KR20170010540A - 살모넬라증 치료를 위한 변이 균주 ｈｉｄ２０９２와 ｈｉｄ２１１４ 및 이를 포함하는 살모넬라증 약제학적 조성물 - Google Patents

살모넬라증 치료를 위한 변이 균주 ｈｉｄ２０９２와 ｈｉｄ２１１４ 및 이를 포함하는 살모넬라증 약제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주 및 이를 포함하는 살모넬라증 예방 및 치료용 약제학적 조성물, 상기 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주를 포함하는 사료 첨가제 및 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주를 동물에 접종하여 살모넬라증을 예방 및 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주는 약독화 균주의 병원성의 회복을 방지하여 안전하면서도 유전형질이 안정적이고 방어효능이 높은 살모넬라증 예방 및 치료 효능이 우수한 생균 백신을 제공한다. 또한, 상기 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주를 백신 조성물 또는 사료의 제조에 사용할 수 있으며, 상기 백신 조성물 또는 사료 조성물을 이용하여 사람 및 동물(특히 조류)의 살모넬라증을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

Description

살모넬라증 치료를 위한 변이 균주 ＨＩＤ２０９２와 ＨＩＤ２１１４ 및 이를 포함하는 살모넬라증 약제학적 조성물{SALMONELLA ENTERITIDIS MUTANT STRAINS HID2092 AND HID2114 AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION USING THE SAME}
본 발명은 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주 HID2092와 HID2114 및 이를 포함하는 살모넬라증 예방 및 치료용 약제학적 조성물, 상기 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주 HID2092와 HID2114를 포함하는 사료 조성물 및 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주 HID2092와 HID2114를 동물에 접종하여 살모넬라증을 예방 및 치료하는 방법에 관한 것이다.
살모넬라증(Salmonellosis)은 균에 오염된 식품을 섭취하게 되면 발생하는 사람 및 가금류 공통 질병으로, 오염 음식 섭취 12~48시간 후에 급성위장염의 증상이 나타나며, 주로 설사, 복통, 구토, 발열이 나타나고 경우에 따라 패혈증으로 사망에 이르기도 한다.
사람의 살모넬라 감염증은 장티푸스형 살모넬라증(typhoidal salmonellosis)과 비-장티푸스형 살모넬라증(non-typhoidal salmonellosis)의 두 가지 형태로 분류된다. 장티푸스형 살모넬라증은 살모넬라 티피(Salmonella Typhi)균이 사람에 감염되어 배출되는 인분을 통해 감염되는 것으로 위생관리가 불충분한 경우에 주로 문제가 되는 것이나, 비-장티푸스형 살모넬라증(non-typhoidal salmonellosis)은 선진국형 장티푸스라고도 불리우며 장티푸스형 살모넬라증을 극복한 미국, 유럽 등의 선진국 나라에서도 축산업 형태의 변화와 축산물 가공 및 보존과 관련되어 공중보건학적으로 커다란 위협을 주고 있다. 우리나라에서도 수십년간 살모넬라 갈리나룸균 및 살모넬라 엔테리티디스균은 대한민국 양계 산업의 심각한 문제를 초래하여 왔으며, 해마다 비-장티푸스형 살모넬라증을 유발하는 살모넬라균에 의한 식중독이 발생되고 있어 대책마련이 시급한 실정이다.
선진국형 살모넬라증인 사람의 비-장티푸스형 살모넬라증에서 문제가 되는 혈청형은 나라마다 지역별로 차이가 있으나 주로 살모넬라 엔테리티디스(S. Enteritidis) 인 것으로 알려져 있으며, 이에 따라 이를 예방하기 위한 백신의 개발 및 실용화가 절실하게 요망된다.
최근까지 연구되고 있거나 사용되고 있는 살모넬라 엔테리티디스 백신은 크게 불활화 백신, 서브유니트 백신, 약독화 생균 백신으로 분류될 수 있다. 불활화 백신은 백신주의 병원성이 전혀 복귀되지 않는다는 점에서 안전성이 높은 장점이 있으나 주로 채액성 면역을 유도하고 세포매개성 면역에 대한 유도는 생균 백신에 비하여 현저히 떨어지는 단점을 지니고 있다. 서브유니트 백신은 불활화 백신과 같이 생균 백식에 비하여 안정성이 높은 장점이 있기는 하나 효능의 지속이 비교적 짧으며 수차례 백신 투여가 요구된다는 점에서 경제성이 떨어진다. 이에 비해 생균 백신은 다른 두 타입의 백신에 비하여 접종 방법의 다양성, 체액성 면역은 물론 점막 면역, 세포매개성 면역까지 유도할 수 있고, 이종항원도 운반할 수 있는 여러 가지 장점을 지니고 있다.
