KR20120129777A

KR20120129777A - 약독화, 면역강화 살모넬라 엔테리티디스의 변이균주를 포함하는 살모넬라증 예방용 생균 백신 조성물

Info

Publication number: KR20120129777A
Application number: KR1020120051220A
Authority: KR
Inventors: 이존화; 라훌 난드래; 기꾸 마쓰다
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2011-05-17
Filing date: 2012-05-15
Publication date: 2012-11-28
Also published as: KR101481789B1

Abstract

본 발명은 숙주침입관련 병원체 유전자 및 그 기능이 상실된 살모넬라 엔테리티디스의 약독화 변이균주; 살모넬라 엔테리티디스의 면역강화 변이균주; 또는 이들의 조합을 포함하는 살모넬라증 예방용 생균 백신 조성물 및 이들을 접종하여 조류에서 살모넬라 엔테리티디스 균의 난계대 오염을 예방하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약독화, 면역강화 변이균주는 가금류에 투여시 편리하게 경구접종이 가능하며, 이 경우 더욱 효과적으로 예방능력을 제공할 수 있고, 유전자 2개가 동시에 결실되어 있어 가금에 투여 시, 병원성 회복의 우려가 낮아 방어력이 우수하면서도 안전하다. 또한, 숙주점막세포 부착력 및 침입력, 면역 유도력이 우수할 뿐만 아니라 백신에 의한 계란오염을 일으키지 않아서 안전하다. 또한, 본 발명에 따른 백신 조성물을 혼합 접종하면 야생균주로 인한 감염 및 계란오염을 매우 효과적으로 방어할 수 있으므로, 본 발명의 약독화, 면역강화 변이균주는 살모넬라증을 예방하는 생균 백신 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

약독화, 면역강화 살모넬라 엔테리티디스의 변이균주를 포함하는 살모넬라증 예방용 생균 백신 조성물 {Vaccine composition comprising attenuated and immunopotentiated mutant of Salmonella Enteritidis for preventing salmonellosis}

본 발명은 숙주침입관련 병원체 유전자 및 그 기능이 상실된 살모넬라 엔테리티디스의 약독화 변이균주; 살모넬라 엔테리티디스의 면역강화 변이균주; 또는 이들의 조합을 포함하는 살모넬라증 예방용 생균 백신 조성물 및 이들을 접종하여 조류에서 살모넬라 엔테리티디스 균의 난계대 오염을 예방하는 방법에 관한 것이다.

사람의 식중독 원인의 가장 중요한 원인체인 살모넬라균은 1886년 수의세균학자 Salmon에 의해 처음으로 분리 보고된 이후, LPS(lipopolysaccharide)의 O-항원과 편모 단백질 (H-antigen)에 대한 혈청학적 반응에 따라 현재까지 약 2,500종이 넘는 혈청형이 보고되어 있다. 지구 환경 거의 모든 동식물에 살모넬라균이 분포되어 있지만 (Nolan et al. 1991, Poppe et al. 1992), 지금까지 자연계에서 발견된 살모넬라균 중 절반 이상은 조류에서 분리된 것이며 Salmonella spp. 의 보균숙주로서 조류의 역할이 중요한 것으로 추정되고 있다. 사람이 Salmonella에 오염된 식품을 섭취하게 되면 12~48시간 후에 급성위장염의 증상이 나타나며, 주로 설사, 복통, 구토, 38~40℃정도의 발열이 나타난다. 저항력이 없거나 강건한 환자의 경우에도 경우에 따라 패혈증으로 사망에 이르기도 한다.

사람의 살모넬라 감염증은 두 가지 형태로 분류되는데, 하나는 살모넬라 티피(Salmonella Typhi)균이 사람에 감염되어 배출되는 인분(人糞)을 통해 감염되며, 위생관리가 불충분한 경우에 주로 문제가 되는 장티푸스형 살모넬라증(typhoidal salmonellosis)이고, 다른 하나는 비-장티푸스형 살모넬라증(non-typhoidal salmonellosis)으로서 20세기 후반부터 미국과 서유럽 등 장티푸스형 살모넬라증을 극복한 나라에서도 축산업 형태의 변화와 축산물 가공 및 보존과 관련되어 공중보건학적으로 커다란 위협을 주고 있는 살모넬라증이다. 우리나라에서도 해마다 비-장티푸스형 살모넬라증을 유발하는 살모넬라균에 의한 식중독이 발생되고 있어 대책마련이 시급한 실정이다.

선진국형 살모넬라증인 사람의 비-장티푸스형 살모넬라증에서 문제가 되는 혈청형은 나라마다 지역별로 차이가 있으나 주로 S. Enteritidis 인 것으로 알려져 있다. 우리나라에서도 1997년 조사자료에 의하면 S. Enteritidis (44.1%), S. Typhimurium (23.5%)으로 서양국가들과 동일한 유행경향을 보이고 있으며, S. Enteritidis가 주류를 이루는 것으로 보고되었다 (김 등. 1998). 이처럼, S. Enteritidis의 인체감염 문제가 부각되면서 이를 예방하기 위한 사균백신(bacterin) 및 생균백신의 개발 및 실용화가 신속하게 이루어지고 있다.

현재 실용화되어 있는 백신은 5가지 정도가 있다. ①Megan™Vac 1 (Megan Health사)는 약독화 S. Typhimurium △cya△crp균주(Hassan JO and Curtiss, 1990, 1997) 를 가금류에 접종함으로 S. Typhimurium 및 S. Enteritidis 감염을 예방하는 목적으로 미국, New Zealand, Dominican 공화국에서 사용되고 있다. 그러나 그 방어력이 충분하지 않다는 지적이 있다. 이는 백신균주로 살모넬라 타이피무리움을 이용한 데다가, 세균의 생존에 필수적인 대사와 관련된 유전자인 cya 및 crp 유전자를 결손시켰기 때문인 것으로 판단된다. Cya와 crp유전자의 결손시 세균은 말토오스를 포함한 당질발효능력을 잃게 되어 생존능력이 현저히 저하됨으로 약독화가 이루어진다. 또한 ②SG9R (가금티푸스 예방백신, Intervet/Schering-Plough Animal Health사)을 S. Enteritidis 예방에 전용(轉用)하기도 한다 (Feberwee et al. 2001). 그러나, 같은 살모넬라균이라도 혈청형이 다른 경우는 혈청형이 같은 경우보다 방어력이 떨어진다는 단점이 있다. ③TAD Salmonella vac® E 및 T (Lohmann Animal Health사, Germany)는 S. Typhimurium 및 S. Typhimurium 를 화학적으로 돌연변이시킨 변이균주이다 (Schroder, 2002, Gantois et al., 2006). 기타 사균백신으로는 ④오일 에멀젼 사균백신 (Miyamoto et al. 1999) 및 ⑤노빌리스 살렌박 (iron-restricted S. Enteritidis 의 박테린, Woodward et al. 2002) (Intervet/Schering-Plough Animal Health사)이 있다.

사균백신(④,⑤)의 이용은 농장에 아직 생균백신을 도입하지 않고자 하는 국가에서 적합하며 계란오염 방지 등 어느 정도 효과를 보이고는 있으나, 일반적으로 생균백신의 방어력이 더 우수하다. 그러나, 생균백신 중에서 ②SG9R 및 ③TAD Salmonella vac^®은 유전학적으로 규정되지 않은 변이균주로서 안전성 및 안정성에 문제가 있다. 예를 들어 ②SG9R은 실험실내에서 만들어진 R-타입 약독균주이지만, S-타입으로 병원성을 회복할 가능성이 있다. 또한, 화학적 돌연변이(chemo-mutagenesis)로 제작된 균주도 유전적으로 배경을 알 수 없을 뿐 더러 그 유전형질의 안정성 자체를 논의할 수 없는 약점이 있다.

