CN116836900A - 肠炎沙门菌ryhB-1和sopE双基因缺失株及其作为减毒疫苗候选株的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种肠炎沙门菌ryhB‑1和sopE双基因缺失株及其作为减毒疫苗的应用，其中的双基因缺失株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20221957。该缺失株利用λ‑Red同源重组技术，敲除肠炎沙门菌的非编码小RNA RyhB‑1和侵袭相关靶基因sopE，获得双基因缺失的减毒沙门菌。本发明制备的减毒沙门菌毒力显著降低，具有良好的安全性；攻毒后保护试验表明其具有良好的保护效果可保护鸡群免于发病；鸡群免疫后机体内会诱导全面高效的体液、细胞免疫。本发明为预防禽肠炎沙门菌感染提供了安全、免疫原性好、保护效力高的禽肠炎沙门菌减毒疫苗。

Description

肠炎沙门菌ryhB-1和sopE双基因缺失株及其作为减毒疫苗候 选株的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基因缺失型肠炎沙门菌减毒活疫苗候选株及其作为减毒疫苗候选株的应用。
背景技术
沙门菌(Salmonella)是一种重要的人兽共患病原菌，自然界中分布广泛，种类多，对禽畜健康、人类公共安全、食品安全均产生严重影响。目前已经报道的沙门菌血清型有2900多种，其中肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌两种血清型对我国养禽业威胁较大。
肠炎沙门菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis)是一种常见的革兰氏阴性肠杆菌，该菌能通过动物以及相关的肉类、蛋类或者空气、水和食物等途径进行传播，能够引起成年鸡的隐性感染，受感染的家禽通过粪便向外界环境中排菌，造成环境污染，导致病原菌难以净化。感染雏鸡通常表现为严重的全身性感染和高死亡率。肠炎沙门菌不仅可以在鸡的盲肠中持续带菌，可造成垂直传播；而且在屠宰过程中能够污染肉产品，导致水平传播，被污染的禽肉、禽蛋食用后可能对人类的健康造成威胁。在我国每年约3亿人因肠炎沙门菌感染而患病，占食源性病原菌疾病总数的70％-80％。因此，迫切需要安全有效的途径来防治禽肠炎沙门菌的感染。
在沙门菌的预防和治疗方面，我国通常依赖于传统的抗生素防治，但抗生素的滥用导致沙门菌耐药性不断增强，同时集约化养殖使动物群体的免疫力下降，多重耐药菌株的增加导致抗生素治疗的效果越来越差，且抗生素的滥用导致药物残留，影响人类健康。在此前提下，对易感动物进行疫苗接种是目前控制沙门菌感染、降低沙门菌在宿主体内定殖的有效措施。
随着分子生物学和免疫学的进步和发展，越来越多的商品化疫苗投入市场，常见的疫苗种类包括灭活苗、DNA疫苗、亚单位疫苗和减毒活疫苗。与减毒活疫苗相比，其他疫苗具有明显的局限性：灭活苗不能在体内繁殖，进入机体后在短时间内就会被宿主清除，导致免疫时间较短；而亚单位疫苗也因能表达的抗原数量有限和存在抗原漂移的风险，需要重复多次的免疫才能达到预期免疫效果；DNA疫苗也因仅限于对载体上编码的蛋白产生免疫保护，而存在整合到宿主基因组的风险。
减毒活疫苗通过基因工程方法缺失或者突变与沙门菌新陈代谢或者毒力相关的基因，构建出对人和动物致病力显著降低，且不改变自身良好的免疫原性的沙门菌减毒株，这类疫苗具有使用方便、免疫性好和环境良好等优点，且免疫效果牢固，免疫持续期长，既可以诱导宿主产生体液免疫也可以诱导细胞免疫，在鸡群的不同日龄均可接种。众多研究表明，沙门菌减毒活疫苗对预防沙门菌在宿主肠道定植和全身性感染具有良好的效果。减毒活疫苗由于自身的诸多优势，已经成为多种致病菌疫苗研究的热点，现阶段国内许多机构通过敲除毒力基因构建减毒株并应用于临床，具有良好的效果。
肠炎沙门菌非编码小RNA RyhB-1具有调节铁代谢稳态、氧化应激等生命活动的能力，能在肠道内低氧环境下帮助细菌寻找更有利生存环境的调控机制，而且RyhB-1被证实在肠道环境下对宿主致病性具有调控作用，可在转录后水平调控由SPI-1编码的T3SS效应蛋白SopE的表达，效应蛋白SopE是位于SPI-1外的可激活宿主细胞Rho家族成员的小GTPases Rac1和Cdc42的鸟苷酸交换因子，能活化宿主细胞内的PAK及肌球蛋白MYO6的级联放大反应使上皮细胞F-肌动蛋白聚合、膜褶皱从而引起胞吞作用，促使沙门菌内化进入细胞内。而且SopE能够进一步的诱导基质细胞caspase-1活化从而触发IL-1和IL-18的释放，引发肠道黏膜炎症反应。因此ryhB-1和sopE基因的缺失可影响T3SS-1的关键功能，降低肠炎沙门菌对宿主的侵袭力和毒力，可作为肠炎沙门菌减毒疫苗候选株减毒基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种肠炎沙门菌ryhB-1和sopE双基因缺失株及其制备的减毒活疫苗和应用，以达到预防肠炎沙门菌感染的作用。
为了实现以上目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明首先提供了一种肠炎沙门菌ryhB-1和sopE双基因缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE，其特征在于所述的基因缺失株同时不含有ryhB-1基因和sopE基因，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20221957，保藏日期为2022年12月13日，保藏分类命名为肠道沙门菌SE50336ΔryhB-1ΔsopE(Salmonella enterica SE50336ΔryhB-1ΔsopE)，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
