CN110029079B

CN110029079B - 表达分泌猪伪狂犬病毒蛋白优势抗原区的重组枯草芽孢杆菌及应用

Info

Publication number: CN110029079B
Application number: CN201910236982.7A
Authority: CN
Inventors: 杨倩; 王佳璐; 王永恒; 林�建; 李昱辰
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-03-27
Filing date: 2019-03-27
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2039-03-27
Also published as: CN110029079A

Abstract

本发明公开了表达分泌猪伪狂犬病毒蛋白优势抗原区的重组枯草芽孢杆菌及应用。通过蛋白结构分析获得gC和gD蛋白优势抗原区，并通过分子生物学技术构建以枯草芽孢杆菌分泌型质粒p43NMK为载体的重组质粒，电击转化枯草芽孢杆菌后筛选重组菌株。通过鼻腔免疫重组菌株可以显著提高局部黏膜免疫和系统免疫，该重组枯草芽孢杆菌有望成功开发成为预防猪伪狂犬病的鼻腔疫苗，并用于药物的研发。

Description

表达分泌猪伪狂犬病毒蛋白优势抗原区的重组枯草芽孢杆菌及应用

技术领域

本发明涉及基因工程及应用，特别涉及表达分泌猪伪狂犬病毒蛋白优势抗原区的重组枯草芽孢杆菌及应用。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种非致病性革兰氏阳性益生菌，广泛应用于人类和动物。枯草杆菌是一种安全、经济的抗生素替代品，在美国食品药品监督管理局(FDA)普遍认为是安全的。此外，枯草芽孢杆菌能够有效调节机体细胞免疫和体液免疫。枯草芽孢杆菌能抵抗动物的许多疾病，如猪流行性腹泻(PED)、口蹄疫(FMD)和流感等。枯草芽孢杆菌的基因操作已较为成熟，许多不同类型的重组枯草芽孢杆菌已经被证实能够引起动物体独特的免疫应答，产生良好的保护作用。

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的，以仔猪死胎、母猪流产和公猪不育为典型特征的急性传染病。伪狂犬病从1900年被发现以来，已经扩散至全球44个国家，给全球养猪业带来了巨大的经济损失。此外，伪狂犬病毒的天然宿主和贮存宿主是猪，但是伪狂犬病毒能够感染的范围非常广泛，包括牛羊等家畜、犬猫等宠物，及多种野生动物，近年来，也有少量报道伪狂犬感染人的病例。自从上世纪90年代发达国家推行伪狂犬净化计划以来，大大降低了伪狂犬在全球造成的损失。然而从2011年开始，大量伪狂犬变异毒株在我国出现，传统疫苗难以提供有效的保护力，使得伪狂犬病在我国造成了新的流行，造成了巨大的经济损失，并给全球的生物安全带来了严重威胁。伪狂犬病毒最为常见的传播途径是鼻腔感染。当伪狂犬病毒通过鼻腔传播时，病毒在上呼吸道复制，然后感染感觉神经末梢，并通过突触感染神经元侵入神经系统。因此，鼻内免疫是预防伪狂犬病毒感染的重要措施。

鼻腔免疫是一种有效而有吸引力的免疫途径，可以预防由上呼吸道病原体感染引起的疾病。此外，鼻腔免疫不需要针头和注射器，快捷方便可用于大规模免疫。鼻腔免疫能够模拟病原体的自然感染，并在鼻粘膜中诱导免疫球蛋白A(IgA)的产生。鼻腔独特的结构(易于接近且血管分布较多)可以为疫苗提供一个良好的免疫环境，鼻腔中含有丰富的T淋巴细胞和B淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞和淋巴组织，如鼻相关淋巴组织(NALT)等。鼻腔免疫可诱导强烈的黏膜免疫反应和全身系统性免疫反应，从而阻止病原感染。因此，鼻腔免疫具有极大的临床应用潜力。

伪狂犬病毒基因组包含11种不同的包膜糖蛋白(命名为gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM和gN)，它们通过与宿主细胞相互作用在病毒感染中发挥重要作用。其中，gC和gD是引起免疫应答的主要蛋白质。表达gC和gD的重组杆状病毒已被证明能显著诱导高水平的PRV特异性血清抗体IgG和IFN-γ来应对病毒感染。此外，表达gC和gD的重组DNA疫苗可以有效地诱导体液免疫和细胞免疫对抗PRV感染。而利用枯草芽孢杆菌表达gC和gD蛋白进行免疫保护还未见研究。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供一种表达分泌猪伪狂犬病毒蛋白优势抗原区的重组枯草芽孢杆菌。

本发明的另一目的是提供一种表达分泌猪伪狂犬病毒蛋白优势抗原区的重组枯草芽孢杆菌在制备抗猪伪狂犬病毒的药物中的应用。

本发明的最后一个目的是提供一种表达分泌猪伪狂犬病毒蛋白优势抗原区的重组枯草芽孢杆菌在预防猪伪狂犬病的鼻腔疫苗中的应用。

技术方案：

本发明提供的一种表达分泌猪伪狂犬病毒蛋白优势抗原区的重组枯草芽孢杆菌，包含以枯草芽孢杆菌分泌型质粒p43NMK为载体的融合表达重组质粒。

进一步地，所述融合表达重组质粒由gCa-EGFP和gDa-EGFP使用In-Fusion无缝克隆试剂盒连接至线性化质粒p43NMK，测序正确后得到重组质粒p43NMK-gCa-EGFP和p43NMK-gDa-EGFP，其中，gCa-EGFP融合基因序列为SEQ ID NO.1，gDa-EGFP融合基因序列为SEQ IDNO.2。

