KR101605020B1 - 안전성이 강화된 가금티푸스용 백신 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 가금티푸스 예방용 백신 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 가금티푸스 예방용 백신 조성물은 세포성 및 점막성 면역능력 및 야외 균주에 대한 우수한 방어력을 가지면서도, 동물에 주입시 매우 빠르게 사멸되어 체내 잔류량이 적고, 병변을 발생시키기 않으며, 염증반응, 식욕부진 등의 접종에 의한 부작용을 최소화 할 수 있는 우수한 안전성을 갖는 것인바, 가금 산업 분야에서 질병의 예방을 위하여 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

안전성이 강화된 가금티푸스용 백신 조성물{VACCINE COMPOSITION IMPROVED SAFETY FOR FOWL TYPHOID}
본 발명은 가금티푸스 예방을 위한 백신 조성물에 관한 것이다.
가금티푸스(Fowl typhoid)는 가금류에서 패혈증을 일으키는 급성 또는 만성의 세균성 전염병이다. 가금티푸스균(Salmonella Gallinarum)이 그 원인체이며, 닭에서 어린 병아리부터 성계에 이르기까지 모든 주령에 쉽게 감염될 수 있으며 폐사율이 높다. 가금티푸스는 주로 분변을 통하여 경구적으로 감염되지만 생식기관과 계란을 통한 수직감염도 가능하여, 가금티푸스 근절을 어렵게 하고 있다.
현재까지 개발된 가금티푸스 예방용 백신은 경구접종으로는 방어력이 상당히 떨어진다는 한계가 지적되어 왔으며, 실제 이 두 가지 제품도 피하 또는 근육접종을 권장하고 있어, 가금산업 현장에서의 적용을 제한하고 있다. 즉, 주사기를 사용하는 침습적인 접종방법(피하, 근육 접종)은 적용되는 동물의 신체적 스트레스를 유발시키며 접종에 따른 부작용을 일으킬 수 있는 뿐만 아니라, 전문인이 개체마다 직접 접종하여야 하기 때문에 경제적 측면에서도 불리하다.
또한, 시판되고 있는 생균 백신에 포함된 S. gallinarum 9R균주는 세계적으로 백신균주로 사용되고 있으나, 1950년대 개발된 S. gallinarum 9R균주의 생물학적, 생화학적 성상 및 안전성과 면역원성에 차이가 있고, 최근 S. gallinarum 9R균주의 병원성이 복귀되어 안전성이 문제가된 사건이 있었다. 이에 국내에서는 상기 균주를 이용한 백신생산의 허가시 균주의 특성, 실험실적 안전성 및 면역원성, 야외농장에서의 안전성 및 면역원성을 시험하도록 요구하고 있다.
한편, 수지상 세포(Dendritic cell, DC)는 면역계의 가장 강력한 항원 제시 세포(antigen-presenting cells, APC)이다. DC는 병원체가 침입하면 항원을 포획하여 미생물의 시그널에 의한 활성화 후 림프구 공동-자극 분자 측면에서 가공된 항원을 미접촉 T 세포(naive T cell) 및 자극된(primed) T 세포에게 제시하는 림프 기관으로 이동한다(Sousa et al., 1999). T 세포의 발달 및 증식은 활성에 의해 생성되는 사이토카인 미세환경에 의존적이다. 최근, DC가 Th1(T helper cell type)- 또는 Th2-직접 면역반응 DC에 대한 T 세포의 분화 활성을 조절하는 것이 증명된 바 있다(Rissoan et al., 1999). 따라서, DC는 선천성 및 후천성 면역 간 필수적인 연결이다. 또한, 생 살모넬라 균은 감염되어 DC와 같은 숙주 항원 제시 세포 내에서 복제 할 수 있다(Bueno et al., 2008; Rosi et al., 2012). 또한, 살모넬라 감염은 뮤린 DC에서 성숙과 사이토카인 생산을 유도하여, 항원 제시를 위한 세포 및 T 세포의 자극을 프로그래밍할 수 있다(Marriott et al., 1999). 조류 숙주에서 특정 세포 내 및 체액성 면역반응을 유도하는 생 약독화 SG 균주에 대해서는 잘 알려져 있으나(Desin et al., 2013; Barrow, 2007), 닭 DC 및 생 약독화 SG 백신 사이의 상호 작용에 대해서는 잘 알려지지 않았다.
따라서, 가금티푸스의 예방을 위하여 방어력이 우수하면서도, 병원성 복귀 등의 문제가 발생하지 않고, 접종 개체 내에서 잔류, 병변과 같은 부작용이 나타나지 않는 안전한 백신 균주의 개발이 필요하다.
본 발명은 면역활성 유도능 및 방어력이 높으면서도, 안전성이 높아 개체 내에서 접종에 의한 문제를 일으키지 않는 생균 백신용 균주의 개발을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum, KCTC12557BP) 균주를 유효성분으로 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 조류에 접종하는 단계;를 포함하는 가금티푸스 예방 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 KCTC12557BP의 수탁번호를 갖는 살모넬라 엔테리카 혈청 갈리나룸(Salmonella enterica serova Gallinarum)를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 균주를 포함하는 가금티푸스 예방용 사료첨가용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 경구 및 피하용으로 모두 사용할 수 있는 가금티푸스 생균 백신을 개발하고자, 가금티푸스 예방 백신 조성물을 제작하였고, 이를 산란계에 적용한 결과 경구접종으로 충분한 면역 반응 유도 및 효과적인 방어능력과 함께, 체내 잔류가 적어 부작용이 낮은 백신 균주를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum, KCTC12557BP) 균주를 유효성분으로 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물을 제공한다.
상기 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum) 균주는 살모넬라 엔테리카 혈청청 갈리나룸(Salmonella enterica serova Gallinarum)으로, 플라스미드 벡터 시스템 pJHL80-LTB을 새롭게 제조하고, 이를 △lon, △cpxR 및 △asd가 결실된 살모넬라 갈리나룸 균주에 삽입하여 제조된 것으로, 본 발명에서는 JOL1355 균주로 명명하였고, 이를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KRIBB)에 2014년 2월 12일자로 기탁하여, 기탁번호 KCTC12557BP를 부여받았다.
상기 플라스미드 pJHL80-LTB는 아스파테이트 세미-알데히드 디하이드로게나아제(aspartate semi-aldehyde dehydrogenase; asd)(이하 asd라 칭함) 유전자를 지니고 있는데, 이 asd 유전자는 세균의 세포벽 합성에 필수적으로 관여한다. 따라서, asd 유전자를 가진 플라스미드를 asd 유전자가 결손된 세균에 형질전환하는 경우에 형질전환된 세포를 선발하는 방법으로 항생제 저항 유전자를 이용한 선발표지자(selection marker) 대신에 비항생제 표지자(marker)로서 asd 유전자를 사용할 수 있다. 즉, asd 유전자가 결손된 숙주세포로서의 세균은 생존에 필요한 세포벽 합성을 위해 asd 유전자를 반드시 이용해야 하기 때문에, 형질전환 후 살아있는 숙주 세균은 asd 유전자를 포함하고 있는 플라스미드를 반드시 가지고 있게 된다.
또한, 상기 플라스미드 pJHL80-LTB는 비항생제 마커 와 p15A origin, 5ST1 T2 등을 조합하여 단백질분비를 조절할 수 있는 백터를 제작하고 면역증강인자로를 이 벡터에 클로닝(cloning)하여 이 면역증강단백질을 지속적으로 발현할 수 있는 유전자를 포함하고 있어, 형질전환 후에도 균주는 플라스미드를 반드시 가지고 있게 된다.
상기 플라스미드 pJHL80-LTB는 프로모터에 의해 발현이 조절되며, 클로닝된 외래 단백질의 전사 종결은 5ST1T2 (5S rRNA transcription terminator T1T2)의 ρ-독립 전사 종결 서열에 의해 이루어진다. 또한, pJHL165 벡터는 blaSS의 다운스트림에는 His-epitope 유전자가 위치하여, 형질전환 이후에 면역점적법(immunoblotting assay)으로 외래 단백질인 LTB 단백질의 분비를 확인할 때, 항-his-tag 항체(anti-his-tag antibody)를 이용할 수 있게 하여 기존에 이용하는 항혈청 없이 좀 더 간편하게 단백질의 분비를 확인할 수 있게 하였다.
상기 플라스미드 pJHL80-LTB는 낮은 복사 플라스미드로 복제원점으로 p15A ori를 가지고 있어, 플라스미드가 안정적으로 유지된다. 또한, 베타-락타마제(β-lactamase) 신호 염기서열을 암호화하는 DNA 단편을 추가하여 재조합 플라스미드를 더 강화하여, 살모넬라에서 원형질외극(periplasmic space)으로 더욱 효율적으로 전이되도록 하였다.
상게 백신 조성물은 면역 증강용 조성물 일 수 있다.
상기 백신 조성물은 추가적으로 용매, 면역증강제(adjuvant), 부형제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 더 포함할 수 있다. 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수가 있고, 면역증강제로는 프로인트항원보강제(freund's adjuvant), 알루미늄 하이드록사이드 겔, 및 식물성 및 광물성 오일 등이 있고, 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트 등이 있으나 이에 한정되지 않고 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 백신 제조에 사용하는 물질을 더 포함할 수 있다.
상기 백신은 약독화된 생균 백신, 사균 백신, 서브유닛 백신(subunit vaccine), 합성 백신(synthetic vaccine), 유전공학 백신(genetic gengineering vaccine) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있으나, 효과적으로는 생균 백신일 수 있다. 바람직하게는 상기 백신 조성물에 포함되는 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum, KCTC12557BP)은 생균일 수 있다.
상기 생균 백신은 약독화된 살아있는 세균을 포함하는 백신을 의미하고, 상기 약독화(attenuation)란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고 면역체계만을 자극해서 면역원성을 유도할 수 있다. 상기 생균을 백신조성물에 사용하는 경우 면역 효과가 가장 우수하나, 균주의 독성이 회복될 수 있어, 개체 내 감염을 유발하는 부작용이 발생할 수 있다. 본 발명의 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum, KCTC12557BP) 균주를 유효성분으로 포함하는 백신을 생균 백신으로 이용하는 경우, 개체에서 우수한 항체 유도능 및 방어능을 가지면서도, 동무에 주입시 빠르게 사멸하여 상기 균주가 접종된 개체의 장내에 잔류하는 양이 적고, 그 기간도 짧아 백신 균주에 의한 개체의 부작용의 가능성이 매우 적고 안전성이 우수하여, 부작용없이 가금티푸스의 감염을 예방 할 수 있다.
상기 사균 백신은 불활화 백신 또는 사독 백신이라고도 하며, 죽은 세균을 포함하는 백신이다. 이의 예로는 전 세균 백신(whole-virus vaccine)과 분할 백신(split vaccine)이 있다.
상기 서브유닛 백신은 세균의 구성성분 중 면역기능을 일으킬 수 있는 항원 성분만을 추출하여 제조한 백신으로, 세균 방어에 필요한 항원 부위에 대해서만 면역형성을 유도함으로써 부작용을 최소화할 수 있다. 일 예로, 개 인플루엔자 세균의 HA 단백질 및/또는 NA 단백질을 추출하여 사용할 수 있다.
상기 합성 백신은 세균의 항원 또는 항원 결정기만을 화학적으로 합성하거나 또는 재조합 DNA 기술로 생산한 펩타이드를 포함한 백신을, 일 예로 인플루엔자 세균의 HA 및/또는 NA 단백질을 합성하여 백신으로 사용할 수 있다.
유전공학 백신은 세균의 병원성을 일으키는 특이 유전자를 변형하거나 제거하여 제조한 것일 수 있다.
상기 백신 조성물의 제조방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 이용되는 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있고, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사액제로 제조하며, 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내, 비강 또는 경막 외(eidural) 경로로 투여할 수 있다. 바람직하게는 경구 또는 근육 접종용 일 수 있다. 특히 가금티푸스의 경우 대량의 조류에 대하여 백신을 투여하여야 하므로, 경구 투여용이 유용하게 이용될 수 있으나, 경구 투여의 경우 점막에 의하여 백신의 흡수가 저해되는 문제가 있으나, 본 발명의 백신 조성물의 이러한 문제를 해결하여 경구 투여에 의하여도 우수한 면역 효과를 가질 수 있음을 실험적으로 확인하였다.