优选的，所述肠炎沙门菌ryhB-1和sopE双基因缺失株为ryhB-1和sopE基因同时不表达的肠炎沙门菌。
野生型肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis)为现有技术，具体可使用的肠炎沙门菌包括但不限于：野生型肠炎沙门菌50336。所述野生型肠炎沙门菌C50336来源：中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CMCC(B)50336。
进一步的，被缺失的ryhB-1基因序列为SEQ ID NO:1所示；被缺失的sopE基因如SEQ ID NO:2所示。
进一步的，所述减毒株还可经过其他基因改造。
所述的其他基因改造是指除ryhB-1和sopE基因缺失以外的基因改造，可以是单个目标基因或为多个目标基因的改造。目标基因并不特指，可以根据研究需要设定并改造。理论上可以不断对其进行基因改造，对于目标基因的改造数量可以按照需要操作，没有特别限制。基因改造方法包括但不限于目标基因的插入和缺失等。
本发明还提供上述肠炎沙门菌ryhB-1和sopE双基因缺失株构建方法，利用PCR技术扩增出两端与肠炎沙门菌sopE基因上、下游序列同源且中间为氯霉素抗性基因的DNA片段，电击转化入含有质粒pKD46的SE50336感受态细胞中，筛选后获得替换sopE的阳性克隆SE50336ΔsopE::Cat，再电转入温度敏感型质粒pCP20以消除氯霉素抗性基因，构建肠炎沙门菌基因缺失株SE50336ΔsopE；接着以单基因缺失株SE50336ΔsopE为出发菌株，利用Red同源重组技术以相同的方法将ryhB-1基因敲除，得到目的菌株SE50336ΔryhB-1ΔsopE。
进一步的，sopE基因片段的扩增引物包括P1和P2；所述P1的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示，所述P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步的，SE50336ΔsopE::Cat的鉴定引物为P3和P4，所述P3的核苷酸序列如SEQID NO:5所示，所述P4的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
进一步的，ryhB-1基因片段的扩增引物为P5和P6，所述P5的核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示，所述P6的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
进一步的，SE50336ΔryhB-1ΔsopE的鉴定引物为P7和P8，所述P7的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述P8的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明进一步提供了所述基因缺失型肠炎沙门菌减毒疫苗候选株在制备禽肠炎沙门菌疾病的活疫苗或制备防治肠炎沙门菌感染药物中的应用。
进一步的，用于检测鸡细胞因子的引物序列如SEQ ID NO:11～22所示。
本发明提供了一种肠炎沙门菌减毒活疫苗，含有前述肠炎沙门菌ryhB-1和sopE双基因缺失株。
进一步的，所述活疫苗中含有佐剂。
有益效果
本发明构建的减毒疫苗候选株具有以下优势：1.选择的减毒基因是肠炎沙门菌中非编码小RNAryhB-1，ryhB-1作为全局调控因子可以促进T3SS-1侵袭相关基因的表达，因此ryhB-1基因的敲除相较于单个毒力基因的敲除大大降低了肠炎沙门菌对雏鸡的致病性，安全性试验证明了缺失株在雏鸡体内和细胞内的定殖、侵袭能力均显著下降，具有更好的安全性；2.免疫接种方式为口服，相较于肌肉注射方式，有效的避免了小日龄雏鸡因肌肉注射而产生应激反应，在实际应用中更适合所有日龄的鸡接种；减毒株经口服途径免疫雏鸡后，能够诱导产生良好的体液免疫和细胞免疫应答，两次的口服接种免疫能够有效预防鸡肠炎沙门菌野毒株的感染，为雏鸡提供近70％的保护率。3.在评估肠炎沙门菌减毒株的生物安全性前，开展试验探究雏鸡口服接种的最小剂量，相较于其他减毒疫苗株直接采取单一剂量进行免疫，我们采用统一的评分标准对不同剂量下雏鸡的精神、粪便状态及存活率进行评分，保护效力评估方法更科学、安全。本发明可应用于制备针对禽肠炎沙门菌的商品化减毒活疫苗和对禽肠炎沙门菌疾病的防控。
附图说明
图1为本发明肠炎沙门菌SE50336ΔryhB-1ΔsopE缺失株的PCR验证；
其中，M：100bp DNALadder；Lane1：SE50336；Lane2：带氯霉素抗性基因的sopE片段；Lane3：SE50336ΔryhB-1ΔsopE缺失株；
图2为本发明对肠上皮细胞Caco-2黏附力测定；
图3为本发明对肠上皮细胞Caco-2侵袭力测定；
图4为本发明在脾脏上载菌量测定；
图5为本发明在肝脏上载菌量测定；
图6为本发明在小肠上载菌量测定；
图7为本发明免疫后雏鸡血清IgG抗体水平测定；
图8为本发明免疫后雏鸡血清IgG抗体消长曲线；
图9为本发明免疫后雏鸡黏膜IgA抗体水平测定；
图10-14为本发明免疫后雏鸡外周血淋巴细胞中细胞因子表达量测定。
其中，*，p<0.05；**，p<0.01。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步的详细描述，以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
