CN109212205B - 伪狂犬病病毒gC蛋白抗体、含该抗体的试剂盒及应用 - Google Patents
伪狂犬病病毒gC蛋白抗体、含该抗体的试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及特异性结合伪狂犬病病毒gC蛋白的鼠单克隆抗体的可变区序列，其为鼠单克隆抗体1B9的可变区序列或鼠单克隆抗体1F2的可变区序列；本发明还涉及由所述可变区序列中的重链可变区序列或其保守性变异体，和/或相应的其各自所述可变区序列中轻链可变区序列或其保守性变异体组成的伪狂犬病病毒gC蛋白抗体。以所述抗体建立的免疫组化方法解决了PCR不能在组织和细胞内进行明确定位、无法跟踪病原在机体的动态分布、定性及半定量检测的问题。含所述抗体的试剂盒基于双单抗夹心原理准确检测PRVgC蛋白的含量，克服了PRVgC蛋白与其它蛋白串联表达或融合表达后无法准确定量、预期表达效果无法验证的技术难题。
Description
技术领域
本发明属于畜牧类生物制药技术领域，涉及伪狂犬病病毒gC蛋白抗体、含该抗体的试剂盒及应用。
背景技术
猪伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科(Herpesviridae)α亚科中的猪疱疹病毒I型(Suid herpesvirus type I，亦称伪狂犬病病毒Pseudorabies virus,PRV)所引起的猪、牛、羊、犬、猫、兔、鼠、野猪、貂、熊、狐等多种家畜、野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主症的急性传染病。
猪的伪狂犬病在我国广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疾病之一，可引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊胎，仔猪出现神经症状、麻痹以及大中猪呼吸道症状等，特别地20周龄内感染后死亡率高达100％。研究表明以PRVgB、gC、gD蛋白为主的亚单位疫苗能够给免疫动物特别是猪提供相应的保护，不仅能使猪免遭猪伪狂犬病的侵袭，还能使猪免受猪伪狂犬病毒变异株所引发的伪狂犬病的侵袭；特别地以三种蛋白中的两者或三者的串联表达或融合表达效果最为显著。但通过基因工程手段串联表达或融合表达后的蛋白存在的难题在于仅能通过常用的BCA或Bradford方法定量表达后的总蛋白含量，而无法准确定量各自蛋白表达的含量，且不能确定各蛋白是否达到预期的表达效果，从而导致无法配制亚单位疫苗。
目前PRV病原的临床检测主要为聚合酶链反应PCR方法，此方法中涉及的引物、酶等多为国外进口且较为昂贵，使得养殖场特别是小规模或散户养殖望而却步；另外此方法虽广泛用于疫病的诊断，但由于其不能在组织和细胞内进行明确定位、无法跟踪病原在机体的动态分布、半定量检测，从而限制了PCR在病理组织学上的应用。
根据本领域公知常识，能够用于免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)的抗体会在其使用说明书中作出明确标识和注明，按这些抗体的说明所示，大多数都不能用于IHC检测。虽然个别抗体标明可用于IHC，但我们实际应用发现并非如此。这些抗体均为研究用试剂，没有经过大量样本临床病例试验或验证，没有关键的对病毒感染组织或细胞的定位检测能力，为流行病学的准确调查和后期的预防、治疗造成麻烦。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供伪狂犬病病毒gC蛋白抗体、含该抗体的试剂盒及应用。
为此，本发明第一方面提供了特异性结合伪狂犬病病毒gC蛋白的鼠单克隆抗体的可变区序列，其为鼠单克隆抗体1B9的可变区序列或鼠单克隆抗体1F2的可变区序列。
在本发明的一些实施例中，在鼠单克隆抗体1B9的可变区序列中，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；和/或轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
在本发明的另一些实施例中，在鼠单克隆抗体1F2的可变区序列中，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.6所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；和/或轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.8所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
本发明第二方面提供了伪狂犬病病毒gC蛋白抗体，其由本发明第一方面所述可变区序列中的重链可变区序列或其保守性变异体，和/或所述可变区序列中轻链可变区序列或其保守性变异体组成；所述抗体或该抗体的片段仍保持特异性结合伪狂犬病病毒的能力。
根据本发明，所述抗体为单克隆抗体或基因工程抗体；优选所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体、猪源单克隆抗体或所述抗体的片段；优选所述抗体为鼠单克隆抗体1B9或鼠单克隆抗体1F2。
本发明第三方面提供了本发明第二方面所述的抗体在用于进行非诊断目的的伪狂犬病病毒检测中的应用。
根据本发明，所述非诊断目的的伪狂犬病病毒检测包括流行病学分析、对离体组织进行检测、表位鉴定研究、疫苗的半成品及成品检验，以及定性和定量鉴别检验含伪狂犬病病毒抗原和其他抗原的疫苗组合物中的伪狂犬病病毒抗原的检测。
在本发明的一些实施方式中，采用免疫组化的方法进行非诊断目的的伪狂犬病病毒检测。
在本发明的一些优选的实施例中，所述免疫组化的方法采用鼠单克隆抗体1F2为一抗。
在本发明的一些进一步优选的实施例中，所述一抗使用时作1:50-1:1000稀释。
本发明第四方面提供了一种ELISA试剂盒，其包括本发明第二方面所述抗体或所述抗体的片段、伪狂犬病病毒gC蛋白标准品，以及用于对抗原抗体反应进行检测的检测试剂。
在本发明的一些实施例中，所述抗体包括鼠单克隆抗体1B9和鼠单克隆抗体1F2，并且所述鼠单克隆抗体1B9和鼠单克隆抗体1F2中的一种包被在微孔板上，另一种被标记物标记。
在本发明的另一些实施例中，所述标记物包括酶、荧光基团或化学发光基团；
在本发明的又一些实施例中，所述检测试剂包括与所述标记物发生颜色反应的底物；优选地，所述检测试剂包括酶显色试剂、荧光试剂或化学发光试剂。
根据本发明的一些具体的实施例，所述试剂盒包括酶标记的鼠单克隆抗体1B9、用于包被微孔板的鼠单克隆抗体1F2和伪狂犬病病毒gC蛋白标准品。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述鼠单克隆抗体1F2的包被量为0.075-0.15μg/ml；所述酶标记的鼠单克隆抗体1B9使用时进行1:(1500-9000)的体积稀释。
