DE69535561T2 - NUKLEOTID- UND AMINOSÄURESEQUENZEN gB, gC UND gD DES HERPESVIRUS DES HUNDES UND IHRE VERWENDUNGEN - Google Patents

NUKLEOTID- UND AMINOSÄURESEQUENZEN gB, gC UND gD DES HERPESVIRUS DES HUNDES UND IHRE VERWENDUNGEN Download PDF

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Description

  • BEREICH DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft das Herpesvirus des Hundes (CHV), Nucleotide oder isolierte Nucleinsäuren, die die CHV-gB-, -gC- und -gD-Glycoproteine codieren, und die Aminosäuresequenzen davon, Vektoren wie ein rekombinantes Pockenvirus, z.B. Vaccinia- und Avipoxvirus ("Avipoxvirus")-Rekombinanten, die die CHV-gB, -gC und/oder -gD enthalten, die dieselben codieren und exprimieren, Glycoproteine davon, Impfstoffe, immunologische oder antigene Zusammensetzungen des Nucleotids (wie von Vektoren, zum Beispiel einem rekombinanten Pockenvirus, z.B. Vaccinia- oder Avipoxvirus-Rekombinanten, die die (ein) CHV-gB-, -gC- und/oder -gD- codierende(s) und exprimierende(s) Glycoprotein(e) davon enthalten) oder von den Glycoproteinen, zum Beispiel von der Expression der Nucleotide in einem Vektorsystem, und Verfahren, die die Nucleotide, Glycoproteine und Zusammensetzungen anwenden.
  • Einige Veröffentlichungen sind im folgenden Text zitiert, wobei die vollständige Zitierung von jeder im Abschnitt mit dem Titel Bezugnahmen dargelegt ist. Die Veröffentlichung, die im Verlauf des Textes zitiert ist, ist hiermit durch Bezugnahme hierin inkorporiert.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Das Herpesvirus des Hundes (CHV) verursacht eine tödliche, hämorrhagische Krankheit in neugeborenen Welpen und eine selbst-limitierende, normalerweise subklinische Infektion des oberen Atmungstrakts in erwachsenen Hunden (Appel, 1987). Es ist gezeigt worden, dass verschiedene Stämme und Isolate von CHV basierend auf Unterschiedenen in den Restriktionsendonuclease-Spaltungsmustern ihrer DNA voneinander unterschieden werden können (Xuan et al., 1990). Es ist jedoch wenig über die genomische Struktur von CHV bekannt. Das Genom ist nicht kartiert worden, und es ist keine Nucleotidsequenz veröffentlicht worden. Darüber hinaus, obwohl CHV-neutralisierende Antikörper nach der Immunisierung von Mäusen mit CHV (Xuan et al., 1991) oder gereinigten CHV-Glycoproteinen (Limcupao et al., 1991) hergestellt worden sind, sind die Gene, die immunologisch entsprechende Proteine codieren, nicht identifiziert worden.
  • Herpesvirus-Glycoproteine vermitteln wesentliche virale Funktionen wie die zelluläre Anheftung und Penetration, die Zell-zu-Zell-Verbreitung des Virus und, was wichtig ist, bestimmen das Pathogenitätsprofil der Infektion. Herpesvirus-Glycoproteine sind kritische Bestandteile in der Interaktion mit dem Immunsystem des Wirts (Seear, 1985a; Seear 1985b). Herpesvirus-Glycoproteine sind Antigene, die sowohl durch die humoralen als auch die zellulären Immunsysteme erkannt werden, und es ist gezeigt worden, dass sie schützende Immunantworten in geimpften Wirten hervorrufen (Wachsman et al., 1987; Marchioli et al., 1987; Eberle et al., 1980; Papp-Vid et al., 1979).
  • Während einer Herpesvirus-Infektion richtet sich der Hauptanteil der Immunantwort gegen die viralen Hüllen-Glycoproteine. Es ist gezeigt worden, dass diese Antigene sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten hervorrufen. Einige Berichte haben darauf hingewiesen, dass eine Impfung mit den Herpesvirus-gB-, -gC- und/oder -gD-Glycoproteinen in anderen Herpesvirus-Systemen eine schützende Immunantwort induzieren kann.
  • Die gut charakterisierten Glycoproteine des Herpes simplex-Virus schließen gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gJ, gK, gL und gM ein (Seear, 1985a; Seear 1985b; Ackermann et al., 1986; Frink et al., 1983; Frame et al., 1986; Longnecker et al., 1987; Richman et al., 1986; Swain et al., 1985; Zezulak, 1984; Roizman und Sears, 1990; Hutchinson et al., 1992a; Hutchinson et al., 1992b; Raines und Roizman, 1993). Eine Reihe von Untersuchungen hat auf die Wichtigkeit von Herpes simplex-Virus-Glycoproteinen im Hervorrufen von Immunantworten hingewiesen. Daher ist berichtet worden, dass gB und gD wichtige Immunantworten hervorrufen können (Berman et al., 1983; Cantin et al., 1987; Cremer et al., 1985; Lasky et al., 1984; Martin et al., 1987a; Martin et al., 1987b; Paoletti et al., 1984; Perkus et al., 1985; Rooney et al., 1988; Wachsman et al., 1987; Zarling et al., 1986a; Zarling et al., 1986b). gC kann auf Klasse I-beschränkte cytotoxische Lymphocyten stimulieren (Glorioso et al., 1985; Rosenthal et al., 1987), wohingegen gD für Klasse II cytotoxische T-Zell-Antworten stimulieren kann (Martin et al., 1987a; Martin et al., 1987b; Wachsman et al., 1987; Zarling et al., 1986a; Zarling 1986b). Von gG wurde gezeigt, dass es ein Ziel für eine Komplement-abhängige, Antikörper-gelenkte Virus-Neutralisierung ist (Sullivan et al., 1987; Sullivan et al., 1988). Von einer Reihe von Glycoproteinen von anderen Herpesviren ist auch gezeigt worden, dass sie wichtige Immunantworten hervorrufen.
  • Beide Subtypen des Herpesvirus vom Pferd (EHV) exprimieren sechs abundante Glycoproteine (Allen et al., 1986; Allen et al., 1987). Die genomischen Teile der DNA-Sequenzen, die gp2, gp10, gp13, gp14, gp17/18 und gp21/22a codieren, sind unter Verwendung von Lambda-gt11-Expressionsvektoren und monoclonalen Antikörpern bestimmt worden (Allen et al., 1987). Die Glycoproteine gb13 und gp14 waren in denselben Orten innerhalb der L-Komponente des Genoms lokalisiert, an die die gC- beziehungsweise gB-Homologe des Herpes simplex-Virus kartieren (Allen et al., 1987). Die Hüllen-Glycoproteine sind die Haupt-Immunogene von Herpesviren, die in das Hervorrufen sowohl der humoralen als auch der zellulären Wirt-Immunantworten involviert sind (Ben-Porat et al., 1986; Cantin et al., 1987; Glorioso et al., 1984; Wachsman et al., 1988; Wachsman et al., 1989), und sind so von höchstem Interesse für jene, die versuchen, Impfstoffe zu gestalten.
  • Vor kurzem ist über die Nucleotidsequenz des Kentucky T431-Stamms der transkriptionellen EHV-1-Einheit, die gp13 codiert, berichtet worden (Allen et al., 1988). Von dem Glycoprotein wurde gezeigt, dass es homolog zum Herpes simplex-Virus (HSV)-gC-1 und -gC-2, zum Pseudorabiesvirus (PRV)-gIII und zum Varizella-Virus (VZV)-gpV ist (Allen et al., 1988). EHV-1-gp13 ist daher das strukturelle Homolog der Herpesvirus gC-ähnlichen Glycoproteine.
  • Über die Nucleotidsequenz von EHV-1-gp14 (Whalley et al., 1989; Riggio et al., 1989) ist kürzlich berichtet worden. Eine Analyse der vorhergesagten Aminosäuresequenz des gp14-Glycoproteins offenbarte eine signifikante Homologie zu dem entsprechenden Glycoprotein von HSV, gB.
  • Von monoclonalen Antikörpern, die gegen manche EHV-1-Glycoproteine gerichtet sind, ist gezeigt worden, dass sie neutralisierend sind (Sinclair et al., 1989). Passive Immunisierungsexperimente zeigten, dass monoclonale Antikörper, die gegen gp13 oder gp14 (Shimizu et al., 1989) oder gegen gp13, gp14 oder gp17/18 (Stokes et al., 1989) gerichtet sind, Hamster gegen eine letale Herausforderung schützen konnten. Andere gB- und gC-Glycoprotein-Analoge sind auch in den Schutz vor Krankheiten, die durch Alphaherpesviren verursacht werden, involviert (Cantin et al., 1987; Cranage et al., 1986; Glorioso et al., 1984).
  • Das Pseudorabiesvirus (PRV), ein Alphaherpesvirus, ist das verursachende Agens der Aujesky-Krankheit. Das PRV-Genom besteht aus einer doppelsträngigen 90 × 106 Dalton-DNA (Rubenstein et al., 1975), die durch invertierte Wiederholungssequenzen in einzigartige lange (UL) oder einzigartige kurze (US) Segmente geteilt wird (Stevely, 1977; Ben-Porat et al., 1979). Das PRV-Genom codiert ungefähr 100 Polypeptide, deren Expression in einer kaskadenartigen Weise ähnlich zu anderen Herpesviren reguliert wird (Ben-Porat et al., 1985; Hampl et al., 1984).
  • Das PRV-Glycoprotein gp50 ist das Herpes simplex-Virus Typ-1 (HSV-1)-gD-Analog (Wathen et al., 1984). Der offene Leserahmen der DNA codiert 402 Aminosäuren (Petrovskis et al., 1986). Die reife glycosylierte Form (50–60 kDa) enthält ein O-verknüpftes Kohlenhydrat ohne N-verknüpfte Glycosylierung (Petrovskis et al., 1986). Schweineserum ist hochgradig reaktiv mit PRV-gp50, was seine Wichtigkeit als ein Immunogen nahelegt. Monoclonale Antikörper gegen gp50 neutralisieren mit oder ohne Komplement PRV in vitro (Wathen et al., 1984; Wathen 1985; Eloit et al., 1988) und schützen Mäuse (Marchioli et al., 1988; Wathen et al., 1985; Eloit et al., 1988) und Schweine passiv (Marchioli et al., 1988). Vacciniavirus-Rekombinante, die PRV-gp50 exprimieren, induzierten Serum-neutralisierende Antikörper und schützten sowohl Mäuse als auch Schweine gegen eine letale PRV-Herausforderung (Kost et al., 1989; Marchioli et al., 1987; Ishii et al., 1988).
  • PRV-gIII ist das HSV-1-gC-Analog (Robbins et al., 1986). Ein funktioneller Ersatz von PRV-gIII durch HSVgC wurde nicht beobachtet (Whealy et al., 1989). Obwohl PRV-gIII für eine Replikation in vitro nicht wesentlich ist (Wathen et al., 1986; Robbins et al., 1986), ist die reife glycosylierte Form (98 kDa) ein häufig vorkommender Bestandteil der PRV-Hülle. Monoclonale anti-gpIII-Antikörper neutralisieren das Virus in vitro mit oder ohne Komplement (Hampl et al., 1984; Eloit et al., 1988; Wathen et al., 1986) und können Mäuse und Schweine passiv schützen (Marchioli et al., 1988). Das PRV-Glycoprotein gIII kann Mäuse und Schweine nach einer Immunisierung mit einem Cro/gIII-Fusionsprotein, das in E. coli exprimiert wird (Robbins, A., R. Watson, L. Enquist, Europäische Patentanmeldung 0162738A1 ), oder wenn es in einer Vaccinia-Rekombinante exprimiert wird (Panicali, D., L. Gritz, G. Mazzara, Europäische Patentanmeldung 0261940A2 ) vor einer letalen PRV-Herausforderung schützen.
  • PRV-gpII ist das HSV-1-gB-Homolog (Robbins et al., 1987). Von monoclonalen Antikörpern, die gegen PRV-geII gerichtet sind, ist gezeigt worden, dass sie das Virus in vitro (Ben-Porat et al., 1986) mit oder ohne Komplement (Wittmann et al., 1989) neutralisieren. Darüber hinaus zeigten passive Immunisierungsuntersuchungen, dass neutralisierende monoclonale Antikörper Schweine teilweise schützten (Marchioli et al., 1988). Es ist gezeigt worden, dass die Immunisierung mit auf NYVAC (einem hochgradig abgeschwächten Vacciniavirus)basierenden Rekombinanten, die Pseudorabiesvirus (PRV)-gII (gB) oder -gp50 (gD) exprimieren, Schweine gegen eine virulente PRV-Herausforderung schützt (Brockmeier et al., 1993). Darüber hinaus ist gezeigt worden, dass Vaccinia-Rekombinanten, die PRV-gII und -gp50 oder -gII, -gIII (gC) und -gp50 exprimieren, einen höheren Grad des Schutzes hervorrufen als Rekombinanten, die gII oder gp50 alleine exprimieren, was eine potenzielle synergistische Wirkung mit diesen Glycoproteinen nahelegt (Riviere et al., 1992).
  • Das Herpes simplex-Virus Typ-1 (HSV1)-Genom codiert mindestens elf antigenisch verschiedene Glycoproteine: gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gJ, gK, gL und gM (Roizman et al., 1990). Mäuse, die mit gereinigtem HSV1-gB, -gC oder -gD immunisiert wurden, sind gegen eine letale HSV1-Herausforderung geschützt (Chan, 1983). Mäuse sind auch durch eine passive Immunisierung mit Antikörpern gegen Gesamt-HSV1- (Davis et al., 1979) oder HSV2- (Oakes et al., 1978) Virus und mit Antikörpern gegen die individuellen HSV2-gB-, -gC-, -gD- oder -gE-Glycoproteine (Balachandran et al., 1982) gegen eine letale HSV1- oder HSV2-Herausforderung geschützt worden.
  • Es ist gezeigt worden, dass Vacciniavirus-Vektoren, die HSV1-gB (McLaughlin-Taylor et al., 1988) und HSV1-gC (Rosenthal et al., 1987) exprimieren, cytotoxische T-Zellantworten induzieren. Zusätzlich ist gezeigt worden, dass Mäuse, die mit rekombinantem Vacciniavirus, das entweder HSV1-gB (Cantin et al., 1987), HSV1-gC (Weir et al., 1989) oder HSV1-gD (Paoletti et al., 1984) exprimiert, immunisiert wurden, gegen eine letale Herausforderung von HSV1 geschützt sind. Es ist auch gezeigt worden, dass ein rekombinantes Vacciniavirus, das HSV1-gD exprimiert, in einem Meerschweinchen-Modellsystem schützend vor HSV2 ist (Wachsman et al., 1987).
  • Rinder-Herpesvirus 1 (BHV1) spezifiziert mehr als 30 strukturelle Polypeptide, von denen 11 glycosyliert sind (Misra et al., 1981). Drei von diesen Glycoproteinen, gI, gIII und gIV, sind charakterisiert worden, und es ist gefunden worden, dass sie homolog zu den Herpes simplex-Virus (HSV)-Glycoproteinen gB, gC und gD sind (Lawrence et al., 1986, Zamb, 1987). Es ist gezeigt worden, dass eine Immunisierung mit dem gereinigten Rinder-Herpesvirus Typ 1 (BHV1)-gI (gB), -gIII (gC) und/oder -gIV (gD) Rinder gegen eine BHV1/Pasteurella haemolytica-Herausforderung schützt (Babiuk et al., 1987).
  • Es ist gezeigt worden, dass das feline Herpesvirus Typ-1 (FHV-1) mindestens 23 unterschiedliche Proteine enthält (Meas et al., 1984; Fargeaud et al., 1984). Mindestens fünf davon sind glycosyliert (Fargeaud et al., 1984; Compton, 1989), wobei die berichteten Molekulargewichte im Bereich von 120 kDa bis 60 kDa sind. Es ist gezeigt worden, dass die FHV-1-Glycoproteine immunogen sind (Meas et al., 1984; Compton, 1989). Wie einige andere Alphaherpesviren scheint FHV-1 ein Homolog des Glycoproteins B (gB) von HSV-1 zu haben (Maeda et al., 1992). Das FHV-1-gB-Glycoprotein ist ein 134 kDa-Komplex, der mit β-Mercaptoethanol in zwei Glycoproteine von 66 kDa und 60 kDa dissoziiert wird. Das FHV-1-DNA-Genom ist ungefähr 134 Kb groß (Rota et al., 1986).
  • Das Epstein Barr-Virus (EBV), ein menschliches B-lymphotropes Herpesvirus, ist ein Mitglied der Gattung Lymphocryptovirus, die zu der Unterfamilie Gammaherpesvirus gehört (Roizman et al., 1990). Da das EBV-Genom vollständig sequenziert wurde (Baer et al., 1984), wie die Genome von VZV (Davison et al., 1986), HSV1 (McGeoch et al., 1988), MCHV (Chee et al., 1990) und EHV1 (Telford et al., 1992), sind zahlreiche Homologien zwischen diesen verschiedenen Herpesviren beschrieben worden (Kieff et al., 1990).
  • Das menschliche Cytomegalievirus (HCMV) ist ein Mitglied der Betaherpesvirinae-Unterfamilie (Familie Herpesviridae). Drei immunologisch verschiedene Familien von Glycoproteinen, die mit der HCMV-Hülle assoziiert sind, sind beschrieben worden (Gretch et al., 1998): gCI (gp55 und gp93-130); gCII (gp47-52); und gCIII (gp85-145). Das Gen, das gCI codiert, ist homolog zu HSVI-gB.
  • Zusätzlich ist gezeigt worden, dass eine Immunisierung mit einer Gefügelpocken-Rekombinante, die das Marek-Krankheit-Virus (MDV)-gB exprimiert, Hühner gegen eine virulente MDV-Herausforderung schützt (Nazarian et al., 1992).
  • Die Ergebnisse dieser Untersuchungen weisen darauf hin, dass eine Immunantwort gegen die gB-, gC- und/oder gD-Glycoproteine Tiere der Zielspezies gegen eine Herpesvirus-Herausforderung schützen kann und dass die Bereitstellung von Nucleotiden für CHV-gB-, -gC- und -gD-Glycoproteine ein wertvoller Fortschritt gegenüber dem derzeitigen Stand der Technik ist, da es das Bereitstellen der Glycoproteine und von antigenen, immunologischen oder Impfstoff-Zusammensetzungen von den Vektorsystemen und von den Glycoproteinen ermöglicht. Darüber hinaus können die Glycoproteine von der Expression der Nucleotide verwendet werden, um Antikörper hervorzurufen, die weiter in diagnostischen Antikörperbindungs-Tests, Kits oder Tests zum Absichern des Vorliegens oder Fehlens der Glycoproteine/des Glycoproteins in einer Probe wie Seren und daher des Vorliegens oder Fehlens von CHV oder einer Immun- oder antigenen Antwort (gegen entweder CHV oder die Glycoproteine) verwendet werden können. Daher fließen viele Nutzen aus dem Bereitstellen der Nucleotide für CHV-gB-, -gC- und -gD-Glycoproteine.
  • Es gibt verschiedene Vektorsysteme für die Expression von exogener DNA wie die Phagen-, z.B. Lambda-, und E. coli-Systeme (Allen et al., 1987; Robbins, EPA 0162738 A1 ; Panicali, EPA 0261940 A2 , jede davon ist hierin durch Bezugnahme ausdrücklich inkorporiert).
  • Das Vacciniavirus und kürzlicher andere Pockenviren sind für die Insertion und Expression von fremden Genen verwendet worden. Die Grundtechnik des Inserierens von fremden Genen in einen lebenden infektiösen Pockenvirus involviert die Rekombination zwischen Pocken-DNA-Sequenzen, die ein fremdes genetisches Element in einem Spenderplasmid flankieren, und homologen Sequenzen, die im rettenden Pockenvirus vorhanden sind (Piccini et al., 1987).
  • Genau gesagt werden die rekombinanten Pockenviren in zwei Schritten konstruiert, die auf dem Fachgebiet bekannt und analog zu den Verfahren für das Erzeugen von synthetischen Rekombinanten von Pockenviren wie dem Vacciniavirus und dem Avipoxvirus sind, die in den US-Patenen Nr. 4,769,330 , 4,772,848 , 4,603,112 , 5,100,587 und 5,179,993 beschrieben sind, wobei die Offenbarungen davon hierin durch Bezugnahme inkorporiert sind.
  • Zuerst wird die DNA-Gensequenz, die in das Virus inseriert werden soll, insbesondere ein offener Leserahmen von einer Nicht-Pocken-Quelle, in ein E. coli-Plasmid-Konstrukt platziert, in das eine DNA, die homolog zu einem Teil der DNA des Pockenvirus ist, inseriert worden ist. Getrennt wird die DNA-Gensequenz, die inseriert werden soll, an einen Promotor ligiert. Die Promotor-Gen-Verbindung wird in dem Plasmidkonstrukt so positioniert, dass die Promotor-Gen-Verbindung auf beiden Enden durch eine DNA flankiert wird, die homolog zu einer DNA-Sequenz ist, die eine Region von Pocken-DNA flankiert, die einen nicht-essentiellen Locus enthält. Das resultierende Plasmidkonstrukt wird dann durch Züchten in E. coli-Bakterien amplifiziert (Clewell, 1972) und isoliert (Clewell et al., 1969; Maniatis et al., 1982).
  • Zweitens wird das isolierte Plasmid, das die DNA-Gensequenz, die inseriert werden soll, enthält, in eine Zellkultur, z.B. Hühnerembryofibroblasten, zusammen mit dem Pockenvirus transfiziert. Die Rekombination zwischen der homologen Pocken-DNA in dem Plasmid beziehungsweise dem viralen Genom ergibt ein Pockenvirus, das durch das Vorliegen fremder DNA-Sequenzen in einer nicht-essentiellen Region seines Genoms modifiziert ist. Der Begriff „fremde" DNA bezeichnet exogene DNA, insbesondere DNA von einer Nicht-Pocken-Quelle, die Genprodukte codiert, die normalerweise nicht durch das Genom produziert werden, in das die exogene DNA platziert wird.
  • Eine genetische Rekombination ist im Allgemeinen der Austausch von homologen Abschnitten der DNA zwischen zwei Strängen der DNA. In bestimmten Viren kann RNA DNA ersetzen. Homologe Abschnitte einer Nucleinsäure sind Abschnitte einer Nucleinsäure (DNA oder RNA), die dieselbe Sequenz von Nucleotidbasen aufweisen.
  • Eine genetische Rekombination kann natürlich während der Replikation oder Herstellung von neuen viralen Genomen in der infizierten Wirtszelle erfolgen. Daher kann eine genetische Rekombination zwischen viralen Genen während des viralen Replikationszyklus erfolgen, der in einer Wirtszelle erfolgt, die mit zwei oder mehreren unterschiedlichen Viren oder anderen genetischen Konstrukten co-infiziert wird. Ein Abschnitt einer DNA von einem ersten Genom wird austauschbar im Konstruieren des Abschnitts des Genoms eines zweiten co-infizierenden Virus verwendet, in dem die DNA homolog mit jener des ersten viralen Genoms ist.
  • Die Rekombination kann jedoch auch zwischen Abschnitten der DNA in verschiedenen Genomen stattfinden, die nicht perfekt homolog sind. Wenn solch ein Abschnitt von einem ersten Genom ist, das homolog mit einem Abschnitt eines anderen Genoms ist, mit der Ausnahme des Vorliegens von zum Beispiel einem genetischen Marker oder einem Gen, das eine antigene Determinante codiert, die in einen Teil der homologen DNA inseriert wurde, im ersten Abschnitt, kann eine Rekombination noch immer stattfinden, und die Produkte jener Rekombination sind dann durch das Vorliegen jenes genetischen Markers oder Gens im rekombinanten viralen Genom nachweisbar. Zusätzliche Strategien sind kürzlich für das Herstellen eines rekombinanten Vacciniavirus berichtet worden.
  • Eine erfolgreiche Expression der inserierten genetischen DNA-Sequenz durch das modifizierte infektiöse Virus erfordert zwei Bedingungen. Erstens muss die Insertion in eine nicht-essentielle Region des Virus erfolgen, damit das modifizierte Virus lebensfähig bleibt. Die zweite Bedingung für die Expression der inserierten DNA ist das Vorliegen eines Promotors in der korrekten Beziehung zu der inserierten DNA. Der Promotor muss so platziert werden, dass er stromaufwärts der DNA-Sequenz, die exprimiert werden soll, gelegen ist.
  • Vacciniavirus ist erfolgreich verwendet worden, um gegen Pocken zu impfen, was in der weltweiten Ausrottung von Pocken in 1980 gipfelte. Im Verlauf seiner Geschichte sind viele Stämme von Vaccinia entstanden. Diese verschiedenen Stämme zeigen eine variierende Immunogenität und werden in verschiedenen Ausmaßen mit potenziellen Komplikationen in Verbindung gebracht, wobei die schwersten davon eine Encephalitis nach der Vacciniainfektion und generalisierte Vaccinia sind (Behbehani, 1983).
  • Mit der Ausrottung der Pocken wurde eine neue Rolle für Vaccinia wichtig, jene eines gentechnisch hergestellten Vektors für die Expression von fremden Genen. Gene, die eine große Zahl von heterologen Antigenen codieren, sind in Vaccinia exprimiert worden, was oft in einer schützenden Immunität gegen eine Herausforderung durch das entsprechende Pathogen resultiert (Literaturübersicht in Tartaglia et al., 1990a).
  • Es ist gezeigt worden, dass der genetische Hintergrund des Vaccinia-Vektors die schützende Wirksamkeit des exprimierten fremden Immunogens beeinflusst. Zum Beispiel schützte die Expression von Epstein Barr-Virus (EBV)-gp340 im Wyeth-Impfstoffstamm des Vacciniavirus Lisztaffen („cottontop tamarins") nicht gegen EBV-Virus-induziertes Lymphom, während die Expression desselben Gens im WR-Laborstamm von Vacciniavirus schützend war (Morgan et al., 1988).
  • Eine feine Balance zwischen der Wirksamkeit und der Sicherheit eines Vacciniavirus-basierenden rekombinanten Impfstoff-Kandidaten ist äußerst wichtig. Das rekombinante Virus muss das (die) Immunogen(e) in einer Weise präsentieren, die eine schützende Immunantwort im geimpften Tier hervorruft, der aber jegliche signifikante pathogene Eigenschaften fehlen. Daher würde das Abschwächen des Vektorstamms ein höchst wünschenswerter Fortschritt gegenüber dem derzeitigen Stand der Technik sein.
  • Eine Reihe von Vacciniagenen ist identifiziert worden, die für das Wachstum des Virus in Gewebekultur nicht wesentlich sind und deren Deletion oder Inaktivierung die Virulenz in einer Vielfalt von Tiersystemen reduziert.
  • Das Gen, das die Vacciniavirus-Thymidinkinase (TK) codiert, ist kartiert (Hruby et al., 1982) und sequenziert worden (Hruby et al., 1983; Weir et al., 1983). Die Inaktivierung oder vollständige Deletion des Thymidinkinase-Gens verhindert nicht das Wachstum des Vacciniavirus in einer breiten Vielfalt von Zellen in Gewebekultur. TK-Vacciniavirus ist auch zur Replikation in vivo an der Stelle der Impfung auf eine Vielfalt von Wegen in einer Vielfalt von Wirten in der Lage.
  • Es ist für das Herpes simplex-Virus Typ 2 gezeigt worden, dass eine intravaginale Impfung von Meerschweinchen mit dem TK–-Virus in signifikant niedrigeren Virustitern im Rückenmark resultierte als dies die Impfung mit dem TK+-Virus tat (Stanberry et al., 1985). Es ist gezeigt worden, dass ein Herpesvirus, das die TK-Aktivität in vitro codiert, nicht für das Viruswachstum in aktiv metabolisierenden Zellen wichtig war, aber für das Viruswachstum in ruhenden Zellen erforderlich war (Jamieson et al., 1974).
  • Eine Abschwächung von TK–-Vaccinia ist in Mäusen gezeigt worden, die auf den intracerebralen und intraperitonealen Wegen geimpft wurden (Bullen et al., 1985). Eine Abschwächung wurde sowohl für den neurovirulenten WR-Laborstamm als auch für den Wyeth-Impfstoffstamm beobachtet. In Mäusen, die durch den intradermalen Weg geimpft wurden, erzeugte rekombinantes TK–-Vaccinia im Vergleich zum Eltern-TK+-Vacciniavirus äquivalente neutralisierende anti-Vaccinia-Antikörper, was darauf hinweist, dass der Verlust der TK-Funktion in diesem Testsystem die Immunogenität des Vacciniavirus-Vektors nicht signifikant senkt. Nach der intranasalen Impfung von Mäusen mit rekombinantem TK–- und TK+-Vacciniavirus (WR-Stamm) ist eine signifikant geringere Verbreitung des Virus zu anderen Stellen, einschließlich des Gehirns, gefunden worden (Taylor et al., 1991a).
  • Ein anderes Enzym, das in den Nucleotid-Metabolismus involviert ist, ist die Ribonucleotid-Reduktase. Es wurde gezeigt, dass der Verlust einer viral codierten Ribonucleotid-Reduktase-Aktivität im Herpes simplex-Virus (HSV) durch Deletion des Gens, das die große Untereinheit codiert, keine Auswirkung auf das virale Wachstum und die DNA-Synthese in sich teilenden Zellen in vitro hat, aber die Fähigkeit des Virus, auf an Serum-ausgehungerten Zellen zu wachsen, schwer beeinträchtigte (Goldstein et al., 1988). Unter Verwendung eines Mausmodells für eine akute HSV-Infektion des Auges und eine reaktivierbare latente Infektion in den Trigeminus-Ganglien wurde eine reduzierte Virulenz für HSV, von dem die große Untereinheit der Ribonucleotid-Reduktase deletiert wurde, im Vergleich zu der Virulenz, die durch das Wildtyp-HSV gezeigt wird, gezeigt (Jacobson et al., 1989).
  • Sowohl die kleine (Slabaugh et al., 1988) als auch die große (Schmitt et al., 1988) Untereinheit der Ribonucleotid-Reduktase sind im Vacciniavirus identifiziert worden. Eine insertionelle Inaktivierung der großen Untereinheit der Ribonucleotid Reduktase im WR-Stamm des Vacciniavirus führt zu einer Abschwächung des Virus, gemessen durch intracraniale Impfung von Mäusen (Child et al., 1990).
  • Das Vacciniavirus-Hämagglutinin-Gen (HA) ist kartiert und sequenziert worden (Shida, 1986). Das HA-Gen von Vacciniavirus ist nicht essentiell für das Wachstum in Gewebekultur (Ichihashi et al., 1971). Die Inaktivierung des HA-Gens des Vacciniavirus resultiert in einer reduzierten Neurovirulenz in Kaninchen, die auf dem intracranialen Weg geimpft wurden, und kleineren Läsionen an der Stelle der intradermalen Impfung in Kaninchen (Shida et al., 1988). Der HA-Locus wurde für die Insertion von fremden Genen in den WR-Stamm (Shida et al., 1987), Derivate des Lister-Stamms (Shida et al., 1988) und den Copenhagen-Stamm (Guo et al., 1989) von Vacciniavirus verwendet. Es ist gezeigt worden, dass rekombinantes HA-Vacciniavirus, das fremde Gene exprimiert, immunogen (Guo et al., 1989; Itamura et al., 1990; Shida et al., 1988; Shida et al., 1987) und schützend gegen eine Herausforderung durch das relevante Pathogen ist (Guo et al., 1989; Shida et al., 1987).
  • Das Kuhpockenvirus (Brighton red-Stamm) produziert rote (hämorrhagische) Pocken auf der Chroinallantois-Membran von Hühnereiern. Spontane Deletionen im Kuhpocken-Genom erzeugen Mutanten, die weiße Pocken produzieren (Pickup et al., 1984). Die hämorrhagische Funktion (u) kartiert auf ein 38 kDa-Protein, das durch ein frühes Gen codiert wird (Pickup et al., 1986). Es ist gezeigt worden, dass dieses Gen, das eine Homologie zu Serin-Protease-Inhibitoren hat, die entzündliche Antwort des Wirts auf das Kuhpockenvirus inhibiert (Palumbo et al., 1989) und ein Inhibitor der Blutgerinnung ist.
  • Das u-Gen ist im WR-Stamm von Vacciniavirus vorhanden (Kotwal et al., 1989b). Mäuse, die mit einer WR-Vacciniavirus-Rekombinante, in der die u-Region durch Insertion eines fremden Gens inaktiviert worden ist, geimpft wurden, produzieren im Vergleich zu Mäusen, die mit einem ähnlichen rekombinanten Vacciniavirus, in dem das u-Gen intakt ist, geimpft wurden, höhere Antikörperspiegel gegen das fremde Genprodukt (Zhou et al., 1990). Die u-Region ist in einer defekten, nicht-funktionellen Form im Copenhagen-Stamm von Vacciniavirus vorhanden (offene Leserahmen B13 und B14 nach der Terminologie, über die in Goebel et al., 1990a,b berichtet wird).
  • Das Kuhpockenvirus ist in infizierten Zellen in cytoplasmatischen Typ A-Einschlusskörpern (ATI) lokalisiert (Kato et al., 1959). Es wird angenommen, dass die Funktion von ATI der Schutz der Kuhpocken-Virionen während der Verbreitung von Tier zu Tier ist (Bergoin et al., 1971). Die ATI-Region des Kuhpocken-Genoms codiert ein 160 kDa-Protein, das die Matrix der ATI-Körper bildet (Funahashi et al., 1988; Patel et al., 1987). Das Vacciniavirus, obwohl es eine homologe Region in seinem Genom enthält, produziert im Allgemeinen keine ATI. Im WR-Stamm von Vaccinia wird die ATI-Region des Genoms als ein 94 kDa-Protein translatiert (Patel et al., 1988). Im Copenhagen-Stamm des Vacciniavirus sind die meisten der DNA-Sequenzen, die der ATI-Region entsprechen, deletiert, wobei das verbleibende 3'-Ende der Region mit Sequenzen stromaufwärts der ATI-Region fusioniert ist, um den offenen Leserahmen (ORF) A26L zu bilden (Goebel et al., 1990a,b).
  • Über eine Vielfalt von spontanen (Altenburger et al., 1989; Drillien et al., 1981; Lai et al., 1989; Moss et al., 1981; Paez et al., 1985; Panicali et al., 1981) und gestalteten (Perkus et al., 1991; Perkus et al., 1989; Perkus et al., 1986) Deletionen nahe dem linken Ende des Vacciniavirus-Genoms ist berichtet worden. Es wurde gezeigt, dass ein WR-Stamm von Vacciniavirus mit einer spontanen 10 kb-Deletion (Moss et al., 1981; Panicali et al., 1981) durch intracraniale Impfung in Mäusen abgeschwächt wurde (Buller et al., 1985). Von dieser Deletion wurde später gezeigt, dass sie 17 potenzielle ORFs einschließt (Kotwal et al., 1988b). Spezifische Gene in der deletierten Region schließen das Virokin N1L und ein 35 kDa-Protein (C3L nach der Terminologie, über die in Goebel et al., 1990a,b, berichtet wird) ein. Eine insertionelle Inaktivierung von NIL reduziert die Virulenz durch intracraniale Impfung sowohl für normale als auch Nacktmäuse (Kotwal et al., 1989a). Das 35 kDa-Protein wird wie N1L in das Medium von Vacciniavirus-infizierten Zellen sezerniert. Das Protein enthält eine Homologie zu der Familie der Komplement-Kontrollproteine, insbesondere zu Komplement 4B-Bindungsprotein (C4bp) (Kotwal et al., 1988a). Wie das zelluläre C4bp bindet das 35 kDa-Vaccinia-Protein die vierte Komponente des Komplements und inhibiert die klassische Komplement-Kaskade (Kotwal et al., 1990). Daher scheint es, dass das 35 kDa-Vaccinia-Protein das Virus beim Umgehen der Wirts-Abwehrmechanismen unterstützt.
  • Das linke Ende des Vaccinia-Genoms schließt zwei Gene ein, die als die Wirtsbereichs-Gene K1L (Gillard et al., 1986) und C7L (Perkus et al., 1990) identifiziert worden sind. Die Deletion von beiden dieser Gene reduziert die Fähigkeit des Vacciniavirus, auf einer Vielfalt von menschlichen Zelllinien zu wachsen (Perkus et al., 1990).
  • Zwei zusätzliche Impfstoffvektorsysteme involvieren die Verwendung von natürlicherweise auf Wirte eingeschränkten Pockenviren, der Vogelpockenviren. Sowohl Geflügelpockenvirus (FPV) und Kanarienpockenvirus (CPV) sind manipuliert worden, um fremde Genprodukte zu exprimieren. Das Geflügelpockenvirus (FPV) ist das prototypische Virus der Vogelpockenvirus-Gattung der Pockenvirusfamilie. Das Virus verursacht eine wirtschaftlich wichtige Krankheit des Geflügels, die seit den 1920ern durch die Verwendung von abgeschwächten Lebendimpfstoffen gut kontrolliert worden ist. Die Replikation der Vogelpockenviren ist auf Vogelspezies beschränkt (Matthews, 1982b), und es gibt keine Berichte in der Literatur über ein Vogelpockenvirus, das eine produktive Infektion in irgendeiner Nicht-Vogel-Spezies, einschließlich Mensch, verursacht. Diese Wirt-Einschränkung liefert eine angeborene Sicherheitsbarriere gegen eine Übertragung des Virus auf andere Spezies und macht die Verwendung von auf Vogelpockenvirus basierenden Impfstoffvektoren in tierärztlichen und menschlichen Anwendungen zu einem attraktiven Vorhaben.
  • FPV ist vorteilhaft als ein Vektor, der Antigene von Geflügel-Pathogenen exprimiert, verwendet worden. Das Hämagglutinin-Protein eines virulenten Vogelgrippe-Virus wurde in einer FPV-Rekombinante exprimiert (Taylor et al., 1988a). Nach der Impfung der Rekombinante in Hühner und Puten wurde eine Immunantwort induziert, die entweder gegen eine homologe oder eine heterologe virulente Influenzavirus-Herausforderung schützend war (Taylor et al., 1988a). FPV-Rekombinanten, die die Oberflächen-Glycoproteine des Newcastle-Krankheits-Virus exprimieren, sind auch entwickelt worden (Taylor et al., 1990; Edbauer et al., 1990).
  • Trotz der Wirt-Einschränkung für die Replikation von FPV und CPV auf Vogelsysteme wurde gefunden, dass Rekombinanten, die von diesen Viren stammen, extrinsische Proteine in Zellen von Nicht-Vogel-Ursprung exprimieren. Weiterhin wurde gezeigt, dass solche rekombinante Viren immunologische Antworten, die gegen das fremde Genprodukt gerichtet sind, hervorrufen, und wo es passend ist wurde gezeigt, dass sie einen Schutz vor einer Herausforderung gegen das entsprechende Pathogen bieten (Tartaglia et al., 1993 a, b; Taylor et al., 1992; 1991b; 1988b).
  • Obwohl vor Kurzem gezeigt worden ist, dass affinitätsgereinigte Herpesvirus-Glycoproteine des Hundes, wenn sie in Mäuse injiziert werden, die Produktion von Virus-neutralisierenden Antikörpern hervorrufen können (Limcumpao et al., 1991), sind vordem die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen der CHV-gB-, -gC- und -gD-Glycoproteine nicht gelehrt oder vorgeschlagen worden, und das Bereitstellen dieser Sequenzen würde von großem Wert sein. Weiterhin sind ein Impfstoff, antigene oder immunologische Zusammensetzungen von den Nucleotiden für die CHV-gB-, -gC- und -gD-Glycoproteine (wie Formvektorsysteme, die solche Nucleotide enthalten) sowie von den Glycoproteinen selbst (wenn sie von Vektorsystemen exprimiert werden, die solche Nucleotide enthalten) vordem nicht gelehrt oder vorgeschlagen worden, und diese Nucleotide, Vektorsysteme, Glycoproteine und Zusammensetzungen würden von großem Wert sein.
  • AUFGABEN UND ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, Nucleinsäuren bereitzustellen, die CHV-gB, -gC und -gD codieren,
    wobei die Nucleinsäure ausgewählt wird von der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) Nucleinsäuren, die eine Nucleotidsequenz von einer der SEQ ID NOS: 1, 11 und 18 aufweisen, wobei die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 das Herpesvirus-gB-Glycoprotein des Hundes codiert, die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 11 das Herpesvirus-gC-Glycoprotein des Hundes codiert und die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 18 das Herpesvirus gD-Glycoprotein des Hundes codiert;
    • (b) Nucleinsäuren, die ein Herpesvirus-gB-Glycoprotein des Hundes codieren, das eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist;
    • (c) Nucleinsäuren, die ein Herpesvirus-gC-Glycoprotein des Hundes codieren, das eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 12 oder 13 aufweist; und
    • (d) Nucleinsäuren, die ein Herpesvirus-gD-Glycoprotein des Hundes codieren, das eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 19 aufweist.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Vektoren bereitzustellen, die Nucleotide oder isolierte Nucleinsäuren enthalten, die CHV-gB, -gC und/oder -gD codieren.
  • Es ist ein weitere Aufgabe der Erfindung, CHV-gB-, -gC- und/oder -gD-Glycoproteine zu liefern, insbesondere aus der Expression von Nucleotiden oder isolierten Nucleinsäuren dafür in einem Vektorsystem.
  • Es ist eine zusätzliche Aufgabe der Erfindung, antigene, Impfstoff- oder immunologische Zusammensetzungen von den CHV-gB-, -gC- und/oder -gD-Nucleotiden oder isolierten Nucleinsäuren oder einem Vektor, der sie enthält, von den Glycoproteinen selbst z.B. durch Expression durch den Vektor bereitzustellen.
  • Es ist noch eine andere Aufgabe dieser Erfindung, modifizierte rekombinante Viren bereitzustellen, wobei die Viren eine erhöhte Sicherheit aufweisen, und ein Verfahren des Herstellens solcher rekombinanter Viren bereitzustellen.
  • Es ist eine zusätzliche Aufgabe dieser Erfindung, eine antigene, Impfstoff- oder immunologische Zusammensetzung von rekombinantem Pockenvirus bereitzustellen, die einen erhöhten Sicherheitsgrad im Vergleich zu bekannten rekombinanten antigenen, Impfstoff- oder immunologischen Pockenvirus-Zusammensetzungen aufweist.
  • Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, einen modifizierten Vektor für das Exprimieren eines Genprodukts in einem Wirt bereitzustellen, worin der Vektor so modifiziert ist, dass er im Wirt eine abgeschwächte Virulenz hat.
  • Es ist eine andere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren für das Exprimieren eines Genprodukts wie CHV-gB, -gC und/oder -gD in einer Zelle, die in vitro gezüchtet wird, unter Verwendung eines modifizierten rekombinanten Virus oder eines modifizierten Vektors, das/der einen erhöhten Grad der Sicherheit hat, bereitzustellen.
