CN115991745A

CN115991745A - 一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN115991745A
Application number: CN202211368419.3A
Authority: CN
Inventors: 刘开云; 郭刚; 谭润卿; 王宁; 孙敏
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2022-07-19
Filing date: 2022-11-03
Publication date: 2023-04-21

Abstract

本发明公开了一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB及其制备方法与应用，该重组抗原蛋白TatB的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，该重组抗原蛋白TatB编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明通过质粒构建、诱导表达、亲和层析和交换层析纯化等步骤得到高纯度的抗原蛋白，纯化工艺简单、成本低、可操作性强，经过纯化制备后的抗原具有较高免疫原性和免疫效价，可以用作基因工程亚单位疫苗。而作为幽门螺杆菌膜转运蛋白中的重要组成蛋白，重组抗原蛋白TatB将成为幽门螺杆菌基因工程疫苗研制过程中最有希望的候选抗原之一。

Description

一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，涉及重组抗原蛋白，具体涉及一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB及其制备方法与应用。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是一种呈螺旋形或S形的革兰氏阴性微需氧细菌。幽门螺杆菌感染是全球最常见的感染疾病之一，在一些发展中国家，一半以上的人口感染了幽门螺杆菌。流行病学研究显示，幽门螺杆菌感染与慢性胃炎、消化性溃疡、胃淋巴瘤以及胃癌等疾病密切相关。1994年，世界卫生组织已经将幽门螺杆菌列为第Ⅰ类生物致癌因子。现今治疗幽门螺杆菌感染引发的相关疾病主要采用抗生素结合的“三联”或“四联”疗法来抑制或者清除患者体内的幽门螺杆菌，虽然早期治疗效果显著，但是对再次感染患者的治疗效果就明显降低，并且停药后极易出现复发现象。

就感染幽门螺杆菌后，在治疗上遇到的问题，人们不得不寻找新的解决途径，以期做到既不会增加菌的耐药性，又可以提高临床治疗的效果。经过数十年的科学研究，已有大量的实验证明，免疫接种可以有效预防甚至治疗幽门螺杆菌感染所带来的一系列疾病。1993年Czinn等用猫胃螺旋杆菌裂解物口服免疫小鼠诱导黏膜产生高水平的分泌性IgA(sIgA)，同时发现还可以预防猫胃螺旋杆菌的再感染，首次证实了疫苗的保护作用，随后针对幽门螺杆菌的疫苗被越来越多的学者开始研究。因此疫苗接种有望成为未来预防和治疗幽门螺杆菌感染最有效也是最有前景的手段之一。

幽门螺杆菌全菌疫苗抗原成分复杂且幽门螺杆菌还存在生产周期长、培养条件苛刻、产量低、易污染等多种问题，因此以幽门螺杆菌全菌制备传统的疫苗存在很多困难。随着分子生物学的不断发展，基因工程疫苗成为了目前的研究热点。现今已有多种幽门螺杆菌不同的基因组或基因被克隆用作幽门螺杆菌基因工程疫苗的研究，其中包括：趋化因子cheA和cheY，鞭毛素基因flaA和flaB，热休克蛋白质基因hspA，尿素酶基因UreA、UreB，空泡毒素基因vacA等。虽然其中有些抗原蛋白能够产生一定的免疫保护作用，但目前都还存在着免疫活性较低、重组表达效率低导致蛋白大量制备困难等问题。因此，对幽门螺杆菌疫苗进一步的研究除了应完善免疫方式和筛选高效无毒佐剂类型外，更主要是开发出多种更加全面有效的免疫抗原，通过多价抗原的组合组成高效的人用幽门螺杆菌疫苗。

发明内容

针对现有幽门螺杆菌全菌疫苗存在的抗原成分复杂且还存在生产周期长、培养条件苛刻、产量低、易污染等问题，以及在幽门螺杆菌基因工程疫苗研发过程中，具有较高免疫活性的抗原蛋白种类较少，现有已知基因的重组抗原普遍免疫效价较低或者难以大量制备等问题，本发明的目的是解决上述问题，提供一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB及其制备方法与应用，本发明在重组表达的基础上通过镍离子亲和层析和阴离子交换层析两步纯化得到高纯度的抗原蛋白，动物实验表明重组抗原蛋白TatB具有良好的免疫原性和较高的免疫效价，同时能够诱导高效的黏膜免疫应答，可作为有效的疫苗候选抗原。

