KR101950931B1 - ptsI 및 crr 유전자 결손된 약독화 살모넬라 타이피뮤리움 균주 및 상기 균주를 이용한 생균 백신 조성물 - Google Patents

ptsI 및 crr 유전자 결손된 약독화 살모넬라 타이피뮤리움 균주 및 상기 균주를 이용한 생균 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 살모넬라 타이피뮤리움균의 염색체에서 병원성을 유발하는 유전자인 ptsI(Phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase I) 및 crr(catabolite repression resistant component) 유전자를 동시에 결실시킨 살모넬라 타이피뮤리움 균주를 이용한 생균 백신 조성물에 관한 것으로, 상기 유전자가 결실된 살모넬라 타이피뮤리움 백신 균주를 마우스에 투여하였을 때 약독화된 것을 확인하였으며, 근육 투여 시 항체의 생성이 더욱 경제적임을 확인하였다.

Description

ptsI 및 crr 유전자 결손된 약독화 살모넬라 타이피뮤리움 균주 및 상기 균주를 이용한 생균 백신 조성물{ptsI and crr mutated and attenuated Salmonella typhimurium and a composition for vaccine using the same}
본 발명은 ptsI(Phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase I) 및 crr(catabolite repression resistant component) 유전자 결손형 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 균주 및 상기 균주를 이용한 생균 백신 조성물에 관한 것이다.
살모넬라(Salmonella)는 형태학적 또는 생리학적으로 대장균과 유사하지만 의학상의 편의를 위해 K. Kauffmann 등의 제창에 의해 독립된 속(genus)으로 분류되었다. 살모넬라는 1885년 Salmon과 Smith가 돈콜레라로 죽은 돼지에서 살모넬라 코레라에수이스(Salmonella choleraesuis)를 최초로 분리 보고한 이래, 장염과 위장염 환자 및 각종 질병을 가진 동물로부터 분리되었다. 또한 닭을 비롯한 소, 돼지, 염소, 개, 고양이 등의 건강한 동물과 환경물에서도 분리되었는데, 살모넬라 속 균은 현재까지 2,500여 종 이상의 혈청형이 보고된 실정이며 동물에 따른 숙주 특이성이 있는 균종(예를 들면 사람에서의 S. typhi, 소에서 S. dublin, 돼지에서의 S. choleraesuis, 닭에서의 S. pullorum , S. gallinarum)과 숙주 특이성이 없는 균종(S. typhimurim , S. enteriditis , S. newprot 등)으로 크게 구분 지을 수 있고, 이 중 축산물을 통해 사람의 식중독을 일으키는 혈청형은 후자에 해당한다.
살모넬라(Salmonella)는 그람 음성의 통성 혐기성 세균으로, 주로 구강을 통해 숙주 내로 들어오며, 이들은 포유동물, 조류, 파충류, 각종 애완동물, 가축 등에 감염하여 위염, 설사, 패혈증 등의 질병을 일으킨다. 뿐만 아니라 살모넬라는 사람에게도 감염하여 위염, 장티푸스 등의 심각한 질병을 일으키기도 하며, 특히 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)은 사람에게 가장 빈번히 감염을 일으키는 살모넬라 혈청형(serotype)이다. 살모넬라 감염은 주로 살모넬라균이 함유된 유제품, 계란, 육류 등 가축 유래의 식품이나 가축들의 분뇨에 의해 오염된 물을 통하여 발생하며, 식품을 통하여 살모넬라 감염이 이루어지면 48시간 이내에 위염이 발생한다. 살모넬라 감염은 위생시설이 현대화되어 있는 선진국에서도 일 년에 약 1,400,000 건이 발생하고 있는 것으로 추정되어, 이에 대한 백신이 계속적으로 개발되고 있다.
가축의 질병을 예방하기 위해 사용되는 불활화 사균백신의 경우 특이 항원에 대한 면역반응이 잘 유도되지 않거나 선모 정제 백신의 경우 발현유도 및 정제과정이 번거롭고, 재조합 서브유닛 정제 백신의 경우 항원의 분리정제 및 면역성을 증강시켜야 하는 까다로운 제조 공정과정을 거쳐야 한다. 또한, 변성을 방지하고, 백신 부작용을 줄이기 위해 안정적으로 보관해야 하며 각 개체를 주사기를 이용해 접종해야 하는 불편함뿐만 아니라 주사기를 이용하여 항원을 투여하는 경우 소화기 관련 림프조직 또는 점막 관련 림프조직에 항원이 노출되지 않아 점막면역을 강력하게 활성화하지 못하는 단점이 있으며, 구강으로 정제 백신을 투여하는 경우에도 소화기관내 낮은 pH 조건 등에서 변성이 발생되므로 면역원성을 유지하기는 어려운 문제점이 있다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 생균백신을 이용한 동물 질병예방 백신개발이 도입될 수 있는데, 생균백신 개발에 이용하는 미생물은 동물병원균으로 소화기관련 림프조직 또는 점막관련 림프조직에 부착, 침투한 후 집락을 이룰 수 있어야 한다. 주사기를 이용하는 경우에 비해 생균백신은 감염경로인 구강 또는 비강과 같은 점막부위에서 면역반응을 충분히 유도 가능하여 병원균의 감염을 효과적으로 방어할 수 있게 된다. 생균백신을 사용하는데 있어 살모넬라균을 다가백신(multivalent)으로 개발하기 위해서는 살모넬라 자체의 병원성을 약화시키고, 외부항원을 발현하여 세포 외로 분비할 수 있는 분비체계를 갖추는 방법 및 면역원성을 높이기 위해 림프조직 침투력이 증가될 수 있도록 하는 접근 등이 연구되어 왔다. 외부항원 발현과 균주 선택을 위해서는 asd(aspartate β-semialdehyde dehydrogenase) 유전자를 근간으로 한 시스템이 개발되었는데, 약독화 살모넬라 균주의 펩티도글리칸 합성에 필요한 asd 유전자를 결실하여 DAP(diaminopimelic acid) 요구주가 되게 한 후, 외부항원 유전자를 갖는 asd 플라스미드로 형질전환 함으로써 외부항원을 발현시킬 수 있고, 항생제 없이 해당 균주를 선택할 수 있도록 하였다. 그러나, 발현항원에 대한 면역반응을 충분히 유도하기 위해서는 대량으로 분비될 수 있도록 세포 외 분비능력이 더욱 향상되어야 한다. 현재까지 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)이나 살모넬라 타이피(Salmonella typhi)를 대상으로 하는 생균 백신이 개발되어 시판이 되고 있으나, 살모넬라 타이피뮤리움(S. typhimurium)을 대상으로한 생균백신은 개발된 바 없다.