实施例中所使用的实验方法，例如常规的分子生物学技术、细胞培养、抗体水平检测等如无特殊说明，均为常规方法。
本发明所述基因缺失型肠炎沙门菌减毒疫苗候选株的具体构建方法是：利用PCR技术扩增出两端与肠炎沙门菌sopE基因上、下游序列同源且中间为氯霉素抗性基因的DNA片段，电击转化入含有质粒pKD46的SE50336感受态细胞中，筛选后获得替换sopE的阳性克隆(SE50336ΔsopE::Cat)，再电转入温度敏感型质粒pCP20以消除氯霉素抗性基因，成功构建了肠炎沙门菌基因缺失株SE50336ΔsopE；接着以单基因缺失株SE50336ΔsopE为出发菌株，利用Red同源重组技术以相同的方法将ryhB-1基因敲除，即得到目的菌株SE50336ΔryhB-1ΔsopE。接着以1日龄如皋黄鸡为模型，比较基因缺失株和野生株之间的毒力差异，进一步的体内、体外安全性试验结果表明，基因缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE的毒力显著低于野毒株SE50336，在体内、体外均具有良好的安全性；接种后能够刺激鸡群机体诱发全面高效的体液、细胞免疫；攻毒后保护试验表明其具有良好的保护效果可保护鸡群免于发病；因此本发明所构建的肠炎沙门菌缺失株具有作为肠炎沙门菌减毒疫苗候选株的潜力。
实施例1肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis)减毒疫苗候选株SE50336ΔryhB-1ΔsopE的构建
1.试验材料和方法
1.1菌株
野生型肠炎沙门氏菌50336来源于中国医学微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CM CC(B)50336。
1.2肠炎沙门菌ryhB-1和sopE双基因缺失株的构建
本发明提供的肠炎沙门菌ryhB-1和sopE双基因缺失株是利用Red同源重组技术构建的，具体包括以下步骤：
1.2.1引物设计
根据Genebank中已发布的肠炎沙门菌中sopE的基因序列设计引物，对SE50336中sopE基因片段进行测序鉴定设计出P1、P2(带有氯霉素抗性的同源臂扩增引物)；P3、P4(鉴定引物)，上述引物均由南京擎科生物公司合成，具体序列如下表1-1：
表1-1PCR引物序列以及扩增片段大小
1.2.2带氯霉素抗性基因的PCR产物制备与纯化
以pKD3质粒为模板，P1、P2为引物进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃ 30s，53℃ 1min，72℃ 1min，10个循环，94℃ 30s，63℃ 1min，72℃ 1min，25个循环，72℃延伸10min；PCR反应体系(50μL)参考表1-2；反应结束后利用琼脂糖凝胶电泳检测鉴定，试剂盒回收纯化PCR产物，电泳结果如图1所示。
表1-2PCR扩增反应体系
1.2.3感受态细胞的制备以及pKD46质粒的转化
挑取LB平板上划线分离活化的肠炎沙门氏菌SE50336，37℃160rpm过夜培养8-12h，次日以1:100比例将过夜培养的菌株转接入新鲜的LB培养基，37℃160rpm振荡培养至OD600值为0.4～0.6时，将菌液分装至10mL离心管中，放置4℃冰浴30min，4℃4000rpm离心10min，收集菌体；菌体用等体积超纯水重悬，4℃4000rpm离心10min，收集菌体，将菌体再次用10％ CaCl2-甘油重悬，4℃冰浴30min，4℃4000rpm离心10min，并且重复一次，最后将菌体沉淀用1/100体积的10％CaCl2-甘油重悬，100μL/管分装后于-70℃保存备用。
次日取50ng pKD46质粒加到SE50336感受态细胞中，吹打混匀后吸取100μL至预冷的电极杯中(参数为2200V，25μF，200Ω)电击一次，立即吸出至1mL LB液体培养基，反复吹打混匀。于37℃，160rpm培养15-20min，4000rpm离心5min，弃去900μL上清，剩余菌液直接涂布Amp抗性(100ng/mL)LB平板，放入30℃培养箱倒置培养过夜。
1.2.4Red重组酶诱导和带氯霉素抗性PCR产物片段的电转化
将鉴定正确的pKD46阳性转化子接种于4mLAmp抗性LB液体培养基，过夜培养后1:100转接入40mL含Amp抗性LB液体培养基，30℃160rpm培养至OD600为0.2～0.3；加入L-阿拉伯糖至终浓度为30mmol/L，继续培养诱导1h，使pKD46质粒中的Exo、Beta、Gam三种同源重组酶充分表达；冰浴30min后，4000rpm离心7min，按1.2.3方法重悬菌体3次，最后用1mL 10％甘油重悬菌体，100μL/支分装，于-70℃保存备用。
将1.2.2纯化的带氯霉素抗性PCR产物100-300ng与100μL含pKD46质粒的电感受态细胞混合后，立即加到预冷的电极杯中，2200v电击一次，立即吸出至1mL LB液体培养基，吹打混匀后于30℃，160rpm培养1-2h，取出后4000rpm离心5min，弃去900μL上清后剩余菌液均涂布至含有Cm(34ng/mL)和Amp(100ng/mL)抗性的LB平板，倒置放入30℃培养箱，静置20h。
1.2.5一次重组菌的PCR鉴定
挑取可在Cm和Amp双抗性平板上生长的单菌落，并接种于含双抗的LB液体培养基，37℃，160rpm培养12h后，通过煮沸法提取基因组DNA为模板，利用缺失鉴定引物P3、P4进行鉴定，若得到长度为1161bp的单一条带即视为一次重组菌SE50336ΔsopE::cat构建成功。PCR体系见表1-3，电泳结果如图1所示：
表1-3PCR扩增反应体系
