KR20110022428A - 돼지의 병원성 대장균의 부착인자가 형질전환된 약독화 살모넬라균 변이주 및 이를 포함하는 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신 조성물 - Google Patents

돼지의 병원성 대장균의 부착인자가 형질전환된 약독화 살모넬라균 변이주 및 이를 포함하는 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지의 병원성 대장균의 부착인자(adhesin) 유전자를 포함하는, lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주 및 이를 포함하는, 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 살모넬라균 변이주의 제조방법 및 상기 살모넬라균 변이주를 생균 또는 사균 백신으로 준비하여, 모돈 또는 자돈에 접종하는 것을 특징으로 하는, 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료를 위한 백신화 방법을 제공한다. 본 발명의 백신은 상기 발현·분비된 각 부착인자 항원과 약독화 살모넬라균이 돼지의 점막에서 점막 및 전신 면역반응을 유도하여 야외 병원성 대장균 및 살모넬라균을 동시에 방어할 수 있다. 또한, 본 발명의 백신은 기존의 돼지 병원성 대장균 백신보다 안전하며 면역반응 유도 및 병원성 대장균에 대한 방어효과가 훨씬 우수함을 확인하였다.
병원성 대장균, 살모넬라균, 약독화, 백신, 부착인자

Description

돼지의 병원성 대장균의 부착인자가 형질전환된 약독화 살모넬라균 변이주 및 이를 포함하는 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신 조성물{Attenuated Salmonella mutants transformed with adhesin gene of pathogenic Escherichia coli in pigs and Vaccine composition comprising thereof for protection and treatment against pathogenic Escherichia coli and Salmonella in pigs}
본 발명은 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신에 관한 것이다.
동물에 있어 포유시기의 폐사 원인 중 약 80% 이상이 소화기 질병에 의해 발생한다. 또한 육성시기에는 소화기 질병에 의해 증체율이 현저하게 감소하여 양돈가에 심각한 경제적 손실을 일으킨다. 특히 포유자돈에서의 1회 설사는 출하시기를 약 1주일 정도 지연시키기 때문에 자돈에서의 소화기 질병은 양돈 산업에 막대한 경제적 손실을 초래하는 중요한 질병이다. 자돈에서 병원성 대장균과 살모넬라균에 의한 소화기 질병은 전체 소화기 질병 원인균 중에서 약 30%와 20% 정도를 차지한다. 더욱이 세균성 소화기 질병 원인균 중에서는 거의 대부분을 이들이 차지할 정 도로 그 발생이 빈번하다. 이처럼 양돈 산업에 있어 심각한 경제적 손실을 초래하는 세균성 소화기 질병을 예방하기 위하여 전 세계적으로 효과적인 예방백신을 개발하고자 많은 심혈을 기울이고 있다. 소화기 점막은 대다수의 소화기 및 호흡기 질병 유발 병원균과 처음으로 접하는 장소임과 동시에 이들 세균의 감염을 제일 먼저 방어하는 장소이기 때문에 매우 중요한 곳이다. 하지만 기존 상용화 백신의 대부분은 주로 병원성 대장균을 포르말린으로 불활화시킨 사균백신이거나 정제한 항원을 오일이나 겔 등 적합한 면역증강제와 혼합하여 판매되고 있다. 더욱이 이런 종류의 백신은 근육으로 접종하여 점막에서의 방어보다는 전신성 면역화에 중점을 두고 있다. 이런 전신 백신은 전신 면역 유도는 높지만 점막에서의 항체 유도에는 별다른 영향을 주지 못해 점막에서의 항체 역가는 매우 낮아 병원균 방어에 실패하는 경우가 종종 발생하는 것으로 보고되고 있다. 그래서 미국을 비롯한 선진국에서는 점막면역을 유도할 수 있는 백신 및 면역증강제 개발에 많은 연구가 진행 중에 있다. 하지만 아직까지 이는 사람의 질병 및 실험동물인 마우스를 대상으로 한 기초 연구가 주종을 이루고 있을 뿐이다. 최근에는 수의학분야에서도 일부의 질병에 대해서 특히, 조류 및 돼지를 대상으로 점막면역에 대한 연구가 수행 중에 있다. 그렇지만 아직 국내외적으로 연구실 수준의 연구가 진행되고 있을 뿐 현장에서는 아직 활용되지 못하고 있다.
　병원성 대장균은 돼지에서 주로 설사 및 부종병과 같은 다양한 장관 감염을 일으키는 병원체로서 주로 장독성 대장균 (entrotoxigenic Escherichia coli; ETEC)에 의해 야기되며 또한 장병원성 대장균 (enteropathogenic Escherichia coli; EPEC)에 의해서도 야기된다. 돼지에서 지금까지 알려진 ETEC의 주요 부착인자(fimbriae)에는 F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F18, F41이 있으며 EPEC의 부착인자로는 intimin이 알려져 있다. 세균이 숙주 세포에 부착하는데 사용하는 모든 인자를 부착인자라하며 이에는 세균의 fimbria와 같은 세포 표면 단백질이 포함되어 있다. 세균은 이들 부착인자를 이용하여 숙주의 장관 세포 표면에 안정적으로 부착하여 증식을 시작하면서 질병을 일으킨다. 따라서 이들 병원성 세균의 부착인자에 대한 면역반응이 유도된다면 세균에 감염되었을 경우 유도 항체가 이들 부착인자와 결합하여 세균이 숙주의 장관 표면에 부착하여 증식할 수 있는 기회를 미연에 차단함으로써 병원성 세균에 의한 질병 발생을 예방할 수 있을 것이다.
현재 상용화되어 있는 양돈용 대장균 백신은 주요 ETEC의 부착인자 즉, F4 (K88ab, K88ac, K88ad), F5 (K99), F6 (987P), F41을 발현하는 대장균을 배양한 후 이들 세균을 포르말린 등으로 불활화 하거나 또는 이들 부착인자를 정제하여 임신 모돈에 근육 접종하는 예방백신 접종 방법을 사용하고 있다. 하지만 사균을 이용한 근육 접종은 세균막에 있는 많은 비특이적인 물질로 인해 특이 항원에 대한 면역반응이 잘 유도되지 않는 경우가 많다. 특히 사균을 이용한 근육 접종은 전신 면역반응은 어느 정도 유도를 하지만 실질적으로 ETEC가 병변을 일으키는 점막에서의 항체 유도는 효과적이지 않아 종종 방어에 실패하는 경우가 있다. 또한 살모넬라균을 불활화하여 근육 접종하는 경우에는 점막면역과 세포 매개성 면역반응이 잘 유도되지 않아 야외균주의 방어에 있어서 생균 백신에 비해 효과적이지 못하다고 알려져 있으며, 더욱이 현재 국내에서 상용화 되어 있는 양돈용 살모넬라균에 대한 예방백 신은 전무한 실정이다. 그러나 많은 연구를 통해 살모넬라균 유전자 및 그 유전자에 의한 발현 단백질에 대한 정보가 많이 밝혀져 살모넬라균에 대한 유전체 조작이 가능하게 되었다. 따라서 일부 유전자 결손 기술을 이용하여 보다 효과적인 약독화 백신 개발 연구에 관심이 집중되고 있다. 더욱이 펩티도글리칸 합성과 관계가 있는 asd 유전자가 결여된 살모넬라균과 asd 유전자를 갖고 있는 플라스미드 제작이 가능해 졌다. 따라서 asd 유전자를 갖고 있는 플라스미드에 원하는 항원 유전자를 cloning한 후 이 플라스미드에 의한 변이 균주의 형질전환이 기능하게 되었다. 따라서 원하는 외래 단백질을 발현할 수 있는 전달계 (delivery system)로서 이 시스템을 이용하여 살모넬라균과 동시에 다른 세균에 대한 방어가 가능한 예방백신 개발을 위한 연구가 활발히 수행되고 있다.
또한, 최근 병원성 대장균의 LTB(heat-labile enterotoxin B subunit)는 CTB(cholera toxin B subunit)와 더불어 강력한 면역증강제로서 많은 연구가 수행되고 있다. 따라서 이들 면역증강제를 포함하여 특이적으로 대장균 부착인자 항원을 보조하고 살모넬라 항원들과 결합하여 sIgA를 비롯한 체액성 면역반응을 강력하게 유도하여 경구접종용 백신의 효능을 증가시킬 수 있는 경구용 면역증강제에 대한 연구가 필요하다.
본 발명은 우선 ETEC와 EPEC의 주요 부착인자 유전자를 SecA, SecB 그리고 LepB 시스템을 이용하여 발현되는 항원의 분비가 증가되도록 개발된 대장균 및 살모넬라균 셔틀 플라스미드인 pBP244에 각각 클로닝한 다음 이들 플라스미드를 lon, cpxR 및 asd 세 유전자를 인위적으로 결실시킨 약독화 살모넬라균에 형질전환시켰 으며, 상기 형질전환된 살모넬라 변이 균주를 포함한 백신 조성물을 돼지에 접종한 결과 돼지의 점막에서 각 부착인자를 안정적으로 분비하여 점막 및 전신 면역을 유도함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 유전자를 포함하는 살모넬라균 변이주 및 이를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 살모넬라균 변이주를 포함하는 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신 조성물 및 이를 이용한 백신화 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F4(K88ab), F4(K88ac), F5(K99), F6(FasA), F18(FedA), F18(FedF), F41 및 Intimin으로 구성된 군 중에서 선택된 어느 하나의 유전자, 및 asd 유전자를 포함하는, lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변이주 중 어느 하나 이상을 포함하는 혼합 살모넬라균 변이주를 제공한다.