한편, 현재 실용화되어 있는 생균 백신은 3가지 정도가 있다. ① 약독화 S. Typhimurium△ cya △ crp 균주를 사용하는 Megan™Vac 1 (Megan Health사)가 있다. 그러나 이는 방어력이 충분하지 않다는 지적이 있다. 이는 백신 균주로 살모넬라 타이피무리움을 이용한 데다가, 세균의 생존에 필수적인 대사와 관련된 유전자인 cya 및 crp 유전자를 결손시켰기 때문인 것으로 판단된다. cya와 crp 유전자의 결손시 세균은 말토오스를 포함한 당질발효능력을 잃게 되어 생존능력이 현저히 저하됨으로 약독화가 이루어진다. 또한 ② SG9R (가금티푸스 예방백신, Intervet/Schering-Plough Animal Health사)을 S. Enteritidis 예방에 전용하기도 한다. 그러나 이는 같은 살모넬라균이라도 혈청형이 다른 경우는 혈청형이 같은 경우보다 방어력이 떨어진다는 단점이 있으며, S-타입으로 병원성을 회복할 가능성도 있다는 문제점이 있다. ③ S. Enteritidis 및 S. Typhimurium를 화학적으로 돌연변이시킨 변이균주를 사용하는 TAD Salmonella vac E 및 T (Lohmann AnimalHealth사, 독일)가 있으나 이는 유전학적으로 규정되지 않은 변이균주로서 안전성 및 안정성에 문제가 있다.
즉 아직까지 확실한 방어효과와 면역원성을 보이는 상업화된 생균 백신은 거의 전무한 실정으로, 약독화 균주의 병원성의 회복을 방지하여 안전하면서도 유전형질이 안정적이고, 충분한 방어력을 갖는 생균 백신의 개발이 절실히 요구되고 있다.
1. 한국공개특허 10-2012-0129777 2. 한국공개특허 10-2011-0126227 3. 한국공개특허 10-2012-0128583
본 발명은 약독화 균주의 병원성의 회복을 방지하여 안전하면서도 유전형질이 안정적이고 살모넬라증 예방 및 치료 효능이 우수한 생균 백신을 제공하고자 한다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 살모넬라 엔테리티디스균의 염색체에서 rfaH 유전자 또는 msbB 유전자가 불활성화된 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자의 불활성화는 대상 유전자의 일부 또는 전체의 결실에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, rfaH 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고, msbB 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, rfaH 유전자가 불활성화된 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주는 기탁번호 KCTC 12797BP의 균주이고, msbB 유전자가 불활성화된 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주는 기탁번호 KCTC 12798BP의 균주일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주를 유효성분으로 포함하는 살모넬라증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 생균 백신 조성물일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주를 조류에 접종하여 살모넬라증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주는 약독화 균주의 병원성의 회복을 방지하여 안전하면서도 유전형질이 안정적이고 살모넬라증 예방 및 치료 효능이 우수한 생균 백신 조성물을 제공한다. 또한, 상기 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주를 백신 조성물 또는 사료의 제조에 사용할 수 있으며, 이에 따른 백신 조성물 또는 사료를 이용하여 사람 및 동물의 살모넬라증을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
도 1은 람다 레드 재조합 시스템을 이용하여 제조한 LPS 변이 균주의 확인 실험 결과이다. 도 1a는 rfaH 유전자 결손 균주(실시예1, Δ rfaH), 도 1b는 msbB 유전자 결손 균주(실시예2, Δ msbB)에 대한 결과이다 (Lane M : DNA 마커)
도 2는 본 발명에 따른 변이 균주의 배양 실험 결과이다. 도 2a는 LB 배지에서 배양한 실험 결과이고, 도 2b는 M9 최소배지에서 배양한 실험 결과이다. 비교예(야생 균주)-wild type, 실시예1-ΔrfaH, 실시예2-Δ msbB .
도 3은 LPS 발현 정도(패턴)을 측정한 실험 결과이다. Lane1-비교예(야생 균주), lane2-실시예1(ΔrfaH), lane3-실시예2(Δ msbB).
도 4는 동물의 생존율을 평가한 실험 결과이다. 비교예(야생 균주)-wild type 1403, 실시예1-ΔrfaH, 실시예2-Δ msbB, (*** 야생 균주와 비교하여 유의적인 차이가 있음, p<0.001)
도 5는 군체 형성을 측정한 실험 결과(접종 후 3일, 14일)이다. 도 5a는 간, 도 5b는 비장이다. 비교예(야생 균주)-wild type, 실시예1-Δ rfaH, 실시예2-Δ msbB (** p<0.01, *** p<0.001. 'α'는 접종 3일째 야생형과 대비하여 변이 균주가 유의적인 차이가 있음, 'β'는 접종 14일째 비교예 2와 다른 변이 균주와 대비하여 유의적인 차이가 있음, 'φ'는 접종 3일과 접종 14일 대비함, 'ND'는 개체가 사망하여 측정할 수 없음)
도 6a는 체중 대비 간 중량비, 도6b는 체중 대비 중량비를 나타낸 결과이다. (*** p<0.001.)
도 7은 각 실험군의 비장을 나타낸 사진이다. 대조군-control, 비교예(야생 균주)-SE 1403, 실시예1-Δ rfaH, 실시예2-Δ msbB .
상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 살모넬라 엔테리티디스균(Salmonella Enteritidis)의 염색체에서 rfaH 유전자 또는 msbB 유전자가 불활성화된 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주, 이를 포함하는 살모넬라증 예방 및 치료용 약제학적 조성물, 이를 포함하는 살모넬라증 예방 및 치료용 사료 조성물 및 이를 사용한 살모넬라증 예방 및 치료방법을 제공한다. 이하 첨부된 도면을 이용하여 본 발명의 구성을 더욱 상세하게 살펴보도록 한다.
