CN113861284A

CN113861284A - 猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN113861284A
Application number: CN202010621361.3A
Authority: CN
Inventors: 田克恭; 王莹; 谭菲菲
Original assignee: Luoyang Pu Tai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Luoyang Pu Tai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2021-12-31
Anticipated expiration: 2040-06-30
Also published as: CN113861284B

Abstract

本发明提供了伪狂犬病病毒单克隆抗体及单链抗体，以及含该单克隆抗体的疫苗组合物及其应用。该单克隆抗体对伪狂犬病病毒临床毒株(含变异株、经典株)的中和效价明显高于早期疫苗株的，可用于伪狂犬病病毒gD蛋白结构解析、中和活性位点、表位鉴定研究、变异株制备疫苗免疫后产生高滴度中和抗体的研究。含该单克隆抗体的疫苗组合物可用于制备预防和/或治疗猪伪狂犬病和犬伪狂犬病相关疫病的药物中的应用。

Description

猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体及其应用。

背景技术

伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科(Herpesviridae)α亚科中的猪疱疹病毒I型(Suid herpesvirus 1strain，亦称伪狂犬病病毒Pseudorabies virus，PRV)所引起的猪、牛、羊、犬、猫、兔、鼠、野猪、貂、熊和狐等多种家畜、野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疾病之一，可引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊胎，仔猪出现神经症状、麻痹、特别地20周龄内感染后100％死亡率，以及大中猪呼吸道症状等。

目前市售的疫苗厂家有40多个，为了更准确比较免疫效果，郭天成等(猪伪狂犬病毒Bartha株与变异株疫苗免疫后中和效价比较试验,广东畜牧兽医科技,2017,42(4):46-47)采用中和试验对疫苗免疫后的猪只进行中和抗体效价的量化检测，结果发现PRV变异株疫苗免疫即使免疫次数少于原有Bartha株疫苗但免疫后的中和效价依然明显高于原有Bartha株疫苗。免疫机理尚不清楚，无法为后期疫苗改进及相应诊断试剂产品的制备提供研发思路。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于制备一种猪伪狂犬病病毒单克隆抗体，该单克隆抗体对疫苗株和经典株、变异株的中和活性存在显著差异。

本发明涉及一种特异性结合伪狂犬病病毒gD蛋白的单克隆抗体5F6的可变区，所述可变区包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ ID No.1所示核苷酸序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述轻链可变区为SEQ ID No.2所示核苷酸序列或其煎饼序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。

本发明还涉及一种特异性结合伪狂犬病病毒gD蛋白的抗体或其片段，所述抗体或其片段的重链可变区为SEQ.ID No.1所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或其片段的轻链可变区为SEQ.ID No.2所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。

作为本发明的一种实施方式，所述抗体或其片段为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体；所述抗体或其片段仍保持特异性结合猪伪狂犬病病毒gD蛋白的能力。

作为本发明的一种实施方式，所述抗体或其片段为鼠源单克隆抗体5F6，所述鼠源单克隆抗体5F6重链可变区为SEQ ID No.1所示核苷酸序列编码、轻链可变区为SEQ IDNo.2所示核苷酸序列编码。

所述单克隆抗体5F6特异性结合伪狂犬病病毒gD蛋白，对PRV变异株、经典株、早期疫苗株的IFA效价≥1∶6400，ELISA效价≥1∶512000，表明与PRV不同类型的毒株均呈现良好的反应性；与猪源其它病毒均不反应，且仅与猪伪狂犬病病毒gD蛋白发生特异性反应；对PRV临床毒株(含变异株、经典株)的中和效价明显高于疫苗株的，具有显著性差异。

作为本发明的一种实施方式，所述抗体或其片段为单链抗体5F6，所述单链抗体5F6重链可变区为SEQ ID No.1所示核苷酸序列编码、轻链可变区为SEQ ID No.2所示核苷酸序列编码。

所述单链抗体5F6特异性结合伪狂犬病病毒gD蛋白，对PRV变异株、经典株、早期疫苗株的IFA效价≥1∶3200，表明与PRV不同类型的毒株均呈现良好的反应性；对PRV临床毒株(含变异株、经典株)的中和效价明显高于疫苗株的，具有显著性差异。

本发明还涉及一种杂交瘤细胞5F6株，所述杂交瘤细胞5F6株分泌所述鼠源单克隆抗体5F6。

本发明还涉及所述抗体或其片段的应用，所述应用包括伪狂犬病病毒gD蛋白结构解析、中和活性位点、表位鉴定研究、变异株制备疫苗免疫后产生高滴度中和抗体的研究。

作为本发明的一种实施方式，所述应用中所述抗体或其片段为所述单克隆抗体5F6或所述单链抗体5F6。

所述单克隆抗体5F6识别PRVgD蛋白的位点位于101～200AA(其氨基酸序列详见SEQ ID No.3)，进一步位于130～170AA(其氨基酸序列详见SEQ ID No.4)，进一步位于130～149AA(其氨基酸序列详见SEQ ID No.5)。