또한, 본 발명은 돼지의 병원성 대장균의 LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자, 및 asd 유전자를 포함하는, lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주를 제공한다.
또한, 본 발명은 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F4(K88ab), F4(K88ac), F5(K99), F6(FasA), F18(FedA), F18(FedF), F41 및 Intimin으로 구성된 군 중에서 선택된 어느 하나의 유전자를 포함하는 상기 살모넬라균 변이주 중 어느 하나 이상 을 포함하는 혼합 살모넬라균 변이주와 돼지의 병원성 대장균의 LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자를 포함하는 상기 살모넬라균 변이주를 포함하는 혼합 살모넬라균 변이주를 제공한다.
또한, 본 발명은 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F4(K88ab), F4(K88ac), F5(K99), F6(FasA), F18(FedA), F18(FedF), F41 또는 Intimin 유전자를 각각 포함하는 8개의 살모넬라균 변이주 모두를 포함하는 혼합 살모넬라균 변이주와 돼지의 병원성 대장균의 LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자를 포함하는 살모넬라균 변이주를 포함하는 혼합 살모넬라균 변이주를 제공하며, 본 발명자들은 이 혼합 살모넬라균 변이주를 기탁기관(한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC))에 기탁하였다(기탁번호 KCTC11541BP).
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 살모넬라균 변이주를 포함하는, 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신 조성물를 제공한다.
상기 돼지의 병원성 대장균증은, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 소화기 질환, 부종병 (edema disease), 호흡기 질환 또는 비뇨생식기계 질환을 포함한다.
상기 소화기 질환은, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 신생자돈 설사병, 조발성 설사병, 3주령 설사병, 백리, 포유자돈 설사병, 또는 이유자돈 설사병을 포함한다.
상기 병원성 대장균은 바람직하게는 장독성 대장균 (entrotoxigenic Escherichia coli .; ETEC) 또는 장병원성 대장균 (enteropathogenic Escherichia coli;; EPEC)이다.
상기 살모넬라균은, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 살모넬라균은 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 파라타이피(Salmonella paratyphi), 살모넬라 센다이(Salmonella sendai), 살모넬라 갈리나리움(Salmonella gallinarium) 및 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나가 숙주세포로서 이용될 수 있다.
상기 백신 조성물에서, 살모넬라균 변이주는 생균 또는 사균으로 사용할 수 있으며, 사균은, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 가열 또는 포르말린으로 불활화시킬 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 백신 조성물을 포함하는, 돼지의 면역증강 또는 성장촉진을 위한 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 (i) 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F4(K88ab), F4(K88ac), F5(K99), F6(FasA), F18(FedA), F18(FedF), F41 및 Intimin으로 구성된 군 중에서 선택된 어느 하나의 유전자를 증폭시키는 단계; (ii) 상기 부착인자 유전자를 asd 유전자를 가진 플라스미드에 클로닝하는 단계; (iii) 살모넬라 균주의 염색체 DNA에서 lon, cpxR 및 asd 유전자를 결실시켜 약독화 살모넬라 균주를 제조하는 단계; (iv) 단계 (ii)의 클로닝된 플라스미드로 단계 (iii)의 약 독화 살모넬라 균주를 형질전환시키는 단계; 및 (iv) 형질전환된 살모넬라균 변이주를 선별하는 단계를 포함하는 살모넬라균 변이주를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (i) 돼지의 병원성 대장균의 LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자를 증폭시키는 단계; (ii) 상기 LTB 유전자를 asd 유전자를 가진 플라스미드에 클로닝하는 단계; (iii) 살모넬라 균주의 염색체 DNA에서 lon, cpxR 및 asd 유전자를 결실시켜 약독화 살모넬라 균주를 제조하는 단계; (iv) 단계 (ii)의 클로닝된 플라스미드로 단계 (iii)의 약독화 살모넬라 균주를 형질전환시키는 단계; 및 (iv) 형질전환된 살모넬라균 변이주를 선별하는 단계를 포함하는 살모넬라균 변이주를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 살모넬라균 변이주를 생균 또는 사균 백신으로 준비하여, 모돈 또는 자돈에 접종하는 것을 특징으로 하는, 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료를 위한 백신화 방법을 제공한다.
상기 백신화 방법에서, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 또는 비강 경로로 백신을 접종할 수 있다. 바람직하게는, 1차 및 2차 접종시 생균 백신을 경구로 접종할 수 있다. 보다 바람직하게는, 1차 및 2차 접종시 생균 백신을 경구로 접종하되, 2차 접종시 LTB를 발현 분비하는 살모넬라 변이균주를 제외한 생균 백신을 접종할 수 있다.
　　　　　　본 발명의 변이균주는 항원 발현·분비 능력을 향상시킨 플라스미드에 클로닝 된 돼지의 병원성 대장균의 주요 부착인자 유전자가 전달계인 약독화 살모넬라균에 의해 발현·분비되도록 제작되었다. 본 발명의 백신은 상기 발현·분비된 각 부착인자 항원과 약독화 살모넬라균이 돼지의 점막에서 점막 및 전신 면역반응을 유도하여 야외 병원성 대장균 및 살모넬라균을 동시에 방어할 수 있다. 또한, 본 발명의 백신은 기존의 돼지 병원성 대장균 백신보다 안전하며 면역반응 유도 및 병원성 대장균에 대한 방어효과가 훨씬 우수함을 확인하였다. 더욱이 본 발명의 백신의 경구접종방법은 주사기가 필요하지 않아 주사기에 의한 모돈의 스트레스 감소 효과뿐만 아니라 주사기에 의한 접종에서의 부작용도 없으며 주사기 접종에 필요한 특별한 전문가의 도움도 필요하지 않아 누구나 간편하고 손쉽게 접종할 수 있는 장점이 있다.
이하, 본 발명의 구성요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 인용된 문헌은 본 발명의 명세서에 참조로서 통합된다.
실시 예
실시예 1: 부착인자 유전자의 준비 및 확인
1-1. 실시예에 사용된 균주
단백질 항원 발현과 백신 클로닝 제작을 위한 각 부착인자 발현 유전자는 병원성 대장균인 JOL416 (K88ab 발현), JOL417 (K88ac 발현), JOL412 (K99 발현), JOL415 (987P 발현), JOL500 (F18 발현), JOL413 (F41 발현), JOL206 (intimin 발현)로부터 확보되었다. 그리고 병원성 대장균 야외 분리주인 JOL599 (F4 발현), JOL489 (F5와 F41 발현), JOL564 (F6 발현), JOL500과 살모넬라균 야외 분리주인 JOL389 (S. Typhimurium)는 도전감염 균주로 사용하였다. 이들 균주는 Luria-Bertani (LB) broth에서 배양되었다. Escherichia coli χ6212 [F-λ- Φ80Δ(lacZYA - argF) endA1 recA1 hsdR17 deoR thi -1 glnV44 gyrA96 relA1 Δ asdA4]와 약독화 살모넬라 티피무리움 (JOL912) (Δlon Δ cpxR Δ asd)(기탁번호 KCTC11540BP)은 DAP(diaminopimellic acid)(50 ㎍/ml)이 포함된 LB broth에서 배양되었다. asd 유전자를 발현하는 플라스미드 pBP244를 이용하여 병원성 대장균의 각 부착인자를 발현 및 분비하는 약독화 살모넬라 티피무리움을 선택할 때에는 DAP을 포함하지 않은 LB 아가(agar)에서 선택되었다. (표 1, 도 2)
실시예에 사용된 균주 및 플라스미드
균주 설명 입수방법










클로닝 제작용		 JOL416 F4 (K88ab) fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 국립수의과학검역원 (E. Coli G.C.V. K88ab)
JOL417 F4 (K88ac) fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 국립수의과학검역원 (ETEC E-126 O149:K91, K88ac)
JOL412 F5 (K99) fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 E. coli G.C.V. K99
JOL415 F6 (987P) fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 국립수의과학검역원 (ETEC E-127 O141:K88ab, 987P)
JOL500 F18 fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 야외 분리 주
JOL413 F41 fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 국립수의과학검역원 (ETEC E-92 O9:K35, K99, F41)
JOL206 intimin fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 ATCC 43890
JOL908 pBP244 (Asd 발현 플라스미드)를 가진 Escherichia coli χ7213 Kim 등 J. Microbiol. Biotechnol. 2007, 17:1316-1323. 참조

숙주
세포		 JOL767 Escherichia coli χ7213 Δ asd Kim 등 J. Microbiol. Biotechnol. 2007, 17:1316-1323 참조
JOL912 Salmonella Typhimurium CK110 Δlon Δ cpxR Δ asd KCTC11540BP



백신
균주		 JOL940 Escherichia coli의 K88ab를 발현하는 JOL912
JOL941 Escherichia coli의 K88ac를 발현하는 JOL912
JOL946 Escherichia coli의 K99를 발현하는 JOL763
JOL937 Escherichia coli의 FasA를 발현하는 JOL763
JOL934 Escherichia coli의 FedA를 발현하는 JOL763
JOL935 Escherichia coli의 FedF를 발현하는JOL912
JOL947 Escherichia coli의 F41를 발현하는 JOL763
JOL948 Escherichia coli의 intimin을 발현하는 JOL912
JOL906 Escherichia coli의 LTB를 발현하는 JOL912




도전
감염
균주		 JOL599 F4 fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 국립수의과학검역원 (ETEC E-26 O149:K91, K88ac)
JOL489 F5 및 F41 fimbriae를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 국립수의과학검역원 (ETEC E-92 O9:K35, K99, F41)
JOL564 F6 fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 국립수의과학검역원 (ETEC E-127 O141:K88ab, 987P)
JOL389 Salmonella Typhimurium 야생형 분리주 국립수의과학검역원 (Salmonella Typhimurium ST302)
약독화 살모넬라 티피무리움(JOL912)(Δlon Δ cpxR Δ asd)에서 결실된 유전자 서열정보는, lon은 GenBank FJ609803.1; cpxR은 GenBank AE006468.1; asd는 GenBank AF015781.1에서 용이하게 입수할 수 있다. 본 발명자들은 상기 약독화 살모넬라 티피무리움(Δlon Δ cpxR Δ asd) 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다(기탁번호 KCTC11540BP, Samonella enterica serovar Typhimurium strain JOL912, 2009년 8월 3일 기탁).