本发明第五方面提供了一种利用本发明第四方面所述的ELISA检测试剂盒检测伪狂犬病病毒gC蛋白的含量的方法，其包括：
步骤S1，将标准品系列稀释液、待检样品稀释液同时加入微孔板中，孵育；
步骤S2，弃反应液；
步骤S3，将稀释后的酶标抗体微孔板孵育；
步骤S4，弃反应液；
步骤S5，加显色液，孵育；
步骤S6，加终止液，并用酶标仪测吸光度值OD450nm；
步骤S7，根据标准品系列稀释液的吸光度值绘制标准曲线，计算待检样品中PRVgC蛋白相应的含量。
在本发明的一些优选的实施例中，所述标准品系列稀释液通过将标准品用样品稀释液稀释为0-720ng/ml。
在本发明的一些进一步优选的实施例中，所述标准品系列稀释液稀释为0-360ng/ml。
本发明第六方面提供了一种如本发明第四方面所述的ELISA检测试剂盒在定量检测伪狂犬病病毒gC蛋白全蛋白或其片段或其保守性变异体或其活性片段单独表达，或与其它蛋白串联表达或融合表达时的伪狂犬病病毒gC蛋白的含量的应用。
本发明所提供的伪狂犬病病毒gC蛋白单克隆抗体以及含这些抗体的试剂盒的具有以下有益效果：以所述单克隆抗体建立的免疫组化方法解决了采用PCR不能在组织和细胞内进行明确定位、无法跟踪病原在机体的动态分布、无法定性及半定量检测的问题；弥补了现有商品化抗体因未经大量样本临床病例试验或验证而不具备关键的对PRV经典株、变异株病毒感染组织或细胞的定位检测能力，并由此为流行病学的准确调查和后期的预防、治疗造成麻烦的问题。含所述单克隆抗体的试剂盒基于双单抗夹心原理准确检测PRVgC蛋白的含量，克服了PRVgC蛋白与其它蛋白串联表达或融合表达后无法准确定量、预期表达效果无法验证的技术难题，解决了配制疫苗的关键问题。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。
本发明涉及一种特异性结合伪狂犬病病毒gC蛋白的鼠单克隆抗体1B9的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
本发明进一步涉及一种伪狂犬病病毒gC蛋白抗体，其由所述单克隆抗体1B9可变区序列中重链可变区序列或其保守性变异体，和/或所述可变区序列中轻链可变区序列或其保守性变异体组成。所述抗体可以为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体、猪源单克隆抗体或所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合伪狂犬病病毒的能力。
在本发明的一些优选实施方式中，所述抗体为单克隆抗体1B9。
所述鼠单克隆抗体1B9的ELISA效价均≥1:1024000，IPMA效价为1:800，与PRVgC蛋白及PRV抗原具有良好的反应性。
本发明还涉及一种特异性结合伪狂犬病病毒gC蛋白的鼠单克隆抗体1F2的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.6所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.8所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
本发明还进一步涉及一种伪狂犬病病毒gC蛋白抗体，其由所述单克隆抗体1F2可变区序列中重链可变区序列或其保守性变异体，和/或所述的可变区序列中轻链可变区序列或其保守性变异体组成的抗体；所述抗体可以为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体、猪源单克隆抗体或所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合伪狂犬病病毒的能力。
在本发明的一些优选实施方式中，所述抗体为单克隆抗体1F2。
所述单克隆抗体1F2的ELISA效价均≥1:2048000，IPMA效价为1:12800，与PRVgC蛋白及PRV抗原具有良好的反应性。
本发明中所用术语“gC蛋白”又称gIII蛋白，是成熟的病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，基因序列约1.5kb。
本发明中所用术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。“抗体”为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG、IgE、IgM、IgC和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP0120694A和EP0125023A中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区，参见EP184187A，GB2188638A或EP239400A。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成核苷酸序列或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。
本发明中所用术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体，而仍能保持与伪狂犬病病毒特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。
本发明中所用术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地，多肽的保守性变异体之氨基酸序列不同于母本多肽，但是差异有限，以使与母本多肽之序列与保守性变异体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列上的差异可以是例如：一个或多个氨基酸残基及其任意组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生，或者它可以是非自然产生的变异体。多肽之非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而产生。
本发明还涉及前文中所述的抗体在用于进行非诊断目的的伪狂犬病病毒检测中的应用。
本发明中，所述非诊断目的的伪狂犬病病毒检测包括流行病学分析、对离体组织进行检测、表位鉴定研究、疫苗的半成品及成品检验，以及定性和定量鉴别检验含伪狂犬病病毒抗原和其他抗原的疫苗组合物中的伪狂犬病病毒抗原的检测。
在本发明的一些实施方式中，采用免疫组化的方法进行非诊断目的的伪狂犬病病毒检测。
在本发明的一些优选的实施例中，所述免疫组化的方法采用鼠单克隆抗体1F2为一抗，采用酶标的羊抗鼠抗体作为酶标二抗。