상기 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 세균 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제 또는 예방제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 결정될 수 있다.
상기 백신은 일, 주, 월 또는 년에 걸쳐서 1 회; 또는 다르게는 2 회 이상으로 개 개체에 투여될 수 있다. 상기 제 2 투여는 제 1 투여 이후 1 주 내지 8 주 후에 투여 될 수 있다. 바람직하게는 3주 내지 4주 후에 투여될 수 있다. 상기 제 1 및 후속 투여는 예를 들어, 그 양 및/또는 형태 면에서 달라질 수 있다. 그러나, 때때로 투여는 양과 형태가 동일하다. 단독 투여만이 투여되는 경우에, 그러한 투여량 단독의 백신 투여량은 일반적으로 백신의 치료상 유효량을 포함한다. 그러나, 1 투여량을 초과하여 투여되는 경우에, 그렇게 함께 투여되는 백신의 양들은 치료상 유효량을 구성할 수 있다.
상기 생균 백신의 일반적인 투여량은 개체당 103 cfu/10㎕ 이상 일 수 있다. 상기 cfu는 단위체(unit)을 형성하는 세포(cell)를 의미한다. 바람직하게는 1 x 101 내지 1 x 1015 cfu/100㎕/개체무게 농도로 투여될 수 있다.
상기 개체가 닭인 경우, 생후 3주 된 닭의 평균 몸무게를 기준으로 1Ⅹ101 내지 1Ⅹ109 cfu/100㎕/개체로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 조류에 접종하는 단계;를 포함하는 가금티푸스 예방 방법을 제공한다.
상기 백신 조성물은 바람직하게는 1 x 101 내지 1 x 1015 cfu/100㎕/개체무게의 농도로 투여될 수 있고, 상기 개체가 닭인 경우, 상기 백신 조성물은 1Ⅹ105 내지 1Ⅹ109 cfu/200㎕/개체(닭)으로 접종 될 수 있다.
상기 조류는 닭, 오리, 칠면조, 매추리, 물새, 비둘기, 카나리아 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 예방 방법은 제1항의 백신 조성물을 개체에 1차 접종하는 단계; 및 상기 1차 접종된 날로부터 2 주 내지 4주 후에 제1차의 백신 조성물을 2차 접종하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 백신을 2차로 접종하는 경우, 개체 내 면역반응을 더 높일 수 있어 면역효과를 강화 할 수 있으면서도, 백신균주가 개체 내에 거의 잔류하지 않아 안전성이 높은 효과가 있다.
또한 본 발명은 KCTC12557BP의 수탁번호를 갖는 살모넬라 엔테리카 혈청 갈리나룸(Salmonella enterica serova Gallinarum)균주를 제공한다.
상기 JOL1355 균주는 야생형 SG 균주 JOL394(Matsuda et al., 2010)에서△lon과 △cpxR 유전자를 결실 시켜 JOL 916 균주를 제조한 후에, JOL 916 균주에서 △asd 유전자를 대립유전자 교환법(allelic exchange method)으로 다시 결실시킨 균주에(Kang et al., 2002), asd 유전자가 추가된 낮은 복사 Asd+ 플라스미드(low copy Asd+ plasmid)인 pJHL80(p15A ori)에 LTB 유전자를 삽입한 pJHL80-LTB 플라스미드를 전기천공법을 이용하여 상기 △lon, △cpxR 및 △asd가 결실된 균주에 도입하여 제조 되었고, 이를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KRIBB)에 2014년 2월 12일자로 기탁하여, 기탁번호 KCTC12557BP를 부여받았다.
상기 균주는 면역증강인자를 벡터에 클로닝하고 있어, 면역증강단백질을 지속적으로 발현할 수 있으며, 이로 인하여 세포벽 투과성이 증가되서 동물에 투여된 경우 상기 JOL1355 균주가 숙주 내에서 빠르게 사멸되므로 안정성이 높아진다.
상기 균주의 경우, 생균 백신용 면역 균주로 이용하는 경우 우수한 체내 면역반응 유도능과 가금티푸스에 대한 방어력을 가지면서도, 접종개체에서 염증반응, 식욕결핍 등의 부작용을 일으키기 않고, 개체 내 잔류하는 정도가 극히 미미하여 접종에 의한 부작용이 없어 우수한 안전성을 갖는다. 또한, 점막 면역활성이 우수한바, 경구 투여 방식 등에 의해서도 효과적으로 면역효과를 가질 수 있다.
상기 체내 면역반응 유도능은 면역화에 따른 T세포의 효과적인 유도, 림프구의 증식, 혈장 항체 및 장내의 항체의 증식 등과 같이, 면역에 반응하는 활성들이 유도되어 체내 면역이 활성화 될 수 있는 모든 반응을 의미한다.
또한 본 발명은 상기 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum, KCTC12557BP)균주를 포함하는 가금티푸스 예방용 사료첨가용 조성물을 제공한다.
상기 균주를 포함하는 사료첨가용 조성물의 경우, 집단 사육 또는 생활하는 조류의 때를 한번에 면역화 할 수 있고, 상기 균주의 경우 구강 내 점막에 의한 흡수의 저하 등이 발생하지 않으므로 가금티푸스의 예방에 있어서 우수한 효과를 갖는다.
본 발명에 따른 가금티푸스 예방용 백신조성물은 세포성 및 점막성 면역능력 및 야외 균주에 대한 우수한 방어력을 가지면서도, 동물에 주입시 매우 빠르게 사멸되어 체내 잔류량이 적고, 병변을 발생시키기 않으며, 염증반응, 식욕부진 등의 접종에 의한 부작용을 최소화 할 수 있어 안전성이 우수하므로, 조류의 가금티푸스 예방에 효과적으로 사용할 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 pJHL80-LTB 플라스미드의 제작을 나타내는 도이다.
도 2는 웨스턴 블롯 분석법(Western blot assay)에 의하여 검출된 LTB 어쥬반트 단백질을 나타내는 도이다. 도 2에 있어서 레인(Lane) M은 단백질 마커(protein marker); 레인 1은 음성 대조군 그리고 레인 2는 JOL1355의 LTB 단백질을 나타낸다. 화살표는 레인 2에서 LTB 단백질 발현을 나타낸다.
도 3은 LTB를 분비하는 살모넬라 갈리나룸 백신 후보, JOL1355를 이용하여, 닭에서 살모넬라 갈리나룸-특이적 OMP 항원에 대한 혈장 IgG와 장내의 분비형 IgA 면역반응 결과를 나타내는 도이다. 상기 값은 평균±표준편차(SD)(ng/mL)를 나타낸다. 통계학적으로 P=0.05의 유의성을 가진다(* P = 0.05 vs. 대조군).
도 4는 LTB를 분비하는 살모넬라 갈리나룸 백신 후보, JOL1355를 이용하여, 닭에서 LTB 항원에 대한 혈장 IgG와 장내의 분비형 IgA 면역반응 결과를 나타내는 도이다. 상기 값은 평균±표준편차(SD)(ng/mL)를 나타낸다. 통계학적으로 P=0.05의 유의성을 가진다(* P = 0.05 vs. 대조군).
도 5는 면역접종으로부터 4주 후에, 용해된 항원을 이용하여 말초 림프구 증식을 분석한 결과에 따른 닭 림프구 샘플의 자극 지표(Stimulation index)를 나타내는 도이다. 상기 값은 평균±표준편차(SD)(ng/mL)를 의미한다(* P = 0.05 vs. 대조군).
도 6은 면역접종(immunization) 7일 후에, CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ T 세포의 세포수 유동 혈구 계산 분석 결과를 나타내는 도이다.
a) CD3+, CD4+, CD8+ T 세포에 대하여 유동 혈구 산점도(Flow scatter dot plot)를 나타낸다. 플랏(plots)은 각각 그룹의 대표 샘플에 대한 분석 결과를 나타낸다. b) 대조군 및 실험군(immunized group)의 말초 혈액 샘플에서 CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ T 세포의 세포수를 나타낸 막대그래프이다. 통계학적으로 P=0.05의 유의성을 갖는다(* P = 0.05 vs. PBS 접종 대조군).
도 7은 야생형 살모넬라 갈리나룸(JOL422) 도전접종 후, 실험군과 대조군 닭의 생존률을 나타내는 도이다. 예방 접종 후 4주 뒤에, 실험군과 대조군의 모든 닭에게 JOL422를 1x106 cfu로 포함하는 세균 현탁액 100 ㎕를 경구-도전접종하였다. 닭은 도전접종 후 7일 때 되는 때부터 사망(mortality)함을 확인하였다.
도 8은 일 실시예에 따른 모든 면역화된 그룹(immunized group)의 닭에 있어서 살모넬라 갈리나룸-특이적 OMP 항원에 대한 혈장 IgG와 장내의 분비형 IgA 면역반응을 나타내는 도이다. 도 1에 있어서 A는 PBS-주입된 대조군; B는 JOL916으로 기본 및 추가 면역접종 실험군; C는 JOL966(SG9R)과 기본 및 추가 면역접종 실험군; D는 JOL1355과 기본 및 추가 면역접종 실험군을 나타낸다. 화살표는 기본 면역접종(prime immunization) 후 4 주 경과 시점에서 추가 면역접종(booster immunization) 한 것을 나타낸다. 상기 값은 평균±표준편차(SD)(ng/mL)를 나타낸다. 통계학적으로 P=0.05의 유의성을 가진다(* P = 0.05 vs. PBS 접종 대조군).
도 9는 추가 면역 접종으로부터 3주 후에, 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum)의 용해된 항원을 이용하여 말초 림프구 증식을 분석한 결과에 따른닭 림프구 샘플의 자극 지표(Stimulation index)를 나타내는 도이다. A 부터 D는 도 1에 나타낸 바와 같고, 상기 값은 평균±표준편차(SD)(ng/mL)를 의미한다(* P = 0.05 vs. PBS 접종 대조군).
도 10은 추가 면역접종(booster immunization)으로부터 7일 후에, CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ T 세포의 세포수 유동 혈구 계산 분석 결과를 나타내는 도이다.
a) CD3+, CD4+, CD8+ T 세포에 대하여 유동 혈구 산점도(Flow scatter dot plot)를 나타낸다. 플랏(plots)은 각각 그룹의 대표 샘플에 대한 분석 결과를 나타낸다. b) 대조군 및 실험군(immunized group)의 말초 혈액 샘플에서 CD3+CD4+ T 세포의 세포수를 나타낸 막대그래프이다. c) 대조군 및 실험군(immunized group)의 말초 혈액 샘플에서 CD3+CD8+ T 세포의 세포수를 나타낸 막대그래프이다. A 부터 D는 도 1에 나타낸 바와 같고, 통계학적으로 P=0.05의 유의성을 가진다(* P = 0.05 vs. PBS 접종 대조군).
도 11은 닭 DC 내 JOL 1355의 생존을 보여준다.
도 12는 유동 세포 계측법을 이용한 표현형 분석에 의한 닭 BM-DC에서의 CD40, CD80, 및 MHC-II의 발현을 보여준다. 비-자극 대조군 세포로부터의 히스토그램은 붉은 색 피크로 표시되고, JOL1355 또는 LPS 자극 세포의 히스토그램은 푸른 색 피크로 표시된다. 나타낸 데이터는 3 번의 독립된 실험의 대표 값이다.
도 13은 자극된 닭 BM-DC의 사이토카인 유전자 발현의 정량적인 실시간 PCR 분석 결과를 보여준다. 자극 및 비-자극 DC 간의 사이토카인 발현에 있어 유의한 차이는 별표(*)로 표시된다(** P≤0.01를 나타낸다).
도 14는 면역조치한 닭의 간 및 비장 샘플에서 분리한 JOL1355 내에서 lon 유전자의 삭제를 PCR를 통하여 확인한 결과이다. 화살표 머리는 lon 유전자의 PCR 산물을 나타낸다.
도 15는 면역조치한 닭의 간 및 비장 샘플에서 분리한 JOL1355 내에서 cpxR 유전자의 삭제를 PCR를 통하여 확인한 결과이다. 화살표 머리는 cpxR 유전자의 PCR 산물을 나타낸다.