进一步地，重组枯草芽孢杆菌包含有gC和gD蛋白优势抗原区。重组枯草芽孢杆菌制备方法为通过蛋白结构分析获得猪伪狂犬病毒gC和gD蛋白优势抗原区，通过分子生物学技术构建以枯草芽孢杆菌分泌型质粒p43NMK为载体的融合表达重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到表达分泌猪伪狂犬病毒蛋白优势抗原区的重组枯草芽孢杆菌。

进一步地，所述gC和gD蛋白优势抗原区为gC和gD蛋白全长中具有抗原表位的蛋白片段。

进一步地，所述gC和gD蛋白优势抗原区为具有免疫原性的编码序列，其中，gC蛋白的基因序列为SEQ ID NO.3，氨基酸序列为SEQ ID NO.25；gD蛋白的基因序列为SEQ IDNO.4，氨基酸序列为SEQ ID NO.26。

所述表达分泌猪伪狂犬病毒蛋白优势抗原区的重组枯草芽孢杆菌在制备抗猪伪狂犬病毒的药物中的应用。

所述表达分泌猪伪狂犬病毒蛋白优势抗原区的重组枯草芽孢杆菌在制备猪伪狂犬病的鼻腔疫苗中的应用。

上述技术方案成功构建了表达伪狂犬病毒gC和gD蛋白优势抗原区的重组枯草芽孢杆菌，并通过鼻腔免疫能够刺激局部黏膜产生较高的IgA和IgG抗体，有效防治伪狂犬病毒感染。

有益效果：本发明构建的重组枯草芽孢杆菌是目前国内外第一株表达猪伪狂犬病毒gC和gD优势抗原区的枯草芽孢杆菌；所选择的猪伪狂犬病毒gC和gD优势抗原区是目前国内外首次报道克隆的；本发明可以作为预防猪伪狂犬病感染的基因工程鼻腔疫苗或者用于相关药物的生产研发。

附图说明

图1为伪狂犬病毒gC和gD蛋白基因PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳图；

图2为伪狂犬病毒gC蛋白TMHMM 2.0跨膜分析结果；

图3为伪狂犬病毒gD蛋白TMHMM 2.0跨膜分析结果；

图4为伪狂犬病毒gC蛋白优势抗原区Protean分析结果；

图5为伪狂犬病毒gD蛋白优势抗原区Protean分析结果；

图6为伪狂犬病毒优势抗原区gCa与gDa基因PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳图；

图7为增强型绿色荧光蛋白EGFP基因PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳图；

图8为gCa-EGFP串联片段PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳图；

图9为gDa-EGFP串联片段PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳图；

图10为(A)重组质粒构建流程；(B，C)重组枯草芽孢杆菌Westren-blot验证蛋白表达；(D，E)重组枯草芽孢杆菌显微镜观察绿色荧光；(F)重组枯草芽孢杆菌免疫程序图；

图11为(A)免疫重组枯草芽孢杆菌后小鼠血清IgG水平；(B)免疫重组枯草芽孢杆菌后小鼠肺泡涮洗液IgA水平；(C)免疫重组枯草芽孢杆菌后小鼠阴道涮洗液IgA水平。

具体实施方式

本发明涉及串联表达伪狂犬病毒gC和gD蛋白优势抗原区和增强型绿色荧光蛋白EGFP的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis-gCa和B.subtilis-gDa。重组枯草芽孢杆菌B.subtilis-gCa和B.subtilis-gDa，属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。通过鼻腔免疫重组枯草芽孢杆菌B.subtilis-gCa和B.subtilis-gDa，可以显著提高局部黏膜的IgA抗体水平。

本专利下述方法如无特殊注明，全部为分子学常规实验方法。实验具体涉及的材料和试剂如下：

材料：枯草芽孢杆菌WB800为本实验室保存菌株(可通过商业途径购买获得)；伪狂犬ZJ01株(基因序列参考：NCBI登录号KM061380.1；伪狂犬ZJ01株的制备参考：顾真庆.我国猪伪狂犬病病毒变异株全基因组序列分析及其gE/gI基因缺失灭活疫苗免疫特性[D].)由南京农业大学动物医学院姜平教授惠赠；质粒p43NMK构建方法参考：张晓舟.枯草杆菌新型表达系统和遗传操作体系的建立及应用[D].南京农业大学，2006。pLJM1-EGFP为本实验室保存(可通过商业途径购买获得)。

试剂：硫酸卡那霉素，氨苄青霉素等均购自Takara公司；细菌基因组提取试剂盒购自康为公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等均购自Omega公司；In-fusion无缝克隆试剂盒，高保真PCR酶均购自诺唯赞公司；DH5α感受态购自翊圣公司，限制性内切酶均购自Thermo公司。

