＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させた時間０のＶｅｒｏ細胞において、約３５０ｋｂｐのかすかなバンドが示された。このレベルは残存ウイルスを示す。バンドの強度は、感染後７２時間には増幅されており、ウイルスの繁殖の増加とはならないＶｅｒｏ細胞において、いくらかのレベルのウイルス特異的ＤＮＡの複製が起こっていることが示唆された。ＭＲＣ−５細胞で生成された相当する試料は、この細胞系統では、これらの条件下ではウイルス特異的ＤＮＡの蓄積は検出されないことを示唆していた。この実験を続いて付加的なヒト細胞系統、特にＷＩＳＨおよびデトロイト５３２細胞を含むように拡張した。ＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞を陽性コントロールとして用意した。ＡＬＶＡＣ−ＲＧで接種した、ＷＩＳＨ、デトロイト５３２細胞のいずれにおいても、ウイルス特異的ＤＮＡ蓄積は検出されなかった。この方法の検出限界はまだ十分に確認されておらず、この方法の感度より低いレベルで、ウイルスＤＮＡ蓄積は起こっているかも知れないことは注意されるべきである。ウイルスＤＮＡ複製を³Ｈチミジンの取り込みによって測定した別の実験は、ＶｅｒｏおよびＭＲＣ−５について得られた結果を支持していた。
狂犬病Ｇ遺伝子の発現の分析いずれかの遺伝子、特に挿入した外来遺伝子の発現が、ウイルスＤＮＡ複製のないヒト細胞系列中で起こるか否かを決定するため、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させた、³⁵Ｓ−メチオニン標識された鳥類および非鳥類細胞破砕物について免疫沈降実験を行った。狂犬病Ｇ遺伝子特異的モノクローナル抗体を用いた免疫沈降の結果は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染させたＣＥＦ、ＶｅｒｏおよびＭＲＣ−５、ＷＩＳＨおよびデトロイト細胞中で６７ｋＤａの糖タンパク質の免疫沈降を示した。このような特異的狂犬病遺伝子産物は、感染させていないか又は親に感染させた細胞破砕物からは検出されなかった。
この実験の結果は、分析されたヒト細胞系統中では、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ組換体は感染を開始しＨ６ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターの転写制御のもとで外来遺伝子を発現することは可能であるが、ＤＮＡ複製を通した複製は進行せず、いかなる検出可能なウイルス繁殖の生成も見られなかった。Ｖｅｒｏ細胞中においては、いくらかのレベルでのＡＬＶＡＣ−ＲＧ特異的ＤＮＡ蓄積は見られたが、これらの方法によってはウイルス繁殖は検出されなかった。これらの結果は、分析されたヒト細胞系統中ではウイルス複製の防御はＤＮＡ複製の開始に先だって起こるが、その一方Ｖｅｒｏ細胞中では防御はウイルスＤＮＡ複製の開始に続いて起こることを示唆しているであろう。
ＡＬＶＡＣ−ＲＧにおいて発現された狂犬病糖タンパク質が免疫原性か否かを決定するため、多くの動物種をこの組換体の接種により試験した。現在の狂犬病ワクチンの効率はマウスモデルシステムで評価されている。それ故、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを用いた同様の試験を行った。９つの異なったウイルス調製物（種ウイルスを１０連続の組織培養継代後に生成されたワクチンバッチ（Ｊ）を含む）を、６．７から８．４のｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌの感染力価の範囲で連続的に希釈し、５０から１００μｌの希釈液を４匹の生後６週間のマウスの足部に接種した。マウスに１４日後に頭蓋内経路で、対照マウスグループ中の致死滴定により決定された１５から４３マウスＬＤ₅₀を含む３００μｌの狂犬病ウイルスＣＶＳ株を投与した。ＰＤ₅₀（５０％防御量）として表された能力を、投与１４日後に計算した。この実験の結果を表１０に示す。この結果から、ＡＬＶＡＣ−ＲＧは一貫して、３．３３から４．５６、平均３．３７（標準偏差０．４８）のＰＤ₅₀値の範囲で狂犬病ウイルス投与に対してマウスを防御可能であることが示された。この研究の拡散として、雄マウスを、６．０ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀のＡＬＶＡＣを含む５０μｌのウイルス、または等量の感染させていない細胞懸濁液で頭蓋内に接種した。マウスを接種後１日、３および６日に犠牲にし、脳を取り除き、固定し、分画した。組織病理学的試験により、マウス中でのＡＬＶＡＣ−ＲＧの神経毒性の証拠は無いことが示された。
ＡＬＶＡＣ−ＲＧのイヌおよびネコに対する安全性と効率を評価するため、１４の生後５ヶ月のビーグル犬の群および１４の生後４ヶ月のネコの群を試験した。それぞれの種の４匹の動物はワクチン接種されなかった。５匹の動物は６．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀を皮下投与で、５匹の動物は７．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀を同じ経路で投与された。動物は抗狂犬病抗体の分析のために採血された。接種されなかったまたは６．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀を投与された動物に、接種後２９日目に３．７ｌｏｇ₁₀マウスＬＤ₅₀（イヌ、側頭中）または４．３ｌｏｇ₁₀マウスＬＤ₅₀（ネコ、首中）のＮＹＧＳ狂犬病ウイルス投与株を投与した。この実験の結果を表１１に示した。
いずれの投与量についても、イヌ、ネコいずれにおいても接種に対する不利な反応は見られなかった。６．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀で免疫化された５匹のイヌのうちの４匹は、ワクチン接種後１４日で抗体力価を有し、２９日には全てのイヌが有していた。全てのイヌは、対照の４匹中３匹を殺すような投与に対して防御された。ネコにおいては、６．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀を投与された５匹のうち３匹が、１４日に特異的抗体力価を有し、２９日には全てのネコが陽性であったが平均抗体力価は２．９ＩＵと低かった。全ての対照を殺すような投与に対して５匹中３匹が生き残った。７．７ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀で免疫化された全てのネコは１４日に抗体力価を有し、２９日には、相乗平均力価は８．１国際単位と計算された。
リスザル（Ｓａｉｍｉｒｉｓｃｉｕｒｅｕｓ）のＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ−ＲＧおよび関係のないカナリアポックスウイルス組換体の接種に対する免疫反応を調べた。猿のグループを上記のように接種し、狂犬病特異的抗体の存在について血清分析した。皮内経路の接種に対する軽度の典型的な皮膚反応は別にして、不利な反応はいずれの猿においても見られなかった。少量の残存ウイルスが皮膚外傷から、皮下接種の後、接種後２日および４日のみに単離された。全ての検体で７日およびそれ以降は陰性だった。筋内接種に対する局部反応は無かった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧで接種された４匹の全ての猿が、ＲＦＦＩ試験で測定された抗狂犬病血清中和抗体を生産した。最初の接種から約６ヶ月後、全ての猿および１匹の付加的な接種されていない猿に、６．５ｌｏｇ₁₀ＴＣＩＤ₅₀のＡＬＶＡＣ−ＲＧを、皮下経路で左大腿部の外側表面上に再び接種した。抗狂犬病抗体の存在について血清を分析した。結果を表１２に示す。
狂犬病にかかったことのない５匹の猿のうち４匹が、ＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種後７日までに血清学的反応を生成した。接種後１１日までには、５匹の猿全てが検出可能な抗体を有していた。前に狂犬病糖タンパク質にさらした４匹の猿の、全てがワクチン接種後の３日と７日との間に顕著な血清中和力価の増加を示した。この結果はリスザルのＡＬＶＡＣ−ＲＧでのワクチン接種は、不利な副作用を引き起こさず、初期中和抗体反応が誘導されうることを示している。アムナネスティック（ａｍｎａｎｅｓｔｉｃ）反応もまた再ワクチン接種で誘導される。ＡＬＶＡＣもしくは無関係の外来遺伝子を発現するカナリアポックス組換体への事前の接種は、再ワクチン接種時の抗狂犬病免疫反応の誘導に影響しなかった。
ＨＩＶ−２血清陽性のサルのＡＬＶＡＣ−ＲＧ接種に対する免疫的反応を評価した。動物は上記のように接種され、抗狂犬病血清中和抗体の存在をＲＦＦＩ試験によって評価した。その結果は、表１３に示されているが、皮下経路で接種されたＨＩＶ−２陽性動物は、抗狂犬病抗体を１回の接種の１１日後までに生成した。アムナネスティック反応が、最初の接種の約３ヶ月後に与えられた追加免疫接種の後で検出された。経口経路で組換体を投与された動物においては反応は検出されなかった。加えて、一連の６匹の動物を、減少させた量のＡＬＶＡＣ−ＲＧで筋内または皮下経路のいずれかで接種した。接種された６匹の内の５匹が、接種後１４日までに、抗体力価に顕著な差もなく反応した。ＨＩＶに事前にさらされたチンパンジーを、７．０ｌｏｇ₁₀ｐｆｕのＡＬＶＡＣ−ＲＧで皮下もしくは筋内経路で接種した。接種後３ヶ月に、両方の動物を同じ方法で再接種した。結果を表１４に示す。
筋内もしくは皮下のいずれの経路でも、不利な反応は見られなかった。両方のチンパンジーは最初の接種に１４日までに反応し、再接種に続いて強力な上昇反応が検出された。