本发明制备的单克隆抗体、单链抗体对猪伪狂犬病病毒临床株(包括经典株、变异株)的中和效价明显高于早期疫苗株的，可用于PRVgD蛋白结构解析、中和活性位点、表位鉴定研究、变异株制备疫苗免疫后产生高滴度中和抗体的研究。

本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的所述抗体或其片段，以及药学上可接受的载体。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物包含免疫量的所述单克隆抗体5F6和/或所述单链抗体5F6，以及药学上可接受的载体。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物包括免疫量的所述单克隆抗体5F6的重链可变区和轻链可变区序列制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物经肌肉注射或皮下注射给药。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物包括但不限于注射液。

本发明的疫苗组合物还可进一步包含其他病毒抗原，在针对感染伪狂犬病毒的不同动物中，与其他感染该动物的抗原共同施用，通过一步免疫同时预防和治疗多种病原导致的感染或疾病。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物进一步含有感染猪的病原抗原，所述其他感染猪的病原抗原包括猪瘟病毒抗原、猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪链球菌抗原、猪流感病毒抗原、猪传染性胸膜肺炎抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、猪波氏杆菌抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、猪细小病毒抗原和猪乙型脑炎病毒抗原中的一种或多种。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物进一步含有感染犬的病原抗原，所述其他感染犬的病原抗原包括犬细小病毒抗原、犬瘟热病毒抗原、犬腺病毒I型抗原、犬腺病毒II型抗原、犬钩端螺旋体抗原、犬冠状病毒抗原、犬副流感病毒抗原、狂犬病病毒抗原、犬流感病毒抗原、犬呼肠病毒抗原、犬轮状病毒抗原、犬疱疹病毒抗原、犬病毒性乳头瘤病毒抗原、犬极细小病毒抗原、犬腮腺炎病毒抗原、犬淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒抗原和支气管败血波氏杆菌抗原中的一种或多种；优选地，所述其他感染犬的病原抗原为犬细小病毒抗原、犬瘟热病毒抗原、犬冠状病毒抗原、犬副流感病毒抗原、犬腺病毒I型抗原、犬腺病毒II型抗原、犬钩端螺旋体抗原、狂犬病病毒抗原和犬流感病毒抗原中的一种或多种。

本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗伪狂犬病病毒感染相关疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，所述伪狂犬病病毒感染相关疾病包括猪伪狂犬病病毒经典株导致的伪狂犬病和猪伪狂犬病病毒变异株导致的伪狂犬病。

作为本发明的一种实施方式，所述伪狂犬病病毒感染相关疾病包括猪伪狂犬病和犬伪狂犬病。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体5F6的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病病毒感染相关疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体5F6的重链可变区和轻链可变区序列制备的单链抗体的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病病毒感染相关疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体5F6的疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬伪狂犬病病毒感染相关疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体5F6的重链可变区和轻链可变区序列制备的单链抗体的疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬伪狂犬病病毒感染相关疾病的药物中的应用。

本发明制备的单克隆抗体5F6对经典株、变异株的中和活性明显高于对原有疫苗株的中和活性，可用于中和表位机理研究等，还可用于制备预防和/治疗伪狂犬病的疫苗，弥补了现有疫苗的不足；该疫苗能够对伪狂犬病病毒经典株和变异株有效中和，可以预防和治疗伪狂犬病病毒经典株和变异株导致的伪狂犬病；该疫苗具有广谱性的特点，应用对象不受动物种属的限制，其预防和治疗效力在猪、犬的动物实验上显示，效果优良。

具体实施方式

术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区，参见EP.A.184187，GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成核苷酸序列或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。

术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体，而仍能够保持与猫杯状病毒特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。

术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地，多肽的保守性变异体之氨基酸序列不同于母本多肽，但是差异是有限的，以使与母本多肽之序列与保守性变异体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列上的差异可以是例如：一个或多个氨基酸残基及其任意组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生，或者它可以是非自然产生的变异体。多肽之非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而产生。

术语“猪伪狂犬病病毒gD蛋白”又称“猪伪狂犬病病毒gD糖蛋白”，是猪伪狂犬病病毒进行感染必需的结构蛋白，是成熟的病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，也称为“gp50蛋白”。

