CN116640190B - 一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f及其制备方法与应用 - Google Patents
一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了一种编码幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f的核酸，其序列如SEQ NO:2所示。本发明提供的幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f，具有较高的表达效率，较高的免疫活性和良好的免疫保护效果，且制备方法工艺简单、成本低、可操作性强，为重组幽门螺杆菌疫苗研制提供了新的抗原选择。
Description
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及幽门螺杆菌重组抗原蛋白，具体涉及一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f及其制备方法与应用。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是一种感染率极高的致病菌。据相关统计数据，超过一半的世界人口感染了幽门螺杆菌。幽门螺杆菌可引起胃部持续炎症，且与许多胃肠疾病有关，包括消化性溃疡、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等。并且幽门螺杆菌感染是引发胃癌的最大危险因素，该细菌被世界卫生组织列为I类致癌物。根除幽门螺旋杆菌可以减轻胃炎，降低许多并发症的风险，临床上针对于幽门螺杆菌感染主要采用“三联”或“四联”的抗生素疗法来抑制或者清除患者体内的幽门螺杆菌。随着时间的推移，由于抗生素抗药性的增加，标准三联疗法的治愈率正在下降，尤其是克拉霉素。在克拉霉素耐药率高的地区，治疗成功率低于80％。对于这些地区，相关医学组织建议采用含铋四联疗法，然而四种药物的联合使用必然导致更高的成本和更多的副作用。
由于微生物耐药性导致的治疗失败案例增多，使通过根除有风险的幽门螺杆菌来预防高危人群胃癌的策略成为研究热点，开发一种有效的疫苗是预防幽门螺杆菌感染并最终预防胃癌的有效选择。针对幽门螺杆菌等粘膜病原体开发一种有效的长期保护性疫苗是非常具有挑战性的，需要从多个方面着手，首先需要确定必需的和高度保守的抗原。
以往对于幽门螺杆菌抗原的临床研究大多集中在幽门螺杆菌毒力因子上；包括选用幽门螺杆菌细胞毒素(如液泡细胞毒素A (VacA))，免疫调节剂中性粒细胞激活蛋白(NAP)，粘连素(如幽门螺杆菌粘附素A (HpaA)或唾液酸结合粘附素(SabA))，以及酸中和酶脲酶作为疫苗抗原。然而，大部分已知抗原蛋白都存在着免疫活性较低、重组表达效率低导致蛋白大量制备困难等问题。因此，对幽门螺杆菌疫苗进一步的研究急需开发出多种更加全面有效的免疫抗原。
发明内容
本发明目的旨在提供了一种新型幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f，具有良好的免疫抗原性，能够诱导高效的黏膜免疫应答。
本发明另一目的提供编码上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f的核酸。
本发明第三个目的提供上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f的制备方法，在重组表达的基础上通过包涵体洗涤、镍离子亲和层析和阳离子交换层析三步纯化得到高纯度的抗原蛋白。
本发明第四个目的旨在提供上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f的用途。
由于幽门螺杆菌表现出极高的遗传变异性，在不同的幽门螺杆菌菌株中，低保守性的抗原容易发生免疫逃避，保护率低，免疫原性较差。在幽门螺杆菌基因工程疫苗研发过程中，具有较高免疫活性的抗原蛋白种类较少，现有已知基因的重组抗原普遍存在免疫效价较低或者难以大量制备等问题。
目前生物信息学是生物学研究热点，本发明利用对数据库中多种幽门螺杆菌抗原蛋白结构的学习，根据“反向免疫学”原理筛选出针对幽门螺杆菌的一种新型免疫重组抗原蛋白RlpA f。重组抗原蛋白RlpA f的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。稀有脂蛋白A(RlpA)是幽门螺杆菌中一种外膜蛋白，参与多蛋白和多酶分裂体及伸长酶体的组装。RlpA体系包括多个亚基蛋白质，在幽门螺杆菌菌体分裂和延伸过程中参与肽聚糖细胞壁合成或降解，此前尚未有研究表明幽门螺杆菌的RlpA f蛋白能作为幽门螺杆菌特异性抗原引起机体免疫反应。
本发明还提供了编码上述重组抗原蛋白RlpA f的核酸，该核酸序列如SEQ ID NO:2所示。该重组抗原蛋白RlpA f是通过选择幽门螺杆菌基因组编码蛋白中呈现高特异性的肽段编码基因作为目的基因片段，并将该目的基因片段通过原核表达载体导入宿主细胞中进行表达而制备得到，该目的基因片段具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列(下划线部分表示酶切位点)。