実施例２２狂犬病糖タンパク質を発現するカナリアポックスウイルス（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）を用いたヒトの免疫化
ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）は実施例２１および図１８Ａおよび１８Ｂで記述されたように開発された。ワクチン製造をスケールアップするために、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を特定の病原体のない卵から派生した初代ＣＥＦ細胞中で増殖させた。細胞を多重度０．０１で感染させ、３７℃で３日間保温した。
ワクチンウイルス懸濁液を、血清フリーの培地中の感染させた細胞の超音波破砕により得た；細胞破片を遠心分離と濾過により取り除いた。その結果得られた清澄化された懸濁液にリンパ形成安定剤（アミノ酸混合物）を加え、１回分の量ごとにバイアルに小分けし、凍結乾燥した。血清フリー培地およびリンパ形成安定剤中のウイルス懸濁液を１０倍ごとに連続して希釈することにより、力価が減少してゆく３つのバッチをリンパ形成に先だって調製した。
細胞基質、培地およびウイルスシードおよび最終産物の品質制御テストを、実験室齧歯類中での無害性および偶発的な作用物に注意しながら行った。望ましくない特徴は何も発見されなかった。
臨床前データ生体外での研究により、ＶｅｒｏまたはＭＲＣ−５細胞はＡＬＶＡＣ−ＲＧの増殖を支持しないことが示された；一連の８（Ｖｅｒｏ）および１０（ＭＲＣ−５）盲連続継代により、ウイルスのこれらの非鳥類細胞系統中での増殖への検出可能な適応は引き起こされなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を感染もしくは接種したヒト細胞系統（ＭＲＣ−５、ＷＩＳＨ、デトロイト５３２、ＨＥＬ、ＨＮＫもしくはＥＢＶを形質転換したリンパ芽球細胞）の分析で、ウイルス特異的ＤＮＡの蓄積は見られず、これらの細胞内においてはＤＮＡ合成に先だって複製のブロックが起きていることが示唆された。しかしながら、重要なことには、狂犬病ウイルス糖タンパク質遺伝子の発現は、試験された全ての細胞系統において、カナリアポックス複製サイクルの中止段階はウイルスＤＮＡ複製に先だって行われることを示している。
ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の安全性および効率は、動物における一連の実験で立証された。カナリア、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、実験室齧歯類（乳児および成マウス）、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコおよびイヌ、リスザル、サル科マカク属のサル、およびチンパンジーに、１０⁵から１０⁸ｐｆｕの範囲にある量を接種した。多様な経路が用いられ、もっとも一般的には皮下、筋内および皮内であったが、経口（サルおよびマウス）および頭蓋（マウス）内も用いられた。
カナリアにおいては、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）は乱切部位において「受け入れ」外傷を、病気の兆候または死を伴わずに引き起こした。ウサギへの皮内接種は、拡散せずに７−１０日で治る典型的なポックス接種反応を引き起こした。これらの動物実験のいずれにおいても、カナリアポックスによる望ましくない副作用は見られなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の接種に続いて、齧歯類、イヌ、ネコ、および霊長類において、高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ）で測定された抗狂犬病抗体が生産されたことにより、免疫原性が立証された。ＡＬＶＡＣ−ＲＧで免疫化されたマウス、イヌ、およびネコにおける狂犬病ウイルス投与実験により、防御が立証された。
ボランティア２５人の健康な、２０−４５歳の年齢で、以前に狂犬病免疫の経歴のない成人を登録した。彼らの健康状態を完全な医学的経歴、生理的試験、血液学および血液化学分析により評価した。除外基準には、妊娠、アレルギー、あらゆる種類の免疫抑制、慢性衰弱病、ガン、過去３ヶ月以内の免疫グロブリンの注入、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＢ型肝炎表面抗原に対する血清陽性が含まれていた。
研究計画参加者に無作為に標準ヒト二倍体細胞狂犬病ワクチン（ＨＤＣ）バッチ番号Ｅ０７５１（ＰａｓｔｅｕｒＭｅｒｉｅｕｘＳｅｒｕｍｓ＆Ｖａｃｃｉｎｅ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）または研究用ワクチンＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を割り当てた。
この試みは量増加研究と命名された。実験用ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ワクチンの３つのバッチは、３つのグループのボランティア（グループＡ、ＢおよびＣ）に順番に、各々の段階の間に２週間の間隔を置いて用いられた。３つのバッチの濃度はそれぞれ、１０^3.5、１０^4.5、１０^5.5組織培養感染量（ＴＣＩＤ₅₀）／投与量であった。
それぞれのボランティアは、同じワクチンを４週間の間隔をおいて三角筋領域に皮下で２投与量投与された。注入されたワクチンの本質は、最初の接種時には参加者には知られていなかったが、調査者には知られていた。
２回目の注入時の、即時ヘルペス感受性の危険を最小化するため、実験ワクチンの中程度の量を割り当てられたグループＢのボランティアは、少ない量を１時間前に接種され、大量を割り当てられたグループＣは、少量および中程度の量を１時間の間隔をおいて連続的に投与された。
６ヶ月後、最も多い投与量のＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）（グループＣ）およびＨＤＣワクチンの被験者に、３回目の量のワクチンを要請した；彼らは無作為に、前回と同じワクチンを投与されるるかまたは別のワクチンを投与された。その結果、以下の免疫化の手順に相当する４種類のグループが形成された。１．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＨＤＣ；２．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）；３．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＨＤＣ；４．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）。
副作用の観察全ての対象を注入後１時間観察し、次の５日間毎日再検査した。彼らは局所的および全体的反応を次の３週間記録するよう要請され、１週間に２回問診された。
実験室調査者登録前およびそれぞれの接種後２、４および６日後の血液試料を得た。分析は、全血液細胞計数、肝臓酵素およびクレアチンキナーゼアッセイを含んでいた。
抗体アッセイ最初の注入の７日前および、研究の７、２８、３５、５６、１７３、１８７および２０８日に抗体アッセイを行った。
狂犬病に対する中和抗体のレベルは、高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ）（Ｓｍｉｔｈ＆Ｙａｅｇｅｒ、ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｎＲａｂｉｓ中）を用いて決定した。カナリアポックス抗体は直接ＥＬＩＳＡにより測定した。抗原である、ＴｒｉｔｏｎＸ１００で破壊した精製カナリアポックスウイルスの懸濁液をマイクロプレートにコートした。固定化された血清の希釈液を室温で２時間反応させ、反応している抗体はペルオキシダーゼで標識化された抗ヒトＩｇＧヤギ血清で明らかとされた。この結果は４９０ｎｍの光学密度により表されている。
分析２５人の対象が登録され、研究を実行された。１０人の男性と１５人の女性で平均年齢は３１．９歳であった（２１から４８まで）。３人を除く全ての対象が以前に天然痘ワクチンの証拠を有していた；残りの対象の３人は典型的な傷跡もワクチン接種経歴も有してはいなかった。３人の対象は少量の実験用ワクチン（１０^3.5、１０^4.5ＴＣＩＤ₅₀）の投与量で投与され、９人の対象は１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀の投与量で投与され、１０人はＨＤＣワクチンを投与された。
安全性（表１４）最初のシリーズの免疫化の間、接種後２４時間以内に３７．７℃を超える熱が、１人のＨＤＣ被験者（３７．８℃）および１人のｖＣＰ６５１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀の被験者（３８℃）において見られた。ワクチン接種に帰属される他の全体的反応はいずれの被験者においても観察されなかった。
局所的反応は皮下でＨＤＣワクチンを接種された被験者１０人中９人で見られ、ｖＣＰ６５の１０^3.5、１０^4.5、１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀での被験者ではそれぞれ３人中０人、３人中１人および９人中９人であった。
圧痛はもっとも一般的な兆候であったが、つねに穏やかであった。他の局所的兆候には、穏やかで一過性の赤化と硬化が含まれていた。全ての兆候は通常２４時間以内に沈静化し、７２時間以上は続かなかった。
血液細胞計数、肝臓酵素あるいはクレアチンキナーゼの値に顕著な変化は無かった。
免疫反応；狂犬病に対する中和抗体（表１６）最初の注入から２８日後に全てのＨＤＣ被験者は防御的力価（０．５ＩＵ／ｍｌ以上）を有していた。これとは対照的に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の被験者は、グループＡおよびＢ（１０^3.5、１０^4.5、ＴＣＩＤ₅₀）では０人が、グループＣ（１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀）では９人中２人のみがこの防御的力価に達していた。
５６日目（即ち第２の接種から２８日後）には、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の被験者のうち、グループＡでは３人中０人、グループＢでは３人中２人、およびグループＣでは９人中９人においてこの防御的力価が達成され、１０人のＨＤＣ被験者の全てにおいても保持されていた。
５６日の相乗平均力価は、グループＡ、Ｂ、ＣおよびＨＤＣそれぞれにおいて０．０５、０．４７、４．４および１１．５ＩＵ／ｍｌであった。
１８０日には、全ての対象において狂犬病抗体力価は実質的に減少していたが、ＨＤＣ被験者１０人中５人、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）被験者９人中５人において最小防御力価である０．５ＩＵ／ｍｌより大きく残存していた；相乗平均力価はグループＨＤＣおよびグループＣで、それぞれ０．５１および０．４５ＩＵ／ｍｌであった。
カナリアポックスウイルスに対する抗体（表１７）観察された免疫化前力価は、高い力価を示した対象が事前のカナリヤに接触していなかったにも拘わらず、力価０．２２から１．２３Ｏ．Ｄ．単位で広く変化していた。免疫化前と２回目の免疫化後の力価との間での２倍より大きい増加と定義した場合、血清変換はグループＢでは対象３人中１人、グループＣでは対象９人中９人で得られたが、ＨＤＣまたはグループＡでは対象は１人も血清変換されなかった。
追加免疫注入ワクチンは同様に６ヶ月後の追加免疫接種時にも十分耐性があった：ＨＤＣ追加免疫被験者９人中２人で、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加免疫被験者１０人中１人で熱がみられた。局所的反応はＨＤＣ追加免疫被験者９人中６人で、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加免疫被験者９人中５人でみられた。
観察図２２Ａ−２２Ｄは、狂犬病中和抗体力価（高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ）ＩＵ／ｍｌ）を示している：同じまたは別のワクチンで予め免疫化されたボランティア体内におけるＨＤＣおよびｖＣＰ６５（１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀）の追加免疫効果。ワクチンは０、２８および１８７日および２０８日に与えられた。０、７、２８、３５、５６、１７３および１８０日に抗体力価を測定した。
図２２Ａ−２２Ｄに示されるとおり、与えられた追加免疫量は免疫化の方式に拘わらず全ての対象中で、狂犬病抗体力価のさらなる増加をもたらした。しかしながら、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加免疫は全体的に、ＨＤＣ追加免疫より低い免疫反応を誘導し、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）グループは他の３つのグループより顕著に低い力価を有していた。同様に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加免疫注入は、ＨＤＣワクチンを以前に投与された対象５人中３人、および以前にＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）で免疫化された対象５人すべてにおいて、カナリアポックス抗体力価の増加をもたらした。
全体として、ｖＣＰ６５の投与による局所的副作用は、ウイルスの局所的増殖を示すものではなかった。特に、ワクチンの注入後にみられる等の皮膚の外傷は無かった。見かけ上のウイルスの複製が無かったにも拘わらず、注入はボランティアにおいて大量のカナリアポックスベクターおよび発現された狂犬病糖タンパク質の両方に対する抗体の生産をもたらした。
狂犬病中和抗体は、マウス中の血清中和試験と相関することが知られている高速蛍光焦点阻害試験（ＲＦＦＩＴ）によりアッセイした。１０^5.5ＴＣＩＤ₅₀の被験者９人のうち、５人は最初の量の後より少ないレベルの反応を示した。狂犬病抗体の防御的力価が、２回目の接種の後で、試験された多量の被験者の全て、および、中程度の量の被験者においてすら３人中２人において得られた。この研究において、両方のワクチンは、生ワクチンで推奨されているが不活性化ＨＤＣにはされていない、皮下経路で投与された。この接種経路は、接種部位を注意深く観察するのに最適であるために選択されたが、これによりＨＤＣ被験者における抗体の遅い出現が説明できる：事実、ＨＤＣ被験者は７日には１人も抗体増加を有していなかったが、ＨＤＣワクチンが筋肉で投与された殆どの研究においては、かなりの割合の対象が有している（Ｋｌｉｅｔｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｉｎｔ’ｌＧｒｅｅｎＣｒｏｓｓ−ｇｅｎｅｖａ，１９８１；Ｋｕｗｅｒｔｅｔａｌ．，Ｉｎｔ’ｌＧｒｅｅｎＣｒｏｓｓ−Ｇｅｎｅｖａ，１９８１）。しかしながら、本発明は必ずしも皮下経路の投与に限定されない。
狂犬病中和抗体のＧＭＴ（相乗平均）は、試験しているワクチンはＨＤＣ対照よりも低かったが、しかし防御に要求される最小値よりも十分に上だった。本研究で用いられた３種類の投与量について得られた明白な投与量効果反応は、より多量の投与量はより強力な反応を誘導するかもしれないことを示唆している。この開示から確かに、当業者は、委された患者に対する適切な量を選択できる。
抗体反応を上昇させる能力は、もう一つのこの実施例の重要な結果である；事実、狂犬病抗体力価は量、どの免疫化の方式でも、６ヶ月後に全ての対象において得られ、カナリアポックスベクターまたは狂犬病糖タンパク質によって以前に誘導された免疫性は組換えワクチン候補株または従来のＨＤＣ狂犬病ワクチンによる追加免疫にブロック効果を有さないことが示された。このことは、他のワクシニアウイルス組織体に関する、以前から存在する免疫によってヒトにおいて免疫反応はブロックされるという発見と対照をなす（Ｃｏｏｎｅｙｅｔａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ１９９１，３３７：５６７−７２；Ｅｔｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ９：４７０−７２，１９９１）。
このように、この実施例は、非複製的ポックスウイルスが動物もしくは人間において免疫化ベクターとして、複製作用物は免疫反応を与えるという利点があるが、十分に伝播性であるウイルスによって引き起こされる安全性の問題をともなわずに利用可能であることが明白に示された。

実施例２３ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡのＬＤ ₅₀ の様々なワクシニアウイルス株との比較
マウス雄の異系交配されたスイスウェブスターマウス（ＳｗｉｓｓＷｅｂｓｔｅｒｍｉｃｅ）を、タコニックファーム（ＴａｃｏｎｉｃＦａｒｍ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）より購入し、マウス用食事および水ａｄｌｉｂｉｔｕｍで生後３週間で使用するまで育てた（「通常」マウス）。両方の性の新生異系交配スイスウェブスターマウスを、タコニックファームで行われた続いての定期の妊娠により得た。用いられた全ての新生マウスは２日間の期間内に配達された。
ウイルスＡＬＶＡＣはカナリアポックスウイルス集団のプラーク精製により派生し、初代ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）中で調製された。ショ糖密度勾配遠心分離による精製に続いて、ＣＥＦ細胞中でプラーク形成単位を数え上げた。ワクシニアウイルスＷＲ（Ｌ）変異体は、ＷＲの大プラーク表現型の選択により派生された（Ｐａｎｉｃａｌｉｅｔａｌ．，１９８１）。ニューヨーク州保健委員会ワクシニアウイルスワクチン株であるＷｙｅｔｈは、ＰａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＣａｌｆＬｙｍｐｈＴｙｐｅワクチンＤｒｙｖａｘ、制御番号３０２００１Ｂより得た。コペンハーゲン株ワクシニアウイルスＶＣ−２をＩｎｓｔｉｔｕｔＭｅｒｉｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅより得た。ワクシニアウイルス株ＮＹＶＡＣはコペンハーゲンＶＣ−２から派生された。Ｗｙｅｔｈ株を除く全てのワクシニアウイルス株をＶｅｒｏアフリカミドリザル腎臓細胞中で培養し、ショ糖密度勾配遠心分離により精製しそしてＶｅｒｏ細胞上でのプラーク形成単位を数え上げた。Ｗｙｅｔｈ株はＣＥＦ細胞中で増殖させ、ＣＥＦ細胞中で数え上げた。
接種１０匹の通常マウスに、ストック調整物を滅菌リン酸緩衝生理食塩水で１０倍づつ連続的に希釈したいくつかの希釈液の１つを、０．０５ｍｌ頭蓋内経路（ｉｃ）で接種した。いくつかの場合には、希釈しないストックウイルス調製物を接種に用いた。
１０匹の、生後１日または２日の新生マウスのグループに、通常マウスと注入量が０．０３ｍｌで用いられたこと以外は同じようにｉｃで接種した。
全てのマウスについて、接種後１４日（新生マウス）または２１日（通常マウス）の期間にわたり、毎日死亡率を観察した。接種の次の朝に死んでいるのが見つかったマウスは、トラウマによる死の可能性があるので除外した。
実験集団の死亡率５０％を達成するために要求される致死量（ＬＤ₅₀）をＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの比例法により測定した。
ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣの、通常マウスおよび、若異系交配マウスに対するｉｃ経路でのＬＤ ₅₀ と、様々なワクシニアウイルス株との比較若マウス、通常マウスにおけるＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの毒性は、他の試験されたワクシニアウイルスよりも数桁のオーダーで低かった（表１８）。ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣは、Ｗｙｅｔｈ株より通常マウス中で３０００倍以上も毒性が低いこと；１２５０００倍以上も親ＶＣ−２より毒性が低いこと；および６３００００００倍もＷＲ（Ｌ）派生体よりも毒性が低いことが判明した。これらの結果は、ＮＹＶＡＣは他のワクシニア株と比較して高度に弱毒化されていること、および、両方とも極端に大量（３．８５ｘ１０⁸ｐｆｕ；ＡＬＶＡＣおよび３ｘ１０⁸ｐｆｕ；ＮＹＶＡＣ）に頭蓋内経路で接種すると、まだ同定されていない機構によってマウスにおいて死を引き起こすが、ＡＬＶＡＣは一般的に頭蓋内経路で投与された場合には若マウスにおいて非毒性であること、を示唆しているであろう。
ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣの、新生異系交配マウスに対するｉｃ経路でのＬＤ ₅₀ と、様々なワクシニアウイルス株との比較５つのポックスウイルス株の相対毒性を、通常、新生マウスに対して頭蓋内（ｉｃ）投与モデルシステムにおいて滴定により試験した（表１９）。終了点としての死亡率に関し、ＬＤ₅₀値は、ＡＬＶＡＣは１０００００倍以上もワクシニアウイルスＷｙｅｔｈ株よりも非毒性であること；ワクシニアウイルスコペンハーゲンＶＣ−２株より２０００００倍以上も非毒性であること；およびワクシニアウイルスＷＲ−Ｌ株より２５００００００倍以上も非毒性であることが示された。にもかかわらず、試験された最も多量の投与量６．３ｘ１０⁷ｐｆｕでは、死亡率１００％という結果であった。６．３ｘ１０⁶ｐｆｕでは、３３．３％という死亡率であった。死の原因は、実際に決定されてはいないが、最も多量の投与量（約６．３ＬＤ₅₀）のグループの平均生存時間（ＭＳＴ）は６．７プラスマイナス１．５日だったので、毒物学的またはトラウマ的本質ではないようであった。５ＬＤ₅₀の投与量ではＭＳＴが４．８プラスマイナス０．６日であるＷＲ（Ｌ）と比較した場合、ＡＬＶＡＣのＭＳＴは顕著に長かった（Ｐ＝０．００１）。
ＮＹＶＡＣと比較して、Ｗｙｅｔｈは１５０００倍以上も毒性であり；ＶＣ−２は３５０００倍以上も毒性であり；ＷＲ（Ｌ）は３００００００倍以上も毒性であった。ＡＬＶＡＣと同様に、最も多量の２つのＮＹＶＡＣ投与量６ｘ１０⁸ｐｆｕおよび６ｘ１０⁷ｐｆｕは、１００％の死亡率を引き起こした。しかしながら、３８０ＬＤ₅₀に相当する、最も多量に投与されたマウスのＭＳＴはたったの２日であった（９匹が２日に死に、１匹が４日に死んだ）。これと対照的に、最も多量の５００ＬＤ₅₀に相当するＷＲ−Ｌを投与された全てのマウスは、４日まで生存した。