1- 2. 병원성 대장균의 총 DNA 추출 및 부착인자 유전자 증폭
병원성 대장균의 총 DNA 추출은 통상적인 방법에 따라 준비하였다. 즉, -70℃에 보관 중인 병원성 대장균을 LB 아가에 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양된 콜로니들 중에서 한 콜로니를 선택하여 1.5㎖ LB broth에 접종하여 하룻밤 배양한 후 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 멸균 증류수를 1㎖ 첨가하여 재부유시켰다. 이 부유액을 원심분리한 후 상청액을 제거한 다음 멸균 증류수 50㎕를 첨가하여 다시 부유시켰다. 그리고 95℃에서 20분간 가열한 후 원심분리하여 상청액을 조심스럽게 멸균 소형관으로 옮겨 병원성 대장균의 총 DNA로 추출하였다.
ETEC 및 EPEC의 각 부착인자 유전자는 제한효소 절단 부위를 가진 특이 프라이머(표 2)를 이용하여 PCR 기법으로 증폭하였다. 증폭된 각 부착인자 유전자는 아가로스 겔을 이용하여 해당 크기를 확인한 다음 AccuPrep 겔 정제키트(Bioneer, Korea)를 이용하여 정제하였다. (도 2)
실시예에 사용된 프라이머들
부착인자 프라이머 (5'→3') 제한효소






ETEC		 F4 K88ab CCGC GGA TCC GGC ACA TGC CTG GAT GAC BamHI
CCGC AAG CTT CCA GCA ACT TTA GTA ATA A HindIII
K88ac CCGC GGA TCC GGC ACA TGC CTG GAT GAC T BamHI
CCGC AAG CTT AAT TGG CAG CTC ATC ACG HindIII
F5 K99 GAA TCC AT AAA AAA ACA CTG CTA EcoRI
AAG CTT TTA CAT ATA AGT GAC TAA GAA HindIII
F6 FasA CCGC GGA TCC AGC GCC CGC TGA AAA CAA BamHI
CCGC AAG CTT ATT ACG GTG TAC CTG CTG A HindIII
F18 FedA CCGC GAA TTC CAG CAA GGG GAT GTT AAA T EcoRI
CCGC AAG CTT GAT GAT TAC TTG TAA GTA HindIII
FedF CCGC GAA TTC GCG TCT ACT CTA CAA GTA EcoRI
CCGC AAG CTT TTA CTG TAT CTC GAA AAC AA HindIII
F41 F41 GAA TTC ATG AAA AAG ACT CTG ATT GC EcoRI
AAG CTT TTA ACT ATA AAT AAC GGT GA HindIII
EPEC Intimin CCG GGA TCC GAT GAA AAA CGG TCA GCC AGT BamHI
CCG AAG CTT TAT TTT AGC CGG GGT GGT TAT HindIII
Adjuvant LTB CCGC GAA TTC GCT CCC CAG TCT ATT ACA G EcoRI
CCGC AAG CTT CTA GTT TTC CAT ACT GAT TG HindIII
상기 프라이머를 이용하여 증폭시킨 유전자의 서열정보는, F4(K88ab)는 GenBank V00292.1; F4(K88ac)는 GenBank AJ616256.1; F5(K99)는 GenBank M35282.1; F6(FasA)는 GenBank U50547.1; F18(FedA)는 GenBank AY569976.1; F18(FedF)는 GenBank AY970818.1; F41은 GenBank X14354.1; Intimin(Eae)은 GenBank FJ609803.1; LTB는 GenBank EU113255.1에서 용이하게 입수할 수 있다.
1- 3. 부착인자를 발현하는 대장균의 제작
실시예 1-2에서 정제된 PCR 증폭산물과 pQE9 (EcoRI과 HindIII), pQE10 (BamHI과 HindIII) 또는 pET28a (EcoRI과 HindIII) 플라스미드를 표 2에서 기술된 제한 효소로 각각 절단한 후 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 절단된 각 절편을 AccuPrep 겔 정제 키트를 이용하여 정제한 다음 T4 DNA 리가아제(Takara, Japan)로 두 산물을 라이게이션한 후 E. coli JM109 또는 E. coli Top 10으로 형질전환하였다. 이들 형질전환된 균주를 앰피실린(pQE9 또는 pQE10을 발현 플라스미드로 사용하였을 경우) 또는 카나마이신(pET28a를 발현 플라스미드로 사용하였을 경우)이 각각 첨가된 LB 아가에 골고루 펴서 말린 다음 37℃에서 하룻밤 배양하여 발현 플라스미드로 형질전환 된 E. coli JM109 또는 E. coli Top 10을 선택하였다.
각 부착인자유전자가 삽입된 플라스미드는 E. coli JM109 또는 E. coli Top 10으로부터 AccuPrep 플라스미드 추출 키트 (Bioneer, Korea)를 이용하여 플라스미드를 분리하여 표 2에 제시된 바와 같이 제한 효소로 절단하여 아가로스 겔 에서 전기영동하여 확인하였다. 그리고 이렇게 확인된 해당 콜로니를 각 발현 플라스미드에 맞는 항생제가 첨가된 LB broth 5㎖에 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양된 균액 중 250㎕를 각 항생제가 첨가된 새로운 5㎖ LB broth에 재접종하여 45분간 배양한 후 이중 1㎖는 유도 전 대조군으로 사용하기 위해 멸균 소형관으로 옮겼다. 나머지 4㎖에는 IPTG(isopropyl-βD-thiogalactopyranoside)의 최종 농도가 1mM이 되도록 첨가하여 3시간 동안 배양한 후 이중 1㎖는 유도 후 발현 여부를 확인하기 위해 멸균 소형관에 옮겼다. 그리고 나머지 3㎖는 발현 단백질이 가용성인지 또는 불용성인지를 확인하기 위해 4,000×g에서 20분간 원심분리한 후 멸균 PBS(phosphate buffered saline) 500㎕로 재부유시켰다. 이를 초음파처리 (sonication)하여 세포를 분쇄한 다음 10,000×g에서 20분간 원심분리하여 상층액은 새로운 멸균 소형관에 옮기고 침전물 (pellet)은 500㎕의 멸균 PBS로 재부유시켰다. 이들 상층액 (발현 단백질이 가용성일 경우)과 재부유액 (발현 단백질이 불용성일 경우) 그리고 유도전,후에 준비한 샘플들을 SDS-PAGE로 전기영동하여 각 부착인자의 발현 여부 및 발현 상태를 확인하였다.
1-4. 각 부착인자 항원 및 항혈청 준비
실시 예 1-3에서 확인된 콜로니를 LB broth 200㎖에 접종하여 30℃에서 150rpm의 속도로 흔들어 주면서 하룻밤 배양하였다. 이 배양액에 IPTG의 최종농도가 1mM이 되도록 첨가하여 같은 조건으로 4시간 재배양한 후 8,000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하였다. 상층액은 버리고 침전물은 PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride)가 1mM이 되도록 첨가된 10㎖의 멸균 PBS로 재부유시켰다. 이 부유액을 -70℃에서 냉동한 다음 37℃ 수욕조 내에서 해동하였다. 이와 같이 냉동과 해동의 과정을 2~3회 반복한 다음 마지막으로 해동한 후 부유액을 초음파처리하여 세포들을 분쇄하였다. 이 초음파처리된 액을 15,000rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하여 상층액을 멸균관에 옮겼다. 발현 단백질이 가용성일 경우에는 버퍼 B (100mM NaH2PO4, 10mM Tris·Cl, 8M urea, pH 8.0) 4㎖를 상층액과 혼합하였고 불용성일 경우에는 6㎖의 버퍼 B로 침전물을 재부유시킨 후 실온에서 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 이 반응액을 15,000rpm, 4℃에서 20분간 원심분리한 후 상층액을 레진(resin)이 들어 있는 관으로 옮겨 단백질이 레진과 결합하도록 30분간 교반하였다. 이 반응액을 준비된 칼럼에 충전시키고 천천히 흘려보낸 다음 버퍼 C (100mM NaH2PO4, 10mM Tris·Cl, 8M urea, pH 6.3)를 6㎖씩 충전하여 칼럼을 3회 세정하여　 레진과 결합하지 않은 기타 불필요한 단백질을 제거하였다. 2㎖의 용리 버퍼(100mM NaH2PO4, 10mM Tris·Cl, 8M urea, pH 4.5)로 칼럼을 충전시킨 후 20분간 반응시켜 발현 단백질을 레진으로부터 분리시킨 다음 용리 버퍼를 1㎖씩 첨가하여 단백질을 회수하였다. 회수된 단백질을 SDS-PAGE에서 전기영동하여 발현 단백질을 확인하였으며 단백질량을 정량한 후 -70℃에 보관하며 ELISA 항원으로 사용하였다.