본 발명은 살모넬라 엔테리티디스균의 염색체에서 rfaH 유전자 또는 msbB 유전자가 불활성화된 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주를 특징으로 한다.
상기 살모넬라 엔테리티디스는 살모넬라속의 세균성 감염형 식중독의 원인균으로 장염균이라고도 한다. 이 균은 살모넬라의 대표적인 균으로 모든 동물에서 감염을 일으킬 수 있고 숙주 적응력이 매우 높다. 주모(周毛)를 가지고 있어 운동성이 있는 그람음성의 통성 혐기성 간균이다. 유당분해력이 없고, 인돌을 형성하지 않으며, 황화수소를 생성하지 않아 대장균과는 구별된다. 발육 최적 온도는 35~37℃이고 증식이 가능한 온도 범위는 10~43℃이며, 60℃에서 20분간 가열로 사멸한다. 최적 pH는 7.2~7.4이다. 크기는 0.5~0.8×3~4μm이다.
상기 rfaH 유전자 또는 msbB 유전자는 살모넬라 지질다당류(Salmonella lipopolysaccharide, LPS)와 관련된 유전자이다. 상기 살모넬라 지질다당류는 숙주 세포 표면의 부착성, 장내 군체 형성, 혈청 저항성, 세포내 복제성 등에 매우 중요한 기능을 수행하며, O-항원 다당류(O-antigen polysaccharide), 중심 올리고당류(core oligosaccharide) 및 지질 A(Lipid A)로 이루어져 있다.
상기 rfaH 유전자에 의하여 발현되는 RfaH는 전사 활성 인자로서 O-항원 다당류 및 중심 올리고당류의 생합성을 제어하며, 세균의 세포내 생존에 관련 있으며, 혹독한 환경에서 세균을 보호하는 역할을 한다. 상기 msbB 유전자에 의하여 발현되는 MsbB는 아실전이효소(acyltransferase)로서 지질 A 전구체에 미리스트산(myristic acid)을 보충하는 역할을 한다.
본 발명에서 이용하는 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주는 불활성화된 rfaH유전자 또는 불활성화된 msbB 유전자를 포함하며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유전자의 불활성화는 대상 유전자의 결손에 의한다.
상기 본 발명에 따른 변이균주 제조를 위해 불활성화, 바람직하게는 결손시킨 상기 rfaH의 유전자는 서열번호 1에 염기서열을 나타내었고, msbB 유전자는 서열번호 2에 염기서열을 나타내었다.
일반적으로 균주 내 유전자군의 불활성화는 여러 가지 형태로 제작할 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현의 신호구조의 변형 또는 안티센스(antisense)-RNA 기술에 의해 유전자 발현을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 유전자발현의 신호 구조는, 예를 들어 억제(repressor) 유전자, 활성화(activator) 유전자, 작동자(operator), 프로모터, 감쇠자(attenuator), 리보솜 결합 자리, 시작 코돈(codon) 그리고 종료자(terminator) 들이며, 이에 한정되지 않는다(Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 195 (1998)), Carrier and Keasling (Biotechnology Progress 15: 58 64 (1999)), Franch and Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3: 159 164 (2000)), 및 Knippers ("Molecular Genetics", 6th edition, 1995) 또는 Winnacker ("Genes and Clones", 1990)).
또한, 목적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 가닥과 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 가닥으로 구성되는 이중가닥 RNA(dsRNA)을 도입하여 목적유전자 mRNA의 분해를 유도함으로서 목적유전자의 발현을 억제하는 메커니즘인 RNA 간섭(RNA interference:RNAi) 방법을 사용할 수 있다. 또는, 단일 세포의 게놈 내에서 다른 위치로 이동할 수 있는 DNA 서열인 트랜스포존을 매개로한 돌연변이를 일으켜 목적 유전자의 기능을 차단하여 불활성화하는 방법을 사용할 수도 있다. 유전자군 단백질의 촉매 활성의 변화 또는 감소를 유도하는 돌연변이들은 당업계에 잘 알려져 있다(Qiu와 Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611 8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95: 5511 5515 (1998)), Wente and Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266: 20833 20839 (1991), 및 Hagemann ("General Genetics", 1986)).