実施例２４ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）およびＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）の評価
免疫沈降事前に形成された鳥類もしくは非鳥類細胞の単層に１０ｐｆｕ／細胞の親ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）もしくはＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）ウイルスを接種した。接種をメチオニンフリーで２％の透析牛胎児血清を添加したＥＭＥＭ中で接種を行った。１時間の保温の後で、接種物を除去し、培地を２０μＣｉ／ｍｌの^3.5Ｓ−メチオニンを含むＥＭＥＭ（メチオニンフリー）で置換した。一晩、約１６時間の保温の後、細胞をバッファーＡ（１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、１０ｍＭトリスｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０１％アジ化ナトリウム、５００単位／ｍｌのアプロチニンおよび０．０２％フェニルメチルスルフォニルフロリド）の添加により溶解させた。免疫沈降を、Ｃ．Ｔｒｉｍａｒｃｈｉ博士、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ研究所、ニューヨーク州保健部、Ａｌｂａｎｙ、ニューヨークによって供給された２４−３Ｆ１０と命名された、狂犬病糖タンパク質特異的モノクローナル抗体、およびベーリンガーマンハイム社より得られたラット抗マウス接合体（型番＃６０５−５００）を用いて行った。ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージーより得られたプロテインＡセファロースＣＬ−４８を支持マトリクスとして用いた。免疫沈降沈殿物は、Ｄｒｅｙｆｕｓｓｅｔａｌ．（１９８４）の方法に従って１０％ポリアクリルアミドゲルにより分画した。ゲルを固定化し、間接撮影用に１Ｍサリチル酸ナトリウムで１時間処理し、免疫沈降されたタンパク質種を視覚化するためにコダックＸＡＲ−２フイルムに曝露した。
動物の起源ニュージーランド白ウサギはＨａｒｅ−Ｍａｒｌａｎｄ（Ｈｅｗｉｔｔ、ニュージャージー）より得た。生後３週間の雄のスイスウェブスター異系交配マウス、定期妊娠雌スイスウェブスター異系交配マウス、および生後４週間のスイスウェブスターヌード（ｎｕ⁺ｎｕ⁺）マウスはタコニックファーム社（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ニューヨーク）より得た。全ての動物はＮＩＨガイドラインに従って維持された。全ての動物プロトコルはＩＡＣＵＣ協会で承認されている。必要と思われるときは、明らかに末期的病状のマウスは安楽死させた。
ウサギにおける外傷２匹のウサギの各々に、皮下で複数の部位に、それぞれ１０⁴、１０⁵、１０⁶、１０⁷または１０⁸ｐｆｕの試験用ウイルスを含むＰＢＳまたはＰＢＳのみを０．１ｍｌ接種した。ウサギを４日から外傷が治るまで毎日観察した。硬化および潰瘍化を測定し記録した。
接種部位からのウイルスの回収１匹のウサギに、皮下で複数の部位に、１０⁶、１０⁷、１０⁸ｐｆｕの試験用ウイルスを含むＰＢＳまたはＰＢＳのみを０／１ｍｌ接種した。１１日後、ウサギを安楽死させ、接種部位それぞれから採取された皮膚生検試料を、機械的破壊および直接的ではない超音波によって無菌的に、ウイルス回収のために調製した。感染可能なウイルスはＣＥＦ単層上でのプラーク滴定によりアッセイした。
マウス中での毒性マウス１０匹、またはヌードマウス実験では５匹のグループを、いくつかの０．５ｍｌの滅菌ＰＢＳ中のウイルス希釈液のうちの１つで、ｉｐ接種した。実施例２３を参照した。
シクロホスファミド（ＣＹ）処理マウスをｉｐ経路で４ｍｇ（０．０２ｍｌ）のＣＹ（ＳＩＧＭＡ）で−２日に接種し、続いて０日にウイルスを接種した。感染後に続く日々には、マウスにＣＹをｉｐ接種：１日には４ｍｇ；４、７および１１日には２ｍｇ；１４、１８、２１、２５および２８日には３ｍｇ。免疫抑制を間接的にクルターカウンター（ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｕｎｔｅｒ）により１１日に白血球を計数することにより観察した。平均白血球数は処理されていないマウス（ｎ＝４）で１μｌあたり１３５００細胞、ＣＹ処理対照マウス（ｎ＝５）で１μｌあたり４２２０細胞であった。
ＬＤ ₅₀ の計算死亡率５０％をなすために必要な致死量（ＬＤ₅₀）を、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの比例法（ＲｅｅｄａｎｄＭｕｅｎｃｈ，１９３８）により決定した。
ＮＹＶＡＣ−ＲＧのマウス中での能力試験生後４−６週間のマウスに、５０から１００μｌのＶＶ−ＲＧ（Ｋｉｅｎｙｅｔａｌ．，１９８４）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９１ｂ）、またはＮＹＶＡＣ−ＲＧのいずれかの、２．０−８．０ｌｏｇ₁₀組織培養感染量５０％（ＴＣＩＤ₅₀）を含む希釈液を足部に接種した。各々のグループは８匹のグループからなっていた。接種後１４日に、マウスに脳内接種で１５ＬＤ₅₀の狂犬病ウイルスＣＶＳ株を投与した（０．０３ｍｌ）。２８日には、生存したマウスを数え、防御量５０％（ＰＤ₅₀）を計算した。
ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）の誘導ワクシニアウイルスＮＹＶＡＣは、コペンハーゲンワクチン株のプラーククローン単離体であるＶＣ−２から開発された。ＶＣ−２からＮＹＶＡＣを開発するために、多くの毒性に関与するウイルス機能を含む１８のワクシニアＯＲＦを、一連の連続的操作によりこの開示の前の部分で記述したように精密に欠失させた。これらの欠失は、新しい所望でないＯＲＦが現れることを防ぐために計画された方式で構築した。図１９はＮＹＶＡＣを開発するために欠失されたＯＲＦを模式的に示している。図１９の上部は、ワクシニアウイルスゲノム（ＶＣ−２プラーク単離体、コペンハーゲン株）のＨｉｎｄＩＩＩ制限地図を示している。拡大部分は、ＮＹＶＡＣの開発において連続的に欠失されたＶＣ−２の６つの領域である。この欠失はこの開示の前の部分で記述されている（実施例１３から１８）。以下に、座からＯＲＦが欠失された欠失座を、機能もしくはホモロジーおよびそれらの遺伝子産物の分子量とともに列記する。
ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣのヒト組織細胞系統上での複製の研究ヒト起源の細胞中でのワクシニアウイルスＮＹＶＡＣ株（ｖＰ８６６）の複製のレベルを決定するために、６種類の細胞系統に、細胞あたり０．１ｐｆｕの投入多重度で液体培地に接種し、７２時間保温した。平行して、コペンハーゲン親クローン（ＶＣ−２）も接種した。初代ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞（１０−１１日経過したＳＰＦ起源の受精卵から得た、Ｓｐａｆａｓ、Ｉｎｃ．，Ｓｔｏｒｒｓ、ＣＴ）を、全てのウイルスに対する許容的細胞基質を代表させて含めた。培養を２つの基準：生産的ウイルス複製の発生および外因性抗原の発現、に基づいて分析した。
多数のヒト派生細胞中でのＮＹＶＡＣの複製能力を図２０に示した。ＶＣ−２およびＮＹＶＡＣは両方ともＣＥＦ細胞中で生産的に複製可能であったが、ＮＹＶＡＣは僅かに収量が減少した。ＶＣ−２は、試験された６種類のヒト派生細胞系統のうち、ＥＢＶ形質転換リンパ芽球細胞系統ＪＴ−１（エプスタイン−バーウィルスで形質転換されたヒトリンパ芽球細胞系統、Ｒｉｃｋｉｎｓｏｎｅｔａｌ．，１９８４を参照）を除いて、匹敵する収量で生産的に複製可能であった。これに反し、ＮＹＶＡＣは、いずれの試験されたヒト派生細胞系統においてもその生産的複製能力において高度に減衰されていた。残存ウイルスレベル以上の感染可能なウイルスの少量の増加が、ＮＹＶＡＣに感染させたＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１、ヒト胚肺起源）、デトロイト５３２（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ５４、ヒト包皮、ダウン症）、ＨＥＬ２９９（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１３７、ヒト胚肺細胞）およびＨＮＫ（ヒト新生児腎臓細胞、ＷｈｉｔｔｉｋｅｒＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、型番＃７０−１５１）細胞より得られた。これらの細胞系統における複製は、ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞から得られた収量、または親ＶＣ−２（表２０）と比較して、顕著に減少していた。ＮＹＶＡＣおよびＶＣ−２のＣＥＦ細胞中の２４時間での収量は７２時間での収量と同等であったことは注目すべきである。ヒト細胞系統培養をさらに４８時間（さらに２回のウイルス増殖サイクル）保温することは、従って、得られる相対ウイルス収量を増幅させるかもしれない。
ヒト派生細胞系統ＭＲＣ−５およびデトロイト５３２において得られる低レベルのウイルス収量と一致して、検出可能であるが減少したレベルでのＮＹＶＡＣ特異的ＤＮＡ蓄積がみられた。ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞でみられたものと関連して、ＭＲＣ−５およびデトロイト５３２ＮＹＶＡＣ感染細胞系統ＤＮＡ蓄積レベルの相対ウイルス収量を比較した。ＮＹＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡ蓄積はいずれの他のヒト派生細胞においても観察されなかった。
同等の実験をアビポックスウイルスＡＬＶＡＣを用いて行った。ウイルス複製の結果は表２０に示す。カナリアポックスウイルスの鳥類種への宿主制限と一致して、子ウイルスはいずれのヒト細胞系統においても検出されなかった。ＡＬＶＡＣがこれらのヒト派生細胞内で生産的複製の欠失は、ＡＬＶＡＣ特異的ＤＮＡ蓄積がいずれのヒト派生細胞系統においても検出されなかったという観察とも一致している。
ヒト細胞中でのＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）による狂犬病糖タンパク質の発現効率的な外来遺伝子の発現が、顕著なレベルの生産的ウイルス複製の存在無しに得られるか否かを決定するために、同じ細胞系統を、狂犬病ウイルス糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣ組換ウィルス（ｖＰ８７９、実施例１９）³⁵Ｓメチオニン存在下で接種した。放射性標識された培養破砕物から、狂犬病糖タンパク質特異的モノクローナル抗体を用いて狂犬病糖タンパク質の免疫沈降を行った。６７ｋＤａのタンパク質の免疫沈降が検出され、狂犬病糖タンパク質の完全グリコシル化型と一致していた。血清学的に交叉反応する生産物は、非感染もしくは親ＮＹＶＡＣ感染細胞破砕物においては検出されなかった。分析された他の全てのヒト細胞においても同様の結果が得られた。
ウサギ皮膚への接種皮内（ｉｄ）接種に続くウサギの外傷の誘導および本質が、ワクシニアウイルスの病原性の尺度として、以前から用いられている（Ｂｕｌｌｅｒｅｔａｌ．，１９８８；Ｃｈｉｌｄｅｔａｌ．，１９９０；Ｆｅｎｎｅｒ，１９５８；Ｆｌｅｘｎｅｒｅｔａｌ．，１９８７；ＧｈｅｎｄｏｎａｎｄＣｈａｒｎｏｓ，１９６４）。故に、ワクシニア株ＷＲ（ＡＴＣＣ＃ＶＲ１１９、ＣＶ−１細胞ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ７０上でプラーク精製、およびＬ変異体と命名されたプラーク単離体、ＡＴＣＣ＃ＶＲ２０３５Ｐａｎｉｃａｌｉｅｔａｌ．，１９８１に記載の通りに選択）、Ｗｙｅｔｈ（ＡＴＣＣ＃ＶＲ３２５、ＤＲＹＶＡＣとして流通、ＷｙｅｔｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍａｒｉｅｔｔａ、ＰＡ）、コペンハーゲン（ＶＣ−２）、およびＮＹＶＡＣでのｉｄ接種と関連した外傷の本質を、２匹のウサギ（Ａ０６９およびＡ１２８）への接種により評価した。２匹のウサギは、ウイルスに対して異なった全体的感受性を示し、ウサギＡ１２８はウサギＡ０６９よりも深刻ではない反応を示した。ウサギ１２８Ａにおいては、外傷は比較的小さく接種後２７日までに治癒した。ウサギＡ０６９においては、外傷は強烈で、特にＷＲ接種部位に対してひどく、４９日後にようやく治癒した。外傷の強度は、リンパ排出経路に関連して接種部位にもまた依存していた。特に、背脊椎上に位置した部位ではより強烈な外傷を示し、側腹部に位置した外傷を治癒するためにはより長い時間を要した。全ての外傷を、４日から最後の外傷が消失するまで毎日測定し、最大の外傷の大きさと治癒に要した日数の平均を計算した（表２１）。対照ＰＢＳを接種した部位からは局所反応は観察されなかった。潰瘍化外傷がワクシニアウイルス株ＷＲ、ＶＣ−２およびＷｙｅｔｈを接種した部位で観察された。重要なことには、ＮＹＶＡＣを接種した部位では潰瘍化または硬化した外傷は観察されなかった。
感染可能なウイルスの接種部位での持続性これらのウイルスの接種部位での相対持続性を評価するため、ウサギに対して、皮内経路で複数の部位に、１０⁶、１０⁷または１０⁸ｐｆｕのＶＣ−２、ＷＲ、ＷｙｅｔｈまたはＮＹＶＡＣを含む０．１ｍｌのＰＢＳを接種した。各々のウイルスは、１０⁷ｐｆｕ量を背脊椎上に、１０⁶および１０⁸量を隣接させて位置させた。接種部位を１１日間毎日観察した。ＷＲは最も強烈な反応を誘導し、ＶＣ−２およびＷｙｅｔｈが続いた（表２２）。潰瘍化は最初に９日目にＷＲおよびＷｙｅｔｈで、１０日目にＶＣ−２で観察された。ＮＹＶＡＣまたは対照ＰＢＳを接種した部位は潰瘍化も硬化も示さなかった。接種後１１日目に、接種部位から皮膚試料を切り出し、機械的に破壊し、ウイルスをＣＥＦ細胞で滴定した。結果を表２２に示す。この時点で、投与された以上のウイルスが回収された例は無かった。ワクシニア株ＷＲの回収は、投与ウイルス量に関係なく約１０⁶ｐｆｕであった。ワクシニア株ＷｙｅｔｈおよびＶＣ−２の回収は投与量に関係なく１０³から１０⁴ｐｆｕであった。感染可能なウイルスはＮＹＶＡＣ接種部位から回収されなかった。
遺伝的もしくは化学的免疫欠損マウスの接種大量のＮＹＶＡＣ（５ｘ１０⁸ｐｆｕ）またはＡＬＶＡＣ（１０⁹ｐｆｕ）を腹腔経路でヌードマウスに接種したが、１００日間の観察期間にわたって死亡、外傷および明白な病気もみられなかった。これと対照的に、ＷＲ（１０³から１０⁴ｐｆｕ）、Ｗｙｅｔｈ（５ｘ１０⁷または５ｘ１０⁸ｐｆｕ）もしくはＶＣ−２（１０⁴から１０⁹ｐｆｕ）を接種したマウスは、伝播した典型的なポックスウイルス外傷を、最初はつま先、次に尾に示し、続いていくつかの動物においては深刻な睾丸炎を示した。ＷＲまたはＷｙｅｔｈを感染させたマウスにおいては、伝播した外傷の現れは総じて最後には死へとつながっていたが、ＶＣ−２に感染させたマウスは殆どは最後には回復した。計算されたＬＤ₅₀値は表２３に示されている。
特に、ＶＣ−２を接種されたマウスは、つま先に、１から２日後には尾に外傷（赤い丘疹）を示した。これらの外傷は接種後（ｐｉ）１１から１３日の間に最も高い投与量のマウスにおいて（１０⁹、１０⁸か、１０⁷かおよび１０⁶ｐｆｕ）、ｐｉ１６日には１０⁵ｐｆｕ投与されたマウス、およびｐｉ２１日には１０⁴ｐｆｕ投与されたマウスにおいて起こった。１０³および１０²ｐｆｕを接種したマウスにおいては、１００日の観察期間の間は外傷はみられなかった。ｐｉ２３日には、１０⁹および１０⁸ｐｆｕを接種したマウスにおいて、７日後には他のグループ（１０⁷から１０⁴ｐｆｕ）において睾丸炎がみられた。睾丸炎は特に１０⁹および１０⁸ｐｆｕグループにおいて強烈で、減少してはいたものの、１００日間の観察の終わりまで観察された。いくつかの、ｐｉ３０−３５日頃に起じてきた痘様外傷が、２、３のマウスの皮膚上にみられた。殆どの痘外傷は通常はｐｉ６０−９０日の間に治癒した。１０⁹ｐｆｕを接種したグループのマウスが１匹だけ死に（ｐｉ３４日）、１０⁸ｐｆｕを接種したグループのマウスが１匹だけ死んだ（ｐｉ９４日）。ＶＣ−２を接種されたマウスにおいて他に死亡は観察されなかった。
１０⁴ｐｆｕのワクシニアＷＲ株を接種したマウスはｐｉ１７日で痘外傷を示し始めた。これらの外傷はＶＣ−２を注入されたマウスによって示された（つま先、尾と拡がる）外傷と同様に現れた。１０³ｐｆｕのワクシニアＷＲ株を接種したマウスはｐｉ３４日まで外傷を示さなかった。睾丸炎は最も多量のＷＲ（１０⁴ｐｆｕ）を接種したマウスにおいてのみみられた。観察期間の後半の間、外傷は口の周りに現れ、マウスは摂食を停止した。１０⁴ｐｆｕのワクシニアＷＲ株を接種したマウスは全て、ｐｉ２１日から３１日の間に死ぬか必要と思われたときは安楽死させた。１０³ｐｆｕのワクシニアＷＲ株を接種したマウス５匹のうち４匹はｐｉ３５日から５７日の間に死ぬか、必要と思われるときには安楽死させた。低いＷＲの投与量（１から１００ｐｆｕ）を接種されたマウスにおいて死亡は観察されなかった。
ワクシニアウイルスＷｙｅｔｈ株を多量に（５ｘ１０⁷ｐｆｕおよび５ｘ１０⁸ｐｆｕ）接種されたマウスはつま先と尾に外傷を示し、睾丸炎を起こし、死んだ。５ｘ１０⁶ｐｆｕもしくはこれ以下のＷｙｅｔｈを注入されたマウスは病気もしくは外傷の兆候を示さなかった。
表２３に示されるとおり、ＣＹ処理マウスは、ヌードマウスよりも高感度なポックスウイルス毒性アッセイモデルを提供した。ワクシニアウイルス株ＷＲ、ＷｙｅｔｈおよびＶＣ−２に対するＬＤ₅₀値は、このモデルシステムにおいては、ヌードマウスモデルにおけるよりも顕著に低かった。さらに、以下に示すように、Ｗｙｅｔｈ、ＷＲおよびＶＣ−２ワクシニアウイルスを、それぞれ多量に注入されたマウスで生じた外傷は、より早い外傷の形成という結果となった。ヌードマウスでみられたように、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを注入されたＣＹ処理マウスは、外傷を引き起こさなかった。しかしながら、ヌードマウスとは異なり、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを投与されたＣＹ処理マウスにおいて、投与量に関係なく、いくつかの死亡が観測された。これらのランダムな出来事が死の原因と考えられる。
全てのＷｙｅｔｈ投与量（９．５ｘ１０⁴から９．５ｘ１０⁸ｐｆｕ）で注入されたマウスは、ｐｉ７日と１５日の間にそれらの尾および／またはつま先に痘外傷を示した。加えて、尾とつま先は膨張した。尾の外傷の発展は、ポックス外傷に典型的な丘疹、潰瘍化および最終的なかさぶたの形成であった。全てのＶＣ−２投与量（１．６５ｘ１０⁵から１．６５ｘ１０⁹ｐｆｕ）で注入されたマウスもまた、Ｗｙｅｔｈで接種されたマウスのそれと同様に、それらの尾および／またはつま先に痘外傷を示した。これらの外傷は、接種後７−１２日の間に観察された。少量のＷＲウイルスを注入されたマウスでは外傷は観察されなかったが、これらのグループにおいて死亡は引き起こされた。
ＮＹＶＡＣ−ＲＧの能力試験ワクシニアウイルスコペンハーゲン株の弱毒化が、その結果生じたＮＹＶＡＣ株の有用なベクターとしての能力を顕著に変化させることなく効果を示していることを調べるため、比較能力試験を行った。ウイルスを弱毒化するために行われた連続的遺伝子操作の間のベクターの免疫原的能力を観察するために、狂犬病ウイルス糖タンパク質をレポーター外因性遺伝子として用いた。狂犬病糖タンパク質遺伝子を発現するベクターの防御効果を、狂犬病に対する標準ＮＩＨマウス能力試験（ｓｅｌｉｇｍａｎｎ，１９７３）により評価した。表２４は高度弱毒化ＮＹＶＡＣベクターから得られたＰＤ₅₀値は、ｔｋ座に狂犬病糖タンパク質遺伝子を有するコペンハーゲンをベースとした組換体（Ｋｉｅｎｙｅｔａｌ．，１９８４）を用いて得られた値と同一であり、鳥類種に複製が限定されているカナリアポックスベースのベクターであるＡＬＶＡＣ−ＲＧについて得られたＰＤ₅₀値に近かった。
観察公知の毒性遺伝子を欠失され制限された生体外増殖特性を有するＮＹＶＡＣを、その弱毒化特性を評価するため動物モデルシステム中で分析した。これらの研究は、神経毒性ワクシニアウイルス実験室株、ＷＲ、２つのワクシニアウイルス株、Ｗｙｅｔｈ（ニューヨーク市保健局）およびコペンハーゲン（ＶＣ−２）、さらにカナリアポックスウイルス株、ＡＬＶＡＣ（実施例２３を参照）と比較して行った。これとともに、これらのウイルスは、マウス投与モデルおよびウサギ皮膚モデルにおける、最も毒性株であるＷＲ、立証された特性とともに以前に用いられていた弱毒化ワクチン株を提供しているコペンハーゲン（ＶＣ−２）およびＷｙｅｔｈ、複製が鳥類種に限られているポックスウイルスの例を提供しているＡＬＶＡＣに関し、相対的病原性ポテンシャルのスペクトルを提供した。これらの生体内分析の結果は、ワクシニアウイルス株、ＷＲ、Ｗｙｅｔｈおよびコペンハーゲン（ＶＣ−２）と比較して高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣの性質を明白に示している（表１８−２４）。重要なことには、ＮＹＶＡＣのＬＤ₅₀値は、鳥類宿主制限アビポックスウイルス、ＡＬＶＡＣについて見られた値と匹敵するものであった。ＮＹＶＡＣによる死亡は、ＡＬＶＡＣと同様に、極端に大量のウイルスが頭蓋内経路で投与された場合にのみ観察された（実施例２３、表１８、１９、２３）。これらの死が、多量のタンパク質の接種の非特異的な必然的結果であるか否かはまだ確定はしていない。免疫不全マウスモデル（ヌードマウスおよびＣＹ処理）における分析はまた、ＷＲ、Ｗｙｅｔｈおよびコペンハーゲン株と比較して、ＮＹＶＡＣの相対的に高い弱毒化特性を示している（表２１および２２）。重要なことには、伝播したワクシニア感染あるいはワクシニア性病気の証拠が、ＮＹＶＡＣを接種された動物またはＡＬＶＡＣを接種させた動物においては、観察期間にわたって観察されなかったことである。ＮＹＶＡＣ中の複数の毒性関連遺伝子の欠失は、病原性に関して相乗効果を示した。他のＮＹＶＡＣの無毒性の尺度が、ウサギ皮膚への皮内投与によって提供された（表２１および２２）。非鳥類種では複製できないウイルスであるＡＬＶＡＣについての結果を考えると、ＡＬＶＡＣの皮内接種は、投与量に応じたかたちで硬化の範囲を引き起こしたので、接種部位における複製能力は、単に反応性と相関しているのではない。従って、ウイルスの複製能力以外の要素が外傷の形成に寄与していることはあり得る。ＮＹＶＡＣの遺伝子の欠失は外傷の現れを防止する。
同じく、実施例２３を含む先の実施例およびこの実施例の結果は、ＷＲ、および以前にワクシニアウイルスワクチン株として用いられていた、Ｗｙｅｔｈおよびコペンハーゲンと比較して、高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣの性質を示している。事実、試験された動物モデルシステムにおける、ＮＹＶＡＣの病原性プロフィールは、鳥類種でのみ生産的に複製することが知られているポックスウイルス、ＡＬＶＡＣのそれに近かった。ヒト（表２０）およびマウス、ブタ、イヌおよびウマを含む他の種から派生した細胞上での、明らかに制限されたＮＹＶＡＣの生産的複製能力は、ワクチン接種されていない接触体もしくは一般的環境への滞在的伝播を限定もしくは防止するとともに、ワクチン接種された個体内での伝播の、低い可能性をベクターに提供する。
重要なことには、ＮＹＶＡＣベースのワクチン候補株は効率的であることが示されている。数多くの病原体由来の外来遺伝子産物を発現するＮＹＶＡＣ組換体は、霊長類を含むいくつかの動物種において外来遺伝子産物に対する免疫反応を誘導する。特に、狂犬病糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣベース組換体は、致死量の狂犬病投与に対してマウスを防御可能であった。ＮＹＶＡＣベースの狂犬病糖タンパク質組換体の能力は、ｔｋ遺伝子座中に狂犬病糖タンパク質を含むコペンハーゲンベースに対するＰＤ₅₀値に匹敵していた（表２４）。ＮＹＶＡＣベースの組換体は麻疹ウイルス中和抗体をウサギにおいて誘導し、ブタにおいて仮性狂犬病ウイルスおよび日本脳炎ウイルス投与に対する防御を誘導することが示された。高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣ株は、ヒトおよび獣医学の用途に安全性の利点を付与している（Ｔａｒｔａｇｌｉａｅｔａｌ．，１９９０）。さらには、ＮＹＶＡＣの総合的研究室用発現ベクターシステムとしての利用は、ワクシニアウイルス利用に関する生物的危険を大きく減少させる。
以下の基準によって、この実施例の結果および、実施例２３を含む文書中の実施例は、ＮＹＶＡＣが高度に弱毒化されていることを示している：ａ）接種部位での検出可能な硬化あるいは潰瘍化がない（ウサギ皮膚）；ｂ）皮内接種部位からの感染可能はウイルスの速やかな消失（ウサギ皮膚）；ｃ）睾丸炎がない（ヌードマウス）；ｄ）大きく減少された毒性（頭蓋内投与、生後３週間および新生マウス）；ｅ）大きく減少された病原性および免疫不全対象物（ヌードおよびシクロホスファミド処理マウス）において拡散性がない；およびｆ）劇的に減少された、多様なヒト組織培養細胞上での複製能力。しかしながら、高度に弱毒化されているにも拘わらず、ＮＹＶＡＣは、ベクターとして、外因性抗原に対して強力な免疫反応を誘導する能力を保持している。