术语“中和活性”是指中和抗体具有中和病毒的作用，其中“中和抗体”在本文以最广义使用，指的是抑制伪狂犬病病毒重复感染靶细胞的任何抗体，而不管实现中和的机制。因而，举例来说，可通过抑制病毒附着或粘附到细胞表面来实现中和，例如通过设计抗体，所述抗体直接结合到，或者接近于，负责病毒附着或粘附的位点，还可以通过定向到病毒体(Virion)表面的抗体来实现中和，其导致病毒体的聚集，可通过抑制病毒附着到靶细胞以后病毒和细胞膜融合，通过抑制胞吞作用(endocytosis)抑制来自受感染的子代病毒等，进一步发生中和。本发明的中和抗体不受限于实现中和的机制。

术语“免疫量”当理解为“预防有效量”时，是指能够在接种的个体中足以引发免疫保护反应的量。本领域技术人员知晓，所述“预防有效量”随免疫接种的方式、时机、给药对象以及所述单克隆抗体或其片段的不同而不同，结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规范，本领域技术人员应当能够通过有限的试验得出所用单克隆抗体的“预防有效量”；当理解为“治疗有效量”时，是指能够对受试个体产生有效保护以及中和病毒的量。本领域技术人员知晓，所述“治疗有效量”随治疗方案、病程、治疗对象的状况以及所用单克隆抗体或其片段的不同而不同。结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规程，临床技术人员应当能够凭借其经验得出所用单克隆抗体的“治疗有效量”。

术语“药学上可接受的载体”是指不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂。

术语“预防和/或治疗”在涉及伪狂犬病病毒感染时是指抑制伪狂犬病病毒的复制、抑制伪狂犬病病毒的传播或防止伪狂犬病病毒在其宿主体内定居，以及减轻伪狂犬病病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

术语“猪伪狂犬病”感染猪后以妊娠母猪流产、产死胎、弱胎和木乃伊胎，青年猪的呼吸道疾病，新生仔猪发热、神经症状、衰竭死亡为特征。

术语“猪”是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物，如猪。

术语“犬伪狂犬病”感染犬后以精神不安、反应迟钝、身体某部奇痒、唾液增多、快速死亡为特征

术语“犬”是指任何属于犬科成员的动物，如犬。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用的磷酸盐缓冲液为pH值7.4的PBS，其1L体积配方为：NaCl8.0g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KH₂PO₄ 0.2g，用超纯水定容至1L，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1前期猪伪狂犬病病毒单克隆抗体的制备、纯化及鉴定

将前期制备的猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体5株(3G1、3B6、4A5、4D9、5G7，详见中国专利CN109206509A)、猪伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体1株(1H1，详见中国专利CN106188280A)、猪伪狂犬病病毒gC蛋白单克隆抗体4株(1B9、1F2、3D4、4C7，详见中国专利CN109212205A)分别用猪伪狂犬病病毒变异株HN1201株(PRV HN1201株保藏号为CCTCCNO.V201311，参见专利CN104004774A)、经典株Fa株(购自中国兽医药品监察所)、疫苗株Bartha株分别进行中和试验，结果：仅单克隆抗体5G7、1H1对PRV三种类型的毒株均具有非补体依赖性中和活性，且中和效价无明显差别；其它对PRV三种类型的毒株均不具有非补体依赖性的中和活性。目前这些PRV的单克隆抗体无法阐述原有疫苗株及后期变异株制备的疫苗株免疫猪只后产生中和抗体显著差异的机理。

另外，本发明研发团队所做的大量实验研究发现：猪伪狂犬变异毒株gB、gC的中和抗体都不是很高，gD的中和效价有1∶20多，gD蛋白是最重要的免疫保护相关性蛋白，更能反应出打苗之后的免疫情况，可以更准确的制定免疫程序(https://www.zgyz001.com/news/enterprise_news/123390.html)。基于此，本发明人着重进行猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体的制备，特别是可以识别PRVgD蛋白中和表位位点的单克隆抗体的制备。

实施例2猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体的制备、纯化及鉴定

2.1 猪伪狂犬病病毒gD蛋白的制备及鉴定

在生长良好的PK15细胞上接种PRV HN1201病毒或其不同代次的培养物，收集病毒液，少量用于提取PRV基因组DNA并按专利CN105251000A制备PRVgD蛋白，用SDS-PAGE光密度法测定PRVgD蛋白(简称PRVgD1)的含量为200μg/ml。

2.2 PRVgD蛋白单克隆抗体的制备和纯化

首先，将PRV HN1201株病毒液经甲醛灭活后与弗氏佐剂等体积乳化后免疫小鼠10只，隔2周免1次，用实施例1.1制备的PRV HN1201株制备的间接免疫荧光(IFA)抗原板对3-6次免疫后的小鼠血清进行IFA持续检测，结果：各组小鼠血清IFA效价均≤1∶640，任选1只按Harlow E等(Harlow E,Lane D.Antibodies:a laboratory manual.New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press.1998,139-312)文献的操作方法进行细胞融合，融合后阳性率为0，放弃。