그럼에도 이러한 백신은 가금류에 접종하여 방어면역을 유도함으로 분변으로의 세균배출과 산란계 조직내 정착을 감소시키는데 성공하였다. 하지만, 최종 목표인 계란의 오염을 방어하는 데까지는 그 효과가 미치지 못하였고(Gantois et al., 2006; Miyamoto et al., 1999), 계란오염을 줄일 수는 있었어도 완전히 방어할 수 는 없었다. 즉, 현재까지의 백신기술로는 계란오염을 완벽하게 막는 데 성공하지 못하였다. 이는 살모넬라 엔테리티디스가 조류의 생식기, 특히 난소(ovary)에 임상증상 없이 정착할 수 있는 성질 때문이다. 예컨대, TAD Salmonella vac^® 의 경우도 백신 접종한 동물의 공격 접종 후 난소의 감염율은, 야생균주(wild type)를 인공감염시킨 대조군(23/29)에 비해 감소(11/30~17/30)되긴 하였으나 여전히 상당히 높은 실정이다(Gantois et al., 2006).

따라서, 약독화 균주의 병원성의 회복을 방지하여 안전하면서도 유전형질이 안정적이고, 난계대 오염을 충분히 방어함으로써 사람의 식중독을 예방할 수 있는 안전한 생균백신의 개발이 절실히 요구되고 있다.

본 발명자들은 사람의 식중독을 예방할 수 있는 안전한 생균 백신에 대해 연구하던 중, 약독화, 면역강화 변이균주를 어린 일령의 병아리에 접종한 후 변이균주의 접종에 의한 병변이 발생하지 않고, 상기 변이균주를 병아리에 반복 접종하자 세포성, 체액성 면역반응이 우수하게 일어나며, 상기 변이균주의 접종 후 야생균주를 공격접종한 경우에도 야생균주를 효과적으로 방어할 뿐만 아니라 계란으로의 난계대 오염이 방어되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 숙주침입관련 병원체 유전자 및 그 기능이 상실된 살모넬라 엔테리티디스의 약독화 변이균주; 면역강화 변이균주; 또는 이들의 조합을 포함하는 살모넬라증 예방용 생균 백신 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 살모넬라 엔테리티디스의 약독화 변이균주; 면역강화 변이균주; 또는 이들의 조합을 조류에 접종하여, 조류에서 살모넬라 엔테리티디스 균의 난계대 오염을 예방하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 살모넬라 엔테리티디스균의 염색체 DNA에서 lon 및 cpxR 유전자가 결실된 약독화 변이균주; 살모넬라 엔테리티디스균의 염색체 DNA에서 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실되고, 대장균(Escherichia coli)의 LTB(heat-labile toxin subunit B)를 발현하는 면역강화 변이균주; 또는 이들의 조합을 포함하는, 살모넬라증 예방용 생균 백신 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 살모넬라 엔테리티디스의 약독화 변이균주; 면역강화 변이균주; 또는 이들의 조합을 조류에 접종하여, 조류에서 살모넬라 엔테리티디스 균의 난계대 오염을 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 약독화, 면역강화 변이균주는 가금류에 투여시 편리하게 경구접종이 가능하며, 이 경우 더욱 효과적으로 예방능력을 제공할 수 있고, 유전자 2개가 동시에 결실되어 있어 가금에 투여 시, 병원성 회복의 우려가 낮아 방어력이 우수하면서도 안전하다. 또한, 숙주점막세포 부착력 및 침입력, 면역 유도력이 우수할 뿐만 아니라 백신에 의한 계란오염을 일으키지 않아서 안전하다. 또한, 본 발명에 따른 백신 조성물을 혼합 접종하면 야생균주로 인한 감염 및 계란오염을 매우 효과적으로 방어할 수 있으므로, 본 발명의 약독화, 면역강화 변이균주는 살모넬라증을 예방하는 생균 백신 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 살모넬라 엔테리티디스 △lon △cpxR 변이균주(JOL919)를 닭 살모넬라증을 예방하고 인체 살모넬라 감염증을 예방하는 백신으로 적용하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 1일령 병아리에서 변이균주의 세포성 면역 유도력을 변이 이전의 야생균주(wild type)와 비교한 도이다.
도 3은 1일령 병아리에서 변이균주의 점막면역 유도력을 변이 이전의 야생균주와 비교한 도이다.
도 4는 1일령 병아리에서 변이균주의 체액성면역 유도력을 변이 이전의 야생균주와 비교한 도이다.
도 5는 1일령 및 5주령에 백신접종시 세포성면역을 나타낸 도이다.
도 6은 1일령 및 5주령에 백신접종시 T 림프구의 분포를 나타낸 도이다.
도 7은 1일령 및 5주령에 백신접종시 체액성 면역(혈장 IgG) 및 점막면역(소장 내 IgA)의 유도 정도를 나타낸 도이다.
도 8은 1일령, 5주령, 16주령에 백신접종시 세포성면역의 유도 정도를 나타낸 도이다(A:대조군, B:경구접종, C:근육접종).
도 9는 1일령, 5주령, 16주령에 백신접종시 T 림프구의 분포를 나타낸 도이다(A:대조군, B:경구접종, C:근육접종).
도 10은 1일령, 5주령, 16주령에 백신접종시 체액성면역(혈장 IgG), 점막면역(소장 내 IgA)의 유도 정도를 나타낸 도이다.
도 11은　1일령, 5주령, 16주령에 백신접종 후 야생균주의 공격 접종시 산란율을 나타낸 도이다(A:대조군, B:경구접종, C:근육접종)
　 도 12은 LTB(heat-labile toxin subunit B)를 발현하는 pJHL165-LTB 백터를 나타낸 도이다.
도 13은 면역원성이 강화된 백신균주(JOL1228)를 나타낸 도이다.

또한, 본 발명은 상기 살모넬라 엔테리티디스의 약독화 변이균주; 면역강화 변이균주; 또는 이들의 조합을 조류에 혼합 접종하여, 조류에서 살모넬라 엔테리티디스 균의 난계대 오염을 예방하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명의 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)는 살모넬라(Salmonella)속의 세균성 감염형 식중독의 원인균으로 장염균이라고도 한다. 이 균은 살모넬라의 대표적인 균으로 모든 동물에서 감염을 일으킬 수 있고 숙주 적응력이 매우 높다. 주모(周毛)를 가지고 있어 운동성이 있는 그람음성의 통성 혐기성 간균이다. 유당 분해력이 없고, 인돌을 형성하지 않으며, 황화수소를 생성하지 않아 대장균과는 구별된다. 발육 최적 온도는 35~37℃이고 증식이 가능한 온도 범위는 10~43℃이며, 60℃에서 20분간 가열로 사멸한다. 최적 pH는 7.2~7.4이다. 크기는 0.5~0.8×3~4μ이다. 살모넬라 엔테라이티디스는 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium)과 살모넬라 더비(Salmonella derby) 등과 함께 돼지에게 급성 및 만성 장염을 일으키는 원인균 중의 하나이다.

본 발명에서는 사람 식중독의 주요 원인인 살모넬라 엔테리티디스의 염색체 DNA에서 lon 및 cpxR 유전자를 결실시켜 살모넬라증 예방용 생균 백신 조성물을 제조한다. 본 발명에서 lon 및 cpxR 유전자 제거는 공지의 유전공학적 방법을 통해 달성 가능하다. 예를 들면, S. Enteritidis 야생균주 JOL860 (표 1)에서 자살벡터 pMEG375 (by Dr.CurtissR.III. Dozoisetal., 2003)를 이용한다. 제조방법은 Kim SW 등 (2009, J Microbiol Methods. 79:314-320)의 방법을 이용할 수 있다. 얻어진 변이균주를 JOL919라 한다. 또한, 자살벡터를 이용한 동종접합 교환(alleic exchange)으로 해당유전자 염기서열 전체를 교체시켜 유전자를 결실시킬 수 있다.

살모넬라 타이피무리움의 경우 살모넬라 타이피무리움 균주에서 상기의 유전자를 결실시키는 공지의 방법은 그 주요 목적이 살모넬라 타이피무리움의 감염을 예방하려는 것이 아니라, 살모넬라균을 외래항원의 운반체로 이용하는 것을 목적으로 한다. 그러나 본 발명은 사람 식중독증의 주요 원인인 살모넬라 엔테리티디스균을 변이시켜 이를 사람 살모넬라증 예방을 위해 가금류에 접종하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 사람 식중독의 주요 원인인 살모넬라 엔테리티디스의 염색체 DNA에서 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실되고, Escherichia coli 의 LTB(heat-labile toxin subunit B)를 발현하는 면역강화 변이균주를 포함하는 살모넬라증 예방용 생균 백신 조성물을 제조한다. 본 발명에서 lon, cpxR 및 asd 유전자의 제거 및 LTB를 발현하는 벡터의 제조 및 삽입은 공지의 유전공학적 방법을 통해 달성 가능하다.