1其表达载体质粒构建方法包括：

1.1gC和gD蛋白基因的克隆

以伪狂犬ZJ01株基因组为模板，设计特异性引物进行PCR扩增，其特异性引物如下：

C-F1：atggcctcgctcgcg(SEQ ID NO.5)；

C-R1：gcacgatggctaggatgg(SEQ ID NO.6)：

D-F1：atgctgctcgcagcgc(SEQ ID NO.7)；

D-R1：cccctcaggcggaagaagat(SEQ ID NO.8)；

PCR反应体系为50uL，PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃30sec，60℃30sec，72℃l min，32cycles，72℃5min，4℃10min；PCR产物经过核酸凝胶电泳鉴定后用凝胶回收试剂盒回收产物。

1.2gC和gD蛋白优势抗原区的筛选

运用TMHMM 2.0软件对gC和gD蛋白的氨基酸序列跨膜结构进行预测分析，截取其膜外部分用DNAstar中Protean功能分析蛋白抗原性，预测其优势抗原性区，命名为gCa(gC蛋白优势抗原区gCa基因序列为SEQ ID NO.9)和gDa(gD蛋白抗原优势区gDa基因序列为SEQID NO.10)。

1.3优势抗原区gCa和gDa蛋白基因的克隆

以1.1得到的gC和gD基因为模板，设计特异性引物进行PCR扩增，并在其下游5’端引入与EGFP基因下游3’端相同的15bp同源臂序列，其特异性引物如下：

Ca-F1：acgacggcgctcggcacg(SEQ ID NO.11)；

Ca-R1：tcgcccttgctcaccatgctgaagaggagccgc(SEQ ID NO.12)；

Da-F1：gtcccctcgcccttcg(SEQ ID NO.13)；

Da-R1：cgcccttgctcaccatgtctcgggcctcgggg(SEQ ID NO.14)；

PCR反应体系为50uL，PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，32cycles，72℃5min，4℃10min；PCR产物经过核酸凝胶电泳鉴定后用凝胶回收试剂盒回收产物。

1.4增强型绿色荧光蛋白EGFP(其基因序列为SEQ ID NO.15)基因的克隆

以实验室保存的质粒pLJM1-EGFP为模板，设计特异性引物进行PCR扩增，并在其上游5’端分别引入与gCa和gDa基因上游3’端相同的15bp同源臂序列，其特异性引物如下：

Eca-F1：gcggctcctcttcagcatggtgagcaagggcga(SEQ ID NO.16)：

Eda-F1：gcgccgcaccacgccgatggtgagcaagggcg(SEQ ID NO.17)；

E-R1：cttgtacagctcgtccatg(SEQ ID NO.18)；

1.5融合克隆gCa和gDa与EGFP片段

分别以1.3中得到的gC和gD基因，1.4中得到的EGFP基因为模板，设计特异性引物进行重叠PCR扩增，并在其上下游分别引入与线性化质粒p43NMK相同的15bp同源臂序列。其特异性引物如下：

CaE-F1：ttgtaacacatgcctcagctgcaggaacgacggcgctcggc(SEQ ID NO.19)；

CaE-R1：tgattacgccaagcttttacttgtacagctcgtccatgcc(SEQ ID NO.20)；

DaE-F1：gtttttgtaacacatgcctcagctgcaggagtcccctcgcccttcg(SEQ ID NO.21)；

DaE-R1：tgattacgccaagcttttacttgtacagctcgtccatgcc(SEQ ID NO.22)；

PCR反应体系为50uL，PCR反应条件分为两步：1.不加酶和引物95℃预变性3min，95℃30sec，60℃1min，72℃1min，10cycles；2.加酶和引物95℃预变性3min，95℃30sec，60℃1min，72℃1min，22cycles 72°C 5min，4℃10min；PCR产物经过核酸凝胶电泳鉴定后用凝胶回收试剂盒回收产物，命名为gCa-EGFP和gDa-EGFP。

1.6重组质粒的构建

将1.4中得到的gCa-EGFP和gDa-EGFP使用In-Fusion无缝克隆试剂盒连接至线性化质粒p43NMK(PstI和HindIII双酶切后进行凝胶回收所得)，测序正确后得到重组质粒p43NMK-gCa-EGFP和p43NMK-gDa-EGFP。

2电击转化枯草芽孢杆菌WB800菌株，属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

2.1枯草芽孢杆菌WB800感受态制备

首先将枯草芽孢杆菌WB800菌株在无抗的固体LB平板上三区划线。置于37℃恒温培养箱12h后，挑取单菌落进行扩培，16h后按照1∶16接种于生长培养基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，山梨醇91g，定容至1000ml，高压蒸汽灭菌)，置于恒温摇床中37℃180rpm/min进行扩培，待细菌生长至OD600≈0.9时，将菌液放入冰水中预冷10min。随后4℃5000rpm/min离心15min收集菌体，用预冷的电击洗液(山梨醇9g，甘露醇69g，海藻糖189g，甘油10％，定容至1000ml，高压蒸汽灭菌)洗涤菌体4次，直至无培养基成分。最后用1/40生长培养基体积的电击洗液重悬菌体，至终浓度为1×10¹⁰CFU/ml。每管60μl分装至EP管后放置于-80℃超低温冰箱保存备用。