도 16은 면역조치한 닭의 간 및 비장 샘플에서 분리한 JOL1355 내에서 eltB 유전자의 삭제를 PCR를 통하여 확인한 결과이다. 화살표 머리는 eltB 유전자의 PCR 산물을 나타낸다.
도 17은 병원성 야생형 SG JOL420의 챌린지 후 14일경에, 대조군 및 JOL1355-면역화 군에서의 간 및 비장의 총병변(Gross lesion)을 관찰하였다. [(I) 백색패치에서 부풀어오름 및 출혈성 간 (간비대) 및 (II) 비대화 및 출혈성 비장 (비장비대), (III) 및 (IV) 챌린지 후 15일 경의 챌린지된 생존한 새의 정상 간 및 비장]
[실험예 1] 재조합 균주의 제조 및 백신 사용 가능성 확인
통계분석은 SPSs 16.0프로그램(SPSS Inc. USA)이용하여 수행하였다. 결과값은 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. Mann-Whitney U 시험법은 실험군과 음성대조군의 동물 사이에서 면역반응의 현저한 차이점을 관찰하기 위하여 사용하였다. 실험동물의 사망여부(mortality)는 도전접종 후 실험군과 음성대조군 사이에서 Chi-square 시험법을 이용하여 확인하였다.
1-1. 새로운 벡터(pJHL80-LTB) 및 재조합 균주(JOL1355)의 제조
본 발명의 재조합 균주는 종래 공지 균주에 대하여, 새로운 벡터시스템의 제조를 통하여 새로운 균주를 제조하는 방법으로 재조하였다. 본 발명에서 사용된 플라스미드, 벡터 및 균주는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
5
12균주 또는 플라스미드		 설명a 인용
E. coli
JOL500 야생형 F18+, LT+, STa+, STb+, stx2+,
stx2e+ ETEC isolate from pig		 Hur & Lee, 2011
S. Gallinarum 재조합 균주
JOL394 닭에서 분리된 야생형 Matsuda et al., 2010
JOL916 △lon, △cpxR, JOL394 파생물(derivative) Matsuda et al., 2010
JOL966 Live SG9R vaccine (Nobilis®; Intervet International, Netherlands) 시판 중
JOL967 △lon, △cpxR, △asd, JOL 916 파생물(derivative) Jeon et al., 2012
JOL96-7JHL80 pJHL80 포함하는JOL967 본 발명
JOL1355 pJHL80-LTB 포함하는 JOL967 본 발명
JOL422 닭에서 분리된 야생형, 도전접종 균주. Matsuda et al., 2011
Plasmids
pBR322 클로닝 벡터(Cloning vector); Apr Tcr Bolivar et al., 1977
pJHL80 Asd+ vector, p15A ori, β-lactamase signal sequence-based periplasmic secretion plasmid, 6xHis Nandre and Lee, 2014/ 본 발명
pJHL80-LTB eltB 포함하는JHL80 파생물(derivative) Nandre and Lee, 2014 / 본 발명
Primer Primer sequence (5'- 3') Source
asd-F CGGAAATGATTCCCTTCCTAACG Kang et al. (2002)
asd-R TATCTGCGTCGTCCTACCTTCAG
eltB-F CCGCGAATTCGCTCCCCAGTCTATTACAG Hur & Lee (2011)
eltB-R CCGCAAGCTTCTAGTTTTCCATACTGATTG
OMPC-F ATCGCTGACTTATGCAATCG Alvarez et al. (2004)
OMPC-R CGGGTTGCGTTATAGGTCTG
SG-F GATCTGCTGCCAGCTCAA Kang et al. (2011)
SG-R GCGCCCTTTTCAAAACATA
lon-both-F ATTTTATCTCCCCTTTCGTTTTTC Jeon et al. (2012)
lon-both-R CTGCCAGCCCTGTTTTTATTAGC
cpxR-both-F CAGCGCCAGCGTCAACCAGAAGAT Jeon et al. (2012)
cpxR-both-R GAGGCCATAACAGCAGCGGTAACT
LTB-F GCTCCCCAGTCTATTACAG Hur & Lee (2011)
또한, 플라스미드 및 벡터를 제조하기 위하여, 상기 표 2에 나타낸 프라이머를 이용하였다. 살모넬라 타이피무리움(Salmonella Typhimurium, accession number AF015781)의 asd 유전자 염기서열은 asd 프라이머(표 2)를 이용하여 PCR로 증폭되었다. asd 유전자 증폭된 DNA 단편은 Asd+ 벡터(p15A ori)를 구성하는데 사용되었다.
JOL1355 균주를 위한 플라스미드 벡터(pJHL80-LTB)를 제조하기 위하여, pBR322 DNA 주형을 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)법으로 베타-락타마제 유전자를 증폭하였고, 상기 PCR 산물을 Asd+ 벡터로 클론하여 pJHL80 플라스미드를 제조하였다(표 1). Ptrc에 하여 촉진된 전사는 멀티클로닝 사이트 뒤에 위치하는 전사 종결자 5ST1T2에 의하여 정지되었다. LTB를 코딩하는 eltB 유전자 대장균(E. coli 균주, JOL500)의 게놈 DNA는 eltB 특이적 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였고(표 2), 상기 eltB 유전자의 PCR 산물을 낮은 복사 플라스미드 pJHL80에 도입하여, pJHL80-LTB를 제조하였다(도 1). pJHL80에 베타-락타마제(β-lactamase) 신호 염기서열을 암호화하는 DNA 단편을 추가하여 재조합 플라스미드를 더 강화하여, 살모넬라에서 원형질외극(periplasmic space)으로 더욱 효율적으로 전이되도록 하였다.
재조합 균주를 제조하기 위하여, 야생형 SG 균주 JOL394(Matsuda et al., 2010)에서 △lon과 △cpxR 유전자를 결실 시켜 JOL 916 균주를 제조한 후에, JOL 916 균주에서 △asd 유전자를 대립유전자 교환법(allelic exchange method)으로 다시 결실시키고(Kang et al., 2002), 안정된-치사 숙주-벡터 시스템(balanced-lethal host-vector system)으로 JOL967 재조합 균주를 제조하였다. 구체적으로, 상기 asd를 결실시킨 JOL916 균주에 asd 유전자가 추가된 낮은 복사 Asd+ 플라스미드(low copy Asd+ plasmid)인 pJHL80(p15A ori)를 삽입하여 JOL 967균주를 제조하였다. 그 다음, pJHL80-LTB 플라스미드를 전기천공법을 이용하여 JOL967 균주에 도입하였다. 최종적으로 JOL1355 균주가 재조합 되었고, 이를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KRIBB)에 2014년 2월 12일자로 기탁하여, 기탁번호 KCTC12557BP를 부여받았다.
상기 재조합 JOL1355 균주(K)를 살모넬라 갈라니움의 생 LTB 백신 후보로 하여, 그 가능성을 확인하였다.
1-2. JOL1355의 LTB 단백질 분비능 확인
JOL1355의 LTB 단백질 분비를 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯 분석법(Western blot assay)을 수행하였다. 샘플은 백신 후보균주 JOL1355(pJHL80-LTB)와 음성 대조군으로 JOL96-7pJHL80 균주를 Luria-Bertani(LB) 배지(Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)에서 37 ℃를 유지하면서 배양하는 방법으로 준비하였다. 3400 x g 에서 20분 동안 원심분리 한 후, 배양배지의 상층액은 각각 0.22 ? 크기의 여과필터를 통과시켰고, 20%(v/v) 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA)을 이용하여 하룻밤 동안 침전시켜, 분비된 형태의 LTB를 분리시켰다. JOL1355 및 JOL96-7pJHL80 단백질 샘플 은 96 ℃에서 5 min분 동안 가열되었고, 15% 소듐 도네실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis gel electrophoresis, SDS-PAGE)에 의하여 분리되었다. 분리된 단백질은 전기영동에 의하여 폴리비닐이딘 플루오라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 막(Millipore, Billerica, MA, USA) 으로 옮겨졌고, 공지된 방법으로 면역블로팅을 실시하였다 (Hur & Lee, 2011). 상기 분석결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 11.6 kDa 밴드(LTB 단백질 모노머의 크기)가 나타났으나(레인 2), 음성 대조군 샘플에서는 밴드가 나타나지 않음을 확인하였다(레인 1).
1-3. 백신조성물을 위한 균주의 배양
JOL1355 및 도전접종을 위하여 독성이 강한 야생형 균주, JOL422는 LB 배지(Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)에서 37 ℃조건으로 광학밀도(OD)600의 0.6까지 배양되었다. 그 후, 수확한 세포를 원심분리(16,100 x g, 5 분)하고, 펠렛은 다시 인산완충식염수(PBS)에 접종에 적절한 농도로 재현탁 하였다.
1-4. 면역접종에 따른 백신효과 확인
실험 동물은 생후 하루된 암컷 로만브라운(Lohmann-Brown) 닭을 이용하였다. 물과 사료는 자유식(ad libitum) 방법으로 공급하였다. 모든 동물의 실험은 한국 동물보호 심의회의 지침에 따라 국립전북대학교 윤리 위원회의 윤리 승인(CBU 2011-0017) 범위 내에서 수행하였다.
백신효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 시험예 1과 시험예 2로 나누어 실험을 실시하였고, 각 실시예는 다시, 두 개의 그룹인 면역접종을 실시한 실험군(immunized group)과 PBS만을 접종한 음성대조군으로 나누어 실시하였다.
<시험예 1>
닭(n=40)을 두 그룹으로 나누었고, 첫 번째 그룹(음성대조군 1)의 닭은 100 ㎕의 살균한 PBS로 접종되었다(n=20). 남은 닭(n=20, 실험군 1)은 100 ㎕의 총 세균 현탁액으로 면역접종 되었다. 상기 세균 현탁액은 총 세균 현탁액 100 ㎕에 LTB 분비하는 희석된 생균 JOL1355이 1 x 108(cfu)로 포함된 것을 이용하였다. 상기 면역접종은 생후 4주된 닭에 대하여 실시하였다.
<시험예 2>
닭(n=50)을 두 개 그룹으로 나누었고, 첫 번째 그룹(음성대조군 2)의 닭은 100 ㎕의 살균한 PBS로 접종되었다(n=25). 남은 닭(n=25, 실험군 2)은 100 ㎕의 총 세균 현탁액으로 면역접종 되었다. 상기 세균 현탁액은 총 세균 현탁액 100 ㎕에 LTB 분비하는 희석된 생균 JOL1355이 1 x 108(cfu)로 포함된 것을 이용하였다. 야생형 SG 분리주 JOL422를 도전접종 균주로 사용하였다. 모든 닭에 경구투여 방식으로 100 ㎕(1 x 106cfu)세균 현탁액을 투여하는 도전접종을 수행하였다. 상기 도전접종은 면역접종(immunization)으로부터 4 주 후에 실시하였다. 물과 사료는 균 접종 전에는 공급하지 않았고, 면역접종하고 2시간 이후에 재공급하였다.
1-4-1. LTB 균주 JOL1355의 안전성 확인
실시예 1의 음성대조군 1과 실험군 1을 대상으로, 면역접종 후로부터 4주 동안 JOL1355를 포함하는 생백신에 의하여 식욕부진, 우울, 설사의 징후가 조류에서 발생되는지 매일 관찰하였다.
또한, 면역접종으로부터 4 주 동안, 매주마다 각 그룹(실험군 1 및 음성대조군 1)에서 선택된 5마리에 대하여, LTB 균주(JOL1355)가 닭의 간(liver)과 비장(spleen)에 남아있는지를 확인하였다. LTB 균주의 잔류는 살모넬라 속을 위한 OMPC 프라이머, 살모넬라 갈리나룸을 위한 SG 프라이머, 백신균주를 위한 lon 및 cpxR 프라이머 그리고 LTB 어쥬반트 균주를 위한 LTB 프라이머를 이용하여 PCR로 확인하였다(Alvarez et al., 2004; Kang et al., 2011; Jeon et al., 2012). 간과 비장 샘플 에서 육안적 병변(gross lesions)과 세균의 잔류(bacterial recovery)의 확인은 Matsuda et al., 2011에 개시된 방법에 따라 수행하였다.