1주일 정도의 적응기간을 거친 약 2Kg 정도의 암컷 뉴질랜드 흰토끼(New Zealand white rabbit)에 위에서 준비된 각 부착인자 항원이 200㎍이 되도록 멸균 PBS로 희석 한 후 프로인트 완전면역증강제(Freund's complete adjuvant)과 동량 혼합하여 피하 접종하였다. 1차 접종 14일 후에 동량의 항원을 프로인트 불완전면역증강제(Freund's incomplete adjuvant)과 같은 방법으로 혼합하여 피하 접종하여 부스팅(boosting)하였다. 2차 접종 후 14일째에 채혈하여 혈청을 분리한 다음 -70℃에 보관하며 각 부착인자 항혈청으로 사용하였다.
실시예 2: 각 부착인자를 발현·분비하는 약독화 살모넬라 티피무리움의 제작 및 확인
2-1. 병원성 대장균의 부착인자 유전자를 asd 유전자를 포함한 플라스미드에 클로닝
부착인자 유전자의 발현이 확인된 각 플라스미드와 pBP244를 표 2에서 제시한 제한효소로 절단한 후 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 펩티도글리칸 합성과 관련된 asd 유전자를 갖고 있는 플라스미드인 pBP244의 제작은 문헌(Kim et al., 2007, Journal of Microbiology and Biotechnology, 17: 1316-1323)에 상세히 기술되어 있다. pBP244는 SecA, SecB 및 LepB 시스템을 이용하여 발현되는 항원의 분비가 증가되도록 개발된 셔틀 플라스미드이다. AccuPrep 겔 정제 키트를 이용하여 아가로스 겔로부터 절단된 부착인자와 pBP244 절편을 정제하고 T4 DNA 리가아제를 이용하여 4℃에서 하룻밤 라이게이션하였다. 이 라이게이션된 반응액으로 E. coli χ6212 (JOL767)를 형질전환시켜 DAP을 첨가하지 않은 LB 아가에 골고루 펴서 말린 다음 하룻밤 배양하여 pBP244에 의하여 형질전환된 균주를 선택하였다. 각 부착인자의 확인은 E. coli χ6212로부터 플라스미드를 분리하여 각 부착인자에 해당하는 제한 효소로 절단한 후 아가로스 겔에서 전기영동하여 최종 확인하였다.　　　
2-2. 병원성 대장균의 부착인자 유전자를 포함한 플라스미드를 약독화 살모넬라 티피무리움에 형질전환
위에서 최종 확인된 각 정제 플라스미드를 일렉트로포레이션(electropoartion)방법에 의하여 JOL912에 형질전환시켜 JOL940 (K88ab 발현·분비), JOL941 (K88ac 발현·분비), JOL946 (K99 발현·분비), JOL937 (FasA 발현·분비), JOL934 (FedA 발현·분비), JOL935 (FedF 발현·분비), JOL947 (F41 발현·분비), JOL948 (intimin 발현·분비)를 얻었다. 즉, JOL 912를 DAP (50㎍/㎖)이 포함된 LB broth에서 중간-로그 단계(mid-log phase)까지 배양한 후 멸균된 ice-cold 10% 글리세롤 함유 증류수로 두 번 세척하였다. 준비된 JOL912를 0.2 ㎝ 큐벳에 넣고 플라스미드 0.1 ㎍과 섞은 후 Bio-Rad MicroPulser (Bio-Rad, USA)의 사전 프로그램 세팅 중 Ec2에 따라 전기충격을 가하였다. 반응된 균을 큐벳에서 회수한 다음 DAP을 넣지 않은 LB broth 1㎖를 첨가하여 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 형질전환된 살모넬라균을 선별하기 위해 배양된 균액 100㎕를 다시 DAP을 첨가하지 않은 LB 아가에 골고루 펴서 말린 다음 37℃에서 하룻밤 배양한 후 형성된 균주를 선별하였다. (표 1, 도 2)
또한 백신의 면역반응 유도를 강화하기 위해 E. coli의 열민감독소 서브유닛(heat-labile toxin subnuit B; LTB)를 클로닝하여 위와 동일한 방법으로 형질전환시켜 JOL 906 (LTB 발현·분비)을 얻어 경구접종용 면역증강제로 사용하였다.
본 발명자들은 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F4(K88ab), F4(K88ac), F5(K99), F6(FasA), F18(FedA), F18(FedF), F41 또는 Intimin 유전자를 각각 포함하는 8개의 살모넬라균 변이주 모두를 포함하는 혼합 살모넬라균 변이주와 돼지의 병원성 대장균의 LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자를 포함하는 살모넬라균 변이주를 포함하는 혼합 살모넬라균 변이주를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다(기탁번호 KCTC11541BP, Samonella Typhymurium strain JOLPV9(mix), 2009년 8월 3일 기탁).
2-3. 약독화 살모넬라 티피무리움 배양액 내에서 발현·분비된 각 부착인자 확인
실시예 2-2에서 제작된 백신 균주가 해당 부착인자를 발현하여 세포 밖으로 분비하는지를 확인하기 위하여 각 백신 후보균주를 100㎖ LB broth에 하룻밤 배양 한 후 7,000 rpm에서 원심분리하여 상청액 샘플을 준비하였다. 이 상청액은 ice-cold 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)이 10%가 되도록 첨가하여 얼음 위에서 30분간 반응시킨 후 원심분리하여 침전물은 세포 내에 남아 있는 발현 항원을 검출하는데 사용하였다. 각 샘플을 94℃에서 5분간 끓인 후 SDS-PAGE를 수행한 다음 PVDF 멤브레인으로 옮겨 블로킹 버퍼(3% skim milk in PBST)로 하룻밤 반응시켰다. 다음 날 실시예 1-4에서 준비한 각 부착인자에 대한 항혈청 (폴리클로날 항체)을 1:200내지는 1:250으로 희석하여 1시간 반응시킨 후 1:40,000으로 희석된 2차 항체 (goat anti-rabbit IgG(H+L) HRP)로 1시간 반응시켰다. WEST-oneTM Western Blotting System (Intron Biotechnology, Korea)으로 발색하여 발현을 확인하였다. 웨스턴 블롯의 결과 각 부착인자가 잘 발현되어 분비되는 것이 확인되었으며 일부의 부착인자는 발현 부착인자끼리 서로 결합하여 이량체(dimer) 또는 폴리머를 형성하는 경우가 있음이 확인되었다. 그리고 대조군의 경우에는 각 부착인자에 상응하는 항원을 발현하지 않았다. (도 3 참조)
　
실시 예 3: 백신 조성물의 제조
3-1. 생균 백신의 제조　　　　　　
생균 백신을 준비하기 위해서는 실시예 2-3에서 각 부착인자의 발현·분비가 확인된 약독화 살모넬라 티피무리움을 10㎖ LB Broth에 접종하여 37℃에서 200 rpm의 속도로 16시간 배양하였다. 이 배양액을 1/100 (부피)의 비율로 100㎖ LB broth에 첨가하여 같은 조건에서 3~5 시간 동안 재배양하였다. 이 재배양액을 4℃에서 4,000 rpm으로 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물은 멸균 PBS로 재부유시키는 방법으로 세척하였다. 같은 방법으로 2번 더 세척한 후 마지막 침전물은 수크로즈가 20% 함유된 멸균 PBS (PBS-수크로즈) 소량으로 부유시켜 OD600값을 측정하여 균수를 확인하였다. 10㎖ PBS-수크로즈에 각 부착인자를 발현·분비하는 약독화 살모넬라 티피무리움 및 LTB를 발현·분비하는 약독화 살모넬라 티피무리움이 각각 2.5×109 cfu가 되도록 혼합하여 생균백신으로 준비하였다. 단 생균백신으로 1차 및 2차 모두를 경구로 접종할 경우에는 2차 접종시에는 LTB를 발현·분비하는 약독화 살모넬라 티피무리움을 제외한 생균백신을 접종하였다.
3-2. 사균 백신의 제조　　　　　　
사균백신을 준비하기 위해서는 상기와 같은 방법으로 약독화 살모넬라 티피무리움을 준비하고 세척하였다. 마지막 세척 후 침전물을 멸균 PBS로 109 cfu/ml가 되도록 희석한 후 포르말린의 최종 농도가 1%가 되도록 첨가하였다. 실온에서 24시간 동안 반응시켜 불활화시킨 다음 멸균 PBS로 3번 세척하였다. 이 부유액 100㎕를 트립틱 소이 아가(Tryptic Soy Agar)에 접종한 후 37℃에서 하룻밤 배양하여 균의 사멸 여부를 확인하였다. 백신균주의 불활화 여부를 확인한 후 각 약독화 살모넬라 티피무리움이 2.5×109 세포가 되도록 수산화 알미늄겔 10mg/ml에 혼합하여 사균 백신으로 준비한 다음 4℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.　
　
실시 예 4:　백신 조성물의 효과 확인
4-1. 모돈에서 접종경로별 백신 효능 시험
　　　　　　　
4-1-1. 모돈에서 백신의 접종경로 및 방법
접종 경로 및 방법을 달리하여 예방접종을 실시한 후 각 부착인자 및 살모넬라 티피무리움의 지다당류 (lipopolysaccharide; LPS)에 대한 특이 면역반응 유도 여부를 알아보기 위해 임신 모돈 12두를 한 그룹 당 3두씩 총 4 그룹 (그룹 A, B, C, D)으로 나누어 실험하였다.
그룹 A는 분만 예정일 8주 전인 임신 모돈에 사균백신을 1차 근육 접종 (intramuscular injection; IM) 한 다음 3주 후 (분만 예정일 5주 전)에 생균백신을 경구로 2차 접종하였다.