  • Diese und andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach Berücksichtigung des Folgenden leichter offensichtlich werden.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Aufklärung der CHV'-gB-, -gC- und -gD-Nucleotide, der Glycoproteine davon und von antigenen, Impfstoff- oder immunologischen Zusammensetzungen, die die Nucleotidsequenzen und die Glycoproteine anwenden.
  • Dementsprechend liefert die vorliegende Erfindung eine Nucleinsäure, die ein Herpesvirus-gB-Glycoprotein des Hundes codiert, worin die Nucleinsäure oben definiert ist.
  • Die vorliegende Erfindung liefert eine Nucleinsäure, die ein Herpesvirus-gC-Glycoprotein des Hundes codiert, worin die Nucleinsäure oben definiert ist.
  • Die vorliegende Erfindung liefert eine Nucleinsäure, die ein Herpesvirus-gD-Glycoprotein des Hundes codiert, worin die Nucleinsäure oben definiert ist.
  • Die Nucleotide sind vorzugsweise DNA. Die Nucleotide oder isolierten Nucleinsäuren haben vorzugsweise die DNA-Sequenzen, wie in den 1, 4 und 7 dargelegt.
  • Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Herpesvirus-gB-Glycoprotein des Hundes, das durch die Nucleinsäure der Erfindung codiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung liefert ein Herpesvirus-gC-Glycoprotein des Hundes, das durch die Nucleinsäure der Erfindung codiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung liefert ein Herpesvirus-gD-Glycoprotein des Hundes, das durch die Nucleinsäure der Erfindung codiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin einen Vektor, der das Nucleotid oder die isolierte Nucleinsäure für Herpesvirus-gB, -gC und/oder -gD des Hundes enthält. Vorzugsweise ist der Vektor ein rekombinantes Pockenvirus wie ein rekombinantes Vaccinia- oder Avipoxvirus, mehr bevorzugt ist das Vaccinia- oder Avipoxvirus abgeschwächt, wie NYVAC, ALVAC oder TROVAC.
  • Daher betrifft die vorliegende Erfindung in einem bevorzugten Aspekt ein modifiziertes rekombinantes Virus, das durch ein inaktiviertes Virus codierte genetische Funktionen hat, sodass das rekombinante Virus eine abgeschwächte Virulenz und verstärkte Sicherheit aufweist. Die Funktionen können nicht-essentiell oder mit der Virulenz assoziiert sein. Das Virus ist vorteilhafterweise ein Pockenvirus, insbesondere ein Vacciniavirus oder ein Avipoxvirus wie ein Geflügelpockenvirus und ein Kanarienpockenvirus. Das modifizierte rekombinante Virus kann in einer nicht-essentiellen Region des Virusgenoms eine heterologe DNA-Sequenz einschließen, die ein antigenes CHV-Protein, z.B. CHV-gC, -gB und -gD oder jegliche Kombination davon, codiert.
  • In einem noch weiteren bevorzugten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein modifiziertes rekombinantes Virus, das nicht-essentielle Virus-codierte genetische Funktionen darin inaktiviert hat, sodass das Virus eine abgeschwächte Virulenz hat, und in dem das modifizierte rekombinante Virus weiterhin DNA von einer heterologen Quelle in einer nicht-essentiellen Region des Virusgenoms enthält. Die DNA kann ein CHV-gB, -gC und -gD oder jegliche Kombination davon codieren. Insbesondere werden die genetischen Funktionen durch Deletieren eines offenen Leserahmens, der einen Virulenzfaktor codiert, oder durch Verwenden von natürlicherweise auf Wirte eingeschränkten Viren, inaktiviert. Das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Virus ist vorteilhafterweise ein Pockenvirus, insbesondere ein Vacciniavirus oder ein Avipoxvirus wie ein Geflügelpockenvirus und ein Kanarienpockenvirus. Vorteilhafterweise wird der offene Leserahmen aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus J2R, B13R + B14R, A26L, A56L, C7L – K1L und I4L (nach der Terminologie, über die in Goebel et al., 1990a, b, berichtet wird) und einer Kombination davon. In dieser Hinsicht umfasst der offene Leserahmen ein Thymidinkinase-Gen, eine hämorrhagische Region, eine Typ A-Einschlusskörper- Region, ein Hämagglutiningen, eine Wirtsbereichs-Genregion oder eine große Untereinheit, Ribonucleotid-Reduktase oder eine Kombination davon. Der modifizierte Copenhagen-Stamm von Vacciniavirus wird als NYVAC identifiziert (Tartaglia et al., 1992).
  • Die vorliegende Erfindung liefert noch weiter eine antigene, Impfstoff- oder immunologische Zusammensetzung zum Induzieren einer antigenen oder immunologischen Antwort in einem Wirt wie einem Hund, umfassend einen geeigneten Vektor, enthaltend das/die Nucleotid(e) oder isolierte(n) Nucleinsäure(n) für Herpesvirus-gB, -gC und/oder -gD des Hundes und einen geeigneten Trägerstoff; oder das/die Herpesvirus-gB-, -gC- und/oder -gD-Glycoprotein(e) des Hundes, z.B. von der Expression davon in einem Vektor, der das/die Nucleotid(e) der Erfindung enthält, und einen geeigneten Trägerstoff.
  • Die vorliegende Erfindung liefert noch weiter Verfahren, die das/die erfinderische(n) Nucleotid(e) oder isolierte(n) Nucleinsäure(n), Glycoprotein(e), Zusammensetzung(en) anwenden.
  • Daher liefert die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von Herpesvirus-gB, -gC und/oder -gD des Hundes, umfassend das Inserieren des Nucleotids/der Nucleotide oder der isolierten Nucleinsäure(n) dafür in einen geeigneten Vektor, Züchten des Vektors und Gewinnen des Glycoproteins aus dem Vektor. Der Vektor kann ein Pockenvirus wie Vaccinia- oder Avipoxvirus, ein Phage wie Lambda oder E. coli oder jegliches andere geeignete Virus oder ein bakterieller Vektor sein. Das Züchten kann Infizieren von Zellen, die für eine virale Infektion empfänglich sind, durch den Virusvektor oder Züchten von Kolonien des bakteriellen Vektorsystems wie durch Platten- oder Brühen-Verfahren sein. Und das Gewinnen kann durch Separieren des Glycoproteins/der Glycoproteine aus den viral infizierten Zellen oder aus den bakteriellen Zellen erfolgen.
  • Daher betrifft die vorliegende Erfindung in einem bevorzugten Aspekt ein Verfahren zum Exprimieren eines Genprodukts in einer Zelle, die in vitro gezüchtet wird, durch Einbringen eines modifizierten rekombinanten Virus, das eine abgeschwächte Virulenz und eine verstärkte Sicherheit aufweist, in die Zelle. Das modifizierte rekombinante Virus kann in einer nicht-essenziellen Region des Virusgenoms eine heterologe DNA-Sequenz einschließen, die ein antigenes Protein, z.B. CHV-gB, -gC und -gD oder jegliche Kombination davon, codiert.
  • In ähnlicher Weise liefert die Erfindung ein Verfahren zum Impfen oder zum Stimulieren einer antigenen oder immunologischen Antwort in einem Wirt wie einem Hund gegen ein Herpesvirus des Hundes, umfassend das Verabreichen der erfinderischen antigenen, Impfstoff- oder immunologischen Zusammensetzung an den Wirt, z.B. den Hund. Zusätzlich schließt die Erfindung einen Antikörper ein, der durch die Expression des (der) erfinderischen Nucleotids (Nucleotide) hervorgerufen wird. Aus dem Antikörper kann durch bekannte Techniken ein monoclonaler Antikörper hergestellt werden, und der Antikörper oder der monoclonale Antikörper kann in einem diagnostischen Bindungstest, Test oder Kit angewendet werden, um das Vorliegen oder Fehlen von CHV-gB, -gC und/oder -gD in einer Probe wie Seren und daher das Vorliegen oder Fehlen von CHV oder einer Antikörper- oder Immunantwort gegen CHV oder gegen die Glycoproteine davon zu bestimmen.
  • Diese und andere Ausführungsformen innerhalb der vorliegenden Erfindung werden beschrieben oder sind aus der folgenden detaillierten Beschreibung offensichtlich.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die folgende detaillierte Beschreibung, die beispielhaft wiedergegeben ist, aber die Erfindung nicht nur auf die spezifischen beschriebenen Ausführungsformen limitieren soll, kann am besten im Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen verstanden werden, in denen:
  • 1 die Nucleotidsequenz und vorhergesagte Aminosäuresequenz des CHV-gB-Homologs zeigt (SEQ ID NOS: 1, 2);
  • 2 die Hydropathie-Analyse des CHV-gB-Homologs zeigt;
  • 3A und 3B die Aminosäure-Homologie von 8 gB-Homologen zeigen (SEQ ID NOS: 3–10);
  • 4 die Nucleotidsequenz und vorhergesagte Aminosäuresequenz des CHV-gC-Homologs und des ORF2 zeigt (SEQ ID NOS: 11–13);
  • 5 die Hydropathie-Analyse des CHV-gC-Homologs zeigt;
  • 6 die Aminosäure-Homologie von 4 gC-Homologen zeigt (SEQ ID NOS: 14–17);
  • 7 die Nucleotidsequenz und vorhergesagte Aminosäuresequenz des CHV-gD-Homologs zeigt (SEQ ID NOS: 18–20);
  • 8 die Hydropathie-Analyse des CHV-gD-Homologs zeigt;
  • 9 die Aminosäure-Homologie von 4 gD-Homologen zeigt (SEQ ID NOS: 20–23);
  • 10 schematisch ein Verfahren für die Konstruktion des Plasmids pSD460 für die Deletion des Thymidinkinase-Gens und die Herstellung des rekombinanten Vacciniavirus vP410 zeigt;
  • 11 schematisch ein Verfahren für die Konstruktion des Plasmids pSD486 für die Deletion der hämorrhagischen Region und Herstellung des rekombinanten Vacciniavirus vP553 zeigt;
  • 12 schematisch ein Verfahren für die Konstruktion des Plasmids pMP494Δ für die Deletion der ATI-Region und Herstellung des rekombinanten Vacciniavirus vP618 zeigt;
  • 13 schematisch ein Verfahren für die Konstruktion des Plasmids pSD467 für die Deletion des Hämagglutinin-Gens und Herstellung des rekombinanten Vacciniavirus vP723 zeigt;
  • 14 schematisch ein Verfahren für die Konstruktion des Plasmids pMPCK1Δ für die Deletion des Genclusters [C7L–K1L] und Herstellung des rekombinanten Vacciniavirus vP804 zeigt;
  • 15 schematisch ein Verfahren für die Konstruktion des Plasmids pSD548 für die Deletion der großen Untereinheit der Ribonucleotid-Reduktase und Herstellung des rekombinanten Vacciniavirus vP866 (NYVAC) zeigt;
  • 16 schematisch ein Verfahren für die Konstruktion des Plasmids pRW842 für die Insertion des Tollwut-Glycoprotein G-Gens in den TK-Deletions-Locus und Herstellung des rekombinanten Vacciniavirus vP879 zeigt;
  • 17 die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 62) eines Kanarienpocken-PvuII-Fragments, enthaltend den C5-ORF, zeigt;
  • 18A und 18B schematisch ein Verfahren für die Konstruktion des rekombinanten Kanarienpockenvirus vCP65 (ALVAC-RG) zeigen;
  • 19 schematisch die ORFs zeigt, die deletiert wurden, um NYVAC herzustellen;
  • 20 die Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 72) eines Fragments der TROVAC-DNA zeigt, die einen F8-ORF enthält;
  • 21 die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 75) eines 2356 Basenpaar-Fragments der TROVAC-DNA zeigt, die den F7-ORF enthält;
  • 22A bis 22D grafische Darstellungen von neutralisierenden Tollwut-Antikörper-Titern (RFFIT, IE/ml), der Booster-Wirkung von HDC und vCP65 (105,5 TCID50) in Freiwilligen zeigen, die vorher mit entweder demselben oder dem alternativen Impfstoff immunisiert wurden (die Impfstoffe wurden an den Tagen 0, 28 und 180 gegeben, die Antikörper-Titer wurden an den Tagen 0, 7, 28, 35, 56, 173, 187 und 208 gemessen);
  • 23 die Nucleotidsequenz des durch den I3L-Promotor kontrollierten CHV-gB-Gens zeigt, das in pCHV37 und vCP320 enthalten ist;
  • 24 die Nucleotidsequenz der ALVAC C6-flankierenden Arme zeigt;
  • 25 die Immunpräzipitations-Analyse von vCP320-infizierten Zellen zeigt (Lysate von 35S-markierten, scheininfizierten Zellen (Bahn A), ALVAC-infizierten Zellen (Bahn B), vCP320-infizierten Zellen (Bahn C) und CHV-infizierten Zellen (Bahn D) wurden mit einem CHV-gB-spezifischen monoclonalen Antikörper, 112582 (erhalten von Rhone Merieux, Lyon, Frankreich), immunpräzipitiert und auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetrennt.
    Die Molekulargewichts-Standards sind in Bahn E aufgetrennt);
  • 26 die Nucleotidsequenz des durch den H6-Promotor kontrollierten CHV-gC-Gens zeigt, das in pCHV40 und vCP322 enthalten ist;
  • 27 die Immunpräzipitations-Analyse von vCP322-infizierten Zellen zeigt (Lysate von 35S-markierten, scheininfizierten Zellen (Bahn A), ALVAC-infizierten Zellen (Bahn B), vCP322-infizierten. Zellen (Bahn C) und CHV-infizierten Zellen (Bahn D) wurden mit einem CHV-gC-spezifischen monoclonalen Antikörper, 2011A9 (erhalten von Rhone Merieux, Lyon, Frankreich), immunpräzipitiert und auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Die Molekulargewichts-Standards sind in Bahn E aufgetrennt);
  • 28 die Nucleotidsequenz des durch den H6-Promotor kontrollierten CHV-gD-Gens zeigt, das in pCHV26 und vCP294 enthalten ist; und
  • 29 die Immunpräzipitations-Analyse von vCP294-infizierten Zellen zeigt (Lysate von 35S-markierten, scheininfizierten Zellen (Bahn A), ALVAC-infizierten Zellen (Bahn B), vCP294-infizierten Zellen (Bahn C) und CHV-infizierten Zellen (Bahn D) wurden mit einem CHV gD-spezifischen monoclonalen Antikörper, 208D11 (erhalten von Rhone Merieux, Lyon, Frankreich), immunpräzipitiert und auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Die Molekulargewichts-Standards sind in Bahn E aufgelöst).
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Diese Erfindung liefert Nucleotide, wie im Anspruch 1 definiert, die die CHV-gB-, -gC- und -gD-Gene codieren. Diese Gene codieren Polypeptide von 879, 459 beziehungsweise 345 Aminosäuren. Ein Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenz dieser Glycoproteine mit den gB-, gC- und gD-Aminosäuresequenzen von anderen Herpesviren weist darauf hin, dass CHV ein Alphaherpesvirus ist; eine Schlussfolgerung, die mit der früheren Klassifizierung dieses Virus gemäß den biologischen Eigenschaften konsistent ist. Diese Analyse offenbarte auch, dass die Homologie unter den gB-Homologen größer ist als die Homologie unter gC- oder gD-Homologen, was nahe legt, dass die strukturellen und funktionellen Einschränkungen auf gB größer sein können als jene auf gC oder gD.
  • Eine Ausrichtung von homologen gB-, gC- und gD-Polypeptiden offenbarte, dass die große Mehrheit der Cystein-Reste perfekt konserviert ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass diese Cystein-Reste aufgrund ihrer Fähigkeit, Disulfid-Bindungen zu bilden, wichtig im Beibehalten der strukturellen und funktionellen Integrität der gB-, gC- und gD-Glycoproteine sind. Tatsächlich ist in HSV1-gD gezeigt worden, dass Cystein 1 eine Disulfidbindung mit Cystein 5 bildet, Cystein 2 eine Disulfidbindung mit Cystein 6 bildet und Cystein 3 eine Disulfidbindung mit Cystein 4 bildet (Long et al., 1992). Darüber hinaus ist gezeigt worden, dass eine Mutation von jedem dieser Reste eine schwerwiegende Wirkung auf die Konformation, das Prozessieren und die Funktion des resultierenden Glycoproteins hat (Wilcox et al., 1988; Long et al., 1990). Daher kann die Konservierung von Cystein-Resten in den Glycoproteinen der Erfindung auch eine strukturelle Bedeutung haben.
  • Der hohe Grad der Homologie unter den gC- gD- und besonders den gB-Homologen legt auch nahe, dass diese Glycoproteine gemeinsame Funktionen haben. Tatsächlich ist gezeigt worden, dass das BHV1-gB-Homolog ein gB–-PRV-Virus retten kann, was darauf hinweist, dass diese 2 Glycoproteine funktionell äquivalent sind (Kopp & Mettenleiter, 1992).
  • Die Ausrichtung der gB-, gC- und gD-Aminosäuresequenzen offenbarte auch, dass potenzielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen einigermaßen konserviert sind. Es wird angenommen, dass eine N-verknüpfte Glycosylierung eine Rolle in einer Vielfalt von Funktionen wie dem Beibehalten der Protein-Konformation und dem Schutz gegen einen proteolytischen Abbau spielt. Die biologische Bedeutung von N-verknüpften Kohlenhydraten auf Herpesvirus-Glycoproteine ist jedoch nicht vollständig verstanden. Zum Beispiel ist gezeigt worden, dass eine Tunicamycin-Behandlung von HSV1-infizierten Zellen die Produktion von infektiösen Virionen inhibiert (Pizer et al., 1980). Zusätzlich ist gezeigt worden, dass eine Endoglycosidase-Behandlung von HSV1-Virionen die Infektiosität senkt (Kuhn et al., 1988). Auf der anderen Seite scheint eine N-verknüpfte Glycosylierung von HSV1-gD nicht absolut essentiell zu sein, da eine Mutagenese der Glycosylierungsstellen auf diesem Glycoprotein nicht die Infektiosität beeinflusst (Sodora et al., 1991). Daher kann, obwohl die Glycosylierungsstellen auf den gB-, gC- und gD-Glycoproteinen relativ gut konserviert sind, eine korrekte Glycosylierung von jedem dieser Polypeptide nicht absolut essentiell sein.
  • Der G + C-Gehalt von Herpesviren variiert von 33%–75% (Roizman, 1982). Es ist nahe gelegt worden, dass diese ausgedehnte Variabilität auf eine nicht-selektive Mutations-Neigung zurückzuführen ist, die auf dem Vorliegen (oder Fehlen) von viral codierten oder induzierten Enzymen basiert, die in den Nucleotid-Metabolismus involviert sind (Honess, 1984). Zum Beispiel haben sowohl VZV als auch Herpesvirus saimiri (HVS) relativ niedrige G + C-Gehalte (46% beziehungsweise 46%), und beide codieren ein Enzym, die Thymidylat-Synthetase; das in die TTP-Synthese involviert ist (Davison & Scott, 1986; Honess et al., 1986). Auf der anderen Seite haben HSV1, HCMV und EBV relativ hohe G + C-Gehalte (68%, 57% beziehungsweise 60%), und es scheint, dass sie keine Thymidylat-Synthetase codieren (Honess et al., 1986). Durch DNA-Dichteanalyse ist bestimmt worden, dass CHV den niedrigsten G + C-Gehalt von jedem Herpesvirus aufweist, 33% (Plummer et al., 1969; Roizman, 1982); ein Wert, der mit dem relativ niedrigen G + C-Gehalt der Nucleotide der Erfindung konsistent ist (29%). Ohne auf die Theorie, dass CHV kein Enzym codiert, das in den Nucleotid-Mechanismus involviert ist, festgelegt sein zu wollen, ist von der vorliegenden Erfindung der ORF, der unmittelbar stromabwärts des CHV-gC-Gens gelegen ist, nicht homolog zu der VZV-Thymidylat-Sythetase. Daher, wenn CHV ein Thymidylat-Synthetase-Gen enthält, wird es nicht an derselben genomischen Ort wie VZV gefunden.
  • Neugeborene Welpen, die CHV ausgesetzt werden, sterben normalerweise, ohne CHV-spezifische neutralisierende Antikörper zu bilden. Außerdem können die maternalen Antikörper oder eine Behandlung mit Immunserum von seropositiven Hunden Welpen vor einer tödlichen CHV-Infektion schützen (Carmichael, 1970). Daher können Serum-neutralisierende Antikörper Welpen gegen eine tödliche CHV-Infektion schützen. In ähnlicher Weise können Serum-neutralisierende Antikörper erwachsene Hunde vor der selbst-limitierenden subklinischen Infektion des oberen Atmungstrakts schützen.
  • Es ist bekannt, dass drei CHV-Glycoproteine, gp145/112, gp80 und gp47, CHV-neutralisierende Antikörper hervorrufen (Xuan et al., 1991). Die Gene, die diese Glycoproteine codieren, sind nicht identifiziert worden. Ohne auf irgendeine Theorie festgelegt werden zu wollen, ist es dennoch möglich, dass diese Antigene durch die gB-, gC- und gD-Gene dieser Erfindung codiert werden. Da einige Berichte darauf hingewiesen haben, dass eine Immunantwort gegen gB, gC und/oder gD einen Schutz von Zielspezies-Tieren gegen eine Herpesvirus-Herausforderung bereitstellen kann (Babiuk et al., 1987; Nazarian et al., 1992; Riviere et al., 1992; Brockmeier et al., 1993), liefern die CHV-gB-, -gC- und -gD-Gene dieser Erfindung wirksame CHV-Glycoproteine, immunologische oder Impfstoff-Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung derselben.
  • Insbesondere können die Nucleotide dieser Erfindung in jedes geeignete Vektorsystem für eine Expression inseriert werden. Zum Beispiel kann (können) das (die) Nucleotid(e) in jedes geeignete bakterielle Vektorsystem wie das E. coli-System unter Anwenden von bekannten Verfahren (siehe z.B. Robbins, EPA 0162738 A1 ; Panicali, EPA 0261940 A2 ) inseriert werden.
  • Das (die) Nucleotid(e) kann (können) in jedes geeignete Phagen- oder virale Vektorsystem wie die Lambda-, Pockenvirus-, Herpesvirus- (siehe Roizman, US-Patent Nr. 4,769,331 , hierin durch Bezugnahme inkorporiert), Baculovirus-, Poliovirus- (siehe Kitson et al., J. Virol. 65, 3068–3075, 1991, hierin durch Bezugnahme inkorporiert) und Adenovirus- (siehe Grunhaus et al., 1992, „Adenovirus as cloning vectors", Seminars in Virology (Bd. 3) S. 237–52, 1993; Ballay et al., EMBO Journal, Bd. 4, S. 3861–65; Graham, Tibtech 8, 85–87, April, 1990; Prevec et al., J. Gen. Virol. 70, 429–434, jedes davon ist hierin durch Bezugnahme inkorporiert) Systeme unter Anwenden von bekannten Verfahren inseriert werden.
  • Das bevorzugte Vektorsystem ist ein Pockenvirus-Vektorsystem, insbesondere ein Avipox-Vacciniavirus-System, in dem die Rekombination wie in den US-Patenten Nr. 4,769,330 , 4,772,848 , 4,603,112 , 5,100,587 und 5,179,993 ist. Ein abgeschwächtes Pockenvirus-System ist jedoch noch mehr bevorzugt.
  • Um einen neuen Vaccinia-Impfstoffstamm, NYVAC (vP866), zu entwickeln, wurde der Copenhagen-Impfstoffstamm von Vacciniavirus durch die Deletion von sechs nicht-essentiellen Regionen des Genoms, die bekannte oder potenzielle Virulenzfaktoren codieren, modifiziert. Die sequentiellen Deletionen sind unten detailliert beschrieben. Alle Bezeichnungen der Vaccinia-Restriktionsfragmente, offenen Leserahmen und Nucleotid-Positionen basieren auf der Terminologie, über die in Goebel et al., 1990a,b, berichtet wurde.
  • Die Deletions-Loci wurden auch als Empfänger-Loci für die Insertion von fremden Genen gestaltet.
  • Die Regionen, die in NYVAC deletiert wurden, sind unten aufgelistet. Die Abkürzungen und Bezeichnungen von offenen Leserahmen für die deletierten Regionen (Goebel et al., 1990a,b) und die Bezeichnung der Vaccinia-Rekombinante (vP), die alle Deletionen enthält, sind durch die spezifizierte Deletion auch aufgelistet:
    • (1) Thymidinkinase-Gen (TK; J2R) vP410;
    • (2) hämorrhagische Region (u; B13R + B14R) vP553;
    • (3) Typ A-Einschlusskörper-Region (ATI; A26L) vP618;
    • (4) Hämagglutinin-Gen (HA; A56R) vP723;
    • (5) Wirtsbereichs-Genregion (C7L–K1L) vP804; und
    • (6) große Untereinheit, Ribonucleotid-Reduktase (I4L) vP866 (NYVAC).
  • NYVAC ist ein genetisch manipulierter Vacciniavirus-Stamm, der durch die spezifische Deletion von 18 offenen Leserahmen, die Genprodukte codieren, die mit der Virulenz und dem Wirtsbereich assoziiert sind, hergestellt wurde. NYVAC ist durch eine Reihe von Kriterien hochgradig abgeschwächt, einschließlich i) gesenkter Virulenz nach intracerebraler Impfung in neugeborenen Mäusen, ii) Harmlosigkeit in genetisch (nu +/nu +) oder chemisch (Cyclophosphamid) immungeschwächten Mäusen, iii) Versagen, eine disseminierte Infektion in immungeschwächten Mäusen zu verursachen, iv) Fehlen einer signifikanten Verhärtung und Geschwürbildung auf Kaninchenhaut, v) schneller Beseitigung von der Stelle der Impfung und vi) stark reduzierter Replikationskompetenz auf einer Reihe von Gewebekultur-Zelllinien, einschließlich jener von menschlichem Ursprung. Nichtsdestotrotz induzieren auf NYVAC basierende Vektoren ausgezeichnete Antworten auf extrinsische Immunogene und lieferten eine schützende Immunität.
  • TROVAC bezeichnet eine abgeschwächtes Geflügelpockenvirus, die ein Plaque-cloniertes Isolat war, das vom FP-1-Impfstoffstamm des Geflügelpockenvirus abgeleitet wurde, der für die Impfung von 1 Tag alten Hühnern lizenziert ist. ALVAC ist ein auf abgeschwächtem Kanarienpockenvirus basierender Vektor, der ein plaquecloniertes Derivat des lizenzierten Kanarienpocken-Impfstoffs Kanapox war (Tartaglia et al., 1992). ALVAC hat einige allgemeine Eigenschaften, die dieselben sind wie einige allgemeine Eigenschaften von Kanapox. Es ist auch gezeigt worden, dass auf ALVAC basierende rekombinante Viren, die extrinsische Immunogene exprimieren, als Impfstoff-Vektoren wirksam sind (Tartaglia et al., 1993 a,b). Dieser Avipox-Vektor ist für eine produktive Replikation auf Vogel-Spezies beschränkt. Auf menschlichen Zellkulturen wird die Kanarienpockenvirus-Replikation früh im viralen Replikationszyklus vor der viralen DNA-Synthese beendet. Nichtsdestotrotz, wenn das Virus gestaltet wurde, um extrinsische Immunogene zu exprimieren, wird eine authentische Expression und Prozessierung in vitro in Säugerzellen beobachtet, und eine Impfung in zahlreiche Säugerspezies induziert Antikörper- und zelluläre Immunantworten auf das extrinsische Immunogen und liefert einen Schutz gegen eine Herausforderung mit dem verwandten Pathogen (Taylor et al., 1992; Taylor et al., 1991). Neuere klinische Phase 1-Versuche einer Kanarienpocken/Tollwut-Glycoprotein-Rekombinante (ALVAC-RG) sowohl in Europa als auch in den Vereinigten Staaten zeigten, dass der experimentelle Impfstoff gut toleriert wurde und schützende Spiegel von Tollwutvirus-neutralisierenden Antikörper-Titern induzierte (Cadoz et al., 1992; Fries et al., 1992). Zusätzlich zeigten mononucleäre periphäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), die von den ALVAC-RG-Impfungen stammten, signifikante Spiegel einer Lymphocyten-Proliferation, wenn sie mit gereinigtem Tollwutvirus stimuliert wurden (Fries et al., 1992).
  • NYVAC, ALVAC und TROVAC sind auch als einzigartig unter allen Pockenviren anerkannt worden, dadurch, dass das National Institutes of Health („NIH") (U.S. Public Health Service), Recombinant DNA Advisory Commitee, das Richtlinien für die körperliche Sicherheit von genetischem Material wie Viren und Vektoren, d.h. Richtlinien für Sicherheitsmaßnahmen für die Verwendung von solchen Viren und Vektoren, die auf der Pathogenität des bestimmten Virus oder Vektors basieren, herausgibt, eine Reduzierung der körperlichen Sicherheitsstufe von BSL2 zu BSL1 gewährte. Kein anderes Pockenvirus hat eine körperliche Sicherheitsstufe von BSL1. Sogar der Copenhagen-Stamm von Vacciniavirus – der allgemeine Pocken-Impfstoff – hat eine höhere körperliche Sicherheitsstufe; nämlich BSL2. Dementsprechend hat der Fachbereich anerkannt, dass NYVAC, ALVAC und TROVAC eine niedrigere Pathogenität als jedes andere Pockenvirus aufweisen.
  • Basierend auf den Abschwächungs-Profilen der NYVAC-, ALVAC- und TROVAC-Vektoren und ihrer demonstrierten Fähigkeit, sowohl humorale als auch zelluläre immunologische Antworten auf extrinsische Immunogene hervorzurufen (Tartaglia et al., 1993a,b; Taylor et al., 1992; Konishi et al., 1992), bieten solche rekombinante Viren eindeutig einen deutlichen Vorteil gegenüber früher beschriebenen auf Vacciniabasierenden rekombinanten Viren.
  • Nach dem Züchten der Bakterien oder infizierten Zellen mit dem rekombinanten Virus wird das (werden die) Glycoprotein(e) durch bekannte Techniken wie Chromatographie gewonnen (siehe Robbins, EPA 0162738 A1 ; Panicali, EPA 0261940 A2 ).
  • Das (die) gewonnene(n) Glycoprotein(e) kann (können) dann in einem Impfstoff, einer antigenen oder immunologischen Zusammensetzung, der/die auch einen geeigneten Trägerstoff enthält, verwendet werden. Dementsprechend sind die erfinderischen Nucleotide ziemlich nützlich.
  • Alternativ kann das virale Vektorsystem, insbesondere das bevorzugte Pockenvirus-Vektorsystem in einem Impfstoff, einer antigenen oder immunologischen Zusammensetzung, der/die auch einen geeigneten Trägerstoff enthält, verwendet werden. Das rekombinante CHV-Pockenvirus in der Zusammensetzung exprimiert nach der Verabreichung oder Impfung das CHV-Glycoprotein in vivo.
  • Die antigene, immunologische oder Impfstoff-Zusammensetzung der Erfindung (entweder enthaltend Glycoprotein(e), das/die von einem Vektorsystem exprimiert wird (werden), das die (das) erfinderische(n) Nucleotid(e) enthält, oder enthaltend ein geeignetes Vektorsystem wie das rekombinanten CHV-Pockenvirus) wird an Welpen auf dieselbe Weise wie maternale Antikörper oder Immunserum von seropositiven Hunden verabreicht (Carmichael, 1970). Seronegativen Hunden wird die Zusammensetzung auf dieselbe Weise verabreicht, wie andere antigene, Impfstoff- oder immunologische Zusammensetzungen verabreicht werden. Ein veterinärmedizinischer Fachmann kann aus dieser Offenbarung die Dosierung ohne unnötiges Experimentieren unter Berücksichtigung solcher Faktoren wie des Alters, Gewichts, der Rasse, des Geschlechts und der allgemeinen Gesundheit des bestimmten Hundes oder Welpen bestimmen.
  • Zusätzlich stimulieren das erfinderische rekombinante Pockenvirus und die Expressionsprodukte davon eine Immun- oder Antikörperantwort in Tieren. Von jenen Antikörpern können monoclonale Antikörper durch Techniken, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, hergestellt werden, und jene monoclonalen Antikörper oder die Antigene, die von den erfinderischen Nucleotiden exprimiert werden, können in wohlbekannten Antikörper-Bindungstests, diagnostischen Kits oder Tests angewendet werden, um das Vorliegen oder Fehlen eines (von) bestimmten CHV-gB-, -gC- und/oder -gD-Antigens(en) oder Antikörpern dagegen und davon das Vorliegen oder Fehlen des Virus zu bestimmen oder um zu bestimmen, ob eine Immunantwort gegen das Virus oder (die) Antigen(e) einfach stimuliert worden ist.
  • Monoclonale Antikörper sind Immunglobuline, die durch Hybridomzellen produziert werden. Ein monoclonaler Antikörper reagiert mit einer einzelnen antigenen Determinante und liefert eine größere Spezifität als ein konventioneller, Serum-abstammender Antikörper. Darüber hinaus macht das Screenen einer großen Zahl von monoclonalen Antikörpern es möglich, einen individuellen Antikörper mit der erwünschten Spezifität, Avidität und vom erwünschten Isotyp auszuwählen. Hybridomzelllinien liefern eine konstante kostengünstige Quelle von chemisch identischen Antikörpern, und Präparate von solchen Antikörpern können leicht standardisiert werden. Verfahren zum Produzieren von monoclonalen Antikörpern sind Fachleuten wohlbekannt, z.B. Koprowski, H. et al., US-Pat. Nr. 4,196,265 , erteilt am 1. Apr. 1989, hierin durch Bezugnahme inkorporiert.
  • Verwendungen von monoclonalen Antikörpern sind bekannt. Eine solche Verwendung ist in diagnostischen Verfahren, z.B. David, G. und Greene, H., US-Pat. Nr. 4,376,110 , erteilt am 8. März 1983, hierin durch Bezugnahme inkorporiert.
  • Monoclonale Antikörper sind auch verwendet worden, um Materialien durch Immunadsorptions-Chromatographie zu gewinnen, z.B. Milstein, C., 1980, Scientific American 243:66, 70, hierin durch Bezugnahme inkorporiert.
  • Zusätzlich können die erfinderischen Nucleotide als Sonden, um das Vorliegen von CHV-DNA in Proben abzusichern, sowie in der Herstellung von PCR-Primern zum Replizieren oder Clonieren von CHV-DNA verwendet werden. Verfahren für das Verwenden von DNA als Sonden oder für das Herstellen von PCR-Primern sind auf dem Fachgebiet bekannt.
  • Daher sind die erfinderischen Nucleotide und die Expressionsprodukte der erfinderischen Nucleotide (und daher die Nucleotide) ziemlich nützlich.
  • Die folgenden nicht-limitierenden Beispiele sind nur als Illustration gegeben und sollen nicht als eine Einschränkung dieser Erfindung angesehen werden.
  • BEISPIELE
  • VERFAHREN UND MATERIALIEN:
  • Herstellung von genomischer CHV-DNA. CHV (erhalten von L. Carmichael, Cornell University) wurde auf Madin-Darby-Nierenzellen des Hundes (MDCK-Zellen) (ATCC CCL34) vermehrt. Die virale DNA wurde durch eine Standard-Methodik (Tartaglia et al., 1990) isoliert.
  • DNA-Hybridisierung. Genomische CHV-DNA wurde mit Restriktionsenzymen verdaut, auf Agarosegelen laufen gelassen und auf Gene-Screen-Membranen (New England Nuclear) unter Bedingungen transferiert, die durch die Hersteller empfohlen werden. Die Hybridisierungen wurden bei 44°C, 53°C oder 59°C in 1M NaCl, 1% SDS und 10% Dextransulfat durchgeführt. Die Hybridisierungssonde schloss ein 1800 bp-BamHI-XbaI-Fragment, enthaltend ein internes Segment des felinen Herpesvirus (FHV)-gB-Gens, ein 950 bp-BamHI-EcoRI-Fragment, enthaltend das 3'-Ende des FHV-gC-Gens, und ein 970 bp-BamHI-HindIII-Fragment, enthaltend das 3'-Ende des FHV-gD-Gens, ein (Audonnet, unveröffentlichte Ergebnisse).
  • Clonieren und DNA-Sequenzieren. Die genomischen CHV-Fragmente wurden in pBluescriptSK (Stratagene) subcloniert. Plasmid-DNA wurde hergestellt und unter Verwendung von Standardtechniken manipuliert. Nucleotid-Sequenzieren wurde auf doppelsträngigen Plasmid-Matrizen unter Verwendung des modifizierten T7-Enzyms Sequenase (U.S. Biochemical Corporation) und von Standardprotokollen, die durch den Hersteller empfohlen werden, durchgeführt. M13-Vorwärts- und -Rückwärtsprimer wurden verwendet, um die anfängliche Sequenz zu erhalten, und spezifisch angefertigte Primer, hergestellt mit einem Biosearch 8700- oder einem Applied Biosystems 380B-Oligonucleotid-Synthesegerät, wurden für die folgenden Reaktionen verwendet.
  • DNA- und Aminosäuresequenz-Analysen. DNA- und Aminosäuresequenz-Analysen wurden mit PC/GENE- (IntelliGenetics, Incorporated), ALIGN Plus(Scientific and Educational Software) und IBI-Pustell (International Biotechnologies, Incorporated)-Softwarepaketen durchgeführt. Homologie-Suchen wurden auf der SWISS-PROT (Ausgabe 20 oder 23) (IntelliGenetics, Incorporated)-Datenbank unter Verwendung des FASTA-Programms (Pearson & Lipman, 1988) durchgeführt.
  • DNA-Clonierung und Synthese. Plasmide wurden durch Standard-Vorgehensweisen konstruiert, gescreent und (Maniatis et al., 1982; Perkus et al., 1985; Piccini et al., 1987) gezüchtet. Restriktionsendonucleasen wurden von Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, New England Biolabs, Beverly, MA; und Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN, erhalten. Das Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase wurde von Boehringer Mannheim Biochemicals erhalten. BAL-31-Exonuclease und die DNA-Ligase des Phagen T4 wurden von New England Biolabs erhalten. Die Reagenzien wurden verwendet, wie es durch die verschiedenen Vertreiber beschrieben wird.
  • Synthetische Oligodesoxyribonucleotide wurden auf einem Biosearch 8750- oder Applied Biosystems 380B-DNA-Synthesegerät hergestellt, wie früher beschrieben (Perkus et al., 1989). Das DNA-Sequenzieren wurde durch das Didesoxy-Kettenterminierungsverfahren (Sanger et al., 1977) unter Verwendung der Sequenase (Tabor et al., 1987) durchgeführt, wie früher beschrieben (Guo et al., 1989). Die DNA-Amplifizierung durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für die Sequenzbestätigung (Engelke et al., 1988) wurde unter Verwendung von spezifisch gestalteten synthetisierten Oligonucleotidprimern und dem GeneAmp DNA Amplification Reagent Kit (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) in einem automatisierten Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler durchgeführt. Überschüssige DNA-Sequenzen wurden von den Plasmiden durch Restriktionsendonuclease-Verdau, gefolgt von limitiertem Verdau durch BAL-31-Exonuclease und Mutagenese (Mandecki, 1986) unter Verwendung von synthetischen Oligonucleotiden deletiert.
  • Zellen, Virus und Transfektion. Die Ursprünge und Zustände der Kultivierung des Copenhagen-Stamms von Vacciniavirus sind früher beschrieben worden (Guo et al., 1989). Die Herstellung von rekombinantem Virus durch Rekombination, in situ-Hybridisierung von Nitrocellulose-Filtern und Screenen auf B-Galactosidase-Aktivität sind, wie früher beschrieben (Piccini et al., 1987).
  • Die Ursprünge und Zustände der Kultivierung des Copenhagen-Stamms von Vacciniavirus und von NYVAC sind, früher beschrieben worden (Guo et al., 1989; Tartaglia et al., 1992). Die Herstellung des rekombinanten Virus durch Rekombination, in situ-Hybridisierung von Nitrocellulose-Filtern und Screenen auf β-Galactosidase-Aktivität sind, wie früher beschrieben (Panicali et al., 1982; Perkus et al., 1989).
  • Das Eltern-Kanarienpockenvirus (Rentschler-Stamm) ist ein Impfstamm für Kanarienvögel. Der Impfstoffstamm wurde von einem Wildtyp-Isolat erhalten und durch mehr als 200 Reihenpassagen auf Hühnerembryofibroblasten abgeschwächt. Eine Haupt-Virussaat wurde vier aufeinanderfolgenden Plaque-Reinigungen unter Agar unterzogen, und ein Plaque-Clon wurde durch fünf zusätzliche Passagen amplifiziert, wonach das Stammvirus als das Elternvirus in den in vitro-Rekombinationstests verwendet wurde. Das Plaque-gereinigte Kanarienpocken-Isolat wird als ALVAC bezeichnet.
  • Der Stamm von Geflügelpockenvirus (FPV), bezeichnet FP-1, ist früher beschrieben worden (Taylor et al., 1988a). Es ist ein abgeschwächter Impfstoffstamm, der für die Impfung von Tage alten Kücken nützlich ist. Der Elternvirusstamm Duvette wurde in Frankreich als ein Geflügelpocken-Schorf von einem Huhn erhalten. Das Virus wurde durch ungefähr 50 Reihenpassagen in embryonierten Hühnereiern, gefolgt von 25 Passagen auf Hühnerembryofibroblastenzellen abgeschwächt. Das Virus wurde vier aufeinanderfolgenden Plaque-Reinigungen unterzogen. Ein Plaque-Isolat wurde weiter in primären CEF-Zellen amplifiziert und ein Bestandvirus, bezeichnet als TROVAC, etabliert.
  • Virale NYVAC-, ALVAC- und TROVAC-Vektoren und ihre Derivate wurden vermehrt, wie früher beschrieben (Piccini et al., 1987; Taylor et al., 1988a,b). Vero-Zellen und Hühnerembryofibroblasten (CEF) wurden vermehrt, wie früher beschrieben (Taylor et al., 1988a,b).
  • Beispiel 1 – IDENTIFIZIERUNG UND SEQUENZIERUNG DES CHV-gB-GENS
  • Die Hybridisierung der genomischen CHV-DNA bei relativ niedriger Stringenz mit einer radioaktiv markierten Sonde, enthaltend die felinen Herpesvirus (FHV)-gB-, -gC und -gD-Gene (Audonnet, unveröffentlichte Ergebnisse), identifizierte eine komplementäre Sequenz. Ein 6 kb-XbaI-Fragment, enthaltend diese Sequenz, wurde cloniert, und die Nucleotidsequenz der Hybridisierungsregion wurde bestimmt. Die Sequenz des Nucleotids, das das CHV-gB-Gen codiert, ist in 1 zusammen mit der vorhergesagten Aminosäure-Expression (gB-Glycoprotein) davon gezeigt. Die mutmaßlichen Transmembranregionen und potenziellen TATA-, CAAT- und Polyadenylierungssignal-Sequenzen sind unterstrichen. Die Nucleotide und vorhergesagten Aminosäurereste sind rechts von der Sequenz nummeriert.
