KR20080110594A - 약독화 살모넬라 생백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수의학적 종을 감염시키는 박테리아의 약독화 guaB 유전자 돌연변이체, 특히 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 및 이의 이용 및 생산에 관계한다. 본 발명은 박테리아 감염을 예방하고, 특히 수의학적 종, 바람직하게는 가금류에서 살모넬라증을 예방하기 위해 이와 같은 돌연변이에 기초한 약독화 생백신에 관계한다.

Description

약독화 살모넬라 생백신{LIVE ATTENUATED SALMONELLA VACCINE}

본 발명은 약독화 박테리아 돌연변이체(attenuated bacterial mutants), 특히 약독화 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 돌연변이체, 및 이를 포함하는 약독화 생백신에 관계한다.

살모넬라는 장내박테리아과(Enterobacteriaceae)에 속하는 그램 음성, 조건적 혐기성(facultative anaerobic), 운동성, 락토즈 비발효 막대 박테리아이다. 살모넬라균은 통상적으로 오염된 식품을 섭취로 인하여 인간에 감염되어 살모넬라증(Salmonellosis)을 일으킨다.

소, 닭, 칠면조, 양, 돼지, 개, 고양이, 말, 나귀, 물개, 도마뱀을 포함하는 많은 동물 종으로부터 살모넬라균을 분리하였다.

중요한 살모넬라 병인균의 95% 는 살모넬라 엔테리카이며, 가장 흔한 혈청형이 S. 엔테리카 혈청형(serovar) 티피무리움(S. Typhimurium), S. 엔테리카 혈청형 엔테리티디스 (S. Enteritidis)이다.

살모넬라 감염은 전세계적으로 심각한 의료 및 수의학적 문제가 되며, 식품업계에 항상 고민거리가 된다. 오염된 음식에서 바로 확인되지 않을 수 있다.

치명적인 인체 감염을 피하고, 낙농업계에 심각한 경제적 손실을 피하기 위 해 동물의 살모넬라증을 관리하는 것이 중요하다.

자연계에 살모넬라균의 편재는 감염된 동물의 확인 및 도살만으로 질병 제어를 힘들게 한다.

경쟁적인 배제 및 백신주사에 근거한 몇가지 통제 전략으로 가금류(poultry)의 감염 통제를 테스트하였다.

농장 동물에 백신주사는 살모넬라균에 의한 동물원성 감염증을 예방하는 가장 효과적인 방법으로 흔히 간주된다.

완전하게 죽은 세포 백신과 서브유닛 백신으로 동물 및 사람에서 살모넬라 감염의 예방에 이용하면 다양한 결과를 얻는다. 전반적으로 비활성화된 백신으로는 살모넬라 증으로부터 보호를 할 수 없다.

약독화 살모넬라 생백신은 다음과 같은 이유로 비활성화된 백신 조성물보다 우수하다:

(i) 항체 반응에 추가하여 세포-매개된 면역원성을 유도하는 능력;

(ii) 주사기 감염의 위험없이 경구 투여;

(iii) 단일 약량 투여후에도 효과;

(iv) 다중 점막 부위에 면역 반응 유도;

(v) 낮은 생산 단가; 그리고

(vi) 면역계에 재조합 항원의 운반을 위한 캐리어로써의 가능한 용도.

약독화 돌연변이 균주(attenuated mutant strains)를 이용한 경우에 항상 양호한 결과가 나오는 것이 아니기 때문에 실제 시장에서 약독화 살모넬라 생백신이 거의 이용되지 않는다.

예를 들면, aro- 또는 cAMP 돌연변이체로 가금류에 백신 주사하였지만, 백신 주사후 많은 닭이 바로 죽었다. 살모넬라균에 의한 감염이 매우 초기에 발생하기 때문에, 매우 어린 병아리에 백신주사를 놓는 것이 어렵다. 그러나 병아리는 면역계의 미숙으로 인하여 살모넬라균에 매우 민감하다. 백신주사를 맞은 병아리에 보호가 미약한 점에 추가하여, 백신 균주가 장시간 배출되는 것도 가끔 관찰된다.

cya 및 crp 유전자에 결손(deletion)들이 있는 Megan^® Vacl 균주로 조류를 백신주사하면(US Patents 5,389,368; US 5,855,879; US 5,855,880) 도전 후에 유독성 살모넬라 도전 균주가 분리되는 조류의 수가 감소되었다. 그러나, 완전하게 보호되지는 못하였다(http://www.meganhealth.com/meganvac. html).

약독화 살모넬라 개량된 생백신, 일반적으로 동물 종을 감염시키는 박테리아의 약독화 살모넬라 개량된 생백신의 필요성은 여전히 존재한다.

살모넬라 및 다른 균주의 발병력에 guaB 돌연변이 영향에 대한 문헌 정보가 빈약하다.

McFarland and Stocker(1987, Microbial pathogenesis 3: 129-141)은 BALB/c 생쥐에서 S. 티피무리움(Salmonella Typhimurium) 및 S. 두블린(S. dublin)의 guaA 및 guaB Tn1O 삽입 돌연변이체의 발병력 감소에 대해 보고하였다. 높은 약량(S. 티피무리움(Salmonella Typhimurium)의 경우 2.5xlO⁷ cfu; S. 두블린의 경우 lO⁴ cfu)에서, 이들 두 저자는 영양요구(auxotrophic) 균주의 번식으로 인하여 치사 률이 상당히 높다고 보고하였다.

Wang et al.,(2001, Infection and Immunity 69 : 4734-4741)은 사람에서 장티푸스에 대항한 백신으로 전임상 시도에 대한 보고를 하였다. Wang 등의 백신은 △g ua BA 돌연변이로 구성된다. 그러나, 이와 같은 약독화 균주는 생쥐에서는 여전히 상당한 잔류 발병률을 보였다.

국제 특허 출원 WO 99/58146 및 US Patent 6,190,669에서는 △guaBA 돌연변이를 가지는 살모넬라 티피 백신에 대해 설명하고 있는데, 이는 외부 항원을 운반하는 생(live) 벡터로 이용된다.

본 발명의 목적은 약독화 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 살모넬라증에 대항하는 약독화 살모넬라 생백신 및 이에 근거한 예방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 라이브 벡터 및 외부 항원을 발현시키는 DNA 중개된 백신으로 유용한 약독화 살아있는 균주를 제공하는 것이다. 이와 같은 균주들은 다가 백신을 포함한 백신 개발에 매우 적합하다.

본 발명의 또 다른 목적은 약독화 생백신으로 이용할 수 있는 S. 엔테리카(S. enterica)를 얻는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 박테리아 감염되는 동물 특히 가금류에 약독화 균주를 만드는 방법 및 이 물질을 제공하는 것이다.

일반적인 목적은 식품 안정성 및 동물의 건강을 개선시키는 것이다.

발명의 요약

본 발명의 첫째 측면은 약독화 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 균주 돌연변이에 관계하는데, 이 돌연변이는 de novo 구아닌 뉴클레오티드를 만들 수 없고, 이 돌연변이에 guaB 유전자에 결손 돌연변이가 있다.