2.2电击转化重组质粒进入枯草芽孢杆菌WB800感受态

首先取上述2.1中制备的一管枯草芽孢杆菌WB800感受态，放置于冰上待感受态全部融化后，加入1μl(50ng/μl)上述1.5中构建成功的重组质粒p43NMK-gCa-EGFP和p43NMK-gDa-EGFP，充分混匀后加入1mm电击杯中置于冰上冰浴30min。冰浴完全后将电极杯插入电穿孔仪中进行电击，电击条件为：22KV/cm，25μF，2000Ω，5ms。电击完毕后迅速加入1ml恢复液(蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，山梨醇91g，甘露醇69g，海藻糖189g，定容至1000ml，高压蒸汽灭菌)，37℃160rpm/min培养3h，5000rpm/min离心3min收集菌体，100ul恢复液重悬菌体后涂布于硫酸卡那霉素抗性固体LB培养板，置于37℃恒温培养箱14-18h观察验证阳性菌落，并命名为B.subtilis-gCa和B.subtilis-gDa。

3重组枯草芽孢杆菌验证

3.1硫酸卡那霉素抗性筛选

取100mg硫酸卡那霉素溶于足量的水中，定容至10ml。然后过滤后分装成小份于-20℃贮存备用。按照50ug/ml的浓度加入固体LB(胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂16g，定容至1000ml，高压蒸汽灭菌)充分混匀后按照10ml/块倒入9mm培养皿中，充分冷却后备用。

3.2提取阳性菌落质粒测序验证

挑取上述3.1中的阳性菌落按照质粒提取试剂盒的方法提取质粒，质粒经过PstI与HindIII双酶切验证后送南京金斯瑞生物科技公司进行测序验证。测序引物如下：

F1：gctaaagcggccaagg(SEQ ID NO.23)

R1：gtgtggaattgtgagcg(SEQ ID NO.24)

3.3Western-blot验证重组蛋白

挑取上述3.1中的阳性菌落接入5ml LB液体培养基中(胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，定容至1000ml，高压蒸汽灭菌)置于37℃220rpm/min恒温摇床中培养24h，按照5000rpm/min离心3min收集菌体，菌体用500μl 0.01mol/L PBS(NaC18g，KC10.2g，Na₂HPO₄·12H₂O1.44g，KH₂PO₄0.24g，定容至1000ml，高压蒸汽灭菌)重悬。重悬后的菌体用超声破碎仪破碎，破碎条件：300w，10s/10s，20min。破碎完全后13000rpm/min离心5min弃去残渣，上清用SDS Loading buffer充分混匀，沸水煮10min。配置12％蛋白胶进行电泳，将蛋白胶通过电转印1.5h进入PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭2h，1∶1000EGFP单克隆抗体4℃孵育过夜，按照15min/次用TBST洗涤3次，按照1∶1000羊抗鼠二抗室温孵育2h，用TBST按照15min/次洗涤3次，加入ECL发光液显色，凝胶成像系统观察。

3.4荧光共聚焦显微镜观察

挑取上述3.1中的阳性菌落接入5ml LB液体培养基中(胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，定容至1000ml，高压蒸汽灭菌)置于37℃220rpm/min恒温摇床中培养24h，然后取一滴菌液于载玻片上，甘油封片后置于荧光共聚焦显微镜下观察荧光。

4鼻腔免疫重组枯草芽孢杆菌对小鼠免疫应答水平的检测

4.1免疫程序及样品采集

将60只健康的SPF雌性BALB/C小鼠(5周龄，购自扬州大学实验动物中心)随机分为4组，每组15只(为避免交叉污染四组小鼠在同样的条件下分隔开进行饲养)。4个实验组分别免疫：PBS组；空白枯草芽孢杆菌WB800混合PRV灭活病毒组(B.subtilis-PRV)；B.subtilis-gCa组；B.subtilis-gDa组。0天免疫后每隔7天采集血清，肺泡涮洗液和阴道涮洗液；并于第14天加强一次免疫，35天处死全部小鼠。

4.2间接ELISA方法检测特异性SIgA和IgG水平

用抗原包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)，碳酸钠0.75g，碳酸氢钠1.46g，去离子水定容至500ml，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用)稀释纯化的伪狂犬病毒至2.5μg/ml包被96孔ELISA板，每孔加100μl，37℃恒温孵育1h后4℃过夜包被。12h后倒出孔内液体，加入400μl/孔洗涤液PBST(0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8g，0.05％Tween-20，加去离子水定容到1000ml)，每次洗5min，然后用力在桌上拍干，重复洗涤3次。每孔加入400μl 5％脱脂奶封闭液(PBST 100ml，5g脱脂奶，充分混匀)，37℃恒温封闭2h。倒出孔内液体，如前述洗涤3次，拍干。每孔加入100μl检测样品(血清1∶100稀释，肺泡涮洗液和阴道涮洗液1∶50稀释)，稀释液为0.1％BSA(取100ml 0.02mol/L磷酸盐缓冲液，加0.1gBSA，充分混匀)，于37℃恒温孵育1.5h，倒出孔内液体，洗涤3次，拍干。检测不同样品，每孔分别加入100μl经稀释液1∶2000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IA抗体、羊抗小鼠IG抗体，37℃恒温孵育1h，倒出孔内液体，洗涤3次，拍干。每孔加入100μlTMB显色液，于37℃避光作用5min。每孔加入50μl硫酸终止液，酶标仪检测OD450。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 表达分泌猪伪狂犬病毒蛋白优势抗原区的重组枯草芽孢杆菌及应用