바람직하게는, 유전자군의 불활성화는 단일 또는 복합 염기서열의 변이, 단일 또는 복합 유전자의 결손, 유전자 내에 외래 유전자의 삽입, 유전자군 전체의 결손, 유전자군의 프로모터의 억제 서열 삽입, 프로모터의 돌연변이, 유전자군의 발현 억제 조절 삽입, 유전자군의 단일 또는 복합 염기서열에 대한 RNAi 도입, 트랜스포존 매개 돌연변이 또는 이러한 변이체들의 조합 중 하나의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
상기에 기술한 방법들은 본 기술 분야에 통상의 사람에게 일반적으로 이해되어지며, (Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Third Edition (Cold SpringHarbor Press 2001)에서 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
유전자의 염기 서열 중 활성 부위의 단일 또는 복합 서열을 변화하여, 유전자로부터 발현되는 단백질의 활성을 매우 낮출 수도 있고, 단일 또는 복합 유전자의 결손, 염기서열 내부에 외래 유전자인 항생제 내성 유전자나 다른 유전자를 삽입하여 완전한 단백질이 발현되지 못하게 하는 방법일 수 있다. 바람직하게는 염색체에 존재하는 유전자의 염기 서열을 모두 결손하는 방법을 사용할 수도 있다(Russell CB et al, J. Bacteriol.(1989);171:2609-2613, Hamilton CM et al, J. Bacteriol.(1989);171:4617-4622, Link AJ et al, J. Bacteriol. (1997);179:6228-6237). 또는 상기 방법에 의한 변이체의 조합으로 불활성화 시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 병원성 유전자를 가장 확실하게 불활성화하기 위해 마지막 방법인 염색체내의 염기서열을 모두 결손하는 방법을 사용하였다. 유전자군을 결손하는 방법은 대장균 유전자 결손 방법으로 널리 알려진 Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 재조합 효소(lamda Red recombinase)를 이용한 '1 단계 불활성화 방법(Onestep deletion method)'(Datsenko KA et al, PNAS, (2000);97(12):6640-6645)을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주를 포함하는 살모넬라증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 그 중에서도 생균 백신 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명자들은 본 발명에서 제조한 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주를 기탁기관에 기탁하여 기탁번호를 부여받았는데, rfaH의 유전자가 결실된 변이균주에 대해 본 발명자들은 "HID2092"로 균주명을 명명하였고, 2015년 04월 21일자로 한국생명공학연구원에 균주 기탁하여 “KCTC 12797BP"로 기탁번호를 부여받았으며, msbB의 유전자가 결실된 변이균주에 대해 본 발명자들은 "HID2114"로 균주명을 명명하였고, 2015년 04월 21일자로 한국생명공학연구원에 균주 기탁하여 “KCTC 12798BP"로 기탁번호를 부여받았다.
본 발명의 명세서에서의 용어 예방은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 살모넬라 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물 또는 백신은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다.
본 발명에서 용어 "백신"은 항원, 즉 병원체를 약하게 만들어 인체에 주입하여 항체를 형성하게 하여 그 질병에 저항, 면역성을 가지게 하는 의약품을 총칭하는 것으로, 백신의 종류는 완전히 병원체를 죽여 만드는 사백신과 약독화시켜 만드는 생백신이 있다. 본 발명에서 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주는 야생 균주와 비교했을 때 항원으로 작용하는 단백질은 동일하게 존재하고, 병원성은 매우 낮춘 균주이기 때문에 살모넬라 예방용 생백신으로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 조류에게서는 조류의 살모넬라증을 예방하여 가금 파라티푸스를 예방함으로써, 사람에게서 인체 살모넬라증을 예방하고, 사람의 식중독을 예방한다. 본 발명의 대상이 되는 조류는 닭, 오리, 칠면조, 메추리, 물새, 비둘기, 카나리아 등이 될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주를 포함하는 가축용 사료 조성물보다 바람직하게는 사료 첨가제를 제공한다. 이는 사료 첨가제로 사용되면서 생백신 역할을 하여 살모넬라를 예방할 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주를 사료첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키거나, 사료 제조 시 직접 첨가시켜 제조할 수 있다. 본 발명의 사료 내 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주는 액상 또는 건조상태일 수 있으며, 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 사료 조성물은 본 발명의 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주 외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서의 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주를 포함하는 사료에는 식물성으로는 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질유, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물 부산물류 등이 있으며, 동물성으로는 단밸질류, 무기물류, 유지류, 광물성 유지류, 단세포 단밸질, 동물성 플랑크톤류, 남은 음식물 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서의 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주를 포함하는 사료 첨가제의 예로는 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등이 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주를 동물에 접종하여 살모넬라증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 조성물은 약학적 제제의 형태로 동물에게 투여되거나, 가축의 사료 또는 음수에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법을 통해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 사료 첨가제의 형태로 사료에 혼합되어 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 비경구, 동맥내, 피내, 경피, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경구 및 비강내 투여경로를 포함한 다양한 경로 등을 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명의 치료방법은 본 발명의 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 나이, 체중, 건강 상태, 성별, 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하나, 일반적으로 104 내지 108 CFU의 양으로 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실시예 1. 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주 제작
(1) 실험 균주 및 배양 조건
한국산 닭에서 살모넬라 엔테리카 엔테리티디스(Salmonella enterica Enteritidis) IVKW 1403를 수득하여 모든 실험에서 야생형으로 사용하였다. 박테리아는 37℃에서 루리아-베르타니(LB) 액체배지 또는 한천배지에서 배양하였으며, 항생제(ampicillin 200 ㎍/㎖, kanamycin 83㎍/㎖, or tetracycline 35㎍/㎖)를 사용해 선별과정을 수행하였다.
상기의 살모넬라 균주를 Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 재조합 효소(lamda Red recombinase)(Datsenko KA et al, PNAS, (2000);97(12):6640-6645)을 이용하여 rfaH 유전자 및 msbB 유전자를 결실시킨 변이 균주를 제조하였다. 상기 변이 균주 제작에 사용한 플라스미드는 표 1과 같다. 참고로, 여기서 결실시킨 상기 rfaH 유전자는 서열번호 1의 염기서열이며, 상기 msbB 유전자는 서열번호 2의 염기서열에 나타내었다.