在本发明的一些进一步优选的实施例中，所述一抗使用时作1:50-1:1000稀释。
本发明另外还涉及前文中所述的抗体在制备用于进行非诊断目的的伪狂犬病病毒检测中的试剂中的应用。
本发明中，所述非诊断目的的伪狂犬病病毒检测包括流行病学分析、对离体组织进行检测、表位鉴定研究以及定性和定量鉴别检验含伪狂犬病病毒抗原和其他抗原的疫苗组合物中的伪狂犬病病毒抗原的检测。
在本发明的一些实施方式中，采用免疫组化的方法进行非诊断目的的伪狂犬病病毒检测。
在本发明的一些优选的实施例中，所述免疫组化的方法采用鼠单克隆抗体1F2为一抗，采用酶标的羊抗鼠抗体作为酶标二抗。
在本发明的一些进一步优选的实施例中，所述一抗使用时作1:50-1:1000稀释。
根据本发明的一些实施方式，所述免疫组化方法包括以下步骤：
步骤1)取材：采集猪只的扁桃体、脑、肺等组织样品，迅速置于福尔马林固定，必要时对其进行适当修块；
步骤2)石蜡切片的制备：固定后的组织样品经流水冲洗后再用自动脱水机进行脱水、透明、浸蜡，用包埋机包埋后切片、展片、裱片于已处理的玻片上，烤片；
步骤3)抑制内源性酶：将玻片脱蜡至蒸馏水，滴加3％H2O2静置以抑制内源性酶；
步骤4)抗原修复：用抗原热修复如高压热修复、煮沸热修复、微波热修复，或酶消化法处理烤片后的玻片以修复抗原；
步骤5)封闭：用磷酸盐缓冲液洗涤3次，滴加封闭液如马血清或牛血清白蛋白(BSA)封闭；
步骤6)染色：吸去封闭液后加入稀释的一抗，室温孵育1小时或37℃孵育45-60分钟或2-8℃孵育过夜；用磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入酶标二抗，室温孵育1小时或37℃孵育45-60分钟：
步骤7)显色：用磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入AEC(3-amino-9-ethylcarbozole，3-氨基-9-乙基卡唑)或DAB(Diaminobenzidine，3,3-二氨基苯联胺)显色液显色，视染色情况用磷酸盐缓冲液或蒸馏水终止；加入苏木素衬染细胞核以复染，必要时进行脱水、透明、封片、镜检；
其中，所述步骤6)中所述一抗为所述鼠单克隆抗体1F2可变区序列对应的所述抗体或所述抗体的片段；
其中，所述步骤6)中所述一抗为所述鼠单克隆抗体1F2；
其中，所述步骤6)中所述一抗使用时作1:50-1:1000稀释；
其中，所述步骤6)中所述酶标二抗为酶标的羊抗鼠抗体。
本发明所用术语“酶”包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和β-D-半乳糖苷酶的任一种。
本发明所用术语“磷酸盐缓冲液”是指含有磷酸或其盐并被调至理想pH值的溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约4-10的范围，优选约5-9的范围，更有选约6-8的范围，最优选约7.4。进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。
本发明所用用语“猪伪狂犬病”亦称为“伪狂犬病”。类似地，用语“猪伪狂犬病病毒”亦称为“伪狂犬病病毒”，同样类似地“猪伪狂犬病病毒gC蛋白”亦称为“伪狂犬病病毒gC蛋白”。
本发明还涉及一种ELISA试剂盒，其包括上述抗体或该抗体的片段、伪狂犬病病毒gC蛋白标准品，以及用于对抗原抗体反应进行检测的检测试剂。
在本发明的一些实施例中，所述抗体包括鼠单克隆抗体1B9和鼠单克隆抗体1F2，并且所述鼠单克隆抗体1B9和鼠单克隆抗体1F2中的一种包被在微孔板上，另一种被标记物标记。
在本发明的另一些实施例中，所述标记物包括酶、荧光基团或化学发光基团；
在本发明的又一些实施例中，所述检测试剂包括与所述标记物发生颜色反应的底物；优选地，所述检测试剂包括酶显色试剂、荧光试剂或化学发光试剂。
在本发明的一些具体实施例中，所述ELISA试剂盒包括标记有标记物的有效量的具有鼠单克隆抗体1B9的可变区序列的抗体或所述抗体的片段，和/或有效量的具有鼠单克隆抗体1F2的可变区序列的所述的抗体或所述抗体的片段，用于和伪狂犬病病毒gC蛋白进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂，以及伪狂犬病病毒gC蛋白标准品；其中，所述标记物包括酶、荧光基团、化学发光基团；所述检测抗原抗体反应的试剂为与所述标记物发生颜色反应的底物，包括酶显色试剂、荧光试剂、化学发光试剂。
在本发明的一些具体实施例中，所述ELISA试剂盒包括标记有标记物的有效量的所述单克隆抗体1B9、有效量的所述单克隆抗体1F2，和伪狂犬病病毒gC蛋白进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂，以及伪狂犬病病毒gC蛋白标准品；其中，所述标记的所述单克隆抗体1B9的标记物包括酶、荧光、化学发光，以及所述检测抗原抗体反应的试剂为与所述标记物发生颜色反应的底物，包括酶显色试剂、荧光试剂、化学发光试剂。
在本发明的一些优选的实施例中，所述ELISA试剂盒包括包被所述单克隆抗体1F2的微孔板、酶标记的所述单克隆抗体1B9，以及伪狂犬病病毒gC蛋白标准品；其中，所述单克隆抗体1F2的包被量为0.075-0.15μg/ml，所述酶标记的所述单克隆抗体1B9使用时作V/V1:1500-1:9000稀释。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述ELISA试剂盒包括包被所述单克隆抗体1F2的微孔板、酶标记的所述单克隆抗体1B9、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液，以及伪狂犬病病毒gC蛋白标准品；其中，所述单克隆抗体1F2的包被量为0.075-0.15μg/ml，所述酶标记的所述单克隆抗体1B9使用时作V/V1:1500-1:9000稀释。
在本发明的一些进一步具体优选的实施例中，所述ELISA试剂盒中：
所述样品稀释液为磷酸盐缓冲液；
所述洗涤液为含0.05％V/V Tween-20的磷酸盐缓冲液；
所述终止液为2M H2SO4；
所述显色液包括A液和B液；其中，
所述A液为TMB 20mg加入10ml无水乙醇后用双蒸水定容至100ml，混匀后无菌分装；
所述B液为柠檬酸2.1g、无水Na2HPO42.82g、0.75％的过氧化氢尿素0.64ml用双蒸水溶解并定容至100ml，混匀后无菌分装。
本发明还涉及一种利用本发明所述的ELISA检测试剂盒检测伪狂犬病病毒gC蛋白的含量的方法，其包括：
步骤S1，将标准品系列稀释液、待检样品稀释液同时加入微孔板中，孵育；
步骤S2，弃反应液；
步骤S3，将稀释后的酶标抗体微孔板孵育；
步骤S4，弃反应液；
步骤S5，加显色液，孵育；
步骤S6，加终止液，并用酶标仪测吸光度值OD450nm；
步骤S7，根据标准品系列稀释液的吸光度值绘制标准曲线，计算待检样品中PRVgC蛋白相应的含量。