目前生物信息学是生物学研究热点，本发明利用对数据库中多种幽门螺杆菌抗原蛋白结构的学习，根据“反向免疫学”原理筛选出针对幽门螺杆菌的一种新型免疫重组抗原蛋白TatB。Tat是幽门螺杆菌中一种将折叠蛋白质跨膜转运的体系，其信号肽中含有一个高度保守的双精氨酸模体。Tat体系包括TatA、TatB等多种蛋白质，它们的复合物在质膜上形成转运通道，此前尚未有研究表明幽门螺杆菌的TatB蛋白能作为幽门螺杆菌特异性抗原引起机体免疫反应。本发明将选定的TatB抗原基因克隆至的蛋白表达载体，重组在工程菌内进行大规模表达，经过纯化制备后的抗原可以用作基因工程亚单位疫苗，纯化工艺简单、成本低、可操作性强。而作为幽门螺杆菌膜转运蛋白中的重要组成蛋白，抗原蛋白TatB也将是幽门螺杆菌基因工程疫苗研制过程中最有希望的候选抗原之一。

为达到上述目的，本发明提供了一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB，所述重组抗原蛋白TatB的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1TatB基因的氨基酸序列：

KFPQAVVDIKKETLEYQKLFENKVESLKGVKIEELEDAKVTAENEIKSIQDLMQDYKQSLENNAPPNHSNKEISNEEALNEEISNNESLKGAELLTNNPKEHDKEKEHVLE。

所述重组抗原蛋白TatB编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。该重组抗原蛋白TatB是通过选择幽门螺杆菌基因组编码蛋白中呈现高特异性的肽段编码基因作为目的基因片段，并将该目的基因片段通过原核表达载体导入宿主细胞中进行表达而制备得到，该目的基因片段具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列(下划线部分表示酶切位点)。

SEQ ID NO:2TatB基因核苷酸序列：

CCATGGAGAAATTTCCGCAAGCAGTTGTTGATATCAAGAAAGAAACTTTGGAGTATCAGAAATTATTTGAGAACAAAGTTGAGTCCCTTAAGGGTGTGAAAATCGAGGAGTTAGAGGACGCTAAAGTCACAGCGGAGAATGAGATCAAAAGTATCCAAGACCTGATGCAAGATTATAAGCAAAGTCTGGAAAACAACGCCCCGCCGAATCATTCGAATAAAGAAATCAGCAATGAGGAGGCCCTGAATGAAGAAATTAGCAACAATGAAAGTCTGAAGGGTGCGGAGCTTCTGACAAACAACCCAAAGGAACACGACAAAGAGAAAGAGCATGTCCTCGAG。

本发明还提供了一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB的制备方法，包括以下步骤：

S1、质粒构建

将核苷酸序列为SEQ ID NO:2的基因作为目的基因片段，将该目的基因片段连接在表达载体质粒中构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；

S2、诱导表达

将所述重组表达质粒转化至重组蛋白表达的宿主菌中进行诱导表达，收集诱导表达后的菌体，破碎处理后离心并收集上清液；

S3、产物纯化

将上清液依次经镍柱亲和层析、阴离子阴离子柱交换层析纯化后，获得幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB，所述重组抗原蛋白TatB的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB的制备方法，重组表达质粒的构建为本领域的常规操作。本发明通过“反向免疫学”原理，设计筛选获得潜在幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB编码氨基酸序列，根据氨基酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示目的基因片段，最后将该目的基因片段通过双酶切连接在表达载体质粒中获得重组表达质粒。本领技术人员可以采用常规手段获得重组表达质粒，本发明中，步骤S1具体包括以下步骤：

S11、筛选获得幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB编码氨基酸序列，根据氨基酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得目的基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

S12、对目的基因进行全基因合成，通过Xho I和Nco I的酶切位点连接到表达载体质粒中构建重组表达质粒。

上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB的制备方法，诱导表达为本领域的常规操作，本发明对此并无特殊限制，本领域技术人员可以根据常规方式对重组菌株进行诱导表达使其产生重组抗原蛋白，本发明中，步骤S2具体包括以下步骤：