또한, 근육주사를 통하여 생균 백신을 투여할 경우 일반적으로 더욱 효과적인 항체 형성 반응을 유도할 수 있다. 현재까지 개발된 살모넬라 생균 백신은 구강용 백신으로, 근육주사용 백신은 개발된 적이 없다. 근육주사용 생균 백신 개발을 통해 효과적인 인수 공통질병 제어가 가능하고, 특히 근육주사를 통하여 생균 백신을 면역할 수 있을 경우 다양한 병원체 단백질(독감, 구제역 등)과 항암용 백신을 위한 재조합 균주의 제조로의 광범위한 활용이 가능하다.
Phosphoenolpyruvate (PEP):carbohydrate phosphotransferase system (PTS)은 하기 그림과 같이 당 성분을 흡수하는 시스템으로서 이를 조절하는 유전자는 대표적으로 ptsH , ptsI , crr로 구성되어 있다.
Figure 112017088435763-pat00001
이에, 본 발명자들은 효과적인 살모넬라 생백신을 제조하기 위하여 예의 노력한 결과, 살모넬라 타이피뮤리움 균의 염색체에서 ptsI(Phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase I) 및 crr(catabolite repression resistant component) 유전자를 동시에 결실시킨 살모넬라 타이피뮤리움 변이 균주를 제조하였을 때, 상기 살모넬라 타이피뮤리움 변이 균주는 병원성이 약독화 되었음에도 불구하고, 근육 투여 시 더욱 효과적으로 항체 형성을 유도, 개체의 면역 획득을 위한 백신으로 활용 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
대한민국 공개특허 제 10-2008-0082156호 (2008년09월11일) 대한민국 등록특허 제 10-1481789호 (2015년01월06일)
본 발명의 목적은 ptsI(Phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase I) 및 crr(catabolite repression resistant component) 유전자 결손형 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 균주 및 상기 균주를 이용한 생균 백신 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ptsI(Phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase I) 및 crr(catabolite repression resistant component) 유전자가 결손된, 병원성이 약화된 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 함유하는 살모넬라 감염 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 함유하는 살모넬라 감염 예방용 사료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 및 약제학적으로 허용되는 담체를 유효성분으로 함유하는 식중독, 장티푸스, 복막염, 궤양성 대장염, 크론병, 장관 베체트병, 감염성 설사, 위장염, 염증성 장질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증, 장관 급이성 설사 및 허혈성 장염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 살모넬라 감염증 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 벡터 내 항생제 서열의 일부를 포함하는, ptsI(Phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase I) 및 crr(catabolite repression resistant component) 유전자 서열의 일부를 각각 증폭시키는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 증폭된 산물을 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 형질전환시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 형질전환시킨 살모넬라 타이피뮤리움 균주에서 항생제 서열을 제거하는 단계; 및
4) ptsI 및 crr 유전자가 모두 결손된 균주를 선별하는 단계를 포함하는 병원성이 약화된 살모넬라 타이피뮤리움 균주 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 균주의 염색체에서 병원성을 유발하는 유전자인 ptsI(Phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase I) 및 crr(catabolite repression resistant component) 유전자를 동시에 결실시킨 살모넬라 타이피뮤리움 균주를 이용한 생균 백신 조성물에 관한 것으로, 상기 유전자가 결실된 살모넬라 타이피뮤리움 백신 균주를 마우스에 투여하였을 때 약독화된 것을 확인하였으며, 근육 투여 시 항체의 생성이 더욱 경제적임을 확인하였다.
도 1은 ptsI 또는 crr 유전자가 결실된 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 균주의 유전체 모식도를 나타낸 도이다:
KST0004 WT: 야생형 살모넬라 타이피뮤리움 LT2;
KST0572(LT2ΔptsI): ptsI 유전자가 결손된 살모넬라 타이피뮤리움 변이균주;
KST0594(LT2Δcrr): crr 유전자가 결손된 살모넬라 타이피뮤리움 변이균주; 및
KST0567(LT2ΔptsIcrr): ptsI 및 crr 유전자가 결손된 살모넬라 타이피뮤리움 변이균주(기탁번호 KCTC13192BP).
도 2는 대식세포에 감염된 돌연변이 균주의 2시간 및 18시간 후의 생존 결과를 나타낸 도이다:
KST0004 WT: 야생형 살모넬라 타이피뮤리움 LT2;
KST0567(LT2ΔptsIcrr) : ptsI 및 crr 유전자가 결손된 살모넬라 타이피뮤리움 변이균주;
KST0594(LT2Δcrr) : crr 유전자가 결손된 살모넬라 타이피뮤리움 변이균주; 및
KST0572(LT2ΔptsI) : ptsI 유전자가 결손된 살모넬라 타이피뮤리움 변이균주.
도 3는 돌연변이 균주의 병원성 유전자 Salmonella Pathogenesis Island I(SPI-1) 및 Salmonella Pathogenesis Island 2(SPI-2)의 발현 변화를 나타낸 도이다:
KST0004 WT: 야생형 살모넬라 타이피뮤리움 LT2;
KST0567(LT2ΔptsIcrr) : ptsI 및 crr 유전자가 결손된 살모넬라 타이피뮤리움 변이균주;
KST0594(LT2Δcrr) : crr 유전자가 결손된 살모넬라 타이피뮤리움 변이균주; 및
KST0572(LT2ΔptsI) : ptsI 유전자가 결손된 살모넬라 타이피뮤리움 변이균주.
