KR101712012B1 - 개선된 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 돼지 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물 - Google Patents

개선된 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 돼지 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지의 병원성 대장균의 각 부착인자 유전자, asd 유전자, E-lysis 유전자 및 각 부착인자를 세포벽에 잘 발현되도록 agfA 신호서열을 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된, murA 및 asd 유전자가 결실된 고스트 살모넬라균 변이주, 상기 고스트 살모넬라균 변이주를 포함하는 돼지 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 고스트 살모넬라균 변이주는 사균 백신의 일종으로 세포질 성분은 없으면서 야생 균주와 동일한 외각성분 및 외각구조를 가진 살모넬라 변이주 형태를 띠므로 약독화 생균 백신과 유사한 방어 효과를 나타내면서 동시에 병원성 복귀 및 생태계 오염의 우려가 전혀 없는 돼지의 대장균증 예방용 고스트 백신 개발에 유용할 것으로 기대된다.

Description

개선된 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 돼지 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물{Vaccine composition for preventing or treating porcine pathogenic colibacillosis comprising improved ghost Salmonella mutant as effective component}
본 발명은 개선된 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 돼지 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
산업 동물에 있어서 포유 시기에 폐사의 원인 중 약 80% 이상이 소화기 질환에 의해 야기되고 있으며, 육성시기에 증체율 감소의 중요한 원인 중 하나가 바로 소화기 질환이다. 특히 포유자돈에서의 1회 설사는 출하시기를 약 1주일 정도 지연시키는 것으로 알려져 있어 포유자돈에서의 소화기 질환은 양돈 산업에 막대한 경제적 손실을 초래하는 중요한 질병 중 하나이다. 자돈에서 병원성 대장균과 살모넬라균에 의한 소화기 질환은 작년 한해 전체 소화기 질환 원인 중 약 57%와 30% 정도를 차지한다. 더욱이 세균성 소화기 질환 원인균 중에서는 거의 대부분을 차지할 정도로 그 발생률이 빈번하다. 이처럼 양돈 산업에 심각한 경제적 손실을 초래하는 세균성 소화기 질환을 예방하기 위하여 전 세계적으로 효과적인 예방백신을 개발하고자 많은 심혈을 기울이고 있다.
소화기 점막은 대다수의 소화기 및 호흡기 질환 유발 병원균과 처음으로 접하는 장소임과 동시에 이들 세균의 감염을 방어하는 최전방으로서 매우 중요한 곳이다. 하지만 기존 상용화 백신의 대부분은 주로 병원성 대장균을 포르말린 등으로 불활화시킨 사균 백신이거나 유전자 조작 기술을 이용하여 항원성이 높은 항원을 정제한 단백질 항원을 오일이나 겔 등과 같이 적합한 면역증강제와 혼합한 형태이다. 이런 종류의 백신은 주로 근육으로 접종하기 때문에 점막에서의 방어보다는 전신면역(systemic immunization)에 중점을 두고 있다. 이런 전신성 백신(systemic vaccine)은 전신면역 유도는 높지만 점막에서의 항체 유도에는 별다른 영향을 주지 못해 점막에서의 항체 역가는 매우 낮아 병원균 방어에 실패하는 경우가 종종 발생하는 것으로 보고되고 있다. 따라서 미국을 비롯한 선진국에서는 점막면역을 유도할 수 있는 백신 및 면역증강제 개발에 많은 연구가 진행 중에 있다. 하지만 아직까지 이는 사람의 질병 및 실험동물인 마우스를 대상으로 한 기초 연구가 주종을 이루고 있다. 최근에는 수의학 분야에서도 일부의 질병에 대해서 특히, 조류 및 돼지를 대상으로 점막면역에 대한 연구가 수행 중에 있다. 그렇지만 아직 국내외적으로 연구실 수준의 연구가 진행되고 있을 뿐 현장에서는 아직 활용되지 못하고 있는 실정이다.