本发明还提供了上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f的制备方法，将选定的RlpAf抗原基因克隆至的蛋白表达载体，重组在工程菌内进行大规模表达，经过纯化制备后的抗原可以用作基因工程亚单位疫苗，纯化工艺简单、成本低、可操作性强。
本发明提供的一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f制备方法，包括以下步骤：
S1、质粒构建
将核酸序列为SEQ ID NO:2的基因作为目的基因片段，将该目的基因片段连接在表达载体质粒中构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；
S2、诱导表达
将所述重组表达质粒转化至重组蛋白表达的宿主菌中进行诱导表达，收集诱导表达后的菌体；
S3、产物纯化
对收获的菌体进行破碎处理后离心并收集沉淀，将沉淀依次经包涵体洗涤、镍柱亲和层析、阳离子柱交换层析纯化后，获得幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f，所述重组抗原蛋白RlpA f的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f的制备方法，重组表达质粒的构建为本领域的常规操作。本发明通过“反向免疫学”原理，设计筛选获得潜在幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f编码氨基酸序列，根据氨基酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得核酸序列如SEQ ID NO:2所示目的基因片段，最后将该目的基因片段通过双酶切连接在表达载体质粒中获得重组表达质粒。本领技术人员可以采用常规手段获得重组表达质粒，本发明中，步骤S1具体包括以下分步骤：
S11、筛选获得幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f氨基酸序列，如SEQ ID NO:1所示；根据氨基酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得目的基因片段，核酸序列如SEQ IDNO:2所示；
S12、对S11中的得到的核酸序列进行全基因合成，并通过Xho I和Nco I的酶切位点连接到表达载体质粒中完成重组表达质粒构建。
上述步骤S12中，所述表达载体质粒为pET28a(+)。
上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f的制备方法，步骤S2诱导表达为本领域的常规操作，本发明对此并无特殊限制，本领域技术人员可以根据常规方式对重组菌株进行诱导表达使其产生重组抗原蛋白，本发明中，步骤S2具体操作为：将重组表达质粒转化至表达宿主菌中获得可以表达重组抗原蛋白RlpA f的重组菌株，对重组菌株进行培养至OD6000.6-0.8，再于30-37℃、180-240rpm条件下，使用浓度为0.3-0.5mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达4-8h；将诱导表达后的菌液离心弃去上清液得沉淀菌体。上述所述宿主菌为大肠杆菌。
上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f的制备方法，步骤S3通过包涵体洗涤、镍柱亲和层析及阳离子柱交换层析对抗原蛋白进行纯化，镍柱亲和层析和阳离子柱交换层析的具体操作可以采用本领域常规操作。本发明中，所述步骤S3具体包括以下分步骤：
S31、包涵体洗涤
破菌：破碎菌体细胞，离心收集破菌沉淀；
洗涤：使用缓冲液A及缓冲液B交替洗涤破菌沉淀；所述缓冲液A的组成为：pH7～8的20～50mM磷酸盐缓冲液，含300～500mM NaC1，50-100U核酸酶，1-2mM MgCl2；缓冲液B的组成为：pH7～8的20～50mM磷酸盐缓冲液，含0.5％-2％Triton X-100，0.5-1.5mM EDTA，100～200mM NaCl；
溶解：使用缓冲液C充分溶解洗涤后的破菌沉淀并离心去除不溶杂质；缓冲液C的组成为：pH7～8的20～50mM磷酸盐缓冲液，含4-8M尿素，300～500mM NaC1，10～20mM咪唑；
过滤：取上清液经抽滤备用；
S32、镍柱亲和层析
平衡：使用缓冲液C平衡镍柱；
上样：将所述步骤S31的上清液进行上样；
复平衡：使用缓冲液C复平衡镍柱；
洗脱：使用缓冲液D洗脱杂质蛋白；然后使用缓冲液E洗脱目的蛋白，收集洗脱液；缓冲液D的组成为：pH7～8的20～50mM磷酸盐缓冲液，含4-8M尿素，100～200mM NaCl，20～40mM咪唑；所述缓冲液E的组成为：pH7～8的20～50mM磷酸盐缓冲液，含4-8M尿素，100～200mM NaCl，50～70mM咪唑；
S33、阳离子柱交换层析
平衡：使用缓冲液F平衡阳离子柱；缓冲液F的组成为：pH7～8的10～20mM磷酸盐缓冲液，含4-8M尿素；
上样：将所述步骤S32的洗脱液使用缓冲液F稀释后进行上样；
复平衡：使用缓冲液F复平衡阳离子柱；
复性：使用缓冲液G柱上复性；缓冲液G液组成为pH7～8的10～20mM磷酸盐缓冲液，含0.5％-1％精氨酸，10～30mM NaCl；