도 4는 돌연변이 균주의 구강투여를 통해 약독화를 확인한 도이다:
KST0004 WT: 야생형 살모넬라 타이피뮤리움 LT2;
KST0567(LT2ΔptsIcrr) : ptsI 및 crr 유전자가 결손된 살모넬라 타이피뮤리움 변이균주;
KST0594(LT2Δcrr) : crr 유전자가 결손된 살모넬라 타이피뮤리움 변이균주; 및
KST0572(LT2ΔptsI) : ptsI 유전자가 결손된 살모넬라 타이피뮤리움 변이균주.
도 5는 돌연변이 균주의 복강투여를 통해 약독화를 확인한 도이다:
KST0004 WT: 야생형 살모넬라 타이피뮤리움 LT2;
KST0567(LT2ΔptsIcrr) : ptsI 및 crr 유전자가 결손된 살모넬라 타이피뮤리움 변이균주;
KST0594(LT2Δcrr) : crr 유전자가 결손된 살모넬라 타이피뮤리움 변이균주; 및
KST0572(LT2ΔptsI) : ptsI 유전자가 결손된 살모넬라 타이피뮤리움 변이균주.
도 6은 돌연변이 균주 KST0567(LT2ΔptsIcrr)의 구강 투여를 통해 항체 형성을 확인한 도이다.
도 7은 돌연변이 균주 KST0567(LT2ΔptsIcrr)의 근육 투여를 통해 항체 형성을 확인한 도이다.
도 8은 돌연변이 균주 KST0567(LT2ΔptsI,crr)의 근육 투여 후, 구강 내로 살모넬라 타이피뮤리움으로 공격 감염시킨 뒤 돌연변이 균주 KST0567(LT2ΔptsIcrr)의 생존 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 ptsI(Phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase I) 및 crr(catabolite repression resistant component) 유전자가 결손된, 병원성이 약화된 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 균주를 제공한다.
상기 균주는 수탁번호 KCTC13192BP로 기탁된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 ptsI 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성되고, crr 유전자는 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 유전자의 "결손"은 유전자 중의 하나 이상의 염기가 제거되는 것으로, 해당 유전자가 코딩하는 단백질의 활성이 불활성화되거나, 해당 유전자가 코딩하는 단백질이 합성되지 않는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 함유하는 살모넬라 감염 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 식중독, 장티푸스, 복막염, 궤양성 대장염, 크론병, 장관 베체트병, 감염성 설사, 위장염, 염증성 장질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증, 장관 급이성 설사 및 허혈성 장염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 살모넬라 감염증 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 백신 조성물이 면역 반응을 일으킬 수 있는 숙주 동물은 인간, 닭, 오리, 꿩, 칠면조 등의 가금류, 돼지, 염소, 양, 소, 개, 고양이 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 백신은 약독화된 생독 백신 또는 사독 백신, 서브유닛 백신(subunit vaccine), 합성 백신(synthetic vaccine) 또는 유전공학 백신(genetic engineering vaccine)일 수 있으나, 효과적인 면역 반응을 유도하는 생독 백신이 바람직하다.
본 발명에서 사용된 용어 "생독 백신"이란 살아있는 균의 활성성분을 포함하는 백신을 의미한다. 또한 용어 "약독화된(attenuated)"이란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고 면역 체계만을 자극해서 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 균의 약독화는 자외선(UV) 조사, 약품처리 또는 시험관 내 고차 연속 계대배양에 의해 달성될 수 있다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듦으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 유전자 서열의 특정 결실 또는 균주의 게놈 내로의 서열의 삽입에 의해 달성될 수 있다.
용어 "사독 백신"이란 불활화 백신 또는 사균 백신이라고도 하며, 죽은 균을 포함한 백신이다. 용어 "서브유닛 백신"은 균의 구성성분 중 면역기능을 일으킬 수 있는 항원 성분만을 추출하여 제조한 백신으로, 균의 방어에 필요한 항원 부위에 대해서만 면역형성을 유도함으로써 부작용을 최소화할 수 있다. "유전공학 백신"은 균의 병원성을 일으키는 특이 유전자를 변형하거나 제거한 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 백신은 숙주동물에 발생하는 살모넬라 균 이외의 균에 의해 발생하는 질병을 예방하기 위하여 사용되는 다른 백신의 제조에 사용되는 불활화된 균체들 또는 항원들과 혼합하여 식중독을 포함한 다른 질병들을 함께 예방할 수 있는 혼합 또는 복합 백신으로 사용될 수 있다. 용어 "혼합 백신"이란 서로 다른 바이러스 백신을 함께 사용한 백신을 말한다.
또한, 본 발명의 백신 조성물을 추가적으로 용매, 면역증강제(adjuvant) 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수가 있으며, 면역증강제로는 프레운즈(Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔과 식물성 및 광물성 오일 등이 있으며, 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 기술자에게 잘 알려진 백신 제조에 사용되는 물질을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 서브바이랄 (subviral) 입자 보조제, 콜레라독소, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 드립 (drip) 또는 스프레이 등의 비강용 제형 그리고 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비강 내 투여를 위한 제제에 적합한 침투제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 적합한 제형물은 안정성과 순응도를 위해 바람직하게 무균, 등장 및 완충되도록 제형화된다. 비강 내 투여를 위한 제제는 또한 정상적인 섬모 작용을 유지시키기 위해 점액 분비를 여러 측면에서 자극하도록 제조되며, 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1990))에 기술된 바와 같이, 적합한 제형이 바람직하게 등장성의, pH 5.5 내지 6.5를 유지하는 약간 완충된 제형이며, 가장 바람직하게 항미생물 방부제 및 적합한 약물 안정화제를 포함한다.
상기 조성물은 근육, 피하, 복강, 정맥, 경구, 진피, 안구 및 뇌 내 경로로 이루어진 군 중 어느 하나 이상의 경로를 통해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사액제로 제조하며, 진피 내, 근육 내, 복막 내, 정맥 내, 비강 또는 경막 외(eidural) 경로로 투여할 수 있다.