PCR扩增条件如下：95℃3min；95℃1min，54℃45s，72℃1min，30个循环；72℃延伸7min。1.2.6pKD46质粒的消除
将1.2.5鉴定正确的一次重组菌接种于Cm抗性的LB液体培养基，42℃160rpm培养8～10h后传代，重复传代6～8次，在Cm抗性LB平板上划线进行鉴定，37℃过夜培养后挑取单菌落接种Amp抗性和Cm抗性LB液体培养基，结果具有Cm抗性而不具有Amp抗性的单菌落为成功消除pKD46质粒的一次重组菌，鉴定正确的一次重组菌命名为SE50336ΔsopE::cat。
1.2.7FLP酶介导的二次重组
按照1.2.3方法将已消除pKD46质粒的一次重组菌制成感受态细胞，电转化导入pCP20质粒，涂布于含Amp抗性和Cm抗性LB平板，30℃培养过夜。将阳性转化子接种于无抗性的LB液体培养基中，42℃振荡培养8～10h传代，重复4～6次后，在LB平板上划线置37℃培养箱培养过夜。次日各挑取3个单菌落接种LB液体培养基，8～10h后进行Amp和Cm抗性检测，筛选同时对两种抗生素敏感的二次重组菌。
1.2.8二次同源重组菌的PCR鉴定
将1.2.7获得的已消除pCP20质粒的二次重组菌提取基因组DNA为模板、P3、P4为鉴定引物进行PCR扩增，体系以及条件均与1.2.5中一致，将鉴定正确的菌株命名为SE50336ΔsopE。
根据GeneBank已发布的肠炎沙门菌中ryhB-1的基因序列设计引物，对50336中ryhB-1基因片段进行测序鉴定，设计P5、P6(带有氯霉素抗性的同源臂扩增引物)；P7、P8(鉴定引物)，利用Red同源重组技术以相同的方法敲除ryhB-1基因，即得到目的菌株SE50336ΔryhB-1ΔsopE，引物序列见表1-4：
表1-4PCR引物序列以及扩增片段大小
以P3、P4为鉴定引物进行扩增，若得到长度为231bp的单一条带视为二次同源重组菌SE50336ΔryhB-1ΔsopE构建成功，将PCR鉴定正确后的菌株命名为SE50336ΔryhB-1ΔsopE，即得到目的菌株，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
实施例2肠炎沙门菌减毒疫苗候选株SE50336ΔryhB-1ΔsopE的安全性评估
1、试验材料：实施例1所构建的肠炎沙门菌基因缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE。
2、试验方法
活化基因缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE，次日按1:100比例转接至LB液体培养基中培养后，用无菌PBS洗去培养基成分，并用PBS重悬调整细菌数量。通过对雏鸡的半数致死量(LD50)测定、对肠上皮细胞Caco-2上黏附和侵袭力测定及鸡群体内定植试验，对肠炎沙门菌SE50336ΔryhB-1ΔsopE缺失株在体内和体外的安全性进行评估。
试验例1：肠炎沙门菌减毒疫苗候选株SE50336ΔryhB-1ΔsopE LD50的测定
1、试验材料：
供试样品：实施例1所构建的肠炎沙门菌缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE；回补株SE50336ΔryhB-1ΔsopE/pryhB-1psopE。
对照：PBS；
2、试验方法
将200只1日龄如皋黄鸡随机分成4组(3个攻毒组、1个对照组)，分组情况及攻毒剂量见表2-1。各攻毒组和对照组隔离饲养，各组在相同条件下按照相同饲养程序饲养14天(育雏温度37℃，育雏料不含任何抗生素，保证饮水和采食)。
表2-1试验动物分组及攻毒剂量
3、试验结果
各攻毒组死亡情况及半数致死量详见表2-2，与野生株SE50336相比，缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE的半数致死量明显上升，毒力下降；与回补株SE50336ΔryhB-1ΔsopE/pryhB-1psopE相比，缺失株半数致死量上升，毒力减弱，表明肠炎沙门菌野生株SE50336敲除ryhB-1、sopE基因后，毒力显著下降。
表2-2SE50336、SE50336ΔryhB-1ΔsopE、SE50336ΔryhB-1ΔsopE/pryhB-1psopE半数致死量
试验例2：肠炎沙门菌减毒疫苗候选株SE50336ΔryhB-1ΔsopE对肠上皮细胞Caco-2黏附、侵袭力测定
1、试验材料：
供试样品：实施例1所构建的肠炎沙门菌缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE；
对照：野生株SE50336；单基因缺失株SE50336ΔryhB-1；
2、试验方法
复苏肠上皮细胞Caco-2，以含20％ FBS的DMEM培养基，37℃、5％ CO2培养条件下静置培养、传代。待细胞长满细胞瓶底，加900μL 0.25％胰酶，37℃消化5min，待消化完全后加1mL完全培养基终止消化，按1:5比例继续传代，活化3代后铺96孔板，每孔细胞数为104个。复苏野生株SE50336、双缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE及相应回补株，活化后培养至OD600＝1.0，4000rpm离心4min后收集菌体，用DMEM培养基重悬并调整菌液浓度，按照MOI值为100:1比例将100μL菌液加到96孔板，每株菌3个重复。37℃孵育1h后弃去培养基，用PBS轻洗3遍；每孔加入200μL 0.5％TritonX-100，37℃裂解20～30min；将裂解液转到无菌离心管后，每孔加入100μL PBS洗涤并收集至离心管中，重复3次，共收集500μL孵育液，取50μL孵育液10倍倍比稀释，设置10-1、10-2、10-3稀释度滴板，37℃培养12h后进行细菌计数，重复3次，测定缺失株对肠上皮细胞Caco-2的黏附力。