그 결과, 생 LTB 백신 후보균주 JOL1355는 실험 1에서 조류의 유전적 상태에 어떤 부정적인 효과를 일으키지 않았고, 면역접종된 닭에서 육안적 병변이 관찰되지 않았다. 또한, LTB 백신 균주는 면역접종 후 1-4주 동안 대조군과 실험군의 간과 비장에서 발견되지 않았다.
1-4-2. ELISA에 의한 전신적(Systemic) 면역반응(IgG) 및 점막의(mucosal) 면역반응(sIgA)의 확인
항-살모넬라 갈리나룸 항체를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2의 각각의 그룹(음성대조군 2 및 실험군 2)에서 면역접종 후에 다섯 마리의 닭으로부터 혈액 샘플 및 장세척(intestinal lavage) 샘플을 채취하였다. 전신적인 IgG 농도를 측정하기 위한 혈장샘플은 말초 혈액을 원심분리하여 수득하였다. 분비형 IgA(sIgA) 농도의 측정을 위한 장세척 샘플은 세척기술을 이용하여 수득하였다(Porter & Holt, 1992). 장세척 샘플은 사용하기 전 까지4 ℃에서 보관하였다. 간접적인 ELISA는 야생형 SG JOL394 균주로부터 추출된 외막단백 단편(outer membrane protein fraction, OMP)을 이용하여 수행되었다. 닭의 IgG 및 IgA ELISA 정량 키트(Quantitation Kits, Bethyl Laboratories, TX, USA)를 이용하여 IgG 및 IgA 농도를 측정하는 방법으로 ELISA를 수행하였다(Matsuda et al., 2010; Matsuda et al., 2011). 그 결과를 도 3에 나타내었다.
또한, LTB 항원에 대한 혈장 IgG 및 장내의 sIgA 항체가 측정되었다. 간략하게, microlon ELISA plate wells(Greiner Bio-One GmbH, Germany)을 3.4 ㎍/mL 농도의 LTB 항원으로 코팅하였다. LTB 항원은 공지된 E. coli 야생형 균주 JOL500(Hur and Lee, 2011)로부터 준비하였다. 혈장의 1:100 희석액과 세척액 샘플의 1:4 희석액을 LTB-c코팅된 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 배양하였다. 그 다음으로 goat 항-닭 IgG 및 IgA 호스레디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP)-켤레(conjugate)로 1시간 동안 반응시켰다. HRP 활성은 o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(o-phenylenediamine dihydrochloride, Sigma-Aldrich, USA)로 측정되었다. OD492는 3M H2SO4로 반응을 정지시킨 후에, ELISA 리더기를 이용하여 측정하였다. 항체역가의 평균 농도는 IgG 및 IgA 항체 각각에 대하여 표준곡선을 구성하여 측정하였다(Hur & Lee, 2011). 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 면역접종 이후 2주, 3주 및 4주 각각의 시점에서, 실험군 2(immunized group)의 혈장 IgG와 장내의 sIgA 수준은 음성대조군 2와 비교하여 현저하게 상승되었다. 구체적으로, 실험군 2의 혈장 IgG 수준은 면역접종 후 3주가 되는 때에 음성대조군2와 비교하여 약 2.2 배 상승되었고, 실험군의 장내의 sIgA 수준은 면역접종 후 3주가 되는 때에 대조군과 비교하여 2.3배 상승되었다. 따라서 본 발명의 JOL1355(KCTC12557BP)를 포함하는 백신의 경우 백신을 투여하는 개체에서 전신적인 면역 및 장내의 면역 반응을 일으키는 효과를 가짐을 확인하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 실험군 2(immunized group)의 항-LTB 혈장 IgG 및 장내의 sIgA 수준은 대조군과 비교하여 현저하게 높다. 혈장 IgG 수준은 면역접종 후 2주, 3주 그리고 4주가 된 때에 실험군 2에서 현저하게 높았다. 반면에 장내의 sIgA 수준은 면역접종 후 1주, 2주, 3두 및 4주가 된 때에 실험군 2(immunized group)에서 높게 나타났다. 면역접종 후 3주가 된 때에, 실험군에서의 혈장 IgG 수준은 대조군보다 약 3.1배 증가되었고, 실험군의 장내의 sIgA 수준은 면역접종 후 2주 및 3주가 된 때에 대조군과 비교하여 약 2.0배 상승한 것을 확인 하였다. 따라서 본 발명의 JOL1355(KCTC12557BP)를 포함하는 백신의 경우 백신을 투여하는 개체에서 면역 반응을 일으키는 효과를 가짐을 확인하였다.
1-4-3. 세포성 면역 확인
세포성 면역(cell-mediated immunity)을 확인하기 위하여, 면역접종으로부터 4 주 후에, 실험군 2 및 음성대조군 2 각각에서 임의적으로 선택된 다섯 마리의 닭에서 말초 림프구를 분리하였다. 트리판 블루 색소 배제 시험(trypan blue dye exclusion test) 후에, RPMI-1640 배지에서, 100 ㎕의 살아있는 단핵세포 현탁액(1 x 105 cfu/mL)을 배양하였다. 상기 배양은 3회 실시하였고, 96-well 조직 배양 플레이트에서 수행하였으며, 50 ㎕의 배지만을 사용하거나, 4 ㎍/mL의 용해된 항원(soluble antigen)을 포함하는 배지를 사용하였고, 40 ℃, 5% CO2 대기조성, 적정 습도에서 72 시간 동안 수행하였다.
상기 용해된 항원은 이미 공지된 SG 야생형 균주 JOL394로부터 준비되었다(Rana & Kulshreshtha, 2006). 유도 림프구의 증식은 살아있는 세포에서 마커로써 생물발광(bioluminescence) 아데노신 트리포스페이트(adenosine triphosphate, ATP)를 이용하여, ViaLight®Plus Kit(Lonza Rockland, ME, USA)로 측정하였다. 발광된 빛의 강도는 광도계(luminometer, TriStarLB941, Berthold technologies GmbH & Company, Bad Wildbad, Germany)로 측정하였다. 특이적 항원에 대한 유약화 반응(blastogenic response)은 이미 공지된 (Rana & Kulshreshtha, 2006)의 평균 자극지수(stimulation index, SI)에 따랐다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 백혈구의 증식 반응이 확인되었고, 특히 면역화 후 4주가 된 때에, 실험군(immunized group)의 평균 SI 값은 대조군보다 2.3배 높은 것을 확인하였다.
1-4-4. CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ T 세포 면역 확인
면역화에 따른 T세포의 효과적인 유도(induction)를 확인하기 위하여, 면역접종으로부터 7일 후에, 실험군 2 및 음성대조군 2 각각의 그룹에서 선택된 세 마리의 닭에서 혈액 샘플을 채취하였다. 채취된 혈액 샘플은 3% 헤타스타치(hetastarch, Sigma Immuno Chemicals, St. Louis, MO, USA)와 1:2의 범위로 혼합하고, 65 x g으로 10분 동안 원심분리하여, 적혈구(erythrocyte)를 침전시켰다. 상청액 세포(백혈구, leukocyte)는 PBS에 농도가 1x106 cells/mL이 되도록 하였다. 분리된 백혈구 100 ㎕(1 x 106 cfu)를 플로오레세인이소티오시안산염(fluorescein isothiocyanate, FITC)-표지된 항-CD3, 비오틴(biotin, BIOT)-표지된 항-CD4 그리고 피코에리트린(phycoerythrin, PE)-표지된 항-CD8a(Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) 단일클론 항체와 함께 배양하였고, 상기 배양은 암상태에서 4 ℃의 온도로 30 분 동안 수행하였다. 상기 배양물을 PBS로 세척하고, 세포는 100 ㎕ PBS 에 재현탁되었고, 다시 알로피코시아닌(allophycocyanin, APC)-표지된 스트렙타아비딘(streptavidin)(Southern Biotech, Birmingham, AL, USA)와 함께 암상태에서 4 ℃의 온도로 30 분 동안 배양되었다. 이를 다시 세척하고, 모든 샘플은 FACS Calibur(BD Bioscience, Heidelberg, Germany)로 분석되었다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 면역접종 후 7일 째 되는 날, CD3+CD4+ T 세포의 세포수는 실험군 2(immunized group)에서 31.8 ± 9.1(%) 임을 확인하여, 15.5 ± 6.1(%)인 음성대조군 2과 비교하여 실험군 2에서 현저하게 상승된 것을 확인하였다. 또한 CD3+CD8+ T 세포는 실험군 2(immunized group)에서 14.0 ± 1.5(%) 였고, 7.7 ± 3.8(%)인 음성대조군 2과 비교하여 현저하게 상승되었다. 따라서, 본 발명의 백신균주JOL1355(KCTC12557BP)를 포함하는 경우 백신을 투여하는 개체에서 T세포의 면역 반응이 효과적으로 유도되는 것을 확인하였다.
1-5. JOL1355 균주의 방어력 확인
야생형 SG 균주 JOL422를 도전접종 균주로 이용하였고, 도전접종은 각각의 닭에 대하여 100 ㎕ 세균 현탁액(1 x 106 cfu)을 경구 투여하는 방법으로 수행하였다. 실험군 2 및 음성대조군 2의 닭에 면역접종으로부터 4 주 후에 도전접종 하였다. 도전접종 후 14일 동안, 모든 닭의 유전적 상태와 사망(mortality) 여부를 관찰하였다. 통계분석은 SPSs 16.0프로그램(SPSS Inc. USA)이용하여 수행하였다. 결과값은 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. Mann-Whitney U 시험법은 실험군과 음성대조군의 동물 사이에서 면역반응의 현저한 차이점을 관찰하기 위하여 사용하였다. 실험동물의 사망여부(mortality)는 도전접종 후 실험군과 음성대조군 사이에서 Chi-square 시험법을 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도전접종 후, 실험군 2(immunized group)에서 적은 수의 닭이 미미하고, 일시적인 우울증을 나타내었다. 그러나, 면역화 되지 않은 음성대조군 2의 모든 닭에서는 도전접종 후에 우울증의 징후가 나타나는 것을 확인하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 실험군 2(immunized group)는 음성대조군 2와 비교하여 현저하게 높은 생존률을 나타내었다. 도전접종 후 14일 동안, 실험군 2에서는 25마리 닭 중에서 21마리의 닭이 생존한 반면, 음성대조군 2에서는 25 마리 중 6 마리만 생존하였다. 이러한 결과는 대조군에서 76% 사망률(mortality rate)을 나타내는 것에 비하여, 실험군(immunized group)에서 16% 사망률(mortality rate)을 나타내는바 본 발명의 백신균주JOL1355(KCTC12557BP)를 포함하는 경우 백신을 투여하는 경우, 가금티푸스에 의한 조류의 사망률을 현저하게 낮출 수 있음을 나타낸다.
따라서, 상기와 같이 SG균주 JOL1355(KCTC12557BP)를 가금티푸스 예방용 백신균주로 사용할 수 있음을 확인 하였는바, SG균주 JOL1355(KCTC12557BP)의 백신효과가 다른 균주와 비교하여 우수함을 갖는지를 확인하기 위하여 비교실험을 실시하였다.
[실험예 2] JOL1355(KCTC12557BP) 균주의 백신효과 비교
통계분석은 SPSs 16.0프로그램(SPSS Inc. USA)이용하여 수행하였다. 결과값은 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. Mann-Whitney U 시험법은 실험군과 음성대조군의 동물 사이에서 면역반응의 현저한 차이점을 관찰하기 위하여 사용하였다. 실험동물의 사망여부(mortality)는 도전접종 후 실험군과 음성대조군 사이에서 Chi-square 시험법을 이용하여 확인하였다.
2-1. 사용된 백신 균주
(양성대조군 1) 생백신용 균주로 야생형 SG 균주 JOL394에서 lon과 cpxR 유전자를 결실시킨 SG 균주 JOL916를 사용하였다(Matsuda et al., 2010)(표 1).
(양성대조군 2) 현재 시판중인 생백신용 Live SG9R JOL966 균주와 플라스미드(Nobilis® Intervet International, Boxmeer, the Netherlands)를 제품사용법에 따라서 제조합하여 사용하였다(Becton, Dickinson, and Company, Franklin Lakes, NJ)(표 1).