S21、将重组表达质粒转化至表达宿主菌中获得可以表达重组抗原蛋白TatB的重组菌株，对重组菌株进行培养至OD₆₀₀ 0.6-0.8，再于30-37℃、180-240rpm条件下，使用浓度为0.3-0.5mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达4-8h；

S22、将诱导表达后的菌液离心弃去上清液得沉淀菌体，沉淀菌体加入缓冲液A混悬均匀，破碎菌体处理后，离心弃沉淀，上清液经抽滤瓶过0.45μm滤膜抽滤备用。

上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB的制备方法，所述表达质粒载体为pET28a(+)；所述宿主菌为大肠杆菌。

上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB的制备方法，本发明通过镍柱亲和层析和阴离子柱交换层析对抗原蛋白进行纯化，镍柱亲和层析和阴离子柱交换层析的具体操作可以采用本领域常规操作。本发明中，所述步骤S3具体包括以下步骤：

S31、镍柱亲和层析

平衡：使用缓冲液A平衡镍柱；

上样：将所述步骤S2的上清液进行上样；

复平衡：使用缓冲液B复平衡镍柱；

洗脱：使用缓冲液C洗脱杂质蛋白；然后使用缓冲液D洗脱目的蛋白，收集洗脱液；

S32、阴离子柱交换层析

平衡：使用缓冲液E平衡阴离子柱；

上样：将所述步骤S31的洗脱液使用缓冲液E稀释后进行上样；

复平衡：使用缓冲液E复平衡阴离子柱；

洗脱：使用缓冲液F洗脱杂质蛋白；然后使用缓冲液G洗脱目的蛋白，收集洗脱液，得到幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB。

上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB的制备方法，优选地，所述缓冲液A的组成为：pH7～8的20～50mM磷酸盐缓冲液，300～500mM NaC1，0～25mM咪唑；缓冲液B的组成为：pH7～8的20～50mM磷酸盐缓冲液，100～200M NaCl，0～25mM咪唑；缓冲液C的组成为：pH7～8的20～50mM磷酸盐缓冲液，100～200mM NaCl，30～40mM咪唑；缓冲液D的组成为：pH7～8的20～50mM磷酸盐缓冲液，100～200mM NaCl，80～120mM咪唑；所述缓冲液E的组成为：pH7～8的20～50mM磷酸盐缓冲液；缓冲液F的组成为：pH7～8的20～50mM磷酸盐缓冲液，40～70mMNaCl；缓冲液G液组成为pH7～8的20～50mM磷酸盐缓冲液，120～200mM NaCl。

上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB的制备方法，本发明对菌体(细胞)破碎的方法并没有特殊的限制，所述步骤S2中，优选采用高压均质仪或超声破碎仪破碎菌体，高压均质仪破菌参数优选为：压力600～800bar，流速100～150mL/min，重复4～8次；超声破碎仪破菌参数优选为：超声3～5s，停止3～5s，交互进行破菌20～40min。进一步地，对于步骤S2中的离心操作参数也可以采用本领域中常规操作参数，优选地，离心速度为10000～14000g，离心时间为20～40min。

上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB的制备方法，镍柱和阴离子柱中的填料可以采用本领域常规填料，优选地，所述镍柱中的填料优选采用Ni-琼脂糖HP(Ni-Sepharose HP)；所述阴离子柱中的填料优选采用Q-琼脂糖HP(Q-Sepharose HP)。

本发明还提供了上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB在制备幽门螺杆菌疫苗中的应用。动物实验证明重组抗原蛋白TatB可有效刺激机体产生较高水平的免疫应答，具有较高免疫活性，同时经免疫保护力评价实验证实TatB疫苗具有良好的保护效果，证明了重组抗原蛋白TatB具有疫苗应用价值。本发明将选定的抗原基因克隆至的蛋白表达载体，重组在工程菌内进行大规模表达，经过纯化制备后的抗原可以用作基因工程亚单位疫苗。而作为幽门螺杆菌膜转运蛋白中的重要组成蛋白，重组抗原蛋白TatB也将是幽门螺杆菌基因工程疫苗研制过程中最有希望的候选抗原之一。

本发明提供的幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB及其制备方法与应用具有以下有益效果：

(1)本发明提供的幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB，具有较高的表达效率。本发明根据“反向免疫学”原理，通过数据分析获得了幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB的如SEQ ID NO:1所示的编码氨基酸序列，对其序列进行了针对表达宿主菌株的密码子优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，将获得的核苷酸序列通过全化学合成构建至表达载体质粒pET28a(+)并转化至重组蛋白表达宿主大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行诱导表达，表达的重组蛋白表达量高于37％。