  • Ein offener Leserahmen (ORF), beginnend an der Position 201 und endend an der Position 2840, wurde identifiziert. Das Translationsprodukt (vorhergesagt) dieses ORF ist 879 Aminosäuren lang. Ein Vergleich dieser Aminosäuresequenz mit der SWISS-PROT (Ausgabe 20)-Datenbank offenbarte eine signifikante Homologie mit dem gB-Glycoprotein von zahlreichen Herpesviren. Zusätzliche Analysen offenbarten, dass das CHV-Genprodukt (vorhergesagt) mehr homolog zu dem gB-Glycoprotein von alpha-Herpesviren wie Herpes simplex-Virus Typ 1 (HSV1) als von beta- oder gamma-Herpesviren wie dem menschlichen Cytomegalievirus (HCMV) oder Epstein-Barr-Virus (EBV) war. Diese Analysen und die Ergebnisse davon sind unten in Tabelle 1 gezeigt. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass CHV als ein alpha-Herpesvirus klassifiziert werden sollte; eine Schlussfolgerung, die mit der früheren Klassifizierung dieses Virus gemäß biologischen Eigenschaften übereinstimmt (Carmichael et al., 1965; Roizman, 1982). Tabelle 1. HOMOLOGIE ZWISCHEN DEN VORHERGESAGTEN AMINOSÄURESEQUENZEN VON 10 HERPESVIRUS-gB-GLYCOPROTEINEN
    FHV EHV1 PRV BHV1 VZV MDV HSV1 HCMV EBV
    CHV 78 61 61 59 55 52 50 29 27
    FHV 57 59 58 51 48 48 27 27
    EHV1 52 52 47 45 44 27 26
    PRV 63 52 48 50 29 29
    EHV1 52 46 48 28 28
    VZV 49 48 30 28
    MDV 48 30 29
    HSV1 28 29
    HCMV 32
  • Die Werte in Tabelle 1 wurden unter Verwendung des ALIGN Plus-Programms erhalten und werden als Homologie in Prozent ausgedrückt. Die gesamte gB-Aminosäuresequenz wurde verwendet. Die Ausrichtungsparameter waren: Strafe für Fehlpaarung = 2, Strafe für offene Lücke = 4, Strafe für ausgedehnte Lücke = 1. Bezugnahmen: FHV (Maeda et al., 1992), EHV1 (Whalley et al., 1989), PRV (Robbins et al., 1987), BHV1 (Whitbeck et al., 1988), VZV (Keller et al., 1986), MDV (Ross et al., 1989), HSV1 (Bzik et al., 1984), HCMV (Kouzarides et al., 1987) und EBV (Pellett et al., 1985).
  • Beispiel 2 – ANALYSE DER CHV-gB-NUCLEOTIDSEQUENZ
  • Die nicht codierenden 5'- und 3'-Regionen des CHV-gB-Gens enthalten zahlreiche regulatorische RNA-Polymerase II-Sequenzmotive wie TATA-Box-, CAAT-Box- und Polyadenylierungssignal-Sequenzen (Corden et al., 1980; Proudfoot & Brownlee, 1976) (1). Potenzielle TATA-Box-Sequenzen werden an den Positionen 34, 36, 119 und 148 ungefähr 165 bp, 160 bp, 80 bp und 50 bp stromaufwärts des CHV-gB-Startcodons gefunden. Potenzielle CAAT-Box-Sequenzen (ATTG) werden an den Positionen 89, 97 und 165 ungefähr 110 bp, 100 bp und 35 bp stromaufwärts des gB-Startcodons gefunden. Potenzielle Polyadenylierungssignal-Sequenzen (AATAAA) werden an den Positionen 2839 und 2961 ungefähr 0 bp und 120 bp stromabwärts des CHV-gB-Stoppcodons gefunden.
  • Es ist gezeigt worden, dass die Nucleotidsequenz, die das Initiationscodon umgibt, die Wirksamkeit des Translationsstarts beeinflusst (Kozak, 1986).
  • Insbesondere ist gefunden worden, dass die Sequenz [A/G]NNATGG am wirksamsten ist. Daher ist in Bezug auf die Kozak-Regeln die Nucleotidsequenz, die das CHV-gB-Startcodon (AGTATGT) umgibt, an der Position –3, aber nicht an der Position +4 günstig (1). Die Tatsache, dass das CHV-gB-Gen nicht den Regeln von Kozak folgt, ist nicht ungewöhnlich. Die FHV-(Maeda et al., 1992), PRV (Robbins et al., 1987), Varicella-Zoster-Virus (VZV)-(Keller et al., 1986), MDV-(Ross et al., 1989) und HSV1-(Bzik et al., 1984) gB-Gene enthalten auch ein Pyrimidin an der Position +4.
  • Beispiel 3 – ANALYSE DER VORHERGESAGTEN CHV-gB-AMINOSÄURESEQUENZ
  • Die abgeleitete Aminosäuresequenz des CHV-gB-Homologs wird in 1 dargelegt. Eine Hydropathie-Analyse dieser Aminosäuresequenz ist in 2 gezeigt. Das Profil wurde mit dem PC/GENE SOAP-Programm unter Verwendung des Verfahrens von Kyte & Doolittle (1982) und einem Intervall von 13 Aminosäuren erhalten. Die vertikale Achse repräsentiert die relative Hydropathie, wobei positive Werte hydrophob sind und negative Werte hydrophil sind. Die horizontale Achse repräsentiert die Aminosäurenummer des CHV-gB-Homologs.
  • Die Hydropathie-Analyse dieser Aminosäuresequenz offenbarte das Vorliegen von 2 hervorstechenden hydrophoben Peaks. Der erste Peak, am N-Terminus gelegen, repräsentiert, ohne durch irgendeine Theorie festgelegt werden zu wollen, eine potenzielle Signalsequenz. Die N-terminalen Signalsequenzen initiieren den Transport über die Membran des endoplasmatischen Retikulums und können für die korrekte post-translationelle Modifizierung und das Anzielen von Glycoproteinen entscheidend sein (Blobel, 1980). Signalsequenzen variieren in der Länge von etwa 15-30 Resten und bestehen gewöhnlich aus einer basischen N-terminalen Region, einer zentralen hydrophoben Region und einer kurzen, relativ polaren C-terminalen Region. Zusätzlich entspricht die Spaltungsstelle gewöhnlich der -3,-1-Regel, wobei der Rest an der Position –1 klein ist (Ala, Ser, Gly, Cys, Thr oder Gln) und der Rest an der Position –3 nicht aromatisch (Phe, His, Tyr oder Trp), geladen (Asp, Glu, Lys oder Arg) oder groß und polar ist (Asn oder Gln), und die Reste –3 bis +1 nicht Pro sind (von Heijne, 1986). Obwohl die Analyse mit PSIGNAL, einem PC/GENE-Programm, das gestaltet ist, um eukaryontische Signalsequenzen nachzuweisen, das N-terminale Ende von CHV-gB nicht als eine potenzielle Signalsequenz identifiziert, hat diese Region Elemente, die typischen Signalsequenzen entsprechen; nämlich einen hydrophoben Kern (Reste 2–17) und eine relativ polare C-terminale Region (1). Die Tatsache, dass PSIGNAL keine Signalsequenz in der N-terminalen Region von CHV-gB nachweist, ist nicht einzigartig. Dieser Algorithmus weist auch keine Signalsequenz in der N-terminalen Region des VZV-gB-Homologs nach.
  • Der (die) zweite(n), sehr breite(n) hydrophobe(n) Peaks (2) mit den vorhergesagten Membran-umspannenden Segmenten zwischen den Aminosäureresten 725 und 741 und 746–750 und 766–772 (unter Verwendung des Verfahrens von Klein et al. (1985)) wirkt (wirken), ohne durch irgendeine Theorie festgelegt sein zu wollen, als eine Membran-Ankerregion. Es ist die Hypothese aufgestellt worden, dass die Transmembran-Domäne von HSV1-gB sowie von anderen gB-Homologen die Membran dreimal durchquert (Pellett et al., 1985). Die Hydropathie-Analyse von CHV-gB offenbart das Vorliegen von mindestens 2 verschiedenen hydrophoben Peaks. Daher haben CHV-gB und HSV1-gB ähnliche Transmembran-Strukturen.
  • Die Ausrichtung der CHV-gB-Aminosäuresequenz mit ähnlichen Sequenzen von anderen Herpesviren offenbarte eine ausgedehnte Homologie durch die gesamte Sequenz mit Ausnahme des N-Terminus, einer Region, die die mutmaßliche Spaltungsstelle umgibt (siehe unten), und einer Region nahe des C-Terminus. Die 3A und 3B zeigen die Aminosäure-Homologie von 8 gB-Homologen. Die Aminosäuresequenzen der CHV-, FHV-, EHV1-, PRV-, HSV1-, VZV, HCMV- und EBV-gB-Homologen (für Bezugnahmen, aus denen die Sequenzen erhalten wurden, siehe Text unter Tabelle 1) wurden unter Verwendung des PC/GENE CLUSTAL-Programms ausgerichtet. Lücken, die durch Striche angezeigt werden, wurden eingebracht, um die Homologie zu maximieren. Ausgerichtete Reste, die in allen 8 Sequenzen identisch sind, werden durch einen Stern (*) angezeigt. Ausgerichtete Reste, die in der Mehrzahl der Sequenzen identisch sind, sind durch einen Punkt (.) angezeigt. Konservierte Cystein-Reste sind eingerahmt. Potenzielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen sind schattiert. Mutmaßliche proteolytische Spaltungsstellen sind unterstrichen.
  • Diese Ausrichtung offenbarte auch, dass die breite Mehrheit von Cystein-Resten perfekt konserviert ist. Zum Beispiel enthält CHV-gB 11 Cystein-Reste, wobei 10 davon in allen alpha-, beta- und gamma-Herpesviren perfekt konserviert sind. In der Tat wird der einzige Cystein-Rest in CHV-gB, der nicht konserviert ist, nahe dem N-Terminus gefunden und kann in der mutmaßlichen Signalsequenz gelegen sein. Diese Ergebnisse zeigen, dass die gB-Glycoproteine relativ ähnliche Tertiärstrukturen haben.
  • Die Ausrichtung der gB-Aminosäuresequenzen offenbarte auch, dass die potenziellen N-verknüpften Glycosylierungsstellen relativ gut konserviert sind (3A und 3B). N-verknüpfte Oligosaccharide können zu den Asn-Resten, die die Sequenz Asn-X-Ser oder Asn-X-Thr haben, zugefügt werden, wobei X nicht Pro ist (Sause, 1983). CHV-gB enthält 13 potenzielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen. Drei dieser Stellen sind jedoch in der mutmaßlichen cytoplasmatischen Domäne gelegen und müssen daher nicht glycosyliert sein. Die Lokalisation der potenziellen N-verknüpften Glycosylierungsstellen ist in der Mehrzahl der gB-Glycoproteine relativ gut konserviert (3A und 3B).
  • Das gB-Glycoprotein der meisten Herpesviren wird während der Reifung intern gespalten, wobei die folgenden Peptide durch Disulfid-Bindungen zusammengehalten werden. Das VZV-gB-Homolog (gpII) wird zum Beispiel zwischen den Arg- und Ser-Resten gespalten, was in 2 Glycoproteinen von ungefähr 60 kd resultiert (Keller et al., 1986). Die gB-Glycoproteine von FHV (Maeda et al., 1992), equinem Herpesvirus Typ 1 (EHV1) (Whalley et al., 1989), PRV (Robbins et al., 1987), BHV1 (Whitbeck et al., 1988), MDV (Ross et al., 1989) und HCMV (Kouzarides et al., 1987) werden auch gespalten. Darüber hinaus ist eine Sequenz, Arg-X-Arg-Arg/Lys--Ser/Ala, die ähnlich zu der Sequenz an der VZV-Spaltungsstelle ist, Arg-Thr-Arg-Arg--Ser, an nahezu derselben Stelle in jedem dieser gB-Glycoproteine vorhanden. Umgekehrt wird diese Sequenz nicht in HSV1-(Bzik et al., 1984) und EBV-(Pellett et al., 1985) gB-Glcyoproteinen gefunden, die nicht gespalten werden. Die Signifikanz dieses Spaltungsereignisses ist unbekannt. Es scheint jedoch nicht für die Replikation in vitro wesentlich zu sein, da Stämme von BHV1 (Blewett & Misra, 1991) und HCMV (Spaete et al., 1990), die an der Spaltungsstelle mutiert worden sind und daher ein ungespaltenes gB-Glycoprotein codieren, noch infektiös sind. Ohne durch die Theorie, dass CHV-gB intern proteolytisch gespalten wird, festgelegt sein zu wollen, ist die Sequenz Arg-Lys-Arg-Arg--Ser an derselben Stelle in CHV wie in VZV, FHV, EHV1, PRV, BHV1, MDV und HCMV vorhanden.
  • Beispiel 4 – IDENTIFIZIERUNG UND SEQUENZIERUNG DES CHV-gC-GENS
  • Genomische CHV-Fragmente wurden zufällig in pBluescriptSK cloniert. Die Nucleotidsequenz der Termini dieser Fragmente wurde bestimmt, und die vorhergesagte Aminosäuresequenz der potenziellen ORFs wurde auf eine Homologie gegen die SWISS-PROT (Ausgabe 20)-Aminosäure-Datenbank analysiert. Unter Verwendung dieser Methodik wurde ein 12 kb-XbaI-Fragment, das einen ORF mit Homologie zu den Herpesvirus-gC-Glycoproteinen codiert, identifiziert. Die Nucleotidsequenz dieses ORF ist in 4 dargelegt. 4 zeigt die Nucleotidsequenz und vorhergesagte Aminosäuresequenz des CHV-gC-Homologs und des ORF2. Die mutmaßliche Transmembran-Region und die potenziellen TATA-, CAAT- und Polyadenylierungssignal-Sequenzen sind unterstrichen. Nucleotide und vorhergesagte Aminosäurereste sind rechts von der Sequenz nummeriert. Das mutmaßliche CHV-gC-Gen beginnt an der Position 201 und endet an der Position 1580. Das vorhergesagte Translationsprodukt ist 459 Aminosäuren lang. Ein Vergleich dieser Aminosäuresequenz mit der Sequenz der gC-Glycoproteine von anderen Herpesviren ist in Tabelle 2, unten, gezeigt und offenbarte eine ausgedehnte Homologie, die darauf hinweist, dass dieser ORF das CHV-gC-Homolog codiert (Tabelle 2). Tabelle 2. HOMOLOGIE ZWISCHEN DEN VORHERGESAGTEN AMINOSÄURESEQUENZEN VON 9 HERPESVIRUS-gC-GLYCOPROTEINEN
    FHV EHV1 EHV4 PRV BHV1 VZV MDV HSV1
    CHV 44 32 34 27 27 29 27 25
    FHV 32 33 29 31 28 25 23
    EHV1 81 31 32 30 27 27
    EHV4 32 31 31 25 27
    PRV 37 27 25 29
    BHV1 29 25 27
    VZV 22 22
    MDV: 23
  • Die Werte in Tabelle 2 wurden unter Verwendung des ALIGN Plus-Programms erhalten und sind als Homologie in Prozent ausgedrückt. Die gesamte gC-Aminosäuresequenz wurde verwendet. Siehe Tabelle 1 für Ausrichtungs-Parameter. Bezugnahmen: FHV (Audonnet, unveröffentlichte Ergebnisse), EHV1 (Allen & Coogle, 1988), EHV4 (Nicolson & Onions, 1990), PRV (Robbins et al., 1986), BHV1 (Fitzpatrick et al., 1989), VZV (Davison & Scott, 1986), MDV (Ihara et al., 1989) und HSV1 (McGoech et al., 1988).
  • Beispiel 5 – ANALYSE DER CHV-gC-NUCLEOTIDSEQUENZ
  • Potenzielle TATA-Box-Sequenzen (TATA) werden an den Positionen 22 und 81 ungefähr 180 bp und 120 bp stromaufwärts des CHV-gC-Startcodons gefunden (4). Eine zusätzliche TATA-Sequenz wird an der Position 175 gefunden. Aufgrund ihrer Nähe zum gC-Startcodon muss diese Sequenz jedoch keine potenzielle TATA-Box-Sequenz sein. Potenzielle CAAT-Box-Sequenzen (CAAT und ATTG) werden an den Positionen 13, 59 und 119 ungefähr 190 bp, 140 bp und 80 bp stromaufwärts des gC-Startcodons gefunden. Eine potenzielle Polyadenylierungssignal-Sequenz (AATAAA) wird an der Position 1744 ungefähr 165 bp stromabwärts des CHV-gC-Stoppcodons und 45 bp innerhalb des ORF 2 gefunden (siehe unten). Andere potenzielle Polyadenylierungssignal-ähnliche Sequenzen werden auch in der nicht codierenden gC-3'-Region gefunden.
  • Wie das CHV-gB-Gen ist die Nucleotidsequenz, die das CHV-gC-Startcodon (AAAATGA) umgibt, günstig in Bezug auf die Regeln von Kozak an der Position –3, aber nicht an der Position +4 (4). Die FHV-(Audonnet, unveröffentlichte Ergebnisse), EHV1 (Allen & Coogle, 1988) und VZV-(Davison & Scott, 1986) gC-Gene enthalten auch ein ungünstiges Nucleotid an der Position +4.
  • Beispiel 6 – ANALYSE DER VORHERGESAGTEN CHV-gC-AMINOSÄURE SEQUENZ
  • Die abgeleitete Aminosäuresequenz des CHV-gC-Homologs ist in 4 dargelegt. 5 zeigt die Hydropathie-Analyse des CHV-gC-Homologs. Das Profil wurde mit dem PC/GENE SOAP-Programm unter Verwendung des Verfahrens von Kyte & Doolittle (1982) und einem Intervall von 13 Aminosäuren erhalten. Die vertikale Achse repräsentiert die relative Hydropathie, wobei positive Werte hydrophob sind und negative Werte hydrophil sind. Die horizontale Achse repräsentiert die Aminosäurenummer des CHV-gC-Homologs.
  • Die Hydropathie-Analyse der vorhergesagten CHV-gC-Aminosäuresequenz offenbarte das Vorliegen von 2 hervorstechenden hydrophoben Peaks (5). Der erste Peak, am N-Terminus gelegen, repräsentiert, ohne durch irgendeine Theorie festgelegt werden zu wollen, eine potenzielle Signalsequenz. Obwohl die Analyse mit PSIGNAL das N-terminale Ende dieses Polypeptids nicht als eine potenzielle Signalsequenz identifiziert, hat diese Region eine basische N-terminale Region, einen hydrophoben Kern (Reste 6–20) und eine relativ polare C-terminale Region (4). Der zweite hydrophobe Peak mit einem vorhergesagten membrandurchspannenden Segment zwischen den Resten 424–433 und 449–456 (unter Verwendung des Verfahrens von Klein et al. (1985)) wirkt, ohne durch irgendeine Theorie festgelegt sein zu wollen, als eine Membran-Ankerregion. 6 zeigt die Aminosäure-Homologie von 4 gC-Homologen. Die Aminosäuresequenzen der CHV-, FHV-, EHV1- und HSV1-gC-Homologe (für Bezugnahmen siehe Tabelle 2) wurden unter Verwendung des PC/GENE CLUSTAL-Programms ausgerichtet. Lücken, die durch Striche angezeigt werden, wurden eingebracht, um die Homologie zu maximieren. Ausgerichtete Reste, die in allen 4 Sequenzen identisch sind, werden durch einen Stern (*) angezeigt. Ausgerichtete Reste, die in der Mehrzahl der Sequenzen identisch sind, sind durch einen Punkt (.) angezeigt. Konservierte Cystein-Reste sind eingerahmt. Potenzielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen sind schattiert.
  • Die Ausrichtung der CHV-gC-Aminosäuresequenz mit homologen Sequenzen von anderen Herpesviren offenbarte einen mäßigen Grad der Homologie durch die gesamte Sequenz mit der Ausnahme des N-Terminus (6). Diese Ausrichtung offenbarte auch, dass die Mehrheit von Cystein-Resten perfekt konserviert ist. Zum Beispiel enthält CHV-gC 10 Cystein-Reste, wobei 8 davon in allen alpha-Herpesviren perfekt konserviert sind. In der Tat sind die einzigen Cystein-Reste in CHV-gC, die nicht konserviert sind, in den mutmaßlichen Transmembran- oder intrazellulären Domänen gelegen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die gC-Glycoproteine relativ ähnliche Tertiärstrukturen haben. Die Ausrichtung mit anderen gC-Sequenzen offenbarte auch die relative Konservierung von potenziellen N-verknüpften Glycosylierungsstellen.
  • Beispiel 7 – IDENTIFIZIERUNG UND SEQUENZIERUNG DES ORF2
  • Die Nucleotidsequenz-Analyse der Region stromabwärts des CHV-gC-Gens offenbarte das Vorliegen eines zweiten ORF (4). Dieser ORF (ORF2) startet an der Position 1699 und endet an der Position 2226. Das vorhergesagte Translationsprodukt ist 175 Aminosäuren lang. Tabelle 3 unten zeigt, dass der Vergleich dieser Aminosäuresequenz mit der SWISS-PROT (Ausgabe 23)-Datenbank eine signifikante Homologie mit den ORFs offenbarte, die stromabwärts von anderen alpha-Herpesvirus-gC-Genen gelegen sind. Die Homologiewerte für die ORF2-Homologe zeigen, dass in CHV, FHV, EHV1, Pferde-Herpesvirus Typ 4 (EHV4), MDV, Herpesvirus des Truthahns (HVT) und möglicherweise HSV1 der ORF, der stromabwärts des gC-Gens gelegen ist, eine hochgradig divergente, aber evolutionär verwandte Genfamilie darstellt. Umgekehrt zeigt der ORF (Gen 13), der benachbart zum VZV-gC-Gen gelegen ist, keine signifikante Homologie mit irgendeinem der anderen, vergleichbar positionierten ORFs. Darüber hinaus ist das Gen 13 auf dem Genom in der umgekehrten Richtung im Vergleich zu allen anderen ORF2-ähnlichen Genen orientiert (Davison & Scott, 1986). Diese Ergebnisse sind übereinstimmend mit den vorgeschlagenen Funktionen der Proteine, die durch diese 2 Gruppen von Genen codiert werden; das VZV-Gen 13 codiert eine Thymidylat-Synthetase (Davison und Scott, 1986), wohingegen das HSV1-ORF2-ähnliche Gen (UL45) ein mutmaßliches Virion-Protein codiert (Telford et al., 1992). Daher codieren die ORFs, die benachbart zum gC-Gen liegen, in CHV, FHV, EHV1, EHV4, MDV, HVT und möglicherweise HSV1 Proteine, die strukturell und funktionell nicht verwandt mit dem Protein sind, das stromabwärts des VZV-gC-Homologs codiert wird. Tabelle 3. HOMOLOGIE ZWISCHEN DEN VORHERGESAGTEN AMINOSÄURESEQUENZEN DER ORFS, DIE BEHNACHBART ZUM gB-Gen LIEGEN, IN 8 HERPESVIREN
    FHV EHV1 EHV4 MDV HTV HSV1 VZV
    CHV 197(22) 211(22) 219(21) 62(4) 105(13) 53(4) 31(0)
    FHV 177(24) 167(18) 69(4) 66(4) 40(1) 52(1)
    EHV1 470(50) 95(8) 104(9) 79(7) 58(3)
    EHV4 132(8) 130(11) 60(5) 30(0)
    MDV 767(75) 83(6) 28(0)
    HTV 91(7) 33(0)
    HSV1 49(2)
  • Die Werte in Tabelle 3 wurden unter Verwendung der FASTA- und RDF2-Programme (Pearson & Lipman, 1988) erhalten. Ein ktup von 1 wurde verwendet. Die Werte in Klammern repräsentieren die Zahl der Standardabweichungen zwischen dem FASTA-Wert und dem Mittel der Werte, die von 100 zufällig permutierten Versionen der potenziell verwandten Sequenz erhalten wurden. Bezugnahmen: FHV (Audonnet, unveröffentlichte Ergebnisse), EHV1 (Telford et al., 1992), EHV4 (Nicolson & Onions, 1990), MDV (Ihara et al., 1989), HVT (Kato et al., 1989), HSV1 (McGeoch et al., 1988) und VZV (Davison & Scott, 1986).
  • Beispiel 8 – ANALYSE DER CHV-ORF2-NUCLEOTIDSEQUENZ
  • Potenzielle TATA-Box-Sequenzen (TATA) werden an den Positionen 1604, 1606, 1635 und 1662 ungefähr 95, 93, 65 und 35 bp stromaufwärts des ORF2-Startcodons und ungefähr 24, 26, 55 und 80 bp stromabwärts des gC-Gen-Stoppcodons gefunden (4). Eine potenzielle CAAT-Box-Sequenz (CAAT) wird an der Position 1584 ungefähr 115 bp stromaufwärts des Startcodons gefunden.
  • Potenzielle Polyadenylierungssignal-Sequenzen (AATAAA) werden an den überlappenden Positionen 2225, 2229, 2234 und 2238 ungefähr 0-15 bp stromabwärts des ORF2-Stoppcodons gefunden. Die Nucleotidsequenz, die das ORF2-Startcodon umgibt (AATATGG) ist an den Positionen –3 und +4 günstig in Bezug auf die Regeln von Kozak.
  • Beispiel 9 – IDENTIFIZIERUNG UND SEQUENZIERUNG DES CHV-gD-GENS
  • Unter Verwendung derselben Methodik, die verwendet wurde, um das CHV-gC-Homolog zu kartieren, wurde ein 7 kb-PstI-Fragment identifiziert, das einen ORF mit Homologie zu den Herpesvirus-gD-Glycoproteinen codiert. 7 zeigt die Nucleotidsequenz und vorhergesagte Aminosäuresequenz des CHV-gD-Homologs.
  • Die mutmaßliche Signalsequenz, Transmembran-Region und potenzielle Polyadenylierungssignal-Sequenzen sind unterstrichen. Die Nucleotide und vorhergesagten Aminosäurereste sind rechts von der Sequenz nummeriert. Das CHV-gD-Gen beginnt an der Position 201 und endet an der Position 1238. Das Translationsprodukt (vorhergesagt) ist 345 Aminosäuren lang. Tabelle 4 unten liefert einen Vergleich dieser Aminosäuresequenz mit der Sequenz von anderen gD-Glycoproteinen und offenbarte eine ausgedehnte Homologie, was darauf hinweist, dass dieser ORF das CHV-gD-Homolog codiert. Tabelle 4. Homologie zwischen den vorhergesagten Aminosäuresequenzen von 6 Herpesvirus-gD-Glycoproteinen
    FHV EHV1 PRV BHV1 HSV1
    CHV 45 35 27 34 21
    FHV 31 30 34 24
    EHV1 26 27 21
    PRV 37 27
    BHV1 24
  • Die Werte in Tabelle 4 wurden unter Verwendung des ALIGN Plus-Programms erhalten und sind als Homologie in Prozent ausgedrückt. Die gesamte gD-Aminosäuresequenz wurde verwendet. Siehe Tabelle 1 für Ausrichtungs-Parameter. Bezugnahmen: FHV (Audonnet, unveröffentlichte Ergebnisse), EHV1 (Flowers et al., 1991), PRV (Petrovskis et al., 1986), BHV1 (Tikoo et al., 1990) und HSV1 (Lasky & Dowbenko, 1984).
  • Beispiel 10 – ANALYSE DER CHV-gD-NUCLEOTIDSEQUENZ
  • Es wurden keine TATA- oder CAAT/ATTG-Sequenzen unmittelbar stromaufwärts des CHV-gD-Gens identifiziert (7). Zahlreiche potenzielle TATA- Box-ähnliche Sequenzen wurden jedoch gefunden. Potenzielle Polyadenylierungssignal-Sequenzen (AATAAA) wurden an den Positionen 1260 und 1287 ungefähr 25 bp und 50 bp stromabwärts des CHV-gD-Stoppcodons gefunden. Wie die CHV-gB- und -gC-Gene ist die Nucleotidsequenz, die das CHV-gD-Startcodon (AAAATGA) umgibt, an der Position –3, aber nicht an der Position +4 günstig in Bezug auf die Regeln von Kozak (7). Die FHV-(Audonnet, unveröffentlichte Ergebnisse), EHV1-(Audonnet et al., 1990; Flowers et al., 1991), PRV (Petrovskis et al., 1986) und BHV1-(Tikoo et al., 1990) gD-Gene enthalten auch ein ungünstiges Nucleotid an der Position +4.
  • Beispiel 11 – ANALYSE DER VORHERGESAGTEN CHV-gD-AMINOSÄURE SEQUENZ
  • Die abgeleitete Aminosäuresequenz des CHV gD-Homologs ist in 7 dargestellt. 8 zeigt die Hydropathie-Analyse des CHV-gD-Homologs. Das Profil wurde mit dem PC/GENE SOAP-Programm unter Verwendung des Verfahrens von Kyte & Doolittle (1982) und einem Intervall von 11 Aminosäuren erhalten. Die vertikale Achse repräsentiert die relative Hydropathie, wobei positive Werte hydrophob sind und negative Werte hydrophil sind. Die horizontale Achse repräsentiert die Aminosäurenummer des CHV-gD-Homologs.
  • Die Hydropathie-Analyse der vorhergesagten CHV-gD-Aminosäuresequenz offenbarte das Vorliegen von 2 hervorstechenden hydrophoben Peaks (8). Der erste Peak, am N-Terminus gelegen, repräsentiert, ohne durch irgendeine Theorie festgelegt werden zu wollen, eine potenzielle Signalsequenz. Tatsächlich identifizierte PSIGNAL eine potenzielle Spaltungsstelle zwischen den Positionen 16 und 17. Der zweite hydrophobe Peak mit einem vorhergesagten membrandurchspannenden Segment zwischen den Resten 304–311 und 327–332 (unter Verwendung des Verfahrens von Klein et al. (1985)) wirkt, ohne durch irgendeine Theorie festgelegt sein zu wollen, als eine Membran-Ankerregion.
  • 9 zeigt die Aminosäure-Homologie von 4 gD-Homologen. Die Aminosäuresequenzen der CHV-, FHV-, EHV1- und HSV1-gD-Homologe (für Bezugnahmen siehe Tabelle 4) wurden unter Verwendung des PC/GENE CLUSTAL-Programms ausgerichtet. Lücken, die durch Striche angezeigt werden, wurden eingebracht, um die Homologie zu maximieren. Ausgerichtete Reste, die in allen 4 Sequenzen identisch sind, werden durch einen Stern (*) angezeigt. Ausgerichtete Reste, die in der Mehrzahl der Sequenzen identisch sind, sind durch einen Punkt (.) angezeigt. Konservierte Cystein-Reste sind eingerahmt. Potenzielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen sind schattiert. Die Ausrichtung der CHV-gD-Aminosäuresequenz mit homologen Sequenzen von anderen Herpesviren offenbarte einen mäßigen Grad der Homologie durch die gesamte Sequenz mit der Ausnahme des N-Terminus (9). Diese Ausrichtung offenbarte auch, dass die breite Mehrheit von Cystein-Resten perfekt konserviert ist. Zum Beispiel enthält CHV-gD 6 Cystein-Reste, wobei alle davon in allen alpha-Herpesviren perfekt konserviert sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass die gD-Glycoproteine relativ ähnliche Tertiärstrukturen haben. Diese Ausrichtung offenbarte auch, dass die potenziellen N-verknüpften Glycosylierungsstellen gut konserviert sind. Ohne durch irgendeine Theorie festgelegt sein zu wollen, dass die CHV-gD-Glycosylierungsstellen verwendet werden, ist bekannt, dass alle der potenziellen HSV1-gD-Glycosylierungsstellen verwendet werden (Sodora et al., 1991).
  • Beispiel 12 – GENOMISCHE ORGANISATION
  • Die gB-, gC- und gD-Gene wurden nicht auf spezifische Lagen auf dem CHV-Genom kartiert. Die Nucleotidsequenz-Analysen der Regionen, die diese Gene flankieren, weisen jedoch darauf hin, dass die genomische Organisation von CHV ähnlich zu anderen alpha-Herpesviren ist. Zum Beispiel hat der ORF, der unmittelbar stromaufwärts des CHV-gB-Gens gelegen ist, eine Homologie mit dem Gen 30 von VZV (Davison & Scott, 1986) und UL28 von HSV1 (McGeoch et al., 1988), wobei beide unmittelbar stromaufwärts des gB-Homologs in jenen Viren gelegen sind. Der ORF2, der unmittelbar stromabwärts des CHV-gC-Gens gelegen ist, hat eine Homologie mit den ORFs, die unmittelbar stromabwärts des gC-Homologs in FHV (Audonnet, unveröffentlichte Ergebnisse), EHV1 (Telford et al., 1992), EHV4 (Nicolson & Onions, 1990), HVT (Kato et al., 1988) und vielleicht HSV1 (McGeoch et al., 1988) gelegen sind. Zusätzlich hat der ORF, der unmittelbar stromabwärts des CHV-gD-Gens gelegen ist, eine Homologie zum gI-Gen von EHV1 (Audonnet et al., 1990) und dem gp63-Gen von PRV (Petrovskis et al., 1986), wobei beide unmittelbar stromabwärts des gD-Homologs in jenen Viren gelegen sind (Daten nicht gezeigt).
  • Beispiel 13 – KONSTRUKTION DES PLASMIDS pSD460 FÜR DIE DELETION DES THYMIDINKINASE-GENS (J2R)
  • Jetzt Bezug nehmend auf 10 enthält das Plasmid pSD406 Vaccinia-HindIII J (Pos. 83359–88377), cloniert in pUC8. pSD406 wurde mit HindIII und PvuII geschnitten, und das 1,7 kb-Fragment von der linken Seite von HindIII J in pUC8 cloniert, das mit HindIII/SmaI geschnitten wurde, was pSD447 bildet. pSD447 enthält das gesamte Gen für J2R (Pos. 83855–84385). Das Startcodon ist in einer NlaIII-Stelle enthalten, und das Stoppcodon ist in einer SspI-Stelle enthalten. Die Richtung der Transkription wird in 10 durch einen Pfeil angezeigt.
  • Um einen linken flankierenden Arm zu erhalten, wurde ein 0,8 kb-HindIII/EcoRI-Fragment von pSD447 isoliert, dann mit NlaIII verdaut und ein 0,5 kb-HindIII/NlaIII-Fragment isoliert. Die aneinander gelagerten synthetischen Oligonucleotide MPSYN43/MPSYN44 (SEQ ID NO: 24/SEQ ID NO: 25)
    Figure 00450001
    wurden mit dem 0,5 kb-HindIII/NlaIII-Fragment in das pUC18-Vektorplasmid ligiert, das mit HindIII/EcoRI geschnitten wurde, was das Plasmid pSD449 herstellt.
  • Um ein Restriktionsfragment zu erhalten, das einen rechten Vacciniaflankierenden Arm und pUC-Vektorsequenzen enthält, wurde pSD447 mit SspI (teilweise) in den Vaccinia-Sequenzen und mit HindIII an der pUC/Vaccinia-Verbindung geschnitten und ein 2,9 kb-Vektorfragment isoliert. Dieses Vektorfragment wurde mit den aneinander gelagerten synthetischen Oligonucleotiden MPSYN45/MPSYN46 (SEQ ID NO: 26/SEQ ID NO: 27)
    Figure 00450002
    ligiert, um pSD459 herzustellen.
  • Um die linken und rechten flankierenden Arme in ein Plasmid zu kombinieren, wurde ein 0,5 kb-HindIII/SmaI-Fragment von pSD449 isoliert und mit dem pSD459-Vektorplasmid ligiert, das mit HindIII/SmaI geschnitten wurde, was das Plasmid pSD460 herstellte. pSD460 wurde als Spenderplasmid für die Rekombination mit dem Wildtyp-Eltern-Vacciniavirus Copenhagen-Stamm VC-2 verwendet. Eine 32P-markierte Sonde wurde durch Primer-Extension unter Verwendung von MPSYN45 (SEQ ID NO: 26) als Matrize und dem komplementären 20-mer-Oligonucleotid MPSYN47 (SEQ ID NO: 28) (5'TTAGTTAATTAGGCGGCCGC 3') als Primer synthetisiert. Das rekombinante Virus vP410 wurde durch Plaque-Hybridisierung identifiziert.
  • Beispiel 14 – KONSTRUKTION DES PLASMIDS pSD486 FÜR DIE DELETION EINER HÄMORRHAGISCHEN REGION (B13R + B14R)
  • Jetzt Bezug nehmend auf 11 enthält das Plasmid pSD419 Vaccinia-SalI G (Pos. 160,744–173,351), cloniert in pUC8. pSD422 enthält das benachbarte Vaccinia-SalI-Fragment auf der rechten Seite, SalI J (Pos. 173,351–182,746), cloniert in pUC8. Um ein Plasmid zu konstruieren, von dem die hämorrhagische Region u, B13R–B14R (Pos. 172,549–173,552), deletiert ist, wurde pSD419 als die Quelle für den linken flankierenden Arm verwendet, und pSD442 wurde als die Quelle für den rechten flankierenden Arm verwendet. Die Richtung der Transkription für die u-Region ist in 11 durch einen Pfeil angezeigt.
  • Um unerwünschte Sequenzen von pSD419 zu entfernen, wurden Sequenzen auf der linken Seite der NcoI-Stelle (Pos. 172,253) durch Verdau von pSD419 mit NcoI/SmaI entfernt, gefolgt von einem Auffüllen der Enden mit dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase und Ligierung, was das Plasmid pSD476 herstellt. Ein rechts flankierender Vaccinia-Arm wurde durch Verdau von pSD422 mit HpaI am Stoppcodon von B14R und durch Verdau mit NruI 0,3 kb rechts davon erhalten. Dieses 0,3 kb-Fragment wurde isoliert und mit einem 3,4 kb-HincII-Vektorfragment, das von pSD476 isoliert wurde, ligiert, was das Plasmid pSD477 herstellt. Die Lokalisierung der teilweisen Deletion der Vaccinia-u-Region in pSD477 wird durch ein Dreieck angezeigt. Die verbleibende B13R-codierenden Sequenzen in pSD477 wurden durch Verdau mit ClaI/HpaI entfernt, und das resultierende Vektorfragment wurde mit den aneinander gelagerten synthetischen Oligonucleotiden SD22-mer/SD20-mer (SEQ ID NO: 29/SEQ ID NO: 30)
    Figure 00470001
    ligiert, was pSD479 herstellte. pSD479 enthält ein Startcodon (unterstrichen), gefolgt von einer BamHI-Stelle. Um die E. coli-beta-Galactosidase in den B13-B14 (u)-Deletionslocus unter der Kontrolle des u-Promotors zu platzieren, wurde ein 3,2 kb-BamHI-Fragment, enthaltend das beta-Galactosidase-Gen (Shapira et al., 1983), in die BamHI-Stelle von pSD479 inseriert, was pSD479BG herstellt. pSD479BG wurde als Spenderplasmid für die Rekombination mit dem Vacciniavirus vP410 verwendet. Das rekombinante Vacciniavirus vP533 wurde als eine blauer Plaque in der Anwesenheit des chromogenen Substrats X-Gal isoliert. In vP533 wird die B13R-B14R-Region deletiert und wird durch beta-Galactosidase ersetzt.
  • Um die beta-Galactosidase-Sequenzen von vP533 zu entfernen, wurde das Plasmid pSD486, ein Derivat von pSD477, verwendet, das eine Polylinkerregion, aber kein Startcodon an der u-Deletionsverbindung enthält. Zuerst wurde das ClaI/HpaI-Vektorfragment von pSD477, auf das oben Bezug genommen wurde, mit den aneinander gelagerten synthetischen Oligonucleotiden SD42-mer/SD40-mer (SEQ ID NO: 31/SEQ ID NO:32)
    Figure 00470002
    ligiert, was das Plasmid pSD478 herstellt. Als Nächstes wurde die EcoRI-Stelle an der pUC/Vaccinia-Verbindung durch Verdau von pSD478 mit EcoRI zerstört, gefolgt von einem Auffüllen der Enden mit dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase und Ligierung, was das Plasmid pSD478E– herstellt. pSD478– wurde mit BamHI und HpaI verdaut und mit den aneinander gelagerten synthetischen Oligonucleotiden HEM5/HEM6 (SEQ ID NO: 33/SEQ ID NO: 34)
    Figure 00470003
    ligiert, was das Plasmid pSD486 herstellte. pSD486 wurde als Spenderplasmid für die Rekombination mit dem rekombinanten Vacciniavirus vP533 verwendet, was vP553 herstellte, das als ein klarer Plaque in der Anwesenheit von X-Gal isoliert wurde.
  • Beispiel 15 – KONSTRUKTION DES PLASMIDS pMP494Δ FÜR DIE DELETION DER ATI-REGION (A26L)
  • Jetzt Bezug nehmend auf 12 enthält pSD414 SalIB, cloniert in pUC8. Um unerwünschte DNA-Sequenzen links von der A26L-Region zu entfernen, wurde pSD414 mit XbaI innerhalb der Vaccinia-Sequenzen (Pos. 137,079) und mit HindIII an der pUC/Vaccinia-Verbindung geschnitten, dann wurden mit dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase glatte Enden erzeugt und es folgte eine Ligierung, was im Plasmid pSD483 resultierte. Um unerwünschte Vaccinia-DNA-Sequenzen rechts der A26L-Region zu entfernen, wurde pSD483 mit EcoRI (Pos. 140,665 und an der pUC/Vaccinia-Verbindung) geschnitten und ligiert, was das Plasmid pSD484 bildete. Um die A26L-codierende Region zu entfernen, wurde pSD484 mit NdeI (teilweise) leicht stromaufwärts des A26L-ORF (Pos. 139,004) und mit HpaI (Pos. 137,889) leicht stromabwärts des A26L-ORF geschnitten. Das 5,2 kb-Vektorfragment wurde isoliert und mit den aneinander gelagerten synthetischen Oligonucleotiden ATI3/AT14 (SEQ ID NO: 35/SEQ ID NO: 36)
    Figure 00480001
    ligiert, was die Region stromaufwärts von A26L rekonstruiert und den A26L-ORF durch eine kurze Polylinkerregion ersetzt, die die Restriktionsstellen BgIII, EcoRI und HpaI enthält, wie oben angezeigt. Das resultierende Plasmid wurde pSD485 bezeichnet. Da die BgIII- und EcoRI-Stellen in der Polylinkerregion von pSD485 nicht einzigartig sind, wurden unerwünschte BgIII- und EcoRI-Stellen von Plasmid pSD483 (oben beschrieben) durch Verdau mit BgIII (Pos. 140,136) und mit EcoRI an der pUC/Vaccinia-Verbindung entfernt, gefolgt von dem Erzeugen glatter Enden mit dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase und Ligierung. Das resultierende Plasmid wurde pSD489 bezeichnet. Das 1,8 kb-ClaI (Pos. 137,198)/EcoRV (Pos. 139,048)-Fragment von pSD489, enthaltend den A26L-ORF, wurde durch das entsprechende, 0,7 kb-Polylinker-enthaltende ClaI/EcoRV-Fragment von pSD485 ersetzt, was pSD492 herstellte. Die BgIII- und EcoRI-Stellen in der Polylinkerregion von pSD492 sind einzigartig.
