CN106188280B - 单克隆抗体、及其疫苗组合物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了抗伪狂犬病病毒单克隆抗体，以及含有该单克隆抗体的疫苗组合物及应用。该单克隆抗体具有很高的中和效价，能对猪伪狂犬病病毒经典株和变异株有效中和，使用含有该单克隆抗体的疫苗组合物具有广谱性的特性，应用对象不受动物种属的限制，其预防和治疗效力在猪、犬的动物实验上显示，效果优良。

Description

单克隆抗体、及其疫苗组合物和应用

技术领域

本发明涉及抗伪狂犬病病毒单克隆抗体及含该单克隆抗体的疫苗组合物和应用，属于生物技术领域。

背景技术

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)，又称Aujeszky氏病，是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的包括家畜和多种野生动物的一种以发热、奇痒及脑脊髓炎为症状的高度接触性、急性传染病。

猪是该病的天然宿主和储存者，该病不仅可引起妊娠母猪的流产，甚至产死胎、弱胎和木乃伊胎，还可引发新生仔猪发热、出现神经症状，甚至衰竭而死，死亡率可达100％。自1902年首次在美国发现以来，猪伪狂犬病已在全球范围内流行，给世界养猪业的健康发展造成了巨大的经济损失，成为严重危害养猪业健康发展的重大传染病之一。目前，预防和/或治疗猪伪狂犬病主要是通过免疫猪伪狂犬病疫苗，但猪伪狂犬病病毒不断发生变异，尤其对于仔猪而言其母源抗体存在干扰，从而导致疫苗免疫失败。

伪狂犬病病毒感染多种家畜和野生动物，其中，犬是除了兔外对该病毒最为敏感的动物，目前犬感染伪狂犬病毒引起的发病和死亡屡有发生，例如刘蕾等在中国畜牧兽医学会小动物医学分会第六次学术研讨会暨中国畜牧兽医学会兽医外科学分会第十八次学术研讨会上报道“关注伪狂犬病患犬，它就在你面前”，公开了犬因为食用患伪狂犬的猪肉而发生伪狂犬病，并且从脑组织中扩增出了目的基因片段。犬感染PRV后潜伏期为3-6天，一旦发病，多在36小时内死亡。至今仍无有效的预防和控制措施或产品。

基于此，亟需研发一种预防和/或治疗该病的疫苗，该疫苗应能适应多种患病动物，其效果不受动物种属的限制。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种抗伪狂犬病病毒单克隆抗体，以及含该单克隆抗体的疫苗组合物和应用。所述疫苗组合物不仅可预防和/或治疗猪伪狂犬病，还可以不分种属地预防和/或治疗犬伪狂犬病。

本发明涉及一种特异性结合伪狂犬病病毒的单克隆抗体的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQID No.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。

本发明还涉及具有上述可变区序列的抗体或抗体的片段，所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合伪狂犬病病毒的能力。

本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的本发明的所述抗体或抗体的片段，以及药学上可接受的载体。

本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗伪狂犬病病毒感染相关疾病的药物中的应用。

本发明制备的单克隆抗体具有较强的中和活性，可用于制备预防和/治疗伪狂犬病的疫苗，弥补了现有疫苗的不足；该疫苗能够对伪狂犬病病毒经典株和变异株有效中和，可以预防和治疗伪狂犬病病毒经典株和变异株导致的伪狂犬病；该疫苗具有广谱性的特点，应用对象不受动物种属的限制，其预防和治疗效力在猪、犬的动物实验上显示，效果优良。

序列表中

SEQ ID No.1为抗伪狂犬病病毒单克隆抗体1H1重链可变区核苷酸序列；

SEQ ID No.2为抗伪狂犬病病毒单克隆抗体1H1重链可变区氨基酸序列；

SEQ ID No.3为抗伪狂犬病病毒单克隆抗体1H1轻链可变区核苷酸序列；

SEQ ID No.4为抗伪狂犬病病毒单克隆抗体1H1轻链可变区氨基酸序列。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、鼠源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、鼠源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区，参见EP.A.184187，GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用基因工程方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。

术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得其活性片段或保守性变异体，而仍能够保持与伪狂犬病病毒特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。