본 발명에 따른 살모넬라증 예방효과는 (i) 살모넬라 엔테리티디스의 염색체 DNA에서 lon 및 cpxR 유전자를 결실시켜 숙주세포 부착 및 침입에 관련된 특성 등을 조사하는 단계; (ii) 어린 병아리에 다양한 농도로 접종함으로 약독화 상태와 안전성을 야생균주(wild type)와 비교하는 단계; (iii) 어린 병아리에서 면역유도력을 야생균주와 비교하는 단계; (iv) 어린 병아리에서 백신접종 후 야생균주를 접종하여 방어력을 측정하는 단계; (v) 접종회수 및 백신프로그램에 따른 면역형성을 측정하는 단계; (vi) 장기적 실험에서 접종경로 및 백신프로그램에 따른 계란오염을 조사하는 단계 (백신 자체에 의한 사람 감염 여부에 관한 안전성 확인); (vii) 백신접종에 의한 야생균주의 감염으로부터 계란오염 방어력을 측정하는 단계 (사람 식중독 관련 방어력 확인)를 거쳐 확인될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 조류에게서는 조류의 살모넬라증을 예방하여 가금 파라티푸스를 예방함으로써, 사람에게서 인체 살모넬라증을 예방하고, 사람의 식중독을 예방한다.

본 발명의 대상이 되는 조류는 닭, 오리, 칠면조, 메추리, 물새, 비둘기, 카나리아 등이 될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 조류에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 경피, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 피하 내 또는 비강 경로에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 단독으로 투여할 수 있고, 면역강화 균주를 포함하는 백신 조성물과 혼합하여 투여할 수 있다. 본 발명의 약독화 균주를 포함하는 백신 조성물 및 면역강화 균주를 포함하는 백신조성물의 혼합투여시, 백신의 혼합 균수비는 약 2:1~10:1, 바람직하게는 약 5:1 이다.

본 발명의 백신 조성물의 단독 투여시, 약독화 또는 면역강화 변이균주의 투여량은 약 1X10⁶ 내지 1X10¹⁰ cfu/100μl, 바람직하게는 약 1X10⁷ cfu/마리이며, 약독화 변이균주와 면역강화 변이균주의 혼합 투여량은 약 1X10⁶ cfu/마리 내지 1X10¹⁰ cfu/마리, 바람직하게는 약 1X10⁷ cfu/마리 일 수 있으나, 임상실험 결과에 따라 가감될 수 있고, 1일령, 6주령, 16주령의 간격으로 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 살모넬라 엔테리티디스 변이균주 ( JOL919 ) 제작 및 변이균주의 생물학적 특성조사

(1) lon 및 cpxR 유전자 결실 균주의 제작

S. Enteritidis 야생균주(wild type) JOL860 에서 자살벡터 pMEG375 (by Dr.CurtissR.III. Dozoisetal.,2003)를 이용하였다. 제조방법은 Kim SW 등 (2009, J Microbiol Methods. 79:314-320)의 방법을 이용하였다. 얻어진 변이균주를 JOL919라 명명하였다.

하기의 표 1은 실시예에 사용된 균주 및 플라스미드를 설명한 표이다.

<본 발명에 언급되는 균주 및 벡터>

(2) 변이균주의 생물형 분석

API 20E 키트 (bioMerieux, Rhone, France) 를 이용하여 변이균주(JOL919)와 야생균주(JOL860)의 생물형을 분석하였다. 세균은 각각 LB 아가로오스 겔에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 다음, 세균집락 하나를 0.85% 식염수에 부유시켜 API20E 키트의 제품설명서의 지시대로 실험하였다. 그 결과, 변이균주의 생물학적 형은, β-갈락토시다아제 (-), 아르기닌 디하이드로라아제 (+), 리신 디카복실라아제 (+), 오르니틴 디카복실라아제 (+), 시트르산 활용 (+), 황화수소 생산 (+), 요소분해효소 (-), 트립토판 디아미나아제 (-), 인돌 생산 (-), 아세토인 생산 (-), 젤라티나아제 (-), 포도당 발효 (+), 만니톨 발효 (+), 이노시톨 발효 (-), 소르비톨 발효 (+), 람노오스 발효 (+), 수크로오스 발효 (-), 멜리비오스 발효 (+), 아미그달린 발효 (-), 아라비노오스 발효 (+) 로 나타났으며, 변이이전의 야생균주(JOL860)와 완전히 일치함을 확인하였다.

이는 lon 및 cpxR유전자를 완전히 결실하여도 살모넬라 엔테리티디스의 생화학적 성질이 변하지 않음을 나타내며, 기본적인 대사능력이 저하되지 않음을 시사한다.

(3) 변이균주의 협막다당체 ( Capusular polysaccharide ) 생산량

협막 다당체의 양을 ConA-결합법(concanavalin A-binding )으로 형광 정량분석(Fluorometric quantification) 하였다 (Robitaille et al., 2006). 세포외벽에 생산되는 협막 다당체는 살모넬라의 닭 소장 상피세포에 부착과 관련이 있다. 각 균주를 LB 아가로오스 겔에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 OD₆₀₀ 값이 1.0이 되도록 농도를 조절하였다. FITC(Fluorescein isothiocyanate)-접합 ConA (Sigma-Aldrich, MO, USA) 를 최종농도가 4 ㎍/mL가 되도록 첨가한 후 실온에서 30분간 반응시켰다. PBS로 2번 세척한 후 250 ㎕ 씩 96-웰 마이크로플레이트(Berthold technologies GmbH & Co. KG, Bad Wildbad, Germany)에 옮겨 TriStarLB941 (Berthold thechnologies)를 이용하여, 각각 485 nm 및 530 nm의 여기(excitation) 및 방출(emission) 파장에서 형광 강도(fluorescence intensity)를 측정하였다. 실제 세균수를 세균집락 계수법으로 구하여 결과를 최종적으로 보정하였다.

그 결과 변이균주 JOL919는 야생균주 JOL860의 21.2배 (P < 0.01)의 협막 다당체를 생산하고 있음을 알 수 있었다. 이 결과는 본 백신 변이균주가, 야생균주나 기타 다양한 약독화된 균주보다 숙주동물 소화관 점막에 부착하는 능력을 더욱 강하게 지니고 있음을 시사하며 숙주동물로의 침입력이 우수하여 강한 면역력이 유도될 것으로 기대된다.

(4) 변이균주 ( JOL919 )의 핌브리아 ( fimbriae ) 발현

변이균주(JOL919)의 핌브리아 발현량을 비교하였다. 핌브리아는 숙주세포 침입 및 항원으로 중요하다. 먼저 fimA 유전자를 살모넬라 타이피무리움 야생형에서 5'-GGA TC CGC TGA TCC TAC TCC GGT GAG-3', 5'-CTC GAG TTC GTA TTT CAT GAT AAA GG-3' 프라이머를 이용하여 pET28a에 클로닝하고, 과발현된 6XHis-Tag이 부탁된 단백질을 Ni-NTA 아가로오스 (Qiagen,CA,USA)를 이용하여 정제(affinity-purification)하였다. 이 단백질을 토끼에 접종하여 항-FimA 혈청을 얻었다. 혈청은 -80℃에서 보관하였다. JOL860 및 JOL919를 LB 아가로오스 겔에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하여 세균 집락을 얻었고, 이를 PBS에 부유시켰다. OD₆₀₀값을 기초로 농도를 조절한 후 2x10⁵CFU/30 ul을 토우빈스 전사 완충액(Towbins transfer buffer, 25mM Tris, 192mM glycine, 20% methanol)에 담근 Protran^® 니트로셀룰로오스 막 (0.2 ㎛, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)에 96-웰 Bio-Dot^TM 장치 (Bio-Rad)를 이용하여 블로팅(blot)하였다. 진공을 가하여 상기 니트로셀룰로오스 막을 건조시킨 후, 니트로셀룰로오스 막을 장치에서 분리하여 5% 탈지우유(TBS-SM)를 포함한 Tris-완충용액(TBS, 10mM Tris, 0.9% sodium chloride, pH7.4)으로 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. TBS로 3번 세척한 후 토끼의 항-FimA 혈청을 TBS-SM에 1:1000배 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 3번 세척한 후 퍼옥시다아제-결합 산양 항-토끼 IgG (H+L) (Pierce Biotechnology, IL, USA)를 TBS-SM에 1:20,000배 희석하여 1시간 반응시켜 3번 세척한 후 West-one^TM 웨스턴 블롯 검출 시스템(Intron Biotechnology, Kyongi, Korea)으로 발광반응을 일으키고 Kodak Image Station 4000MM (Carestream Health, NY, USA)로 발광강도를 측정하였다. 실제 세균수를 집락계수법으로 구하여 최종적으로 보정하였다.