S. 엔테리카(S, enterica)에 대해 여기에서 설명한 원리는 매개물로서 구아닌 뉴클레오티드를 이용할 수 있는 임의의 유기체에 적용될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 한 면은 guaB 유전자에 결손 돌연변이를 함유하는 박테리아 감염 수의학 종들의 약독화 돌연변이 균주에 관한 것이다. 본 명세서에서 "박테리아 감염 수의종"(bacterium infecting veterinary species)이란 동물에 병인성인 박테리아를 말하고, guaB 유전자에 결손 돌연변이에 의해 감소될 수 있는 것을 말한다. 동물을 감염시키는 박테리아는 그램 음성이 될 수도 있다. 가금류에 선호적인 그램 음성 박테리아는 살모넬라 (Salmonella), 파스테우렐라(Pasteurella), 대장균(Escherichia coli)등이다. 살모넬라 엔테리카 및 병인성 대장균이 가장 선호적이다. 병인성("pathogenic to")은 약독화되지 않았다면 동물에서 감염성 질환을 일으킬 수 있다는 의미이다.

본 발명의 돌연변이체는 기능을 하는 GuaB 유전자 산물을 발현시키지 못한다. 환언하면, guaB 유전자 기능이 손상되어, 영양요구성 약독화 균주가 얻어진다.

guaB 유전자에 결손 돌연변이를 가지는 본 발명의 돌연변이 균주는 0.3mM 구아닌, 산틴, 구아노신 또는 산토신이 보충되지 않은 Minimal A 배지에서는 생장할 수 없다.

본 발명은 특히 약독화 살모넬라 엔테리티디스 (S. Enteritidis) 및 살모넬라 티피무리움(S. Typhimurium) 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

guaB 유전자에 결손 돌연변이를 모균주 S. 엔테리티디스 파아지 타입 4 76Sa88 또는 모균주 살모넬라 티피모리움(S. Typhimurium ) 1491S96으로 도입시킨다.

본 발명에 따라 수득된 약독화 S. 엔테리카 균주는 살모넬라 엔테리티디스 (S. Enteritidis) SM69(기탁번호 LMG P-21641)이다. 다른 예로는 살모넬라 티피모리움(S. Typhimurium)(기탁번호 LMG P-21646)이다.

본 발명의 약독화 돌연변이 균주는 다가(polyvalent 또는 multivalent) 백신을 포함한 약독화 생백신으로 이용하는데 매우 적합하다. 본 발명의 약독화 돌연변이 균주는 외부 항원을 인코드하고 발현시켜, 생벡터로 및/또는 DNA-매개된 백신으로 이용할 수 있다.

본 발명의 두 번째 측면은 박테리아 감염(예를 들어, 살모넬라균에 의한 살모넬라증)에 대해 수의학적 종을 면역화시키기 위해 다음으로 구성된 약학 조성물 또는 백신에 관계한다:

- 본 발명에 따른 돌연변이 균주의 약리학적 효과적인 또는 면역화량; 이때 돌연변이는 guaB 유전자에 결손 돌연변이로 인하여 구아닌 뉴클레오티드를 de novo에서 만들 수 없으며; 및

-약리학적으로 수용가능한 캐리어 또는 희석제.

바람직한 조성물은 본 발명에 따른 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 돌연변이 균주로 구성된 것들이다.

본 발명의 약독화 균주는 진핵 세포로 외부 항원을 인코드하는 DNA를 운반할 수 있다. 이와 같은 외부 항원은 본 발명의 약독화 돌연변이 균주로 구성된 플라스미드에 의해 인코드되고 발현될 수 있다.

일반적으로, 약 lO² cfu 내지 lO¹⁰ cfu, 바람직하게는 약 lO⁵ cfu 내지 lO¹⁰ cfu을 투여(예를 들어, 약리학적으로 효과적인 또는 면역량)한다. 면역화량은 투여 경로에 따라 달라진다. 당업자는 장관외로 투여되는 백신의 효과량이 음용수 등을 통하여 투여되는 유사 백신의 양보다 작다는 것을 알 수 있을 것이다.

본 발명의 약독화 균주 및 이를 포함하는 조성물 또는 백신이 박테리아 감염(가령, 살모넬라증) 및 다른 가망 질환(다가 백신의 경우)에 대해 동물 또는 수의학 종을 면역화시키는데 매우 적합하다.

본 발명의 추가 특징은 동물, 특히 수의학적 종, 좀더 바람직하게는 박테리아에 의한 감염(예컨데, 살모넬라균에 의한 살모넬라증)에 대해 닭과 같은 가금류를 면역화시키는 방법에 관계하며, 이 방법은 이를 필요로 하는 동물 또는 수의학적 종에 본 발명의 약독화 돌연변이 균주 및/또는 이를 포함하는 백신의 효과량을 투여하여 동물 또는 수의학적 종에서 면역 반응을 유도하는 것으로 구성된다.

살모넬라증에 대해 면역화되는 수의학적 종을 예로 들면, 가금류, 작은 또는 무거운 가축, 닭, 칠면조, 오리, 메추라기, 뿔닭, 돼지, 양, 어린 송아지, 소 등이 된다.

일반적으로 동물에 바람직한 약량이 구강, 비강 또는 장관외 경로를 통하여 투여된다.

본 발명의 마지막 특징은 약물(예컨데, 백신으로 사용)로 이용할 수 있는 본 발명의 돌연변이 균주에 관계한다. 본 발명의 다른 측면은 살모넬라증과 같은 병인균(감염성 박테리아)에 의한 질병의 예방(및/또는 치료)를 목적으로 백신과 같은 약물 조제에 본 발명의 약독화 돌연변이 균주를 이용하는 것에 관계한다. 치료되는 동물 또는 수의학적 종의 예와 권장 약량은 상기에서 제공하였다.

발명의 상세한 설명

guaB 유전자에 결손 돌연변이가 가축에 면역 반응을 유도하면서 발병력은 상당히 감소시킨 약독화 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)를 유도한다는 놀라운 발견이다. 이와 같은 결손이 중간매개물로써 구아닌 뉴클레오티드를 이용하는 임의 유기체를 약독화시킬 수도 있을 것이다.

여기에서 이용된 "유전자(gene)"는 코딩 서열 및 프로모터와 종료 시그날과 같은 이의 조절 서열을 말하는 것이다.

본 발명에 따른 결손 돌연변이는 퓨린 대사 경로 효소 IMP 데하이드로게나제(guaB 에 의해 인코드됨)가 비활성화된 것이다.

이와 같은 비활성화는 결손을 통해 얻어지는데, 이에 의해 guaB 유전자 기능이 손상되어 영향을 받은 유전자는 기능을 하지 못하게 된다(어떠한 기능적 유전자 산물도 형성되지 않음). 당업자는 이와 같은 돌연변이체를 어떻게 수득하는지를 잘 알 것이며, guaB 유전자 기능이 손상되었는지를 간단한 테스트를 통하여 알 수 있다. 기능을 하는 guaB 유전자 산물이 발현되지 않는 돌연변이 균주는 0.3mM 구아닌, 산틴, 구아노신 또는 산토신이 보충되지 않은 Minimal A 배지에서는 생장할 수 없다.

본 발명은 여러 목적들 중에 약독화 살모넬라 엔테리티디스 (S. Enteritidis) 및 살모넬라 티피모리움(S. Typhimurium)을 제공하는데, 이들이 가장 흔한 S. 엔테리카 혈청형이기 때문이다.

본 발명의 약독화 균주를 제공한다. 본 발명은 다른 약독화 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 균주를 특히, 살모넬라증에 대한 약독화 생백신으로 이용하거나 생 백터로 이용하거나 및/또는 외부 항원을 발현시키는 DNA-매개된 백신으로 이용할 수 있다. 여기에서 외부 항원("foreign antigen")은 살모넬라에 대해 이물질인 항원을 말한다.