  • Eine 3,3 kb-BgIII-Kassette, enthaltend das E. coli-beta-Galactosidase-Gen (Shapira et al., 1983) unter der Kontrolle des Vaccinia 11 kDA-Promotors (Bertholet et al., 1985; Perkus et al., 1990), wurde in die BgIII-Stelle von pSD492 inseriert, was pSD493 KBG bildete. Das Plasmid pSD493 KBG wurde in der Rekombination mit dem rettenden Virus vP553 verwendet. Das rekombinante Vacciniavirus vP581, enthaltend beta-Galactosidase in der A-26L-Deletionsregion, wurde als ein blauer Plaque in der Anwesenheit von X-Gal isoliert.
  • Um ein Plasmid für das Entfernen der beta-Galactosidase-Sequenzen vom rekombinanten Vacciniavirus vP581 herzustellen, wurde die Polylinkerregion des Plasmids pSD492 durch Mutagenese (Mandecki, 1986) unter Verwendung der synthetischen Oligonucleotide MPSYN177 (SEQ ID NO: 37) (5' AAAATGGGCGTGGATTGTTAACTTTATATAACTTATTTTTTGAATATAC 3') deletiert. Im resultierenden Plasmid pMP494Δ wird die Vaccinia-DNA, die die Positionen [137,889–138,937] umspannt, einschließlich des gesamten A26L-ORF, deletiert. Eine Rekombination zwischen dem pMP494Δ und der beta-Galactosidaseenthaltenden Vaccinia-Rekombinante vP581 resultierte in der Vaccinia-Deletionsmutante vP618, die als ein klarer Plaque in der Anwesenheit von X-Gal isoliert wurde.
  • Beispiel 16 – KONSTRUKTION DES PLASMIDS pSD467 FÜR DIE DELETION DES HÄMAGGLUTININ-GENS (A56R)
  • Jetzt Bezug nehmend auf 13, kreuzt das Vaccinia-SalI G-Restriktionsfragment (Pos. 160,744–173,351) die HindIII A/B-Verbindung (Pos. 162,539). PSD419 enthält Vaccinia-SalI G, cloniert in pUC8. Die Richtung der Transkription für das Hämagglutinin (HA)-Gen ist in 13 durch einen Pfeil angezeigt. Vaccinia-Sequenzen, die von HindIII B stammen, wurden durch Verdau von pSD419 mit HindIII innerhalb der Vaccinia-Sequenzen und an der pUC/Vaccinia- Verbindung entfernt, gefolgt von einer Ligierung. Das resultierende Plasmid pSD456 enthält das HA-Gen A56R, flankiert von 0,4 kb der Vaccinia-Sequenzen auf der linken Seite und 0,4 kb der Vaccinia-Sequenzen auf der rechten Seite. Die A56R-codierenden Sequenzen wurden durch Schneiden von pSD456 mit RsaI (teilweise; Pos. 161,090) stromaufwärts der A56R-codierenden Sequenzen und mit EagI (Pos. 162,054) nahe dem Ende des Gens entfernt. Das 3,6 kb-RsaI/EagI-Vektorfragment von pSD456 wurde isoliert und mit den aneinander gelagerten synthetischen Oligonucleotiden MPSYN59 (SEQ ID NO: 38), MPSYN62 (SEQ ID NO: 39), MPSYN60 (SEQ ID NO: 40) und MPSYN61 (SEQ ID NO: 41)
    Figure 00500001
    ligiert, was die DNA-Sequenzen stromaufwärts des A56R-ORF rekonstruiert und den A56R-ORF durch eine Polylinkerregion ersetzt, wie oben angezeigt. Das resultierende Plasmid ist pSD466. Die Vaccinia-Deletion in pSD466 umspannt die Positionen [161,185–162,053]. Die Stelle der Deletion in pSD466 ist in 13 durch ein Dreieck angezeigt.
  • Eine 3,2 kb-BgIII/BamHI- (teilweise) Kassette, enthaltend das E. coli-beta-Galactosidase-Gen (Shapira et al., 1983) unter der Kontrolle des Vaccinia-11 kDa-Promotors (Bertholet et al., 1985; Guo et al., 1989), wurde in die BgIII-Stelle von pSD466 inseriert, was pSD466KBG bildete. Das Plasmid pSD466KBG wurde in Rekombination mit dem rettenden Virus vP618 verwendet. Das rekombinante Vacciniavirus vP708, enthaltend beta-Galactosidase in der A56R-Deletion, wurde als ein blauer Plaque in der Anwesenheit von X-Gal isoliert.
  • Die beta-Galactosidase-Sequenzen wurden unter Verwendung des Spenderplasmids pSD467 von vP708 deletiert. pSD467 ist identisch zu pSD466 mit der Ausnahme, dass die EcoRI-, SmaI- und BamHI-Stellen durch Verdau von pSD466 mit EcoRI/BamHI von der pUC/Vaccinia-Verbindung entfernt wurden, gefolgt von der Erzeugung glatter Enden mit dem Klenow Fragment der E. coli-Polymerase und einer Ligierung. Die Rekombination zwischen vP708 und pSD467 resultierte in der rekombinanten Vaccinia-Deletionsmutante vP723, die als ein klarer Plaque in der Anwesenheit von X-Gal isoliert wurde.
  • Beispiel 17 – KONSTRUKTION DES PLASMIDS pMPCSK1Δ FÜR DIE DELETION DER OFFENEN LESERAHMEN [C7L-K1L]
  • Jetzt Bezug nehmend auf 14, wurden die folgenden Vaccinia-Clone in der Konstruktion von pMPCSK1Δ verwendet. pSD420 wird in pUC8 SalI H-cloniert. pSD435 wird in pUC18 KpnI F-cloniert. pSD435 wird mit SphI geschnitten und wieder ligiert, was pSD451 bildet. In pSD451 werden die DNA-Sequenzen links der SphI-Stelle (Pos. 27,416) in HindIII M entfernt (Perkus et al., 1990). pSD409 wird in pUC8 HindIII M-cloniert.
  • Um ein Substrat für die Deletion des [C7L-K1L]-Genclusters von Vaccinia bereitzustellen, wurde zuerst die E. coli-beta-Galactosidase wie folgt in den Vaccinia-M2L-Deletionslocus (Guo et al., 1990) inseriert. Um die BgIII-Stelle in pSD409 zu eliminieren, wurde das Plasmid mit BgIII in den Vaccinia-Sequenzen (Pos. 28,212) und mit BamHI an der pUC/Vaccinia-Verbindung geschnitten, dann ligiert, um das Plasmid pMP409B zu bilden. pMP409B wurde an der einzigartigen SphI-Stelle (Pos. 27,416) geschnitten. M2L-codierende Sequenzen wurden durch Mutagenese (Guo et al., 1990; Mandecki, 1986) unter Verwendung des synthetischen Oligonucleotids
    Figure 00510001
    entfernt. Das resultierende Plasmid pMP409D enthält eine einzigartige BgIII-Stelle, die in den M2L-Deletionslocus inseriert ist, wie oben angezeigt. Eine 3,2 kb-BamHI (teilweise)/BgIII-Kassette, enthaltend das E. coli-beta-Galactosidase-Gen (Shapira et al., 1983) unter der Kontrolle des 11 kDa-Promotors (Bertholet et al., 1985), wurde in pMP409D inseriert, das mit BgIII geschnitten wurde. Das resultierende Plasmid pMP409DBG (Guo et al., 1990) wurde als Spenderplasmid für die Rekombination mit dem rettenden Vacciniavirus vP723 verwendet. Das rekombinante Vacciniavirus vP784, enthaltend beta-Galactosidase, die in den M2L-Deletionslocus inseriert ist, wurde als ein blauer Plaque in der Anwesenheit von X-Gal isoliert.
  • Ein Plasmid, von dem die Vacciniagene [C7L-K1L] deletiert waren, wurde in pUC8 zusammengefügt, das mit SmaI, HindIII geschnitten und mit dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase mit glatten Enden versehen wurde. Der linke flankierende Arm, der aus den Vaccinia-HindIII C-Sequenzen besteht, wurde durch Verdau von pSD420 mit XbaI (Pos. 18,628) erhalten, gefolgt von der Erzeugung glatter Enden mit dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase und Verdau mit BgIII (Pos. 19,706). Der rechte flankierende Arm, der aus den Vaccinia-HindIII K-Sequenzen besteht, wurde durch Verdau von pSD451 mit BgIII (Pos. 29,062) und EcoRV (Pos. 29,778) erhalten. Von dem resultierenden Plasmid pMP581CK werden die Vaccinia-Sequenzen zwischen der BgIII-Stelle (Pos. 19,706) in HindIII C und der BgIII-Stelle (Pos. 29,062) in HindIII K deletiert. Die Stelle der Deletion der Vaccinia-Sequenzen im Plasmid pMP581CK wird in der 14 durch ein Dreieck angezeigt.
  • Um überschüssige DNA an der Vaccinia-Deletionsverbindung zu entfernen, wurde das Plasmid pMP581CK an den NcoI-Stellen in den Vaccinia-Sequenzen (Pos. 18,811; 19,655) geschnitten, mit Bal-31-Exonuclease behandelt und einer Mutagenese (Mandecki, 1986) unter Verwendung des synthetischen Oligonucleotids MPSYN233 (SEQ ID NO: 43) 5'-TGTCATTAACACTATACTCATATTAATAAAAAT AATATTTATT-3 unterzogen. Von dem resultierenden Plasmid pMPCSKIΔ werden die Vaccinia-Sequenzen, Positionen 18,805–29,108, deletiert, die 12 offene Vaccinia-Leserahmen [C7L–K1L] umspannen. Die Rekombination zwischen pMPCSK1Δ und der beta-Galactosidase-enthaltenden Vaccinia-Rekombinante vP784 resultierte in der Vaccinia-Deletionsmutante vP804, die als ein klarer Plaque in der Anwesenheit von X-Gal isoliert wurde.
  • Beispiel 18 – KONSTRUKTION DES PLASMIDS pSD548 FÜR DIE DELETION DER GROßEN UNTEREINHEIT RIBONUCLEOTIDREDUKTASE (I4L)
  • Jetzt Bezug nehmend auf 15 enthält das Plasmid pSD405 Vaccinia-HindIII I (Pos. 63,875–70,367), cloniert in pUC8. pSD405 wurde mit EcoRV in den Vaccinia-Sequenzen (Pos. 67933) und mit SmaI an der pUC/Vaccinia-Verbindung verdaut und ligiert, was das Plasmid pSD518 bildete. pSD518 wurde als die Quelle von allen Vaccinia-Restriktionsfragmenten verwendet, die in der Konstruktion von pSD548 verwendet wurden.
  • Das Vaccinia-I4L-Gen erstreckt sich von Position 67,371-65,059. Die Richtung der Transkription für I4L wird in 15 durch einen Pfeil angezeigt. Um ein Vektorplasmid-Fragment zu erhalten, von dem ein Teil der I4L-codierenden Sequenzen deletiert ist, wurde pSD518 mit BamHI (Pos. 65,381) und HpaI (Pos. 67,001) verdaut und unter Verwendung des Klenow-Fragments der E. coli-Polymerase mit glatten Enden versehen. Dieses 4,8 kb-Vektorfragment wurde mit einer 3,2 kb-SmaI-Kassette ligiert, die das E. coli-beta-Galactosidase-Gen (Shapira et al., 1983) unter der Kontrolle des 11 kDa-Vaccinia-Promotors (Bertholet et al., 1985; Perkus et al., 1990) enthielt, was im Plasmid pSD524KBG resultierte. PSD524KBG wurde als Spenderplasmid für die Rekombination mit dem Vacciniavirus vP804 verwendet. Das rekombinante Vacciniavirus vP855, enthaltend die beta-Galactosidase in einer teilweisen Deletion des I4L-Gens, wurde als ein blauer Plaque in der Anwesenheit von X-Gal isoliert.
  • Um die beta-Galactosidase und den Rest des I4L-ORF von vP855 zu deletieren, wurde das Deletionsplasmid pSD548 konstruiert. Die linken und rechten flankierenden Vaccinia-Arme wurden getrennt in pUC8 zusammengefügt, wie unten detailliert beschrieben und schematisch in der 15 dargelegt.
  • Um ein Vektorplasmid zu konstruieren, um den linken flankierenden Vaccinia-Arm aufzunehmen, wurde pUC8 mit BamHI/EcoRI geschnitten und mit den aneinander gelagerten synthetischen Oligonucleotiden 518A1/518A2 (SEQ ID NO: 44/SEQ ID NO: 45)
    Figure 00530001
    ligiert, was das Plasmid pSD531 bildete. pSD531 wurde mit RsaI (teilweise) und BamHI geschnitten und ein 2,7 kb-Vektorfragment isoliert. pSD518 wurde mit BgIII (Pos. 64,459)/RsaI (Pos. 64,994) geschnitten und ein 0,5 kb-Fragment isoliert. Die zwei Fragmente wurden zusammen ligiert, was pSD537 bildete, das den vollständigen flankierenden Vaccinia-Arm links von den I4L-codierenden Sequenzen enthält.
  • Um ein Vektorplasmid zu konstruieren, um den rechten flankierenden Vaccinia-Arm aufzunehmen, wurde pUC8 mit BamHI/EcoRI geschnitten und mit den aneinander gelagerten synthetischen Oligonucleotiden 518B1/518B2 (SEQ ID NO: 46/SEQ ID NO: 47)
    Figure 00540001
    ligiert, was das Plasmid pSD532 bildete. pSD532 wurde mit RsaI (teilweise)/EcoRI geschnitten und ein 2,7 kb-Vektorfragment isoliert. pSD518 wurde mit RsaI innerhalb der Vaccinia-Sequenzen (Pos. 67,436) und EcoRI an der Vaccinia-pUC-Verbindung geschnitten und ein 0,6 kb-Fragment isoliert. Die zwei Fragmente wurden zusammen ligiert, was pSD538 bildete, das den vollständigen flankierenden Vaccinia-Arm rechts der I4L-codierenden Sequenzen enthält.
  • Der rechte flankierende Vaccinia-Arm wurde als ein 0,6 kb-EcoRI/BgIII-Fragment von pSD538 isoliert und in das pSD537-Vektorplasmid ligiert, das mit EcoRI/BgIII geschnitten wurde. Im resultierenden Plasmid pSD539 wird der I4L-ORF (Pos. 65,047-67,386) durch eine Polylinkerregion ersetzt, die links von einer 0,6 kb-Vaccinia-DNA und rechts von einer 0,6 kb-Vaccinia-DNA flankiert wird, alles in einem pUC-Hintergrund. Die Stelle der Deletion in den Vaccinia-Sequenzen ist in 15 durch ein Dreieck angezeigt. Um eine mögliche Rekombination der beta-Galactosidase-Sequenzen im pUC-abstammenden Teil von pSD539 mit den beta-Galactosidase-Sequenzen im rekombinanten Vacciniavirus vP855 zu verhindern, wurde die Vaccinia-I4L-Deletionskassette von pSD539 in pRC11 versetzt, einem pUC-Derivat, von dem alle beta-Galactosidase-Sequenzen entfernt und durch eine Polylinkerregion ersetzt worden sind (Colinas et al., 1990). pSD539 wurde mit EcoRI/PstI geschnitten und das 1,2 kb-Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde in pRC11 ligiert, das mit EcoRI/PstI geschnitten wurde (2,35 kb), was pSD548 bildete. Die Rekombination zwischen pSD548 und der beta-Galactosidase-enthaltenden Vaccinia-Rekombinante vP855 resultierte in der Vaccinia-Deletionsmutante vP866, die als ein klarer Plaque in der Anwesenheit von X-Gal isoliert wurde.
  • Die DNA vom rekombinanten Vacciniavirus vP866 wurde durch Restriktionsverdaue, gefolgt von Elektrophorese auf einem Agarosegel, analysiert. Die Restriktionsmuster waren, wie erwartet. Eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Engelke et al., 1988) unter Verwendung von vP866 als Matrize und Primern, die die sechs Deletions-Loci, die oben detailliert angeführt wurden, flankieren, produzierte DNA-Fragmente mit den erwarteten Größen. Eine Sequenzanalyse der durch PCR hergestellten Fragmente um die Gebiete der Deletionsverbindungen bestätigte, dass die Verbindungen, wie erwartet waren. Das rekombinante Vacciniavirus vP866, das die sechs konstruierten Deletionen enthielt, wie oben beschrieben, wurde als der Vaccinia-Impfstoffstamm „NYVAC" bezeichnet.
  • Beispiel 19 – INSERTION EINES TOLLWUT-GLYCOPROTEIN G-GENS IN NYVAC
  • Das Gen, das das Tollwut-Glycoprotein G unter der Kontrolle des Vaccinia H6-Promotors codiert (Taylor et al., 1988a,b), wurde in das TK-Deletionsplasmid pSD513 inseriert. pSD513 ist identisch zum Plasmid pSD460 (10) mit Ausnahme der Anwesenheit einer Polylinkerregion.
  • Jetzt Bezug nehmend auf 16 wurde die Polylinkerregion durch Schneiden von pSD460 mit SmaI und Ligieren das Plasmidvektors mit den aneinander gelagerten synthetischen Oligonucleotiden VQ1A/VQ1B (SEQ ID NO: 48/SEQ ID NO: 49)
    Figure 00550001
    inseriert, um das Vektorplasmid pSD513 zu bilden. pSD513 wurde mit geschnitten und mit einer 1,8 kb-Kassette mit SmaI-Enden ligiert, die das Gen enthielt, das das Tollwut-Glycoprotein G-Gen unter der Kontrolle des Vaccinia-H6-Promotors codiert (Taylor et al., 1988a,b). Das resultierende Plasmid wurde als pRW842 bezeichnet. pRW842 wurde als Spenderplasmid für die Rekombination mit NYVAC-rettendem Virus (vP866) verwendet. Das rekombinante Vacciniavirus vP879 wurde durch Plaque-Hybridisierung unter Verwendung einer 32P-markierten DNA-Sonde für die Tollwut-Glycoprotein G-codierenden Sequenzen identifiziert.
  • Die modifizierten rekombinanten Viren der vorliegenden Erfindung liefern Vorteile als rekombinante Impfstoffvektoren. Die abgeschwächte Virulenz des Vektors reduziert die Gelegenheit für die Möglichkeit einer unkontrollierten Infektion aufgrund einer Impfung in dem geimpften Individuum vorteilhaft und vermindert auch die Übertragung von geimpften auf ungeimpfte Individuen oder die Kontamination der Umwelt.
  • Die modizifierten rekombinanten Viren werden auch zum Vorteil in einem Verfahren zum Exprimieren eines Genprodukts in einer Zelle, die in vitro kultiviert wird, durch Einbringen des modifizierten rekombinanten Virus, das eine fremde DNA hat, die Genprodukte in der Zelle codiert und exprimiert, in die Zelle verwendet.
  • Beispiel 20 – KONSTRUKTION VON TROVAC-NDV, DAS DIE FUSION UND HÄMAGGLUTININ-NEURAMINIDASE-GLYCOPROTEINE DES NEWCASTLE-KRANKHEITS-VIRUS EXPRIMIERT
  • Dieses Beispiel beschreibt die Entwicklung von TROVAC, einem Geflügelpockenvirus-Vektor, und einer Geflügelpocken-Newcastle-Krankheits-Virus-Rekombinante, genannt TROVAC-NDV, und seine Sicherheit und Wirksamkeit. Ein Geflügelpockenvirus (FPV)-Vektor, der sowohl die F- als auch die HN-Gene des virulenten NDV-Stamms Texas exprimiert, wurde konstruiert. Die produzierte Rekombinante wurde TROVAC-NDV bezeichnet. TROVAC-NDV exprimiert authentisch prozessierte NDV-Glycoproteine in Vogel-Zellen, die mit dem rekombinanten Virus infiziert wurden, und eine Impfung von Tage alten Hühnern schützt gegen eine nachfolgende virulente NDV-Herausforderung.
  • Zellen und Viren. Der Texas-Stamm von NDV ist ein velogenischer Stamm. Die Herstellung von cDNA-Clonen der F- und HN-Gene ist früher beschrieben worden (Taylor et al., 1990; Edbauer et al., 1990). Der Stamm von FPV, bezeichnet FP-1, ist früher beschrieben worden (Taylor et al., 1988a). Es ist ein Impfstoff- Stamm, der für die Impfung von Tage alten Hühnern nützlich ist. Der Eltern-Virusstamm Duvette wurde in Frankreich als ein Geflügelpocken-Schorf von einem Huhn erhalten. Das Virus wurde durch ungefähr 50 Reihenpassagen in embryonierten Hühnereiern, gefolgt von 25 Passagen auf Hühnerembryofibroblastenzellen, abgeschwächt. Das Virus wurde vier aufeinanderfolgenden Plaque-Reinigungen unterzogen. Ein Plaque-Isolat wurde weiter in primären CEF-Zellen amplifiziert und ein Stammvirus, das als TROVAC bezeichnet wurde, etabliert. Das Stammvirus, das in dem in vitro-Rekombinationstest verwendet wurde, um TROVAC-NDV zu produzieren, war zwölf Passagen in primären CEF-Zellen von dem Plaque-Isolat unterzogen worden.
  • Konstruktion einer Kassette für NDV-F. Ein 1,8 kbp-BamHI-Fragment, enthaltend alle bis auf 22 Nucleotide vom 5'-Ende der F-Protein-codierenden Sequenz, wurde von pNDV81 (Taylor et al., 1990) ausgeschnitten und in die BamHI-Stelle von pUC18 inseriert, um pCE13 zu bilden. Der Vacciniavirus-H6-Promotor, der früher beschrieben wurde (Taylor et al., 1988a,b; Guo et al., 1989; Perkus et al., 1989) wurde durch Verdauen von pCE13 mit SalI, Auffüllen der klebrigen Enden mit dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase und Verdauen mit HindIII in pCE13 inseriert. Ein HindIII-EcoRV-Fragment, enthaltend die H6-Promotor-Sequenz, wurde dann in pCE13 inseriert, um pCE38 zu bilden. Ein perfektes 5'-Ende wurde durch Verdauen von pCE38 mit KpnI und NruI und Inserieren der aneinander gelagerten und Kinase-behandelten Oligonucleotide CE75 (SEQ ID NO: 50) und CE76 (SEQ ID NO: 51) hergestellt, um pCE47 herzustellen.
    CE75: CGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGCTCCAGATCTTCTACCAGGATCCCGGTAC
    CE76: CGGGATCCTGGTAGAAGATCTGGAGCCCATTACGATACAAACTTAACGGATATCG.
  • Um die nicht-codierende Sequenz vom 3'-Ende des NDV-F zu entfernen, wurde ein SmaI- bis PstI-Fragment von pCE13 in die SmaI- und PstI-Stellen von pUC18 inseriert, um pCE23 zu bilden. Die nicht-codierenden Sequenzen wurden durch sequentiellen Verdau von pCE23 mit SacI, BamHI, Exonuclease III, SI-Nuclease und EcoRI entfernt. Die aneinander gelagerten und Kinase-behandelten Oligonucleotide CE42 (SEQ ID NO: 52) und CE43 (SEQ ID NO: 53) wurden dann inseriert, um pCE29 zu bilden.
    CE42: AATTCGAGCTCCCCGGG
    CE43: CCCGGGGAGCTCG
  • Das 3'-Ende der NDV-F-Sequenz wurde dann in das Plasmid pCE20, das schon das 5'-Ende von NDV-F enthielt, durch Clonieren eines PstI-SacI-Fragments von pCE29 in die PstI- und SacI-Stellen von pCE20 inseriert, um pCE32 zu bilden. Das Herstellen von pCE20 ist früher in Taylor et al., 1990, beschrieben worden.
  • Um die H6-Promotor- und NDV-F-5'-Sequenzen, die in pCE47 enthalten sind, mit den 3'-NDV-F-Sequenzen, die in pCE32 enthalten sind, auszurichten, wurde ein HindIII-PstI-Fragment von pCE47 in die HindIII- und PstI-Stellen von pCE32 inseriert, um pCE49 zu bilden. Die vom H6-Promotor kontrollierten NDV-F-Sequenzen wurden dann durch Clonieren eines HindIII-NruI-Fragments von pCE49 in die HindIII- und SmaI-Stellen von pJCA002 (unten beschrieben) zu dem F8-Locus, von dem der ORF entfernt wurde, (unten beschrieben) transferiert, um pCE54 zu bilden. Transkriptions-Stoppsignale wurden durch Verdauen von pCE54 mit SacI, teilweises Verdauen mit BamHI und Inserieren der aneinander gelagerten und Kinase-behandelten Oligonucleotide CE166 (SEQ ID NO: 54) und CE167 (SEQ ID NO: 55) in pCE54 inseriert, um pCE58 zu bilden.
    CE166: CTTTTTATAAAAAGTTAACTACGTAG
    CE167: GATCCTACGTAGTTAACTTTTTATAAAAAGAGCT
  • Ein perfektes 3'-Ende für NDV-F wurde durch Verwenden der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit pCE54 als Matrize und den Oligonucleotiden CE182 (SEQ ID NO: 56) und CE183 (SEQ ID NO: 57) als Primer erhalten.
    CE182: CTTAACTCAGCTGACTATCC
    CE183: TACGTAGTTAACTTTTTATAAAAATCATATTTTTGTAGTGGCTC
  • Das PCR-Fragment wurde mit PvuII und HpaI verdaut und in pCE58 cloniert, das mit HpaI verdaut und teilweise mit PvuII verdaut worden war. Das resultierende Plasmid wurde pCE64 bezeichnet. Translations-Stoppsignale wurden durch Clonieren eines HindIII-HpaI-Fragments, das den vollständigen H6-Promotor und die F-codierende Sequenz von pCE64 enthält, in die HindIII- und HpaI-Stellen von pRW846 inseriert, um pCE71, die endgültige Kassette für NDV-F, herzustellen. Das Plasmid pRW846 ist im Wesentlichen äquivalent zum Plasmid pJCA002 (unten beschrieben), aber enthält den H6-Promotor und Transkriptions- und Translations-Stoppsignale. Der Verdau von pRW846 mit HindIII und HpaI eliminiert den H6-Promotor, aber lässt die Stoppsignale intakt.
  • Konstruktion der Kassette für NDV-HN. Die Konstruktion des Plasmids pRW802 wurde früher in Edbauer et al., 1990, beschrieben. Dieses Plasmid enthält die NDV-HN-Sequenzen, verknüpft mit dem 3'-Ende des Vacciniavirus-H6-Promotors, in einem pUC9-Vektor. Ein HindIII-EcoRV-Fragment, das das 5'-Ende des Vacciniavirus-H6-Promotors umspannt, wurde in die HindIII- und EcoRV-Stellen von pRW802 inseriert, um pRW830 zu bilden. Ein perfektes 3'-Ende für NDV-HN wurde durch Inserieren der aneinander gelagerten und Kinase-behandelten Oligonucleotide CE162 (SEQ ID NO: 58) und CE163 (SEQ ID NO: 59) in die EcoRI-Stelle von pRW830 erhalten, um pCE59, die endgültige Kassette für NDV-HN, zu bilden.
    CE162:
    AATTCAGGATCGTTCCTTTACTAGTTGAGATTCTCAAGGATGATGGGATTTAATTT
    TTATAAGCTTG
    CE163: AATTCAAGCTTATAAAAATTAAATCCCATCATCCTTGAGAATCTCAACTAGTAAA
    GGAACGATCCTG
  • Konstruktion des FPV-Insertionsvektors. Das Plasmid pRW731-15 enthält ein 10 kb-PvuII-PvuII-Fragment, das von genomischer DNA cloniert wurde. Die Nucleotidsequenz wurde an beiden Strängen für ein 3660 bp-PvuII-EcoRV-Fragment bestimmt. Die Grenzen eines offenen Leserahmens, hier als F8 bezeichnet, wurden bestimmt. Das Plasmid pRW761 ist ein Sub-Clon von pRW731-15, der ein 2430 bp-EcoRV-EcoRV-Fragment enthält. Der F8-ORF war gänzlich zwischen einer XbaI-Stelle und einer SspI-Stelle in pRW761 enthalten. Um ein Insertionsplasmid zu kreieren, das bei einer Rekombination mit genomischer TROVAC-DNA den F8-ORF eliminieren würde, wurden den folgenden Schritte gefolgt. Das Plasmid pRW761 wurde vollständig mit XbaI verdaut; und teilweise mit SspI verdaut. Eine 3700 bp-Xba-SspI-Bande wurde von dem Gel isoliert und mit den aneinander gelagerten doppelsträngigen Oligonucleotiden JCA017 (SEQ ID NO: 60) und JCA018 (SEQ ID NO: 61) ligiert.
    JCA017: 5'
    CTAGACACTTTATGTTTTTTAATATCCGGTCTTAAAAGCTTCCCGGGGATCCTTATACGG
    GGAATAAT
    JCA018: 5'
    ATTATTCCCCGTATAAGGATCCCCCGGGAAGCTTTTAAGACCGGATATTAAAAAACATAA
    AGTGT
    Das Plasmid, das aus dieser Ligierung resultiert, wurde als pJCA002 bezeichnet.
  • Konstruktion eines Doppelinsertionsvektors für NDV-F und -HN. Die vom H6-Promotor kontrollierte NDV-HN-Sequenz wurde in die vom H6-Promotor kontrollierte NDV-F-Kassette durch Clonieren eines HindIII-Fragments von pCE59, das mit dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase aufgefüllt worden war, in die HpaI-Stelle von pCE71 inseriert, um pCE80 zu bilden. Das Plasmid pCE80 wurde mit NdeI vollständig verdaut und mit BgIII teilweise verdaut, um ein 4760 bp-NdeI-BgIII-Fragment herzustellen, das die NDV-F- und -HN-Gene enthält, wobei beide durch den H6-Promotor gelenkt und mit den F8-flankierenden Armen verknüpft sind. Das Plasmid pJCA021 wurde durch Inserieren eines 4900 bp-PvuII-HindII-Fragments von pRW731-15 in die SmaI- und HindII-Stellen von pBSSK+ erhalten. Das Plasmid pJCA021 wurde dann mit NdeI und BgIII verdaut und an das 4760 bp-NdeI-BgIII-Fragment von pCE80 ligiert, um pJCA024 zu bilden. Das Plasmid pJCA024 enthält daher die NDV-F- und -HN-Gene als Insertionen in entgegengesetzter Orientierung, wobei die 3'-Enden benachbart zu und zwischen den flankierenden FPV-Armen vorliegen. Beide Gene sind mit dem Vacciniavirus-H6-Promotor verknüpft. Der rechte flankierende Arm, der benachbart zu der NDV-F-Sequenz ist, besteht aus 2350 bp der FPV-Sequenz. Der linke flankierende Arm, der benachbart zu der NDV-HN-Sequenz ist, besteht aus 1700 bp der FPV-Sequenz.
  • Entwicklung von TROVAC-NDV. Das Plasmid pJCA024 wurde unter Verwendung des Caliumphosphat-Präzipitationsverfahrens, das früher beschrieben wurde (Panicali et al., 1982; Piccini et al., 1987), in TROVAC-infizierte primäre CEF-Zellen transfiziert. Positive Plaques wurde auf der Basis der Hybridisierung an spezifische, radioaktiv markierte NDV-F- und -HN-Sonden ausgewählt und fünf aufeinanderfolgenden Runden der Plaquereinigung unterzogen, bis eine reine Population erreicht wurde. Ein repräsentativer Plaque wurde dann amplifiziert, und die resultierende TROVAC-Rekombinante wurde als TROVAC-NDV (vFP96) bezeichnet.
  • Immunfluoreszenz. Eine indirekte Immunfluoreszenz wurde unter Verwendung eines polyclonalen anti-NDV-Serums und von Seren, die in Kaninchen gegen Vacciniavirus-Rekombinanten, die NDV-F oder NDV-HN exprimieren, produziert wurden, als mono-spezifische Reagenzien durchgeführt, wie beschrieben (Taylor et al., 1990).
  • Immunpräzipitation. Immunpräzipitations-Reaktionen wurden unter Verwendung eines polyclonalen anti-NDV-Serums, das von SPAFAS Inc., Storrs, CT, erhalten wurde, durchgeführt, wie beschrieben (Taylor et al., 1990).
  • Das Stammvirus wurde durch in situ-Plaque-Hybridisierung gescreent, um zu bestätigen, dass der F8-ORF deletiert war. Die korrekte Insertion der NDV-Gene in das TROVAC-Genom und die Deletion des F8-ORF wurden auch durch Southern Blot-Hybridisierung bestätigt.
  • In NDV-infizierten Zellen wird das F-Glycoprotein in der Membran durch eine hydrophobe Transmembran-Region nahe dem Carboxyl-Terminus verankert und erfordert die post-translationale Spaltung eines Vorläufers, F0, in zwei Disulfidverknüpfte Polypeptide F1 und F2. Die Spaltung von F0 ist für das Bestimmen der Pathogenität eines gegebenen NDV-Stamms wichtig (Homma und Ohuchi, 1973; Nagai et al., 1976; Nagai et al., 1980), und die Sequenz der Aminosäuren an der Spaltungsstelle ist daher für das Bestimmen der viralen Virulenz kritisch. Es ist bestimmt worden, dass Aminosäuren an der Spaltungsstelle in der NDV-F-Sequenz, die in FPV inseriert wurde, um rekombinantes vFP29 zu bilden, die Sequenz Arg – Arg – Gln – Arg – Arg (SEQ ID NO: 42) hatten (Taylor et al., 1990), die mit der Sequenz übereinstimmt, von der gefunden wurde, dass sie eine Voraussetzung für virulente NDV-Stämme ist (Chambers et al., 1986; Espion et al., 1987; Le et al., 1988; McGinnes und Morrison, 1986; Toyoda et al., 1987). Das HN-Glycoprotein, das in Zellen synthetisiert wurde, die mit virulenten Stämmen von NDV infiziert wurden, ist ein ungespaltenes Glycoprotein von 74 kDa. Äußerst avirulente Stämme wie Ulster und Queensland codieren einen HN-Vorläufer (HNo), der für die Aktivierung eine Spaltung benötigt (Garten et al., 1980).
  • Die Expression der F- und HN-Gene in TROVAC-NDV wurde analysiert, um zu bestätigen, dass die Genprodukte authentisch prozessiert und präsentiert wurden. Indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung eines polyclonalen anti-NDV-Hühnerserums bestätigte, dass immunreaktive Proteine auf der infizierten Zelloberfläche präsentiert wurden. Um zu bestimmen, dass beide Proteine auf der Plasmamembran präsentiert wurden, wurden monospezifische Kaninchenseren gegen Vaccinia-Rekombinanten produziert, die entweder die F- oder die HN-Glycoproteine exprimieren. Indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung dieser Seren bestätigte die Oberflächen-Präsentation von beiden Proteinen.
  • Immunpräzipitations-Experimente wurden durch Verwenden von (35S)-Methionin-markierten Lysaten von CEF-Zellen, die mit Eltern- und rekombinanten Viren infiziert wurden, durchgeführt. Die erwarteten Werte der offensichtlichen Molekulargewichte der glycosylierten Formen von F1 und F2 sind 54,7 beziehungsweise 10,3 kDa (Chambers et al., 1986). In den Immunpräzipitations-Experimenten unter Verwendung eines polyclonalen anti-NDV-Serums wurden die Fusions-spezifischen Produkte mit der passenden Größe von der NDV-F-Einzelrekombinante vFP29 (Taylor et al., 1990) und der TROVAC-NDV-Doppelrekombinante vFP96 nachgewiesen. Das HN-Glycoprotein mit der passenden Größe wurde auch von der NDV-HN-Einzelrekombinante VFP-47 (Edbauer et al., 1990) und TROVAC-NDV nachgewiesen. Es wurden keine NDV-spezifischen Produkte von nicht-infizierten und mit Eltern-TROVAC infizierten CEF-Zellen nachgewiesen.
  • In CEF-Zellen werden die F- und HN-Glycoproteine geeigneterweise auf der Oberfläche von infizierten Zellen präsentiert, wo sie durch NDV-Immunserum erkannt werden. Eine Immunpräzipitations-Analyse wies darauf hin, dass das F0-Protein authentisch in die F1- und F2-Komponenten gespalten wird, die in virulenten Stämmen erforderlich sind. In ähnlicher Weise wurde das HN-Glycoprotein in CEF-Zellen, die mit rekombinantem TROVAC-NDV infiziert wurden, authentisch prozessiert.
  • Frühere Berichte (Taylor et al., 1990; Edbauer et al., 1990; Boursnell et al., 1990a,b,c; Ogawa et al., 1990) würden darauf hinweisen, dass die Expression entweder von HN oder F alleine ausreichend ist, um eine schützende Immunität gegen eine NDV-Herausforderung hervorzurufen. Arbeit an anderen Paramyxoviren hat jedoch darauf hingewiesen, dass ein Antikörper gegen beide Proteine für eine vollständige schützende Immunität erforderlich sein kann. Es ist gezeigt worden, dass sich das SV5-Virus in Gewebekultur in der Anwesenheit eines Antikörpers gegen das HN-Glycoprotein, aber nicht gegen das F-Glycoprotein verbreiten konnte (Merz et al., 1980). Zusätzlich ist nahe gelegt worden, dass Impfstoff-Versagen mit abgetöteten Masernvirus-Impfstoffen aufgrund einer Inaktivierung der Fusionskomponente erfolgen (Norrby et al., 1975). Da für beide NDV-Glycoproteine gezeigt worden ist, dass sie für das Hervorrufen eines Virus-neutralisierenden Antikörpers verantwortlich sind (Avery et al., 1979) und beide Glycoproteine, wenn sie individuell in einem Geflügelpocken-Vektor exprimiert werden, zum Induzieren einer schützenden Immunantwort in der Lage sind, kann anerkannt werden, dass der wirksamste NDV-Impfstoff beide Glycoproteine exprimieren sollte.
  • Beispiel 21 – KONSTRUKTION VON ALVAC-REKOMBINANTEN, DIE DAS TOLLWUTVIRUS-GLYCOPROTEIN G EXPRIMIEREN
  • Dieses Beispiel beschreibt die Entwicklung von ALVAC, einem Kanarienpocken-Virusvektor, und von einer Kanarienpocken-Tollwut-Rekombinante, bezeichnet als ALVAC-RG (vCP65), und ihrer Sicherheit und Wirksamkeit.
  • Zellen und Viren. Das Eltern-Kanarienpockenvirus (Rentschler-Stamm) ist ein Impfstoffstamm für Kanarienvögel. Der Impfstoffstamm wurde von einem Wildtyp-Isolat erhalten und durch mehr als 200 Reihenpassagen auf Hühnerembryofibroblasten abgeschwächt. Eine Master-Virussaat wurde vier aufeinanderfolgenden Plaquereinigungen unter Agar unterzogen, und ein Plaque-Clon wurde durch fünf zusätzliche Passagen amplifiziert, wonach das Stammvirus als das Elternvirus in in vitro-Rekombinationstests verwendet wurde. Das Plaque-gereinigte Kanarienpocken-Isolat wird ALVAC bezeichnet.
  • Konstruktion eines Kanarienpocken-Insertionsvektors. Ein 880 bp-Kanarienpocken-PvuII-Fragment wurde zwischen die PvuII-Stellen von pUC9 cloniert, um pRW764.5 zu bilden. Die Sequenz dieses Fragments ist in 17 (SEQ ID NO: 62) zwischen den Positionen 1372 und 2251 gezeigt. Die Grenzen eines offenen Leserahmens, bezeichnet C5, wurden definiert. Es wurde bestimmt, dass der offene Leserahmen an der Position 166 innerhalb des Fragments begann und an der Position 487 endete. Die C5-Deletion wurde ohne Unterbrechung von offenen Leserahmen gemacht. Die Basen von der Position 167 bis Position 455 wurden durch die Sequenz (SEQ ID NO: 63) GCTTCCCGGGAATTCTAGCTAGCTAGTTT ersetzt. Diese Ersatzsequenz enthält HindIII-, SmaI- und EcoRI-Insertionsstellen, gefolgt von Translationsstopps und einem Transkriptions-Terminationssignal, das durch die Vacciniavirus-RNA-Polymerase erkannt wird (Yuen et al., 1987). Die Deletion des C5-ORF wurde durchgeführt, wie unten beschrieben. Das Plasmid pRW764.5 wurde teilweise mit RsaI geschnitten, und das lineare Produkt wurde isoliert. Das lineare RsaI-Fragment wurde wieder mit BgIII geschnitten, und das pRW764.5-Fragment, jetzt mit einer RsaI- bis BgIII-Deletion von Position 156 bis Position 462, wurde isoliert und als ein Vektor für die folgenden synthetischen Oligonucleotide verwendet:
    RW145 (SEQ ID NO: 64):
    ACTCTCAAAAGCTTCCCGGGAATTCTAGCTAGCTAGTTTTTATAAA
    RW146 (SEQ ID NO: 65):
    GATCTTTATAAAAACTAGCTAGCTAGAATTCCCGGGAAGCTTTTGAGAGT
  • Die Oligonucleotide RW145 und RW146 wurden aneinander gelagert und in den oben beschriebenen pRW 764.5-RsaI- und BgIII-Vektor inseriert. Das resultierende Plasmid wird pRW831 bezeichnet.