그 결과 변이균주는 야생균주의 28배 (P < 0.01)에 달하는 fimA를 발현하고 있음을 알 수 있었다. 이 결과는 본 백신 변이균주(JOL919)가, 야생균주나 기타 다양한 약독화된 균주보다 숙주동물 소화관 점막에 침입하는 능력을 더욱 강하게 지니고 있음을 시사한다. 따라서, 본 변이균주(JOL919)를 이용한 백신조성물은 상기 실시예 1의 (3)의 결과와 더불어 숙주동물 점막에의 부착능력과 침입력이 우수함으로써 강한 면역력을 유도할 것으로 기대된다.

실시예 2. 살모넬라 엔테리티디스 변이균주(JOL919 균주)의 배양 및 접종

살모넬라 변이균주(JOL919)는 20% 글리세롤이 첨가된 LB 브로스(broth)에 부유하고 스톡(stock)을 만들어 -80℃에 보관하였다. 이 스톡을 LB 아가로오스 배지에 접종하고 37℃에서 16시간 배양 후, 집락(colony)을 얻었다. 군집(colony) 하나를 LB 브로스에 접종하여 진탕 배양기(shaking incubator, 200 rpm, 37℃)에서 16시간 동안 배양한 배양액을 1/100(부피)의 비율로 LB 브로스에 첨가하여 배양기에서 농도가 10⁹cfu(colony forming unit)/ml 정도가 될 때까지 배양하였다. 인공배지에서 이러한 방법으로 배양 중균 시 본 백신 변이균주(JOL919)의 증균속도는 야생균주와 동일하였다.

접종을 위하여 이 배양액을 4℃에서 4,000 rpm으로 원심분리하여 PBS (Phosphate buffered saline)로 3번 동일한 조건으로 세척하고 OD₆₀₀ 값을 측정해 농도를 적절히 희석 또는 농축하여 생균백신으로 접종하였다. 사균백신으로는 적절한 농도로 1% 포르말린에 첨가 후 PBS에 재 부유시켜 4℃에서 24시간 불활화시킨 것을 PBS로 3번 세척하여 세균의 사멸을 LB 아가로오스에서 확인 후 접종하였다.

실시예 3.　어린 병아리에서 살모넬라 엔테리티디스 변이(백신)균주의 안전성 관찰 실험

살모넬라 엔테리티디스는 1주령 이하의 어린 병아리에서 인식 가능한 병원성을 나타낸다. 실시예 2에 의해 얻어진 JOL919의 안전성을 관찰하기 위해, 1×10⁷cfu 또는 1×10¹⁰cfu를 Brown Nick 암컷 1일령 병아리에 경구접종(PO) 하였다. 접종 후 침울, 식욕부진, 설사의 유무를 매일 확인하였다. 또한 접종 후 10일째에 각 군에서 무작위로 선택한 5마리를 안락사시켜 간, 비장, 신장, 소장, 맹장림프조직의 육안적 병리소견을 조사하였다. 또한, 비장 및 맹장에서 분리된 접종균수를 조사하였다. 접종 후 2, 3, 4주째에 분변을 개체 별로 채집하여 분변 중에 배출되는 접종균수를 조사하였다. 병리소견은 0, 1, 2, 3점으로 기록하였으며, 0점이 정상인 반면 3점은 매우 심각한 병변임을 나타내었다. 또한, 세균수는 다음과 같이 조사하였다. 조직 또는 분변을 BPW(Buffered peptone water, Becton, Dickinson and Company, France)에서 분쇄하고 상층액을 BGA (Brilliant Green Agar, Becton, Dickinson and Company, France) 에 접종하여 군체수를 개수하였으며 음성인 경우 집적 배양(enrichment culture)을 BPW에서 37℃ 16시간 배양 후 Rappaport-Vassiliadis R10 broth (Becton, Dickinson and Company, France)에 1/100 volume 접종하여 42℃에서 48시간 배양후 BGA에서 살모넬라의 유무를 확인하였다.

결과는 표 2 내지 표 4에 나타내었다.

어린 병아리에서 야생균주 및 백신균주 접종후 10일째 내부장기 병변

균주	접종량 (CFU)	n	간	비장	신장	소장	맹장 편도
JOL860	1 x 10⁷	5	2.0 ± 0.6	1.0 ± 0.6	1.0 ± 0.0	0.6 ± 0.5	0.6 ± 0.5
	1 x 10¹⁰	5	3.0 ± 0.6	1.6 ± 0.5	1.0 ± 0.0	0.8 ± 0.4	0.6 ± 0.5
JOL919	1 x 10⁷	5	0.0 ± 0.0*	0.0 ± 0.0*	0.0 ± 0.0*	0.0 ± 0.0*	0.0 ± 0.0*
	1 x 10¹⁰	5	0.0 ± 0.0*	0.2 ± 0.4*	0.0 ± 0.0*	0.0 ± 0.0*	0.2 ± 0.4c*

* JOL919 접종군이 JOL860 접종군과 비교하여 통계학적으로 차이가 인정된다.

어린 병아리에서 야생균주 및 백신균주 접종후 10일째 내부장기에서 세균생존

균주	접종량 (CFU)	n	비장	맹장
JOL860	1 x 10⁷	5	4.1 ± 0.6	7.0 ± 0.6
	1 x 10¹⁰	5	4.8 ± 0.7	6.9 ± 1.6
JOL919	1 x 10⁷	5	0.8 ± 1.2*	2.0 ± 1.7*
	1 x 10¹⁰	5	0.6 ± 0.9*	4.5 ± 0.9

백신균주 접종후 병아리 분변내 백신균주 함량 변화

균주	접종량 (CFU)	n	2주차	3주차	4주차
JOL860	1 x 10⁷	5	1.9 ± 1.6	0.3 ± 0.4	0.0 ± 0.0
	1 x 10¹⁰	5	1.3 ± 1.1	0.0 ± 0.0	0.0 ± 0.0
JOL919	1 x 10⁷	5	0.0 ± 0.0	0.0 ± 0.0	0.0 ± 0.0
	1 x 10¹⁰	5	2.4 ± 1.3	0.8 ± 1.5	0.0 ± 0.0

표 2에 나타낸 바와 같이, 변이균주 JOL919접종군에서는 1×10⁷cfu과 1×10¹⁰cfu 접종군 모두 통계학적으로 매우 약한 병변 밖에 관찰되지 않아 충분히 약독화되었음을 알 수 있었다.

표 3에 나타낸 바와 같이, JOL919의 1×10⁷cfu 접종군에서는 비장과 맹장 내 세균수가, 1×10¹⁰cfu 접종군에서는 비장 내 세균수가 야생균주 보다 적게 검출되어 lon/cpxR 유전자를 결실시킴으로 장기 내 생존능력이 현저히 저하되었음을 알 수 있었다.