(2)本发明提供的幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB的制备方法，纯化工艺简单，纯化产物的纯度高于99％，重复性好，回收率高。说明该重组抗原蛋白TatB便于大量制备，具有良好的应用基础。

(3)本发明提供的幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB，具有较高的免疫活性和免疫保护效果。当将纯化获得的蛋白与氢氧化铝佐剂共同注射免疫BalB/c小鼠，TatB加免疫佐剂组血清中IgG水平显著高于阴性对照组(PBS组)P<0.01，免疫小鼠产生的最高抗体效价达到1:64000，免疫后抗体阳性率达到100％，证明该重组抗原蛋白TatB可有效刺激机体产生较高的免疫应答，具有较高免疫活性；当重组抗原蛋白TatB与LTs63K佐剂联合滴鼻免疫小鼠后检测重组抗原蛋白TatB免疫小鼠产生的sIgA抗体效价达到1:256；免疫后抗体阳性率达到100％，说明重组抗原蛋白TatB能够刺激小鼠产生较高水平黏膜免疫应答。同时经免疫保护力评价实验证实TatB疫苗具有良好的保护效果，证明了重组抗原蛋白TatB具有疫苗应用价值，为重组幽门螺杆菌疫苗研制提供了新的抗原选择。

附图说明

图1为pET28a(+)/TatB质粒双酶切鉴定结果，泳道1为重组质粒，泳道2位酶切后鉴定结果，分离片段约为5000bp和350bp；

图2为TatB蛋白诱导鉴定结果，泳道1为菌体破碎悬液，泳道2为菌体破碎液上清，泳道3为菌体破碎沉淀重悬液；

图3为镍柱亲和层析后SDS-PAGE电泳结果，泳道1为上样，泳道2为流穿，泳道3-7为目的蛋白洗脱；

图4为离子柱层析后SDS-PAGE电泳结果，泳道1为上样，泳道2为流穿，泳道3-4为目的蛋白洗脱；

图5为制备的LTs63K SDS-PAGE电泳结果，泳道1为上样，泳道2为流穿，泳道3-5为目的蛋白洗脱；

图6所示为特异性抗体IgG检测结果。

图7所示为特异性抗体sIgA检测结果。

具体实施方式

以将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明。

以下实施例中，所使用大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)购自成都博奥晨曦生物科技有限公司，申请人保存；所使用幽门螺杆菌菌株Helicobacter pylori ATCC700824购自美国菌种保藏中心，申请人保存；DNA Marker、限制性内切酶Nco I和Xho I、核酸Marker为Takara公司产品、蛋白Marker为Thermo Fisher公司产品；质粒提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。镍柱亲和填料为Ni-Sepharose HP(cytiva)，阴离子柱使用填料为Q-Sepharose HP(cytiva)。离心机的型号为Beckman Coulter，JXN-26。

实施例1

本实施例提供的幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB，通过以下步骤制备获得：

S1、质粒构建

将核苷酸序列为SEQ ID NO:2的基因作为目的基因片段，将该目的基因片段连接在表达载体质粒中构建含有目的基因片段的重组表达质粒，步骤S1具体包括以下步骤：

S11、通过“反向免疫学”原理，设计筛选获得潜在幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB编码氨基酸序列，根据氨基酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得目的基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

S12、对目的基因进行全基因合成(武汉金开瑞生物工程有限公司完成)，通过XhoI和Nco I的酶切位点连接到表达载体pET28a(+)构建重组表达质粒，质粒测序结果与目的基因比对序列完全相同，经过结果分析确认无氨基酸突变。从重组TatB-pET28a(+)-E.coliTop 10菌株中提取重组质粒，进行双酶切验证，酶切条带大小与理论结果一致，结果如图1所示，泳道1为重组质粒，泳道2位酶切后鉴定结果，分离片段约为5000bp和350bp。