생 벡터 백신, 소위 "캐리어 백신" 및 "살아있는 항원 운반 시스템"은 백신학에서 흥미롭고 다양한 분야로 구성된다 (Levine et a.1, 1990, Microecol . Ther. 19:23-32). 이 접근 방식에서 살아있는 바이러스 또는 박테리아 백신을 변형시켜 다른 미생물의 외부 항원을 발현시키고, 면역계로 이들 항원을 운반하도록 하여, 보호 면역 반응을 촉진시킨다. 보급될 살아있는 박테리아 벡터에는 약독화 살모넬라가 포함된다.

본 발명의 목적은 다가 생 백신과 같은 생백신으로 이용하기 위해 약독화 S. 엔테리카(S. enterica) 균주와 같은 약독화 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적중 하나는 예컨데, 살모넬라증에 대항하여 다음의 구성을 가진 백신을 제공하는 것이다;

- 본 발명에 따른 돌연변이(예컨데, 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 돌연변이 균주)의 약리학적 효과적인 또는 면역화량; 이것은 guaB 유전자에 결손 돌연변이로 인하여 de novo 구아닌 뉴클레오티드를 만들 수 없으며; 및

-약리학적으로 수용가능한 캐리어 또는 희석제.

본 발명의 또 다른 목적은 다음으로 구성된 벡터 생백신을 제공하는 것이다;

-본 발명에 따른 돌연변이(예컨데, 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 돌연변이)의 약리학적 효과적인 또는 면역화량; 이것은 guaB 유전자에 결손 돌연변이로 인하여 de novo 구아닌 뉴클레오티드를 만들 수 없으며, 상기 돌연변이는 외부 항원을 인코드하고 발현하며; 및

-약리학적으로 수용가능한 캐리어 또는 희석제.

(S. 엔테리카(S. enterica)) 생 벡터에 이용되는 특정 외부 항원은 본 발명에서 중요한 것은 아니다.

본 발명의 다른 목적은 다음으로 구성된 DNA-매개된 백신을 제공한다:

-본 발명에 따른 돌연변이(살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 돌연변이)의 약리학적 효과량 또는 면역화량; 이것은 de novo 구아닌 뉴클레오티드를 만들 수 없으며, 상기 돌연변이는 guaB 유전자에 돌연변이체를 함유하고, 상기 돌연변이는 진핵 세포에서 인코드되고 발현되는 플라스미드와 외부 항원을 포함하고; 및

-약리학적으로 수용가능한 캐리어 또는 희석제.

U.S. patent 5,877,159에서 DNA-매개된 백신 작제 및 이의 이용에 대해서 상세히 설명하고 있으며 이 특허를 참고문헌으로 첨부한다. 다시 말하지만, DNA 매개된 백신에 이용되는 특정 외부 항원이 본 발명에서 중요한 것은 아니다.

S. 엔테리카(S. enterica)(벡터 생백신에서 원핵 프로모터를 이용할 경우) 또는 S. 엔테리카(S. enterica)에 의해 침범당한 세포(DNA 매개된 백신에서 진핵 프로모터를 이용하는 경우) 중 어디에서 외부 항원을 발현시킬 것인가에 대한 결정은 동물 연구 또는 임상 시험에서 최대 면역 반응을 제공하기 위해 특정 항원으로 백신 구조 및/또는, 항원의 글리코실화 반응이 이의 보호성 면역원성에 필수적인가 및/또는, 항원의 정확한 3차원 형태가 어떤 형태에서 얻을 수 있는 지에 따라 달라진다(US Patent 5,783,196).

본 발명의 백신에서, 투여되는 본 발명의 돌연변이체의 약리학적 효과량 또는 면역화량은 개체의 나이, 체중 및 성별에 따라 달라진다. 여기에서 "면역화량"은 약학 조성물/백신을 제공받은 동물에서 면역반응을 유도할 수 있는 양을 의미한다. 유도되는 면역반응은 체액, 국소, 점막 및/또는 세포 면역 반응이 될 수 있다.

이용되는 특정 제약학적 수용가능한 캐리어 또는 희석제가 본 발명에서 중요한 것은 아니며 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들이다. 희석제에는 위산에 대한 완충작용을 하는 완충액, 예를 들면 슈크로즈를 포함하는 구연산염 완충액(pH 7.0), 중탄산염 완충액(pH 7.0) 또는 아스코르브산, 락토즈 및 선택적으로 아스파르탐을 포함하는 중탄산염 완충액(pH 7.0)이 있다. 캐리어에는 단백질 예로 들면 탈지우유에서 볼 수 있는 단백질; 슈크로즈와 같은 슈가 또는 폴리비닐피리돈이 포함된다.

본 발명에 따른 결손 돌연변이체는 표준 상동성 재조합 기술을 이용하여 만들 수 있는데, guaB 유전자 일부 예를 들면 guaB 코딩 서열의 일부분을 제1단계에서 저항성 유전자와 측면 FRT 부위로 대체한다.

바람직하게는 제2단계에서, 저항성 유전자를 두 개 FRT 부위사이에 재조합에 의해 제거한다. Datsenko and Wanner (2000)의 방법에 따라 항생제 저항성 유전자를 제거하는 재조합 분자 기전을 이용하여 한 개 FRT 부위와 프라이밍 부위 P1 및 P2는 남게 된다(도 4 참고).

본 발명의 특정 예는 SEQ ID NO: 12로 구성된 돌연변이된 guaB 유전자 또는 코딩 서열로 구성된 S. 엔테리티디스(S. Enteritidis)의 guaB 결손 돌연변이에 관계한다.

도 1은 구아노신 모노포스페이트의 생합성 경로를 나타내는 개요도이다Zalkin and Nygaard, 1996, in "Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, Second edition", 1996 F. C. Neidhardt ed. ASM Press, Washington D. C, Vol.l, Ch. 34:561-579에서 발췌).

AICAR: 5'-포스포리보실-4-카르복사미드-5-아미노이미다졸;

ATP: 아데노신 삼인산염;

G: 구아닌;

GMP: 구아노신 일인산염;

GR: 구아노신;

Hx: 하이포산틴;

HxR: 하이포산틴 리보사이드 (이노신);

IMP: 이노신 일인산염;

X: 산틴,

XMP: 산토신 일인산염;

guaA: GMP 합성효소,

guaB: IMP 데하이드로게나제;

guaC: GMP 환원효소.

도 2는 S. 엔테리티디스(S. Enteritidis)의 게놈(SEQ ID NO: 10) contig 1294. guaB 유전자의 ATG 개시 코돈 및 TGA 종료 코돈은 굵게 표시하였다.

도 3은 pUC18에 클론된 살모넬라 엔테리티디스 (S. Enteritidis)의 △guaB 단편 서열을 나타낸다(SEQ ID NO: 11). 이용된 프라이머는 수평 화살표로 나타내었다. 프라이머 GuaB6-GuaB7로 만들어진 단편을 pUC18에 클론하였다. guaB 유전자의 ATG 개시 및 TGA 종료 코돈 및 CCCGGG SmaI 제한효소 부위는 굵게 나타내었다.

도 4는 S. 엔테리티디스(S. Enteritidis) PCR 단편의 뉴클레오티드 서열을 나타내는데, 이 단편은 프라이머 GuaBlO을 이용하여 서열화 후에 수득된 guaB 결손을 포함한다(SEQ ID NO: 12). PCR 단편을 돌연변이 SM20의 전체 게놈 DNA를 이용 하여 프라이머 GuaB6-GuaB7로 증폭시켰다. 남아있는 FRT 부위는 굵은 이태리체로 나타내었고, Pl 및 P2 프라이머는 화살표로 나타내었다(Datsenko and Wanner, 2000, PNAS 97:-6640-6645). guaB 유전자의 ATG 개시 및 TGA 종료 코든은 굵게 나타내었다.