根据本发明的一些优选实施方式，所述标准品系列稀释液通过将标准品用样品稀释液稀释为0-720ng/ml。
在本发明的一些优选的实施例中，所述标准品系列稀释液稀释为0-360ng/ml。
在本发明的一些具体优选的实施例中，利用本发明所述的ELISA检测试剂盒检测伪狂犬病病毒gC蛋白的含量的方法包括以下步骤：
(1)将标准品用样品稀释液稀释至720ng/ml之后进行2倍倍比稀释即360、180、90、45、0ng/ml，将待检样品用样品稀释液稀释1:100-1:200，将标准品系列稀释液、待检样品稀释液同时按100μl/孔加入微孔板中，封板并置37℃温育45-90分钟或室温孵育60分钟；
(2)弃反应液，用洗涤液洗涤2-4次，拍干或抽干；
(3)将稀释后的酶标抗体按100μl/孔加入后封板并置37℃温育30-45分钟或室温孵育45分钟；
(4)弃反应液，用洗涤液洗涤2-4次，拍干或抽干；
(5)加显色液A液、B液各50μl/孔，置37℃温育10分钟或室温孵育15分钟；
(6)加终止液50μl/孔，10分钟内用酶标仪读吸光度值OD450nm；
(7)根据标准品系列稀释液的吸光度值绘制标准曲线，计算待检样品中PRVgC蛋白相应的含量。
本发明还涉及本发明所述的ELISA检测试剂盒在定量检测伪狂犬病病毒gC蛋白全蛋白或其片段或其保守性变异体或其活性片段单独表达，或与其它蛋白串联表达或融合表达时的伪狂犬病病毒gC蛋白的含量中的应用。
根据本发明的一些实施方式，提供了所述ELISA试剂盒定量检测伪狂犬病病毒gC蛋白全蛋白或其片段或其保守性变异体或其活性片段单独表达，或与其它蛋白串联表达或融合表达时的伪狂犬病病毒gC蛋白的含量的方法，其包括：
步骤T1，将标准品用样品稀释液稀释至720ng/ml之后进行2倍倍比稀释即360、180、90、45、0ng/ml，将待检样品用样品稀释液稀释1:100-1:200，将标准品系列稀释液、待检样品稀释液同时按100μl/孔加入微孔板中，封板并置37℃温育45-90分钟或室温孵育60分钟；
步骤T2，弃反应液，用洗涤液洗涤2-4次，拍干或抽干；
步骤T3，将稀释后的酶标抗体按100μl/孔加入后封板并置37℃温育30-45分钟或室温孵育45分钟；
步骤T4，弃反应液，用洗涤液洗涤2-4次，拍干或抽干；
步骤T5，加显色液A液、B液各50μl/孔，置37℃温育10分钟或室温孵育15分钟；
步骤T6，加终止液50μl/孔，10分钟内用酶标仪读吸光度值OD450nm；
步骤T7，根据标准品系列稀释液的吸光度值绘制标准曲线，计算待检样品中PRVgC蛋白相应的含量。
实施例
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1：含伪狂犬病病毒gC蛋白的制备
1.1PRVgC蛋白的制备
在生长良好的PK15细胞上接种PRV HN1201病毒或其不同代次的培养物(PRVHN1201株保藏号为CCTCC NO.V 201311，参见专利CN104004774A)，该不同代次的培养物为5-35代以内的培养物，提取PRV基因组DNA，设计引物
gC1-F:CGCGGATCCATGGCCTCGCTCGCGCGTGCGAT
gC1-R:TGTGAAGCTTTCACAGCGCGGACCGGCGGTAGT
并按专利CN104004774A方法制备PRVgC蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司)中的说明书测定PRVgC蛋白(简称PRVgC1)，含量为160μg/ml。
1.2含PRVgC蛋白的串联表达蛋白的制备
设计引物
gC2-F:CCAATGCATATGGCCTCGCTCGCGCGTGCGA
gC2-R:CATGCCATGGTCACAGCGCGGACCGGCGGTA
gB2-F:CGCGGATCCATGCTAGGGGGCGTCGGGGTCCT
gB2-R:TGTGAAGCTTCTAATGCCCGCTGGTGGCGGTCT
按专利CN105693827A所述方法制备PRVgC蛋白与PRVgB蛋白片段的串联表达蛋白(简称PRVgC2)。
设计引物
gC3-F:CCAATGCATATGGCCTCGCTCGCGCGTGCGA
gC3-R:CATGCCATGGTCACAGCGCGGACCGGCGGTA
gD3-F:CGCGGATCCATGCTGCTCGCAGCGCTATT
gD3-R:TGTGAAGCTTCTACGGACCGGGCTGCGCTT
按专利CN105693827A所述方法制备HN1201株PRVgC蛋白与PRVgD蛋白的串联表达蛋白(简称PRVgC3)。
参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量，结果：PRVgC2、PRVgC3总蛋白含量为15、19μg/ml。
1.3含PRVgC蛋白的融合表达蛋白的制备
设计引物
gB4-F:CGCGGATCCATGCTAGGGGGCGTCGGGGTCCT
gB4-R:
TGATCCACCTCCCCCTGATCCACCTCCCCCTGATCCACCTCCCCCATGCCCGCTGGTGGCGGTCTT
gC4-F:
GGGGGAGGTGGATCAGGGGGAGGTGGATCAGGGGGAGGTGGATCAATGGCCTCGCTCGCGCGTGC
gC4-R:TGTGAAGCTTTCACAGCGCGGACCGGCGGTAGT
按专利CN105693827A所述方法制备PRVgC蛋白与PRVgB蛋白的融合表达蛋白(简称PRVgC4)
设计引物
gC5-F:CGCGGATCCATGGCCTCGCTCGCGCGTGCGAT
gC5-R:
TGATCCACCTCCCCCTGATCCACCTCCCCCTGATCCACCTCCCCCCAGCGCGGACCGGCGGTAGTAG
gD5-F:
GGGGGAGGTGGATCAGGGGGAGGTGGATCAGGGGGAGGTGGATCAATGCTGCTCGCAGCGCTATTGG
gD5-R:TGTGAAGCTTCTACGGACCGGGCTGCGCTTTTA
按专利CN105693827A所述方法制备PRVgC蛋白与PRVgD蛋白的融合表达蛋白(简称PRVgC5)。参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量，结果：PRVgC4、PRVgC5总蛋白的含量为5、8.6μg/ml。
但PRVgC2、PRVgC3、PRVgC4、PRVgC5只能测定总蛋白的含量，无法准确预测各蛋白相应的表达量，无法监测表达效果是否达到预期，导致配苗时各组分不清楚，也无法对疫苗免疫后产生效果好坏的原因进行分析。
实施例2：伪狂犬病病毒gC蛋白单克隆抗体的制备、纯化及鉴定
2.1PRVgC蛋白单克隆抗体的制备和纯化