돼지에서 설사를 일으키는 병원성 대장균 중 장독소원성 대장균 (entrotoxigenic Escherichia coli ETEC)에 의해 주로 설사 및 부종병과 같은 다양한 장관 감염이 발생하고 있으며, 또한 장병원성 대장균(enteropathogenic Escherichia coli EPEC)에 의해서도 야기되고 있다. 돼지에서 지금까지 알려진 ETEC의 주요 부착인자(adhesin)(fimbriae)에는 F4(K88), F5(K99), F6(987P,Fas), F18, F41이 있으며 EPEC의 부착인자로는 인티민(intimin)이 알려져 있다. 세균이 숙주 세포에 부착하는데 사용하는 모든 인자를 부착인자(adhesin)라고 하며 이에는 세균의 핌브리아(fimbria)와 같은 세포 표면 단백질이 포함되어 있다. 세균은 이들 부착인자를 이용하여 숙주의 장관 세포 표면에 안정적으로 부착하여 증식을 시작하면서 독소를 분비함으로써 질병을 일으킨다. 따라서 이들 병원성 세균의 부착인자에 대한 면역반응이 유도된다면 세균에 감염되었을 경우 이들 유도 항체가 이들 부착인자와 결합하여 세균이 숙주의 장관 표면에 부착하여 증식할 수 있는 기회를 미연에 차단함으로써 병원성 세균에 의한 질병 발생을 예방할 수 있을 것이다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 생균 백신을 이용한 동물질병예방 백신개발이 도입될 수 있는데, 생균 백신 개발에 이용하는 미생물은 동물병원균으로 소화기관련 림프조직 또는 점막관련 림프조직에 부착, 침투한 후 집락을 이룰 수 있어야 한다. 주사기를 이용하는 경우에 비해 생균 백신은 감염경로인 구강 또는 비강과 같은 점막부위에서 면역반응을 충분히 유도가능하여 병원균의 감염을 효과적으로 방어할 수 있게 된다. 생균 백신을 사용하는데 있어 살모넬라균을 다가백신(multivalent)으로 개발하기 위해서는 살모넬라 자체의 병원성을 약화시키고, 외부항원을 발현하여 세포외로 분비할 수 있는 분비체계를 갖추는 방법 및 면역원성을 높이기 위해 림프조직 침투력이 증가될 수 있도록 하는 접근 등이 연구되어 왔다. 외부항원 발현과 균주 선택을 위해서는 asd 유전자를 근간으로 한 시스템이 개발되었는데, 약독화 살모넬라 균주의 펩티도글리칸 합성에 필요한 aspartate β-semialdehyde dehydrogenase(asd) 유전자를 결실하여 DAP(diaminopimelic acid) 요구주가 되게 한 후, 외부항원 유전자를 갖는 asd 플라스미드로 형질전환함으로써 외부항원을 발현시킬 수 있고, 항생제 없이 해당균주를 선택할 수 있도록 하였다. 그러나, 발현항원에 대한 면역반응을 충분히 유도하기 위해서는 대량으로 분비될 수 있도록 세포외 분비능력이 더욱 향상되어야 한다.
한편, 한국등록특허 제1478202호에는 '다목적 고스트 살모넬라 백신 및 이를 이용한 동물 면역반응 유도방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0765357호에는 '고스트 비브리오 앵귈라룸 및 이를 함유하는 비브리오증의 예방용 백신'이 개시되어 있으나, 본 발명의 개선된 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 돼지 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 E-lysis cassette, p15A 복제기점(ori) 및 agfA 신호 서열에 연결된 돼지의 독소원성 대장균의 부착인자(adhesin) 유전자를 포함하는 재조합 벡터와 살모넬라 고스트 유도 변이주를 제작하여 상기 재조합 벡터로 형질전환된 변이주가 부착인자를 세포외벽에 안정적으로 다량으로 발현하여 이들 항원에 대한 면역반응을 유도해내며 병원성 대장균 감염을 효과적으로 방어함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 asd(aspartate β-semialdehyde dehydrogenase) 유전자, PR 프로모터/cI 리프레서(repressor)에 작동가능하게 연결된 세포 용해(E-lysis) 유전자, p15A 복제기점(ori), agfA(thin aggregative fimbriae A) 신호 서열(signal sequence) 및 상기 agfA 신호 서열과 연결된 세포 부착인자 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 고스트 살모넬라 변이주를 제공한다.