  • Konstruktion eines Insertionsvektors, der das Tollwut G-Gen enthält. Die Konstruktion von pRW838 ist unten illustriert. Die Oligonucleotide A bis E, die das Translations-Startcodon des H6-Promotors mit dem ATG von Tollwut G überlappen, wurden in pUC9 als pRW737 cloniert. Die Oligonucleotide A bis E enthalten den H6-Promotor, startend bei NruI, bis zu der HindIII-Stelle von Tollwut G, gefolgt von BgIII. Die Sequenzen der Oligonucleotide A bis E ((SEQ ID NO: 66) – (SEQ ID NO: 70)) sind:
    A (SEQ ID NO: 66); CTGAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTAA
    GTTTGTATCGTAATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGT
    B (SEQ ID NO: 67): CATTACGATACAAACTTAACGGATATCGCGATAA
    TGAAATAATTTCAG
    C (SEQ ID NO: 68): ACCCCTTCTGGTTTTTCCGTTGTGTTTTGGGAAA
    TTCCCTATTTACACGATCCCAGACAAGCTTAGATCTCAG
    D (SEQ ID NO: 69): CTGAGATCTAAGCTTGTCTGGGATCGTGTAAATA
    GGGAATTTCCCAAAACA
    E (SEQ ID NO: 70): CAACGGAAAAACCAGAAGGGGTACAAACAGGAGA
    GCCTGAGGAAC
  • Das Diagramm der aneinander gelagerten Oligonucleotide A bis E ist wie folgt:
    Figure 00650001
  • Die Oligonucleotide A bis E wurden kinasebehandelt, aneinander gelagert (95°C für 5 Minuten, dann auf Zimmertemperatur abgekühlt) und zwischen die PvuII-Stellen von pUC9 inseriert. Das resultierende Plasmid pRW737 wurde mit HindIII und BgIII geschnitten und als ein Vektor für das 1,6 kbp-HindIII-BgIII-Fragment von ptg155PRO (Kieny et al., 1984) verwendet, was pRW739 herstellte. Die ptg155PRO-HindIII-Stelle befindet sich 86 bp stromabwärts des Tollwut G-Translations-Startcodons. BgIII befindet sich stromabwärts des Tollwut G-Translations-Stoppcodons in ptg155PRO. pRW739 wurde teilweise mit NruI geschnitten, vollständig mit BgIII geschnitten, und ein 1,7 kbp-NruI-BgIII-Fragment, enthaltend das 3'-Ende des H6-Promotors, der früher beschrieben wurde (Taylor et al., 1988a,b; Guo et al., 1989; Perkus et al., 1989), durch das gesamte Tollwut G-Gen, wurde zwischen die NruI- und BamHI-Stellen von pRW824 inseriert. Das resultierende Plasmid wird pRW832 bezeichnet. Eine Insertion in pRW824 fügte den H6-Promotor 5' von NruI zu. Die pRW824-Sequenz von BamHI, gefolgt von SmaI, ist (SEQ ID NO: 71): GGATCCCCGGG pRW824 ist ein Plasmid, das ein nicht-relevantes Gen enthält, das präzise mit dem Vacciniavirus-H6-Promotor verknüpft ist. Der Verdau mit NruI und BamHI schneidet dieses nicht-relevante Gen vollständig aus. Das 1,8 kbppRW832-SmaI-Fragment, enthaltend das vom H6-Promotor kontrollierte Tollwut G, wurde in das SmaI von pRW831 inseriert, um das Plasmid pRW838 zu bilden.
  • Entwicklung von ALVAC-RG. Das Plasmid pRW838 wurde durch Verwenden des Calciumphosphat-Präzipitationsverfahrens, das früher beschrieben wurde (Panicali et al., 1982; Piccini et al., 1987), in ALVAC-infizierte primäre CEF-Zellen transfiziert. Positive Plaques wurden auf der Basis der Hybridisierung an eine spezifische Tollwut G-Sonde ausgewählt und 6 aufeinanderfolgenden Runden einer Plaquereinigung unterzogen, bis eine reine Population erreicht wurde. Ein repräsentativer Plaque wurde dann amplifiziert, und die resultierende ALVAC-Rekombinante wurde ALVAC-RG (vCP65) bezeichnet (siehe auch 18A und 18B). Die korrekte Insertion des Tollwut G-Gens in das ALVAC-Genom ohne folgende Mutation wurde durch Sequenzanalyse bestätigt.
  • Immunfluoreszenz. Während der endgültigen Stadien der Zusammenlagerung der reifen Tollwut-Viruspartikel wird die Glycoprotein-Komponente vom Golgi-Apparat zu der Plasmamembran transportiert, wo sie akkumuliert, wobei sich das Carboxy-Ende in das Cytoplasma und der Großteil des Proteins auf der externen Oberfläche der Zellmembran erstreckt. Um zu bestätigen, dass das Tollwut-Glycoprotein, das in ALVAC-RG exprimiert wird, korrekt präsentiert wird, wurde eine Immunfluoreszenz auf primären CEF-Zellen durchgeführt, die mit ALVAC oder ALVAC-RG infiziert waren. Die Immunfluoreszenz wurde, wie früher beschrieben (Taylor et al., 1990), unter Verwendung eines monoclonalen Tollwut G-Antikörpers durchgeführt. Eine starke Oberflächenfluoreszenz wurde auf CEF-Zellen nachgewiesen, die mit ALVAC-RG infiziert waren, aber nicht mit dem Eltern-ALVAC.
  • Immunpräzipitation. Vorgeformte Einzellschichten von primären CEF-, Vero- (eine Linie von afrikanischen Meerkatzen-Nierenzellen ATCC # CCL81) und MRC-5-Zellen (eine Fibroblasten-ähnliche Zelllinie, abgeleitet von einem normalen menschlichen fötalen Lungengewebe ATCC # CCL171) wurden mit 10 PbE pro Zellen mit dem Elternvirus ALVAC und dem rekombinanten Virus ALVAC-RG in der Anwesenheit von radioaktiv markiertem 35S-Methionin geimpft und behandelt, wie früher beschrieben (Taylor et al., 1990). Die Immunpräzipitations-Reaktionen wurden unter Verwendung eines monoclonalen Tollwut G-spezifischen Antikörpers durchgeführt. Eine wirksame Expression eines Tollwut-spezifischen Glycoproteins mit einem Molekulargewicht von ungefähr 67 kDa wurde mit dem rekombinanten ALVAC-RG nachgewiesen. Es wurden keine Tollwut-spezifischen Produkte in nicht infizierten Zellen oder Zellen, die mit dem Eltern-ALVAC-Virus infiziert wurden, nachgewiesen.
  • Sequenzielles Passagenexperiment. In Untersuchungen mit ALVAC-Virus in einem Bereich von Nicht-Vogelspezies wurde keine proliferative Infektion oder offenkundige Krankheit beobachtet (Taylor et al., 1991b). Um jedoch zu etablieren, dass weder das Eltern- noch das rekombinante Virus an das Wachstum in Nicht-Vogel-Zellen angepasst werden könnten, wurde ein sequenzielles Passagenexperiment durchgeführt.
  • Mit den zwei Viren ALVAC und ALVAC-RG wurden in 10 sequenziellen Blindpassagen drei Zelllinien beimpft:
    • (1) Primäre Hühnerembryofibroblasten (CEF)-Zellen, produziert von 11 Tage alten weißen Leghorn-Embryonen;
    • (2) Vero-Zellen – eine kontinuierliche Linie von afrikanischen Meerkatzen-Nierenzellen (ATCC # CCL81); und
    • (3) MRC-5-Zellen – eine diploide Zelllinie, abgeleitet von einem menschlichen fötalen Lungengewebe (ATCC # CCL171).
  • Die anfängliche Impfung wurde bei einer m.o.i. von 0,1 PbE pro Zelle unter Verwendung von drei 60 mm-Schalen von jeder Zelllinie, enthaltend 2 × 106 Zellen pro Schale, durchgeführt. Eine Schale wurde in der Anwesenheit von 40 μg/ml Cytosinarabinosid (Ara C), einem Inhibitor der DNA-Replikation, beimpft. Nach einer Absorptionsdauer von 1 Stunde bei 37°C wurde das Inokulum entfernt und die Einzelzellschicht gewaschen, um nicht absorbiertes Virus zu entfernen. Zu dieser Zeit wurde das Medium durch 5 ml EMEM + 2% NBCS bei zwei Schalen (Proben t0 und t7) und 5 ml EMEM + 2% NBCS, enthaltend 40 μg/ml Ara C, bei der dritten (Probe t7A) ersetzt. Die Probe t0 wurde bei –70°C gefroren, um einen Hinweis auf das Rest-Eingabevirus zu liefern. Die Proben t7 und t7A wurden bei 37°C für 7 Tage inkubiert, wonach die Inhalte geerntet und die Zellen durch indirekte Beschallung zerstört wurden.
  • Mit einem ml der Probe t7 von jeder Zelllinie wurden unverdünnt drei Schalen derselben Zelllinie (um die Proben t0, t7 und t7A zu liefern) und eine Schale mit primären CEF-Zellen beimpft. Die Proben t0, t7 und t7A wurden wie für die Passage Eins behandelt. Die zusätzliche Beimpfung von CEF-Zellen wurde eingeschlossen, um einen Amplifizierungsschritt für einen empfindlicheren Nachweis des Virus zu liefern, das in den Nicht-Vogel-Zellen vorhanden sein könnte.
  • Dieses Vorgehen wurde für 10 (CEF und MRC-5) oder 8 (Vero) sequenzielle Blindpassagen wiederholt. Die Proben wurden dann dreimal gefroren und wieder aufgetaut und durch Titration auf primäre CEF-Einzelzellschichten getestet.
  • Der Virusertrag in jeder Probe wurde dann durch Plaque-Titration auf CEF-Einzellschichten unter Agarose bestimmt. Die zusammengefassten Ergebnisse des Experiments sind in den Tabellen 5 und 6 gezeigt.
  • Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass sowohl das Eltern-ALVAC als auch das rekombinante ALVAC-RG zu anhaltender Replikation auf CEF-Einzelzellschichten ohne Verlust des Titers in der Lage sind. In Vero-Zellen fielen die Virusspiegel nach 2 Passagen für ALVAC und 1 Passage für ALVAC-RG unter den Nachweisspiegel. In MRC-5-Zellen war ein ähnliches Ergebnis offenkundig, und nach 1 Passage wurde kein Virus nachgewiesen. Obwohl in den Tabellen 5 und 6 nur die Ergebnisse für vier Passagen gezeigt sind, wurden die Reihen für 8 (Vero) und 10 (MRC-5) Passagen ohne nachweisbare Anpassung eines Virus an ein Wachstum in den Nicht-Vogel-Zellen fortgesetzt.
  • In der Passage 1 waren in der t7-Probe in MRC-5- und Vero-Zellen relativ hohe Spiegel des Virus vorhanden. Dieser Virusspiegel war jedoch äquivalent zu jenem, der in der t0-Probe und der t7A-Probe gesehen wurde, die in der Anwesenheit von Cytosinarabinosid inkubiert wurden, wobei keine virale Replikation erfolgen kann. Dies zeigte, dass die Virusspiegel, die nach 7 Tagen in Nicht-Vogel-Zellen gesehen werden, Restvirus und nicht neu repliziertes Virus repräsentieren.
  • Um den Test empfindlicher zu machen, wurde mit einem Teil der 7 Tage-Ernte von jeder Zelllinie eine permissive CEF-Einzelzellschicht beimpft und nach cytopathischer Wirkung (CPE) oder nach 7 Tagen, wenn keine CPE offenkundig war, geerntet. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 7 gezeigt. Sogar nach der Amplifizierung durch eine permissive Zelllinie wurde das Virus nur in MRC-5- und Vero-Zellen für zwei zusätzliche Passagen nachgewiesen. Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass es unter den verwendeten Bedingungen keine Anpassung eines Virus an ein Wachstum in Vero- oder MRC-5-Zellen gab.
  • Impfung von Makaken- Vier HIV-seropositive Makaken wurden anfänglich mit ALVAC-RG geimpft, wie in Tabelle 8 beschrieben. Nach 100 Tagen wurden diese Tiere wieder geimpft, um eine Booster-Wirkung festzustellen, und zusätzliche sieben Tiere wurden mit einem Dosisbereich geimpft. Blut wurde in geeigneten Intervallen gezogen und Seren wurden nach Hitzeinaktivierung bei 56°C für 30 Minuten auf die Anwesenheit eines anti-Tollwut-Antikörpers unter Verwendung des Rapid Fluorescent Focus Inhibition Assay (Smith et al., 1973) analysiert.
  • Impfung von Chimpansen. Zwei erwachsene männliche Chimpansen (50 bis 65 kg Gewichtsbereich) wurden intramuskulär oder subcutan mit 1 × 107 PbE vCP65 geimpft. Die Tiere wurden auf Reaktionen überwacht und Blut wurde in regelmäßigen Abständen für die Analyse auf das Vorliegen eines anti-Tollwut-Antikörpers mit dem RFFI-Test (Smith et al., 1973) entnommen. Die Tiere wurden 13 Wochen nach der anfänglichen Impfung mit einer äquivalenten Dosis erneut geimpft.
  • Impfung von Mäusen. Gruppen von Mäusen wurden mit 50 und 100 μl eines Bereichs von Verdünnungen von verschiedenen Chargen von vCP65 geimpft. Die Mäuse wurden in die Fußsohle geimpft. Am Tag 14 wurden die Mäuse durch eine intracraniale Impfung von 15 bis 43 Maus-LD50 des virulenten CVS-Stamms des Tollwutvirus herausgefordert. Das Überleben der Mäuse wurde überwacht und eine schützende Dosis 50% (PD50) 28 Tage nach der Impfung berechnet.
  • Impfung von Hunden und Katzen. Zehn Beagle-Hunde, 5 Monate alt, und 10 Katzen, 4 Monate alt, wurden subcutan mit entweder 6,7 oder 7,7 log10 TCID50 von ALVAC-RG geimpft. Vier Hunde und vier Katzen wurden nicht geimpft. Den Tieren wurde 14 und 28 Tage nach der Impfung Blut entnommen, und der Tollwut-Antikörper wurde in einem RFFI-Test bewertet. Die Tiere, die 6,7 log10 TCID50 von ALVAC-RG erhielten, wurden 29 Tage nach der Impfung mit 3,7 log10 Maus-LD50 (Hunde) oder 4,3 log10 Maus-LD50 (Katzen) des NYGS-Tollwutvirus-Herausforderungsstamms herausgefordert.
  • Impfung von Totenkopfaffen. Drei Gruppen von vier Totenkopfaffen (Saimiri sciureus) wurden mit einem der drei Viren (a) ALVAC, dem Eltern-Kanarienpockenvirus, (b) ALVAC-RG, der Rekombinante, die das Tollwut G-Glycoprotein exprimiert, oder (c) vCP37, einer Kanarienpocken-Rekombinante, die das Hüllen-Glycoprotein des felinen Leukämievirus exprimiert, geimpft. Die Impfungen wurden unter Ketamin-Anästhesie durchgeführt. Jedes Tier erhielt zur selben Zeit: (1) 20 μl instilliert auf der Oberfläche des rechten Auges ohne Skarifikation; (2) 100 μl als einige Tropfen in den Mund; (3) 100 μl in jede von zwei intradermalen Injektionsstellen in der rasierten Haut der äußeren Fläche des rechten Arms; und (4) 100 μl in den anterioren Muskel des rechten Oberschenkels.
  • Vier Affen wurden mit jedem Virus geimpft, zwei mit insgesamt 5,0 log10 PbE und zwei mit insgesamt 7,0 log10 PbE. Den Tieren wurde in regelmäßigen Abständen Blut entnommen und die Seren wurden auf das Vorliegen eines Anti-Tollwut-Antikörpers unter Verwendung eines RFFI-Tests (Smith et al., 1973) analysiert. Die Tiere wurden täglich auf Reaktionen auf die Impfung überwacht. Sechs Monate nach der anfänglichen Impfung wurden die vier Affen, die ALVAC-RG erhielten, zwei Affen, die anfänglich vCP37 erhielten, und zwei Affen, die anfänglich ALVAC erhielten, sowie ein unbehandelter Affe mit 6,5 log10 PbE ALVAC-RG subcutan geimpft. Die Seren wurden auf das Vorliegen eines Tollwut-neutralisierenden Antikörpers in einem RFFI-Test (Smith et al., 1973) überwacht.
  • Impfung von menschlichen Zelllinien mit ALVAC-RG. Um zu bestimmen, ob eine wirksame Expression eines fremden Gens in Nicht-Vogel-Zellen, in denen sich das Virus nicht produktiv repliziert, erreicht werden könnte, wurden fünf Zelltypen, eine vom Vogel und vier von Nicht-Vögeln, auf den Virusertrag, die Expression des fremden Tollwut G-Gens und eine virale spezifische DNA-Akkumulierung analysiert. Die beimpften Zellen waren:
    • (a) Vero, afrikanische Meerkatzen-Nierenzellen, ATCC # CCL81;
    • (b) MRC-5, menschliche embryonale Lunge, ATCC # CCL 171;
    • (c) WISH, menschliches Amnion, ATCC # CCL 25;
    • (d) Detroit-532, menschliche Vorhaut, Down-Syndrom, ATCC # CCL 54; und
    • (e) Primäre CEF-Zellen.
  • Hühnerembryofibroblastenzellen, die von 11 Tage alten weißen Leghorn-Embryonen produziert wurden, wurden als eine Positivkontrolle eingeschlossen. Alle Impfungen wurden auf vorgebildeten Einzelzellschichten von 2 × 106 Zellen durchgeführt, wie unten diskutiert.
  • A. Verfahren für die DNA-Analyse.
  • Drei Schalen von jeder Zelllinie wurden mit 5 PbE/Zelle des Virus, das getestet wird, beimpft, was eine nicht-beimpfte Extra-Schale von jeder Zelllinie ermöglicht. Eine Schale wurde in der Anwesenheit von 40 μg/ml Cytosinarabinosid (Ara C) inkubiert. Nach einem Adsorptionszeitraum von 60 Minuten bei 37°C wurde das Inokulum entfernt und die Einzelzellschicht zweimal gewaschen, um nicht adsorbiertes Virus zu entfernen. Das Medium (mit oder ohne Ara C) wurde dann ersetzt. Die Zellen von einer Schale (ohne Ara C) wurden als eine Zeitpunkt Null-Probe geerntet. Die verbleibenden Schalen wurden bei 37°C für 72 Stunden inkubiert, wonach die Zellen geerntet und verwendet wurden, um die DNA-Akkumulierung zu analysieren. Jede Probe von 2 × 106 Zellen wurde in 0,5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 40 mM EDTA, resuspendiert und für 5 Minuten bei 37°C inkubiert.
  • Ein gleiches Volumen von 1,5% Agarose, die bei 42°C vorgewärmt wurde und 120 mM EDTA enthielt, wurde zu der Zellsuspension zugefügt und sanft gemischt. Die Suspension wurde auf eine Agarosestopfen-Form transferiert und konnte für mindestens 15 min aushärten. Die Agarosestopfen wurden dann entfernt und für 12–16 Stunden bei 50°C in einem Volumen von Lysepuffer (1% Sarcosyl, 100 μg/ml Proteinase K, 10 mM Tris HCl, pH 7,5, 200 mM EDTA), das den Stopfen vollständig bedeckt, inkubiert. Der Lysepuffer wurde dann durch 5,0 ml steriles 0,5 × TBE (44,5 mM Trisborat, 44,5 mM Borsäure, 0,5 mM EDTA) ersetzt und bei 4°C für 6 Stunden unter dreimaligem Wechseln des TBE-Puffers äquilibriert. Die virale DNA im Stopfen wurde von der zellulären RNA und DNA unter Verwendung eines Pulsfeld-Elektrophoresesystems fraktioniert. Die Elektrophorese wurde für 20 Stunden bei 180 V mit einem Anstieg von 50–90 sec bei 15°C in 0,5 × TBE durchgeführt. Man ließ die DNA mit Lambda-DNA-Molekulargewichtsstandards laufen. Nach der Elektrophorese wurde die virale DNA-Bande durch Färben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die DNA wurde dann auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und mit einer radioaktiv markierten Sonde, die von gereinigter genomischer ALVAC-DNA hergestellt wurde, sondiert.
  • B. Schätzung des Virusertrags.
  • Die Schalen wurden, genau wie oben beschrieben, beimpft, mit der Ausnahme, dass die Eingabe-Multiplizität 0,1 PbE/Zelle war. 72 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen durch drei aufeinanderfolgende Zyklen von Einfrieren und Auftauen lysiert. Der Virusertrag wurde durch Plaque-Titration auf CEF-Einzelzellschichten bewertet.
  • C. Analyse der Expression des Tollwut G-Gens.
  • Schalen wurden mit rekombinantem oder Eltern-Virus bei einer Multiplizität von 10 PbE/Zelle beimpft, was eine zusätzliche Schale als eine nicht-infizierte Viruskontrolle ermöglicht. Nach einem Ein-Stunden-Adsorptionszeitraum wurde das Medium entfernt und durch Methionin-freies Medium ersetzt. Nach einem 30 Minuten-Zeitraum wurde dieses Medium duch Methionin-freies Medium, enthaltend 25 uCi/ml 35S-Methionin, ersetzt. Die infizierten Zellen wurden über Nacht (ungefähr 16 Stunden) markiert, dann durch die Zugabe von Puffer A-Lysepuffer lysiert. Eine Immunpräzipitation wurde, wie früher beschrieben (Taylor et al., 1990), unter Verwendung eines monoclonalen Tollwut G-spezifischen Antikörpers durchgeführt.
  • Ergebnisse: Schätzung des viralen Ertrags. Die Ergebnisse der Titration auf den Ertrag 72 Stunden nach der Impfung bei 0,1 PbE pro Zelle sind in Tabelle 9 gezeigt. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass, während in den Vogel-Zellen eine produktive Infektion erreicht werden kann, durch dieses Verfahren in den vier Nicht-Vogel-Zellsystemen kein Anstieg im Virusertrag nachgewiesen werden kann.
  • Analyse der viralen DNA-Akkumulierung. Um zu bestimmen, ob die Blockierung der produktiven viralen Replikation in den Nicht-Vogel-Zellen vor oder nach der DNA-Replikation erfolgte, wurde DNA von den Zelllysaten durch Elektrophorese fraktioniert, auf Nitrocellulose transferiert und auf das Vorliegen von viraler spezifischer DNA sondiert. DNA von nicht-infizierten CEF-Zellen, ALVAC-RG-infizierten CEF-Zellen zum Zeitpunkt Null, ALVAC-RG-infizierten CEF-Zellen 72 Stunden nach der Infektion und ALVAC-RG-infizierten CEF-Zellen 72 Stunden nach der Infektion in der Anwesenheit von 40 μg/ml Cytosinarabinosid zeigte bei allen eine gewisse Hintergrundaktivität, wahrscheinlich aufgrund von kontaminierender zellulärer CEF-DNA in der radioaktiv markierten ALVAC-DNA-Sondenherstellung. ALVAC-RG-infizierte CEF-Zellen zeigten jedoch 72 Stunden noch der Infektion eine starke Bande in der Region von ungefähr 350 kbp, was eine ALVAC-spezifische virale DNA-Akkumulierung repräsentiert. Wenn die Kultur in der Anwesenheit des DNA-Syntheseinhibitors Cytosinarabinosid inkubiert wird, ist keine solche Bande nachweisbar. Äquivalente Proben, die in Vero-Zellen produziert wurden, zeigten eine sehr schwache Bande bei ungefähr 350 kbp in den ALVAC-RG-infizierten Vero-Zellen zum Zeitpunkt Null. Dieser Spiegel repräsentierte Restvirus. Die Intensität der Bande war 72 Stunden nach der Infektion verstärkt, was darauf hinweist, dass ein gewisser Spiegel von viraler spezifischer DNA-Replikation in Vero-Zellen erfolgt war, die nicht in einem Anstieg in der viralen Nachkommenschaft resultiert hatte. Äquivalente Proben, die in MRC-5-Zellen produziert wurden, wiesen darauf hin, dass keine virale spezifische DNA-Akkumulierung unter diesen Bedingungen in dieser Zelllinie nachgewiesen wurde. Dieses Experiment wurde dann ausgedehnt, um zusätzliche menschliche Zelllinien einzuschließen, insbesondere WISH- und Detroit-532-Zellen. ALVAC-infizierte CEF-Zellen dienten als eine Positivkontrolle. Weder in WISH- noch in Detroit-Zellen, die mit ALVAC-RG beimpft wurden, wurde eine virale spezifische DNA-Akkumulierung nachgewiesen. Es sollte bemerkt werden, dass die Nachweisgrenzen dieses Verfahrens nicht vollständig abgesichert worden sind, und eine virale DNA-Akkumulierung kann erfolgen, aber in einem Bereich unter der Empfindlichkeit des Verfahrens. Andere Experimente, in denen die virale DNA-Replikation durch 3H-Thymidin-Inkorporation gemessen wurde, unterstützen die Ergebnisse, die mit Vero- und MRC-5-Zellen erhalten wurden.
  • Analyse der Tollwut-Genexpression. Um zu bestimmen, ob eine virale Genexpression, besonders jene des inserierten fremden Gens, in den menschlichen Zelllinien sogar in der Abwesenheit einer viralen DNA-Replikation erfolgte, wurden Immunpräzipitations-Experimente an 35S-Methionin-markierten Lysaten von Vogel- und Nicht-Vogel-Zellen, die mit ALVAC und ALVAC-RG infiziert wurden, durchgeführt. Die Ergebnisse der Immunpräzipitation unter Verwendung eines monoclonalen Tollwut G-spezifischen Antikörpers illustrierten eine spezifische Immunpräzipitation eines 67 kDa-Glycoproteins in CEF-, Vero- und MRC-5, WISH- und Detroit-Zellen, die mit ALVAC-RG infiziert wurden. In keinem der nicht-infizierten und mit dem Elternvirus infizierten Zelllysaten wurden solche spezifischen Tollwut-Genprodukte nachgewiesen.
  • Die Ergebnisse dieses Experiments wiesen darauf hin, dass in den analysierten menschlichen Zelllinien, obwohl die ALVAC-RG-Rekombinante in der Lage war, eine Infektion zu iniziieren und ein fremdes Genprodukt unter der transkriptionellen Kontrolle des frühen/späten H6-Vacciniavirus-Promotors zu exprimieren, die Replikation weder durch die DNA-Replikation fortschritt, noch gab es irgendeine nachweisbare, produzierte virale Nachkommenschaft. In den Vero-Zellen wurde, obwohl ein gewisser Spiegel einer ALVAC-RG-spezifischen DNA-Akkumulierung beobachtet wurde, durch diese Verfahren keine virale Nachkommenschaft nachgewiesen. Diese Ergebnisse würden darauf hinweisen, dass in den analysierten menschlichen Zelllinien die Blockierung der viralen Replikation vor dem Beginn der DNA-Replikation erfolgt, während in Vero-Zellen die Blockierung nach dem Beginn der viralen DNA-Replikation erfolgt.
  • Um festzustellen, ob das in ALVAC-RG exprimierte Tollwut-Glycoprotein immunogen war, wurde eine Reihe von Tierarten durch Beimpfung mit der Rekombinante getestet. Die Wirksamkeit der derzeitigen Tollwutimpfstoffe wird in einem Maus-Modellsystem bewertet. Ein ähnlicher Test wurde daher unter Verwendung von ALVAC-RG durchgeführt. Neun verschiedene Präparationen des Virus (einschließlich einer Impfstoff-Charge (J), die nach 10 Gewebekultur-Reihenpassagen des Saat-Virus produziert wurde) mit infektiösen Titern im Bereich von 6,7 bis 8,4 log10 TCID50 pro ml wurden reihenverdünnt und mit 50 bis 100 μl der Verdünnungen wurden vier bis sechs Wochen alte Mäusen in die Fußsohle geimpft. Die Mäuse wurden 14 Tage später auf dem intracranialen Weg mit 300 μl des CVS Stamms des Tollwutvirus, enthaltend 15 bis 43 Maus-LD50, bestimmt durch Sterblichkeits-Titration in einer Kontrollgruppe von Mäusen, herausgefordert. Die Wirksamkeit, ausgedrückt als die PD50 (protektive Dosis 50%), wurde 14 Tage nach der Herausforderung berechnet. Die Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle 10 gezeigt. Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass ALVAC-RG beständig in der Lage war, Mäuse gegen eine Tollwutvirus-Herausforderung mit einem PD50-Wert im Bereich von 3,33 bis 4,56 mit einem Mittelwert von 3,73 (STD 0,48) zu schützen. Als eine Ausdehnung dieser Untersuchung wurden männliche Mäuse intracranial mit 50 μl des Virus, enthaltend 6,0 log10 TCID50 von ALVAC-RG oder mit einem äquivalenten Volumen einer nicht infizierten Zellsuspension geimpft. Die Mäuse wurden an den Tagen 1, 3 und 6 nach der Impfung getötet und ihre Gehirne entfernt, fixiert und geschnitten. Eine histopathologische Untersuchung zeigte keinen Hinweis auf eine Neurovirulenz von ALVAC-RG in Mäusen.
  • Um die Sicherheit und Wirksamkeit von ALVAC-RG für Hunde und Katzen zu bewerten, wurde eine Gruppe von 14 5 Monate alten Beagles und 14 4 Monate alten Katzen analysiert. Vier Tiere von jeder Spezies wurden nicht geimpft. Fünf Tiere erhielten 6,7 log10 TCID50 subcutan und fünf Tiere erhielten 7,7 log10 TCID50 auf demselben Weg. Den Tieren wurde für eine Analyse auf anti-Tollwut-Antikörper Blut entnommen. Die Tiere, die keine Impfung oder 6,7 log10 TCID50 von ALVAC-RG erhielten, wurden 29 Tage nach der Impfung mit 3,7 log10 Maus-LD50 (Hunde in den Schläfenmuskel) oder 4,3 log10 Maus-LD50 (Katzen in den Nacken) des NYGS-Tollwutvirus-Herausforderungsstamms herausgefordert. Die Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle 11 gezeigt.
  • Weder in Katzen noch in Hunden wurden bei jeder Dosis des Impfvirus schädliche Reaktionen auf die Impfung gesehen. Vier von 5 Hunden, die mit 6,7 log10 TCID50 geimpft wurden, hatten am Tage 14 nach der Impfung Antikörper-Titer, und nach 29 Tagen hatten alle Hunde Titer. Alle Hunde waren vor einer Herausforderung geschützt, die drei der vier Kontrollen tötete. Bei Katzen hatten drei von fünf Katzen, die 6,7 log10 TCID50 erhielten, am Tag 14 spezifische Antikörper-Titer, und am Tag 29 waren alle Katzen positiv, obwohl der mittlere Antikörper-Titer bei 2,9 IE niedrig war. Drei von fünf Katzen überlebten eine Herausforderung, die alle Kontrollen tötete. Alle Katzen, die mit 7,7 log10 TCID50 geimpft wurden, hatten am Tag 14 und am Tag 29 Antikörper-Titer, das Geometrische Mittel des Titers wurde als 8,1 Internationale Einheiten berechnet.
  • Die Immunantwort von Totenkopfaffen (Saimiri sciureus) auf eine Impfung mit ALVAC, ALVAC-RG und einer nicht verwandten Kanarienpockenvirus-Rekombinante wurde untersucht. Gruppen von Affen wurden geimpft, wie oben beschrieben, und die Seren auf das Vorliegen eines Tollwut-spezifischen Antikörpers analysiert. Abgesehen von geringgradigen typischen Hautreaktionen auf die Impfung auf dem intradermalen Weg wurde in keinem der Affen eine schädliche Reaktivität gesehen. Kleine Mengen von Restvirus wurden von den Hautläsionen nach der intradermalen Impfung nur an den Tagen zwei und vier nach der Impfung isoliert. Am Tag sieben und später waren alle Proben negativ. Es gab keine lokale Reaktion auf die intramuskuläre Injektion. Alle vier Affen, die mit ALVAC-RG geimpft wurden, entwickelten anti-Tollwut-Serum-neutralisierende Antikörper, gemessen in einem RFFI-Test. Ungefähr sechs Monate nach der anfänglichen Impfung wurden alle Affen und ein zusätzlicher nicht-behandelter Affe auf dem subcutanen Weg auf der äußeren Seite des linken Oberschenkels mit 6,5 log10 TCID50 von ALVAC-RG wieder geimpft. Die Seren wurden auf das Vorliegen eines anti-Tollwut-Antikörpers analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt.
  • Vier der fünf Affen, die bisher keine Berührung mit Tollwut hatten, entwickelten sieben Tage nach der Impfung mit ALVAC-RG eine serologische Antwort. Alle fünf Affen hatten 11 Tage nach der Impfung einen nachweisbaren Antikörper. Von den vier Affen mit vorherigem Kontakt mit dem Tollwut-Glycoprotein zeigten alle zwischen den Tagen 3 und 7 nach der Impfung einen signifikanten Anstieg im Serumneutralisierenden Titer. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Impfung von Totenkopfaffen mit ALVAC-RG keine schädlichen Nebenwirkungen produziert und eine primäre neutralisierende Antikörper-Antwort induziert werden kann. Bei der Wiederholungsimpfung wird auch eine anamnestische Antwort induziert. Ein vorheriger Kontakt mit ALVAC oder einer Kanarienpocken-Rekombinante, die ein nicht verwandtes fremdes Gen exprimiert, interferiert nicht mit der Induktion einer anti-Tollwut-Immunantwort nach einer Wiederholungsimpfung.
  • Die immunologische Antwort von HIV-2-seropositiven Makaken auf eine Impfung mit ALVAC-RG wurde bewertet. Die Tiere wurden, wie oben beschrieben, geimpft, und die Anwesenheit eines anti-Tollwut-Serum-neutralisierenden Antikörpers wurde in einem RFFI-Test bewertet. Die Ergebnisse, die in Tabelle 13 gezeigt sind, wiesen darauf hin, dass HIV-2-positive Tiere, die auf dem subcutanen Weg geimpft wurden, 11 Tage nach einer Impfung einen anti-Tollwut-Antikörper entwickelten. Nach einer Auffrischungsbeimpfung, die ungefähr drei Monate nach der ersten Impfung gegeben wurde, wurde eine anamnestische Antwort nachgewiesen. In Tieren, die die Rekombinante auf dem oralen Weg erhielten, wurde keine Antwort nachgewiesen. Zusätzlich wurde eine Reihe von sechs Tieren mit ansteigenden Dosen von ALVAC-RG, die entweder auf den intramuskulären oder subcutanen Wegen gegeben wurden, geimpft. Fünf der sechs geimpften Tiere antworteten 14 Tage nach der Impfung ohne signifikanten Unterschied im Antikörper-Titer.
  • Zwei Chimpansen mit vorherigem Kontakt mit HIV wurden mit 7,0 log10 PbE von ALVAC-RG auf dem subcutanen oder intramuskulären Weg geimpft. Drei Monate nach den Impfungen wurden beide Tiere in einer identischen Weise wieder geimpft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 gezeigt.
  • Weder auf den intramuskulären noch den subcutanen Wegen wurde eine schädliche Reaktivität auf die Impfung bemerkt. Beide Chimpansen antworteten auf die primäre Impfung nach 14 Tagen, und nach einer Wiederholungsimpfung wurde eine stark ansteigende Antwort nachgewiesen. Tabelle 5. Sequenzielle Passage von ALVAC in Vogel- und Nicht-Vogel-Zellen.
    CEF Vero MRC-5
    Pass 1
    Probe toa 2.4 3.0 2.6
    t7b 7.0 1.4 0.4
    t7Ac 1.2 1.2 0.4
    Pass 2
    Probe to 5.0 0.4 N.D.d
    t7 7.3 0.4 N.D.
    t7A 3.9 N.D. N.D.
    Pass 3
    Probe to 5.4 0.4 N.D.
    t7 7.4 N.D. N.D.
    t7A 3.8 N.D. N.D.
    Pass 4
    Probe to 5.2 N.D. N.D.
    t7 7.1 N.D. N.D.
    t7A 3.9 N.D. N.D.
    • a: Diese Probe wurde zum Zeitpunkt Null geerntet und repräsentiert das Rest-Eingabevirus. Der Titer wird als log10 PbE pro ml ausgedrückt.
    • b: Diese Probe wurde 7 Tage nach der Infektion geerntet.
    • c: Diese Probe wurde in der Anwesenheit von 40 μg/ml Cytosinarabinosid geimpft und 7 Tage nach der Infektion geerntet.
    • d: Nicht nachweisbar
    Tabelle 6. Sequenzielle Passage von ALVAC-RG in Vogel und Nicht-Vogel-Zellen
    CEF Vero MRC-5
    Pass 1
    Probe t0a 3.0 2.9 2.9
    t7b 7.1 1.0 1.4
    t7Ac 1.8 1.4 1.2
    Pass 2
    Probe t0 5.1 0.4 0.4
    t7 7.1 N.D.d N.D.
    t7A 3.8 N.D. N.D.
    Pass 3
    Probe t0 5.1 0.4 N.D.
    t7 7.2 N.D. N.D.
    t7A 3.6 N.D. N.D.
    Pass 4
    Probe t0 5.1 N.D. N.D.
    t7 7.0 N.D. N.D.
    t7A 4.0 N.D. N.D
    • a: Diese Probe wurde zum Zeitpunkt Null geerntet und repräsentiert das Rest-Eingabevirus. Der Titer wird als log10 PbE pro ml ausgedrückt.
    • b: Diese Probe wurde 7 Tage nach der Infektion geerntet.
    • c: Diese Probe wurde in der Anwesenheit von 40 μg/ml Cytosinarabinosid geimpft und 7 Tage nach der Infektion geerntet.
    • d: Nicht nachweisbar.
    Tabelle 7. Amplifizierung des Restvirus durch Passage in CEF-Zellen
    CEF Vero MRC-5
    a) ALVAC
    Pass 2a 7.0b 6.0 5.2
    3 7.5 4.1 4.9
    4 7.5 N.D.c N.D.
    5 7.1 N.D. N.D.
    b) ALVAC-RG
    Pass 2a 7.2 5.5 5.5
    3 7.2 5.0 5.1
    4 7.2 N.D. N.D.
    5 7.2 N.D. N.D.
    • a: Pass 2 repräsentiert die Amplifizierung in CEF-Zellen der Tag 7-Probe von Pass 1.
    • b: Titer, ausgedrückt als log10 PbE pro ml
    • c: Nicht nachweisbar
    Tabelle 8. Plan der Impfung von Rhesus-Makaken mit ALVAC-RG (vCP65)
    Tier Impfung
    176 L Primär: 1 × 108 PbE vCP65 oral in TANG
    Sekundär: 1 × 107 PbE vCP65 plus 1 × 107
    PbE vcP82a auf sc Weg
    185 L Primär: 1 × 108 PbE vCP65 oral in Tang
    Sekundär: 1 × 107 PbE vCP65 plus 2 × 107
    PbE vCP82 auf sc Weg
    177 L Primär: 5 × 107 PbE sc vCP65 auf sc Weg
    Sekundär: 1 × 107 PbE vCP65 plus 1 × 107
    PbE vCP82 auf sc Weg
    186L Primär: 5 × 107 PbE vCP65 auf sc Weg
    Sekundär: 1 × 107 PbE vCP65 plus 1 × 107
    PbE vCP82 auf sc Weg
    178L Primär: 1 × 107 PbE vCP65 auf sc Weg
    182L Primär: 1 × 107 PbE vCP65 auf IM Weg
    179L Primär: 1 × 106 PbE vCP65 auf sc Weg
    183L Primär: 1 × 106 PbE vCP65 auf IM Weg
    180L Primär: 1 × 106 PbE vCP65 auf sc Weg
    184L Primär: 1 × 105 PbE vCP65 auf IM Weg
    187L Primär: 1 × 107 PbE vCP65 oral
    • a: vCP82 ist eine Kanarienpockenvirus-Rekombinante, die die Masernvirus-Fusion und Hämagglutinin-Gene exprimiert.
    Tabelle 9. Analyse des Ertrags in Vogel- und Nicht-Vogel-Zellen, die mit ALVAC-RG geimpft wurden
    Zeitpunkt der Probenanalyse Zelltyp t0 t72 t72Ab
    Expt 1
    CEF 3.3a 7.4 1.7
    Vero 3.0 1.4 1.7
    MRC-5 3.4 2.0 1.7
    Expt 2
    CEF 2.9 7.5 < 1.7
    WISH 3.3 2.2 2.0
    Detroit-532 2.8 1.7 < 1.7
    • a: Titer, ausgedrückt als log10 PbE pro ml
    • b: Kultur, inkubiert in der Anwesenheit von 40 μg/ml Cytosinarabinosid
    Tabelle 10: Wirksamkeit von ALVAC-RG, getestet in Mäusen
    Test Herausforderungs-Dosis PD50 b
    Anfängliche Aussaat 43 4.56
    Primäre Aussaat 23 3.34
    Impfstoff Charge H 23 4.52
    Impfstoff Charge I 23 3.33
    Impfstoff Charge K 15 3.64
    Impfstoff Charge L 15 4.03
    Impfstoff Charge M 15 3.32
    Impfstoff Charge N 15 3.39
    Impfstoff Charge J 23 3.42
    • a: Ausgedrückt als Maus-LD50
    • b: Ausgedrückt als log10 TCID50
    Tabelle 11. Wirksamkeit von ALVAC-RG in Hunden und Katzen
    Hunde Katzen
    Dosis Antikörpera Überlebenb Antikörper Überleben
    6.7 11.9 5/5 2.9 3/5
    7.7 10.1 N.T. 8.1
    N.T.
    • a: Antikörper am Tag 29 nach der Impfung, ausgedrückt als das geometrische Mittel des Titers in Internationalen Einheiten.
    • b: Ausgedrückt als ein Verhältnis der Überlebenden zu herausgeforderten Tieren
    Figure 00840001
    Figure 00850001
    Tabelle 14. Impfung von Chimpansen mit ALVAC-RG
    Wochen nach der Impfung Tier 431 I.M. Tier 457 S.C.
    0 < 8a < 8
    1 < 8 < 8
    2 8 32
    4 16 32
    8 16 32
    12b/0 16 8
    13/1 128 128
    15/3 256 512
    20/8 64 128
    26/12 32 128
    • a: Titer, ausgedrückt als Kehrwert der letzten Verdünnung, die eine Inhibition der Fluoreszenz in einem RFFI-Test zeigt
    • b: Tag der Wiederimpfung
  • Beispiel 22 – IMMUNISIERUNG VON MENSCHEN UNTER VERWENDUNG VON KANARIENPOCKEN, DIE EIN TOLLWUT-GLYCOPROTEIN EXPRIMIEREN (ALVAC-RG; vCP65)
  • ALVAC-RG (vCP65) wurde hergestellt, wie im Beispiel 21 und den 18A und 18B beschrieben. Für eine Steigerung der Produktion und eine Impfstoff-Herstellung wurde ALVAC-RG (vCP65) in primären CEF, die von spezifizierten pathogen-freien Eiern abgeleitet wurden, gezüchtet. Die Zellen wurden bei einer Multiplizität von 0,01 infiziert und bei 37°C für drei Tage inkubiert.
  • Die Impfstoff-Virussuspension wurde durch Ultraschall-Zerstörung im serumfreien Medium der infizierten Zellen erhalten; der Zelltrümmer wurden dann durch Zentrifugieren und Filtration entfernt. Die resultierende geklärte Suspension wurde mit einem Lyophilisierungs-Stabilisator (ein Gemisch von Aminosäuren) ergänzt, in Einzeldosis-Ampullen dispensiert und gefriergetrocknet. Drei Chargen mit absteigendem Titer wurden durch zehnfache Reihenverdünnungen der Virussuspension in einem Gemisch von serumfreiem Medium und Lyophilisierungs-Stabilisator vor der Lyophilisierung hergestellt.
  • Qualitätskontroll-Tests wurden bei den Zellsubstraten, Medien und Virus-Aussaaten und dem Endprodukt mit Schwerpunkt auf der Suche nach Zufallsagenzien und der Ungefährlichkeit in Labornagern angewendet. Es wurde kein unerwünschtes Merkmal gefunden.