도 5는 S. 티피모리움(S. Typhimurium) LT2, 완전한 게놈 220의 부분 117(SEQ ID NO: 13)의 guaB 유전자를 나타낸다. guaB 유전자의 ATG 개시 및 TGA 종료 코돈을 굵게 표시하였다.

도 6-7은 각각 SM69 및 SM86의 기탁 수령증이다.

본 발명은 첨부된 도면을 참고하여 다음의 실시예 및 구체예에서 더욱 상세하게 설명될 것이다. 특정 구체예 및 실시예에 본 발명의 범위를 국한시키고자 함은 아니다.

실시예 1: 영양요구성 ( auxotrophic ) 돌연변이는 guaB 유전자에 영향을 끼친다

야생형 S. 엔테리티디스(S. Enteritidis)의 영양요구성 삽입 돌연변이를 삽입 돌연변이 생성을 통하여 얻었다. 0.3mM 구아닌, 산틴, 구아노신 또는 산토신이 보충된 Minimal A 배지에서만 돌연변이 균주가 생장할 수 있다.

이와 같은 데이터로 영양요구성 돌연변이 균주는 효소 IMP 데하이드로게나제(EC 1.1.1.205)를 인코드하는 guaB 유전자에 영향을 끼친다는 것이 강력하게 제기된다. 도 1에서 나타낸 것과 같이, 이 효소는 이노신-5'-일인산염(IMP)을 산토 신 일인산염(XMP)으로 전환시킨다.

삽입 돌연변이체가 복귀되면 균주의 병인성이 복원된다. 이 때문에 약독화 생백신으로의 이용에만 용도가 한정된다. 이 측면에서 결손 돌연변이체가 바람직하다. S. 엔테리티디스 (S. Enteritidis) 및 S. 티피모리움(S. Typhimurium)의 guaB 결손 돌연변이가 만들어지고 이를 테스트하였다. 도 2와 5에서는 두 가지 혈청형의 guaB 유전자가 제공된다.

실시예 2: guaB 결손 돌연변이체

guaB 결손 돌연변이체 작제

대장균(Escherichia coli) K12 게놈에 결손 돌연변이를 만드는 방법(Datsenko and Wanner, 2000, PNAS 97 : 6640-5, 참고문헌으로 첨부함)에 준하여 guaB 결손 돌연변이체를 만들었다.

이 방법은 박테리오파아지 λ Red 리콤비나제 시스템의 중재를 통하여 PCR에 의해 생성된 선형 DNA 단편의 상동성 재조합을 이용한다.

guaB 서열은 항생제 저항성 유전자로 대체된다. 이 저항성 유전자는 FRT 부위에 인접하고(FLP 인지 표적 부위), FLP 리콤비나제에 의해 중재되는 부위-특이적 재조합에 의해 게놈으로부터 잘려나갈 것이다.

오버랩(Overlap) PCR (Ho et al . , 1989, 유전자 77:51-59)을 이용하여 선형 단편을 작제한다. 이 원리는 두 개 프라이머 세트를 이용에 의존하는데, 하나는 guaB 유전자의 상류쌍 (GuaB3-GuaB4; GuaB3 : 5' GGCTGCGATT GGCGAGGTAG TA 3', SEQ ID NO 2; GuaB4 : 5' GGTGATCCCG GGCGTCAAAC GTCAGGGCTT CTTTA 3', SEQ ID NO 3)이며, 다른 하나는 하류 쌍이다(GuaB5-GuaB2 ; GuaB5 : 5' TTGACGCCCG GGATCACCAA AGAGTCCCCG AACTA 3', SEQ ID NO 4 ; GuaB2 : 5' CGTTCAGGCG CAACAGGCCG TTGT 3', SEQ ID NO 1).

이들 세트에는 SmaI 제한 부위가 추가되며, 부분적으로 상보적인 프라이머(GuaB4, GuaB5)를 포함한다.

생성된 상보 서열의 어닐링(annealing) 및 쇄 연장(chain elongation)후에, 외측 프라이머(GuaB6-GuaB7; GuaB6 : 5' GCAACAACTC CTGCTGGTTA 3', SEQ ID NO 5; GuaB7 : 5' AGACCGAGGA TCACTTTATC 3', SEQ ID NO 6)를 이용한 PCR로 g uaB 코딩 서열의 861 염기쌍 내부 단편을 대체한 6개 염기쌍 SmaI 부위를 가진 단편이 만들어진다. 이와 같은 △guaB 단편을 벡터 pUCl8(도 3)에 클론시켰다.

프라이머 Pl (5' GTGTAGGCTG GAGCTGCTTC 3', SEQ ID NO 8) 및 P2 (5' CATATGAATA TCCTCCTTAG 3', SEQ ID NO:9) (Datsenko and Wanner, 2000) 그리고 주형으로 플라스미드 pKD3 DNA (Datsenko and Wanner, 2000)를 이용하여 클로람페니콜 저항성 유전자(cat)와 이의 인접 FRT 서열을 증폭시켰다.

클론된 △guaB 단편의 SmaI 부위에 PCR 단편을 결찰시켰다. 포개넣은(nested) 프라이머 (GuaB6-GuaB7)를 이용하여 원하는 단편을 만든다.

생성된 PCR 단편은 S. 엔테리티디스 파아지 타입 4 균주 76Sa88 (칠면조에서 임상적으로 분리; Veterinary and Agrochemical Research Centre, Groeselenberg 99, B-1180 Ukkel , Belgium에서 구함)-박테리오파아지 람다 레드 리콤비나제 시스 템을 인코드하는, 온도 감응성 복제 플라스미드 pKD46를 가지고 있음.

클로람페니콜 저항성 형질변환체는 Minimal A 배지 및 0.3mM 구아닌이 보충된 Minimal A 배지에서 테스트하였다. 다음의 프라이머 조합을 이용하여 PCR에 의해 △guaB :: catFRT 돌연변이체를 확인하였다: GuaB6-GuaB7, GuaB6-P2, GuaB7-Pl, P1-P2.

S. 엔테리티디스 △guaB :: catFRT 돌연변이체(SM12)는 전기천공에 의해 온도 감응성 복제 플라스미드 pCP20로 형질변환시켰다. 플라스미드 pCP20는 FLP 리콤비나제를 인코드하는데, 이 효소는 FRT-부위를 인지하여 cat 유전자를 제거한다. 생성된 균주는 SM20로 명명한다.

결손이 있는 PCR 단편은 돌연변이체 SM20의 전체 게놈 DNA와 프라이머 복합 GuaB6-GuaB7을 이용하여 얻었다(도면 4참고).

프라이머 GuaBlO (5'AGGAAGTTTG AGAGGATAA 3', SEQ ID NO 7)를 이용하여 이 단편의 서열확인에 의해 △guaB 돌연변이를 확인하였다.

표 1에서는 상기 언급된 모든 프라이머의 서열을 제시한다.

레드 리콤비나제 시스템의 발현으로 인한 가능성 있는 추가 돌연변이의 존재를 피하기 위해 동질유전자형(isogenic) 균주를 작제하였다.