术语“中和活性”是指中和抗体具有中和病毒的作用，其中“中和抗体”在本文以最广义使用，指的是抑制伪狂犬病病毒重复感染靶细胞的任何抗体，而不管实现中和的机制。因而，举例来说，可通过抑制病毒附着或粘附到细胞表面来实现中和，例如通过设计抗体，所述抗体直接结合到，或者接近于，负责病毒附着或粘附的位点，还可以通过定向到病毒体(Virion)表面的抗体来实现中和，其导致病毒体的聚集，可通过抑制病毒附着到靶细胞以后病毒和细胞膜融合，通过抑制胞吞作用(endocytosis)抑制来自受感染的子代病毒等，进一步发生中和。本发明的中和抗体不受限于实现中和的机制。

本发明涉及一种特异性结合伪狂犬病病毒的单克隆抗体的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQID No.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。

本发明还涉及一种由所述单克隆抗体可变区序列中重链可变区序列或其保守性变异体，和/或所述的可变区序列中轻链可变区序列或其保守性变异体组成的抗体；所述抗体可以为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体、猪源单克隆抗体或所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体片段仍保持特异性结合伪狂犬病病毒的能力。

作为本发明的一种实施方式，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNo.2，和轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.4。

作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体1H1，所述单克隆抗体1H1重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2，和轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.4。

作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体1H1，所述单克隆抗体1H1重链可变区的氨基酸序列由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或其简并序列编码，和轻链可变区的氨基酸序列由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列或其简并序列编码。

所述单克隆抗体1H1为抗伪狂犬病病毒单克隆抗体1H1，其对伪狂犬病病毒变异株中和效价达到1︰295.13，对伪狂犬病病毒经典株中和效价达到1︰214.25，具有较强中和病毒的能力。

术语“免疫量”当理解为“预防有效量”时，是指能够在接种的个体中足以引发免疫保护反应的量。本领域技术人员知晓，所述“预防有效量”随免疫接种的方式、时机、给药对象以及所述单克隆抗体或其片段的不同而不同，结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规范，本领域技术人员应当能够通过有限的试验得出所用单克隆抗体的“预防有效量”；当理解为“治疗有效量”时，是指能够对受试个体产生有效保护以及中和病毒的量。本领域技术人员知晓，所述“治疗有效量”随治疗方案、病程、治疗对象的状况以及所用单克隆抗体或其片段的不同而不同。结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规程，临床技术人员应当能够凭借其经验得出所用单克隆抗体的“治疗有效量”。

术语“药学上可接受的载体”是指不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂。

本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的所述抗体或所述抗体的片段，以及药学上可接受的载体。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物包含免疫量的所述单克隆抗体1H1，以及药学上可接受的载体。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物包括免疫量的所述单克隆抗体1H1的重链可变区制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物包括免疫量的所述单克隆抗体1H1的重链可变区和轻链可变区序列制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物经肌肉注射或皮下注射给药。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物包括但不限于注射液。

术语“预防和/或治疗”在涉及伪狂犬病病毒感染时是指抑制伪狂犬病病毒的复制、抑制伪狂犬病病毒的传播或防止伪狂犬病病毒在其宿主体内定居，以及减轻伪狂犬病病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

术语“猪伪狂犬病”感染猪后以妊娠母猪流产、产死胎、弱胎和木乃伊胎，青年猪的呼吸道疾病，新生仔猪发热、神经症状、衰竭死亡为特征。

术语“猪”是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物，如猪。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物进一步含有其他病原抗原，所述其他病原抗原包括感染猪的病原抗原或感染犬的病原抗原。