首先，将实施例1制备的PRV HN1201株病毒液(2×108TCID50/ml)分别经甲醛、β-丙内酯、二乙烯亚胺BEI灭活，分组与弗氏佐剂乳化后免疫小鼠10只/组，并以实施例1制备的PRVgC1包被的ELISA方法对3-7次免后的小鼠血清进行ELISA持续检测，结果：各组小鼠血清ELISA效价均≤1:400，任选1只进行细胞融合，融合后阳性率为0，放弃。
其次，将实施例1制备的PRVgC1与弗氏佐剂等体积乳化后免疫小鼠10只，隔2周免1次，以实施例1制备的PRVgC1包被的ELISA方法对3-7次免后的小鼠血清进行ELISA持续检测，结果：各组小鼠血清ELISA效价均≤1:800，任选1只进行细胞融合，融合后阳性率为0，放弃。
再次，将实施例1制备的PRV HN1201株病毒液(2×108TCID50/ml)经甲醛灭活与弗氏佐剂等体积乳化后首次免疫小鼠20只，2周后将实施例1制备的PRVgC1与弗氏佐剂等体积乳化第2次免疫，如此反复免疫3轮。免疫第2轮后每次免后9天对20只小鼠采血并用以实施例1制备的PRVgC1包被的ELISA方法对血清持续进行ELISA持续检测。结果：各组小鼠血清ELISA效价均≤1:1000，任选1只进行细胞融合，融合后阳性率为0，放弃。
最后，将实施例1制备的PRV HN1201株病毒液(2×108TCID50/ml)经甲醛灭活、PRVgC1(100μg/ml)混合后与弗氏佐剂等体积乳化后首次免疫小鼠20只，隔2周进行第2-5次免疫，第6次用PRVgC1直接免疫。免疫4-5次后陆续后小鼠死亡，将存活的10只小鼠采血并用以实施例1制备的PRVgC1包被的ELISA方法对血清进行ELISA持续检测。将小鼠血清免疫4-5次后ELISA效价有上升趋势且ELISA效价≥1:12800的仅3只小鼠，陆续按Harlow E等(Harlow E,Lane D.Antibodies:a laboratory manual.New York:Cold Spring HarborLaboratory Press.1998,139-312)文献的操作方法进行细胞融合，用ELISA对其进行有限稀释法亚克隆筛选，累计仅获得10株阳性杂交瘤细胞，阳性率仅为1％。将PRV HN1201株感染的PK-15细胞包被于微孔板，经免疫过氧化物酶单层细胞试验IPMA评价10株阳性杂交瘤细胞上清，发现1株有非特异性反应、1株为阴性故舍弃，获得8株阳性杂交瘤细胞(1B9、1F2、8H2、10F6)。分别将其注入已经石蜡刺激的经产母鼠内，制备8株单克隆抗体的腹水，取混匀后的小样经ELISA、IPMA评价，结果见表1。
表1 5株单克隆抗体腹水的评价结果
| 序号 | 杂交瘤细胞株名称 | ELISA | IPMA | 腹水产生情况 |
| 1 | 1B9 | ≥1:1024000 | 1:800 | 适中 |
| 2 | 1F2 | ≥1:2048000 | 1:12800 | 适中 |
| 3 | 3D4 | 1:4096 | 1:800 | 适中 |
| 4 | 4E5 | 1:400-1:1600 | 1:80 | 较快且量少 |
| 5 | 4C7 | 1:8192 | 1:800 | 适中 |
| 6 | 5C1 | 1:4096 | 1:1000 | 适中 |
| 7 | 8H2 | 1:2048 | 1:40 | 较慢且量少 |
| 8 | 10F6 | 1:512 | 1:160 | 较快且量少 |
根据表1的评价结果，选出5株制备腹水时腹水产生及产量均适中的，且在ELISA、IPMA水平上均相对较高、与PRVgC蛋白及病毒均具有良好反应性的单克隆抗体1B9、1F2进行后续研究。将5株的腹水用陈丹等(陈丹，孙广瑞，柳增善.辛酸-硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应用.安徽农业科学,2007,35(26):8105,8108)所述辛酸-硫酸铵联合沉淀法纯化，之后用SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定，结果：纯化后1株单克隆抗体5C1纯度较低仅为50％故舍弃，其余4株单克隆抗体的纯度均≥85％；用BCA蛋白定量试剂盒分按照说明书分别进行定量分析，结果：单克隆抗体1B9、1F2、3D4、4C7的浓度分别为3.8、4.2、1.2、0.8mg/ml。
2.2单克隆抗体1B9、1F2特异性的鉴定
将猪瘟病毒CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV、猪圆环病毒2型PCV2、猪细小病毒PPV、伪狂犬病病毒PRV及培养PRV用PK15细胞分别固定于微孔板中，将单克隆抗体1B9、1F2腹水作为一抗，将荧光标记兔抗鼠抗体二抗作为荧光标记二抗，按照间接免疫荧光方法IFA进行检测，结果：单克隆抗体1B9、1F2仅与PRV反应，而不与其它猪常见病及培养用细胞发生交叉反应。
将PRVgBΔ148-546蛋白、PRVgB蛋白(按照专利CN10563827A制备)，PRVgD蛋白(按专利CN104004774A方法制备)，以及实施例1制备的PRVgC1，分别包被于微孔板中，将单克隆抗体1B9、1F2腹水作为一抗，按ELISA进行检测，结果：单克隆抗体1B9、1F2仅与PRVgC蛋白反应，而不与PRV其它蛋白反应。
表明：单克隆抗体1B9、1F2为PRVgC蛋白的特异性单克隆抗体。
2.3单克隆抗体1B9、1F2的应用
将实施例1制备的PRVgC1、PRVgC2、PRVgC3、PRVgC4、PRVgC5以及专利CN104248757制备的PRVgBgD亚单位疫苗半成品，以及添加206佐剂(46％V/V)后制备的疫苗成品，经Western blot鉴定，结果：PRVgC1、PRVgC2、PRVgC3、PRVgC4、PRVgC5做成的亚单位疫苗半成品及对应的疫苗成品反应为阳性，而PRVgBgD亚单位疫苗半成品及对应的疫苗成品为阴性。据此，可将两株单克隆抗体用于含PRVgC蛋白疫苗或不含PRVgC蛋白疫苗的半成品及成品检验。
2.4单克隆抗体中和活性的测定
按《中国兽药典》2015版所述固定病毒稀释血清法测定鼠单克隆抗体1B9、1F2的中和效价，先将鼠单克隆抗体1B9、1F2的不同稀释倍数(1:1V/V-1:2048V/V)与新鲜兔血清混合，再与PK15细胞于37℃、5％CO2条件下孵育1小时，分别加入PRV经典株Fa株与MA株(均购自中国兽药监察所)，疫苗株Bartha株(购自中国兽药监察所)及变异株HN1201株的病毒稀释液(均含100TCID50/mL)，置37℃、5％CO2条件下培养72-120小时观察细胞病变，并计算中和效价，结果见表2。
表2单克隆抗体对不同毒株的中和效价
| 单克隆抗体 | HN1201株 | Bartha株 | Ma |
| 1B9 | 1:158 | 1:631 | 1:316 |
| 1F2 | 0 | 0 | 0 |