実施例２５トリインフルエンザウイルス血球凝集素糖タンパク質を発現するＴＲＯＶＡＣ組換体の構築
この実施例はトリインフルエンザウイルスの３つの血清型の血球凝集素遺伝子を発現するニワトリポックスウイルス組換体の開発を記述する。
細胞およびウイルスＨ４、Ｈ５およびＨ７血球凝集素遺伝子のｃＤＮＡクローンを含むプラスミドを、Ｄｒ．ＲｏｂｅｒｔＷｅｂｓｔｅｒ、Ｓｔ．ＪｕｄｅＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＲｅｓｅａｒｃｈＨｏｓｐｉｔａｌ、Ｍｅｍｐｈｉｓ、Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅより入手した。ＦＰ−１と命名されたＦＰＶ株は以前に記述されている（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９８８ａ，ｂ）。これは、生後１日のニワトリのワクチン接種に有用なワクチン株である。親株Ｄｕｖｅｔｔｅはフランスでニワトリからニワトリポックスのかさぶたとして得られた。親株はふ化鶏卵における約５０回の連続継代とそれに続くニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞で２５回の継代により弱毒化された。このウイルスは１９８０年にＲｈｏｎｅＭｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅで得られ、マスターウイルスシードを作り出した。このウイルスは１９８９年にＶｉｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓに受領され、ウイルスは４回の連続プラーク精製にかけられた。１つのプラーク単離体を初代ＣＥＦ細胞中で増幅し、ＴＲＯＶＡＣと命名されたストックウイルスとした。この生体外組換えテストでＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８９）およびＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）を生成するために用いられたストックウイルスは、初代ＣＥＦ中で８回の継代にかけられさらに増幅された。ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７（ｖＦＰ１００）を生成するために用いられたストックウイルスは、初代ＣＥＦ中で１２回の継代にかけられさらに増幅された。
Ｆ８座へのニワトリポックス挿入プラスミドの構築プラスミドｐＲＷ７３１．１５は、ＴＲＯＶＡＣゲノムＤＮＡからクローン化された１０ｋｂｐのＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片を有している。３６５９ｂｐＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片のヌクレオチド配列が両方の鎖について決定された。この配列を図２０に示す（配列番号７２）。本研究室でＦ８と命名されたオープンリーディングフレームの限定が、この配列の内部で決定された。オープンリーディングフレームは、位置４９５から開始され位置１８８７で終了する。以下に記述するように、位置７７９から位置１９２６までを欠失させた。
プラスミドｐＲＷ７６１は２４３０ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶ断片を含むｐＲＷ７３１．１５のサブクローンである。プラスミドｐＲＷ７６１をＸｂａＩで完全消化、ＳｓｐＩで部分消化した。３７００ｂｐのＸｂａＩ−ＳｓｐＩバンドを単離し、アニーリングさせたオリゴヌクレオチドＪＣＡ０１７（配列番号６０）およびＪＣＡ０１８（配列番号６１）と連結した。