이름 특성
pTP 233 람다 레드 재조합효소 발현벡터, 보조 플라스미드, 온도민감성 ori; AmpRTetR
pKD4 FLP 인지 사이트(FRT)((oriR, AmpRKmR)에 의하여 측면화된 kan 카세트의 증폭을 위한 템플레이트 플라스미드
pCP 20 flp 재조합 효소 유전자, CmRAmpR유전자를 함유하는 온도 민감성 플라스미드(30℃에서 복제)
이후 프라이머들을 사용하여 플라스미드 pKD4의 가나마이신 저항성 유전자를 증폭하였다. 이후 전기영동법을 사용하여 각 PCR 조각들을 세포 내에 삽입하였다. 상기 세포들을 가나마이신(83㎍/㎖)을 함유하는 LB 한천배지에 배양하여 변이 균주를 선별하였다. 상기 선별된 변이 균주를 적당한 프라이머를 사용하여 확인하였다. 상기에 사용된 프라이머는 표 2에 기재하였다.
프라이머 서열(5'→3')
Msbb_long_F 0228 ATGGCGGGGATTGCATTAACACCGGCATCATTCCGTGACCCTTTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
Msbb_long_R 0228 TTATACGGCTGAATCTCGCCTGGCTTGCGGGTTTTGAGCAGCTTCCTCCTTAGTTCCTATTCCG
Long_rfaH_F CTAAATCTTGCGAAAACCGGTGTTTTTTACGCTCTGCTTCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
Long_rfaH_R GCGGATAAGAGTCATTATGCAATCCTGGTATTTACTGTACCATATGAATATCCTCCTTAG
MsbB_com_F2 CGGGCGCTAATTAATCTGTCT
MsbB_com_R3 CGGTTCAACCAATACCACGCGTAT
RfaH_com_F GATCTTACGCCGAAACCAA
RfaH_com_R CATTGTAGCCTCTTGGTAAGC
이후, 플라스미드 pCP20을 사용하여 가나마이신 저항성 영역을 제거하였다.
(2) 변이 균주의 확인
상술한 방법에 따라 제조한 rfaH 유전자 결실 균주(Δ rfaH), msbB 유전자 결실 균주(Δ msbB), rfaH 유전자 및 msbB 유전자 결실 균주(Δ rfaH Δ msbB)를 군체 PCR방법에 의하여 변이 균주의 생성을 확인하였다(도 1 참조).
구분 설명
비교예 살모넬라 엔테리카 엔테리티디스 IVKW 1403 야생균주
실시예1 rfaH 유전자 결실 균주(Δ rfaH)
실시예2 msbB 유전자 결실 균주(Δ msbB)
실시예 1에 대한 확인 결과는 도 1의 (a)에 나타내고, 실시예 2에 대한 확인 결과는 도 1의 (b)에 나타내었다.
한편, 도 1의 각 그림에서 레인 1에는 비교예(야생 균주)를 확인한 것이고, 레인 2는 각 유전자를 가나마이신 카세트와 치환한 변이 형태이고, 레인 3은 가나마이신 카세트를 제거한 변이 형태(각 실시예)이다. 모든 변이 균주에서 예상한 유전자 크기의 변이균주들을 확인할 수 있다.
구체적으로, 도 1(a)에서는 Lane 1: wild type, 815 bp; lane 2: rfaH::KM, 1886 bp; lane 3: rfaH, 459 bp. 이고, 도 1(b)에서는 Lane 1: wild type, 1141 bp; lane 2: msbB::KM, 1845 bp; lane 3: msbB, 418 bp임을 확인하였다.
또한 상기 변이된 균주들에 대해 한국생명공학원에 균주를 기탁하였는데, rfaH의 유전자가 결실된 변이균주를 본 발명자들은 "HID2092"로 명명하였고, 2015년 04월 21일자로 한국생명공학연구원에 균주 기탁하여 “KCTC 12797BP"로 기탁번호를 부여받았으며, msbB의 유전자가 결실된 변이균주에 대해 본 발명자들은 "HID2114"로 명명하였고, 2015년 04월 21일자로 한국생명공학연구원에 균주 기탁하여 “KCTC 12798BP"로 기탁번호를 부여받았다.
실시예 2. 변이 균주의 배양 및 성장
상기에서 제조한 변이 균주를 LB 배지와 M9 최소 배지에서 각각 배양하여 성장 정도를 평가하였다. LB 배지에 변이 균주 5㎖를 접종하고, 17 내지 18시간 동안 (흡광도 600nm, 0.8) 배양한 다음 M9 최소 배지 또는 LB 배지 100㎖에 각각 옮겼다. 이후 48시간 동안 2시간 간격으로 박테리아의 성장을 측정하였다. 상기 실험 결과는 도 2에 도시하였다(도 2(a)는 LB 배지에서 배양한 결과, 도 2(b)는 M9 최소배지에서 배양한 결과이다).
LB 배지에서 배양한 결과, 모든 변이 균주는 배양 2시간 까지 성장하지 않았고, 2시간 경과된 이후부터 성장하기 시작하였다. 비교예(야생 균주)이 가장 좋은 성장을 보였으며, 그 다음으로 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 순서로 성장을 하였으나, 이들의 성장 속도 간에 유의적인 차이는 없었다. 이는 본 발명에 따른 변이로 인하여 균주의 성장이 지연되는 않은 것을 의미한다.