돌연변이체 SM12의 △guaB :: catFRT 돌연변이는 야생형 S. 엔테리티디스 76Sa88에 박테리오파아지 P22 HT int-(Davis, R.W. , Botstein D. and Roth, J. R. (1980))를 이용하여 형질변환유도된 것이다 In Advanced Bacterial Genetics , A manual for genetic engineering . Cold Spring Harbor Laboratory , Cold Spring Harbor, N. Y.). 플라스미드 pCP20를 이용하여 cat 유전자를 제거하였다. 생성된 균주는 SM69라고 명명하였다(기탁번호 LMG P-21641).

S. 티피모리움(S. Typhimurium ) 균주 1491S96의 △guaB 돌연변이체는 동일한 과정에 동일한 프라이머를 이용하여 만들었다. 생성된 균주 S. 티피모리움 △guaB: : catFRT 및 S. 티피모리움 △guaB을 각각 SM9 및 SMl9으로 명명하였다. SM86 (기탁번호 LMG P-21646)는 균주 SM9로부터 박테리오파아지 P22 HT int- 용해물질에 의해 형질변환 유도한 후 플라스미드 pCP20을 이용하여 cat 유전자를 잘라낸 것으로부터 수득된 동질유전자형 균주이다.

△guaB 돌연변이체 SM19, SM20, SM86 및 SM69는 박테리오파지 P22에 민감하다. 이는 고유 리포폴리사카라이드(LPS)의 존재를 증명한다.

생쥐에서 guaB 결손 돌연변이 SM20 을 이용한 병독성( Virulence ) 및 보호 검사

두 가지 독립적인 실험을 통하여 6-8주령 암컷 BALB/c 생쥐의 구강 감염으로 생쥐에서 돌연변이체 SM20의 병독성을 테스트하였다. 상기 설명한 것과 같이 실시하였다. 야생형 타입 균주 S. 엔테리티디스 76Sa88를 양성 대조군과 나란히 테스트하였다. S. 엔테리티디스 76Sa88 △aroA 돌연변이체 SM50가 백신 대조군으로 실험에 포함된다. 이 돌연변이는 완전한 aroA 코딩 서열이 정확하게 결손되었고, Datsenko and Wanner(2000)의 방법에 따라 만들었다.

표 2와 3에 완전한 데이터가 제공되어있다. 이들 결과로 생쥐에서△guaB 돌연변이체 SM20가 상당히 약독화되었지만 높은 약량으로 투여할 경우에 일부 잔존 병인성은 여전히 나타났다. 돌연변이체를 경구 투여하면 이에 상응하는 병원성 야생형 S. 엔테리티디스 균주 76Sa88의 고약량에 의한 감염으로부터 보호성 면역을 유도한다. 이와 같은 보호 수준은 적으로 S. 엔테리티디스 △aroA 돌연변이체 SM50에 의해 부여되는 보호 수준에 상당한다.

생쥐에서 동종유전자형 guaB 결손 돌연변이체 SM69 및 SM86 의 병독성 및 보호 검사

생쥐에서 돌연변이체 SM69 및 SM86의 병독성은 BALB/c 암컷 생쥐(주령 6-8)의 경구 감염을 통하여 테스트하였다. 상기에서 설명한 것과 같이 실시한다. 야생형 균주 S. 엔테리티디스 76Sa88 및 S. 티피모리움 1491S96을 양성 대조군으로 나란히 테스트하였다.

표 4-7에서는 온전한 데이터가 제공되어 있다. 이 결과로 생쥐에서△guaB 돌연변이체 SM69 및 SM86이 상당히 약독화되었지만 높은 약량으로 투여할 경우에 일부 잔존 병인성은 여전히 나타났다. 돌연변이체를 경구 투여하면 이에 상응하는 병원성 야생형 균주의 고약량에 의한 감염으로부터 보호성 면역을 유도한다.

기관내 ( intratracheal ) 그리고 경구 위관( gavage ) 루트에 의해 1일된 병아 리에서 S. 엔테리티디스 △guaB 결손 돌연변이 SM69 의 안전성 효과

본 연구의 목적은 1일된 병아리에서 S. 엔테리티디스 △guaB 돌연변이체 균주 SM69 마스터 씨드의 안전성(safety)을 평가하는 것이다. 안전성의 평가에 제1변수는 치사율이다.

1일된 병아리 다리에 띠를 묶고, 네 개 처리군에 각각 무작위로 배치시킨 다.(1군: SM69-IT, 2군: SM69-OG, 3군: PBS-IT, 4군: PBS-OG). 마스터 씨드 접종후에, 1군과 2군의 새끼를 한 개 분리기에 배치하고, 3군과 4군의 새끼를 다른 분리기에 둔다.

1군과 2군의 병아리에는 각각 기관내(IT) 경로 또는 경구 관(OG) 경로를 통하여 SM69 마스터 씨드를 새 당(per bird) 실제 역가 1.28 X lO⁸cfu/0.2㎖ 로 접종하였다. 3군과 4군의 병아리에는 각각 기관내(IT) 경로 또는 경구 관(OG) 경로를 통하여 새 당 0.2㎖ PBS(인산염 완충액)를 투여하였다.

SM69 또는 PBS로 접종후에 38일까지 병아리 치사율을 관찰하였다. 표 8에서는 4개 집단에서의 치사율을 종합한 결과를 나타낸 것이다. 1군에서 접종 외상(inoculation trauma)으로 인하여 접종동안 한 마리 새가 죽었다. 접종 2일째(DPI; day post inoculation)에 두 마리 새가 죽었다. 3일 내지 13일 사이에 세 마리 새가 죽었다(각각 3, 5, 13 DPI). 따라서, 1군에서 총 6마리가 죽었다. 2군에서는 전체 두 마리의 새가 죽었다. 한 마리 는 접종 외상으로 접종 동안에 죽었고, 다른 한 마리는 접종 5일 후에 죽었다. 기관내 또는 구강 경로를 통하여 PBS로 처리된 군에서 죽은 새는 없었다.

이 연구로부터 S. 엔테리티디스 △guaB 돌연변이 균주 SM69는 기관내 또는 구강관 경로를 통하여 1일령의 새끼에 1.28 x lO⁸ cfu 투여한 경우에 안전하지 못하다는 결론을 얻었다.

기관내 ( tracheal ) 그리고 경구관 ( oral gavage ) 루트에 의해 2주령된 병아리 에서 S. 엔테리티디스 △ guaB 결손 돌연변이 SM69 의 안전성 평가

2주령된 특정 병인균 없는(SPF) 병아리에서 S. 엔테리티디스 △guaB 돌연변이체 균주 SM69의 안전성을 기관내 및 경구관 경로에 의하여 평가하였다. 안전성의 평가에 제1기준는 치사율이며 제2기준은 체중이다.

2주령된 새의 다리에 띠를 묶고, 네 개 처리군에 각각 무작위로 배치시킨다.(SM69-IT, SM69-OG, Poulvac ST-IT, PBS-IT). 1군에서 10마리 새에 기관 경로에 의하여 SM69를 접종하고; 2군에서는 구강관을 통하여 10마리 새끼에 SM69를 접종하고; 3군에서는 10마리 새에 S. 티피모리움 AroA ^- 백신(Poulvac^® ST)를 기관 경로에 의하여 접종하였고; 4군에 5마리 새에는 기관내 경로를 통하여 PBS를 투여하였다.