其次，将PRV HN1201株病毒液经甲醛灭活与弗氏佐剂等体积乳化后首次免疫小鼠20只，2周后将PRVgD蛋白与弗氏佐剂等体积乳化第2次免疫，如此反复免疫3轮。免疫第2轮后，每次免后9天对20只小鼠采血并用以实施例1制备的PRVgD蛋白包被的ELISA方法对血清持续进行ELISA检测。将小鼠血清免疫4-6次后ELISA效价有上升趋势且ELISA效价≥1∶12800的仅2只小鼠进行细胞融合，用ELISA对其进行有限稀释法亚克隆筛选，获得6株阳性杂交瘤细胞，阳性率仅为2％。将PRV HN1201株感染的PK-15细胞包被于微孔板，经间接免疫荧光IFA评价6株阳性杂交瘤细胞上清，发现1株有非特异性吸附故舍弃，获得5株阳性杂交瘤细胞(3G1、3B6、4A5、4D9、5G7)。将5株杂交瘤细胞制备腹水后进行中和效价测定，结果：仅单克隆抗体5G7对PRV三种类型的毒株均具有非补体依赖性的中和活性，且中和效价无明显差别，其余均无非补体依赖性的中和活性。

再次，将制备的PRVgD蛋白与弗氏佐剂等体积乳化后首次免疫小鼠30只，2周后将PRVgD蛋白与弗氏佐剂等体积乳化第2次免疫，如此反复免疫3轮。免疫第2轮后，每次免后9天对30只小鼠采血并用PRV变异株HN1201株制备的间接免疫荧光抗原板(即IFA抗原板)方法对血清持续进行IFA检测。结果：小鼠血清免疫4-6次后IFA效价有上升趋势且IFA效价≥1∶6400的仅1只小鼠，并将其小鼠血清用PRVgD蛋白包被的ELISA板进行ELISA检测，结果：仅1只小鼠血清的ELISA效价≥1∶128000。将该小鼠进行细胞融合，用IFA对其进行有限稀释法亚克隆筛选，获得15株阳性杂交瘤细胞，阳性率仅为2％。

收集15株阳性杂交瘤细胞的上清，用经典株Fa株、疫苗株Bartha株(购自)制备的间接免疫荧光抗原板(即IFA抗原板)，结果：仅有10株(株号依次为：1G2、2A7、2F5、2G10、3C5、3E6、3H3、4B2、4H5、5F6)杂交瘤细胞与PRV变异株、经典株、疫苗株均呈现良好的反应(IFA效价均≥1∶8)，其余5株杂交瘤细胞与PRV经典株或疫苗株反应较弱(IFA效价均＜1∶2)，舍弃。

将10株阳性杂交瘤细胞分别制备小鼠腹水，用辛酸-硫酸铵联合沉淀法纯化，再用SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定，结果：10株单克隆抗体的纯度均不低于85％；用BCA蛋白定量试剂盒按照说明书分别进行定量分析，结果：10株单克隆抗体的蛋白含量均不低于2.0mg/ml。

2.3 猪伪狂犬病病毒单克隆抗体中和效价的测定

按《中国兽药典》2015版所述固定病毒稀释血清法测定10株单克隆抗体的中和效价，先将单克隆抗体的不同稀释倍数(1:1V/V-1:2048V/V)与PK15细胞于37℃、5％CO₂条件下孵育1小时，分别加入PRV疫苗株Bartha株、经典株Fa株及变异株HN1201株病毒稀释液(均含100TCID₅₀/ml)，置37℃、5％CO₂条件下培养72-120小时观察细胞病变，并计算中和效价，结果见表1。

表1 10株单克隆抗体中和效价结果汇总

结果显示：仅单克隆抗体5F6与PRV不同类型(疫苗株、经典株、变异株)的毒株均有中和反应，但该中和活性与单克隆抗体5G7的反应结果不一样，对疫苗株的中和效价明显低，对临床毒株(经典株、HN1201株)的中和效价明显高(比对疫苗株的至少高448倍)。进一步可将单克隆抗体5F6用于PRVgD蛋白结构解析、中和活性位点以及变异株制备疫苗免疫后产生高滴度中和抗体产生的研究。

2.4 猪伪狂犬病病毒单克隆抗体5F6的评价

2.4.1 单克隆抗体亚型的鉴定

用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对单克隆抗体5F6的亚型进行鉴定。结果：单克隆抗体5F6的重链亚型为IgG1，轻链类型均为kappa。

2.4.2 特异性鉴定

将猪瘟病毒CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV、猪圆环病毒2型PCV2、猪细小病毒PPV、猪伪狂犬病病毒PRV、猪流行性腹泻病毒PEDV、猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪轮状病毒PRoV及培养PRV用PK15细胞分别固定于微孔板中，将单克隆抗体5F6腹水作为一抗，将荧光标记兔抗鼠二抗作为二抗，按照间接免疫荧光方法IFA进行检测，结果：单克隆抗体5F6仅与PRV反应，而不与其它猪常见病及培养用细胞发生交叉反应。