S2、诱导表达

将重组表达质粒转化至重组蛋白表达的宿主菌中，，并对重组菌株进行诱导表达，收集诱导表达后的菌体，破碎处理后离心并收集上清液，步骤S2具体包括以下步骤：

S21、将重组质粒转化表达菌株E.coli BL21(DE3)，获得可以表达TatB的重组大肠杆菌TatB-pET28a(+)-E.coli BL21(DE3)。重组菌株进行平板划线复苏培养过夜，将过TatB-pET28a(+)-E.coli BL21(DE3)平板单菌落接种60mL卡那霉素抗性的LB培养基，220rpm 37℃过夜培养，再将过夜培养的SecG-pET28a(+)-E.coli BL21(DE3)60mL接种至6L卡那霉素抗性的TB培养基中，220rpm、37℃培养2h，至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入1M IPTG 3mL，使其IPTG终浓度为0.5mM，恒温摇床中220rpm、37℃诱导表达4h。

S22、使用冷冻落地式离心机将诱导表达后的菌液8000g离心20min，收集菌体。取10g湿菌加入300mL缓冲液A(50mM PB，500mM NaCl，25mM咪唑，pH 7.4)重悬菌体后，将菌液进行高压均质仪破碎细胞，细胞破碎液12000g离心30min收集上清液，上清液经抽滤瓶过0.45μm滤膜抽滤备用。

S3、产物纯化

将上清液依次经镍柱亲和层析、阴离子柱交换层析纯化后，获得幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB，重组抗原蛋白TatB的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。步骤S3具体包括以下步骤：

平衡：纯化仪上使用缓冲液A(50mM PB，500mM NaCl，25mM咪唑，pH 7.4)平衡镍柱；

上样：取步骤S22的上清液进行上样；

复平衡：使用缓冲液B(50mM PB，150mM NaCl，25mM咪唑，pH 7.4)复平衡镍柱；

洗脱：使用缓冲液C(50mM PB，150mM NaCl，35mM咪唑，pH 7.4)洗脱杂质蛋白；然后使用缓冲液D(50mM PB，150mM NaCl，100mM咪唑，pH 7.4)洗脱目的蛋白，收集洗脱液，纯化电泳结果如图3所示，泳道1为上样，泳道2为流穿，泳道3-7为目的蛋白洗脱。

S32、阴离子柱交换层析

平衡：使用缓冲液E(20mM PB，pH 7.4)平衡阴离子柱；

上样：将步骤S31的洗脱液使用缓冲液E(20mM PB，pH 7.4)稀释10倍后进行上样；

复平衡：使用缓冲液E(20mM PB，pH 7.4)复平衡阴离子柱；

洗脱：使用缓冲液F(20mM PB，50mM NaCl，pH 7.4)洗脱杂质蛋白；然后使用缓冲液G(20mM PB，150mM NaCl，pH 7.4)洗脱目的蛋白，收集A280指示的蛋白洗脱峰，得到幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB，该重组抗原蛋白TatB的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。经15％SDS-page灰度分析检测蛋白纯度，BCA法进行浓度测定后-80℃保存备用。纯化电泳结果如图4所示，泳道3-4为目的蛋白洗脱，经15％SDS-PAGE检测，洗脱液呈单一目标蛋白条带，分子质量约为16.8kDa，获得的纯化蛋白纯度为99.2％。

实施例2

本实施例将对重组菌株的表达效率进行验证分析，具体包括以下步骤：

S1、质粒构建

S11、通过“反向免疫学”原理，设计筛选获得潜在幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB编码氨基酸序列，重组抗原蛋白TatB编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。根据氨基酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得目的基因片段，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示(下划线部分表示酶切位点)。

S12、对目的基因进行全基因合成，通过Xho I和Nco I的酶切位点连接到表达载体pET28a(+)构建重组表达质粒，质粒测序结果与目的基因比对序列完全相同，经过结果分析确认无氨基酸突变。从重组TatB-pET28a(+)-E.coli Top 10菌株中提取重组质粒，进行双酶切验证，酶切条带大小与理论结果一致，结果如图1所示。

S2、诱导表达

将重组表达质粒转化至重组蛋白表达的宿主菌中，并对重组菌进行诱导表达，收集诱导表达后的菌体，破碎处理后进行电泳分析鉴定，步骤S2具体包括以下步骤：

S21、将重组质粒转化表达菌株E.coli BL21(DE3)，获得可以表达TatB的重组大肠杆菌TatB-pET28a(+)-E.coli BL21(DE3)。重组菌株进行平板划线复苏培养过夜，将TatB-pET28a(+)-E.coli BL21(DE3)平板单菌落接种10mL卡那霉素抗性的LB培养基，220rpm、37℃过夜培养，取过夜培养的菌液200μL转接至20mL卡那霉素抗性的LB培养基中，220rpm 37℃培养2-3h，二次活化至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入1M IPTG 10μL，使IPTG终浓度为0.5mM，再置于恒温摇床220rpm、37℃诱导表达4h。