この連結により生じたプラスミドをｐＪＣＡ００２と命名した。プラスミドｐＪＣＡ００４はワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結した非関連遺伝子をプラスミドｐＪＣＡ００２中に有している。ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの配列は以前に記述された（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９８８ａ，ｂ；Ｇｕｏｅｔａｌ．，１９８９；Ｐｅｒｋｕｓｅｔａｌ．，１９８９）。プラスミドｐＪＣＡ００４をＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで消化し、非関連遺伝子とＨ６プロモーター３７末端の一部を欠失させた。アニーリングさせたオリゴヌクレオチドＲＷ１７８（配列番号７３）およびＲＷ１７９（配列番号７４）をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化し、ＪＣＡ００４のＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩ部位の間に入れ、ｐＲＷ８４６を生成した。

それ故、プラスミドｐＲＷ８４６はＨ６プロモーターの５’ＥｃｏＲＶを、ＯＲＦ欠失されたＦ８座に有している。プラスミドｐＲＷ８４６中のＨ６プロモーターの３’ＨｉｎｃＩＩ部位に、翻訳終了コドン、ワクシニアウイルス初期プロモーター（Ｙｕｅｎｅｔａｌ．，１９８７）により認識される転写終結コドンおよびＳｍａＩ部位が続いている。
Ｆ７座へのニワトリポックス挿入プラスミドの構築元々のＦ７ＯＲＦが欠失されていない挿入プラスミド、ｐＲＷ７３１．１３は、５．５ｋｂｐのＦＰゲノムのＰｖｕＩＩ断片をｐＵＣ９のＰｖｕＩＩ部位中に有している。挿入部位はこれらの配列内部の固有のＨｉｎｃＩＩである。図２１に示されているヌクレオチド配列（配列番号７５）は、固有のＨｉｎｃＩＩ部位を含む２３５６ｂｐの領域について決定された。この配列の解析により、固有のＨｉｎｃＩＩ部位（図２１、下線）は９０アミノ酸のポリペプチドをコードしているＯＲＦの内部に位置していることが明らかとなった。ＯＲＦは位置１５３１のＡＴＧにより始まり、位置８９８で終わる（図２１中で矢印で示された位置）。
ＯＲＦ欠失させた挿入プラスミドのためのアームはｐＲＷ７３１．１３をテンプレートとして用いたＰＣＲにより派生した。ＯＲＦの上流領域に相当する５９６ｂｐのアーム（ＨＢと命名）は、オリゴヌクレオチドＦ７３ＰＨ２（配列番号７６）およびＦ７３ＰＢ（配列番号７７）により増幅された。

ＯＲＦの下流領域に相当する２７０ｂｐのアーム（ＥＨと命名）は、オリゴヌクレオチドＦ７５ＰＨＥ（配列番号７８）およびＦ７３ＰＨ１（配列番号７９）により増幅された。

断片ＥＨをＥｃｏＲＶで消化し、１２６ｂｐの断片を生成した。ＥｃｏＲＶ部位は３’末端にあり、５’末端はＨｉｎｃＩＩの３’末端を含むようＰＣＲにより形成した。この断片を、ＨｉｎｃＩＩで消化したｐＢＳ−ＳＫ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）中に挿入し、プラスミドｐＦ７Ｄ１とした。この配列をジデオキシヌクレオチド配列分析により確認した。プラスミドｐＦ７Ｄ１をＡｐａＩで直線化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、５９６ｂｐのＨＢ断片へ連結した。生成されたプラスミドをｐＦ７Ｄ２と命名した。全体の配列と方向をヌクレオチド配列分析により確認した。
プラスミドｐＦ７Ｄ２をＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩで消化し、６００ｂｐの断片を生成させた。この断片をＡｐａＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、続いてＢａｍＨＩで消化したｐＢＳ−ＳＫに挿入した。その結果生成されたプラスミドをｐＦ７Ｄ３と命名した。このプラスミドは４０４ｂｐのＨＢアームと１２６ｂｐのＥＨアームを含んでいる。
プラスミドｐＦ７Ｄ３を、ＸｈｏＩで直線化し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼクレノー断片で２ｍＭのｄＮＴＰの存在下で平滑化した。この直線化されたプラスミドはアニーリングさせたオリゴヌクレオチドＦ７ＭＣＳＢ（配列番号８０）およびＦ７ＭＣＳＡ（配列番号８１）と連結させた。

これは、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩおよびＳｍａＩ制限部位を含むマルチプルクローニング領域をＥＨアームとＨＢアームとの間に挿入するために行った。生成されたプラスミドをｐＦ７ＤＯと命名した。
Ｆ８座へのＨ４血球凝集素挿入プラスミドの構築Ａ／Ｔｙ／Ｍｉｎ／８３３／８０から派生したトリインフルエンザＨ４をコードしているｃＤＮＡは、プラスミドｐＴＭ４Ｈ８３３中に、Ｄｒ．Ｒ．Ｗｅｂｓｔｅｒより入手した。プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｒｕＩで消化し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼクレノー断片でｄＮＴＰの存在下で平滑化した。Ｈ４コード領域を含む平滑化２．５ｋｂｐＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｒｕＩ断片を、ｐＩＢＩ２５（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、ＮｅｗＨａｖｅｎ、ＣＴ）のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ８２８を部分的にＢａｎＩＩで切断し、線状の産物を単離しＨｉｎｄＩＩＩで再び切断した。今、１００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｎＩＩを欠失されたプラスミドｐＲＷ８２８は、合成オリゴヌクレオチドＲＷ１５２（配列番号８２）およびＲＷ１５３（配列番号８３）のベクターとして用いた。これらのオリゴヌクレオチドは、ＥｃｏＲＶ部位からのＨ６プロモーターの３’部分を表し、Ｈ４ｃＤＮＡのＡＴＧをプロモーターのＡＴＧと並列させている。

これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、ＢａｎＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、上記のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｎＩＩ欠失ｐＲＷ８２８ベクター中に挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ８４４をＥｃｏＲＶおよびＤｒａＩで切断し、３’Ｈ６プロモートされたＨ４コード配列を含む１．７ｋｂｐ切断を、ｐＲＷ８４６（以前に記述）のＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｃＩＩ部位に挿入し、ｐＲＷ８４８とした。プラスミドｐＲＷ８４８は、それ故、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結したＨ４コード領域を、ニワトリポックスウイルスＦ８座ＯＲＦ欠失領域中に有している。
Ｆ８座へのＨ５血球凝集素挿入プラスミドの構築Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｒｅｌａｎｄ／１３７８／８３から派生したトリインフルエンザＨ５をコードしているｃＤＮＡは、プラスミドｐＴＨ２９中に、Ｄｒ．Ｒ．Ｗｅｂｓｔｅｒより入手した。合成ヌクレオチドＲＷ１０（配列番号８４）からＲＷ１３（配列番号８７）までは、以前に記述されたワクシニアウイルスＨ６プロモーターの翻訳開始コドンをＨ５遺伝子のＡＴＧとオーバーラップさせるために設計された。配列は、Ｈ５遺伝子の５’ＳａｌＩ部位を通して連続しており、Ｈ５停止コドンを含む３’Ｈ５ＤｒａＩ部位で再び開始する。

オリゴヌクレオチドを、９５℃で３分間、続いてゆっくりと室温で冷却しアニーリングさせた。これは以下の、示された末端での二本鎖構造という結果となる。

ｐＲＷ７４２のＥｃｏＲＶとＰｓｔＩ部位との間へのオリゴヌクレオチドのクローン化によりｐＲＷ７４４を生成した。ｐＲＷ７３１．１５のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入されたワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結した非関連遺伝子を有するプラスミドｐＲＷ７４２Ｂは以前に記述された。ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＶによる消化で、非関連遺伝子およびＨ６プロモーターの３’末端を除去した。今、プラスミドｐＲＷ７４４はトリインフルエンザＨ５のＡＴＧとオーバーラップしたＨ６プロモーターの３’部分を有している。このプラスミドはまた、５’ＳａｌＩ部位を通ったＨ５配列およびＨ５停止コドン（ＤｒａＩ部位を含む）からの３’配列を含む。ＤｒａＩ部位の利用によりＨ５３’非コード末端を除去する。オリゴヌクレオチドは、初期ワクシニアウイルスＲＮＡポリメラーゼにより認識される転写終結シグナル（Ｙｕｅｎｅｔａｌ．，１９８７）を付与する。Ｈ６プロモートされたＨ５の構築を完成させるため、Ｈ５コード領域を１．６ｋｂｐのＳａｌＩ−ＤｒａＩ断片としてｐＴＨ２９から単離した。プラスミドｐＲＷ７４４をＤｒａＩで部分切断し、線状断片を単離し、ＳａｌＩで再び消化した、ＳａｌＩとＤｒａＩとの間の８ベースを欠失させたプラスミドを、１．６ｋｂｐのｐＴＨ２９ＳａｌＩ−ＤｒａＩ断片のベクターとして用いた。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ７５９をＥｃｏＲＶおよびＤｒａＩで切断した。３’Ｈ６プロモーターおよびＨ５遺伝子を含む１．７ｋｂｐのｐＲＷ７５９ＥｃｏＲＶ−ＤｒａＩ断片を、ｐＲＷ８４６（以前に記述）のＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した。その結果生成されたプラスミドｐＲＷ８４９は、ＯＲＦ欠失Ｆ８座内にＨ６プロモートされたトリインフルエンザウイルスＨ５遺伝子を含んでいた。
Ｆ７座へのＨ７血球凝集素挿入ベクターの構築Ａ／ＣＫ／ＶＩＣ／１／８５由来のＨ７血球凝集素を含むプラスミドｐＣＶＨ７１は、Ｄｒ．Ｒ．Ｗｅｂｓｔｅｒより入手した。Ｈ７遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼクレノー断片により平滑末端化し、ｐＩＢＩ２５のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入し、ｐＲＷ８２７とした。合成オリゴヌクレオチドＲＷ１６５（配列番号８８）およびＲＷ１６６（配列番号８９）とをアニーリングさせ、ＨｉｎｃＩＩおよびＳｔｙＩで消化し、ｐＲＷ８２７のＥｃｏＲＶおよびＳｔｙＩ部位に挿入し、ｐＲＷ８４５とした。