(양성대조군 3) 생백신용 균주로 SG 균주 JOL967를 사용하였다. JOL967는 상기 실험예 1-1과 같이, asd를 결실시킨 JOL916 균주에 asd 유전자가 추가된 낮은 복사 Asd+ 플라스미드(low copy Asd+ plasmid)인 pJHL80(p15A ori)를 삽입하여 JOL 967균주를 제조하였다(표 1).
(실시예 1) 상기 실험예 1-1과 같은 방법으로 제조된 JOL1355(KCTC12557BP)를 사용하였다.
2-2. 백신 접종을 위한 백신균주 및 도전접종 균주의 준비
JOL916, JOL966(SG9R), JOL1355 및 도전접종을 위한 야생형 균주 JOL420를 각각 LB 배지(Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)에서 37 ℃조건으로 광학밀도(OD)600의 0.6까지 배양되었다. 그 후, 수확한 세포를 원심분리(16,100 x g, 5 분)하고, 펠렛은 다시 인산완충식염수(PBS)에 접종에 적절한 농도로 재현탁 하였다.
2-3. 닭에 면역접종
실험 동물은 생후 4 주된 암컷 로만브라운(Lohmann-Brown) 닭을 이용하였다. 물과 사료는 자유식(ad libitum) 방법으로 공급하였다. 모든 동물의 실험은 한국 동물보호 심의회의 지침에 따라 국립전북대학교 윤리 위원회의 윤리 승인(CBU 2011-0017) 범위 내에서 수행하였다.
<시험예 3> 균주에 따른 면역효과 비교
닭(n=60)을 4 그룹으로 나누었고, 생후 4주된 닭에게 경구투여 방식으로 접종을 실시하였다.
첫 번째 그룹(음성대조군 3)의 닭은 200 ㎕의 살균된 PBS로 접종되었다(n=20).
두 번째(양성대조군1-1) 및 세 번째(양성대조군2-1) 그룹은 각각 1 x 107(cfu)의 세균 현탁액 200 ㎕로 면역접종 되었다. 양성대조군 1-1은 JOL916 균주가 포함된 세균 현탁액, 양성대조군 2-1은 JOL966 균주가 포함된 세균 현탁액으로 면역접종 하였다.
네 번째 그룹(실시예 1)은 JOL1355의 1 x 108(cfu)의 세균 현탁액 200 ㎕로 면역접종 되었다.
<시험예 4> 접종 횟수에 따른 면역효과 비교
닭(n=80)을 4 그룹으로 나누었고, 닭에게 경구투여 방식으로 생후 4주째에 기본(prime) 면역접종을 수행하였고, 8주째에 추가(booster) 면역접종을 실시하였다.
첫 번째 그룹(음성대조군 4, A)의 닭은 기본 및 추가 면역접종 모두 200 ㎕의 살균된 PBS로 접종되었다(n=20).
두 번째 그룹(양성대조군1-2, B)은 기본 및 추가 면역접종 모두 JOL916 균주가 1 x 107(cfu)로 포함된 세균 현탁액 200 ㎕로 접종되었다.
세 번째 그룹(양성대조군2-2, C)은 기본 및 추가 면역접종 모두 JOL966 균주가 1 x 107(cfu)로 포함된 세균 현탁액 200 ㎕로 접종되었다.
네 번째 그룹(실시예 2, D)은 JOL1355 균주가 1 x 108(cfu)로 포함된 세균 현탁액 200 ㎕로 면역접종 되었다.
2-3-1. 안전성 확인
상기 시험예 3의 닭에 대하여, 경구투여 후 3 주 동안 닭에서 생백신에 포함된 균주에 의하여 식욕부진, 우울, 설사의 징후가 조류에서 발생되는지 매일 관찰하였고(Matsuda et al., 2011), 비대 및 괴사성 병소(necrotic foci)과 같은 육안적 병변이 발생하는지도 관찰하였다.
또한, 근육접종 후, 1, 3, 7, 14 및 21일 째에, 각각의 그룹에서 선택된 3 마리의 닭의 간과 비장을 확인하였고, 각각의 그룹에서 선택된 3 마리 닭의 간, 비장 및 맹장에 균주가 잔류하고 있는지도 확인하였다. 균주의 잔류는 살모넬라 속을 위한 OMPC 프라이머, 살모넬라 갈리나룸을 위한 SG 프라이머, 백신균주를 위한 lon 및 cpxR 프라이머 그리고 LTB 어쥬반트 균주를 위한 LTB 프라이머를 이용하여 PCR로 확인하였다(Alvarez et al., 2004; Kang et al., 2011; Jeon et al., 2012). 간과 비장 샘플 에서 육안적 병변(gross lesions)과 세균의 잔류(bacterial recovery)의 확인은 Matsuda et al., 2011에 개시된 방법에 따라 수행하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

그룹
장기
 면역접종 후 일(DAY)
1 3 7 14 21
n/Na Countb n/N Count n/N Count n/N Count n/N Count
음성
대조군
 간 0/3 0±0 0/3 0±0 0/3 0±0 0/3 0±0 0/3 0±0
비장 0/3 0±0 0/3 0±0 0/3 0±0 0/3 0±0 0/3 0±0
맹장 0/3 0±0 0/3 0±0 0/3 0±0 0/3 0±0 0/3 0±0
JOL916
 간 3/3 2.3±0.2 3/3 3.3±1.0 3/3 1.5±0.3 0/3 0±0 1/3 0.7±1.0
비장 3/3 3.8±0.3 3/3 3.8±0.4 3/3 3.3±0.5 3/3 2.7±0.1 0/3 0±0
맹장 0/3 0±0 0/3 0±0 1/3 1.2±1.7 0/3 0±0 1/3 0.3±0.5

JOL966
 간 3/3 2.5±1.5 3/3 2.7±0.8 3/3 1.4±0.3 0/3 0±0 0/3 0±0
비장 3/3 2.1±1.5 3/3 4.2±0.4 3/3 3.3±0.3 0/3 0±0 1/3 0.3±0.5
맹장 0/3 0±0 0/3 0±0 1/3 1.3±1.8 1/3 0.7±1.0 0/3 0±0
JOL1355
 간 3/3 2.4±1.2 0/3 0±0 0/3 0±0 0/3 0±0 0/3 0±0
비장 3/3 3.8±0.2 3/3 3.5±0.3 2/3 1.8±1.3 0/3 0±0 0/3 0±0
맹 0/3 0±0 0/3 0±0 0/3 0±0 0/3 0±0 0/3 0±0
a n/N, 증균배양법(enrichment culture method)에 의한 전체 샘플에서 양성을 나타낸 샘플의 수
b 조류의 간, 비장, 맹장에서 직접 및 증균배양에 의하여 관찰된 세균수(면역접종 후 1, 3, 7 및 14일 째) (평균　±　SD log10 cfu/g).
JOL916 균주(양성대조군1-1) 및 JOL966(양성대조군2-1)을 투여한 그룹의 닭은 식욕부진 및 우울증 징후를 보였으나, JOL1355 균주(실시예 1)는 접종된 닭에서 유전적인 영향을 일으키는 그 어떤 부정적인 효과를 야기하지 않았다. 따라서 본 발명의 JOL1355 균주에 의한 부작용 걱정이 없어 안전성이 우수함을 확인 할 수 있었다.
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 육안적 병변에 의한 안전성의 확인 결과, JOL916와 JOL966 균주에 의하여 육안적 병변(비대 및 괴사성 병소)이 간과 비장에서 면역접종 후 21일 동안 나타났으나, JOL1355 균주에 의한 육안적 병변은 간과 비장에서 면역접종 후 3일 동안 미미하게 나타났다. 균주의 잔류성 확인 결과, JOL916와 JOL966는 면역접종 후 1, 3, 7, 14 및 21일 동안 닭의 장내에서 잔류하는 것이 확인되었으나, JOL1355 균주는 면역접종 후 비장에서는 1, 3 및 7일 동안만 잔류하였고, 간에서는 면역 당일 하루만 잔류하는 것으로 확인되었다(표 2).
따라서 JOL1355 균주를 포함하는 생백신을 투여하는 경우 투여 후 14일 째에는 개체의 장기에 전혀 잔류하지 않는 것이 확인 되었고, 이에 의하여 균주에 의한 개체의 감염 등의 부작용이 발생할 가능성이 현저히 낮아, 백신의 안전성이 향상되는 것을 확인 하였다. 이는 특히 공지된 백신균주와 살펴보면 육안적 병변의 발생이 약 1/7로 감소하고, 균주의 잔류 시기가 절반으로 감소한 것으로, 본 발명의 균주가 백신으로 안전성이 향상된 것임을 실험적으로 확인하였다.
이에 안전성이 확보된 본 발명의 JOL1355 균주의 면역력 또한 우수한지 확인해보고자 하기 실험을 실시하였다.
2-3-2. ELISA에 의한 전신적(Systemic) 면역반응(IgG) 및 점막의(mucosal) 면역반응(sIgA)의 확인
상기 시험예 4의 닭에 대하여, 각각의 그룹에서 격주로 다섯 마리의 닭으로부터 혈액 샘플 및 장세척 샘플을 채취하였다. 전신적인 IgG 농도를 측정하기 위한 혈장샘플은 말초 혈액을 원심분리하여 수득하였다. 분비형 IgA(sIgA) 농도의 측정을 위한 장세척 샘플은 세척기술을 이용하여 수득하였다(Porter & Holt, 1992). 간접적인 ELISA는 야생형 SG JOL394 균주로부터 추출된 외막단백 단편(outer membrane protein fraction, OMP)을 이용하여 수행되었다. 닭의 IgG 및 IgA ELISA 정량 키트(Quantitation Kits, Bethyl Laboratories, TX, USA)를 이용하여 IgG 및 IgA 농도를 측정하는 방법으로 ELISA를 수행하였다(Matsuda et al., 2010; Matsuda et al., 2011). 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 기본 면역접종 후(post-prime immunization, PPI) 3주 째에, B, C 및 D 그룹의 각각의 혈장 IgG 역가가 음성대조군(A)과 비교하여 2.4, 2.6 및 2.2 배 높았다. 또한, B, C 및 D 그룹의 각각의 혈장 IgG 역가는 추가 면역접종 후(PBI) 대조군과 비교하여 2.8, 2.6 및 2.6배 높았다. 이로써 본 발명의 JOL1355 균주를 포함하는 생백신의 경우 접종을 반복하는 경우 더욱 우수한 면역효과를 가질 수 있음을 확인하였다.
기본 면역접종 후(PPI) 3주 째에, 점막의 IgA 항체는 대조군과 비교하여 B, C 및 D 그룹에서 각각 2.0, 2.1 및 1.9 배 상승한 것을 확인 하였다. 또한 추가 면역접종 후(PBI) 3 주 째에, 장내-특이적 IgA 역가는 B, C 및 D 그룹에서 2.1, 2.5 및 2.0 배 높았다. 상기 결과를 통해서 특이적 혈장 IgG와 장내의 sIgA 항체는 면역화된 그룹에서 높게 나타나고, 각 그룹들 사이에서는 통계적으로 유의적 차이가 없음을 확인 하였다.
따라서, D 그룹의 JOL1355 균주의 경우 높은 안전성을 가지면서도 전신적 면역과 점막 면역에서 종래의 균주들과 동일한 수준의 우수한 면역활성을 유도하였는바, 경구 및 근육투여용으로 모두 효과적으로 사용할 수 있고, 이에 따른 부작용이 극히 낮은 안전한 백신을 제조할 수 있음을 확인 하였다.
2-3-3. 세포성 면역 확인
세포성 면역(cell-mediated immunity)을 확인하기 위하여, 추가 면역접종으로부터 21일 후에, 상기 시험예 4의 그룹 각가에서 임의적으로 선택된 다섯 마리의 닭에서 말초 림프구를 분리하였다. 트리판 블루 색소 배제 시험(trypan blue dye exclusion test) 후에, RPMI-1640 배지에서, 100 ㎕의 살아있는 단핵세포 현탁액(1 x 105 cfu/mL)을 배양하였다. 상기 배양은 3회 실시하였고, 96-well 조직 배양 플레이트에서 수행하였으며, 50 ㎕의 배지만을 사용하거나, 4 ㎍/mL의 용해된 항원(soluble antigen)을 포함하는 배지를 사용하였고, 40 ℃, 5% CO2 대기조성, 적정 습도에서 72 시간 동안 수행하였다.