将PRVgBΔ148～546蛋白、PRVgB蛋白(按照专利CN10563827A制备)，PRVgC蛋白(按照专利CN104004774A所示PRVgC序列通过杆状病毒载体表达而成)，以及实施例2.1制备的PRVgD蛋白，分别包被于微孔板中，将单克隆抗体5F6腹水作为一抗，将酶标羊抗鼠二抗作为二抗，按ELISA进行检测，结果：单克隆抗体5F6仅与PRVgD蛋白反应，而不与PRV其它蛋白反应。表明：单克隆抗体5F6为PRVgD蛋白的特异性单克隆抗体。

2.4.3 IFA评价

用检测免疫荧光(IFA)方法对单克隆抗体5F6进行效价测定。IFA检测方法：培养贴壁PK-15细胞，按照病毒感染复数MOI为0.005～0.1剂量分别接入含PRV HN1201株、Fa株、Ma株、Bartha株的毒种，同时设健康细胞对照孔，37℃、5％CO₂条件下培养48～72小时后，弃上清；用80％的丙酮溶液于2～8℃固定30min，PBS洗3次，病毒接种孔和细胞对照孔分别加入100μl 1︰100稀释后再2倍倍比稀释的单克隆抗体5F6，同时用PRV小鼠阳性血清加入病毒接种孔作阳性对照，37℃作用60分钟；用PBS洗3次并扣干；加入1︰500稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃作用60分钟；用PBS洗3次并扣干；加入50μl PBS后于荧光显微镜下观察。IFA效价判定：以可观察到黄绿色荧光的接毒细胞板孔对应的抗体最大稀释度作为抗体的IFA效价。

结果：单克隆抗体5F6对PRV HN1201株、Fa株、Ma株、Bartha株的IFA效价依次为1∶12800、1∶6400、1∶6400、1∶6400。

2.4.4 ELISA效价

将PRVgD蛋白按100ng/孔、100μl孔包被于ELISA板，将单克隆抗体5F6用磷酸盐缓冲液进行100倍稀释后再进行2倍倍比稀释作为一抗于37℃孵育1小时，洗涤后加入酶标记的羊抗鼠IgG于37℃孵育30分钟，洗涤后加入底物显色，终止后于酶标仪上读取OD_450nm值，进行间接ELISA反应，并将单克隆抗体5G7作为阳性对照。结果：单克隆抗体的ELISA效价为1∶512000。

2.4.5可变区测序

根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：

P1：5’

-ACTAGTCGACATGAAATGCTCGTGGRTYATSAACTT-3’

P2：5’-ACTAGTCGACATGAAATGCAGCTGGRTYAT-3’

设计轻链可变区引物序列：

P3：5’-ACTAGTCGACATGGTYGTYATVTCCTTGCT-3’

P4：5’

-ACTAGTCGACATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKW-3’

培养并收集杂交瘤细胞5F6，提取RNA后反转录作为模板，用上述引物对其可变区序列进行扩增，将扩增产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。结果：单克隆抗体5F6的重链可变区、轻链可变区的核苷酸序列分别如SEQ.ID No.1、SEQ.ID No.2所示。

实施例3单克隆抗体5F6识别抗原表位的鉴定

3.1 PRVgD蛋白中和表位位点的初步鉴定

根据PRV HN1201株(NCBI登录号：KP722022.1)gD蛋白、Bartha株(NCBI登录号：JF797217.1)gD蛋白的核苷酸序列编码的氨基酸序列设计成多肽(见表2)，将各肽段直接交由金斯瑞生物科技有限公司合成并用碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)稀释后按500ng/孔、100μl孔包被于ELISA板，封闭、干燥后将单克隆抗体5F6、5G7、1H1、3B6用磷酸盐缓冲液分别稀释100倍后作为一抗于37℃孵育1小时，洗涤后加入酶标记的羊抗鼠IgG于37℃孵育30分钟，洗涤后加入底物显色，终止后于酶标仪上读取OD_450nm值，以进行间接ELISA反应。同时，将实施例2.1制备的PRVgD蛋白按100ng/孔、100μl孔包被于ELISA板，将单克隆抗体5F6、5G7、1H1、3B6用磷酸盐缓冲液分别稀释16000倍后作为一抗进行间接ELISA反应，作为对照。结果(见表2)：初步表明单克隆抗体5F6识别PRVgD蛋白的抗原位点位于101～200AA，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

表2 PRVgD蛋白肽段与单克隆抗体反应结果汇总(OD值)