按上述方法取100μL DMEM重悬的菌液加到96孔板，37℃孵育1h，弃去培养基，PBS轻洗3遍；每孔加入100μg/mL的庆大霉素100μL，继续培养1h，弃去培养基，PBS轻洗3遍；每孔加入200μL0.5％ TritonX-100，37℃裂解20～30min；将裂解液转到无菌离心管后，用无菌PBS对裂解液进行10倍倍比稀释，滴板计数，试验重复3次，测定缺失株对肠上皮细胞Caco-2的侵袭力。
3、试验结果
试验结果如图2和图3所示：与野生株相比，SE50336ΔryhB-1ΔsopE缺失株对Caco-2细胞的黏附力和侵袭力均显著下降(p<0.05)，回补株黏附和侵袭力则高于缺失株。体外细胞试验表明ryhB-1和sopE基因的缺失减弱了肠炎沙门菌对肠上皮细胞的黏附能力和侵袭能力，毒力显著降低。
试验例3：肠炎沙门菌减毒疫苗候选株SE50336ΔryhB-1ΔsopE口服接种最小剂量测定
1、试验材料：
供试样品：实施例1中所构建的肠炎沙门菌缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE；
对照：野生株SE50336；PBS；
2、试验方法
60只3日龄如皋黄鸡随机分成3组，2个实验组(SE50336组、SE50336ΔryhB-1ΔsopE组)和1个空白对照组。每组20只，将野生株SE50336、缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE分别以5×108、1×109、5×109、1×1010CFU剂量对雏鸡进行口服接种，接种剂量均为0.2mL/羽。各组雏鸡灌胃前12h断食，4h断水，提前30min口服0.5％碳酸氢钠溶液以中和胃酸。接种后两周内持续观测鸡群精神状态和排便情况，两周后，扑杀所有试验鸡，记录各组鸡群的精神状况和脏器病变特点。
3、试验结果
持续观察接种后2周内，不同剂量下各试验组鸡群的存活情况，结果显示鸡群在口服接种1×109CFU/mL剂量时，缺失株50336ΔryhB-1ΔsopE组的存活率为100％，而此接种剂量下野生株50336组的存活率为80％；临床观察结果显示缺失株组鸡群精神状态良好，粪便颜色正常，未见不良反应，而野生株组内有个别鸡出现精神沉郁、嗜睡及腹泻等肠炎沙门菌感染的典型症状。结合以上结果，将1×109CFU/mL定为免疫保护试验的最小接种剂量。
试验例4：肠炎沙门菌减毒疫苗候选株SE50336ΔryhB-1ΔsopE在鸡群体内定植试验
1、试验材料：
供试样品：实施例1中所构建的肠炎沙门菌缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE；
对照：野生株SE50336；PBS；
2、试验方法
90只3日龄如皋黄鸡随机分成3组，每组30只，2个试验组(SE50336组、SE50336ΔryhB-1ΔsopE组)和1个空白对照组；各试验组雏鸡均以无抗生素饲料和无菌水饲喂。试验组雏鸡以1×109CFU/mL剂量口服接种，接种剂量均为0.2mL/羽，空白组以等量灭菌PBS代替。于接种后第3、5、7、10、14天时，每组随机选取3只鸡剖杀，无菌取脾脏、肝脏和小肠，称重、研磨后细菌计数。
3、试验结果
接种后雏鸡脾脏、肝脏、小肠上载菌量结果如图4-图6所示：试验期间，缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE组雏鸡脏器上载菌量均低于野生株SE50336组，与接种后第5、7、10、14天相比，各试验组在接种后第3天时脏器上的载菌量达到最高；在接种后第14天，缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE组雏鸡脏器上仍可分离出细菌，说明缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE接种后不会被机体快速清除。
以上试验结果表明：缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE相较于野生株SE50336，在雏鸡体内毒力显著下降，且接种后能够在鸡群体内定植一段时间，刺激机体产生免疫应答，不会被快速清除。
实施例3肠炎沙门菌减毒疫苗候选株SE50336ΔryhB-1ΔsopE的免疫原性评估
1、试验材料：
供试样品：实施例1所构建的肠炎沙门菌缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE；
对照：野生株SE50336；PBS；
2、试验方法
利用LB培养基活化并培养细菌，用灭菌的PBS洗去多余的培养基成分，调整细菌数为1×109CFU/200μL。处理后的菌液口服途径免疫1日龄如皋黄鸡，初次免疫两周后，以相同的剂量和途径进行二免。初免后每隔1周无菌心脏采血一次，共采血4次，将采集的血液样品分离血清后，测定免疫后雏鸡血清特异性IgG抗体水平；同时初免后每隔1周采集2cm小肠用于测定黏膜特异性IgA抗体水平；初免后每隔1周采集无菌心脏抗凝血，分离出淋巴细胞后利用qRT-PCR方法测定淋巴细胞中细胞因子的表达量，对肠炎沙门菌SE50336ΔryhB-1ΔsopE缺失株接种后雏鸡的免疫效果进行评估。
试验例1：肠炎沙门菌减毒疫苗候选株SE50336ΔryhB-1ΔsopE免疫后鸡群血清IgG抗体水平测定
1、试验材料：
供试样品：实施例1中所构建的肠炎沙门菌缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE；