또한, 본 발명은 asd(aspartate β-semialdehyde dehydrogenase) 유전자, PR 프로모터/cI 리프레서(repressor)에 작동가능하게 연결된 세포 용해(E-lysis) 유전자, p15A 복제기점(ori), agfA(thin aggregative fimbriae A) 신호 서열(signal sequence) 및 상기 agfA 신호 서열과 연결된 세포 부착인자 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계를 포함하는 돼지의 대장균증 예방 또는 치료용 고스트 살모넬라균 변이주의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 돼지의 대장균증 예방 또는 치료용 고스트 살모넬라 변이주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 고스트 살모넬라 변이주 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 돼지의 대장균증 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 고스트 살모넬라균 변이주 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 돼지의 대장균증의 예방용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 고스트 살모넬라균 변이주는 사균 백신의 일종으로 세포질 성분은 없으면서 야생 균주와 동일한 외각성분 및 외각구조를 가진 살모넬라 변이주 형태를 띠므로 약독화 생균 백신과 유사한 방어 효과를 나타내면서 동시에 병원성 복귀 및 생태계 오염의 우려가 전혀 없는 돼지의 대장균증 예방용 고스트 백신 개발에 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 사용된 재조합 벡터 pJHLP69의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 각 항원을 발현시킨 고스트 살모넬라 변이주를 혼합한 백신 조성물을 접종한 후 각 항원에 대한 혈청 IgG 항체 역가를 분석한 결과이다. 그룹 A(■): PBS 접종(대조구), 그룹 B(□): 상업적인 백신으로 1차 근육 주사 후 2차 접종, 그룹 C(▧): 각 4×108의 고스트 세포를 포함하는 혼합물(총 2×109 cells) 1ml로 1차 근육 주사 후 2차 접종, 그룹 D(▦): 각 4×108의 고스트 세포를 포함하는 혼합물(총 2×109 cells) 1ml로 1차 구강 접종 후 2차 접종. *는 두 그룹간의 통계상 유의성 있는 차이를 나타낸다(*P<0.05).
도 3은 본 발명의 백신 조성물을 임신 모돈에 접종한 후 각 부착인자의 초유에서 IgG 및 IgA에 대한 항체역가를 분석한 결과이다. 그룹 A(□): PBS 접종(대조구), 그룹 B(■): 상업적인 백신으로 1차 근육 주사 후 2차 접종, 그룹 C(▧): 각 4×108의 고스트 세포를 포함하는 혼합물(총 2×109 cells) 1ml로 1차 근육 주사 후 2차 접종, 그룹 D(▦): 각 4×108의 고스트 세포를 포함하는 혼합물(총 2×109 cells) 1ml로 1차 구강 접종 후 2차 접종. *는 두 그룹간의 통계상 유의성 있는 차이를 나타낸다(*P<0.05).
도 4는 본 발명의 백신 조성물을 신생 자돈에 접종한 후 각 부착인자의 혈청 IgG 및 IgA에 대한 항체역가를 분석한 결과이다. 그룹 A(□): PBS 접종(대조구), 그룹 B(■): 상업적인 백신으로 1차 근육 주사 후 2차 접종, 그룹 C(▧): 각 4×108의 고스트 세포를 포함하는 혼합물(총 2×109 cells) 1ml로 1차 근육 주사 후 2차 접종, 그룹 D(▦): 각 4×108의 고스트 세포를 포함하는 혼합물(총 2×109 cells) 1ml로 1차 구강 접종 후 2차 접종. *는 두 그룹간의 통계상 유의성 있는 차이를 나타낸다(*P<0.05).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 asd(aspartate β-semialdehyde dehydrogenase) 유전자, PR 프로모터/cI 리프레서(repressor)에 작동가능하게 연결된 세포 용해(E-lysis) 유전자, p15A 복제기점(ori), agfA(thin aggregative fimbriae A) 신호 서열(signal sequence) 및 상기 agfA 신호 서열과 연결된 세포 부착인자 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 asd(aspartate β-semialdehyde dehydrogenase) 유전자는 세포벽 합성에 있어서 펩티도글리칸의 크로스 연결에 관여하는 DAP(diaminopimellic acid) 합성의 개시지점에 관련된 효소로, DAP가 결핍된 배지에서 asd 유전자 결핍주에 asd 유전자의 도입 여부를 확인할 수 있어, 이는 유용한 플라스미드의 선택표지이다.
본 발명의 재조합 벡터에서 상기 "세포 용해(E-lysis) 유전자"는 대장균의 외막에 터널을 구성하여 구멍을 내서 대장균 세포 내 핵산성분을 빼내어 용해(lysis)시키는 역할이 있다는 사실이 알려져 있으며, E-lysis 유전자에 의한 세포 용해의 결과, 핵산 성분을 포함한 모든 세포 내용물이 세포 외부로 유출되고, 외막(outer membrane), 주변 세포질 공간(periplasmic space) 및 내막(inner membrane)만이 남게 된다.
상기 E-lysis 유전자 상류에 PR 프로모터/cI 리프레서(repressor) 조절부위를 연결하여 특정 온도 조건에서만 E-lysis 유전자 발현을 유도할 수 있도록 하여 고스트화 유도 재조합 벡터를 제조하였다.