특이적 항원은 (Rana and Kulshreshtha, 2006)에서 공지된 SG 야생형 균주 JOL394로부터 준비하였고, 유도 림프구의 증식은 살아있는 세포에서 마커로써 생물발광(bioluminescence) 아데노신 트리포스페이트(adenosine triphosphate, ATP)를 이용하여, ViaLight®Plus Kit(Lonza Rockland, ME, USA)로 측정하였다. 발광된 빛의 강도는 광도계(luminometer, TriStarLB941, Berthold technologies GmbH & Company, Bad Wildbad, Germany)로 측정하였다. 특이적 항원에 대한 유약화 반응(blastogenic response)은 이미 공지된 (Rana & Kulshreshtha, 2006)의 평균 자극지수(stimulation index, SI)에 따랐다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 음성대조군 4와 면역화 그룹(양성대조군 1-2, 2-2 및 실시예 2)에서, 양성대조군 1-2, 2-2 및 실시예 2의 SI 값이 2.1, 2.3 및 1.7 배 높은 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 백신 균주를 생백신으로 이용하는 경우 효과적으로 개체를 면역화 시킬 수 있음을 확인 하였다.
따라서, 본 발명의 JOL1355 균주의 경우 높은 안전성을 가지면서도 세포성 면역에서 종래의 균주들과 동일한 수준의 우수한 면역활성을 유도하면서도, 부작용이 극히 낮은 안전한 백신을 제조할 수 있음을 확인 하였다.
2-3-4. CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ T 세포 면역 확인
면역화에 따른 T세포의 효과적인 유도(induction)를 확인하기 위하여, 추가 면역접종으로부터 7일 후에, 상기 시험예 4의 그룹 각가에서 임의적으로 선택된 다섯 마리의 닭에서 혈액샘플을 채취하였다. 백혈구를 얻기 위하여, 채취된 혈액 샘플은 3% 헤타스타치(hetastarch, Sigma Immuno Chemicals, St. Louis, MO, USA)와 1:2의 범위로 혼합하고, 65 x g으로 10분 동안 원심분리하여, 적혈구(erythrocyte)를 침전시켰다. 상청액 세포(백혈구, leukocyte)는 PBS에 농도가 1x106 cells/mL이 되도록 하였다. 분리된 백혈구 100 ㎕(1x106 cfu)를 플로오레세인이소티오시안산염(fluorescein isothiocyanate , FITC)-표지된 항-CD3, 비오틴(biotin, BIOT)-표지된 항-CD4 그리고 피코에리트린(phycoerythrin, PE)-표지된 항-CD8a(Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) 단일클론 항체와 함께 배양하였고, 상기 배양은 암상태에서 4 ℃의 온도로 30 분 동안 수행하였다. 상기 배양물을 PBS로 세척하고, 세포는 100 ㎕ PBS 에 재현탁되었고, 다시 알로피코시아닌(allophycocyanin, APC)-표지된 스트렙타아비딘(streptavidin)(Southern Biotech, Birmingham, AL, USA)와 함께 암상태에서 4 ℃의 온도로 30 분 동안 배양되었다. 이를 다시 세척하고, 모든 샘플은 FACS Calibur(BD Bioscience, Heidelberg, Germany)로 분석되었다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 추가 면역접종 후 7일 째 되는 날, CD3+CD4+ T 세포의 세포수는 B, C 및 D 그룹에서 각각 51.0 ± 1.6, 53.0 ± 2.1 및 47.8 ± 5.7으로 음성대조군 4(40.9 ± 2.0)와 비교하여 현저하게 상승된 것을 확인하였다. 또한 CD3+CD8+ T 세포는 B, C 및 D 그룹에서 각각 14.6 ± 1.1, 14.1 ± 0.5 및 15.7 ± 1.1으로, 음성대조군 4(8.5 ± 0.3)와 비교하여 현저하게 상승된 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 백신균주JOL1355(KCTC12557BP)를 포함하는 경우 백신을 투여하는 개체에서 T세포의 면역 반응이 효과적으로 유도되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 JOL1355 균주의 경우 높은 안전성을 가지면서도 T 세포성 면역에서 종래의 균주들과 동일한 수준의 우수한 면역활성을 유도하면서도, 부작용이 극히 낮은 안전한 백신을 제조할 수 있음을 확인 하였다.
2-4. JOL1355 균주의 방어력 확인
야생형 SG 균주 JOL422를 도전접종 균주로 이용하였고, 도전접종은 각각의 닭에 대하여 100 ㎕ 세균 현탁액(1 x 106 cfu)을 경구 투여하는 방법으로 수행하였다. 상기 도전접종된 닭은 생후 11주, 추가 면역접종 후 3주 된 개체를 사용하였다. 모든 닭의 유전적 상태와 사망(mortality) 여부를 도전접종 후 14일 동안 관찰하였다. 14일 경과 후, 죽거나 살아있는 닭에 대하여 간과 비장에 세균이 잔류하였는지를 확인하였고, 그 방법은 (Matsuda et al., 2011)에 이미 공지된 방법에 따랐다. 도전접종 균주의 잔류여부는 PCR을 통하여 확인하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
Group
N
생존률 (%)		 n/N 세균 잔류
Liver Spleen
A 20 6(30) 14/20 14/20 14/20
B 20 20(100) 2/20 2/20 2/20
C 20 20(100) 3/20 3/20 3/20
D 20 18(90) 3/20 3/20 3/20
표 4에 나타낸 바와 같이, 방어력 확인 결과, B, C 및 D 그룹에서 적은 수의 개체가 미미하고 일시적인 울증을 나타냈다. 그러나 음성대조군 4(A 그룹)에서는 아주 적은 개체만 도전접종 후 우울증을 회복하였고, 대다수의 개체에서 심각한 우울증을 나타냈고, 사망하였다. 14일 동안, B(100%), C(100%) 및 D(90%) 그룹은 A 그룹(30%)과 비교하여 현저하게 높은 생존률을 나타냈다(표 3). 또한, B, C 및 D 그룹에서 간과 비장에서의 세균 잔류가 A 그룹보다 현저히 낮게 나타났고(표 3), 이러한 결과는 B, C 및 D 그룹이 A 그룹과 비교하여 도전접종 균주에 대한 더 우수한 방어력을 가짐을 나타내며, 상기 B, C 및 D 그룹 사이의 방어력은 통계적으로 유의적인 차이가 없는바, 본 발명의 JOL1355 균주의 경우 우수한 방어력과 안전성을 함께 갖는 우수한 백신 균주임을 확인 하였다.
[실험예 3] JOL1355(KCTC12557BP) 균주의 닭 골수 유래 DC의 반응 비교
3-1. 실험방법 및 재료
닭 골수로부터 수지상 세포(DC)의 증식
6-12 주된 닭으로부터 닭 BM-DCs를 획득하였다. 대퇴골과 경골을 제거하고 멸균 기기를 이용하여 주변의 근육 조직으로부터 분리하였다. 뼈를 멸균 PBS로 3 회 세척하고, 골수를 PBS로 플러싱하였다. 골수 세포 현탁액 내의 클러스터를 격렬한 피펫팅으로 분리하였다. PBS에 두 번 세척한 후, 상기 세포들을 PBS에 재현탁시키고, 총 3 ml의 세포 현탁액을 조심스럽게 3 ml Histopaque-1119 (Sigma-aldrich, St. Louis, MO, USA)에 넣고, 실온에서 40분 동안 1200 g로 원심 분리하였다. 표면의 세포층을 수집하고 RPMI-1640 배지(HyClone Laboratories, South Logan, Utah, USA)로 두 번 세척하였다. 총 1 X 106 세포를 10% 닭 혈청(Sigma-aldrich, USA), 1 % 비필수 아미노산, 1 % L-글루타민, 1 U/ml 페니실린, 1 ㎍/ml 스트렙토마이신, 50 ng/ml 재조합 닭 GM-CSF(Kingfisher Biotech, USA) 및 25 ng/ml 재조합 닭 IL-4(Kingfisher Biotech, USA)를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 5% CO2, 41℃에서 7 일간 배양하였다. 7 일 배양 동안, 2 일 마다 배지의 3/4를 상술한 필수 성분들을 함유하는 신선한 RPMI-1640 배지로 교체하여 미부착된 세포들을 제거하였다.
살모넬라 갈리나륨(S. Gallinarum)과 DC의 감염
신선한 LB 배지에 1:10으로 희석한 S. Gallinarum JOL1355를 하루 밤 동안 광학밀도(OD)600의 0.5-0.6에 도달할 때까지 배양하여, 대수적으로 증가하는 S. Gallinarum JOL1355를 획득하였다. 이후 박테리아를 멸균 PBS에 넣고 400 g에서 원심 분리하여 3 회 세척하고, 최종적인 박테리아 현탁액(항생제없이)을 RPMI에 넣었다. 7 일 째에 JOL1355로 감염시키기 위해서, DC를 세척하고 항생제가 없는 RPMI에 재현탁하여, 6 웰 세포 배양 플레이트의 웰에 시딩하였다(1 X 106 세포/웰을 함유하는 1 ml). 100 ㎕의 박테리아 현탁액을 첨가하여 DC를 감염시켜서 10 박테리아/셀의 MOI(multiplicity of infection)를 획득하였다. 감염은 5% CO2에서 2 시간 동안 40℃로 진행하였다. 2 시간 후, DC를 항생제 없는 배지로 세번 세척하고, 50 ㎍/ml의 겐타마이신을 첨가하여, 24 시간동안 세포를 인큐베이션하였다. 24 시간 인큐베이션 후, 세포를 수집하고, 유동 세포 분석(flow cytometry analysis)에 이용하거나 RNA 추출을 실시하였다. 사이토카인 발현 및 유동 세포 분석을 위하여, 양성 대조군 세포들은 50 ㎍/ml의 겐타마이신을 함유한 RPMI에 넣은 2 μg/ml의 LPS(Sigma?ldrich, St. Louis, MO)로 자극하였고, 음성 대조군의 세포들은 비-자극한 상태로 두었다. JOL1355에 의한 세포 내 감염을 정량화하기 위하여, 웰 당 1 X 106 DC를 항생제 없는 RPMI 1640에 현탁하였다. 박테리아를 M.O.I. 10일 때 첨가하고, DC 상에 200 g에서 5 분간 원심분리하여, 2 시간 인큐베이션 후. 세포들을 PBS로 3 회 세척하고 50 ㎍/ml의 겐타마이신이 보충된 신선한 RPMI에 재현탁하여 남아있는 세포외 박테리아를 사멸하였다. 감염 후 3, 6, 12, 24, 및 48 시간 (post infection, PI)에서, 상기 감염된 세포를 PBS로 3 회 세척하고, PBS에 넣은 1% 트리톤 X-100으로 용해하였다. BGA(Brilliant Green Agar) 플레이트 상에 일련의 10 배 희석액을 플레이팅함으로써 세포 생존 박테리아(viable intracellular bacteria) 수를 결정하였다.