S22、使用冷冻落地式离心机将诱导表达后的菌液8000g离心10min，弃去上清，取0.5g沉淀菌体加入4mL缓冲液A(50mM PB，500mM NaCl，25mM咪唑，pH 7.4)混悬均匀，冰浴超声破碎细胞10min(功率100w，超声3s停止3s)，4℃、10000g离心10min，分离上清及沉淀。

S23、加入4mL缓冲液A重悬沉淀，分别取裂菌液、上清、重悬沉淀各40μL加入10μL 5×蛋白上样缓冲液(生工，货号：C508320-0010)，100℃金属浴10min。

S24、将处理好的裂解菌液、离心上清和离心沉淀重悬液分别取10μL作为样品上样，进行12％的SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色后，通过凝胶扫描成像系统(BIO-RAD，ChemiDocTM MP Imaging System)扫描成像。如图2所示，泳道1为菌体破碎悬液，泳道2为菌体破碎液上清，泳道3为菌体破碎沉淀重悬液，灰度分析结果表明，重组抗原蛋白TatB在TatB-pET28a(+)-E.coli BL21(DE3)中呈可溶性表达，表达量占总蛋白37％。

实施例3

本实施例将以实施例1中制备的重组抗原蛋白TatB作为抗原，进行动物免疫实验，具体如下。

S1、重组抗原蛋白TatB与氢氧化铝联合免疫小鼠

以实施例1中制备的重组抗原蛋白TatB作为抗原，配合氢氧化铝佐剂，通过肌肉注射免疫小鼠，免疫结束后检测小鼠血清中的特异性抗体，鉴定重组蛋白的免疫原性。

实验动物：BalB/c小鼠：40只，8-10周龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，分组如表1所示。

表1重组抗原蛋白TatB与氢氧化铝佐剂联合免疫小鼠实验分组

50μg重组抗原蛋白TatB或等体积PBS和氢氧化铝佐剂1：1混合，4℃吸附30min，双侧大腿肌肉注射，50μL/侧，共100μL/鼠。分别于0、14、21、28天进行四次免疫。

S2、重组抗原蛋白TatB与LTs63K佐剂联合滴鼻免疫小鼠

实验动物：BalB/c小鼠，雌性，8-10周龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，LTs63K自制(制备方法如文献：冯强.重组大肠杆菌不耐热肠毒素及其突变体以及其B亚单位的构建表达与性质研究.[D].重庆大学.2003)，制备结果如图5所示，泳道1为上样，泳道2为流穿，泳道3-5为目的蛋白洗脱。动物分组如下表2所示：

表2重组抗原蛋白TatB与LTs63K佐剂联合免疫小鼠分组

50μg抗原和LTs63K佐剂混合后，混匀仪4℃轻柔混匀30min，置于冰盒中备用，吸取已配制的免疫原，缓慢滴于小鼠鼻腔小鼠：9μL/侧，共18μL/鼠；分别于0、14、21、28天进行四次免疫，注射剂量与免疫方式同上。

S3、小鼠特异性抗体检测

S31、抗原TatB与氢氧化铝佐剂联合免疫小鼠后血清特异性抗体IgG Elisa检测

免疫5天后采集小鼠眼眶静脉血，4℃静置3h后3000rpm离心5min分离血清，Elisa检测TatB特异性血清IgG水平变化。

a、抗原包被：取包被液将TatB纯化蛋白稀释至4μg/mL，100μL/孔包被酶标板，4℃过夜。

b、封闭：封闭液300μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板后4℃保存备用。

c、标本稀释：将血清从1:4000开始进行系列倍比稀释至1:128000。

d、加样：取包被好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，每个样品做双重复，37℃孵育1h，PBST洗涤4次；

e、加二抗：用抗体稀释液1:10000稀释HRP标记羊抗小鼠IgG(生工，货号：D110087-0100)，100μL/孔，37℃孵育30min，PBST洗涤4次；