그룹 B는 임신 모돈이 분만 예정일 8주 전일 때 생균백신을 경구로 1차 접종 한 다음 3주 후에 LTB를 발현·분비하는 약독화 살모넬라 티피무리움을 제외한 생균백신을 2차 경구접종하였다.
그룹 C는 분만 예정일 8주 전 임신 모돈에 생균 백신을 경구로 1차 접종 한 다음 3주 후에 사균백신을 근육으로 2차 접종하였다.
그룹 D는 모돈이 분만 예정일 8주전 및 5주전 일 때 PBS-수크로즈를 각각 경구로 접종하여 대조군으로 사용하였다.
백신 접종 전, 1차 백신 접종 후 3주, 2차 접종 후 2주, 분만 시점에 모돈에서 그리고 자돈이 태어난 후 6일째 (1주령)에 각각 혈액을 채취하여 분리한 혈청을 대상으로 각 부착인자 항원 및 살모넬라 티피무리움의 LPS에 대한 혈청 IgG 및 IgA 그리고 분만 동안에 채취된 초유에서 같은 항원에 대한 sIgA 및 점막 IgG의 항체 역가를 간접 ELISA 방법으로 측정하였다. 예방접종 된 모돈에서 출생한 자돈이 1주령이 되었을 때 국내에서 분리된 병원성 대장균 야외 분리주 (JOL599, 489, 564, 500) 또는 살모넬라 티피무리움 야외 분리주 (JOL398)를 경구 감염시킨 후 설사 유무로 방어 효과를 측정하였다. (표 3)
접종 경로별 백신접종 및 도전감염 실험 개요
그룹 접종 두수 예방접종 도전감염
모돈 자돈
분만 8주전 분만 5주전 1주령
A 3 근육접종　
사균백신		 경구접종　
생균백신		 JOL599, 489, 564, 500이
각각 1×109 cfu가 되도록 혼합하여 경구접종,
JOL389를 1×109 cfu로
경구접종
B 3 경구접종　
생균백신		 경구접종　
생균백신
C 3 경구접종　
생균백신		 근육접종　
사균백신
D 3 20% 수크로즈 20% 수크로즈
4-1-2. 접종경로별 혈청에서의 대장균 부착인자에 대한 항체 역가
살모넬라 티피무리움의 LPS는 LPS 추출 키트 (Intron Biotechnology, Korea) 판매제조회사에서 추천하는 방법에 따라 야외 분리균주인 JOL389 (Salmonella Typhimurium 야외균주)로부터 정제하여 -70℃에 보관하며 ELISA 항원으로 사용하였다. 간접 ELISA는 각 부착인자 항원 및 LPS를 플랫 버텀 96웰 고결합 ELISA 플레이트 (Greiner, Germany)에 흡착시킨 후 돼지 IgG (또는 IgA) ELISA 정량 키트 (Bethyl, Tx, USA)를 사용하여 사용설명서의 방법에 따라 실시하였다.
백신 접종군 (그룹 A, B, C) 모두에서 각 부착인자에 대한 특이 혈청 IgG는 백신을 1차 접종한 3주 후부터 증가하기 시작하여 대다수의 부착인자 (K88ac와 F41 제외)에 대한 항체역가는 분만시점에 최고의 역가가 관찰되었다. 혈청 IgA의 경우에는 모든 부착인자에서 백신 접종 후 분만 시점에 높은 항체 역가 유도되었다. 하지만 대조군에서의 혈청 IgG 및 IgA 항체 역가는 접종 전부터 분만시점까지 모든 부착인자에 대해 거의 변화가 없었다. 각 그룹에서 태어난 자돈이 초유 및 모유를 섭취한 후 6일째 (생후 1주령) 되는 날 채취한 혈청에서 각 부착인자에 대한 특이 항체 역가를 비교하여 보았다. 그룹 A에서 태어난 자돈의 혈청 IgG는 대조군에 비해 각 부착인자에 따라 차이는 있으나 최소 1.2배 (F41)에서 최고 2.6배 (K88ab) 이상 높은 항체 역가가 관찰되었다. 그리고 혈청 IgA는 대조군에 비해 최소 1.2배 (K99)에서 최고 10배 (intimin) 이상의 항체 역가가 관찰되었다. 그룹 B의 모돈에서 태어난 자돈에서의 각 부착인자에 대한 혈청 IgG 및 IgA는 그룹 A의 모돈에서 출생한 자돈에서의 항체 역가와 비슷하거나 높은 것으로 관찰되었다. 하지만 그룹 C의 경우에는 대조군과 비슷하거나 약간 높은 수준의 항체 역가가 관찰될 뿐이었다.(도 4a 내지 4c 참조)
4-1-3. 접종경로별 초유에서의 대장균 부착인자에 대한 항체 역가
초유에서 점막 IgG의 경우 백신 접종군 (그룹 A, B, C)의 점막 IgG는 대조군 (그룹 D)에 비해 최소 1.3배 이상의 항체 역가가 관찰되었고 sIgA의 경우에는 백신 접종군이 대조군에 비해 최소 1.4배 이상의 항체 역가가 관찰되었다. 특히 1차와 2차 모두 경구로 접종한 그룹 B에서 전신 및 점막에서의 항체 역가가 그룹 A와 C에서의 항체 역가 보다 높거나 같은 수준으로 관찰되었다. (도 5a 및 5b 참조)
그룹 A의 경우 살모넬라 티피무리움의 LPS에 대한 혈청 IgG 및 IgA는 1차 접종 3주 후부터 항체 역가가 증가하기 시작하여 2차 접종 후 2주 후에 최고의 항체 역가가 관찰되었다가 분만시점에 약간 감소하였다. 초유에서의 살모넬라 티피무리움의 LPS에 대한 점막 IgG는 그룹 D에 비해 약 1.3배가, sIgA는 약 2.8배의 항체역가가 관찰되었다.
그룹 B는 1차 접종 후 3주 후에 LPS에 대한 혈청 IgG 및 IgA는 그룹 A의 경우보다 월등히 높은 수준으로 증가하였다가 2차 접종 후 2주에는 그룹 A보다 약간 낮은 항체 역가로 관찰되었다. 그렇지만 분만 시점에 혈청 IgG는 그룹 A와 비슷한 수준의 항체역가가 그리고 혈청 IgA의 경우에는 그룹 A보다 높은 수준으로 다시 증가하였다. 더불어 초유에서 그룹 B의 점막 IgG는 그룹 A에 비해 높은 수준의 항체 역가가 그리고 sIgA의 경우에는 그룹 A보다 약간 낮은 수준의 항체 역가가 각각 관찰되었다.
그룹 C의 경우에는 혈청 IgG 및 IgA는 1차 접종 후부터 증가하기 시작하여 다른 그룹들과 마찬가지로 2차 후 2주째에 최고의 항체 역가를 보이다가 분만시점에는 다른 그룹들에 비해 낮은 항체 역가가 관찰되었다. 더불어 초유에서의 점막 IgG는 대조군에 비해 약 1.6배만이 그리고 sIgA는 오히려 대조군 보다 낮은 항체 역가가 관찰되었다. 그룹 A에서 태어난 자돈의 경우 혈청 IgG 및 IgA 모두 대조군에 비해 약 6배 높은 항체 역가가 관찰되었다. 그리고 그룹 B는 혈청 IgG 및 IgA 모두에서 그룹 A보다 약간 높은 항체 역가가 관찰되었다. 그렇지만 그룹 C의 경우에는 혈청 IgG는 그룹 A와 비슷한 수준의 항체 역가가, 그리고 혈청 IgA는 대조군에 비해 약간 높은 수준의 항체 역가만이 관찰되었다.(도 6 참조)
4-1-4. 다양한 경로로 예방접종된 모돈에서 출생한 자돈의 병원성 대장균과 살모넬라균에 대한 방어 효과
모돈에 분만 8주와 5주 전에 각각 예방접종한 후 출생한 자돈이 1주령이 되었을 때 병원성 대장균 또는 살모넬라 티피무리움 야외분리주 (살모넬라균)로 각각 경구 감염시켜 폐사 및 설사 유무를 확인하여 백신의 효능을 비교하여 보았다. 그룹 A의 자돈에 병원성 대장균으로 도전감염 한 9두와 살모넬라균으로 도전감염 한 5두 모두에서 폐사뿐만 아니라 설사도 관찰되지 않았다. 그룹 B의 자돈 또한 병원성 대장균으로 도전감염 한 7두와 살모넬라균으로 도전감염 한 7두 모두에서 폐사 및 설사가 관찰되지 않았다. 하지만 그룹 C는 병원성 대장균으로 도전감염 한 8두 중 1두에서, 살모넬라균으로 도전감염 한 12두 중 4두에서 각각 설사가 관찰되었다. 그리고 대조군인 그룹 D는 병원성 대장균으로 도전감염 한 자돈 20두 중 5두가 폐사하였고 15두는 심한 설사가 관찰되었을 뿐만 아니라 살모넬라균으로 도전감염 한 6두 모두에서 심한 설사가 관찰되었다. 설사하는 자돈의 분변으로부터 균 분리 및 동정을 수행하여 도전감염 시킨 야외 분리균주가 각각 분리되었다. (표 4)
다양한 경로로 예방접종된 모돈에서 출생한 자돈에서의 도전감염 후 병원성 대장균과 살모넬라균에 대한 방어 효과
그룹 접종두수 도전감염 임상증상 설사 분변에서의
균 분리
1주령 자돈 폐사 설사
A 9 F4, F5, F6, F18, F41 발현 병원성 대장균 각각 1×109 cfu로 경구접종 0 0 　
B 7 0 0 　
C 8 0 1 병원성 대장균
D 20 5 15 병원성대장균
A 5 살모넬라 티피무리움 야외 분리주를 2×109 cfu로 경구접종 0 0 　
B 7 0 0 　
C 12 0 4 살모넬라균
D 6 0 6 살모넬라균
국내 포유자돈에서 주로 발생하는 것으로 보고되고 있으며 또한 국내에서 시판되고 있는 병원성 대장균 예방백신과 관련된 병원성 대장균의 부착인자인 F4, F5, F6, F41과 포유자돈에서의 설사 원인균 중 하나인 살모넬라에 대한 방어여부를 확인하기 위해 K88ab, K88ac, K99, FasA, F41, Intimin을 각각 발현하는 백신균주를 실시 예 3-1에서와 같이 제조하여 실험에 사용하였다. 즉 준비된 예방백신을 모돈에 분만 8주와 5주 전에 실시 예 4-1-1의 그룹 B처럼 각각 경구로 예방접종한 후 출생한 자돈이 1주령이 되었을 때 병원성 대장균 또는 살모넬라 티피무리움 야외분리주 (살모넬라균)로 각각 경구 감염시켜 폐사 및 설사 유무를 확인하여 백신의 효능을 비교하여 보았다. 그룹 B-2의 자돈에 병원성 대장균으로 도전감염 한 7두와 살모넬라균으로 도전감염 한 3두 모두에서 폐사뿐만 아니라 설사도 관찰되지 않았다. 하지만 대조군인 그룹 D-2는 병원성 대장균으로 도전감염 한 5두 중 5두에서, 살모넬라균으로 도전감염 한 5두 중 5두에서 모두에서 심한 설사가 관찰되었다. 설사하는 자돈의 분변으로부터 균 분리 및 동정을 수행하여 도전감염시킨 야외 분리균주가 각각 분리되었다. (표 5)