注：AA表示氨基酸。

3.2 PRVgD蛋白中和表位位点的进一步鉴定

根据PRV HN1201株(NCBI登录号：KP722022.1)gD蛋白、Bartha株(NCBI登录号：JF797217.1)gD蛋白的核苷酸序列编码的氨基酸序列设计成多肽，将101～200AA处分3个肽段(见表3)直接交由金斯瑞生物科技有限公司合成，并用碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)稀释后按500ng/孔、100μl孔包被于ELISA板，将单克隆抗体5F6、5G7、1H1、3B6用磷酸盐缓冲液分别稀释100倍后作为一抗进行间接ELISA反应。同时，将实施例4.1制备的PRVgD蛋白肽段101～200AA作为对照。结果(见表3)：进一步判定单克隆抗体5F6识别PRVgD蛋白的抗原位点位于130～170AA，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

表3 PRVgD蛋白肽段与单克隆抗体反应结果汇总(OD值)

注：AA表示氨基酸。

3.3 PRVgD蛋白中和表位位点的再次鉴定

根据PRV HN1201株(NCBI登录号：KP722022.1)gD蛋白、Bartha株(NCBI登录号：JF797217.1)gD蛋白的核苷酸序列编码的氨基酸序列设计成多肽，将130～170AA处分2个肽段(见表4)直接交由金斯瑞生物科技有限公司合成，并用碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)稀释后按500ng/孔、100μl孔包被于ELISA板，将单克隆抗体5F6、5G7、1H1、3B6用磷酸盐缓冲液分别稀释100倍后作为一抗进行间接ELISA反应。同时，将实施例4.1制备的PRVgD蛋白肽段101～200AA作为阳性对照。结果(见表4)：可判定单克隆抗体5F6识别PRVgD蛋白的抗原位点位于130～149AA，氨基酸序列如SEQ ID No.5所示上。

表4 PRVgD蛋白肽段与单克隆抗体反应结果汇总(OD值)

注：AA表示氨基酸。

实施例4基因工程抗体的制备及应用

将实施例2.4中的单克隆抗体的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因序列分别进行扩增，移入连接肽后，连接至原核表达pET-32a+，构建重组质粒pET-32a-5F6-ScFv，转化BL21进行表达，获得含单链抗体5F6的融合蛋白。

按实施例2.4.3所述IFA方法评价单链抗体5F6的IFA效价，结果：单链抗体5F6对HN1201株、Fa株、Ma株、Bartha株的IFA效价依次为1∶6400、1∶3200、1∶3200、1∶3200，均≥1∶3200。

按实施例所述中和试验方法评价单链抗体5F6的中和活性，结果：单链抗体5F6对HN1201株、Fa株、Ma株、Bartha株的中和效价依次为1∶1122、1∶708、1∶708、1∶1.58。

将实施例3制备的PRVgD蛋白的肽段包被的ELISA板与单链抗体5F6 100倍的稀释液作为一抗进行间接ELISA反应，结果：仅PRVgD蛋白肽段130～149AA反应呈阳性(OD值为0.609)，其余均为阴性。以上结果显示SEQ.ID No.1、SEQ.ID No.2可用于猪伪狂犬病病毒基因工程抗体的制备，可对不同类型的猪伪狂犬病病毒毒株呈现良好的反应性，可对不同类型的猪伪狂犬病病毒毒株呈现差异性的中和活性。

实施例5单克隆抗体5F6预防和治疗猪伪狂犬病的应用

5.1 单克隆抗体5F6预防猪伪狂犬病效果评价

筛选PRV抗原、抗体双阴性的1-3日龄仔猪20头，随机分为4组，第1组、第3组肌肉注射实施例1中制备的单克隆抗体5F6 2ml，第2组、第4组分别肌肉注射PBS缓冲液2ml；注射24小时后第1、2组动物同时滴鼻接种实施例1制备的猪伪狂犬病病毒HN1201株1ml(10^7.0TCID₅₀/ml)，第3、4组动物同时滴鼻接种实施例1制备的猪伪狂犬病病毒Fa株1ml(10^7.0TCID₅₀/ml)，每日观察仔猪的临床症状，连续观察14天，通过临床发病率、发病程度、死亡率及采用PCR方法检测鼻拭子中的病毒监测排毒天数来评价单克隆抗体5F6的预防猪伪狂犬病的效果，结果见表5。

表5 单克隆抗体5F6预防猪感染PRV的试验结果

5.2 单克隆抗体5F6治疗猪伪狂犬病效果评价

筛选PRV抗原、抗体双阴性的1-3日龄仔猪20头，随机分为4组(第5-8组)，第5-6组均分别通过滴鼻接种实施例1制备的猪伪狂犬病病毒HN1201株1ml(10^7.0TCID₅₀/ml)，第7-8组均分别通过滴鼻接种实施例1制备的猪伪狂犬病病毒Fa株1ml(10^7.0TCID₅₀/ml)，接种后12小时第5组、第7组分别肌肉注射实施例1制备的单克隆抗体5F62ml进行治疗，第6组、第8组分别肌肉注射PBS 2ml，每日观察仔猪的临床症状，连续观察14天，通过临床发病率、发病程度、死亡率及采用PCR方法检测鼻拭子中的病毒来监测排毒天数，从而评价单克隆抗体5F6治疗猪伪狂犬病病毒感染的效果，结果见表6。