f、显色：加入底物显色液100μL/孔，37℃孵育10min后加入终止液50μL/孔，酶标仪上以450nm波长测定OD值；

g、结果判断：A_样品/A_阴性≥2.1为阳性。

其中，a中包被液为0.05mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH9.6(15mM Na₂CO₃，35mMNaHCO₃)；b中封闭液为10mM PBS(pH7.4)+1％BSA；d中PBST洗液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20；e中抗体稀释液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％ Tween-20+0.5％BSA；f中显色液为TMB储存液﹕底物缓冲液﹕3％过氧化氢＝10﹕90﹕1，TMB储存液为1mg/mL TMB溶于DMSO，底物缓冲液为柠檬酸0.53mM(pH5.0)、Na₂HPO₄ 100mM；f中终止液为2M H₂SO₄。

检测结果如图6所示：检测重组TatB蛋白免疫小鼠产生的最高抗体效价达到1：64000，TatB免疫小鼠对重组TatB的几何平均滴度为1:46987.85，免疫后抗体阳性率达到100％，说明本发明获得的重组TatB蛋白能够使免疫小鼠体产生免疫反应，产生特异性抗体，证明了本发明获得的TatB具有较高的免疫原性和免疫效价。

表3 TatB免疫后小鼠血清IgG几何平均滴度

S32、抗原TatB与LTs63K佐剂联合滴鼻免疫小鼠后阴道灌洗液特异性抗体sIgAElisa检测

第四次免疫后5天，用PBST(含0.05％吐温20的PBS)采集BalB/c小鼠阴道灌洗液，75μL/次，灌洗4次，收集300μL/鼠。采集后涡旋1min，12000g离心3min取上清液用于Elisa检测TatB特异性sIgA水平变化。具体步骤如下：

a、抗原包被：取包被液将TatB纯化蛋白稀释至4μg/mL，100μL/孔包被酶标板，4℃过夜；

b、封闭：封闭液300μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板后4℃保存备用；

c、标本稀释：将血清从1:16开始进行系列倍比稀释至1:256；

e、加二抗：用抗体稀释液1:10000稀释HRP标记羊抗小鼠IgA(Abcam，货号：Ab97235)，100μL/孔，37℃孵育30min，PBST洗涤4次；

g、结果判断：A_样品/A_阴性≥2.1为阳性。

其中，a中包被液为0.05mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH9.6(15mM Na₂CO₃，35mMNaHCO₃)；b中封闭液为10mM PBS(pH7.4)+1％BSA；d中PBST洗液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20；e中抗体稀释液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20+0.5％BSA；f中显色液为TMB储存液﹕底物缓冲液﹕3％过氧化氢＝10﹕90﹕1，TMB储存液为1mg/mL TMB溶于DMSO，底物缓冲液为柠檬酸0.53mM(pH5.0)、Na₂HPO₄ 100mM；f中终止液为2M H₂SO。

检测结果如图7所示：检测TatB蛋白抗原免疫小鼠产生的sIgA抗体效价达到1:256；TatB免疫小鼠对重组TatB的几何平均滴度为1:174.9，如表4所示；免疫后抗体阳性率达到100％，说明本发明获得的重组抗原蛋白TatB能够刺激小鼠产生黏膜免疫应答，产生特异性分泌抗体。

表4 TatB免疫后小鼠阴道灌洗液sIgA几何平均滴度

实施例4

本实施例将对实施例1制备的重组抗原蛋白TatB免疫后攻毒保护力进行实验分析评价，具体如下。

S1、小鼠灌胃：在实施例3中的所述的末次滴鼻免疫后10天对小鼠口服灌胃H.pylori ATCC700824活菌进行攻毒实验，灌胃前24h断食，17h断水，每只小鼠感染剂量为2.0×10⁷CFU，灌胃后2h恢复水食。

S2、平板培养：灌胃后一周宰杀小鼠，取胃组织剪碎后放入PBS缓冲液中，涡旋洗涤3min，将洗涤原液与其10倍稀释液涂布于含有5％脱纤维绵羊血(南京茂捷生物)与0.5％复合抗生素(万古霉素1.67mg/mL、多粘菌素0.0694mg/mL、甲氧苄啶0.5mg/mL、两性霉素B0.2mg/m)的Skirrow平板上(月示蛋白胨15g/L(海博生物)、胰蛋白胨2.5g/L(Oxoid)、酵母浸粉5g/L(Oxoid)、氯化钠5g/L(科隆试剂)、pH7.4)，37℃微需氧(5％O₂、10％CO₂、85％N₂)培养2-3d后观察。