洗脱：使用缓冲液H洗脱杂质蛋白；然后使用缓冲液I洗脱目的蛋白，收集洗脱液，获得幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f；缓冲液H液组成为pH7～8的10～20mM磷酸盐缓冲液，含0.5％-1％精氨酸，40～60mM NaCl；缓冲液I液组成为pH7～8的10～20mM磷酸盐缓冲液，含0.5％-1％精氨酸，200～400mM NaCl。
上述步骤S31中，对菌体(细胞)破碎的方法并没有特殊的限制，本发明优选采用高压均质仪或超声破碎仪破碎菌体，高压均质仪破菌参数优选为：压力600～800bar，流速100～150mL/min，重复4～8次；超声破碎仪破菌参数优选为：超声3～5s，停止3～5s，交互进行破菌20～40min。离心操作参数也可以采用本领域中常规操作参数，优选地，离心速度为10000～14000g，离心时间为20～40min。
上述步骤S32和S33中，镍柱和阳离子柱中的填料可以采用本领域常规填料，优选地，所述镍柱中的填料优选采用Ni-琼脂糖HP(Ni-Sepharose HP)；所述阳离子柱中的填料优选采用SP-琼脂糖HP(SP-Sepharose HP)。
本发明还提供了上述幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f的用途，用于制备幽门螺杆菌疫苗。动物实验证明重组抗原蛋白RlpA f可有效刺激机体产生较高水平的免疫应答，具有较高免疫活性，同时经免疫保护力评价实验证实RlpA f疫苗具有良好的保护效果，证明了重组抗原蛋白RlpA f具有疫苗应用价值，可以用作基因工程亚单位疫苗。而作为幽门螺杆菌膜转运蛋白中的重要组成蛋白，重组抗原蛋白RlpA f也将是幽门螺杆菌基因工程疫苗研制过程中最有希望的候选抗原之一。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f，具有较高的表达效率，表达的重组蛋白表达量高于35％。
(2)本发明提供的幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f的制备方法，纯化工艺简单，纯化产物的纯度高于98％，重复性好，回收率高。说明该重组抗原蛋白RlpA f便于大量制备，具有良好的应用基础。
(3)本发明提供的幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f，具有较高的免疫活性和免疫保护效果；使用纯化获得的蛋白与氢氧化铝佐剂共同注射免疫Balb/C小鼠，RlpA f加免疫佐剂组血清中IgG水平显著高于阴性对照组(PBS组)P<0.01，免疫小鼠产生的最高抗体效价达到1:131072，免疫后抗体阳性率达到100％，证明该重组抗原蛋白RlpA f可有效刺激机体产生较高的免疫应答，具有较高免疫活性；当重组抗原蛋白RlpA f与LTs63K佐剂联合滴鼻免疫小鼠后检测重组抗原蛋白RlpA f免疫小鼠产生的sIgA抗体效价达到1:128；免疫后抗体阳性率达到100％，说明重组抗原蛋白RlpA f能够刺激小鼠产生较高水平黏膜免疫应答。同时经免疫保护力评价实验证实RlpA f疫苗具有良好的保护效果，证明了重组抗原蛋白RlpA f具有疫苗应用价值，为重组幽门螺杆菌疫苗研制提供了新的抗原选择。
附图说明
图1为pET28a(+)/RlpA f质粒双酶切鉴定结果，泳道1为重组质粒，泳道2为酶切后鉴定结果，分离片段约为860bp。
图2为RlpA f蛋白诱导鉴定结果，泳道1为菌体破碎悬液，泳道2为菌体破碎液上清，泳道3为菌体破碎沉淀重悬液。
图3为镍柱亲和层析后SDS-PAGE电泳结果，泳道1为上样，泳道2为流穿，泳道3、4为目的蛋白洗脱。
图4为离子柱层析后SDS-PAGE电泳结果，泳道1为上样，泳道2为流穿，泳道3、4为杂质洗脱，泳道5-7为目的蛋白洗脱。
图5为制备的LTs63K SDS-PAGE电泳结果，泳道1为上样，泳道2为流穿，泳道3-5为目的蛋白洗脱。
图6为特异性抗体IgG检测结果，R-Al为抗原联合铝佐剂组，Al为佐剂对照组。
图7为特异性抗体sIgA检测结果，A为抗原联合佐剂组，B为佐剂对照组。
具体实施方式
以将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明。
以下实施例中，所使用大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)购自成都博奥晨曦生物科技有限公司；所使用幽门螺杆菌菌株Helicobacter pylori ATCC700824购自美国菌种保藏中心；DNA Marker、限制性内切酶Nco I和Xho I、核酸Marker为Takara公司产品；蛋白Marker为Thermo Fisher公司产品；质粒提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品；镍柱亲和填料为Ni-Sepharose HP(cytiva)，阳离子柱使用填料为SP-Sepharose HP(cytiva)；离心机的型号为Beckman Coulter，JXN-26。
实施例1
本实施例将对重组菌株的表达效率进行验证分析，具体包括以下步骤：
S1、质粒构建
将核苷酸序列为SEQ ID NO:2的基因作为目的基因片段，将该目的基因片段连接在表达载体质粒中构建含有目的基因片段的重组表达质粒，步骤S1具体包括以下步骤：