기존에 사용하던 pBR ori은 고 카피(high copy) 복제기점으로 갑자기 많은 항원과 E-lysis 발현을 조절하기 위해 역방향 아라비노스 시스템(arabinose system)으로 조절이 필요하다. 즉 급격한 항원 및 E-lysis 발현은 결국 숙주 세포에 악영향을 미쳐 숙주 세포가 과부하가 걸리는 현상이 생기는 경우가 많다. 이를 극복하기 위해 아라비노스 시스템이 필요하며 또한 이의 성장을 위해서는 아라비노스를 첨가하여야 하는 번거로움이 있다.
상기 단점을 극복하기 위해 본 발명에서는 낮은 카피 수를 갖는 복제기점인 p15A 복제기점(ori)을 사용하였다. p15A 복제기점(ori)을 포함하는 벡터를 사용함으로써 세포가 성장하는 동안 천천히 항원을 발현하며, 배양온도를 올렸을 때 세균을 용균시키기에 충분한 양을 발현시키므로 기존의 벡터에서 사용하던 많은 항원과 E-lysis 발현을 조절하기 위한 역방향 아라비노스 시스템에 의한 조절이 필요하지 않는다.
상기 agfA(thin aggregative fimbriae A) 신호 서열(signal sequence)은 세포 부착인자를 세포외벽에 다량 발현시키기 위해 삽입되었다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 asd(aspartate β-semialdehyde dehydrogenase) 유전자, PR 프로모터/cI 리프레서(repressor)에 작동가능하게 연결된 세포 용해(E-lysis) 유전자, p15A 복제기점(ori), agfA(thin aggregative fimbriae A) 신호 서열(signal sequence) 및 상기 agfA 신호 서열과 연결된 MCS(multicloning site)를 포함하는 재조합 벡터인 "pJHP69 플라스미드" 를 제작하였고, 상기 구축한 벡터의 MCS 부위에 세포 부착인자 유전자를 삽입하여 본 발명의 최종적인 재조합 벡터를 제조하였다.
본 발명의 재조합 벡터는 세포 부착인자 유전자를 포함하며, 이는 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 K88ab, K88ac, K99, FasA 및 F41 유전자로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자를 포함하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 생성물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 선별 표지 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 고스트 살모넬라 변이주를 제공한다.
상기 고스트 살모넬라 변이주는 약독화된 것이 바람직하다. 상기 약독화된 고스트 살모넬라 변이주는 murA(UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase) 및 asd 유전자가 결실된 것이 바람직하다. 상기 MurA는 펩티도글리칸 생합성에서 첫 번째 결합을 촉진하는 효소로 UDP-N-아세틸글루코사민(UDP-N-acetylglucosamine)의 3'-히드록시(hydroxy group)에 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate, PEP)를 결합시킨다.
상기 murA 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주는 asd 유전자가 결실된 DAP 요구주로서 항생제 없이 항원 재조합 균주를 선택할 수 있도록 제작되었을 뿐만 아니라, murA 유전자를 결실하여 병원성이 약독화된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 살모넬라균 변이주는 부착인자를 세포외벽에 발현할 수 있으며, 바람직하게는 돼지의 병원성 대장균의 부착인자인 K88ab, K88ac, K99, FasA 또는 F41를 세포외벽에 발현할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은
(a) asd(aspartate β-semialdehyde dehydrogenase) 유전자, PR 프로모터/cI 리프레서(repressor)에 작동가능하게 연결된 세포 용해(E-lysis) 유전자, p15A 복제기점(ori), agfA(thin aggregative fimbriae A) 신호 서열(signal sequence) 및 상기 agfA 신호 서열과 연결된 세포 부착인자 유전자를 포함하는 고스트 유도 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(b) 살모넬라 균주의 게놈 DNA에서 murA 및 asd 유전자를 결실시켜 약독화된 살모넬라 변이주를 제조하는 단계;
(c) 상기 (a) 단계의 재조합 벡터로 상기 (b) 단계의 murA 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라 변이주를 형질전환시키는 단계;
(d) 상기 형질전환된 살모넬라균 변이주를 선별하는 단계;
(e) 선별된 살모넬라 변이주를 아라비노즈를 함유하는 배지에서 25~30℃ 조건으로 배양하는 단계;
(f) 상기 배양액의 세포밀도(OD600)가 0.2~0.5에 도달하면 아라비노즈를 함유하지 않는 배지에서 40~43℃의 온도에서 추가로 배양하는 단계; 및
(g) 상기 배양액의 세포밀도 감소가 중지되었을 때 상기 살모넬라를 수득하는 단계;를 포함하는 돼지의 대장균증 예방 또는 치료용 고스트 살모넬라균 변이주의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법에서, 세포 부착인자 유전자는 돼지의 병원성 대장균의 K88ab, K88ac, K99, FasA 및 F41을 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 돼지의 대장균증 예방 또는 치료용 고스트 살모넬라 변이주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 고스트 살모넬라 변이주 중 2 이상을 포함하는 돼지의 대장균증 예방 또는 치료용 고스트 살모넬라 변이주 혼합물을 제공한다.