结果显示：单克隆抗体1B9在有补体存在情况下，具有中和活性，对3个毒株的中和效价≥1:158；单克隆抗体1F2不论在有无补体的情况下，均没有中和活性。据此，可将两株单克隆抗体用于PRVgC蛋白结构解析等机理研究如表位鉴定研究、定性和定量鉴别检验含伪狂犬病病毒抗原和其他抗原的疫苗组合物中伪狂犬病病毒抗原的检测等。
2.5单克隆抗体1B9、1F2的亚型及可变区序列测定
用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit并参照说明书对单克隆抗体1B9、1F2的亚型进行鉴定。结果：单克隆抗体1B9、1F2的重链亚型均为IgG2a，轻链类型均为kappa。
根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：
P1：GGGAATTCAAATSCTGGGT
P2：CCAAAGCTTGGGRCCARK
设计轻链可变区引物序列：
P3：ACTAGTCGACATGAGTGTGCYCACTCA
P4：CCCAAGCTTGGATGGTGGGAAGAT
按照张爱华等(张爱华，闭兰，王志友等.系列鼠抗CD分子单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆和序列分析.中国生物制品学杂志，2001,15(2)：65-68)建立的可变区序列测定方法，通过分子克隆技术分别获得单克隆抗体1B9、1F2的可变区序列，选取对应的克隆质粒送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。结果，单克隆抗体1B9的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3所示，由其推导的氨基酸序列分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.4；单克隆抗体1F2的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQ ID No.5、SEQ ID No.7所示，由其推导的氨基酸序列分别为SEQ ID No.6、SEQ IDNo.8。
综上所述，根据免疫学原理及两株单克隆抗体的特性，可用两株单克隆抗体进行非诊断目的的伪狂犬病病毒检测中的应用，包括流行病学分析、对离体组织进行检测、表位鉴定研究、定性和定量鉴别检验含伪狂犬病病毒抗原和其他抗原的疫苗组合物中伪狂犬病病毒抗原的检测。
实施例3：免疫组化方法的建立及应用
3.1免疫组化方法的建立
免疫组化的方法包括以下步骤：
1)取材：采集猪只的扁桃体、脑、肺等组织样品，迅速置于福尔马林固定，必要时对其进行适当修块。
2)石蜡切片的制备：固定经流水冲洗后再用自动脱水机进行脱水、透明、浸蜡，用包埋机包埋后切片、展片、裱片于已处理的玻片上，烤片。
3)抑制内源性酶：将玻片脱蜡至蒸馏水，滴加3％H2O2静置以抑制内源性酶。
4)抗原修复：用抗原热修复如高压热修复、煮沸热修复、微波热修复，或酶消化法处理烤片后的玻片以修复抗原。
5)封闭：用磷酸盐缓冲液洗涤3次，滴加封闭液如马血清或牛血清白蛋白BSA封闭；
6)染色：吸去封闭液后加入稀释的一抗，室温孵育1小时或37℃孵育45-60分钟或2-8℃孵育过夜；用磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入酶标的羊抗鼠抗体作为酶标二抗，室温孵育1小时或37℃孵育45-60分钟。
7)显色：用磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入AEC或DAB显色液显色，视染色情况用磷酸盐缓冲液或蒸馏水终止；加入苏木素衬染细胞核以复染，必要时进行脱水、透明，封片、镜检。
3.2免疫组化用一抗的筛选
将实施例2制备的4株单克隆抗体1B9、1F2、3D4、4C7(纯化后的腹水)作为一抗，按1:50-1:3200 2倍比稀释后对PRV HN1201株、Fa株、Ma株分别攻毒后收集的临床病料，按照实施例3.1所述方法进行免疫组化检测，结果见表2。由表2可知：单克隆抗体1F2用于PRVHN1201株、Fa株、Ma株的免疫组化反应时效价均≥1:800，效价较高且背景干净；而其余3株单克隆抗体1B9、3D4、4C7的效价较低且背景很高或有非特异反应，无法有效地得到应用。
表3免疫组化用一抗的筛选结果
3.3临床应用
将临床收集的278份扁桃体、脑、肺等组织样品经北京世纪元亨动物防疫技术有限公司PRV PCR试剂盒检测出207份阳性、71份阴性；并将207份阳性进行测序，结果发现有158份为PRV变异株，其余为PRV经典株。用单克隆抗体1F2(1:1000)作为一抗按实施例3.1所述免疫组化方法进行检测，结果见表4。由表3可知：免疫组化与PCR方法的阳性符合率为92％，阴性符合率为100％，总符合率为94％；另PRV的感染集中于细胞核上和细胞质内，以脑部组织病变(占所有脑部组织样品的91％)最为突出。另外，此次278份有90份阳性临床样品为4头(20份/头)发病猪的扁桃体、脑、肺组织样品(每种各6份)，为连续5天采集的发病猪的脑组织样品，通过免疫组化连续跟踪发现：4头猪的病变均由最初的扁桃体、肺脏逐渐转入到脑部。
表4免疫组化与PCR检测结果比较
综上所述，以单克隆抗体1F2为一抗建立的免疫组化方法在其1:1000稀释检测时与PCR的符合率高，可代替PCR方法进行流行病学调查；可准确定位病变组织、清晰明了地观察到病原在组织细胞中的生长动态或扩散过程，使得病原检测更加直观清晰，为PRV(包括PRV经典株和变异株所引发)疫病的预防和治疗提供支持，为后期PRV特别是变异株的原因、致病机理和过程的研究，以及表位鉴定研究奠定基础。
实施例4：含PRVgC蛋白单克隆抗体的ELISA试剂盒制备及应用
4.1PRVgC蛋白单克隆抗体配对试验
将实施例2制备的5株单克隆抗体分别纯化后，用相同浓度0.3μg/ml、100μl/孔分别包被于微孔板中，加入实施例1制备的PRVgC1抗原V/V 1:100稀释液后，分别与5株酶标的单克隆抗体V/V1:2500稀释液进行配对反应，显色，酶标仪读其吸光度值OD450nm，结果见表5。
表5不同单克隆抗体组合的试验结果
用抗体相加试验验证两株单克隆抗体针对的抗原表位是否相同进行测定。将实施例1制备的PRVgC1包被于微孔板后用封闭液进行封闭，然后加入第一株饱和浓度的单克隆抗体与之反应，洗涤，拍干，再加入另一株饱和浓度的单克隆抗体与之反应。两株单克隆抗体反应完毕后，再加入HRP标记的羊抗鼠IgG与之反应，洗涤，显色，测定其吸光度A值。按公式AI＝[(A1.2-A1)/A2]×100％，分别计算单隆抗体两两叠加的增值指数AI。其中，A1、A2分别为单抗1和2的A值，A1.2为单抗1叠加单抗2的A值；当AI大于50％即可初步断定两种单抗对应不同的抗原结合位点。结果见表6。
表6：单克隆抗体两两叠加的增值指数AI