상기 백신 조성물 내 균주는 104 내지 109 CFU로 포함될 수 있으며, 구체적으로 104 내지 106 CFU로 포함될 수 있다.
본 발명자들은 본 발명의 구체적인 실시예에서 제작한 변이균주 KST0594(LT2Δcrr), KST0572(LT2ΔptsI) 및 KST0567(LT2ΔptsIcrr)의 병원성 감소 여부를 확인하기 위해 세포 감염 실험을 수행한 결과, 야생형 균주(KST0004)를 감염시킨 대식세포에 비하여 돌연변이 균주 KST0594(LT2Δcrr), KST0572(LT2ΔptsI) 및 KST0567(LT2ΔptsIcrr)를 감염시킨 대식세포에서 살모넬라 감염 수가 감소한 것을 확인하였다(도 2 참조). 또한, 병원성 유전자인 Salmonella Pathogenesis Island I(SPI-1) 및 Salmonella Pathogenesis Island 2(SPI-2)의 발현 변화를 확인한 결과, KST0567(LT2ΔptsI,crr) 균주의 SPI-1 및 SPI-2의 발현은 야생형 균주에 비하여 현저하게 감소된 것을 확인하였다(도 3 참조).
본 발명의 실시예에서 제작한 KST0594(LT2Δcrr), KST0572(LT2ΔptsI) 및 KST0567(LT2ΔptsI,crr)의 백신으로써 사용 가능함을 확인하기 위해 약독화 여부를 확인하고자 마우스에 구강(oral) 또는 복강(IP)을 통해 접종한 후 마우스의 생존 비율을 측정하였고 그 결과, 구강을 통해 투여하였을 경우 KST0572(LT2ΔptsI) 및 KST0567(LT2ΔptsIcrr)을 투여한 마우스는 20일 후에도 모두 생존하는 것을 확인하였고(도 4 참조), 복강을 통하여 접종하였을 때 KST0567(ΔptsIcrr)은 96시간 후에도 모두 생존하는 것을 확인하였다(도 5 참조). 즉, KST0567(LT2ΔptsIcrr) 돌연변이 균주가 구강 백신 실험에서는 기존의 KST0572(LT2ΔptsI) 백신 균주와 차이가 없었으나, 복강 백신 실험의 경우에서 보다 높은 안전성을 가지고 있는 것이 확인되었다.
또한, 본 발명자들은 KST0567(LT2ΔptsIcrr)의 구강 및 근육 투여를 통해 살모넬라 특이 항체 형성을 확인한 결과, KST0567(LT2ΔptsIcrr) 백신 균주는 근육 주사하였을 때 구강 투여와 비교하여 10,000배 적은 농도의 생균 백신만으로도 동일한 항체 형성 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 6 및 도 7 참조).
또한, 본원발명의 백신 균주 KST0567(LT2ΔptsIcrr)는 상기와 같이 구강 투여와 비교하여 효율적으로 항체 형성을 유도하고 이 항체에 의하여 살모넬라 감염에 대한 보호면역 또한 활성화되는 것을 확인하였다(도 8 참조).
따라서, 본 발명의 수탁번호 KCTC13192BP로 기탁된 살모넬라 타이피뮤리움 돌연변이 균주 KST0567(LT2ΔptsIcrr)는 기존에 백신 균주로 알려진 살모넬라 타이피뮤리움 균주 KST0572(LT2ΔptsI) 보다 높은 안전성을 가지고 있고, 근육 주사하였을 때 구강 투여와 비교하여 10,000배 적은 농도의 생균 백신만으로도 동일한 항체 형성 효과를 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명의 수탁번호 KCTC13192BP로 기탁된 살모넬라 타이피뮤리움 돌연변이 균주 KST0567를 근육 주사용 생균 백신 조성물로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 함유하는 살모넬라 감염 예방용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명은 당해 기술 분야에 공지된 일반적인 사료 성분을 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 사료 조성물은 곡물 가루, 당질, 비타민, 아미노산, 단백질, 지질, 광물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 사료 조성물에는 곡물 및 곡물 부산물이 사용될 수 있는데, 예컨대 평지씨, 면실, 대두, 밀기울，미강，탈지강，맥강，옥수수겨，맥아근，대두피， 감자 전분，고구마 전분，옥수수 전분，커피박，잠사，잠분，해조분，타피오카，대두박，면실박，임자박，채종박，아마박，호마박, 옥수수글루텐，밀글루텐，낙화생박，야자박，해바라기씨박，주정박，옥수수배아박，고추씨박，장유박，맥주박 중에서 하나 또는 2종 이상이 혼합될 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 수용성 및 수불용성 모노사카라이드, 디사카라이드 및 폴리사카라이드와 같은 당 및 복합 탄수화물을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 당질로서 보다 상세하게는, 포도당, 만노오스, 프룩토오스, 백당, 맥아당, 셀로비오스, 젖당, 트레할로오스, 멜리비오스, 라피노오스, 에스크린, 살리신, 아미그달린, 만니톨, 솔비톨, 소르보스, 멘티토오스 등을 들 수 있으며, 당밀, 자당 뿐만 아니라 올리고당도 병용하여 이용할 수 있다.
본 발명의 사료 조성물에 포함될 수 있는 임의의 아미노산 성분에는 아르기닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린, 티로신, 알라닌, 아스파르트산, 글루탐산나트륨, 글리신, 프롤린, 세린, 시스테인, 및 이들의 동족체, 및 이들의 염이 있다.
또한, 본 발명의 사료 조성물에 임의로 첨가할 수 있는 비타민에는 티아민· HCl, 리보플라빈, 피리독신·HCl, 니아신, 니아신아미드, 이노시톨, 염화콜린, 판토텐산칼슘, 바이오틴, 폴산, 아스코르브산, 및 비타민 A, B, K, D 및 E 등이 있다. 이 중, 특히 비타민 A, 비타민 B군 및 비타민 E는 항산화 물질로도 사용될 수 있다.