对照：野生株SE50336；PBS；
2、试验方法
将120只1日龄如皋黄鸡随机分成3组，2个试验组(SE50336、SE50336ΔryhB-1Δsop E)和1个空白对照组，每组40只，各试验组均以1×109CFU/200μL的剂量对雏鸡进行口服免疫。初免两周后，所有试验组以相同的剂量和方式进行二免。
初次免疫后每隔1周无菌采集心脏血，直至二次免疫后的第二周，共采血4次，同时取1日龄非免疫组雏鸡血清作为阴性血清。利用D群沙门氏菌特异性抗体检测试剂盒测定免疫后雏鸡血清中IgG抗体水平，并绘制血清抗体消长规律。
3、试验结果
以1×109CFU/mL剂量口服免疫两次后，各试验组鸡群血清特异性IgG抗体检测结果和阳性率如表3-1和表3-2所示：在第一次接种后第14天各试验组均可检测到抗体阳性雏鸡，缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE组雏鸡抗体的阳性率随着免疫天数的增加也不断上升，在免疫后第28天SE50336、SE50336ΔryhB-1ΔsopE两组的阳性率均达到100％。
按照试剂盒说明书方法计算各试验组雏鸡血清IgG抗体滴度，测定结果如图7所示。随着免疫天数的增长，SE50336、SE50336ΔryhB-1ΔsopE两组血清IgG抗体水平均呈上升趋势，空白组血清抗体维持在较低水平；在二免一周时，SE50336组、SE50336ΔryhB-1ΔsopE组血清IgG抗体水平均显著高于空白组(p<0.05)，在二免二周时，SE50336ΔryhB-1ΔsopE组抗体水平达到峰值，略高于SE50336组，此时两组的抗体水平均显著高于空白组(p<0.01)。
根据免疫期间各试验组雏鸡血清IgG特异性抗体水平测定结果，绘制抗体水平随时间变化的消长规律折线图，如图8所示。结果显示随着免疫天数的增加，野生株SE50336、缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE免疫后雏鸡血清IgG抗体水平均不断增长，缺失株组雏鸡血清抗体水平在免疫后第28天达到最高值，表明缺失株口服免疫后可诱导机体内长久、高效的体液免疫。
表3-1免疫后各组雏鸡抗体检测结果
注：“-”表示肠炎沙门菌抗体检测结果为阴性，“+”表示肠炎沙门菌抗体检测结果为阳性。
表3-2各组鸡群在不同天数的阳性率(％)
试验例2：肠炎沙门菌减毒疫苗候选株SE50336ΔryhB-1ΔsopE免疫后雏鸡黏膜IgA抗体水平测定
1、试验材料：
供试样品：实施例1所构建的肠炎沙门菌缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE；
对照：野生株SE50336；PBS；
2、试验方法
每次免疫后采集各试验组雏鸡的小肠黏膜样品，以采集的肠黏膜样品作为一抗，间接ELISA法测定免疫后雏鸡黏膜IgA抗体水平。
3、试验结果
连续4周免疫期间，各试验组雏鸡肠黏膜IgA抗体水平如表3-3和图9所示。在二免一周时，SE50336、SE50336ΔryhB-1ΔsopE两组均可检测到黏膜IgA抗体，二次加强免疫后，两组雏鸡黏膜IgA抗体水平明显上升，二免二周时，SE50336ΔryhB-1ΔsopE组雏鸡IgA抗体水平达到最高，略高于SE50336组，此时两组抗体水平均显著高于空白对照组(p<0.05)，以上结果表明缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE免疫雏鸡后能够诱导机体内良好的黏膜免疫。
表3-3各组雏鸡黏膜IgA抗体检测结果
注：“*”表示与对照组相比有显著性差异(p<0.05)。
试验例3：肠炎沙门菌减毒疫苗候选株SE50336ΔryhB-1ΔsopE免疫后雏鸡淋巴细胞中细胞因子表达量测定
1、试验材料：
供试样品：实施例1所构建的肠炎沙门菌缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE；
对照：野生株SE50336；PBS；
2、试验方法
根据GenBank上发布的基因序列，设计用于检测鸡细胞因子IL-6、IL-10、IL-1β、IFN-γ、TNF-α、β-actin表达量的荧光定量引物，引物由南京擎科生物公司合成。引物序列见表3-4：
表3-4RT-PCR引物序列及目的片段长度
首次免疫后每隔1周每组随机抽取5只鸡，进行无菌心脏采血，一免二周后以相同的剂量和接种方式进行二免，共采集4次。使用鸡外周血淋巴细胞分离试剂盒分离淋巴细胞，对分离得到的细胞进行总RNA的提取，并测定RNA浓度。接着利用反转录试剂盒合成cDNA，采用实时荧光定量PCR法测定相关细胞因子的相对表达量，对同一cDNA样品设置3个相同反应体系，以做重复性检测，得到的数据以SPSS25软件进行显著性差异分析。
3、试验结果
在免疫后连续4周试验期内，多种细胞因子参与肠炎沙门菌的免疫反应。IL-6、IL-10在感染后起到免疫调节作用，促进B细胞的分化和抗体的产生，图10和图11显示了野生株SE50336、缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE免疫初期IL-6、IL-10的表达量较低，二次免疫后表达量显著上调，促进机体抗体的分泌。免疫初期由于细菌在机体内定植，引起了IL-1β高水平表达，图12显示了一免一周时，野生株SE50336、缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE两组的表达量均显著高于空白组(p<0.01)，随着细菌在体内的定植量下降，IL-1β的表达量逐渐降低。