オリゴヌクレオチドＲＷ１６５（配列番号８８）およびＲＷ１６６（配列番号８９）はＨ６プロモーターの３’部分をＨ７遺伝子に連結している。Ｈ７遺伝子の３’非コード末端は、ｐＲＷ８４５のＡｐａＬＩ消化の線状産物を単離し、ＥｃｏＲＩで再び切断し、最も大きな断片を単離し、合成ヌクレオチドＲＷ２２７（配列番号９０）およびＲＷ２２８（配列番号９１）とアニーリングさせることにより除去した。その結果生成されたプラスミドはｐＲＷ８５４である。

ｐＲＷ８５４のＨ７の停止コドンにはＨｐａＩ部位が続いている。ＯＲＦ欠失されたＦ７座中のＨ６プロモートされたＨ７構築物中間体を、ｐＲＷ８５４のＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩ断片を、ＥｃｏＲＶで切断し、ＰｓｔＩ部位を平滑化させたｐＲＷ８５８中に移動させることにより生成した。プラスミドｐＲＷ８５８（以下に記述）は、Ｈ６プロモーターをＦ７ＯＲＦ欠失中に含む挿入プラスミドである。
プラスミドｐＲＷ８５８は、非関連遺伝子に連結したＨ６プロモーターを有する８５０ｂｐのＳｍａＩ／ＨｐａＩ断片を、以前に記述されたｐＦＤＯのＳｍａＩ部位に挿入することによって構築された。この非関連配列は、ｐＲＷ８５８のＥｃｏＲＶ（Ｈ６プロモーターの３’末端の２４ｂｐ上流の部位）およびＰｓｔＩでの消化により取り除いた。３．５ｋｂｐのその結果生じた断片を単離しＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼクレノー断片を用いて２ｍＭのｄＮＴＰ存在下で平滑末端化した。この平滑化された断片を、ｐＲＷ８５４（以前に記述）から派出した１７００ｂｐのＥｃｏＲＶ／ＨｐａＩ断片に連結させた。このＥｃｏＲＶ／ＨｐａＩ断片は、ＶＶＨ６プロモーターの最３’２４ｂｐの３’に並列された完全ＡＩＶＨＡ（Ｈ７）遺伝子を有している。その結果生成されたプラスミドはｐＲＷ８６１と命名された。
１２６ｂｐＥＨアーム（以前に定義）は、ｐＲＷ８６１中で、ＴＲＯＶＡＣＤＮＡとの組換え頻度を増加させるために伸長させた。これを実行するため、５７５ｂｐのＡｃｃＩ／ＳｎａＢＩ断片をｐＲＷ７３１．１３（以前に定義）から派生させた。この断片を単離し、ｐＲＷ８６１のＡｃｃＩ部位とＮａｅＩ部位との間に挿入した。その結果生成されたプラスミドは、ＡＩＶＨ７遺伝子に隣接している７２５ｂｐのＥＨアームおよび４０４ｂｐのＨＢアームを有し、ｐＲＷ８６９と命名された。プラスミドｐＲＷ８６９は、それ故、５’末端でワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結されたＨ７コード配列を有している。左隣接アームは４０４ｂｐのＴＲＯＶＡＣ配列からなり右隣接アームは欠失ＯＲＦＦ７座への挿入を目的とした７２５ｂｐのＴＲＯＶＡＣ配列からなる。
ＴＲＯＶＡＣ−トリインフルエンザウイルス組換体の開発トリインフルエンザウイルスＨＡコード配列を有する挿入プラスミドを、個別に、ＴＲＯＶＡＣを感染させた初代ＣＥＦ細胞に、以前に記述された（Ｐａｎｉｃａｌｉｅｔａｌ．，１９８２；Ｐｉｃｃｉｎｉｅｔａｌ．，１９８７）リン酸カルシウム沈殿法により形質導入した。ＨＡ特異的放射性標識プローブとのハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な集団が達成させるまで連続したプラーク精製過程にかけた。１つの代表プラークが続いて増幅されてストックウイルスとされた。プラスミドｐＲＷ８４９は、生体外組換えテストにおいて用いられ、その結果、Ｈ５血球凝集素を発現するＡＬＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８９）を生成した。プラスミドｐＲＷ８４８が用いられ、その結果、Ｈ４血球凝集素を発現するＡＬＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）を生成した。プラスミドｐＲＷ８６９が用いられ、その結果、Ｈ７血球凝集素を発現するＡＬＶＡＣ−ＡＩＨ７（ｖＦＰ１００）を生成した。
免疫蛍光インフルエンザウイルスに感染した細胞においては、ＨＡ分子は合成され、プレカーサー分子として粗面小胞体においてグリコシル化される。原形質膜への輸送の間に、最終的にジスルフィド結合したＨＡ₁およびＨＡ₂サブユニットとなるタンパク質切断である翻訳後の拡張的修飾、および成熟ウイルスエンベローブへ取り込まれる場所である宿主細胞膜への挿入を受ける。ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ組換体に感染させた細胞中でＨＡ分子が細胞表面で発現されているかどうかを決定するため、免疫蛍光を行った。直接的でない免疫蛍光は以前に記述されたように（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９０）行った。ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４ではＨ４血球凝集素が、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５ではＨ５血球凝集素が、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７ではＨ７血球凝集素が表面で発現していることが、表面蛍光により確認された。Ｈ５血球凝集素の発現は、Ｈ５ＨＡ特異的モノクローナル抗体のプールを用いて検出された。Ｈ４ＨＡの発現はヤギ単独特異的抗Ｈ４血清を用いて分析した。Ｈ７ＨＡの発現はＨ７特異的モノクローナル抗体調製物を用いて分析した。
免疫沈降ウイルス粒子が感染可能であるためには、血球凝集素のポリペプチドの切断が必要であるため、血球凝集素分子の切断部位およびその周辺の配列は、ウイルス毒性の決定において重要な役割を果たすことが同定されている。毒性Ｈ５およびＨ７ウイルスは、ＨＡ₁にカルボキシ末端において１以上の塩基性アミノ酸を有している。これにより、一連の塩基性アミノ酸を認識する細胞内プロテアーゼに血球凝集素を切断することを可能にし、感染可能なウイルスが生体外でも生体内でも拡散することを可能にしていると考えられている。無毒性株のＨ４血球凝集素分子は組織培養中では、外因性トリプシンが添加されないかぎり切断されない。
ＴＲＯＶＡＣ組換体によって発現された血球凝集素分子が実際にプロセシングされているか否かを決定するため、免疫沈降実験を記述されたように（Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．，１９９０）、上記の特異的試薬を用いて行った。
ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８９）によって発現されたＨ５血球凝集素の免疫沈降分析により、糖タンパク質は、それぞれ約４４および２３ｋＤａの分子量の切断産物ＨＡ₁およびＨＡ₂として明瞭であることを示した。感染させていない細胞もしくは親ＴＲＯＶＡＣウイルスに感染させた細胞においては、このようなタンパク質は沈殿されなかった。同様に、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ１００）によって発現されたＨ５血球凝集素の免疫沈降分析により、切断産物ＨＡ₂特異的沈殿を示した。ＨＡ₁切断産物は認識されなかった。感染させていないＣＥＦ細胞もしくは親ＴＲＯＶＡＣウイルスに感染させたＣＥＦ細胞においては、このようなタンパク質は沈殿されなかった。これと対照的に、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）によって発現されたＨ４血球凝集素の免疫沈降分析においては、プレカーサータンパク質ＨＡ₀のみの発現を示した。無毒性亜型の血球凝集素の、組織培養中での発現の欠如と一致している。感染させていないもしくは親ＴＲＯＶＡＣウイルスに感染させたＣＥＦ細胞においては、Ｈ４特異的タンパク質は検出されなかった。組換えによる組換えウイルスの開発、ニトロセルロース膜フィルターによるin situハイブリダイゼーション、およびベータガラクトシダーゼ活性によるスクリーニングは以前に記述された通りである（Ｐａｎｉｃａｌｉｅｔａｌ．，１９８２；Ｐｅｒｋｕｓｅｔａｌ．，１９８９）。
実施例２６ベクターシステム中のＣＨＶｇＢ、ｇＣおよびｇＤヌクレオチド、それからの発現およびベクターシステムおよび発現産物の利用
ＣＨＶｇＢ糖タンパク質の発現を、ワクシニアウイルスＩ３Ｌプロモーターの制御下にあるＣＨＶｇＢ相同体遺伝子を置くことにより達成した。ＣＨＶｇＣ糖タンパク質の発現を、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの制御下にあるＣＨＶｇＣ相同体遺伝子を置くことにより達成した。ＣＨＶｇＤ糖タンパク質の発現を、ワクシニアウイルス４２Ｋ遺伝子プロモーターの制御下にあるＣＨＶｇＤ相同体遺伝子を置くことにより達成した。ｇＢおよびｇＣをコードしているものはＡＴＩ座中に、ｇＤをコードしているものはＨＡ座にある。
ドナープラスミドの開発ＣＨＶｇＢをコードしている配列はＰＣＲ派生させた。ＣＨＶｇＢ断片を、プラスミド中のＡＴＩＯＲＦ欠失座中のＩ３Ｌ−ＣＨＶｇＢカセットにＩ３Ｌプロモーター要素をコードしているＰＣＲ派生断片と融合した。ＣＨＶｇＣをコードしているものはＰＣＲ派生され、プラスミド中のＨＡＯＲＦ欠失座内に融合された。
ドナープラスミドを、Ｉ３Ｌ−ＣＨＶｇＢ−−Ｈ６−ＣＨＶｇＣ二重構築物をＮＹＶＡＣＡＴＩ欠失座中へ挿入するために用いた。
生体外組換えを、Ｖｅｒｏ細胞において、ドナープラスミド、およびレスキューウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）を用いて行った。組換ウィルスを定法に従って同定、精製した（Ｐｉｃｃｉｎｉｅｔａｌ．，１９８７）。ＣＨＶｇＢおよびＣＨＶｇＣ遺伝子をＡＴＩＯＲＦ欠失座中に含むＮＹＶＡＣベース組換体は、ＮＹＶＡＣ−ＣＨＶｇＢｇＣと命名された。
ドナープラスミドの開発ＣＨＶｇＤをコードしている配列を、４２Ｋプロモーターと融合し、その結果ＮＹＶＡＣＨＡＯＲＦ欠失座へ挿入用に開発されたプラスミドとなった。
生体外組換えを、Ｖｅｒｏ細胞のにおいて、ＣＨＶ−ｇＤ４２Ｋドナープラスミド、およびレスキューウイルスとしての組換ワクシニアウイルスＣＨＶ−ｇＢｇＣ（ＮＹＶＡＣがバックグラウンド）を用いて行った。これは定法に従って行った（Ｐｉｃｃｉｎｉｅｔａｌ．，１９８７）。ＣＨＶｇＢおよびｇＣ遺伝子をＡＴＩＯＲＦ欠失座に、ＣＨＶｇＤ遺伝子をＨＡＯＲＦ欠失座中に含むＮＹＶＡＣベース組換体をＮＹＶＡＣ−ＣＨＶｇＢｇＣｇＤと命名した。
ＡＬＶＡＣドナープラスミドの開発Ｉ３Ｌ−ＣＨＶｇＢ−−Ｈ６−ＣＨＶｇＣ−−４２Ｋ−ＣＨＶｇＤ三重構築物をＡＬＶＡＣＣ３ＯＲＦ欠失座に挿入するためのドナープラスミドであるプラスミドが、上記のプラスミドから構築された。
生体外組換えを、初代ニワトリ胚繊維芽細胞において、ドナープラスミドおよびレスキューウイルスとしてのＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）を用いて行った。続いて生成された組換体の同定および精製を定法により行った（Ｐｉｃｃｉｎｉｅｔａｌ．，１９８７）。ＣＨＶｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子をＣ３ＯＲＦ欠失座中に有するＡＬＶＡＣベース組換体をＡＬＶＡＣ−ＣＨＶｇＢｇＣｇＤと命名した。
分析により、組換体による糖タンパク質の発現、および糖タンパク質は実質的に予測された配列であることを確認した。
実施例２７ｖＣＰ３２０の開発；ＣＨＶｇＢを発現するＡＬＶＡＣ組換体
ｖＣＰ３２０、ＣＨＶｇＢを発現するＡＬＶＡＣ組換体を、以下の手順により開発した。ＣＨＶｇＢ遺伝子を含む６ｋｂのＸｂａＩ断片をＣＨＶゲノムＤＮＡから単離し、ｐＢＳＫ＋のＸｂａＩ部位にクローニングした。この操作により開発されたプラスミドをｐＣＨＶ２と称した。
ＣＨＶｇＢ遺伝子を、続いてカナリアポックス隣接アームの間にクローン化した。これは、ＣＨＶｇＢを含むｐＣＨＶ２の３７００ｂｐのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＶ断片を、ｐＢＨＶＣ１６の５８００ｂｐのＳａｃＩ−ＮａｅＩ断片中にクロン化することにより達成した。（ｐＢＨＶＣ１６はＣ５隣接アーム中にクローン化されたＢＨＶ１ｇＣ遺伝子のコピーを有している。）この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ１４と称した。
外来性３’非コード領域を除去した。これは、ｇＢ遺伝子の３′末端を含む２１０ｂｐのＳｍａＩ−ＣｌａＩ消化したＰＣＲ断片を、５５００ｂｐのｐＣＨＶ１４の部分ＳｍａＩ−ＣｌａＩ断片中にクローン化することにより達成された。（このＰＣＲ断片は、プラスミドｐＣＨＶ２から、プライマーＣＨＶＰ３９（配列番号９２）およびＣＨＶＰ４０（配列番号９３）によって生成された。