M9 최소 배지에서 배양한 결과, 배양 6시간에서 모든 균주의 성장이 지연되었고, 배양 6시간 이후에는 본 발명의 실시예만을 제외하고는 잘 성장하였다. 본 발명의 실시예는 M9 최소배지에서 10시간 이상 배양하여야 성장을 확인할 수 있었다.
또한, LB 배지에서 배양한 경우 모든 변이 균주의 lag phase가 M9 최소배지에서 배양한 경우보다 6시간 일찍 종결되었다.
실시예 3. LPS 발현 경향 분석
상술한 방법으로 제조된 변이 균주를 16% 디옥시콜레이트-폴리아크릴아마이드 젤(DOC-page gel)을 사용한 전기영동법 및 실버스테이닝법으로 LPS 발현 정도(경향)을 평가하고, 실험 결과를 도 3에 도시하였다.
레인 2에는 실시예 1(Δ rfaH)의 결과가 도시되어 있으며, LPS 유전자의 상단 부분이 나타나 있지 않았고, 상기 시료는 가장 빨리 이동하였다. 이는 rfaH를 결실한 변이 균주(실시예 1)에서는 0-항원 체인이 합성되지 않는 것을 의미한다.
또 다른 변이 균주인 실시예 2(ΔmsbB)은 비교예 (야생 균주)과 대비하여 하단부 안쪽 중심 밴드가 더 높은 발현정도를 나타낸 것을 제외하고는 야생 균주에 비하여 유사한 경향을 보였으나, 발현정도가 현저히 낮게 나타났다.
실시예 4. 살모넬라 감염 쥐의 생존율(병독성)
생후 7주령의 BALB/c 암컷 마우스를 준비한 후, 상기 제조한 변이 균주를 상이한 농도로 하여 마우스의 복강으로 주사하여 병독성을 측정하였다. 박테리아 세포는 두번 세척한 다음, 10배 PBS 용액에 연속적으로 희석하였다. 변이 균주의 접종량은 각각106, 107 및 108 CFU/100㎕(도 4a, 4b, 4c 참조)로 서로 상이하였다.
감염 후 2주동안 4 마리(대조군 및 3마리 마우스)의 특정병원균부재(specific pathogen free, SPF) 마우스로 이루어진 각 그룹을 관찰하였고, 매일 개체사망을 여부를 기록하였다. 실험동물의 윤리적 사용을 위해 3R 원칙을 준수하였으며, 강원대학교의 동물실험윤리위원회 규정하에서 동물실험을 실시하였다(허가번호 KW-130829-1).
상기 실험 결과는 도 4에 도시하였다. 비교예(야생균주)을 접종받은 모든 마우스는 투여 용량에 상관없이 접종 3일째에 폐사하였다. 반면 본 발명의 실시예들을 106 CFU/100㎕ 접종 받은 군의 마우스는 모두 전체 실험 기간 동안 생존하였고, 107 CFU/100㎕ 접종 받은 군의 마우스는 50%가 생존하였다.
실시예들을 106 CFU/100㎕ 접종 받은 군의 마우스에서는, 실시예 1을 접종 받은 모든 군은 3일째 실험 대상의 100%가 폐사한 반면, 실시예 2는 전체 실험 기간 동안 50%가 생존함을 보였다.
전체적으로, 비교예를 접종받은 군에 비해 실시예들을 접종받은 군들이 현저히 높은 생존율을 보였고, 본 발명에 따른 실시예2가 실시예1에 비해 접종받은 군의 생존율이 높은 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 살모넬라 변이 균주의 집락 형성
생후 7주령의 BALB/c 암컷 마우스를 사용하여 변이 균주의 집락 형성을 측정하였다. 5마리의 특정병원균부재(SPF) 마우스로 이루어진 한 군에 대하여 106 CFU/100㎕의 변이 균주 각각을 복강내 주사하였다.
감염 후 3일 및 14일째 되는 날에 대상 동물을 폐사시켰다. 간과 비장을 균질화한 후, Salmonella -Shigella(SS) agar(BD, USA)에서 세균의 집락수를 측정하였다.
상기 실험 결과는 도 5에 도시하였다. 접종 3일째, 간에서는 변이 균주(실시예 1 및 실시예 2)를 접종받은 두 군 모두 야생성 균주(비교예)을 접종받은 군에 비하여 세균의 집락수가 각각 4.6 log CFU/g, 4.9 log CFU/g 씩 감소함을 보였다(도 5a 참조).
야생균주를 접종받은 군은 접종 14일 이전에 모든 개체가 폐사하였기 때문에, 접종 14일째 세균수 측정이 불가능하였다. 접종 14일째에는, 변이 균주(실시예 1 및 실시예 2)를 접종받은 군에서 각각 2.6 log CFU/g, 1.5 log CFU/g 을 나타내어, 변이 균주를 접종 받은 모든 군에서 접종 3일째와 대비하여 접종 14일째 집락수 형성이 유의적으로 감소하였다.
접종 3일째, 비장에서는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2를 투여 받은 군의 집락수가 야생형을 투여 받은 군에 비하여 각각 6.3 log CFU/g, 6.8log CFU/g 씩 통계적으로 유의성 있게 감소하였다(도 5b 참조).
접종 14일째에는, 비장에서 실시예 2를 접종받은 군이 실시예 1 군과 비교시 유의성있게 낮게 형성된 집락수를 보였다. 또한, 실시예 2를 접종 받은 군에서 접종 3일째와 대비하여 접종 14일째 집락수 형성이 유의적으로 감소하였다.