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1161

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 1

acgacggcgc tcggcacgac gcccaacggg ggcgggggcg gcaacagcag cgcgggcgag 60

ctctcgccct cgccgccctc gacgcccgag cccgtctcgg ggacgacggg ggccgcggcc 120

tccacgcccg ccgccgtctc gacgccccgg gtcccgccgc cctcggtctc gcgccggaag 180

ccccagcgga acggcaacag gacgcgcgtc cacggcgaca aggccacctc gcacgggcgc 240

aagcgcatcg tgtgccgcga gcggctgttc tcggcgaggg tgggggacgc ggtcagcttc 300

gggtgcgccg tcgtcccgcg cgccggggag accttcgagg tccgcttctg ccgccgcggg 360

cgcttccgct cgcccgacgc cgaccccgag tactttgacg agcccccgcg cccggagctc 420

ccgcgggagc ggctcctctt cagcatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 480

gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 540

gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 600

aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 660

agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 720

tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 780

gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 840

gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 900

atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 960

gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 1020

cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 1080

aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 1140

ggcatggacg agctgtacaa g 1161

<210> 2

<211> 1856

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 2

atgctgctcg cagcgctatt ggcggcgctg gtcgcccgga cgacgctcgg cgcggacgtg 60

gacgccgtgc ccgcgccgac cttccccccg cccgcgtacc cgtacaccga gtcgtggcag 120

ctgacgctga cgacggtccc ctcgcccttc gtcggccccg cggacgtcta ccacacgcgc 180

ccgctggagg acccgtgcgg ggtggtggcg ctgatctccg acccgcaggt ggaccggctg 240

ctgaacgagg cggtggccca ccggcggccc acgtaccgcg cccacgtggc ctggtaccgc 300

atcgcggacg ggtgcgcgca cctgctgtac tttatcgagt acgccgactg cgaccccagg 360

cagatctttg ggcgctgccg gcgccgcacc acgccgatgt ggtggacccc gtccgcggac 420

tacatgttcc ccacggagga cgagctgggg ctgctcatgg tggccccggg gcggttcaac 480

gagggccagt accggcgcct ggtgtccgtc gacggcgtga acatcctcac cgacttcatg 540

gtggcgctcc ccgaggggca agagtgcccg ttcgcccgcg tggaccagca ccgcacgtac 600

aagttcggcg cgtgctggag cgacgacagc ttcaagcggg gcgtggacgt gatgcgattc 660

ctgacgccgt tctaccagca gcccccgcac cgggaggtgg tgaactactg gtaccgcaag 720

aacggccgga cgctcccgcg ggcctacgcc gccgccacgc cgtacgccat cgaccccgcg 780

cggccctcgg cgggctcgcc gaggcccagg ccccggcccc ggcccaggcc ccggccgaag 840

cccgagcccg ccccggcgac gcccgcgccc ccggaccgcc tgcccgagcc ggcgacgcgg 900

gaccacgccg ccggggggcg ccccacgccg cgacccccga ggcccgagac gccgcaccgc 960

cccttcgccc cgccggccgt cgtgcccagc gggtggccgc agcccgcgga gccgttcccg 1020

ccccggacca ccgccgcgcc gggcgtctcg cgccaccgct cggtgatcgt cggcacgggc 1080

accgcgatgg gcgcgctcct ggtgggcgtg tgcgtctaca tcttcttccg cctgagggga 1140

tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg 1200

gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg 1260

gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc 1320

tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc 1380

agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct 1440

tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg 1500

tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca 1560

agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg 1620

gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg 1680

accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact 1740

acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc 1800

tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaag 1856

<210> 3

<211> 1417

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 3

atggcctcgc tcgcgcgtgc gatgctcgcg ctgctggcgc tctacacggc ggccatcgcc 60

gcggcgccgt cgtccacgac ggcgctcggc acgacgccca acgggggcgg gggcggcaac 120

agcagcgcgg gcgagctctc gccctcgccg ccctcgacgc ccgagcccgt ctcggggacg 180

acgggggccg cggcctccac gcccgccgcc gtctcgacgc cccgggtccc gccgccctcg 240

gtctcgcgcc ggaagcccca gcggaacggc aacaggacgc gcgtccacgg cgacaaggcc 300

acctcgcacg ggcgcaagcg catcgtgtgc cgcgagcggc tgttctcggc gagggtgggg 360

gacgcggtca gcttcgggtg cgccgtcgtc ccgcgcgccg gggagacctt cgaggtccgc 420

ttctgccgcc gcgggcgctt ccgctcgccc gacgccgacc ccgagtactt tgacgagccc 480

ccgcgcccgg agctcccgcg ggagcggctc ctcttcagct ccgccaacgc ctccctcgcc 540

cacgcggacg cgctcgcctc cgccgtcgtc gtcgagggcg agcgcgcgac cgtcgccaac 600

gtctcgggcg aggtgtccgt gcgcgtggcc gcggcggacg ccgagaccga gggcgtctac 660

acgtggcgcg tgctgtccgc caacggcacc gaggtccgca gcgccaacgt ctcgctcgtc 720

ctgtaccacc agcccgagtt cggcctgagc gcgccgcccg tcctcttcgg cgagcccttc 780

cgggcggtgt gcgtcgtccg cgactactac ccgcggcgca gcgtgcgcct gcgctggttc 840

gcggacgagc acccggtgga cgccgccttc gtgaccaaca gcaccgtggc cgacgagctc 900

gggcgccgca cgcgcgtctc cgtggtgaac gtgacgcgcg cggacgtccc gggcctcgcg 960

gccgcggacg acgcggacgc gctcgcgccg agcctgcgct gcgaggccgt gtggtaccgc 1020

gacagcgtgg cctcgcagcg cttctccgag gccctgcgcc cccacgtcta ccacccggcg 1080

gcggtctcgg tgcgcttcgt cgagggcttc gccgtctgcg acggcctctg cgtgcccccg 1140

gaggcgcgcc tcgcctggtc cgaccacgcc gccgacaccg tctaccacct cggcgcctgc 1200

gccgagcacc ccggcctgct caacgtgcgg agcgcccgcc cgctgtcgga cctcgacggg 1260

cccgtcgact acacctgccg cctcgagggc atgccctcgc agctgcccat cttcgaggac 1320

acgcagcgct acgacgcctc ccccacgtcc gtgagctggc ccgtcgtgac cagcatgatc 1380

accgtcatcg ccggcatcgc catcctagcc atcgtgc 1417

<210> 4

<211> 1139

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 4

atgctgctcg cagcgctatt ggcggcgctg gtcgcccgga cgacgctcgg cgcggacgtg 60

gacgccgtgc ccgcgccgac cttccccccg cccgcgtacc cgtacaccga gtcgtggcag 120

ctgacgctga cgacggtccc ctcgcccttc gtcggccccg cggacgtcta ccacacgcgc 180

ccgctggagg acccgtgcgg ggtggtggcg ctgatctccg acccgcaggt ggaccggctg 240

ctgaacgagg cggtggccca ccggcggccc acgtaccgcg cccacgtggc ctggtaccgc 300

atcgcggacg ggtgcgcgca cctgctgtac tttatcgagt acgccgactg cgaccccagg 360

cagatctttg ggcgctgccg gcgccgcacc acgccgatgt ggtggacccc gtccgcggac 420

tacatgttcc ccacggagga cgagctgggg ctgctcatgg tggccccggg gcggttcaac 480

gagggccagt accggcgcct ggtgtccgtc gacggcgtga acatcctcac cgacttcatg 540

gtggcgctcc ccgaggggca agagtgcccg ttcgcccgcg tggaccagca ccgcacgtac 600

aagttcggcg cgtgctggag cgacgacagc ttcaagcggg gcgtggacgt gatgcgattc 660

ctgacgccgt tctaccagca gcccccgcac cgggaggtgg tgaactactg gtaccgcaag 720

aacggccgga cgctcccgcg ggcctacgcc gccgccacgc cgtacgccat cgaccccgcg 780

cggccctcgg cgggctcgcc gaggcccagg ccccggcccc ggcccaggcc ccggccgaag 840

cccgagcccg ccccggcgac gcccgcgccc ccggaccgcc tgcccgagcc ggcgacgcgg 900

gaccacgccg ccggggggcg ccccacgccg cgacccccga ggcccgagac gccgcaccgc 960

cccttcgccc cgccggccgt cgtgcccagc gggtggccgc agcccgcgga gccgttcccg 1020

ccccggacca ccgccgcgcc gggcgtctcg cgccaccgct cggtgatcgt cggcacgggc 1080

accgcgatgg gcgcgctcct ggtgggcgtg tgcgtctaca tcttcttccg cctgagggg 1139

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 5

atggcctcgc tcgcg 15

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 6

gcacgatggc taggatgg 18

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 7