S11、通过“反向免疫学”原理，设计筛选获得潜在幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f编码氨基酸序列，如SEQ ID NO:1所示；根据氨基酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得目的基因片段，核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:1如下：
MAVKKNGVKNLSYKHESLRAYENAKDYDPTTKKATYKRNFFERHFKHHTDSQDSNTKQPLDNGMRDSSAIQRATMRPYQVGGKWYYPTKVDLGEKFDGIASWYGPNFHAKKTSNGEIYNMYAHTAAHKTLPMNTVVKVINVDNNSSTIVRINDRGPFVSDRIIDLSNAAARDIDMVQKGTASVRLQYEQSFNANYSKILHKEFKVGESEKSVSGGKFSLQMGAFRNQIGAQTLADKLQTENKNYSVKVAFKDDLYKVLVQGFQSEEEARDFMKKYNQNAVLTRELE。
SEQ ID NO:2如下(下划线部分表示酶切位点)：
CCATGGCAGTGAAGAAGAACGGGGTCAAGAACCTTAGTTACAAGCACGAATCATTGCGTGCCTACGAGAACGCGAAGGACTACGACCCGACGACGAAGAAAGCGACCTACAAACGTAATTTCTTCGAGCGTCACTTCAAACATCATACAGATTCTCAAGATTCAAACACGAAACAGCCCTTAGATAATGGAATGCGCGATAGCAGTGCTATTCAGCGTGCCACTATGCGCCCATACCAGGTTGGAGGCAAGTGGTACTATCCTACCAAAGTTGACTTAGGGGAGAAATTCGATGGAATTGCGTCTTGGTATGGACCTAACTTTCACGCAAAGAAAACCTCAAACGGGGAAATTTATAATATGTACGCACACACCGCTGCGCACAAAACCTTGCCTATGAATACCGTCGTAAAAGTAATTAACGTTGACAATAATTCATCAACAATCGTGCGTATTAATGATCGTGGGCCGTTCGTATCCGATCGTATCATTGACTTGTCGAACGCAGCCGCCCGCGATATTGACATGGTGCAAAAGGGAACTGCCAGCGTTCGTTTACAATATGAACAATCATTCAATGCTAACTACTCTAAGATTTTGCACAAAGAATTTAAAGTGGGTGAGTCCGAAAAGTCTGTGTCCGGCGGCAAATTTAGCCTTCAGATGGGTGCGTTCCGCAATCAGATTGGCGCCCAGACACTGGCGGACAAGTTACAGACCGAAAACAAGAACTACTCAGTGAAAGTGGCGTTCAAGGACGACCTGTATAAAGTTCTTGTACAAGGTTTCCAATCCGAAGAGGAAGCACGCGACTTTATGAAGAAATATAACCAAAATGCAGTACTGACACGCGAACTCGAG。
S12、对S11中的得到的核酸序列进行全基因合成，并通过Xho I和Nco I的酶切位点连接到表达载体质粒中完成重组表达质粒构建；质粒测序结果与目的基因比对序列完全相同，经过结果分析确认无氨基酸突变。从重组RlpA f-pET28a(+)-E.coli Top 10菌株中提取重组质粒，进行双酶切验证，酶切条带大小与理论结果一致，结果如图1所示，泳道1为重组质粒，泳道2位酶切后鉴定结果，分离片段约为860bp。
S2、诱导表达
将重组表达质粒转化至重组蛋白表达的宿主菌中，并对重组菌进行诱导表达，收集诱导表达后的菌体，破碎处理后进行电泳分析鉴定。
本步骤具体包括以下分步骤：
S21、将重组质粒转化表达菌株E.coli BL21(DE3)，获得可以表达RlpA f的重组大肠杆菌RlpA f-pET28a(+)-E.coli BL21(DE3)。重组菌株进行平板划线复苏培养过夜，将RlpA f-pET28a(+)-E.coli BL21(DE3)平板单菌落接种10mL卡那霉素抗性的LB培养基，于37℃、220rpm条件下过夜培养。
37℃IPTG诱导：取过夜培养的菌液200μL转接至20mL卡那霉素抗性的LB培养基中，于37℃、220rpm条件下培养2h，二次活化至OD600为0.6时，加入1M IPTG 10μL，使IPTG终浓度为0.5mM，再置于恒温摇床于37℃、220rpm条件下诱导表达4h。
16℃IPTG诱导：取过夜培养的菌液200μL转接至20mL卡那霉素抗性的LB培养基中，于37℃、220rpm条件下培养2h，二次活化至OD600为0.6时，提前降温16℃，加入1M IPTG 10μL，使IPTG终浓度为0.5mM，再置于恒温摇床于16℃、220rpm条件下诱导表达12h。
S22、使用冷冻落地式离心机将诱导表达后的菌液8000g离心10min，弃去上清，取0.5g沉淀菌体加入4mL缓冲液A(50mM PB磷酸盐缓冲液，0.5M NaCl，pH 7.4，100U核酸酶，2mM MgCl2)混悬均匀，冰浴超声破碎细胞10min(功率100w，超声3s停止3s)得到全菌破碎液，之后对破菌液于4℃、10000g离心10min，分离上清及沉淀。