この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ１５と称した。
Ｉ３ＬプロモーターをｇＢ開始コドンの上流にクローン化した。さらに、ｇＢ遺伝子の５’末端に位置している３つのＴ₅ＮＴ初期転写終結シグナル配列を改変した。これは、Ｉ３ＬプロモーターおよびｇＢ遺伝子のＴ₅ＮＴ改変５’末端を含む１４０ｂｐのＳｃａＩ−ＳａｌＩ消化ＰＣＲ断片を、ｐＣＨＶ１５の６３００ｂｐのＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片中にクローン化することにより達成した。（このＰＣＲ断片はプラスミドｐＣＨＶ２より、プライマーＣＨＶＰ４２（配列番号９４）

およびＣＨＶＰ７８（配列番号９５）

により生成された。この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ２７と称した。
ｐＣＨＶ２７のＳｃａＩ−ＳａｌＩに隣接している配列の誤りを修正した。これは、Ｉ３ＬプロモーターおよびＣＨＶｇＢ遺伝子のＴ₅ＮＴ改変５’末端を含む、ｐＣＨＶ２７の１８０ｂｐのＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を、ｐＣＨＶ１５の６３００ｂｐのＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片中にクローン化することにより達成した。この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ２８と称した。
ＣＨＶｇＢ遺伝子の３′末端の近くの早期転写終結シグナル配列を続いて改変した。これは、ＣＨＶｇＢ遺伝子のＴ₅ＮＴ改変領域を含む３３０ｂｐの、ＳｐｅＩ−Ａｓｐ７１８消化断片を、ｐＣＨＶ２８の５４５０ｂｐのＳｐｅＩ−Ａｓｐ７１８断片中にクローン化することにより達成した。（このＰＣＲ断片は１５０ｂｐＰＣＲ断片、２８０ｂｐＰＣＲ断片およびプライマーＣＨＶＰ８９（配列番号９６）

およびＣＨＶＰ９２（配列番号９７）

から得られた）。１５０ｂｐＰＣＲ断片はプラスミドｐＣＨＶ２から、プライマーＣＨＶＰ８９（配列番号９６）

およびＣＨＶＰ９０（配列番号９８）

により得た。２８０ｂｐＰＣＲ断片は、プラスミドｐＣＨＶ２から、プライマーＣＨＶＰ９１（配列番号９９）

およびＣＨＶＰ９２（配列番号９７）

により得た。この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ３１と称した。
ＣＨＶｇＢ遺伝子の中部にある初期転写終結シグナル配列を続いて改変した。これは、ｇＢ遺伝子のＴ₅ＮＴ改変領域を含む、４８０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＢｓａＢＩ消化ＰＣＲ断片を、５０００ｂｐのｐＣＨＶ３１のＢａｍＨＩ−ＢｓａＢＩ断片中にクローン化することにより達成した。（このＰＣＲ断片は、３８０ｂｐＰＣＲ断片、２１０ｂｐＰＣＲ断片およびプライマーＣＨＶＰ８７（配列番号１００）

およびＣＨＶＰ９４（配列番号１０１）

から得た。）３８０ｂｐＰＣＲ断片はプラスミドｐＣＨＶ２から、プライマーＣＨＶＰ９３（配列番号１０２）

およびＣＨＶＰ９４（配列番号１０１）

により得られた。２１０ｂｐＰＣＲ断片はプラスミドｐＣＨ２から、プライマーＣＨＶ８７（配列番号１００）およびＣＨＶＰ８８（配列番号１０３）により得た。

この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ３２と称した。
以前の操作で除かれたｇＢ遺伝子の一部をｐＣＨＶ３２中に再びクローン化した。これは、以前の操作で除去されたｇＢ遺伝子の３’末端を含むｐＣＨＶ３１の２０００ｂｐの部分ＢｓａＢＩ−ＰｓｔＩ断片を、５４５０ｂｐのｐＣＨＶ３２のＢｓａＢＩ−ＰｓｔＩ断片中にクローン化することにより達成した。この操作で生成されたプラスミドをｐＣＨＶ３６と称した。
Ｉ３ＬプロモートされたｇＢ遺伝子を、続いて、Ｃ６隣接アームの間にクローン化した。これは、Ｉ３ＬプロモートされたｇＢ遺伝子を含むｐＣＨＶ３６の２７５０ｂｐのＳａｌＩ−ＳｍａＩ断片を、４３５０ｂｐのｐＨＩＶ３４のＳａｌＩ−ＳｍａＩ断片中にクローン化することにより達成した。（ｐＨＩＶ３４は、Ｃ６隣接アームの間にクローン化された、Ｈ６プロモートされたＨＩＶ２ｇｐ１２０（＋ＴＭ）遺伝子のコピーを有している。）この操作により得られたプラスミドをｐＣＨＶ３７と称した。ｐＣＨＶ３７中のＩ３ＬプロモートされたｇＢ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１０４、１０５）を図２３に示す。ＡＬＶＡＣ６Ｃ隣接アームのＤＮＡ配列（配列番号１０７、１０８）を図２４に示す。
ｐＣＨＶ３７を、生体外組換え実験に、レスキューウイルスであるＡＬＶＡＣとともに用いてｖＣＰ３２０を得た。
免疫沈降分析を、ｖＣＰ３２０がＣＨＶｇＢを発現するか否かを決定するために行った。ＭＤＣＫ細胞単層を、親ウイルス（ＡＬＶＡＣ）（ｍ．ｏ．ｉ＝１５ｐｆｕ／細胞）、ｖＣＰ３２０（ｍ．ｏ．ｉ＝１５ｐｆｕ／細胞）もしくはＣＨＶ（ｍ．ｏ．ｉ＝１５ｐｆｕ／細胞）で、偽感染もしくは感染させた。１時間の吸収期間に続いて、接種物を取り除き、細胞に、２％透析牛胎児血清および［³⁵Ｓ］−システイン（５０μＣｉ／ｍｌ）を含む改変Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（マイナスシステイン）を２ｍｌ重層させた。破砕物を感染後１８時間で、１ｍｌの３ｘバッファーＡ（４５０ｍＭＮａＣｌ、３％ＮＰ−４０、３０ｍＭトリス（ｐＨ＝７．４）、３ｍＭＥＤＴＡ、０．０３％アジ化ナトリウムおよび０．６ｍｇ／ｍｌＰＭＳＦ）中に回収し、ｇＢ特異的モノクローナル抗体１１２５Ｂ２（Ｄｒ．ＭｉｃｈｅｌＲｉｖｉｅｒｅ、ＲｈｏｎｅＭｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅより入手）の１：１００希釈液を用いてＣＨＶｇＣの発現を分析した。普通マウス血清およびヤギ抗マウスタンパク質Ａ−セファロース複合体を用いて前洗浄した破砕物を、モノクローナル抗ヤギ抗マウスタンパク質Ａ−セファロース複合体とともに４℃で一晩保温し、１ｘバッファーＡで４回、およびＬｉＣｌ₂／尿素バッファーで２回洗浄した。沈殿したタンパク質を、２ｘＬａｅｍｍｌｉ’ｓバッファー（１２５ｍＭトリス（ｐＨ＝６．８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％２−メルカプトエタノール）を添加することにより免疫複合体から解離させ、５分間沸騰させた。タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分画、固定し、１Ｍサリチル酸ナトリウムで間接撮影用に処理した。ＣＨＶに感染させた細胞（レーンＤ）およびｖＣＰ３２０に感染させた細胞（レーンＣ）からは適切なサイズのタンパク質が沈殿したが、偽感染細胞（レーンＡ）またはＡＬＶＡＣに感染させた細胞（レーンＢ）からは沈殿しなかった（図２５）。これらの結果はｖＣＰ３２０はＣＨＶｇＢを発現することを示している。
実施例２８ｖＣＰ３２２の開発；ＣＨＶｇＣを発現するＡＬＶＡＣ組換体
ｖＣＰ３２２、ＣＨＶｇＣを発現するＡＬＶＡＣ組換体を、以下の手順により開発した。ＣＨＶｇＣ遺伝子を含む２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をＣＨＶゲノムＤＮＡから単離し、ｐＶＱＨ６ＣＰ３ＬＳＡのＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。（ｐＶＱＨ６ＣＰ３ＬＳＡはＣ３隣接アームの間にクローン化されたＨ６プロモーターのコピーを有している。）この操作は、ｇＣ遺伝子をＨ６プロモーターの下流でＣ３隣接アームの間に位置づける。この操作により開発されたプラスミドをｐＣＨＶ１７と称した。
外来性３’非コード領域を除去し、ｇＣ遺伝子の３’末端の近くに位置している３つのＴ₅ＮＴ初期転写終結シグナル配列を改変した。これは、オリゴヌクレオチドＣＨＶＬ６６（配列番号１０９）

およびＣＨＶＬ６７（配列番号１１０）

を、ｐＣＨＶ１７の８４００ｂｐのＣｌａＩ−ＰｓｔＩ断片中にクローン化することにより達成した。この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶと称した。
ｇＣ遺伝子の開始コドンを続いてＨ６プロモーターの開始コドンに整列させた。さらに、２つの初期転写終了シグナル配列を改変した。これは、Ｈ６プロモーターの３’末端およびＴ₅ＮＴ改変ｇＣ遺伝子を含む、７４０ｂｐのＮｒｕＩ−ＢｓｒＧＩ消化ＰＣＲ断片を、７９００ｂｐのｐＣＨＶ２０のＮｒｕＩ−ＢｓｒＧＩ断片中にクローン化することにより達成した。（このＰＣＲ断片は、５００ｂｐのＰＣＲ断片、３００ｂｐのＰＣＲ断片およびオリゴヌクレオチドＣＨＶＰ９６（配列番号１１１）