atgctgctcg cagcgc 16

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 8

cccctcaggc ggaagaagat 20

<210> 9

<211> 444

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 9

acgacggcgc tcggcacgac gcccaacggg ggcgggggcg gcaacagcag cgcgggcgag 60

ctctcgccct cgccgccctc gacgcccgag cccgtctcgg ggacgacggg ggccgcggcc 120

tccacgcccg ccgccgtctc gacgccccgg gtcccgccgc cctcggtctc gcgccggaag 180

ccccagcgga acggcaacag gacgcgcgtc cacggcgaca aggccacctc gcacgggcgc 240

aagcgcatcg tgtgccgcga gcggctgttc tcggcgaggg tgggggacgc ggtcagcttc 300

gggtgcgccg tcgtcccgcg cgccggggag accttcgagg tccgcttctg ccgccgcggg 360

cgcttccgct cgcccgacgc cgaccccgag tactttgacg agcccccgcg cccggagctc 420

ccgcgggagc ggctcctctt cagc 444

<210> 10

<211> 815

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 10

gtcccctcgc ccttcgtcgg ccccgcggac gtctaccaca cgcgcccgct ggaggacccg 60

tgcggggtgg tggcgctgat ctccgacccg caggtggacc ggctgctgaa cgaggcggtg 120

gcccaccggc ggcccacgta ccgcgcccac gtggcctggt accgcatcgc ggacgggtgc 180

gcgcacctgc tgtactttat cgagtacgcc gactgcgacc ccaggcagat ctttgggcgc 240

tgccggcgcc gcaccacgcc gatgtggtgg accccgtccg cggactacat gttccccacg 300

gaggacgagc tggggctgct catggtggcc ccggggcggt tcaacgaggg ccagtaccgg 360

cgcctggtgt ccgtcgacgg cgtgaacatc ctcaccgact tcatggtggc gctccccgag 420

gggcaagagt gcccgttcgc ccgcgtggac cagcaccgca cgtacaagtt cggcgcgtgc 480

tggagcgacg acagcttcaa gcggggcgtg gacgtgatgc gattcctgac gccgttctac 540

cagcagcccc cgcaccggga ggtggtgaac tactggtacc gcaagaacgg ccggacgctc 600

ccgcgggcct acgccgccgc cacgccgtac gccatcgacc ccgcgcggcc ctcggcgggc 660

tcgccgaggc ccaggccccg gccccggccc aggccccggc cgaagcccga gcccgccccg 720

gcgacgcccg cgcccccgga ccgcctgccc gagccggcga cgcgggacca cgccgccggg 780

gggcgcccca cgccgcgacc cccgaggccc gagac 815

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 11

acgacggcgc tcggcacg 18

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 12

tcgcccttgc tcaccatgct gaagaggagc cgc 33

<210> 13

<211> 16

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 13

gtcccctcgc ccttcg 16

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 14

cgcccttgct caccatgtct cgggcctcgg gg 32

<210> 15

<211> 717

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 15

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 16

gcggctcctc ttcagcatgg tgagcaaggg cga 33

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 17

gcgccgcacc acgccgatgg tgagcaaggg cg 32

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 18

cttgtacagc tcgtccatg 19

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 19

ttgtaacaca tgcctcagct gcaggaacga cggcgctcgg c 41

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 20

tgattacgcc aagcttttac ttgtacagct cgtccatgcc 40

<210> 21

<211> 46

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 21

gtttttgtaa cacatgcctc agctgcagga gtcccctcgc ccttcg 46

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 22

tgattacgcc aagcttttac ttgtacagct cgtccatgcc 40

<210> 23

<211> 16

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 23

gctaaagcgg ccaagg 16

<210> 24

<211> 17

<212> DNA

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 24

gtgtggaatt gtgagcg 17

<210> 25

<211> 460

<212> PRT

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 25

Met Ala Ser Leu Ala Arg Ala Met Leu Ala Leu Leu Ala Leu Tyr Thr

1 5 10 15

Ala Ala Ile Ala Ala Ala Pro Ser Ser Thr Thr Ala Leu Gly Thr Thr

20 25 30

Pro Asn Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ser Ser Ala Gly Glu Leu Ser Pro