由表5可知：只有当单克隆抗体1F2作为包被原、单克隆抗体1B9作为酶标抗体，或当单克隆抗体1B9作为包被原、单克隆抗体1F2作为酶标抗体时，检测结果才有效，而其他的搭配模式所测的吸光度较低，无法完成后续准确有效的定量检测。
同时验证了两株单克隆抗体针对抗原表位的异同，结果：鼠单克隆抗体1B9与1F2抗体相加指数均高于50％，表明两株单克隆抗体识别不同的抗原表位，可用于建立双抗体夹心方法。
4.2ELISA试剂盒的制备
包被的微孔板1：将0.075-0.15μg/ml鼠单克隆抗体1F2包被于微孔板中，置2-8℃包被过夜或37℃包被1小时，用样品洗涤液洗2-3遍并拍干或抽干，用封闭液于37℃封闭2小时，用样品洗涤液洗2-3遍并拍干或抽干。
酶标抗体1：用过碘酸钠法标记纯化的单克隆抗体1B9，所用酶为辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶AP，经鉴定酶标后抗体含量为1.4mg/ml，标记率为0.78；使用时按V/V1:1500-1:9000任一倍数稀释。
包被的微孔板2：将0.5μg/ml单克隆抗体1B9包被于微孔板中，置2-8℃包被过夜或37℃包被1小时，用样品洗涤液洗2-3遍并拍干或抽干，用封闭液于37℃封闭2小时，用样品洗涤液洗2-3遍并拍干或抽干。
酶标抗体2：用过碘酸钠法标记纯化的单克隆抗体1F2，所用酶为辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶AP，经鉴定酶标后抗体含量为1.4mg/ml，标记率为0.78；使用时按V/V1:4000稀释。
样品稀释液：磷酸盐缓冲液。
洗涤液：含0.05％V/V Tween-20的磷酸盐缓冲液。
标准品：实施例1制备的PRVgC蛋白(简称PRVgC1)。
显色液：包括A液和B液，其中，A液为TMB 20mg加入10ml无水乙醇后用双蒸水定容至100ml，混匀后无菌分装；B液为柠檬酸2.1g、无水Na2HPO42.82g、0.75％的过氧化氢尿素0.64ml用双蒸水溶解并定容至100ml，混匀后无菌分装。
终止液：2M H2SO4。
将包被的微孔板1、酶标抗体1、样品稀释液、洗涤液、标准品、显色液、终止液组装成试剂盒1；将包被的微孔板2、酶标抗体2、样品稀释液、洗涤液、标准品、显色液、终止液组装成试剂盒2。
4.3ELISA试剂盒的检测方法
检测方法包括
①将标准品用样品稀释液稀释至720ng/ml之后进行2倍倍比稀释即360、180、90、45、0ng/ml，另将待检样品如实施例1制备的PRVgC2、PRVgC3、PRVgC4、PRVgC5用样品稀释液稀释1:100-1:200，将标准品系列稀释液、待检样品稀释液同时按100μl/孔加入微孔板中，封板并置37℃温育45-90分钟或室温孵育60分钟；
②弃反应液，用洗涤液洗涤2-4次，拍干或抽干；
③将稀释后的酶标抗体按100μl/孔加入后封板并置37℃温育30-45分钟或室温孵育45分钟；
④弃反应液，用洗涤液洗涤2-4次，拍干或抽干；
⑤加显色液A液、B液各50μl/孔，置37℃温育10分钟或室温孵育15分钟；
⑥加终止液50μl/孔，10分钟内用酶标仪读吸光度值OD450nm；
⑦根据标准品系列稀释液的吸光度值绘制标准曲线，计算待检样品中PRVgC蛋白相应的含量。
4.4ELISA试剂盒的优化
将一个单克隆抗体按照0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.15、0.1、0.075、0.05、0.0375、0.025、0.01875μg/mL 12个梯度纵向包被微孔板；将另一抗体酶标后按照1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000 7个梯度稀释后，对2μg/mL的实施例1制备的PRVgC1进行夹心ELISA检测。选择P/N即样品值/阴性值最高孔所对应的抗体浓度，分别作为包被抗体及酶标抗体最佳工作浓度。按此试验方案分别建立以鼠单克隆抗体1F2为包被抗体与酶标抗体1B9配对的检测方法，及以鼠单克隆抗体1B9为包被抗体与酶标抗体1F2配对的检测方法，分别检测梯度稀释的gC蛋白样品，以蛋白浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，绘制曲线，计算双抗体夹心ELISA的线性范围及相关系数。选择线性范围大且相关系数高的配对方式，作为最优配对，以实现对抗原的准确检测。
结果：试剂盒1，以鼠单克隆抗体1F2为包被抗体且包被浓度为0.05-0.15μg/mL，鼠单克隆抗体1B9酶标后做为酶标抗体(1:1500-1:9000)的配对方式，检测的线性范围大(0-720ng/mL)且相关系数高(≥99％)；而试剂盒2，以1B9为包被抗体(0.5μg/ml)为包被抗体，1F2酶标后做为酶标抗体(1:4000)的配对方式，线性范围为0-180ng/ml，相关系数为96％左右。从检测线性范围宽及节省原材料的角度，故选择试剂盒1进行后续试验。
4.5ELISA试剂盒的应用
样品稀释液中分别添加实施例1制备的PRVgC1蛋白400、250、120ng/ml进行加标回收试验，按实施例4.3所述方法进行重复检测各5次。
结果：根据标准品系列稀释液的吸光度值绘制标准曲线为y＝0.0042x-0.0082,R2＝0.9967；根据PRVgC1稀释液400、250、120ng/ml对应的OD450nm值，计算各自的加标回收率及变异系数，见表7。
表7抗原加标回收试验结果
由表7可知：本试剂盒及方法准确度高、重复性好，可用于实际样品的检测。故对将实施例1制备的PRVgC2、PRVgC3、PRVgC4、PRVgC5用样品稀释液稀释1:100-1:200，按实施例4.3所述方法对进行定量检测，结果：PRVgC2、PRVgC3、PRVgC4、PRVgC5中相应的PRVgC蛋白部分的含量分别为5.486、7.802、2.341、3.908μg/ml，可根据此结果准确配苗用于动物免疫。
以上所述的实施例仅为本发明的较佳实施例，仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
<110> 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司
<120> 伪狂犬病病毒gC蛋白抗体、含该抗体的试剂盒及应用
<130> 2017
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
<213> 鼠单克隆抗体1B9重链可变区核苷酸序列
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<213> 鼠单克隆抗体1B9重链可变区氨基酸序列
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val