S23、加入4mL缓冲液A重悬沉淀，分别取裂菌液、上清、重悬沉淀各40μL加入10μL 5×蛋白上样缓冲液(生工，货号：C508320-0010)，100℃金属浴10min，得到处理好的全菌破碎液、离心上清和离心沉淀重悬液。
S24、将处理好的全菌破碎液、离心上清和离心沉淀重悬液分别取10μL作为样品上样，进行12％的SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色后，通过凝胶扫描成像系统(BIO-RAD，ChemiDocTM MP Imaging System)扫描成像。如图2所示，泳道1为全菌破碎液，泳道2为菌体离心上清，泳道3为菌体离心沉淀重悬液，灰度分析结果表明，重组抗原蛋白RlpA f在RlpAf-pET28a(+)-E.coli BL21(DE3)中大部分均为包涵体，表达量为35.8％。
实施例2
本实施例提供的幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f，通过以下步骤制备获得：
S1、质粒构建
将核苷酸序列为SEQ ID NO:2的基因作为目的基因片段，将该目的基因片段连接在表达载体质粒中构建含有目的基因片段的重组表达质粒，步骤S1具体包括以下分步骤：
S11、通过“反向免疫学”原理，设计筛选获得潜在幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f编码氨基酸序列，如SEQ ID NO:1所示；根据氨基酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得目的基因片段，核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
S12、对S11中的得到的核酸序列进行全基因合成，并通过Xho I和Nco I的酶切位点连接到表达载体pET28a(+)构建重组表达质粒；质粒测序结果与目的基因比对序列完全相同，经过结果分析确认无氨基酸突变。从重组RlpA f-pET28a(+)-E.coli Top 10菌株中提取重组质粒，进行双酶切验证，酶切条带大小与理论结果一致。
S2、诱导表达
将重组表达质粒转化至重组蛋白表达的宿主菌中，并对重组菌株进行诱导表达，收集诱导表达后的菌体。
本步骤中，将重组质粒转化表达菌株E.coli BL21(DE3)，获得可以表达RlpA f的重组大肠杆菌RlpA f-pET28a(+)-E.coli BL21(DE3)。重组菌株进行平板划线复苏培养过夜，将RlpA f-pET28a(+)-E.coli BL21(DE3)平板单菌落接种60mL卡那霉素抗性的LB培养基，于37℃、220rpm条件下过夜培养，再将过夜培养的RlpA f-pET28a(+)-E.coli BL21(DE3)60mL接种至6L卡那霉素抗性的TB培养基中，于37℃、220rpm条件下培养2h，至OD600为0.6时，加入1M IPTG 3mL，使其IPTG终浓度为0.5mM，恒温摇床中于37℃、220rpm条件下诱导表达4h。使用冷冻落地式离心机将诱导表达后的菌液8000g离心20min，收集菌体。
S3、产物纯化
上述获得的菌体依次经包涵体洗涤、镍柱亲和层析、阳离子柱交换层析纯化后，获得单一幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f，重组抗原蛋白RlpA f的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本步骤具体包括以下分步骤：
S31、包涵体洗涤
取20g湿菌，加入500mL缓冲液A(50mM PB磷酸盐缓冲液，0.5M NaCl，pH 7.4，100U核酸酶，2mM MgCl2)重悬菌体后，将菌液通过高压均质仪破碎细胞，细胞破碎液2000g离心10min弃上清收集沉淀；沉淀用缓冲液B(50mM PB磷酸盐缓冲液，1％Triton X-100，1mMEDTA，0.1M NaCl，pH 7.4)洗涤1次，弃上清；再取沉淀用缓冲液A洗涤1次，重复3次交替洗涤，洗涤条件为加入缓冲液振荡直至彻底分散重悬菌体，洗涤完成后12000g离心15min，弃上清。最后一次洗涤获得的沉淀加入500mL缓冲液C(50mM PB磷酸盐缓冲液，8M尿素，0.5MNaCl，10mM咪唑，pH 7.4)溶解搅拌1h后12000rpm离心30min，取上清经抽滤瓶过0.45μm滤膜抽滤备用。
S32、镍离子柱亲和层析
平衡：纯化仪上使用缓冲液C(50mM PB磷酸盐缓冲液，8M尿素，0.5M NaCl，10mM咪唑，pH 7.4)平衡镍柱；
上样：取步骤S31中的上清液上样；
复平衡：使用缓冲液C复平衡镍柱；
洗脱：使用缓冲液D(50mM PB磷酸盐缓冲液，8M尿素，0.15M NaCl，40mM咪唑，pH7.4)洗脱杂质蛋白；使用缓冲液E(50mM PB磷酸盐缓冲液，8M尿素，0.15MNaCl，60mM咪唑，pH7.4)洗脱目的蛋白，收集洗脱液，纯化电泳结果如图3所示，泳道1为上样，泳道2为流穿，泳道3、4为目的蛋白洗脱。
S33、阳离子柱交换层析
平衡：使用缓冲液F(20mM PB磷酸盐缓冲液，8M尿素，pH 7.4)平衡阳离子柱；
上样：将步骤S32的目的蛋白洗脱液使用缓冲液F稀释10倍后进行上样；
复平衡：使用缓冲液F复平衡阳离子柱；
复性：使用缓冲液G(20mM PB磷酸盐缓冲液，0.6％精氨酸，10mM NaCl，pH 7.4)柱上复性；