  • Vorklinische Daten. In vitro-Untersuchungen wiesen darauf hin, dass VERO- oder MRC-5-Zellen das Wachstum von ALVAC-RG (vCP65) nicht unterstützen; eine Reihe von acht (VERO) und 10 (MRC) Blind-Serienpassagen verursachte keine nachweisbare Anpassung des Virus an das Wachstum in diesen Nicht-Vogel-Linien. Analysen von menschlichen Zelllinien (MRC-5, WISH, Detroit 532, HEL, HNK oder EBV-transformierten lymphoblastoiden Zellen), die mit ALVAC-RG (vCP65) infiziert oder geimpft wurden, zeigten keine Akkumulierung von Virus-spezifischer DNA, was nahe legt, dass in diesen Zellen die Blockade in der Replikation vor der DNA-Synthese erfolgt. Signifikanterweise weist jedoch die Expression des Tollwutvirus-Glycoproteingens in allen getesteten Zelllinien darauf hin, dass der fehlgeschlagene Schritt im Kanarienpocken-Replikationszyklus vor der viralen DNA-Replikation erfolgt.
  • Die Sicherheit und Wirksamkeit von ALVAC-RG (vCP65) wurden in einer Reihe von Experimenten in Tieren dokumentiert. Eine Reihe von Tierarten, einschließlich Kanarienvögel, Hühner, Enten, Gänse, Labornager (säugende und erwachsene Mäuse), Hamster, Meerschweinchen, Kaninchen, Katzen und Hunde, Totenkopfaffen, Rhesus-Makaken und Chimpansen, wurde mit Dosen im Bereich von 105 bis 108 PbE geimpft. Eine Vielfalt von Wegen wurde verwendet, am häufigsten subcutan, intramuskulär und intradermal, aber auch oral (Affen und Mäuse) und intracerebral (Mäuse).
  • In Kanarienvögel verursachte ALVAC-RG (vCP65) eine „Aufnahme"-Läsion an der Stelle der Vernarbung ohne Hinweis auf Krankheit oder Tod. Die intradermale Impfung von Kaninchen resultierte in einer typischen Pockenvirus-Impfreaktion, die sich nicht ausdehnte und in sieben bis zehn Tagen verheilte. In keinem der Tier-Tests gab es schädliche Nebenwirkungen aufgrund der Kanarienpocken. Die Immunogenität wurde durch die Entwicklung von anti-Tollwut-Antikörpern nach der Impfung von ALVAC-RG (vCP65) in Nagern, Hunden, Katzen und Primaten dokumentiert, gemessen durch einen (Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT). Der Schutz wurde auch durch Tollwutvirus-Herausforderungsexperimente in Mäusen, Hunden und Katzen, die mit ALVAC-RG (vCP65) immunisiert waren, demonstriert.
  • Freiwillige. 25 gesunde Erwachsene im Alter von 20–45 ohne vorherige Geschichte einer Tollwut-Immunisierung wurden eingeschrieben. Ihr Gesundheitszustand wurde durch vollständige Anamnesen, körperliche Untersuchungen, hämatologische und Blutchemie-Analysen bewertet. Ausschlusskriterien schlossen Schwangerschaft, Allergien, Immunschwäche irgendeiner Art, chronisch zehrende Krankheit, Krebs, Injektion von Immunglobulinen in den letzten drei Monaten und Seropositivität für das menschliche Immunschwächevirus (HIV) oder für das Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen ein.
  • Untersuchungsgestaltung. Die Teilnehmer wurden zufällig verteilt, um entweder den üblichen Human Diploid Cell Rabies Vaccine (HDC), Charge Nr. E0751 (Pasteur Merieux Serums & Vaccine, Lyon, Frankreich), oder den Untersuchungsimpfstoff ALVAC-RG (vCP65) zu erhalten.
  • Der Versuch wurde als eine Dosis-Steigerungs-Untersuchung gestaltet. Drei Chargen des experimentellen ALVAC-RG (vCP65)-Impfstoffs wurden sequenziell in drei Gruppen von Freiwilligen (den Gruppen A, B und C) mit zwei Wochen-Abständen zwischen jedem Schritt verwendet. Die Konzentration der drei Chargen war 103,5, 104,5 beziehungsweise 105,5 Gewebekultur-Infektiöse Dosis (TCID50) pro Dosis.
  • Jeder Freiwillige erhielt zwei Dosen desselben Impfstoffs subcutan in der Deltamuskel-Region in einem Abstand von vier Wochen. Das Wesen des injizierten Impfstoffs war dem Teilnehmer zur Zeit der ersten Injektion nicht bekannt, war aber dem Untersucher bekannt.
  • Um das Risiko einer unmittelbaren Hypersensitivität zur Zeit der zweiten Injektion zu minimieren, wurde den Freiwilligen der Gruppe B, die der mittleren Dosis der experimentellen Impfstoffs zugeordnet wurden, 1 h vorher die niedrigere Dosis injiziert, und jene, die der höheren Dosis zugeordnet wurden (Gruppe C), erhielten sukzessive die niedrigere und die mittlere Dosis in stündlichen Intervallen.
  • Sechs Monate später wurde den Empfängern der höchsten Dosierung von ALVAC-RG (vCP65) (Gruppe C) und des HDC-Impfstoffs eine dritte Dosis des Impfstoffs angeboten; sie wurden dann zufällig verteilt, um entweder denselben Impfstoff wie vorher oder den alternativen Impfstoff zu erhalten. Als ein Ergebnis wurden vier Gruppen entsprechend dem folgenden Immunisierungsschema gebildet: 1. HDC, HDC – HDC; 2. HDC, HDC – ALVAC-RG (vCP65); 3. ALVAC-RG (vCP65), ALVAC-RG (vCP65) – HDC; 4. ALVAC-RG (vCP65), ALVAC-RG (vCP65), ALVAC-RG (vCP65).
  • Überwachen der Nebenwirkungen. Alle Individuen wurden für 1 h nach der Injektion überwacht und jeden Tag für die nächsten fünf Tage erneut untersucht. Sie wurden gebeten, lokale und systemische Reaktionen für die nächsten drei Wochen aufzuzeichnen, und wurden zweimal pro Woche telefonisch befragt.
  • Labor-Untersucher. Blutproben wurden vor dem Einschreiben und zwei, vier und sechs Tage nach jeder Injektion erhalten. Die Analyse schloss eine vollständige Blutzellen-Zählung, Leberenzyme und Kreatinkinase-Tests ein.
  • Antikörper-Tests. Antikörper-Tests wurden sieben Tage vor der ersten Injektion und an den Tagen 7, 28, 35, 56, 173, 187 und 208 der Untersuchung durchgeführt.
  • Die Spiegel der neutralisierenden Antikörper gegen Tollwut wurden unter Verwendung des Rapid Fluorescent Focus Inhibition-Tests (RFFIT) (Smith & Yaeger, In Laboratory Techniques an Rabies) bestimmt. Die Kanarienpocken-Antikörper wurden durch direkten ELISA gemessen. Mit dem Antigen, einer Suspension von gereinigtem Kanarienpockenvirus, aufgebrochen mit 0,1% Triton X100, wurden Mikroplatten beschichtet. Festgesetzte Verdünnungen der Seren wurden für zwei Stunden bei Zimmertemperatur umgesetzt, und die reagierenden Antikörper wurden mit einem Peroxidase-markierten anti-menschliches IgG-Ziegenserum nachgewiesen. Die Ergebnisse sind als die optische Dichte, gelesen bei 490 nm, ausgedrückt.
  • Analyse. 25 Individuen wurden eingeschrieben und beendeten die Untersuchung. Es gab 10 Männer und 15 Frauen und das mittlere Alter war 31,9 (21 bis 48). Alle außer drei Individuen hatten einen Hinweis auf eine frühere Pocken-Impfung; die drei verbleibenden Individuen hatte keine typische Narbe und Impfgeschichte. Drei Individuen erhielten jede der niedrigeren Dosen des experimentellen Impfstoffs (103,5 und 104,5 TCID50), neun Individuen erhielten 105,5 TCID50 und zehn erhielten den HDC-Impfstoff.
  • Sicherheit (Tabelle 14). Während der ersten Impfserie wurde höheres Fieber als 37,7°C innerhalb von 24 Stunden nach der Injektion in einem HDC-Empfänger (37,8°C) und in einem vCP65-105,5 TCID50-Empfänger (38°C) bemerkt. In keinem Teilnehmer wurde eine andere systemische Reaktion, die der Impfung zuschreibbar war, beobachtet.
  • Lokale Reaktionen wurden in 9/10 Empfängern des HDC-Impfstoffs, der subcutan injiziert wurde, und in 0/3, 1/3 und 9/9 Empfängern von vCP65-103,5 104,5 beziehungsweise 105,5 TCID50 bemerkt.
  • Empfindlichkeit war das häufigste Symptom und war immer mild. Andere lokale Symptome schlossen Rötung und Verhärtung ein, die auch mild und vorübergehend waren. Alle Symptome klangen normalerweise innerhalb von 24 Stunden ab und dauerten nie länger als 72 Stunden.
  • Es gab keine signifikante Änderung in den Blutzellzahlen, Leber-Enzymen oder Kreatinkinase-Werten.
  • Immunantworten; Neutralisierende Antikörper gegen Tollwut (Tabelle 16). 28 Tage nach der ersten Injektion hatten alle HDC-Empfänger schützende Titer (≥ 0,5 IE/ml). Im Gegensatz dazu erreichten keine Empfänger in den Gruppen A- und B- (103,5 und 104,5 TCID50) und nur 2/9 Empfänger in der Gruppe C- (105,5 TCID50) ALVAC-RG (vCP65) diesen schützenden Titer.
  • Am Tag 56 (d.h. 28 Tage nach der zweiten Injektion) wurden schützende Titer in 0/3 der Gruppe A-, 2/3 der Gruppe B- und 9/9 der Gruppe C-Empfänger des ALVAC-RG (vCP65)-Impfstoffs erreicht und persistierten in allen 10 HDC-Empfängern.
  • Am Tag 56 waren die geometrischen Mittel der Titer 0,05, 0,47, 4,4 und 11,5 IE/ml in den Gruppen A, B, C beziehungsweise HDC.
  • Am Tag 180 waren die Tollwut-Antikörper-Eiter in allen Individuen wesentlich abgesunken, aber blieben in 5/10 HDC-Empfängern und in 5/9 ALVAC-RG (vCP65)-Empfängern über dem minimalen schützenden Titer von 0,5 IE/ml; die geometrischen Mittel der Titer waren 0,51 und 0,45 IE/ml in den Gruppen HCD beziehungsweise C.
  • Antikörper gegen das Kanarienpockenvirus (Tabelle 17). Die beobachteten Präimmun-Titer variierten trotz der Abwesenheit irgendeines früheren Kontakts mit Kanarienvögeln stark, wobei die Titer in jenen Individuen mit den höchsten Titern von 0,22 bis 1,23 O.D.-Einheiten variierten. Wenn als ein mehr als zweifacher Anstieg zwischen den Titern der Prä-Immunisierung und nach der zweiten Injektion definiert, wurde in 1/3 Individuen in der Gruppe B und in 9/9 Individuen in der Gruppe C eine Serokonversion erhalten, wohingegen in den Gruppen A oder HDC kein Individuum serokonvertierte.
  • Auffrischungsinjektion. Der Impfstoff wurde sechs Monate später, zur Zeit der Auffrischungsinjektion, ähnlich gut toleriert: Fieber wurde in 2/9 HDC-Auffrischungs-Empfängern und in 1/10 ALVAC-RG (vCP65)-Auffrischungs-Empfängern bemerkt. Lokale Reaktionen waren in 5/9 Empfängern der HDC-Auffrischung und in 6/10 Empfängern der ALVAC-RG (vCP65)-Auffrischung vorhanden.
  • Beobachtungen. Die 22A–22D zeigen Grafiken von Tollwutneutralisierenden Antikörper-Titern (Rapid Fluorescent Focus inhibition-Test oder RFFIT, IE/ml): Eine Auffrischungswirkung von HDC und vCP65 (105,5 TCID50) in Freiwilligen, die vorher mit entweder demselben oder dem alternativen Impfstoff immunisiert wurden. Die Impfstoffe wurden an den Tagen 0, 28 und 180 gegeben. Die Antikörper-Titer wurden an den Tagen 0, 7, 28, 35, 56, 173 und 187 und 208 gemessen.
  • Wie in den 22A–22D gezeigt, resultierte die gegebene Auffrischungsdosis in einem weiteren Anstieg der Tollwut-Antikörper-Titer in jedem Individuum, unabhängig vom Immunisierungsschema. Die ALVAC-RG (vCP65)-Auffrischung rief jedoch allgemein niedrigere Immunantworten hervor als die HDC-Auffrischung, und die ALVAC-RG (vCP65), ALVAC-RG (vCP65) – ALVAC-RG (vCP65)-Gruppe hatte signifikant niedrigere Titer als die drei anderen Gruppen. In ähnlicher Weise resultierte die ALVAC-RG (vCP65)-Auffrischungsinjektion in einem Anstieg der Kanarienpocken-Antikörper-Titer in 3/5 Individuen, die vorher den HDC-Impfstoff erhalten hatten, und in allen fünf Individuen, die vorher mit ALVAC-RG (vCP65) immunisiert wurden.
  • Im Allgemeinen wies keine der lokalen Nebenwirkungen von der Verabreichung von vCP65 auf eine lokale Replikation des Virus hin. Insbesondere fehlten Läsionen der Haut wie jene, die nach der Injektion eines Impfstoffs beobachtet werden. Trotz des offensichtlichen Fehlens einer Replikation des Virus führte die Injektion zu Freiwilligen, die signifikante Mengen von Antikörpern sowohl gegen den Kanarienpockenvektor als auch gegen das exprimierte Tollwut-Glycoprotein herstellten.
  • Tollwut-neutralisierende Antikörper wurden mit dem Rapid Fluorescent Focus Inhibition-Test (RFFIT) getestet, von dem bekannt ist, dass er gut mit dem Serum-Neutralisationstest in Mäusen korreliert. Von 9 Empfängern von 105,5 TCID50 hatten fünf Antworten mit niedrigem Spiegel nach der ersten Dosis. Schützende Titer von Tollwut-Antikörpern wurden nach der zweiten Injektion in allen Empfängern der höchsten getesteten Dosis und sogar in 2 der 3 Empfänger der mittleren Dosis erhalten. In dieser Untersuchung wurden beide Impfstoffe subcutan gegeben, wie es normalerweise für Lebendimpfstoffe, aber nicht für den inaktivierten HDC-Impfstoff empfohlen wird. Dieser Weg der Injektion wurde gewählt, da er am besten eine vorsichtige Untersuchung der Injektionsstelle ermöglichte, aber dies könnte das späte Auftreten von Antikörpern in den HDC-Empfängern erklären: in der Tat hatte keiner der HDC-Empfänger einen Antikörper-Anstieg am Tag 7, wohingegen in den meisten Untersuchungen, in denen der HDC-Impfstoff intramuskulär gegeben wird, ein signifikanter Anteil der Individuen einen Anstieg hat (Klietmann et al., Int'l Green Cross-Genf, 1981; Kuwert et al., Int'l Green Cross-Genf, 1981). Dennoch ist diese Erfindung nicht notwendigerweise auf den subcutanen Weg der Verabreichung beschränkt.
  • Das GMT (geometrische Mittel der Titer) von Tollwut-neutralisierenden Antikörpern war mit dem experimentellen Impfstoff niedriger als mit dem HDC-Kontrollimpfstoff, aber noch deutlich über dem minimalen Titer, der für einen Schutz erforderlich ist. Die klare Dosis-Wirkungs-Antwort, die mit den drei Dosierungen, die in dieser Untersuchung verwendet wurden, erhalten wurde, legt nahe, dass eine höhere Dosis eine stärkere Antwort induzieren könnte. Natürlich kann der Fachmann aus dieser Offenbarung eine geeignete Dosierung für einen bestimmten Patienten auswählen.
  • Die Fähigkeit, die Antikörperantwort aufzufrischen, ist ein weiteres wichtiges Ergebnis dieses Beispiels; in der Tat wurde ein Anstieg in den Tollwut-Antikörper-Titern nach der 6 Monate-Dosis in jedem Individuum erhalten, unabhängig vom Immunisierungsschema, was zeigt, dass die vorbestehende Immunität, die entweder durch den Kanarienpockenvektor oder das Tollwut-Glycoprotein hervorgerufen wurde, keine blockierende Wirkung auf die Auffrischung mit dem rekombinanten Impfstoffkandidaten oder dem konventionellen HDC-Tollwut-Impfstoff hatte. Dies steht im Kontrast zu Befunden mit Vaccinia-Rekombinanten in Menschen von anderen, dass die Immunantwort durch eine vorbestehende Immunität blockiert werden kann (Cooney et al., Lancet 1991, 337:567–72; Etinger et al., Vaccine 9:470–72, 1991).
  • Daher zeigt dieses Beispiel deutlich, dass ein nicht-replizierendes Pockenvirus als ein Immunisierungsvektor in Tieren oder Menschen dienen kann, mit all den Vorteilen, die replizierende Agenzien der Immunantwort verleihen, aber ohne das Sicherheitsproblem, das durch ein vollständig permissives Virus erzeugt wird. TABELLE 15: Reaktionen in den 5 Tagen nach der Impfung
    vCP65-Dosis (TCID50) 103,5 104,5 105,5 H D C-Kontrolle
    Injektion 1. 2. 1. 2. 1. 2. 1. 2.
    Anz. der Geimpften 3 3 3 3 9 9 10 10
    Temp. > 37,7°C 0 0 0 0 0 1 1 0
    Schmerzhaftigkeit 0 0 1 1 6 8 8 6
    Rötung 0 0 0 0 0 4 5 4
    Verhärtung 0 0 0 0 0 4 5 4
    TABELLE 16: Tollwut-neutralisierende Antikörper (RFFIT; IE/ml) Individuelle Titer und geometrisches Mittel der Titer (GMT)
    Tage
    Nr. TCID50/Dosis 0 7 28 35 56
    1 103.5 < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1 0.2
    3 103.5 < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1
    4 103.5 < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1
    G.M.T. < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1
    6 104.5 < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1 < 0.1
    7 104.5 < 0.1 < 0.1 < 0.1 2.4 1.9
    10 104.5 < 0.1 < 0.1 < 0.1 1.6 1.1
    G.M.T. < 0.1 < 0.1 0.1 0.58 0.47
    11 105.5 < 0.1 < 0.1 1.0 3.2 4.3
    13 105.5 < 0.1 < 0.1 0.3 6.0 8.8
    14 105.5 < 0.1 < 0.1 0.2 2.1 9.4
    17 105.5 < 0.1 < 0.1 < 0.1 1.2 2.5
    18 105.5 < 0.1 < 0.1 0.7 8.3 12.5
    20 105.5 < 0.1 < 0.1 < 0.1 0.3 3.7
    21 105.5 < 0.1 < 0.1 0.2 2.6 3.9
    23 105.5 < 0.1 < 0.1 < 0.1 1.7 4.2
    25 105.5 < 0.1 < 0.1 < 0.1 0.6 0.9
    G.H.T. < 0.1 < 0.1 0.16 1.9 4.4*
    2 HDC < 0.1 < 0.1 0.8 7.1 7.2
    5 HDC < 0.1 < 0.1 9.9 12.8 18.7
    8 HDC < 0.1 < 0.1 12.7 21.1 16.5
    9 HDC < 0.1 < 0.1 6.0 9.9 14.3
    12 HDC < 0.1 < 0.1 5.0 9.2 25.3
    15 HDC < 0.1 < 0.1 2.2 5.2 8.6
    16 HDC < 0.1 < 0.1 2.7 7.7 20.7
    19 HDC < 0.1 < 0.1 2.6 9.9 9.1
    22 HDC < 0.1 < 0.1 1.4 8.6 6.6
    24 HDC < 0.1 < 0.1 0.8 5.8 4.7
    G.M.T. < 0.1 < 0.1 2.96 9.0 11.5*
    • * p = 0,007 Student-t-Test
    TABELLE 17: Kanarienpocken-Antikörper: geometrisches Mittel der Titer* im ELISA
    Tage
    vCP65-Dosierung TCID50/Dosis 0 7 28 35 56
    103.5 0.69 ND 0.76 ND 0.68
    104.5 0.49 0.45 0.56 0.63 0.87
    105.5 0.38 0.38 0.77 1.42 1.63
    HDC-Kontrolle 0.45 0.39 0.40 0.35 0.39
    • * Optische Dichte bei einer 1/25-Verdünnung
  • Beispiel 23 – VERGLEICH DER LD50 VON ALVAC UND NYVAC MIT VERSCHIEDENEN VACCINIAVIRUS-STAMMEN
  • Mäuse. Männliche ausgezüchtete Swiss Webster-Mäuse wurden von Taconic Farms (Germantown, NY) gekauft und bei Mäuse-Futter und Wasser ad libitum bis zur Verwendung im Alter von 3 Wochen („normale” Mäuse) gehalten. Neugeborene ausgezüchtete Swiss Webster-Mäuse waren von beiden Geschlechtern und wurden nach zeitlich abgestimmten Schwangerschaften, die durch Taconic Farms durchgeführt wurden, erhalten. Alle verwendeten neugeborenen Mäuse wurden innerhalb eines zwei Tage-Zeitraums geliefert.
  • Viren. ALVAC wurde durch Plaque-Reinigung einer Kanarienpockenvirus-Population abgeleitet und wurde in primären Hühnerembryofibroblastenzellen (CEF) hergestellt. Nach der Reinigung durch Zentrifugation über Saccharose-Dichtegradienten wurde ALVAC hinsichtlich Plaque-bildender Einheiten in CEF-Zellen gezählt. Die WR (L)-Variante des Vacciniavirus wurde durch Selektion von großen Plaque-Phänotypen von WR abgeleitet (Panicali et al., 1981). Der Wyeth New York State Board of Health-Impfstoffstamm von Vacciniavirus wurde von dem Pharmaceuticals Calf Lymph Type-Impfstoff Dryvax, Kontrollnummer 302001B, erhalten. Das Copenhagen-Stamm Vacciniavirus VC-2 wurde vom Institut Merieux, Frankreich, erhalten. Der Vacciniavirus-Stamm NYVAC wurde von Copenhagen VC-2 abgeleitet. Alle Vacciniavirus-Stämme mit Ausnahme des Wyeth-Stamms wurden in Vero-Nierenzellen der afrikanischen Meerkatze gezüchtet, durch Saccharosegradienten-Dichtezentrifugation gereinigt und hinsichtlich Plaquebildender Einheiten auf Vero-Zellen gezählt. Der Wyeth-Stamm wurde in CEF-Zellen gezüchtet und in CEF-Zellen gezählt.
  • Impfungen. Gruppen von 10 normalen Mäusen wurden intracranial (ic) mit 0,05 ml von einer von mehreren Verdünnungen des Virus, die durch 10-faches Reihenverdünnen der Stammpräparationen in steriler phosphatgepufferter Salzlösung hergestellt wurden, geimpft. In manchen Fällen wurde eine unverdünnte Stamm-Viruspräparation für das Impfen verwendet.
  • Gruppen von 10 neugeborenen Mäusen, 1 bis 2 Tage alt, wurden ic in ähnlicher Weise wie die normalen Mäuse geimpft, mit der Ausnahme, dass ein Injektionsvolumen von 0,03 ml verwendet wurde.
  • Alle Mäuse wurden täglich für einen Zeitraum von 14 Tagen (neugeborene Mäuse) oder 21 Tagen (normale Mäuse) nach der Impfung auf Mortalität beobachtet. Mäuse, die am Morgen nach der Impfung tot aufgefunden wurden, wurden aufgrund eines möglichen Tods durch das Trauma ausgeschlossen.
  • Die letale Dosis, die benötigt wurde, um eine Mortalität für 50% der experimentellen Population zu produzieren (LD50), wurde durch das proportionale Verfahren von Reed und Muench bestimmt.
  • Vergleich der LD50 von ALVAC und NYVAC mit verschiedenen Vacciniavirus-Stämmen für normale, Junge ausgezüchtete Mäuse auf dem ic-Weg. In jungen, normalen Mäusen war die Virulenz von NYVAC und ALVAC einige Größenordnungen niedriger als von den anderen getesteten Vacciniavirus-Stämmen (Tabelle 18). Es wurde gefunden, dass NYVAC und ALVAC in normalen Mäusen über 3000-mal weniger virulent sind als der Wyeth-Stamm; über 12500-mal weniger virulent als der Eltern-VC-2-Stamm; und über 63 000 000-mal weniger virulent als die WR(L)-Variante. Diese Ergebnisse würden nahe legen, dass NYVAC hochgradig abgeschwächt im Vergleich zu anderen Vaccinia-Stämmen ist, und dass ALVAC im Allgemeinen für junge Mäuse nicht virulent ist, wenn es intracranial verabreicht wird, obwohl beide in Mäusen bei extrem hohen Dosen (3,85 × 108 PbE, ALVAC und 3 × 108 PbE, NYVAC) durch einen nicht festgestellten Mechanismus auf diesem Weg der Beimpfung eine Mortalität verursachen können.
  • Vergleich der LD50 von ALVAC und NYVAC mit verschiedenen Vacciniavirus-Stämmen für neugeborene ausgezüchtete Mäuse auf dem ic-Weg. Die relative Virulenz von 5 Pockenvirus-Stämmen für normale, neugeborene Mäuse wurde durch Titration in einem intracranialen (ic) Herausforderungs-Modellsystem getestet (Tabelle 19). Mit der Mortalität als der Endpunkt wiesen die LD50-Werte darauf hin, dass ALVAC über 100 000-mal weniger virulent ist als der Wyeth-Impfstoffstamm von Vacciniavirus; über 200 000-mal weniger virulent als der Copenhagen-VC-2-Stamm von Vacciniavirus; und über 25 000 000-mal weniger virulent als die WR-L-Variante von Vacciniavirus. Nichtsdestotrotz resultierte bei der höchsten getesteten Dosis, 6,3 × 107 PbE, 100% Mortalität. Mortalitätsraten von 33,3% wurden bei 6,3 × 106 PbE beobachtet. Die Todesursache, während sie nicht tatsächlich bestimmt wurde, war wahrscheinlich nicht von toxikologischem oder traumatischem Wesen, da die mittlere Überlebenszeit (MST) der Mäuse der höchsten Dosierungsgruppe (ungefähr 6,3 LD50) 6,7 ± 1,5 Tage war. Wenn mit WR(L) bei einer Herausforderungsdosis von 5 LD50 verglichen, worin die MST 4,8 ± 0,6 Tage ist, war die MST von ALVAC-herausgeforderten Mäusen signifikant länger (P = 0,001).
  • Im Vergleich zu NYVAC wurde gefunden, dass Wyeth über 15 000-mal virulenter; VC-2 mehr als 35 000-mal virulenter; und WR(L) über 3 000 000-mal virulenter ist. Ähnlich wie ALVAC verursachten die zwei höchsten Dosen von NYVAC, 6 × 108 und 6 × 107 PbE, 100% Mortalität. Die MST von Mäusen, die mit der höchsten Dosis, entsprechend 380 LD50, herausgefordert wurden, war jedoch nur 2 Tage (9 Todesfälle am Tag 2 und 1 am Tag 4). Im Gegensatz dazu überlebten alle Mäuse, die mit der höchsten Dosis von WR-L, äquivalent zu 500 LD50, herausgefordert wurden, bis zum Tag 4. Tabelle 18. Berechnete 50% letale Dosis für Mäuse durch verschiedene Vacciniavirus-Stämme und für das Kanarienpockenvirus (ALVAC) auf dem ic-Weg.
    POCKENVIRUSSTAMM BERECHNETE LD50 (pbE)
    WR(L) 2.5
    VC-2 1.26 × 104
    WYETH 5.00 × 104
    NYVAC 1.58 × 108
    ALVAC 1.58 × 108
    Tabelle 19. Berechnete 50% letale Dosis für neugeborene Mäuse durch verschiedene Vacciniavirus-Stämme und für das Kanarienpockenvirus (ALVAC) auf dem ic-Weg.
    POCKENVIRUSSTAMM BERECHNETE LD50 (PbE)
    WR(L) 0.4
    VC-2 0.1
    WYETH 1.6
    NYVAC 1.58 × 106
    ALVAC 1.00 × 107
  • Beispiel 24 – BEWERTUNG VON NYVAC (vP866) UND NYVAC-RG (vP879)
  • Immunpräzipitierungen. Vorgebildete Einzelzellschichten von Vogel- oder Nicht-Vogel-Zellen wurden mit 10 PbE pro Zelle von Eltern-NYVAC (vP866)- oder NYVAC-RG (vP879)-Virus beimpft. Die Beimpfung wurde in EMEM, das frei von Methionin und mit 2% dialysiertem fötalem Rinderserum ergänzt war, durchgeführt. Nach einer Ein-Stunden-Inkubation wurde das Inokulum entfernt und das Medium durch EMEM (Methionin-frei), enthaltend 20 μCi/ml 35S-Methionin, ersetzt. Nach einer Inkubation über Nacht von ungefähr 16 Stunden wurden die Zellen durch die Zugabe von Puffer A (1% Nonidet P-40, 10 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,01% Natriumazid, 500 Einheiten pro ml Aprotonin und 0,02% Phenylmethylsulfonylfluorid) lysiert. Eine Immunpräzipitation wurde unter Verwendung eines Tollwut-Glycoprotein-spezifischen monoclonalen Antikörpers, bezeichnet 24-3F10, bereitgestellt von Dr. C. Trimarchi, Griffith Laboratories, New York State Department of Health, Albany, New York, und eines Ratten-anti-Maus-Konjugats, das von Boehringer Mannheim Corporation (Kat. #605–500) erhalten wurde, durchgeführt. Protein A Sepharose CL-48, erhalten von Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, New Jersey, wurde als eine Trägermatrix verwendet. Die Immunpräzipitate wurden auf 10% Polyacrylamid-Gelen gemäß dem Verfahren von Dreyfuss et al. (1984) fraktioniert. Die Gele wurden fixiert, für die Fluorographie mit 1 M Na-Salicylat für eine Stunde behandelt und einem Kodak XAR-2-Film exponiert, um die immunpräzipitierte Proteinart sichtbar zu machen.
  • Quelle der Tiere. New Zealand White-Kaninchen wurde von Hare-Marland (Hewitt, New Jersey) erhalten. Drei Wochen alte männliche ausgezüchtete Swiss Webster-Mäuse, zeitlich abgestimmt trächtige weibliche ausgezüchtete Swiss Webster-Mäuse und vier Wochen alte Swiss Webster-Nackt (nu+nu+)-Mäuse wurden von Taconic Farms, Inc. (Germantown, New York), erhalten. Alle Tiere wurden gemäß NIH-Richtlinien gehalten. Alle Tier-Protokolle wurden durch das institutionelle IACUC genehmigt. Wenn es als nötig erachtet wurde, wurden Mäuse, die offensichtlich unheilbar krank waren, euthanasiert.
  • Bewertung der Läsionen in Kaninchen. Jedes von zwei Kaninchen wurde intradermal an mehreren Stellen mit 0,1 ml PBS, enthaltend 104, 105, 106, 107 oder 108 PbE von jedem Testvirus, oder mit PBS alleine geimpft. Die Kaninchen wurden täglich vom Tag 4 bis zur Auflösung der Läsion beobachtet. Verhärtungen und Geschwüre wurden gemessen und aufgezeichnet.
  • Virusgewinnung von den Impfstellen. Ein einzelnes Kaninchen wurde intradermal an mehreren Stellen mit 0/1 ml PBS, enthaltend 106, 107 oder 108 PbE von jedem Testvirus oder mit PBS alleine geimpft. Nach 11 Tagen wurde das Kaninchen euthanasiert, und Hautbiopsie-Proben wurden von jeder der Impfstellen durch mechanische Zerstörung und indirekte Beschallung für die Virusgewinnung aseptisch präpariert. Infektiöses Virus wurde durch Plaque-Titration auf CEF-Einzelzellschichten getestet.
  • Virulenz in Mäusen. Gruppen von 10 Mäusen oder fünf im Nacktmäuse-Experiment wurden ip mit einer von mehreren Verdünnungen des Virus in 0,5 ml sterilem PBS geimpft. Es wird auch auf Beispiel 23 Bezug genommen.
  • Cyclophosphamid (CY)-Behandlung. Mäuse wurden am Tag –2 auf dem ip-Weg mit 4 mg (0,02 ml) CY (SIGMA) injiziert, gefolgt von einer Virus-Injektion am Tag 0. An den folgenden Tagen nach der Infektion wurde den Mäusen ip CY injiziert: 4 mg am Tag 1; 2 mg an den Tagen 4, 7 und 11; 3 mg an den Tagen 14, 18, 21, 25 und 28. Eine Immunsuppression wurde indirekt durch Auszählen der weißen Blutzellen mit einem Coulter-Zähler am Tag 11 überwacht. Die durchschnittliche weißen Blutzellen-Zahl war 13 500 Zellen pro μl für unbehandelte Mäuse (n = 4) und 4 220 Zellen pro μl für CY-behandelte Kontrollmäuse (n = 5).
  • Berechnung der LD50. Die letale Dosis, die erforderlich ist, um 50% Mortalität (LD50) zu produzieren, wurde durch das proportionale Verfahren von Reed und Muench (Reed und Muench 1938) bestimmt.
  • Wirksamkeits-Testen von NYVAC-RG in Mäusen. Vier bis sechs Wochen alte Mäuse wurden mit 50 bis 100 μl eines Bereichs von Verdünnungen (2,0–8,0 log10 infektiöse Gewebekultur-Dosis 50% (TCID50)) von entweder W-RG (Kieny et al., 1984), ALVAC-RG (Taylor et al., 1991b) oder NYVAC-RG in die Fußsohle geimpft. Jede Gruppe bestand aus acht Mäusen. 14 Tage nach der Impfung wurden die Mäuse durch intracraniale Impfung mit 15 LD50 des Tollwutvirus CVS-Stamms (0,03 ml) herausgefordert. Am Tag 28 wurden die überlebenden Mäuse gezählt und die schützende Dosis 50% (PD50) berechnet.
  • Ableitung von NYVAC (vP866). Der NYVAC-Stamm von Vacciniavirus wurde von VC-2, einem plaqueclonierten Isolat des COPENHAGEN-Impfstoff-Stamms, hergestellt. Um NYVAC von VC-2 herzustellen, wurden 18 Vaccinia-ORFs, einschließlich einer Reihe von viralen Funktionen, die mit der Virulenz assoziiert sind, in einer Reihe von sequenziellen Manipulationen, wie früher in dieser Offenbarung beschrieben, präzise deletiert. Diese Deletionen wurden in einer Weise konstruiert, die so gestaltet ist, um das Auftreten von neuen unerwünschten offenen Leserahmen zu verhindern. 19 stellt die ORFs, die deletiert wurden, um NYVAC herzustellen, schematisch dar. Oben in 19 ist die HindIII-Restriktionskarte des Vacciniavirus-Genoms (VC-2-Plaque-Isolat, COPENHAGEN-Stamm) dargestellt. Ausgedehnt dargestellt sind die sechs Regionen von VC-2, die in der Herstellung von NYVAC sequenziell deletiert wurden. Die Deletionen wurden früher in dieser Offenbarung beschrieben (Beispiele 13 bis 18). Unter einem solchen Deletionslocus sind die ORFs, die von jenem Locus deletiert wurden, zusammen mit den Funktionen oder Homologien und dem Molekulargewicht ihrer Genprodukte aufgelistet.
  • Replikations-Untersuchungen von NYVAC und ALVAC auf menschlichen Gewebe-Zelllinien. Um den Spiegel der Replikation des NYVAC-Stamms von Vacciniavirus (vP866) in Zellen von menschlichem Ursprung zu bestimmen, wurden sechs Zelllinien bei einer Eingabe-Multiplizität von 0,1 PbE pro Zelle unter Flüssigkultur beimpft und für 72 Stunden inkubiert. Der COPENHAGEN-Elternclon (VC-2) wurde parallel geimpft. Primäre Hühnerembryofibroblasten (CEF)-Zellen (erhalten von 10–11 Tage alten befruchteten Eiern von SPF-Ursprung, Spafas, Inc., Storrs, CT) wurden eingeschlossen, um ein permissives Zellsubstrat für alle Viren zu repräsentieren. Die Kulturen wurden auf der Basis von zwei Kriterien analysiert: dem Auftreten einer produktiven viralen Replikation und der Expression eines extrinsischen Antigens.
  • Das Replikationspotenzial von NYVAC in einer Reihe von vom Menschen abgeleiteten Zellen ist in Tabelle 20 gezeigt. Sowohl VC-2 als auch NYVAC sind zur produktiven Replikation in CEF-Zellen in der Lage, NYVAC jedoch mit leicht reduzierten Erträgen. VC-2 ist auch zur produktiven Replikation in den sechs vom Menschen abstammenden Zelllinien, die gestestet wurden, mit vergleichbaren Erträgen in der Lage, außer in der EBV-transformierten lymphoblastoiden Zelllinie JT-1 (menschliche lymphoblastoide Zelllinie, die mit Epstein-Barr-Virus transformiert wurde, siehe Rickinson et al., 1984). Im Gegensatz dazu ist NYVAC in seiner Fähigkeit, in jeder der getesteten, vom Menschen abgeleiteten Zelllinien produktiv zu replizieren, hochgradig abgeschwächt. Kleine Anstiege von infektiösem Virus über die Restvirus-Spiegel wurden von NYVAC-infizierten MRC-5- (ATCC #CCL171, menschlicher embryonaler Lungen-Ursprung), DETROIT 532- (ATCC #CCL54, menschliche Vorhaut, Down-Syndrom), HEL 299- (ATCC #CCL137, menschliche embryonale Lungenzellen) und HNK- (menschliche neonatale Nierenzellen, Whittiker Bioproducts, Inc. Walkersville, MD, Kat. #70–151) Zellen erhalten. Die Replikation auf diesen Zelllinien war im Vergleich zu den Viruserträgen, die von NYVAC-infizierten CEF-Zellen oder mit Eltern-VC-2 erhalten wurden, signifikant reduziert (Tabelle 20). Es sollte bemerkt werden, dass die Erträge nach 24 Stunden in CEF-Zellen sowohl für NYVAC als auch VC-2 äquivalent zu dem 72-Stunden-Ertrag sind. Das Inkubierenlassen der menschlichen Zelllinien-Kulturen für zusätzliche 48 Stunden (weitere zwei virale Wachstumszyklen) kann daher den erhaltenen relativen Virusertrag amplifiziert haben.
  • Übereinstimmend mit den niedrigen Spiegeln der Viruserträge, die in den vom Menschen abgeleiteten Zelllinien MRC-5 und DETROIT 532 erhalten wurden, wurden nachweisbare, aber reduzierte Spiegel von NYVAC-spezifischer DNA-Akkumulierung bemerkt. Der Spiegel der DNA-Akkumulierung in den -NYVACinfizierten MRC-5- und DETROIT 532-Zelllinien im Vergleich zu jenem, der in NYVAC-infizierten CEF-Zellen beobachtet wurde, war parallel zu den relativen Viruserträgen. NYVAC-spezifische virale DNA-Akkumulierung wurde in keiner der anderen, vom Menschen abgeleiteten Zellen beobachtet.
  • Ein äquivalentes Experiment wurde auch unter Verwendung des Avipoxvirus ALVAC durchgeführt. Die Ergebnisse der Virusreplikation sind auch in Tabelle 20 gezeigt. Übereinstimmend mit der Wirtsbereich-Einschränkung von Kanarienpockenvirus auf Vogel-Spezies war in keiner der menschlichen Zelllinien ein Nachkommenvirus nachweisbar. Auch übereinstimmend mit einem Fehlen der produktiven Replikation von ALVAC in diesen vom Menschen abgeleiteten Zellen ist die Beobachtung, dass in keiner der vom Menschen abgeleiteten Zelllinien eine ALVAC-spezifische DNA-Akkumulierung nachweisbar war.
  • Expression von Tollwut-Glycoprotein durch NYVAC-RG (vP879) in menschlichen Zellen. Um zu bestimmen, ob eine wirksame Expression eines fremden Gens in der Abwesenheit von signifikanten Spiegeln einer produktiven viralen Replikation erhalten werden könnte, wurden dieselben Zelllinien mit der NYVAC-Rekombinante, die das Tollwutvirus-Glycoprotein exprimiert (vP879, Beispiel 19), in der Anwesenheit von 35S-Methionin beimpft. Eine Immunpräzipitation des Tollwut-Glycoproteins wurde vom radioaktiv markierten Kulturlysat unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers, der für das Tollwut-Glycoprotein spezifisch ist, durchgeführt. Die Immunpräzipitation eines 67 kDa-Proteins wurde übereinstimmend mit einer vollständig glycosylierten Form des Tollwut-Glycoproteins nachgewiesen. Es wurde kein serologisch kreuzreaktives Produkt in nicht infizierten oder mit dem Elternvirus-NYVAC infizierten Zelllysaten nachgewiesen. Äquivalente Ergebnisse wurden mit allen anderen analysierten menschlichen Zellen erhalten.
  • Impfungen auf der Kaninchen-Haut. Die Induktion und das Wesen von Hautläsionen auf Kaninchen nach intradermalen (id) Impfungen ist früher als ein Maß der Pathogenität von Vacciniavirus-Stämmen verwendet worden (Buller et al., 1988; Child et al., 1990; Fenner, 1958; Flexner et al., 1987; Ghendon und Chernos 1964). Daher wurde das Wesen der. Läsionen, die mit id-Impfungen mit den Vaccinia-Stämmen WR (ATCC #VR119 Plaque-gereinigt auf CV-1-Zellen, ATCC #CCL70, und ein Plaque-Isolat, bezeichnet als L-Variante, ATCC #VR2035, ausgewählt, wie in Panicali et al., 1981, beschrieben), WYETH (ATCC #VR325, vermarktet als DRYVAC durch Wyeth Laboratories, Marietta, PA), COPENHAGEN (VC-2) und NYVAC assoziiert sind, durch Impfen von zwei Kaninchen (A069 und A128) bewertet. Die zwei Kaninchen zeigten unterschiedliche Gesamt-Empfindlichkeiten gegen die Viren, wobei das Kaninchen A128 weniger schwere Reaktionen zeigte als das Kaninchen A069. Im Kaninchen A128 waren die Läsionen relativ klein und lösten sich bis 27 Tage nach der Impfung auf. Auf dem Kaninchen A069 waren die Läsionen intensiv, besonders an den WR-Impfstellen, und lösten sich erst nach 49 Tagen auf. Die Intensität der Läsionen war auch abhängig von der Lage der Impfstellen in Bezug auf das Lympfabfluss-Netzwerk. Insbesondere zeigten alle Stellen, die über dem Rückgrat gelegen sind, intensivere Läsionen und erforderten längere Zeiten, um sich aufzulösen, als die Läsionen, die an den Flanken lokalisiert sind. Alle Läsionen wurden täglich vom Tag 4 bis zum Verschwinden der letzten Läsion gemessen, und die Mittelwerte der maximalen Läsionsgröße und der Tage bis zur Auflösung wurden berechnet (Tabelle 21). Es wurden keine lokalen Reaktionen von den Stellen beobachtet, an denen Kontroll-PBS injiziert wurde. Ulzerative Läsionen wurden an den Stellen beobachtet, an denen die WR-, VC-2- und WYETH-Vacciniavirus- Stämme injiziert wurden. Signifikanterweise wurden keine Verhärtung oder ulzerative Läsionen an Stellen der Impfung mit NYVAC beobachtet.