본 발명의 상기 고스트 살모넬라균 변이주 혼합물은 murA 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균이, K88ab, K88ac, K99, FasA 및 F41로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 돼지의 병원성 대장균의 부착인자를 세포외벽에 발현하는 고스트 살모넬라균 변이주를 2 이상 포함하고 있는 혼합물이다.
바람직하게는, 상기 고스트 살모넬라균 변이주 혼합물은 K88ab를 세포외벽에 발현하는 고스트 살모넬라균 변이주, K88ac를 세포외벽에 발현하는 고스트 살모넬라균 변이주, K99를 세포외벽에 발현하는 고스트 살모넬라균 변이주, FasA를 세포외벽에 발현하는 고스트 살모넬라균 변이주 및 F41를 세포외벽에 발현하는 고스트 살모넬라균 변이주를 모두 포함하는 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 고스트 살모넬라 변이주 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 돼지의 대장균증 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 백신 조성물은 K88ab, K88ac, K99, FasA 및 F41로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 돼지의 병원성 대장균의 부착인자를 세포외벽에 발현하는 고스트 살모넬라균 변이주 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하여, 상기 백신 조성물을 동물에 처리하여 돼지 대장균증을 예방 또는 치료할 수 있는 것이다.
상기 백신 조성물은 모돈 또는 자돈에 접종하는 것이 바람직하나, 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 바람직하게는 고스트 백신을 경구 또는 근육 내 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 조성물의 투여량은 돼지의 무게, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 고스트 백신 조성물의 투여량은 모돈 1두당 약 2×108 내지 2×1011 세포, 바람직하게는 약 2×109 내지 2×1010 세포로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동 면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동 면역은 면역에 관계하는 항체의 생성기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤 (iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 서브바이랄 (subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 드립 (drip) 또는 스프레이 등의 비강용 제형 그리고 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비강내 투여를 위한 제제에 적합한 침투제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 적합한 제형물은 안정성과 순응도를 위해 바람직하게 무균, 등장 및 완충되도록 제형화된다. 비강내 투여를 위한 제제는 또한 정상적인 섬모 작용을 유지시키기 위해 점액 분비를 여러 측면에서 자극하도록 제조되며, 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1990))에 기술된 바와 같이, 적합한 제형이 바람직하게 등장성의, pH 5.5 내지 6.5를 유지하는 약간 완충된 제형이며, 가장 바람직하게 항미생물 방부제 및 적합한 약물 안정화제를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 고스트 살모넬라균 변이주 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 돼지의 대장균증의 예방용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 사료 첨가제는 살모넬라균 변이주 또는 이의 혼합물을 원형 그대로 사용하거나 또는 추가적으로 가축에 허용되는 곡류 및 그 부산물 등의 공지된 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염 (중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있으며, 상기 사료첨가제를 공급하는 경우는 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 박테리아 균주, 플라스미드 및 생장 조건
본 발명에서 사용된 모든 균주와 플라스미드는 표 1에 기재되어 있다. 각각의 K88ab, K88ac, K99, FasA 및 F41 핌브리아 항원(fimbrial antigen)을 암호화하는 유전자를 야생형 ETEC 균주인 JOL416, JOL417, JOL412, JOL415 및 JOL413으로부터 각각 증폭하였다(Hur 및 Lee, 2011, J. Vet. Med. Sci. 73:1265-73). 설사 자돈(diarrheal piglet)으로부터의 야생형 ETEC 분리주인 JOL489, JOL564 및 JOL599을 도전감염 균주로 사용하였다. 약독화된 살모넬라 티피무리움 변이균주(Δ murA Δasd)인 JOL1346은 야생형 살모넬라 티피무리움인 JOL401으로부터 murA 및 asd 유전자를 결실시켜서 제조하였고, 핌브리아 항원을 전달하기 위한 전달 균주로 사용하였다. pJHLP69 플라스미드는 p15A 복제기점, asd 유전자, agfA 신호서열 및 고스트 카세트(ghost cassette)을 포함하였다. 고스트 카세트는 phiX174 lysis E 유전자와 파지 λpR37-cI857 조절 시스템을 포함하였다. 야생형 대장균과 JOL401은 LB 액체배지(Luria-Bertani broth; Becton, Dickinson and Company, 미국) 또는 LB 한천배지에서 37℃로 배양하였다. 반면 고스트 플라스미드를 포함하는 균주는 28℃에서 L-아라비노스가 첨가된 LB 배지에서 배양하였다. JOL1346 배양을 위해 디아미노피멜산(Diaminopimelic acid, DAP; Sigma-Aldrich, 미국)을 배지에 50㎍/mL 농도로 첨가하였다.