およびＣＨＶＰ９７（配列番号１１２）

を用いて生成した。５００ｂｐのＰＣＲ断片は、プラスミドｐＣＨＶ１３からオリゴヌクレオチドＣＨＶＰ６８（配列番号１１３）

およびＣＨＶＰ６９（配列番号１１４）

により生成した。３００ｂｐのＰＣＲ断片は、プラスミドｐＣＨＶ１３からオリゴヌクレオチドＣＨＶＰ９５（配列番号１１５）

およびＣＨＶＰ９６（配列番号１１１）

により生成した。（ｐＣＨＶ１３は、ｇＣ遺伝子を含む２．２ｋｂのＥｃｏＲＩゲノム断片をｐＢＳＫ＋のＥｃｏＲＩ部位にクローニングすることにより得られた。）この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ３８と称した。
Ｈ６プロモートされたｇＣ遺伝子を続いてＣ６隣接アーム中にクローン化した。これは、Ｈ６プロモートされたｇＣ遺伝子を含むｐＣＨＶ３８の１４００ｂｐＮｒｕＩ−ＰｓｔＩ断片およびオリゴヌクレオチドＣＨＶＬ９８（配列番号１１６、５’−ＡＡＴＴＴＧＣＡ−３’）を、ｐＨＩＶ３４の４５００ｂｐのＮｒｕＩ−ＥｃｏＲＩ断片中にクローン化することにより達成した。（ｐＨＩＶ３４は、Ｈ６プロモートされたＨＩＶ２ｇｐ１２０（＋ＴＭ）遺伝子をＣ６隣接アーム中に有している。）この操作によって生成されたプラスミドをｐＣＨＶ４０と称した。ｐＣＨＶ４０中のＨ６プロモートされたｇＣ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１１７、１１８）を図２６に示す。ＡＬＶＡＣＣ６隣接アームのＤＮＡ配列（配列番号１０７、１０８）を図２４に示す。
ｐＣＨＶ４０を、生体外組換え実験に、レスキューウイルスであるＡＬＶＡＣとともに用いてｖＣＰ３２２を得た。
免疫沈降分析を、ｖＣＰ３２２がＣＨＶｇＣを発現するか否かを決定するために行った。ＭＤＣＫ細胞単層を、親ウイルス（ＡＬＶＡＣ）（ｍ．ｏ．ｉ＝１５ｐｆｕ／細胞）もしくはｖＣＰ３２２（ｍ．ｏ．ｉ＝１５ｐｆｕ／細胞）またはＣＨＶ（ｍ．ｏ．ｉ＝１５ｐｆｕ／細胞）で、偽感染もしくは感染させた。１時間の吸収期間に続いて、接種物を取り除き、細胞に、２％透析牛胎児血清および［³⁵Ｓ］−システイン（５０μＣｉ／ｍｌ）を含む改変Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（マイナスシステイン）を２ｍｌ重層させた。破砕物を感染後１８時間で、１ｍｌの３ｘバッファーＡ（４５０ｍＭＮａＣｌ、３％ＮＰ−４０。３０ｍＭトリス（ｐＨ＝７．４）、３ｍＭＥＤＴＡ、０．０３％アジ化ナトリウムおよび０．６ｍｇ／ｍｌＰＭＳＦ）中に回収し、ｇＣ特異的モノクローナル抗体２０１１Ａ９（Ｄｒ．ＭｉｃｈｅｌＲｉｖｉｅｒｅ、ＲｈｏｎｅＭｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅより入手）の１：１００希釈液を用いてＣＨＶｇＤの発現を分析した。普通マウス血清およびヤギ抗マウスタンパク質Ａ−セファロース複合体を用いて前洗浄した破砕物を、モノクローナル抗ヤギ抗マウスタンパク質Ａ−セファロース複合体とともに４℃で一晩保温し、１ｘバッファーＡで４回、およびＬｉＣｌ₂／尿素バッファーで２回洗浄した。沈殿したタンパク質を、２ｘＬａｅｍｍｌｉ’ｓバッファー（１２５ｍＭトリス（ｐＨ＝６．８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％２−メルカプトエタノール）を添加することにより免疫複合体から解離させ、５分間沸騰させた。タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分画、固定し、１Ｍサリチル酸ナトリウムで間接撮影用に処理した。ＣＨＶに感染させた細胞（レーンＤ）およびｖＣＰ３２２に感染させた細胞（レーンＣ）からは適切なサイズのタンパク質が沈殿したが、偽感染細胞（レーンＡ）またはＡＬＶＡＣに感染させた細胞（レーンＢ）からは沈殿しなかった（図２７）。これらの結果はｖＣＰ３２２はＣＨＶｇＣを発現することを示している。
実施例２９ｖＣＰ２９４の開発；ＣＨＶｇＤを発現するＡＬＶＡＣ組換体
ｖＣＰ２９４、ＣＨＶｇＤを発現するＡＬＶＡＣ組換体を、以下の手順により開発した。ＣＨＶｇＤ遺伝子を含む７ｋｂのＰｓｔＩ断片をＣＨＶゲノムＤＮＡから単離し、ｐＢＳＫ＋のＰｓｔＩ部位にクローニングした。この操作により開発されたプラスミドをｐＣＨＶ１１と称した。
ＣＨＶｇＤ遺伝子を、続いてカナリアポックス隣接アームの間にクローン化した。これは、ＣＨＶｇＤを含むｐＣＨＶ１１の１４７５ｂｐのＰｓｔＩ−ＳｎａＢＩ断片を、ｐＨＩＶ３４の５６００ｂｐのＰｓｔＩ−ＳｎａＢＩ断片中にクロン化することにより達成した。（ｐＨＩＶ３４はＣ６隣接アーム中にクローン化されたＨ６プロモートされたＨＩＶ２ｇｐ１２０（＋ＴＭ）遺伝子のコピーを有している。）これにより、ＣＨＶｇ遺伝子はＨ６プロモータの下流でＣ６隣接アームの間に位置づける。この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ１８と称した。
ｇＤ遺伝子の開始コドンを続いてＨ６プロモーターの開始コドンに整列させた。これは、オリゴヌクレオチドＣＨＶＬ８１（配列番号１２０）

およびオリゴヌクレオチドＣＨＶＬ８２（配列番号１２１）

をｐＣＨＶ１８の５６００ｂｐのＮｒｕＩ−ＰｆｌＭＩ断片中にクローン化することにより達成した。この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ２１と称した。
ＣＨＶｇＤ遺伝子の３’末端にある、３つの初期転写終了シグナル配列を続いて改変した。これは、「Ｔ₅ＮＴ改変」ｇＤ遺伝子の３’末端およびＣ３隣接アームを含む、１４００ｂｐのｐＣＨＶ２２のＢｇｌＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を、３７００ｂｐのｐＣＨＶ２１のＢｇｌＩＩ−Ａｓｐ７１８断片中にクローン化することにより達成した。（ｐＣＨＶ２２は、「Ｔ₅ＮＴ改変」ｇＤ遺伝子の３’末端を含む４３０ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ消化ＰＣＲ断片を３９００ｂｐのｐＨＩＶ４３のＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片中にクローン化して形成した。ｐＨＩＶ４３は、Ｃ３隣接アームの間にクローン化されたＨ６プロモートされたＨＩＶ１ｇｐ１２０−マウスＩＬ−２融合遺伝子を有している。（このＰＣＲ断片はプラスミドｐＣＨＶ１８から、オリゴヌクレオチドＣＨＶＰ７９（配列番号１２２）

およびＣＨＶＰ８０（配列番号１２３）

により生成された。））この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ２４と称した。
続いて、「Ｔ₅ＮＴ改変」ＣＨＶｇＤ遺伝子の中央領域を、ｐＣＨＶ２４中にクローン化した。これは、「Ｔ₅ＮＴ改変」ＣＨＶｇＤ遺伝子の中央領域を含む２４０ｂｐのＢｇｌＩＩ−消化ＰＣＲ断片を、ｐＣＨＶ２４のＢｇｌＩＩ部位中にクローン化することにより達成した。（このＰＣＲ断片はプラスミドｐＣＨＶ１８から、オリゴヌクレオチドＣＨＶＰ８３（配列番号１２４）

およびＣＨＶＰ８４（配列番号１２５）

により生成された。）この操作により生成されたプラスミドをｐＣＨＶ２５と称した。
Ｃ３隣接アームを続いてＣ６隣接アームで置換した。これは、Ｃ６隣接アームを含むｐＣＨＶ２１の１１６０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ａｓｐ７１８断片を、ｐＣＨＶ２５の４１００ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ａｓｐ７１８断片中にクローン化することにより達成した。この操作によって生成されたプラスミドをｐＣＨＶ２６と称した。ｐＣＨＶ２６中のＨ６プロモートされたｇＤ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１２７、１２８）を図２８に示す。ＡＬＶＡＣＣ６隣接アームのＤＮＡ配列（配列番号１０７、１０８）を図２４に示す。
ｐＣＨＶ２６を、生体外組換え実験に、レスキューウイルスであるＡＬＶＡＣとともに用いてｖＣＰ２９４を得た。
免疫沈降分析を、ｖＣＰ２９４がＣＨＶｇＤを発現するか否かを決定するために行った。ＭＤＣＫ細胞単層を、親ウイルス（ＡＬＶＡＣ）（ｍ．ｏ．ｉ＝１５ｐｆｕ／細胞）、ｖＣＰ２９４（ｍ．ｏ．ｉ＝１５ｐｆｕ／細胞）またはＣＨＶ（ｍ．ｏ．ｉ＝１５ｐｆｕ／細胞）で、偽感染もしくは感染させた。１時間の吸収期間に続いて、接種物を取り除き、細胞に、２％透析牛胎児血清および［³⁵Ｓ］−システイン（５０μＣｉ／ｍｌ）を含む改変Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（マイナスシステイン）を２ｍｌ重層させた。破砕物を感染後１８時間で、１ｍｌの３ｘバッファーＡ（４５０ｍＭＮａＣｌ、３％ＮＰ−４０。３０ｍＭトリス（ｐＨ＝７．４）、３ｍＭＥＤＴＡ、０．０３％アジ化ナトリウムおよび０．６ｍｇ／ｍｌＰＭＳＦ）中に回収し、ｇＣ特異的モノクローナル抗体２０８Ｄ１１（Ｄｒ．ＭｉｃｈｅｌＲｉｖｉｅｒｅ、ＲｈｏｎｅＭｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅより入手）の１：１００希釈液を用いてＣＨＶｇＢの発現を分析した。普通マウス血清およびヤギ抗マウスタンパク質Ａ−セファロース複合体を用いて前洗浄した破砕物を、モノクローナル抗ヤギ抗マウスタンパク質Ａ−セファロース複合体とともに４℃で一晩保温し、１ｘバッファーＡで４回、およびＬｉＣｌ₂／尿素バッファーで２回洗浄した。沈殿したタンパク質を、２ｘＬａｅｍｍｌｉ’ｓバッファー（１２５ｍＭトリス（ｐＨ＝６．８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％２−メルカプトエタノール）を添加することにより免疫複合体から解離させ、５分間沸騰させた。タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分画、固定し、１Ｍサリチル酸ナトリウムで間接撮影用に処理した。ＣＨＶに感染させた細胞（レーンＤ）およびｖＣＰ２９４に感染させた細胞（レーンＣ）からは適切なサイズのタンパク質が沈殿したが、偽感染細胞（レーンＡ）またはＡＬＶＡＣに感染させた細胞（レーンＢ）からは沈殿しなかった（図２９）。これらの結果はｖＣＰ２９４はＣＨＶｇＤを発現することを示している。
このように本発明の好適な実施例を詳細に記述してきたが、添付したクレームによって定義された発明は、上の記述で示された特定の詳細に限定されるものでは無いことは、それらの精神もしくは範囲から外れること無しにそれらの明らかな変化が可能であることから理解されよう。
組換体は、子犬および成犬においてＣＨＶに対する抗体もしくは免疫反応を刺激するために利用可能であり、組換体を感染させた細胞から単離可能である発現産物もまたそうである。さらに、組換体またはそれらの発現産物は、組換体またはそれらの発現産物を投与された動物において抗体を生産可能であり、その抗体はさらにここに記述したように利用可能である。

Claims

以下に記載の配列番号１、１１または１８の配列を有する、イヌヘルペスウイルスｇＢ、ｇＣまたはｇＤ糖タンパク質をコードする単離核酸：
ＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の核酸。
イヌヘルペスウイルスｇＢ糖タンパク質をコードすることを特徴とする請求の範囲第１項記載の単離核酸。
イヌヘルペスウイルスｇＣ糖タンパク質をコードすることを特徴とする請求の範囲第１項記載の単離核酸。
イヌヘルペスウイルスｇＤ糖タンパク質をコードすることを特徴とする請求の範囲第１項記載の単離核酸。
請求の範囲第２項記載の単離核酸を含むベクター。
前記ベクターがポックスウイルスであることを特徴とする請求の範囲第６項記載のベクター。
前記ポックスウイルスがアビポックスウイルスまたはワクシニアウイルスであることを特徴とする請求の範囲第７項記載のベクター。
ウイルスが弱毒化された毒性を有するように内部でウイルスにコードされた遺伝子機能が不活性化されているが、保持された効果を有し；ウイルスゲノムの非必須領域中にイヌヘルペスウイルスｇＢ、ｇＣおよびｇＤの少なくとも１つをコードする外因性ＤＮＡをさらに含む改変組換体であることを特徴とする請求の範囲第６項記載のベクター。
前記ウイルスがポックスウイルスであることを特徴とする請求の範囲第９項記載のベクター。
前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１０項記載のベクター。
少なくとも１つのオープンリーディングフレームを欠失させることにより前記遺伝子機能が不活性化されていることを特徴とする請求の範囲第１１項記載のベクター。
前記欠失された遺伝子機能がＣ７Ｌ−Ｋ１Ｌオープンリーディングフレームまたは宿主域機能を含むことを特徴とする請求の範囲第１２項記載のベクター。
Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６ＲおよびＩ４Ｌからなる群より選択される少なくとも１つの付加的なオープンリーディングフレームが欠失されていることを特徴とする請求の範囲第１３項記載のベクター。
チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子およびリボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの付加的なオープンリーディングフレームが欠失されていることを特徴とする請求の範囲第１３項記載のベクター。
Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６ＲおよびＩ４Ｌが前記ウイルスから欠失されていることを特徴とする請求の範囲第１４項記載のベクター。
チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主域領域およびリボヌクレオチド還元酵素ラージサブユニットが前記ウイルスから欠失されていることを特徴とする請求の範囲第１５項記載のベクター。
ＮＹＶＡＣ組換ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１６項記載のベクター。
ＮＹＶＡＣ組換ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１７項記載のベクター。
宿主中で弱毒化された毒性を有するように改変され；イヌヘルペスウイルスｇＢ、ｇＣおよびｇＤの少なくとも１つをコードする外因性ＤＮＡをウイルスゲノムの非必須領域中に含む改変組換アビポックスウイルスであることを特徴とする請求の範囲第６項記載のベクター。
前記ウイルスがカナリアポックスウイルスであることを特徴とする請求の範囲第２０項記載のベクター。
前記カナリアポックスウイルスが、ニワトリ胚繊維芽細胞上での２００以上の連続継代を通して弱毒化されたＲｅｎｔｓｃｈｌｅｒワクチン株であり、それに由来するマスターシードが、寒天下で４回の連続プラーク精製にかけられ、それ由来のプラーククローンが５回の付加的な継代を通して増幅されたものであることを特徴とする請求の範囲第２１項記載のベクター。
ＡＬＶＡＣ組換体であることを特徴とする請求の範囲第２２項記載のベクター。
ｖＣＰ３２０、ｖＣＰ３２２またはｖＣＰ２９４であることを特徴とする請求の範囲第２３項記載のベクター。
請求の範囲第６、９、１８、２０又は２３項のいずれか１項記載のベクターを細胞内に導入することを特徴とする、遺伝子産物を生体外で培養された細胞内で発現させるための方法。
請求の範囲第６、９、１８、２０又は２３項のいずれか１項記載のベクターの生体外発現により単離されたイヌヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＢ、ｇＣまたはｇＤ。