洗脱：使用缓冲液H(20mM PB磷酸盐缓冲液，0.6％精氨酸，60mM NaCl，pH 7.4)洗脱杂质蛋白；使用缓冲液I(20mM PB磷酸盐缓冲液，0.6％精氨酸，300mM NaCl，pH7.4)洗脱目的蛋白，收集A280指示的蛋白洗脱峰，得到幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f，该重组抗原蛋白RlpA f的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。经15％SDS-page灰度分析检测蛋白纯度，BCA法进行浓度测定后-80℃保存备用。纯化电泳结果如图4所示，泳道1为上样，泳道2为流穿，泳道3、4为杂质洗脱，泳道5-7为目的蛋白洗脱。经15％SDS-PAGE检测，洗脱液呈单一目标蛋白条带，分子质量约为33.5kDa，获得的纯化蛋白纯度为98.7％。
实施例3动物血清特异性抗体IgG检测
本实施例将以实施例2中制备的重组抗原蛋白RlpA f作为抗原，进行动物血清特异性抗体IgG检测，具体方法如下：
L1、重组抗原蛋白RlpA f与氢氧化铝联合免疫小鼠
以实施例2中制备的重组抗原蛋白RlpA f作为抗原，联合氢氧化铝佐剂，通过肌肉注射免疫小鼠，免疫结束后检测小鼠血清中的特异性抗体，鉴定重组蛋白免疫原性。
实验动物：Balb/C小鼠：40只，7-8周龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，分组如表1所示。
表1重组抗原蛋白RlpA f与氢氧化铝佐剂联合免疫小鼠实验分组
50μg重组抗原蛋白RlpA f或等体积PBS和氢氧化铝佐剂按照体积比1：1混合，于4℃吸附30min，双侧大腿肌肉注射，50μL/侧，共100μL/鼠。分别于0、14、21、28天进行四次免疫。
L2、抗原RlpA f与氢氧化铝佐剂联合免疫小鼠后血清特异性抗体IgG Elisa检测
免疫5天后采集小鼠眼眶静脉血，于4℃静置3h后3000rpm离心5min分离血清，Elisa检测RlpA f特异性血清IgG水平变化：
a、抗原包被：取包被液将RlpA f纯化蛋白稀释至4μg/mL，100μL/孔包被酶标板，4℃过夜。
b、封闭：封闭液300μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板后4℃保存备用。
c、标本稀释：将血清从1:8192开始进行系列倍比稀释至1:131072。
d、加样：取包被好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，每个样品做双重复，37℃孵育1h，PBST洗涤4次；
e、加二抗：用抗体稀释液1:10000稀释HRP标记羊抗小鼠IgG(生工，货号：
D110087-0100)，100μL/孔，37℃孵育30min，PBST洗涤4次；
f、显色：加入底物显色液100μL/孔，37℃孵育10min后加入终止液50μL/孔，酶标仪上以450nm波长测定OD值；
g、结果判断：A样品/A阴性≥2.1为阳性。
其中，a中包被液为0.05mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH9.6(15mM Na2CO3，35mMNaHCO3)；b中封闭液为10mM PBS(pH7.4)+1％BSA；d中PBST洗液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20；e中抗体稀释液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20+0.5％BSA；f中显色液为TMB储存液﹕底物缓冲液﹕3％过氧化氢＝10﹕90﹕1，TMB储存液为1mg/mL TMB溶于DMSO，底物缓冲液为柠檬酸0.53mM(pH5.0)、Na2HPO4 100mM；f中终止液为2M H2SO4。
检测结果如图6所示：检测重组RlpA f蛋白免疫小鼠产生的最高抗体效价达1:131072，RlpA f免疫小鼠的几何平均滴度为1:72716.74，免疫后抗体阳性率达到100％，说明本发明获得的重组RlpA f蛋白能够使免疫小鼠体产生免疫反应，产生特异性抗体，证明了本发明获得的RlpA f具有较高的免疫原性和免疫效价。
表2RlpA f免疫后小鼠血清IgG几何平均滴度
实施例4动物免疫性检测
本实施例将以实施例2中制备的重组抗原蛋白RlpA f作为抗原，进行动物免疫实验，具体方法如下：
M1、重组抗原蛋白RlpA f与LTs63K佐剂联合滴鼻免疫小鼠
实验动物：Balb/C小鼠，雌性，7-8周龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，LTs63K自制(制备方法如文献：冯强.重组大肠杆菌不耐热肠毒素及其突变体以及其B亚单位的构建表达与性质研究.[D].重庆大学.2003)，制备结果如图5所示，泳道1为上样，泳道2为流穿，泳道3-5为目的蛋白洗脱。动物分组如下表3所示：
表3重组抗原蛋白RlpA f与LTs63K佐剂联合免疫小鼠分组
50μg抗原或等体积PBS和10μgLTs63K佐剂混合后，混匀仪4℃轻柔混匀30min，置于冰盒中备用，吸取已配制的免疫原，缓慢滴于小鼠鼻腔，10μL/侧，共20μL/鼠；分别于0、14、21、28天进行四次免疫。