예방접종된 모돈에서 출생한 자돈에서의 도전감염 후 병원성 대장균과 살모넬라균에 대한 방어 효과
그룹 접종두수 도전감염 임상증상 설사 분변에서의
균 분리
1주령 자돈 폐사 설사
B-2 7 F4, F5, F6, F41 발현 병원성
대장균 각각 1×109 cfu로
경구접종		 0 0
D-2 5 0 5 병원성 대장균
B-2 3 살모넬라 티피무리움 야외 분리주를 2×1009 cfu로 경구접종 0 0
D-2 5 0 5 살모넬라
이상의 결과를 종합해 보면 경구로 1차 및 2차 모두를 예방접종한 경우가　탁월한 면역반응 유도와 더불어 병원성 대장균 및 살모넬라균에 대한 방어에 효과적임을 확인할 수 있었다
　　　　　　
4-2. 자돈에서 백신접종 후 특이 면역반응 유도
4-2-1. 자돈에서 백신의 접종경로 및 방법
자돈에서 예방접종 후 면역반응 유도 여부를 확인하기 위해 자돈을 4 그룹 (E, F, G, H)으로 나누어 그룹 E는 실시 예 4-1-1의 그룹 B에서와 같이 모돈에 각각 예방접종한 후 태어난 자돈을 대상으로 생후 2주령의 자돈에 사균백신을 근육으로 1㎖씩 접종하였다. 대조군에서 출생한 자돈 (그룹 F)은 멸균 PBS로 위와 같은 방법으로 각각 접종하였다. 그룹 G는 실시 예 4-1-1의 그룹 B에서와 같이 백신을 접종한 모돈에서 출생한 자돈이 2주령이 되었을 때 사균백신을 근육으로 1㎖씩 접종하고 5주령 때에 생균백신을 2㎖씩 경구접종하였다. 대조군에서 출생한 자돈 (그룹 H)은 멸균 PBS로 위와 같은 방법으로 각각 접종하였다. 백신 접종 후 각 부착인자 및 살모넬라 티피무리움의 LPS에 대한 특이 면역반응 유도 여부를 확인하기 위해 2주령 및 5주령째에 각각 혈액을 채취하여 혈청을 분리 한 후 혈청 IgG 및 IgA의 항체 역가를 간접 ELISA 방법으로 측정하였다. 그룹 E와 F의 자돈이 5주령이 되었을 대 병원성 대장균 (JOL599, 489, 564, 500)을 동량씩 섞어 혼합한 후 경구 감염시킨 후 설사 유무로 방어능에 대한 효과를 측정하였다. 그리고 그룹 G와 H의 자돈이 11주령이 되었을 때 살모넬라균 (JOL389)을 경구 감염시킨 후 설사 유무 및 분변에서의 균 분리동정으로 방어능에 대한 효과를 측정하였다. (표 6)
　
자돈에서의 백신접종 및 도전감염 실험 개요
그룹 접종 두수 예방접종 도전감염
모돈 자돈 자돈
분만
예정일
8주전		 분만
예정일
5주전		 2주령 5주령 5주령 10주령
E 6 경구접종 생균백신 경구접종 생균백신 근육접종 사균백신 　 JOL599, 489, 564, 500이 각각 1×109 cfu가 되도록 혼합하여 경구접종 　
F 16 20% sucrose 20% sucrose 멸균
PBS		 　 　
G 15 경구접종 생균백신 경구접종 생균백신 근육접종 사균백신 경구접종 생균백신 　 JOL398를
5×109 cfu로
경구접종
H 11 20% sucrose 20% sucrose 멸균
PBS		 20% sucrose 　
이유자돈에서 주로 발생하는 대장균증 (F4 발현 대장균과 F18 발현 대장균) 및 부종병 (F18발현 대장균)과 관련된 부착인자인 K88ab, K88ac 그리고 FedA와 FedF 및 이유 후 주로 발병하는 살모넬라증에 대한 방어 여부를 확인하기 위해 자돈을 4 그룹 (E-2, F-2, G-2, H-2)으로 나누어 그룹 E-2는 실시 예 4-1-1에서의 그룹 B에서와 같이 모돈에 각각 예방접종 (FedA 및 FedF는 제외) 한 후 태어난 자돈을 대상으로 생후 2주령의 자돈에 K88ab, K88ac,FedA 와 FedF 발현 백신균주로 제조된 사균백신을 근육으로 1㎖씩 접종하였고, 생후 4주령이 되었을 때 K88ab, K88ac,FedA 와 FedF 그리고 LTB 살모넬라 백신 균주가 각 2.5×109 cfu 가 되도록 2㎖ PBS-수크로즈에 혼합하여 경구로 각각 접종하였다. 대조군에서 출생한 자돈 (그룹 F-2)은 멸균 PBS로 위와 같은 방법으로 각각 접종하였다. 그룹 G-2는 실시 예 4-1-1의 그룹 B에서와 같이 백신(FedA 및 FedF는 제외)을 접종한 모돈에서 출생한 자돈이 2주령이 되었을 때 K88ab, K88ac,FedA 와 FedF 발현 백신균주로 제조된 사균백신을 근육으로 1㎖씩 접종하였고, 생후 5주령이 되었을 때 K88ab, K88ac,FedA 와 FedF 그리고 LTB 살모넬라 백신 균주가 각 2.5×109 cfu 가 되도록 2㎖ PBS-수크로즈에 혼합하여 경구로 각각 접종하였다. 대조군에서 출생한 자돈 (그룹 H-2)은 멸균 PBS로 위와 같은 방법으로 각각 접종하였다. 그룹 E-2와 F-2의 자돈이 5주령이 되었을 대 병원성 대장균 (JOL599, 500)을 동량씩 섞어 혼합한 후 경구 감염시킨 후 설사 유무로 방어능에 대한 효과를 측정하였다. 그리고 그룹 G-2와 H-2의 자돈이 11주령이 되었을 때 살모넬라균 (JOL389)을 경구 감염시킨 후 설사 유무 및 분변에서의 균 분리동정으로 방어능에 대한 효과를 측정하였다. (표 7)
자돈에서의 백신접종 및 도전감염 실험 개요
그룹 접종두수 예방접종 도전감염
모돈 자돈 자돈
분만
예정일
8주전		 분만
예정일
5주전		 2주령 4주령 5주령 5주령 10주령
E-2 6 경구접종
생균백신
(단, FedA 및 FedF 제외)		 경구접종
생균백신 (단, FedA 및 FedF 제외)		 근육접종
사균백신 (K88ab, K88ac, FedA, FedF)		 경구접종
생균백신 (K88ab, K88ac, FedA, FedF)		 JOL599, 489, 564, 500이 각각 1×109 cfu가 되도록 혼합하여 경구접종
F 16 20% sucrose 20% sucrose 멸균
PBS		 20% sucrose
G-2 15 경구접종
생균백신
(단, FedA 및 FedF 제외)		 경구접종
생균백신
(단, FedA 및 FedF 제외)		 근육접종
사균백신 (K88ab, K88ac, FedA, FedF)		 경구접종
생균백신
(K88ab, K88ac, FedA, FedF)		 JOL398를
5×109 cfu로
경구접종
H-2 11 20% sucrose 20% sucrose 멸균
PBS		 20% sucrose
4-2-2. 자돈에서 백신접종 후 대장균 부착인자에 대한 항체 역가
그룹 E의 경우 생후 2주령에서 모든 부착인자 항원에 대한 혈청 IgG는 그룹 F에 비해 최소 1.5배 (F41)에서 최고 30배 (FasA) 높은 항체 역가가 관찰되었다. 생후 5주령에서의 혈청 IgG는 K99을 제외한 다른 모든 부착인자에 대해 그룹 F에 비해 최소 1.2배 (K88ab)에서 약 3배 (FedA) 이상의 항체 역가가 관찰되었다. 그리고 FasA와 F41을 제외한 나머지 부착인자에 대한 IgG는 2주령에 비해 대체로 5주령일 때에 감소하는 경향을 보였다. (도 7)
4-2-3. 자돈에서 백신접종 후 살모넬라 티피무리움의 LPS 에 대한 항체 역가
그룹 E의 경우 살모넬라 티피무리움의 LPS에 대한 혈청 IgG 및 IgA는 생후 2주령일 때에 그룹 F에 비해 각각 60배와 33.3배 높은 항체 역가가 관찰되었으며, 5주령일 때에 IgG는 75배 이상의 항체 역가가 관찰된 반면 혈청 IgA는 대조군과 비슷한 수준의 항체 역가가 관찰되었다.　(도 8)
　　　　　　
4-2-4. 예방접종된 자돈의 병원성 대장균과 살모넬라균에 대한 방어 효과
자돈에 예방접종을 한 다음 도전감염 후의 임상증상을 보면 그룹 E 및 그룹 F의 자돈 모두에서 폐사는 관찰되지 않았다. 하지만 그룹 E 및 그룹 G는 병원성 대장균 또는 살모넬라균으로 도전감염 한 후 이들 균에 의한 설사가 관찰되지 않은 반면 그룹 F는 병원성 대장균으로 도전감염 한 16두 중 7두에서, 그룹 H는 살모넬라균에 의해 11두 중 4두에서 각각 설사가 관찰되었고 도전감염 한 균도 각각 분리되었다. (표 8)
예방접종된 자돈에서 도전감염한 후 병원성 대장균과 살모넬라균에 대한 방어 효과
그룹 접종두수 도전감염 임상증상 설사 분변에서의 균 분리
자돈 폐사 설사
5주령 10주령
E 6 F4, F5, F6, F18, F41 발현 병원성 대장균을 각각 1×109 cfu로
경구접종		 　 0 0 　