IFN-γ可激活巨噬细胞，刺激B细胞分化和增殖，产生免疫球蛋白，发挥抗菌活性，TNF-α可参与自身的免疫反应，并促使其他细胞因子的合成和释放，两者的表达量反映出宿主的细胞免疫水平，图13和图14显示了野生株SE50336、缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE二次免疫后IFN-γ、TNF-α细胞因子的表达量稳定上调，免疫期间两试验组的表达量均显著高于空白组(p<0.05)，发挥机体清除细菌的作用。值得注意的是，SE50336ΔryhB-1ΔsopE与SE50336组的细胞因子表达量之间差异不显著(p>0.05)，表明将肠炎沙门菌中调控因子ryhB-1和毒力基因sopE作为减毒基因的缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE毒力降低，但仍具有良好的免疫原性，接种后可在雏鸡体内诱导高效、持久的细胞免疫应答。
实施例4肠炎沙门菌减毒疫苗候选株SE50336ΔryhB-1ΔsopE的免疫保护力评估
1、试验材料：实施例1所构建的肠炎沙门菌缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE；
对照：野生株SE50336；PBS；
2、试验方法
鸡群免疫攻毒试验分组见表4-1。将30只如皋黄鸡随机分成3组，设置野生株组(SE50336)、缺失株组(SE50336ΔryhB-1ΔsopE)和健康对照组，每组10只鸡。除健康对照组外，各试验组均在二免后第三周，以肠炎沙门菌标准株SE50336 100×LD50剂量进行攻毒，观察攻毒后2周内各试验组鸡群的临床症状、剖检脏器的大体病变和组织病理切片对发病症状进行计数、评分。
表4-1鸡群免疫-攻毒试验程序
试验例1：肠炎沙门菌减毒疫苗候选株SE50336ΔryhB-1ΔsopE免疫后攻毒鸡群临床症状观察
1、试验材料：
供试样品：实施例1所构建的肠炎沙门菌缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE；
对照：野生株SE50336；PBS；
2、试验方法
二次免疫后，各试验组鸡群均以口服接种方式感染肠炎沙门菌标准株SE50336，剂量为100×LD50 0.2mL/只。持续观察攻毒后14天内各试验组鸡群的精神状态和粪便情况，根据临床症状评分标准对各试验组鸡群进行评分，以评估缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE对鸡群的保护效果，临床症状的评分标准见表4-2：
表4-2临床症状评分标准
3、试验结果
免疫后攻毒各试验组鸡群的临床症状评分结果如表4-3所示，结果显示缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE免疫后鸡群精神沉郁和腹泻症状评分均低于野生株SE50336；临床观察可见SE50336组鸡群出现皮毛凌乱、精神沉郁和腹泻症状，而SE50336ΔryhB-1ΔsopE与健康对照组鸡群精神状态良好，较活跃，粪便成型，未见明显症状。以上结果表明缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE两次口服免疫后能够有效减轻鸡群感染禽肠炎沙门菌后精神沉郁和腹泻临床症状的出现，为鸡群提供良好的保护作用。
表4-3临床症状平均评分结果
注：“*”表示与健康对照组有显著性差异(p<0.05)。
试验例2：肠炎沙门菌减毒疫苗候选株SE50336ΔryhB-1ΔsopE免疫后攻毒鸡群大体剖检观察结果
1、试验材料：
供试样品：实施例1中所构建的肠炎沙门菌缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE；
对照：野生株SE50336；PBS；
2、试验方法
攻毒2周后，对各试验组鸡群进行剖检，无菌取心脏、肝脏、脾脏，观察并记录脏器的病理变化，对心脏、肝脏、脾脏的病变程度进行评分，根据脏器病理变化评分标准对各试验组鸡群进行评分，以评估缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE对鸡群的保护效果病理变化及评分标准见表4-4。
表4-4脏器病理变化评分标准
发病判定标准如下：
(1)死亡
(2)观察周期内有一天(或以上)临床症状(见评分表格)评分不低于2分或者观察周期内连续三天(或以上)临床症状(见评分表格)评分不低于1分。
(3)剖检后肝脏或者脾脏病理变化不低于1分。
3、试验结果
攻毒2周后，各试验组脏器剖检病变评分结果见表4-5：结果显示缺失株SE50336Δryh B-1ΔsopE免疫后鸡群脏器病变评分低于野生株SE50336；SE50336组鸡群心脏、肝脏可见白色结节和出血点，脾脏轻微肿大，而SE50336ΔryhB-1ΔsopE与健康对照组鸡群脏器颜色正常，剖检脏器未见病变。以上结果表明缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE口服免疫雏鸡后能够有效减轻禽肠炎沙门菌感染对脏器的损伤，具有良好的保护效果。
表4-5病理变化平均评分结果
注：“*”表示与健康对照组有显著性差异(p<0.05)。
攻毒保护率结果如表4-6所示：结果表明，缺失株SE50336ΔryhB-1ΔsopE免疫后鸡群发病率显著低于野生株SE50336组，两次的口服免疫能有效预防禽肠炎沙门菌的感染，为鸡群提供近70％的保护率，高于野生株自身天然免疫所提供的10％保护率。
表4-6攻毒保护率结果
上述实施例仅示例性说明本发明的较佳实施例，而非对本发明任何形式和实质上的限制。任何熟知此技术的人士在不违背本发明的精神及范畴下，还可对上述实施例进行改进、修饰或补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切些许改动、等效修饰或者改变，均仍属于本发明的权利要求范围内。