본 발명의 사료 조성물에 포함될 수 있는 지방산은, 예를 들어, 대두유, 평지씨유, 옥수수유, 홍화유, 해바라기유, 라이스유, 비프스테이크 식물유, 달맞이꽃유, 유리지치유, 아마인유 등의 식물유, 및 가다랭이, 고등어, 정어리 등의 어유 및 각종 미생물 유래의 트리글리세라이드 등의 유지를 가수 분해 처리함으로써 획 득할 수 있다. 그리고, 상기에서 얻어지는 지방산의 금속염으로서 지방산의 칼슘염 및 마그네슘염 또한 포함될 수 있다.
본 발명의 사료 조성물에는 사장석, 벤토나이트, 맥반석 등 공지의 바이오세라믹 물질이 소량 첨가되어 항균 기능 등을 배가시킬 수 있다.
아울러, 본 발명은
1) 벡터 내 항생제 서열의 일부를 포함하는, ptsI(Phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase I) 및 crr(catabolite repression resistant component) 유전자 서열의 일부를 각각 증폭시키는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 증폭된 산물을 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 형질전환시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 형질전환시킨 살모넬라 타이피뮤리움 균주에서 항생제 서열을 제거하는 단계; 및
4) ptsI 및 crr 유전자가 모두 결손된 균주를 선별하는 단계;
를 포함하는 병원성이 약화된 살모넬라 타이피뮤리움 균주 제조 방법을 제공한다.
상기 ptsI 및 crr 유전자의 일부를 결손시키기 위하여 서열번호 3 및 4의 프라이머를 사용하여 중합연쇄반응을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 1)의 벡터는 pKD13일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 수탁번호 KCTC13192BP로 기탁된 살모넬라 타이피뮤리움 돌연변이 균주 KST0567(LT2ΔptsIcrr)는 기존에 백신 균주로 알려진 살모넬라 타이피뮤리움 균주 KST0572(LT2ΔptsI) 보다 높은 안전성을 가지고 있고, 근육 주사하였을 때 구강 투여와 비교하여 10,000배 적은 농도의 생균 백신만으로도 동일한 항체 형성 효과를 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명의 수탁번호 KCTC13192BP로 기탁된 살모넬라 타이피뮤리움 돌연변이 균주 KST0567를 근육 주사용 생균 백신 조성물, 살모넬라 타이피뮤리움 감염 예방용 사료 조성물, 또는 식중독 예방 또는 치료용 백신 조성물로 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해서 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
약독화 살모넬라 타이피뮤리움 ( Salmonella typhimurium ) 변이균주의 제작
<1-1> ptsI 및 crr 유전자가 결손된 변이균주의 제작
ptsI 및 crr 유전자가 결실된 살모넬라 타이피뮤리움 변이균주를 제작하기 위하여, 야생형 살모넬라 타이피뮤리움 LT2 균주(출처: ATCC 700720D-5)를 사용하였다. 상기 박테리아를 배양하기 위해 사용된 영양 배지는 저염 LB(Bacto-trypton 10 g/L, Bacto-yeast extract 5 g/L, NaCl 5 g/L)로 박테리아는 LB에서 37℃, 180 rpm의 조건으로 배양하였다.
ptsI 및 crr 유전자를 결실시키기 위하여 pKD13의 항생제(kanamycin) 부분을 증폭할 수 있는 20개의 뉴클레오타이드(20 nt)와 살모넬라의 ptsI 혹은 crr에 상동하는 40개의 뉴클레오타이드(40 nt)을 포함한 60개의 뉴클레오타이드의 프라이머 2개(표 1의 3166 및 5166; 서열번호 3 및 서열번호 4)를 합성 후 이를 이용하여 pKD13에서 FRT 시퀀싱이 앞뒤로 포함된 kanamycin 유전자를 표 2 조건으로 PCR 하였다. 증폭된 PCR 산물을 PCR-ΔptsIcrr로 명명하였다.
PCR 산물인 PCR-ΔptsIcrr을 정제하고 레드헬퍼프라스미드(pKD46)을 포함하고 있는 살모넬라 타이피뮤리움 LT2에 전기천공법으로 형질 전환시켜 kanamycin 저항성을 획득한 ptsI 및 crr 결손 변이 균주를 얻었다. 획득한 ptsI 및 crr 결손 변이 균주에서 kanamycin 유전자를 제거하기 위하여 FLP recombinase를 발현하는 pCP20 벡터를 ptsI 및 crr 결손 변이 균주에 각각 형질전환하여 kanamycin 유전자를 제거하여 최종적으로 ptsI 및 crr 유전자를 제거한 KST0567 균주를 제작하였고, 상기 균주를 수탁기관에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC13192BP).
<1-2> ptsI 유전자가 결손된 변이균주의 제작
본 발명자들은 상기와 같은 방법으로 ptsI 유전자 결손형 살모넬라 타이피뮤리움 균주를 제작하였다.
구체적으로, ptsI 유전자를 결실시키기 위하여 프라이머 2개(표 1의 3166 및 5155; 서열번호 3 및 서열번호 5)를 이용하여 PCR 하였으며, kanamycin 유전자를 제거하여 최종적으로 ptsI 유전자를 제거한 KST0572 균주를 제작하였다.
<1-3> crr 유전자가 결손된 변이균주의 제작
본 발명자들은 상기와 같은 방법으로 crr 유전자 결손형 살모넬라 타이피뮤리움 균주를 제작하였다.
구체적으로, crr 유전자를 결실시키기 위하여 프라이머 2개(표 1의 3166 및 3155; 서열번호 3 및 서열번호 6)를 이용하여 PCR 하였으며, kanamycin 유전자를 제거하여 최종적으로 crr 유전자를 제거한 KST0572 균주를 제작하였다.