표 4에 나타낸 바와 같이, 접종 후 분변을 통해 일어날 수 있는 환경오염 여부를 조사하기 위한 분변내 세균은 1×10¹⁰cfu 접종군에서 접종 후 4주째부터는 배출되지 않아, 통상적으로 접종 후 4주까지 배출되는 야생균주와 비슷함을 인정할 수 있었다. 반면, 1×10⁷cfu (권장접종량) 접종군에서는 2, 3, 4주째부터 모두 배출되지 않은 것으로 확인되어, 야생균주보다 환경오염 위험이 낮은 것으로 확인되었다.

실시예 4. 1일령 병아리에서 방어면역 형성시험

Brown Nick 암컷 1일령 병아리 15마리를 야생균주 JOL860 접종군(n = 5), 백신접종군(n = 5) 및 비접종대조군(n = 5)으로 나누어 접종군은 야생균주(JOL860) 또는 백신균주 (JOL191) 를 1×10⁷cfu씩 경구투여하였으며, 비접종대조군은 PBS(Phosphate buffered saline)를 접종하였다. 4주째에 세포성 면역, 점막 면역, 체액성 면역을 각각 살모넬라 엔테리티디스 항원을 이용한 말초림프세포증식반응, 소장관내 분비형 IgA농도, 혈장 IgG농도를 구하여 군별로 비교하였다.

(1) 말초림프세포 증식반응

말초림프세포증식반응은 Barta et al. (Avian Dis, 1992)의 연구성과를 참고하였으며, 헤파린 첨가 혈액 0.8ml를 실온에서 40 rpm (<10 rcf)로 10분동안 원심분리하여 혈장과 함께 단핵백혈구를 회수하여 항생제와 우태아혈청을 첨가한 RPMI1640 완전 배양액(complete media)으로 세척, 재부유 시키고 트리판 블루 제외 테스트(trypane blue exclusion test)로 살아있는 세포수를 확인하여 세포수를 1×10⁵cfu/㎖로 조절하였다.　 96-웰 플레이트에 웰 당 이 부유액을 100㎕씩, 그리고 0.1㎍/ml 수용성 항원 용액(Rana et al, 2006)을 50㎕씩 (대조 웰은 RPMI)넣고 5% CO₂ 존재 하, 40℃에서 96시간 동안 배양하였다. 배양한 말초림프세포는 ViaPlus 분석 키트 (Lonza, USA)를 사용하여 세포를 처리하고 발광을 측정하고 특이항원으로 자극된 웰의 값과 항원 대신 RPMI를 첨가한 대조군 웰의 값의 비율을 자극 지수(Stimulation index, SI)로 구하여 군별로 비교하였다.

결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 백신균주 접종군에서 야생균주 접종군과 비슷한 세포성 면역반응이 일어난 것으로 알 수 있었다(*는 통계학적 유의차이가 있음을 나타냄).

(2) 소장관 내 분비형 IgG 농도의 측정

분비형 IgA양은 다음과 같이 구하였다. 10cm 길이의 소장을 1 ml의 PBS로 세척하여 원심분리로 투명한 상층액을 얻어, 100mM PMSF, 1% 소디움 아지드(Sodium azide), 5% BSA(bovine serum albumin)를 각각 상층액 1㎖당 10㎕씩 첨가하고 4℃에 보관하여 익일 ELISA의 샘플로 사용하였다. ELISA는 chicken IgA ELISA quantitation kit (Bethyl, Tx, USA)를 사용하여 사용설명서를 따라서 IgG 농도 결정과 기본적으로 같은 방법으로 실시하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 분비형 IgA (점막면역반응)는 야생균주 접종군에서 PBS투여군(대조군)과 비슷한 번면, 백신접종군에서는 더 강한 반응이 일어난 것으로 알 수 있었다.

(3) 혈장 IgG 농도의 측정

혈장 IgG 농도는 다음과 같이 결정하였다. 혈장은 헤파린 첨가 말초혈액에서 분리하였다. 또한, OMP 항원 (Kang et al., Infect Immun. 70(4):1739-1749. 2002)을 바닥이 편평한 96-웰 고 결합능 ELISA 플레이트(Greiner, Germany)에 흡착시켜서 닭의 IgG ELISA 정량분석 키트 (Bethyl, Tx, USA)를 사용하여 사용설명서를 따라서 실시하였다.

결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 체액성 면역은 접종군에서 모두 높은 값을 나타내었다. 이와 같이, 본 백신균주는 방어면역 유도력이 야생균주(JOL860)보다 강하였으며, 변이균주의 백신으로서의 우수성을 나타내었다.

실시예 5. 1일령 병아리에서 백신에 의한 방어면역 형성 및 야생균주 감염 방어

1일령 병아리 20마리를 각각 백신접종군(n = 10) 및 대조군(n = 10)으로 나누어 백신접종군은 백신균주 (JOL191) 1×10⁷cfu를, 대조군은 PBS 를 경구적으로 투여하였다. 4주째에 모두 야생강독균주 (JOL1182) 1×10⁹cfu를 경구투여하였다. 야생균주의 공격접종 후 2주 동안 매일 침울(depression) 상태를 관찰하여 0점 (건강), 1, 2, 3점(심각한 증상)으로 점수를 기록하였으며, 2주째 날에 안락사시켜 실시예 3과 동일한 방법으로 간, 비장, 맹장(맹장 및 그 내용물)에서 야생균주 검출을 시도하여 샘플 1그램당 세균수를 결정하였다.

결과는 표 5에 나타내었다.

1일령 병아리에서 백신에 의한 야생균주 방어효과

군	n	살모넬라 엔테리티디스(+) 병아리의 수	침울 지수	장기내 세균수/g
군	n	살모넬라 엔테리티디스(+) 병아리의 수	침울 지수	간	비장	맹장
대조군	10	7	1.2 ± 0.8	1.0 ± 0.0	1.8 ± 1.6	0.6 ± 0.8
백신 접종군	10	2*	0.2 ± 0.4*	0.0 ± 0.0*	0.3 ± 0.7*	0.2 ± 0.6*

표 5에 나타낸 바와 같이, 침울 점수는 2 주 평균(± 표준오차) 으로 백신 접종군이 1.2 ± 0.8, 대조군은 0.2 ± 0.4 으로 통계학적으로 백신 접종군의 건강상태가 좋았다. 또한, 각 장기에서 인정된 세균도 백신 접종군에서 매우 적은 것으로 나타나, 대조군에 비하여 통계학적 차이를 보였다. 결국, 백신접종군에서 야생균주가 분리된 경우가 10마리 당 2 마리였으며, 이는 대조군의 10마리 당 7 마리보다 통계학적으로 적어, 어린 병아리에서 야생균주에 의한 감염이 백신에 의하여 효과적으로 이루어져 있음을 알 수 있었다.

실시예6 . 1일령과 5주령에 백신접종하여 방어력을 확인하는 시험

Brown Nick 암컷 병아리 40마리를 각각 백신접종군(n = 20)과 대조군(n = 20)으로 나누었다. 백신접종군은 1일령(1차 접종) 및 5주령(2차 접종)에 각각 JOL919를 1 x 10⁷cfu를 경구투여하였으며, 대조군은 PBS를 투여하였다. 9주령에는 야생강독균주 JOL1182를 1 x 10⁹cfu를 모든 닭에 접종하였다.

1차 접종 후 (4주령) 및 2차 접종 후 (9주령)에 세포성 면역의 형성을 말초림프구증식반응 및 유세포 분석법(Flow cytometry)으로 관찰하였다.

(1) 말초림프세포 증식반응

말초림프세포 증식반응은 실시예 4의 (1)과 동일한 방법으로 실시하였다.

결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 1차 및 2차 접종 후 림프구의 항원특이적 증식반응이 강하게 나타나 있었다.

(2) 유세포분석법

유세포 분석(Flow cytometry)을 위하여 헤파린이 첨가된 혈액을 3% hetastarch (Sigma Immuno Chemicals)와 1:2의 비율로 혼합하여 65 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 적혈구를 침강시켜 상층액을 분석에 사용하였다 (Crouch et al., 1993). 1 x 10⁷cfu 의 림프세포 부유액 (100 uL)을 APC-접합 단일클론항체 CD45 (백혈구에 공통적인 세포표면 구조물) 및 FITC-라벨 단일클론항체 CD3 (T 림프구에 나타나 있는 세포표면 구조물) (Beckman Coulter, CA, USA)로 20분 동안 염색하여 샘플당 2 x 10⁴ cells 을 FACS Calibur (BD Bioscience, Heidelberg, Germany, 15mW, 488 nm argon ion laser)로 분석하고, 염색된 세포의 비율을 CellQuestPro 4.0.2(BD Bioscience)를 이용하여 산출하였다.