유동 세포 계측법에 의한 세포 표면 마커의 검출
세포 표면 마커의 발현은 FACSCalibur flow cytometer(BD Biosciences, USA)로 분석하였다. 닭 CD40, CD80, 및 MHC Class II에 대한 단일 클론 항체는 미국 ABD Serotec에서 구입하였다. DC를 0.5% BSA 및 0.005% NaN3(FACS 버퍼)가 보충된 PBS에 재현탁하고, 마우스 항-닭 CD40 또는 마우스 항-닭 CD80 또는 FITC-표지 마우스 항-닭 MHC Class II 항체를 얼음에 30 분 동안 인큐베이션한 후, FACS 버퍼로 세척하고, 5 분 동안 1500 rpm에서 원심 분리하였다. 마우스 항-닭 CD40 또는 마우스 항-닭 CD80이 부착된 세포의 2차 염색을 위해, FITC-결합 염소 항-마우스 IgG(H/L) 항체(Abd Serotec, USA)를 적절히 희석한 희석액과 함께 세포를 인큐베이션하였다. 총 100,000 이벤트를 FACSCalibur flow cytometer를 사용하여 수집하였다. 데이터는 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
살모넬라 갈리나륨 감염 후 DC의 사이토카인 유전자 발현의 분석
24 시간 후 감염에서, 세포를 PBS로 한번 세척하고, 용해하여 하이브리드-R RNA 추출 키트 (GeneAll, 한국)를 사용하여 RNA를 추출하였다. 분리된 총 RNA는 DNase 1(Promega, USA)로 처리 하하였다. DNase 처리된 총 RNA는 High Capacity cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, USA).를 사용하여 역전사하였다. 공공 데이터베이스에서 사용할 수 있는 서열들을 기반으로 하여 닭 사이토카인에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하였다. 2X SYBR 그린 마스터 믹스(Qiagen, 독일)을 이용하여 어플라이드 바이오 시스템즈 스텝원 플러스 실시간 PCR 시스템 (Foster City, CA)에서 RT-PCR 분석을 실시하였다. 사이토카인에 대한 전사체 수준을 계산하기 위해, 임계 사이클 (CT)은 기준 유전자 B-액틴으로 정규화하였다. 비교 Ct 값 방법은, 2-△△Ct으로 계산된 유전자 발현의 변화(fold-changes)를 결정하기 위해 적용하였다.
통계 분석
사이토카인 유전자 발현 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표현된다. 통계적 차이는 맨-휘트니 U 테스트(Mann-Whitney U test)로 평가하였다. P≤0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
3-2. 닭 BMDC에서 JOL1355의 세포 내 생존 확인
닭 DC에서 JOL1355 균주의 생존을 평가하기 위해, 본 발명자들은 감염 후 박테리아의 성장을 확인하였다. JOL1355에 의한 DC의 성공적인 감염은 감염 후 3 시간에서 높은 박테리아 수로 나타났다(도 11). JOL1355이 감염 후 48 시간까지 닭 DC에서 살아남을 수 있었지만, 세포 내 박테리아의 수는 시간이 지남에 따라 감소하였다(도 11). 이러한 결과는 JOL1355가 DC를 감염시킬 수는 있지만, 계속해서 그 연장 기간 동안 닭 DC를 증식시킬 수 없다는 것을 제시한다.
3-3. JOL1355 감염에 대한 반응으로서 DC에서 증가된 공동자극 분자(costimulatory molecules)의 세포 표면 발현 확인
JOL1355 감염이 T 세포를 자극하는 중요한 분자의 DC 표면 발현을 변경하는 지를 조사하기 위해, DC를 살아있는 JOL1355로 2 시간 동안 펄싱(pulsed)하고, 추가적으로 24 시간까지 인큐베이션한 후 MHC-II, CD40 및 CD80의 표면 발현을 분석하였다. JOL1355 감염 24 시간 후 DC에서 항원 제시 및 T 세포의 자극에 관여하는 관련된 분자들의 발현 변화를 유세포 분석으로 평가하였다. 전체 배양 시간의 24 시간에서, DC 집단은 표면 MHC-II, CD40 및 CD80의 불균질 수준으로부터 이들 분자의 유사하게 높은 수준을 발현하는 보다 동일한 집단으로 바뀌었다. 비-감염된 배양과 비교하여 감염된 DC는 MHC-II, CD40, 및 CD80의 발현이 증가된 것으로 나타났다(도 12). 또한, LPS로 자극된 양성 대조군 세포는 표면 발현 MHC-II, CD40 및 CD80 마커가 상향 조절된 것으로 나타났다(도 12).
3-4. JOL1355 자극에 대한 반응으로서 DC에 의한 사이토카인 유전자 발현의 유도 확인
DC의 가장 중요한 특징 중 하나는 사이토카인을 생산하고 다른 면역 세포에 항원을 제시하는 능력이다. 이러한 이유로, 본 발명자들은 JOL1355 또는 LPS에 노출에 대한 반응으로 IL-6, IL10, 및 IFN-γ를 포함한 다수의 사이토카인의 전사체를 생산하는 배양된 닭 BM-DC의 능력을 평가하였다. 항원 자극 세포는 자극 후 24 시간에 RNA 분리를 위하여 채취하였다. 비-자극된 미성숙 DC를 대조군 시료로 이용하였다. 상기 결과는 비-자극된 대조군 세포와 비교하여, 전-염증성 사이토카인 IL-6이 JOL1355-자극 DC에 의하여 강하게 발현되는 것을 보여준다(도 13). 또한, LPS-자극 DC는 상당한 IL-6 유전자 발현을 유도하였다. 또한, JOL1355-자극 DC에서 IFN-γ과 IL10의 유전자 발현은 비-자극 DC과 비교하여 유의하게 증가되었다(도 13). 또한, LPS-자극 양성 대조군 DC는 대조군인 비-자극 배양에 비교해 모든 타겟 사이토카인 유전자가 유의하게 높게 발현하였다(P ≥ 0.05).
백신 항원은 면역 시스템에 직접 제시되지 않으나, 제일 먼저 포획되고, 처리되어, 예컨대 DC와 같은 항원-제시 분자에 결합하여야 한다. 높은 면역 반응을 유도하는 백신을 개발하기 위한 가장 좋은 방법은 병원균이 수행하는 것과 동일한 방식으로 DC를 자극하는 것이다. 이상적인 백신 균주는 APC에 대하여 고도로 감염성이 있을 뿐만 아니라 병원균의 억제되지 않는 증식을 방지하기 위해 숙주 세포의 항균 방어 메커니즘에 민감한 것이다. 본 연구에서는 생 약독화 SG 백신 후보(JOL1355)와 상호 작용하는 닭 골수 BM-DC의 능력은 특정 관심이었다. DC의 성숙은 림프 기관으로의 이동을 촉진하고 APC의 전체, T 세포 자극 능력을 유도하기 위해 필수적인 일련의 변화를 포함한다. 본 연구에서는 JOL1355 감염이 닭 BM-DC의 성숙을 유도하는 것으로 나타났다. JOL1355가 발생시킨 닭 DC는 CD40, CD80, 및 MHC-II 분자의 표면 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 또한, DC 활성화 과정 동안 방출된 천연 사이토카인은 자극된 면역 반응의 유형을 정의하기 위한 중요한 파라미터이다. 본 실험에서, JOL1355 또는 LPS에 노출된 닭 미성숙 DC는 IL6, IL-10 및 IFN-γ의 합성을 상향-조절시켰다(up-regulated). 이러한 데이터는 JOL1355가 강하게 닭 BM-DC의 활성화 및 성숙을 유도하고 그 결과 DCs는 적응성 면역 반응에 대한 SG 항원을 전송한다는 것을 제시한다.
결론적으로, 본 발명자들은 최초로, 생 약독화된(live attenuated) SG 백신 균주로 닭 유래 BM-DC가 표현형 및 기능적으로 성숙되도록 하였고, 이는 CD40, CD80, 및 MHC-II 마커와 사이토카인 발현의 상향-조절에 의하여 증명되었다. 인 비트로 상에서 확인된 JOL1355에 대한 닭 DC의 반응은 생 약독화 백신이 생체 내에서 어떻게 분명한 면역학적 반응을 유도하는 지 이해하는 데 도움이 될 것이다.
[실험예 4] JOL1355(KCTC12557BP) 균주 백신 접종 시 동물의 내부장기에 미치는 영향 확인
닭에서 백신을 접종한 후 간, 신장 췌장 등 주요 대사를 담당하는 장기에 영향을 미치는지의 여부와 생균 접종에 따른 병원성 미생물의 감염 및 염증 여부, 빈혈 등과 같은 부작용 여부를 측정하기 위해 백신(JOL1355)을 접종하지 않은 닭과 백신을 접종한 닭을 대상으로 이들을 직접, 간접적인 수치로 비교하기 위해 혈청에서의 생화학적 검사와 혈액학적 검사를 실시하였다.
백신을 접종 한 후 7 일째에 닭으로부터 혈액을 채취하여 헤파린이 함유된 진공채혈관 (녹십자)을 통해 채혈한 전혈을 대상으로 하여 혈액학적 검사를 수행하였다. 또한 혈청을 분리하여 혈청에서의 생화학적 검사를 hematology analyzer (DRI-CHEM 3500i, FuJIFILM)을 이용하여 분석하였다.
4-1. 혈액생화학적 검사 결과
닭에 백신을 접종한 후 접종된 백신이 간, 조혈기관, 신장, 췌장 등 주요 장기에 영향을 미치는지를 알아보기 위해, 백신을 접종 하지 않은 닭 25수(PBS 접종) 와 추천되는 량 10배 (2x108)의 백신을 접종한 닭 25수로부터 혈청을 채취하여 이들 기관과 밀접한 관련이 있는 혈액에서의 생화학적 검사를 실시하였다. 그 결과는 표 5에서 보는 바와 같이 백신을 처치한 군에서의 생화학 수치가 백신을 접종하지 않은 군에서의 생화학 수치와 통계학적 차이가 없었다. 이는 간 (ALB, ALP, AST, CHO, GLU, BUN, LDH), 뼈 (ALP), 신장 (BUN, URE), 영양 (GLU, CHO, ALB), 췌장 (GGST) 등 주요 대사를 담당하는 장기 기능에 백신이 영향을 미치지 않았음을 증명하는 것이다.
Figure 112015017776132-pat00001
ALB: albumin, ALP: alkaline phosphatase, ALT: alanine aminotransferase, AST: aspartate aminotransgerase, CA: calcium, CHO: total cholesterol, GLU: glucose, PHO: phosphate, TP: total protein, BIL: total bilirubin, LDH: lactic acid dehydrogenase, TG: triglycerides, AMY: amylase.
4-2. 혈액학적 검사 결과
닭에서 백신을 접종한 후 발생할 수 있는 부작용 여부를 확인하기 위해 백신을 접종 하지 않은 닭 25수와 추천되는 량의 10배 백신을 접종한 닭 25수로부터 혈액을 채취하여 혈액학적 검사를 실시하였다. 그 결과 표 6에서 보는 바와 같이 병원성 미생물의 감염 및 염증 여부, 빈혈 등의 지표가 되는 혈액학적 수치들에 대한 결과는 모든 백신을 접종하지 않은 (PBS 접종) 대조군의 수치와 크게 다르지 않아 백신 접종이 닭의 전반적인 건강에 유해한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
Figure 112015017776132-pat00002
WBC: white blood cells, HGB: hemoglobin, HCT: hematocrit, MCH: mean corpusclar hemoglobin, MCHC: mean corpuscular hemoglobin concentration, RDW: red cell distribution width, MPV: mean platelet volume
[실험예 5] 애쥬번트 단백질을 분비하는 가금티푸스에 대한 살모넬라 갈리나룸 생백신 후보의 방어 효과 확인
실험방법 및 재료
0.6의 600의 OD (optical density)에서 37℃의 온도에서 LB 부로스에서 백신 균주 JOL1355를 배양하였다. 회수된 세포를 펠렛을 획득하기 위하여 16,100 × g으로 5분간 원심분리하였으며, PBS에 재부유하고, 새에 접종하기 전에 적절한 농도로 조절하여 SG 분비 LTB 백신 후보를 제조하였다.
LTB-분비 균주 JOL1355에서의 플라스미드의 안정성 실험
플라스미드 안정성 실험을 위하여, 4, 5, 6 주령의 시기에 JOL1355와 1 × 108 CFUs 를 포함하는 세균 현탁액의 200 ㎕을 근육내로 접종하였다. JOL1355 의 분변 배출 (fecal shedding) 실험을 위하여, 2군의 새 (1군당 10마리)를 4주령에 1 × 108 CFUs를 포함하는 세균 현탁액 200 ㎕로 JOL1355를 근육내 및 경구로 접종하였다.
닭에게 면역조치된 JOL1355내에서의 플라스미드의 안정성은 동물 3 계대를 통하여 실험하였다. 면역 조치 1일 후 간과 비장으로부터 JOL1355를 분리하였다. JOL1355 균주의 존재는 lon, cpxR, 및 LTB 프라이머를 이용한 PCR를 통하여 확인하였다. 회수된 JOL1355 구ㅠㄴ주를 2차 면역조치에 사용하였으며, JOl1355 내의 플라스미드의 존재를 동일한 과정으로 분리 및 확인하였다. 그 다음, 제 2의 in vivo 계대 후 분리된 JOL1355 균주를 3차 면역조치에 사용하였으며, 분리 및 PCR을 이용한 확인을 수행하였다.