접종 3일째에, 실험 개체들의 장기/체중 비율을 측정하여, 도 6a 및 도 6b에 도시하였다. 변이 균주를 접종 받은 모든 군(실시예 1 및 2)의 간과 비장의 체중 대비 비율이 야생형을 접종 받은 군에 비하여 현저히 낮았다.
본 발명의 실시예2를 투여 받은 군의 체중 대비 간 비율 및 체중 대비 비장 비율이 가장 낮았으며, 상기 비율은 병균을 접종하지 않은 대조군(control)과 거의 유사할 정도의 수준이었다.
< 실시예 6>
마우스에서 생균백신 후보주에 대한 방어율 시험
본 발명자들은 마우스에서 생균백신 후보주에 대한 방어율 시험을 위해, 실험동물로 7주령의 BALB/c 암컷마우스를 사용하였고, IVC Rack(MVCS; Threeshine, Korea)에서 사육하였다. 방어율 시험의 경우, 백신접종 4주 후 108 CFU/mouse의 살모넬라 엔테리티디스 HID1403을 마우스 구강으로 공격접종한 뒤, 7일차에 마우스의 장기무게 측정 및 간과 비장으로부터 검출된 공격균주의 균수 측정을 하였다. 분리된 간과 비장은 PBS에 희석하여 Tissue Lyser(QIAGEN, USA)로 조직을 파쇄한 후 Salmonella-Shigella(SS) agar(BD, USA)에서 집락수를 측정하였다. SE 변이주에 대한 마우스에서 방어효과를 측정하기 위해 복강내(IP) 적정량을 접종하였으며, 음성대조군은 phosphate-buffered saline(PBS)만을 투여하였다.
공격접종 1주 후에 모든 군의 마우스들을 폐사시킨 다음 간과 비장을 추출하여 공격균주의 집락수를 측정한 결과, 간에서는 대조군(2.8 X 105 CFU/g)과 비교 시 모든 군들이 통계적으로 유의성 있게 낮은 값을 보였다(p<0.001). 이는 본 백신후보균주 백신의 방어능력이 뛰어남을 보여주는 것이다. 비장에서도 대조군(1.8 X 106 CFU/g)과 비교 시에 백신군들이 유의성 있게 낮은 집락수를 보였다(p<0.001). 실시예들 간의 비교에선, 통계적 유의성이 관찰되지 않았다 (도 6 참조).
< 실시예 7>
방어율 시험마우스에서 생균백신 후보주에 대한 항체가 조사
백신접종 1, 2, 3, 4주 후에 모든 마우스에서 안와채혈 방식으로 혈액을 채취하였다. 혈액의 항체가 변화를 확인하기 위해 ELISA를 실시하였다. 50μl/well의 항원 (Salmonella Enteritidis OMP 또는 LPS, 10/ml)을 각각의 well에 코팅하고, plate (Nunc, Wiesbaden, Germany)를 -4℃에 16시간 동안 보관하였다. 그 후, PBST (0.05% Tween20 + PBS)로 plate를 세번 세척한 다음, 2% BSA (Merck, Darmsdadt, W. Germany)로 37℃에서 blocking하였다. PBST로 다시 세척한 다음, 1차 항체로 0.5% BSA가 포함된 PBS에 100배로 희석된 혈청을 100 첨가하고, 1.1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 2차 항체로 700배 및 2500배로 희석된 IgG, IgG1, IgG2a, IgA를 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 100의 TMB (SurModics, Eden Prairie, USA)를 첨가하고, 3분 동안 어두운 곳에서 반응시킨 후, 2N의 H2SO4로 반응을 중지시키고, ELISA reader로 흡광도를 측정하였다.
Whole cell을 항원으로 사용하여 IgG(도 8a 참조), IgG1(도 8b 참조), IgG2a(도 8c 참조)에 대한 항체가를 측정한 결과, 대조군과 비교 시 백신접종 1주 차 실시예 1의 IgG1와 IgG2a에 대한 항체가를 제외한 모든 군에서 실험기간동안 유의성을 보이며 현저히 높은 항체가를 보였다. 백신접종 4주 차엔, IgG, IgG1에 대한 실시예 2가 접종된 군이 실시예 1군에 비교하여 유의성있게 높은 항체가를 나타내었다. 또한, 실시예 2의 항체가는 백신접종 1주 째부터 실험기간 동안 점차적으로 증가한 반면, 실시예 1의 항체가는 백신접종 3주 째까지 증가하다가 4주 째부터 다소 감소함을 보였다. 하지만, 모든 실시예들이 실험기간 동안 높은 항체가를 보여 높은 방어력을 보이는 것을 확인하였다(도 8 참조).