1군과 2군의 병아리에는 각각 기관내(IT) 경로 또는 경구 관(OG) 경로를 통하여 SM69 마스터 씨드를 새 당 실제 역가 2.304 X lO⁸cfu/0.2㎖로 접종하였다. 3군 병아리에는 기관 경로를 통하여 Poulvac^® ST를 2.19 X lO⁸cfu/0.2㎖로 투여하였다. 4군의 병아리에는 각각 기관내 경로를 통하여 새 당 0.2㎖ PBS를 투여하였다.

접종 후에 1군 및 2군 처리를 받은 새끼를 하나의 분리기에 두고, 3군과 4군 처리를 받은 새끼를 다른 분리기에 두었다.

접종후 21일까지 매일 치사율을 관찰하였고, 연구 기간이 종료되는 시점(21일)에서 모든 새의 체중을 기록하였다. Poulvac^® ST 및 PBS를 기관내 접종의 대조군으로 이용하였다.

21일간의 관찰기간동안에, SM69 기관내 처리군(1군)에서 1마리가 감염된 난황낭으로 죽었다. SM69 접종과 연관된 치사는 없었고 이는 SM69 균주가 테스트한 기관내 그리고 구강관 경로를 통하여 새 당 2.304 X lO⁸cfu 역가에서는 안전하다는 것을 말해주는 것이다. 예상한 바와 같이, Poulvac^® ST를 2.19 X lO⁸cfu 역가로 처리된 또는 PBS 투여된 군에서도 죽은 새끼는 없었고, 이는 이 연구가 유효하다는 것을 말해주는 것이다(표 9).

가변량변수 분석 모델(ANOVA)(체중을 종속변수로, 포함된 처리를 독립변수로 한) 체중을 군간에 비교하였다. 군간 비교는 다중 비교를 목적으로 Tukey' 테스트를 통하여 이루어졌다. 유의성 수준은 p <0.05으로 설정하였다. 이 연구는 대조군 병아리(PBS 대조군)이 건강하며, 연구를 통하여 질병의 임상적 징후나 치사률이 나타나지 않았기 때문에 유효한 것으로 판단된다.

기관내 또는 구강관 경로를 통하여 SM69, Poulvac^® ST 또는 PBS를 투여한 병아리들에서 최종 체중에 유의적인 차이는 없었다(표 5). 1일령의 각 군에 새에서 기저선을 정립하지는 않았지만, 4개 군에서 초기 체중은 상당한 차이가 있었는데, 그 이유는 4개 처리군 각각에 새들을 무작위로 배치하였기 때문이다.

SM69 접종으로 인한 치사율이 없었기 때문에, S. 엔테리티디스 △guaB 돌연변이 균주, SM69는 2주령된 새에 테스트된 역가 2.304 X lO⁸cfu/0.2㎖로 기관내 또는 구강관 접종 경로를 통하여 투여하였을 때 안전하다고 결론을 내릴 수 있다. 제 2안전성 파라미터인 새의 몸무게에서 SM69 접종으로 인한 새끼의 최종 체중에 영향은 없었다.

다음의 미생물들은 부다페스트 협력에 따라 기탁기관 BCCM/LMG Culture Collection, Laboratorium voor Microbiologie, K. L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent (Belgium)에 기탁되었다: 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) SM69 -기탁번호 LMG P-21641 (기탁일: 9 August, 2002), S. 티피모리움(S. Typhimurium ) SM86 -기탁번호 LMG P-21646 (기탁일: 28 August, 2002). 기탁은 Prof. J. -P. Hernalsteens의 이름으로 이루어졌다. 주소; (기존 주소): Vrije Universiteit Brussel, Laboratorium Genetische Virologie, Paardenstraat 65, B-1640 Sint-Genesius-Rhode, (현주소): Vrije Universiteit Brussel, Onderzoeksgroep Genetische Virologie, Pleinlaan 2, B-1050 Brussels, Belgium.

프라이머 서열

SEQ ID NO	프라이머	서열
1	GuaB2	5' CGTTCAGGCGCAACAGGCCGTTGT 3'
2	GuaB3	5' GGCTGCGATTGGCGAGGTAGTA 3'
3	GuaB4	5' GGTGATCCCGGGCGTCAAACGTCAGGGCTTCTTTA 3'
4	GuaB5	5' TTGACGCCCGGGATCACCAAAGAGTCCCCGAACTA 3'
5	GuaB6	5' GCAACAACTCCTGCTGGTTA 3'
6	GuaB7	5' AGACCGAGGATCACTTTATC 3'
7	GuaB10	5' AGGAAGTTTGAGAGGATAA 3'
8	P1	5' GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 3'
9	P2	5' CATATGAATATCCTCCTTAG 3'