S3、分析鉴定：结合幽门螺杆菌菌落特征，采用快速尿素酶试剂以及镜检等方式结合来检测平板上是否长出幽门螺杆菌，以此来确定小鼠的感染率。其中，疫苗保护率＝(对照组感染阳性率-免疫组感染阳性率)/对照组感染阳性率*100％。

S4、结果统计：对照组与实验组各20只小鼠平板培养情况统计如表5所示，对照组20只小鼠平板培养检测均为阳性，感染率为100％，实验组小鼠20只小鼠中有14只小鼠平板培养阳性，感染率为70％，得出本疫苗的保护效率为30％。说明本发明获得的重组抗原蛋白TatB能够诱导小鼠产生较强的免疫应答，并且能抑制小鼠胃内的幽门螺杆菌定植，对幽门螺杆菌感染产生保护预防效果。

表5小鼠免疫后攻毒幽门螺杆菌感染阳性率统计

注:“+”表示为快速尿素酶试剂与镜检均为阳性，“-”表示为快速尿素酶试剂与镜检阴性

本领域的普通技术人员将会意识到，这里的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB，其特征在于：所述重组抗原蛋白TatB的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB，其特征在于：所述重组抗原蛋白TatB的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、质粒构建

S2、诱导表达

S3、产物纯化

将上清液依次经镍柱亲和层析、阴离子柱交换层析纯化后，获得幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB，所述重组抗原蛋白TatB的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB的制备方法，其特征在于：所述步骤S1包括以下步骤：

S11、筛选获得幽门螺杆菌抗原TatB编码氨基酸序列，根据氨基酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得目的基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

5.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB的制备方法，其特征在于：所述步骤S2包括以下步骤：

S21、将重组表达质粒转化至表达宿主菌中获得可以表达重组抗原蛋白TatB的重组菌株，对重组菌株进行培养至OD₆₀₀ 0.6-0.8，再于30-37℃、180-240rpm条件下，使用浓度为0.3-0.5mM异丙基硫代半乳糖苷诱导表达4-8h；

6.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB的制备方法，其特征在于：所述步骤S3具体包括以下步骤：

S31、镍柱亲和层析

平衡：使用缓冲液A平衡镍柱；

上样：取所述步骤S2的上清液进行上样；

复平衡：使用缓冲液B复平衡镍柱；

S32、阴离子柱交换层析

平衡：使用缓冲液E平衡阴离子柱；

上样：将所述步骤S31的洗脱液使用缓冲液E稀释后进行上样；

复平衡：使用缓冲液E复平衡阴离子柱；

7.根据权利要求6所述的幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB的制备方法，其特征在于：所述缓冲液A的组成为：pH7～8的20～50mM磷酸盐缓冲液，300～500mM NaC1，0～25mM咪唑；缓冲液B的组成为：pH7～8的20～50mM磷酸盐缓冲液，100～200M NaCl，0～25mM咪唑；缓冲液C的组成为：pH7～8的20～50mM磷酸盐缓冲液，100～200mM NaCl，30～40mM咪唑；缓冲液D的组成为：pH7～8的20～50mM磷酸盐缓冲液，100～200mM NaCl，80～120mM咪唑；所述缓冲液E的组成为：pH7～8的20～50mM磷酸盐缓冲液；缓冲液F的组成为：pH7～8的20～50mM磷酸盐缓冲液，40～70mM NaCl；缓冲液G液组成为pH7～8的20～50mM磷酸盐缓冲液，120～200mMNaCl。

8.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，采用高压均质仪或超声破碎仪破碎菌体，高压均质仪破菌参数为：压力600～800bar，流速100～150mL/min，重复4～8次；超声破碎仪破菌参数为：超声3～5s，停止3～5s，交互进行破菌20～40min。

9.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB的制备方法，其特征在于：所述表达质粒载体为pET28a(+)；所述宿主菌为大肠杆菌。

10.权利要求1或2所述幽门螺杆菌重组抗原蛋白TatB在制备幽门螺杆菌疫苗中的应用。