SEQ ID NO:1
tgcgttcaggggaacccctacggagaacctgaaagcacgacattgctcacattgcttccagtattattttggccagcttttgctggcttttttttt
SEQ ID NO:2
aaaaacaggaaaccacaccactaaaagaaaaatcaaccgagaaaaattctttagcaaaaagtattctcgcagtaaaaaatcacttcatcaaattaa
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SEQ ID NO:3ctaaaagaaaaataaaccgagaaaaattctttagcaaaaagtattctcgctgtgtaggctggagctgcttcg
SEQ ID NO:4atagcacacttcattaaacagcggtacaacttctgtcataatgatcttctccatatgaatatcctcctta
SEQ ID NO:5aaaaacaggaaaccacacca
SEQ ID NO:6tttgttggaattgctgtgga
SEQ ID NO:7ttttgcaaaaagaagtagacaagtgcgaatgagaatgattattattgccttgtgtaggctggagctgcttcg
SEQ ID NO:8agcacttcccggggacaaaatgacaagtaagccaggctgaaacaaaaccccatatgaatatcctccttag
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SEQ ID NO:18ccctcacggtcttctccataaa
SEQ ID NO:19gagatgctgcgcttctacac
SEQ ID NO:20ccatggctttgtagatcccgt
SEQ ID NO:21tgggcatcaagggctaca
SEQ ID NO:22tcgggttggttggtgatc

Claims (10)

1.肠炎沙门菌ryhB-1和sopE双基因缺失株，其特征在于，所述的肠炎沙门菌ryhB-1和sopE双基因缺失株中的ryhB-1基因和sopE基因同时被敲除，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20221957。
2.根据权利要求1所述的肠炎沙门菌ryhB-1和sopE双基因缺失株，其特征在于，所述的ryhB-1基因序列为SEQ ID NO:1所示；所述的sopE基因如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1或2所述的肠炎沙门菌ryhB-1和sopE双基因缺失株构建方法，其特征在于，利用PCR技术扩增出两端与肠炎沙门菌sopE基因上、下游序列同源且中间为氯霉素抗性基因的DNA片段，电击转化入含有质粒pKD46的SE50336感受态细胞中，筛选后获得替换sopE的阳性克隆SE50336ΔsopE::Cat，再电转入温度敏感型质粒pCP20以消除氯霉素抗性基因，构建肠炎沙门菌基因缺失株SE50336ΔsopE；接着以单基因缺失株SE50336ΔsopE为出发菌株，利用Red同源重组技术以相同的方法将ryhB-1基因敲除，得到目的菌株SE50336ΔryhB-1ΔsopE。
4.根据权利要求3所述的肠炎沙门菌ryhB-1和sopE双基因缺失株构建方法，其特征在于，sopE基因片段的扩增引物包括P1和P2；所述P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
5.根据权利要求3所述的肠炎沙门菌ryhB-1和sopE双基因缺失株构建方法，其特征在于，SE50336ΔsopE::Cat的鉴定引物为P3和P4，所述P3的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述P4的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
6.根据权利要求3所述的肠炎沙门菌ryhB-1和sopE双基因缺失株构建方法，其特征在于，ryhB-1基因片段的扩增引物为P5和P6，所述P5的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述P6的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
7.根据权利要求3所述的肠炎沙门菌ryhB-1和sopE双基因缺失株构建方法，其特征在于，SE50336ΔryhB-1ΔsopE的鉴定引物为P7和P8，所述P7的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述P8的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
8.如权利要求1或2所述的肠炎沙门菌ryhB-1和sopE双基因缺失株在制备禽肠炎沙门菌病活疫苗或制备防治肠炎沙门菌感染药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，用于检测鸡细胞因子的引物序列如SEQ IDNO:11～22所示。
10.一种禽肠炎沙门菌病减毒活疫苗，其特征在于，含有如权利要求1或2所述的肠炎沙门菌ryhB-1和sopE双基因缺失株。
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