SEQUENCE LISTING <110> Fort Dodge Animal Health <120> LIVE ATTENUATED SALMONELLA VACCINE <130> BP.FDAH.001A/EP <160> 13 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GuaB2 primer <400> 1 cgttcaggcg caacaggccg ttgt 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GuaB3 primer <400> 2 ggctgcgatt ggcgaggtag ta 22 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GuaB4 primer <400> 3 ggtgatcccg ggcgtcaaac gtcagggctt cttta 35 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GuaB5 primer <400> 4 ttgacgcccg ggatcaccaa agagtccccg aacta 35 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GuaB6 primer <400> 5 gcaacaactc ctgctggtta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GuaB7 primer <400> 6 agaccgagga tcactttatc 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GuaB10 primer <400> 7 aggaagtttg agaggataa 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1 primer <400> 8 gtgtaggctg gagctgcttc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2 primer <400> 9 catatgaata tcctccttag 20 <210> 10 <211> 2903 <212> DNA <213> Salmonella Enteritidis <220> <221> misc_feature <223> Contig 1294 of the S. Enteritidis genome <220> <221> misc_feature <222> (1581)..(1583) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (1657)..(1657) <223> n is a, c, g, or t <400> 10 ctgatcgaac aagccttcgg cctgcagttt ggcttttagc tgctcatatt tctgctgcaa 60 caagccttcg cccgcgggct gcatactttc ggcgatgatt tgataatcgc cgcgcggctc 120 gtacagcgta atgttggcgc gtaccagcac ctgctgcccg tgctgcgggc ggaacgtcac 180 ccggcgattg ctgttacgga acatcgcaca gcgcacctga gcggtatcgt ctttgagcgt 240 aaagtaccag tggcccgacg caggctgcgt gaaattagaa atctcgccgc tgatccatac 300 ctgtcccatc tcctgttcta acagcagacg aaccgtctgg ttaaggcggc ttacggtaaa 360 aattgaggaa gtttgagagg ataacatgtg agcgggatca aattctaaat cagcaggtta 420 ttcaatcgat agtaacctgc tcacggggga tcgcaagcac tatttgcaaa aaaatgtaga 480 tgcaaccgat tacgttctgt ataatgccgc gggaatattt attaacctcc caggcgagat 540 attgcccatg ctacgtatcg ctaaagaagc tctgacgttt gacgacgtcc tccttgttcc 600 cgctcactcc accgttttgc cgaatactgc cgatctcagc acgcagttga cgaaaactat 660 tcgtctgaat attcctatgc tttctgcggc gatggacacc gtgacggaag cgcgcctggc 720 aattgccctg gcccaggaag gcggcattgg ttttatccac aaaaacatgt ctattgagcg 780 ccaggcggaa gaagttcgcc gcgtgaagaa acacgagtcc ggcgtagtga ccgacccgca 840 gaccgtcctg ccaaccacca cgttgcatga agtgaaagcc ctgaccgagc gtaacggttt 900 tgcgggctat ccggtggtga ctgaagataa cgagctggtg ggtatcatca ccggtcgtga 960 cgtgcgtttt gtgactgacc tgaaccagcc ggtgagtgtc tacatgacac cgaaagagcg 1020 tctggtgacc gttcgtgaag gcgaagcccg tgaagtcgtg ctggcaaaaa tgcacgaaaa 1080 acgcgtagaa aaagcgctgg tcgttgatga taacttccat ctgcttggca tgattaccgt 1140 aaaagatttc cagaaagcgg aacgtaaacc aaactcctgt aaagatgagc agggccgttt 1200 acgtgtcggc gcggcggtcg gcgcaggcgc gggcaacgaa gagcgcgttg acgcgctggt 1260 ggcggcaggc gttgacgtac tgctgatcga ctcctctcac ggtcactctg aaggcgtgtt 1320 gcaacgtatc cgtgagacgc gtgctaaata tcctgacctg caaatcatcg gcgggaacgt 1380 tgcgacgggc gcaggcgctc gcgcactggc ggaagccggt tgcaacgcgg tgaaagtggg 1440 tatcggcccg ggttccatct gtacgactcg tatcgggact ggtgtgggcg ttccgcagat 1500 caccgctgtt tctgacgcgg tggaagcgct ggaaggcacc gggattccgg ttatcgctga 1560 cggcggtatc cgtttctccg nnnacatcgc caaagccatc gccgcaggcg cgagcgcggt 1620 aatggtgggt tctatgctgg ccggtaccga agaatcnccg ggcgaaatcg aactctacca 1680 gggccgttct tacaaatctt atcgcggtat gggttctctg ggcgcgatgt ccaaaggttc 1740 ctccgaccgt tacttccaga gcgacaacgc cgccgacaaa ctggtgccgg aaggtatcga 1800 aggccgcgta gcctataaag gtcgcctgaa agagatcatt caccagcaga tgggcggcct 1860 gcgctcctgt atggggctga ccggttgtgc taccatcgac gaactgcgta ctaaagcgga 1920 gtttgtgcgt atcagcggtg cgggtatcca ggaaagccac gttcacgacg tgaccatcac 1980 caaagagtcc ccgaactacc gtctgggctc ctgattttct tcgcccgacc ttcgcgtcgg 2040 gcgatttatt taatctgttt cacttgcctc ggaataagcg tcaatgacgg aaaacattca 2100 taagcatcgc atcctcattc tggacttcgg ttctcagtac actcaactgg ttgcgcgccg 2160 cgtgcgtgag ctgggtgttt actgtgaact gtgggcgtgg gatgtgacag aagcacaaat 2220 tcgtgacttc aacccaagcg gcattattct ttccggcggc ccggaaagca ccaccgaaga 2280 aaacagcccg cgcgcgccgc agtatgtctt tgaagcaggc gtgccggtat ttggcgtttg 2340 ctatggtatg cagaccatgg cgatgcagct tggcggtcat gtagaaggtt ctaatgagcg 2400 tgaatttggt tatgcgcagg tcgaagtgtt gaccgacagc gcgctggttc gcggtattga 2460 agattccctg accgcagacg gcaaaccgct gctggacgtg tggatgagcc acggcgataa 2520 agtgacggcg attccgtccg acttcgtgac cgtcgccagc accgagagct gcccgttcgc 2580 cattatggcc aacgaagaaa aacgcttcta cggcgtacag ttccacccgg aagtgactca 2640 cacccgccag ggtatgcgca tgctggagcg ttttgtacgc gatatctgcc agtgtgaagc 2700 gttgtggacg ccggcgaaga tcatcgatga cgccgtggcg cgcattcgcg agcaggtagg 2760 cgacgataaa gtgatcctcg gtctctccgg cggcgtggat tcttccgtca ccgccatgct 2820 gctgcaccgc gcgatcggta aaaatctgac ctgtgttttc gtcgacaacg gcctgttgcg 2880 cctgaacgaa gccgagcagg tga 2903 <210> 11 <211> 1995 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of the delta-guaB fragment of S. Enteritidis cloned in pUC18 <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n is a, c, g, or t <400> 11 ggctgcgatt ggcgaggtag tagtccatcg ccatgcccag acgctgctgg cgganctgga 60 tctgacgcaa caactcctgc tggttacggc tgacaatttc tgccgctgct gatggcgtag 120 cgcgcgcagg tcggcgacaa aatcagctat cgtgacgtcc gtttcgtgac cgacggcgct 180 gaccaccgga atgcggctgg caaaaatcgc ccgcgccacg cgttcgtcgt taaaactcca 240 caaatcttcc agcgaaccgc cgccgcgccc gacgatcagt acatcacatt cgccgcgcgc 300 gttcgccagt tcgatagcac gaacgatctg ccccggcgcg tcgtcgccct ggactgcggt 360 tggatagata ataacgggca gggatgggtc acgacgcttt agcacgtgga gaatatcgtg 420 cagcgccgcg ccggttttcg aagtgatcac cccaacgcag tgggccgggg agggcaacgg 480 ctgtttatgc tgctgatcga acaagccttc ggcctgcagt ttggctttta gctgctcata 540 tttctgctgc aacaagcctt cgcccgcggg ctgcatactt tcggcgatga tttgataatc 600 gccgcgcggc tcgtacagcg taatgttggc gcgtaccagc acctgctgcc cgtgctgcgg 660 gcggaacgtc acccggcgat tgctgttacg gaacatcgca cagcgcacct gagcggtatc 720 gtctttgagc gtaaagtacc agtggcccga cgcaggctgc gtgaaattag aaatctcgcc 780 gctgatccat acctgtccca tctcctgttc taacagcaga cgaaccgtct ggttaaggcg 840 gcttacggta aaaattgagg aagtttgaga ggataacatg tgagcgggat caaattctaa 900 atcagcaggt tattcaatcg atagtaacct gctcacgggg gatcgcaagc actatttgca 960 aaaaaatgta gatgcaaccg attacgttct gtataatgcc gcggcaatat ttattaacct 1020 cccaggtgag atattgccca tgctacgtat cgctaaagaa gctctgacgt ttgacgcccg 1080 ggatcaccaa agagtccccg aactaccgtc tgggctcctg attttcttcg cccgaccttc 1140 gcgtcgggcg atttatttaa tctgtttcac ttgcctcgga ataagcgtca atgacggaaa 1200 acattcataa gcatcgcatc ctcattctgg acttcggttc tcagtacact caactggttg 1260 cgcgccgcgt gcgtgagctg ggtgtttact gtgaactgtg ggcgtgggat gtgacagaag 1320 cacaaattcg tgacttcaac ccaagcggca ttattctttc cggcggcccg gaaagcacca 1380 ccgaagaaaa cagcccgcgc gcgccgcagt atgtctttga agcaggcgtg ccggtatttg 1440 gcgtttgcta tggtatgcag accatggcga tgcagcttgg cggtcatgta gaaggttcta 1500 atgagcgtga atttggttat gcgcaggtcg aagtgttgac cgacagcgcg ctggttcgcg 1560 gtattgaaga ttccctgacc gcagacggca aaccgctgct ggacgtgtgg atgagccacg 1620 gcgataaagt gacggcgatt ccgtccgact tcgtgaccgt cgccagcacc gagagctgcc 1680 cgttcgccat tatggccaac gaagaaaaac gcttctacgg cgtacagttc cacccggaag 1740 tgactcacac ccgccagggt atgcgcatgc tggagcgttt tgtacgcgat atctgccagt 1800 gtgaagcgtt gtggacgccg gcgaagatca tcgatgacgc cgtggcgcgc attcgcgagc 1860 aggtaggcga cgataaagtg atcctcggtc tctccggcgg cgtggattct tccgtcaccg 1920 ccatgctgct gcaccgcgcg atcggtaaaa atctgacctg tgttttcgtc gacaacggcc 1980 tgttgcgcct gaacg 1995 <210> 12 <211> 349 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the S. Enteritidis PCR fragment, which includes the guaB deletion, obtained using primer GuaB10 <400> 12 catgtgtgag cgggatcaaa ttctaaatca gcaggttatt caatcgatag taacctgctc 60 acgggggatc gcaagcacta tttgcaaaaa aaatgtagat gcaaccgatt acgttctgta 120 taatgcccgg caatatttat taacctccca ggtgagatat tcgccatgta cgtatcgcta 180 aagaagccct gacgtttgac gcccgtgtag gctggagctg cttcgaagtt cctatacttt 240 ctagagaata ggaactccgg aataggaact aaggaggata ttcatatggg atcaccaaag 300 atccccgaac taccgtctgg gctctgattt tcttcgcccg accttcgcg 349 <210> 13 <211> 1553 <212> DNA <213> Salmonella Typhimurium <220> <221> misc_feature <223> guaB gene of S. Typhimurium LT2, section 117 of 220 of the complete genome <400> 13 atttgcaaaa aaatgtagat gcaaccgatt acgttctgta taatgccgcg gcaatattta 60 ttaacctccc aggtgagata ttgcccatgc tacgtatcgc taaagaagcc ctgacgtttg 120 acgacgtcct ccttgttccc gctcactcca ccgttttgcc gaatactgcc gatctcagca 180 cgcagttgac gaaaactatt cgtctgaata ttcctatgct ttctgcggcg atggacaccg 240 tgacggaagc gcgcctggca attgccctgg cccaggaagg cggcattggt tttatccaca 300 aaaacatgtc cattgagcgc caggcggaag aagttcgccg cgtgaagaaa cacgagtccg 360 gcgtagtgac cgacccgcag accgtcctgc caaccaccac gttgcatgaa gtgaaagccc 420 tgaccgagcg taacggtttt gcgggctatc cggtggtgac tgaagataac gagctggtgg 480 gtatcatcac cggtcgtgac gtgcgttttg tgactgacct gaaccagccg gttagcgttt 540 acatgacgcc gaaagagcgt ctggtgaccg ttcgtgaagg cgaagcccgt gaagtcgtgc 600 tggcaaaaat gcacgaaaaa cgcgtagaaa aagcgctggt cgttgatgat aacttccatc 660 tgcttggcat gattaccgta aaagatttcc agaaagcgga acgtaaacca aactcctgca 720 aagatgagca gggccgttta cgtgtcggcg cggcggtcgg cgcaggcgcg ggcaacgaag 780 agcgcgttga cgcgctggtg gcggcaggcg ttgacgtact gctgatcgac tcctctcacg 840 gtcattcaga aggcgtgttg caacgtatcc gtgaaacccg tgctaaatat cctgacctgc 900 aaatcatcgg cggcaacgtc gcgacaggcg caggcgctcg cgcactggcg gaagccggtt 960 gcagcgcggt gaaagtcggt attggcccgg gttccatctg taccactcgt atcgtgactg 1020 gcgtgggcgt tccgcagatc accgctgttt ctgacgcagt tgaagcgctg gaaggtaccg 1080 gtattccggt tatcgctgac ggcggtatcc gtttctccgg cgacatagcc aaagcgattg 1140 ccgcaggtgc aagcgcggta atggtgggtt ccatgctggc gggtacggaa gaatccccgg 1200 gcgaaatcga actctaccag ggccgttctt acaaatctta ccgcggcatg ggctcgctgg 1260 gtgcgatgtc caaaggttcc tccgaccgtt acttccagag cgacaacgcc gctgacaaac 1320 tggtgccgga aggtatcgaa ggtcgcgtag cctataaagg tcgcctgaaa gagatcattc 1380 accagcagat gggcggcctg cgctcctgta tggggctgac cggttgtgct accatcgacg 1440 aactgcgtac taaagcggag tttgtgcgta tcagcggtgc gggcattcag gaaagccacg 1500 ttcacgacgt gaccatcacc aaagagtccc cgaactaccg tctgggctcc tga 1553