결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 유세포 분석의 결과 백신접종군에서 T 림프구의 비율이 매우 상승되어 있어, 2차 접종 후 더욱 강한 세포면역이 유도되어 있음을 알 수 있었다.

(3) 체액성 면역 및 점막 면역의 유도

1차접종 후 1, 3, 5, 7, 9주째에 혈장 IgG와 소장 세척액 중 분비형 IgA의 농도를 실시예 6과 동일한 방법으로 구하였다.

결과는 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 혈장 IgG 및 분비형 IgA도 1차 및 2차 접종 후 상승하고 있었으며, 이러한 결과는 추가접종으로 더욱 강한 방어면역을 제공할 수 있음을 나타낸다.

(4) CD4 +, CD8 + 세포 침윤 분석

야생균주 접종 후 1, 3, 5일째에 맹장조직을 절제하여 조직절편 (7 um)을 10 분 동안 아세톤으로 고정하여 -70 ^oC 에서 보관하였다. 내재성 퍼옥시다아제를 퍼옥시다아제 블로킹 시약 (DAKO Envision System, Denmark)으로 블로킹(blocking)한 다음, 비오틴-라벨 항 CD4 및 CD8 단일클론항체 (Novus Biologicals, CO, USA)를 각각 1:50 및 1:100로 희석하여 4 ^oC에서 1 시간 반응시켰다. 그 후 조직과 특이적으로 결합된 항체를 스트렙타비딘(streptavidin)과 45분 동안 실온에서 반응시켜 퍼옥시다아제 기질 (AEC substrate, Vector Laboratories Inc., CA, USA)로 발색시켰다. 조직절편은 헤마톡실린으로 대조염색하여 광학현미경으로 관찰하였다. 또한 OLYMPUS, analySIS^®TS (Tokyo, Japan)를 이용하여 CD4+ 및 CD8+의 분포를 분석하였다.

그 결과, 야생균주 접종 후 맹장조직에서 백신접종군에서는 대조군보다 CD4+ 세포의 침윤이 점막고유층(lamina propria)에 강하게 나타나 있었으며, CD8+ 세포 침윤은 점막고유층 및 점막하조직에 강하게 나타나 있었으며, 이는 백신으로 형성된 면역이 야생균주 침입을 효과적으로 막고 있음을 나타낸다.

또한, 야생균주 접종 후 7일 및 14일째에 실시예 3과 동일한 방법으로 간 및 비장의 육안적 병변 및 간, 비장, 및 맹장에서 야생균주수를 구하였다.

결과는 표 6에 나타내었다.

백신에 의한 감염방어를 나타내는 야생균주 접종 후 해부검사 결과

군	Day	감염수 (%)	병변		장기내 세균수/g
군	Day	감염수 (%)	간	비장	간	비장	맹장
Control	7	5/6(83)	0.83 ± 0.37	1.83 ± 0.37	0.33 ± 0.47	1.69 ± 1.28	0.48 ± 0.70
Immunized	7	2/6 (33)	0.00 ± 0.00*	0.67 ± 0.47*	0.00 ± 0.00*	0.33 ± 0.47*	0.51 ± 0.78
Control	14	6/13(46)	0.31 ± 0.46	1.38 ± 0.73	0.00 ± 0.00	1.05 ± 1.29	0.63 ± 1.01
Immunized	14	1/13(8)*	0.00 ± 0.00*	0.46 ± 0.63*	0.00 ± 0.00*	0.17 ± 0.60*	0.15 ± 0.51

n/N(%):야생균주가 최소한 1가지 장기에서 검출된 동물수 및 비율.

*: 통계학적으로 백신접종군이 대조군보다 작은 값임을 나타낸다(P < 0.05).

표 6에 나타낸 바와 같이, 야생균주 접종 7일 후에는 간과 비장의 병변 및 세균수 결과로 보면 대조군보다 백신접종군에서 야생균주로 인한 감염이 심하지 않았으며, 14일째에는 최종적 감염수(%) 결과에서도 백신접종에 의한 야생균주 감염 방어가 인정되었다. 이처럼 두 차례의 백신접종으로 산란계의 감염자체를 상당히 줄일 수 있음을 알 수 있었다.

실시예7 . 백신으로 인한 계란 오염여부 및 야생균주로 인한 계란오염 방어실험

Brown Nick 암컷 병아리 60마리를 A, B, C의 3개군(n = 20) 으로 나누었다. A군은 백신비접종 대조군이며, B군은 1일령, 6주령, 16주령에 백신균주를 10⁷ cfu씩 경구투여 하였으며, C군은 백신균주를 10⁷ cfu씩 1일령에는 경구투여, 6 및 16주령에는 근육주사 하였다. 모든 닭은 24주령에 야생강독균주 JOL1182를 1 x 10⁷cfu/0.5 mL 의 농도로 0.5 mL씩 모든 닭에 정맥주사하였다. 경구접종은 어린 병아리에게 매우 적합하여, 접종에 의한 스트레스를 최소화할 수 있으며, 근육(또는 피하)주사는 성장한 병아리에 현재 가금티푸스 백신 등으로 이용되는 방법이다. 자연계에서는 살모넬라 엔테리티디스 감염이 경구적으로 이루어지는 것으로 생각되어 있지만, 본 실시예에서는 인공감염으로 인한 계란오염 방지여부를 확인하기 위하여 자주 사용되는 방법으로써, 야생균주를 정맥주사로 투여하였다. 다음 표 7에 본 실시예의 개요를 나타내었다.

백신접종프로그램 비교실험예

군	N	1차접종	2차접종	3차접종	계란수집	야생균주 접종	계란수집	병리해부
군	N	1일령	6주령	16주령	21-24주령	24주령	24-27주령	27주
A	20	-	-	-	백신균주로 인한 계란오염 실험	정맥주사	야생균주로 인한 계란오염 실험	내부장기 병변 및 야생균주 침입방어 평가
B	20	경구	경구	경구		정맥주사
C	20	경구	근육	근육		정맥주사

면역유도 관찰:

1)격주로 혈장 IgG, 소장 내 IgA 측정

2)백신접종 4주 후에 림프세포 증식분석, 유세포분석법

(1) 백신으로 인한 계란 오염여부

모든 닭은 21주령부터 산란을 시작하게 되었다. 이 계란을 3주 동안 야생균주 접종 전까지 매일 수집하여 계란에서 백신균주가 검출되는지 여부를 검사하였다. 계란 내용물은 BPW(buffered peptone water, Becton, Dickinson and Company, USA)와 혼합하여 37°C에서 하룻밤 예비증균시키고, 이 내용물을 RV 브로스(Rapport Vassiliadis R10 broth, Becton, Dickinson and Company, USA)에 접종하여 42^oC에서 48시간 동안 증균하여 BGA(Brilliant Green Agar, Becton, Dickinson and Company, USA) 배지에 접종 및 배양함으로 살모넬라 세균의 유무를 확인하였다.

그 결과, 백신접종군(B, C)이 산란한 계란을 포함하여 어떤 계란에서도 세균이 분리되지 않아, 1일령, 6주령, 16주령에 접종하는 백신프로그램으로 인한 계란 오염은 없었다. 이 결과는 본 백신에 의한 계란섭취로 인한 인체감염의 위험성이 없다는 것을 나타낸다.

(2) 세포성 면역형성 확인

1, 2, 3차 백신 접종 4주후(각각 4, 10, 20주령)에 세포성 면역 형성을 확인하기 위하여 실시예 4와 동일한 방법으로 말초림프세포 증식반응 실험을 수행하였고, 실시예 6과 동일한 방법으로 말초백혈구에서 T 세포의 비율을 유세포분석법으로 분석하였다.