F 16 　 0 7 병원성대장균
G 15 - JOL389를
5×109 cfu로
경구접종		 0 0 　
H 11 - 0 4 살모넬라균
자돈에 예방접종을 한 다음 도전감염 후의 임상증상을 보면 그룹 E-2 및 그룹 F-2의 자돈 모두에서 폐사는 관찰되지 않았다. 하지만 그룹 E-2 및 그룹 G-2는 병원성 대장균 또는 살모넬라균으로 도전감염 한 후 이들 균에 의한 설사가 관찰되지 않은 반면 그룹 F-2는 병원성 대장균으로 도전감염 한 3두 중 3두에서, 그룹 H-2는 살모넬라균에 의해 2두 중 1두에서 각각 설사가 관찰되었고 도전감염 한 균주도 각각 분리되었다. (표 9)
예방접종 된 자돈에서 도전감염한 후 병원성 대장균과 살모넬라균에 대한 방어 효과
그룹 접종두수 도전감염 임상증상 설사 분변에서의 균 분리
자돈 폐사 설사
5주령 10주령
E-2 4 F4, F18 발현 병원성 대장균을 각각 1×109 cfu로 경구접종 0 0
F-2 3 0 3 병원성대장균
G-2 3 - JOL389를 5×109 cfu로 경구접종 0 0
H-2 2 - 0 1 살모넬라균
이상의 결과로 자돈에서의 예방접종 또한 모돈에서와 마찬가지로 탁월한 면역반응 유도와 더불어 병원성 대장균 및 살모넬라균에 대한 우수한 방어 효과를 확인할 수 있었다.
　　　　　　
4-3. 모돈 및 자돈에 백신접종 후 부작용 관찰 실험
　실시예 4-1-1에서와 같이 모돈 (그룹 A, B, C)에 분만 예정일 8주와 5주 전에 생균 및 사균 백신으로 각각 예방접종하였고 대조군 (그룹 D)은 PBS-수크로즈로 같은 방법으로 모돈에 접종하였다. 백신접종 후 발열 여부, 분변의 변화, 식욕감퇴(anorexia), 의기소침 (depression)을 중심으로 건강상태를 관찰하였다. 백신 접종군 및 대조군 모두에서 백신접종 후 설사 (diarrhea), 식욕감퇴, 의기소침을 포함하여 아무런 임상증상도 관찰되지 않았다.
실시 예 4-2-1에서와 같이 그룹 E는 생후 2주령 자돈에 사균 백신으로 근육으로 1차 접종하고 생후 5주령 자돈에 생균 백신을 경구로 2차 접종하였다. 대조군 (그룹 F)은 같은 시기에 멸균 PBS와 PBS-수크로즈로 각각 접종한 후 발열 여부, 분변의 변화, 식욕감퇴, 의기소침을 중심으로 건강상태를 관찰하였다. 그룹 E와 그룹 F 모두에서 설사, 식욕감퇴, 의기소침을 포함하여 아무런 임상증상도 관찰되지 않았다.　
4-4. 본 발명의 백신과 기존 상업용 백신의 면역반응 유도 비교실험
4-4-1. 본 발명의 백신과 기존 상업용 백신의 비교실험 개요
본 발명의 백신과 기존에 상용화되어 판매되고 있는 한 백신인 porcine Escherichia coli bacterin (돼지에 분포되고 있는 병원성 대장균 중 4종의 혈청형 균을 배양한 후 포르말린으로 불활화하여 최종 제품의 균수가 1㎖ 당 100억 개의 대장균이 함유되도록 조정된 사균백신)과의 백신 효능을 상호 비교하였다. 즉, 본 발명의 백신 (그룹 I, L)은 분만 예정일 8주와 5주 전에 생균을 각각 경구접종하였으며, 기존 상업용 백신(그룹 J, M)은 백신 제조회사에서 추천하는 방법에 따라 분만 예정일 6주와 2주 전에 각각 근육으로 2ml씩 접종하였다. 그리고 대조군 (그룹 K, N)은 PBS-수크로즈로 본 발명의 백신 접종 시기와 같은 시기에 각각 경구로 접종하였다. 백신 접종 후 유도된 항체 역가를 상호 비교하기 위하여 분만 시점에 혈액 및 초유를 각각 채취하여 혈청 IgG 및 점막 IgG와 sIgA를 간접 ELISA로 측정하였다. 더불어 자돈에서의 이행 항체 역가를 비교하기 위해 자돈이 1일령, 1주령, 3주령일 때 각각 혈액을 채취하여 혈청 IgG 및 IgA 항체 역가를 간접 ELISA로 측정하였다. 예방접종 된 모돈에서 출생한 자돈이 1주령 및 3주령이 되었을 때 국내 돼지에서 분리한 병원성 대장균 (JOL599, 489, 564, 500)을 경구 감염시킨 후 설사 유무로 이 균에 대한 방어 효과를 측정하였다. (표 10)
본 발명의 백신과 기존 상업용 백신의 예방접종 및 도전감염 실험 개요
그룹 접종 두수 예방접종 도전감염
모돈 자돈
분만
예정일
8주전		 분만
예정일
6주전		 분만
예정일
5주전		 분만
예정일
2주전		 1주령 3주령
I 3 경구접종 생균백신 - 경구접종 생균백신 - F4, F5, F6, F18, F41 발현 병원성 대장균이
각각 1×108 cfu가 되도록 혼합하여 경구접종		 -
J 3 - 2ml
근육접종		 - 2ml
근육접종
K 3 20% sucrose - 20% sucrose -
L 3 경구접종 생균백신 - 경구접종 생균백신 - - F4, F5, F6, F18, F41 발현 병원성 대장균이 각각
1×109 cfu가
되도록 혼합하여
경구접종
M 3 - 2ml
근육접종		 - 2ml
근육접종
N 3 20% sucrose - 20% sucrose -
4-4-2. 본 발명의 백신과 기존 상업용 백신의 대장균의 부착인자에 대한 항체 역가 비교
본 발명의 백신 접종군 (그룹 I, M)의 경우에는 각 부착인자에 대한 혈청 IgG 항체 역가는 기존 상업용 백신 (그룹 J, M)보다 K88ab를 제외하고 최소 2배 (K88ac, F41)에서 최고 10배 (FedA) 정도 높은 항체 역가가 관찰되었다. 하지만 상업용 백신의 경우에는 각 부착인자 (K88ab, K99 제외)에 대한 IgG의 항체 역가는 대조군 (그룹 K, N)에 비해 같거나 약간 높게 측정되었을 뿐이었다. 초유에서의 점막 IgG의 경우에는 모든 대장균 부착인자에 대해 개발 백신이 상업용 백신 보다 최소 2.5배 이상 높은 항체 역가가 관찰되었고 sIgA의 경우에도 모든 부착인자에 대해 상업용 백신보다 최소 1.3배 이상 높은 항체 역가가 관찰되었다.(도 9a 내지 9d)
4-4-3. 본 발명의 백신과 기존 상업용 백신의 살모넬라 티피무리움의 LPS 에 대한 항체 역가 비교
살모넬라 티피무리움의 LPS에 대한 항체 역가에서도 본 발명의 백신의 경우에는 1차 접종 후 3주 후부터 대조군 보다 무려 혈청 IgG는 110배가, 혈청 IgA는 17배 높은 항체 역가가 관찰되었다. 초유에서의 점막 IgG의 경우에는 약 30배가, sIgA는 10배 높은 항체 역가가 관찰되었으며 기존 상업용 백신 접종 군은 살모넬라에 대한 백신은 포함되어 있지 않아 대조군과 비슷한 수준의 항체 역가가 관찰되었다. 본 발명의 백신 접종군에서 태어난 3주령 자돈에서의 살모넬라 티피무리움의 LPS에 대한 항체 역가는 대조군의 자돈에 비해 혈청 IgG는 50배가, 혈청 IgA는 26.7배 정도 높은 항체 역가가 관찰되었다. 하지만 기존 상업용 백신접종 군은 살모넬라에 대한 백신은 포함되어 있지 않아 대조군과 비슷한 수준의 항체 역가가 관찰되었다.(도 10)
4-4-4. 본 발명의 백신과 기존 상업용 백신의 병원성 대장균에 대한 방어 효과 비교
1주령 자돈에서 도전감염 후 방어 여부를 비교하여 본 결과 모든 실험군에서 병원성 대장균에 의한 폐사는 없었다. 본 발명의 백신 접종군 및 기존 상업용 백신 접종군에서 태어난 1주령의 자돈 모두에서 도전감염 후 설사가 관찰되지 않았다. 하지만 대조군의 자돈 9두 중 3두에서 설사가 관찰되었다. 그리고 3주령 자돈에서의 방어 여부 비교시험에서는 본 발명의 백신 접종 자돈 모두에서는 설사가 관찰되지 않았다. 반면 기존 상업용 백신접종 자돈 11두 중 4두에서, 대조군의 경우에는 8두 중 4두에서 설사가 관찰되었으며 도전감염에 사용된 균도 각각 분리되었다. 따라서 개발백신이 기존 백신의 경우보다 면역반응 유도 및 방어에 있어 현저한 효과가 있음이 확인되었다. (표 11)
개발백신과 기존 상업용 백신 접종군에서 도전감염 후 병원성 대장균에 대한 방어 효과
그룹 접종 두수 예방접종 도전감염
모돈 접종
두수		 자돈
분만
8주전		 분만
6주전		 분만
5주전		 분만
2주전		 1주령 3주령 설사 설사 분변에서의
균 분리
I 3 경구접종 생균백신 - 경구접종 생균백신 - 12 F4, F5, F6, F18, F41이 각각 1×108 cfu가 되도록 혼합하여 경구접종 - 0 　
J 3 - 2ml
근육접종		 - 2ml
근육접종		 8 0 　
K 3 20%
수크로즈		 - 20%
수크로즈		 - 9 3 병원성
대장균
L 3 경구접종 생균백신 - 경구접종 생균백신 - 9 - F4, F5, F6, F18, F41이 각각 1×109 cfu가 되도록 혼합하여 경구접종 0 　
M 3 - 2ml
근육접종		 - 2ml
근육접종		 11 4 병원성
대장균
N 3 20%
수크로즈		 - 20%
수크로즈		 - 8 4 병원성
대장균
지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
도 1은 본 발명의 개관도이다.