表6 单克隆抗体5F6治疗猪感染PRV的试验结果

结果表明，单克隆抗体5F6能够使猪减轻由猪伪狂犬病病毒(经典株、变异株)引起的临床症状，减少死亡率以及减少排毒天数，有很好的预防和/或治疗作用。

实施例6单克隆抗体5F6预防和治疗犬伪狂犬病的应用

6.1 单克隆抗体5F6预防犬伪狂犬病的应用

筛选PRV抗原、抗体双阴性的2月龄中华田园犬20只，随机分为4组，第1组、第3组分别按1ml/kg的剂量肌肉注射实施例1中制备的单克隆抗体5F6，第2组、第4组分别肌肉注射PBS缓冲液1ml/kg；注射后24小时第1-2组动物同时滴鼻分别接种实施例1制备的猪伪狂犬病病毒HN1201株1ml(10^5.0TCID₅₀/ml)，第3-4组动物同时滴鼻分别接种实施例1制备的猪伪狂犬病病毒Fa株1ml(10^5.0TCID₅₀/ml)，每日观察犬的临床症状，连续观察14天，通过临床发病率、发病程度、死亡率及采用PCR方法检测鼻拭子中的病毒监测排毒天数来评价单克隆抗体5F6的预防犬伪狂犬病的效果，结果见表7。

表7 单克隆抗体5F6预防犬感染PRV的试验结果

6.2 单克隆抗体5F6治疗犬伪狂犬病的应用

筛选PRV抗原、抗体双阴性的2月龄中华田园犬20只，随机分为4组(第5-8组)，均分别通过滴鼻接种实施例1制备的猪伪狂犬病病毒HN1201株1ml(10^5.0TCID₅₀/ml)；接种12小时后第5、7组分别按1ml/kg的剂量肌肉注射实施例1制备的单克隆抗体5F6进行治疗。同时，第6、8组分别按1ml/kg肌肉注射PBS，每日观察犬的临床症状，连续观察14天，通过临床发病率、发病程度、死亡率及采用PCR方法检测鼻拭子中的病毒来监测排毒天数，从而评价单克隆抗体5F6治疗犬伪狂犬病病毒感染的效果，结果见表8。

表8 单克隆抗体5F6治疗犬感染PRV的试验结果

结果表明，单克隆抗体5F6能够使犬减轻由猪伪狂犬病病毒(经典株、变异株)引起的临床症状，减少死亡率以及减少排毒天数，有很好的预防和/或治疗作用。

综上所述，根据免疫学原理及单克隆抗体5F6的特性(对经典株、变异株的中和活性明显高于对原有疫苗株的中和活性，这一特性是单克隆抗体5F6是我们累计筛选出的160余株猪伪狂犬病病毒单克隆抗体中唯一呈现该特性的单克隆抗体)，单克隆抗体5F6可进行非诊断目的的猪伪狂犬病病毒检测中的应用，包括PRVgD蛋白结构解析、中和活性位点、表位鉴定研究、变异株制备疫苗免疫后产生高滴度中和抗体的研究。本发明制备的含单克隆抗体5F6的疫苗组合物能够对伪狂犬病病毒经典株和变异株有效中和，可以预防和治疗伪狂犬病病毒经典株和变异株导致的伪狂犬病；该疫苗具有广谱性的特点，应用对象不受动物种属的限制，其预防和治疗效力在猪、犬的动物实验上显示，效果优良。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 洛阳普泰生物技术有限公司

<120> 猪伪狂犬病病毒gD蛋白单克隆抗体及其应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 363

<212> DNA

<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）

<400> 1

gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagaa cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60

tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacttata ttcactgggt gaatcagagg 120

cctgaacagg gcctggagtg gattggaaag attgatcctg cgaatggtaa tactgaatat 180

gacccgaagt tccaggacaa ggccactatc acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240

ctgcagctca ccagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagtcctttc 300

tacggtagta ggggcccctt ctttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360

gca 363

<210> 2

<211> 321

<212> DNA

<213> 杂交瘤细胞（hybridoma）

<400> 2

actattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtat cagcaggaga caggtttacc 60

ataacctgca aggccagtca gagtgtaagt aatgatgtag cttggtacca acagaagcca 120

gggcagtctc ctaaactgct gatatactat gcatccaatc gctacactgg agtccctgat 180

cgcttcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgtgcaggct 240

gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcag gattatagct ctcctccgac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 3