본 발명에 사용된 균주 및 벡터
균주/플라스미드 설명 출처
균주
Escherichia coli
JOL416 Wild type F4 (K88ab)+ ETEC isolate from pig Hur and Lee, 2012
JOL417 Wild type F4 (K88ac)+ ETEC isolate from pig Hur and Lee, 201
JOL412 Wild type F5 (K99)+ ETEC isolate from pig Hur and Lee, 2011
JOL415 Wild type F6 (Fas)+ ETEC isolate from pig Hur and Lee, 2011
JOL413 Wild type F41+ ETEC isolate from pig Hur and Lee, 2011
JOL489 Wild type F5+, F41+, LT+, stx2 + ETEC isolate from pig Hur and Lee, 2013
JOL564 Wild type F6+, stx+, stx2 + ETEC isolate from pig Hur and Lee, 2013
JOL599 Wild type F4+, LT+, STa+, STb+, EAST1+ ETEC isolate from pig Hur and Lee, 2013
Samonella typhimurium
JOL401 wild type from chicken Hur and Lee, 2010
JOL1346 JOL401 derivative △murA△asd
JOL1347 JOL1346 with pJHLP69-K88ab
JOL1348 JOL1346 with pJHLP69-K88ac
JOL1349 JOL1346 with pJHLP69-K99
JOL1350 JOL1346 with pJHLP69-FasA
JOL1351 JOL1346 with pJHLP69-F41
플라스미드
pYA3560 asd+, p15A ori Kang et al., 2002
pJHLP69 asd+, p15A ori plasmid carrying ghost cassette, agfA-signal sequence/6xHis
2. 핌브리아 항원( fimbrial antigens )을 발현하는 살모넬라 고스트 균주의 제작
상기 E lysis 고스트 카세트는 cI857 조절인자를 가진 센스 λpR 프로모터에 E lysis 유전자가 삽입된 프로모터 구축물에 기반하였다. E lysis 카세트는 p15A 복제기점, MCS(multicloning site) 및 asd 유전자를 포함하는 pYA3560 플라스미드에 삽입하였다. agfA 유전자의 DNA 절편은 대장균의 게놈 DNA을 주형으로 PCR로 증폭하였다. 외래 항원 전달 시스템을 제조하기 위하여 대장균의 agfA 신호 서열에서 6-TMD(transmembrane domain) 영역을 암호화하는 DNA 서열을 Ptrc 프로모터 조절하에 삽입하였다. agfA TMD 영역은 His6 에피토프 서열(epitope sequence)에 인-프레임하여 융합하였고, 에피토프 서열의 3' 말단은 MCS에 연결되어 외래 항원이 클로닝되었다. 결과적으로 생성된 플라스미드는 p15A 복제기점을 가지며, 이는 pJHLP69로 명명하였다(도 1).
세포외벽에 재조합 K88ab, K88ac, K99, FasA 및 F41 항원을 발현하는 살모넬라 고스트 백신 후보자를 제작하기 위하여, 상기 항원을 암호화하는 유전자를 PCR 방법으로 증폭하였다. 증폭된 유전자 각각은 pJHLP69에 클로닝 후 JOL1346에 형질전환하였다. 상기 항원 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 콜로니는 DAP가 없는 LB 한천배지에서 선택하였다. 각 플라스미드를 포함하는 콜로니는 L-아라비노스가 함유된 LB 한천배지 내 28℃에서 배양 후 선택하였다. 각 균주명은 K88ab을 발현하는 JOL1347, K88ac을 발현하는 JOL1348, K99을 발현하는 JOL1349, FasA을 발현하는 JOL1350 및 F41을 발현하는 JOL1351로 칭하였다(표 1).
3. 고스트 백신 후보자 제작
각 균주의 단일 콜로니를 0.2% L-아라비노스가 함유된 LB 배지에 접종하여 28℃에서 OD600가 0.3~0.4에 도달할 때까지 배양하였다. 세포를 수집하여 PBS에 세척한 후 L-아라비노스가 없는 LB 배지에 재현탁하였다. 이어서 온도를 42℃로 높여서 E-매개 용출(lysis)을 유도하였다. 40시간 후 용출 유도를 관찰한 후 4000×g, 10분간 원심분리하여 세포를 수확하였다. 수확된 고스트는 PBS로 3회 세척한 후 재현탁하여 사용되기 전까지 -20℃에 보관하였다.