本发明的疫苗组合物还可进一步包含其他的抗原，在针对感染伪狂犬病毒的不同动物中，与其他感染该动物的抗原共同施用，通过一步免疫同时预防和治疗多种病原导致的感染或疾病。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物进一步含有感染猪的病原抗原，所述其他感染猪的病原抗原包括猪瘟病毒抗原、猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪链球菌抗原、猪流感病毒抗原、猪传染性胸膜肺炎抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、猪波氏杆菌抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪霍乱沙门氏菌抗原、猪细小病毒抗原和猪乙型脑炎病毒抗原中的一种或多种。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物进一步含有感染犬的病原抗原，所述其他感染犬的病原抗原包括犬细小病毒抗原、犬瘟热病毒抗原、犬腺病毒I型抗原、犬腺病毒II型抗原、犬钩端螺旋体抗原、犬冠状病毒抗原、犬副流感病毒抗原、狂犬病病毒抗原、犬流感病毒抗原、犬呼肠病毒抗原、犬轮状病毒抗原、犬疱疹病毒抗原、犬病毒性乳头瘤病毒抗原、犬极细小病毒抗原、犬腮腺炎病毒抗原、犬淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒抗原和支气管败血波氏杆菌抗原中的一种或多种；优选地，所述其他感染犬的病原抗原为犬细小病毒抗原、犬瘟热病毒抗原、犬冠状病毒抗原、犬副流感病毒抗原、犬腺病毒I型抗原、犬腺病毒II型抗原、犬钩端螺旋体抗原、狂犬病病毒抗原和犬流感病毒抗原中的一种或多种。

本发明还涉及所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗伪狂犬病病毒感染相关疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，所述伪狂犬病病毒感染相关疾病包括猪伪狂犬病病毒经典株导致的伪狂犬病和猪伪狂犬病病毒变异株导致的伪狂犬病。

作为本发明的一种实施方式，所述伪狂犬病病毒感染相关疾病包括猪伪狂犬病和犬伪狂犬病。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体1H1的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病病毒感染相关疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体1H1的重链可变区制备的单链抗体的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病病毒感染相关疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体1H1的重链可变区和轻链可变区序列制备的单链抗体的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病病毒感染相关疾病的药物中的应用。

术语“犬伪狂犬病”感染犬后以精神不安、反应迟钝、身体某部奇痒、唾液增多、快速死亡为特征

术语“犬”是指任何属于犬科成员的动物，如犬。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体1H1的疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬伪狂犬病病毒感染相关疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体1H1的重链可变区制备的单链抗体的疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬伪狂犬病病毒感染相关疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体1H1的重链可变区和轻链可变区序列制备的单链抗体的疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬伪狂犬病病毒感染相关疾病的药物中的应用。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1抗猪伪狂犬病病毒单克隆抗体的制备、鉴定及检验

1.1抗猪伪狂犬病病毒单克隆抗体的制备

将猪伪狂犬病病毒HN1201株(参见中国专利CN103923884A)接种BHK21细胞，至细胞病变为85％时收获病毒，-40℃快速冻融一次，3000r/min离心30min，去除细胞碎片后进行灭活，然后按照Harlow E等(Harlow E,Lane D.Antibodies:a laboratory manual.NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1998,139-312)文献的操作方法制备小鼠杂交瘤细胞，该小鼠杂交瘤细胞分泌抗猪伪狂犬病病毒单克隆抗体1H1，通过小鼠腹水生产单克隆抗体的方法制备单克隆抗体。

1.2抗猪伪狂犬病病毒单克隆抗体的鉴定

1.2.1单克隆抗体类型和亚类的鉴定

运用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit(购自Pierce公司)并参照说明书对抗体的亚型进行鉴定。鉴定结果见表1：