결과는 도 8 및 도 9에 나타내었다.

도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 백신접종군(B, C군)에서는 증식반응이 강하게 나타났고, 백혈구 중 T 림프구의 비율이 1차, 2차, 3차 접종에 의하여 증가하였다. 또한, B군(모두 경구접종)은 C군(2, 3차접종은 근육주사)보다 더욱 우수한 반응성을 보여, 더욱 강한 세포성 면역이 유도되어 있을 가능성이 시사되었다.

(3) 체액성 면역형성 확인

살모넬라 엔테리티디스 항원 특이적 혈장 IgG 농도 및 분비형 IgA 농도는 실시예 4와 동일한 방법으로 1차 접종 후 격주로 구하였다. 단, 분비형 IgA 농도 결정을 위한 샘플은 동물을 희생시키지 않고 소화관 세척액을 얻기 위하여 다음과 같은 방법을 시행하였다(Berthelot-Herault et al., Vet Immunol Immunopathol, 2003). 즉, 소화관 세척용액(lavage solution, 48.5 mM PEG [polyethylene glycol 3350], 40mM Na₂SO₄, 20mM NaHCO₃, 10mM KCl, 25 mM NaCl)을 경구적으로 12 ㎖/㎏BW(body weight)씩 투여하고 30분 후 필로카핀(pilocarpine)을 13mg/kg BW (BW<300 g의 경우 20mg/kg BW)의 용량으로 근육 주사하였다. 산란계를 한 마리씩 깨끗한 용기에 수용하고 용기에는 STI/EDTA 용액(0.1 mg soybean trypsin inhibitor in 50 mM EDTA, pH 8.0) 을 5 ml 씩 놓고 배출물과 잘 혼합하였다. 30분 후, 배출물을 회수하고 100mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)를 1㎖당 10㎕씩 첨가한 다음 원심분리하여(13,000 rpm, 2 min, 4℃) 투명한 상층액을 얻었다. 상층액에 다시 100mM PMSF, 1% 아지드화 나트륨(Sodium azide), 5% BSA(bovine serum albumin)를 각각 1㎖당 10㎕씩 첨가하고 4℃에 보관하여 익일 ELISA의 샘플로 사용하였다.

결과는 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, IgG, 분비형 IgA 모두 1, 2, 3차 접종으로 인하여 상승되었지만, 그 상승의 폭이 혈장 IgG의 경우 C군(2, 3차를 근육접종)에서, 분비형 IgA의 경우 B군(모두 경구접종)에서 더욱 강하게 나타나 있었다.

(4) 백신접종 후 산란율 분석

백신접종 후 각군의 24주령에 야생균주를 공격접종하였다. 접종 후 3주 동안 매일 계란을 수집하여, 산란율을 분석하였다.

결과는 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 대조군 (A군)은 인공감염 후 산란율이 74%, 61.6%, 60.9%로 매주 감소를 보였다. 반면, B군은 79.7%, 65.4%, 81.2%로 2주째에 상당히 감소되지만 3주째에는 회복되었으며, C군도 역시 75.7%, 65.7%, 77.1%로 B군과 비슷한 양상을 나타내어 백신접종에 의한 방어효과를 확인할 수 있었다.

(5) 백신접종 후 야생균주의 공격접종으로 인한 계란의 오염여부

야생균주의 인공감염 후 살모넬라로 인한 계란 오염율을 검사하였다. 계란은 5개 이하의 계란을 묶어서 전수검사를 실시하였으며, 그 결과를 양성을 나타낸 묶음의 수 및 비율로 표 8에 나타내었다.

계란오염 방어력을 나타내는 야생균주 접종 후 계란오염

군^a	1주차	2주차	3주차
A	8/28 (28.6%)^b	12/28 (42.8%)	8/28 (28.6%)
B	0/28 (0%)^**	3/28(10.7%)^*	0/28 (0%)^**
C	1/28 (3.6%)^*	4/28 (14.3%)^*	1/28 (3.6%)^*

*: P < 0.05

**: P < 0.01

표 8에 나타낸 바와 같이, 대조군(A군)은 28.6%, 42.8%, 28.6%로서 정맥접종으로 인하여 심각한 계란 오염율을 나타내었다. 그럼에도 불구하고 C군은 3.6%, 14.3%, 3.6%로 오염은 백신접종에 의하여 상당히 방어되었으며, B군에서는 2주째에 오염이 10.7%로 방어되었으며, 1주째, 3주째에는 오염이 완벽하게 방어되었다. 이 결과는 위에서 언급한 세포성 면역 관찰과 분비형 IgA 분석 결과와 일치하였다. 또한 본 결과는 본 백신균주가, 야생균주로 인한 계란 오염을 우수한 효율로 방어시켜 계란섭취로 인한 인체 살모넬라증을 효과적으로 방어할 수 있음을 알 수 있다.

(6) 백신접종 후 공격접종한 산란계에서 살모넬라증 방어력 분석

백신을 접종한 각 계군의 공격접종 후 3주째에 모든 산란계를 안락사시켜 실시예 3과 동일한 방법으로 병변을 관찰하며, 세균검사를 실시하였다. 본 실험에서는 세균검사에 난소(ovary)를 포함시켰다.

결과는 표 9에 나타내었다.

군	n	감염수 (%)	육안 병변		검출 세균수
군	n	감염수 (%)	간	비장	간	비장	맹장	난소
A	20	12(60)	1.1 ± 0.9	1.8 ± 0.9	0.5 ± 0.9	1.6 ± 1.4	0.3 ± 0.9	1.0 ± 1.8
B	20	4(20)*	0.1 ± 0.3*	0.4 ± 0.5*	0.0 ± 0.0*	0.6 ± 1.2*	0.0 ± 0.0*	0.2 ± 0.8*
C	20	5(25)*	0.2 ± 0.4^*	0.5 ± 0.7*	0.0 ± 0.0*	0.7 ± 1.3*	0.1 ± 0.3	0.3 ± 0.9*

표 9에 나타낸 바와 같이, B군, C군 모두 대조군에 비하여 감염이 방어되었으며, 특히 B군은 모든 검사항목에서 통계학적 차이를 나타내었다.

이상의 결과를 통합하면, 본 백신균주는 산란계에 접종 시 계란오염을 일으키지 않아서 안전하며, 동시에 야생균주로 인한 감염 및 계란오염을 효과적으로 방어할 수 있음을 나타내었으며, 백신은 경구 접종하는 경우에 더욱 좋은 방어력을 기대할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 8. 면역강화균주(JOL1228)의 제작

면역강화 균주 (JOL1228)를 얻기 위하여 (i) 살모넬라 엔테리티디스의 염색체 DNA에서 lon, cpxR, asd 유전자를 결실시켜 약독화 숙주 균주(JOL1087)를 제작하고, (ii) LTB 유전자를 ETEC 균주에서 외부유전자 유지 및 발현용 벡터(pET28a)에 클로닝하고, (iii) 숙주 살모넬라 엔테리티디스 세포외부로 외부유전자를 발현 및 분비하는 분비용 벡터(pJHL165)를 제작하고, (iv) pJHL165에 클로닝된 LTB를 삽입하고 pJHL165-LTB를 얻어 asd 결실 균주인 E. coli χ6212를 형질전환하고, (v) 숙주 살모넬라 엔테리티디스 JOL1087를 pJHL165-LTB 벡터로 형질전환하여 면역원성이 강화된 백신균주(JOL1228)를 제작하였다. 이러한 제작과정은 이 분야의 통상의 방법으로 실시하였다.

LTB(heat-labile toxin subunit B)를 발현하는 pJHL165-LTB 벡터는 도 12에 나타내었으며, 면역원성이 강화된 백신균주(JOL1228)는 도 13에 나타내었다.