LPS을 항원으로 사용하여 IgG(도 9a 참조), IgG1(도 9b 참조), IgG2a(도 9c 참조)에 대한 항체가를 측정한 결과, 대조군과 비교 시 백신접종 1주 차 실시예 1의 IgG1에 대한 항체가를 제외한 모든 군에서 실험기간 동안 높은 항체가를 보였다. 백신접종 4주 차엔, IgG, IgG1에 대한 실시예 2가 접종된 군이 실시예 1군에 비교하여 유의성있게 높은 항체가를 나타내어 whole cell 항원을 사용했을 시와 같은 경향을 보였다. 또한, 실시예 2의 항체가는 백신접종 1주 째부터 실험기간 동안 점차적으로 증가한 반면, 실시예 1의 항체가는 백신접종 3주 째까지 증가하다가 4주 째부터 다소 감소함을 보여 whole cell 항원을 사용했을 시와 같은 경향을 보였다. 그러나, 4주 째에 항원의 비교 시에 LPS의 경우가 실시예들의 항체가가 더 차이를 보이는 경향을 나타내었다. 이는 O-polysacchairide와 core oligosaccharide가 완벽히 제거된 실시예 1이 LPS가 항원으로 사용되었을 시에, 상대적으로 더 낮은 항체가를 보이는 것으로 사료된다.
통계분석
실험군간의 유의성 있는 차이를 보기 위한 통계적 분석은 one-way ANOVA를 이용하였다. p < 0.05인 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였으며, Bonferroni의 다중비교검정을 실시하여 군간의 차이를 비교하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC12797BP 20150421 한국생명공학연구원 KCTC12798BP 20150421
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Kangwon National University <120> SALMONELLA ENTERITIDIS MUTANT STRAINS HID2092 AND HID2114 AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION USING THE SAME <130> pn1503-075 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 489 <212> DNA <213> rfaH gene sequence <400> 1 atgcaatcct ggtatttact gtactgcaaa cgcgggcaac ttcagcgtgc tcaggaacac 60 ctcgaaagac aagcggtaag ttgcctgaca ccgatgatca ccctggaaaa aatggtacgc 120 ggaaaacgta cctccgtcag cgaaccgctc tttcctaatt atctgttcgt tgaatttgat 180 ccggaagtga tacataccac tacaatcaac gccacgcgcg gcgtcagcca ttttgtgcgc 240 tttggcgcgc atcctgcgat cgtgccttcc agcgttattc atcagctttc tatctacaag 300 cccgaaggcg ttgtcgatcc tgaaaccccc tatcccggcg atagcgtcat catcacggaa 360 ggcgcatttg aagggctgaa agcgattttt accgaaccgg atggcgaaac gcgttcgatg 420 ttactgctta atttactcaa taaagaagtg aagcagagcg taaaaaacac cggttttcgc 480 aagatttag 489 <210> 2 <211> 990 <212> DNA <213> msbB gene sequence <400> 2 agcagaccct ggaaaagcat ggaaaccaaa aaaaataata gtgagtatat ccctgaattc 60 gaaaaatcct ttcgctatcc gcagtattgg ggcgcctggt tgggcgcggc ggcaatggcg 120 gggattgcat taacaccggc atcattccgt gaccctttgc tggcgacgct ggggcgcttt 180 gccggacggc tggggaagag ttctcgtcgc cgggcgctaa ttaatctgtc tttgtgcttt 240 ccgcagcgta gcgaagctga gcgcgaagcg attgtcgatg agatgttcgc caccgcgcca 300 caggcaatgg cgatgatggc tgagttggcg atgcgcggtc cgaaaaaaat tcaacagcgt 360 gttgactggg aaggtctgga aatcattgag gagatgcgtc gtaacgacga aaaagtcatt 420 tttctcgtac cgcatggctg gggcgtcgac attccagcta tgctgatggc ctctcagggg 480 caaaaaatgg cggcgatgtt tcataatcag ggtaatccgg tttttgacta tatctggaac 540 accgtgcgtc ggcgttttgg cggacgtttg catgcgcgca atgacgggat taaacccttt 600 attcagtctg ttcgtcaggg ctactggggt tactacctgc cggaccagga tcatggcccg 660 gagcatagtg aattcgttga tttctttgcg acatacaaag cgacgctgcc cgcgattggt 720 cggctgatga aagagtgccg cgcacgcgtg ataccgcttt tcccggtgta taatggtaaa 780 acgcatcgcc tgactatcca gattcgcccg ccaatggacg atctgctcac ggctgacgac 840 cacactatcg ccagacggat gaacgaagag gtcgaaattt ttgtcggccc gcatccggaa 900 cagtacacct ggatcctgaa gctgctcaaa acccgcaagc caggcgagat tcagccgtat 960 aagcgtaaag atctttatcc catcaaataa 990

Claims (7)

  1. 살모넬라 엔테리티디스균의 염색체에서 rfaH 유전자 또는 msbB 유전자가 불활성화된 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유전자의 불활성화는 대상 유전자의 일부 또는 전체의 결손에 의한 것임을 특징으로 하는 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주.
  3. 제1항에 있어서,
    rfaH 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고, msbB 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주.
  4. 제1항에 있어서,
    rfaH 유전자가 불활성화된 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주는 기탁번호 KCTC 12797BP의 균주이고, msbB 유전자가 불활성화된 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주는 기탁번호 KCTC 12798BP의 균주인 것을 특징으로 하는 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주.
  5. 제1항의 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주를 유효성분으로 포함하는 살모넬라증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 조성물은 생균 백신 조성물인 것을 특징으로 하는 살모넬라증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  7. 제1항의 살모넬라 엔테리티디스 변이 균주를 조류에 접종하여 살모넬라증을 예방 또는 치료하는 방법.
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