유전자 결손 균주 제작을 위한 PCR에 사용한 프라이머
프라이머 이름 서열 서열번호
3166 GCT AGA CTT TAG TTC CAC AAC ACT AAA CCT ATA AGT TGG GGA AAT ACA CAT ATG AAT ATC CTC CTT A 서열번호 3
5166 AAT CAG TTC TTT GAT TTC ATC CAT GTT GGA GAT AAC AAC CGG AGT CAG GGT GTA GGC TGG AGC TGC TTC 서열번호 4
5155 AGT TCA GTA CGG ACG GTG ACA TTG GCT GGT AAA GGT GGT GTA GGC TGG AGC TGC TTC 서열번호 5
3155 ATC CAC GAG ATG CGG CCC AAT TTA CTG CTT AGG AGA AGA TCA CAT ATG AAT ATC CTC CTT A 서열번호 6
PCR 반응 조건
94℃ 5 분
94℃ 0.5 분 30 사이클
56.2℃ 0.5 분
72℃ 0.5 분
72℃ 10 분
< 실험예 1> 살모넬라 타이피뮤리움 백신 균주, KST0594 ( LT2Δ crr ), KST0572 ( LT2Δ ptsI ) 및 KST0567(LT2Δ ptsIcrr) 의 약독화 확인
<1-1> 인 비트로( in vitro ) 상에서 백신 균주의 약독화 확인
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제작한 변이균주 KST0594(LT2Δcrr), KST0572(LT2ΔptsI) 및 KST0567(LT2ΔptsI,crr)의 병원성 감소 여부를 확인하기 위해 세포 감염 실험을 수행하였다.
구체적으로, 마우스 대식세포에 변이 균주 KST0594(LT2Δcrr), KST0572(LT2ΔptsI) 및 KST0567(LT2ΔptsIcrr) 그리고 야생형 균주 살모넬라 타이피뮤리움 LT2를 103 CFU의 동일한 양으로 감염시킨 뒤 2시간 및 18시간 후 각각 감염된 살모넬라의 수를 측정하였다. 마우스 대식세포인 Raw264.7을 48 well-plate에 5x105 cells/ml의 농도로 300 ㎕ DMEM 배지와 함께 부착시킨 후 항생제를 첨가하지 않은 배양액으로 교체해준다. 변이 균주 KST0584(LT2Δcrr), KST0572(LT2ΔptsI) 및 KST0567(LT2ΔptsIcrr) 그리고 야생형 균주 살모넬라 타이피뮤리움 LT2를 103 CFU으로 감염시킨다. 37℃에서 1시간 배양 후, 인산염완충액을 이용하여 Raw264.7에 부착하지 않은 살모넬라를 제거하고 나서 대식세포벽에 부착한 살모넬라를 제거하기 위하여 10 ug/ml의 농도로 gentamycin을 1시간 동안 처리한다. 300 ㎕의 DMEM 배지를 첨가한 후 2시간 후에 감염된 살모넬라의 수를 측정하였으며, 추가적으로 16시간을 배양한 후에 세포내에서 증식한 살모넬라의 수를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 야생형(KST0004) 균주를 감염시킨 대식세포에 비하여 돌연변이 균주 KST0594(LT2Δcrr), KST0572(LT2ΔptsI) 및 KST0567(LT2ΔptsIcrr)를 감염시킨 대식세포에서 살모넬라 감염 수가 감소한 것을 확인하였다(도 2의 A). 또한, 형광형미경을 통하여 확인한 결과에서도 돌연변이 균주를 감염시킨 마우스 대식세포에서 감염된 살모넬라의 비율이 감소됨을 확인하였다(도 2의 B).
<1-2> 병원성 유전자의 발현 확인
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제작한 변이균주 KST0594(LT2Δcrr), KST0572(LT2ΔptsI) 및 KST0567(LT2ΔptsIcrr)의 병원성 감소 여부를 확인하기 위해, 당 대사 돌연변이 균주의 감염능력 감소가 감염에 중요한 병원성 유전자인 Salmonella Pathogenesis Island I(SPI-1) 및 Salmonella Pathogenesis Island 2(SPI-2)의 발현의 변화 때문인지 확인하고자 SPI-1 및 SPI-2의 발현 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 KST0567(LT2ΔptsI,crr) 균주의 SPI-1(A)과 SPI-2(B) 발현은 야생형(KST0004), 그리고 변이균주 ST0594(LT2Δcrr) 및 KST0572(LT2ΔptsI)에 비하여 현저하게 감소된 것을 확인하였다(도 3).
<1-3> 인 비보( in vivo ) 상에서 백신 균주의 약독화 확인
상기 실시예 1에서 제작한 KST0594(LT2Δcrr), KST0572(LT2ΔptsI) 및 KST0567(LT2ΔptsIcrr)의 백신으로써 사용 가능함을 확인하기 위해 약독화 여부를 확인하고자 마우스에 구강(oral) 또는 복강(IP)을 통해 접종한 후 마우스의 생존 비율을 측정하였다.
구체적으로, 야생형 살모넬라 타이피뮤리움 LT2 균주(KST0004), KST0594(LT2Δcrr), KST0572(LT2ΔptsI) 또는 KST0567(LT2ΔptsIcrr) 백신 균주를 배양하여 PBS에 현탁한 후 BALB/c 마우스에 구강을 통하여 109 CFU (colony forming unit; 박테리아 숫자)의 균주를 투여한 후, 마우스의 생존 여부를 관찰하였다. 또한, 복강을 통해 106 CFU의 균주를 투여한 후 마우스의 생존 여부를 관찰하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 구강을 통해 투여하였을 경우 약 10일 후 KST0594(LT2Δcrr) 및 야생형(KST0004)을 투여하였을 때 모든 마우스가 사망하여 KST0594(LT2Δcrr)의 병원성은 야생형과 큰 차이가 없었으나, KST0572(LT2ΔptsI) 및 KST0567(LT2ΔptsIcrr)을 투여한 마우스는 20일 후에도 모두 생존하는 것을 확인하였다(도 4의 A). 구강으로 감염 후 2일 뒤에 장내 살모넬라 수를 측정하였을 경우, 야생형에 비하여 돌연변이 균주 세 가지 모두 감소하는 것을 확인하였고, 특히 KST0567(LT2ΔptsIcrr)의 투여 시 가장 적은 양의 살모넬라가 장내에서 발견되었다(도 4의 B).