  • Persistenz von infektiösem Virus an der Stelle der Impfung. Um die relative Persistenz dieser Viren an der Stelle der Impfung zu bewerten, wurde ein Kaninchen intradermal an mehreren Stellen mit 0,1 ml PBS, enthaltend 106, 107 oder 108 PbE VC-2, WR, WYETH oder NYVAC, geimpft. Für jedes Virus wurde die 107 PbE-Dosis über dem Rückgrat lokalisiert, flankiert von den 106- und 108-Dosen. Die Stellen der Impfung wurden täglich für 11 Tage beobachtet. WR rief die intensivste Antwort hervor, gefolgt von VC-2 und WYETH (Tabelle 22). Eine Geschwürbildung wurde zuerst am Tag 9 für WR und WYETH und am Tag 10 für VC-2 beobachtet. Die Stellen, an denen NYVAC oder Kontroll-PBS geimpft wurde, zeigten keine Verhärtung oder Geschwürbildung. Am Tag 11 nach der Impfung wurden Hautproben von den Stellen der Impfung ausgeschnitten, mechanisch zerstört, und das Virus wurde auf CEF-Zellen titriert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 22 gezeigt. Zu diesem Zeitpunkt wurde in keinem Fall mehr Virus gewonnen, als verabreicht wurde. Die Gewinnung des Vacciniastamms WR war ungefähr 106 PbE des Virus an jeder Stelle, unabhängig von der Menge des verabreichten Virus. Die Gewinnung der Vacciniastämme WYETH und VC-2 war 103 und 104 PbE, unabhängig von der verabreichten Menge. Von den Stellen, an denen NYVAC geimpft wurden, wurde kein infektiöses Virus gewonnen.
  • Impfung von genetisch oder chemisch immundefizienten Mäusen. Eine intraperitoneale Impfung von hohen, Dosen NYVAC (5 × 108 PbE) oder ALVAC (109 PbE) in Nacktmäuse verursachte über den 100 Tage-Beobachtungszeitraum keine Todesfälle, keine Läsionen und keine offensichtliche Krankheit. Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse, die mit WR (103 bis 104 PbE), WYETH (5 × 107 oder 5 × 108 PbE) oder VC-2 (104 bis 109 PbE) geimpft wurden, disseminierte Läsionen, die typisch für Pockenviren sind, zuerst an den Zehen, dann am Schwanz, in manchen Tieren gefolgt von schwerer Orchitis. In Mäusen, die mit WR oder WYETH infiziert wurden, führte das Auftreten von disseminierten Läsionen im Allgemeinen zum schlussendlichen Tod, wohingegen sich die meisten Mäuse, die mit VC-2 infiziert wurden, schlussendlich erholten. Die berechneten LD50-Werte sind in Tabelle 23 angegeben.
  • Insbesondere begannen Mäuse, die mit VC-2 geimpft wurden, Läsionen an ihren Zehen (rote Pappeln) und 1 bis 2 Tage später am Schwanz zu zeigen. Diese Läsionen traten zwischen 11 und 13 Tagen nach der Impfung (pi) in Mäusen, denen die höchsten Dosen (109, 108, 107 und 106 PbE) gegeben wurden, am Tag 16 pi in Mäusen, denen 105 PbE gegeben wurden, und am Tag 21 pi in Mäusen, denen 104. PbE gegeben wurden, auf. In Mäusen, die mit 103 und 102 PbE geimpft wurden, wurden keine Läsionen während des 100-tägigen Beobachtungszeitraums beobachtet. Eine Orchitis wurde am Tag 23 pi in Mäusen, denen 109 und 108 PbE gegeben wurden, und ungefähr 7 Tage später in den anderen Gruppen (107 bis 104 PbE) bemerkt. Die Orchitis war in den 109 und 108 PbE-Gruppen besonders intensiv und wurde, obwohl zurückgehend, bis zum Ende des 100 Tage Beobachtungszeitraums beobachtet. Manche Pocken-ähnliche Läsionen wurden auf der Haut von ein paar Mäusen beobachtet, auftretend etwa 30–35 Tage pi. Die meisten Pockenläsionen heilten normalerweise zwischen 60–90 Tage pi. Nur eine Maus starb in der Gruppe, die mit 109 PbE geimpft wurde (Tag 34 pi), und eine Maus starb in der Gruppe, die mit 108 PbE geimpft wurde (Tag 94 pi). In den VC-2-geimpften Mäusen wurden keine anderen Todesfälle beobachtet.
  • Mäuse, die mit 104 PbE des WR-Stamms von Vaccinia geimpft wurden, begannen am Tag 17 pi, Pockenläsionen zu zeigen. Diese Läsionen traten identisch zu den Läsionen auf, die durch die mit VC-2 injizierten Mäuse gezeigt wurden (geschwollene Zehen, Schwanz). Mäuse, die mit 103 PbE des WR-Stamms geimpft wurden, entwickelten bis 34 Tage pi keine Läsionen. Eine Orchitis wurde nur in den Mäusen bemerkt, die mit der höchsten Dosis von WR (104 PbE) geimpft wurden. Während der letzteren Stadien des Beobachtungszeitraums erschienen die Läsionen um den Mund, und die Mäuse hörten auf zu essen. Alle Mäuse, die mit 104 PbE WR geimpft wurden, starben zwischen 21 Tage und 31 Tage pi oder wurden euthanasiert, wenn es als notwendig erachtet wurde. Vier der 5 Mäuse, in die mit 103 PbE WR injiziert wurden, starben zwischen 35 Tage und 57 Tage pi oder wurden euthanasiert, wenn es als notwendig erachtet wurde. Es wurden keine Todesfälle in Mäusen beobachtet, die mit niedrigeren Dosen von WR (1 bis 100 PbE) geimpft wurden.
  • Mäuse, die mit dem WYETH-Stamm von Vacciniavirus in höheren Dosen (5 × 107 und 5 × 108 PbE) geimpft wurden, zeigten Läsionen an Zehen und Schwänzen, entwickelten eine Orchitis und starben. Mäuse, in die 5 × 106 PbE oder weniger von WYETH injiziert wurden, zeigten keine Zeichen einer Krankheit oder von Läsionen.
  • Wie in Tabelle 23 gezeigt, lieferten CY-behandelte Mäuse ein empfindlicheres Modell für das Testen der Pockenvirus-Virulenz, als dies Nacktmäuse taten. Die LD50-Werte für die WR-, WYETH- und VC-2-Vacciniavirus-Stämme waren in diesem Modellsystem signifikant niedriger als in dem Nacktmaus-Modell. Zusätzlich entwickelten sich Läsionen in Mäusen, in die WYETH-, WR- und VC-2-Vacciniaviren injiziert wurden, wie unten bemerkt, wobei höhere Dosen von jedem Virus in einer schnelleren Bildung von Läsionen resultierte. Wie es bei Nacktmäusen gesehen wurde, entwickelten CY-behandelte Mäuse, in die NYVAC oder ALVAC injiziert wurde, keine Läsionen. Im Gegensatz zu Nacktmäusen wurden jedoch in CY-behandelten Mäusen, die mit NYVAC oder ALVAC herausgefordert wurden, unabhängig von der Dosis manche Todesfälle beobachtet. Diese zufälligen Ereignisse sind in Bezug auf die Todesursache verdächtig.
  • Mäuse, in die allen Dosen von WYETH (9,5 × 104 bis 9,5 × 108 PbE) injiziert wurden, zeigten zwischen 7 und 15 Tage pi Pockenläsionen auf ihrem Schwanz und/oder auf ihren Zehen. Zusätzlich waren die Schwänze und Zehen geschwollen. Die Entwicklung von Läsionen auf dem Schwanz war mit der Bildung einer Pappel, Geschwürbildung und schließlich der Bildung eines Schorfs typisch für Pockenläsionen. Mäuse, die mit allen Dosen von VC-2 (1,65 × 105 bis 1,65 × 109) geimpft wurden, entwickelten auch Pockenläsionen auf ihren Schwänzen und/oder ihren Zehen, analog zu jenen der mit WYETH injizierten Mäuse. Diese Läsionen wurden zwischen 7–12 Tagen nach der Impfung beobachtet. Es wurde keine Läsionen an Mäusen beobachtet, in die niedrigere Dosen des WR-Virus injiziert wurden, obwohl in dieser Gruppe Todesfälle auftraten.
  • Wirksamkeits-Testen von NYVAC-RG. Um zu bestimmen, dass eine Abschwächung des COPENHAGEN-Stamms von Vacciniavirus ohne signifikantes Ändern der Fähigkeit des resultierenden NYVAC-Stamms, ein nützlicher Vektor zu sein, bewirkt worden war, wurden vergleichende Wirksamkeits-Tests durchgeführt. Um das immunogene Potenzial des Vektors während der sequenziellen genetischen Manipulationen, die durchgeführt wurden, um das Virus abzuschwächen, zu überwachen, wurde ein Tollwutvirus-Glycoprotein als ein extrinsisches Reporter-Antigen verwendet. Die schützende Wirksamkeit der Vektoren, die das Tollwut- Glycoprotein-Gen exprimieren, wurde in dem NIH-Maus-Wirksamkeits-Standardtest für Tollwut (Seligmann, 1973) bewertet. Tabelle 24 demonstriert, dass die PD50-Werte, die mit dem hochgradig abgeschwächten NYVAC-Vektor erhalten wurden, identisch zu jenen sind, die unter Verwendung einer auf COPENHAGEN basierenden Rekombinante erhalten wurden, die das Tollwut-Glycoprotein-Gen im tk-Locus enthielt (Kieny et al., 1984), und ähnlich zu den PD50-Werten sind, die mit ALVAC-RG, einem auf Kanarienpocken basierenden Vektor, der auf eine Replikation in Vogel-Spezies beschränkt ist, erhalten wurden.
  • Beobachtungen. NYVAC, von dem bekannte Virulenz-Gene deletiert wurden und das eingeschränkte in vitro-Wachstums-Charakteristika hat, wurde in Tiermodell-Systemen analysiert, um seine Abschwächungs-Charakteristika zu bewerten. Diese Untersuchungen wurden im Vergleich mit dem neurovirulenten Vacciniavirus-Laborstamm WR, zwei Vacciniavirus-Impfstoffstämmen, WYETH (New York City Board of Health) und COPENHAGEN (VC-2), sowie mit einem Kanarienpockenstamm, ALVAC (siehe auch Beispiel 23), durchgeführt. Zusammen lieferten diese Viren ein Spektrum von relativ pathogenen Potenzialen im Maus-Herausforderungsmodell und im Kaninchen-Hautmodell, wobei WR der virulenteste Stamm war, WYETH und COPENHAGEN (VC-2) früher verwendete abgeschwächte Impfstoffstämme mit dokumentierten Charakteristika lieferten und ALVAC ein Beispiel eines Pockenvirus lieferte, dessen Replikation auf Vogel-Spezies beschränkt ist. Die Ergebnisse dieser in vivo-Analysen zeigen deutlich die hochgradig abgeschwächten Eigenschaften von NYVAC im Vergleich zu den Vacciniavirus-Stämmen WR, WYETH und COPENHAGEN (VC-2) (Tabellen 18–24). Signifikanterweise waren die LD50-Werte für NYVAC vergleichbar zu jenen, die mit dem auf Vogelwirt beschränkten Avipoxvirus ALVAC beobachtet wurden. Todesfälle aufgrund von NYVAC sowie ALVAC wurden nur beobachtet, wenn äußerst hohe Dosen des Virus auf dem intracranialen Weg verabreicht wurden (Beispiel 23, Tabellen 18, 19, 23). Es ist noch nicht etabliert worden, ob diese Todesfälle aufgrund von nicht-spezifischen Folgen der Impfung einer hohen Proteinmasse erfolgten. Die Ergebnisse von Analysen in den immungeschwächten Mausmodellen (Nackt und CY-behandelt) zeigen auch die relativ hohen Abschwächungs-Charakteristika von NYVAC im Vergleich zu den WR-, WYETH- und COPENHAGEN-Stämmen (Tabellen 21 und 22). Signifikanterweise wurde in mit NYVAC geimpften Tieren oder ALVAC geimpften Tieren über den Beobachtungszeitraum kein Hinweis auf eine disseminierte Vaccinia-Infektion oder Vaccinia-Krankheit beobachtet. Die Deletion von mehreren Virulenz-assoziierten Genen in NYVAC zeigt eine synergistische Wirkung im Bezug auf die Pathogenität. Ein anderes Maß der Ungefährlichkeit von NYVAC wurde durch die intradermale Verabreichung auf Kaninchenhaut geliefert (Tabellen 21 und 22). In Anbetracht der Ergebnisse mit ALVAC, einem Virus, dass unfähig ist, in Nicht-Vogel-Spezies zu replizieren, ist die Fähigkeit, sich an der Stelle der Impfung zu replizieren, nicht die einzige Korrelation mit der Reaktivität, da die intradermale Impfung von ALVAC Gebiete der Verhärtung in einer Dosis-abhängigen Weise verursachte. Daher ist es wahrscheinlich, dass andere Faktoren als die replikative Fähigkeit des Virus zu der Bildung der Läsionen beitragen. Die Deletion von Genen in NYVAC verhindert das Auftreten von Läsionen.
  • Zusammen zeigen die Ergebnisse in diesem Beispiel und in den vorhergehenden Beispielen, einschließlich Beispiel 23, das hochgradig abgeschwächte Wesen von NYVAC im Vergleich zu WR und den früher verwendeten Vacciniavirus-Impfstoffstämmen WYETH und COPENHAGEN. Tatsächlich war das pathogene Profil von NYVAC in den getesteten Tiemodell-Systemen ähnlich zu jenem von ALVAC, einem Pockenvirus, von dem bekannt ist, dass es nur in Vogel-Spezies produktiv repliziert wird. Die offensichtlich eingeschränkte Fähigkeit von NYVAC, auf Zellen, die von Menschen (Tabelle 20) und anderen Spezies, einschließlich der Maus, des Schweins, des Hundes und Pferdes, stammen, produktiv repliziert zu werden, liefert eine beachtliche Barriere, die eine potenzielle Übertragung auf nicht geimpfte Kontaktindividuen oder auf die allgemeine Umwelt limitiert oder verhindert, zusätzlich zum Bereitstellen eines Vektors mit einer reduzierten Wahrscheinlichkeit der Verbreitung innerhalb des geimpften Individuums.
  • Signifikanterweise ist gezeigt worden, dass auf NYVAC basierende Impfstoff-Kandidaten wirksam sind. NYVAC-Rekombinanten, die fremde Genprodukte von einer Reihe von Pathogenen exprimieren, haben immunologische Antworten gegen die fremden Genprodukte in mehreren Tier-Spezies, einschließlich Primaten, hervorgerufen. Insbesondere war eine auf NYVAC basierende Rekombinante, die das Tollwut-Glycoprotein exprimiert, in der Lage, Mäuse gegen eine letale Tollwut-Herausforderung zu schützen. Die Potenz der NYVAC-basierenden Tollwut- Glycoprotein-Rekombinante war vergleichbar zum PD50-Wert für eine auf COPENHAGEN basierende Rekombinante, die das Tollwut-Glycoprotein im tk-Locus enthielt (Tabelle 24). Es ist auch gezeigt worden, dass auf NYVAC basierende Rekombinanten Masernvirus-neutralisierende Antikörper in Kaninchen und einen Schutz gegen eine Pseudorabiesvirus- und eine japanische Encephalitisvirus-Herausforderung in Schweinen hervorrufen. Der hochgradig abgeschwächte NYVAC-Stamm verleiht Sicherheitsvorteile bei menschlichen und veterinärmedizinischen Anwendungen (Tartaglia et al., 1990). Darüber hinaus kann die Verwendung von NYVAC als ein allgemeines Labor-Expressionsvektorsystem die biologischen Risiken, die mit der Verwendung von Vacciniavirus assoziiert sind, stark reduzieren.
  • Durch die folgenden Kriterien zeigen die Ergebnisse dieses Beispiels und der Beispiele hierin, einschließlich Beispiel 23, dass NYVAC hochgradig abgeschwächt ist: a) keine nachweisbare Verhärtung oder Geschwürbildung an der Stelle der Impfung (Kaninchenhaut); b) schnelle Beseitigung des infektiösen Virus von der intradermalen Stelle der Impfung (Kaninchenhaut); c) Fehlen einer testikulären Entzündung (Nacktmäuse); d) stark reduzierte Virulenz (intracraniale Herausforderung, sowohl drei Wochen-alte als auch neugeborene Mäuse); e) stark reduzierte Pathogenität und Versagen, sich in immundefizienten Individuen zu verbreiten (Nackt- und Cyclophosphamid-behandelte Mäuse); und f) dramatisch reduzierte Fähigkeit, auf einer Vielfalt von menschlichen Gewebekultur-Zellen repliziert zu werden. Obwohl es hochgradig abgeschwächt ist, behält NYVAC dennoch als ein Vektor die Fähigkeit, starke Immunantworten auf extrinsische Antigene zu induzieren. Tabelle 20. Replikation von COPENHAGEN (VC-2), NYVAC und ALVAC in von Vogel oder Mensch abgeleiteten Zelllinien
    Zellen Stunden nach der Infektion Ertraga % Ertrag
    VC-2 NYVAC ALVAC
    CEF 0 3.8b 3.7 4.5
    24 8.3 7.8 6.6
    48 8.6 7.9 7.7
    72 8.3 7.7 7.5 25
    72Ac < 1.4 1.8 3.1
    MRC-5 0 3.8 3.8 4.7
    72 7.2 4.6 3.8 0.25
    72A 2.2 2.2 3.7
    WISH* 0 3.4 3.4 4.3
    72 7.6 2.2 3.1 0.000 4
    72A _d 1.9 2.9
    DETROIT 0 3.8 3.7 4.4
    72 7.2 5.4 3.4 1.6
    72A 1.7 1.7 2.9
    HEL 0 3.8 3.5 4.3
    72 7.5 4.6 3.3 0.125
    72A 2.5 2.1 3.6
    JT-1 0 3.1 3.1 4.1
    72 6.5 3.1 4.2 0.039
    72A 2.4 2.1 4.4
    HNK 0 3.8 3.7 4.7
    72 7.6 4.5 3.6 0.079
    72A 3.1 2.7 3.7
    • a: Ertrag von NYVAC 72 Stunden nach der Infektion, ausgedrückt als ein Prozentsatz des Ertrags von VAC-2 nach 72 Stunden auf derselben Zelllinie.
    • b: Titer, ausgedrückt als LOG50 PbE pro ml.
    • c: Die Probe wurde in der Anwesenheit von 40 μg/ml Cytosinarabinosid inkubiert.
    • d: Nicht bestimmt.
    • *: Menschliche Amnionzellen ATCC #CCL25.
    Tabelle 21. Verhärtung und Geschwürbildung an der Stelle der intradermalen Impfung der Kaninchenhaut
    VIRUSSTAMM DOSISa VERHÄRTUNG GESCHWÜRBILDUNG
    Größeb Tagec Größe Tage
    WR 104 386 30 88 30
    105 622 35 149 32
    106 1057 34 271 34
    107 877 35 204 35
    108 581 25 88 26
    WYETH 104 32 5 --d --
    105 116 15 -- --
    106 267 17 3 15
    107 202 17 3 24
    108 240 29 12 31
    VC-2 104 64 7 -- --
    105 86 8 -- --
    106 136 17 -- --
    107 167 21 6 10
    108 155 32 6 8
    NYVAC 104 -- -- -- --
    105 -- -- -- --
    106 -- -- -- --
    107 -- -- -- --
    108 -- -- -- --
    • a PbE des angezeigten Vacciniavirus in 0,1 ml PBS, intradermal geimpft in eine Stelle.
    • b mittlere maximale Größe der Läsionen (mm2)
    • c mittlere Zeit nach der Impfung für vollständiges Abheilen der Läsion.
    • d keine wahrnehmbaren Läsionen.
    Tabelle 22. Persistenz von Pockenviren an der Stelle der intradermalen Impfung
    Virus Inokulum-Dosis Insgesamt gewonnenes Virus
    WR 8.0a 6.14
    7.0 6.26
    6.0 6.21
    WYETH 8.0 3.66
    7.0 4.10
    6.0 3.59
    VC-2 8.0 4.47
    7.0 4.74
    6.0 3.97
    NYVAC 8.0 0
    7.0 0
    6.0 0
    • a: ausgedrückt als log10 PbE.
    Tabelle 23. Virulenz-Untersuchungen in immunsupprimierten Mäusen
    Pockenvirus-Stamm LD50 a
    Nacktmäuse Cyclophosphamidbehandelte Mäuse
    WR 422 42
    VC-2 > 109 < 1.65 × 105
    WYETH 1.58 × 107 1.83 × 106
    NYVAC > 5.50 × 108 7.23 × 108
    ALVAC > 109 ≥ 5.00 × 108b
    • a: Berechnete 50% letale Dosis (PbE) für Nackt- oder Cyclophosphamidbehandelte Mäuse durch die angezeigten Vacciniaviren und für ALVAC auf intraperitonealem Weg.
    • b: 5 von 10 Mäusen starben bei der höchsten Dosis von 5 × 108 PbE.
    Tabelle 24. Vergleichende Wirksamkeit von NYVAC-RG und ALVAC-RG in Mäusen
    Rekombinante pD50 a
    VV-RG 3.74
    ALVAC-RG 3.86
    NYVAC-RG 3.70
    • a: Vier bis sechs Wochen-alte Mäuse wurden mit 50–100 μl eines Bereichs von Verdünnungen (2,0–8,0 log10 Gewebekultur-Infektionsdosis 50% (TCID50) von entweder W-RG (Kieny et al., 1984), ALVAC-RG (vCP65) oder NYVAC-RG (vP879) in die Fußsohle geimpft. Am Tag 14 wurden die Mäuse jeder Gruppe durch intracraniale Impfung von 30 μl eines lebenden CVS-Stamm-Tollwutvirus, entsprechend 15 letalen Dosen 50% (LD50), pro Maus herausgefordert. Am Tag 28 wurden die überlebenden Mäuse gezählt, und eine schützende Dosis 50% (PD50) wurde berechnet.
  • Beispiel 25 – KONSTRUKTION VON TROVAC-REKOMBINANTEN, DIE DIE HÄMAGGLUTININ-GLYCOPROTEINE VON VOGELINFLUENZAVIREN EXPRIMIEREN
  • Dieses Beispiel beschreibt die Entwicklung von Gefügelpockenvirus-Rekombinanten, die die Hämagglutinin-Gene von drei Serotypen des Vogelinfluenza-Virus exprimieren.
  • Zellen und Viren. Plasmide, die cDNA-Clone der H4-, H5- und H7-Hämagglutinin-Gene enthalten, wurden von Dr. Robert Webster, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, Tennessee, erhalten. Der Stamm von FPV, bezeichnet FP-1, ist früher beschrieben worden (Taylor et al., 1988a,b). Er ist ein Impfstoff-Stamm, der für die Impfung von Tage-alten Küken nützlich ist. Der Eltern-Virusstamm Duvette wurde in Frankreich als ein Geflügelpocken-Schort von einem Huhn erhalten. Das Virus wurde über ungefähr 50 Reihenpassagen in embryonierten Hühnereiern, gefolgt von 25 Passagen auf Hühnerembryofibroblasten (CEF)-Zellen abgeschwächt. Dieses Virus wurde im September 1980 durch Rhone Merieux, Lyon, Frankreich, erhalten und eine Master-Virussaat etabliert. Das Virus wurde im September 1989 von Virogenetics erhalten, wo es vier aufeinanderfolgenden Plaque-Reinigungen unterzogen wurde. Ein Plaque-Isolat wurde weiter in primären CEF-Zellen amplifiziert, und ein Stammvirus, als TROVAC bezeichnet, wurde etabliert. Das Stammvirus, das in dem in vitro-Rekombinationstest verwendet wurde, um TROVAC-AIH5 (vFP89) und TROCAV-AIH4 (vFP92) zu produzieren, war weiter über 8 Passagen in primären CEF-Zellen amplifiziert worden. Das Stammvirus, das verwendet wurde, um TROVAC-AIH7 (vFP100) zu produzieren, war durch 12 Passagen in primären CEF-Zellen weiter amplifiziert worden.
  • Konstruktion eines Gefügelpocken-Insertionsplasmids am F8-Locus. Das Plasmid pRW731.15 enthält ein 10 kbp-PvuII-PvuII-Fragment, das von genomischer TROVAC-DNA cloniert wurde. Die Nucleotidsequenz wurde auf beiden Strängen für ein 3659 bp-PvuII-EcoRV-Fragment bestimmt. Diese Sequenz ist in 20 (SEQ ID NO: 72) gezeigt. Die Grenzen eines offenen Leserahmens, der in diesem Labor als F8 bezeichnet wurde, wurden innerhalb dieser Sequenz bestimmt. Der offene Leserahmen beginnt bei Position 495 und endet bei Position 1887. Eine Deletion wurde von Position 779 zu Position 1926 durchgeführt, wie unten beschrieben.
  • Das Plasmid pRW761 ist ein Sub-Clon von pRW731.15, der ein 2430 bp-EcoRV-EcoRV-Fragment enthält. Das Plasmid pRW761 wurde mit XbaI vollständig verdaut und mit SspI teilweise verdaut. Eine 3700 bp-XbaI-SspI-Bande wurde isoliert und mit den aneinander gelagerten doppelsträngigen Oligonucleotiden JCA017 (SEQ ID NO: 60) und JCA018 (SEQ ID NO: 61) ligiert.
    JCAO17 (SEQ ID NO:60) 5' CTAGACACTTTATGTTTTTTAATATCCGGTCTT
    AAAAGCTTCCCGGGGATCCTTATACGGGGAATAAT 3'
    JCA018 (SEQ ID NO:61) 5' ATTATTCCCCGTATAAGGATCCCCCGGGAA
    GCTTTTAAGACCGGATATTAAAAAACATAAAGTGT 3'
  • Das Plasmid, das aus dieser Ligierung resultiert, wurde pJCA002 bezeichnet. Das Plasmid pJCA004 enthält ein nicht relevantes Gen, das im Plasmid pJCA002 mit dem Vacciniavirus H6-Promotor verknüpft ist. Die Sequenz des Vacciniavirus H6-Promotors ist früher beschrieben worden (Taylor et al., 1988a,b; Guo et al. 1989; Perkus et al., 1989). Das Plasmid pJCA004 wurde mit EcoRV und BamHI verdaut, was das nicht relevante Gen und einen Teil des 3'-Endes des H6-Promotors deletiert. Die aneinander gelagerten Oligonucleotide RW178 (SEQ ID NO: 73) und RW179 (SEQ ID NO: 74) wurden mit EcoRV und BamHI geschnitten und zwischen die EcoRV- und BamHI-Stellen von JCA004 inseriert, um pRW846 zu bilden.
    RW178 (SEQ ID NO: 73): 5' TCATTATCGCGATATCCGTGTTAACTAGCTA
    GCTAATTTTTATTCCCGGGATCCTTATCA 3'
    RW179 (SEQ ID NO: 74): 5' GTATAAGGATCCCGGGAATAAAAATTAGCT
    AGCTAGTTAACACGGATATCGCGATAATGA 3'
  • Das Plasmid pRW846 enthält daher den H6-Promotor 5' von EcoRV in dem F8-Locus, aus dem der ORF entfernt worden war. Auf die HincII-Stelle 3' des H6-Promotors in pRW846 folgen Translations-Stoppcodons, eine transkriptionelle Stoppsequenz, die durch frühe Vacciniavirus-Promotoren erkannt wird (Yuen et al., 1987), und eine SmaI-Stelle.
  • Konstruktion eines Geflügelpocken-Insertionsplasmids am F7-Locus. Das ursprüngliche F7-Insertionsplasmid pRW731.13, aus dem der ORF nicht entfernt worden war, enthielt ein genomisches 5,5 kb-FP-PvuII-Fragment in der PvuII-Stelle von pUC9. Die Insertionsstelle war ein einzigartiges HincII innerhalb dieser Sequenzen: Die Nucleotidsequenz, die in 21 (SEQ ID NO: 75) gezeigt ist, wurde für eine 2356 bp-Region bestimmt, die die einzigartige HincII-Stelle umfasst. Eine Analyse dieser Sequenz offenbarte, dass die einzigartige HincII-Stelle (21, unterstrichen) innerhalb eines ORF gelegen war, der ein Polypeptid von 90 Aminosäuren codiert. Der ORF beginnt mit einem ATG an Position 1531 und endet an der Position 898 (die Positionen sind in 21 durch Pfeile markiert).
  • Die Arme für das Insertionsplasmid, aus dem der ORF entfernt worden war, wurden durch PCR unter Verwendung von pRW731.13 als Matrize abgeleitet. Ein 596 bp-Arm (bezeichnet als HB), der der Region stromaufwärts des ORF entsprach, wurde mit den Oligonucleotiden F73PH2 (SEQ ID NO: 76) (5'-GACAATCTAAGTCCTATATTAGAC-3') und F73PB (SEQ ID NO: 77) (5'-GGATTTTTAGGTAGACAC-3') amplifiziert. Ein 270 bp-Arm (bezeichnet als EH), der der Region stromabwärts des ORF entsprach, wurde unter Verwendung der Oligonucleotide F75PE (SEQ ID NO: 78) (5'-TCATCGTCTTCATCATCG-3') und F73PH1 (SEQ ID NO: 79) (5'-GTCTTAAACTTATTGTAAGGGTATACCTG-3') amplifiziert.
  • Das Fragment EH wurde mit EcoRV verdaut, um ein 126 bp-Fragment herzustellen. Die EcoRV-Stelle ist am 3'-Ende, und das 5'-Ende wurde durch PCR gebildet, um das 3'-Ende einer HincII-Stelle zu enthalten. Dieses Fragment wurde in pBS-SK (Stratagene, La Jolla, KA), das mit HincII verdaut wurde, inseriert, um das Plasmid pF7D1 zu bilden. Die Sequenz wurde durch Didesoxynucleotid-Sequenzanalyse bestätigt. Das Plasmid pF7D1 wurde mit ApaI linearisiert, unter Verwendung der T4-DNA-Polymerase mit stumpfen Enden versehen und an das 596 bp-HB-Fragment ligiert. Das resultierende Plasmid wurde als pF7D2 bezeichnet. Die gesamte Sequenz und Orientierung wurden durch Nucleotid-Sequenzanalyse bestätigt.
  • Das Plasmid pF7D2 wurde mit EcoRV und BgIII verdaut, um ein 600 bp-Fragment herzustellen. Dieses Fragment wurde in pBS-SK inseriert, das mit ApaI verdaut, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und danach mit BamHI verdaut worden war. Das resultierende Plasmid wurde als pF7D3 bezeichnet. Dieses Plasmid enthält einen HB-Arm von 404 bp und einen EH-Arm von 126 bp.
  • Das Plasmid pF7D3 wurde mit XhoI linearisiert und mit dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase wurden in der Anwesenheit von 2 mM dNTPs glatte Enden erzeugt. Dieses linearisierte Plasmid wurde mit den aneinander gelagerten Oligonucleotiden F7MCSB (SEQ ID NO: 80) (5'-AACGATTAGTTAGTTACTAAAAGCTTGCTGCAGCCCGGGTTTTTTATTAGTTT AGTTAGTC-3') und F7MCSA (SEQ ID NO: 81) (5'-GACTAACTAACTAATA AAAAACCCGGGCTGCAGCAAGCTTTTTGTAACTAACTAATCGTT-3') ligiert. Dies wurde durchgeführt, um eine mehrfache Clonierungsregion zu inserieren, die die Restriktionsstellen für HindIII, PstI und SmaI zwischen den EH und HB-Armen enthält. Das resultierende Plasmid wurde als pF7DO bezeichnet.
  • Konstruktion eines Insertionsplasmids für das H4-Hämagglutinin am F8-Locus. Eine cDNA-Kopie, die das Vogelinfluenza H4 codiert, das von A/Ty/Min/833/80 abgeleitet wurde, wurde von Dr. R. Webster im Plasmid pTM4H833 erhalten. Das Plasmid wurde mit HindIII und NruI verdaut und unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase wurden in der Anwesenheit von dNTPs glatte Enden erzeugt. Das stumpf endende 2,5 kbp-HindIII-NruI-Fragment, das die H4-codierende Region enthält, wurde in die HincII-Stelle von pIB125 (international Biotechnologies, Inc., New Haven CT) inseriert. Das resultierende Plasmid pRW828 wurde mit BanII teilweise geschnitten, das lineare Produkt isoliert und mit HindIII wieder geschnitten. Das Plasmid pRW828, jetzt mit einer 100 bp-HindIII-BanII-Deletion, wurde als ein Vektor für die synthetischen Oligonucleotide RW152 (SEQ ID NO: 82) und RW 153 (SEQ ID NO: 83) verwendet. Diese Oligonucleotide repräsentieren den 3'-Teil des H6-Promotors von der EcoRV-Stelle und richten das ATG des Promotors mit dem ATG der H4-cDNA aus.
    RW152 (SEQ ID NO: 82): 5' GCACGGAACAAAGCTTATCGCGATATCCGTTA
    AGTTTGTATCGTAATGCTATCAATCACGATTCTGTTCCTGCTCATAGC
    AGAGGGCTCATCTCAGAAT 3'
    RW153 (SEQ ID NO: 83): 5' ATTCTGAGATGAGCCCTCTGCTATGAGCAGGA
    ACAGAATCGTGATTGATAGCATTACGATACAAACTTAACGGATATCGC
    GATAAGCTTTGTTCCGTGC 3'.
  • Die Oligonucleotide wurden aneinander gelagert, mit BanII und HindIII geschnitten und in den HindIII-BanII-deletierten pRW828 Vektor, der oben beschrieben ist, inseriert. Das resultierende Plasmid pRW844 wurde mit EcoRV und DraI geschnitten, und das 1,7 kbp-Fragment, enthaltend H4-codierende 3'-Sequenz, die vom H6-Promotor kontrolliert wird, wurde zwischen die EcoRV- und HincII-Stellen von pRW846 (früher beschrieben) inseriert, was das Plasmid pRW848 bildete. Das Plasmid pRW848 enthält daher die H4-codierende Sequenz, verknüpft mit dem Vacciniavirus H6-Promotor im F8-Locus, aus dem der ORF entfernt worden war, eines Geflügelpockenvirus.
  • Konstruktion eines Insertionsplasmids für H5-Hämagglutinin am F8-Locus. Ein cDNA-Clon des Vogelinfluenza H5, das von A/Turkey/Ireland/1378/83 abgeleitet wurde, wurde von Dr. R. Webster im Plasmid pTH29 erhalten. Die synthetischen Oligonucleotide RW10 (SEQ ID NO: 84) bis RW13 (SEQ ID NO: 87) wurden gestaltet, um das Translations-Startcodon des früher beschriebenen Vacciniavirus-H6-Promotors mit dem ATG des H5-Gens zu überlappen. Die Sequenz setzt sich durch die 5'-SalI-Stelle des H5-Gens fort und beginnt wieder an der 3'-H5-DraI-Stelle, die das H5-Stoppcodon enthält.
    RW10 (SEQ ID NO: 84): 5' GAAAAATTTAAAGTCGACCTGTTTTGTTGAGT
    TGTTTGCGTGGTAACCAATGCAAATCTGGTC
    ACT 3'
    RW11 (SEQ ID NO: 85): 5' TCTAGCAAGACTGACTATTGCAAAAAGAAGCA
    CTATTTCCTCCATTACGATACAAACTTAACG
    GAT 3'
    RW12 (SEQ ID NO: 86): 5' ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGAGGAAA
    TAGTGCTTCTTTTTGCAATAGTCAGTCTTGCTAG
    AAGTGACCAGATTTGCATTGGT 3'
    RW13 (SEQ ID NO: 87): 5' TACCACGCAAACAACTCAACAAAACAGGTCG
    ACTTTAAATTTTTCTGCA 3'
  • Die Oligonucleotide wurden bei 95°C für drei Minuten aneinander gelagert, gefolgt von einem langsamen Abkühlen bei Zimmertemperatur. Dies resultiert in der folgenden Doppelstrang-Struktur mit den angezeigten Enden.
  • Figure 01200001
  • Die Clonierung der Oligonucleotide zwischen die EcoRV- und PstI-Stellen von pRW742B resultierte in pRW744. Das Plasmid pRW742B enthält den Vacciniavirus- H6-Promotor, verknüpft mit einem nicht relevanten Gen, das an der HincII-Stelle von pRW731-15, wie früher beschrieben, inseriert wurde. Der Verdau mit PstI und EcoRV eliminiert das nicht relevante Gen und das 3'-Ende des H6-Promotors. Das Plasmid pRW744 enthält jetzt den 3'-Teil des H6-Promotors, der mit dem ATG des Vogelinfluenza H5 überlappt. Das Plasmid enthält auch die H5-Sequenz durch die 5'-SalI-Stelle und die 3'-Sequenz des H5-Stoppcodons (enthaltend eine DraI-Stelle). Die Verwendung der DraI-Stelle entfernt das nicht-codierende H5-3'-Ende. Die Oligonucleotide fügen ein Transkriptions-Stoppsignal hinzu, das durch die frühe Vacciniavirus-RNA-Polymerase erkannt wird (Yuen et al., 1987). Um das durch den H6-Promotor kontrollierte H5-Konstrukt zu vervollständigen, wurde die H5-codierende Region als ein 1,6 kbp-SalI-DraI-Fragment von pTH29 isoliert. Das Plasmid pRW744 wurde mit DraI teilweise verdaut, das lineare Fragment isoliert, mit SalI wieder geschnitten, und das Plasmid, von dem jetzt acht Basen zwischen SalI und DraI deletiert sind, wurde als ein Vektor für das 1,6 kbp-pTH29-SalI- und DraI-Fragment verwendet. Das resultierende Plasmid pRW759 wurde mit EcoRV und DraI geschnitten. Das 1,7 kbp-PRW759-EcoRV-DraI-Fragment, enthaltend den 3'-H6-Promotor und das H5-Gen, wurde zwischen die EcoRV- und HincII-Stellen von pRW846 (früher beschrieben) inseriert. Das resultierende Plasmid pRW849 enthält das durch den H6-Promotor kontrollierte Vogelinfluenzavirus H5-Gen im F8-Locus, aus dem der ORF entfernt worden war.
  • Konstruktion eines Insertionsvektors für H7-Hämagglutinin am F7-Locus. Das Plasmid pCVH71, enthaltend das H7-Hämagglutinin von A/CK/VIC/1/85, wurde von Dr. R. Webster erhalten. Ein EcoRI-BamHI-Fragment, enthaltend das H7-Gen, wurde mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen und in die HincII-Stelle von pIB125 als P RW827 inseriert. Die synthetischen Oligonucleotide RW165 (SEQ ID NO: 88) und RW 166 (SEQ ID NO: 89) wurden aneinander gelagert, mit HincII und StyI geschnitten und zwischen die EcoRV- und StyI-Stellen von pRW827 inseriert, um pRW845 herzustellen.
    RW165 (SEQ ID NO: 88): 5' GTACAGGTCGACAAGCTTCCCGGGTATCGCG
    ATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAATACTCAAATTCTAATACTCA
    CTCTTGTGGCAGCCATTCACACAAATGCAGACAAAATCTGCCTTGGAC
    ATCAT 3'
    RW166 (SEQ ID NO: 89): 5' ATGATGTCCAAGGCAGATTTTGTCTGCATTTG
    TGTGAATGGCTGCCACAAGAGTGAGTATTAGAATTTGAGTATTCATTA
    CGATACAAACTTAACGGATATCGCGATACCCGGGAAGCTTGTCGACCT
    GTAC 3'
  • Die Oligonucleotide RW165 (SEQ ID NO: 88) und RW166 (SEQ ID NO: 89) verknüpfen den 3'-Teil des H6-Promotors mit dem H7-Gen. Das nicht codierende 3'-Ende des H7-Gens wurde durch Isolieren des linearen. Produkts eines ApaLI-Verdaus von pRW845, wieder Schneiden desselben mit EcoRV, Isolieren des größten Fragments und Aneinanderlagern mit den synthetischen Oligonucleotiden RW227 (SEQ ID NO: 90) und RW228 (SEQ ID NO: 91) entfernt. Das resultierende Plasmid war pRW854.
    RW227 (SEQ ID NO: 90): 5' ATAACATGCGGTGCACCATTTGTATAT
    AAGTTAACGAATTCCAAGTCAAGC 3'
    RW228 (SEQ ID NO: 91): 5' GCTTGACTTGGAATTCGTTAACTTATA
    TACAAATGGTGCACCGCATGTTAT 3'
  • Das Stoppcodon von H7 in PRW854 wird von einer HpaI-Stelle gefolgt. Das dazwischenliegende durch den H6-Promotor kontrollierte H7-Konstrukt im F7-Locus, aus dem der ORF entfernt worden war, (unten beschrieben) wurde durch Übertragen des pRW854-EcoRV-HpaI-Fragments in pRW858 hergestellt, das mit EcoRV geschnitten und an seiner PstI-Stelle stumpfendig gemacht worden war. Das Plasmid pRW858 (unten beschrieben) enthält den H6-Promotor in einem F7-Insertionsplasmid, aus dem der ORF entfernt worden war.
  • Das Plasmid pRW858 wurde durch Insertion eines 850 bp-SmaI/HpaI-Fragments, das den H6-Promotor verknüpft mit einem nicht relevanten Gen enthielt, in die SmaI-Stelle von pF7DO, das früher beschrieben wurde, konstruiert. Die nicht relevanten Sequenzen wurden durch Verdau von pRW858 mit EcoRV (Stelle 24 bp stromaufwärts des 3'-Endes des H6-Promotors) und PstI ausgeschnitten. Das resultierende 3,5 kb-Fragment wurde isoliert und unter Verwendung des Klenow- Fragments der E. coli-DNA-Polymerase in der Anwesenheit von 2 mM dNTPs stumpfendig gemacht. Dieses stumpf endende Fragment wurde an ein 1700 bp-EcoRV/HpaI-Fragment ligiert, das von pRW854 (früher beschrieben) abgeleitet wurde. Dieses EcoRV/HpaI-Fragment enthält das gesamte AIV-HA (H7)-Gen 3' neben den am meisten 3'-gelegenen 24 bp des W-H6-Promotors. Das resultierende Plasmid wurde pRW861 bezeichnet.
  • Der 126 bp-EH-Arm (früher definiert) wurde in pRW861 verlängert, um die Rekombinationshäufigkeit mit der genomischen TROVAC-DNA zu erhöhen. Um dies zu erzielen, wurde ein 575 bp-AccI/SbaBI-Fragment von pRW 731.13 (früher definiert) abgeleitet. Das Fragment wurde isoliert und zwischen die AccI- und NaeI-Stellen von pRW861 inseriert. Das resultierende Plasmid, das einen EH-Arm von 725 bp und einen HB-Arm von 404 bp enthält, die das AIV-H7-Gen flankieren, wurde als pRW869 bezeichnet. Das Plasmid pRW869 besteht daher aus der H7-codierenden Sequenz, die an ihrem 5'-Ende mit dem Vacciniavirus H6-Promotor verknüpft ist. Der linke flankierende Arm besteht aus 404 bp der TROVAC-Sequenz und der rechte flankierende Arm aus 725 bp der TROVAC-Sequenz, die die Insertion in den F7-Locus steuert, aus dem der ORF entfernt worden war.