4. 면역 및 샘플 수집
본 발명에 사용된 임신 모돈(n=12)과 자돈(n=78)은 Large Yorkshire 품종이다. 임신 모돈은 통상적으로 농가에서의 백신 프로그램에 따라 예방접종하였다. 예상되는 분만일 10일 전에 임신 모돈을 각각 자돈을 위한 열전등(heat lamp)과 분만틀을 가진 분만우리에 옮겼다. 임신 모돈은 항생제 또는 다른 생장 촉진제 없는 식단으로 급이하였다. 자돈은 출생 후 최대 28일까지 모돈과 키웠다. 전체 12마리 임신 모돈을 4그룹으로 나누었다. 모든 임신 모돈은 임신 11주에 1차 접종한 후 임신 14주에 2차 접종하였다. 그룹 A는 PBS로 1차 근육 주사(IM) 후 2차 접종하였다. 그룹 B는 상업적인 백신(Porcine E. coli Vaccine-Polyvalent, Green Cross Veterinary Products Co., 한국)으로 1차 근육 주사 후 2차 접종하였다. 그룹 C는 각 4×108 cells의 고스트 세포를 포함하는 혼합물(총 2×109 cells) 1ml로 근육 주사 후 2차 근육 접종하였다. 그룹 D는 각 4×108 cells의 고스트 세포를 포함하는 혼합물(총 2×109 cells) 10ml로 구강 접종 후 2차 접종 하였다. 혈액 샘플은 1차 접종 후 0주(0WPPI, week post prime immunization)(임신 11주의 1차 접종 전), 3주(0WPPI)(임신 14주의 2차 접종 전), 6주(0WPPI)(분만일)에 수집하였다. 초유(colostrum) 샘플은 분만일의 모돈으로부터 수집하였다. 자돈의 혈액 샘플은 출생 4일 후 경정맥에서 수집하였다. 모든 샘플은 사용 전까지 -70℃에 저장하였다. 모든 실험동물은 한국동물보호협회 지침에 따라 준수사항을 전북대 동물윤리위원회로부터 승인을 받아 사용하였다.
5. ELISA 면역 반응 측정
K88ab, K88ac, K99, FasA 및 F41 재조합 단백질을 정제하였다. 혈청에서의 항원-특이적 IgG 및 초유에서의 IgA와 IgG의 역가(titer)를 평가하기 위하여, pig IgG 또는 IgA ELISA Quantitation Kit(Bethyl Lab Inc., 미국)을 사용하여 효소면역분석법(ELISA)을 수행하였다. 간략히 기술하면, 임신 모돈과 자돈의 혈청 샘플을 1:200으로 희석하여 IgG 역가에 사용하였다. 초유의 IgA 및 IgG 역가를 측정하기 위해 초유 샘플은 각각 1:16 및 1:320으로 희석하였다. 효소 반응은 o-페닐렌디아민(Sigma-Aldrich, 미국)로 발색하여 492nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준화된 곡선 그래프는 표준집단과 그것들의 흡광도(absorbance) 사이의 관계를 나타내기 위해서 만들어졌고, 각각의 표본에 있는 항체 농도(㎍/㎖)는 이 곡선 그래프를 이용하여 결정되었다.
6. 도전감염
도전감염 실험을 위해 JOL489, JOL564 및 JOL599을 감염 균주(challenge strain)로 준비하였다. 5일령 자돈은 각 1×109 CFU/ml 도전감염 균주의 혼합물 3㎖로 구강 내 접종하였다. 자돈은 접종 14일 동안 매일 설사 및 치사 여부를 모니터링하였다. 설사 자돈에서 직장도말(rectal swab)로 검체를 채취하여 K88ab, K88ac, K99, FasA 및 F41를 포함하는지 여부를 PCR 방법으로 확인하였다.
7. 통계적 분석
결과는 평균±표준편차(SD)로 나타냈다. Mann-Whitney U-test로 집단 간 통계적 비교 분석을 하였다. 분석은 SPSS version 16.0 software(SPSS, 미국)로 실행하였고, p≤0.05 일 때 통계적으로 유의미하다고 간주하였다.