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이 복강을 통하여 접종하였을 때는 LT2 야생형(KST0004)은 36시간 후에 모두 사망하였고, KST0594(LT2Δcrr) 또한 야생형과 큰 차이가 없었으며, KST0572(LT2ΔptsI)은 병원성이 감소하기는 하였으나 80시간 이후 마우스 모두 사망하였다. 그러나 KST0567(LT2ΔptsIcrr)은 96시간 후에도 모두 생존하였으며, 2주일 동안 관찰하였을 경우에도 모두 생존하는 것을 확인하였다(도 5).
이 결과를 통해 KST0567(LT2ΔptsIcrr) 돌연변이 균주가 야생형에 비하여 약독화 되었으며, 구강 백신 실험에서는 기존의 KST0572(LT2ΔptsI) 백신 균주와 차이가 없었으나, 복강 백신 실험의 경우에서 KST0567(LT2ΔptsIcrr) 돌연변이 균주가 KST0572(LT2ΔptsI) 보다 높은 안전성을 가지고 있는 것이 확인되었다.
< 실험예 2> 살모넬라 타이피뮤리움 백신 균주를 이용한 항체 형성 확인
<2-1> KST0567 ( LT2Δ ptsIcrr ) 백신 균주의 구강 투여를 통한 살모넬라 특이 항체 형성 확인
상기 실시예 1에서 제작한 ptsI 및 crr 유전자 돌연변이 균주 KST0567(LT2ΔptsIcrr)의 구강 투여를 통해 살모넬라 특이 항체 형성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 같이 KST0567(LT2ΔptsIcrr) 백신 균주를 배양하여 PBS에 현탁한 후 BALB/c 마우스에 108 CFU 의 농도의 복강 투여로 1 내지 3회 구강투여하고, 7일 후 혈청을 분리하여 살모넬라에 반응하는 total Ig, IgG, IgM, IgA 항체의 역가를 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 1회 백신을 투여한 후 한 후 7일 후(14일 째)와 2회 백신을 투여한 후 7일 후(28일 째)에는 모든 항체의 역가가 백신을 투여하지 않은 그룹과 큰 차이가 없었으나, 3회 백신을 투여한 후 7일 후(42일 째)에는 백신을 투여하지 않은 그룹의 모든 항체 역가가 10 ~ 250 이하인 것에 비해 백신을 투여한 그룹은 모든 항체의 역가가 80 ~ 1000 이상으로 높은 역가를 나타내었다(도 6).
<2-2> KST0567 ( LT2Δ ptsIcrr ) 백신 균주의 근육 투여를 통한 살모넬라 특이 항체 형성 확인
상기 실시예 1에서 제작한 ptsI 및 crr 유전자 돌연변이 균주 KST0567(LT2ΔptsIcrr)의 백신으로써 근육 투여 사용이 우수함을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 돌연변이 균주 KST0567(LT2ΔptsIcrr)를 배양하여 PBS에 현탁한 후 마우스 BALB/c 5마리에 105 CFU 의 농도로 1 내지 3회 근육 주사로 투여하고 7일 후 혈청을 분리하여 살모넬라에 반응하는 total Ig, IgG, IgM, IgA 항체의 역가를 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 백신을 처리하지 않은 마우스의 경우는 모든 항체 역가가 200 이하로 매우 낮게 나타났다. KST0567(LT2ΔptsIcrr) 백신 균주를 근육으로 1회 면역시켰을 경우에는 모든 항체 역가가 400 ∼ 1400 이상으로 확인되었다(도 7).
따라서, 본 발명의 KST0567(LT2ΔptsIcrr) 백신 균주는 근육 주사하였을 때 구강 투여와 비교하여 10,000배 적은 농도의 생균 백신만으로도 동일한 항체 형성 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
< 실험예 3> 살모넬라 감염 보호 면역 확인
본 발명자들은 상기 실험예 <2-2>에서와 같이 KST0567(LT2ΔptsIcrr) 백신 균주를 배양하여 PBS에 현탁한 후 마우스 BALB/c 5마리에 105 CFU 의 농도로 3회 근육 주사로 투여하고 7일 후 야생형 살모넬라 LT2을 107 CFU로 복강을 통하여 투여(공격 감염)한 후 생존률을 측정하였다.
그 결과, 도 8에서와 같이 백신을 투여하지 않은 그룹은 5일 내에 모두 사망하였으나, 백신을 투여한 그룹은 21일 후에도 모두 생존하였다.
따라서, 본원발명의 수탁번호 KCTC13192BP로 기탁한 백신 균주 KST0567(LT2ΔptsIcrr)는 실험예 <2-2>와 같이 구강 투여와 비교하여 효율적으로 항체 형성을 유도하고 이 항체에 의하여 살모넬라 감염에 대한 보호면역 또한 활성화되는 것을 확인하였다.