<211> 100

<212> PRT

<213> 猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus）

<400> 3

Ile Ala Asp Gly Cys Ala His Leu Leu Tyr Phe Ile Glu Tyr Ala Asp

1 5 10 15

Cys Asp Pro Arg Gln Ile Phe Gly Arg Cys Arg Arg Arg Thr Thr Pro

20 25 30

Met Trp Trp Thr Pro Ser Ala Asp Tyr Met Phe Pro Thr Glu Asp Glu

35 40 45

Leu Gly Leu Leu Met Val Ala Pro Gly Arg Phe Asn Glu Gly Gln Tyr

50 55 60

Arg Arg Leu Val Ser Val Asp Gly Val Asn Ile Leu Thr Asp Phe Met

65 70 75 80

Val Ala Leu Pro Glu Gly Gln Glu Cys Pro Phe Ala Arg Val Asp Gln

85 90 95

His Arg Thr Tyr

100

<210> 4

<211> 41

<212> PRT

<213> 猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus）

<400> 4

Thr Thr Pro Met Trp Trp Thr Pro Ser Ala Asp Tyr Met Phe Pro Thr

1 5 10 15

Glu Asp Glu Leu Gly Leu Leu Met Val Ala Pro Gly Arg Phe Asn Glu

20 25 30

Gly Gln Tyr Arg Arg Leu Val Ser Val

35 40

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus）

<400> 5

Thr Thr Pro Met Trp Trp Thr Pro Ser Ala Asp Tyr Met Phe Pro Thr

1 5 10 15

Glu Asp Glu Leu

20

Claims

1.一种特异性结合伪狂犬病病毒gD蛋白的单克隆抗体5F6的可变区，所述可变区包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区为SEQ ID No.1所示核苷酸序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述轻链可变区为SEQ ID No.2所示核苷酸序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。

2.一种特异性结合伪狂犬病病毒gD蛋白的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段的重链可变区为SEQ.ID No.1所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或其片段的轻链可变区为SEQ.ID No.2所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；

优选地，所述抗体或其片段为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体；所述抗体或其片段仍保持特异性结合伪狂犬病病毒gD蛋白的能力；

更优选地，所述抗体或其片段为单克隆抗体5F6或单链抗体5F6。

3.一种权利要求2所述抗体或其片段的应用，所述应用包括伪狂犬病病毒gD蛋白结构解析、中和活性位点、表位鉴定研究、变异株制备疫苗免疫后产生高滴度中和抗体的研究。

4.一种杂交瘤细胞5F6株，所述杂交瘤细胞5F6株分泌权利要求2所述单克隆抗体5F6。

5.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的权利要求2所述抗体或其片段，以及药学上可接受的载体。

6.根据权利要求5所述疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的权利要求2所述抗体或其片段，以及药学上可接受的载体。

7.根据权利要求6所述疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物进一步含有其他病原抗原，所述其他病原抗原包括感染猪的病原抗原或感染犬的病原抗原。

8.根据权利要求6所述疫苗组合物，其中，所述其他感染猪的病原抗原包括猪瘟病毒抗原、猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪链球菌抗原、猪流感病毒抗原、猪传染性胸膜肺炎抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、猪波氏杆菌抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、猪细小病毒抗原和猪乙型脑炎病毒抗原中的一种或多种。

9.根据权利要求6所述疫苗组合物，其中，所述其他感染犬的病原抗原包括犬细小病毒抗原、犬瘟热病毒抗原、犬腺病毒I型抗原、犬腺病毒II型抗原、犬钩端螺旋体抗原、犬冠状病毒抗原、犬副流感病毒抗原、狂犬病病毒抗原、犬流感病毒抗原、犬呼肠病毒抗原、犬轮状病毒抗原、犬疱疹病毒抗原、犬病毒性乳头瘤病毒抗原、犬极细小病毒抗原、犬腮腺炎病毒抗原、犬淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒抗原和支气管败血波氏杆菌抗原中的一种或多种；优选地，所述其他感染犬的病原抗原为犬细小病毒抗原、犬瘟热病毒抗原、犬冠状病毒抗原、犬副流感病毒抗原、犬腺病毒I型抗原、犬腺病毒II型抗原、犬钩端螺旋体抗原、狂犬病病毒抗原和犬流感病毒抗原中的一种或多种。

10.根据权利要求5～9任一项所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗伪狂犬病病毒感染相关疾病的药物中的应用；

优选地，所述伪狂犬病病毒感染相关疾病包括猪伪狂犬病病毒经典株导致的伪狂犬病和猪伪狂犬病病毒变异株导致的伪狂犬病；

优选地，所述伪狂犬病病毒感染相关疾病包括猪伪狂犬病和犬伪狂犬病。