Claims (17)

1. 수의학적 종을 감염시키는 박테리아의 약독화 돌연변이 균주로, de novo 구아닌 뉴클레오티드를 형성할 수가 없으며, 돌연변이에는 guaB 유전자에 결손 돌연변이가 포함된 약독화 돌연변이 균주.
2. 제 1 항에 있어서, 수의학적 종은 가금류인 돌연변이 균주.
3. 전술한 어느 한 항에 있어서, 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 또는 (병인균) 대장균(Escherichia coli) 균주인 돌연변이 균주.
4. 전술한 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 균주는 외부 항원을 인코드하고 발현시키는 돌연변이 균주.
5. 전술한 어느 한 항에 있어서, S 엔테리티디스(S. enteritidis) 또는 S. 티피모리움(S. Typhimurium ) 균주인 돌연변이 균주.
6. 전술한 어느 한 항에 있어서, 돌연변이를 모균주 S. 엔테리티디스(S. enteritidis) 파아지 타입 4 균주 76Sa88로 도입시킨 돌연변이 균주.
7. 제 6 항에 있어서, 기탁번호 LMG P-21641인 S. 엔테리티디스(S. enteritidis) 균주 SM69인 돌연변이 균주.
8. 전술한 어느 한 항에 있어서, 돌연변이를 모균주 S. 티피모리움(S. Typhimurium) 1491S96으로 도입시킨 돌연변이 균주.
9. 제 8 항에 있어서, 기탁번호 LMG P-21646인 S. 티피모리움(S. Typhimurium) 균주 SM86인 돌연변이 균주.
10. 박테리아 감염으로부터 수의학적 종을 면역화시키는, 다음을 포함하는 백신:

    - 약리학적 유효량 또는 면역화량의 전술한 어느 한 항에 따른 돌연변이 균주, 이것은 guaB 유전자에 결손 돌연변이로 인하여 de novo 구아닌 뉴클레오티드를 만들 수 없음; 및

    - 약리학적으로 수용가능한 캐리어 또는 희석제.
11. 제 10 항에 있어서, 돌연변이 균주는 외부 항원을 인코드하고 발현하는 백신.
12. 제 10항 또는 제11항에 있어서, 돌연변이 균주는 진핵세포에서 외부 유전자를 인코드하고 발현시키는 플라스미드를 포함하는 백신.
13. 박테리아 감염으로부터 수의학적 종을 면역화시키는 방법에 있어서,

    이를 필요로 하는 수의학적 종에 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 균주 및/또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 백신의 면역화량을 투여하는 단계로 구성되는 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 수의학적 종은 가금류인 방법.
15. 제 13 항 또는 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 균주 및/또는 백신을 경구, 비강 또는 장관외 경로를 통하여 투여하는 방법.
16. 의약품으로 사용되는 제 1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 약독화 돌연변이 균주.
17. 수의학적 종, 바람직하게는 가금류에서 박테리아에 의한 감염 예방 및/또는 치료를 위한 백신 또는 약품을 제조하는데 사용되는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 약독화 돌연변이 균주.

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