한국생명공학연구원 KCTC13192BP 20170202
<110> Korea Atomic Energy Research Institute <120> pts I and crr mutated and attenuated Salmonella typhimurium and a composition for vaccine using the same <130> 2016P-10-004 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1728 <212> DNA <213> Salmonella typhimurium <400> 1 atgatttcag gcattttagc atccccgggt atcgctttcg gcaaagcact gctgctgaaa 60 gaagacgaaa tcgtcattga ccggaaaaaa atttctgccg acaaggttga tcaggaagtt 120 gaacgttttc tgagcggtcg tgccaaggca tctgcgcaac tggaagcgat caagacaaaa 180 gctggtgaaa cgttcggtga agaaaaagaa gccatctttg aagggcatat tatgctgctc 240 gaagatgagg agctggagca ggaaatcata gccctgatta aagataagca catgacggct 300 gacgcagccg cacatgaagt tatcgaaggt caggccactg ccctggaaga actggatgac 360 gaatacctga aagagcgtgc ggctgacgta cgtgatattg gtaagcgcct gctgcgcaac 420 atcctgggtc tggccattat cgatctgagc gcgattcagg aagaagttat cctggttgcc 480 gctgacctga cgccgtcaga aaccgcgcag ctgaacctgc agaaagtgct gggcttcatc 540 accgacgcgg gcggacgcac gtctcatacc tccatcatgg cgcgttctct ggaactgccg 600 gcgatcgtag gtaccggtag cgtcaccgct caggtgaaaa acggcgatta tctgattctg 660 gatgccgtaa acaaccaggt ttacgtcaac ccgaccaacg atgttattga gcaactgcgc 720 gccgtccagg agcaggttgc gaccgagaaa gcggaactgg ctaaactgaa agatctgccg 780 gcaatcacgc tggatggaca tcaggttgaa gtttgcgcca acatcggtac cgttcgtgac 840 gttgaaggcg ctgagcgcaa cggcgcggaa ggcgttggtc tgtatcgtac tgaattcctg 900 ttcatggatc gcgacgcgct gccgacggaa gaagagcagt ttgccgccta taaagcggtc 960 gctgaagcgt gcggctcgca ggcggttatc gtccgtacca tggacattgg cggcgacaaa 1020 gagctgccgt acatgaactt cccgaaagaa gagaacccgt tcctgggctg gcgcgccgtg 1080 cgtatcgcca tggatcgcaa agagatcctg cgtgaccagg ttcgcgcgat tctgcgtgcc 1140 tccgctttcg gtaaattgcg cattatgttc ccgatgatca tctctgttga agaagttcgc 1200 gcgctgcgca aagagattga aatctacaaa caggaactgc gtgacgaagg taaagcattt 1260 gacgaaagca ttgagattgg cgtgatggtg gaaacaccgg ctgcggcgac aattgcgcgt 1320 catttagcca aagaagttga tttctttagt atcggcacca atgatttaac gcagtacacc 1380 ctggcagttg accgtggtaa tgatatgatt tcacaccttt accagccaat gtcaccgtcc 1440 gtactgaact tgatcaagca agttattgat gcttctcatg cagaaggtaa atggactggc 1500 atgtgtggtg agcttgcagg cgacgaacgt gctacacttc tgttgctggg gatgggtctg 1560 gacgaattct ctatgagcgc catttctatc ccgcgcatta agaagattat ccgtaacacg 1620 aacttcgaag atgcgaaggt gttagcagag caggctcttg ctcaaccgac aacggacgag 1680 ttaatgacgc tggttaacaa gttcattgaa gaaaaaacaa tctgctaa 1728 <210> 2 <211> 510 <212> DNA <213> Salmonella typhimurium <400> 2 atgggtttgt tcgataaact aaaatctctg gtttctgatg ataagaaaga caccggaact 60 attgagattg ttgccccgct ctctggcgag atcgtcaaca tcgaagacgt gccggatgta 120 gtttttgctg aaaaaatcgt tggtgatggc atcgctatca aaccaaccgg taacaaaatg 180 gtcgcccctg ttgacggtac catcggcaaa atctttgaaa ccaaccatgc gttctctatc 240 gaatccgata gcggcattga gctgttcgtt cacttcggta tcgacaccgt tgagctgaaa 300 ggcgaaggct tcaagcgtat tgctgaagaa ggtcagcgcg tgaaagttgg cgatccggtc 360 atcgagttcg atctgccgtt gctggaagaa aaagccaagt ctaccctgac tccggttgtt 420 atctccaaca tggatgaaat caaagaactg atcaaactgt ccggtagcgt gaccgtgggt 480 gaaactccgg ttatccgcat taagaagtaa 510 <210> 3 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3166 <400> 3 gctagacttt agttccacaa cactaaacct ataagttggg gaaatacaca tatgaatatc 60 ctcctta 67 <210> 4 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5166 <400> 4 aatcagttct ttgatttcat ccatgttgga gataacaacc ggagtcaggg tgtaggctgg 60 agctgcttc 69 <210> 5 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5155 <400> 5 agttcagtac ggacggtgac attggctggt aaaggtggtg taggctggag ctgcttc 57 <210> 6 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3155 <400> 6 atccacgaga tgcggcccaa tttactgctt aggagaagat cacatatgaa tatcctcctt 60 a 61

Claims (12)

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  5. ptsI(Phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase I) 및 crr(catabolite repression resistant component) 유전자가 결손된, 병원성이 약화된 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 균주(KCTC13192BP)를 유효성분으로 함유하는 살모넬라 감염 예방용 백신 조성물.
  6. ptsI(Phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase I) 및 crr(catabolite repression resistant component) 유전자가 결손된, 병원성이 약화된 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 균주(KCTC13192BP) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 유효성분으로 함유하는 식중독, 장티푸스, 복막염, 궤양성 대장염, 크론병, 장관 베체트병, 감염성 설사, 위장염, 염증성 장질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증, 장관 급이성 설사 및 허혈성 장염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 살모넬라 감염증 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 조성물은 근육, 피하, 복강, 정맥, 경구, 진피, 안구 및 뇌 내 경로로 이루어진 군 중 어느 하나 이상의 경로를 통해 투여될 수 있는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  8. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 균주는 104 내지 109 CFU로 포함되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  9. ptsI(Phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase I) 및 crr(catabolite repression resistant component) 유전자가 결손된, 병원성이 약화된 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 균주(KCTC13192BP)를 유효성분으로 함유하는 살모넬라 감염 예방용 사료 조성물.
  10. 1) 벡터 내 항생제 서열의 일부를 포함하는, ptsI(Phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase I) 및 crr(catabolite repression resistant component) 유전자 서열의 일부를 각각 증폭시키는 단계;
    2) 상기 단계 1)에서 증폭된 산물을 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)에 형질전환시키는 단계;
    3) 상기 단계 2)의 형질전환시킨 살모넬라 타이피뮤리움 균주에서 항생제 서열을 제거하는 단계; 및
    4) ptsI 및 crr 유전자가 모두 결손된 균주를 선별하는 단계;
    를 포함하는 병원성이 약화된 살모넬라 타이피뮤리움 균주 제조 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 ptsI 및 crr 유전자의 일부를 결손시키기 위하여 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 사용하여 중합연쇄반응(PCR) 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 단계 1)의 벡터는 pKD13인 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020170116488A 2017-09-12 2017-09-12 ptsI 및 crr 유전자 결손된 약독화 살모넬라 타이피뮤리움 균주 및 상기 균주를 이용한 생균 백신 조성물 KR101950931B1 (ko)

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