실시예 9. 약독화 균주( JOL919 ) 및 면역강화 균주( JOL1182 ) 접종의 방법

하기의 표 10과 같이, 산란계(Hy-Line brown, 암컷) 100마리를 5개 군으로 나누어, 1일령, 6주령, 16주령에 JOL1228(Δlon ΔcpxR, LTB 분비균주)와 JOL919(Δlon ΔcpxR 균주)를 혼합 또는 JOL919 단독으로 경구접종하였다. 혼합접종하는 경우, JOL1228과 JOL919의 혼합비율은 예비실험을 통하여 세균수로 5:1로 결정하였다. 또한, 22주령에 계란오염을 잘 일으키는 것으로 이미 확인된 살모넬라 엔테리티디스 야생균주 JOL1182를 정맥에 접종하였다.

<약독화 변이균주(JOL919) 및 면역강화 변이균주(JOL1228) 접종시험 개요>

*실시예 2 결과를 참조하여, JOL919와 JOL1228는 세포수로 5:1의 비율로 혼합하였다.

실시예 10. 백신접종 산란계에서 백신균주로 인한 계란오염 유무

상기 실시예 9와 같이 백신접종한 계군은 20주령부터 모두 산란을 시작하였다. 2주 동안 매일 계란을 수거하여 백신균주로 인한 계란 오염이 있는지를 검사하였다. 외각을 소독한 후 계란 3-4개의 내용물을 섞어(이하 BATCH라고 함) 계란 1개당 40 mL의 BPW(buffered peptone water, Becton, Dickinson and Company, France)과 혼합하여 37℃, 16시간 배양 후 RV 브로스(Rappaport-Vassiliadis R10 broth, Becton, Dickinson and Company, France)에 1/100(부피) 비율로 접종하여 42℃에서 48시간 배양 후 BGA에서 살모넬라의 유무를 확인하였다.

그 결과, 백신균주가 검출된 계란은 하나도 없었으며 백신균주가 계란오염을 일으키지 않음을 확인할 수 있었다.

실시예 11.　 야생균주(JOL1182)의 공격접종 후, 백신접종 산란계에서 계란 생산성 개선 시험

백신접종된 산란계에 야생균주로 공격 접종하여, 본 발명의 면역강화 변이균주(JOL1228)를 이용한 백신이 살모넬라의 감염으로 인한 계란 생산성의 저하를 막을 수 있는지 검사하였다. 공격접종 후 3주 동안 매일 계란을 수거하여 백신접종 동물과 비접종 대조군 간에 차이가 있는지를 조사하였다. 산란율을 다음 식을 따라 산출하였다.

[식]

산란율 = [7일간의 정상 계란 산란수] / [산란계 마리수 x 7일]

결과는 표 11에 나타내었다.

백신접종 산란계에서 도전감염 후 인정된 계란생산성 개선

군	계란생산성(%)	결과의 해석
A	49.7	백신접종을 하지 않은 경우 야생균주 인공감염 후 계란 생산성을 나타냄
B	65.3	면역강화 균주를 혼합하지 않은 경우 야생균주 인공감염 후 계란생산성을 나타내며, 비접종 대조군과 비교하여 통계학적으로 개선되지 않았다.
C	79.3*	면역강화균주를 1차 접종에서만 혼합한 경우 야생균주 인공감염 후 계란생산성을 나타내며, 비접종 대조군과 비교하여 통계학적으로 개선되었다.
D	72.7*	면역강화균주를 1차 및 2차 접종에서 혼합한 경우 야생균주 인공감염 후 계란생산성을 나타내며, 비접종 대조군과 비교하여 통계학적으로 개선되었다.
E	71*	면역강화균주를 1차, 2차 및 3차 접종에서 혼합한 경우 야생균주 인공감염 후 계란생산성을 나타내며, 비접종 대조군과 비교하여 통계학적으로 개선되었다.

각 군의 백신접종상황은 표 10 참조.

*대조군(A군)과 비교하여 통계학적 차이가 인정됨

표 11에 나타낸 바와 같이, JOL1228를 혼합 접종한 군 C, D, E에서 비접종 대조군과 비교하여 통계학적으로 우수한 성적을 얻었다.

실시예 12. 야생균주(JOL1182)의 공격접종 후 계란 오염 방어 시험

도전감염 후 3주 동안 매일 수거한 계란에서 야생균주가 내용물에 함유되는지 유무를 백신 비접종 대조군과 비교하여 조사하였다. 조사방법은 실시예 10과 동일한 방법으로 실시하였다.

결과는 표 12에 나타내었다.

백신접종 산란계에서 도전감염 후 인정된 계란오염 방어

군	오염이 확인된 BATCH 수				계란오염 방어율 (%)	결과의 해석
군	1-3 주	제 1 주	제 2 주	제 3 주	계란오염 방어율 (%)	결과의 해석
A	33/74	14/28	11/28	8/28	55	백신접종하지 않고 인공감염 후 계란오염 상황
B	9/74**	4/28**	4/28*	1/28*	88	통계학적으로 높은 효율로 방어
C	9/74**	6/28*	3/28*	0/28**	88	통계학적으로 높은 효율로 방어
D	0/74**	0/28**	0/28**	0/28**	100	계란오염을 완벽하게 방어
E	8/74**	4/28**	4/28*	2/28*	89	통계학적으로 높은 효율로 방어

*대조군(A군)과 비교하여 통계학적 차이가 인정됨(p < 0.05)

**대조군(A군)과 비교하여 통계학적 차이가 인정됨(p < 0.01)

표 12에 나타낸 바와 같이, 1차 및 2차 접종을 면역강화 변이균주를 혼합한 경우에 계란오염을 완전히 방어할 수 있음을 발견할 수 있었다. 보통 자연감염에서는 경구적으로 감염되어 계란 오염율이 본 실시예처럼 높지 않다. 본 실시예에서 이미 계란오염을 잘 일으킴을 확인한 균주를 정맥내 주사의 방법으로 접종하여 더욱 인공적 계란 오염 발생율을 높여 백신 비접종 대조군(A군)에서 55%이었던 점을 감안하면, 본 공격실험에서 100% 방어에 성공한 것은 D군과 같은 백신 프로그램의 계란오염 방어력이 우수함을 알 수 있었다.

Claims

살모넬라 엔테리티디스균의 염색체 DNA에서 lon 및 cpxR 유전자가 결실된 약독화 변이 균주; 살모넬라 엔테리티디스균의 염색체 DNA에서 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실되고, Escherichia coli 의 LTB(heat-labile toxin subunit B)를 발현하는 면역강화 변이균주; 또는 이들의 조합을 포함하는, 살모넬라증 예방용 생균 백신 조성물.
제1항에 있어서, 약독화 변이균주 및 면역강화 변이균주의 조합은 2:1 내지 10:1의 균수비로 혼합된 것을 특징으로 하는, 살모넬라증 예방용 생균 백신 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 살모넬라증은 가금 살모넬라증 또는 인체 살모넬라증임을 특징으로 하는 생균 백신 조성물.
제3항에 있어서, 상기 가금 살모넬라증은 조류의 가금 파라티푸스임을 특징으로 하는 생균 백신 조성물.
제4항에 있어서, 상기 조류는 닭, 오리, 칠면조, 메추리, 물새, 비둘기, 카나리아로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생균 백신 조성물.
제3항에 있어서, 상기 인체 살모넬라증은 식중독임을 특징으로 하는 생균 백신 조성물.
살모넬라 엔테리티디스의 염색체 DNA에서 lon 및 cpxR 유전자가 결실된 약독화 변이균주; 살모넬라 엔테리티디스의 염색체 DNA에서 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실되고 Escherichia coli의 LTB(heat-labile toxin subunit B)를 발현하는 면역강화 변이균주; 또는 이들의 조합을 조류에 접종하여, 조류에서 살모넬라 엔테리티디스균의 난계대 오염을 예방하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 조류는 닭, 오리, 칠면조, 메추리, 물새, 비둘기, 카나리아로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 약독화 변이균주 및 면역강화 변이균주의 조합은 2:1 내지 10:1의 균수비로 혼합된 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 약독화 변이균주 또는 면역강화 변이균주의 단독 접종량은 1X10⁶ 내지 1X10¹⁰ cfu/마리 인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 약독화 변이균주 및 면역강화 변이균주의 혼합 접종량은 1X10⁶ cfu/마리 내지 1X10¹⁰ cfu/마리 인 것을 특징으로 하는 방법.