表1单克隆抗体类型的鉴定

单克隆抗体

IgA

IgM

IgG3

IgG2b

IgG2a

IgG1

Kappa

Lambda

1H1

-

-

-

-

+

-

+

-

注：+表示阳性反应，-表示阴性反应。

由表1可知，单克隆抗体1H1重链亚型为IgG2a，轻链类型为Kappa。

1.2.2单克隆抗体特异性的鉴定

按照祁小乐(祁小乐，单克隆抗体双夹心ELISA检测伪狂犬病病毒的研究，河南农业大学硕士论文，2004)所提供的方法进行单克隆抗体的特异性鉴定。

测定结果显示：单克隆抗体1H1与其他病毒(PRRSV、HCV、PPV)均不发生反应，仅与猪伪狂犬病病毒发生反应，表明其是抗猪伪狂犬病病毒的特异性单克隆抗体。

1.3单克隆抗体的检验

1.3.1单克隆抗体的外观

室温下，肉眼观察可见单克隆抗体为淡黄色或淡红色液体，未见絮状物沉淀。

1.3.2无菌试验

采用无菌检验法，取纯化后的单克隆抗体原料接种10mL/管的营养琼脂斜面培养基、改良马丁培养基和硫乙醇酸盐培养基各2管(接种量为0.5mL/管)。接种后的硫乙醇酸盐培养基及营养琼脂斜面培养基分别一管置于30-35℃培养，另一管于20-25℃培养。改良马丁培养基置于20-25℃培养。同时以无菌生理盐水同法操作做阴性对照。培养14天后均未观察到培养基中有微生物生长，表明单克隆抗体1H1原料符合无菌要求。

1.3.4单克隆抗体中和效价的测定

参照祁小乐(祁小乐，单克隆抗体双夹心ELISA检测伪狂犬病病毒的研究，河南农业大学硕士论文，2004)所提供的所述中和试验方法，对单克隆抗体1H1进行中和效价的测定。

该单克隆抗体对不同猪伪狂犬病病毒株的体外中和试验结果见表1：

表1单克隆抗体中和试验结果

毒株名称	HN1201株	FA株	MA株
				中和效价	1︰295.13	1︰214.25	1︰100.24

由表1结果可见，单克隆抗体1H1不仅对猪伪狂犬病病毒变异株HN1201株有效中和，且能对猪伪狂犬病病毒经典株FA株、MA株均有效中和。

1.4单克隆抗体1H1可变区序列的测定

根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计1H1重链可变区引物序列：

P1：CGTCGTGGCTGTGATCTCTGTTCYTCTG

P2：CCTCCG RGCATCGGAT ATACTGRTGG

设计1H1轻链可变区引物序列：

P3：ACTTCGACTTCCTYCAATVTTRGTGCTGC

P4：CCCGAATTCACTCCATGTGCCATGTTGA

按照张爱华等(张爱华，闭兰，王志友等.系列鼠抗CD分子单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆和序列分析.中国生物制品学杂志，2001,15(2)：65-68)建立的可变区序列测定方法，通过分子克隆技术分别获得单克隆抗体1H1的可变区序列，选取对应的克隆质粒送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。结果，单克隆抗体1H1的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3所示，由其推导的氨基酸序列分别为SEQID No.2、SEQ ID No.4。

实施例2单克隆抗体1H1预防和治疗猪伪狂犬病的应用

2.1单克隆抗体1H1预防猪伪狂犬病效果评价

筛选PRV抗原、抗体双阴性的1-3日龄仔猪10头，随机分为2组，第一组肌肉注射实施例1中制备的单克隆抗体1H1 2ml，第二组肌肉注射PBS缓冲液2ml，注射24小时后两组动物同时滴鼻接种实施例1制备的猪伪狂犬病病毒HN1201株1ml(10^7.0TCID₅₀/ml)，每日观察仔猪的临床症状，连续观察14天，通过临床发病率、发病程度、死亡率及采用PCR方法检测鼻拭子中的病毒监测排毒天数来评价单克隆抗体1H1的预防猪伪狂犬病的效果，结果见表2。

表2单克隆抗体1H1预防猪感染PRV的试验结果

2.2单克隆抗体1H1治疗猪伪狂犬病效果评价

筛选PRV抗原、抗体双阴性的1-3日龄仔猪10头，随机分为2组(第三-四组)，均分别通过滴鼻接种实施例1制备的猪伪狂犬病病毒HN1201株1ml(10^7.0TCID₅₀/ml)，接种后12小时第三组肌肉注射实施例1制备的单克隆抗体1H1 2ml进行治疗，第四组肌肉注射PBS 2ml，每日观察仔猪的临床症状，连续观察14天，通过临床发病率、发病程度、死亡率及采用PCR方法检测鼻拭子中的病毒来监测排毒天数，从而评价单克隆抗体1H1治疗猪伪狂犬病病毒感染的效果，结果见表3。