도 2는 각 부착인자 항원 준비 및 각 부착인자를 발현·분비하는 약독화 살모넬라 티피무리움 제작 과정을 도시한 것이다.
도 3은 웨스턴 블롯을 이용하여 약독화 살모넬라 티피무리움 배양액 내에서 발현·분비된 각 부착인자를 확인한 것이다. 레인　1은 대조군의 상층액 에서의 분비 항원을, 레인 2는 각 부착인자 발현·분비 백신균주의 상층액에서의 분비 항원을 나타낸다.
도 4a 내지 4c는 접종 경로별 혈청에서의 대장균 부착인자에 대한 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 5a 및 5b는 접종 경로별 초유에서의 대장균 부착인자에 대한 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 6은 접종 경로별 살모넬라 티피무리움의 LPS에 대한 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 7은 자돈에서의 백신접종 후 대장균 각 부착인자에 대한 혈청 IgG 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 8은 자돈에서 백신접종 후 살모넬라 티피무리움의 LPS에 대한 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 9a 내지 9d는 본 발명의 백신과 기존 상업용 백신 접종 후 모돈 및 자돈에서의 대장균의 각 부착인자에 대한 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 백신과 기존 상업용 백신 접종 후 모돈 및 자돈에서의 살모넬라 티피무리움의 LPS 대한 항체 역가를 나타낸 것이다.

Claims (27)

  1. 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F4(K88ab), F4(K88ac), F5(K99), F6(FasA), F18(FedA), F18(FedF), F41 및 Intimin으로 구성된 군 중에서 선택된 어느 하나의 유전자, 및 asd 유전자를 포함하는, lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주.
  2. 돼지의 병원성 대장균의 LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자, 및 asd 유전자를 포함하는, lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주.
  3. 제1항의 변이주 중 어느 하나 이상을 포함하는 혼합 살모넬라균 변이주.
  4. 제3항의 변이주와 제2항의 변이주를 포함하는 혼합 살모넬라균 변이주.
  5. 제4항에 있어서,
    제3항의 변이주는 제1항의 8개의 변이주 모두를 포함함을 특징으로 하는 혼합 살모넬라균 변이주.
  6. 제3항의 혼합 살모넬라균 변이주를 포함하는, 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신 조성물.
  7. 제4항의 혼합 살모넬라균 변이주를 포함하는, 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신 조성물.
  8. 제5항의 혼합 살모넬라균 변이주를 포함하는, 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신 조성물.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    돼지의 병원성 대장균증은 소화기 질환, 부종병 (edema disease), 호흡기 질환 또는 비뇨생식기계 질환을 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    소화기 질환은 신생자돈 설사병, 조발성 설사병, 3주령 설사병, 백리, 포유자돈 설사병, 또는 이유자돈 설사병을 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  11. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    병원성 대장균은 장독성 대장균 (entrotoxigenic Escherichia coli .; ETEC) 또는 장병원성 대장균 (enteropathogenic Escherichia coli;; EPEC)임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  12. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    살모넬라균은 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 파라타이피(Salmonella paratyphi), 살모넬라 센다이(Salmonella sendai), 살모넬라 갈리나리움(Salmonella gallinarium) 및 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  13. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    형질전환시킨 살모넬라균 변이주는 생균 또는 사균임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    사균은 가열 또는 포르말린으로 불활화시킨 사균임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  15. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 또는 비강 경로로 투여됨을 특징으로 하는 백신 조성물.
  16. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 포함하는, 돼지의 면역증 강 또는 성장촉진을 위한 사료 첨가제.
  17. (i) 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F4(K88ab), F4(K88ac), F5(K99), F6(FasA), F18(FedA), F18(FedF), F41 및 Intimin으로 구성된 군 중에서 선택된 어느 하나의 유전자를 증폭시키는 단계;
    (ii) 상기 부착인자 유전자를 asd 유전자를 가진 플라스미드에 클로닝하는 단계;
    (iii) 살모넬라 균주의 염색체 DNA에서 lon, cpxR 및 asd 유전자를 결실시켜 약독화 살모넬라 균주를 제조하는 단계;
    (iv) 단계 (ii)의 클로닝된 플라스미드로 단계 (iii)의 약독화 살모넬라 균주를 형질전환시키는 단계; 및
    (iv) 형질전환된 살모넬라균 변이주를 선별하는 단계를 포함하는 살모넬라균 변이주를 제조하는 방법.
  18. (i) 돼지의 병원성 대장균의 LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자를 증폭시키는 단계;
    (ii) 상기 LTB 유전자를 asd 유전자를 가진 플라스미드에 클로닝하는 단계;
    (iii) 살모넬라 균주의 염색체 DNA에서 lon, cpxR 및 asd 유전자를 결실시켜 약독화 살모넬라 균주를 제조하는 단계;
    (iv) 단계 (ii)의 클로닝된 플라스미드로 단계 (iii)의 약독화 살모넬라 균 주를 형질전환시키는 단계; 및
    (iv) 형질전환된 살모넬라균 변이주를 선별하는 단계를 포함하는 살모넬라균 변이주를 제조하는 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    돼지의 병원성 대장균은 장독성 대장균 (entrotoxigenic Escherichia coli .; ETEC) 또는 장병원성 대장균 (enteropathogenic Escherichia coli;; EPEC)임을 특징으로 하는 살모넬라균 변이주를 제조하는 방법.
  20. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    살모넬라균은 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 파라타이피(Salmonella paratyphi), 살모넬라 센다이(Salmonella sendai), 살모넬라 갈리나리움(Salmonella gallinarium) 및 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 살모넬라균 변이주를 제조하는 방법.
  21. 제3항의 혼합 살모넬라균 변이주를 생균 또는 사균 백신으로 준비하여, 모돈 또는 자돈에 접종하는 것을 특징으로 하는, 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료를 위한 백신화 방법.
  22. 제4항의 살모넬라균 변이주를 생균 또는 사균 백신으로 준비하여, 모돈 또는 자돈에 접종하는 것을 특징으로 하는, 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료를 위한 백신화 방법.
  23. 제5항의 살모넬라균 변이주를 생균 또는 사균 백신으로 준비하여, 모돈 또는 자돈에 접종하는 것을 특징으로 하는, 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료를 위한 백신화 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    사균은 가열 또는 포르말린으로 불활화시킴을 특징으로 하는 백신화 방법.
  25. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 또는 비강 경로로 백신을 접종함을 특징으로 하는 백신화 방법.
  26. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    1차 및 2차 접종시 생균 백신을 경구로 접종함을 특징으로 하는 백신화 방법.
  27. 제22항 또는 제23항에 있어서,
    1차 및 2차 접종시 생균 백신을 경구로 접종하되, 2차 접종시 LTB를 발현 분비하는 살모넬라 변이균주를 제외한 생균 백신을 접종함을 특징으로 하는 백신화 방법.
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