35 40 45

Ser Pro Pro Ser Thr Pro Glu Pro Val Ser Gly Thr Thr Gly Ala Ala

50 55 60

Ala Ser Thr Pro Ala Ala Val Ser Thr Pro Arg Val Pro Pro Pro Ser

65 70 75 80

Val Ser Arg Arg Lys Pro Gln Arg Asn Gly Asn Arg Thr Arg Val His

85 90 95

Gly Asp Lys Ala Thr Ser His Gly Arg Lys Arg Ile Val Cys Arg Glu

100 105 110

Arg Leu Phe Ser Ala Arg Val Gly Asp Ala Val Ser Phe Gly Cys Ala

115 120 125

Val Val Pro Arg Ala Gly Glu Thr Phe Glu Val Arg Phe Cys Arg Arg

130 135 140

Gly Arg Phe Arg Ser Pro Asp Ala Asp Pro Glu Tyr Phe Asp Glu Pro

145 150 155 160

Pro Arg Pro Glu Leu Pro Arg Glu Arg Leu Leu Phe Ser Ser Ala Asn

165 170 175

Ala Ser Leu Ala His Ala Asp Ala Leu Ala Ser Ala Val Val Val Glu

180 185 190

Gly Glu Arg Ala Thr Val Ala Asn Val Ser Gly Glu Val Ser Val Arg

195 200 205

Val Ala Ala Ala Asp Ala Glu Thr Glu Gly Val Tyr Thr Trp Arg Val

210 215 220

Leu Ser Ala Asn Gly Thr Glu Val Arg Ser Ala Asn Val Ser Leu Val

225 230 235 240

Leu Tyr His Gln Pro Glu Phe Gly Leu Ser Ala Pro Pro Val Leu Phe

245 250 255

Gly Glu Pro Phe Arg Ala Val Cys Val Val Arg Asp Tyr Tyr Pro Arg

260 265 270

Arg Ser Val Arg Leu Arg Trp Phe Ala Asp Glu His Pro Val Asp Ala

275 280 285

Ala Phe Val Thr Asn Ser Thr Val Ala Asp Glu Leu Gly Arg Arg Thr

290 295 300

Arg Val Ser Val Val Asn Val Thr Arg Ala Asp Val Pro Gly Leu Ala

305 310 315 320

Ala Ala Asp Asp Ala Asp Ala Leu Ala Pro Ser Leu Arg Cys Glu Ala

325 330 335

Val Trp Tyr Arg Asp Ser Val Ala Ser Gln Arg Phe Ser Glu Ala Leu

340 345 350

Arg Pro His Val Tyr His Pro Ala Ala Val Ser Val Arg Phe Val Glu

355 360 365

Gly Phe Ala Val Cys Asp Gly Leu Cys Val Pro Pro Glu Ala Arg Leu

370 375 380

Ala Trp Ser Asp His Ala Ala Asp Thr Val Tyr His Leu Gly Ala Cys

385 390 395 400

Ala Glu His Pro Gly Leu Leu Asn Val Arg Ser Ala Arg Pro Leu Ser

405 410 415

Asp Leu Asp Gly Pro Val Asp Tyr Thr Cys Arg Leu Glu Gly Met Pro

420 425 430

Ser Gln Leu Pro Ile Phe Glu Asp Thr Gln Arg Tyr Asp Ala Ser Pro

435 440 445

Thr Ser Val Ser Trp Pro Val Val Thr Ser Met Ile

450 455 460

<210> 26

<211> 379

<212> PRT

<213> 猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 26

Met Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Leu Val Ala Arg Thr Thr Leu

1 5 10 15

Gly Ala Asp Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Thr Phe Pro Pro Pro Ala

20 25 30

Tyr Pro Tyr Thr Glu Ser Trp Gln Leu Thr Leu Thr Thr Val Pro Ser

35 40 45

Pro Phe Val Gly Pro Ala Asp Val Tyr His Thr Arg Pro Leu Glu Asp

50 55 60

Pro Cys Gly Val Val Ala Leu Ile Ser Asp Pro Gln Val Asp Arg Leu

65 70 75 80

Leu Asn Glu Ala Val Ala His Arg Arg Pro Thr Tyr Arg Ala His Val

85 90 95

Ala Trp Tyr Arg Ile Ala Asp Gly Cys Ala His Leu Leu Tyr Phe Ile

100 105 110

Glu Tyr Ala Asp Cys Asp Pro Arg Gln Ile Phe Gly Arg Cys Arg Arg

115 120 125

Arg Thr Thr Pro Met Trp Trp Thr Pro Ser Ala Asp Tyr Met Phe Pro

130 135 140

Thr Glu Asp Glu Leu Gly Leu Leu Met Val Ala Pro Gly Arg Phe Asn

145 150 155 160

Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Leu Val Ser Val Asp Gly Val Asn Ile Leu

165 170 175

Thr Asp Phe Met Val Ala Leu Pro Glu Gly Gln Glu Cys Pro Phe Ala

180 185 190

Arg Val Asp Gln His Arg Thr Tyr Lys Phe Gly Ala Cys Trp Ser Asp

195 200 205

Asp Ser Phe Lys Arg Gly Val Asp Val Met Arg Phe Leu Thr Pro Phe

210 215 220

Tyr Gln Gln Pro Pro His Arg Glu Val Val Asn Tyr Trp Tyr Arg Lys

225 230 235 240

Asn Gly Arg Thr Leu Pro Arg Ala Tyr Ala Ala Ala Thr Pro Tyr Ala

245 250 255

Ile Asp Pro Ala Arg Pro Ser Ala Gly Ser Pro Arg Pro Arg Pro Arg

260 265 270

Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Lys Pro Glu Pro Ala Pro Ala Thr Pro

275 280 285

Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Pro Ala Thr Arg Asp His Ala Ala

290 295 300

Gly Gly Arg Pro Thr Pro Arg Pro Pro Arg Pro Glu Thr Pro His Arg

305 310 315 320

Pro Phe Ala Pro Pro Ala Val Val Pro Ser Gly Trp Pro Gln Pro Ala

325 330 335

Glu Pro Phe Pro Pro Arg Thr Thr Ala Ala Pro Gly Val Ser Arg His

340 345 350

Arg Ser Val Ile Val Gly Thr Gly Thr Ala Met Gly Ala Leu Leu Val

355 360 365

Gly Val Cys Val Tyr Ile Phe Phe Arg Leu Arg

370 375

Claims

1.一种表达分泌猪伪狂犬病毒蛋白优势抗原区的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：包含以枯草芽孢杆菌分泌型质粒p43NMK为载体的融合表达重组质粒；

包含有gC和gD蛋白优势抗原区，gC蛋白优势抗原区gCa基因序列为SEQ ID NO.9，gD蛋白抗原优势区gDa基因序列为SEQ ID NO.10。

2.根据权利要求1所述的表达分泌猪伪狂犬病毒蛋白优势抗原区的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述融合表达重组质粒由gCa-EGFP和gDa-EGFP 使用In-Fusion无缝克隆试剂盒连接至线性化质粒p43NMK，测序正确后得到重组质粒p43NMK-gCa-EGFP 和p43NMK-gDa-EGFP，其中，gCa-EGFP融合基因序列为SEQ ID NO.1，gDa-EGFP融合基因序列为SEQ IDNO.2。

3.权利要求1所述的表达分泌猪伪狂犬病毒蛋白优势抗原区的重组枯草芽孢杆菌在制备抗猪伪狂犬病毒的药物中的应用。

4.权利要求1所述的表达分泌猪伪狂犬病毒蛋白优势抗原区的重组枯草芽孢杆菌在制备猪伪狂犬病的鼻腔疫苗中的应用。