M2、抗原RlpA f与LTs63K佐剂联合滴鼻免疫小鼠后阴道灌洗液特异性抗体sIgAElisa检测
第四次免疫后5天，用PBST(含0.05％Tween 20的PBS)采集Balb/C小鼠阴道灌洗液，75μL/次，灌洗4次，收集300μL/鼠。采集后涡旋1min，12000g离心3min取上清液用于Elisa检测RlpA f特异性sIgA水平变化。具体步骤如下：
a、抗原包被：取包被液将RlpA f纯化蛋白稀释至4μg/mL，100μL/孔包被酶标板，4℃过夜；
b、封闭：封闭液300μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板后4℃保存备用；
c、标本稀释：将血清从1:8开始进行系列倍比稀释至1:128；
d、加样：取包被好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，每个样品做双重复，37℃孵育1h，PBST洗涤4次；
e、加二抗：用抗体稀释液1:10000稀释HRP标记羊抗小鼠IgA(Abcam，货号：Ab97235)，100μL/孔，37℃孵育30min，PBST洗涤4次；
f、显色：加入底物显色液100μL/孔，37℃孵育10min后加入终止液50μL/孔，酶标仪上以450nm波长测定OD值；
g、结果判断：A样品/A阴性≥2.1为阳性。
其中，a中包被液为0.05mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH9.6(15mM Na2CO3，35mMNaHCO3)；b中封闭液为10mM PBS(pH7.4)+1％BSA；d中PBST洗液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20；e中抗体稀释液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20+0.5％BSA；f中显色液为TMB储存液﹕底物缓冲液﹕3％过氧化氢＝10﹕90﹕1，TMB储存液为1mg/mL TMB溶于DMSO，底物缓冲液为柠檬酸0.53mM(pH5.0)、Na2HPO4 100mM；f中终止液为2M H2SO。
检测结果如图7所示：检测抗原蛋白RlpA f免疫小鼠产生的sIgA抗体效价达到1:128；RlpA f免疫小鼠对重组RlpA f的几何平均滴度为1:66.26，如表4所示；免疫后抗体阳性率达到100％，说明本发明获得的重组抗原蛋白RlpA f能够刺激小鼠产生较高水平黏膜免疫应答，产生特异性分泌抗体。
表4RlpA f免疫后小鼠阴道灌洗液sIgA几何平均滴度
实施例5重组抗原蛋白RlpA f免疫后攻毒保护力评价
本实施例将对实施例2制备的重组抗原蛋白RlpA f免疫后攻毒保护力进行实验分析评价，具体如下：
N1、小鼠灌胃：在实施例3中的所述的末次滴鼻免疫后10天对小鼠口服灌胃H.pylori ATCC700824活菌进行攻毒实验，小鼠灌胃前24h断食，17h断水，每只小鼠感染剂量为2.0×107CFU，灌胃后2h恢复水食。
N2、平板培养：灌胃后一周宰杀小鼠，取胃组织剪碎后放入PBS缓冲液中，涡旋洗涤3min，将洗涤原液与其10倍稀释液涂布于含有5％脱纤维绵羊血(南京茂捷生物)与0.5％复合抗生素(万古霉素1.67mg/mL、多粘菌素0.0694mg/mL、甲氧苄啶0.5mg/mL、两性霉素B0.2mg/m)的Skirrow平板上(蛋白胨15g/L(海博生物)、胰蛋白胨2.5g/L(Oxoid)、酵母浸粉5g/L(Oxoid)、氯化钠5g/L(科隆试剂)、pH7.4)，37℃微需氧(5％O2、10％CO2、85％N2)培养3d后观察。
N3、分析鉴定：结合幽门螺杆菌菌落特征，采用快速尿素酶试剂以及镜检等方式结合来检测平板上是否培养出幽门螺杆菌，以此来确定小鼠的感染率；其中，疫苗保护率＝(对照组感染阳性率-免疫组感染阳性率)/对照组感染阳性率×100％。
N4、结果统计：对照组与实验组各20只小鼠平板培养情况统计如表5所示，对照组20只小鼠中19只平板培养检测为阳性，感染率为95％，实验组小鼠20只小鼠中有12只小鼠平板培养阳性，感染率为60％，得出本疫苗的保护效率为36.8％。说明本发明获得的重组抗原蛋白RlpA f能够诱导小鼠产生较强的免疫应答，并且能抑制小鼠胃内的幽门螺杆菌定植，对幽门螺杆菌感染产生保护预防效果。
表5小鼠免疫后攻毒幽门螺杆菌感染阳性率统计
| 小鼠编号 | 对照组 | 实验组 | 小鼠编号 | 对照组 | 实验组 |
| 1 | + | - | 11 | + | + |
| 2 | + | + | 12 | + | + |
| 3 | + | + | 13 | + | + |
| 4 | + | - | 14 | + | + |
| 5 | + | - | 15 | + | - |
| 6 | + | - | 16 | + | + |
| 7 | + | + | 17 | + | + |
| 8 | + | + | 18 | - | + |
| 9 | + | - | 19 | + | - |
| 10 | + | + | 20 | + | - |
注:“+”表示为快速尿素酶试剂与镜检均为阳性，“-”表示为快速尿素酶试剂与镜检阴性