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Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Asn Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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<212> DNA
<213> 鼠单克隆抗体1B9轻链可变区核苷酸序列
<400> 3
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
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<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 鼠单克隆抗体1F2轻链可变区氨基酸序列
<400> 8
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Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
Claims (19)
1.特异性结合伪狂犬病病毒gC蛋白的鼠单克隆抗体的可变区序列，其为鼠单克隆抗体1B9的可变区序列或鼠单克隆抗体1F2的可变区序列；
在所述鼠单克隆抗体1B9的可变区序列中，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；
在所述鼠单克隆抗体1F2的可变区序列中，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。
2.伪狂犬病病毒gC蛋白抗体，其由权利要求1中所述鼠单克隆抗体1B9的可变区序列中的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列组成或由权利要求1中所述鼠单克隆抗体1F2的可变区序列中的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸 序列组成；所述伪狂犬病病毒gC蛋白抗体仍保持特异性结合伪狂犬病病毒的能力；所述伪狂犬病病毒gC蛋白抗体为单克隆抗体或基因工程抗体。
3.根据权利要求2所述的伪狂犬病病毒gC蛋白抗体，其特征在于，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体、猪源单克隆抗体。
4.根据权利要求2所述的伪狂犬病病毒gC蛋白抗体，其特征在于，所述伪狂犬病病毒gC蛋白抗体为重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的鼠单克隆抗体1B9或重链可变区氨基酸序列为SEQID No.6所示的氨基酸序列，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.8所示的氨基酸序列的鼠单克隆抗体1F2。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的伪狂犬病病毒gC蛋白抗体在用于进行非诊断目的的伪狂犬病病毒检测中的应用，所述伪狂犬病病毒的毒株选自HN1201、FA和MA中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述非诊断目的的伪狂犬病病毒检测包括流行病学分析、对离体组织进行检测、表位鉴定研究、疫苗半成品及成品检验，以及定性和定量鉴别检验含伪狂犬病病毒抗原和其他抗原的疫苗组合物中的伪狂犬病病毒抗原的检测。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，采用免疫组化的方法进行非诊断目的的伪狂犬病病毒检测。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述免疫组化的方法采用权利要求4中所述的鼠单克隆抗体1F2为一抗。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述一抗使用时作1:50-1:1000稀释。
10.一种ELISA试剂盒，其包括权利要求2-4中任一项所述伪狂犬病病毒gC蛋白抗体、伪狂犬病病毒gC蛋白标准品，以及用于对抗原抗体反应进行检测的检测试剂。
11.根据权利要求10所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述伪狂犬病病毒gC蛋白抗体包括权利要求4所述鼠单克隆抗体1B9和鼠单克隆抗体1F2，并且所述鼠单克隆抗体1B9和鼠单克隆抗体1F2中的一种包被在微孔板上，另一种被标记物标记；
所述检测试剂为与所述标记物发生颜色反应的底物。
12.根据权利要求11所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述标记物包括酶、荧光基团或化学发光基团。
13.根据权利要求11所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括酶显色试剂、荧光试剂或化学发光试剂。
14.根据权利要求11所述的ELISA试剂盒，其包括酶标记的鼠单克隆抗体1B9、用于包被微孔板的鼠单克隆抗体1F2和伪狂犬病病毒gC蛋白标准品。
15.根据权利要求14所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述鼠单克隆抗体1F2的包被量为0.075-0.15μg/ml；所述酶标记的鼠单克隆抗体1B9使用时进行1:(1500-9000)的体积稀释。
16.利用权利要求10-15中任一项所述的ELISA试剂盒非诊断目的地检测伪狂犬病病毒gC蛋白的含量的方法，其包括：
步骤S1，将标准品系列稀释液、待检样品稀释液同时加入微孔板中，孵育；
步骤S2，弃反应液；
步骤S3，将稀释后的酶标抗体微孔板孵育；
步骤S4，弃反应液；
步骤S5，加显色液，孵育；
步骤S6，加终止液，并用酶标仪测吸光度值OD450nm；
步骤S7，根据标准品系列稀释液的吸光度值绘制标准曲线，计算待检样品中伪狂犬病病毒gC蛋白相应的含量。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述标准品系列稀释液通过将标准品用样品稀释液稀释为0-720ng/ml。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述标准品系列稀释液稀释为0-360ng/ml。
19.一种如权利要求10-15中任一项所述的ELISA试剂盒非诊断目的地在定量检测伪狂犬病病毒gC蛋白全蛋白单独表达，或与其它蛋白串联表达或融合表达时的伪狂犬病病毒gC蛋白的含量中的应用。
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