表3单克隆抗体1H1治疗猪感染PRV的试验结果

结果表明，单克隆抗体1H1能够使猪减轻由猪伪狂犬病病毒引起的临床症状，减少死亡率以及减少排毒天数，有很好的预防和/或治疗作用。

实施例3单克隆抗体1H1预防和治疗犬伪狂犬病的应用

3.1单克隆抗体1H1预防犬伪狂犬病的应用

筛选PRV抗原、抗体双阴性的2月龄中华田园犬10只，随机分为2组，第一组按1ml/kg的剂量肌肉注射实施例1中制备的单克隆抗体1H1，第二组肌肉注射PBS缓冲液1ml/kg，注射后24小时2组动物同时滴鼻接种实施例1制备的猪伪狂犬病病毒HN1201株1ml(10^5.0TCID₅₀/ml)，每日观察犬的临床症状，连续观察14天，通过临床发病率、发病程度、死亡率及采用PCR方法检测鼻拭子中的病毒监测排毒天数来评价单克隆抗体1H1的预防犬伪狂犬病的效果，结果见表4。

表4单克隆抗体1H1预防犬感染PRV的试验结果

3.2单克隆抗体1H1治疗犬伪狂犬病的应用

筛选PRV抗原、抗体双阴性的2月龄中华田园犬10只，随机分为2组(第三-四组)，均分别通过滴鼻接种实施例1制备的猪伪狂犬病病毒HN1201株1ml(10^5.0TCID₅₀/ml)，接种12小时后第三组按1ml/kg的剂量肌肉注射实施例1制备的单克隆抗体1H1进行治疗。同时，第四组按1ml/kg肌肉注射PBS，每日观察犬的临床症状，连续观察14天，通过临床发病率、发病程度、死亡率及采用PCR方法检测鼻拭子中的病毒来监测排毒天数，从而评价单克隆抗体1H1治疗犬伪狂犬病病毒感染的效果，结果见表5。

表5单克隆抗体1H1治疗犬感染PRV的试验结果

结果表明，单克隆抗体1H1能够使犬减轻由猪伪狂犬病病毒引起的临床症状，减少死亡率以及减少排毒天数，有很好的预防和/或治疗作用。

实施例4基因工程抗体的制备和应用

按照李越等(李越.A型流感病毒单链抗体基因的克隆及抗病毒活性研究.新疆农业大学硕士学位论文,2014)建立的单链抗体制备的操作方法，用单克隆抗体1H1的重链可变区、轻链可变区序列(分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3)制备单链抗体1。

将猪伪狂犬病病毒HN1201株(参见中国专利CN103923884A)接种BHK21细胞，至细胞出现30％的病变，用80％丙酮4℃固定30min，用pH7.4PBS洗涤3次，5min/次，加入单链抗体1置于37℃作用1小时，用pH7.4PBS洗涤3次，5min/次，加入FITC标记的兔抗鼠IgG置于37℃作用1小时，用pH7.4PBS洗涤3次，5min/次，置于荧光显微镜下观察。以单链抗体1阻止PRV感染细胞的最高稀释度作为其中和抗体效价，并按照实施例1.3.4对单链抗体的中和效价进行测定。

结果显示：单链抗体1可以抑制PRV结合细胞，其中和效价为1:150.3，具有中和伪狂犬病的特性，能有效进行攻毒保护。表明：单克隆抗体1H1的可变区序列可用于伪狂犬病病毒基因工程抗体的制备，并且所制备的基因工程抗体具有中和伪狂犬病病毒的活性。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种特异性结合伪狂犬病病毒的抗体或其片段，其中，1）所述抗体或其片段的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；所述抗体或其片段的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体。

3.根据权利要求2所述的抗体或其片段，其中，所述基因工程抗体包括单链抗体。

4.一种预防和/或治疗伪狂犬病病毒感染相关疾病的药物，其中，所述药物包含免疫量的权利要求1-3任一项所述的抗体或其片段，以及药学上可接受的载体。

5.权利要求1-3任一项所述的抗体或其片段在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病病毒经典株导致的伪狂犬病和猪伪狂犬病病毒变异株导致的伪狂犬病的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述伪狂犬病是猪伪狂犬病病毒经典株或者猪伪狂犬病病毒变异株导致的猪伪狂犬病和犬伪狂犬病。