本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f的用途，其特征在于，用于制备幽门螺杆菌疫苗，所述幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、质粒构建
将核酸序列为SEQ ID NO:2的基因作为目的基因，将该目的基因连接在表达载体中构建含有所述目的基因的重组表达质粒；
S2、诱导表达
将所述重组表达质粒转化至重组蛋白表达的宿主菌中进行诱导表达，收集诱导表达后的菌体；
S3、产物纯化
对收获的菌体进行破碎处理后离心并收集沉淀，将沉淀依次经包涵体洗涤、镍柱亲和层析、阳离子柱交换层析纯化后，获得幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f，所述重组抗原蛋白RlpA f的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述镍柱亲和层析步骤如下：
平衡：使用缓冲液C平衡镍柱；缓冲液C的组成为：pH7~8的20~50mM磷酸盐缓冲液，4~8 M尿素，300~500 mM NaC1，10~20mM咪唑；所述镍柱中的填料采用Ni-琼脂糖 HP；
上样：将包涵体洗涤所得的上清液进行上样；
复平衡：使用上述缓冲液C复平衡镍柱；
洗脱：使用缓冲液D洗脱杂质蛋白；然后使用缓冲液E洗脱目的蛋白，收集洗脱液；缓冲液D的组成为：pH7~8的20~50mM磷酸盐缓冲液，4~8 M尿素，100~200mM NaCl，20~40 mM咪唑；所述缓冲液E的组成为：pH7~8的20~50 mM磷酸盐缓冲液，4~8 M尿素，100~200 mM NaCl，50~70 mM咪唑；
所述阳离子柱交换层析步骤如下：
平衡：使用缓冲液F平衡阳离子柱；缓冲液F的组成为：pH7~8的10~20mM磷酸盐缓冲液，4~8 M尿素；所述阳离子柱中的填料采用SP-琼脂糖 HP；
上样：将镍柱亲和层析所得的洗脱液使用上述缓冲液F稀释后进行上样；
复平衡：使用上述缓冲液F复平衡阳离子柱；
复性：使用缓冲液G柱上复性；缓冲液G液组成为pH7~8的10~20 mM磷酸盐缓冲液，0.5%~1%精氨酸，10~30 mM NaCl；
洗脱：使用缓冲液H洗脱杂质蛋白；然后使用缓冲液I洗脱目的蛋白，收集洗脱液，获得幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f；缓冲液H液组成为pH7~8的10~20 mM磷酸盐缓冲液，0.5%~1%精氨酸，40~60 mM NaCl；缓冲液I液组成为pH7~8的10~20 mM磷酸盐缓冲液，0.5%~1%精氨酸，200~400 mM NaCl。
3.根据权利要求2所述的幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f的制备方法，其特征在于，步骤S1具体包括以下分步骤：
S11、筛选获得幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f氨基酸序列，如SEQ ID NO:1所示；根据氨基酸序列，进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得目的基因，核酸序列如SEQ ID NO:2所示；
S12、对S11中的得到的核酸序列进行全基因合成，并通过Xho I和Nco I的酶切位点连接到表达载体中完成重组表达质粒构建。
4.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f的制备方法，其特征在于，步骤S12中，所述表达载体为pET28a（+）。
5.根据权利要求2所述的幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f的制备方法，其特征在于，步骤S2具体操作为：将重组表达质粒转化至表达宿主菌中获得可以表达重组抗原蛋白RlpA f的重组菌株，对重组菌株进行培养至OD600 0.6~0.8，再于30~37℃、180~240 rpm条件下，使用浓度为0.3~0.5 mM异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达4~8 h；将诱导表达后的菌液离心弃去上清液得沉淀菌体。
6.根据权利要求5所述的幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f的制备方法，其特征在于，上述所述宿主菌为大肠杆菌。
7.根据权利要求2所述的幽门螺杆菌重组抗原蛋白RlpA f的制备方法，其特征在于，所述包涵体洗涤步骤如下：
破菌：破碎菌体细胞，离心收集破菌沉淀；
洗涤：使用缓冲液A及缓冲液B交替洗涤破菌沉淀；所述缓冲液A的组成为： pH7~8的20~50 mM磷酸盐缓冲液，300~500 mM NaC1，50-100 U核酸酶，1~2 mM MgCl2；缓冲液B的组成为：pH7~8的20~50mM磷酸盐缓冲液，0.5%~2% Triton X-100，0.5~1.5 mM EDTA，100~200 mMNaCl；
溶解：使用缓冲液C充分溶解洗涤后的破菌沉淀并离心去除不溶杂质；缓冲液C的组成为：pH7~8的20~50mM磷酸盐缓冲液，4-8 M尿素，300~500 mM NaC1，10~20mM咪唑；
过滤：取上清液经抽滤备用。
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