또한, 면역조치 후 JOL1355의 분변 배출 (Fecal shedding)을 확인하였다. 멸균된 BPW (buffered peptone water) (Becton, Dickinson and Company, USA)의 5ml내로 분변 샘플을 수집하여, 사전-농축 배양물을 생성하였다. 사전-농축 배양물의 10배의 연속 희석물은 플레이트의 BGA (brilliant green agar) (Becton, Dickinson and Company) 배지에 도말하였으며, 플레이트는 37℃에서 밤새 배양하였다. 사전-농축 후 챌린지 균주 (challenge strain)에 음성인 샘플을 Rappaport-Vassiliadis R10 broth (RV) (Becton, Dickinson and Company)에 48시간동안 42℃에서 배양함으로써 농축하였다. 그 다음, 농축된 배양물의 멸균된 루프 (loops)를 BGA 배지상에 도말하였다.
백신 후보의 안정성 검사
총 100마리의 닭을 50마리의 동일한 2개의 군으로 분류하였다(n = 25): 예방접종 군 및 대조군.
예방 접종군은 닭 당 JOL1355의 1 × 108 콜로니 형성 단위 (CFU)로 근육 내 접종하였다. 대조군은 PBS (100 μL , pH 7.4)로 근육 내 접종 하였다. 닭을 4주령 및 8주령 각각에 프라이밍 (primed)및 부스팅 (boosted)되었다. 대조군 A 닭은 4, 8 주령에 PBS로 근육 내 접종 하였다. 그룹 B 닭 은 1 × 108 CFUs를 포함하는 JOL1355의 세균 현탁액 200 μL로 프라이밍 및 부스팅하였다.
챌린지 실험
SG 야생형 균주 JOL420를 병원성 챌린지 균주로서 사용하였다. SG 야생형 균주 JOL420를 동물 계대 (animal passage)하고 챌린지 용량 준비를 위하여 간 및 비장으로부터 회수하였다.
모든 닭은 11령주 (3 주 PBI) 에서, 1 × 106 CFUs를 함유하는 세균 현탁액 200 μL 를 사용하여 JOL420를 접종하였다. 모든 닭은 병원성 SG 챌린지의 투여 후 14일 동안 일반조건 및 사망률을 실험하였다. 세균 회복을 챌린지 실험의 끝에 수행하였다.
접종 후 사망률, 총 병변 및 회복의 관찰
접종 후, 사망률을 2 주 동안 매일 측정하였다. 남아있는 모든 동물의 명백한 회복 후, 챌린지 후 2 주에, A 군과 B 군 의 모든 동물을 희생시켰다. 간 및 비장의 비대해지고 괴저성 반점의 총 변변을 각 병변 에 대하여, 0, 1, 2, 또는 3의 점수를 부여하였다. 0 의 점수는 병변이 없는 것을 나타내며, 더 높은 점수는 더 심한 병변을 나타낸다. 세균 회복을 위하여, 간 및 비장의 샘플을 완충된 펩톤수 (Becton, Dickinson and Company)에서 저미고, 열거 (enumeration)를 위하여 균질현탁액 (homogenate)를 BGA 에 접종하고, 지속적으로 교반함과 동시에 37℃에서 밤새 배양하였으며, 뒤이어, Rappaport-Vassiliadis R10 broth (Becton, Dickinson and Company)에 48 시간동안 42℃에서 배양하였다.
농축 브로스 (broth)의 루프를 BGA 상에서 스트리킹 (streaked) 하고, 살모넬라 형 콜로니를 24 시간 동안 37℃에서 배양 후 조사 하였다.
통계적 분석
달리 명시되지 않는 한 모든 데이터는 평균 ± 표준편차 의 값으로 표현된다. 분석은 SPSS 16.0 program (SPSS Inc.) 로 수행 하였다.
병변 점수의 유의차에 대한 짝분석 (pair-wise analysis)를 위하여 Mann-Whitney U 시험을 사용하였고, 접종된 균수와 양성 대조군을 음성 대조군과 비교 하였다. 양성률 및 사망률의 유의차를 위하여 Chi-square 시험을 수행하였다. 모든 분석은 단측 (one-tailed)이며, 통계적 유의성은 P 값 <0.05으로 확인하였다.
5.1 LTB-분비 균주 JOL1355의 플라스미드 안정성의 확인
제 1, 제2 및 제3 계대 후 닭의 간 및 비장으로부터 LTB 분비 균주 JOL1355를 분리하고, lon, cpxR 및 LTB에 대한 PCR로 확인하였다(도 1, 2, 및 3). 제3 계대 후에 면역 조치된 닭의 간 및 비장으로부터 분리된 LTB 분비 균주 JOL1355는 닭 내 iv vivo 번식 후 JOL1355 내의 플라스미드가 안정적임을 나타내었다. 도 14, 15 및 16은 각각 PCR을 통한 lon, cpxR, 및 LTB 유전자의 확인 결과를 나타낸다.
이는 백신균주는 백신으로써 동물에 사용하여도 그 사용횟수에 상관없이 균주가 안정적이고 변이나 Plasmid 에 변화가 없음을 의미한다.
5.2 면역 조치후 JOL1355 분변 배출의 확인
LTB 애주번트 균주 JOL355의 분변 배출을 구강 및 근육 내 면역 조치 후, 1, 2, 3, 5, 7, 8, 15, 21일 시점에서 모니터링하였다.
열마리의 경구 및 근육 접종 닭으로부터 각각 BPW 로 분변 샘플을 수집하고 이를 균질화하였다. 상술한 바와 같이, 열거 및 이후 농축 배양을 실시 하였다. 백신 균주를 위하여 lon, 및 cpxR를 이용한 PCR로 양성 콜로니를 확인하였다.
경구 접종한 군에서는 새 한마리 만이 1일에서 JOL1355 분비를 PCR을 통하여 확인하였으며, 면역조치 후 2, 3, 5, 7,9,11,15 및 21 에서는 분변 샘플에서 분리되지 않았다. 근육 내 면역된 군에서는 면역 조치후 21일 간 JOL1355이 분리되지 않았다. 결과를 표 7에 나타내었다.
백신균주는 생균이기에 분변으로 배출되어 환경에 오염이 없어야 한다. 이 실험은 백신균주를 근육으로 접종했을 때 균 배출이 전혀 없었고, 경구로 접종했을 때 접종 후 첫날 만 10마리중 1마리에서 배출될 뿐 그 외는 전혀 배출이 없어 환경에 매우 안전한 백신균주임을 나타낸다.
Day post Immunization Route No of positive samples/Total birds screened
1 Oral 1/10
Intramuscular 0/10
3 Oral 0/10
Intramuscular 0/10
5 Oral 0/10
Intramuscular 0/10
7 Oral 0/10
Intramuscular 0/10
9 Oral 0/10
Intramuscular 0/10
11 Oral 0/10
Intramuscular 0/10
15 Oral 0/10
Intramuscular 0/10
21 Oral 0/10
Intramuscular 0/10
5.3 야생형 챌린지에 대한 방어 효과 확인
5.3.1 닭에서 LTB 분비 SG 백신 후보 (JOL1355)의 안정성 확인
닭에 SG 분비 LTB 백신 후보 (JOL1355)로 4 및 8주령에 각각 프라이밍 및 부스팅하였다. 백신의 안전성을 평가하기 위해 임상 증상 및 사망률을 포함하는 파라미터를 접종 후 측정 하였다. 면역화된 군 모두에서 백신과 연관된 사망률은 확인되지 않았다. 또한, 새들은 접종 후 식욕 부진, 설사, 또는 우울증의 증상 없이 건강하게 생존하였다. 이는 백신균주 주입 후 닭에서 아무런 이상 임상증상이 없음을 보여 주며 백신이 부작용이 없음을 보여준다.
3.3.2 병원성 챌린지에 대한 방어 효과의 확인
챌린지 후 14일 간 면역조치된 군 및 대조군에서 일반조건 및 생존률을 기반으로 방어 효과를 평가하였다.
JOL1355를 포함하는 본 발명자의 이전 연구를 바탕으로, 새들을 1x108 CFUs JOL1355를 근육 주사로 접종하고, 이후 LTB 분비 SG 백신 후보 (JOL1355) 병원성 챌린지에 대한 보호 효과를 조사하기 위해, 11주령 (3 주 PBI)에 챌린지 균주를 경구를 통하여 접종하였다. 챌린지 후 14일 간 새의 생존율을 관찰하였다. 각 군당 25마리의 새를 이용하여 보호 효과를 2회씩 확인하였다.
병원성 챌린지 후, 면역접종된 군의 몇마리의 새에서 우울증이 나타났으나, 그 후 명백한 회복을 나타낸 반면, 대조군의 새들은 사료 섭취의 감소, 심한 우울증 및 이후 사망률의 증가를 나타내었다.
비면역군에 비하여 JOL1355 면역화된 군에서 유의적인 보호효과 및 생존율을 나타내었다.
백신을 접종 한 그룹의 사망이 8 일 및 12일에 한하여 확인된 반면, 대조군에서 최초 사망이 챌린지 후 6일에 관찰되었으며, 챌린지 후 14일 동안 사망이 꾸준히 관찰되었다(표 8). 면역화 그룹은 46 % 사망률를 보인 비-면역화 대조군에 비하여, 유의적으로 낮은 사망률인 4 %를 나타내었다(표 9).
면역 후 14일에, JOL1355의 보호 효과를 평가하기 위하여, 부검 검사를 위해 각 군의 생존한 닭을 희생시켰다. 상술한 바와 같이, 간 및 비장에 존재하는 비대화, 및 흰색 괴사 반점을 0 내지 3으로 점수를 부여하였다.
면역화된 군의 장기의 병변 점수의 평균을 비면역화된 대조군의 것과 비교하였다.
JOL1355 면역화된 군은 대조군에 비하여 현저히 낮은 병변 점수를 나타내었다 (p<0.001)(표 9).
세균 회복을 14일 경의 면역화된 군 및 대조군으로부터 생존한 새의 간 및 비장에서 수행하였다. 면역화 및 제어 그룹의 간 및 비장에서 세균 회복 사이에 유의한 차이는 없었다.
이는 백신균주가 가금티푸스균에 의해 감염을 방어하는 지에 대한 탁월한 방어효과를 보여준다.
Figure 112015017776132-pat00003
Figure 112015017776132-pat00004
한국생명공학연구원 KCTC12557BP 20140212

Claims (9)

  1. 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum, KCTC12557BP) 균주를 유효성분으로 포함하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 가금티푸스 예방용 백신 조성물은 경구 또는 근육 접종용인 것인, 가금티푸스 예방용 백신 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum, KCTC12557BP)는 생균인 것을 특징으로 하는 가금티푸스 예방용 백신 조성물.
  4. 제1항의 백신 조성물을 조류에 접종하는 단계;를 포함하는 가금티푸스 예방 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 1Ⅹ105 내지 1Ⅹ109 cfu/200㎕/개체로 접종 하는 것인, 가금티푸스 예방 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 조류는 닭, 오리, 칠면조, 매추리, 물새, 비둘기, 카나리아 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 가금티푸스 예방 방법.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 예방 방법은 제1항의 백신 조성물을 개체에 1차 접종하는 단계; 및
    상기 1차 접종된 날로부터 2 주 내지 4주 후에 제1차의 백신 조성물을 2차 접종하는 단계를 포함하는 것인, 가금티푸스 예방 방법.
  8. KCTC12557BP의 수탁번호를 갖는 살모넬라 엔테리카 혈청 갈리나룸(Salmonella enterica serova Gallinarum).
  9. 제8항의 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum, KCTC12557BP) 균주를 포함하는 가금티푸스 예방용 사료첨가용 조성물.
KR1020150025378A 2014-02-20 2015-02-23 안전성이 강화된 가금티푸스용 백신 조성물 KR101605020B1 (ko)

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