  • Entwicklung von TROVAC-Vogelinfluenzavirus-Rekombinanten. Insertionsplasmide, die die Vogelinfluenzavirus-HA-codierenden Sequenzen enthalten, wurden durch Verwendung des Calciumphosphat-Präzipitationsverfahrens, das früher beschrieben wurde (Panicali et al., 1982; Piccini et al., 1987), individuell in TROVAC-infizierte primäre CEF-Zellen transfiziert. Positive Plaques wurden auf der Basis der Hybridisierung an HA-spezifische, radioaktiv markierte Sonden ausgewählt und sequenziellen Runden einer Plaque-Reinigung unterzogen, bis eine reine Population erreicht wurde. Ein repräsentativer Plaque wurde dann amplifiziert, um ein Stammvirus zu produzieren. Das Plasmid pRW849 wurde in einem in vitro-Rekombinationstest verwendet, um rekombinantes TROVAC-AIH5 (vFP89) zu produzieren, das das H5-Hämagglutinin exprimiert. Das Plasmid pRW848 wurde verwendet, um rekombinantes TROVAC-AIH4 (vFP92) zu produzieren, das das H4-Hämagglutinin exprimiert. Das Plasmid pRW869 wurde verwendet, um rekombinantes TROVAC-AIH7 (vFP100) zu produzieren, das das H7-Hämaggluinin exprimiert.
  • Immunfluoreszenz. In Influenzavirus-infizierten Zellen wird das HA-Molekül als ein Vorläufermolekül am rauen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert und glycosyliert. Während der Passage zur Plasmamembran vollzieht es eine ausgiebige post-translationelle Modifikation, die in der proteolytischen Spaltung in die Disulfidverknüpften HA1- und HA2-Untereinheiten und der Insertion in die Wirtszellmembran gipfelt, wo es in der Folge in reife virale Hüllen inkorporiert wird. Um zu bestimmen, ob die HA-Moleküle, die in Zellen produziert werden, die mit den rekombinanten TROVAC-AIV-Viren infiziert wurden, auf der Zelloberfläche exprimiert wurden, wurden Immunfluoreszenz-Untersuchungen durchgeführt. Eine indirekte Immunfluoreszenz wurde durchgeführt, wie beschrieben (Taylor et al., 1990). Die Oberflächen-Expression des H5-Hämagglutinins in TROVAC-AIRS, des H4-Hämagglutinins in TROVAC-AIH4 und des H7-Hämagglutinins in TROVAC-AIH7 wurde durch indirekte Immunfluoreszenz bestätigt. Die Expression des H5-Hämagglutinins wurde unter Verwendung eines Pools von monoclonalen Antikörpern, die für das H5HA spezifisch sind, nachgewiesen. Die Expression des H4HA wurde unter Verwendung eines monospezifischen Ziege-anti-H4-Serums analysiert. Die Expression des H7HA wurde unter Verwendung eines monoclonalen H7-spezifischen Antikörperpräparats analysiert.
  • Immunpräzipitation. Es ist festegestellt worden, dass die Sequenz an der und um die Spaltungsstelle des Hämagglutinin-Moleküls eine wichtige Rolle im Bestimmen der viralen Virulenz spielt, da die Spaltung des Hämagglutinin-Polypeptids für Viruspartikel notwendig ist, um infektiös zu sein. Die Hämagglutinin-Proteine der virulenten H5- und H7-Viren besitzen mehr als eine basische Aminosäure am Carboxy-Ende von HA1. Es wird angenommen, dass dies zellulären Proteasen, die eine Reihe von basischen Aminosäuren erkennen, erlaubt, das Hämagglutinin zu spalten, und dem infektiösen Virus ermöglicht, sich sowohl in vitro als auch in vivo zu verbreiten. Die Hämagglutinin-Moleküle der avirulenten H4-Stämme werden in Gewebekultur nicht gespalten, außer wenn exogenes Trypsin zugefügt wird.
  • Um zu bestimmen, dass die Hämagglutinin-Moleküle, die durch die TROVAC-Rekombinanten exprimiert werden, authentisch prozessiert wurden, wurden Immunpräzipitations-Experimente, wie beschrieben (Taylor et al., 1990), unter Verwendung der oben beschriebenen spezifischen Reagenzien durchgeführt.
  • Die Immunpräzipitations-Analyse des H5-Hämagglutinins, das durch TROVAC-AIH5 (vFP89) exprimiert wird, zeigte, dass das Glycoprotein als die zwei Spaltungsprodukte HA1 und HA2 mit ungefähren Molekulargewichten von 44 beziehungsweise 23 kDa vorliegt. Von nicht infizierten Zellen oder Zellen, die mit dem Eltern-TROVAC infiziert wurden, wurden keine solchen Proteine präzipitiert. In ähnlicher Weise zeigte die Immunpräzipitations-Analyse des Hämagglutinins, das durch TROVAC-AIH7 (vFP100) exprimiert wird, eine spezifische Präzipitation des HA2-Spaltungsprodukts. Das HA1-Spaltungsprodukt wurde nicht erkannt. Von nicht infizierten CEF-Zellen oder TROVAC-infizierten CEF-Zellen wurden keine Proteine spezifisch präzipitiert. Im Gegensatz dazu zeigte die Immunpräzipitations-Analyse des Expressionsprodukts von TROVAC-AIH4 (vFP92) die Expression von nur dem Vorläuferprotein-HAo. Dies ist in Übereinstimmung mit dem Fehlen der Spaltung der Hämagglutinine von avirulenten Subtypen in Gewebekultur. In nicht infizierten CEF-Zellen oder Zellen, die mit TROVAC infiziert wurden, wurden keine H4-spezifischen Proteine nachgewiesen. Die Herstellung eines rekombinanten Virus durch Rekombination, in situ-Hybridisierung von Nitrocellulose-Filtern und Screenen auf β-Galactosidase-Aktivität sind, wie früher beschrieben (Panicali et al., 1982; Perkus et al., 1989).
  • Beispiel 26 – CHV-gB-, -gC- UND -gD-NUCLEOTIDE IM VEKTORSYSTEM, EXPRESSION DAVON UND VERWENDUNG DES VEKTORSYSTEMS UND EXPRESSIONSPRODUKTS
  • Die Expression des CHV-gB-Glycoproteins wird durch Setzen des Gens des CHV-gB-Homologs unter die Kontrolle des Vacciniavirus I3L-Promotors erreicht. Die Expression des CHV-gC-Glycoproteins wird durch Setzen des Gens des CHV-gC-Homologs unter die Kontrolle des Vacciniavirus H6-Promotors erreicht. Die Expression des CHV-gD-Glycoproteins wird durch Setzen des Gens des CHV-gD-Homologs unter die Kontrolle des Entomopoxvirus 42K-Gen-Promotors erreicht. Die gB- und gC-Codierung erfolgt im ATI-Locus, und die gD-Codierung erfolgt im HA-Locus.
  • Herstellung des Spenderplasmids. Die CHV-gB-codierende Sequenz ist PCR-abgeleitet. Das CHV-gB-Fragment wird an ein PCR-abgeleitetes Fragment, das das I3L-Promotorelement enthält, in einem Plasmid, das die Kassette I3L-CHV-gB in dem ATI-Locus, aus dem der ORF entfernt worden war, enthält, fusioniert. Die CHV gC- Codierung ist PCR-abgeleitet und wird in einem Plasmid in den ORF-entfernten HA-Locus fusioniert.
  • Ein Spenderplasmid wird verwendet, um die I3L-CHV-gB -- H6-CHV-gC-Doppelkonstruktion in den NYVAC-ATI-Locus, aus dem der ORF entfernt worden war, zu inserieren.
  • Eine in vitro-Rekombination wird auf Vero-Zellen unter Verwendung des Spenderplasmids und von vP866 (NYVAC) als das rettende Virus durchgeführt. Standardprotokolle wurden verwendet, um das rekombinante Virus zu identifizieren und zu reinigen (Piccini et al., 1987). Die auf NYVAC basierende Rekombinante, die die CHV-gB- und -gC-Gene im ATI-Locus, aus dem der ORF entfernt worden war, enthält, wird NYVAC-CHVgBgC bezeichnet.
  • Herstellung des Spenderplasmids. Die CHV-gD-codierende Sequenz wird an den 42K-Promotor fusioniert und ein daraus resultierendes Plasmid für die Insertion mit dem NYVAC-HA-Locus, aus dem der ORF entfernt worden war, hergestellt.
  • Eine in vitro-Rekombination wird auf Vero-Zellen unter Verwendung des CHV-gD-42K-Spenderplasmids und des rekombinanten Vacciniavirus NYVAC-CHVgBgC (NYVAC-Hintergrund) als das rettende Virus durchgeführt. Dies wird mit Standardvorgehensweisen durchgeführt (Piccini et al., 1987). Die auf NYVAC basierende Rekombinante, die die CHV-gB- und -gC-Gene im ATI-Locus, aus dem der ORF entfernt worden war, und das CHV-gD-Gen im HA-Locus, aus dem der ORF entfernt worden war, enthält, wird NYVAC-CHVgBgCgD bezeichnet.
  • Herstellung eines ALVAC-Spenderplasmids. Ein Plasmid-Spenderplasmid, um die I3L-CHV-gB -- H6-CHV-gC -- 42K-CHV-gD-Dreifachkonstruktion in den ALVAC-C3-Locus, aus dem der ORF entfernt worden war, zu inserieren, wird aus den obigen Plasmiden konstruiert.
  • Eine in vitro-Rekombination wird auf primären Hühnerembryofibroblasten unter Verwendung des Spenderplasmids und CPpp (ALVAC) als das rettende Virus durchgeführt. Standardvorgehensweisen werden befolgt, um die hergestellte Rekombinante zu identifizieren und zu reinigen (Piccini et al., 1987). Die auf ALVAC basierende Rekombinante enthält die CHV-gB-, -gC- und -gD-Gene im C3-Locus, aus dem der ORF entfernt worden war, und wird ALVAC-CHVgBgCgD bezeichnet.
  • Eine Analyse bestätigt die Expression der Glycoproteine durch die Rekombinanten, und die Glycoproteine liegen im Wesentlichen innerhalb der vorhergesagten Sequenzen.
  • Beispiel 27 – HERSTELLUNG VON vCP320; EINER ALVAC-REKOMBINANTE, DIE CHV gB EXPRIMIERT
  • vCP320, eine ALVAC-Rekombinante, die CHV gB exprimiert, wurde durch die folgenden Vorgehensweisen hergestellt. Ein 6 kb-XbaI-Fragment, enthaltend das CHV-gB-Gen, wurde von genomischer CHV-DNA isoliert und in die XbaI-Stelle von pBSK+ cloniert. Das Plasmid, das durch diese Manipulation hergestellt wurde, wird pCHV2 genannt.
  • Das CHV-gB-Gen wurde dann zwischen die Kanarienpocken-flankierenden Arme cloniert. Dies wurde durch Clonieren des 3700 bp-SacI-EcoRV-Fragments von pCHV2, das das CHV-gB-Gen enthält, in das 5800 bp-SacI-NaeI-Fragment von pBHVC16 erreicht. (pBHVC16 enthält eine Kopie des BHV1-gC-Gens, cloniert zwischen die C5-flankierenden Arme.) Das Plasmid, das durch diese Manipulation hergestellt wurde, wird pCHV14 genannt.
  • Die fremde, nicht codierende 3'-Sequenz wurde dann eliminiert. Dies wurde durch Clonieren eines 210 bp-SmaI-ClaI-verdauten PCR-Fragments, enthaltend das 3'-Ende des gB-Gens, in das 5500 bp SmaI-ClaI-Teilfragment von pCHV14 erreicht. (Dieses PCR-Fragment wurde vom Plasmid pCHV2 mit den Primern CHVP39 (SEQ ID NO: 92; 5'-TAAGAATGGTAATTCT-3') und CHVP40 (SEQ ID NO: 93; 5'-TTCCCGGGTTAAACTTTACTTTCATTTTC-3') hergestellt.) Das Plasmid, das durch diese Manipulation hergestellt wurde, wird pCHV15 genannt.
  • Der I3L-Promotor wurde dann stromaufwärts des gB-Startcodons cloniert. Zusätzlich wurden 3 frühe Transkriptions-Terminierungssignal-Sequenzen T5NT, die im 5'-Ende des gB-Gens liegen, modifiziert. Dies wurde durch Clonieren eines 140 bp-ScaI-SalI-verdauten PCR-Fragments, enthaltend den I3L-Promotor und das T5NT-modifizierte 5'-Ende des gB-Gens, in das 6300 bp-ScaI-SalI-Fragment von pCHV15 erreicht. (Dieses PCR-Fragment wurde von dem Plasmid pCHV2 mit den Primern CHVP42 (SEQ ID NO: 94; 5'-TTGTCGACTGAGATAAAGTGAAAATATATATCATTATATTACAAAGTACAATTAT TTAGGTTTAATCATGTTTTCATTGTATCTATAT-3') und CHVP78 (SEQ ID NO: 95; 5'- TTAGTACTTTCCGGTGTTGTTGGATCACATATTATTAAAGTATAAATAATAAAGAA-3') erreicht.) Das Plasmid, das durch diese Manipulation hergestellt wurde, wird pCHV27 genannt.
  • Ein Fehler in der Sequenz, die das ScaI-SalI-Fragment von pCHV27 flankiert, wurde dann korrigiert. Dies wurde durch Clonieren des 180 bp-ScaI-SalI-Fragments von pCHV27, enthaltend den I3L-Promotor und das T5NT-modifizierte 5'-Ende des gB-Gens, in das 6300 bp-ScaI-SalI-Fragment von pCHV15 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation hergestellt wurde, wird pCHV28 genannt.
  • Eine frühe Transkriptions-Terminierungssignal-Sequenz nahe dem 3'-Ende des CHV-gB-Gens wurde dann modifiziert. Dies wurde durch Clonieren eines 330 bp-SpeI-Asp718-verdauten PCR-Fragments, enthaltend die T5NT-modifizierte Region des CHV-gB-Gens, in das 5450 bp-SpeI-Asp718-Fragment von pCHV28 erreicht. (Dieses PCR-Fragment wurde von einem 150 bp-PCR-Fragment, einem 280 bp-PCR-Fragment und den Primern CHVP89 (SEQ ID NO: 96; 5'-TGGAATGAAGTTATGAAACT-3') und CHVP92 (SEQ ID NO: 97; 5'-TGCACTGATCATTTCAATTTC-3') hergestellt). Das 150 bp-PCR-Fragment wurde vom Plasmid pCHV2 mit den Primern CHVP89 (SEQ ID NO: 96; 5'- TGGAATGAAGTTATGAAACT3') und CHVP90 (SEQ ID NO: 98; 5'-TGGAATTTTGAATGAAAACACTAGAACC-3') hergestellt. Das 280 bp-PCR-Fragment wurde von dem Plasmid pCHV2 mit den Primern CHVP91 (SEQ ID NO: 99; 5'-TTCTAGTGTTTTCATTCAAAATTCCAT-3') und CHVP92 (SEQ ID NO: 97; 5'-TGCACTGATCATTTCAATTTC-3') hergestellt.) Das Plasmid, das durch diese Manipulation hergestellt wurde, wird pCHV31 genannt.
  • Eine frühe Transkriptions-Terminierungssignal-Sequenz in der Mitte des CHV-gB-Gens wurde dann modifiziert. Dies wurde durch Clonieren eines 480 bp-BamHI-BsaBI-verdauten PCR-Fragments, enthaltend die T5NT-modifizierte Region des gB-Gens, in das 5000 bp-BamHI-BsaBI-Fragment von pCHV31 erreicht. (Dieses PCR-Fragment wurde von einem 380 bp-PCR-Fragment, einem 210 bp-PCR-Fragment und den Primern CHVP87 (SEQ ID NO: 100: 5'-CCTTCAAAGTTTAATACACC-3') und CHVP94 (SEQ ID NO: 101; 5'-TATGGCTTCACGTTTGGCAC-3') hergestellt.) Das 380 bp-PCR-Fragment wurde von dem Plasmid pCHV2 mit den Primern CHVP93 (SEQ ID NO: 102; 5'- CACCGGGGATATAATTCATATGTCCCCTTTCTTTGGATTACGAGATGGT-3') und CHVP94 (SEQ ID NO: 101; 5'-TATGGCTTCACGTTTGGCAC-3') hergestellt. Das 210 bp-PCR-Fragment wurde von dem Plasmid pCHV2 mit den Primern CHVP87 (SEQ ID NO: 100: 5'-CCTTCAAAGTTTAATACACC-3') und CHVP88 (SEQ ID NO: 103; 5'-CCATCTCGTAATCCAAAGAAAGGGGACATATGAAT-3') hergestellt.) Das Plasmid, das durch diese Manipulation hergestellt wurde, wird pCHV32 genannt.
  • Ein Teil des gB-Gens, das in der vorherigen Manipulation entfernt wurde, wurde dann in pCHV32 zurückcloniert. Dies wurde durch Clonieren des 2000 bp-BsaBI-PstI-Teilfragments von pCHV31, enthaltend das 3'-Ende des gB-Gens, das in der vorherigen Manipulation entfernt wurde, in das 5450 bp-BsaBI-PstI-Fragment von pCHV32 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation hergestellt wurde, wird pCHV36 genannt.
  • Das durch den I3L Promotor kontrollierte gB-Gen wurde dann zwischen die C6-flankierenden Arme cloniert. Dies wurde durch Clonieren des 2750 bp-SalI-SmaI-Fragments von pCHV36, enthaltend das I3L durch den Promotor kontrollierte gB-Gen, in das 4350 bp-SalI-SmaI-Fragment von pHIV34 erreicht. (pHIV enthält eine Kopie des durch den H6 Promotor geförderte HIV2-gp120 (+ TM)-Gens, cloniert zwischen die C6-flankierenden Arme.) Das Plasmid, das durch diese Manipulation hergestellt wurde, wird pCHV37 genannt. Die DNA-Sequenz des durch den I3L-Promotor kontrollierten gB-Gens in pCHV37 (SEQ ID NOS: 104, 105, 106) ist in 23 gezeigt. Die DNA-Sequenz der ALVAC C6-flankierenden Arme (SEQ ID NOS: 107, 108) ist in 24 gezeigt.
  • pCHV37 wurde in in vitro-Rekombinations-Experimenten mit ALVAC als das rettende Virus verwendet, um vCP320 zu ergeben.
  • Eine Immunpräzipitations-Analyse wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob vCP320 CHV-gB exprimiert. Eine MDCK-Zelleinzelzellschicht wurde entweder scheininfiziert oder mit dem Elternvirus (ALVAC) (m.o.i. = 15 PbE/Zelle), vCP320 (m.o.i. = 15 PbE/Zelle) oder CHV (m.o.i. = 10 PbE/Zelle) infiziert. Nach einer Adsorptionsperiode von einer Stunde wurde das Inokulum entfernt, und die Zellen wurden mit 2 ml modifiziertem Eagle-Medium (ohne Cystein), enthaltend 2% dialysiertes fötales Rinderserum und [35S]-Cystein (50 μCi/ml), überschichtet. Die Lysate wurden 18 Stunden nach der Infektion in 1 ml 3X Puffer A (450 mM NaCl, 3% NP-40, 30 mM Tris (pH = 7,4), 3 mM EDTA, 0,03% Na-Azid und 0,6 mg/ml PMSF) geerntet und auf CHV-gB-Expression unter Verwendung einer 1:100-Verdünnung eines gB-spezifischen monoclonalen Antikörpers, 112562 (erhalten von Dr. Michel Riviere, Rhone Merieux, Lyon, Frankreich) analysiert. Die Lysate, die mit normalen Mausseren und einem Ziege-anti-Maus-Antikörper-Protein A-Sepharosekomplex vorgeklärt wurden, wurden über Nacht bei 4°C mit einem monoclonalen Ziege-anti-Maus-Antikörper-Protein A-Sepharosekomplex inkubiert und 4X mit 1X Puffer A und 2X mit einem LiCl2/Harnstoff-Puffer gewaschen. Die präzipitierten Proteine wurden von den Immunkomplexen durch die Zugabe von 2X Laemmli-Puffer (125 mM Tris (pH = 6,8), 4% SDS, 20% Glycerin, 10% 2-Mercaptoethanol) und Kochen für 5 min dissoziiert. Die Proteine wurden auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel fraktioniert, fixiert und mit 1 M Na-Salicylat für die Fluorographie behandelt. Die Proteine mit der geeigneten Größe wurden von den CHV-infizierten Zellen (Bahn D) und vCP320-infizierten Zellen (Bahn C) präzipitiert, wurden aber nicht von scheininfizierten Zellen (Bahn A) oder ALVAC-infizierten Zellen (Bahn B) präzipitiert (25). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass vCP320 CHV-gB exprimiert.
  • Beispiel 28 – HERSTELLUNG VON vCP322, EINER ALVAC-REKOMBINANTE, DIE CHV-gC EXPRIMIERT
  • vCP322, eine ALVAC-Rekombinante, die CHV-gC exprimiert, wurde durch die folgende Vorgehensweise hergestellt. Ein 2,2 kb-EcoRI-Fragment, enthaltend das CHV-gC-Gen, wurde von genomischer CHV-DNA isoliert und in die EcoRI-Stelle von pVQH6CP3LSA cloniert. (pVQH6CP3LSA enthält eine Kopie des H6-Promotors, cloniert zwischen die C3-flankierenden Arme.) Diese Manipulation positioniert das gC-Gen stromabwärts des H6-Promotors und zwischen die C3-flankierenden Arme. Das Plasmid, das durch diese Manipulation hergestellt wurde, wird pCHV17 genannt.
  • Die fremde nicht codierende 3'-Sequenz wurde dann eliminiert und 3 frühe T5NT-Transkriptions-Terminierungssignal-Sequenzen, die nahe dem 3'-Ende des gC-Gens gelegen sind, wurden modifiziert. Dies wurde durch Clonieren der Oligonucleotide CHVL66 (SEQ ID NO: 109; 5'-CGATGTTAATAAGTATTACCACAATAATTGGTGGAGCCATTTCGTTATAGTATTG ATTTTCATAACAGCTTTATGTTTCTATTGTTCAAAAAATAATAAGATCTAACTGCA-3') und CHVL67 (SEQ ID NO: 110; 5'- GTTAGATCTTATTATTTTTTGAACAATAGAAACATAAAGCTGTTATGAAAATCAAT ACTATAACGAAAATGGCTCCACCAATTATTGTGGTAATACTTATTAACAT-3') in das 8400 bp-ClaI-PstI-Teilfragment von pCHV17 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation hergestellt wurde, wird pCHV20 genannt.
  • Das Startcodon des gC-Gens wurde dann mit dem Startcodon des H6-Promotors ausgerichtet. Zusätzlich wurden 2 frühe Transkriptions-Terminierungssignal-Sequenzen modifiziert. Dies wurde durch Clonieren eines 740 bp-NruI-BsrGI-verdauten PCR-Fragments, enthaltend das 3'-Ende des H6-Promotors und 5'-Ende des T5NT-modifizierten gC-Gens, in das 7900 bp-NruI-BsrGI-Fragment von pCHV20 erreicht. (Dieses PCR-Fragment wurde von einem 500 bp-PCR-Fragment, einem 300 bp-PCR-Fragment und den Oligonucleotiden CHVP96 (SEQ ID NO: 111; 5'-CGTAGATTCCAATGGAAAGT-3') und CHVP97 (SEQ ID NO: 112; 5'-TTTTCGCGATATCCGTTAAGT-3') hergestellt. Das 500 bp-PCR-Fragment wurde vom Plasmid pCHV13 mit den Oligonucleotiden CHVP68 (SEQ ID NO: 113; 5'-TTTTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAGTTTTAAAAATTTCTATCTAAT ATATGTAATTATAATTTTCATAAACTCGATAATAAC-3') und CHVP69 (SEQ ID NO: 114; 5'-TTTGTATACCTAATAAGAAATCATTATAAAAGT-3') hergestellt. Das 300 bp-PCR-Fragment wurde vom Plasmid (pCHV13 mit den Oligonucleotiden CHVP95 (SEQ ID NO: 115; 5'-CTTTTATAATGATTTCTTATTAGGTATACAAAATC-3') und CHVP96 (SEQ ID NO: 111; 5'-CGTAGATTCCAATGGAAAGT-3') hergestellt. (pCHV13 wurde durch Clonieren des genomischen 2,2 kb-EcoRI-CHV-Fragments, enthaltend das gC-Gen, in die EcoRI-Stelle von pBSK+ erhalten.) Das Plasmid, das durch diese Manipulation hergestellt wurde, wird pCHV38 genannt.
  • Das durch den H6-Promotor kontrollierte gC-Gen wurde dann zwischen die C6-flankierenden Arme cloniert. Dies wurde durch Clonieren des 1400 bp-NruI-PstI-Fragments von pCHV38, enthaltend das durch den H6-Promotor kontrollierte gC-Gen, und des Oligonucleotids CHVL98 (SEQ ID NO: 116; 5'-AATTTGCA-3'), in das 4500 bp-NruI-EcoRI-Fragment von pHIV34 erreicht. (pHIV34 enthält eine Kopie des durch den H6-Promotor geförderten HIV2-gp120 (+ TM)-Gens, cloniert zwischen die C6-flankierenden Arme.) Das Plasmid, das durch diese Manipulation hergestellt wurde, wird pCHV40 genannt. Die DNA-Sequenz des durch den H6-Promotor geförderten gC-Gens in pCHV40 (SEQ ID NOS: 117, 118, 119) ist in 26 gezeigt. Die DNA-Sequenz der ALVAC C6-flankierenden Arme (SEQ ID NOS: 107, 108) ist in 24 gezeigt.
  • pCHV40 wurde in in vitro-Rekombinations-Experimenten mit ALVAC als das rettende Virus verwendet, um vCP322 zu ergeben.
  • Eine Immunpräzipitations-Analyse wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob vCP322 das CHV-gC exprimiert. MDCK-Zell-Einzelschichten wurden entweder schein-infiziert oder mit dem Elternvirus (ALVAC) (m.o.i. = 15 PbE/Zelle), vCP322 (m.o.i. = 15 PbE/Zelle) oder CHV (m.o.i. = 10 PbE/Zelle) infiziert. Nach einer Adsorptionsperiode von einer Stunde wurde das Inokulum entfernt, und die Zellen wurden mit 2 ml modifiziertem Eagle-Medium (ohne Cystein), enthaltend 2% dialysiertes fötales Rinderserum und [35S]-Cystein (50 μCi/ml), überschichtet. Die Lysate wurden 18 Stunden nach der Infektion in 1 ml 3X Puffer A (450 mM NaCl, 3% NP-40, 30 mM Tris (pH = 7,4), 3 mM EDTA, 0,03% Na-Azid und 0,6 mg/ml PMSF) geerntet und auf die CHV-gC-Expression unter Verwendung einer 1:100-Verdünnung eines gC-spezifischen monoclonalen Antikörpers, 2011A9 (erhalten von Dr. Michel Riviere, Rhone Merieux, Lyon, Frankreich) analysiert. Die Lysate, die mit normalen Mausseren und einem Ziege-anti-Maus-Antikörper-Protein A-Sepharosekomplex vorgeklärt wurden, wurden über Nacht bei 4°C mit einem monoclonalen Ziege-anti-Maus-Antikörper-Protein A-Sepharosekomplex inkubiert und 4X mit 1X Puffer A und 2X mit einem LiCl2/Harnstoff-Puffer gewaschen. Die präzipitierten Proteine wurden von den Immunkomplexen durch die Zugabe von 2X Laemmli-Puffer (125 mM Tris (pH = 6,8), 4% SDS, 20% Glycerin, 10% 2-Mercaptoethanol) und Kochen für 5 min dissoziiert. Die Proteine wurden auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel fraktioniert, fixiert und mit 1 M Na-Salicylat für die Fluorographie behandelt. Die Proteine mit der geeigneten Größe wurden von CHV-infizierten Zellen (Bahn D) und vCP322-infizierten Zellen (Bahn C) präzipitiert, wurden aber nicht von scheininfizierten Zellen (Bahn A) oder ALVAC-infizierten Zellen (Bahn B) präzipitiert (27). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass vCP322 das CHV-gC exprimiert.
  • Beispiel 29 – HERSTELLUNG VON vCP294, EINER ALVAC-REKOMBINANTE, DIE CHV-gD EXPRIMIERT
  • vCP294, eine ALVAC-Rekombinante, die CHV-gD exprimiert, wurde durch die folgende Vorgehensweise hergestellt. Ein 7 kb-PstI-Fragment, enthaltend das CHV-gD-Gen, wurde von genomischer CHV-DNA isoliert und in die PstI-Stelle von pBSK+ cloniert. Das Plasmid, das durch diese Manipulation hergestellt wurde, wird pCHV11 genannt.
  • Das CHV-gD-Gen wurde dann zwischen die Kanarienpocken-flankierenden Arme cloniert. Dies wurde durch Clonieren des 1475 bp-PstI-SnaBI-Fragments von pCHV11, enthaltend das CHV-gD-Gen, in das 5600 bp-PstI-SmaI-Fragment von pHIV34 erreicht. (pHIV34 enthält eine Kopie des durch den H6-Promotor kontrollierten HIV2 gp120 (+ TM)-Gens, cloniert zwischen die C6-flankierenden Arme.) Dies platziert das CHV-gD-Gen zwischen die C6-flankierenden Arme und stromabwärts des H6-Promotors. Das Plasmid, das durch diese Manipulation hergestellt wurde, wird pCHV18 genannt.
  • Das Startcodon des H6-Promotors wurde dann mit dem Startcodon des CHV-gD-Gens ausgerichtet. Dies wurde durch Clonieren der Oligonucleotide CHVL81 (SEQ ID NO: 120; 5'-CGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGATTAAACTTCTATTTATCTTATTTTATTT TAACCCAATAA-3') und CHVL82 (SEQ ID NO: 121; 5'-TTGGGTTAAAATAAAATAAGATAAATAGAAGTTTAATCATTACGATACAAACTTA ACGGATATCG-3') in das 5600 bp-NruI-PfIMI-Fragment von pCHV18 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation hergestellt wurde, wird pCHV21 genannt.
  • Drei frühe Transkriptions-Terminierungssignal-Sequenzen am 3'-Ende des CHV-gD-Gens wurden dann modifiziert. Dies wurde durch Clonieren des 1400 bp-BgIII-Asp718-Fragments von pCHV22, enthaltend das „T5NT-modifizierte" 3'-Ende des CHV-gD-Gens und einen C3-flankierenden Arm, in das 3700 bp-BgII-Asp718-Fragment von pCHV21 erreicht. (pCHV22 wurde durch Clonieren eines 430 bp-BgIII-EcoRI-verdauten PCR-Fragments, enthaltend das „T5NT-modifizierte" 3'-Ende des CHV-gD-Gens, in das 3900 bp-BgIII-EcoRI-Fragment von pHIV43 hergestellt (pHIV43 enthält eine Kopie des durch den H6-Promotor kontrollierten HIV1-gp120-murines IL-2-Fusionsgens, cloniert zwischen die C3-flankierenden Arme). (Dieses PCR-Fragment wurde vom Plasmid pCHV18 mit den Oligonucleotiden CHVP79 (SEQ ID NO: 122; 5'-TTGAATTCCTAAACATTTGTTGTTAATTTTTTATAATTATTATATATTTTTTGTCTTT TATAAACAAAGAAT-3') und CHVP80 (SEQ ID NO: 123; 5'-TTAGATCTGTAGGAGCATCAAAAGTTGACGATGAACTTTTCTATCTAAATAGAGC TGGTCCCCAAACCCTGCTTAAATATTATGTTATTAAAGATTTCTAT-3'). hergestellt).) Das Plasmid, das durch diese Manipulation hergestellt wurde, wird pCHV24 genannt.
  • Die „T5NT-modifizierte" zentrale Region des CHV-gD-Gens wurde dann in pCHV24 cloniert. Dies wurde durch Clonieren eines BgIII-verdauten 240 bp-PCR-Fragments, enthaltend die „T5NT-modifizierte" zentrale Region des CHV-gD-Gens, in die BgIII-Stelle von pCHV24 erreicht. (Dieses PCR-Fragment wurde vom Plasmid pCHV18 mit den Oligonucleotiden CHVP83 (SEQ ID NO: 124; 5'-TTAGATCTAGATTCCTTACACCATTCCATAAAAGTTGGTTCAAATTTATCTTCTTTA GAGAAATAACAAGTTTCTCGTGGTAATTGAACCATAAAATCAGTATAGAAAAC-3') und CHVP84 (SEQ ID NO: 125; 5'-TATTTTGATTGTGATCC-3') hergestellt.) Das Plasmid, das durch diese Manipulation hergestellt wurde, wird pCHV25 genannt.
  • Der C3-flankierende Arm wurde dann durch den C6-flankierenden Arm ersetzt. Dies wurde durch Clonieren des 1160 bp-EcoRI-Asp718-Fragments von pCHV21, enthaltend den C6-flankierenden Arm, in das 4100 bp-EcoRI-Asp718-Fragment von pCHV25 erreicht. Das Plasmid, das durch diese Manipulation hergestellt wurde, wird pCHV26 genannt. Die DNA-Sequenz des durch den H6-Promotor kontrollierten gD-Gens in pCHV26 (SEQ ID NOS: 126, 127, 128) ist in 28 gezeigt. Die DNA-Sequenz der ALVAC-C6-flankierenden Arme (SEQ ID NOS: 107, 108) ist in 24 gezeigt.
  • pCHV26 wurde in in vitro-Rekombinations-Experimenten mit ALVAC als das rettende Virus verwendet, um vCP294 zu ergeben.
  • Eine Immunpräzipitations-Analyse wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob vCP294 das CHV-gD exprimiert. MDCK-Zell-Einzelschichten wurden entweder schein-infiziert oder mit dem Elternvirus (ALVAC) (m.o.i. = 15 PbE/Zelle), vCP294 (m.o.i. = 15 PbE/Zelle) oder CHV (m.o.i. = 10 PbE/Zelle) infiziert. Nach einer Adsorptionsperiode von einer Stunde wurde das Inokulum entfernt, und die Zellen wurden mit 2 ml modifiziertem Eagle-Medium (ohne Cystein), enthaltend 2% dialysiertes fötales Rinderserum und [35S]-Cystein (50 μCi/ml), überschichtet. Die Lysate wurden 18 Stunden nach der Infektion in 1 ml 3X Puffer A (450 mM NaCl, 3% NP-40, 30 mM Tris (pH = 7,4), 3 mM EDTA, 0,03% Na-Azid und 0,6 mg/ml PMSF) geerntet und auf die CHV-gD-Expression unter Verwendung einer 1:100-Verdünnung eines gD-spezifischen monoclonalen Antikörpers, 208D11 (erhalten von Dr. Michel Riviere, Rhone Merieux, Lyon, Frankreich) analysiert. Die Lysate, die mit normalen Mausseren und einem Ziege-anti-Maus-Antikörper-Protein A-Sepharosekomplex vorgeklärt wurden, wurden über Nacht bei 4°C mit einem monoclonalen Ziege-anti-Maus-Antikörper-Protein A-Sepharosekomplex inkubiert und 4X mit 1X Puffer A und 2X mit einem LiCl2/Harnstoff-Puffer gewaschen. Die präzipitierten Proteine wurden von den Immunkomplexen durch die Zugabe von 2X Laemmli-Puffer (125 mM Tris (pH = 6,8), 4% SDS, 20% Glycerin, 10% 2-Mercaptoethanol) und Kochen für 5 min dissoziiert. Die Proteine wurden auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel fraktioniert, fixiert und mit 1 M Na-Salicylat für die Fluorographie behandelt. Die Proteine von ähnlicher Größe wurden von CHV-infizierten Zellen (Bahn D) und vCP294-infizierten Zellen (Bahn C) präzipitiert, wurden aber nicht von scheininfizierten Zellen (Bahn A) oder ALVAC-infizierten Zellen (Bahn B) präzipitiert (29). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass vCP294 das CHV-gD exprimiert.
  • Dadurch, dass bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben wurden, soll verstanden werden, dass die Erfindung, die durch die angefügten Ansprüche definiert ist, nicht durch bestimmte Details, die in der obigen Beschreibung dargelegt sind, limitiert werden soll, da viele offensichtliche Variationen davon möglich sind, ohne von der Idee oder dem Rahmen davon abzuweichen.
  • Die Rekombinanten können verwendet werden, um eine Antikörper- oder Immunantwort in Welpen und erwachsenen Hunden gegen CHV zu stimulieren, und auch die Expressionsprodukte, die von Zellen, die durch die Rekombinanten infiziert wurden, isoliert werden können, können dazu verwendet werden. Weiterhin können die Rekombinanten oder die Expressionsprodukte derselben verwendet werden, um Antikörper in einem Tier herzustellen, dem die Rekombinanten oder die Expressionsprodukte derselben verabreicht wurden, und die Antikörper können weiterhin verwendet werden, wie hierin beschrieben.
  • BEZUGNAHMEN
    • 1. Ackermann, M., R. Longnecker, B. Roizman, und L. Pereira, Virology 150, 207–220 (1986).
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  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (23)

  1. Nucleinsäure die Glycoprotein gB, gC oder gD des Herpesvirus vom Hund codiert, wobei die Nucleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) Nucleinsäuren, die eine Nucleotidsequenz einer der SEQ ID NOs: 1, 11 und 18 haben, wobei die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 das Glycoprotein gB des Herpesvirus vom Hund codiert, die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 11 das Glycoprotein gC des Herpesvirus vom Hund codiert, und die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 18 das Glycoprotein gD des Herpesvirus vom Hund codiert; (b) Nucleinsäuren, die ein Glycoprotein gB des Herpesvirus vom Hund codieren, das SEQ ID NO: 2 als Aminosäuresequenz hat; (c) Nucleinsäuren, die ein Glycoprotein gC des Herpesvirus vom Hund codieren, das SEQ ID NO: 12 oder 13 als Aminosäuresequenz hat; (d) Nucleinsäuren, die ein Glycoprotein gD des Herpesvirus vom Hund codieren, das SEQ ID NO: 19 als Aminosäuresequenz hat.
  2. Nucleinsäure nach Anspruch 1, die DNA ist.
  3. Vektor, enthaltend die Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2.
  4. Vektor nach Anspruch 3, wobei der Vektor ein Pockenvirus ist.
  5. Vektor nach Anspruch 4, wobei das Pockenvirus ein Avipoxvirus oder ein Vacciniavirus ist.
  6. Vektor nach einem der Ansprüche 3 bis 5, der ein modifiziertes rekombinantes Virus ist, wobei das modifizierte rekombinante Virus inaktivierte Virus-codierte genetische Funktionen hat, so dass das Virus abgeschwächte Virulenz, jedoch aufrechterhaltene Wirksamkeit hat; und wobei das Virus des weiteren exogene DNA umfasst, die zumindest eine der Nucleinsäuren von Anspruch 1 oder 2 hat.
  7. Vektor nach Anspruch 6, wobei die genetischen Funktionen durch Deletieren von mindestens einem offenen Leserahmen inaktiviert sind.
  8. Vektor nach Anspruch 7, wobei die deletierten genetischen Funktionen einen C7L-K1L-offenen Leserahmen einschließen, oder Wirtsbereichsfunktionen.
  9. Vektor nach Anspruch 8, wobei: (a) zumindest ein zusätzlicher offener Leserahmen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus J2R, B13R +B14R, A26L, A56R, I4L, einem Thymidinkinase-Gen, einer hämorrhagischen Region, einer Typ A-Einschlusskörperregion, einem Hämagglutiningen, und einer großen Untereinheit, Ribonucleotidreduktase, (b) J2R, B13R +B14R, A26L, A56R, C7L-K1L und I4L, oder (c) ein Thymidinkinase-Gen, eine hämorrhagische Region, eine Typ A-Einschlusskörperregion, ein Hämagglutiningen, eine Wirtsbereichsregion, und eine große Untereinheit, Ribonucleotidreduktase des Virus deletiert sind.
  10. Vektor nach Anspruch 9, enthaltend die Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, der ein NYVAC-rekombinantes Virus ist.
  11. Vektor nach Anspruch 3, der ein modifiziertes rekombinantes Avipoxvirus ist, das so modifiziert ist, dass es abgeschwächte Virulenz in einem Wirt hat; und das exogene DNA in einer nichtessentiellen Region des Virusgenoms enthält, wobei die exogene DNA mindestens eine der Nucleinsäuren nach Anspruch 1 oder 2 hat.
  12. Vektor nach Anspruch 11, wobei das Virus ein Kanarienpockenvirus ist.
  13. Vektor nach Anspruch 12, wobei das Kanarienpockenvirus ein Rentschler-Impfstoffstamm ist, der durch mehr als 200 serielle Passagen auf Hühnerembryofibroblasten abgeschwächt wurde, wobei ein Master-Seed hiervon vier aufeinanderfolgenden Plaqueaufreinigungen unter Agar unterworfen wurde, wovon ein Plaqueclon durch fünf weitere Passagen amplifiziert wurde.
  14. Vektor nach Anspruch 13, enthaltend die Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, der ein ALVAC-rekombinantes Virus ist.
  15. Vektor nach Anspruch 14, wobei die Nucleinsäure die Nucleinsäure nach Anspruch 1(b) unter der Kontrolle des I3L Promotors, die Nucleinsäure nach Anspruch 1(c) unter der Kontrolle des H6 Promotors, oder die Nucleinsäure nach Anspruch 1(d) unter der Kontrolle des H6 Promotors ist.
  16. Verfahren zum Exprimieren eines Genprodukts in einer Zelle, die in vitro gezüchtet wird, umfassend das Einbringen eines Vektors wie in einem der Ansprüche 3 bis 15 beansprucht in die Zelle.
  17. Glycoprotein gB, gC oder gD des Herpesvirus vom Hund, wie von einer Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 codiert.
  18. Glycoprotein des Herpesvirus vom Hund nach Anspruch 17, das von der in vitro-Expression nach Anspruch 16 isoliert wurde.
  19. Pharmazeutische und/oder Impfstoffzusammensetzung, umfassend einen Vektor wie in einem der Ansprüche 3 bis 15 beansprucht und/oder ein Glycoprotein gB, gC oder gD des Herpesvirus vom Hund nach Anspruch 17 oder 18 im Gemisch mit einem geeigneten Träger.
  20. Antikörper, der spezifisch ein Glycoprotein gB, gC oder gD des Herpesvirus vom Hund nach Anspruch 17 oder 18 erkennt.
  21. Antikörper nach Anspruch 20, der ein monoclonaler Antikörper ist.
  22. Verwendung einer Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 als Sonde und/oder für die Erzeugung eines PCR-Primers.
  23. Diagnostische Zusammensetzung, umfassend den Antikörper nach Anspruch 20 oder 21.
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