실시예 1. 예방 접종한 모돈의 면역 반응
모돈의 혈청과 초유 내 각각의 항원과의 항체 반응은 도 2와 도 3에 개시되었다. 예방 접종한 모든 모돈 그룹에서의 항원에 대한 혈청 IgG 역가는 대조군인 그룹 A와 비교해 봤을 때 현저하게 증가했다(P≤0.05)(도 2). 또한, 그룹 D에서 항원에 대한 초유 내 IgA와 IgG 역가는 그룹 A에 비해 현저하게 증가하였다(P≤0.05)(도 3). 그룹 B와 그룹 C의 초유 내 IgA와 IgG 역가 또한 그룹 A에 비해 현저하게 증가하였다(도 3).
실시예 2. 자돈의 수동 면역 반응(passive immunity)
자돈의 혈청 내 각각의 항원과의 항체 반응은 도 4에 개시되었다. 출생 4일째인 자돈의 그룹 C와 D에서 모든 항원에 대한 IgA와 IgG 역가는 대조군인 그룹 A에 비해 현저하게 증가하였다(P≤0.001)(도 4). 그룹 B의 혈청 내 IgA와 IgG 역가 또한 그룹 A에 비해 현저하게 증가하였다(도 4).
실시예 3. 도전감염에 대한 자돈의 방어 효과 확인
모든 자돈은 3×109 CFU의 도전감염 균주로 구강 내 접종하였다. 그룹 D의 자돈은 도전감염 14일 후에도 설사 등의 임상 증상이 관찰되지 않았다. 반면에 대조군인 그룹 A 자돈의 경우 18마리 중 16마리(88.9%)에서 설사가 관찰되었다. 감염 3일 후에 3마리는 심한 설사로 인해 폐사하였다. 그룹 B의 23마리 중 7마리에서 설사가 관찰되었고 그룹 C의 경우 17마리 중 4마리에서 설사가 관찰되었고 1마리가 폐사되었다(표 2).
ETEC 감염균주에 대한 도전감염 후 자돈의 임상 증상
그룹 자돈수 설사(%) 폐사(%)
A 18 16(88.9) 3(16.7)
B 23 7(30.4) 0
C 17 4(23.5) 1(5.3)
D 20 0 0

Claims (9)

  1. 하기 각각의 고스트 살모넬라 변이주를 모두 포함하는 고스트 살모넬라 변이주의 혼합물로서, 각각의 고스트 살모넬라 변이주는 murA 및 asd 유전자가 결실된 약독화 살모넬라 균주에
    (a) asd(aspartate -semialdehyde dehydrogenase) 유전자;
    (b) PR 프로모터/cI 리프레서(repressor)에 작동가능하게 연결된 세포 용해(E-lysis) 유전자;
    (c) p15A 복제기점(ori);
    (d) agfA(thin aggregative fimbriae A) 신호 서열(signal sequence); 및
    (e) 상기 agfA 신호 서열과 연결된 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 K88ab, K88ac, K99, FasA 및 F41을 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시킨 고스트 살모넬라 변이주인 것을 특징으로 하는 고스트 살모넬라 변이주의 혼합물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항의 고스트 살모넬라 변이주의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 돼지의 대장균증 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 백신 조성물은 모돈 또는 자돈에 접종하는 것을 특징으로 하는 돼지의 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  9. 제1항의 고스트 살모넬라 변이주의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 돼지의 대장균증의 예방용 사료 첨가제.
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KR102100503B1 (ko) 개선된 고스트 장관독소형 대장균를 유효성분으로 포함하는 돼지 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물
Hur et al. Protective efficacy by various doses of Salmonella ghost vaccine candidate carrying enterotoxigenic Escherichia coli fimbrial antigen against neonatal piglet colibacillosis
KR102439333B1 (ko) Stx2eA2-단량체-Stx2eB-오량체 재조합 단백질을 포함하는 돼지의 병원성 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물
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JP7295223B2 (ja) 混合ワクチン
KR102588101B1 (ko) FliC-FimA-CD40L 융합 항원을 발현하는 살모넬라 갈리나룸 변이주를 유효성분으로 포함하는 가금티푸스 및 살모넬라증 동시 예방 또는 치료용 백신 조성물
Liu et al. Construction and evaluation of a fluorescence-based live attenuated Escherichia coli delivery system for generating oral vaccine candidate
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KR20210061741A (ko) 돼지 흉막폐렴균 사균체를 포함한 돼지 흉막폐렴 백신 조성물
김아름 Application of the C-terminal fragment of Pasteurella multocida dermonecrotic toxin on the development of vaccines against progressive swine atrophic rhinitis
Pellissery et al. Special Issues

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